JPS62272988A - アスペルギルス　オリザにおけるタンパク生成物の製造法 - Google Patents

アスペルギルス　オリザにおけるタンパク生成物の製造法

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JPS62272988A
JPS62272988A JP62060276A JP6027687A JPS62272988A JP S62272988 A JPS62272988 A JP S62272988A JP 62060276 A JP62060276 A JP 62060276A JP 6027687 A JP6027687 A JP 6027687A JP S62272988 A JPS62272988 A JP S62272988A
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    • C12N9/6481—Pepsins (3.4.23.1; 3.4.23.2; 3.4.23.3)

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の技術分葺〕 本発明はアスペルギルス　オリザ（Ａｓ　ｅｒ　１ｌｌ
ｕｓ吐服組）におけるタンパク生成物の発現法、組換え
ＤＮＡベクター、アスペルギルス（Ａｓ　ｅｒ　１ｌｌ
ｕｓ）用プロモーターおよび形質転換された菌類に関す
る。
〔従来の技術〕
今日までに、組換えＤＮＡ技術によるポリペプチドまた
はタンパクを生産するため数多くの方法が開発されてき
た。主な興味は細菌および酵母に集中されてきたのであ
り、例えばＥ、　ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂ
ｔｉｌｉｓおよびＳａｃｃｈａｒｏｍ　ｃｅｓ　ｃｅｒ
ｅ−ｖｉｓｉａｅは例えば発現および選択系に関して詳
細に特徴化されているものである。
上記の微生物のほかに、ｄｓ　ｎｉｇｅｒのような糸状
菌は、詳細に特徴化されている組換えＤＮＡベクター用
の宿主微生物として有望な候補であり、酵素を商業的に
生産するのに広範囲に用いられている微生物である。形
質転換された宿主微生物から形質転換細胞を選択できる
選択マーカーが用いられる形質転換系の開発に、特に努
力が集中されてきた。
過去数年間に桓眩１旦旦Ｌ１舷匡岨の形質転換のための
各種選択マーカーが報告され、菌の細胞分化を制御する
遺伝学的および分子学的方法を研究する目的で糸状菌統
計１辻履Ｌ１虹匡旺の組込み形質転換の手法が近年にな
り開発されてきた。
＾、　ｎｉｄｕｌａｎｓの形質転換は、Ｎｅｕｒｏｓｐ
ｏｒａ　ｃｒａＳｓａｐｙｒ−４遺伝子（Ｂａ１ｌａｎ
ｃｅ、　Ｄ、Ｊ、ら、Ｂｉｏｃｌ＋ｅｍ。
Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｅｉｕｎ、、第１
１２巻、（１９８３年）、２８４〜２８９頁）、Ａ、　
ｎｉｄｕｌａｎｓ　ａｍｄＳ遺伝子（Ｔｉｌｂｕｒｎ。
Ｊ、Ｇ、ら、Ｇｅｎｅ、第２６巻、（１９８３年）、２
０５〜２２１頁）、Ａ、　ｎｉｄｕｌａｎｓ　ＬｒｐＣ
遺伝子（Ｙｅｌｔｏｎ、　Ｍ、Ｍ、ら、Ｐｒｏｃ　。
Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、＾１、第８１巻
、（１９８４年）、１４７０〜１４フ４頁）およびＡ、
　ｎｉｄｕｌａｎｓ　ａｒｇＢ遺伝子（Ｊｏｈｎ、Ｍ、
＾、およびＰｅｂｅｒｄｙ、　Ｊ、、Ｍｉｃｒｏｂ、　
Ｔｅｃｈｎｏｌ、、第６巻、（１９８４年）３８６〜３
８９頁）を含むプラスミドを用いて説明されてきた。形
質転換するＤＮＡは、比較的低い頻度（典型的には１０
００（１１未満の形質転換体／１μｇのＤＮＡ）で宿主
ゲノムに組込まれ　。
ることが分かった。
ごく最近に、Ａ、　ｎｉｄｕｌａｎｓのａｓｄｓ遺伝子
を用いる７１　Ｉｕｓ　ｎｉｇｅｒの形質転換が報告さ
れ（Ｋｅｌｌｙ。
Ｊ、Ｍ、とｌ１ｙｎｅｓ、　Ｍ、Ｊ、、ＥＭＢＯＪｏｕ
ｒｎａｌ、第４巻、　　　・（１９８５年）、４７５〜
４７９頁）、ａｍｄＳは単一の窒素源としてのアセタミ
ド上では強力には成長できない…ｅｒ　１ｌｌｕｓ　ｎ
ｉｇｅｒの形質転換に使用される有力な選択マーカーで
あることが示された。Ａ。
ｎｉｄｕｌａｎｓのａｒｇＢ遺伝子を用いるＡｓ　ｅｒ
　１ｌｌｕｓ　ｎｉ　ｅｒの形質転換も、最近報告され
た（ＢｕｘＬｏｎ、　Ｆ、Ｐ、ら、Ｇｅｎｅ、第３７巻
、（１９８５年）、２０７〜２１４頁）。
以下余白 〔発明が解決しようとする問題点〕 糸状菌恒狙引１月」μＬ犯Ｘリーにおける異種タンパク
の発現のための系は、主として、この菌における遺伝子
発現の制御法が十分には知られておらず且つクローニン
グベクター上に好適な選択可能な遺伝子マーカーが欠如
していることにより、これまでは開発されなかった。
〔問題点を解決するための手段、発明の作用および効果〕
本発明によれば、上記の形質転換技法を用いて、異種タ
ンパクを高水準で発現させまたはＡｓ　ｅｒ　１ｌｌｕ
ｓ　ｏｒ　ｚａｅにおける同種タンパクの産生を増進さ
せることができる。
本明細書において用いられる「異種タンパク」という表
現はＡ、　吐Ｂ阻によっては産生されないタンパクを意
味し、一方「同種タンパク」という表現はＡ、　詠ｎｌ
阻自体によって産生されるタンパクを意味する。
更に具体的には、Ａ、　１１ＭおよびＡ、　ｎｉｄｕｌ
ａｎｓ−の形質転換に用いたマーカー遺伝子を使用する
ことによって、所望なタンパク生成物を暗号化するＤＮ
Ａで形質転換したＡ、　１ｎ１阻株の選択が可能である
。これら前者の菌類とＡ、　象り１咀との系統発生的距
離（Ｒａｐｅｒ、　Ｋ、Ｂ、およびＦｅｎｎｅｌｌ、　
Ｄ；１．、（１９６５年）Ｔｈｅ　Ｇｅｎｕｓ　Ａｓｐ
ｅｒｇｉｌｌｕｓ）のために、これはまったく予知され
ないものであった。
本発明の第一の見地によれば、 ・　（ａ）アスペルギルス　オリザ（Ａｓ　ｅｒ　１ｌ
ｌｕｓ虹■牲）宿主のゲノム中に１個以上のコピーを組
込み可能であり且つ遺伝子発現を促進する機能を暗号化
するＤＮＡ配列と、形質転換細胞の選択に好適なマーカ
ーと、所望なタンパク生成物を暗号化するＤＮＡ配列と
を有する組換えＤＮＡクローニングベクター系を提供し
、 （ｂ）選定された選択マーカー用の機能遺伝子を・有し
ない唇脛紺辻護ｓ　ｏｒ■阻を工程（ａ）からの組換え
ＤＮＡクローニングベクター系で形質転換し、次いで （ｃ）形質転換したＩ■Ｊ１月−国り虹註駐−宿主を適
当な培養基中で培養する工程から成る唇脛１辻１ｕｓル
■阻においてタンパク生成物の発現法が提供される。
本発明の第二の見地によれば、υ旦Ｊ１υ」邦２、具体
的には唇と」主［駐」Ｄ１阻および唇μ狙１桂眼４ｒに
おけるタンパク生成物の発現に極めて効果的なプロモー
ターであって、ＴＡＫ＾−アミラーゼプロモーターまた
は任意に上流活性化配列が先行する上記プロモーターの
機能的部分として特徴化されるものが提供される。
本発明の第三の見地によれば、Ａｓ３ｙ虹且り一旺註組
におけるタンパク生成物の産生法であって、上記のよう
に組換えＤＮＡクローニングベクターを用いて形質転換
した眞とユ辻臆り躾Ｐ組株を適当な培養基中で培養し、
生成物を培養基から回収する方法が提供される。
使用した形質転換法は、Ａ、　ｎｉｄｕｌａｎｓの形質
転換法の変法（Ｂａｌｌａｎｃｅ、　Ｄ、Ｊ、ら、Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ、　ｌ１ｉｏｐｈｙｓ。
Ｒｅｓ、　Ｃｏ＋ｓ＋ｓｕｎ、　、第１１２巻、（１９
８３年）、２８４〜２８９頁、Ｔｉ１ｂｕｒｎ、　Ｊ、
Ｇ、ら、Ｇｅｎｅ、第２６巻、（１９８３年）、２０５
〜２２１頁）、Ｙｅｌｔｏｎ、　Ｍ、Ｍ、ら、Ｐｒｏｃ
、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ。
Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、＾６、第８１巻、（１９８４年）、
１４７０〜１４７４頁）および＾、　ｎｉｇｅｒの形質
転換についてのＢｕｘｔｏｎ・　らの方法、（Ｇｅｎｅ
、第３７巻、（１９８５年）、２０７〜２１４頁）に類
似の方法であった０本発明の方法では、唇肌」旦ハ１」
すＪ阻は、宿主株のゲノム中に組込むことができるが、
形質転換前は宿主株に有しない選択マーカーを含むベク
ター系で形質転換される。
好ましい選択マーカーはａｒｇＢ（Ａ、　ｎｉｄｕｌａ
ｎｓまなはＡ、　　４）　　、　ＬｒｐＣ（Ａ、　　ｎ
ｉｄｕｌａｎｓ）、　ａｍｄＳ　（Ａ。
ｎｉｄｕｌａｎｓ）またはｐｙｒ４（ｎｉｇｅｒｃｒａ
ｓｓａ）遺伝子、またはＤＩＩＦＲ（ジヒドロフオレー
トレダクターゼまたはその変異株）遺伝子である。更に
好ましい選択マーカーはａｒｇＢまたはａｒ■ＳＩ！伝
子である。野生型Ａ、　ｒ２Ｈμ咀株は通常はａｒｇＢ
＋である（すなわち、ａｒｇＢ：ａ伝子がＡ、　湧Ｊ１
倶において機能的である）。
ａｒｇＢを選択マーカーとして選択する場合には、この
マーカーに対して遺伝子に欠損を有する紅吐■舷のａｒ
ｇＢ変異株を宿主株として用いなければならない、Ａ、
　１Ｊ１阻のａｒｇＢ変異株はＦ、Ｐ、　Ｂｕｘｔｏｎ
らが報告したのと同様にして調製することができる（　
Ｇｅｎｅ、第３７巻、（１９８５年）、２０７〜２１４
頁）。
ａｒｇＢ変異株はオルニチントランスカルバミラーゼ遺
伝子に欠損を有する変異株として定義される。
他方、ａｍｄＳ遺伝子は、野生型Ａ、　ｏｒｕ組株がこ
の遺伝子を含まないので、この野生株の形質転換の選択
マーカーとして用いることができる。
遺伝子配列を促進する機能を暗号化するＤＮＡ配列は、
典型的にはプロモーター、転写ターミネータ−およびポ
リアデニル化シグナルである。
当業界において周知のように上流活性化配列およびエン
ハンサ−配列が先行することのあるプロモーターは＾ｓ
　ｅｒ　１ｌｌｕｓ　ｏｒ　ｚａｅにおいて強力な転写
活性を示すことができる如何なるＤＮＡ配列であっても
よく、アミラーゼ、グルコアミラーゼ、プロテアーゼ、
リパーゼ、セルラーゼおよび解糖酵素のような細胞外お
よび細胞内タンパクのいずれをも暗号化する遺伝子から
誘導することができる。好適なプロモーターはＡ、　ｏ
ｒ■ａｅ　Ｔ＾に＾アミラーゼ、Ｒｈ１ｚｏｓｕｃｏｒ
　ｍ１ｅｈｅｉアスパラギン酸プロテイナーゼ、Ａ、　
ｌ１ｍグルコアミラーゼ、Ａ、　ｌ影！中性α−アミラ
ーゼ、Ａ、ｎ１ＬＬ酸安定α−アミラーゼおよびＲｈｉ
ｚｏｍｕｃｏｒ　５ｉｅｈｅｉ　リパーゼについての遺
伝子から誘導することができる。解糖酵素の遺伝子から
のプロモーターの例は、ＴＰＩ、ＡＤＨおよびＰＧＫで
ある。
本発明による好ましいプロモーターは、＾。
ｏｒｙｚａｅ　ＴＡＫ＾−アミラーゼプロモーターであ
る。
ＴＡＫ＾アミラーゼは周知のα−アミラーゼ（Ｔｏｄａ
ら、Ｐｒｏｃ、　Ｊａｐａｎ　Ａｃａｄ、　、第５８巻
、シリーズＢ（１９８２年）、２０８〜２１２頁）であ
る、プロモーター領域を暗号化するＤＮＡは、Ｔ八に＾
−アミラーゼゲノム性クローンから誘導した。プロモー
ターおよびプロモーターの上流の領域の配列を、プレ領
域およびＴＡＫ＾−アミラーゼについての構造遺伝子の
５′末端と共に第１図に示す。
実施ＦＡ２に更に詳細に説明されるように、プレ領域お
よびプロモーターおよび上流活性化配列を含むＴＡＫ＾
−アミラーゼを暗号化するＤＮＡ配列は、＾、　ｏｒｙ
ｚａｅ　ｍｙｃｅｌｉｕｍから誘導され、Ｂａｗｌ　Ｉ
を消化したｐＢＲ３２２に挿入されて、プラスミドルＴ
へにＡ１フを生成した（第２図を参照されたい）、　ｐ
ＴＡＫ＾１フＬ７から誘導されたＤＮＡは５．５　ｋｂ
　Ｂａｍ１ｌ　Ｉ　／Ｓａｕ　３＾ｌ−Ｂａ輸Ｈ夏／５
ａｕ３＾■フラグメントとして示され、プロモーターお
よび上流活性化配列は位置０で開始する２、　１　ｋｂ
フラグメントを表わす、　Ｂｇ１１１部位までのプロモ
ーターおよび上流活性化配列の確立されたＤＮＡ配列を
、第１図に示す、プロモーターは、ＴＡＫ＾−アミラー
