CN105112347A - 用于在去偶联条件和/或安全操作范围下产生不含c5烃的异戊二烯的方法和组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明描述了从培养的细胞产生异戊二烯的方法，其中该细胞处于稳定期。本发明还提供了包含这些培养的细胞和/或提高的量的异戊二烯的组合物。本发明还提供了包含气相中不可燃浓度的异戊二烯的系统。此外，本发明提供了异戊二烯组合物，例如具有提高的量的异戊二烯或提高的纯度的异戊二烯的组合物。

Description

用于在去偶联条件和/或安全操作范围下产生不含C5烃的异戊二烯的方法和组合物
本申请是申请日为2009年7月1日、发明名称为“用于在去偶联条件和/或安全操作范围下产生不含C5烃的异戊二烯的方法和组合物”的中国专利申请200980134182.9(国际申请号PCT/US2009/049429)的分案申请。
相关申请的交叉参照
本申请要求2008年7月2日提交的美国临时申请61/134,094、2008年7月2日提交的美国临时申请61/133,947和2008年7月2日提交的美国临时申请61/134,011的优先权，上述各个美国临时申请的内容在此完整引入作为参考。
背景技术
异戊二烯(2-甲基-1,3-丁二烯)是多种合成聚合物的关键起始材料，最典型的是合成橡胶的关键起始材料。异戊二烯由多种微生物、植物和动物物种天然产生。特别地，已鉴定出异戊二烯的两种生物合成途径：甲羟戊酸(MVA)途径和非甲羟戊酸(DXP)途径(图19)。然而，来自天然生物体的异戊二烯的产量在商业上并不具吸引力。每年约800,000吨顺式-聚异戊二烯产生自异戊二烯的聚合；这种聚异戊二烯大部分用在轮胎和橡胶工业。异戊二烯还共聚合，用作其他产品中的合成高弹体，如鞋类、机械产品、医疗产品、运动产品和乳胶。
目前，轮胎和橡胶工业基于天然和合成橡胶的使用。天然橡胶获自橡胶树或非洲雨林中发现的植物的乳汁。合成橡胶主要基于丁二烯聚合物。对于这些聚合物，丁二烯作为乙烯和丙烯生产的副产物而获得。
虽然异戊二烯可以通过石油分馏而获得，但是这一物质的纯化是昂贵且耗时的。C5烃流的石油裂解只产生约15％的异戊二烯。因此，需要更加经济的方法来生产异戊二烯。尤其是，需要以足以满足强大的商业加工需求的速度、滴定度和纯度来生产异戊二烯的方法。还需要用于由廉价的起始材料生产异戊二烯的系统。
发明概述
一方面，本发明描述了产生异戊二烯的培养的细胞(cellsinculture)。在一些实施方案中，本发明提供培养的细胞，该细胞产生以异戊二烯的细胞湿重/小时(纳摩尔/gwcm/hr)计，大于约400纳摩尔的异戊二烯/克细胞。在一些实施方案中，该细胞具有异源核酸，其(i)编码异戊二烯合酶多肽和(ii)与启动子有效连接。在一些实施方案中，该细胞在包括碳源的培养基中培养，该碳源例如但不限于糖类、丙三醇、甘油、二羟基丙酮、一碳源、油、动物脂肪、动物油、脂肪酸、脂质、磷脂、甘油脂质(glycerolipid)、单酸甘油酯、甘油二酯、甘油三酯、可再生碳源、多肽(例如，微生物或植物蛋白质或肽)、酵母提取物、来自酵母提取物的组分，或前述两种或多种物质的任意组合。在一些实施方案中，细胞在限量葡萄糖条件下培养。
在一些实施方案中，本发明提供培养的细胞，该细胞将细胞培养基中大于约0.002％的碳转化成异戊二烯。在一些实施方案中，该细胞具有异源核酸，其(i)编码异戊二烯合酶多肽和(ii)与启动子有效连接。在一些实施方案中，该细胞在包括碳源的培养基中培养，该碳源例如但不限于糖类、丙三醇、甘油、二羟基丙酮、一碳源、油、动物脂肪、动物油、脂肪酸、脂质、磷脂、甘油脂质、单酸甘油酯、甘油二酯、甘油三酯、可再生碳源、多肽(例如，微生物或植物蛋白质或肽)、酵母提取物、来自酵母提取物的组分，或前述两种或多种物质的任意组合。在一些实施方案中，细胞在限量葡萄糖条件下培养。
在一些实施方案中，本发明提供培养的细胞，该细胞包含编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸。在一些实施方案中，该细胞具有异源核酸，其(i)编码异戊二烯合酶多肽和(ii)与启动子有效连接。在一些实施方案中，该细胞在包括碳源的培养基中培养，该碳源例如但不限于糖类、丙三醇、甘油、二羟基丙酮、一碳源、油、动物脂肪、动物油、脂肪酸、脂质、磷脂、甘油脂质、单酸甘油酯、甘油二酯、甘油三酯、可再生碳源、多肽(例如，微生物或植物蛋白质或肽)、酵母提取物、来自酵母提取物的组分，或前述两种或多种物质的任意组合。在一些实施方案中，细胞在限量葡萄糖条件下培养。
一方面，本发明描述了产生异戊二烯的方法，如使用本文所述的任意细胞来产生异戊二烯的方法。在一些实施方案中，该方法涉及在足以产生大于约400纳摩尔异戊二烯/gwcm/小时的条件下培养细胞。在一些实施方案中，该方法还包括回收由该细胞产生的异戊二烯。在一些实施方案中，该方法包括纯化由该细胞产生的异戊二烯。在一些实施方案中，该方法包括聚合异戊二烯。在一些实施方案中，该细胞具有异源核酸，其(i)编码异戊二烯合酶多肽和(ii)与启动子有效连接。在一些实施方案中，细胞在包括碳源的培养基中培养，该碳源例如但不限于糖类、丙三醇、甘油、二羟基丙酮、一碳源、油、动物脂肪、动物油、脂肪酸、脂质、磷脂、甘油脂质、单酸甘油酯、甘油二酯、甘油三酯、可再生碳源、多肽(例如，微生物或植物蛋白质或肽)、酵母提取物、来自酵母提取物的组分，或前述两种或多种物质的任意组合。在一些实施方案中，细胞在限量葡萄糖条件下培养。在多种实施方案中，在稳定期产生的异戊二烯的量(如产生的异戊二烯的总量或每升培养液每小时每OD600产生的异戊二烯的量)大于在生长期相同时长产生的异戊二烯的量，或为其的约2倍或更多倍生长期。在一些实施方案中，气相包含大于或约为9.5％(体积)的氧气，且气相中异戊二烯的浓度小于自燃的下限(lowerflammabilitylimit)或大于自燃的上限(upperflammabilitylimit)。在特定实施方案中，(i)气相中异戊二烯的浓度小于自燃的下限或大于自燃的上限，且(ii)细胞产生大于约400纳摩尔异戊二烯/gwcm/小时。
在一些实施方案中，该方法包括在足以将细胞培养基中大于约0.002％的碳(摩尔/摩尔)转化成异戊二烯的条件下培养细胞。在一些实施方案中，该方法还包括回收由该细胞产生的异戊二烯。在一些实施方案中，该方法包括纯化由该细胞产生的异戊二烯。在一些实施方案中，该方法包括聚合异戊二烯。在一些实施方案中，该细胞具有异源核酸，其(i)编码异戊二烯合酶多肽和(ii)与启动子有效连接。在一些实施方案中，细胞在包括碳源的培养基中培养，该碳源例如但不限于糖类、丙三醇、甘油、二羟基丙酮、一碳源、油、动物脂肪、动物油、脂肪酸、脂质、磷脂、甘油脂质、单酸甘油酯、甘油二酯、甘油三酯、可再生碳源、多肽(例如，微生物或植物蛋白质或肽)、酵母提取物、来自酵母提取物的组分，或前述两种或多种物质的任意组合。在一些实施方案中，细胞在限量葡萄糖条件下培养。
在一些实施方案中，仅在稳定期产生异戊二烯。在一些实施方案中，在生长期和稳定期产生异戊二烯。在多种实施方案中，在稳定期产生的异戊二烯的量(如产生的异戊二烯的总量或每升培养液每小时每OD600产生的异戊二烯的量)大于在生长期相同时长产生的异戊二烯的量，或为其的约2、3、4、5、10、20、30、40、50或更多倍。
一方面，本发明描述了产生包含异戊二烯的组合物和系统。在一些实施方案中，该组合物包含大于或约2、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900，或1000毫克异戊二烯。在一些实施方案中，该组合物包含大于或约2、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100克异戊二烯(w/w)，异戊二烯是该组合物的挥发性有机组份。
在一些实施方案中，与该组合物中的全部C5烃的总重量相比，该组合物包含以重量计大于或约99.90、99.92、99.94、99.96、99.98或100％的异戊二烯。在一些实施方案中，与该组合物中的全部C5烃的总重量相比，该组合物包含以重量计小于或约0.12、0.10、0.08、0.06、0.04、0.02、0.01、0.005、0.001、0.0005、0.0001、0.00005或0.00001％C5烃并非异戊二烯(如1,3-环戊二烯、顺式-1,3-戊二烯、反式-1,3-戊二烯、1-戊炔、2-戊炔、1-戊烯、2-甲基-1-丁烯、3-甲基-l-丁炔、反式-戊间二烯、顺式-戊间二烯、戊-4-烯-1-炔、反式-戊-3-烯-1-炔或顺式-戊-3-烯-1-炔)。在一些实施方案中，与该组合物中的全部C5烃的总重量相比，该组合物包含以重量计小于或约0.12、0.10、0.08、0.06、0.04、0.02、0.01、0.005、0.001、0.0005、0.0001、0.00005或0.00001％的1,3-环戊二烯、顺式-1,3-戊二烯、反式-1,3-戊二烯、1-戊炔、2-戊炔、1-戊烯、2-甲基-1-丁烯、3-甲基-l-丁炔、反式-戊间二烯、顺式-戊间二烯、戊-4-烯-1-炔、反式-戊-3-烯-1-炔或顺式-戊-3-烯-1-炔。在特定实施方案中，该组合物具有大于约2mg的异戊二烯，且与该组合物中的全部C5烃的总重量相比，以重量计具有大于或约99.90、99.92、99.94、99.96、99.98或100％的异戊二烯。
在一些实施方案中，该组合物包含小于或约50、40、30、20、10、5、1、0.5、0.1、0.05、0.01，或0.005μg/L化合物，该化合物抑制用于抑制异戊二烯聚合的组合物中的任意化合物的异戊二烯聚合。在特定实施方案中，该组合物还具有大于约2mg异戊二烯。
在一些实施方案中，该组合物具有一种或多种化合物，该化合物选自乙醇、丙酮、C5异戊烯醇(prenylalcohol)和具有10个或更多个碳原子的类异戊二烯化合物。在一些实施方案中，该组合物具有大于或约0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、10、20、30、40、60、80、100或120μg/L乙醇、丙酮、C5异戊烯醇(例如3-甲基-3-丁烯-1-醇或3-甲基-2-丁烯-1-醇)，或任意前述两种或更多物质。在特定实施方案中，该组合物还具有大于约2mg异戊二烯且具有一种或多种化合物，该化合物选自乙醇、丙酮、C5异戊烯醇和具有10个或更多个碳原子的类异戊二烯化合物。
在一些实施方案中，该组合物包括异戊二烯和一种或多种第二化合物，该化合物选自2-庚酮、6-甲基-5-庚-2-酮、2,4,5-三甲基吡啶、2,3,5-三甲基吡嗪、香茅醛、乙醛、甲硫醇、乙酸甲酯、1-丙醇、丁二酮、2-丁酮、2-甲基-3-丁烯-2-醇、乙酸乙酯、2-甲基-1-丙醇、3-甲基-1-丁醛、3-甲基-2-丁酮、1-丁醇、2-戊酮、3-甲基-1-丁醇、异丁酸乙酯、3-甲基-2-丁烯醛、乙酸丁酯、乙酸3-甲基丁酯、乙酸3-甲基-3-丁-1-烯酯、乙酸3-甲基-2-丁-1-烯酯、(E)-3,7-二甲基-1,3,6-一辛三烯、(Z)-3,7-二甲基-1,3,6-一辛三烯和2,3-环庚烯嘧啶(cycloheptenolpyridine)。在多种实施方案中，这些第二组份之一的量相对于以重量百分比单位计的异戊二烯的量(即组份的重量除以异戊二烯的重量，乘以100)是大于或约0.01、0.02、0.05、0.1、0.5、1、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100或110％(w/w)。
在一些实施方案中，该组合物包含(i)包含异戊二烯的气相和(ii)产生大于约400纳摩尔异戊二烯/gwcm/小时的培养的细胞。在一些实施方案中，该组合物包含封闭系统，且气相包含大于或约5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100μg/L异戊二烯(当归一化为培养1小时的1个OD600的1mL)。在一些实施方案中，该组合物包含开放系统，且气相包含大于或约5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100μg/L异戊二烯(当以1vvm的速度喷射时)。在一些实施方案中，与挥发性有机级分中的全部C5烃的总重量相比，气相的挥发性有机级分包含以重量计大于或约99.90、99.92、99.94、99.96、99.98,或100％异戊二烯。在一些实施方案中，与挥发性有机级分中的全部C5烃的总重量相比，气相的挥发性有机级分包含以重量计小于或约0.12、0.10、0.08、0.06、0.04、0.02、0.01、0.005、0.001、0.0005、0.0001、0.00005或0.00001％C5烃，而非异戊二烯(如1,3-环戊二烯、顺式-1,3-戊二烯、反式-1,3-戊二烯、1-戊炔、2-戊炔、1-戊烯,2-甲基-1-丁烯、3-甲基-l-丁炔、反式-戊间二烯、顺式-戊间二烯、戊-4-烯-1-炔、反式-戊-3-烯-1-炔或顺式-戊-3-烯-1-炔)。在一些实施方案中，与挥发性有机级分中的全部C5烃的总重量相比，气相的挥发性有机级分包含以重量计小于或约0.12、0.10、0.08、0.06、0.04、0.02、0.01、0.005、0.001、0.0005、0.0001、0.00005或0.00001％的1,3-环戊二烯、顺式-1,3-戊二烯、反式-1,3-戊二烯、1-戊炔、2-戊炔、1-戊烯、2-甲基-1-丁烯、3-甲基-l-丁炔、反式-戊间二烯、顺式-戊间二烯、戊-4-烯-1-炔、反式-戊-3-烯-1-炔或顺式-戊-3-烯-1-炔。在特定实施方案中，该气相的挥发性有机级分具有大于约2mg的异戊二烯，且与挥发性有机级分中的全部C5烃的总重量相比，以重量计具有大于或约99.90、99.92、99.94、99.96、99.98或100％的异戊二烯。
在一些实施方案中，该气相的挥发性有机级分包含小于或约50、40、30、20、10、5、1、0.5、0.1、0.05、0.01或0.005μg/L化合物，该化合物抑制(抑制异戊二烯聚合的)气相挥发性有机级分中的任意化合物的异戊二烯聚合。在特定实施方案中，该气相的挥发性有机级分还具有大于约2mg异戊二烯。
在一些实施方案中，气相的挥发性有机级分具有一种或多种化合物，该化合物选自乙醇、丙酮、C5异戊烯醇和具有10个或更多个碳原子的类异戊二烯化合物。在一些实施方案中，该气相的挥发性有机级分具有大于或约0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、10、20、30、40、60、80、100或120μg/L乙醇、丙酮、C5异戊烯醇(例如3-甲基-3-丁烯-1-醇或3-甲基-2-丁烯-1-醇)，或任意前述两种或更多物质。在特定实施方案中，该气相的挥发性有机级分还具有大于约2mg异戊二烯且具有一种或多种化合物，该化合物选自乙醇、丙酮、C5异戊烯醇和具有10个或更多个碳原子的类异戊二烯化合物。
在一些实施方案中，该气相的挥发性有机级分包含异戊二烯和一种或多种第二化合物，该化合物选自2-庚酮、6-甲基-5-庚-2-酮、2,4,5-三甲基吡啶、2,3,5-三甲基吡嗪、香茅醛、乙醛、甲硫醇、乙酸甲酯、1-丙醇、丁二酮、2-丁酮、2-甲基-3-丁烯-2-醇、乙酸乙酯、2-甲基-1-丙醇、3-甲基-1-丁醛、3-甲基-2-丁酮、1-丁醇、2-戊酮、3-甲基-1-丁醇、异丁酸乙酯、3-甲基-2-丁烯醛、乙酸丁酯、乙酸3-甲基丁酯、乙酸3-甲基-3-丁-1-烯酯、乙酸3-甲基-2-丁-1-烯酯、(E)-3,7-二甲基-1,3,6-一辛三烯、(Z)-3,7-二甲基-1,3,6-一辛三烯和2,3-环庚烯嘧啶。在多种实施方案中，气相的挥发性有机级分中的这些第二组份之一的量相对于以重量百分比单位计的异戊二烯的量(即组份的重量除以异戊二烯的重量，乘以100)是大于或约0.01、0.02、0.05、0.1、0.5、1、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100或110％(w/w)。
在本发明任意组合物的一些实施方案中，至少部分异戊二烯处于气相。在一些实施方案中，至少部分异戊二烯处于液相(如冷凝物)。在一些实施方案中，至少部分异戊二烯处于固相。在一些实施方案中，至少部分异戊二烯被固体支持物吸附，如包括二氧化硅和活性炭的支持物。在一些实施方案中，该组合物包括乙醇。在一些实施方案中，该组合物以重量计包括约75到约90％的乙醇，如以重量计约75到约80％、约80到约85％，或约85到约90％的乙醇。在一些实施方案中，该组合物以重量计包括约4到约15％的异戊二烯，如以重量计约4到约8％、约8到约12％，或约12到约15％的异戊二烯。
在一些实施方案中，本发明还描述了包括本文所述的任意细胞和/或组合物的系统。在一些实施方案中，该系统包括生物反应器，该腔室包含培养的细胞，该细胞产生大于约400、500、600、700、800、900、1,000、1,250、1,500、1,750、2,000、2,500、3,000、4,000、5,000或更多纳摩尔异戊二烯/gwcm/小时。在一些实施方案中，该系统不是封闭系统。在一些实施方案中，至少该部分异戊二烯从系统中去除。在一些实施方案中，该系统包括包含异戊二烯的气相。在多种实施方案中，该气相包含本文所述的任意组合物。
在一方面，本发明提供包含聚异戊二烯的轮胎。在一些实施方式中，该聚异戊二烯是由(i)聚合在本文所述的任意组合物中的异戊二烯或(ii)聚合由本文所述的任意组合物回收的异戊二烯所产生的。在一些实施方式中，聚异戊二烯包含顺式-1,4-聚异戊二烯。
本发明的任意组合物、系统和方法的一些实施方案中，在气相中产生不燃性浓度的异戊二烯。在一些实施方案中，该气相包含小于约9.5％(体积)的氧气。在一些实施方案中，该气相包含大于或约9.5％(体积)的氧气，且气相中异戊二烯的浓度小于自燃的下限(lowerflammabilitylimit)或大于自燃的上限(upperflammabilitylimit)。在一些实施方案中，该气相的非异戊二烯部分包含约0％至约100％(体积)的氧气，如约10％至约100％(体积)的氧气。在一些实施方案中，该气相的非异戊二烯部分包含约0％至约99％(体积)的氮气。在一些实施方案中，该气相的非异戊二烯部分包含约1％至约50％(体积)的二氧化碳。
本发明的任意方面的一些实施方案中，培养的细胞产生大于或约400、500、600、700、800、900、1,000、1,250、1,500、1,750、2,000、2,500、3,000、4,000、5,000,或更多纳摩尔异戊二烯/gwcm/小时。本发明的任意方面的一些实施方案中，培养的细胞将细胞培养基中大于或约0.002、0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.12、0.14、0.16、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.2、1.4、1.6％或更多的碳转化为异戊二烯。本发明的任意方面的一些实施方案中，培养的细胞产生大于或约1、10、25、50、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1,000、1,250、1,500、1,750、2,000、2,500、3,000、4,000、5,000、10,000、100,000，或更多纳摩尔异戊二烯/以细胞湿重计的细胞克数/小时(纳摩尔/gwcm/小时)。本发明的任意方面的一些实施方案中，培养的细胞产生大于或约1、10、25、50、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1,000、1,250、1,500、1,750、2,000、2,500、3,000、4,000、5,000、10,000、100,000或更多毫克异戊二烯/升培养液(毫克/升培养液，其中培养液的体积包括细胞和细胞培养基的体积)的累积滴定度(总量)。本文公开了其他其他示例性异戊二烯产生速率和异戊二烯总产量。
在本发明任意方面的一些实施方案中，细胞还包含编码IDI多肽的异源核酸。在本发明任意方面的一些实施方案中，细胞还包含编码IDI多肽的内源核酸拷贝的插入片段。在本发明任意方面的一些实施方案中，细胞还包含编码DXS多肽的异源核酸。在本发明任意方面的一些实施方案中，细胞还包含编码DXS多肽的内源核酸拷贝的插入片段。在本发明任意方面的一些实施方案中，细胞还包含编码IDI多肽和DXS多肽的一种或多种核酸。在本发明任意方面的一些实施方案中，一种核酸编码异戊二烯合酶多肽、IDI多肽和DXS多肽。在本发明任意方面的一些实施方案中，一种载体编码异戊二烯合酶多肽、IDI多肽和DXS多肽。在本发明一些实施方式中，载体包含选择标记，如抗生素抗性核酸。
在本发明任意方面的一些实施方案中，异源异戊二烯合酶核酸有效连接T7启动子，例如在中或高拷贝质粒中含有的T7启动子。在本发明任意方面的一些实施方案中，异源异戊二烯合酶核酸有效连接Trc启动子，例如在中或高拷贝质粒中含有的Trc启动子。在本发明任意方面的一些实施方案中，异源异戊二烯合酶核酸有效连接Lac启动子，例如在低拷贝质粒中含有的Lac启动子。在本发明任意方面的一些实施方案中，异源异戊二烯合酶核酸有效连接内源启动子，例如内源性碱性丝氨酸蛋白酶启动子。在一些实施方式中，异源异戊二烯合酶核酸整合到不带选择标记的细胞的染色体中。
在一些实施方案中，一种或更多MVA途径、IDI、DXP或异戊二烯合酶核酸置于在稳定期比在生长期更有活性的启动子或因子的调控下。例如，一种或更多MVA途径、IDI、DXP或异戊二烯合酶核酸置于稳定期σ因子如RpoS的调控下。在一些实施方案中，一种或更多MVA途径、IDI、DXP或异戊二烯合酶核酸置于在稳定期诱导的启动子的调控下，如在稳定期有活性的应答调节基因诱导的启动子的调控下。
在本发明任意方面的一些实施方案中，至少一部分细胞在连续培养(如未稀释的连续培养)的至少或约5、10、20、40、50、60、65或更多次的细胞分裂中维持异源异戊二烯合酶核酸。在本发明任意方面的一些实施方案中，包括异戊二烯合酶、IDI或DXS核酸的核酸也包括选择标记，例如抗生素抗性核酸。
在本发明任意方面的一些实施方案中，细胞还包含编码MVA途径多肽(例如来自酿酒酵母(Saccharomycescerevisia)或粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)的MVA途径多肽)的异源核酸。在本发明任意方面的一些实施方案中，细胞还包含编码MVA途径多肽(例如来自酿酒酵母或粪肠球菌的MVA途径多肽)的内源核酸拷贝的插入片段。在本发明任意方面的一些实施方案中，细胞包含异戊二烯合酶、DXS和MVA途径核酸。在本发明任意方面的一些实施方案中，细胞包含异戊二烯合酶核酸、DXS核酸、IDI核酸和MVA途径核酸(除了IDI核酸以外)。
在本发明任意方面的一些实施方案中，异戊二烯合酶多肽是天然多肽，其来自植物如葛属(Pueraria)(例如，葛麻姆(Puerariamontana)或野葛(Puerarialobata))。
在本发明任意方面的一些实施方案中，细胞是细菌细胞，如革兰氏阳性细菌细胞(例如芽孢杆菌属细胞如枯草杆菌(Bacillussubtilis)细胞，或链霉菌属(Streptomyces)细胞，如浅青紫链霉菌(Streptomyceslividans)、天蓝色链霉菌(Streptomycescoelicolor)或灰色链霉菌(Streptomycesgriseus)细胞)。在本发明任意方面的一些实施方案中，细胞是革兰氏阴性细菌细胞(例如埃希氏菌属(Escherichia)细胞如大肠杆菌细胞(Escherichiacoli)，或泛菌属(Pantoea)细胞如柠檬泛菌(Pantoeacitrea)细胞)。在本发明任意方面的一些实施方案中，细胞是真菌细胞如丝状真菌细胞(例如木霉属(Trichoderma)细胞如里氏木霉(Trichodermareesei)细胞或曲霉属(Aspergillus)细胞如米曲霉(Aspergillusoryzae)和黑曲霉(Aspergillusniger)或酵母细胞(如耶氏酵母属(Yarrowia)细胞如解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)细胞)。
在本发明任意方面的一些实施方案中，微生物多肽碳源包括来自酵母或细菌的一或多种多肽。在本发明任意方面的一些实施方案中，植物多肽碳源包括来自大豆、玉米、卡诺拉油菜(canola)、麻风树、棕榈树、花生、向日葵、椰子、芥菜、油菜籽、棉籽、棕榈仁、橄榄、红花、芝麻或亚麻籽的一种或多种多肽。
在一方面，本发明描述了由任何的本发明组合物或方法所产生的产物。
附图简述
图1是用于在大肠杆菌中表达而密码子优化的野葛异戊二烯合酶基因的核苷酸序列(SEQIDNO:1)。atg起始密码子为斜体，终止密码子为粗体而添加的PstI位点有下划线。
图2是pTrcKudzu的图谱。
图3是pTrcKudzu的核苷酸序列(SEQIDNO:2)。RBS有下划线，野葛异戊二烯合酶起始密码子为粗体大写字母而终止密码子为粗体、大写、斜体字母。载体骨架是pTrcHis2B。
图4是pETNHisKudzu的图谱。
图5是pETNHisKudzu的核苷酸序列(SEQIDNO:5)。
图6是pCL-lac-Kudzu的图谱。
图7是pCL-lac-Kudzu的核苷酸序列(SEQIDNO:7)。
图8A是表示在没有载体的大肠杆菌BL21细胞中异戊二烯产生的图。
图8B是表示在具有pCL-lac-Kudzu的大肠杆菌BL21细胞中异戊二烯产生的图。
图8C是表示在具有pTrcKudzu的大肠杆菌BL21细胞中异戊二烯产生的图。
图8D是表示在具有pETN-HisKudzu的大肠杆菌BL21细胞中异戊二烯产生的图。
图9A是表示在14升补料分批发酵中大肠杆菌BL21/pTrcKudzu随发酵进程的OD的图。
图9B是表示在14升补料分批发酵中大肠杆菌BL21/pTrcKudzu随发酵进程的异戊二烯产生的图。
图10A是表示在柠檬泛菌中的异戊二烯产生的图。对照细胞没有重组野葛异戊二烯合酶。灰色菱形表示异戊二烯合成，黑色方块表示OD600。
图10B是表示在表达pCL-lacKudzu的柠檬泛菌中异戊二烯的产生的图。灰色菱形表示异戊二烯合成，黑色方块表示OD600。
图10C是表示在表达pTrcKudzu的柠檬泛菌中的异戊二烯产生的图。灰色菱形表示异戊二烯合成，黑色方块表示OD600。
图11是表示在表达重组异戊二烯合酶的枯草杆菌中的异戊二烯产生的图。BG3594comK是没有质粒的枯草杆菌菌株(天然异戊二烯产生)。CF443-BG3594comK是具有pBSKudzu的枯草杆菌菌株(重组异戊二烯产生)。y-轴上的IS表示异戊二烯。
图12是pBSKudzu#2的核苷酸序列(SEQIDNO:57)。
图13是用于在耶氏酵母中表达而密码子优化的野葛异戊二烯合酶的核苷酸序列(SEQIDNO:8)。
图14是包含用于在耶氏酵母中表达而密码子优化的野葛异戊二烯合酶基因的pTrex3g图谱。
图15是载体pSPZ1(MAP29Spb)的核苷酸序列(SEQIDNO:11)。
图16是用于在耶氏酵母中表达而密码子优化的合成的野葛(葛麻姆)异戊二烯基因的核苷酸序列(SEQIDNO:12)。
图17是合成的杂交杨(银白杨x欧洲山杨(PopulusalbaxPopulustremula))异戊二烯合酶基因的核苷酸序列(SEQIDNO:13)。ATG起始密码子为粗体而终止密码子有下划线。
图18A表示描绘载体pYLA1、pYL1和pYL2的构建的示意图。
图18B表示描绘载体pYLA(POP1)的构建的示意图。
图18C表示描绘载体pYLA(KZ1)的构建的示意图。
图18D表示描绘载体pYL1(KZ1)的构建的示意图。
图18E表示描绘载体pYLI(MAP29)的构建的示意图。
图18F表示描绘载体pYLA(MAP29)的构建的示意图。
图19表示异戊二烯的MVA和DXP代谢途径(根据F.Bouvier等人，ProgressinLipidRes.44:357-429,2005)。下面的描述包括对于途径中每种多肽的替代名称以及公开有用于测量所示多肽活性的测定法的参考(这些参考各在此通过整体引用作为参考，特别是对于在MVA和DXP途径中的多肽的多肽活性测定法)。甲羟戊酸途径：AACT；乙酰基-CoA乙酰基转移酶，MvaE,EC2.3.1.9.Assay:J.Bacteriol.,184:2116-2122,2002；HMGS；羟甲基戊二酰基-CoA合成酶，MvaS,EC2.3.3.10.Assay:IBacteriol.,184:4065-4070,2002；HMGR；3-羟基-3-甲基戊二酰基-CoA还原酶，MvaE,EC1.1.1.34.Assay:IBacteriol.,184:2116-2122,2002；MVK；甲羟戊酸激酶，ERG12,EC2.7.1.36.Assay:CurrGenet19:9-14,1991.PMK；磷酸甲羟戊酸激酶，ERG8,EC2.7.4.2,Assay:MolCellBiol.,11:620-631,1991；DPMDC；二磷酸甲羟戊酸脱羧酶，MVD1,BC4.1.1.33.Assay:Biochemistry,33:13355-13362,1994；IDI；异戊烯二磷酸δ异构酶，IDI1,EC5.3.3.2.Assay:IBiol.Chem.264:19169-19175,1989。DXP途径：DXS；1-脱氧木酮糖-5-磷酸合酶，dxs,BC2.2.1.7.Assay:PNAS,94:12857-62,1997；DXR；1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶，dxr,BC2.2.1.7.Assay:Eur.IBiochem.269:4446-4457,2002；MCT；4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D赤藓糖醇合酶，IspD,EC2.7.7.60.Assay:PNAS,97:6451-6456,2000；CMK；4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D赤藓糖醇激酶，IspE,BC2.7.1.148.Assay:PNAS,97:1062-1067,2000；MCS；2C-甲基-D-赤藓糖醇2,4-环二磷酸合酶，IspF,BC4.6.1.12.Assay:PNAS,96:11758-11763,1999；HDS；1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基-4-二磷酸合酶，ispG,EC1.17.4.3.Assay:IOrg.Chem.,70:9168-9174,2005；HDR；1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基-4-二磷酸还原酶，IspH,BC1.17.1.2.Assay:JACS,126:12847-12855,2004。
图20表示由没有(左)或具有(右)野葛异戊二烯合酶基因的重组解脂耶氏酵母菌株产生的异戊二烯的GC-MS分析结果的图。箭头表示可信的异戊二烯标准的洗脱时间。
图21是pTrcKudzuyIDIDXSKan的图。
图22是pTrcKudzuyIDIDXSKan的核苷酸序列(SEQIDNO:20)。
图23A是表示在BL21/pTrcKudzukan中从葡萄糖产生异戊二烯的图。时间0是以IPTG(400μmol)诱导的时间。x轴是诱导后的时间；y轴是OD600并且y2轴是异戊二烯的总生产力(μg/L顶空(headspace)或比生产力(μg/L顶空/OD)。菱形表示OD600，圆圈表示总异戊二烯生产力(μg/L)而方块表示异戊二烯的比生产力(μg/L/OD)。
图23B是表示在BL21/pTrcKudzuyIDIkan中从葡萄糖产生的异戊二烯的图。时间0是以IPTG(400μmol)诱导的时间。x轴是诱导后的时间；y轴是OD600并且y2轴是异戊二烯的总生产力(μg/L顶空或比生产力(μg/L顶空/OD)。菱形表示OD600，圆圈表示总异戊二烯生产力(μg/L)而方块表示异戊二烯的比生产力(μg/L/OD)。
图23C是表示在BL21/pTrcKudzuDXSkan中从葡萄糖产生的异戊二烯的图。时间0是以IPTG(400μmol)诱导的时间。x轴是诱导后的时间；y轴是OD600并且y2轴是异戊二烯的总生产力(μg/L顶空或比生产力(μg/L顶空/OD)。菱形表示OD600，圆圈表示总异戊二烯生产力(μg/L)而方块表示异戊二烯的比生产力(μg/L/OD)。
图23D是表示在BL21/pTrcKudzuyIDIDXSkan中从葡萄糖产生的异戊二烯的图。时间0是以IPTG(400μmol)诱导的时间。x轴是诱导后的时间；y轴是OD600并且y2轴是异戊二烯的总生产力(μg/L顶空或比生产力(μg/L顶空/OD)。菱形表示OD600，圆圈表示总异戊二烯生产力(μg/L)而方块表示异戊二烯的比生产力(μg/L/OD)。
图23E是表示在BL21/pCLPTrcKudzu中从葡萄糖产生异戊二烯的图。时间0是以IPTG(400μmol)诱导的时间。x轴是诱导后的时间；y轴是OD600并且y2轴是异戊二烯的总生产力(μg/L顶空或比生产力(μg/L顶空/OD)。菱形表示OD600，圆圈表示总异戊二烯生产力(μg/L)而方块表示异戊二烯的比生产力(μg/L/OD)。
图23F是表示在BL21/pCLPTrcKudzuyIDI中从葡萄糖产生异戊二烯的图。时间0是以IPTG(400μmol)诱导的时间。x轴是诱导后的时间；y轴是OD600并且y2轴是异戊二烯的总生产力(μg/L顶空或比生产力(μg/L顶空/OD)。菱形表示OD600，圆圈表示总异戊二烯生产力(μg/L)而方块表示异戊二烯的比生产力(μg/L/OD)。
图23G是表示在BL21/pCLPTrcKudzuDXS中从葡萄糖产生异戊二烯的图。时间0是以IPTG(400μmol)诱导的时间。x轴是诱导后的时间；y轴是OD600并且y2轴是异戊二烯的总生产力(μg/L顶空或比生产力(μg/L顶空/OD)。菱形表示OD600，圆圈表示总异戊二烯生产力(μg/L)而方块表示异戊二烯的比生产力(μg/L/OD)。
图23H是表示在BL21/pTrcKudzuIDIDXSkan中从葡萄糖产生的异戊二烯的图。箭头指示以IPTG(400μmol)诱导的时间。x轴是诱导后的时间；y轴是OD600并且y2轴是异戊二烯的总生产力(μg/L顶空或比生产力(μg/L顶空/OD)。黑色菱形表示OD600，黑色三角表示总异戊二烯生产力(μg/L)而白色方块表示异戊二烯的比生产力(μg/L/OD)。
图24是pTrcKKDyIkISkan的图谱。
图25是pTrcKKDyIkISkan的核苷酸序列(SEQIDNO:33)。
图26是pCLPtrcUpperPathway的图谱。
图27是pCLPtrcUpperPathway的核苷酸序列(SEQIDNO:46)。
图28表示含有下游MVA途径和用于整合到枯草杆菌染色体nprE基因座的酵母idi的表达盒的图谱。nprE上游/下游表示来自nprE基因座用于整合的各1kb序列。aprE启动子(碱性丝氨酸蛋白酶启动子)表示aprE基因的启动子(-35，-10，+1转录起始位点，RBS)。MVK1表示酵母甲羟戊酸激酶基因。RBS-PMK表示具有起始位点的芽孢杆菌RBS上游的酵母磷酸甲羟戊酸激酶基因。RBS-MPD表示具有起始位点上游的芽孢杆菌PBS的酵母二磷酸甲羟戊酸脱羧酶基因。RBS-IDI表示具有起始位点上游的芽孢杆菌RBS的酵母idi基因。终止子表示来自解淀粉芽孢杆菌(B.amyliquefaciens)的终止子碱性丝氨酸蛋白酶转录终止子。SpecR表示壮观霉素抗性标记。“用于扩增的nprE上游重复”表示用于扩增的上游区域的直接重复。
图29是含有下游MVA途径和用于整合到枯草杆菌染色体nprE基因座的酵母idi的表达盒的核苷酸序列(SEQIDNO:47)。
图30是p9796-poplar的图谱。
图31是p9796-poplar的核苷酸序列(SEQIDNO:48)。
图32是pTrcPoplar的图谱。
图33是pTrcPoplar的核苷酸序列(SEQIDNO:49)。
图34是pTrcKudzuyIDIKan的图谱。
图35是pTrcKudzuyIDIKan的核苷酸序列(SEQIDNO:50)。
图36是pTrcKudzuDXSKan的图谱。
图37是pTrcKudzuDXSKan的核苷酸序列(SEQIDNO:51)。
图38是pCLPTrcKudzu的图谱。
图39是pCLPTrcKudzu的核苷酸序列(SEQIDNO:52)。
图40是pCLPTrcKudzuA3的图谱。
图41是pCLPTrcKudzuA3的核苷酸序列(SEQIDNO:53)。
图42是pCLPTrcKudzuyIDI的图谱。
图43是pCLPTrcKudzuyIDI的核苷酸序列(SEQIDNO:54)。
图44是pCLPTrcKudzuDXS的图谱。
图45是pCLPTrcKudzuDXS的核苷酸序列(SEQIDNO:55)。
图46表示从生物质原料产生异戊二烯的图。小图A表示来自玉米秸秆的异戊二烯产生，小图B表示来自甘蔗渣的异戊二烯产生，小图C表示来自软木材木浆的异戊二烯产生，小图D表示来自葡萄糖的异戊二烯产生，小图E表示来自没有添加原料的细胞的异戊二烯产生。灰色方块表示在接种后的指定时间对培养物的OD600测量，而黑色三角表示在接种后的指定时间的异戊二烯产生。
图47A表示在没有添加葡萄糖的培养物中由BL21(λDE3)pTrcKudzuyIDIDXS(kan)产生的异戊二烯的图。方块表示OD600，而三角表示所产生的异戊二烯(μg/ml)。
图47B表示由BL21(λDE3)pTrcKudzuyIDIDXS(kan)从1％葡萄糖原料转化糖产生的异戊二烯的图。方块表示OD600，而三角表示所产生的异戊二烯(μg/ml)。
图47C表示由BL21(λDE3)pTrcKudzuyIDIDXS(kan)从1％转化糖原料产生的异戊二烯的图。方块表示OD600，而三角表示所产生的异戊二烯(μg/ml)。
图47D表示由BL21(λDE3)pTrcKudzuyIDIDXS(kan)从1％AFEX玉米秸秆原料产生的异戊二烯的图。方块表示OD600，而三角表示所产生的异戊二烯(μg/ml)。
图48表示表明酵母提取物对异戊二烯产生的影响的图。小图A表示在供给不同量的酵母提取物的发酵罐中光密度的时间进程。小图B表示在供给不同量的酵母提取物的发酵罐中异戊二烯滴定度的时间进程。滴定度定义为每升发酵培养液产生的异戊二烯的量。小图C表示酵母提取物对在生长于补料分批培养物中的大肠杆菌中异戊二烯产生的影响。
图49表示证明在500L生物反应器中含有pTrcKudzu+yIDI+DXS质粒的大肠杆菌细胞产生异戊二烯的图。小图A表示在供给葡萄糖和酵母提取物的500-L生物反应器中的光密度的时间进程。小图B表示在供给葡萄糖和酵母提取物的500-L生物反应器中异戊二烯滴定度的时间进程。滴定度定义为每升发酵培养液产生的异戊二烯的量。小图C表示从供给葡萄糖和酵母提取物的500-L生物反应器产生的总异戊二烯的时间进程。
图50是pJMupperpathway2的图谱。
图51是pJMupperpathway2的核苷酸序列(SEQIDNO:56)。
图52是pBSKudzu#2的图谱。
图53A是表示在14升补料分批发酵中表达重组野葛异戊二烯合酶的芽孢杆菌发酵时间期间的生长。黑色菱形表示没有重组异戊二烯合酶(天然异戊二烯产生)的对照菌株(BG3594comK)而灰色三角表示具有pBSKudzu(重组异戊二烯产生)的芽孢杆菌。