ゼプレ配列のＮｅｔ（１）コドンに先行するヌクレオチ
ド−１で終了する。
プレ配列を暗号化するヌクレオチド配列は６３１ＩＩＭ
のヌクレオチドから構成され、成熟ＴＡＫ＾−アミラー
ゼはヌクレオチド６４に対応する位置から開始する。
ｐＴＡＫＡ　１７から、プロモーターに対して上流の配
＼列を含む全プロモーター配列またはその機能的部分は
、当業者に公知の手段によって誘導することができる。
プロモーター配列は、プロモーター配列を、例えば所望
なタンパク生成物またはことなるプレ領域（シグナルペ
プチド）を暗号化する遺伝子のような他のＤＮＡとの連
結を促進する特異的な制限部位を導入するために、リン
カ−を備えていてもよい。
本発明による方法では、（Ｓａ１１部位の開始を表わす
）ヌクレオチド−１１４４（第１図を参照されたい）か
らヌクレオチド−１０の配列を、プロモーター領域の十
分に機能する部分の一例として使用した０本発明のもう
一つの態様では、ヌクレオチド−１１７６から−１まで
のヌクレオチド配列は、ｐｔ＾に＾１７からの未だ配列
されていない１．０５ｋｂフラグメントが先行した。各
種のフラグメントを使用できることは、当業者にとって
明らかである。
本発明の一態様によれば、プロモーターおよび上流活性
化配列は、第１図におけるヌクレオチド−１１４４から
ヌクレオチド−１０の配列を表わす下記の配列または機
能的に等価なヌクレオチド配列を有する。　　　　　　
　　　以−ト余日ＧＴＣＧＡＣＧＣＡＴＴＣＣＧ＾＾Ｔ
Ａ　ＣＧＡＧＧＣＣＴＧＡ　ＴＴ＾＾Ｔ（：ＡＴＴ＾Ｃ
ＡＴＡＣＧＣＣＴＣＣＣＣＧＴＡＧＴＡＧ　ＡＣＣにＡ
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ＣＧＴＡＧＡＧＣＴＴ　＾＾＾ＧＴＡＴＧＴＣＣＣＴＴ
ＧＴＣＧＡＴ　ＧＣＧＡＴＧＴＡＴＣ＾Ｃ＾＾ＣＡＴＡ
Ｔ＾＾＾ＴＡＣＴＡＧＣ＾＾Ｇ（：（：ＡＴ（：ＣＣＡ
　ＴＧＣＴＴにＧＡＧＧ＾ＴＡＣＣ＾＾ＣＣ（：　ＡＣ
＾＾ＣＡＴＣＡＣＡＴＣ＾＾ＧＣＴＣＴ　（’ＣＣＴＴ
ＣＴＣＴ（：＾＾Ｃ＾＾Ｔ＾＾＾ＣＣＣＣＡＣＡＧ もう一つの態様によれば、プロモーターおよび上流活性
化配列は、第１図におけるヌクレオチド−１１７６から
−１までの配列を表わす下記の配列または機能的に等価
なヌクレオチド配列を有する。
＾にＡＴＣＴにＣＣＣＴＴＡＴ＾＾＾ＴＣＴ　ＣＣＴＡ
にＴＣＴＧＡ　ＴＣＧＴＣ（：ＡＣにＣ＾ＴＴＣＣＧ＾
＾ＴＡ　Ｃ（：Ａ（：ＧＣＣＴＧＡ　ＴＴ＾＾ＴＧＡＴ
ＴＡ　ＣＡＴＡＣＧＣＣＴＣＣＧにＧＴＡ（：ＴＡＧ　
ＡＣＣＧＡＧＣＡＧＣＣにＡ（ｕＣＣＡにＴＴ　ＣＡに
ＣにＣＣＴ＾＾＾＾ＣにＣＣＴＴＡＴ　ＡＣ＾＾ＴＴ＾
＾ＧＣＡ（：ＴＴ＾＾＾Ｇ＾＾ＧＴＴＡＧ＾＾ＴＣＴ＾
ＣＧＣＴＴ＾＾＾＾＾にＣＴＡＣＴＴ＾＾＾＾＾ＴＣＧ
ＡＴＣＴ　ＣＧＣＡ（：ＴＣＣＣＧ＾ＴＴＣＧＣＣＴＡ
Ｔ　Ｃ＾＾＾＾ＣＣＡＧＴ　ＴＴ＾＾＾ＴＣ＾＾ＣＴＧ
ＡＴＴ＾＾＾ＣＧＴＧＣＣＧ＾＾ＣＧＡ　ＧＣＴＡＴ＾
＾＾ＴＧ　ＡＴＡＴ＾＾Ｃ＾＾Ｔ　ＡＴＴ＾＾＾ＧＣＡ
ＴＴ＾＾ＴＴＡＧＡＧＣ＾＾ＴＡＴＣＡ（：（：ＣＣに
Ｃ（：ＣＡＣＧ＾＾＾ＣＧＣ＾＾ＣＴＴ＾＾＾＾＾ＧＣ
Ｇ＾＾＾ＧＣＣＣＴＣＴＡＣＴ　＾＾＾ＣＡＧＡＴＴＡ
　ＣＴＴＴＴＧ＾＾＾＾＾ＧにＣＡＣＡＴＣＡ　　（：
ＴＡＴＴＴ＾＾＾Ｇ　　ＣＣＣＧ＾＾ＴＣＣＴ　　丁＾
ＴＴ＾＾ＧＣＧＣＣＧ＾＾＾ＴＣＡＧＧ　ＣＡＧＡＴ＾
＾＾ＧＣＣＡＴＡＣＡＧＧＣＡ　ＧＡＴＡＧＡＣＣＴＣ
ＴＡＣＣＴＡＴＴ＾＾＾ＴＣＧＧＣＴＴＣＴ　ＡＧＧＣ
ＧＣにＣＴＣＣＡＴＣＴ＾＾＾ＴＧＴＴＣＴＧＧＣＴＧ
Ｔ　にＧＴにＴＡＣＡにＧ　ＧＧＣＡＴ＾＾＾＾Ｔ　Ｔ
ＡＣ（：ＣＡＣＴＡＣＣＣＧ＾＾ＴＣＧＡＴ　Ａ（：＾
＾ＣＴＡＣＴＣＡＴＴＴＴＴＡＴＡＴ　ＡＧ＾＾ＧＴＣ
ＡＧ＾＾ＴＴＣＡＴＡにＴ（：　ＴＴＴＴにＡＴＣＡＴ
　ＴＴＴ＾＾＾ＴＴＴＴ　ＴＡＴＡＴＧＧＣＧ（：ＣＴ
Ｃ（：ＴＧ（：ＧＣ＾＾ＣＴＣＧＣＴＴＧＣＧＣににに
Ｃ＾＾ＣＴ　ＣＧＣＴＴＡＣＣＧ＾ＴＴＡＣにＴＴＡＧ
Ｇ　ＯＣＴにＡＴＡＴＴＴ　ＡＣＧＴＧ＾＾＾＾Ｔ　Ｃ
ＧＴＣ＾＾ＣＣＣ＾ＴＧＣ＾＾にＡＣＣ＾＾＾ＧＴＡＧ
Ｔ＾＾＾＾ＣＣＣＣＧＧ＾＾Ｇ　ＴＣ＾＾ＣＡＧＣＡＴ
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＾＾ＣＣＣＣＡＧＣＧＴＣＣＡＣ＾ＴＣＡＣにＡＧＣＧ
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ＡＣにＣＡＣＣＡＴＣＣ＾＾ＴＴＡ（：ＡＡ　（：ＣＡ
ＣＣ＾＾＾ＧＣＣ＾＾＾ＣＡＧＣＣＣ＾＾Ｃ＾＾＾＾＾
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ＣＴＡ　　（：Ｃ（：ＧＣ（：Ｇ＾＾ＡＴＴＴ＾＾＾Ｇ
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Ｃ＾　＾＾ＴＣＡＣＡＧＴＣＧＴＣＣＣＣＧＧＴＡ　Ｔ
ＴＧＴＣＣＴＧＣＡ　Ｇ＾＾ＴＧＣ＾＾ＴＴ　Ｔ＾＾＾
ＣＴＣＴＴＣＴＧＣ（：＾＾ＴＣＣＣＴＴにＧＡＴＴＣ
ＣＣＣにＣＣＣＣＴＡＧＴ　　ＣＧＴＡＧＡにＣＴＴ＾
＾＾ＧＴＡＴＧＴＣＣＣＴＴＧＴＣＧＡＴ　　ＧＣＧＡ
ＴＧＴ＾丁ＣＡＣ＾＾ＣＡＴＡＴ＾＾＾丁＾ＣＴＡＧＣ
＾　＾ＧにＧＡＴＧＣＣ＾　丁ＧＣＴＴＧＧＡＧＧ　　
ＡＴＡＧＣ＾＾ＣＣＧ＾Ｃ＾＾ＣＡＴＣＡＣＡＴＣ＾＾
ＧＣＴＣＴ　ＣＣＣＴＴＣＴＣＴに　＾＾Ｃ＾＾ＴＡ＾
＾ＣＣＣＣＡＣＡＧ＾＾Ｇ　ＧＣＡＴＴＴ 本発明のもう一つの見地によれば、後者の配列では、ｐ
ＴＡＫ＾１７からの１．０５ｋｂ未配列の上流領域（第
２図における位Ｔ！、０〜１．０５）が先行してもよい
。
ターミネータ−およびポリアデニル化配列はプロモータ
ーと同じ源から誘導することができる。
エンハンサ−配列を構造中に挿入してもよい。
発現した生成物は細胞の分裂を要する細胞内に蓄積させ
て、生成物を単離することができる。この付加的工程を
回避し且つ細胞内で発現した生成物の可能な分解量を最
少限にするには、生成物を細胞から分泌するのが好まし
い、この目的のため、所望な生成物の遺伝子は１発現し
た生成物を細胞の分泌経路内への効果的に向けるプレ領
域を有する。自然に起こるシグナルまたはリーダーへブ
チドまたはその機能的部分あるいは分泌を行う合成配列
であることができるこのプレ領域は、−ＪＲ的には分泌
の際に所望な生成物から開裂して、培養液から単離する
準備のできた成熟生成物を残す。
このプレ領域は、如何なる有機物源からのものであって
も分泌されるタンパクの遺伝子から誘導することができ
る。
本発明によれば、プレ領域はυ且虹呈１１１ｕｓ一種か
らのゲルコア゛ミラーゼまたはアミラーゼ遺伝子、Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓ種からのアミラーゼ遺伝子、Ｒｈ１ｚｏｓ
ｕｃｏｒａｉｅｈｅｉからのリパーゼまたはプロテイナ
ーゼ遺伝子、Ｓ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅからのα−因
子の遺伝子または仔牛プロキモシン遺伝子から誘導する
ことができる。更に好ましくは、プレ領域はＡ、　１Ｄ
１咀ＴＡＫ＾アミラーゼ、＾工Ｉ犯ｍ中性α−アミラー
ゼ、Ａ、　ｎｊ３３ｚ酸安定α−アミラーゼ、Ｂ、　Ｉ
ｉｃｈｅｎｉｒｏｒｍｉｓα−アミラーゼ、Ｂａｃｉｌ
ｌｕｓ　ＮＣＩＢ　１１８３７からのマルトース原性ア
ミラーゼ、Ｂ、　ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏ　ｈｉｌｕ
ｓまたはＢ、　Ｉｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ　５ｕｂｔ
ｉｌｉｓｉｎから誘導される。有効なシグナル配列は、
Ａ、　１コｌ咀ＴＡＫ＾−アミラーゼシグナル、Ｒｈｉ
ｚｏｍｕｃｏｒ　ｍ１ｅｈｅｉアスパラギン酸プロテイ
ナーゼシグナルおよびＲｈｉｚｏｍｕｃｏｒａ＋１ｅｂ
ｅｉリパーゼシグナルである。
ＴＡＫ＾−アミラーゼシグナルは下記の配列を有する。
プロモーターおよびターミネータ−配列に機能的に連結
した所望な生成物の遺伝子は、選択マーカーを含むベク
ターに組込むことができ、または宿主株のゲノム中に組
込むことができる別個のベクターまたはプラスミド上に
置いてもよい０本明細書で用いる「ベクター系」という
表現は単一ベクターまたはプラスミドまたは宿主ゲノム
中に組込まれる全ＤＮＡ情報を含む２種類以上のベクタ
ーまたはプラスミドを包含する。ベクターまたはプラス
ミドは、線状または閉じた円形分子であってもよい０本
発明の好ましいＢ様によれば、Ｌ吐■阻は２個のベクタ
ーであって、一つは選択マーカーを含み、もう一つは宿
主株に導入される残りの異種ＤＮＡから成り、プロモー
ター、所望な生成物および転写ターミネータ−の遺伝子
およびポリアデニル化配列を含むもので共形質転換され
る。
通常・は、Ａ、　」ｎ１μ形質転換体は安定であり、選
択マーカーの不在で培養することができる。形質転換体
が不安定になる場合には、選択マーカーを用いて培養の
際に選択してもよい。形質転換細胞を、次に問題のマー
カーに対応する選択圧で培養する。
本発明はＡ、　吐り阻において多種多様なポリペプチド
またはタンパク生成物を高収率で製造する方法を提供す
る。Ａ、　１Ｄ１調は長年にわたり例えばＴ＾に＾−ア
ミラーゼ酵素およびタンパク分解酵素の生産に商業的規
模で用いられてきており、従ってこの微生物の醗酵技術
は十分に開発されており、この微生物は食品工業におい
て使用されることが証明されている０本発明は、原則と
して如何なるポリペプチドまたはタンパク生成物でも高
収量での工業的生産にＡ、ＯＪμ咀の使用°可能性を提
供する。かかる生成物の例はキモシンまたはプロキモシ
ンおよび他のレンネット、プロテアーゼ、アミログルコ
シダーゼ、Ａｓ　６１１ｌｌｕｓからの酸安定アミラー
ゼ、菌のリパーゼまたは原生生物のリパーゼおよび熱に
安定な細菌または菌のアミラーゼである。
本発明をプロキモシン、Ｒｈ１ｚｏＩＩＩｕｃｏｒ　ｍ
１ｅｈｅｉアスパラギン酸プロテイナーゼ、Ｔ八に＾−
アミラーゼおよびＲｈｉｚｏｍｕｃｏｒ　ｍ１ｅｈｅｉ
からのリパーゼの生産によって説明する。これらの酵素
の遺伝子は、下記に更に詳細に説明するように、ＣＤＮ
Ａライブラリーまたはゲノムライブラリーから得た。
〔実施例〕
以下の実施例において出発物質として使用したプラスミ
ドは次の通りである。
ｐ２８５　　　　（＾ＴＣＣＮｏ、　２０６８１）ＰＣ
ＡＭＧ９１　　Ｂｏｅｌら、ＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ、
第３巻、（１９８４年）、１５８１〜１５８５頁。
ｐｌｃ１９ＲＭａｒｓｈら、Ｇｅｎｅ、第３２巻、（１
９８４年）　、４８１〜４８５頁。
ｐｓａ１４３　　Ｂｅｒｓｅら、Ｇｅｎｅ、第２５巻、
（１９８３年）、１０９〜１１７頁、Ｊｏｈｎ　＆Ｐｅ
ｂｅｒｄｙ％Ｅｎｚｙｍｅ　Ｍｉｃｒｏｂ、　Ｔｅｃｈ
ｎｏｌ、。
ｐ３ＳＲ２Ｊ、Ｍ、ＫｅｌｌｙおよびＭｕ、　Ｈｙｎｅ
ｓ、　ＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ、第４巻（１９８５年）
、４７５〜４７９頁。
ｐＢＲ３２２Ｂｏｌｉｖａｒ、　Ｆ、ら、Ｇｅｎｅ、第
２巻（１９７７年）、９５〜１１３頁。
ｐＢＲ３２フ　　Ｃｏｖａｒｒｕｂｉａｓ、　Ｌ、ら、
Ｇｅｎｅ、第１３巻、（１９８１年）、２５〜３５頁。
ｐＵｃ９、ｐＵｃ１３ およびｐＵｃ１９　　Ｖｉｅｉｒａら、Ｇｅｎｅ、第１
９巻、（１９８２年）、２５９〜２６８頁、およびＭｅ
ｓｓｉｎｇ、　Ｍｅｔｈ、　　ｉｎ　Ｅｎｚｙｕ＋ｏｌ
ｏｇｙ。
第１０１巻、（１９８３年）、２０〜２７頁。
使用した菌株は次の通りである。
Ａ、　ｎｉ影工　　＾ＴＣＣ１０１５、＾ＴＣＣ１０５
８２Ａ、吐■阻　＾ＴＣＣ２０４２３、ＩＦＯ４１７７
、＾ＴＣＣ１０１１、＾ＴＣＣ９５７６、＾ＴＣＣ１４