图53B是表示在14升补料分批发酵中表达重组野葛异戊二烯合酶的芽孢杆菌发酵时间期间的异戊二烯产生。黑色菱形表示没有重组异戊二烯合酶(天然异戊二烯产生)的对照菌株(BG3594comK)而灰色三角表示具有pBSKudzu(重组异戊二烯产生)的芽孢杆菌。
图54为在供给葡萄糖的15-L生物反应器中光密度的时间进程。
图55为在供给葡萄糖的15-L生物反应器中异戊二烯滴定度的时间进程。滴定度定义为每升发酵培养液产生的异戊二烯的量。
图56为从供给葡萄糖的15-L生物反应器产生的总异戊二烯的时间进程。
图57为在供给丙三醇的15-L生物反应器中光密度的时间进程。
图58为在供给丙三醇的15-L生物反应器中异戊二烯滴定度的时间进程。滴定度定义为每升发酵培养液产生的异戊二烯的量。
图59为从供给丙三醇的15-L生物反应器产生的总异戊二烯的时间进程。
图60A-60C为在供给葡萄糖的150-L生物反应器中光密度、甲羟戊酸滴定度和比生产力的时间进程。
图61A-61C为在供给葡萄糖的15-L生物反应器中光密度、甲羟戊酸滴定度和比生产力的时间进程。
图62A-62C为在供给葡萄糖的15-L生物反应器中光密度、甲羟戊酸滴定度和比生产力的时间进程。
图63A-63C为在供给葡萄糖的15-L生物反应器中光密度、异戊二烯滴定度和比生产力的时间进程。
图64A-64C为在供给葡萄糖的15-L生物反应器中光密度、异戊二烯滴定度和比生产力的时间进程。
图65A-65C为在供给葡萄糖的15-L生物反应器中光密度、异戊二烯滴定度和比生产力的时间进程。
图66A-66C为在供给葡萄糖的15-L生物反应器中光密度、异戊二烯滴定度和比生产力的时间进程。
图67A-67C为在供给葡萄糖的15-L生物反应器中光密度、异戊二烯滴定度和比生产力的时间进程。
图68为用于系列A的计算的绝热火焰温度图，该绝热火焰温度为针对多种氧水平下燃料浓度的函数。图例以其在图中出现的顺序列出曲线。例如，图例中第一项(40℃时空气中的异戊二烯)对应图中最上面的曲线。
图69为用于系列B的计算的绝热火焰温度图，该绝热火焰温度为针对含有4％水的多种氧水平下燃料浓度的函数。图例以其在图中出现的顺序列出曲线。
图70为用于系列C的计算的绝热火焰温度图，该绝热火焰温度为针对含有5％二氧化碳的多种氧水平下燃料浓度的函数。图例以其在图中出现的顺序列出曲线。
图71为用于系列D的计算的绝热火焰温度图，该绝热火焰温度为针对含有10％二氧化碳的多种氧水平下燃料浓度的函数。图例以其在图中出现的顺序列出曲线。
图72为用于系列E的计算的绝热火焰温度图，该绝热火焰温度为针对含有15％二氧化碳的多种氧水平下燃料浓度的函数。图例以其在图中出现的顺序列出曲线。
图73为用于系列F的计算的绝热火焰温度图，该绝热火焰温度为针对含有20％二氧化碳的多种氧水平下燃料浓度的函数。图例以其在图中出现的顺序列出曲线。
图74为用于系列G的计算的绝热火焰温度图，该绝热火焰温度为针对含有30％二氧化碳的多种氧水平下燃料浓度的函数。图例以其在图中出现的顺序列出曲线。
图75A为系列A的CAFT模型结果从重量百分比到体积百分比的转化的表。
图75B为绘制为体积百分比的来自图68中系列A的CAFT模型的可燃性结果图。
图76A为系列B的CAFT模型结果从重量百分比到体积百分比的转化的表。
图76B为绘制为体积百分比的来自图69中系列B的CAFT模型的可燃性结果图。
图77为可燃性测试容器图。
图78A为测试系列1(0％蒸汽、0psig(磅/平方英寸(表压))和40℃)的可燃性曲线图。
图78B为总结测试系列1的爆炸和非爆炸数据点的表。
图78C为与CAFT模型比较的测试系列1的可燃性曲线图。
图79A为测试系列2(4％蒸汽、0psig)和40℃)的可燃性曲线图。
图79B为总结测试系列2的爆炸和非爆炸数据点的表。
图79C为与CAFT模型比较的测试系列2的可燃性曲线图。
图80A和80B为测试系列1的详细实验条件和结果表。
图81为测试系列2的详细实验条件和结果表。
图82为计算的绝热火焰温度作为在3个大气压下针对多种氧/氮比例的燃料浓度的函数绘制成的图。
图83为计算的绝热火焰温度作为在1个大气压下针对多种氧/氮比例的燃料浓度的函数绘制成的图。
图84为采用图82的数据并按照实施例13中所述方法构建的可燃性气囊的图。试验数据点(圆圈)来自本文所述在1个大气压的初始系统压力下进行的测试。
图85为采用图83的数据并按照实施例13中所述方法构建的可燃性气囊的图。试验数据点(圆圈)来自本文所述在1个大气压的初始系统压力下进行的测试。
图86A为发酵废气的GC/MS色谱图。
图86B为图86A的扩展来表示发酵废气中出现的少量挥发物。
图87A为-78℃下低温捕获(cryo-trapping)后废气中存在的痕量挥发物的GC/MS色谱图。
图87B为-196℃下低温捕获后废气中存在的痕量挥发物的GC/MS色谱图。
图87C为图87B的扩展。
图87D为图87C的扩展。
图88A和88B是比较来自石油衍生的异戊二烯(图88A)和生物学产生的异戊二烯(图88B)的C5烃的GC/MS色谱图。标准品包含在主异戊二烯峰值周围洗脱的三种C5烃杂质(图88A)。相比而言，生物学产生的异戊二烯包含一定量乙醇和丙酮(3.41分钟的运行时间)(图88A)。
图89为表达野葛异戊二烯合酶且具有3g/L酵母提取物的葡萄糖供给的大肠杆菌BL21(DE3)pTrcIS菌株的发酵废气的分析图。
图90表示与异戊二烯结构上相似且还可作为聚合催化剂毒物的几种杂质的结构。
图91为pTrcHis2AUpperPathway(也称为pTrcUpperMVA)的图。
图92A-92C为pTrcHis2AUpperPathway(也称为pTrcUpperMVA)的核苷酸序列(SEQIDNO:86)。
图93为在供给葡萄糖的15-L生物反应器中光密度的时间进程。
图94为在供给葡萄糖的15-L生物反应器中异戊二烯滴定度的时间进程。滴定度定义为每升发酵培养液产生的异戊二烯的量。
图95为从供给葡萄糖的15-L生物反应器产生的总异戊二烯的时间进程。
图96为在供给转化糖的15-L生物反应器中光密度的时间进程。
图97为在供给转化糖的15-L生物反应器中异戊二烯滴定度的时间进程。滴定度定义为每升发酵培养液产生的异戊二烯的量。
图98为从供给转化糖的15-L生物反应器产生的总异戊二烯的时间进程。
图99为在供给葡萄糖的15-L生物反应器中光密度的时间进程。
图100为在供给葡萄糖的15-L生物反应器中异戊二烯滴定度的时间进程。滴定度定义为每升发酵培养液产生的异戊二烯的量。
图101为从供给葡萄糖的15-L生物反应器产生的异戊二烯比活性的时间进程。
图102是pCLPtrcUpperPathwayHGS2的图。
图103A-103C为pCLPtrcUpperPathwayHGS2的核苷酸序列(SEQIDNO:87)。
图104为在供给葡萄糖的15-L生物反应器中光密度的时间进程。
图105为在供给葡萄糖的15-L生物反应器中异戊二烯滴定度的时间进程。滴定度定义为每升发酵培养液产生的异戊二烯的量。
图106为从供给葡萄糖的15-L生物反应器产生的总异戊二烯的时间进程。
图107为质粒MCM330的图。
图108A-108C为质粒MCM330的核苷酸序列(SEQIDNO:90)。
图109为pET24D-Kudzu的图。
图110A-110B为pET24D-Kudzu的核苷酸序列(SEQIDNO:101)。
图111A为在供给葡萄糖的15-L生物反应器中光密度的时间进程。
图111B为在供给葡萄糖的15-L生物反应器中异戊二烯滴定度的时间进程。滴定度定义为每升发酵培养液产生的异戊二烯的量。
图111C为供给葡萄糖的15-L生物反应器中异戊二烯的比生产力的时间进程。
发明详述
一方面，本发明描述了产生增加量和/或纯度的异戊二烯的方法和组合物。如本文所用的，术语“异戊二烯”或“2甲基-1,3-丁二烯”(CAS#78-79-5)指从3,3-二甲基烯丙焦磷酸(DMAPP)中去除焦磷酸的直接且最终挥发性C5烃产品，且不涉及一种或多种异戊烯二磷酸(IPP)分子与一种或多种DMAPP的连接或聚合。
绝大部分异戊二烯衍生自作为非纯净C5烃级份的石化来源，在材料适合用于聚合之前其要求全面纯化(extensivepurification)。几种杂质尤其是问题，如果它们的结构与异戊二烯类似且它们可作为聚合催化剂的毒物。此类化合物包括1,3-环戊二烯、顺式-和反式-1,3-戊二烯、1-戊炔、2-戊炔、3-甲基-l-丁炔、反式-戊间二烯、顺式-戊间二烯、戊-4-烯-1-炔、反式-戊-3-烯-1-炔和顺式-戊-3-烯-1-炔(图90)。在一些实施方案中，本发明的异戊二烯组合物基本上不含任意污染性的不饱和C5烃。如实施例10中的进一步描述，使用本发明方法产生的异戊二烯组合物中除异戊二烯外未发现可检测量的不饱和C5烃(如1,3-环戊二烯、顺式-1,3-戊二烯、反式-1,3-戊二烯、1-戊炔、2-戊炔、1-戊烯、2-甲基-1-丁烯、3-甲基-l-丁炔、反式-戊间二烯、顺式-戊间二烯、戊-4-烯-1-炔、反式-戊-3-烯-1-炔或顺式-戊-3-烯-1-炔)。使用本文所述方法产生的一些异戊二烯组合物包含乙醇、丙酮和C5异戊烯醇，如由GC/MS确定的。从异戊二烯流中去除所有这些组分远比从衍生自石化来源的异戊二烯组合物中除去出现的异构C5烃级份容易。因此，在一些实施方案中，本发明的异戊二烯组合物需要为了聚合用规格的最少的处理。
一方面，本发明的组合物和方法增加异戊二烯生产力并且增加产生的异戊二烯的总量。例如，制备了产生4.8x104纳摩尔/gwem/hr的异戊二烯的细胞培养体系(表1)。这些体系的效率被细胞从细胞培养基所消耗的约2.2％的碳转化成异戊二烯所证明。如实施例和表2所示，产生了每升培养液约3g异戊二烯。如果需要，可以使用其他条件，如在此所述的那些，获得更大量的异戊二烯。在一些实施方式中，将可再生的碳源用于异戊二烯的产生。在一些实施方式中，异戊二烯的产生与细胞的生长去偶联(decouple)。在一些实施方式中，异戊二烯和任意氧化剂的浓度在不可燃范围内以降低，或消除在异戊二烯的产生和回收期间出现着火的风险。本发明的组合物和方法是想要的，因为它们允许每细胞的高异戊二烯产量，允许高碳产量、高异戊二烯纯度、高生产力、低能量利用、低生产成本和投资、以及最小的副反应。这一用于异戊二烯产生的有效、大规模、生物合成工艺为合成异戊二烯类橡胶提供了异戊二烯来源，并且为使用天然橡胶提供了期望的低成本替代法。
如下面进一步讨论，可以通过向细胞导入编码异戊二烯合酶多肽(例如植物异戊二烯合酶多肽)的异源核酸来显著增加由该细胞产生的异戊二烯量。异戊二烯合酶多肽将二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP)转化成异戊二烯。如在实施例中所示，在诸如大肠杆菌、柠檬泛菌、枯草杆菌、解脂耶氏酵母菌和里氏木霉的多种宿主细胞中表达异源葛麻姆(野葛)异戊二烯合酶多肽。所有这些细胞比没有异源异戊二烯合酶多肽的相应细胞产生出更多的异戊二烯。如表1和2所示，使用在此所述的方法产生了大量的异戊二烯。例如，具有异源异戊二烯合酶核酸的枯草杆菌细胞在14升发酵罐中比没有异源核酸的相应对照枯草杆菌细胞产生出高约10倍的异戊二烯(表2)。在发酵罐中由大肠杆菌产生出每升培养液(mg/L，其中培养液的体积包含细胞培养基的体积和细胞的体积)30mg异戊二烯而由枯草杆菌产生的是30mg/L，这表明可以产生显著量的异戊二烯(表2)。如果需要，可以在更大规模产生异戊二烯或者可以使用在此所述的其他条件来进一步增加异戊二烯的量。在下面以及在实施例部分中进一步详述表1和2所列出的载体以及实验条件。
表1：使用本发明的细胞培养物和方法，从摇瓶产生异戊二烯的示例性产量。用于测量异戊二烯产生的测定法描述于实施例I，第II部分。对于这一测定法，在一或多个时间点从摇瓶取出样品并培养30分钟。然后测量这一样品中产生的异戊二烯量。表1中列出了异戊二烯产生的顶空浓度和比速率，并且在此进一步描述。
*归一化为1OD600的1mL，在密封顶空瓶中培养1小时，其中液体与顶空体积比为1:19。
表2：使用本发明的细胞培养物和方法，在发酵罐中的示例性异戊二烯产量。用于测量异戊二烯产生的测定法描述于实施例I，第II部分。对于这一测定法，取发酵罐的废气样品，并分析异戊二烯的量。表2中列出了峰值顶空浓度(其是发酵期间的最高顶空浓度)、滴定度(其是每升培养液所产生的异戊二烯的总量)以及异戊二烯产生的峰值比速率(其是发酵期间的最高比速率)，并且在此进一步描述。
**归一化为1vvm的废气流速(每1L培养液每分钟1体积废气)。
此外，通过含有异源异戊二烯合酶核酸的细胞的异戊二烯产生可以经增加由该细胞所表达的1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶(DXS)多肽和/或异戊烯二磷酸异构酶(IDI)多肽的量所增强。例如，可以将DXS核酸和/或IDI核酸导入细胞中。DXS核酸可为异源核酸或内源核酸的拷贝。类似地，IDI核酸可为异源核酸或内源核酸的拷贝。在一些实施方式中，通过用产生DXS和/或IDI核酸更大转录的其他启动子和/或调控区代替内源DXS和/或IDI启动子和/或调控区来增加DXS和/或IDI多肽的量。在一些实施方式中，细胞含有编码异戊二烯合酶多肽(例如植物异戊二烯合酶核酸)的异源核酸以及编码异戊二烯合酶多肽的内源核酸的拷贝。
编码的DXS和IDI多肽是用于生物合成异戊二烯的DXP途径的一部分(图19)。DXS多肽将丙酮酸和D-甘油醛3-磷酸转变成1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸。虽然不想受任何特定理论所限，但相信增加DXS多肽量会增加通过DXP途径的碳流动，导致更大的异戊二烯产生。IDI多肽催化异戊烯二磷酸(IPP)和二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP)的相互转化。虽然不想受任何特定理论所限，但相信增加细胞中的IDI多肽量会增加IPP的量(和转化速率)，IPP被转化成DMAPP，其又被转化成异戊二烯。
例如，使用具有野葛异戊二烯合酶、酿酒酵母IDI和大肠杆菌DXS核酸的大肠杆菌细胞发酵产生异戊二烯。异戊二烯的水平在15小时的时间段从50至300μg/L变化(实施例7，第VII部分)。
在一些实施方式中，异源或额外的内源异戊二烯合酶、IDI和DXS核酸的存在使得细胞相比于只具有这些异源或额外的内源核酸中一种或两种的相应细胞更加可繁殖地生长或者存活更长。例如，含有异源异戊二烯合酶、IDI和DXS核酸的细胞比只有异源异戊二烯合酶和DXS核酸或者只有异源异戊二烯合酶核酸的细胞生长得更好。而且，已将异源异戊二烯合酶、IDI和DXS核酸成功地有效连接至在大肠杆菌细胞中维持的高拷贝质粒上的强启动子，这表明大量的这些多肽可以在细胞中表达而不会对细胞造成过量的毒性。虽然不想受特定理论所限，但是相信异源或额外的内源异戊二烯合酶和IDI核酸的存在可降低一种或多种潜在的毒性中间产物的量，该中间产物本来是在细胞中存在仅仅一种异源或额外的内源DXS核酸时积累的。
在一些实施方式中，通过增加细胞表达的MVA多肽的量增加由含有异源异戊二烯合酶核酸的细胞产生的异戊二烯(图19)。示例性MVA途径多肽包含任何下述多肽：乙酰-CoA乙酰转移酶(AA-CoA硫解酶)多肽、3-羟基-3-甲基戊二酰基-CoA合酶(HMG-CoA合酶)多肽、3-羟基-3-甲基戊二酰基-CoA还原酶(HMG-CoA还原酶)多肽、甲羟戊酸激酶(MVK)多肽、磷酸甲羟戊酸激酶(PMK)多肽、二磷酸甲羟戊酸脱羧酶(MVD)多肽、IDI多肽和具有两种或更多种MVA途径多肽活性的多肽(例如融合多肽)。例如，可以将一或多个MVA途径核酸导入细胞中。在一些实施方式中，细胞含有上游MVA途径，其该上游MVA途径包括AACoA硫解酶、HMG-CoA合酶和HMG-CoA还原酶核酸。在一些实施方式中，细胞含有下游MVA途径，该下游MVA途径包括MVK、PMK、MVD和IDI核酸。MVA途径核酸可为异源核酸或者内源核酸的拷贝。在一些实施方式中，通过用导致MVA途径核酸更大转录的其他启动子和/或调控区来替代MVA途径核酸的内源启动子和/或调控区而增加该一种或多种MVA途径多肽的量。在一些实施方式中，细胞含有编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸(例如植物异戊二烯合酶核酸)和编码异戊二烯合酶多肽的内源核酸的拷贝。
例如，含有编码野葛异戊二烯合酶多肽的核酸以及编码酿酒酵母MVK、PMK、MVD和IDI多肽的核酸的大肠杆菌细胞以6.67x10-4nmol/L培养液/OD600/hr的速率产生异戊二烯(参见实施例8)。此外，14升具有编码粪肠球菌AA-Co硫解酶、HMG-CoA合酶和HMG-CoA还原酶的核酸的大肠杆菌发酵物产生22克甲羟戊酸(MVA途径的中间产物)。这些细胞的摇瓶产生每升2-4克的甲羟戊酸。这些结果表明异源MVA途径核酸在大肠杆菌中是有活性的。含有上游MVA途径和下游MVA途径以及野葛异戊二烯合酶的核酸的大肠杆菌细胞(菌株MCM127)相比于具有只用于下游MVA途径和野葛异戊二烯合酶的核酸的大肠杆菌细胞(菌株MCM131)产生显著更多的异戊二烯(874μg/L)(参见表3和实施例8，第VIII部分)。
在一些实施方式中，在连续培养物(例如没有稀释的连续培养物)中，至少一部分的细胞维持异源异戊二烯合酶、DXS、IDI和/或MVA途径核酸至少约5、10、20、50、75、100、200、300或更多的细胞分裂。在本发明任何方面的一些实施方式中，包含异源或内源异戊二烯合酶拷贝、DXS、IDI和/或MVA途径核酸的核酸也包含选择标记，如卡那霉素、氨苄青霉素、羧苄青霉素、庆大霉素、潮霉素、腐草霉素、博来霉素、新霉素，或氯霉素抗生素抗性核酸。
如实施例7，第VI部分所示，可以通过将酵母提取物加入细胞培养基中进一步增加所产生的异戊二烯的量。在一些实施方式中，所产生的异戊二烯的量与用于浓度检测的细胞培养基中的酵母提取物的量为线性比例的(图48C)。此外，从具有酵母提取物和葡萄糖的细胞培养基产生了约每升培养液0.11克异戊二烯(实施例7，第VIII部分)。这些实验都使用具有野葛异戊二烯合酶、酿酒酵母IDI和大肠杆菌DXS核酸的大肠杆菌细胞来产生异戊二烯。相比于在酵母提取物存在下增加葡萄糖的量，在葡萄糖存在下增加酵母提取物的量导致产生更多的异戊二烯。而且，增加酵母提取物的量允许细胞在更长的时间里产生高水平的异戊二烯并且提高细胞的健康水平。
也使用三种类型的水解生物量(甘蔗渣，玉米秸秆和软木材木浆)作为碳源来阐述了异戊二烯的产生(图46A-C)。具有野葛异戊二烯合酶、酿酒酵母IDI和大肠杆菌DXS核酸的大肠杆菌细胞从这些水解的生物量碳源比从等量葡萄糖(例如，1％葡萄糖，w/v)产生出更多的异戊二烯。如果需要，本发明的组合物和方法中可以使用任何其他生物量碳源。生物量碳源是想要的，因为它们比许多常规细胞培养基更便宜，从而促进经济地产生异戊二烯。
此外，显示出转化糖作为产生异戊二烯的碳源的作用(图47C和96-98)。例如，从表达MVA途径多肽和野葛异戊二烯合酶的细胞中产生2.4g/L的异戊二烯(实施例8，第XV部分)。丙三醇也被用作碳源，从表达野葛异戊二烯合酶的细胞中产生2.2mg/L的异戊二烯(实施例8，第XV部分)。除了异戊二烯合酶核酸，表达DXS核酸、IDI核酸和/或一种或多种MVA途径核酸(如编整个MVA途径的编码核酸)可提高从丙三醇的异戊二烯的产生。
在一些实施方式中，细胞培养基中包含油。例如，含有野葛异戊二烯合酶核酸的枯草杆菌细胞在含有油和葡萄糖源的细胞培养基中培养时，产生异戊二烯(实施例4，第III部分)。在一些实施方式中，细胞培养基中包含一种以上的油(例如2、3、4、5或更多种油)。虽然不想受任何特定理论所限，但相信(i)油可增加在细胞中可用于向异戊二烯转变的碳量，(ii)油可增加在细胞中的乙酰-CoA的量，从而增加通过MVA途径的碳流动，和/或(ii)油可向细胞提供额外的营养，这是想要的，因为细胞中的许多碳转变成异戊二烯而不是其他产物。在一些实施方式中，在含有油的细胞培养基中培养的细胞天然使用MVA途径来产生异戊二烯或者通常被修饰以含有用于整个MVA途径的核酸。在一些实施方式中，油在加入细胞培养基中之前部分或全部水解以促进宿主细胞对油的使用。
小分子如异戊二烯在细胞(如细菌)中的商业生产的主要障碍之一是该分子的产生与细胞的生长的去偶联。在一些商业上可用的异戊二烯产生的实施方案中，来自原料的大量的碳转化为异戊二烯，而不是用于细胞的生长和保持(“碳效率”)。在多种实施方案中，该细胞将细胞培养基中大于或约0.0015、0.002、0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.12、0.14、0.16、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、5.0、6.0、7.0，或8.0％的碳转化为异戊二烯。在特定实施方案中，来自原料被转化为下游产品的碳的大部分被转化为异戊二烯。如实施例11中进一步描述，表达MVA途径和野葛异戊二烯合酶核酸的大肠杆菌细胞显示出异戊二烯或中间的甲羟戊酸的产生与生长去偶联，导致高碳效率。特别地，从表达来自粪肠球菌的上游(upper)MVA途径的细胞形成甲羟戊酸。从表达来自粪肠球菌的上游MVA途径、来自酿酒酵母的下游(lower)MVA途径和来自葛麻姆(野葛)的异戊二烯合酶的细胞形成异戊二烯。大肠杆菌的四个不同菌株(BL21(LDE3)、BL21(LDE3)Tuner、FM5和MG1655)表明异戊二烯或甲羟戊酸产生与生长去偶联。前两种大肠杆菌菌株是B菌株，而后两种是K12菌株。删除ack和pta基因的MG1655变体中也表明产生与生长的去偶联。该变体还表明了较少的乙酸盐/酯产生。
示例性多肽和核酸
多种异戊二烯合酶，DXS，IDI和/或MVA途径多肽和核酸可以用于本发明的组合物和方法。
如在此使用，“多肽”包括多肽、蛋白质、肽、多肽片段和融合多肽。在一些实施方案中，该融合多肽包括第一多肽(例如异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径多肽，或其催化的活性片段)的部分或全部，且任选包括第二多肽(例如方便融合多肽纯化及检测的肽，如His-标签)的部分或全部。在一些实施方式中，融合多肽具有两种或更多种MVA途径多肽(例如AA-CoA硫解酶和HMG-CoA还原酶多肽)的活性。在一些实施方式中，多肽是具有两种或更多种MVA途径多肽活性的天然发生的多肽(例如由粪肠球菌mvaE核酸编码的多肽)。
在多种实施方式中，多肽具有至少或约50、100、150、175、200、250、300、350、400或更多个氨基酸。在一些实施方式中，多肽片段含有来自全长多肽的至少或约25、50、75、100、150、200、300或更多个连续氨基酸并且它具有相应全长多肽活性的至少或约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％。在具体实施方式中，多肽包含任何天然发生的异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径多肽的整个氨基酸序列或序列区段。在一些实施方式中，多肽相比于野生型(即天然发生的序列)异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径多肽序列具有一或多个突变。
在一些实施方式中，多肽是分离的多肽。如在此所用，“分离的多肽”不是多肽文库，例如2、5、10、20、50或更多种不同多肽的文库的一部分，并且与至少一种与其一起天然发生的组分分离。分离的多肽可以例如通过表达编码该多肽的重组核酸而获得。
在一些实施方式中，多肽是异源多肽。对于“异源多肽”，指氨基酸序列与在相同宿主细胞中天然表达的另一多肽的氨基酸序列不相同的多肽。特别地，异源多肽与在相同天然宿主细胞中的野生型核酸不相同。
如在此使用，“核酸”指单链或双链形式的两个或更多个脱氧核糖核酸和/或核糖核酸。在一些实施方式中，核酸是重组核酸。“重组核酸”，指不含一种或多种核酸(例如基因)的目的核酸，该一种或多种核酸在该目的核酸所源自的生物的天然发生的基因组中，以该目的核酸为侧翼。该术语因此包含，例如整合到载体、整合到自主复制的质粒或病毒，或整合到原核或真核生物的基因组DNA，或者以独立于其他序列而作为分离分子(如cDNA、基因组DNA片段，或由PCR或限制性内切酶酶切所产生的cDNA片段)存在的重组DNA。在多种实施方案中，核酸是重组核酸。在一些实施方式中，异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径核酸有效连接到编码全部或部分的另一多肽的另一核酸以便该重组核酸编码包含异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径多肽以及全部或部分另一多肽(例如，促进融合多肽纯化或检测的肽，例如His-标签)的融合多肽。在一些实施方式中，部分或全部的重组核酸是化学合成的。
在一些实施方式中，核酸是异源核酸。对于“异源核酸”，指核酸序列与在相同宿主细胞中天然发现的另一核酸的核酸序列不相同的核酸。
在具体实施方式中，核酸包含任何天然发生的异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径核酸的整个核酸序列或其区段。在一些实施方式中，核酸包含来自天然发生的异戊二烯合酶核酸、DXS、IDI或MVA途径核酸的至少或约50、100、150、200、300、400、500、600、700、800或更多连续核苷酸。在一些实施方式中，核酸相比于野生型(即天然发生的序列)异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径核酸的序列具有一个或多个突变。在一些实施方式中，核酸具有增加异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径核酸转录或翻译的一或多个突变(例如，沉默突变)。在一些实施方式中，核酸是任何编码异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径多肽的核酸的简并变体。
“密码子简并性”指遗传密码的发散，这允许核苷酸序列的变化而不会影响编码多肽的氨基酸序列。熟练技术人员会充分意识到在使用核苷酸密码子来说明给定氨基酸时，由特定宿主细胞所展现的“密码子偏好”。因此，当合成核酸以改善在宿主细胞中的表达时，想要在一些实施方式中设计核酸，使得其密码子使用频率接近宿主细胞的偏好密码子使用频率。
示例性异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径多肽和核酸的登录号列于附录1(附录1的登录号和它们相应的序列在此通过整体引用作为参考，特别是对于异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径多肽和核酸的氨基酸和核酸序列)。Kegg数据库也含有许多示例性异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径多肽和核酸的氨基酸和核酸序列(参见，例如，网址为“genome.jp/kegg/pathway/map/map00100.html”的互联网和其中的序列，其在此通过整体引用作为参考，特别是对于异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径多肽和核酸的氨基酸和核酸序列)。在一些实施方式中，一种或多种异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径多肽和/或核酸具有与2007年12月12日公开可获得的序列(例如对应于附录1中任何登录号的任何序列或者Kegg数据库中存在的任何序列)相同的序列。进一步在下面描述其他的示例性异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径多肽和核酸。
示例性异戊二烯合酶多肽和核酸
如上面所指出，异戊二烯合酶多肽将二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP)转变成异戊二烯。示例性的异戊二烯合酶多肽包含多肽、多肽片段、肽和具有异戊二烯合酶多肽的至少一种活性的融合多肽。标准方法可以通过测量多肽在体外、在细胞提取物中或在体内将DMAPP转变成异戊二烯的能力而用来测定该多肽是否具有异戊二烯合酶多肽活性。在示例性的测定法中，通过按实施例1所述以摇瓶法生长菌株(例如在此所述的E.coli/pTrcKudzu菌株)来制备细胞提取物。在完成诱导后，将约10mL的细胞在7000xg离心10分钟沉淀并在5ml没有甘油的PEB中重悬浮。使用标准方法，用弗氏压碎器裂解细胞。或者，在-80℃冻融后，用溶菌酶(Ready-Lyse溶菌酶溶液；EpiCentre)处理细胞。
例如，可以按照Silver等人，JBiol.Chem.270:13010-13016,1995以及其中参考文献所述来测量细胞提取物中的异戊二烯合酶多肽活性，它们在此通过整体引用作为参考，特别是对于异戊二烯合酶多肽活性的测定法。在氮蒸汽下蒸发DMAPP(Sigma)至干燥并且在pH8.2的100mM磷酸钾缓冲液中再水化至100mM浓度并储存于-20℃。为了进行测定法，在具有金属螺帽和涂覆特氟龙的硅隔板(AgilentTechnologies)的20ml顶空样品瓶(AgilentTechnologies)中，将5μl的1MMgCl2、1mM(250μg/ml)DMAPP、65μl的PlantExtractBuffer(PEB)(50mMTris-HCl，pH8.0，20mMMgCl2，5％丙三醇和2mMDTT)加入25μl的细胞提取物中并在37℃振荡培养15分钟。通过加入200μl的250mMEDTA淬灭反应并通过GC/MS来量化，如在实施例1，第II部分所述。
示例性异戊二烯合酶核酸包含编码多肽、多肽片段、肽或具有异戊二烯合酶多肽的至少一种活性的融合多肽的核酸。示例性的异戊二烯合酶多肽和核酸包含来自任何在此所述的来源生物的天然发生的多肽和核酸以及源自在此所述任何来源生物的突变多肽和核酸。
在一些实施方式中，异戊二烯合酶多肽或核酸是来自豆科(Fabaceae)，例如蝶形花亚科(Faboideae)。在一些实施方式中，异戊二烯合酶多肽或核酸是来自葛麻姆(野葛)(Sharkey等人，PlantPhysiology137:700-712,2005)、野葛、杨(如银白杨x欧洲山杨(Populusalbaxtremula)(CAC35696)Miller等人，Planta213:483-487,2001)、白杨(如美洲山杨(Populustremuloides))(Silver等人，JBC270(22):13010-1316,1995)或英国栎(夏栎(Quercusrobur))(Zimmer等人，WO98/02550)的天然多肽或核酸，其各在此通过整体引用作为参考，特别是对于异戊二烯合酶核酸和异戊二烯合酶多肽的表达。适合的异戊二烯合酶包括但不限于，Genbank登录号AY341431、AY316691、AY279379、AJ457070和AY182241所鉴定的那些，其各在此通过整体引用作为参考，特别是对于异戊二烯合酶核酸和多肽的序列。在一些实施方式中，异戊二烯合酶多肽或核酸不是来自夏栎的天然发生的多肽或者核酸(即异戊二烯合酶多肽或核酸是除了来自夏栎的天然发生的多肽或者核酸以外的异戊二烯合酶多肽或核酸)。在一些实施方式中，异戊二烯合酶核酸或多肽不是来自杨的天然发生的多肽或核酸(如银白杨x欧洲山杨CAC35696)。
示例性DXS多肽和核酸
如上所指出，1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶(DXS)多肽将丙酮酸和D-甘油醛-3-磷酸转变成1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸。示例性DXS多肽包含多肽、多肽片段、肽和具有DXS多肽的至少一种活性的融合多肽。标准方法(如在此所述的那些)可以通过测量多肽在体外、在细胞提取物中或在体内将丙酮酸和D-甘油醛-3-磷酸转变成1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸的能力而用来测定该多肽是否具有DXS多肽活性。示例性DXS核酸包含编码具有DXS多肽的至少一种活性的多肽、多肽片段、肽或融合多肽的核酸。示例性DXS多肽和核酸包含来自在此所述的任何源生物的天然发生的多肽和核酸以及源自在此所述的任何源生物的突变多肽和核酸。
示例性IDI多肽和核酸
异戊烯二磷酸异构酶多肽(异戊烯二磷酸δ异构酶或IDI)催化异戊烯二磷酸(IPP)和二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP)的相互转变(例如将IPP转变成DMAPP和/或将DMAPP转变成IPP)。示例性IDI多肽包含具有IDI多肽的至少一种活性的多肽、多肽片段、肽和融合多肽。标准方法(如在此所述的那些)可以通过测量多肽在体外、在细胞提取物中或在体内对IPP和DMAPP相互转变的能力而用来测定该多肽是否具有IDI多肽活性。示例性IDI核酸包含编码具有IDI多肽的至少一种活性的多肽、多肽片段、肽或融合多肽的核酸。示例性IDI多肽和核酸包含来自在此所述的任何源生物的天然发生的多肽和核酸以及源自在此所述的任何源生物的突变多肽和核酸。
示例性MVA途径多肽和核酸
示例性MVA途径多肽包含乙酰基-CoA乙酰转移酶(AACoA硫解酶)多肽、3-羟基-3-甲基戊二酰基-CoA合酶(HMG-CoA合酶)多肽、3-羟基-3-甲基戊二酰基-CoA还原酶(HMG-CoA还原酶)多肽、甲羟戊酸激酶(MVK)多肽、磷酸甲羟戊酸激酶(PMK)多肽、二磷酸甲羟戊酸脱羧酶(MVD)多肽、IDI多肽，和具有两种或更多种MVA途径多肽活性的多肽(例如融合多肽)。特别地，MVA途径多肽包含具有MVA途径多肽的至少一种活性的多肽、多肽片段、肽和融合多肽。示例性MVA途径核酸包含编码具有MVA途径多肽的至少一种活性的多肽、多肽片段、肽或融合多肽的核酸。示例性MVA途径多肽和核酸包含来自在此所述的任何源生物的天然发生的多肽和核酸以及源自在此所述的任何源生物的突变多肽和核酸。
特别地，乙酰基-CoA乙酰转移酶多肽(AA-CoA硫解酶或AACT)将两分子的乙酰基-CoA转变成乙酰乙酰基-CoA。标准方法(如在此所述的那些)可以通过测量多肽在体外、在细胞提取物中或在体内将两分子乙酰基-CoA转变成乙酰乙酰基-CoA的能力而用来测定该多肽是否具有AA-CoA硫解酶多肽活性。
3-羟基-3-甲基戊二酰基-CoA合酶(HMG-CoA合酶或HMGS)多肽将乙酰乙酰基-CoA转变成3-羟基-3-甲基戊二酰基-CoA。标准方法(如在此所述的那些)可以通过测量多肽在体外、在细胞提取物中或在体内将乙酰乙酰基-CoA转变成3-羟基-3-甲基戊二酰基-CoA的能力而用来测定该多肽是否具有HMG-CoA合酶多肽活性。
3-羟基-3-甲基戊二酰基-CoA还原酶(HMG-CoA还原酶或HMGR)多肽将3-羟基-3-甲基戊二酰基-CoA转变成甲羟戊酸。标准方法(如在此所述的那些)可以通过测量多肽在体外、在细胞提取物中或在体内将3-羟基-3-甲基戊二酰基-CoA转变成甲羟戊酸的能力而用来测定该多肽是否具有HMG-CoA还原酶多肽活性。
甲羟戊酸激酶(MVK)多肽使甲羟戊酸磷酸化以形成甲羟戊酸-5-磷酸。标准方法(如在此所述的那些)可以通过测量多肽在体外、在细胞提取物中或在体内将甲羟戊酸转变成甲羟戊酸-5-磷酸的能力而用来测定该多肽是否具有MVK多肽活性。
磷酸甲羟戊酸激酶(PMK)多肽使甲羟戊酸-5-磷酸磷酸化以形成甲羟戊酸-5-二磷酸。标准方法(如在此所述的那些)可以通过测量多肽在体外、在细胞提取物中或在体内将甲羟戊酸-5-磷酸转变成甲羟戊酸-5-二磷酸的能力而用来测定该多肽是否具有PMK多肽活性。
二磷酸甲羟戊酸脱羧酶(MVD或DPMDC)多肽将甲羟戊酸-5-二磷酸转变成异戊烯二磷酸多肽(IPP)。标准方法(如在此所述的那些)可以通过测量多肽在体外、在细胞提取物中或在体内将甲羟戊酸-5-二磷酸转变成IPP的能力而用来测定该多肽是否具有MVD多肽活性。
示例性IDI多肽和核酸如上所述。
分离核酸的示例性方法
可以使用标准方法来分离异戊二烯合酶、DXS、IDI和/或MVA途径核酸。从目的源生物(例如细菌基因组)获得想要的核酸的方法是常规的并且是分子生物学领域公知的(参见，例如WO2004/033646及其中引用的文献，其各在此通过整体引用作为参考，特别是对于目的核酸的分离)。例如，如果核酸序列是已知的(例如任何在此所述的已知核酸)，那么可通过限制性内切核酸酶消化来产生适当的基因组文库并且可用与想要的核酸序列互补的探针筛选该文库。一旦分离了序列，可使用标准引物导向扩增方法，如聚合酶链式反应(PCR)来扩增DNA(美国专利号4,683,202，其在此通过整体引用作为参考，特别是对于PCR方法)来获得适于使用适当的载体来转化的DNA量。
或者，可以使用标准方法来化学合成异戊二烯合酶、DXS、IDI和/或MVA途径核酸，例如具有已知核酸序列的任何异戊二烯合酶、DXS、IDI和/或MVA途径核酸。
可以使用标准方法来鉴定可适合用于在此所述组合物和方法的其他异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径的多肽。例如，可以在诸如大肠杆菌的生物中构建已知天然产生异戊二烯的生物的染色体DNA的黏粒文库，然后筛选异戊二烯产生。特别地，可产生黏粒文库，在该文库中，基因组DNA的大区段(35-45kb)包装到载体并用于转化适当的宿主。黏粒载体是独特的，因为能接纳大量DNA。通常，黏粒载体具有封装以及随后环化异源DNA所需的至少一个拷贝的cosDNA序列。除了cos序列，这些载体也含有诸如ColEI的复制起点以及药物抗性标记如对于氨苄青霉素或新霉素有抗性的核酸。使用黏粒载体来转化适当的细菌宿主的方法充分描述于Sambrook等人，MolecularCloning:ALaboratoryManual，第二版，ColdSpringHarbor,1989，其在此通过整体引用作为参考，特别是对于转化方法。
通常对于克隆黏粒，使用适当的限制性内切核酸酶分离异源DNA并使用适当的连接酶将与其邻近黏粒载体的cos区连接。然后将含有线性异源DNA的黏粒载体与DNA包装载体如噬菌体反应。在包装过程期间，切割cos位点并将异源DNA包装到细菌病毒颗粒的头部。然后使用这些颗粒来转染适当的宿主细胞如大肠杆菌。一旦注入细胞，异源DNA在cos粘末端的影响下环化。以这一方式，可以将大区段异源DNA导入宿主细胞并表达。
其他获得异戊二烯合酶、DXS、IDI和/或MVA途径核酸的方法包括通过测定法(例如在此所述的顶空测定法)或通过使用针对于编码一段保守氨基酸(例如，至少3个保守氨基酸)的核苷酸的引物进行PCR来筛选宏基因组文库。可以通过比对已知异戊二烯合酶、DXS、IDI和/或MVA途径多肽的氨基酸序列来鉴定保守氨基酸。可以基于已知的异戊二烯合酶多肽的比对序列鉴定异戊二烯合酶多肽的保守氨基酸。可以对发现能天然产生异戊二烯的生物进行标准蛋白纯化方法(这是本领域公知的)并且可以使用标准方法对得到的纯化多肽测序。文献中记载了其他方法(参见，例如Julsing等人，Applied.Microbiol.Biotechnol.75:1377-84,2007；Withers等人，ApplEnvironMicrobiol.73(l9):6277-83,2007，其各在此通过整体引用作为参考，特别是对于参与异戊二烯合成的核酸鉴定)。