４８８〜１１４９１、＾ＴＣＣ１１８０１および＾ＴＣ
Ｃ１２８９２゜Ｅ、　ｃｏｌｉ　　　ＭＣ１００Ｏ（Ｃ
ａｓａｂａｄａｎ、　ＨＪ、およびＣｏｈｅｎ、　Ｓ、
Ｎ、　、Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　、第１３８巻、
１７９〜２０７頁＞（ＮＣＩＢ　１１９５６）。
Ｒｈｉｚｏｓｕｃｏｒ ｍｉｅｂｅｉ　　　　　　　Ｃｐｓ　　３フ０．６５プ
レプロキモシン遺伝子を仔牛の胃のｃＤＮＡライブラリ
ーから単離し、Ｇ−ＣティリングによってｐＢＲ３２２
のＰｓｔ　１部位に挿入して（ＣｈｉｒＨｗｉｎら、Ｂ
ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第１８巻、（１９７９年）、
５２９４頁およびＴｒｕｅｌｓｅｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ
　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　、第６巻、（１９７９年）、
３０６１頁）、ｐＲ２６を得た。ｐｔｌｃ９をＳａｌ　
Ｉで切断し、切断をクレノーポリメラーゼで満たし、Ｔ
４リガーゼで連結した。生成するプラスミドをＢａｎ＋
ＩＩ　Ｉ　−ＥｃｏＲＩで切断して、２．７ｋｂの大き
なフラグメントをプロキモシン遺伝子のＮ末端を含むｐ
Ｒ２６からの０．４フｋｂ　Ｏａｍｌｌ　Ｉ　　Ｅｃｏ
ＲＩ　　フラグメントと連結し、ｐｔｌｃ９　’を作っ
た。ｐＵｃ９’は、プロキモシン遺伝子のＮ末端に旧ｎ
ｄＩ１１部位を含む、ｐＵｃ１３をＢａｍ１ｌ　Ｉ　−
Ｍａｒ　！　　で切断して、Ｍａｒ　Ｉ　　Ｘａａｉ　
１と大きなそれぞれの小型フラグメントをプロキモシン
遺伝子のＣ末端を含むｐＲ２６の０．６４ｋｂ　Ｘｍａ
　Ｉ　　Ｂｃｌ　Ｉフラグメントと連結して、プラスミ
ドｐＵｃ１３　’を得た。　ｐＵｃ１３’は、プロキモ
シン遺伝子のＣ末端にＸｂａ　１部位を含む、ｐＵｃ１
３’の０．６５ｋｂ　Ｘｍａ　ｌ　−Ｘｂａ　１フラグ
メントを、ｐＵｃ９　’の０．４８ｋｂ　Ｈｉｎｄｌｌ
ｌ−Ｘｍａｌおよびｐ２８５の１１　ｋｂ　Ｘｂａ　ｒ
−Ｈｉｎｄｌｌｌフラグメントと連結して、第３図に示
されるようにプロキモシン遺伝子を含むプラスミドｐ２
８５　’ｐｒｏＣを生成させた。
Ｚ乙 じゃがいも澱粉上で成長させた＾、　ｏｒｙｚａｅ　１
ｗ３２５から、Ｋａｐｌａｎらの方法（Ｂｉｏｃｈｅｍ
、　Ｊ、　、第１８３巻、（１９〕９年）、１８１〜１
８４頁）によって、ｍＲＮＡを調製した。　ＴＡＫＡ−
アミラーゼ遺伝子の１０５０ｂｐを含む部分ＣＤＮＡク
ローンを、ｖｎＲＮＡをＴ＾に＾−アミラーゼにおける
アミノ酸２９５〜２９９についての暗号化配列に相補的
な４−マー・オリゴヌクレオチド混合物 で特異的に感作することによって得た（　Ｔｏｄａら、
Ｐｒｏｃ、　Ｊａｐａｎ　Ａｃａｄ、　、第５８巻、シ
リーズＢ１（１９８２年）、２０８〜２１２頁）、クロ
ーニング法は、Ｇｕｂｌｅｒ　＆　Ｈｏｆｆｍａｎｎ、
　Ｇｅｎｅ、第２５巻、（１９８３年）、２６３〜２６
９頁記載の方法に準じた。ｃＤＮＡクローンの両端およ
び中央手での配列は、ＴＡＫＡ−アミラーゼのアミノ酸
配列に対応する配列が存在することを示した。
ツムクローンの 醇」ｎ１週１１ｗ　３２５からの菌糸を収穫して、Ｈｏ
ｅ　Ｉらの上記文献に記載のしｉ１虹−について用いた
方法に従ってＤＮＡを調製するために加工した。
５ａｕ３＾で部分消化することによって生成した３〜１
０ｋｂの制限フラグメントを、ＢａｍＨＩで消化して、
脱リン酸化したｐＢＲ３２２と連結した（Ｎｅｗ　Ｅｎ
ｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）、　５０，０００個の組換
体をオリゴヌクレオチド１０−ブＮ０Ｒ−１６８（上記
）でスクリーニングして、７個がＴＡＫＡ−アミラーゼ
を暗号化するＤＮＡを含むことを見出した。一つのクロ
ーンをｍＲＮＡｒＭ始２．１　ｋｂ上流を有するプロモ
ーター領域を更に使用するのに選択した。プラスミドｐ
ＴＡＫ＾１７についての制限マツプを第２図に示す、　
Ｅ、　ｃｏｌｉ株に移したｐＴ八に＾１７を１９８７年
２月２３日にＤｅｕｔｓｃｈｅＳａｓｍｌｕｎｇ　　ｖ
ｏｎ　　Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ（口ＳＮ）、
（：ｒｉｅｓｅｂａｃｈｓｔｒａｓｓｅ　８．　Ｄ−３
４００，Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎに寄託され、受託番号Ｄ
Ｓ８４０１２を与えられた。ＤＳＭは１９フフ年のブダ
ペスト条約で認定された国際寄託当局であり、上記の条
約のそれぞれ第９規則および第１１規則に従って、公衆
による寄託および入手の永続性を付与している＊　　　
、、ｉｉヶ。
火１劃［Σ 暖 真菌類Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ　ｍ１ｅｈｅｉ（この菌種
の形態学的および系統学的説明については、５ｈｉｐｐ
６ｒ、　７４．＾。
＾１、　Ｏｎ　　ｔｂｅ　　ｇｅｎｅｒａ　　Ｒｈｉｚ
ｏｍｕｃｏｒ　　ａｎｄ’　Ｐａｒａｓｉｔｅｌｌａ。
５ｔｕｄｉｅｓ　ｉｎ　ｍｙｃｏｌｏｇｙ、　Ｉｎ５ｔ
ｉｔｕｔｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ＲｏｙａｌＮｅｔｈｅｒｌ
ａｎｄｓ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｒ　５ｃｉｅｎｃｅ　ａ
ｎｄ　Ｌｅｔｔｅｒｓ。
第１７号（１９７８年）、５３〜７１頁を参照されたい
）はチーズ製造におけるミルクの凝固に広く用いられて
いる酸プロテイナーゼ（Ｒｈｉｚｏａ＋ｕｃｏｒ　ｍ１
ｅｈｅｉプロテイナーゼ、以下ＲＭＰと省略する）を分
泌する。
Ｅ、　ｃｏｌｉにおいてこのタンパクのｃＤＮＡ組換え
クローンを得るために、全ＲＮＡをＨｏｅ　ｌら（ＥＭ
ＢＯＪｏ、第３巻、１０９７〜１１０２頁、１９８４年
）およびＣｈｉｒｇｗｉｎら（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ（Ｗａｓｈ、）、第１８巻、５２９４〜５２９９．１
９７９年）の方法によってホモゲナイズしたＲ、　ｍ１
ｅｈｅｉ　ｍｙｃｅｌｉｕａから抽出した。ポリ（Ａ）
含有ＲＮＡを、＾ｖｉｖとＬｅｄｅｒ　（ＰＮＡＳ、υ
Ｓ＾、第６９巻、１４０８〜１４１２頁、１９７２年）
によって報告されたオリゴ（ｄＴ）−セルロース上で親
和クロマトグラフィーを２サイクル行うことによって得
な。
オリゴ（ｄＴ）で感作した相補性ＤＮＡを合成して、Ｇ
ｕｂｌｅｒとＨｏｆｆｍａｎ（Ｇｅｎｅ、第２５巻、２
８３〜２６９頁、１９８３年）が報告した方法に従って
二重鎖とした。
二重鎖を、Ｒｏｙｃｈｏｕｄｈｕｒｙら（Ｎｕｃｌｅｉ
ｅ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、第３巻、１０１〜１０６頁、
１９７６年）によって報告された方法によって、ｄＣＴ
Ｐおよび末端デオキシヌクレオチジル・トランスフェラ
ーゼと連結した。
プラスミドｐＢＲ３２７をＰｓｔ　ｌで線形化して、ｄ
ＧＴＰと連結した。オリゴ（ｄＣ）を連結したｄｓｃＤ
ＮＡを、Ｐｅａｃｏｃｋらが記載した方法（Ｂｉｏｃｈ
ｉｍ。
８ｉｏｐｈｙｓ、＾ｅｔａ、第６５５巻、２４３〜２５
０頁、１９８１年）によってこのオリゴ（ｄＧ）を連結
したベクターにアニーリングして、Ｅ、　ｃｏｌｉ　Ｈ
Ｃｌ００ＯのｈｓｄＲ−、Ｍ”誘導体（Ｃａｓａｄａｂ
ａｎとＣｏｈｅｎ、　Ｊ、　Ｍｏｌ；　ｎ１ｏ１．　、
第１３８巻、１７９〜２０７頁、　１９８０年）を形質
転換して組換えクローンを生成させるのに用いた。
ＦｔＭＰ、　　　　ｆ　　　ＤＮＡ　　　　　の１１６
個のヘプタデカマー・オリゴデオキシリボヌクレオチド の混合物であって、その一つがＴｙｒ４ｙｒ−Ｐｈｅ−
Ｔｒｐ−＾ｓｐ−＾！ａを暗号化する領域においてＲＭ
Ｐ＃ＲＮＡに相補的であるもの（［ＩｅｃｈとＦｏｌｔ
ｍａｎｎ、　ＮｅｔｈｍｉｌｋＤａｉｒｙ　Ｊ、　、第
３５巻、２７５〜２８０頁、１９８１年）を＾ｐｐｌｉ
ｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、　Ｉｎｃ、製ＤＮＡ合成
装置上で合成し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法に
よって精製した。　Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ　５ｉｅｈｅ
ｉ　　ＣＤ　ＮＡライブラリーからの約１０，０００個
のＥ、　ｃｏｌｉ組換体をＮｈａｔｍａｎ　５４０７ｆ
’紙に移した。コロニーを、Ｇｅｒｇｅｎらが記載した
方法によってリーシスして、固定した（Ｎｕｃｌｅｉｃ
　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　、第７巻、２１１５〜２１３
５頁、１９７９年）、フィルターを、Ｂｏｅ　Ｉら（Ｅ
ＭＢＯＪ、　、第３巻、１０９７〜１１０２頁、１９８
４年）によって記載された方法によって′３２Ｐ−標識
したＲＭＰ特異的ヘプタデカマー混合物と交雑した。フ
ィルターの交雑と洗浄は４０℃で行い、次いでインテン
シファイヤー・スクリーンを用いて２４時間オートラジ
オグラフィーを行った。ミニプレプ（Ｍｉｎｉｐｒｅｐ
）プラスミドＤＮＡは、標準的な方法（Ｂｉｒｎｂｏｉ
ｍとＤｏｌｙ、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、
　、第７巻、１５１３〜１５２３頁、１９７９年）によ
って交雑するコロニーから単離し、ＣＤＮＡインサート
のＤＮＡ配列をＭａｘａ−とＧ１１ｂｅｒｔの方法（Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ　Ｅｏｚｙｍ＠１．　、第６５巻、４９９
〜５６０頁、１９８０年）によって確立した。
ｐＲＭＰ１０１６は、ｍＲＮＡの５′未翻訳末端の部分
を含み、次いで６９個の酸の長いプレプロ領域と３００
個のアミノ酸をＰＭＲタンパクの成熟部分に暗号化する
領域中に伸びていることを示した。
ｐＲＮＰ１０１６はＲＭＰ　ｍＲＮＡの完全な３′末端
に対応するインサートを含まなかったので、ｃＤＮＡラ
イブラリーをクローンｐＲＭＰ１０１６からの３２ｐニ
ツクが翻訳された３′特異的制限フラグメントで再度ス
クリーニングすることによって、クローンｐＲＭＰ２９
３１を単離しな、このクローンは３′未翻訳領域の部分
とＲＭＰタンパクのカルボキシ末端部分を暗号化する２
７０個のトリプレットを有する開放読み込み枠を含む、
それ故、ｐＲＭＰ１０１６およびｐＲＭＰ２９３１は著
しくオーバーラッグしており、２個のクローンの結合し
た配列は、Ｒ，ｍ１ｅｈｅｉプレプロＲＭＰ　　ＣＤＮ
Ａの配列を与える。１４１６個のヌクレオチドの総ては
、ｃＤＮＡクローニング法から生成するＧ：Ｃテイルの
間に配列した。確立したＤＮＡ配列を第４ａおよびｂ図
に、ＲＭＰへの前駆体の推定アミノ酸配列と共に示す、
第４ａおよびｂ図では、水平線はｃＤＮＡライブラリー
のスクリーニングに用いた合成オリゴ混合物の位置を示
している。矢印は、元のＲＭＰの成熟において加工が起
こる位置を示している。ヌクレオチドは開始Ｍｅｔコド
ンにおける第一の塩基から番号を付け、アミノ酸は成熟
ＲＭＰにおける第一の残基から番号を付けている。この
ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ配列から、ＲＭＰは６９個のアミノ酸の
プロペプチドで４３０個のアミノ酸の長い前駆体として
合成されると結論することができる。この前駆体におけ
る推定上のシグナルペプチダーゼ加工部位（ｖｏｎ　Ｈ
ｅ１ｊｎｅ、Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｓ、　、第
１３３巻、１７〜２１頁、１９８３年）は、＾Ｉａ（−
４８）および＾ｒｇ（−４７＞の間にあると考えられ、
成熟ＲＭＰはＧｌｕ−１および＾Ｊａ（＋１）の間での
自動タンパク分解性開裂によって生成する。ＲＭＰのｃ
　Ｄ　Ｎ　Ａで推定したアミノ酸配列は、以前報告され
た部分的アミノ酸配列（Ｂｅｃｈとｆｏｌｔｍａｎｎ、
Ｎｅｔｈ−Ｍｉｌｋ　Ｄａｉｒｙ　Ｊ、　、第３５巻、
２７５〜２８０頁、１９８１年）と良好に一致している
。
ＲＭＰｃＤＮＡを用いて更に構成作業を促進するため、
次のようにしてクローンｐＲＭＰ２９３１において同定
されたＴＡＡ停止コドンに対して３′のＲａｎ　１部位
に旧ｎｄｌｌｌリンカ−を挿入した。すなわち、２５　
ｕ　ｇ　ｐＲＭＰ２９３１をＰｓｔｌで消化してＲＭＰ
ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａを得た。このインサートを１％アガロー
スゲル電気泳動法で精製し、ゲルから電気溶出し、フェ
ノールおよびクロロホルム抽出によって精製し、ＮａＣ
ｌおよびエタノールで沈澱させた。ＲＭＰの３′半分を
暗号化するこのフラグメントをＢａｎ１で消化し、Ｒａ
ｎ　Ｉ付着ＩＩＪ限部位末端を４個のｄＮＴＰとＥ、　
ｃｏｌｉ　ＤＮＡポリメラーゼのＫｌｅｎｏｗフラグメ
ントとの混合物で満たした。これらの満たした末端に７
４−ＤＮＡリガーゼ反応においてＨｉｎｄｌｌ［リンカ
−を加えた。連結反応混合物をフェノールとクロロホル
ムで抽出して、ＤＮＡを４Ｍ酢酸アンモニウム／エタノ
ールで沈澱させた。
精製したＤＮＡを過剰量・の旧ｎｄｌｌＩ酵素で消化し
て、３８０ｂｐフラグメントを６％ポリアクリルアミド
ゲル上で精製した。ＲＭＰ開放読取り枠の３′末端とＴ
ＡＡ停止コドンを含むこのフラグメントを、旧ｎｄｌｌ
ｌで消化してアルカリ性ホスファターゼで処理したｐｌ
ｃ１９Ｒに連結した。この連結混合物を用いて競合する
Ｅ、　ｃｏｌｉ細胞を形質転換し、形質転換体をアンピ
シリン含有観点プレート上で選択した。プラスミドＤＮ
Ａを形質転換体から精製し、正確な組換体を制限エンド
ヌクレアーゼ消化とアガロースゲル電気泳動法によって
同定した。
かかる正確な組換体、ｐＲＭＰ３　’から、２１０ｂｐ
　８ｇｌｌｌ／ｌ１ｉｎｄｌｆｌフラグメントを６％ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動法によって単離した。こ
のフラグメントはアミノ酸２９７〜２９９でｎｇｌ１１
部位からのＲＭＰ　　ｃＤＮＡの３′末端を含み、ＴＡ
Ａ停止コドン中を通って、挿入された１ｌｉｎｄｌｌｌ
　リンカ−まで伸びている。
ＲＭＰ　　ｃＤＮＡの５′部分は、１％アガロースゲル
電気泳動法によって９９７ｂｐ　Ｈｉｎｄｌｌｌ／Ｂｇ
ｌｌＩとしてｐＲＭＰから単離し、た、Ｈｉｎｄｌ１１
部位は、プロセグメントにおいて残基−３６，−３５に
対応する位置においてＲＭＰ−ＤＮＡ中に配置されてい
る。　　９９７ｂｃ＋５　’フラグメントを旧ｎｄｌｌ
ｌで消化してホスファターゼ処理したｐｌｃ１９Ｒ中で
２１０ｂｐ　３　’フラグメントに連結した。この連結
混合物を用いて、組換体をＥ、　ｃｏｌｉから得て、３
′部分に結合したＲＭＰの５′部分を有する正確なプラ
スミドｐＲＭＰは制限ｒ＃素分析によって同定した。
ｐＲＭＰの構成を第５図に示す。ｐＲＭＰ！、ｔＲＭＰ
ブレ領域およびプロセグメントの５′半分を暗号化しな
い。
実施例４ この実施例では、プラスミドをグルコアミラーゼプロモ
ーター、シグナルおよびターミネータ−配列の制御下に
ＲＭＰを発現するように設計して構成した。グルコアミ
ラーゼプロモーターおよびターミネータ−配列をベクタ
ーｐｃＡＭ（：９１でクローン化したグルコアミラーゼ
ゲノム遺伝子から誘導した。ｐｃＡＭＧ９１の構成はＢ
ｏｅ　Ｉら（ＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ、第３巻、１９８
４年、１５８１〜１５８５頁）によって報告されており
、プラスミドｐｃＡＭＧ９１のエンドヌクレアーゼ制限
マツプは第６図に示す。
ｐＣＡＭ（：９１を５（ＩＩＩおよびＰｓｔｌ制限エン
ドヌク・レアーゼで消化した。上記消化物がら、アガロ
ースゲル上で６９８ｂρフラグメントを単顛しな。この
Ｓａｌ　Ｉ　　Ｐｓｔ　Ｉフラグメントはグルコアミラ
ーゼｙｎＲＮＡの１４０ｂｐ３’未翻訳部分を暗号化す
る領域を含む。この３′フラグメントはＴ４−ＤＮＡポ
リメラーゼで処理して、Ｘｂａ　Ｉリンカ−の添加およ
びＸｂａ　Ｉ制限酵素での消化の前に制限部位を「プラ
ント・エンド」させた、このグルコアミラーゼ遺伝子の
３′末端をＸｂａ　■で線形ｆヒしたｐＵｃ１３に連結
してグルコアミラーゼ遺伝子ポリ（Ａ）付加領域を含む
プラスミドｐＡＭＧ　／　Ｔｅｒｍを生成させた。
ｐＡＭＧ　／　Ｔｅｒ論の構成は、第７ａ図に示す。
＾、　ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼ遺伝子の３′末端は
、１）ＡＭに　／　Ｔｅｒｍからの７００ｂｐ　Ｘｂａ
　Ｉフラグメントとして得た。このターミネータ−フラ
グメントを、Ｘｂａ　ｌで消化してホスファターゼ処理
したｐｌＲ１９Ｒに連結した。この連結混合物を用いて
、Ｅ、　ｃｏｌｉから組換体が得られ、正確なプラスミ
ドｐ、ＩＣＡＭＧ／Ｔｅｒｍであってｐｌｃ１９Ｒの多
重クローニング部位の１ｌｉｎｄｌｌｌ部位に面するタ
ーミネータ−フラグメントの５′末端を有するものは制
限酵素分析によって同定した。ｐｒｃＡＭＧ／　Ｔｅｒ
蹟の構成を、第７２１図に示す、　ｐｌｃＡＭＧ／　Ｔ
ｅｒｍから、グルコアミラーゼターミネータ−（ＡＭＧ
ターミネータ−）領域を１％アガロースゲル電気泳動法
によって７５０ｂｐ　ＨｉｎｄＩ［／Ｃ１ａｌ制限フラ
グメントとして単離しな。
ｐｃＡＭ（：９１から、グルコアミラーゼプロモーター
（ＡＭＧプロモーター）を、グルコアミラーゼシグナル
ペプチドを暗号化する領域、ヘキサペプチド−プロセグ
メントおよび３．５　ｋｂ　Ｃｌａ　Ｉ　／　Ｂｓ５ｌ
ｌｌｌフラグメントとしてのｐＢＲ３２２アンピシリン
耐性遺伝子（＾ｍｐ）と共に、１％アガロースゲル電気
泳動法によって単離した０合成り５ｓｌＩＩＩ／旧ｎｄ
ｌＩＩ　リンカ−は、＾ｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔ
ｅｍｓ　Ｉｎｃ、製ＤＮＡ合成装置上で合成した２種類
の合成３１７−・オリゴヌクレオチドから調製した０合
成リンカーは下記の構造を有する。
ＲＶＳＫＱＳＥＳＫＤ ＣＧＣＧＴ＾＾ＧＴ＾＾ＧＣＡにＡＧＣＧＡＧＡにＣ＾
＾Ｇ（：ＡＴ八　　。
＾ＴＴＣＡＴＴＣＧＴＣＴＣＧＣＴＣＴＣＧＴＴＣＣＴ
ＡＴＴＣＧ＾このリンカ−を、３．５ｋｂグルコアミラ
ーゼプロモーターを含むフラグメントおよび７５０ｂｐ
グルコアミラーゼターミネータ−を含むフラグメントと
の連結反応に用いた。連結混合物を用いてＥ、　ｃｏｌ
ｉを形質転換して、正確な組換体、ｐ６７３は制限エン
ドヌクレアーゼ消化によって同定した。単離したｐ６７
３は１Ｉｉｎｄ［ＩＩクローニングベクターであり、こ
の中に適当なｌ１ｉｎｄｌｌｌ　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａフラグ
メントをグルコアミラーゼへキサペプチドプロセグメン
トおよびグルコアミラーゼ転写ターミネータ−領域の間
に挿入することができる。挿入したＣＤＮＡはグルコア
ミラーゼプロモーターによって転写制御され、翻訳され
た融合生成物の分泌はグルコアミラーゼシグナルペプチ
ドとグルコアミラーゼへキサペプチドプロセグメントと
によって指示される。
ｐ６７３をｌｌ１ｎｄＩＩＩで消化して、アルカリ性ホ
スファターゼで処理して、ｐＲＭＰの消化物から精製し
た１、２ｋｂｌｌｉｎｄｌｌＩと連結した。
連結混合物を用いてＥ、　ｃｏｌｉを形質転換し、ＲＭ
Ｐを発現させるために正確な位置に挿入されたＲＭＰｃ
ＤＮＡを有する組換体ｐ６８６は制限エンドヌクレアー
ゼ消化によって単離されて特徴化された。　ｐ６８８は
以下の構造：グルコアミラーゼシグナルペプチド、グル
コアミラーゼへキサプロペプチド、ＲＭＰからのプロペ
プチドのアミノ酸−４５から−１、成熟ＲＭＰの３６１
個のアミノ酸を有するＲＭＰ前駆体を暗号化する。ｐ６
８６の構成を、第７ｂ図に示す。
夾１匠ｉ　・ 本発明の好ましい態様では、プレプロＲＭＰの開放読取
り枠を、＾、　ｎｉｇｅｒからのグルコアミラーゼ遺伝
子または＾、　０ｒｙ２ａｅからのＴＡＫ＾−アミラー
ゼ遺伝子からのプロモーターの制御下において発現プラ
スミドに挿入すべきである。これを行うために、Ｂａｍ
ＨＩ制限エンドヌクレアーゼ部位を、次の工程によって
プレプロＲＭＰのシグナルペプチドの開始メチオニンコ
ドンの５′に挿入した。
ｐＲＭＰ１０１６を、ＣＤＮＡにおいてアミノ酸残基５
ｅｒ（−６６）およびＧｌｎ（−６５）に対応する位置
で切断するＤｄｅ　Ｉと、ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａにおいてアミ
ノ酸残基Ｌｙｓ（−３６）およびＬｅｕ　（−３５）に
対応する位置で切断するＩＩ　ｉ　ｎ　ｄ　Ｉ　Ｉ　Ｉ
で消化した。精製する８９ｂｐＤｄｅｌ／１１ｉｎｄｌ
ｌｌフラグメントを８％ポリアクリルアミドゲル上で精
製し、フェノールおよびクロロホルム抽出の後電気溶出
し、エタノール沈澱した。以下の配列を有する合成りＮ
Ａフラグメントは、アプライドバイオシステム社製製Ｄ
ＮＡ合成装置上で２個のオリゴヌクレオチドとして合成
した。
ＬＦＳ （：ＡＴＣＣＡＣＣＡＴＧＣＴＧＴＴＣＴＣオリゴ６９
７／６９８（：ＴＧ（：ＴＡＣＧＡＣ＾＾ＧＧ＾＾ＧＴ
このフラグメントは、開始Ｎｅｔ−コドンに対してＢａ
ｍ１ｌ　Ｉ付着末端５′および３′末端にＤｄｅ　Ｉ　
　付着末端を有する。これら２個のオリゴヌクレオチド
は、ＡＴＰおよびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼでキナ
ーゼ化し、互いにアニーリングして、次いでＢａｍ１ｌ
　Ｉ　／　Ｈｉｉｄｌ　ＩＩで消化したｐＵｃ１３ベク
ター中でｐＲＭＰ１０１６から精製した８　９　ｂｐ　
Ｄｄｅｌ／）ｌｉｎｄｌｌｌＲＭＰフラグメントに連結
した。連結混合物を用いて、Ｅ、　ｃｏｌｉ細胞を形質
転換し、正確な組換え体をミニブレプ精製プラスミド上
で制限酵素消化によって同定しな、正確な組換えプラス
ミドを配列して、使用したオリゴヌクレオチドの配列を
証明した。かかる正確なプラスミドｐＲＭＰ５　’を［
ｌａｍｌｌ　（およびｌｌ１ｎｄｌｌＩで消化して、開
始Ｎｅｔコドン、ＲＭＰシグナルペプチドおよびＲＭＰ
プロセグメントの部分を有する１１０ｂｐ　ＢａｍＪＩ
　Ｉ　／　１ｌｉｎｄｌｌｌフラグメント１０％ポリア
クリルアミドゲル電気泳動法によって精製した。このフ
ラグメントを電気溶出し、フェノールおよびクロロポル
ム抽出し、エタノールで沈澱した。ＲＭＰ開放読み込み
枠の残りおよびＡＭＧターミネータ−配列をＥｃｏＲＩ
で消化し、Ｈｉｎｄ口ｌで部分消イヒした後プラスミド
ｐ６８６から得た。これによって、１．９ｋｂフラグメ
ントを放出し、このフラグメントをアガロースゲル電気
泳動法、電気溶出フェノールおよびクロロホルム抽出の
後、エタノールで沈澱させた。この１．９ｋｂフラグメ
ントを、Ｂａ５ａｌ　ｌおよびＥｃｏＲＩで消化したｐ
Ｕｃ１３ベクター中でｐＲ８５’からの１１０ｂｐ　Ｂ
ａｓ＋ＨＩ　／Ｈｉｎｄｌｌｌに連結した。
この連結混合物を用いて、Ｅ、　ｃｏｌｉ細胞を形質転
換し、正確な組換え体をミニプレプ精製プラスミド上で
制限酵素消化によって同定した。かかる正確な組換体は
、ｐＲＭＰＡＭＧＴｅｒｍであった。
ｐＲＭＰＡＭＧＴｅｒ−の構成を第８図に示す。
１暖 グルコアミラーゼプロモーターを以下のようにして単°