此外，可以使用标准序列比对和/或结构预测程序来根据其他DXS、IDI或MVA途径多肽和核酸的一级和/或预测的多肽二级结构与已知DXS、IDI或MVA途径多肽和核酸的结构的相似性而鉴定它们。也可以使用标准数据库如swissprot-trembl数据库(网址在“expasy.org”,SwissInstituteofBioinformaticsSwiss-ProtgroupCMU-1rueMichelServetCH-1211Geneva4,Switzerland)来鉴定异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径多肽和核酸。可以使用标准结构预测程序(例如PredictProtein(630West,168Street,BB217,NewYork,N.Y.10032,USA))的默认设置来预测异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径多肽的二级和/或三级结构。或者，可以使用标准方法来测定异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径多肽的实际二级和/或三级结构。也可以通过与从已知异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径核酸产生的探针杂交来鉴定其他异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径核酸。
示例性启动子和载体
任何在此所述的异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径核酸可以包含在一或多个载体中。因此，本发明也表征了具有编码在此所述的任何异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径多肽的一种以上的核酸的载体。如在此使用，“载体”指能够递送，并期望地在宿主细胞中表达一种或多种目的核酸的构建体。载体的实例包含但不限于质粒、病毒载体、DNA或RNA表达载体、黏粒和噬菌体载体。在一些实施方式中，载体含有受表达控制序列所控的核酸。
如在此使用，“表达控制序列”指指导目的核酸转录的核酸序列。表达控制序列可以是启动子，如组成型或诱导型启动子，或增强子。“诱导型启动子”是在环境或发育调控下有活性的启动子。表达控制序列有效地连接待转录的核酸区段。
在一些实施方式中，载体含有选择标记。术语“选择标记”指能够在宿主细胞中表达的核酸，该选择标记允许轻易选择那些含有导入的核酸或载体的宿主细胞。选择标记的实例包含但不限于抗生素抗性核酸(例如卡那霉素、氨苄青霉素、羧苄青霉素、庆大霉素、潮霉素、腐草霉素、博来霉素、新霉素或氯霉素、)和/或赋予宿主细胞代谢优势如营养优势的核酸。示例性营养选择标记包含本领域已知的那些标记如amdS、argB和pyr4。可用于转化木霉的载体系统中的标记是本领域已知的(参见例如Finkelstein,BiotechnologyoffilamentousFungi,第6章，Finkelstein等人编，Butterworth-Heinemann,Boston,MA,Chap.6.,1992；和Kinghorn等人，AppliedMolecularGeneticsoffilamentousFungi,BlackieAcademicandProfessional,ChapmanandHall,London,1992，其各在此通过整体引用作为参考，特别是对于选择标记)。在一些实施方式中，选择标记是amdS核酸，其编码乙酰胺酶，允许转化的细胞在作为氮源的乙酰胺上生长。构巢曲霉(A.nidulans)amdS核酸作为选择标记的使用描述于Kelley等人，EMBOJ.4:475-479,1985和Penttila等人，Gene61:155-164,1987(其各在此通过整体引用作为参考，特别是对于选择标记)。在一些实施方式中，异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径核酸整合到没有选择标记的细胞的染色体中。
适当的载体是与所用宿主细胞兼容的那些。适当的载体可以源自，例如细菌、病毒(如噬菌体T7或源自M13的噬菌体)、黏粒、酵母或植物。获得和使用此种载体的方法是本领域技术人员已知的(参见，例如Sambrook等人，MolecularCloning:ALaboratoryManual，第二版，ColdSpringHarbor,1989，其在此通过整体引用作为参考，特别是对于载体的使用)。
启动子是本领域公知的。任何在宿主细胞中起作用的启动子可以用于在宿主细胞中表达异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径核酸。用于在多种宿主细胞中驱动异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径核酸表达的起始控制区或启动子很多并且是本领域技术人员所熟知的(参见，例如WO2004/033646及其中引用的文献，其每篇都在此通过整体引用作为参考，特别是对于表达目的核酸的载体)。事实上，任何能够驱动这些核酸的启动子都适于本发明，这些启动子包括但不限于CYC1、HIS3、GAL1、GAL10、ADH1、PGK、PHO5、GAPDH、ADCI、TRP1、URA3、LEU2、ENO和TPI(用于在酵母菌中表达)；AOX1(用于在毕赤酵母(Pichia)中表达)；和lac、trp、λPL、λPR、T7、tac和trc(用于在大肠杆菌中表达)。
在一些实施方式中，使用葡萄糖异构酶启动子(参见，例如美国专利号7,132,527及其中引用的文献，其每篇都在此通过整体引用作为参考，特别是对于用于表达目的多肽的启动子和质粒系统)。可以使用报道的葡萄糖异构酶启动子突变体来改变由有效连接葡萄糖异构酶启动子的核酸所编码的多肽的表达水平(美国专利号7,132,527)。在多种实施方式中，葡萄糖异构酶启动子含于低、中或高拷贝质粒中(美国专利号7,132,527)。
在多种实施方式中，异戊二烯合酶、DXS、IDI和/或MVA途径核酸含于低拷贝质粒中(例如维持在每个细胞约1至约4拷贝的质粒)、中度拷贝质粒(例如维持在每个细胞约10至约15拷贝的质粒)或高拷贝质粒(例如维持在每个细胞约50或更高拷贝的质粒)。在一些实施方式中，异源或额外内源异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径核酸有效连接T7启动子。在一些实施方式中，有效连接T7启动子的异源或额外的内源异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径核酸含于中或高拷贝质粒中。在一些实施方式中，异源或额外的内源异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径核酸有效连接Trc启动子。在一些实施方式中，有效连接Trc启动子的异源或额外的内源异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径核酸含于中或高拷贝质粒中。在一些实施方式中，异源或额外的内源异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径核酸有效连接Lac启动子。在一些实施方式中，有效连接Lac启动子的异源或额外的内源异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径核酸含于低拷贝质粒中。在一些实施方式中，异源或额外的内源异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径核酸有效连接内源启动子，如内源埃希氏菌、泛菌、芽孢杆菌、耶氏酵母、链霉菌，或木霉菌启动子或内源碱性丝氨酸蛋白酶、异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径启动子。在一些实施方式中，有效连接内源启动子的异源或额外的内源异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径核酸含于高拷贝质粒中。在一些实施方式中，载体是不整合到细胞染色体的复制质粒。在一些实施方式中，载体部分或全部整合到细胞染色体中。
在一些实施方式中，载体是任何在引入到真菌宿主细胞时，整合到该宿主细胞基因组中并复制的载体。载体列表参考FungalGeneticsStockCenterCatalogueofStrains(FGSC，网址为“fgsc.net”及其引用的文献，其每篇都在此通过整体引用作为参考，特别是对于载体)。其他适合的表达和/或整合载体的实例提供于Sambrook等人，MolecularCloning:ALaboratoryManual，第二版，ColdSpringHarbor,1989,CurrentProtocolsinMolecularBiology(F.M.Ausubel等人编，1987,Supplement30,section7.7.18)；vandenHondel等人，BennettandLasure(编)MoreGeneManipulationsinFungi,AcademicPresspp.396-428,1991；以及美国专利号5,874,276，其每篇都在此通过整体引用作为参考，特别是对于载体。特别有用的载体包括pFB6、pBR322、PUC18、pUC100和pENTR/D。
在一些实施方式中，异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径核酸有效连接在真菌宿主细胞中显示出转录活性的适当的启动子。启动子可源自一种或多种编码宿主内源或异源的多肽的核酸。在一些实施方式中，启动子可用于木霉宿主。启动子的适当的非限制性实例包括cbh1、cbh2、egl1、egl2、pepA、hfb1、hfb2、xyn1和amy。在一些实施方式中，启动子是宿主细胞天然的启动子。例如，在一些实施方式中，当里氏木霉是宿主时，启动子是天然里氏木霉启动子。在一些实施方式中，启动子是里氏木霉cbhl，它是诱导型启动子并且以登录号D86235保藏于GenBank，其在此通过整体引用作为参考，特别是对于启动子。在一些实施方式中，启动子是真菌宿主细胞异源的启动子。有用的启动子的其他实例包括来自泡盛曲霉(A.awamori)和黑曲霉(A.niger)葡糖淀粉酶(glaA)基因的启动子(Nunberg等人，MotCellBiol.4:2306-2315,1984和Boel等人，EMBOJ.3:1581-1585,1984，其每篇都在此通过整体引用作为参考，特别是对于启动子)；黑曲霉α淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶、里氏木霉xln1和里氏木霉纤维二糖水解酶1的基因的启动子(EP137280，其在此通过整体引用作为参考，特别是对于启动子)。
在一些实施方式中，表达载体也包含终止序列。终止控制区也可源自宿主细胞天然的多种基因。在一些实施方式中，终止序列和启动子序列源自相同来源。在另一实施方式中，终止序列是宿主细胞内源的。特别适合的终止子序列是源自木霉菌株(例如里氏木霉)的cbh1。其他有用的真菌终止子包含来自黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶核酸的终止子(Nunberg等人，MotCellBiol.4:2306-2315,1984和Boel等人，EMBOJ.3:1581-1585,1984；其每篇都在此通过整体引用作为参考，特别是对于真菌终止子)。任选地，可包含终止位点。对于多肽的有效表达，编码该多肽的DNA通过起始密码子而有效连接至选择的表达控制区以便表达导致适当信使RNA的形成。
在一些实施方式中，启动子、编码区和终止子都源自待表达的异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径核酸。在一些实施方式中，异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径核酸的编码区插入通用表达载体以便其处在表达构建体启动子和终止子序列的转录控制下。在一些实施方式中，基因或其部分插入到强cbh1启动子的下游。
可以使用标准技术(Sambrook等人，MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarbor,1982，其在此通过整体引用作为参考，特别是对于适当DNA序列的筛选和载体的构建)将异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径核酸插入载体，如表达载体。用于连接包含目的核酸(例如异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径核酸)、启动子、终止子或其他序列的DNA构建体以及将它们插入适当载体的方法是本领域公知的。例如，可以使用限制性酶来切割异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径核酸和载体。然后，可以将切割下的异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径核酸的相容末端和切割下的载体相连。连接通常是在常规限制性位点处连接来完成。如果不存在此种位点，根据常规实践使用合成的寡核苷酸接头(参见，Sambrook等人，MolecularCloning:ALaboratoryManual，第二版，ColdSpringHarbor,1989以及Bennett和Lasure,MoreGeneManipulationsinFungi,AcademicPress,SanDiego,pp70-76,1991，其在此通过整体引用作为参考，特别是对于寡核苷酸接头)。此外，可以使用已知的重组技术(例如InvitrogenLifeTechnologies,GatewayTechnology)来构建载体。
在一些实施方式中，可能想要以远高于目前在天然发生的细胞中发现的水平来过表达异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径核酸。这一结果可通过将编码那些多肽的核酸选择性地克隆到多拷贝质粒或将那些核酸放在强诱导型或组成型启动子下而实现。过表达想要的多肽的方法是常见的并且是分子生物学领域公知的，并且实例可见于Sambrook等人，MolecularCloning:ALaboratoryManual，第二版，ColdSpringHarbor,1989，其在此通过整体引用作为参考，特别是对于克隆技术)。
下面的来源包括根据本发明有用的其他通用方法学的描述：Kreigler,GeneTransferandExpression；ALaboratoryManual,1990和Ausubel等人编，CurrentProtocolsinMolecularBiology,1994，其每篇都在此通过整体引用作为参考，特别是对于分子生物学和克隆技术)。
示例性源生物
异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径核酸(以及它们的编码多肽)可以获自任何天然含有异戊二烯合酶、DXS、IDI和/或MVA途径核酸的生物。如上所指出，通过多种生物，如细菌、酵母、植物和动物而天然形成异戊二烯。生物含有用于产生异戊二烯的MVA途径、DXP途径或MVA和DXP途径两者(图19)。因此，DXS核酸可以获自，例如任何含有DXP途径或含有MVA和DXP途径两者的生物。IDI和异戊二烯合酶核酸可以获自，例如任何含有MVA途径、DXP途径或MVA和DXP途径两者的生物。MVA途径核酸可以获自，例如任何含有MVA途径或MVA和DXP途径两者的生物。
在一些实施方式中，异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径核酸的核酸序列与由自然界中任何下述生物所产生的核酸序列相同。在一些实施方式中，异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径多肽的氨基酸序列与由自然界中任何下述生物所产生的多肽序列相同。在一些实施方式中，异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径核酸或多肽是源自在此所述的任何生物的突变核酸或多肽。如在此使用，“源自”指被导入一或多个突变的核酸或多肽来源。例如，“源自植物多肽”的多肽指通过向野生型植物多肽的序列(即，天然发生的序列)导入一或多个突变所产生的目的多肽。
在一些实施方式中，源生物是真菌，其实例是曲霉种如米曲霉和黑曲霉，酵母种如酿酒酵母，裂殖酵母(Schizosaccharomyces)种如粟酒裂殖酵母(S.pombe)和木霉种如里氏木霉。在一些实施方式中，源生物是丝状真菌细胞。术语“丝状真菌”指真菌亚门的所有丝状形式(参见，Alexopoulos,C.I.(1962),IntroductoryMycology,Wiley,NewYork)。这些真菌特征为营养菌丝体，其细胞壁由几丁质、纤维素和其他复杂多糖所构成。丝状真菌在形态、生理和遗传上与酵母不同。丝状真菌的营养生长是菌丝延伸并且碳代谢是专性有氧的。丝状真菌的亲本细胞可为下述物种的细胞：木霉(如里氏木霉、红褐肉座菌(Hypocreajecorina)的无性形态,以前归类为T.longibrachiatum、绿色木霉(Trichodermaviride)、康氏木霉(Trichodermakoningii)、哈茨木霉(Trichodermaharzianum))(Sheir-Neirs等人，Appi.Microbiol.Biotechnol20:46-53,1984；ATCCNo.56765和ATCCNo.26921)；青霉属物种(Peniciliiumsp.)，腐质霉属物种(Humicolasp.)(如特异腐质霉(H.insolens)、疏毛腐质霉(H.lanuginose)或灰色腐质霉(H.grisea))；金孢霉属物种(Chrysosporiumsp.)(如C.iucknowense)、Gliociadiumsp.、曲霉属物种(如米曲霉、黑曲霉、酱油曲霉(A.sojae)、日本曲霉(A.japonicus)、构巢曲霉(A.nidulans)或泡盛曲霉(A.awamori))(Ward等人，Appl.Microbiol.Biotechnol.39:7380743、1993和Goedegebuur等人，Genet41:89-98、2002)、镰孢属物种(Fusariumsp.)、(如粉红镰孢(F.roseum)、赤禾镰孢(F.graminum)、F.cerealis、尖镰孢(F.oxysporuim)或F.venenatum)、脉孢菌属物种(Neurosporasp.)、(如粗糙脉胞菌(N.crassa))、肉座菌属物种(Hypocreasp.)、毛霉菌属物种(Mucorsp.)、(如米黑毛霉(M.miehei))、根霉菌属物种(Rhizopussp.)和Emericellasp.(也参见Innis等人，Sci.228:21-26,1985)，但不限于此。术语“Trichoderma”或“Trichodermasp.”或“Trichodermaspp.”指任何以前或目前被归类为木霉属物种的真菌属物种。
在一些实施方式中，真菌是构巢曲霉、泡盛曲霉、米曲霉、棘孢曲霉(A.aculeatus)、黑曲霉、日本曲霉、里氏木霉、绿色木霉、尖镰孢或腐皮镰孢(F.solani)。曲霉菌株公开于Ward等人，Appl.Microbiol.Biotechnol.39:738-743,1993和Goedegebuur等人，CurrGene41:89-98,2002，其每篇都在此通过整体引用作为参考，特别是对于真菌。在具体实施方式中，真菌是木霉属的菌株，例如里氏木霉的菌株。里氏木霉的菌株是已知的并且非限制性实例包括ATCCNo.13631,ATCCNo.26921,ATCCNo.56764,ATCCNo.56765,ATCCNo.56767和NRRL15709，其每篇都在此通过整体引用作为参考，特别是对于里氏木霉菌株。在一些实施方式中，宿主菌株是RL-P37的衍生物。RL-P37公开于Sheir-Neiss等人，Appl.Microbiol.Biotechnology20:46-53,1984，其在此通过整体引用作为参考，特别是对于里氏木霉菌株。
在一些实施方式中，源生物是酵母，例如酿酒酵母，裂殖酵母属物种(Schizosaccharomycessp.)、毕氏酵母属物种(Pichiasp.)或假丝酵母属物种(Candidasp.)。
在一些实施方式中，源生物是细菌，例如芽孢杆菌菌株，如地衣芽孢杆菌或枯草杆菌，泛菌(Pantoea)菌株如柠檬泛菌(P.citrea)，假单胞菌(Pseudomonas)菌株如产碱假单胞菌(P.alcaligenes)，链霉菌(Streptomyces)菌株如白色链霉菌(S.albus)、浅青紫链霉菌(S.lividans)或锈赤链霉菌(S.rubiginosus)，或埃希氏菌菌株如大肠杆菌。
如在此所述，“芽孢杆菌属”包括如本领域技术人员已知的“芽孢杆菌”属中的所有种，包括但不限于枯草杆菌、地衣芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌(B.lentus)、短小芽孢杆菌(B.brevis)、嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)、嗜碱性芽孢杆菌(B.alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、克劳氏芽孢杆菌(B.clausii)、嗜碱芽孢杆菌(B.halodurans)、巨大芽孢杆菌(B.megaterium)、凝固芽孢杆菌(B.coagulans)、环状芽孢杆菌(B.circulans)、灿烂芽孢杆菌(B.lautus)和苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)。已经意识到该芽孢杆菌属持续经历分类学重组。因此，该属意在包括已经被重分类的种，包括但不限于如嗜热脂肪芽孢杆菌(现称作嗜热脂肪土芽孢杆菌(Geobacillusstearothermophilus))的生物。认为在氧气存在下，抗性内孢子的产生是芽孢杆菌属的限定特征，但是这一特征也用于近来命名的脂环酸杆菌属(Alicyclobacillus)、双芽孢杆菌属(Amphibacillus)、硫胺素芽孢杆菌属(Aneurinibacillus)、厌氧芽孢杆菌属(Anoxybacillus)、短芽孢杆菌(Brevibacillus)、Filobacillus、薄壁芽孢杆菌属(Gracilibacillus)、喜盐芽孢杆菌(Halobacillus)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、需盐芽孢杆菌属(Salibacillus)、热杆菌属(Thermobacillus)、脲芽孢杆菌属(Ureibacillus)和枝芽孢杆菌属(Virgibacillus)。
在一些实施方式中，源生物是革兰氏阳性细菌。非限制性实例包括链霉菌(如，浅青紫链霉菌、天蓝色链霉菌(S.coelicolor)或灰色链霉菌(S.griseus)和芽孢杆菌菌株。在一些实施方式中，源生物是革兰氏阴性细菌，如大肠杆菌或假单胞菌。
在一些实施方式中，源生物是植物，如来自豆科(Fabaceae)的植物，如蝶形花亚科。在一些实施方式中，源生物是野葛、杨(如银白杨x欧洲山杨CAC35696)、白杨(如美洲山杨)或夏栎。
在一些实施方式中，源生物是藻类，如绿藻、红藻、灰绿藻(glaucophyte)、chlorarachniophyte、眼虫、chromista或沟鞭藻。
在一些实施方式中，源生物是蓝藻，如根据形态学而被分类为下述组的蓝藻：色球藻目(Chroococcales)、宽球藻目(Pleurocapsales)、颤藻目(Oscillatoriales)、念珠藻目(Nostocales)或真枝藻目(Stigonematales)。
示例性宿主细胞
可以使用多种宿主细胞来表达异戊二烯合酶、DXS、IDI和/或MVA途径多肽并按所要求保护的发明的方法来产生异戊二烯。示例性的宿主细胞包括来自在前面标题为“示例性源生物”部分所列出的任何生物的细胞。宿主细胞可为天然产生异戊二烯的细胞或不天然产生异戊二烯的细胞。在一些实施方式中，宿主细胞天然使用DXP途径产生异戊二烯，并且加入异戊二烯合酶、DXS和/或IDI核酸以增强使用这一途径的异戊二烯产生。在一些实施方式中，宿主细胞天然使用MVA途径产生异戊二烯，并且加入异戊二烯合酶和/或一或多种MVA途径核酸以增强使用这一途径的异戊二烯产生。在一些实施方式中，宿主细胞天然使用DXP途径产生异戊二烯，并且加入一或多种MVA途径核酸来使用DXP途径以及MVA途径的部分或者全部来产生异戊二烯。在一些实施方式中，宿主细胞天然使用DXP和MVA两种途径产生异戊二烯，并且加入一或多种异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径核酸以增强使用这些途径中一种或两种的异戊二烯产生。
示例性转化方法
可以使用用于表达编码的异戊二烯合酶、DXS、IDI和/或MVA途径多肽的标准技术将异戊二烯合酶、DXS、IDI和/或MVA途径核酸或含有它们的载体插入宿主细胞(例如，在此所述的植物细胞、真菌细胞、酵母细胞或细菌细胞)。可以使用诸如转化、电穿孔、核微注射、转导、转染(如，脂转染介导的或DEAE-Dextrin介导的转染或使用重组噬菌体病毒的转染)、磷酸钙DNA沉淀孵育、DNA包被微粒的高速轰击以及原生质体融合这些技术进行DNA构建体或载体向宿主细胞的导入。通用的转化技术是本领域已知的(参见例如，CurrentProtocolsinMolecularBiology(F.M.Ausubel等人编，Chapter9,1987；Sambrook等人，MolecularCloning:ALaboratoryManual，第二版，ColdSpringHarbor,1989；和Campbell等人，Curr.Genet.16:53-56,1989，其各在此通过整体引用作为参考，特别是对于转化方法)。异源多肽在木霉菌中的表达描述于美国专利号6,022,725；美国专利号6,268,328；美国专利号7,262,041；WO2005/001036；Harkki等人，EnzymeMicrob.Technol.13:227-233,1991；Harkki等人，BioTechnol.7:596-603,1989；EP244,234；EP215,594；和Nevalainen等人，TheMolecularBiologyofTrichodermaanditsApplicationtotheExpressionofBothHomologousandheterologousGenes，在MolecularIndustrialMycology，Leong和Berka编，MarcelDekkerInc.,NYpp.129-148,1992，其各在此通过整体引用作为参考，特别是对于转化和表达方法)。对于曲霉菌株的转化也参考Cao等人，Sci.9:991-1001,2000；EP238023；和Yelton等人，Proceedings.Nail.Acad.Sci.USA81:1470-1474,1984(其各在此通过整体引用作为参考，特别是对于转化方法)。所导入的核酸可整合到染色体DNA或者作为染色体外复制序列维持。
任何本领域已知的方法可用于筛选转化体。在一个非限制性实例中，包含amdS标记的稳定转化体与不稳定转化体的区别在于它们更快的生长速率以及在含有乙酰胺的固体培养基上形成平滑而非齿状轮廓的圆形菌落。此外，在通过于固体非选择性培养基(例如缺乏乙酰胺的培养基)上生长转化体来进行稳定性的进一步检测的情形下，从这一培养基收获孢子，并测定随后在含有乙酰胺的选择培养基上萌发并生长的这些孢子的百分数。
在一些实施方式中，通过如下方法来转化真菌细胞，该方法涉及原生质体形成以及原生质体转化以及以已知方式再生细胞壁。在一个具体实施方式中，制备木霉菌用来转化包含从真菌菌丝体制备原生质体(参见，Campbell等人，Curr.Genet.16:53-56,1989，其在此通过整体引用作为参考，特别是对于转化方法)。在一些实施方式中，菌丝体获自萌发的营养孢子。用消化细胞壁的酶来处理菌丝体，得到原生质体。然后通过在悬浮培养基中渗透压稳定剂的存在来保护原生质体。这些稳定剂包括山梨醇、甘露醇、氯化钾、硫酸镁等。通常，这些稳定剂的浓度在0.8M和1.2M之间变化。希望使用在悬浮培养基中约1.2M的山梨醇溶液。
DNA向宿主木霉菌菌株的摄取取决于钙离子浓度。通常，在摄取溶液中使用约10mMCaCl2到50mMCaCl2。除了摄取溶液中的钙离子，通常包括的其他化合物是缓冲系统，如TE缓冲液(10mMTris，pH7.4；1mMEDTA)或10mMMOPS，pH6.0缓冲液(吗啉丙磺酸)和聚乙二醇(PEG)。尽管不希望受任何具体理论所限，但相信聚乙二醇用于融合细胞膜，从而允许培养基中的内容物被送到木霉菌菌株的细胞质中并且质粒DNA被转入核中。这一融合经常留下多拷贝的整合到宿主染色体的质粒DNA。
通常，在转化中使用含有木霉菌原生质体或细胞的悬浮液，这些原生质体或细胞以105至107/mL(如2x106/mL)的密度进行了通透性处理。在适当溶液(如1.2M山梨醇和50mMCaCl2)中100μL体积的这些原生质体或细胞与想要的DNA混合。通常，向摄取溶液中加入高浓度PEG。可将0.1至1体积的25％的PEG4000加入原生质体悬浮液中。在一些实施方式中，约0.25体积加入原生质体悬浮液。也可将诸如二甲亚砜、肝素、亚精胺、氯化钾等添加剂加入摄取溶液，帮助转化。对于其他真菌宿主细胞可以用类似的方法(参见例如，美国专利号6,022,725和6,268,328，其每篇都在此通过整体引用作为参考，特别是对于转化方法)。
通常，然后在约0℃培养混合物10至30分钟的时间。然后向混合物加入另外的PEG以进一步增强想要的核酸序列的摄取。通常以转化混合物体积的5至15倍体积来添加25％的PEG4000；然而，更大或更小的体积也可为适合的。希望25％的PEG4000是转化混合物体积的约10倍。在加入PEG后，在室温或在冰上培养该转化混合物，然后加入山梨醇和CaCl2溶液。然后向熔化的生长培养基等份进一步加入原生质体悬浮液。当生长培养基包括生长选择(如乙酰胺或抗生素)时，其仅允许转化体生长。
可根据常规方法进行细菌细胞的转化，如Sambrook等人，MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarbor,1982所述，其在此通过整体引用作为参考，特别是对于转化方法。
示例性细胞培养基
本发明也包含产生异戊二烯的培养的细胞或细胞群。“培养的细胞”指在允许细胞经历一或多次细胞分裂的溶液(如细胞培养基)中的两种或更多种细胞。“培养的细胞”不包括这样的植物细胞，其是含有已经分化成植物组织的细胞的活的多细胞植物的一部分。在多种实施方式中，细胞培养物包括至少或约10、20、50、100、200、500、1,000、5,000、10,000或更多的细胞。
任何碳源可以用于培养宿主细胞。术语“碳源”指能够被宿主细胞或生物所代谢的一种或多种含碳化合物。例如，用于培养宿主细胞的细胞培养基可包括任何适于维持宿主细胞存活或生长的碳源。
在一些实施方式中，碳源是碳水化合物(例如单糖、二糖、寡糖或多糖)、转化糖(例如，酶促处理的蔗糖浆)、丙三醇、甘油(例如，生物柴油或制造肥皂工艺的甘油副产物)、二羟丙酮、单碳源、油(例如，植物油如玉米、棕榈或大豆油)、动物脂肪、动物油、脂肪酸(例如，饱和脂肪酸、不饱和脂肪酸，或多不饱和脂肪酸)、脂质、磷脂、甘油脂、甘油单酯、甘油二酯、甘油三酯、多肽(例如，微生物或植物蛋白或肽)、可再生碳源(例如，生物量碳源，如水解的生物量碳源)、酵母提取物、来自酵母提取物的组分，聚合物、酸、醇、醛、酮、氨基酸、琥珀酸、乳酸、乙酸、乙醇，或者前述两种或更多种的任意组合。在一些实施方式中，碳源是光合合成的产物，包括但不限于葡萄糖。在一些实施方式中，碳水化合物是木糖或葡萄糖。
示例性单糖包括葡萄糖和果糖；示例性寡糖包括乳糖和蔗糖，而示例性多糖包括淀粉和纤维素。示例性碳水化合物包括C6糖(例如果糖、甘露糖、半乳糖或葡萄糖)和C5糖(例如木糖或阿拉伯糖)。在一些实施方式中，细胞培养基包括碳水化合物以及碳水化合物之外的碳源(例如丙三醇、甘油、二羟丙酮、单碳源、油、动物脂肪、动物油、脂肪酸、脂质、磷脂、甘油脂、甘油单酯、甘油二酯、甘油三酯、可再生碳源，或酵母提取物的组分)。在一些实施方式中，细胞培养基包括碳水化合物以及多肽(例如微生物或植物蛋白或肽)。在一些实施方式中，微生物多肽是来自酵母或细菌的多肽。在一些实施方式中，植物多肽是来自大豆、玉米、油菜、麻风树、棕榈树、花生、向日葵、椰子、芥菜、油菜籽、棉籽、棕榈仁、橄榄、红花、芝麻，或亚麻籽的多肽。
在一些实施方式中，碳水化合物的浓度为至少或约每升培养液5克(g/L，其中，培养液的体积包括细胞培养基的体积和细胞的体积)，例如至少或约10、15、20、30、40、50、60、80、100、150、200、300、400或更多g/L。在一些实施方式中，碳水化合物的浓度在约50和约400g/L之间，例如约100和约360g/L之间，约120和约360g/L之间，或约200和约300g/L之间。在一些实施方式中，碳水化合物的这一浓度包括在宿主细胞培养之前和/或培养期间，加入的碳水化合物的总量。
在一些实施方案中，细胞在有限葡萄糖条件下培养。“有限葡萄糖条件”指添加的葡萄糖的量小于细胞所消耗葡萄糖的量，或约为其的105％(如约100％)。在特定的实施方案中，添加到培养基中的葡萄糖的量大致与在特定时间段细胞消耗的葡萄糖的量相同。在一些实施方案中，通过限制添加的葡萄糖的量调控细胞生长速率，以便细胞以细胞培养基中的葡萄糖的量支持的速率生长。在一些实施方案中，葡萄糖在细胞培养期间不累积。在多种实施方案中，细胞在有限葡萄糖条件下培养约大于或约1、2、3、5、10、15、20、25、30、35、40、50、60，或70个小时。在多种实施方案中，细胞在有限葡萄糖条件下培养约大于或约5、10、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、95，或100％的细胞培养总时长。尽管不意味着限制于任意特定理论下，应认为有限葡萄糖条件可允许更有利的细胞调节。
在一些实施方案中，细胞在过量葡萄糖下培养。在特定实施方案中，添加的葡萄糖的量大于在特定时间段细胞消耗的葡萄糖的量，或约为其的105％(如约或大于110,120,150,175,200,250,300,400,或500％)或更多。在一些实施方案中，在细胞培养期间葡萄糖累积。
示例性脂质是任何含有一种或多种脂肪酸的物质，所述脂肪酸是饱和、不饱和或分支的C4以及以上的脂肪酸。
示例性油是室温为液态的脂质。在一些实施方式中，脂质含有一种或多种C4或更高的脂肪酸(例如，含有具有四个或更多个碳的一种或多种饱和、不饱和或分支脂肪酸)。在一些实施方式中，油获自大豆、玉米、油菜、麻风树、棕榈树、花生、向日葵、椰子、芥菜、油菜籽、棉籽、棕榈仁、橄榄、红花、芝麻、亚麻籽、产油微生物细胞、乌桕，或者是前述两种或更多种的任一组合。
示例性脂肪酸包括通式为RCOOH的化合物，其中“R”是烃。示例性不饱和脂肪酸包括其中“R”包括至少一个碳-碳双键的化合物。示例性不饱和脂肪酸包括但不限于油酸、11－十八碳烯酸、亚油酸、棕榈油酸以及花生四烯酸。示例性多不饱和脂肪酸包括化合物，其中“R”包括多个碳-碳双键。示例性饱和脂肪酸包括化合物，其中“R”是饱和脂族基团。在一些实施方式中，碳源包括一或多种C12-C22脂肪酸，例如C12饱和脂肪酸、C14饱和脂肪酸、C16饱和脂肪酸、C18饱和脂肪酸、C20饱和脂肪酸，或C22饱和脂肪酸。在示例性实施方式中，脂肪酸是棕榈酸。在一些实施方式中，碳源是脂肪酸(例如不饱和脂肪酸)的盐、脂肪酸(例如不饱和脂肪酸)的衍生物，或者脂肪酸(例如不饱和脂肪酸)衍生物的盐。适当的盐包括但不限于锂盐、钾盐、钠盐等。甘油二酯和甘油三酯是丙三醇的脂肪酸酯。
在一些实施方式中，脂质、油、脂肪、脂肪酸、甘油单酯、甘油二酯或甘油三酯的浓度是至少或约每升培养液1克(g/L，其中培养液的体积包括细胞培养基的体积和细胞的体积)，例如至少或约5、10、15、20、30、40、50、60、80、100、150、200、300、400或更多g/L。在一些实施方式中，脂质、油、脂肪、脂肪酸、甘油一酯、甘油二酯或甘油三酯的浓度是约10和约400g/L之间，例如约25和约300g/L之间，约60和约180g/L之间，或约75约150g/L之间。在一些实施方式中，浓度包括在培养宿主细胞之前和/或期间添加的脂质、油、脂肪、脂肪酸、甘油一酯、甘油二酯或甘油三酯的总量。在一些实施方式中，碳源包括(i)脂质、油、脂肪、脂肪酸、甘油一酯、甘油二酯或甘油三酯和(ii)碳水化合物，如葡萄糖。在一些实施方式中，脂质、油、脂肪、脂肪酸、甘油一酯、甘油二酯或甘油三酯与碳水化合物基于碳的比率是约1:1(即每个碳水化合物碳对应脂质、油、脂肪、脂肪酸、甘油一酯、甘油二酯或甘油三酯中的一个碳)。在具体实施方式中，脂质、油、脂肪、脂肪酸、甘油一酯、甘油二酯或甘油三酯的量为约60和约180g/L之间，而碳水化合物的量为约120和约360g/L之间。
示例性微生物多肽碳源包括来自酵母或细菌的一或多种多肽。示例性植物多肽碳源包括来自大豆、玉米、油菜、麻风树、棕榈树、花生、向日葵、椰子、芥菜、油菜籽、棉籽、棕榈仁、橄榄、红花、芝麻，或亚麻籽的一或多种多肽。
示例性的可再生碳源包括奶酪乳清渗透物(cheesewheypermeate)、玉米浆、甜菜糖浆、大麦芽和来自任何前述物质的组分。示例性可再生碳源也包括存在于生物量中的葡萄糖、己糖、戊糖和木糖，生物量如玉米、柳枝稷、甘蔗、发酵工艺的细胞废物，以及来自大豆、玉米，或小麦碾磨的蛋白副产物。在一些实施方式中，生物量碳源是木质纤维素、半纤维素或纤维素物质，例如但不限于草、小麦、麦秸、甘蔗渣、甘蔗渣、软木材木浆、玉米、玉米穗轴或外壳、玉米仁、来自玉米仁的纤维、玉米秸秆、柳枝稷、稻壳产品，或来自谷物(如玉米、高粱、黑麦、小黑麦(triticate)、大麦、小麦和/或酒糟)的湿或干碾磨的副产物。示例性纤维素物质包括木、纸和纸浆废物、草本植物和果浆。在一些实施方式中，碳源包括任何植物部分，例如茎、谷物、根或块茎。在一些实施方式中，将任何下述植物的全部或部分用作碳源：玉米、小麦、黑麦、高粱、小黑麦、水稻、粟、大麦、木薯、豆类例如豆和豌豆、马铃薯、甜薯、香蕉、甘蔗和/或树薯粉。在一些实施方式中，碳源是生物量水解物，如包括木糖和葡萄糖或包括蔗糖和葡萄糖的生物量水解物。
在一些实施方式中，可再生碳源(例如生物量)在添加到细胞培养基之前被预处理。在一些实施方式中，预处理包括酶预处理、化学预处理，或酶和化学预处理两者的组合(参见，例如Farzaneh等人，BioresourceTechnology96(18):2014-2018,2005；美国专利号6,176,176；美国专利号6,106,888；其每篇都在此通过整体引用作为参考，特别是对于可再生碳源的预处理)。在一些实施方式中，可再生碳源在添加到细胞培养基之前被部分或完全水解。