離した。２５μｇのｐｃＡＭＧ９１をＥｃｏＲＩおよび
Ｂｓ５ｌｌＩＩ制限エンドヌクレアーゼで消化した。こ
の二重消化の後、２７０ｂｐ　Ｄ　Ｎ　Ａ　フラグメン
トをアガロースゲル電気泳動法によって単離することが
できな、このフラグメントは、プロモーター領域の一部
分、５′未翻訳領域およびグルコアミラーゼ遺伝子（Ａ
　Ｍ　Ｃ遺伝子）のシグナルペプチドをカバーする。ア
ガロースゲルからＤＮＡを電気溶出した後、フラグメン
トをフェノールおよびクロロホルム抽出し、次いでエタ
ノール沈澱することによって精製した０次いで、２７０
ｂｐの長いフラグメントを５ｆａＨｌで消化した。この
酵素は、グルコアミラーゼ遺伝子の開始ＡＴＧメチオニ
ンコドンに対して５′に開裂部位を有する。完全に消化
した後、ＤＮＡをＤＮＡポリメラーゼＩの大きなフラグ
メント（Ｋｌｅｎｏｗ）および４個のｄＮＴＰ総てで処
理して、ＤＮＡ上にプラントエンドを生成させた。この
ＤＮＡに、ＤＮＡリガーゼを有するＢｇ目■リンカ−を
加えて、ＤＮＡを８ｇｌｌｌ制限酵素の過剰量で消化し
た。１０％ポリアクリルアミドゲル上でＤＮＡフラグメ
ントを分離した後、１７５ｂｐＢｇｌｌｌフラグメント
を電気溶出によって単離することができた。このフラグ
メントは、開始メチオニンコドンに対して５′の５ｆａ
ＮＩ制限部位に対応する位置に挿入されたＢｇｌｌ［リ
ンカ−を有する。
このＤＮＡ切片をＢｇｌｌｌで消化したアルカリホスフ
ァターゼ処理したｐｌｃ１９Ｒベクターに連結して、こ
の連結混合物を用いてＥ、　ｃｏｌｉ細胞を形質転換し
た。生成する形質転換体の中で、正確なプラスミドをミ
ニプレラプラスミド上で制限酵素消化することによって
同定した。かかる正確なプラスミドｐＢ４０４．１をＮ
ｓｉ　ＩおよびＢｇｌｌｌで消化して、グルコアミラー
ゼ遺伝子の５′未翻訳領域をプロモーター領域の３′部
分の約ｔｏｏｂ、と共に含む０．１６ｂｐフラグメント
を放出した。このフラグメントを、ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動法、電気溶出、フェノールおよびクロロホ
ルム抽出およびエタノール沈澱によって精製した。この
フラグメントをｐｃＡＭＧ９１からのグルコアミラーゼ
プロモーター領域の残りの部分に結合させるため、以下
の工程を行った。２５μｇのｐｃＡＭＧ９１をＢｓ５ｌ
ｌｌｌで消化した後、更にＮｄｅ　Ｉで部分的に消化し
た。フラグメント末端を４個総てのｄＮＴＰおよびＤＮ
ＡポリメラーゼのにＩｅｎｏｗフラグメントで満たした
後、１．４ｋｂＤＮＡフラグメントを１％アガロースゲ
ル上で単離した。このフラグメントは、総てのプロモー
ター領域を５′未翻訳領域およびシグナルペプチド暗号
化領域と共に含んでいた。このフラグメントを電気溶出
、フェノールおよびクロロホルム抽出およびエタノール
沈澱によって、Ｄ　Ｎ　Ａ　’ｘ　濃ｔｌａした。Ｎ５
ｉｌで消化した後、ＤＮＡを１％アガロースゲル上で流
して、１．２ｋｂ　Ｎｄｅ　Ｉ　−Ｎｓｉ　Ｉ　　フラ
グメントを電気溶出によって単離した。このＤＮＡは上
記反応でＮｄｅ　１部位にフラントエンドを生じ、これ
をＮｒｕ　Ｉ−Ｂｇｌｌｌで消化したｐｌｃ１９Ｒベク
ター中でのｐ８４０１．１からの０．１６ｋｂ　Ｎｓｉ
　Ｉ　−８ｇｌｌｌフラグメントに連結させた。連結混
合物を用いて、Ｌ」剥ユ＃ｌＩ砲を形質転換し、精製す
る形質転換体の中から、正確な組換体をミニプレブプラ
スミドの制限酵素消化によって同定した。上記の正確な
組換体、ｐＤ４０８．３を旧ｎｄｌｌｌおよびＢｇｌｌ
ｌで消化して、グルコアミラーゼ（ＡＭＧ’）プロモー
ターを１％アガロースゲル上で１．４ｋｂフラグメント
として単離した。このフラグメントを電気溶出、フェノ
ールおよびクロロホルム抽出およびエタノール沈澱した
。このグルコアミラーゼプロモーターフラグメントを次
に、ｌ１ｉｎｄｌｌｌ　−ＥｃｏＲＩで消化したｐｔｌ
ｃ１９ベクター中のｐＲＭＰＡＭＧＴｅｒｍからの２．
　ＯＢａｍ＋ｌｆ　Ｉ　　ＥｃｏＲＩフラグメントに連
結した。連結混合物を用いて、Ｅ、　ｃｏｌｉ細胞を形
質転換し、精製する形質転換体の中から、正確な組換体
をミニプレププラスミドの制限酵素消化によって同定し
た。上記の正確な組換体の一つｐ７７８を大規模に成長
させて、組換えプラスミドを単離して、プラスミド調製
物をＣｓＣＩ／臭化エチジウム遠心分離によって精製し
た。このプラスミドをグルコアミラーゼプロモーターお
よびターミネータ−配列の制御下においてＲＭＰの合成
を指示する。　９４０８．３の構成を第９ａ図に示し、
ｐ７７８の構成を第９ｂ図に示す、以下余白実１し［ ＾ｓ　ｅｒ　１ｌｌｕｓ　ｏｒ　ｚａｅ　Ｔ＾に＾−ア
ミラーゼプロモーターによる活性ＲＭＰを分泌させるよ
うに設計された唇匹」」１徂発現ベクターの構成 唇匹」土」岨」ｎμ咀ＴＡＫ＾−アミラーゼゲノム遺伝
子を含むプラスミドｐＴＡＫ＾１７（実施例２を参照さ
れたい）５０μｇを５ａｌｌで消化した。この酵素は、
成熟Ｔ＾に＾−アミラーゼのアミノ酸残基２６に対応す
る位置においてゲノムＤＮＡでの制限部位を有する。も
う一つの５ａｌｔ制限部位はこの位置に対して約１３０
０個のヌクレオチドだけ上流の、上流プロモーター領域
の５′末端に配設される。
５ａｌｌ　　消化の後、この１３００ｂｐプロモーター
を含むフラグメントをアガロースゲル電気泳動法によっ
て精製し、ＤＮＡをフェノールおよびクロロホルム抽出
およびエタノール沈澱によって精製した。
次いで、ＤＮＡをエクソヌクレアーゼＩＩＩ　榎ｆａｒ
液中に溶解して、Ｈｅｎ１ｋｏｆｆ　、Ｓ、　（Ｇｅｎ
ｅ、第２８巻、３５１〜３５９頁、１９８４年）の方法
に従ってエクソヌクレアーゼＩＩＩで消化した６反応を
停止して、それぞれのＤＮＡ末端において約１３０ｂｐ
の欠失を得な。
この方法ではＴＡＫ＾−アミラーゼ遺伝子の暗号か領域
の５ａｌｌ部位からの約１３０ｂ、の欠失は、開始メチ
オニンコドンの上流に多重クローニング部位リンカ−を
導入する機会を生じる。エクソヌクレアーゼＩＩＩで処
理したＤＮＡを、ｌ１ｅｎｉｋｏｆｆ　、Ｓ、（Ｇｅｎ
ｅ、第２８巻、３５１〜３５９頁、１９８４年）の方法
に従って８１ヌクレア一ゼｍで消化し、フェノールおよ
びクロロホルムで抽出した後エタノールで沈澱した。Ｓ
１ヌクレアーゼで処理したＤＮＡを補修して連結可能な
プラントエンドを得ることは、Ｈｅｎ１ｋｏｆｆ　、Ｓ
、（Ｇｅｎｅ、第２８巻、３５１〜３５９頁、１９８４
年）の方法に従って、４個のｄＮＴＰ総てとＤＮＡポリ
メラーゼＩのＫｌｅｎｏｗフラグメントを用いて行った
。ＤＮＡをＥｃｏＲｌで消化して、１３００ｂ。
５ａｌｌ　　フラグメントで切断して、２群のフラグメ
ントを生成した。一つの群は約３８０ｂｐの長さであり
、照温領域を表わしたが、他の群は６２０ｂ、の長さで
あり、プロモーター領域を含んでいた。
ＥｃｏＲＩ消化生成物のこれらの群をアガロースゲル上
で分離して、約６２０ｂｐの長さのＤＮＡフラグメント
を電気溶出して、ＥｃｏＲＩ　／　Ｓａｇａ　Ｉ　　で
消化したｐＵｃ１９ベクターに連結した。連結混合物を
用いて、競合するＥ、　ｃｏｌｉ細胞を形質転換し１組
換体から、ミニプレププラスミドＤＮＡを単離した。こ
れらの欠失変異株を制限酵素消化によって特徴化して、
開始メチオニンコドンに対して５′の欠失末端を有する
プラスミドを同定した。所望な特徴を有する数個の候補
を配列させ、ＡＴＧ−メチオニンコドンにおけるＡに対
して９ｂｐを欠失した５′を有する変異株（ｐ９）を選
択して、更に構成した。ｐ９をＥｃｏＲＩおよびｌ１ｉ
ｎｄｌｌｌで消化して、フラグメントを含む６４５ｂｐ
　ＴＡＫ＾−アミラーゼプロモーターをアガロースゲル
電気泳動法、フェノールおよびクロロホルム抽出および
エタノールでの沈澱によって単離した。　ｐＴＡＫ＾１
７を５ａｌｌおよびＥｃｏＲｌで消化して、Ｔ八に＾−
アミラーゼプロモーター上流領域を含む５１０ｂｐフラ
グメントを、アガロースゲル電気泳動法、フェノールお
よびクロロホルム抽出およびエタノールでの沈澱によっ
て単離した。これらの２個のプロモーター領域を互いに
連結させ、且つ５ａｉｌおよび旧ｎｄｌｌｌｐで消化し
たＩＣ１９Ｒベクターに連結させた。連結混合物を用い
て、Ｅ、　ｃｏ■細胞を形質転換し、正確な組換体を、
ミニプレプとして抽出されたプラスミドを制限酵素で消
化することによって同定した。かかる組換体の一つｐ７
１９では、＾ｓ　ｅｒ　１ｌｌｕｓ　ｏｒ　ｚａｅから
のＴＡＫ＾−アミラーゼプロモーターフラグメントは、
多数の各種制限酵素消化液によって削除することができ
る１、１ｋｂの移動可能なフラグメントとして見出され
ている。　ｐ７１９の構成を第１０図に示す。
ｐＲＭＰＡＭＧＴｅｒｍから、プレプロＲＭＰ開放読取
り枠およびグルコアミラーゼターミネータ−領域（八Ｍ
ＧＴｅｒｍ　）を、Ｂａｍ１ｌｌおよびＥｃｏＲＩで消
化した後２ｋｂフラグメントとして単離した。このフラ
グメントを、アガロースゲル電気泳動法、次いでフェノ
ールおよびクロロホルム抽出およびエタノールでの沈澱
によって精製した。Ａ、　象ｎｌ咀からのＴＡＫ＾−ア
ミラーゼからのプロモーターを、ｐ７１９を５ａｌｌお
よびＢａｍ１ｌ　Ｉで消化した後に得られる１、１ｋｂ
フラグメントとして単離した。このフラグメントを、ア
ガロースゲル電気泳動法、フェノールおよびクロロホル
ム抽出、次いでエタノールでの沈澱によって精製した。
１．１ｋｂプロモーターフラグメントを５ａｌｌおよび
ＥｃｏＲ［で消化したｐＵｃ１９ベクターにおいてｐＲ
ＭＰＡＭＧＴｅｒｍからの２　ｋｂ　Ｂａ＋ｓＨＩ　／
ＥｃｏＲＩフラグメントに連結した。連結混合物を用い
て、Ｅ、　ｃｏｌｉ細胞を形質転換し、精製する組換体
から、正確な組換体を、ミニプレプブラスミドを制限酵
素で消化することによって同定した。かかる正確な組換
体の一つｐ７７７を大規模に成長させて、組換えプラス
ミドを単離し、プラスミド調製物をＣｓＣｌ　／臭化エ
チジウム遠心分離によってｔ？を製した。　ｐ７７７の
構成を第１１図に示す。
火バ匠比 唇と」±四赳」ｎμ咀ＴＡＫ＾−アミラーゼプロモータ
ーの制御下によるＲｈ１ｚｏｓ＋ｕｃｏｒ　＋ｎ１ｅｈ
ｅｉ　リパーゼを分泌させるように設計された唇鱈」」
１咀発現ベクターの構成　　　　　　以下余白 Ｅ、　ｅｏｌｉにおＧるリパーゼ　ＤＮＡクローンの特
異的オリゴヌクレオチドプローブを構成させることがで
きる情報を得るため、精製したＲｈ１ｚｏ−ｓ＋ｕｃｏ
ｒ　ｍ１ｅｈｅｉリパーゼ（Ｍｏｓｋｏｗ　ｉ　ｔｚ　
、　Ｇ　、Ｊ、ら、Ｊ。
＾ｇｒｉｃ、　Ｆｏｏｄ　ＣｈｅＩＩ＋、、第２５巻、
１９７７年、１１４６〜１１５０頁）について部分配列
を決定した。以下の説明では、ＲＭＬという略号をＲｈ
ｉｚｏｍｕｃｏｒ　ｍ１ｅｈｅｉリパーゼについて用い
た。菌糸体および低分子量物質を除去したＲｈｉｚｏｍ
ｕｃｏｒ　ｍ１ｅｈｅｉの培養液がらの上澄液を、陰イ
オン交換クロマトグラフィーに付した。カラムからの主
要な脂肪分解性分画を、凍結乾燥する前に脱塩および限
外濾過した０次いで、凍結乾燥した粉末を、親和性クロ
マトグラフィーに付した。カラムからの貯蔵したリパー
ゼ分画を脱塩して、限外濾過によって濃縮した０次いで
、この濃縮液を疎水性相互作用クロマトグラフィー（Ｈ
ＩＣ）に付して、ＨＩ　Ｃ−精製からのリパーゼを用い
てアミノ酸配列を決定した。配列の決定は、元の酵素（
Ｎ−末端配列）およびリパーゼを＾ｒｍｉｌｌａｒｉａ
　ｍｅｌｌｅａプロテアーゼを用いてタンパク分解性消
化を行った後に得られる選択されたフラグメントの両方
について行った。配列の決定は、Ｔｈ１ｓ、　Ｌ、ら、
（ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ、　１９８７年、印刷中）によっ
て報告されたのと同じ方法でＧａｓ　ＰｈａｓｅＳｅｑ
ｕｅｎｃｅｒ（＾ｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ
　Ｍｏｄｅｌ　４７０＾）で行った。