在一些实施方式中，可再生碳源(例如玉米秸秆)在添加到细胞培养基之前经历氨纤维膨胀(AFEX)预处理(参见例如，Farzaneh等人，BioresourceTechnology96(18):2014-2018,2005)。在AFEX预处理期间，可再生碳源在中等温度(例如约60至约100℃)和高压(例如约250至约300psi)下受无水液态氨处理约5分钟。然后快速释放压力。在这一过程中，木质素溶解、半纤维素水解、纤维素解晶作用的组合的化学和物理效应，以及增加的表面积使得纤维素和半纤维素几乎完全酶促转化成可发酵糖。AFEX预处理具有可以回收几乎全部的氨并再利用，同时将剩余物用作下游过程中的微生物的氮源的优点。此外，AFEX预处理不需要冲洗流。因此，在AFEX处理后的干物质回收基本上为100％。AFEX基本上是干-干工艺。经处理的可再生碳源是长期稳定的并且可以在酶促水解或发酵工艺中以极高固体负载来供给。纤维素和半纤维素在AFEX工艺中得到很好地保留，只有很少或没有降解。不需要在经历AFEX预处理的可再生碳源酶促水解之前进行中和。AFEX处理的碳源的酶促水解产生清洁的糖流用于随后的发酵。
在一些实施方式中，碳源(例如可再生碳源)的浓度相当于至少或约0.1、0.5、1、1.5、2、3、4、5、10、15、20、30、40，或50％的葡萄糖(w/v)。可以使用标准HPLC方法，用葡萄糖作为参考来测量由碳源产生的葡萄糖的量，从而确定葡萄糖的当量。在一些实施方式中，碳源(例如可再生碳源)的浓度相当于约0.1和约20％之间的葡萄糖，例如约0.1和约10％之间的葡萄糖，约0.5和约10％之间的葡萄糖，约1和约10％之间的葡萄糖，约1和约5％之间的葡萄糖，或约1和约2％之间的葡萄糖。
在一些实施方式中，碳源包括酵母提取物或者酵母提取物的一种或多种组分。在一些实施方式中，酵母提取物的浓度为至少每升培养液1克酵母提取物(g/L，其中培养液的体积包括细胞培养基的体积和细胞的体积)，例如至少或约5、10、15、20、30、40、50、60、80、100、150、200、300或更多g/L。在一些实施方式中，酵母提取物的浓度是约1和约300g/L之间，例如约1和约200g/L之间，约5和约200g/L之间，约5和约100g/L之间，或约5和约60g/L之间。在一些实施方式中，浓度包括在培养宿主细胞之前和/或期间添加的酵母提取物的总量。在一些实施方式中，碳源包括酵母提取物(或其一或多种组分)和另一碳源如葡萄糖。在一些实施方式中，酵母提取物和另一碳源的比率为约1:5，约1:10，或约1:20(w/w)。
此外，碳源也可为单碳底物，如二氧化碳或甲醇。来自单碳源(例如甲醇、甲醛或甲酸酯)的丙三醇产生已经报道于甲基营养酵母中(Yamada等人，Agric.Biol.Chem.,53(2)541-543,1989，其在此通过整体引用作为参考，特别是对于碳源)和细菌中(Hunter等人，Biochemistry,24,4148-4155,1985，其在此通过整体引用作为参考，特别是对于碳源)。这些生物可以同化单碳化合物，氧化态从甲烷到甲酸酯改变，并产生丙三醇。碳同化的途径可以通过核酮糖单磷酸，通过丝氨酸或通过木酮糖单磷酸(Gottschalk,BacterialMetabolism，第二版，Springer-Verlag:NewYork,1986，其在此通过整体引用作为参考，特别是对于碳源)。核酮糖单磷酸途径包括甲酸酯与核酮糖-5-磷酸缩合以形成六碳糖，该六碳糖变成果糖并最终变成三碳产物甘油醛-3-磷酸。同样地，丝氨酸途径通过亚甲基四氢叶酸将单碳化合物同化到糖酵解途径。
除了一碳和二碳底物，也已知甲基营养生物利用许多含有其他含碳的化合物，如甲胺、葡糖胺以及多种氨基酸用于代谢活性。例如，已知甲基营养酵母利用来自甲胺的碳以形成海藻糖或丙三醇(Bellion等人，Microb.GrowthClCompd.,[mt.Symp.]，第7版，415-32.编者:Murrell等人，出版:Intercept,Andover,UK,1993，其在此通过整体引用作为参考，特别是对于碳源)。类似地，众多假丝酵母(Candida)种代谢丙氨酸或油酸(Sulter等人，Arch.Microbiol.153(5),485-9,1990，其在此通过整体引用作为参考，特别是对于碳源)。
在一些实施方式中，在含有生理盐和营养物的标准培养基中培养细胞(见例如，Pourquie,J.等人，BiochemistryandGeneticsofCelluloseDegradation，Aubert等人编，AcademicPress,pp.71-86,1988和Ilmen等人，Appl.Environ.Microbiol.63:1298-1306,1997，其在此通过整体引用作为参考，特别是对于细胞培养基)。示例性的生长培养基是常规商业制备的培养基如LuriaBertani(LB)培养液，SabouraudDextrose(SD)培养液，或酵母培养基(YM)培养液。也可使用其他限定的或合成的生长培养基，并且用于特定宿主细胞生长的适当培养基是微生物或发酵科学领域技术人员已知的。
除了适当的碳源，希望细胞培养基含有适当的矿物、盐、辅因子、缓冲液和本领域技术人员已知的适于培养物生长或增强异戊二烯产生的其他组分(参见例如，WO2004/033646以及其中引用的文献和WO96/35796以及其中引用的文献，其每篇都在此通过整体引用作为参考，特别是对于各自细胞培养基和细胞培养条件)。在异戊二烯合酶、DXS、IDI和/或MVA途径核酸处于诱导型启动子控制下的一些实施方式中，希望诱导剂(例如糖、金属盐或抗微生物剂)以对于诱导异戊二烯合酶、DXS、IDI和/或MVA途径多肽表达有效的浓度添加到培养基中。在一些实施方式中，细胞培养基具有抗生素(例如卡那霉素)，其对应于具有一或多种DXS、IDI和/或MVA途径核酸的载体上的抗生素抗性核酸(例如卡那霉素抗性核酸)。
示例性细胞培养条件
适于维持并生长细菌培养物的材料和方法是本领域公知的。示例性的技术可见于ManualofMethodsforGeneralBacteriologyGerhardt等人编，AmericanSocietyforMicrobiology,Washington,D.C.(1994)或BrockinBiotechnology:ATextbookofIndustrialMicrobiology，第二版，(1989)SinauerAssociates,Inc.,Sunderland,MA，其各在此通过整体引用作为参考，特别是对于细胞培养技术。在一些实施方式中，在允许表达由插入到宿主细胞的核酸所编码的异戊二烯合酶、DXS、IDI和/或MVA途径多肽中一种或多种的条件下，在培养基中培养细胞。
可以使用标准细胞培养条件来培养细胞(参见例如WO2004/033646以及其中引用的文献，其每篇都在此通过整体引用作为参考，特别是对于细胞培养和发酵条件)。细胞在适当温度、气体混合物和pH(例如约20至约37℃，约6％至约84％CO2，以及约5至约9的pH)下生长并维持。在一些实施方式中，细胞在35℃下于适当的细胞培养基中生长。在一些实施方式中，例如，培养物在接近28℃下于适当培养基中在摇动培养或发酵罐中培养直到达到想要量的异戊二烯产生。在一些实施方式中，用于发酵的pH范围为约pH5.0至约pH9.0之间(例如约pH6.0至约pH8.0之间或pH6.5至约pH7.0之间)。根据宿主细胞的要求，反应可在需氧、缺氧或厌氧的条件下进行。对于给定丝状真菌的示例性培养条件是本领域已知的并且可见于科学文献和/或来自真菌源如美国典型培养物保藏中心和真菌遗传种源中心(FungalGeneticsStockCenter)。
在多种实施方式中，使用任何已知的发酵模式，如分批、补料分批或连续发酵方法来培养细胞。在一些实施方式中，使用发酵的分批方法。经典的分批发酵是封闭系统，其中在发酵开始时设定培养基的组成并且该组成在发酵期间不进行人工改变。因此，在发酵开始时，用想要的宿主细胞接种细胞培养基并且允许发酵而不向系统添加任何物质。然而，通常，“分批”发酵是对于添加碳源而言的分批并且经常尝试控制诸如pH和氧浓度的因素。在分批系统中，系统的代谢物和生物量组成持续改变直到发酵停止时。在分批培养物中，细胞稳定地经过静态停滞期到高生长对数期并最终至生长率减小或停止的稳定期。在一些实施方式中，对数期的细胞负责大部分的异戊二烯产生。在一些实施方式中，稳定期的细胞产生异戊二烯。
在一些实施方式中，使用标准分批系统的变型，例如补料分批(Fed-Batch)系统。补料分批发酵方法包括典型的分批系统，只是随着发酵进展而以增量添加碳源。当分解代谢产物阻遏倾向于抑制细胞代谢，以及想要细胞培养基中具有有限量的碳源时，补料分批系统是有用的。可以有限量或过量的碳源(例如葡萄糖)来进行补料分批发酵。对补料分批系统中实际碳源浓度的测量很难，并且因此基于可测因子如pH、溶氧和废气(如CO2)分压的改变来进行估算。分批以及补料分批发酵是本领域普遍且公知的，并且实例可见于Brock,Biotechnology:ATextbookofIndustrialMicrobiology，第二版，(1989)SinauerAssociates,Inc.，其在此通过整体引用作为参考，特别是对于细胞培养和发酵条件。
在一些实施方式中，使用连续发酵方法。连续发酵是开放系统，其中向生物反应器中连续添加限定的发酵培养基并且同时除去等量的条件培养基用于处理。连续发酵通常使培养物维持在恒定的高密度，而细胞主要处于对数期生长。
连续发酵允许调控影响细胞生长或异戊二烯产生的一个因素或任何数量的因素。例如，一种方法将限制营养物如碳源或氮水平维持在固定比率并且允许所有其他参数适度。在其他系统中，可以连续改变影响生长的许多因素同时保持细胞浓度(如培养基浑浊度所测量的浓度)恒定。连续系统致力于维持稳态生长条件。因此由于被丢掉的培养基，在发酵中，细胞损失相对于细胞生长速率保持平衡。调控用于连续发酵工艺的营养物和生长因子的方法以及使产物形成速率最大化的技术是工业微生物领域领域公知的并且多种方法详述于Brock,Biotechnology:ATextbookofIndustrialMicrobiology，第二版，(1989)SinauerAssociates,Inc.，其在此通过整体引用作为参考，特别是对于细胞培养和发酵条件。
在一些实施方式中，细胞固定在基质上作为完整细胞催化剂并经历用于异戊二烯产生的发酵条件。
在一些实施方式中，将多瓶液体培养物放置在摇床上以便将氧气引入液体并维持培养物的均一性。在一些实施方式中，使用培养箱来控制培养物生长的温度、湿度、摇速和/或其他条件。最简单的培养箱是具有可调加热器的保温箱，其通常高达～65℃。更精细的培养箱也可以包括降低温度的能力(通过冷冻)，或控制湿度或CO2水平的能力。大多数培养箱包括计时器；一些也可以编程以通过不同的温度、湿度水平等来循环。培养箱可以从桌面的尺寸到小房间的尺寸来变化。
如果需要，可以改变一部分或者所有细胞培养基以补充营养物和/或避免积累潜在的有害代谢副产物和死亡细胞。在悬浮培养的情形下，可以利用离心或过滤该悬浮培养物而从培养基分离细胞并且然后在新鲜培养基中重悬细胞。在贴壁培养的情形下，可以通过吸取和替代而直接除去培养基。在一些实施方式中，细胞培养基允许在连续培养(例如没有稀释的连续培养)中至少一部分细胞分开用于至少或约5、10、20、40、50、60、65或更多细胞分裂。
在一些实施方式中，使用组成型或渗漏启动子(例如Trc启动子)，并且不添加化合物(如IPTG)来诱导有效连接至启动子的异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径核酸的表达。在一些实施方案中，添加化合物(如IPTG)来诱导有效连接至启动子的异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径核酸的表达。
异戊二烯与细胞生长去偶联的示例性方法
理想地，来自给料的碳转化为异戊二烯，而不是(用于)细胞的生长和维持。在一些实施方案中，细胞培养到低培养基OD600，随后开始或提高异戊二烯的产生。此策略允许大部分碳转化为异戊二烯。
在一些实施方案中，细胞达到这样的光密度以致它们不再分裂或分裂得极慢，但继续产生异戊二烯几个小时(如约2、4、6、8、10、15、20、25、30或更多小时)。例如，图60A-67C阐明在细胞达到这样的光密度以致它们不再分裂或分裂得极慢后，细胞可继续产生大量甲羟戊酸或异戊二烯。在一些情况下，550nm处的光密随时间降低(如由于细胞裂解、生长停止、缺乏营养或导致细胞生长缺乏的其他因子，细胞不再明显指数后，光密度的降低)，并且细胞继续产生大量甲羟戊酸或异戊二烯。在一些实施方案中，细胞在550nm处的光密度在一定时间段内(如大于或约5、10、15、20、25、30、40、50或60小时)增加少于或约50％(如少于或约40、30、20、10、5，或0％)，并且细胞在此期间产生大于或约1、10、25、50、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1,000、1,250、1,500、1,750、2,000、2,500、3,000、4,000、5,000、10,000、20,000、30,000、40,000、50,000、100,000、200,000、300,000、400,000、500,000、600,000、700,000、800,000、900,000、1,000,000或更多纳摩尔异戊二烯/以细胞湿重计的细胞克数/小时(纳摩尔/gwcm/小时)。在一些实施方案中，异戊二烯的量介于约2到约5000纳摩尔/gwcm/小时，如介于约2到约100纳摩尔/gwcm/小时、约100到约500纳摩尔/gwcm/小时、约150到约500纳摩尔/gwcm/小时、约500到约1000纳摩尔/gwcm/小时、约1000到约2000纳摩尔/gwcm/小时，或约2000到约5000纳摩尔/gwcm/小时。在一些实施方案中，异戊二烯的量介于约20到约5000纳摩尔/gwcm/小时、约100到约5000纳摩尔/gwcm/小时、约200到约2000纳摩尔/gwcm/小时、约200到约1000纳摩尔/gwcm/小时、约300到约1000纳摩尔/gwcm/小时，或约400到约1000纳摩尔/gwcm/小时。
在一些实施方案中，细胞在550nm处的光密度在一定时间段内(如大于或约5、10、15、20、25、30、40、50或60小时)增加少于或约50％(如少于或约40、30、20、10、5，或0％)，并且细胞在此期间产生大于或约1、10、25、50、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1,000、1,250、1,500、1,750、2,000、2,500、3,000、4,000、5,000、10,000、50,000、100,000或更多毫克异戊二烯/L培养液(mg/L培养液，其中培养液的体积包括细胞的体积和培养基的体积)的异戊二烯累积滴定度(总量)。在一些实施方案中，异戊二烯的量介于约2到约5000mg/L培养液，如介于约2到约100mg/L培养液、约100到约500mg/L培养液、约500到约1000mg/L培养液、约1000到约2000mg/L培养液，或约2000到约5000mg/L培养液。在一些实施方案中，异戊二烯的量介于约20到约5000mg/L培养液、约100到约5000mg/L培养液、约200到约2000mg/L培养液、约200到约1000mg/L培养液、约300到约1000mg/L培养液，或约400到约1000mg/L培养液。
在一些实施方案中，细胞在550nm处的光密度在一定时间段内(如大于或约5、10、15、20、25、30、40、50或60小时)增加少于或约50％(如少于或约40、30、20、10、5，或0％)，并且细胞在此期间将细胞培养基中大于或约0.0015、0.002、0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.12、0.14、0.16、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、5.0、6.0、7.0或8.0％的碳转化为异戊二烯。在一些实施方案中，碳至异戊二烯的转化百分比介于约0.002到约4.0％、约0.002到约3.0％、约0.002到约2.0％、约0.002到约1.6％、约0.002到约0.005％、约0.005到约0.01％、约0.01到约0.05％、约0.05到约0.15％、约0.15到约0.2％、约0.2到约0.3％、约0.3到约0.5％、约0.5到约0.8％、约0.8到约1.0％，或约1.0到约1.6％。在一些实施方案中，碳至异戊二烯的转化百分比介于约0.002到约0.4％、约0.002到约0.16％、约0.04到约0.16％、约0.005到约0.3％、约0.01到约0.3％，或约0.05到约0.3％。
在一些实施方案中，异戊二烯只在稳定期产生。在一些实施方案中，异戊二烯在生长期和稳定期均产生。在多种实施方案中，在稳定期产生的异戊二烯的量(如产生的异戊二烯的总量或每升培养液每小时每OD600产生的异戊二烯的量)大于或约2、3、4、5、10、20、30、40、50,或更多倍再生长期相同时间内产生的异戊二烯总量。在多种实施方案中，当细胞处于稳定期时，产生大于或约5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、95、99％或更多的异戊二烯总量(如在发酵期某时间段内异戊二烯的产生，如20小时)。在多种实施方案中，当细胞缓慢分裂或完全不分裂以致550nm处的光密度增加少于或约50％(如少于或约40、30、20、10、5，或0％)时，产生大于或约5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、95、99％或更多的异戊二烯总量(如在发酵期某时间段内异戊二烯的产生，如20小时)。在一些实施方案中，异戊二烯只在生长期产生。
在一些实施方案中，一种或更多MVA途径、IDI、DXP或异戊二烯合酶核酸置于在稳定期比在生长期更有活性的启动子或因子的调控下。例如，一种或更多MVA途径、IDI、DXP或异戊二烯合酶核酸置于稳定期σ因子如RpoS的调控下。在一些实施方案中，一种或更多MVA途径、IDI、DXP或异戊二烯合酶核酸置于在稳定期诱导的启动子的调控下，如在稳定期有活性的应答调节基因诱导的启动子的调控下
安全操作范围内的异戊二烯产生
根据其可燃性特征，安全操作范围内的异戊二烯产生简化了商用设施的设计和建设，大大改善了安全操作的能力，并限制了着火隐患。具体地，异戊二烯产生的最佳范围是在安全区，异戊二烯浓度的不可燃范围。在一个此类方面，本发明描述了在异戊二烯浓度的不可燃范围内(在异戊二烯的可燃范围之外)产生异戊二烯的方法。
这样，采用计算机模型和实施测试来确定异戊二烯的自燃的极限(如在O2、N2、CO2存在下，或任意两种或更多种前述气体的组合存在下异戊二烯)以确保工艺安全。可燃范围由自燃的下限(LFL)、自燃的上限(UFL)、限制性氧浓度(LOC)和限制温度表征。对可燃系统，最小量的燃料(如异戊二烯)必须有最小量的氧化剂出现，一般为氧气。LFL是必须存在以维持燃烧的最小量异戊二烯，而UFL是可存在的最大量的异戊二烯。超过此极限，混合物富含燃料且氧气级份太低以致无法形成可燃混合物。LOC表示必须也具有以形成可燃混合物的氧气的最小级份。限制温度是基于异戊二烯的燃点并且是异戊二烯燃烧可扩散的最低温度。这些限制是针对异戊二烯的浓度、氧化剂的类型和浓度、系统中存在的惰性气体、温度和系统的压力而特定的。落入可燃范围极限内的组合物扩散燃烧并要求在设计和工艺设备运行期间附加安全措施。
使用计算机模拟、数学分析和实验测试来测试以下条件。如需要，可使用本文所述方法测试其他条件(如其他温度、压力和永久气体组成)以确定LFL、UFL和LOC浓度。
(1)计算机模拟和数学分析
测试工况1:
异戊二烯:0wt％-14wt％
O2:6wt％-21wt％
N2:79wt％-94wt％
测试工况2:
异戊二烯:0wt％-14wt％
O2:6wt％-21wt％
N2:79wt％-94wt％
用水饱和
测试工况3:
异戊二烯:0wt％-14wt％
O2:6wt％-21wt％
N2:79wt％-94wt％
CO2:5wt％-30wt％
(2)用于最终确定自燃的极限的试验测试
测试工况1:
异戊二烯:0wt％-14wt％
O2:6wt％-21wt％
N2:79wt％-94wt％
测试工况2:
异戊二烯:0wt％-14wt％
O2:6wt％-21wt％
N2:79wt％-94wt％
用水饱和
使用模拟软件来估计用于几种不同测试条件下的系统的可燃性特征。CO2没有显示出对系统自燃的极限的显著影响。由实验测试证实了测试工况1和2。模型结果与实验测试结果一致。添加水后发现只有轻微改变。
在40℃且1个大气压下，针对异戊二烯、O2、N2和CO2的混合物，确定出LOC为9.5体积％。CO2增加到30％并未显著影响异戊二烯、O2和N2的混合物的可燃性特征。在干燥和水饱和的异戊二烯、O2和N2系统之间在可燃性特征方面只显示出轻微改变。限制温度约为-54℃。低于-54℃温度太低以致异戊二烯的燃烧无法扩散。
在一些实施方案中，随系统中氧气量的变化，异戊二烯的LFL范围为约1.5体积％至约2.0体积％，而异戊二烯的UFL范围为约2.0体积％至约12.0体积％。在一些实施方案中，LOC约为9.5体积％氧气。在一些实施方案中，异戊二烯的LFL介于约1.5体积％至约2.0体积％，异戊二烯的UFL介于约2.0体积％至约12.0体积％，并且当温度介于约25℃至约55℃(如40℃)且压力介于1个大气压和3个大气压时，LOC为约9.5体积％氧气。
在一些实施方案中，在存在小于约9.5体积％氧气下(也就是低于要求具有异戊二烯可燃混合物所要求的LOC)产生异戊二烯。在一些实施方案中，其中在具有大于约9.5体积％氧气下产生异戊二烯，异戊二烯的浓度低于LFL(如低于约1.5体积％)。例如，可通过用惰性气体稀释异戊二烯组合物将异戊二烯的量保持在LFL以下(例如，通过持续或间歇地添加惰性气体如氮气以保持异戊二烯组合物在LFL以下)。在一些实施方案中，其中在具有大于约9.5体积％氧气下产生异戊二烯，异戊二烯的浓度高于UFL(如高于约12体积％)。例如，可通过使用以高于UFL的浓度产生异戊二烯的系统(如本文描述的任意细胞培育系统)将异戊二烯的量保持在UFL以上。如需要，可使用相对低水平的氧气以使UFL也相对低水平。这种情况下，要求较低的异戊二烯浓度保持高于UFL。
在一些实施方案中，其中在存在大于约9.5体积％氧气下产生异戊二烯，异戊二烯的浓度在可燃范围内(如出于LFL和UFL之间)。在一些当异戊二烯的浓度可落在可燃范围内的实施方案中，采取一个或多个步骤以降低着火或爆炸的可能性。例如，可避免一种或多种点火源(如可产生火花的任意材料)。在一些实施方案中，采取一个或多个步骤以降低异戊二烯的浓度保持在可燃范围内的时间长度。在一些实施方案中，当异戊二烯的浓度接近或处于可燃范围内时，使用传感器探测。如需要，在细胞培养期间，可在一个或更多个时间点测量异戊二烯的浓度，并且如果异戊二烯的浓度接近或处于可燃范围内，可使用标准方法调整细胞培育条件和/或惰性气体的量。在特定的实施方案中，调整细胞培育条件(如发酵条件)将异戊二烯的浓度降低到低于LFL或将异戊二烯的浓度提高到高于UFL。在一些实施方案中，通过在惰性气体中稀释(如通过持续或间歇地添加惰性气体来保持异戊二烯组合物低于LFL)异戊二烯组合物，保持异戊二烯的量低于LFL。
在一些实施方案中，非异戊二烯的可燃挥发物(如一种或多种糖)的量比产生的异戊二烯的量少至少约2、5、10、50、75，或100倍。在一些实施方案中，气相的非异戊二烯气体部分包含约0％至约100％(体积)氧气，如约0％至约10％、约10％至约20％、约20％至约30％、约30％至约40％、约40％至约50％、约50％至约60％、约60％至约70％、约70％至约80％、约90％至约90％，或约90％至约100％(体积)氧气。在一些实施方案中，气相的非异戊二烯气体部分包含约0％至约99％(体积)氮气，如约0％至约10％、约10％至约20％、约20％至约30％、约30％至约40％、约40％至约50％、约50％至约60％、约60％至约70％、约70％至约80％、约90％至约90％，或约90％至约99％(体积)氮气。
在一些实施方案中，气相的非异戊二烯气体部分包含约1％至约50％(体积)CO2，如约1％至约10％、约10％至约20％、约20％至约30％、约30％至约40％，或约40％至约50％(体积)CO2。
在一些实施方案中，异戊二烯组合物还包含乙醇。例如，乙醇可用于异戊二烯的提取性蒸馏，产生包括乙醇和异戊二烯的组合物(如中间产品流)。理想地，乙醇的量在乙醇的可燃范围之外。在标准条件下(如约1个大气压和600F(NFPA69防爆系统标准(StandardonExplosionPreventionSystems)，2008版，在此完整引入作为参考，尤其关于LOC、LFL和UFL值))，乙醇的LOC约为8.7体积％，并且乙醇的LFL约为3.3体积％，。在一些实施方案中，包括异戊二烯和乙醇的组合物在小于具有可燃乙醇混合物所要求的LOC的条件下(如小于约8.7体积％)产生。在一些实施方案中，其中包括异戊二烯和乙醇的组合物在大于或约具有可燃乙醇混合物所要求的LOC的条件下产生，乙醇浓度低于LFL(如小于约3.3体积％)。
在多种实施方案中，氧化剂(如氧气)的量低于系统中任意燃料(如异戊二烯或乙醇)的LOC。在多种实施方案中，氧化剂(如氧气)的量比约60、40、30、20、10或5％的异戊二烯或乙醇的LOC少。在多种实施方案中，氧化剂(如氧气)的量比异戊二烯或乙醇的LOC少至少2、3、5或更多绝对百分点(体积％)。在特定实施方案中，氧气的量比异戊二烯或乙醇的LOC少至少2个绝对百分点(体积％)(如当异戊二烯的LOC为9.5％时，小于7.5体积％的氧浓度)。在多种实施方案中，燃料(如异戊二烯或乙醇)的量少或约为25、20、15、10或5％的针对该燃料的LFL。
示例性异戊二烯产生
在一些实施方式中，在允许细胞产生异戊二烯的条件下，于细胞培养基中培养细胞。“峰值绝对生产力”指在培养细胞特定时间段内(例如在特定发酵期间的细胞培养)，在废气中异戊二烯的最大绝对量。“峰值绝对生产力时间点”指细胞培养的特定时间段内(例如在特定发酵期间的细胞培养)，当废气中的异戊二烯的绝对量为最大值时的时间点。在一些实施方式中，异戊二烯量在峰值绝对生产力时间点处测量。在一些实施方式中，细胞的峰值绝对生产力约为任何在此所公开的任一异戊二烯量。
“峰值比生产力”指在细胞培养的特定时间段内(例如在特定发酵期间的细胞培养)，每细胞产生的异戊二烯的最大量。“峰值比生产力时间点”指在细胞培养的特定时间段内(例如在特定发酵期间的细胞培养)，当每细胞产生的异戊二烯的量为最大值时的时间点。峰值比生产力通过用总生产力除以细胞量来测定，如由在600nm处的光密度(OD600)来测定。在一些实施方式中，异戊二烯量在峰值比生产力时间点处测量。在一些实施方式中，细胞的峰值比生产力约为任何在此所公开的每细胞的异戊二烯量。
“累积总生产力”指在细胞培养的特定时间段内(例如在特定发酵期间的细胞培养)，产生的异戊二烯的累积总量。在一些实施方式中，测量异戊二烯的累积总量。在一些实施方式中，细胞的累积总生产力约为任何在此所公开的异戊二烯量。
“相对探测器反应”指用于一种化合物(如异戊二烯)的探测器反应(如GC/MS区)与一种或多种化合物(如所有C5烃)的探测器反应(如GC/MS区)的比。按本文所述可测量探测器反应，如使用Agilent6890GC/MS系统进行GC/MS分析，该系统配有AgilentHP-5MSGC/MS柱(30mx0.25mm；0.25μm膜厚度)。如需要，可使用用于每种化合物的反应因子将相对探测器反应转化为重量百分比。该反应因子为给定量的特定化合物产生多少信号的度量(也就是，探测器对特定化合物有多敏感)。当探测器对待比较的化合物具有不同敏感性时，该反应因子可用作矫正因子来将相关的反应因子转化为重量百分比。备选地，通过假定反应因子与待比较的化合物相同，可近似于重量百分比。这样，重量百分比也可假定与相关探测器反应近似相同。
在一些实施方式中，培养的细胞以大于或约1、10、25、50、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1,000、1,250、1,500、1,750、2,000、2,500、3,000、4,000、5,000或更多纳摩尔的异戊二烯/克细胞(细胞湿重)/小时(纳摩尔/gwcm/hr)产生异戊二烯。在一些实施方式中，异戊二烯的量在约2至约5,000纳摩尔/gwcm/hr之间，例如在约2至约100纳摩尔/gwcm/hr之间、约100至约500纳摩尔/gwcm/hr、约150至约500纳摩尔/gwcm/hr、约500至约1,000纳摩尔/gwcm/hr、约1,000至约2,000纳摩尔/gwcm/hr，或约2,000至约5,000纳摩尔/gwcm/hr之间。在一些实施方式中，异戊二烯的量在约20至约5,000纳摩尔/gwcm/hr之间、约100至约5,000纳摩尔/gwcm/hr、约200至约2,000纳摩尔/gwcm/hr、约200至约1,000纳摩尔/gwcm/hr、约300至约1,000纳摩尔/gwcm/hr，或约400至约1,000纳摩尔/gwcm/hr之间。
以纳摩尔/gwcm/hr为单位的异戊二烯的量可以按照美国专利号5,849,970所公开来测量，其在此通过整体引用作为参考，特别是对于异戊二烯产生的测量。例如，使用标准气相色谱系统来分析2ml顶空(例如，来自培养物的顶空，该培养物如在32℃，在密封瓶中以200转/分钟摇动约3小时培养的2mL培养物)的异戊二烯，该系统为例如以正-辛烷/多孔硅胶C柱(AlitechAssociates,Inc.,Deerfield,Ill.)等温操作并且连接RGD2氧化汞还原气体检测器的系统(TraceAnalytical,MenloPark,CA)(参见例如，Greenberg等人，Atmos.Environ.27A:2689-2692,1993；Silver等人，PlantPhysiol.97:1588-1591,1991，其各在此通过整体引用作为参考，特别是对于异戊二烯产生的测量)。气相色谱面积单位通过标准异戊二烯浓度校准曲线而转换成nmol异戊二烯。在一些实施方式中，以细胞湿重计，细胞克数值通过获得细胞培养物的样品的A600值，然后根据具有已知A600值的细胞培养物的湿重的校准曲线将A600值转换成细胞克数来计算。在一些实施方式中，通过假定1升具有A600值为1的培养液(包括细胞培养基和细胞)具有1克湿重细胞来估计细胞克数。该值也除以该培养物被孵育的小时数，如3小时。
在一些实施方式中，培养的细胞以大于或约1、10、25、50、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1,000、1,250、1,500、1,750、2,000、2,500、3,000、4,000、5,000、10,000、100,000，或更多ng的异戊二烯/克细胞(细胞湿重)/hr(ng/gwcm/h)产生异戊二烯。在一些实施方式中，异戊二烯的量在约2至约5,000ng/gwcm/h之间，例如约2至约100ng/gwcm/h之间，约100至约500ng/gwcm/h、约500至约1,000ng/gwcm/h、约1,000至约2,000ng/gwcm/h，或约2,000至约5,000ng/gwcm/h。在一些实施方式中，异戊二烯的量在约20至约5,000ng/gwcm/h、约100至约5,000ng/gwcm/h、约200至约2,000ng/gwcm/h、约200至约1,000ng/gwcm/h、约300至约1,000ng/gwcm/h，或约400至约1,000ng/gwcm/h。以ng/gwcm/h计的异戊二烯的量可以通过将在上面讨论的以纳摩尔/gwcm/hr为单位的异戊二烯产生的值乘以68.1来计算(如下面等式5所述)。
在一些实施方式中，培养的细胞以大于或约1、10、25、50、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1,000、1,250、1,500、1,750、2,000、2,500、3,000、4,000、5,000、10,000、50,000、100,000或更多mg的异戊二烯/L培养液(mg/L培养液，其中培养液的量包括细胞和细胞培养基的体积)来产生累积滴定度(总量)的异戊二烯。在一些实施方式中，异戊二烯的量在约2至约5,000mg/L培养液之间，例如约2至约100mg/L培养液之间、约100至约500mg/L培养液、约500至约1,000mg/L培养液、约1,000至约2,000mg/L培养液，或约2,000至约5,000mg/L培养液。在一些实施方式中，异戊二烯的量在约20至约5,000mg/L培养液之间、约100至约5,000mg/L培 养液、约200至约2,000mg/L培养液、约200至约1,000mg/L培养液、约300至约1,000mg/L培养液，或约400至约1,000mg/L培养液。
来自摇瓶顶空或类似培养物的以mg异戊二烯/L计的异戊二烯的比生产力可以这样测量：在OD600值为约1.0下，从细胞培养物取1ml样品，将其至于20mL瓶中，孵育30分钟，然后测量顶空中异戊二烯的量(如例如，实施例I，第II部分所述)。如果OD600值不是1.0，那么可以通过除以OD600值而将测量归一为OD600值。mg异戊二烯/L顶空的值可以通过乘以因数38而转换成培养液的mg/L培养液/hr/OD600。以mg/L培养液/hr/OD600为单位的值可以乘以小时数以及OD600值以获得以mg异戊二烯/L培养液为单位的累积滴定度。
可以通过对发酵罐废气取样品，按所述，如在实施例I，第II部分所述分析它的异戊二烯量(以例如mg异戊二烯/L气体为单位)并将这一值乘以废气流经每升培养液的速率(例如，以1vvm(空气体积/培养液体积/分钟)来测量发酵罐中以mg/L培养液/hr计的瞬间异戊二烯产生。因此，1mg/L气体的废气水平对应于在空气流速为1vvm时，60mg/L培养液/hr的瞬间生产力。如果需要，可以将以mg/L培养液/hr为单位的值除以OD600值以获得以mg/L培养液/hr/OD为单位的比速率。mg异戊二烯/L气体的平均值可以通过将这一平均废气异戊二烯浓度乘以发酵期间每升发酵培养液冒出的废气的总量而转换成总产物生产力(每升发酵培养液的异戊二烯克数，mg/L培养液)。因此，在1vvm时10小时内0.5mg/L培养液/hr的平均废气异戊二烯浓度对应于300mg异戊二烯/L培养液的总产物浓度。
在一些实施方式中，培养的细胞将细胞培养基中的大于或约0.0015、0.002、0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.12、0.14、0.16、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、5.0、6.0、7.0或8.0％的碳转化成异戊二烯。在一些实施方式中，碳转化成异戊二烯的百分数在如约0.002至4.0％、约0.002至约3.0％、约0.002至约2.0％、约0.002至约1.6％、约0.002至约0.005％、约0.005至约0.01％、约0.01至约0.05％、约0.05至约0.15％,0.15至约0.2％、约0.2至约0.3％、约0.3至约0.5％、约0.5至约0.8％、约0.8至约1.0％，或约1.0至约1.6％之间。在一些实施方式中，碳转化成异戊二烯的百分数在约0.002至约0.4摩尔％,0.002至约0.16摩尔％,0.04至约0.16摩尔％、约0.005至约0.3摩尔％、约0.01至约0.3摩尔％，或约0.05至约0.3摩尔％。
碳转化成异戊二烯的百分数(也称作％碳产量)可以通过将所产生的异戊二烯的摩尔碳除以碳源中的摩尔碳(例如在分批和补料葡萄糖和酵母提取物中的摩尔碳)而测量。这一数字乘以100％得到百分数值(如等式1所示)。
等式1
％碳产量＝(产生的异戊二烯中的摩尔碳)/(碳源中的摩尔碳)*100
对于这一计算，可以假定酵母提取物含有50％w/w碳。作为实例，对于实施例7，第III部分所述的500升，碳转化成异戊二烯的百分数可以按等式2所示来计算。
等式2
％碳产量＝(39.1g异戊二烯*1/68.1mol/g*5C/mol)/[(181221g葡萄糖*1/180mol/g*6C/mol)+(17780g酵母提取物*0.5*1/12mol/g)]*100＝0.042％
对于在此所述的两个500升发酵(实施例7，第VII和VIII部分)，碳转化成异戊二烯的百分数在0.04-0.06％之间。使用在此所述的14升系统实现了0.11-0.16％碳产量。实施例11，部分V描述了使用本文所述方法的1.53％的碳转化为异戊二烯。
本领域熟练技术人员可以容易地将异戊二烯生产量或生产的异戊二烯的量转化成任何其它单位。示例性的等式列于下面用于在单位间的相互转换。
异戊二烯生产量(总的和比生产量)的单位
等式3
1g异戊二烯/L培养液/hr＝14.7mmol异戊二烯/L培养液/hr(总体积率)
等式4
1nmol异戊二烯/gwcm/hr＝1nmol异戊二烯/L培养液/hr/OD600(这一转换假定具有OD600值为1的1升培养液具有1克湿细胞重量)
等式5
1nmol异戊二烯/gwcm/hr＝68.1ng异戊二烯/gwcm/hr(鉴于异戊二烯的分子量)
等式6
1mnol异戊二烯/L气体O2/hr＝90nmol异戊二烯/L培养液/hr(以O2流速为90L/hr每升培养液)
等式7
1μg异戊二烯/L气体废气中的异戊二烯＝60μg异戊二烯/L培养液/hr，流速为每L培养液60L气体(1vvm)
滴定度(总和比)单位
等式8
1nmol异戊二烯/mg细胞蛋白＝150nmol异戊二烯/L培养液/OD600(这一转换假定具有OD600值为1的一升培养液具有约150mg的总细胞蛋白)(比生产力)
等式9
1g异戊二烯/L培养液＝14.7mmol异戊二烯/L培养液(总滴定度)
如果需要，可以使用等式10将包括细胞湿重的任何单位转换成包括细胞干重的相应单位。
等式10
细胞干重＝细胞湿重/3.3
如需要，等式11可用于单位ppm和μg/L之间的转化。尤其，“ppm”指按照μg/g(w/w)或uL/L(vol/vol)定义的每百万份的部分。可通过确定每升废气的质量(即气体的密度)来实施μg/L到ppm的转化(例如每克气体的μg分析物)。例如，在STP下一升空气的密度大致为1.2g/L。这样，在STP下，浓度1ppm(μg/g)相当于0.83μg/L(等式11)。ppm(μg/g)到μg/L的转化是压力、温度和废气中所有组合物的函数。
等式11
1ppm(μg/g)＝0.83μg/L，在标准温度压力下(STP；101.3kPa(1bar)和273.15K)。
可使用通用气体定律(等式12)来实施μg/L到ppmv的转化。例如废气浓度1000μg/Lgas对应14.7umol/Lgas。通用气体常数是0.082057L.atmK-1mol-1，所以使用等式12，14.7umol的HG所占体积在STP下等于0.329mL。所以，在STP下，浓度1000μg/L的HG等于329ppmv或0.0329％(v/v)。
等式12
PV＝nRT，其中“P”是压力，“V”是体积，“n”气体摩尔数，“R”是通用气体常数，“T”是开尔文温度。
一般基于单位体积重量(w/v)，以单位如μg/L度量异戊二烯组合物中的杂质的量。如需要，使用等式13将以单位μg/L的度量转化为单位mg/m3。
等式13
1μg/L＝1mg/m3
在本发明所包含的一些实施方式中，包括编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸的细胞产生异戊二烯的量为在基本上相同条件下，没有编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸时所生长的相应细胞产生的异戊二烯量的至少或约2倍、3倍、5倍、10倍、25倍、50倍、100倍、150倍、200倍、400倍或更高。
在本发明所包含的一些实施方式中，包含编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸以及编码DXS、IDI和/或MVA途径多肽的一或多种异源核酸的细胞产生异戊二烯的量为在基本上相同条件下，没有异源核酸时所生长的相应细胞产生的异戊二烯量的至少或约2倍、3倍、5倍、10倍、25倍、50倍、100倍、150倍、200倍、400倍或更高。