ＲＭＬを、酵素の基質に対する比率を１：４０（モル：
モル）としたことを除いてＭｏｏｄｙら（ＦＥＢＳＬｅ
ｔｔ、、第１７２巻、１９８４年、１４２〜１４８頁）
によって報告されたのと同じ＾ｒｍｉｌｌａｒｉａ　ｍ
ｅｌｌｅａプロテアーゼを用いて消化した。得られたフ
ラグメントをＩＩ　Ｐ　Ｌ　Ｃによって分離して、ＵＶ
吸収を２８０ｎｍおよび２１４ｎｍで観察した。オリゴ
ヌクレオチドプローブの構成のための好適なフラグメン
トを同定するには、これらのフラグメントはＴｒｙおよ
び／またはＴｙｒを含むので、２８０ｎｍおよび２１４
ｎｍの間で高い比率を示したペプチドのみを配列した。
以下のＮ−末端配列が、元のＲＭＬを使用することによ
って見出された。
５　　　　　　　　　　　　　ｔ。
５ｅｒ−１ｉｅ−＾５ｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−１１ｅ−＾
ｒｇ−＾１ａ−＾１ａ−丁ｈｒ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−（Ｓ
ｅｒ）−（＾Ｉａ）−。
タンパク分解性消化液から単離されたフラグメントの一
つは、配列＾ｒｇ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−１１ｅ−Ｐｒｏ−
Ｇｌｙ−へ１ａ−Ｔｈｒ−Ｔｒｙ−八５ｐ−Ｘ−１１ｅ
−１１ｉｓを有し、このフラグメントを特異的オリゴヌ
クレオチドプローブの合成に用いた。
Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ　ｍ１ｅｈｅｉからのアスパラギ
ン酸プロテイナーゼ（ＲＭＰ）組換体を単離するために
構成された実施例３からの上記生物のＣＤＮＡライブラ
リーも用いてリパーゼに特異的な組換体を同定した。オ
リゴヌクレオチドの混合物を、八〇ｐｌｉｅｄＢｉｏｓ
ｙｓｔｅｍｓ　Ｉｎｃ、製ＤＮＡ合成装置で合成した。
構造 ＾ ５　’　ＴＣＣＣＡＮ（：ＴＮＧＣＮＣＣ３’　　　４
３０／４３１を有する混合物は、アミノ酸ｃｔｙ−＾１
ａ−Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−八ｓｐを暗号化する領域において
ＲＭＬ　ｍＲＮＡに相補的であった。このペンタペプチ
ドは、精製したＲＭＬタンパクのタンパク分解性フラグ
メントから得られるアミノ酸配列のセグメントとして同
定された（上記参照）。
・Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ　ｍ１ｅｌｔｅｉ　　（Ｄ　Ｎ
　Ａライブラリーを、ＲＭＰ特異的混合物でスクリーニ
ングするのに記載した方法と同様にして３２Ｐ−キナー
ゼしたリパーゼオリゴヌクレオチド混合物でスクリーニ
ングした。交雑およびフィルターの最初の洗浄は、４３
℃で行った。オートラジオグラフィーの後、フィルター
を４７℃で洗浄した０強力な交雑を示したコロニーを単
離して、対応するプラスミドにおいて挿入されたｃ　Ｄ
　Ｎ　Ａを配列してＲＭＬ特異的組換体を同定した。が
がる２個の組換体ｐ３５３．７およびｐ３５３．１６は
、約１．２ｋｂのインサートを有した。これらの２種類
の組換体がら得られるＤＮＡ配列は、シグナルペプチド
の中央で開始し、ポリＡテイルにまで伸びている。この
領域では、長い開放読取り枠を同定できた。２個の組換
え体は、開始メチオニンコドンを有するシグナルペプチ
ドの５′部分についての配列を含まないので、合成オリ
ゴヌクレオチド（５８４） ５’　ＣＧＡＧＡＧＧ（ＣＡＴＧＡＧＧＧＩＩ；ＴＧＧ
　３’　　　５８４を合成した。このオリゴヌクレオチ
ド５８４は、ポリペプチド領域で見られるアミノ酸配列
Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−１１ｅ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−＾
ｒｇを暗号化する領域におけるＲＭＬ　ｍＲＮＡに相補
的である。オリゴ５８４をＴ４ポリヌクレオチドキナー
ゼおよび３２Ｐ−γ−ＡＴＰを用いて高い比活性にまで
キナーゼ処理した後、記載された方法（［Ｉｏｅｌ、　
Ｅ、ら、Ｉ）ＮＡＳ、　ＩＪＳ＾、第８０巻、２８６６
〜２８６９頁、１９８３年）によって、Ｒｈｉｚｏｍｕ
ｃｏｒ　ｍ１ｅｌ＋ｅｉ　　−ｍＲＮＡでのＡＭＶリバ
ース・トランスクリプターゼとのプライマー伸長反応に
用いた。プライマー伸長反応生成物を１０％ポリアクリ
ルアミド／尿素ゲル上で電気泳動して、２個のＣＤＮＡ
生成物を分割した。これらの２ｆｌｌ！ＪのｃＤＮＡ、
すなわち一つは１５０個のヌクレオチドの長さであり、
もう一方は１６０個のヌクレオチド長さのものを、両方
とも電気溶出し、ＤＮＡ配列のための化学的分解法によ
って配列した０両者のＣＤＮＡはプライマー領域から伸
びており、開始メチオニンコドンに対して位置９のヌク
レオチド５′までの読取り可能な配列を生じた。この配
列は、リパーゼ組換えＣＤＮＡプラスミドから得られた
配列であることを示した。２個のプライマー伸長ＣＤＮ
Ａ生成物の長さは、リパーゼｗＲＮＡの５′末端（ＣＡ
Ｐ一部位）が第１２図に示した第一のＡヌクレオチドに
対して約５または１５ヌクレオチド５′に配列される。
２類からのｍＲＮＡの５′末端の位置におけるマイクロ
ヘテロゲナイエティは、極めて一般的である。２個のク
ローン化したｐ３５３　、７およびｐ３５３．１６から
得られる配列をプライマー伸長分析からの配列と結合す
ることにより、ＲＭＬ前駆体のアミノ酸配列を確立する
ことができる。
ＤＮＡ配列およびＲＭＬ前駆体の対応するアミノ酸配列
を第１２図に示す、第１２図では、水平線はｃＤＮＡ合
成およびＣＤＮＡライブラリースクリーニングに用いら
れた合成オリゴの位置３示している、矢印は、元のＲＭ
Ｌの成熟において加工が起こる位置を示す、ヌクレオチ
ドは、開始Ｍｅｔコドンでの最初の塩基から番号を付け
、アミノ酸は成熟した元のＲＭＬにおける最初の残基か
ら番号を付ける。ＲＭＬを開始Ｍｅｔコドンから伸びて
いる開放読み込み枠によって暗号化し、次いで停止コド
ンに達する前に３６３コドンを通る。この前駆体では、
最初のアミノ酸残基は、典型的な疎水性シグナルペプチ
ドから成る。ｖｏｎ　Ｈｅ１ｊｎｅ　（Ｅｕｒ。
Ｊ、　［１ｉｏｃｈｅｍ、、第１１３巻、１７〜２１頁
、１９８３年）の生産側によれば、シグナルペプチドは
、それぞれ、位置−７１および−７０での＾Ｉａ−およ
びＶａｌ残基の間のシグナルペプチダーゼ開裂によって
以下のプロペプチドから開裂する。
Ｒｈｉｏｍｕｃｏｒ　ｍ１ｅｈｅｉからの培養液の上澄
みから得られる精製ＲＭＬ７）Ｎ末端アミノ酸配列分析
は活性ＲＭＬ酵素のＮ末端として５ｅｒ−１１ｅ−＾５
ｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−１１ｅ−＾ｒｇを同定したので、
ＲＭＬ前駆体の１０ペプチドは前駆体における次の７０
個のアミノ酸残基から成っていた。このＮ末端Ｓｅｒ残
基から始めて、成熟ＲＭＬは停止コドンに達するまでに
２６９個の残基を通って伸びる。この成熟２９５００ダ
ルトン酵素では、リパーゼ基質結合部位は、多数のリパ
ーゼに保存されている残基５ｅｒ（１４４）の付近に配
置される。ＲＭＬ　ｍＲＮＡの３′末端では、１０４個
のヌクレオチドがＴＡＡ停止コドンとポリ（Ａ）テイル
との間の未翻訳領域として配置された。
このポリ（Ａ）テイルに対して２３ヌクレオチド５′で
は、７ＡＴ塩基対から成る反復構造が見出されたが、典
型的な真核生物のポリアデニル化シグナルは同定されな
かった。
本発明の好ましい具体例では、ＲＭＬ　　ｃＤＮＡにつ
いて多くの変更を行った。これらの変更は、開放読み込
み枠に対して制限エンドヌクレアーゼ部位５′および３
′をクローニングおよび付加の際に、ＣＤＮＡに加えた
Ｇ：Ｃテイルの除去を含む、多くの好都合な制限部位も
、ＣＤＮＡのシグナルペプチドおよびプロペプチド領域
に尋人された。
ｐ３５３．１６をＦｎｕＤＩＩで消化して、アガロース
ゲル電気泳動によって８８０ｂｐ　ＤＮＡフラグメント
（ＲＭ　Ｌ　　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａの３′末端）を単離した
。このフラグメントを電気溶出し、フェノールおよびク
ロロホルムで抽出し、エタノールで沈澱した。
ＲＭ　Ｌ　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａの３′末端を次いでＳａｗ　
ｌで消化し且つアルカリ性ホスファターゼで処理したｐ
Ｕｃ１９ベクターに連結した。連結反応を用いて、競合
する１仙細胞を形質転換し、精製した形質転換体から正
確な組換体をミニプレププラスミドの制限酵素消化によ
って同定した。一つのかがる好適な組換体ｐ４３５．２
をＢａｎ１ｌおよびｔｌｉｎｄｌｌｌで消化し、０．６
９ｋｂフラグメントをアガロースゲル電気泳動法で単離
した。このフラグメントを電気溶出し、フェノールおよ
びクロロホルムで抽出し、エタノールで沈澱した。ＲＭ
Ｌ　　ｃＤＮＡのフラグメントは、３′未翻訳領域に結
合したｐＵｃ１９多重クローニング部位の主要部分を有
していた。
ＲＭＬ　ｃＤＮＡの５′末端を、合成オリゴヌクレオチ
ドを用いて再設計して、好都合な制限部位を導入した。
合成フラグメント（ＲＭＬ５’）のＤＮＡ配列を第１４
図に示す、導入した制限部位の位置および個々に合成し
たオリゴヌクレオチドの結合部位を水平線乃至垂直／水
平線によって示す、精製するフラグメント（ＲＭＬ５’
）を２％アガロースゲル上で１５０ｂｐフラグメントと
して精製し、電気溶出し、フェノールおよびＣＨＣｈで
抽出し、更に連結反応を行う前にエタノールで沈澱した
。
ｐ３５３．７をＢａｎ　ＩおよびＲａｎ　Ｉ　Ｉで消化
して、３８７ｂｐＲＭＬフラグメントを１０％ボリアミ
リルアミドゲル電気泳動法によって精製した。このフラ
グメントを電気溶出し、フェノールおよびクロロホルム
で抽出した後、エタノール沈澱をして、次いで合ｔＲＭ
Ｌ５’フラグメントおよびＢａｍ１ｌ　［／旧ｎｃ１１
１１で消化したｐＵｃ１３ベクターにおいてｐ４３５．
２からの０．６９ｋｂ　Ｂａｎ１ｌ／旧ｎｄＩＩＩフラ
グメントに連結した。連結反応を用いて、競合するＥ、
　ｃｏｌｉを形質転換して、精製する形質転換体から正
確な組換体をミニプレズブラスミド上で制限酵素消化す
ることによって同定した。一つのかかる正確な組操体ｐ
Ｂ５４４’では、合成部分を配列して予想した構造を確
認した。　ｐＢ５４４の構成を第１３ａ図に示す。
ｐＢ５４４からプレプロＲＭＬ　　ｃＤＮＡ　をアガロ
ースゲル電気泳動法によって、１．２ｋｂ　Ｂａ５ａｌ
　　フラグメントとして単離した。ｍ↓ｕｓ　虹り牲Ｔ
ＡＫ＾−アミラーゼ遺伝子からのプロモーターおよび＾
ｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉ　ｅｒグルコアミラーゼ遺
伝子からのターミネータ−に基づく発現ベクターを、以
下のようにして調製した。ｐ７１９　（実施例７参照）
刃５ａｌｌおよびＢａｍ１ｌ　Ｉで消化した。生成する
１、１ｋｂ　ＴＡＫ＾−アミラーゼプロモーターフラグ
メントをアガロースゲル電気泳動法によって精製した。
ｐ［ｃＡＭＧ／Ｔｅｒｍ（実施例４参照）は、［１ｚｍ
ＨＩおよびＥｃｏＲＩで消化した。生成する０、７５ｋ
ｂ　Ｔ＾に＾−アミラーゼターミネーターフラグメント
をアガロースゲル電気泳動法によって精製した。フェノ
ールおよびクロロホルム抽出の後、これらの２種類のフ
ラグメントをエタノールで沈澱し、５ａｌｌ／ＥｃｏＲ
ｌで消化したｐＵｃ１９ベクターに連結した。連結反応
を用いて、Ｅ、　ｃｏｌｉを形質転換して、精製する形
質転換体から正確な組換体をミニプレラプラスミド上で
制限酵素消化することによって同定した。一つのかかる
正確な組換体ｐ７）５をＢａｍＨＩで消化して、アルカ