在一些实施方案中，与该组合物中的全部C5烃的总重量相比，该异戊二烯组合物包含以重量计大于或约99.90、99.92、99.94、99.96、99.98或100％的异戊二烯。在一些实施方案中，与用于该组合物中的全部C5烃的探测器反应相比，该组合物具有大于或约99.90、99.91、99.92、99.93、99.94、99.95、99.96、99.97、99.98、99.99或100％的相对探测器反应。在一些实施方案中，与该组合物中的全部C5烃的总重量相比，该异戊二烯组合物包含以重量计约99.90至约99.92、约99.92至约99.94、约99.94至约99.96、约99.96至约99.98、约99.98至100％的异戊二烯。
在一些实施方案中，与该组合物中的全部C5烃的总重量相比，该组合物包含以重量计小于或约0.12、0.10、0.08、0.06、0.04、0.02、0.01、0.005、0.001、0.0005、0.0001、0.00005或0.00001％C5烃并非异戊二烯(如1,3-环戊二烯、顺式-1,3-戊二烯、反式-1,3-戊二烯、1-戊炔、2-戊炔、1-戊烯、2-甲基-1-丁烯、3-甲基-l-丁炔、反式-戊间二烯、顺式-戊间二烯、戊-4-烯-1-炔、反式-戊-3-烯-1-炔或顺式-戊-3-烯-1-炔)。在一些实施方案中，与用于该组合物中的全部C5烃的探测器反应相比，该组合物具有小于或约0.12,0.10,0.08,0.06,0.04,0.02,0.01,0.005,0.001,0.0005,0.0001,0.00005,或0.00001％的用于C5烃而非异戊二烯的相对探测器反应。在一些实施方案中，与用于该组合物中的全部C5烃的探测器反应相比，该组合物具有小于或约小于或约0.12、0.10、0.08、0.06、0.04、0.02、0.01、0.005、0.001、0.0005、0.0001、0.00005或0.00001％的用于1,3-环戊二烯、顺式-1,3-戊二烯、反式-1,3-戊二烯、1-戊炔、2-戊炔、1-戊烯、2-甲基-1-丁烯、3-甲基-l-丁炔、反式-戊间二烯、顺式-戊间二烯、戊-4-烯-1-炔、反式-戊-3-烯-1-炔或顺式-戊-3-烯-1-炔的相对探测器反应。在一些实施方案中，与该组合物中的全部C5烃的总重量相比，该异戊二烯组合物包含以重量计约0.02至约0.04％、约0.04至约0.06％、约0.06至0.08％、约0.08至0.10％，或约0.10至约0.12％的非异戊二烯的C5烃(如1,3-环戊二烯、顺式-1,3-戊二烯、反式-1,3-戊二烯、1-戊炔、2-戊炔、1-戊烯、2-甲基-1-丁烯、3-甲基-l-丁炔、反式-戊间二烯、顺式-戊间二烯、戊-4-烯-1-炔、反式-戊-3-烯-1-炔或顺式-戊-3-烯-1-炔)。
在一些实施方案中，该异戊二烯组合物包含小于或约50、40、30、20、10、5、1、0.5、0.1、0.05、0.01或0.005μg/L化合物，该化合物抑制用于抑制异戊二烯聚合的组合物中的任意化合物的异戊二烯聚合。在一些实施方案中，该异戊二烯组合物包含约0.005至约50、如约0.01至约10、约0.01至约5、约0.01至约1、约0.01至约0.5，或约0.01至约0.005μg/L的化合物，该化合物抑制用于抑制异戊二烯聚合的组合物中的任意化合物的异戊二烯聚合。在一些实施方案中，该异戊二烯组合物包含小于或约50、40、30、20、10、5、1、0.5、0.1、0.05、0.01或0.005μg/L的非异戊二烯的烃(如1,3-环戊二烯、顺式-1,3-戊二烯、反式-1,3-戊二烯、1-戊炔、2-戊炔、1-戊烯、2-甲基-1-丁烯、3-甲基-l-丁炔、反式-戊间二烯、顺式-戊间二烯、戊-4-烯-1-炔、反式-戊-3-烯-1-炔或顺式-戊-3-烯-1-炔)。在一些实施方案中，该异戊二烯组合物包含约0.005至约50、如约0.01至约10、约0.01至约5、约0.01至约1、约0.01至约0.5，或约0.01至约0.005μg/L的非异戊二烯的烃。在一些实施方案中，该异戊二烯组合物包含小于或约50、40、30、20、10、5、1、0.5、0.1、0.05、0.01或0.005μg/L的蛋白质或脂肪酸(如与天然橡胶天然组合的蛋白质或脂肪酸)。
在一些实施方案中，该异戊二烯组合物包含小于或约10、5、1、0.8、0.5、0.1、0.05、0.01或0.005ppm的α炔类、戊间二烯、乙腈、1,3-环戊二烯。在一些实施方案中，该异戊二烯组合物包含小于或约5、1、0.5、0.1、0.05、0.01，或0.005ppm的硫或丙二烯。在一些实施方案中，该异戊二烯组合物包含小于或约30、20、15、10、5、1、0.5、0.1、0.05、0.01或0.005ppm的所有炔类(如戊炔-1、丁炔-2、2MB1-3炔和1-戊炔-4炔)。在一些实施方案中，该异戊二烯组合物包含小于或约2000、1000、500、200、100、50、40、30、20、10、5、1、0.5、0.1、0.05、0.01或0.005ppm的异戊二烯二聚体，如环异戊二烯二聚体(例如，衍生自两个异戊二烯单元二聚的环C10化合物)。
在一些实施方案中，该异戊二烯组合物包括乙醇、丙酮、C5异戊烯醇(例如3-甲基-3-丁烯-1-醇或3-甲基-2-丁烯-1-醇)，或任意前述两种或更多物质。在一些实施方案中，该异戊二烯组合物包含大于或约0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、10、20、30、40、60、80、100或120μg/L乙醇、丙酮、C5异戊烯醇(例如3-甲基-3-丁烯-1-醇或3-甲基-2-丁烯-1-醇)，或任意前述两种或更多物质。在一些实施方案中，该异戊二烯组合物包含约0.005至约120、如约0.01至约80、约0.01至约60、约0.01至约40、约0.01至约30、约0.01至约20、约0.01至约10、约0.1至约80、约0.1至约60、约0.1至约40、约5至约80、约5至约60,或约5至约40μg/L乙醇、丙酮、C5异戊烯醇，或任意前述两种或更多物质。
在一些实施方案中，该异戊二烯组合物包括如下一种或多种如下组份：2-庚酮、6-甲基-5-庚-2-酮、2,4,5-三甲基吡啶、2,3,5-三甲基吡嗪、香茅醛、乙醛、甲硫醇、乙酸甲酯、1-丙醇、丁二酮、2-丁酮、2-甲基-3-丁烯-2-醇、乙酸乙酯、2-甲基-1-丙醇、3-甲基-1-丁醛、3-甲基-2-丁酮、1-丁醇、2-戊酮、3-甲基-1-丁醇、异丁酸乙酯、3-甲基-2-丁烯醛、乙酸丁酯、乙酸3-甲基丁酯、乙酸3-甲基-3-丁-1-烯酯、乙酸3-甲基-2-丁-1-烯酯、(E)-3,7-二甲基-1,3,6-一辛三烯、(Z)-3,7-二甲基-1,3,6-一辛三烯和2,3-环庚烯嘧啶，或线性异戊二烯聚合物(如衍生自多个异戊二烯单元聚合的线性异戊二烯二聚体或线性异戊二烯三聚体)。在多种实施方案中，这些组份之一的量相对于以重量百分比单位计的异戊二烯的量(即组份的重量除以异戊二烯的重量，乘以100)是大于或约0.01、0.02、0.05、0.1、0.5、1、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100或110％(w/w)。在一些实施方案中，与用于异戊二烯的探测器反应相比用于第二化合物的相对探测器反应为大于或约0.01、0.02、0.05、0.1、0.5、1、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100或110％。在多种实施方案中，这些化合物之一的量相对于以重量百分比单位计的异戊二烯的量(即组份的重量除以异戊二烯的重量，乘以100)为约0.01至约105％(w/w)，如约0.01至约90、约0.01至约80、约0.01至约50、约0.01至约20、约0.01至约10、约0.02至约50、约0.05至约50、约0.1至约50，或0.1至约20％(w/w)。
在一些实施方案中，该异戊二烯组合物包括如下一种或多种：醇、醛，或酮(如本文所述的任意醇、醛，或酮)。在一些实施方案中，该异戊二烯组合物包括(i)醇和醛，(ii)醇和酮，(iii)醛和酮，或(iv)醇、醛和酮。
在一些实施方案中，该异戊二烯组合物包含如下一种或多种：甲醇、乙醛、乙醇、甲硫醇、1-丁醇、3-甲基-1-丙醇、丙酮、乙酸、2-丁酮、2-甲基-1-丁醇或吲哚。在一些实施方案中，该异戊二烯组合物包含1ppm或更多如下一种或多种：甲醇、乙醛、乙醇、甲硫醇、1-丁醇、3-甲基-1-丙醇、丙酮、乙酸、2-丁酮、2-甲基-1-丁醇或吲哚。在一些实施方案中，如下一种或多种：甲醇、乙醛、乙醇、甲硫醇、1-丁醇、3-甲基-1-丙醇、丙酮、乙酸、2-丁酮、2-甲基-1-丁醇或吲哚在异戊二烯组合物中(如纯化前的废气)的浓度为约1至约10,000ppm。在一些实施方案中，该异戊二烯组合物(如经过一个或多个纯化步骤后的废气)包含如下一种或多种：甲醇、乙醛、乙醇、甲硫醇、1-丁醇、3-甲基-1-丙醇、丙酮、乙酸、2-丁酮、2-甲基-1-丁醇或吲哚、浓度为约1至约100ppm、如约1至约10ppm、约10至约20ppm、约20至约30ppm、约30至约40ppm、约40至约50ppm、约50至约60ppm、约60至约70ppm、约70至约80ppm、约80至约90ppm，或约90至约100ppm。可使用标准方法，如本文所述的那些或其他标准方法，如质子转移反应质谱(参见，例如，Bunge等人,AppliedandEnvironmentalMicrobiology,74(7):2179-2186,2008，在此完整引入作为参考，尤其关于挥发性有机化合物的分析)，分析来自细胞培养物的挥发性有机化合物(如细胞培养顶空的挥发性有机化合物)。
在一些实施方案中，该组合物包含大于约2毫克异戊二烯，如大于或约5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900，或1000毫克异戊二烯。在一些实施方案中，该组合物包含大于或约2、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100克异戊二烯。在一些实施方案中，该组合物中异戊二烯的量介于约2至约5,000mg，如介于约2至约100mg、约100至约500mg、约500至约1,000mg、约1,000至约2,000mg，或约2,000至约5,000mg。在一些实施方案中，该组合物中异戊二烯的量介于约20至约5,000mg、约100至约5,000mg、约200至约2,000mg、约200至约1,000mg、约300至约1,000mg，或约400至约1,000mg。在一些实施方案中，以该组合物挥发性有机级份的重量计大于或约20、25、30、40、50、60、70、80、90，或95％为异戊二烯。
在一些实施方案中，该组合物包括乙醇。在一些实施方案中，该组合物包括以重量计约75至约90％乙醇，如以重量计约75至约80％乙醇、约80至约85％乙醇，或约85至约90％乙醇。在组合物包括乙醇的一些实施方案中，该组合物还包括以重量计约4至约15％异戊二烯，如以重量计约4至约8％异戊二烯、约8至约12％异戊二烯，或约12至约15％异戊二烯。
在本发明所包含的一些实施方式中，包含编码异戊二烯合酶多肽、DXS多肽、IDI多肽和/或MVA途径多肽的一或多种异源核酸的细胞产生类异戊二烯的量(如由一种或多种IPP分子与一种或多种DMAPP分子反应形成的具有10个或更多个碳原子的化合物)为在基本上相同条件下，没有一种或多种异源核酸时，所生长的相应细胞产生的类异戊二烯化合物的量的至少或约2倍、3倍、5倍、10倍、25倍、50倍、100倍、150倍、200倍、400倍或更高。在本发明涵盖的一些实施方式中，包含编码异戊二烯合酶多肽、DXS多肽、IDI多肽和/或MVA途径多肽的一或多种异源核酸的细胞产生C5异戊烯醇(如3-甲基-3-丁烯-1-醇或3-甲基-2-丁烯-1-醇)的量为在基本上相同条件下，没有一种或多种异源核酸时，所生长的相应细胞产生的C5异戊烯醇的量的至少或约2倍、3倍、5倍、10倍、25倍、50倍、100倍、150倍、200倍、400倍或更高。
示例性异戊二烯纯化方法
在一些实施方式中，在此所述的任何方法还包括回收异戊二烯。例如，可以使用标准技术来回收使用本发明组合物和方法所产生的异戊二烯，例如气提、膜强化分离(membraneenhancedseparation)、分馏、吸附/解吸附、全蒸发、从固相热或真空解吸异戊二烯，或用溶剂提取固定化或吸附在固相上的异戊二烯(参见例如，美国专利号4,703,007和4,570,029，其各在此通过整体引用作为参考，特别是对于异戊二烯回收和纯化方法)。在具体实施方式中，用醇(乙醇、甲醇、丙醇，或其组合)提取性蒸馏来回收异戊二烯。在一些实施方式中，异戊二烯的回收涉及以液体形式分离异戊二烯(例如异戊二烯纯溶液或溶剂中的异戊二烯溶液)。气提涉及以连续方式从发酵废气流除去异戊二烯蒸汽。此种去除可以以多种不同方式实现，包括但不限于吸附至固相，分配到液相，或直接冷凝(如由于接触冷凝盘管或压力增加导致的冷凝)。在一些实施方式中，在蒸发露点以上，稀释异戊二烯蒸汽流的膜富集导致液体异戊二烯的冷凝。在一些实施方案中，压缩并冷凝异戊二烯。
异戊二烯的回收可包括一步或多步。在一些实施方式中，从发酵废气除去异戊二烯蒸汽以及将异戊二烯转化成液相是同时进行的。例如，异戊二烯可以直接从废气流冷凝以形成液体。在一些实施方式中，从发酵废气除去异戊二烯蒸汽以及将异戊二烯转化成液相是顺序进行的。例如，可将异戊二烯吸附至固相然后用溶剂从固相提取。
在一些实施方式中，在此所述的任何方法进一步包括纯化异戊二烯。例如，可以使用标准技术来纯化使用本发明组合物和方法所产生的异戊二烯。纯化指一种方法，通过该方法将异戊二烯与在产生异戊二烯时存在的一种或多种组分分离。在一些实施方式中，异戊二烯作为基本上纯的液体来获得。纯化方法的实例包括(i)以液体提取物从溶液蒸馏和(ii)色谱。如在此使用，“纯化的异戊二烯”指已经与在产生异戊二烯时存在的一种或多种组分分离的异戊二烯。在一些实施方式中，异戊二烯是按重量计，至少约20％不含有在产生异戊二烯时存在的其它组分。在多种实施方式中，异戊二烯是按重量计至少或约25％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、90％、95％，或99％纯的。纯度可以通过任何适当的方法来检测，例如通过柱色谱、HPLC分析或GC-MS分析。
在一些实施方案中，通过将气相引入用于异戊二烯产生的细胞培养系统(如发酵器)循环(利用)在用于异戊二烯去除的一个或多个回收步骤后保留的至少部分气相。
在一些实施方式中，在此所述的任何方法还包括使异戊二烯聚合。例如，可以使用标准方法来聚合纯化的异戊二烯以形成顺式聚异戊二烯或使用标准方法形成其他下游产物。因此，本发明也描述了包含聚异戊二烯的轮胎，如由本文公开的任意异戊二烯组合物制成的顺式-1,4-聚异戊二烯和/或反式-1,4-聚异戊二烯。
实施例
实施例也描述和详解了上面讨论的本发明的方面和实施方式，但是实施例旨在仅仅是本发明的示例并且因此不应以任何方式被认为是限定本发明。除非另有指明，否则温度是摄氏度而压力为大气压或近大气压。前面的实例和详细说明以说明的方式提供而非限制。所有在这一说明书中引用的出版物、专利申请和专利都在此通过引用作为参考，就如同每一出版物、专利申请或专利都具体且单独地引入本文作为参考。特别地，在此引用的所有出版物出于描述和公开可用于本发明的组合物和方法的目的而明确地通过引用作为参考。尽管出于清楚理解的目的，较详细地以说明方式描述了前面的发明，但是对于本领域熟练技术人员来讲显而易见的是，根据本发明的教导，可以进行某些改变和修改而不背离所附权利要求的精神或范围。
实施例1、在表达重组野葛异戊二烯合成酶的大肠杆菌中的异戊二烯产生
在大肠杆菌中表达野葛异戊二烯合酶的载体构建
野葛(葛麻姆异戊二烯合酶基因(IspS)的蛋白序列获自GenBank(AAQ84170)。对于大肠杆菌密码子使用进行优化的野葛异戊二烯合酶基因购自DNA2.0(SEQIDNO:1)。通过用BspLU11I/PstI进行限制性内切核酸酶消化从供应的质粒取下异戊二烯合酶基因，凝胶纯化，并连接到已经用NcoI/PstI消化的pTrdHis2B(Invitrogen)。设计构建体以便异戊二烯合酶基因终止密码子在PstI位点的5’。结果是，当表达构建体时，His-Tag不连接异戊二烯合酶蛋白。对得到的质粒pTrcKudzu通过测序验证(图2和3)。
也将异戊二烯合酶基因克隆到pET16b(Novagen)。这种情形下，异戊二烯合酶基因插入pET16b以便重组异戊二烯合酶蛋白含有N端His标签。通过PCR使用引物对pET-His-Kudzu-2F:5’-CGTGAGATCATATGTGTGCGACCTCTTCTCAATTTAC(SEQIDNO:3)和pET-HisKudzu-R:5’-CGGTCGACGGATCCCTGCAGTTAGACATACATCAGCTG(SEQIDNO:4)从pTrcKudzu扩增异戊二烯合酶基因。这些引物分别在基因5’端添加NdeI位点和在3’端添加BamH1位点。上述质粒pTrcKudzu用作模板DNA，根据生产商的指示，使用Herculase聚合酶(Stratagene)，并且以10pMol的浓度添加引物。在25μl的总体积下进行PCR。PCR产物用NdeI/BamH1消化并且克隆到用相同酶消化的pET16b中。将连接混合物转化到大肠杆菌Top10(Invitrogen)并通过测序筛选正确克隆。将得到的质粒(其中从T7启动子表达野葛异戊二烯合酶基因)命名为pETNHisKudzu(图4和5)。
也将野葛异戊二烯合酶基因克隆到低拷贝数质粒pCL1920中。使用引物来从上述pTrcKudzu扩增野葛异戊二烯合酶基因。正向引物向5’端添加HindIII位点和大肠杆菌共有序列RBS。PstI克隆位点已经存在于pTrcKudzu中，就在终止密码子3’，因此构建反向引物以便最终PCR产物包括PstI位点。引物序列为：HindIII-rbs-KudzuF:5’-CATATGAAAGCTTGTATCGATTAAATAAGGAGGAATAAACC(SEQIDNO:6)和BamH1-KudzuR:
5’-CGGTCGACGGATCCCTGCAGTTAGACATACATCAGCTG(SEQIDNO:4)。使用Herculase聚合酶，以10pmol引物浓度引物和1ng模板DNA(pTrcKudzu)扩增PCR产物。扩增方案包括30个循环的(95℃持续1分钟，60℃持续1分钟，72℃持续2分钟)。产物用HindIII和PstI消化并连接到也用HindIII和PstI消化的pCL1920。连接混合物转化大肠杆菌Top10。通过测序检测若干转化体。得到的质粒命名为pCL-lac-Kudzu(图6和7)。
异戊二烯产生的测定
对于摇瓶培养，将来自摇瓶的1ml培养物转入20mlCTC顶空瓶(Agilent瓶目录#51882753；盖目录/I51882759)。拧紧盖并在相同温度下孵育瓶，以250转/分钟振荡。30分钟后，从培养箱中取出瓶并按下述分析(对于这一测定法的一些实验数值参见表1)。
在测量了发酵罐中的异戊二烯产生的情形下，从发酵罐的废气取样并按下述直接进行分析(对于这一测定法的一些实验数值参见表2)。
使用与CTCAnalytics(Switzerland)CombiPAL自动进样器接口的Agilent6890GC/MS系统，在顶空模式下进行分析。使用AgilentHP-5M5GC/MS柱(30mx0.25mm；0.25pm膜厚)分离分析物。设定取样器以注射500μL顶空气体。GC/MS法利用氦气作为载气，流速为1ml/分钟。注射口保持在250℃，分流比为50:1。在分析期间，烘箱温度保持在37℃持续2分钟。Agilent5793N质量选择检测器在m/z67，以单离子监测(SIM)模式允许。从1.4至1.7分钟，关掉监测器以允许洗脱永久气体。在这些条件下，观察到异戊二烯(2-甲基-1,3-丁二烯)在1.78分钟洗脱。使用校准表来量化异戊二烯绝对量并且发现在1μg/L至2000μg/L为线性的。预计使用这一方法的检测极限为50至100ng/L。
在含有表达重组异戊二烯合酶的大肠杆菌细胞的摇瓶中的异戊二烯产生
将上述载体导入大肠杆菌菌株BL21(Novagen)以产生菌株BL21/ptrcKudzu、BL21/pCL-lac-Kudzu和BL21/pETHisKudzu。在LA(Luria琼脂)和羧苄青霉素(50μg/ml)上涂布菌株用于分离并且在37℃过夜培养。将单菌落接种到含有20mlLuriaBertani培养基(LB)和羧苄青霉素(100μg/ml)的250ml带挡板的摇瓶中。培养物在20℃以200转/分钟振荡过夜生长。测量过夜培养物的OD600并将培养物稀释到含有30mlMagicMedia(Invitrogen)和羧苄青霉素(100μg/ml)的250ml带挡板的摇瓶中至OD600～0.5。在30℃以200转/分钟振荡培养培养物。当OD600～0.5-0.8时，加入400μMIPTG并将细胞在30℃以200转/分钟振荡再培养6小时。在用IPTG诱导后0、2、4和6小时后，收集1ml培养物等分试样，测定OD600并且按上述测量产生的异戊二烯的量。结果如图8所示。
在14升发酵中从BL21/ptrcKudzu产生异戊二烯
从补料分批培养测定由含有重组野葛异戊二烯合酶基因的大肠杆菌大规模产生异戊二烯。每升发酵培养基的发酵培养基(TM2)的配方如下：K2HPO413.6g，KH2PO413.6g，MgSO4*7H2O2g，一水合柠檬酸2g，柠檬酸铁铵0.3g，(NH4)2SO43.2g，酵母提取物5g，1000X改良的痕量金属溶液(ModifiedTraceMetalSolution)1ml。所有组分一起添加并溶解在diH2O中。用氢氧化钾(KOH)调节pH至6.8并定容至体积。终产物用0.22μ过滤器过滤灭菌(只此，不高压灭菌)。1000X改良的痕量金属溶液的配方如下：柠檬酸*H2O40g、MnSO4*H2O30g、NaCl10g、FeSO4*7H2O1g、CoCl2*6H2O1g、ZnSO4*7H2O1g、CuSO4*5H2O100mg、H3BO3100mg、NaMoO4*2H2O100mg。以每次在diH2O中溶解一种组分来溶解每一组分，用HCl/NaOH调节pH至3.0，然后定容至体积并用0.22μ过滤器过滤灭菌。
这一实验在14L生物反应器中进行以监控在想要的发酵、pH6.7和温度34℃下从葡萄糖形成的异戊二烯。在大豆胨-酵母提取物-葡萄糖培养基中制备取自冷冻瓶的大肠杆菌菌株BL21/ptrcKudzu的接种物。当接种物生长至OD550＝0.6后，将2个600ml烧瓶离心并将内容物在70ml上清液中重悬浮以将细胞沉淀(70ml的OD3.1材料)转入生物反应器。接种后不同时间下，取出样品并按上述测定所产生的异戊二烯的量。结果如图9所示。
实施例2、在表达重组杨异戊二烯合酶的大肠杆菌中的异戊二烯产生
杨(银白杨x欧洲山杨)异戊二烯合酶的蛋白序列(Schnitzler,J-P等人，(2005)Flanta222:777-786)获自GenBank(CAC35696)。对于大肠杆菌进行密码子优化的基因购自DNA2.0(p9796-杨，图30和31)。通过用BspLU11I/PstI进行限制性内切核酸酶消化从供应的质粒取下异戊二烯合酶基因，凝胶纯化，并连接到已经用NcoI/PstI消化的pTrcHis2B(Invitrogen)。克隆构建体以便插入片段中的终止密码子在PstI位点之前，这得到His-Tag不连接异戊二烯合酶蛋白的构建体。对得到的质粒pTrcPoplar(图32和33)进行测序验证。
实施例3、在表达重组野葛异戊二烯合酶的柠檬泛菌中的异戊二烯产生
将在实施例1所述的pTrcKudzu和pCL-lacKudzu质粒电穿孔到柠檬泛菌(美国专利号7,241,587)。在分别含有羧苄青霉素(200μg/ml)或壮观霉素(50μg/ml)的LA上选择转化体。按实施例1对于表达重组野葛异戊二烯合酶的大肠杆菌菌株所述进行从摇瓶产生异戊二烯并测定所产生的异戊二烯的量。结果如图10所示。
实施例4、在表达重组野葛异戊二烯合酶的枯草杆菌中的异戊二烯产生
用于表达野葛异戊二烯合酶的枯草杆菌复制质粒的构建
使用在aprE启动子控制下的复制质粒(具有氯霉素抗性表达盒的pBS19)，在枯草杆菌aprEnprEPxylcomK菌株(BG3594comK)中表达野葛异戊二烯合酶基因。使用PCR分别扩增异戊二烯合酶基因、aprE启动子和转录终止子并融合。然后将构建体克隆到pBS19中并转化到枯草杆菌。
aprE启动子的扩增
使用下面的引物，从枯草杆菌的染色体DNA扩增aprE启动子：
CF797(+)起始aprE启动子MfeI
5’-GACATCAATTGCTCCATTTTCTTCTGCTATC(SEQIDNO：58)
CF07-43(-)与野葛ispS融合的aprE启动子
5’-ATTGAGAAGAGGTCGCACACACTCTTTACCCTCTCCTTTTA(SEQIDNO：59)
异戊二烯合酶基因的扩增
从质粒pTrcKudzu扩增野葛异戊二烯合酶基因(SEQIDNO：2)。该基因对于大肠杆菌进行了密码子优化并通过DNA2.0合成。使用下面的引物：
CF07-42(+)将aprE启动子与野葛异戊二烯合酶基因(GTG起始密码子)融合
5’-TAAAAGGAGAGGGTAAAGAGTGTGTGCGACCTCTTCTCAAT(SEQIDNO：60)
CF07-45(-)将野葛异戊二烯合酶基因的3’端与终止子融合
5’-CCAAGGCCGGTTTTTTTTAGACATACATCAGCTGGTTAATC(SEQIDNO：61)
c)转录终止子的扩增
使用下面的引物，从以前测序的质粒pJHPms382扩增解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyliquefaciens)的碱性丝氨酸蛋白酶的终止子：
CF07-44(+)将野葛异戊二烯合酶的3’端与终止子融合
5’-GATTAACCAGCTGATGTATGTCTAAAAAAAACCGGCCTTGG(SEQIDNO：62)
CF07-46(-)解淀粉芽孢杆菌终止子的末端(BamHI)
5’-GACATGACGGATCCGATTACGAATGCCGTCTC(SEQIDNO：63)
使用下述引物进行PCR将野葛片段与终止子片段融合：
CF07-42(+)将aprE启动子与野葛异戊二烯合酶基因融合(GTG起始密码子)
5’-TAAAAGGAGAGGGTAAAGAGTGTGTGCGACCTCTTCTCAAT(SEQIDNO：61)
CF07-46(-)解淀粉芽孢杆菌终止子的末端(BamHI)
5’-GACATGACGGATCCGATTACGAATGCCGTCTC(SEQIDNO：63)
使用下述引物进行PCR将野葛终止子片段与启动子片段融合：
CF797(+)起始aprE启动子MfeI
5’-GACATCAATTGCTCCATTTTCTTCTGCTATC(SEQIDNO：64)
CF07-46(-)解淀粉芽孢杆菌终止子的末端(BamHI)
5’-GACATGACGGATCCGATTACGAATGCCGTCTC(SEQIDNO：63)
使用Qiagen试剂盒纯化融合PCR片段并用限制性酶MfeI和BamHI消化。这一消化的DNA片段用Qiagen试剂盒进行凝胶纯化并连接至称作pBS19的载体，该载体已经用EcoRI和BamHI消化并进行了凝胶纯化。
将连接混合物转化到大肠杆菌Top10细胞，并且在LA和50羧苄青霉素板上筛选菌落。选择总共6个菌落并在LB和50羧苄青霉素中过夜生长，然后用Qiagen试剂盒分离质粒。质粒用EcoRI和BamHI消化以检测插入片段并且将3个正确的质粒送去以下面的引物进行测序：
CF149(+)aprE启动子的EcoRI起点
5’-GACATGAATTCCTCCATTTTCTTCTGC(SEQIDNO：65)
CF847(+)pXX049的序列(aprE启动子末端)
5’-AGGAGAGGGTAAAGAGTGAG(SEQIDNO：66)
CF07-45(-)将野葛异戊二烯合酶的3’端与终止子融合
5’-CCAAGGCCGGTTTTTTTTAGACATACATCAGCTGGTTAATC(SEQIDNO：61)
CF07-48(+)野葛异戊二烯合酶的测序引物
5’-CTTTTCCATCACCCACCTGAAG(SEQIDNO：67)
CF07-49(+)野葛异戊二烯合酶中的测序
5’-GGCGAAATGGTCCAACAACAAAATTATC(SEQIDNO：68)
通过测序发现名为pBSKudzu#2的质粒是正确的(图52和12)并且将它转化到枯草杆菌宿主菌株BG3594comK。在LA和5个氯霉素板上进行筛选。选择转化体并且在LA和5个氯霉素上挑选单菌落，然后在LB和5氯霉素中生长至其达到OD600为1.5。在甘油存在下，将其冻存在-80℃的瓶中。得到的菌株命名为CF443。
在含有表达重组异戊二烯合酶的枯草杆菌细胞的摇瓶中的异戊二烯产生
用来自LA和氯霉素(Cm，25μg/ml)的CF443单菌落接种过夜培养物。培养物在37℃下在LB和Cm中以200转/分钟摇动生长。使用这些过夜培养物(1ml)接种含有25mlGrantsII培养基和终浓度为25μg/ml的氯霉素的250ml带挡板的摇瓶。GrantsII培养基配方为10g大豆胨，3ml1MK2HPO4，75g葡萄糖，3.6g尿素，100ml的10xMOPS，用H2O定容至1L，pH7.2；10XMOPS配方为83.72gMOPS，7.17gtricine，12gKOH颗粒，10ml0.276MK2SO4溶液，10ml0.528MMgCl2溶液，29.22gNaCl，100ml的100x痕量营养物，用H2O定容至1L；以及100X痕量营养物的配方为1.47gCaCl2*2H2O，0.4gFeSO4*7H2O，0.1gMnSO4*H2O，0.1gZnSO4*H2O，0.05gCuCl2*2H2O，0.1gCoCl2*6H2O，0.1gNa2MoO4*2H2O，用H2O定容至1L。在37℃孵育摇瓶并在18、24和44小时取样。在18小时时，对CF443和对照菌株顶空取样。这表示18小时异戊二烯累积。异戊二烯的量通过如实施例1所述的气相色谱来测定。通过表达重组异戊二烯合酶，异戊二烯的产生显著增强(图11)。
III.在14L发酵中由CF443产生异戊二烯
由补料-分批培养测定由在复制质粒上含有重组野葛异戊二烯合酶基因的枯草杆菌进行的大规模异戊二烯产生。通过常规补料-分批发酵在含有大豆粉(Cargill)、磷酸钠和磷酸钾、硫酸镁和柠檬酸、氯化铁和氯化镁溶液的营养培养基中培养表达野葛异戊二烯合酶基因的芽孢杆菌菌株CF443或不表达野葛异戊二烯合酶基因的对照菌株。在发酵之前，使用包括纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶的酶混合物将培养基浸软90分钟(参见W095/04134)。向14-L分批发酵罐加料60％wt/wt葡萄糖(CargillDE99葡萄糖，ADMVersadexgreens或Danisco转化糖)和99％wt/wt油(WesternFamily豆油，其中99％wt/wt是它加入细胞培养基之前的油浓度)。当检测不到批次中的葡萄糖时，开始补料。补料速率在几小时内增加并且被调整以在相等的碳基础上添加油。使用28％w/v氢氧化铵将pH控制在6.8-7.4。在起泡情形下，向培养基中加入消泡剂。将发酵温度控制在37℃并且以750转/分钟搅拌发酵培养物。贯穿整个过程，对诸如pH、DO％、气流和压力的多种其它参数进行监控。DO％保持高于20。在36小时的时间进程中取样并分析细胞生长(OD550)和异戊二烯产生。这些实验的结果如图53A和53B所示。
IV.在枯草杆菌中野葛异戊二烯合酶(ispS)的整合
将野葛异戊二烯合酶基因克隆到在aprE启动子控制下的整合质粒(pJH101-cmpR)中。在检测条件下，未检测到异戊二烯。
实施例5、在木霉中的异戊二烯产生
在里氏木霉中表达野葛异戊二烯合酶的载体的构建
通过DNA2.0合成解脂耶氏酵母菌密码子优化的野葛IS基因(SEQIDNO:8)(图13)。这一质粒用作下面PCR扩增反应的模板：1μl质粒模板(20ng/μl)，1μl引物EL-945(10uM)5’-GCTTATGGATCCTCTAGACTATTACACGTACATCAATTGG(SEQIDNO:9),1μl引物EL-965(10uM)5’-CACCATGTGTGCAACCTCCTCCCAGTTTAC(SEQIDNO:10)，1μldNTP(10mM)，5μl10xPfuUltraII融合HSDNA聚合酶缓冲液，1μlPfuUltraII融合HSDNA聚合酶，40μl水，总反应体积为50μl。正向引物在5’端含有额外的4个核苷酸，这4个核苷酸不与解脂耶氏酵母密码子优化的野葛异戊二烯合酶基因对应，但为克隆到pENTR/D-TOPO载体所需的。反向引物在5’端含有额外的21个核苷酸，这21个核苷酸不与解脂耶氏酵母密码子优化的野葛异戊二烯合酶基因对应，但被插入以克隆到其它载体骨架。使用MJResearchPTC-200热循环仪，按下面进行PCR反应：95℃持续2分钟(仅仅是首个循环)，95℃持续30秒，55℃持续30秒，72℃持续30秒(重复27个循环)，最后一个循环后于72℃持续1分钟。在1.2％E-gel上分析PCR产物以确认解脂耶氏酵母密码子优化的野葛异戊二烯合酶基因的成功扩增。
然后使用TOPOpENTR/D-TOPO克隆试剂盒，按照生产商说明克隆PCR产物：1μlPCR反应物，1μl盐溶液，1μlTOPOpENTR/D-TOPO载体和3μl水，总反应体积为6μl。在室温孵育反应物5分钟。将1微升TOPO反应物转化到TOP10化学感受态大肠杆菌细胞。在LA和50μg/ml卡那霉素板上筛选转化体。挑取若干菌落并且将每个接种到5ml含有LB和50μg/ml卡那霉素的试管中并在37℃以200转/分钟振荡过夜生长。使用QIAprepSpinMiniprepKit，按照生产商说明从过夜培养物管分离质粒。对若干质粒进行测序以验证DNA序列是正确的。
编码解脂耶氏酵母密码子优化的野葛异戊二烯合酶基因的单个pENTR/D-TOPO质粒用于Gateway克隆到定制的pTrex3g载体。pTrex3g的构建描述于WO2005/001036A2。按照制造商对于GatewayLRClonaseIIEnzymeMixKit(Invitrogen)的说明进行反应：1μl解脂耶氏酵母密码子优化的野葛异戊二烯合酶基因pENTR/D-TOPO供体载体，1μlpTrex3g目的载体，6μlTE缓冲液，pH8.0，总反应体积为8μl。反应物在室温孵育1小时然后加入1μl蛋白酶K溶液并继续在37℃孵育10分钟。然后将1μl反应物转化到TOP10化学感受态大肠杆菌细胞。在LA和50μg/ml羧苄青霉素板上筛选转化体。挑取若干菌落并且将每个接种到5ml含有LB和50μg/ml羧苄青霉素的试管中并在37℃以200转/分钟振荡过夜生长。使用QIAprepSpinMiniprepKit(Qiagen,Inc.)，按照生产商说明从过夜培养物管分离质粒。对若干质粒进行测序以验证DNA序列是正确的。
使用BiolisticPDS-1000/HEParticleDeliverySystem进行解脂耶氏酵母密码子优化的野葛异戊二烯合酶pTrex3g质粒(图14)向四缺失的里氏木霉的生物射弹转化(参见WO2005/001036A2)。使用专利公开WO2005/001036A2的实施例11所列方法进行稳定转化体的分离和摇瓶评估。
在里氏木霉重组菌株中的异戊二烯产生
将1ml上述异戊二烯合酶转化体的15和36小时龄培养物转入顶空瓶。密封瓶并在30℃孵育5小时。测量顶空气体并且通过实施例1所述的方法鉴定异戊二烯。两个转化体显示出痕量异戊二烯。异戊二烯的量可通过14小时的孵育而增加。两个阳性样品在14小时的孵育后显示出异戊二烯水平为约0.5μg/L。未转化的对照没显示出可检测的异戊二烯水平。这一实验表明当提供外源异戊二烯合酶时，里氏木霉能够从内源前体产生异戊二烯。
实施例6、在耶氏酵母中的异戊二烯产生
用于在解脂耶氏酵母中表达野葛异戊二烯合酶的载体的构建
用于在解脂耶氏酵母中表达野葛异戊二烯合酶基因的载体构建的起点是载体pSPZ1(MAP29Spb)。这一载体的完整序列(SEQIDNo：11)如图15所示。
使用解脂耶氏酵母菌株GICC120285的染色体DNA作为模板，通过PCR扩增下面的片段：无启动子形式的URA3基因，18S核糖体RNA基因的片段，解脂耶氏酵母XPR2基因的转录终止子，以及含有XPR2和ICL1基因的启动子的两种DNA片段。使用下面的PCR引物：
ICL13
5’-GGTGAATTCAGTCTACTGGGGATTCCCAAATCTATATATACTGCAGGTGAC(SEQIDNO：69)
ICL15
5’-GCAGGTGGGAAACTATGCACTCC(SEQIDNO：70)
XPR3
5’-CCTGAATTCTGTTGGATTGGAGGATTGGATAGTGGG(SEQIDNO：71)
XPR5
5’-GGTGTCGACGTACGGTCGAGCTTATTGACC(SEQIDNO：72)
XPRT3
5’-GGTGGGCCCGCATTTTGCCACCTACAAGCCAG(SEQIDNO：73)
XPRT5
5’-GGTGAATTCTAGAGGATCCCAACGCTGTTGCCTACAACGG(SEQIDNO：74)
Y18S3
5’-GGTGCGGCCGCTGTCTGGACCTGGTGAGTTTCCCCG(SEQIDNO：75)
Y18S5
5’-GGTGGGCCCATTAAATCAGTTATCGTTTATTTGATAG(SEQIDNO：76)
YURA3
5’-GGTGACCAGCAAGTCCATGGGTGGTTTGATCATGG(SEQIDNO：77)
YURA50
5’-GGTGCGGCCGCCTTTGGAGTACGACTCCAACTATG(SEQIDNO：78)
YURA51
5’-GCGGCCGCAGACTAAATTTATTTCAGTCTCC(SEQIDNO：79)
对于PCR扩增，按照生产商的说明书，使用PfuUltraII聚合酶(Stratagene)，生产商提供的缓冲液和dNTPs，2.5μM引物和所示的模板DNA。使用下面的循环进行扩增：95℃持续1分钟；34x(95℃持续30sec；55℃持续30sec；72℃持续3分钟)和72℃持续10分钟，随后4℃孵育。
对于在耶氏酵母中表达进行密码子优化的编码野葛异戊二烯合酶基因的合成DNA分子得自DNA2.0(图16；SEQIDNO：12)。图18显示了携带分别在XPR2和ICL1启动子控制下的合成的野葛异戊二烯合酶基因的质粒pYLA(KZ1)和pYLI(KZ1)的构建方案的全部细节。也构建了对照质粒，其中插入交配因子基因(MAP29)代替异戊二烯合酶基因(图18E和18F)。
类似的克隆方法可以用于表达杨(银白杨x欧洲山杨)异戊二烯合酶基因。杨异戊二烯的序列描述于MillerB.等人，(2001)Planta213，483-487并且示出于图17(SEQIDNO：13)。图18A和B显示了产生携带分别在XPR2和ICL1启动子控制下的合成的杨异戊二烯合酶基因的质粒pYLA(POP1)和pYLI(POP1)的构建方案。
由解脂耶氏酵母重组菌株产生异戊二烯