リ性ホスファターゼで処理した。
ｐＢ５４４からの１．２ｋｂ　ｂｍＨＩ　　ＲＭＬプレ
プロｃＤＮＡフラグメントをこのｐ７７５ベクターに連
結して、Ｅ、　ｃｏｌｉ中に形質転換した。プロモータ
ーとターミネータ−との間で正確な位１に挿入されたＲ
ＭＬプレプロｃＤＮＡを有する組換えｐ７８７を、Ｅ、
　ｃｏｌｉ形質転換体から抽出したミニプレラプラスミ
ド上で制限酵素による消化によって同定した。
ｐ７８７プラスミドＤＮＡを大規模に成長させて、プラ
スミド調製物をＣｓＣｌ／臭化エチジウム遠心分離によ
って精製した。　ｐ７８７の構成を第１３ｂ図に示す。
１００１のＹ　Ｐ　Ｄ　　（５ｈｅｒ輸ａｎら、　Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ　　ｉｎ　　Ｙｅａｓｔ（：ｅｎｅｔｉｃｓ
、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ。
１９８１年）に＾、　ｏｒｙｚａｅ、　ＩＦＯ４１７７
またはそのａｒｇＢ変異株の胞子を接種して、ｆｉ量し
ながら３７℃で約２日問培養した。ミラクロスを通して
枦遇することによって菌糸を回収して、０．６ＭのＭ、
、ｓｏ、　２００１で洗浄した。菌糸を１５ｍ１の１．
２ＭのＭｇ５Ｏ，，１２０ｍ１含む）Ｊ［Ｉ液１１を加
えた。５分後、１ａｌの１２ａ＋ｇ／ｍｌＢ　ＳＡ（Ｓ
ｉｇａ＋ａ、　Ｈ２５型）を加えて、緩やかに撹拌しな
がら１．５〜２．５時間３７℃でインキュベーションし
、詣微鏡下で検討した試料中において多数の原形質体が
観察されるようになるまで継続した。
懸濁液をミラクロスを通してＰ遇し、Ｐ液を無菌チュー
ブに移して、５１の０．６Ｍソルビトール、１００ｍＭ
トリス−１１Ｃ！、ｐＨ＝７．０を積層しな。
１０００ｇで１５分間遠心分離を行い、原形質体を・Ｍ
ｇＳＯ４クッションの上部から収集した。２容量の５Ｔ
Ｃ（１，２Ｍのソルビトール、１０ｍＭのトリス−ＨＣ
ｌ、ｐＨ＝７．５．１０ｍＭのＣａＣ１ｚ）を原形質体
感濁液に加えて、混合物を１０００ｇで５分間遠心分離
した。原形質体ベレットを３ａｌのＳＴＣに再懸濁して
、再度成型した。これを繰り返した０ＭＬ後に、原形質
体を０．２〜１ａｌのＳＴＣに再懸濁した。
１００μｍの原形質体分散液を５〜２５μｇの適当なり
ＮＡを１０μｌのＳＴＣに懸濁したものと混合した。ａ
ｒｇＢ株からの原形質体をｐｓａ１４３　Ｄ　Ｎ　Ａ（
Ａ、　ｎｉｄｕｌａｎｓ　ａｒｇＢｉ！伝子を担持する
プラスミド）およびａｒｇＢ＋株からの原形質体をｐ３
ＳＲ２（Ａ。
ｎｉｄｕｌａｎｓ　ａｒｇＢ　！！伝子を担持するプラ
スミド）と混合した。混合物を室温で２５分間放置した
。
０．２ｓ＋ｌの６０％ＰＥ（：４０００（ＢＤＩ＋２９
５７６）、　１０ｍＭのＣａＣｌ　＝および１０ｍＭの
トリス−１１ｃＩ　、ｐＨ＝７．５を加えて、注意深く
混合しく２回）、最後に０．８５＋ｏｌの上記溶液を加
えて、注意深く混合した。混合物を室温で２５分間放置
し、２５００ｇで１５分間遠心分離し、ペレットを再度
２ｍｌの１．２Ｍソルビト−ルに懸濁した。もう−回沈
降させてから、原形質体を適当なプレートに塗布した。
ｐＳａ　Ｉ　４３で形質転換したａｒｇＩ１株からの原
形質体を炭素および窒素源として、それぞれグルコース
および尿素を有し且つ浸透圧安定のために１．２Ｍソル
ビトールを含む最少限のプレート（Ｃｏｖｅ、　［１ｉ
ｏｃｈｅｓ、　Ｂｉｏｐｂｙｓ。
＾ｅｔａ、第１１３巻、１９６６年、５１〜５６頁）に
拡げた。
ｐ３ＳＲ２で形質転換したａｒｇＢ”株からの原形質体
を、１．０Ｍスク０−ス、ｐＨ＝７．０、窒素源として
１゜ＴｒｌＭのアセタミド、およびバックグラウンド成
長を抑制する２０ｍＭのＣｓＣｌを含む最少限のプレー
ト（Ｃｏｖｅ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、
＾ｃＬａ、第１１３巻、１９６６年、５１〜５６頁）に
塗布した。３７℃で４〜７日間インキュベーションした
後、胞子を回収して、滅菌水に懸濁し、塗布して単一コ
ロニーとした。
この処理法を繰り返して、２回の再分雛の後、単一コロ
ニーの胞子を定義した形質転換体として保存した。
実施例１０ ＪＬ１＾、ｏｒｙｚａｅにお番ＴＡＫ＾−アミーーゼの
北回。
ｐＴＡＫＡ１７を、実施例９に記載したように＾。
ｎ１ｃｌｕｌａｎｓからのａｓｄｓ３Ｆｌ伝子を含むｐ
３ＳＲ２で共形質転換することによって、虹」コ１μ［
Ｆｏ　４１７７中に形質転換した。上記のように調製し
た原形質体を等量のｐＴＡＫＡ　１７およびｐ３ＳＲ２
であってそれぞれ約５μｇを用いた混合物とインキュベ
ーションした。
単一窒素源としてアセタミドを用いることができる９個
の形質転換体を、２回再度単離した。ＹＰＤ　（Ｓｈｅ
ｒ＋ａａｎら、１９８１年）上で３日間成長させた後、
培養液上澄みを５ＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。ゲ
ルを、コマ−ジー・ブリリアン！・・ブルーＲで染色し
た。最良の形質転換体は、形質転換していないＩＦＯ４
１７７の１０〜２０倍のアミラーゼを生成した。一つの
形質転換体を更に研究するために選択して、２リツトル
Ｋｉｅｌｅｒ醗酵装置中で４％大豆ミール上で成長させ
、成長中にグルコースを供給した。醗酵中に、培養液を
激しく撹拌した。これらの条件下では、ＩＦＯ４１７７
は約１ｇ／ｌを生じ、形質転換体は酵素活性として測定
したところ約１２ｇ／Ｉのアミラーゼであった。酵素活
性を澱粉を分解する能力として測定した（　Ｃｅｒｅａ
ｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第１６巻、１９３９年、７１
２〜７２３頁）、使用した澱粉はＭｅｒｃｋ　Ａｍｙｌ
ｕ＋＊　ｓｏｌｕｂｉｌｅｅｒｇ　Ｂ、６であり、分析
はｐＨ４゜７および３７℃で行った。外部がらβ−アミ
ラーゼを加えなかった。
実施例７からのｐ７７７または実施例６からのｐ７７８
を、実施例９に記載の処理法によってｐ３ＳＲ２と共に
共形質転換することによってＩＦＯ−４１７７中へ形質
転換した。形質転換体を選択して、実施例９に記載のよ
うに再度単離した。
形質転換体をＹＰＤ中で３日間成長させ、上澄みを５Ｄ
Ｓ−ＰＡＧＥの後に−ｅｓＬｅｒｎ　ｂｌｏｔｔｉｎｇ
およびＥＬＩＳＡを行って分析した。ｐ７７７およびｐ
７７８からの形質転換体の上澄液は、ＲＭＰ抗体と反応
するタンパク５０〜１５０ｍｇ／　ｌを含んでいた。ブ
ロテイナーゼは、Ｒ，ｍ１ｅｈｅｉで生成したプロテイ
ナーゼと比較して過剰にグリコジル化した。２つの形状
のうち、一方はプロ型であり、他方は加工された成熟プ
ロテイナーゼであると思われた。
ｐ７７８の２種類の形質転換体およびｐ７７７の３種類
の形質転換体を、上記ＴＡＫ八−へミラーゼ形質転換体
と同様に醗酵装置中で成長させた。　ｐ７７８の２種類
の形質転換体は、Ｋｕｎ　ｉ　ｔｚ法（Ｋｕｎｉｔｚ、
　Ｍ、、Ｊｏｕｒ。
Ｇｅｎ、　Ｐｈｙｓｉｏｌ、、第１８巻、１９３５年、
４５９〜４６６頁）によるミルク凝固活性として測定し
たところ、約０．２ｇ／ｌおよび０．４ｇ／ｌのＲＭＰ
を生じ、ｐ７７７の３種類の形質転換体は約０．５ｇ／
Ｉ、２．４ｇ／ｌおよび３．３ｇ／ＩのＲＭＰを生じ、
組換えＲＭＰの特異的活性は没ｐ旦ｒ　ｗｉｔ±１−の
活性と同じであると考えられたくこれについては、後で
確認した）。
５ＤＳ−ＰＡＧＥおよび５ＤＡ−ＰＡＧＥの後に１１ｅ
ｓｔｅｒｎ−ｂｌｏｔｔｉｎｇおよびＥＬＩＳＡを行っ
たところ、大規模で培養する場合には、１つの形状のＲ
ＭＰのみが存在することが判った。ＲＭＰはこれらの成
長条件下でも、過剰にグリコジル化した。
ゲル上にみられるタンパクの量は、酵素活性がら予測さ
れた量とよく相関を有した。
ＲＭＰを親和性クロマトグラフィーおよび寸法゛排除ク
ロマトグラフィーによって培養液の上澄みから精製した
。
精製した組換えＲＭＰのＮ−末端配列を、Ｔｈ１ｓ・ら
（ＴＥＢＳ　Ｌｅｔｔ、１９８７年、印刷中）によって
報告されたのと同様に気相配列装置を用いて、測定した
。
組換えＲＭＰの２つの形状はＮ−末端における加工が不
均一であることを示した。一つの形状は＾ｌａ−＾５ｐ
−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−＾５ｐ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−
Ｇ　Ｉｙ−Ｔｙｒ−のＮ−末端配列を有し、もう一方は
Ｇｌｙ−３ｅｒ−Ｖａｌ−＾５ｐ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇ
　１ｙ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−＾ｓｐ−のＮ−末端配列を有
した。Ｎ−末端でのかかる不均一加工も、Ｍｕｃｏｒｍ
ｉｅｈｉｅからの元のＲＭＰについて記載されている（
Ｐａｑｕｅｔ、　Ｄ、ら、Ｎｅｔｂ、　Ｍｉｌｋ　Ｄａ
ｉｒｙ　Ｊ、、第３５巻、１９８１年、３５８〜３６０
頁）、ｆｆｉ換えＲＭＰの不均一加工は元のＲＭＰの不
均一加工と良好な相関を有し、＾、　ｏｒｙｚａｅは本
発明によれば正確な領域で組換えＲＭＰを加工すること
ができることが判った。
この構成は、＾、　ｏｒｙｚａｅアミラーゼプロモータ
ーの制御下で＾、　ｏｒｙｚａｅ　ＴＡＫ＾−アミラー
ゼ遺伝子からのシグナルペプチド配列がすぐ先行するプ
ロキモシン遺伝子を含む、この構成は更に、＾。
ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼ遺伝子とＥ、　ｃｏｌｉ複
製体からのからのターミネータ−を含む。
ｐ２８５’　ｐｒｏＣ（実施例１参照）からの約４３０
　ｂｐ［１ｓｍＨＩ　／　Ｘｍａ　Ｉフラグメント・お
よび以下の配列＾＾ＴＴＣＣＡにＣＴＧＣＣにＣＧＧＣ
ＣにＡＧＡＴＣＡＣＣＡＧＧにＴＣ（：ＡＣＧＧＣＧＣ
ＣＧＧＣＴＣＴＡＧＴＧＧＴＣＣＴＡＧを有する合成オ
リゴマーをＥｃｏＲｌ　−Ｘｍａ　ｌ切断ｐＵｃ１９プ
ラスミド中に挿入して、プラスミドｐＴｏｃ５Ｇｍを生
成シタ。
ｐＴｏｃ５０ａをＥｃｏＲｌ−５ａｃｌｌで切断し、ｐ
Ｕｃ１９を含む大きなフラグメントとプロキモシン遺伝
子（プロキモシン′）のの５′部分を単離した。このフ
ラグメントをｐＴＡＫ＾１フからの０．６　ｋｂ　Ｅｃ
ｏＲＩ−Ｂａｎ　Ｉフラグメントおよび以下の合成オリ
ゴマーと連結した。
ＧＣＡＣＣＴにＣＴＴＴＧＧＣ ＧＡＣＧ＾＾＾Ｃ（ＫＦＮ　２８０／２８１）形質転換
の後、＾、　ｏｒｙｚａｅ　ＴＡＫ＾−アミラーゼ遺伝
子（プレＴＡＫ＾）からのシグナル配列に融合し且つ約
５００ｂｐ上流のＴＡＫ＾−アミラーゼ配列が先行する
プロキモシン遺伝子（プロキモシン′）の５′部分を含
むプラスミドｐＴｏｃ５１を単離した。　ｐＴｏｃ５１
の構成を第１５ａ図に示す。
ｐＲ２６を旧ｎｆｌで切断して、ＤＮＡポリメラーゼ■
および４個のｄＮＴＰの大きなフラグメント（Ｋｌｅｎ
ｏｗ）で処理し、Ｘｍａ　（で切断した。プロキモシン
遺伝子の３′末端を含む７５０ｂｐフラグメントを単離
した。このフラグメントの３′末端でのＨｉｎｄｌｌｌ
を挿入するために、ｐｔｌｃ９をＸｍａ　ｒ　／　ｌ１
ｉｎｃｌｒで切断して、大きなフラグメントをプロキモ
シン遺伝子の３′末端を含む７５０ｂｐフラグメントに
連結した。
ｐＴＡＫ＾１７からの５．６　ｋｂ　ＥｃｏＲＩ　−Ｃ
ｌａ　Ｉフラグメントを単離して、同じプラスミド貸せ
の２．６ｋｂＣ１ａ　Ｉ　−Ｈ１ｎｄｌｌ！フラグメン
トおよび＾、　ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼ遺伝子ター
ミネータ−およびポリ八部位を含むｐｌｃＡＭＧ／Ｔｅ
ｒｍ（実施例４参照）がらの０、７　ｋｂ　ＥｃｏＲＩ
−旧ｎｄｌｌｌと連結した。生成するプラスミド輪ｐＴ
ｏＣ５２として第１５ｂ図に示す。
ｐＴｏＣ５２を１ｌｉｎｄｌｌｌで切断し、ＥｃｏＲＩ