载体pYLA(KZ1)、pYLI(KZ1)、pYLA(MAP29)和pYLI(MAP29)用SacII消化并通过标准醋酸锂/聚乙二醇方法转化菌株解脂耶氏酵母CLIB122以得到尿苷原养型。简言之，酵母细胞在YEPD(1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖)中过夜生长，通过离心(4000转/分钟，10分钟)收集，用无菌水冲洗并悬浮在0.1M醋酸锂，pH6.0中。将200μl等份细胞悬浮液与线性化质粒DNA溶液(10-20μg)混合，室温孵育10分钟并与1ml在相同缓冲液中的50％的PEG4000混合。进一步在室温孵育悬浮液1小时，随后在42℃热激2分钟。然后将细胞接种在SChisleu平板(0.67％酵母氮碱，2％葡萄糖，各100mg/L亮氨酸和组氨酸)上。在30℃孵育3-4天后出现转化体。
将三个来自pYLA(KZ1)转化的分离菌，三个来自pYLI(KZ1)转化的分离菌，两个来自pYLA(MAP29)转化的分离菌以及两个来自pYLI(MAP29)转化的分离菌在30℃于YEP7培养基(1％酵母提取物，2％蛋白胨，pH7.0)中振荡生长24小时。通过离心收集来自10ml培养物的细胞，在3ml新鲜YEP7中重悬浮并放入15ml螺口盖瓶。将瓶在室温温和(60转/分钟)振荡过夜培养。通过气相色谱使用如实施例1所述的质谱检测器分析这些瓶的顶空中异戊二烯含量。以pYLA(KZ1)和pYLI(KZ1)获得的所有转化体产生可容易检测量的异戊二烯(0.5μg/L至1μg/L，图20)。在携带植酸酶基因而不是异戊二烯合酶基因的对照菌株的顶空中没有检测到异戊二烯。
实施例7：在表达野葛异戊二烯合酶和idi，或dxs，或idi和dxs的大肠杆菌中产生异戊二烯
构建编码野葛异戊二烯合酶和idi，或dxs，或idi和dxs用于在大肠杆菌中产生异戊二烯的载体
i)构建pTrcKudzuKan
用赋予卡那霉素抗性的基因代替pTrcKudzu(实施例1所述)的bla基因。为了除去bla基因，pTrcKudzu用BspHI消化，用虾碱性磷酸酶(SAP)处理，在65℃热处死，然后用Klenow片段和dNTPs末端填平。从琼脂糖凝胶纯化5kbp大片段并将它连接到kanr基因，其已经使用引物MCM225’-GATCAAGCTTAACCGGAATTGCCAGCTG(SEQIDNO:14)和MCM235’-GATCCGATCGTCAGAAGAACTCGTCAAGAAGGC(SEQIDNO:15)从pCR-Blunt-II-TOPO进行PCR扩增，用HindIII和PvuI消化并进行末端填充。在含有50μg/ml卡那霉素的LA上筛选携带有赋予卡那霉素抗性的质粒(pTrcKudzuKan)的转化体。
ii)构建pTrcKudzuyIDIKan
pTrcKudzuKan用PstI消化，用SAP处理，热处死并进行凝胶纯化。其通过合成RBS连接到编码来自酿酒酵母的idi的PCR产物。PCR的引物为NsiI-YIDI1F5’-CATCAATGCATCGCCCTTAGGAGGTAAAAAAAAATGAC(SEQIDNO:16)和PstIYIDI1R5’-CCTTCTGCAGGACGCGTTGTTATAGC(SEQIDNO:17)；以及模板是酿酒酵母基因组DNA。PCR产物用NsiI和PstI消化并在连接前进行凝胶纯化。连接混合物转化到化学感受态TOP10细胞并在含有50μg/ml卡那霉素的LA上筛选。分离若干转化体并测序，将得到的质粒称作pTrcKudzu-yIDI(kan)(图34和35)。
iii)构建pTrcKudzuDXSKan
质粒pTrcKudzuKan用PstI消化，用SAP处理，热处死并进行凝胶纯化。其通过合成RBS连接到编码来自大肠杆菌的dxs的PCR产物。PCR的引物为MCM135’-GATCATGCATTCGCCCTTAGGAGGTAAAAAAACATGAGTTTTGATATTGCCAAATACCCG(SEQIDNO:18)和MCM145’-CATGCTGCAGTTATGCCAGCCAGGCCTTGAT(SEQIDNO:19)；以及模板是大肠杆菌基因组DNA。PCR产物用NsiI和PstI消化并在连接前进行凝胶纯化。将所得的转化反应物转化到TOP10细胞并在含有50μg/ml卡那霉素的LA上筛选。分离若干转化体并测序，将得到的质粒称作pTrcKudzuDXS(kan)(图36和37)。
iv)构建pTrcKudzu-yIDI-dxs(kan)
pTrcKudzu-yIDI(kan)用PstI消化，用SAP处理，热处死并进行凝胶纯化。其通过合成的RBS连接到编码大肠杆菌dxs的PCR产物(引物MCM135’-GATCATGCATTCGCCCTTAGGAGGTAAAAAAACATGAGTTTTGATATTGCCAAATACCCG(SEQIDNO:18)和MCM145’-CATGCTGCAGTTATGCCAGCCAGGCCTTGAT(SEQIDNO:19)，模板TOP10细胞)，该产物以及用NsiI和PstI消化并凝胶纯化。最终质粒称作pTrcKudzu-yIDI-dxs(kan)(图21和22)。
v)构建pCLPtrcKudzu
使用SspI从pTrcKudzu消化来自上述实施例1的含有启动子、结构基因和终止子的DNA片段并凝胶纯化。其连接至已经用PvuII消化，用SAP处理以及热处死的pCL1920。得到的连接混合物转化TOP10细胞并在含有50μg/ml壮观霉素的LA中筛选。分离若干克隆并测序，选择两个克隆。pCLPtrcKudzu和pCLPtrcKudzu(A3)具有相反方向的插入片段(图38-41)。
vi)pCLPtrcKudzuyIDI的构建
来自上述(iii)的NsiI-PstI消化的，凝胶纯化的IDIPCR扩增子连接到已经用PstI消化，用SAP处理以及热处死的pCLPtrcKudzu。连接混合物转化到TOP10细胞并在含有50μg/ml壮观霉素的LA中筛选。分离若干克隆并测序，得到的质粒称作pCLPtrcKudzuyIDI(图42和43)。
vii)pCLPtrcKudzuDXS的构建
来自上述(iii)的NsiI-PstI消化的，凝胶纯化的DXSPCR扩增子连接到已经用PstI消化，用SAP处理以及热处死的pCLPtrcKudzu(A3)。连接混合物转化得TOP10细胞并在含有50μg/ml壮观霉素的LA中筛选。分离若干克隆并测序，得到的质粒称作pCLPtrcKudzuDXS(图44和45)。
在来自以不同拷贝数表达野葛异戊二烯合酶，idi和/或dxs的培养物的顶空中的异戊二烯测量
在LB卡那霉素50μg/mL上生长之前转化有质粒pTrcKudzu(kan)(A)、pTrcKudzu-yIDIkan(B)、pTrcKudzu-DXSkan(C)、pTrcKudzu-yIDIDXSkan(D)的大肠杆菌BL21(λDE3)培养物。在LB壮观霉素50μg/mL上生长pCLPtrcKudzu(E)、pCLPtrcKudzu、pCLPtrcKudzu-yIDI(F)和pCLPtrcKudzu-DXS(G)的培养物。培养物在时间0用400μMIPTG诱导(OD600接近0.5)并且取样用于异戊二烯顶空测量(参见实施例1)。结果如图23A-23G所示。
将质粒pTrcKudzu-yIDI-dxs(kan)通过转化导入大肠杆菌菌株BL21。得到的菌株BL21/pTrcKudzuIDIDXS在20℃下于含有卡那霉素(50μg/ml)的LB中过夜生长并用于接种含1％葡萄糖的TM3(13.6gK2PO4、13.6gKH2PO4、2.0gMgSO4*7H2O、2.0g一水合柠檬酸、0.3g柠檬酸铁铵、3.2g(NH4)2SO4、0.2g酵母提取物、1.0ml1000x改良的痕量金属溶液，调节至pH6.8并用H2O定容，并灭菌过滤)培养瓶。培养瓶在30℃孵育直到OD600达到0.8，然后用400μMIPTG诱导。在诱导后多个时间取样并按实施例1所述测量顶空中的异戊二烯的量。结果如图23H所示。
在大肠杆菌/pTrcKudzuyIDIDXS中从生物量产生异戊二烯
检测菌株BL21pTrcKudzuIDIDXS从三种类型的生物量：甘蔗渣、玉米秸秆和软材木浆产生异戊二烯的能力，以葡萄糖为对照。生物量的水解物由酶促水解来制备(Brown,L和Torget,R.,1996,NREL标准测定法Lap-009“EnzymaticSaccharificationofLignocellulosicBiomass”)并且根据葡萄糖当量以稀释液使用。这一实例中，葡萄糖当量等于1％葡萄糖。使用来自新鲜的转化细胞BL21(DE3)pTrcKudzuyIDIDXS(kan)的平板的单菌落来接种5ml的LB加卡那霉素(50μg/ml)。在25℃过夜振荡孵育培养物。第二天，将过夜培养物在25ml的TM3和0.2％YE和1％原料中稀释至OD600为0.05。原料是玉米秸秆、甘蔗渣或软材木浆。葡萄糖用作阳性对照而没有葡萄糖用作阴性对照。在30℃以180转/分钟振荡孵育培养物。监测培养物的OD600并且当它达到OD600为～0.8时，在1和3小时按实施例1所述分析培养物的异戊二烯产生。培养物未被诱导。所有含有添加的原料的培养物产生的异戊二烯与由葡萄糖阳性对照所产生的异戊二烯相等。实验以一式两份进行并且示出于图46。
在大肠杆菌/pTrcKudzuIDIDXS中从转化糖产生异戊二烯
使用来自新鲜的转化细胞BL21(λDE3)/pTrcKudzuyIDIDXS(kan)的平板的单菌落来接种5ml的LB和卡那霉素(50μg/ml)。在25℃过夜振荡孵育培养物。第二天，将过夜培养物在25ml的TM3和0.2％YE和1％原料中稀释至OD600为0.05。原料是葡萄糖、转化葡萄糖或玉米秸秆。转化糖原料(DaniscoInvertSugar)通过酶处理蔗糖糖浆来制备。AFEX玉米秸秆按下述(第V部分)制备。细胞在30℃生长并且当培养物达到OD600为～0.8-1.0(0小时)时，测量第一个样品。按由OD600所测来分析培养物的生长以及按照实施例1，在0、1和3小时分析异戊二烯产生。结果如图47所示。
从AFEX预处理的玉米秸秆制备水解物
AFEX预处理的玉米秸秆获自MichiganBiotechnologyInstitute。预处理条件为60％湿度，1:1氨负载，以及90℃持续30分钟，然后风干。AFEX预处理的玉米秸秆的水分含量为21.27％。在AFEX预处理的玉米秸秆中的葡聚糖和木聚糖含量分别是31.7％和19.1％(基于干物质)。糖化工艺如下：将20g的AFEX预处理玉米秸秆与5ml的1M柠檬酸钠缓冲液，pH4.8，2.25ml的Accellerase1000，0.1ml的GrindamylH121(来自用于面包制造工业的黑曲霉的Danisco木聚糖酶产物)，以及72.65ml的DI水加入500ml培养瓶。将培养瓶放入定轨摇床并在50℃孵育96小时。从摇床取一个样品并使用HPLC分析。水解物含有38.5g/l的葡萄糖，21.8g/l的木糖和10.3g/l的葡萄糖和/或木糖寡聚物。
酵母提取物对在补料分批培养中生长的大肠杆菌的异戊二烯产生的影响
以14-L规模按前面所述，用含有上述pTrcKudzuyIDIDXS质粒的大肠杆菌细胞进行发酵。以指数速率喂饲酵母提取物(BioSpringer,Montreal,Quebec,Canada)。在40小时发酵期间，送至发酵罐中的酵母提取物的总量在70-830之间变化。在550nm波长测量发酵液的光密度。发酵罐中的最终光密度与所添加的酵母提取物的量成比例(图48A)。按前述测定发酵罐的废气中的异戊二烯水平。异戊二烯滴定度随发酵进程增加(图48B)。所产生的异戊二烯的量与喂饲的酵母提取物的量成线性比例(图48C)。
VII.在pTrcKudzuDXSyIDI的500-L发酵中产生异戊二烯
使用具有野葛异戊二烯合酶、酿酒酵母IDI以及大肠杆菌DXS核酸(大肠杆菌BL21(λDE3)pTrcKudzudxsyidi)的大肠杆菌细胞的500升发酵来产生异戊二烯。异戊二烯的水平在15小时的时间段从50至300μg/L变化。在平均异戊二烯浓度的基础上，通过装置的平均流量以及异戊二烯漏出的程度，收集的异戊二烯的量被计算为接近17g。
在补料分批培养中生长的大肠杆菌的500L发酵中的异戊二烯产生
培养基配方(每升发酵培养基)：
K2HPO47.5g、MgSO4*7H2O2g、一水合柠檬酸2g、柠檬酸铁铵0.3g、酵母提取物0.5g、1000X改良的痕量金属溶液1ml。所有组分一起添加并溶解在diH2O中。对这一溶液高压灭菌。用氨气(NH3)调节pH至7.0并定容至体积。灭菌以及调节pH后，添加葡萄糖10g、硫胺素*HCl0.1g以及抗生素。
1000X改良的痕量金属溶液：
柠檬酸*H2O40g、MnSO4*H2O30g、NaCl10g、FeSO4*7H2O1g、CoCl2*6H2O1g、ZnSO4*7H2O1g、CuSO4*5H2O100mg、H3BO3100mg、NaMoO4*2H2O100mg。以每次在DIH2O中溶解一种组分来溶解每一组分，用HCl/NaOH调节pH至3.0，然后定容至体积并用0.22微米过滤器过滤灭菌。
在500-L生物反应器中，用含有pTrcKudzuyIDIDXS质粒的大肠杆菌细胞进行发酵。进行这一实验来监控在期望的发酵pH7.0以及温度30℃下从葡萄糖和酵母提取物形成的异戊二烯。在大豆胨-酵母提取物-葡萄糖培养基中制备取自冷冻瓶的大肠杆菌菌株的接种物。当接种物生长至在550nm处测量的OD为0.15后，使用20ml接种含有2.5-L大豆胨-酵母提取物-葡萄糖培养基的生物反应器。该2.5-L生物反应器在30℃下生长至OD1.0并将2.0-L转入500-L生物反应器。
以指数速率喂饲酵母提取物(BioSpringer,Montreal,Quebec,Canada)和葡萄糖。在50小时发酵期间，送至生物反应器的葡萄糖和酵母提取物的总量分别为181.2kg和17.6kg。图49A显示了生物反应器中随着时间的光密度。按前述测定生物反应器的废气中的异戊二烯水平。异戊二烯滴定度随着发酵进程而增加(图49B)。在50小时发酵期间产生的异戊二烯总量为55.1g并且产生的时间进程如图49C所示。
实施例8、在表达野葛异戊二烯合酶和重组甲羟戊酸途径基因的大肠杆菌中产生异戊二烯
下游MVA途径的克隆
克隆下游甲羟戊酸途径的策略如下。通过PCR从酿酒酵母染色体DNA扩增甲羟戊酸生物合成途径的四种基因；甲羟戊酸激酶(MVK)，磷酸甲羟戊酸激酶(PMK)、二磷酸甲羟戊酸脱羧酶(MVD)和异戊烯二磷酸异构酶基因并且分别克隆到pCRBluntIITOPO质粒(Invitrogen)。在一些情形下，从大肠杆菌染色体DNA扩增idi基因。设计引物使得在5’端起始密码子上游8bp处插入大肠杆菌共有序列RBS(AGGAGGT(SEQIDNO:80)或AAGGAGG(SEQIDNO:81))以及在3’端添加PstI位点。然后一个接一个地将这些基因克隆到pTrcHis2B载体直到组装了整个途径。
酿酒酵母S288C的染色体DNA获自ATCC(ATCC204508D)。使用PfuTurbo按照生产商的说明书，用引物MVKF(5’-AGGAGGTAAAAAAACATGTCATTACCGTTCTTAACTTCTGC，SEQIDNO:21)和MVK-Pstl-R(5’-ATGGCTGCAGGCCTATCGCAAATTAGCTTATGAAGTCCATGGTAAATTCGTG，SEQIDNO:22)从酿酒酵母染色体扩增MVK基因。通过1.2％E-gel(Invitrogen)电泳鉴定正确大小的PCR产物(1370bp)并将其克隆pZeroBLUNTTOPO。将得到的质粒称作pMVK1。用SacI和Taq1限制性内切核酸酶消化质粒pMVK1并对片段凝胶纯化并连接到用SacI和BsIBI消化的pTrcHis2B。将得到的质粒命名为pTrcMVK1。
使用引物PstI-PMK1R(5’-GAATTCGCCCTTCTGCAGCTACC，SEQIDNO:23)和BsiHXAI-PMK1F(5’-CGACTGGTGCACCCTTAAGGAGGAAAAAAACATGTCAG，SEQIDNO:24)，通过PCR扩增甲羟戊酸生物合成途径的第二种基因PMK。使用PfuTurbo聚合酶(Stratagene)按照生产商的说明书进行PCR反应。将正确大小的产物(1387bp)用PstI和BsiHKI消化并连接到用PstI消化了的pTrcMVK1中。将得到的质粒命名为pTrcKK。以相同方式克隆MVD和idi基因。使用引物对PstI-MVD1R(5’-GTGCTGGAATTCGCCCTTCTGCAGC，SEQIDNO:25)和NsiI-MVD1F(5’-GTAGATGCATGCAGAATTCGCCCTTAAGGAGG，SEQIDNO:26)进行PCR以扩增MVD基因，并且使用引物对PstI-YIDI1R(5’-CCTTCTGCAGGACGCGTTGTTATAGC，SEQIDNO:27)和NsiI-YIDI1F(5’-CATCAATGCATCGCCCTTAGGAGGTAAAAAAAAATGAC，SEQIDNO:28)扩增yIDI基因。在一些情形下，使用来自大肠杆菌的IPP异构酶基因，idi。为了扩增来自大肠杆菌染色体DNA的idi，使用下面的引物对：PstI-CIDI1R(5’-GTGTGATGGATATCTGCAGAATTCG，SEQIDNO:29)和NsiI-CIDI1F(5’-CATCAATGCATCGCCCTTAGGAGGTAAAAAAACATG，SEQIDNO:30)。模板DNA是通过标准方法从大肠杆菌FM5分离的染色体DNA(WO96/35796和WO2004/033646，其各在此通过整体引用作为参考，特别是对于核酸的分离)。最终的质粒命名为pKKDIy用于编码酵母idi基因的构建体或者命名为pKKDIc用于编码大肠杆菌idi基因的构建体。将质粒转化到大肠杆菌宿主BL21用于随后分析。在一些情形下，将来自野葛的异戊二烯合酶克隆到pKKDIy，产生质粒pKKDIyIS。
也将下游MVA途径克隆到含有卡那霉素抗生素抗性标记的pTrc。用限制性内切核酸酶ApaI和PstI消化质粒pTrcKKDIy，在1.2％琼脂糖E-gel上分离5930bp片段并使用QiagenGelPurification试剂盒按照制造商的说明书进行纯化。用限制性内切核酸酶ApaI和PstI消化在实施例7中描述的质粒pTrcKudzuKan，使用QiagenGelPurification试剂盒从1.2％E-凝胶纯化3338bp含有载体的片段。使用RocheQuickLigation试剂盒连接该3338bp载体片段和5930bp下游MVA途径片段。将连接混合物转化到大肠杆菌TOP10细胞并将转化体在37℃下过夜生长，用含有卡那霉素(50μg/ml)的LA筛选。转化体通过限制性酶消化验证并将1个冷冻作为原种。质粒命名为pTrcKanKKDIy。
野葛异戊二烯合酶基因在pTrcKanKKDIy中的克隆
使用引物MCM505’-GATCATGCATTCGCCCTTAGGAGGTAAAAAAACATGTGTGCGACCTCTTCTCAATTTACT(SEQIDNO:31)和MCM535’-CGGTCGACGGATCCCTGCAGTTAGACATACATCAGCTG(SEQIDNO:32)，通过PCR从实施例1所述的pTrcKudzu扩增野葛异戊二烯合酶基因。将得到的PCR片段克隆到pCR2.1中并转化大肠杆菌TOP10。这一片段含有野葛异戊二烯合酶的编码序列以及含有大肠杆菌RBS的上游区。转化体在37℃下过夜孵育，在含有卡那霉素(50μg/ml)的LA上筛选。通过测序验证正确的片段插入并将这一菌株命名为MCM93。
用限制性内切核酸酶NsiI和PstI消化来自菌株MCM93的质粒以释放含有RBS和野葛异戊二烯合酶的1724bp插入片段。在1.2％琼脂糖E-gel上分离该1724bp片段并使用QiagenGelPurification试剂盒按照生产商的说明书进行纯化。用限制性内切核酸酶PstI消化质粒pTrcKanKKDIy，在37℃用SAP处理30分钟并使用QiagenPCR纯化试剂盒进行纯化。使用RocheQuickLigation试剂盒连接质粒和编码野葛异戊二烯合酶的DNA片段。将连接混合物转化到大肠杆菌TOP10细胞并且将转化体在37℃下过夜生长，在含有50μg/ml卡那霉素的LA上筛选。通过限制性酶切验证正确的转化体并且将质粒命名为pTrcKKDyIkISKan(图24和25)。将这一质粒转化得BL21(λDE3)细胞(Invitrogen)。
在表达重组下游甲羟戊酸途径以及来自野葛的异戊二烯合酶的大肠杆菌中从甲羟戊酸产生异戊二烯
在MOPS培养基中培养菌株BL21/pTrcKKDyIkISKan(Neidhardt等人，(1974)J.Bacteriology119：736-747)，调节至pH7.1并补充0.5％葡萄糖和0.5％甲羟戊酸。使用相同的条件只是不添加0.5％甲羟戊酸来建立对照培养。培养从用1％接种物的过夜种子培养物开始并且当培养物达到OD600为0.3至0.5时用500μMIPTG诱导。在30℃以250转/分钟振荡生长培养物。在使用实施例1所述的顶空测定法诱导3小时后分析异戊二烯产生。异戊二烯的最大产量为6.67x104nmol/L培养液/OD600/hr，其中L培养液是培养液的体积并且包括细胞培养基的体积和细胞的体积。没有补充甲羟戊酸的对照培养物没有产生可测量的异戊二烯。
上游MVA途径的克隆
从粪肠球菌克隆包括两个编码三种酶促活性的基因的上游甲羟戊酸生物合成途径。mvaE基因编码一种蛋白质，该蛋白质具有在该途径中的第一和第三蛋白质乙酰-CoA乙酰转移酶和3-羟基-3-甲基戊二酰基-CoA(HMG-CoA)还原酶的酶促活性，并且mvaS基因编码该途径中第二种酶HMG-CoA合酶。使用下面的引物，从粪肠球菌基因组DNA(ATCC700802D-5)扩增mvaE基因，该基因前面为大肠杆菌核糖体结合位点和间隔区。
CF07-60(+)mvaEw/RBS+ATG起始密码子SacI起点
5’-GAGACATGAGCTCAGGAGGTAAAAAAACATGAAAACAGTAGTTATTATTG(SEQIDNO：34)
CF07-62(-)mvaE与mvaS融合，其间有RBS
5’-TTTATCAATCCCAATTGTCATGTTTTTTTACCTCCTTTATTGTTTTCTTAAATC(SEQIDNO：35)
使用下面的引物，从粪肠球菌基因组DNA(ATCC700802D-5)扩增mvaS基因，该基因前面为大肠杆菌RBS和间隔区：
CF07-61(+)mvaE与mvaS融合，其间有RBS
5’-GATTTAAGAAAACAATAAAGGAGGTAAAAAAACATGACAATTGGGATTGATAAA(SEQIDNO：36)
CF07-102(-)mvaS基因BglII末端
5’-GACATGACATAGATCTTTAGTTTCGATAAGAACGAACGGT(SEQIDNO：37)。
使用下面的引物，用PCR将PCR片段融合在一起：
CF07-60(+)mvaEw/RBS+ATG起始密码子SacI的起点
5’-GAGACATGAGCTCAGGAGGTAAAAAAACATGAAAACAGTAGTTATTATTG(SEQIDNO：34)
CF07-102(-)mvaS基因BglII末端
5’-GACATGACATAGATCTTTAGTTTCGATAAGAACGAACGGT(SEQIDNO：37)
融合PCR片段用Qiagen试剂盒纯化并用限制性酶SacI和BglII消化。使用Qiagen试剂盒对该消化的DNA片段进行凝胶纯化并将它连接到可商购的载体pTrcHis2A，该载体已经用SacI和BglII消化以及凝胶纯化。
将连接混合物转化大肠杆菌TOP10细胞并且在LA和50μg/ml羧苄青霉素板上筛选菌落。选择总共6个菌落并在LB和50μg/ml羧苄青霉素中过夜生长并使用Qiagen试剂盒分离质粒。用SacI和BglII消化质粒以检验插入片段并且用下面的引物对一个正确的质粒进行测序：
CF07-58(+)mvaE基因的起点
5’-ATGAAAACAGTAGTTATTATTGATGC(SEQIDNO：38)
CF07-59(-)mvaE基因的末端
5’-ATGTTATTGTTTTCTTAAATCATTTAAAATAGC(SEQIDNO：39)
CF07-82(+)mvaS基因起点
5’-ATGACAATTGGGATTGATAAAATTAG(SEQIDNO：40)
CF07-83(-)mvaS基因末端
5’-TTAGTTTCGATAAGAACGAACGGT(SEQIDNO：41)
CF07-86(+)mvaE中的序列
5’-GAAATAGCCCCATTAGAAGTATC(SEQIDNO：42)
CF07-87(+)mvaE中的序列
5’-TTGCCAATCATATGATTGAAAATC(SEQIDNO：43)
CF07-88(+)mvaE中的序列
5’-GCTATGCTTCATTAGATCCTTATCG(SEQIDNO：44)
CF07-89(+)序列mvaS
5’-GAAACCTACATCCAATCTTTTGCCC(SEQIDNO：45)
通过测序确认命名为pTrcHis2AUpperPathway#1的质粒是正确的并将其转化到可商购的大肠杆菌菌株BL21中。在LA和50μg/ml羧苄青霉素上进行筛选。选择两个转化体并在LB和50μg/ml羧苄青霉素中生长至它们达到OD600为1.5。在甘油存在下，将两个菌株在-80℃下在瓶中冷冻。对于BL21中的pTrcHis2AUpperPathway#l，分离菌#1，将菌株命名为CF449，对于BL21中的pTrcHis2AUpperPathway#1，分离菌#2，命名为CF450。发现两个克隆在分析时表现相同。
UpperMVA途径在pCL1920中的克隆
用限制性内切核酸酶SspI消化质粒pTrcHis2AUpperPathway以释放含有pTrc-mvaE-mvaS-(His-标签)-终止子的片段。在这一片段中，his-标签并未被翻译。使用QiagenGelPurification试剂盒从1.2％E-凝胶纯化这一平末端4.5kbp片段。通过用限制性内切核酸酶PvuII消化载体，用SAP处理并使用QiagenGelPurification试剂盒从1.2％E-凝胶纯化而从pCL1920制备去磷酸化的平末端4.2kbp片段。使用RocheQuickLigationKit连接两个片段并将它转化到TOP10化学感受态细胞。在含有壮观霉素(50μg/ml)的LA上筛选转化体。通过利用PCR筛选插入片段的存在来鉴定正确菌落。将质粒命名为pCLPtrcUpperPathway(图26和27A-27D)。
表达组合的上和下游甲羟戊酸途径的菌株
为了获得具有完整的甲羟戊酸途径加野葛异戊二烯合酶的菌株，将质粒pTrcKXDylkISkan和pCLpTrcUpperPathway都转化到BL21(λDE3)感受态细胞(Invitrogen)中并且在含有卡那霉素(50μg/ml)和壮观霉素(50μg/ml)的LA上筛选转化体。通过质粒制备来检查转化体以确保两种质粒都保留在宿主中。菌株命名为MCM127。
VII.在大肠杆菌/pUpperpathway中从葡萄糖产生甲羟戊酸
将BL21/pTrcHis2A-mvaE/mvaS或FM5/ppTrcHis2A-mvaE/mvaS的单菌落接种到LB和羧苄青霉素(100μg/ml)中并在37℃以200转/分钟振荡过夜生长。在250ml带挡板培养瓶中将这些培养物稀释到50ml培养基中至OD600为0.1。培养基为TM3，1或2％葡萄糖，羧苄青霉素(100μg/ml)或者TM3，1％葡萄糖，水解豆油和羧苄青霉素(100μg/ml)或者TM3和生物量(制备的甘蔗渣、玉米秸秆或柳枝稷)。培养物在30℃以200转/分钟振荡生长约2-3小时至达到OD600为0.4。在该点，通过添加IPTG(400μM)来诱导从mvaEmvaS构建体的表达。进一步培育培养物20或40小时，以2小时间隔取样至诱导后6小时，然后按需要在24、36和48小时取样。通过取出1ml培养物完成取样，测量OD600，在微量离心机中沉淀细胞，除去上清液并分析它的甲羟戊酸。
用TM3培养基和2％葡萄糖作为细胞培养基，具有编码粪肠球菌AA-CoA硫解酶、HMG-CoA合酶和HMG-CoA还原酶多肽的核酸的大肠杆菌细胞的14升发酵产生22克甲羟戊酸。用LB培养基和1％葡萄糖作为细胞培养基，这些细胞的摇瓶产生2-4克甲羟戊酸/升。这些菌株中的甲羟戊酸产生表明MVA途径在大肠杆菌中是有功能的。
从含有上和下游MVA途径加野葛异戊二烯合酶的大肠杆菌BL21产生异戊二烯
通过将含有上和下游MVA途径以及上述野葛异戊二烯合酶基因的质粒与含有实施例7所述的idi、dxs和dxr以及异戊二烯合酶基因的质粒的多种组合来转化而产生下面的菌株。所用宿主细胞为化学感受态BL21(λDE3)并且通过标准方法进行转化。在含有卡那霉素(50μg/ml)或卡那霉素加壮观霉素(浓度均为50μg/ml)的L琼脂上筛选转化体。在37℃培养平板。得到的菌株按下面命名：
在卡那霉素加壮观霉素(各50μg/ml)上生长
MCM127-BL21(λDE3)中的pCLUpperMVA和pTrcKKDyIkIS(kan)
MCM131-BL21(λDE3)中的pCL1920和pTrcKKDyIkIS(kan)
MCM125-BL21(λDE3)中的pCLUpperMVA和pTrcHis2B(kan)
在卡那霉素(50μg/ml)上生长
MCM64-BL21(λDE3)中的pTrcKudzuyIDIDXS(kan)
MCM50-BL21(λDE3)中的pTrcKudzu(kan)
MCM123-BL21(λDE3)中的pTrcKudzuyIDIDXSDXR(kan)
上述菌株从冷冻母液在LA和适当抗生素上划线并在37℃过夜生长得到。每个板的单菌落用来接种摇瓶(25mlLB和适当抗生素)。将培养瓶在22℃以200转/分钟振荡过夜孵育。第二天早晨，将培养瓶转入37℃培养箱并以200转/分钟再振荡生长4.5小时。将25ml培养物离心以沉淀细胞并在5mlLB和适当抗生素中重悬细胞。将培养物稀释到25mlLB+％葡萄糖和适当抗生素中至OD600为0.1。每个菌株建立两个培养瓶，一套用IPTG(800μM)诱导，另一套不诱导。在37℃以250转/分钟振荡孵育培养物。一套培养物在1.50小时后诱导(紧接着取样时间点1)。在每个取样时间点，测量OD600并按实施例1所述测定异戊二烯的量。结果如表3所示。所生成的异戊二烯的量以特定菌株的峰值产生量来表示。
表3.在大肠杆菌菌株中的异戊二烯产生
菌株 异戊二烯(μg/L培养液/hr/OD
MCM50 23.8
MCM64 289
MCM125 ND
MCM131 痕量
MCM127 874
ND：未检测到
痕量：存在峰值但不可积分。
IX.甲羟戊酸的分析
甲羟戊酸内酯(1.0g,7.7mmol)(CAS#503-48-0)由Sigma-Aldrich(WI,USA)提供，其溶解在水(7.7mL)中作为浆液并用氢氧化钾(7.7mmol)处理以产生甲羟戊酸的钾盐。向甲羟戊酸的转化通过1HNMR分析来确认。通过在14,000转/分钟下离心5分钟除去细胞，随后向900μl的H2O中添加300μl等份上清液来制备用于HPLC分析的样品。然后添加高氯酸(36μl的70％溶液)，接着混合并在冰上冷却5分钟。然后再次离心样品(14,000转/分钟，5分钟)并将上清液转入HPLC。以相同方式制备甲羟戊酸标准品(20，10，5，1和0.5g/L)。使用BioRadAminex87-H+柱(300mm×7.0mm)通过HPLC进行甲羟戊酸(20uL注射体积)的分析，该柱用5mM硫酸以0.6mL/分钟洗脱，以折射率(RI)检测。在这些条件下，在18.5分钟时，甲羟戊酸以内酯形式洗脱。
X.从包含上游MVA途径和野葛异戊二烯合酶的大肠杆菌BL21中产生异戊二烯
将表达甲羟戊酸途径多肽和野葛异戊二烯合酶的大肠杆菌的15-L规模发酵用于从补料-分批培养细胞产生异戊二烯。该实验显示在葡萄糖限制条件下生长的细胞导致2.2g/L异戊二烯的产生。
培养基配方(每升发酵培养基)：
使用以下每升发酵培养基的组份来制备培养基：K2HPO47.5g、MgSO4*7H2O2g、一水合柠檬酸2g、柠檬酸铁铵0.3g、酵母提取物0.5g和1000X改良的痕量金属溶液1ml。所有组分一起添加并溶解在diH2O中。对这一溶液高压灭菌。用氢氧化铵(30％)调节pH至7.0并定容至体积。灭菌以及调整pH后，添加葡萄糖10g、硫胺素*HCl0.1g以及抗生素。
1000X改良的痕量金属溶液：
使用以下组份来制备1000X改良的痕量金属溶液：柠檬酸*H2O40g、MnSO4*H2O30g、NaCl10g、FeSO4*7H2O1g、CoCl2*6H2O1g、ZnSO4*7H2O1g、CuSO4*5H2O100mg、H3BO3100mg、NaMoO4*2H2O100mg。以每次在DiH2O中溶解一种来溶解每一组分，用HCl/NaOH调节pH至3.0，然后定容至体积并用0.22微米过滤器过滤灭菌。
在15-L生物反应器中，用含有pCLPtrcUpperPathway(图26)和pTrcKKDyIkIS质粒的BL21(DE3)大肠杆菌细胞进行发酵。进行这一实验来监控在期望的发酵pH7.0以及温度30℃下从葡萄糖形成的异戊二烯。将取自冷冻瓶的大肠杆菌菌株的接种物划线到LB液体培养基琼脂板(含有抗生素)上并在37℃过夜培养。将单菌落接种到大豆胨-酵母提取物-葡萄糖培养基中。当接种物生长至在550nm处测量的OD为1.0后，使用500ml接种5-L生物反应器。
以指数速率供给葡萄糖直到细胞达到稳定期。这一时间后，葡萄糖加料减少以满足代谢要求。在54小时发酵期间，送至生物反应器的葡萄糖总量为3.7kg。通过添加异丙基-β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)完成诱导。当在550nm的光密度(OD550)达到数值10时，IPTG浓度达到25uM。当OD550达到190时，IPTG浓度升至50uM。在发酵38小时时，IPTG浓度升至100uM。图54显示了生物反应器中随着时间的OD550谱。如本文所述测定生物反应器的废气中的异戊二烯水平。异戊二烯的滴定度随着发酵进程增加至终值为2.2g/L(图55)。在54小时发酵期间所产生的异戊二烯的总量为15.9g而产生的时间进程如图56所示。
XI.表达来自甲羟戊酸途径的基因并在15-L规模下于补料分批培养中生长的大肠杆菌的异戊二烯发酵
将表达甲羟戊酸途径多肽和野葛异戊二烯合酶的大肠杆菌的15-L规模发酵用于从补料-分批培养细胞产生异戊二烯。该实验显示在葡萄糖限制条件下生长的细胞导致3.0g/L异戊二烯的产生。
培养基配方(每升发酵培养基)：
使用以下每升发酵培养基的组份来制备培养基：K2HPO47.5g、MgSO4*7H2O2g、一水合柠檬酸2g、柠檬酸铁铵0.3g、酵母提取物0.5g和1000X改良的痕量金属溶液1ml。所有组分一起添加并溶解在diH2O中。对这一溶液高压灭菌。用氢氧化铵(30％)调节pH至7.0并定容至体积。灭菌以及调整pH后，添加葡萄糖10g，硫胺素*HCl0.1g以及抗生素。
1000X改良的痕量金属溶液：
使用以下组份来制备1000X改良的痕量金属溶液：柠檬酸*H2O40g、MnSO4*H2O30g、NaCl10g、FeSO4*7H2O1g、CoCl2*6H2O1g、ZnSO4*7H2O1g、CuSO4*5H2O100mg、H3BO3100mg、NaMoO4*2H2O100mg。以每次在DiH2O中溶解一种来溶解每一组分，用HCl/NaOH调节pH至3.0，然后定容至体积并用0.22微米过滤器过滤灭菌。
在15-L生物反应器中，用含有pCLPtrcUpperPathway和pTrcKKDyIkIS质粒的BL21(DE3)大肠杆菌细胞进行发酵。进行这一实验来监控在期望的发酵pH7.0以及温度30℃下从葡萄糖形成的异戊二烯。将取自冷冻瓶的大肠杆菌菌株的接种物划线到LB液体培养基琼脂板(含有抗生素)上并在37℃过夜培养。将单菌落接种到胰蛋白胨-酵母提取物培养基中。当接种物生长至在550nm处测量的OD为1.0后，使用500ml接种5-L生物反应器。
以指数速率供给葡萄糖直到细胞达到稳定期。这一时间后，葡萄糖加料减少以满足代谢要求。在59小时发酵期间，送至生物反应器的葡萄糖总量为2.2kg。通过添加IPTG完成诱导。当在550nm的光密度(OD550)达到数值10时，IPTG浓度达到25uM。当OD550达到190时，IPTG浓度升至50uM。图93显示了生物反应器中随着时间的OD550谱。如本文所述测定生物反应器的废气中的异戊二烯水平。异戊二烯的滴定度随着发酵进程增加至终值为3.0g/L(图94)。在59小时发酵期间所产生的异戊二烯的总量为22.8g而产生的时间进程如图95所示。在发酵期间进入到产生异戊二烯所利用碳的摩尔产量为2.2％。来自葡萄糖的异戊二烯的质量百分产量为1.0％。
XII.表达来自甲羟戊酸途径的基因并在15-L规模下于补料分批培养中生长的大肠杆菌的异戊二烯发酵
将表达甲羟戊酸途径多肽、野葛异戊二烯合酶和野葛异戊二烯合酶的大肠杆菌的15-L规模发酵用于从补料-分批培养细胞产生异戊二烯。该实验显示在葡萄糖限制条件下生长的细胞导致3.3g/L异戊二烯的产生。
i)pCLPtrcUpperPathwayHGS2的构建
使用引物NsiI-RBS-HGSF(CTTGATGCATCCTGCATTCGCCCTTAGGAGG,SEQIDNO:88)和pTrcR(CCAGGCAAATTCTGTTTTATCAG,SEQIDNO:89)和作为模板的pTrcKKDyIkIS来PCR扩增编码来自野葛的异戊二烯合酶的基因。如此获得的PCR产物用NsiI和PstI进行限制性消化和凝胶纯化。根据制造商的指导，质粒pCLPtrcUpperPathway用PstI限制性消化并使用rAPid碱性磷酸酶(Roche)去磷酸化。
这些DNA片段连接在一起且连接反应物转化到大肠杆菌Top10化学感受态细胞(Invitrogen)、在含壮观霉素(50μg/ml)的L琼脂板上铺板，并在37℃孵育过夜。使用QiagenSpinMini-prep试剂盒从6个克隆中制备质粒DNA。用限制性酶EcoRV和MluI消化质粒DNA来鉴定克隆，其中插入片段具有正确的方向(即，与pTrc启动子相同方向的基因)。
产生的正确质粒命名为pCLPtrcUpperPathwayHGS2。使用本文所述的顶空测定法测定该质粒并发现其在大肠杆菌Top10中产生异戊二烯，这样验证了该基因的功能。将质粒转化到含pTrcKKDyIkIS的BL21(LDE3)以产生菌株BL21/pCLPtrcUpperPathwayHGS2-pTrcKKDyIkIS。与BL21/pCLPtrcUpperMVA和pTrcKKDyIkIS菌株(实施例8,XI部分)相比，该菌株具有异戊二烯合酶的额外拷贝。与用于实施例8、XI部分使用的BL21/pCLPtrcUpperMVA和pTrcKKDyIkIS菌株相比，该菌株还具有提高的HMGS表达和HMGS活性。
ii)表达pCLPtrcUpperPathwayHGS2-pTrcKKDyIkIS并在15-L规模下于补料分批培养中生长的大肠杆菌的异戊二烯发酵
培养基配方(每升发酵培养基)：
使用以下每升发酵培养基的组份来制备培养基：K2HPO47.5g、MgSO4*7H2O2g、一水合柠檬酸2g、柠檬酸铁铵0.3g、酵母提取物0.5g和1000X改良的痕量金属溶液1ml。所有组分一起添加并溶解在diH2O中。对这一溶液高压灭菌。用氢氧化铵(30％)调节pH至7.0并定容至体积。灭菌以及调整pH后，添加葡萄糖10g、硫胺素*HCl0.1g以及抗生素。
1000X改良的痕量金属溶液：
使用以下组份来制备1000X改良的痕量金属溶液：柠檬酸*H2O40g、MnSO4*H2O30g、NaCl10g、FeSO4*7H2O1g、CoCl2*6H2O1g、ZnSO4*7H2O1g、CuSO4*5H2O100mg、H3BO3100mg、NaMoO4*2H2O100mg。以每次在DiH2O中溶解一种来溶解每一组分，用HCl/NaOH调节pH至3.0，然后定容至体积并用0.22微米过滤器过滤灭菌。
在15-L生物反应器中，用含有pCLPtrcUpperPathwayHGS2和pTrcKKDyIkIS质粒的BL21(DE3)大肠杆菌细胞进行发酵。进行这一实验来监控在期望的发酵pH7.0以及温度30℃下从葡萄糖形成的异戊二烯。将取自冷冻瓶的大肠杆菌菌株的接种物划线到LB液体培养基琼脂板(含有抗生素)上并在37℃过夜培养。将单菌落接种到胰蛋白胨-酵母提取物培养基中。当接种物生长至在550nm处测量的OD为1.0后，使用500ml接种5-L生物反应器。
以指数速率供给葡萄糖直到细胞达到稳定期。这一时间后，葡萄糖加料减少以满足代谢要求。在58小时发酵期间，送至生物反应器的葡萄糖总量为2.1kg。通过添加IPTG完成诱导。当在550nm的光密度(OD550)达到数值9时，IPTG浓度达到25uM。当OD550达到170时，IPTG浓度升至50uM。图104显示了生物反应器中随着时间的OD550谱。如本文所述测定生物反应器的废气中的异戊二烯水平。异戊二烯的滴定度随着发酵进程增加至终值为3.3g/L(图104)。在58小时发酵期间所产生的异戊二烯的总量为24.5g而产生的时间进程如图106所示。在发酵期间进入到产生异戊二烯所利用碳的摩尔产量为2.5％。来自葡萄糖的异戊二烯的质量百分产量为1.2％。分析表明，与表达CLPtrcUpperMVA和pTrcKKDyIkIS质粒的BL21(数据未显示)相比，异戊二烯合酶的活性提高了约3-4倍。
XIII.大肠杆菌中下游甲羟戊酸途径的染色体整合
将含甲羟戊酸激酶、甲羟戊酸磷酸激酶、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶和IPP异构酶的合成操纵子整合到大肠杆菌染色体中。如需要，可通过整合不同操纵子5’的启动子改变表达。
表9列出用于本实验的引物
表9.引物
i)靶载体的构建
选择attTn7位点用于整合。通过PCR从M1655细胞扩增同源上游区(attTn7up)(引物MCM78和MCM79)和同源下游区(attTn7down)(引物MCM88和MCM89)。含有1μL10μM引物、3μLddH2O,45μLInvitrogenPlatinumPCRSupermixHighFidelity和刮取的MG1655菌落的50μL反应物在94℃变性2分钟，循环25次(94℃2分钟，50℃30秒和68℃1分钟)，在72℃延伸7分钟并且冷却至4℃。所得的这种DNA根据制造商的使用说明克隆到pCR2.1(Invitrogen)中，产生质粒MCM278(attTn7up)和MCM252(attTn7down)。从MCM252消化下来并凝胶纯化的832bpApaI-PvuI片段克隆到经ApaI-PvuI消化并凝胶纯化的质粒pR6K中,产生质粒MCM276。从MCM278消化下来并凝胶纯化的825bpPstI-NotI片段克隆到经PstI-NotI消化并凝胶纯化的MCM276中,产生质粒MCM281。
ii)下游途径和启动子的克隆
根据制造商的说明，使用RocheExpandLongPCR系统，用引物MCM104和MCM105从pTrcKKDyIkIS扩增MVK-PMK-MVD-IDI基因。该产物用NotI和ApaI消化并且克隆到已经用NotI和ApaI消化并凝胶纯化的MCM281中。使用StratagenePfuUltraII，用引物MCM120和MCM127从GeneBridgesFRT-gb2-Cm-FRT模板DNA扩增CMR盒。对于4个含有1uL约10ng/μL的模板，1μL每种引物，1.25μL10mMdNTP，5μL10x缓冲液，1μL酶和39.75μLddH2O的50uLPCR反应物使用如下PCR程序：在95℃变性4分钟；95℃20秒，55℃20秒，72℃2分钟，5个循环；95℃20秒，58℃20秒和72℃2分钟，25个循环；72℃10分钟并且冷却至4℃。将反应物汇集，在QiagenPCRcleanup柱上纯化并且用来电穿孔水洗涤过的含有质粒MCM296的Pir1细胞。电穿孔在2ml小室中以2.5V和200欧姆实施。电穿孔反应物在LB中于30℃恢复3小时。在含有CMP5、Kan50的LA上选择转化体MCM330(图107和108A-108C)。
iii)整合到大肠杆菌染色体中
从MCM330微量制备的DNA(QiaquickSpin试剂盒)用SnaBI消化并且用来电穿孔转化含有GeneBridges质粒pRedETCarb的BL21(DE3)(Novagen)或MG1655。将细胞在30℃培育至约OD1，随后用0.4％L-阿拉伯糖在37℃诱导1.5小时。这些细胞用4℃℃ddH2O洗涤3次，随后用2μLDNA电穿孔转化。整合体在含有氯霉素(5μg/ml)的L琼脂上选择并且随后证实在L琼脂+卡那霉素(50μg/ml)上不生长。冷冻BL21整合体MCM331和MG1655整合体MCM333。
iv)编码野葛异戊二烯合酶的pET24D-野葛的构建
将野葛异戊二烯合酶基因从pCR2.1载体(Invitrogen)亚克隆到pET24d载体(Novagen)中。具体地，使用引物MCM505’-GATCATGCATTCGCCCTTAGGAGGTAAAAAAACATGTGTGCGACCTCTTCTCAATTTACT(SEQIDNO:99)和MCM535’-CGGTCGACGGATCCCTGCAGTTAGACATACATCAGCTG(SEQIDNO:100)从pTrcKudzu模板DNA扩增野葛异戊二烯合酶基因。使用TaqDNA聚合酶(Invitrogen)实施PCR反应，并且将所得的PCR产物克隆到pCR2.1-TOPOTA克隆载体(Invitrogen)中，并转化到大肠杆菌Top10化学感受态细胞(Invitrogen)中。转化体接种于含有羧苄西林(50μg/ml)的LB琼脂上并在37℃孵育过夜。含有50μg/ml羧苄西林的5mlLB培养物用单一转化体接种并在37℃培育过夜。通过对质粒DNA测序对5个菌落筛选正确的插入序列，其中所述的质粒DNA从1ml液体培养物(LuriaBroth)分离和使用QIAprep离心微量制备试剂盒(Qiagen)纯化。命名为MCM93的所得质粒含有在pCR2.1骨架中的野葛异戊二烯合酶编码序列。
野葛编码序列通过采用PciI和BamH1(Roche)的限制性核酸内切酶消化移出并使用QIA快速凝胶提取试剂盒(Qiagen)进行凝胶纯化。pET24d载体DNA用NcoI和BamHI(Roche)消化，用虾碱性磷酸酶处理(Roche)并使用QIAprep离心微量制备试剂盒(Qiagen)纯化。使用快速DNA连接试剂盒(Roche)，将野葛异戊二烯合酶片段以20μl总体积中的5:1片段对载体比与NcoI/BamH1消化的pET24d连接。将连接混合物的部分(5μl)转化到大肠杆菌Top10化学感受态细胞中并接种于含有卡那霉素(50μg/ml)的L琼脂上。通过测序证实正确的转化体并将其转化到化学感受态BL21(λDE3)pLysS细胞(Novagen)中。在37℃于含有卡那霉素(50μg/ml)的L琼脂上过夜生长后，选择单菌落。在图109中显示命名为pET24D-Kudzu的所得质粒的图。在图110A和110B中显示pET24D-Kudzu的序列(SEQIDNO:101)。使用顶空测定法证实异戊二烯合酶活性。
v)生产菌株
用质粒pCLPtrcupperpathway和pTrcKudzu或pETKudzu共转化菌株MCM331和MCM333，产生表10中所示的菌株。
表10.生产菌株
vi)表达来自甲羟戊酸途径的基因并在15-L规模下于补料分批培养中生长的大肠杆菌的异戊二烯发酵
培养基配方(每升发酵培养基)：
使用以下每升发酵培养基的组份来制备培养基：K2HPO47.5g、MgSO4*7H2O2g、一水合柠檬酸2g、柠檬酸铁铵0.3g、酵母提取物0.5g和1000X改良的痕量金属溶液1ml。所有组分一起添加并溶解在diH2O中。对这一溶液高压灭菌。用氢氧化铵(30％)调节pH至7.0并定容至体积。灭菌以及调整pH后，添加葡萄糖10g、硫胺素*HCl0.1g以及抗生素。
1000X改良的痕量金属溶液：
使用以下组份来制备1000X改良的痕量金属溶液：柠檬酸*H2O40g、MnSO4*H2O30g、NaCl10g、FeSO4*7H2O1g、CoCl2*6H2O1g、ZnSO4*7H2O1g、CuSO4*5H2O100mg、H3BO3100mg、NaMoO4*2H2O100mg。以每次在DiH2O中溶解一种来溶解每一组分，用HCl/NaOH调节pH至3.0，然后定容至体积并用0.22微米过滤器过滤灭菌。
在15-L生物反应器中，用含有上文所述gi1.2整合下游MVA途径，以及pCLPtrcUpperPathway和pTrcKudzu质粒的BL21(DE3)大肠杆菌细胞进行发酵。进行这一实验来监控在期望的发酵pH7.0以及温度30℃下从葡萄糖形成的异戊二烯。将取自冷冻瓶的大肠杆菌菌株的接种物划线到LB液体培养基琼脂板(含有抗生素)上并在37℃过夜培养。将单菌落接种到胰蛋白胨-酵母提取物培养基中。当接种物生长至在550nm处测量的OD为1.0后，使用500ml接种5-L生物反应器。
以指数速率供给葡萄糖直到细胞达到稳定期。这一时间后，葡萄糖加料减少以满足代谢要求。在57小时发酵期间，送至生物反应器的葡萄糖总量为3.9kg。通过添加IPTG完成诱导。当二氧化碳溢出率达到10mmol/L/hr时，IPTG浓度达到100uM。图111A显示了生物反应器中随着时间的OD550谱。如本文所述测定生物反应器的废气中的异戊二烯水平。异戊二烯的滴定度随着发酵进程增加至终值为1.6g/L(图111B)。图111C显示在发酵过程中异戊二烯的比活性且峰值为1.2mg/OD/hr。在57小时发酵期间所产生的异戊二烯的总量为16.2g。在发酵期间进入到产生异戊二烯所利用碳的摩尔产量为0.9％。来自葡萄糖的异戊二烯的质量百分产量为0.4％。
XIV.用丙三醇作为碳源的包含野葛异戊二烯合酶的大肠杆菌的异戊二烯产生
将表达野葛异戊二烯合酶的大肠杆菌的15-L规模发酵用于从补料-分批培养细胞补料丙三醇产生异戊二烯。该实验显示在存在丙三醇(无葡萄糖)下生长的细胞导致2.2mg/L异戊二烯的产生。
培养基配方(每升发酵培养基)：
使用以下每升发酵培养基的组份来制备培养基：K2HPO47.5g、MgSO4*7H2O2g、一水合柠檬酸2g、柠檬酸铁铵0.3g和1000X改良的痕量金属溶液1ml。所有组分一起添加并溶解在diH2O中。对这一溶液高压灭菌。用氢氧化铵(30％)调节pH至7.0并定容至体积。灭菌以及调整pH后，添加丙三醇5.1g、硫胺素*HCl0.1g以及抗生素。
1000X改良的痕量金属溶液：
使用以下每升发酵培养基的组份来制备培养基：柠檬酸*H2O40g、MnSO4*H2O30g、NaCl10g、FeSO4*7H2O1g、CoCl2*6H2O1g、ZnSO4*7H2O1g、CuSO4*5H2O100mg、H3BO3100mg、NaMoO4*2H2O100mg。以每次在DiH2O中溶解一种来溶解每一组分，用HCl/NaOH调节pH至3.0，然后定容至体积并用0.22微米过滤器过滤灭菌。
在15-L生物反应器中，用含有pTrcKudz质粒的BL21(DE3)大肠杆菌细胞进行发酵。进行这一实验来监控在期望的发酵pH7.0以及温度35℃下从丙三醇形成的异戊二烯。将取自冷冻瓶的大肠杆菌菌株的接种物划线到LA液体培养基琼脂板(含有抗生素)上并在35℃过夜培养。将单菌落接种到大豆胨-酵母提取物-葡萄糖培养基中。当接种物生长至在550nm处测量的OD为1.0后，使用600ml接种7.5-L生物反应器。
以指数速率供给丙三醇直到细胞在550nm(OD550)的光密度达到153。在36小时发酵期间，送至生物反应器的丙三醇总量为1.7kg。除了接种物中的葡萄糖，不添加葡萄糖到反应器。通过添加IPTG完成诱导。当OD550达到值50时，IPTG浓度达到20uM。图57显示了生物反应器中随着时间的OD550谱。如本文所述测定生物反应器的废气中的异戊二烯水平。异戊二烯的滴定度随着发酵进程增加至终值为2.2mg/L(图58)。在54小时发酵期间所产生的异戊二烯的总量为20.9mg而产生的时间进程如图59所示。
XV.使用转化糖为碳源的表达来自甲羟戊酸途径的基因并在15-L规模下于补料分批培养中生长的大肠杆菌的异戊二烯发酵
将表达甲羟戊酸途径多肽和野葛异戊二烯合酶的大肠杆菌的15-L规模发酵用于从补料-分批培养中供给转化糖的细胞产生异戊二烯。该实验显示在存在转化糖条件下生长的细胞导致2.4g/L异戊二烯的产生。
培养基配方(每升发酵培养基)：
使用以下每升发酵培养基的组份来制备培养基：K2HPO47.5g、MgSO4*7H2O2g、一水合柠檬酸2g、柠檬酸铁铵0.3g、酵母提取物0.5g和1000X改良的痕量金属溶液1ml。所有组分一起添加并溶解在diH2O中。对这一溶液高压灭菌。用氢氧化铵(30％)调节pH至7.0并定容至体积。灭菌以及调整pH后，添加转化糖10g、硫胺素*HCl0.1g以及抗生素。
1000X改良的痕量金属溶液：
使用以下组份来制备1000X改良的痕量金属溶液：柠檬酸*H2O40g、MnSO4*H2O30g、NaCl10g、FeSO4*7H2O1g、CoCl2*6H2O1g、ZnSO4*7H2O1g、CuSO4*5H2O100mg、H3BO3100mg、NaMoO4*2H2O100mg。以每次在DiH2O中溶解一种来溶解每一组分，用HCl/NaOH调节pH至3.0，然后定容至体积并用0.22微米过滤器过滤灭菌。
在15-L生物反应器中，用含有pCLPtrcUpperPathway和pTrcKKDyIkIS质粒的BL21(DE3)大肠杆菌细胞进行发酵。进行这一实验来监控在期望的发酵pH7.0以及温度30℃下从转化糖形成的异戊二烯。将取自冷冻瓶的大肠杆菌菌株的接种物划线到LB液体培养基琼脂板(含有抗生素)上并在37℃过夜培养。将单菌落接种到胰蛋白胨-酵母提取物培养基中。当接种物生长至在550nm处测量的OD为1.0后，使用500ml接种5-L生物反应器。
以指数速率供给转化糖直到细胞达到稳定期。这一时间后，转化糖加料减少以满足代谢要求。在44小时发酵期间，送至生物反应器的转化糖总量为2.4kg。通过添加IPTG完成诱导。当在550nm的光密度(OD550)达到数值9时，IPTG浓度达到25uM。当OD550达到200时，IPTG浓度升至50uM。图96显示了生物反应器中随着时间的OD550谱。如本文所述测定生物反应器的废气中的异戊二烯水平。异戊二烯的滴定度随着发酵进程增加至终值为2.4g/L(图97)。在44小时发酵期间所产生的异戊二烯的总量为18.4g而产生的时间进程如图98所示。在发酵期间进入到产生异戊二烯所利用碳的摩尔产量为1.7％。来自葡萄糖的异戊二烯的质量百分产量为0.8％。
实施例9、用于整合到枯草杆菌中的上和下游MVA途径的构建
I.在枯草杆菌中上游MVA途径的构建
来自粪肠球菌的上游途径整合到枯草杆菌中处于aprE启动子控制下。上游途径由两种基因组成：编码AACT和HMGR的mvaE，以及编码HMGS的mvaS。这两种基因融合在一起，其间有终止密码子，RBS在mvaS前，并且在aprE启动子控制下。终止子位于mvaE基因后。在mvaE基因后克隆氯霉素抗性标记并且使用同源性侧翼区进行双交换而在aprE基因座处整合该构建体。
通过PCR扩增四个DNA片段以便它们含有使得它们通过PCR反应融合在一起的突出端序列。使用Herculase聚合酶按照生产商说明书进行PCR扩增。
1：PaprE
CF07-134(+)aprE启动子PstI的起点
5’-GACATCTGCAGCTCCATTTTCTTCTGC(SEQIDNO：82)
CF07-94(-)PaprE与mvaE融合
5’-CAATAATAACTACTGTTTTCACTCTTTACCCTCTCCTTTTAA(SEQIDNO：83)
模板：枯草杆菌染色体DNA
2.mvaE
CF07-93(+)mvaE与aprE启动子融合(GTG起始密码子)
5’-TTAAAAGGAGAGGGTAAAGAGTGAAAACAGTAGTTATTATTG(SEQIDNO：84)
CF07-62(-)mvaE与mvaS融合，其间有RBS
5’-TTTATCAATCCCAATTGTCATGTTTTTTTACCTCCTTTATTGTTTTCTTAAATC(SEQIDNO：35)
模板：粪肠杆菌染色体DNA(来自ATCC)
3.mvaS
CF07-61(+)mvaE与mvaS融合，其间有RBS
5’-GATTTAAGAAAACAATAAAGGAGGTAAAAAAACATGACAATTGGGATTGATAAA(SEQIDNO：36)
CF07-124(-)mvaS末端与终止子融合
5’-CGGGGCCAAGGCCGGTTTTTTTTAGTTTCGATAAGAACGAACGGT(SEQIDNO：85)
模板：粪肠杆菌染色体DNA
4.解淀粉芽孢杆菌碱性丝氨酸蛋白酶终止子
CF07-123(+)mvaS末端与终止子融合
5’-ACCGTTCGTTCTTATCGAAACTAAAAAAAACCGGCCTTGGCCCCG(SEQIDNO：86)
CF07-46(-)解淀粉芽孢杆菌终止子BamHI末端
5’-GACATGACGGATCCGATTACGAATGCCGTCTC(SEQIDNO：63)
模板：解淀粉芽孢杆菌染色体DNA
PCR融合反应
5.mvaE与mvaS融合
CF07-93(+)mvaE与aprE启动子融合(GTG起始密码子)
5’-TTAAAAGGAGAGGGTAAAGAGTGAAAACAGTAGTTATTATTG(SEQIDNO：84)
CF07-124(-)mvaS末端与终止子融合
5’-CGGGGCCAAGGCCGGTTTTTTTTAGTTTCGATAAGAACGAACGGT(SEQIDNO：85)
模板：上述#2和3
6.mvaE-mvaS与aprE启动子融合
CF07-134(+)aprE启动子PstI的起点
5’-GACATCTGCAGCTCCATTTTCTTCTGC(SEQIDNO：82)
CF07-124(-)mvaS的末端与终止子融合
5’-CGGGGCCAAGGCCGGTTTTTTTTAGTTTCGATAAGAACGAACGGT(SEQIDNO：85)
模板：上述#1和#4
7.PaprE-mvaE-mvaS与终止子融合
CF07-134(+)aprE启动子PstI的起点
5’-GACATCTGCAGCTCCATTTTCTTCTGC(SEQIDNO：82)
CF07-46(-)解淀粉芽孢杆菌终止子BamHI的末端
5’-GACATGACGGATCCGATTACGAATGCCGTCTC(SEQIDNO：63)
模板：#4和#6
产物用限制性内切核酸酶PstI/BamHI消化并连接到用PstI/BamHI消化的pJM102(Perego，M.1993.IntegrationalvectorsforgeneticmanipulationinBacillussubtilis，p.615-624.A.L.Sonenshein，J.A.Hoch，以及R.Losick(编)，Bacillussubtilisandothergram-positivebacteria：biochemistry，physiology，andmoleculargenetics.AmericanSocietyforMicrobiology，Washington，D.C.)。连接物转化到大肠杆菌TOP10化学感受态细胞并且在含有羧苄青霉素(50μg/ml)的LA上筛选转化体。通过测序鉴定正确质粒并命名为pJMUpperpathway2(图50和51)。纯化后的质粒DNA转化到枯草杆菌aprEnprEPxyl-comK并且在含有氯霉素(50μg/ml)的L琼脂上筛选转化体。选择正确菌落并且在含有氯霉素10、15和25μg/ml的L琼脂顺序平板接种以扩增含有上游途径的表达盒的拷贝数。
通过在含有1％葡萄糖的LB中生长来检测得到的菌株的甲羟戊酸产生。通过GC分析培养物的甲羟戊酸产生。
顺序使用这一菌株作为宿主用于下游甲羟戊酸途径的整合。
使用下面的引物来测序上面的多个构建体。
测序引物：
CF07-134(-)aprE启动子PstI的起点
5’-GACATCTGCAGCTCCATTTTCTTCTGC(SEQIDNO：82)
CF07-58(-)mvaE基因的起点
5’-ATGAAAACAGTAGTTATTATTGATGC(SEQIDNO：38)
CF07-59(-)mvaE基因的末端
5’-ATGTTATTGTTTTCTTAAATCATTTAAAATAGC(SEQIDNO：39)
CF07-82(-)mvaS基因的起点
5’-ATGACAATTGGGATTGATAAAATTAG(SEQIDNO：40)
CF07-83(-)mvaS基因的末端
5’-TTAGTTTCGATAAGAACGAACGGT(SEQIDNO：41)
CF07-86(-)mvaE中的序列
5’-GAAATAGCCCCATTAGAAGTATC(SEQIDNO：42)
CF07-87(-)mvaE中的序列
5’-TTGCCAATCATATGATTGAAAATC(SEQIDNO：43)
CF07-88(-)mvaE中的序列
5’-GCTATGCTTCATTAGATCCTTATCG(SEQIDNO：44)
CF07-89(-)序列mvaS
5’-GAAACCTACATCCAATCTTTTGCCC(SEQIDNO：45)
在含有浓度为5μg/ml的氯霉素的LA上筛选转化体。通过测序确认一个菌落具有正确的整合，并将该菌落在若干天内平板接种在含有增加浓度至最终水平为25μg/ml的氯霉素的LA上。这导致含有目的基因的表达盒的扩增。得到的菌株命名为CF455:pJMupperpathway#lXBacillussubtilisaprEnprEPxylcomK(扩增以在含有氯霉素25μg/ml的LA上生长)。
II.下游MVA途径在枯草杆菌中的构建
由基因mvkl、pmk、mpd和idi组成的下游MVA途径组合在表达盒中，该表达盒由来自枯草杆菌染色体的nprE区域的侧翼DNA区域(整合位点)、aprE启动子、以及壮观霉素抗性标记组成(参见图28和29)。通过DNA2.0合成这一表达盒并将它整合到含有在aprE基因座处整合上游MVA途径的枯草杆菌的染色体中。从实施例4所述的复制质粒表达野葛异戊二烯合酶基因并将它转化到整合有上和下游途径的菌株中。
实施例10：示例性异戊二烯组合物及其制备方法
I.含异戊二烯的发酵废气的组合物分析
用含两种质粒(pCLupperMev；pTrcKKDyIkIS，该质粒编码用于类异戊二烯前体生物合成的全甲羟戊酸途径、来自酵母的异戊烯基焦磷酸异构酶和来自野葛的异戊二烯合酶)的重组大肠杆菌BL21(DE3)菌株实施14L规模的发酵。在顶峰异戊二烯生产力(发酵进行了27.9小时,“EFT”)时左右，将来自14L罐的发酵废气收集到20mL顶空瓶并用顶空GC/MS针对挥发性组份分析。
使用配有AgilentHP-5MSGC/MS柱(30mx250μm；0.25μm膜厚度)的Agilent6890GC/MS系统进行顶空分析。使用CombiPAL自动进样器从20mL顶空瓶中采样500μL等分试样。GC/MS方法利用1ml/分钟流速的氦气作为载气。进样口维持在250℃，伴以50:1的分流比。烘箱温度在37℃维持开始的2分钟，随后在整个方法时间10分钟内以25℃/分钟的速度升至237℃。Agilent5793N质量选择检测仪从m/z29至m/z300扫描。该系统的检测限约为0.1μg/L气体或约0.1ppm。如需要，可使用具有更低检测限的更灵敏设备。
废气包含99.925％(v/v)的永久气体(N2,CO2和O2)，约0.075％的异戊二烯(2-甲基-1,3-丁二烯)(～750ppmv,2100μg/L)和少量(<50ppmv)乙醇、丙酮和两种C5异戊烯醇。未确定水蒸气的量，但估计相当于0℃时平衡蒸汽压力。通过GC/MS色谱图(图86A和86B)中峰值下区域的积分(integration)确定挥发性有机级份的组成且在表6中列出。使用标准方法，用于乙醇和丙酮标准物的校正曲线能进行GC面积到以μg/L为单位的气相浓度的转化。
表6.发酵废气中挥发性有机组份的组合物。使用大肠杆菌BL21(DE3)菌株在发酵的27.9小时时间点分析废气，该菌株表达异源甲羟戊酸途径、来自酵母的异戊烯基焦磷酸异构酶和来自野葛的异戊二烯合酶。
II.重组大肠杆菌菌株发酵期间与异戊二烯共同产生的痕量挥发性有机化合物(VOC)的测量
用含两种质粒(pCLupperMev；pTrcKKDyIkIS)的重组大肠杆菌BL21(DE3)菌株实施14L规模的发酵，该质粒编码用于类异戊二烯前体生物合成的全甲羟戊酸途径、来自酵母的异戊烯基焦磷酸异构酶和来自野葛的异戊二烯合酶。
将发酵废气穿过冷却的顶空瓶来浓缩并鉴定痕量挥发性有机组份。通过用玻璃棉(2g)包裹的20mL顶空瓶以1L/分钟的速度采样来自该发酵的废气10分钟并用干冰冷却到-78℃。用新瓶盖重新封盖该瓶并针对收集到的VOC使用实施例10、部分I中所述的条件用顶空GC/MS分析。图87A-87D观察到的化合物比例是发酵废气、在-78℃的相对蒸汽压力和质谱仪的探测器反应的整体水平的组合。例如，相对于已氧化挥发物(如丙酮和乙醇)的异戊二烯低水平是该材料的高挥发性的函数，以致它不在-78℃的顶空瓶积累。
衍生自生物来源的异戊二烯组合物普遍具有这些化合物中的许多化合物。图87A-87D中显示了该结果并总结在表7A和7B。
表7A:由大肠杆菌BL21(DE3)(pCLupperMev；pTrcKKDyIkIS)产生的废气在-78℃下低温捕获后出现的痕量挥发物。
1GC面积为相对于列出的化合物在峰值下未校正的面积。
2面积％为相对于所有化合物的总峰值面积表达为％的峰值面积。
3比例％为相对于2-甲基-1,3-丁二烯的峰值面积表达为％的峰值面积。
表7B:由大肠杆菌BL21(DE3)(pCLupperMev；pTrcKKDyIkIS)产生的废气在-196℃下低温捕获后出现的痕量挥发物
1GC面积为相对于列出的化合物在峰值下未校正的面积。
2面积％为相对于所有化合物的总峰值面积表达为％的峰值面积。
3比例％为相对于2-甲基-1,3-丁二烯的峰值面积表达为％的峰值面积。
III.C5烃异构体在衍生自发酵的异戊二烯中不存在
使用在液氮中冷却的2mL顶空瓶实施发酵废气中出现的异戊二烯的低温捕获。首先使废气(1L/分钟)通过含氢氧化钠颗粒(pellet)的20mL瓶来最小化2mL瓶(-196℃)中的冰和固体CO2的积累。约10L废气通过该瓶，此后允许带排气地加热到-78℃，随后用新瓶盖再密封并用GC/MS分析。
用使用在顶空模式下的100μL气密注射器的Agilent6890GC/MS系统进行GC/MS顶空分析。用ZebronZB-624GC/MS柱(30mx250μm；1.40μm膜厚度)分离分析物。GC自动进样器配有气密的100μL注射器，并将针高调节到允许注射50μL来自2mLGC瓶的顶空样品。GC/MS方法利用流速1ml/分钟的氦气作为载气。进样口维持在200℃，伴以20:1的分流比。分析期间烘箱温度在37℃维持5分钟。以单离子监测(SIM)模式在m/z55、66、67和70上运行Agilent5793N质量选择检测仪。在这些条件下，观测到在2.966分钟异戊二烯洗脱(图88B)。还使用本方法分析石油衍生异戊二烯的标准(Sigma-Aldrich)，并发现其含有额外C5烃异构体，该异构体紧靠主峰值之前或之后洗脱并基于校正的GC面积量化(图88A)。
表8A：石油衍生异戊二烯的GC/MS分析
化合物 RT(分钟) GC面积 总C5烃的面积％
2-甲基-1-丁烯 2.689 18.2x 103 0.017％
(Z)-2-戊烯 2.835 10.6x 104 0.101％
异戊二烯 2.966 10.4x 107 99.869％
1,3-环戊二烯(CPD) 3.297 12.8x 103 0.012％
表8B：发酵衍生异戊二烯的GC/MS分析(总C5烃百分比)
在单独实验中，分析C5烃的标准混合物以确定探测器反应是否对各化合物相同。化合物为2-甲基-1-丁烯、2-甲基-1,3-丁二烯、(E)-2-戊烯、(Z)-2-戊烯和(E)-1,3-戊二烯.这种情况下，在AgilentDB-Petro柱(100mx0.25mm；0.5μm膜厚度)上在50℃维持15分钟实施分析。GC/MS方法利用流速1ml/分钟的氦气作为载气。进样口维持在200℃，伴以50:1的分流比。以全扫描模式从m/z19至m/z250运行Agilent5793N质量选择检测仪。在这些条件下，100μg/L浓度的每个标准物产生在试验误差内的同样探测器反应。
IV.包含吸附到固相上的异戊二烯的组合物
生物学上产生的异戊二烯被吸附到活性炭，产生含50到99.9％碳、0.1％到50％异戊二烯、0.01％到5％水和少量(<0.1％)其他挥发性有机组份的固相。
发酵废气流过维持在0℃的铜冷凝盘管，随后经过颗粒化二氧化硅干燥过滤器来去除水蒸气。然后除湿的废气穿过含碳的过滤器(KobyJr,KobyFilters,MA)流到由GC/MS在过滤器的排气中检测到异戊二烯穿过的点。通过计算收集期的废气浓度、整体流速和百分比穿过量间接确定吸附到柱体的异戊二烯的量。备选地，可从过滤器由热、真空或溶剂介导的脱附作用来回收被吸附的异戊二烯。
V.冷凝异戊二烯的收集和分析
对发酵废气除湿，并由通过合适的吸附剂(如烧碱石棉)的过滤除去CO2。产生的废气流随后流过液氮冷却的冷凝器以冷凝气流中的VOC。收集容器含有叔丁基邻苯二酚以抑制产生的异戊二烯冷凝。由GC/MS和NMR分析冷凝物以使用如本文所述那些标准方法确定纯度。
VI.通过发酵产生的异戊烯醇
来自表达野葛异戊二烯合酶的大肠杆菌BL21(DE3)的废气的分析显示存在异戊二烯和3-甲基-3-丁烯-1-醇(类异戊二烯)。如由顶空GC/MS确定的图89中显示了这两种化合物随发酵在发酵废气中水平。在该实验中，所含的类异戊二烯(3-甲基-3-丁烯-1-醇,3-MBA)的水平接近10μg/L废气。其他实验在发酵废气中产生的水平约20μg/L废气。
实施例11：表达来自甲羟戊酸途径的基因并在补料-分批培养中发酵的大肠杆菌中异戊二烯的生长与产生的去偶联
实施例11说明细胞生长与甲羟戊酸和异戊二烯产生的去偶联。
I.发酵条件
培养基配方(每升发酵培养基)：
使用以下每升发酵培养基的组份来制备培养基：K2HPO47.5g、MgSO4*7H2O2g、一水合柠檬酸2g、柠檬酸铁铵0.3g、酵母提取物0.5g和1000X改良的痕量金属溶液1ml。所有组分一起添加并溶解在diH2O中。对这一溶液高压灭菌。用氢氧化铵(30％)调节pH至7.0并定容至体积。灭菌以及调整pH后，添加葡萄糖10g、硫胺素*HCl0.1g以及抗生素。
1000X改良的痕量金属溶液：
使用以下组份来制备1000X改良的痕量金属溶液：柠檬酸*H2O40g、MnSO4*H2O30g、NaCl10g、FeSO4*7H2O1g、CoCl2*6H2O1g、ZnSO4*7H2O1g、CuSO4*5H2O100mg、H3BO3100mg、NaMoO4*2H2O100mg。以每次在DiH2O中溶解一种来溶解每一组分，用HCl/NaOH调节pH至3.0，然后定容至体积并用0.22微米过滤器过滤灭菌。
用含有pTrcHis2AUpperPathway(也称为pTrcUpperMVA,图91和92A-92C)(50g/ml羧苄青霉素)或pCLPtrcUpperMVA(也称为pCLPtrcUpperPathway(图26))(50g/ml壮观霉素)质粒的大肠杆菌细胞进行发酵。针对产生异戊二烯的实验，大肠杆菌细胞也含有pTrcKKDyIkIS(50g/ml卡那霉素)质粒。进行这些实验来监控在期望的发酵pH7.0以及温度30℃下从葡萄糖形成的甲羟戊酸或异戊二烯。将取自冷冻瓶的大肠杆菌菌株的接种物划线到LA液体培养基琼脂板(含有抗生素)上并在37℃过夜培养。将单菌落接种到胰蛋白胨-酵母提取物培养基中。当接种物生长至在550nm处测量的光密度为1.0后，其被用于接种生物反应器。
以指数速率供给葡萄糖直到细胞达到稳定期。这一时间后，葡萄糖供给减少以满足代谢要求。通过添加IPTG完成诱导。应用高氯酸(Sigma-Aldrich#244252)处理过的样品(0.3M在4℃培育5分钟)到有机酸HPLC柱(BioRad#125-0140)来确定发酵液中甲羟戊酸的浓度。通过培养液甲羟戊酸峰值尺寸与产生自用高氯酸处理以形成D,L-甲羟戊酸的mevalonolacetone(Sigma-Aldrich#M4667)的校正曲线比较，确定浓度。如本文所述测定来自生物反应器的废气中的异戊二烯水平。异戊二烯的滴定度定义为每升发酵液产生的异戊二烯的量。
II.来自表达pTrcUpperMVA质粒的大肠杆菌BL21(DE3)细胞以150L规模的甲羟戊酸产生
将如上实施例11、部分I所解释的培育在平板上的BL21(DE3)细胞接种到含有45ml胰蛋白胨-酵母提取物培养基的摇瓶中并在30℃下以170转/分钟振荡培育5小时。将该溶液转到胰蛋白胨-酵母提取物培养基的5-L生物反应器中，且该细胞在30℃和27.5转/分钟下生长直到该培养物达到1.0的OD550。将5L接种物接种到含45kg培养基的150L生物反应器。当OD550达到值10时，IPTG浓度达到1.1mM。生物反应器内的OD550随时间的谱显示在图60A。经过发酵过程，甲羟戊酸的滴定度提高到最终值61.3g/L(图60B)。整个发酵过程的比生产力的谱显示在图60C，且与图60A的比较说明生长和甲羟戊酸的产生的去偶联。在52.5小时发酵过程中从14.1kg所利用的葡萄糖中产生的甲羟戊酸总量为4.0kg。用于产生甲羟戊酸的所利用碳的摩尔产量为34.2％。
III.来自表达pTrcUpperMVA质粒的大肠杆菌BL21(DE3)细胞以15L规模的甲羟戊酸产生
将如上实施例11、部分I所解释的培育在平板上的BL21(DE3)细胞接种到含有500ml胰蛋白胨-酵母提取物培养基的摇瓶中并在30℃下以160转/分钟下生长到OD550为1.0。将该材料接种到含4.5kg培养基的15L生物反应器。当OD550达到值10时，IPTG浓度达到1.0mM。生物反应器内的OD550随时间的谱显示在图61A。经过发酵过程，甲羟戊酸的滴定度提高到最终值53.9g/L(图61B)。整个发酵过程的比生产力的谱显示在图61C，且与图61A的比较说明生长和甲羟戊酸的产生的去偶联。在46.6小时发酵过程中从2.1kg所利用的葡萄糖中产生的甲羟戊酸总量为491g。用于产生甲羟戊酸的所利用碳的摩尔产量为28.8％。
IV.来自表达pTrcUpperMVA质粒的大肠杆菌FM5细胞以15L规模的甲羟戊酸产生
将如上实施例11、部分I所解释的培育在平板上的FM5细胞接种到含有500ml胰蛋白胨-酵母提取物培养基的摇瓶中并在30℃下以160转/分钟下生长到OD550为1.0。将该材料接种到含4.5kg培养基的15L生物反应器。当OD550达到值30时，IPTG浓度达到1.0mM。生物反应器内的OD550随时间的谱显示在图62A。经过发酵过程，甲羟戊酸的滴定度提高到最终值23.7g/L(图62B)。整个发酵过程的比生产力的谱显示在图62C，且与图62A的比较说明生长和甲羟戊酸的产生的去偶联。在51.2小时发酵过程中从1.1kg所利用的葡萄糖中产生的甲羟戊酸总量为140g。用于产生甲羟戊酸的所利用碳的摩尔产量为15.2％。
V.来自表达PtrcUpperMVA和pTrcKKDyIkIS质粒的大肠杆菌BL21(DE3)细胞以15L规模的异戊二烯产生
将如上实施例11、部分I所解释的培育在平板上的表达PtrcUpperMVA和pTrcKKDyIkIS质粒的BL21(DE3)细胞接种到含有500ml胰蛋白胨-酵母提取物培养基的摇瓶中并在30℃下以160转/分钟下生长到OD550为1.0。将该材料接种到含4.5kg培养基的15L生物反应器。当OD550达到值10时，IPTG浓度达到25μM。当OD550达到190时，IPTG浓度升高到50μM。发酵38小时时，IPTG浓度升高到100μM。生物反应器内的OD550随时间的谱显示在图63A。异戊二烯的滴定度随着发酵进程增加至终值为2.2g/L培养液(图63B)。整个发酵过程的比生产力的谱显示在图63C且与图63A的比较说明生长和异戊二烯的产生的去偶联。在54.4小时发酵过程中从2.3kg所利用的葡萄糖中产生的异戊二烯总量为15.9g。用于产生异戊二烯的所利用碳的摩尔产量为1.53％。
VI.来自表达PtrcUpperMVA和pTrcKKDyIkIS质粒的大肠杆菌BL21(DE3)tuner细胞以15L规模的异戊二烯产生
将如上实施例11、部分I所解释的培育在平板上的表达PtrcUpperMVA和pTrcKKDyIkIS质粒的BL21(DE3)tuner细胞接种到含有500ml胰蛋白胨-酵母提取物培养基的摇瓶中并在30℃下以160转/分钟下生长到OD550为1.0。将该材料接种到含4.5kg培养基的15L生物反应器。当OD550达到值10时，IPTG浓度达到26μM。当OD550达到175时，IPTG浓度升高到50μM。生物反应器内的OD550随时间的谱显示在图64A。异戊二烯的滴定度随着发酵进程增加至终值为1.32.2g/L培养液(图64B)。整个发酵过程的比生产力的谱显示在图64C，且与图64A的比较说明生长和异戊二烯的产生的去偶联。在48.6小时发酵过程中从1.6kg所利用的葡萄糖中产生的异戊二烯总量为9.9g。用于产生异戊二烯的所利用碳的摩尔产量为1.34％。
VII.来自表达PtrcUpperMVA和pTrcKKDyIkIS质粒的大肠杆菌MG1655细胞以15L规模的异戊二烯产生
将如上实施例11、部分I所解释的培育在平板上的表达PtrcUpperMVA和pTrcKKDyIkIS质粒的MG1655细胞接种到含有500ml胰蛋白胨-酵母提取物培养基的摇瓶中并在30℃下以160转/分钟下生长到OD550为1.0。将该材料接种到含4.5kg培养基的15L生物反应器。当OD550达到值45时，IPTG浓度达到24μM。生物反应器内的OD550随时间的谱显示在图65A。异戊二烯的滴定度随着发酵进程增加至终值为393m2.2g/L培养液(图65B)。整个发酵过程的比生产力的谱显示在图65C且与图65A的比较说明生长和异戊二烯的产生的去偶联。在67.4小时发酵过程中从520g所利用的葡萄糖中产生的异戊二烯总量为2.2g。用于产生异戊二烯的所利用碳的摩尔产量为0.92％。
VIII.来自表达PtrcUpperMVA和pTrcKKDyIkIS质粒的大肠杆菌MG1655ack-pta细胞以15L规模的异戊二烯产生
将如上实施例11、部分I所解释的培育在平板上的表达PtrcUpperMVA和pTrcKKDyIkIS质粒的MG1655ack-pta细胞接种到含有500ml胰蛋白胨-酵母提取物培养基的摇瓶中并在30℃下以160转/分钟下生长到OD5501.0。将该材料接种到含4.5kg培养基的15L生物反应器。当OD550达到值10时，IPTG浓度达到30μM。生物反应器内的OD550随时间的谱显示在图66A。异戊二烯的滴定度随着发酵进程增加至终值为368m2.2g/L培养液(图66B)。整个发酵过程的比生产力的谱显示在图66C，且与图66A的比较说明生长和异戊二烯的产生的去偶联。在56.7小时发酵过程中从531g所利用的葡萄糖中产生的异戊二烯总量为1.8g。用于产生异戊二烯的所利用碳的摩尔产量为0.73％。
IX.来自表达PtrcUpperMVA和pTrcKKDyIkIS质粒的大肠杆菌FM5细胞以15L规模的异戊二烯产生
将如上实施例11、部分I所解释的培育在平板上的表达pCLPtrcUpperMVA和pTrcKKDyIkIS质粒的FM5细胞接种到含有500ml胰蛋白胨-酵母提取物培养基的摇瓶中并在30℃下以160转/分钟下生长到OD550为1.0。将该材料接种到含4.5kg培养基的15L生物反应器。当OD550达到值15时，IPTG浓度达到27μM。生物反应器内的OD550随时间的谱显示在图67A。异戊二烯的滴定度随着发酵进程增加至终值为235m2.2g/L培养液(图67B)。整个发酵过程的比生产力的谱显示在图67C且与图67A的比较说明生长和异戊二烯的产生的去偶联。在52.3小时发酵过程中从948g所利用的葡萄糖中产生的异戊二烯总量为1.4g。用于产生异戊二烯的所利用碳的摩尔产量为0.32％。