で部分的に切断し、６．４ｋｂフラグメントを単離した
。これをｐＴｏｃ５１からの０．９　ｋｂ　ＥｃｏＲＩ
　−Ｘｍａ　Ｉフラグメントおよびプロキモシン遺伝子
（′プロキモシン）の３′部分を含むｐＵｃ９　’ＰＣ
からの０．７　ｋｂ　Ｘｍａ　Ｉ−旧ｎｄｌＩＩフラグ
メントと連結した。生成するプラスミドはｐＴｏｃ５６
と呼ばれ、第１５ｂ図に示す。
ｐ３ＳＲ２（ａｍｄＳ遺伝子）またはｐｓａ１４３（ａ
ｒＨＢ遺伝子）と共形質転換することによって、ｐＴｏ
Ｃ５６を＾。
ｏｒｙｚａｅ　ＩＦＯ４１７７またはａｒｇＢ変異株に
形質転換した。選択的培地で成長する形質転換体を、実
施例９と同様に２回再度単離した。
形質転換体をＹＰＤ中で３日間成長させ、上澄液のプロ
キモシン含量を５ＤＳ−ＰＡＧＥ後Ｗｅｓｔｅｒｎプロ
ット上でＥＬＩＳＡによって分析した。形質転換体は、
上澄液中に１〜１０ｍｇ／ｌのプロキモシンの寸法免疫
反応性タンパクを産生じた。池の免疫反応性タンパクは
上澄液中に検出されながった。
実施ｆ３ｉ１８からのｐ７８７を、実施例９に記載の方
法によってｐ３ＳＲ２で共形性転換することによってＩ
ＦＯ−４１７７中に形質転換した。形質転換体を実施例
９と同様に選択して、再度単離した。
３日間成長させた形質転換体のＹＰＤ培養液からの上澄
液を、５ＤＳ−ＰＡＧＥの後にＷｅｓｔｅｒｎプロット
およびＥＬＩＳＡを行って分析した。最良の形質転換体
は、タンパク１リットル当り２ｍｇの成熟ＲＭＬの寸法
を産生じた。上澄液におけるリパーゼ活性を、トリブチ
リンを開裂する能力として計測した（Ｎ　ＯＶ　Ｏ法人
Ｆ　９５．１／３−ＣＢ）。
この測定によって上澄液に２ｍｇ／Ｉの活性リパーゼが
存在することが判った。
【図面の簡単な説明】
第１図は、ＴＡＫ＾−アミラーゼプロモーターおよび上
流プロモーター領域のＤＮＡ−配列を示し、第２図は、
プラスミドｐＴＡＫ＾１フのエンドヌクレアーゼ制限マ
ツプを示し、 第３図は、プラスミドｐ２８５　’ｐｒｏＣの構成を示
し、第４ａおよびｂ図は、３文字省略によって与えられ
る推定アミノ酸配列を有するプレプロＲｈｉｚｏｍｕｃ
ｏｒ　ｍ１ｅｈｅｉアスパラギン酸プロテイナーゼのＤ
ＮＡ配列を示し、 第５図は、プラスミドｐＲＭＰの構成を示す。 第６図は、プラスミドｐｃＡＭに９１のエンドヌクレア
ーゼ制限マツプを示し、 第７ａ図はプラスミドｐｌｃＡＭＧ／　Ｔｅｒｍの構成
を示し、 第７ｂ図は、プラスミドｐ６８６の構成を示し、第８図
は、プラスミドｐＲＭｌ’ＡＮＧＴｅｒｍの構成を示し
、 第９ａ図は、プラスミドｐＢ４０８．３の構成を示し、
第９ｂ図は、プラスミドｐＢ７７８の構成を示し、第１
０図は、プラスミドｐＢフ１９の構成を示し、第１１図
は、プラスミドｐ７７７の構成を示し、第１２図は、３
文字省略によって与えられる推定アミノ酸配列を有する
プレプロＲｈｉｚｏｍｕｃｏｒｍｉｅｈｅｉリパーゼＣ
ＤＮＡの配列を示し、第１３ａ図は、プラスミドｐＢ５
４４の構成を示し、第１３ｂ図は、１ラスミドｐ７８７
の構成を示し、第１４図は、合成フラグメンｉ−ＲＭＬ
５　’すＤＮＡ配列を示し、 第１５ａ図は、プラスミドｐＴｏｃ５１の構成を示し、
第１５ｂ図は、プラスミドｐＴｏＣ５６の構成を示す。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １、アスペルギルスオリザ（￥Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ
    ￥￥ｏｒｙｚａｅ￥）におけるタンパク生成物の発現方
    法であって、 （ａ）アスペルギルスオリザ（￥Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕ
    ｓ￥￥ｏｒｙｚａｅ￥）宿主のゲノム中に１個以上のコ
    ピーを組込み可能であり且つ遺伝子発現を促進する機能
    を暗号化するＤＮＡ配列と、形質転換細胞の選択に好適
    なマーカーと、所望なタンパク生成物を暗号化するＤＮ
    Ａ配列とを有する組換えＤＮＡクローニングベクター系
    を提供し、 （ｂ）選定された選択マーカー用の機能遺伝子を有しな
    いアスペルギルスオリザ（￥Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ￥
    ￥ｏｒｚａｅ￥）を工程（ａ）からの組換えＤＮＡクロ
    ーニングベクター系で形質転換し、次いで （ｃ）形質転換したアスペルギルスオリザ （￥Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ￥）宿主を
    適当な培養基中で培養する工程から成る方法。 ２、遺伝子発現を促進する機能を暗号化するＤＮＡ配列
    が、プロモーターと、転写開始部位と、転写ターミネー
    ターおよびポリアデニル化機能を有する、特許請求の範
    囲第１項記載の方法。 ３、プロモーターに対して、上流活性化配列が先行する
    、特許請求の範囲第２項記載の方法。 ４、選択マーカーが、￥Ａ．￥ニドランス￥ｎｉｄｕｌ
    ａｎｓ￥または￥Ａ．￥ニガー（￥ｎｉｇｅｒ￥）ａｒ
    ｇＢ、￥Ａ．￥−ニドランス（ｎｉｄｕｌａｎｓ）ｔｒ
    ｐＣ、￥Ａ．￥ニドランス（ｎｉｄｕｌａｎｓ）ａｍｄ
    Ｓ、ニューロスポラクラザーエ（￥Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒ
    ａ￥￥ｃｒａｓｓａｅ￥）Ｐｙｒ４またはＤＨＦＲから
    誘導される、特許請求の範囲第１項記載の方法。 ５、選択マーカーが￥Ａ．￥ニドランス（￥ｎｉｄｕｌ
    ａｎｓ￥）または￥Ａ．￥ニガー（￥ｎｉｇｅｒ￥）か
    ら誘導されるＡｒｇＢ遺伝子または￥Ａ．￥ニドランス
    （￥ｎｉｄｕｌａｎｓ￥）から誘導されるａｍｄＳ遺伝
    子である、特許請求の範囲第４項記載の方法。 ６、プロモーターおよび上流活性化配列がアミラーゼ、
    グルコアミラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、セルラー
    ゼまたは解糖酵素のような細胞外あるいは細胞内タンパ
    クを暗号化する遺伝子から誘導される、特許請求の範囲
    第３項記載の方法。 ７、プロモーターおよび上流活性化配列が、￥Ａ．￥　
    オリザ（ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡアミラーゼ、リゾムコ
    ールマイヘイ（￥Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ￥　￥ｍｉｅｈ
    ｅｉ￥）アスパラギン酸プロテナーゼ、￥Ａ．￥ニガー
    （￥ｎｉｇｅｒ￥）中性α−アミラーゼ、￥Ａ．￥ニガ
    ー（￥ｎｉｇｅｒ￥）グルコアミラーゼまたはリゾムコ
    ールマイヘイ（￥Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ￥　￥ｍｉｅｈ
    ｅｉ￥）リパーゼについての遺伝子から誘導される、特
    許請求の範囲第６項記載の方法。 ８、プロモーターがＡ．ｏｒｙｚａｅ　ＴＡＫＡアミラ
    ーゼプロモーターまたはその機能性部分である、特許請
    求の範囲第７項記載の方法。 ９、プロモーターおよび上流活性化配列が以下の配列 【遺伝子配列があります】 または機能的に等価なヌクレオチド配列を有する、特許
    請求の範囲第８項記載の方法。 １０、プロモーターおよび上流活性化配列が以下の配列 【遺伝子配列があります】 または機能的に等価なヌクレオチド配列を有する、特許
    請求の範囲第８項記載の方法。 １１、特許請求の範囲第１０項記載の配列に対して、プ
    ラスミドｐＴＡＫＡ１７における位置０〜１．０５の１
    ．０５ｋｂ無配列上流領域が先行する、特許請求の範囲
    第１０項記載の方法。 １２、ベクター系が更に培養基に発現した生成物の分泌
    に備えたプレ領域を有する、特許請求の範囲第１項記載
    の方法。 １３、プレ領域がアスペルギルス（￥Ａｓｐｅｒｇｉｌ
    ｌｕｓ￥）種からのグルコアミラーゼあるいはアミラー
    ゼ遺伝子、バシラス（￥Ｂａｃｉｌｌｕｓ￥）種からの
    アミラーゼ遺伝子、リゾムコールマイヘイ（￥Ｒｈｉｚ
    ｏｍｕｃｏｒ￥￥ｍｉｅｈｅｉ￥）からのリパーゼある
    いはプロテイナーゼ遺伝子、￥Ｓ．￥セレビゼ（ｃｅｒ
    ｅｖｉｓｉａｅ）からのα−因子の遺伝子または仔牛の
    プロキモシン遺伝子から誘導される、特許請求の範囲１
    ２項記載の方法。 １４、プレ領域が￥Ａ．￥オリザ（￥ｏｒｙｚａｅ￥）
    ＴＡＫＡアミラーゼ、￥Ａ．￥ニガー（￥ｎｉｇｅｒ￥
    ）中性α−アミラーゼ、￥Ａ．￥ニガー（￥ｎｉｇｅｒ
    ￥）の酸に安定なα−アミラーゼ、￥Ｂ．￥リケニフォ
    ルミス（￥ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ￥）、α−アミ
    ラーゼ、バシラス（￥Ｂａｃｉｌｌｕｓ￥）ＮＣＩＢ１
    １８３７マルトース原性アミラーゼ、￥Ｂ．￥ステロサ
    ーフィラス（￥ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ
    ￥）α−アミラーゼまたは￥Ｂ．￥リケニホルミスズブ
    チリシン（￥ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ￥￥ｓｕｂｔ
    ｉｌｉｓｉｎ￥）の遺伝子から誘導される、特許請求の
    範囲第１３項記載の方法。 １５、プレ領域が以下の配列 【遺伝子配列があります】 を有するＴＡＫＡ−アミラーゼプレ領域である、特許請
    求の範囲第１４項記載の方法。 １６、ベクター系が２個のベクターから成り、一方が選
    択マーカーを有し、他方は遺伝子発現を促進する機能を
    暗号化するＤＮＡ配列と所望なタンパク生成物を暗号化
    するＤＮＡ配列を有する、特許請求の範囲第１項記載の
    方法。 １７、アスペルギルスオリザ（￥Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕ
    ｓ￥￥ｏｒｙｚａｅ￥）におけるタンパク生成物の産生
    法であり、特許請求の範囲第１項記載の組換えＤＮＡク
    ローニングベクター系で形質転換されるアスペルギルス
    オリザ（￥Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ￥）
    株を適当な培養基で培養して、生成物を培養基から回収
    する方法。 １８、アスペルギルス（￥Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ￥）
    におけるタンパク生成物の発現に好適なプロモーターで
    あって、ＴＡＫＡ−アミラーゼプロモーターまたは上流
    活性化配列が任意に先行する上記プロモーターの機能的
    部分であることを特徴とするプロモーター。 １９、以下の配列 【遺伝子配列があります】 または機能的に等価なヌクレオチド配列を有する特許請
    求の範囲第１８項記載のプロモーターおよび上流活性化
    配列。 ２０、上流活性化配列に対して、プラスミドｐＴＡＫＡ
    １７における位置０〜１．０５の１．０５ｋｂ無配列上
    流領域が先行する、特許請求の範囲第１９項記載のプロ
    モーターおよび上流活性化配列。 ２１、以下の配列 【遺伝子配列があります】 または機能的に等価なヌクレオチド配列を有する特許請
    求の範囲第１９項記載のプロモーターおよび上流活性化
    配列。
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