实施例12：表达来自甲羟戊酸途径的基因并在补料-分批培养中发酵的大肠杆菌的指数生长阶段的异戊二烯产生
实施例12阐明细胞的指数生长阶段的异戊二烯产生。
培养基配方(每升发酵培养基)：
使用以下每升发酵培养基的组份来制备培养基：K2HPO47.5g、MgSO4*7H2O2g、一水合柠檬酸2g、柠檬酸铁铵0.3g、酵母提取物0.5g和1000X改良的痕量金属溶液1ml。所有组分一起添加并溶解在diH2O中。对这一溶液高压灭菌。用氢氧化铵(30％)调节pH至7.0并定容至体积。灭菌以及调整pH后，添加葡萄糖10g、硫胺素*HCl0.1g以及抗生素。
1000X改良的痕量金属溶液：
使用以下组份来制备1000X改良的痕量金属溶液：柠檬酸*H2O40g、MnSO4*H2O30g、NaCl10g、FeSO4*7H2O1g、CoCl2*6H2O1g、ZnSO4*7H2O1g、CuSO4*5H2O100mg、H3BO3100mg、NaMoO4*2H2O100mg。以每次在DiH2O中溶解一种来溶解每一组分，用HCl/NaOH调节pH至3.0，然后定容至体积并用0.22微米过滤器过滤灭菌。
在15-L生物反应器中，用含有pCLPtrcUpperMVA和pTrcKKDyIkIS质粒的ATCC11303大肠杆菌细胞进行发酵。进行这一实验来监控在期望的发酵pH7.0以及温度30℃下从葡萄糖形成的异戊二烯。将取自冷冻瓶的大肠杆菌菌株的接种物划线到LB液体培养基琼脂板(含有抗生素)上并在37℃过夜培养。将单菌落接种到胰蛋白胨-酵母提取物培养基中。当接种物生长至在550nm处测量的OD为1.0后，使用500ml接种5-L生物反应器。
以指数速率供给葡萄糖直到细胞达到稳定期。这一时间后，葡萄糖加料减少以满足代谢要求。在50小时发酵期间，送至生物反应器的葡萄糖总量为2.0kg。通过添加IPTG完成诱导。当在550nm的光密度(OD550)达到数值10时，IPTG浓度达到25μM。当OD550达到190时，IPTG浓度升至50μM。图99显示了生物反应器中随着时间的OD550谱。如本文所述测定生物反应器的废气中的异戊二烯水平。异戊二烯的滴定度随着发酵进程增加至终值为1.4g/L(图100)。在50小时发酵期间所产生的异戊二烯的总量为10.0g。生物反应器内随时间的异戊二烯比生产力谱显示在图101。有助于在发酵期间产生异戊二烯的所利用碳的摩尔产量为1.1％。从葡萄糖的异戊二烯重量百分比生产力为0.5％。
实施例13：异戊二烯的可燃性建模和测试
I.异戊二烯的可燃性建模和测试的综述
对多种烃/氧/氮/水/二氧化碳混合物实施可燃性建模和实验。该模型和实验测试目标是定义在固定压力和温度下在特定蒸汽和一氧化碳浓度下，异戊二烯和氧/氮可燃性曲线。表4显示了模型条件矩阵，且表5显示了实施的实验矩阵。
表4.模型的异戊二烯可燃性总结
表5.异戊二烯可燃性测试总结
II.计算绝热火焰温度(CAFT)模型的说明
使用计算绝热火焰温度(CAFT)和用于燃烧扩散的所选极限火焰温度来确定异戊二烯可燃性范围。用于本研究计算火焰温度的计算机程序是NASAGlennResearchCenterCEA(ChemicalEquilibriumwithApplications)软件。
使用用于均匀燃烧机制(其中燃料和氧化剂都为气相)的绝热火焰温度模型确定可燃性范围涉及五个步骤：选择合适的反应物、选择测试条件、选择极限火焰温度、修改反应物和通过计算建立可燃范围。
第一步中，选择合适的反应物，必须决定在系统中存在的反应物种类和每种物质的量。在许多情况下，用于计算的计算机程序具有反应物和产物种类列表。如果在程序中没有发现待研究物质的任意数据，可通过其他资源如JANAF表或互联网获得它们。在本模型中，程序数据库中有水、氮、氧和一氧化碳的数据。程序数据库中没有作为物质的异戊二烯；因此手工输入热力属性。
下一步是确定燃烧过程发生的初始压力和温度条件。在此模型中，压力为1个大气压(绝对)且温度为40℃，异戊二烯的沸点。
燃烧的极限火焰温度可基于理论选择或实验确定。每种方法都有其限制。
基于以前的研究，烃的极限火焰温度落在1000K至1500K的范围内。对本模型，选择值1500K。这是一氧化碳到二氧化碳的反应(高度放热的反应并占很大比例的火焰能量)达到自我维持的温度。
一旦极限火焰温度被确定，在给定反应物混和物(物质浓度)上实施模型计算并确定绝热火焰温度。认为火焰扩散只在温度大于极限火焰温度下出现。随后修改反应物混合物组成来制定扩散和非扩散混合物数据表。
此类模型与实验确定的可燃性极限显示好的一致性。所得的范围以外的区域为不可燃区，其内为可燃区。范围的形状形似刀尖(nose)。该范围的刀尖与气相燃料的限制性氧浓度(LOC)有关。
III.计算绝热火焰温度(CAFT)模型的结果
图68至74绘制的是分别对系列A到G的CAFT模型结果。针对几种氧/氮比例(以重量计)图形将计算绝热火焰温度(使用NASACEA程序)绘制为燃料浓度(以重量计)的函数。曲线在所选极限火焰温度1500K以上的部分含有足以供火焰扩散的燃料水平。以表格来解释图68至74中出现的结果可能是困难的。此外，本表格不利于与通常以体积百分比表示的实验数据比较。
使用系列A作为实例，可将图68中的数据以传统可燃性范围的形式绘图。使用图68并穿过坐标上的1500K温度线读数，可通过为每条曲线(氧氮比)沿与1500K温度线交点向横坐标画出切线可确定本极限火焰温度的燃料浓度。随后可将这些值以针对给定氧化剂的重量百分比的燃料重量百分比绘制成表格(图75A)。随后知道燃料的组成(100wt％异戊二烯)和氧化剂的组成(水、氧和氮的相对含量)，可确定摩尔量。
从这些摩尔量，可计算百分比体积浓度。随后可绘制以体积百分比计的浓度，产生可燃性范围(图75B)。范围圈定的面积是可爆炸范围且不包括的面积为不可爆炸范围。范围的“刀尖”是限制性氧浓度。图75A和75B含针对用于系列B的产生自图69中出现的数据的可燃性范围的计算容积浓度。可对图70-74中出现的数据使用类似方法。
IV.可燃性测试实验设备和过程
在4升高压容器中实施可燃性测试。该容器为圆柱形，内径6”且内部高度8.625”。使用由PID控制器控制的外部加热器维持容器(和内部的气体)的温度。为避免热损失，围绕压力容器包裹陶瓷棉和反射式保温。使用K型热电偶测量气体空间的温度和容器本身的温度。图77显示测试容器。
在进行测试之前，将容器清空并用氮吹扫确保清除来自前面测试的任意气体。随后容器抽真空。此操作后压力通常约为0.05bar(绝对)。由于氮吹扫，造成此初始压力的气体被认为是氮。使用分压力，随后添加合适量的水、异戊二烯、氮和氧以实现所论测试条件。容器内的磁动混合风机确保气体成分的混合。在点火前约1分钟关闭风机，允许气体混合约2分钟。
点火器包括1.5欧姆镍铬线圈和定时器线路上的AC电压源。使用示波器，确定发送34.4VAC到点火器3.2秒。3.8安培的最大电流大致在点火周期的中间出现。这样，最大功率为131W且点火周期提供的总能量大致为210J。
使用连接到数据获取系统的可变磁阻ValidyneDP215压力变送器获得爆燃数据。如压力的升高大于或等于5％，认为气体混合物有爆燃。
V.可燃性测试的结果
在40℃和0psig无蒸汽下实施第一个实验系列(系列1)。在改变异戊二烯和氧浓度下实施测试，产生图78A所示的可燃性曲线。该曲线中所示的数据点仅是那些与曲线靠近的数据。从此系列中取得的所有数据点的详细列表显示在图80A和80B。
图78B总结了图78A中所示的爆炸性数据点。图78C是实验数据与CAFT模型预测的可燃性范围的比较。模型与实验数据非常一致。差异可能是由于测试室的天然非绝热和模型的限制。模型采用用于氧化反应的无限时间轴且不考虑任意反应动力限制。
此外，模型受数据库中平衡状态的化学物质的数量限制并因而可能不能恰当地预测热解物质。还有，模型建立的可燃性范围使用一个限制火焰温度值(1500K)。此限制火焰温度值可以是根据反应化学物质的从1000K到1500K的值的范围。在化学计算的燃料/氧化剂水平之上的燃料浓度下形成的热解化学物质的复杂本质是模型可能不能准确预测此系统的自燃的上限的一个原因。
在40℃和0psig、4％的固定蒸汽浓度下实施第二个实验系列(系列2)。在改变异戊二烯和氧浓度下实施测试产生图79A所示的可燃性曲线。该曲线中所示的数据点仅是那些与曲线靠近的数据。从此系列中取得的所有数据点的详细列表显示在图81。由于在系列1中数据间的相似性，只测试了自燃的下限、限制性氧浓度和自燃的上限的关键点。添加4％的蒸汽到测试混合物不显著改变可燃范围的关键极限。应明白，蒸汽/水和或其他惰性气体(inertant)的更高浓度可影响可燃范围。
图79B总结了土79A中所示的爆炸性数据点。图79C是实验数据与CAFT模型预测的可燃性范围的比较。模型与实验数据非常一致。差异可能是由于系列1中所述的相同因素。
V.在3个大气压下的空气中异戊二烯的自燃的极限计算
实施例13、部分I到IV中所述的方法还用于计算在3个大气压的绝对系统压力和40℃下的异戊二烯的自燃的极限。这些结果与在1个大气压的绝对系统压力和40℃下的实施例13、部分I到IV的那些比较。由于随起始压力的提高可燃范围扩展或变大，所以测试此较高的压力。自燃的上限最受影响，其次限制性氧组成。自燃的下限受影响最小(见，例如“Bulletin627–FlammabilityCharacteristicsofCombustibleGasesandVapors”，由MichaelG.Zabetakis编著，且由前者USBureauof分钟es出版(1965)，在此完整引入作为参考，尤其关于自燃的极限的计算)。
图82中，将计算绝热火焰温度绘制为异戊二烯(燃料)浓度的函数，以总燃料/氮/氧的重量百分比表示，其中系统压力起始为3个大气压。计算火焰温度与在1个大气压系统中初始确定的那些非常相似(图83)。结果，当使用计算绝热可燃数据产生可燃范围时，曲线非常相似(见图84和85)。所以，基于这些理论计算，系统压力从1个大气压提高到3个大气压不会导致可燃范围的显著提高/扩展。如需要，可使用实验测试证实这些模型结果(如本文所述在1个大气压下的实验测试)。
VII.可燃性研究的总结
开发用于异戊二烯/氧/氮/水/一氧化碳系统在40℃和0psig的可燃性范围的计算绝热温度模型。开发出的CAFT模型与本工作中实施的测试产生的实验数据非常一致。系列1和2的实验结果证实了系列A和B的模型结果。
除非另有说明，否则在此使用的所有科技术语的含义是本发明所属领域的技术人员通常所理解的。Singleton等人，DictionaryofMicrobiologyandMolecularBiology，第二版，JohnWiley和Sons,NewYork(1994)，以及Hale&Marham,TheHarperCollinsDictionaryofBiology,HarperPerennial,N.Y.(1991)为熟练技术人员提供了在本发明中使用的许多术语的一般词典。应理解的是，本发明不限于所述的具体方法学、方案和试剂，因为它们可以改变。本领域熟练技术人员也将理解，也可以将与在此所述的任何方法和材料相似或等同的那些用于实施或测试本发明。
在此提供的标题不限于本发明多个方面或实施方式，可以通过参考作为整体的说明书来得到它们。
对于在此所使用，除非另有明确指示，否则术语“一个”或类似术语的使用指一个或多个。
在此所指的“约”某数值或参数包括(并且描述了)涉及该数值或参数本身的实施方式。例如，涉及“约X”的描述包括对“X”的描述。数字范围包括定义该范围的数字。
应理解的是，在此所述的本发明的方面和实施方式包括“包括”该方面和实施方式、“由该方面和实施方式组成”和“基本上由该方面和实施方式组成”。
附录1
示例性1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶核酸和多肽
ATH：AT3G21500(DXPS1)AT4G15560(CLA1)AT5G11380(DXPS3)
OSA：433876843400904342614
CME：CMF089C
PFA：MAL13P1.186
TAN：TA20470
TPV：TP01_0516
ECO：b0420(dxs)
ECJ：JW0410(dxs)
ECE：Z0523(dxs)
ECS：ECs0474
ECC：c0531(dxs)
ECI：UTI89_C0443(dxs)
ECP：ECP_0479
ECV：APECO1_1590(dxs)
ECW：EcE24377A_0451(dxs)
ECX：EcHS_A0491
STY：STY0461(dxs)
STT：t2441(dxs)
SPT：SPA2301(dxs)
SEC：SC0463(dxs)
STM：STM0422(dxs)
YPE：YPO3177(dxs)
YPK：y1008(dxs)
YPM：YP_0754(dxs)
YPA：YPA_2671
YPN：YPN_0911
YPP：YPDSF_2812
YPS：YPTB0939(dxs)
YPI：YpsIP31758_3112(dxs)
SFL：SF0357(dxs)
SFX：S0365(dxs)
SFV：SFV_0385(dxs)
SSN：SSON_0397(dxs)
SBO：SBO_0314(dxs)
SDY：SDY_0310(dxs)
ECA：ECA1131(dxs)
PLU：plu3887(dxs)
BUC：BU464(dxs)
BAS：BUsg448(dxs)
WBR：WGLp144(dxs)
SGL：SG0656
KPN：KPN_00372(dxs)
BFL：Bfl238(dxs)
BPN：BPEN_244(dxs)
HIN：HI1439(dxs)
HIT：NTHI1691(dxs)
HIP：CGSHiEE_04795
HIQ：CGSHiGG_01080
HDU：HD0441(dxs)
HSO：HS_0905(dxs)
PMU：PM0532(dxs)
MSU：MS1059(dxs)
APL：APL_0207(dxs)
XFA：XF2249
XFT：PD1293(dxs)
XCC：XCC2434(dxs)
XCB：XC_1678
XCV：XCV2764(dxs)
XAC：XAC2565(dxs)
XOO：XOO2017(dxs)
XOM：XOO_1900(XOO1900)
VCH：VC0889
VVU：VV1_0315
VVY：VV0868
VPA：VP0686
VFI：VF0711
PPR：PBPRA0805
PAE：PA4044(dxs)
PAU：PA14_11550(dxs)
PAP：PSPA7_1057(dxs)
PPU：PP_0527(dxs)
PST：PSPTO_0698(dxs)
PSB：Psyr_0604
PSP：PSPPH_0599(dxs)
PFL：PFL_5510(dxs)
PFO：Pfl_5007
PEN：PSEEN0600(dxs)
PMY：Pmen_3844
PAR：Psyc_0221(dxs)
PCR：Pcryo_0245
ACI：ACIAD3247(dxs)
SON：SO_1525(dxs)
SDN：Sden_2571
SFR：Sfri_2790
SAZ：Sama_2436
SBL：Sbal_1357
SLO：Shew_2771
SHE：Shewmr4_2731
SHM：Shewmr7_2804
SHN：Shewana3_2901
SHW：Sputw3181_2831
ILO：IL2138(dxs)
CPS：CPS_1088(dxs)
PHA：PSHAa2366(dxs)
PAT：Patl_1319
SDE：Sde_3381
PIN：Ping_2240
MAQ：Maqu_2438
MCA：MCA0817(dxs)
FTU：FTT1018c(dxs)
FTF：FTF1018c(dxs)
FTW：FTW_0925(dxs)
FTL：FTL_1072
FTH：FTH_1047(dxs)
FTA：FTA_1131(dxs)
FTN：FTN_0896(dxs)
NOC：Noc_1743
AEH：Mlg_1381
HCH：HCH_05866(dxs)
CSA：Csal_0099
ABO：ABO_2166(dxs)
AHA：AHA_3321(dxs)
BCI：BCI_0275(dxs)
RMA：Rmag_0386
VOK：COSY_0360(dxs)
NME：NMB1867
NMA：NMA0589(dxs)
NMC：NMC0352(dxs)
NGO：NGO0036
CVI：CV_2692(dxs)
RSO：RSc2221(dxs)
REU：Reut_A0882
REH：H16_A2732(dxs)
RME：Rmet_2615
BMA：BMAA0330(dxs)
BMV：BMASAVP1_1512(dxs)
BML：BMA10299_1706(dxs)
BMN：BMA10247_A0364(dxs)
BXE：Bxe_B2827
BUR：Bcep18194_B2211
BCN：Bcen_4486
BCH：Bcen2424_3879
BAM：Bamb_3250
BPS：BPSS1762(dxs)
BPM：BURPS1710b_A0842(dxs)
BPL：BURPS1106A_A2392(dxs)
BPD：BURPS668_A2534(dxs)
BTE：BTH_II0614(dxs)
BPE：BP2798(dxs)
BPA：BPP2464(dxs)
BBR：BB1912(dxs)
RFR：Rfer_2875
POL：Bpro_1747
PNA：Pnap_1501
AJS：Ajs_1038
MPT：Mpe_A2631
HAR：HEAR0279(dxs)
MMS：mma_0331
NEU：NE1161(dxs)
NET：Neut_1501
NMU：Nmul_A0236
EBA：ebA4439(dxs)
AZO：azo1198(dxs)
DAR：Daro_3061
TBD：Tbd_0879
MFA：Mfla_2133
HPY：HP0354(dxs)
HPJ：jhp0328(dxs)
HPA：HPAG1_0349
HHE：HH0608(dxs)
HAC：Hac_0968(dxs)
WSU：WS1996
TDN：Tmden_0475
CJE：Cj0321(dxs)
CJR：CJE0366(dxs)
CJJ：CJJ81176_0343(dxs)
CJU：C8J_0298(dxs)
CJD：JJD26997_1642(dxs)
CFF：CFF8240_0264(dxs)
CCV：CCV52592_1671(dxs)CCV52592_1722
CHA：CHAB381_1297(dxs)
CCO：CCC13826_1594(dxs)
ABU：Abu_2139(dxs)
NIS：NIS_0391(dxs)
SUN：SUN_2055(dxs)
GSU：GSU0686(dxs-1)GSU1764(dxs-2)
GME：Gmet_1934Gmet_2822
PCA：Pcar_1667
PPD：Ppro_1191Ppro_2403
DVU：DVU1350(dxs)
DVL：Dvul_1718
DDE：Dde_2200
LIP：LI0408(dsx)
DPS：DP2700
ADE：Adeh_1097
MXA：MXAN_4643(dxs)
SAT：SYN_02456
SFU：Sfum_1418
PUB：SAR11_0611(dxs)
MLO：mlr7474
MES：Meso_0735
SME：SMc00972(dxs)
ATU：Atu0745(dxs)
ATC：AGR_C_1351
RET：RHE_CH00913(dxs)
RLE：RL0973(dxs)
BME：BMEI1498
BMF：BAB1_0462(dxs)
BMS：BR0436(dxs)
BMB：BruAb1_0458(dxs)
BOV：BOV_0443(dxs)
BJA：bll2651(dxs)
BRA：BRADO2161(dxs)
BBT：BBta_2479(dxs)
RPA：RPA0952(dxs)
RPB：RPB_4460
RPC：RPC_1149
RPD：RPD_4305
RPE：RPE_1067
NWI：Nwi_0633
NHA：Nham_0778
BHE：BH04350(dxs)
BQU：BQ03540(dxs)
BBK：BARBAKC583_0400(dxs)
CCR：CC_2068
SIL：SPO0247(dxs)
SIT：TM1040_2920
RSP：RSP_0254(dxsA)RSP_1134(dxs)
JAN：Jann_0088Jann_0170
RDE：RD1_0101(dxs)RD1_0548(dxs)
MMR：Mmar10_0849
HNE：HNE_1838(dxs)
ZMO：ZMO1234(dxs)ZMO1598(dxs)
NAR：Saro_0161
SAL：Sala_2354
ELI：ELI_12520
GOX：GOX0252
GBE：GbCGDNIH1_0221GbCGDNIH1_2404
RRU：Rru_A0054Rru_A2619
MAG：amb2904
MGM：Mmc1_1048
SUS：Acid_1783
BSU：BG11715(dxs)
BHA：BH2779
BAN：BA4400(dxs)
BAR：GBAA4400(dxs)
BAA：BA_4853
BAT：BAS4081
BCE：BC4176(dxs)
BCA：BCE_4249(dxs)
BCZ：BCZK3930(dxs)
BTK：BT9727_3919(dxs)
BTL：BALH_3785(dxs)
BLI：BL01523(dxs)
BLD：BLi02598(dxs)
BCL：ABC2462(dxs)
BAY：RBAM_022600
BPU：BPUM_2159
GKA：GK2392
GTN：GTNG_2322
LMO：lmo1365(tktB)
LMF：LMOf2365_1382(dxs)
LIN：lin1402(tktB)
LWE：lwe1380(tktB)
LLA：L108911(dxsA)L123365(dxsB)
LLC：LACR_1572LACR_1843
LLM：llmg_0749(dxsB)
SAK：SAK_0263
LPL：lp_2610(dxs)
LJO：LJ0406
LAC：LBA0356
LSL：LSL_0209(dxs)
LGA：LGAS_0350
STH：STH1842
CAC：CAC2077CA_P0106(dxs)
CPE：CPE1819
CPF：CPF_2073(dxs)
CPR：CPR_1787(dxs)
CTC：CTC01575
CNO：NT01CX_1983
CTH：Cthe_0828
CDF：CD1207(dxs)
CBO：CBO1881(dxs)
CBA：CLB_1818(dxs)
CBH：CLC_1825(dxs)
CBF：CLI_1945(dxs)
CKL：CKL_1231(dxs)
CHY：CHY_1985(dxs)
DSY：DSY2348
DRM：Dred_1078
PTH：PTH_1196(dxs)
SWO：Swol_0582
CSC：Csac_1853
TTE：TTE1298(dxs)
MTA：Moth_1511
MPE：MYPE730
MGA：MGA_1268(dxs)
MTU：Rv2682c(dxs1)Rv3379c(dxs2)
MTC：MT2756(dxs)
MBO：Mb2701c(dxs1)Mb3413c(dxs2)
MLE：ML1038(dxs)
MPA：MAP2803c(dxs)
MAV：MAV_3577(dxs)
MSM：MSMEG_2776(dxs)
MMC：Mmcs_2208
CGL：NCgl1827(cgl1902)
CGB：cg2083(dxs)
CEF：CE1796
CDI：DIP1397(dxs)
CJK：jk1078(dxs)
NFA：nfa37410(dxs)
RHA：RHA1_ro06843
SCO：SCO6013(SC1C3.01)SCO6768(SC6A5.17)
SMA：SAV1646(dxs1)SAV2244(dxs2)
TWH：TWT484
TWS：TW280(Dxs)
LXX：Lxx10450(dxs)
CMI：CMM_1660(dxsA)
AAU：AAur_1790(dxs)
PAC：PPA1062
TFU：Tfu_1917
FRA：Francci3_1326
FAL：FRAAL2088(dxs)
ACE：Acel_1393
SEN：SACE_1815(dxs)SACE_4351
BLO：BL1132(dxs)
BAD：BAD_0513(dxs)
FNU：FN1208FN1464
RBA：RB2143(dxs)
CTR：CT331(dxs)
CTA：CTA_0359(dxs)
CMU：TC0608
CPN：CPn1060(tktB_2)
CPA：CP0790
CPJ：CPj1060(tktB_2)
CPT：CpB1102
CCA：CCA00304(dxs)
CAB：CAB301(dxs)
CFE：CF0699(dxs)
PCU：pc0619(dxs)
TPA：TP0824
TDE：TDE1910(dxs)
LIL：LA3285(dxs)
LIC：LIC10863(dxs)
LBJ：LBJ_0917(dxs)
LBL：LBL_0932(dxs)
SYN：sll1945(dxs)
SYW：SYNW1292(Dxs)
SYC：syc1087_c(dxs)
SYF：Synpcc7942_0430
SYD：Syncc9605_1430
SYE：Syncc9902_1069
SYG：sync_1410(dxs)
SYR：SynRCC307_1390(dxs)
SYX：SynWH7803_1223(dxs)
CYA：CYA_1701(dxs)
CYB：CYB_1983(dxs)
TEL：tll0623
GVI：gll0194
ANA：alr0599
AVA：Ava_4532
PMA：Pro0928(dxs)
PMM：PMM0907(Dxs)
PMT：PMT0685(dxs)
PMN：PMN2A_0300
PMI：PMT9312_0893
PMB：A9601_09541(dxs)
PMC：P9515_09901(dxs)
PMF：P9303_15371(dxs)
PMG：P9301_09521(dxs)
PMH：P9215_09851
PMJ：P9211_08521
PME：NATL1_09721(dxs)
TER：Tery_3042
BTH：BT_1403BT_4099
BFR：BF0873BF4306
BFS：BF0796(dxs)BF4114
PGI：PG2217(dxs)
CHU：CHU_3643(dxs)
GFO：GFO_3470(dxs)
FPS：FP0279(dxs)
CTE：CT0337(dxs)
CPH：Cpha266_0671
PVI：Cvib_0498
PLT：Plut_0450
DET：DET0745(dxs)
DEH：cbdb_A720(dxs)
DRA：DR_1475
DGE：Dgeo_0994
TTH：TTC1614
TTJ：TTHA0006
AAE：aq_881
TMA：TM1770
PMO：Pmob_1001
示例性乙酰辅酶A乙酰转移酶核酸和多肽
HSA：38(ACAT1)39(ACAT2)
PTR：451528(ACAT1)
MCC：707653(ACAT1)708750(ACAT2)
MMU：110446(Acat1)110460(Acat2)
RNO：25014(Acat1)
CFA：484063(ACAT2)489421(ACAT1)
GGA：418968(ACAT1)421587(RCJMB04_34i5)
XLA：379569(MGC69098)414622(MGC81403)414639(MGC81256)
444457(MGC83664)
XTR：394562(acat2)
DRE：30643(acat2)
SPU：759502(LOC759502)
DME：Dmel_CG10932Dmel_CG9149
CEL：T02G5.4T02G5.7T02G5.8(kat-1)
ATH：AT5G48230(ACAT2/EMB1276)
OSA：43261364346520
CME：CMA042CCME087C
SCE：YPL028W(ERG10)
AGO：AGOS_ADR165C
PIC：PICST_31707(ERG10)
CAL：CaO19.1591(erg10)
CGR：CAGLOL12364g
SPO：SPBC215.09c
MGR：MGG_01755MGG_13499
ANI：AN1409.2
AFM：AFUA_6G14200AFUA_8G04000
AOR：AO090103000012AO090103000406
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示例性HMG-CoA合酶核酸和多肽
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SAM：MW2466(mvaA)
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MST：Msp_0858(mvk)
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SAM：MW0547(mvaK2)
SAR：SAR0598(mvaK2)
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SAC：SACOL0638
SAB：SAB0542(mvaK2)
SAA：SAUSA300_0574
SAO：SAOUHSC_00579
SAJ：SaurJH9_0615
SEP：SE0363
SER：SERP0240
SHA：SH2400(mvaK2)
SSP：SSP2120
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LMF：LMOf2365_0013
LIN：lin0012
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LLA：L10014(yebA)
LLC：LACR_0456
LLM：llmg_0427
SPY：SPy_0878(mvaK2)
SPZ：M5005_Spy_0684(mvaK2)
SPM：spyM18_0939
SPG：SpyM3_0597(mvaK2)
SPS：SPs1256
SPH：MGAS10270_Spy0742(mvaK2)
SPI：MGAS10750_Spy0776(mvaK2)
SPJ：MGAS2096_Spy0755(mvaK2)
SPK：MGAS9429_Spy0739(mvaK2)
SPF：SpyM51124(mvaK2)
SPA：M6_Spy0701
SPB：M28_Spy0664(mvaK2)
SPN：SP_0383
SPR：spr0340(mvaK2)
SPD：SPD_0348(mvaK2)
SAG：SAG1324
SAN：gbs1394
SAK：SAK_1355
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STC：str0561(mvaK2)
STL：stu0561(mvaK2)
STE：STER_0600
SSA：SSA_0335(mvaK2)
SSU：SSU05_0291
SSV：SSU98_0287
SGO：SGO_0241
LPL：lp_1733(mvaK2)
LJO：LJ1207
LAC：LBA1169
LSA：LSA0906(mvaK2)
LSL：LSL_0683
LDB：Ldb0997(mvaK)
LBU：LBUL_0904
LBR：LVIS_0860
LCA：LSEI_1092
LGA：LGAS_1035
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BGA：BG0710
BAF：BAPKO_0731
NPH：NP2852A
SSO：SSO2988
STO：ST0978
SAI：Saci_1244
示例性二磷酸甲羟戊酸脱羧酶核酸和多肽
HSA：4597(MVD)
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MCC：696865(MVD)
MMU：192156(Mvd)
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CFA：489663(MVD)
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MXA：MXAN_5018(mvaD)
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SAU：SA0548(mvaD)
SAV：SAV0591(mvaD)
SAM：MW0546(mvaD)
SAR：SAR0597(mvaD)
SAS：SAS0550
SAC：SACOL0637(mvaD)
SAB：SAB0541(mvaD)
SAA：SAUSA300_0573(mvaD)
SAO：SAOUHSC_00578
SAJ：SaurJH9_0614
SAH：SaurJH1_0629
SEP：SE0362
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SHA：SH2401(mvaD)
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示例性异戊二烯合酶核酸和多肽
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Claims (31)

1.能够产生异戊二烯的培养的细胞，其中所述的细胞处于稳定期，且其中异戊二烯产量大于或约2倍于在生长期相同时间产生的异戊二烯的量。
2.权利要求1的细胞，其中所述异戊二烯在气相产生，且
(a)其中所述气相包含大于或约9.5％(体积)的氧，且所述气相中异戊二烯的浓度小于自燃的下限或大于自燃的上限，或
(b)所述气相中异戊二烯的浓度小于自燃的下限或大于自燃的上限，且所述细胞产生大于约400nmole/gwcm/hr的异戊二烯。
3.培养的细胞，其产生大于约400nmole/gwcm/hr的异戊二烯，其中所述细胞在异戊二烯的产生与细胞生长去偶联的条件下生长。
4.培养的细胞，其具有大于约0.1mg/L培养液/hr的异戊二烯的平均容积生产力，其中所述细胞在异戊二烯的产生与细胞生长去偶联的条件下生长。
5.培养的细胞，其从细胞培养基转化超过约0.002摩尔百分比的细胞消耗的碳为异戊二烯，其中所述细胞在异戊二烯的产生与细胞生长去偶联的条件下生长。
6.权利要求1至5中任一项的细胞，其中所述细胞在葡萄糖受限条件下生长。
7.权利要求1至6中任一项的细胞，其中在稳定期产生的异戊二烯的量大于或约2、3、4、5、10、20、30、40、50或更多倍于在生长期相同时间产生的异戊二烯的量。
8.权利要求1至7中任一项的细胞，其还包含编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸。
9.组合物，其包含大于约2mg由权利要求1的细胞产生的异戊二烯，且与该组合物中的全部C5烃的总重量相比，其包含以重量计大于或约99.94％的异戊二烯。
10.组合物，其包含大于或约2、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900，或1000毫克权利要求1的细胞产生的异戊二烯。
11.组合物，其包含大于或约2、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100克权利要求1的细胞的挥发性有机级分的异戊二烯(w/w)。
12.组合物，其包含大于约2mg权利要求1的细胞产生的异戊二烯，且包含小于或约0.5μg/L化合物，所述化合物用于抑制异戊二烯聚合的组合物中的任意化合物。
13.权利要求12的组合物，其中所述抑制异戊二烯聚合的组合物与该组合物中全部C5烃的总重量相比，包含以重量计小于或约0.12、0.10、0.08、0.06、0.04、0.02、0.01、0.005、0.001、0.0005、0.0001、0.00005或0.00001％的一种或多种C5烃，所述C5烃选自：1,3-环戊二烯、顺式-1,3-戊二烯、反式-1,3-戊二烯、1-戊炔、2-戊炔、1-戊烯、2-甲基-1-丁烯、3-甲基-l-丁炔、反式-戊间二烯、顺式-戊间二烯、戊-4-烯-1-炔、反式-戊-3-烯-1-炔或顺式-戊-3-烯-1-炔。
14.权利要求12的组合物，其中所述抑制异戊二烯聚合的组合物与该组合物中全部C5烃的总重量相比，具有以重量计小于或约0.12、0.10、0.08、0.06、0.04、0.02、0.01、0.005、0.001、0.0005、0.0001、0.00005或0.00001％的1,3-环戊二烯、顺式-1,3-戊二烯、反式-1,3-戊二烯、1-戊炔、2-戊炔、1-戊烯、2-甲基-1-丁烯、3-甲基-l-丁炔、反式-戊间二烯、顺式-戊间二烯、戊-4-烯-1-炔、反式-戊-3-烯-1-炔或顺式-戊-3-烯-1-炔。
15.组合物，其包含大于约2mg权利要求1的细胞产生的异戊二烯，且与该组合物中全部C5烃的总重量相比，具有以重量计大于或约99.90、99.92、99.94、99.96、99.98或100％异戊二烯。
16.权利要求15的组合物，其中所述异戊二烯回收自废气部分。
17.组合物，其包含大于约2mg权利要求1的细胞产生的异戊二烯，且包含一种或多种化合物，该化合物选自乙醇、丙酮、C5异戊烯醇，和具有10个或更多个碳原子的类异戊二烯化合物。
18.组合物，其包含大于约2mg权利要求1的细胞产生的异戊二烯，且具有一种或多种第二化合物，该第二化合物选自2-庚酮、6-甲基-5-庚-2-酮、2,4,5-三甲基吡啶、2,3,5-三甲基吡嗪、香茅醛、乙醛、甲硫醇、乙酸甲酯、1-丙醇、丁二酮、2-丁酮、2-甲基-3-丁烯-2-醇、乙酸乙酯、2-甲基-1-丙醇、3-甲基-1-丁醛、3-甲基-2-丁酮、1-丁醇、2-戊酮、3-甲基-1-丁醇、异丁酸乙酯、3-甲基-2-丁烯醛、乙酸丁酯、乙酸3-甲基丁酯、乙酸3-甲基-3-丁-1-烯酯、乙酸3-甲基-2-丁-1-烯酯、(E)-3,7-二甲基-1,3,6-一辛三烯、(Z)-3,7-二甲基-1,3,6-一辛三烯和2,3-环庚烯嘧啶，其中所述第二化合物的量相对于异戊二烯的量是大于或约0.01％(w/w)。
19.组合物，其包含(i)包含异戊二烯的气相，和(ii)权利要求1-8中任一项的培养的细胞。
20.权利要求19的组合物，其中所述组合物包含封闭系统，且当归一化为培养1小时的1个OD600的1mL，所述气相包含大于或约5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100μg/L异戊二烯。
21.权利要求19的组合物，其中所述组合物包含开放系统，且当以1vvm的速度喷射时，所述气相包含大于或约5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100μg/L异戊二烯。
22.权利要求19的组合物，其中所述组合物包含气相的挥发性有机级分，与挥发性有机级分中的全部C5烃的总重量相比，所述气相的挥发性有机级分包含以重量计大于或约99.90、99.92、99.94、99.96、99.98或100％异戊二烯。
23.产生异戊二烯的方法，所述方法包括：
(a)在合适异戊二烯产生的培养条件下培养权利要求1-8中任一项的细胞，其中稳定期产生的异戊二烯的量大于或约2倍于在生长期相同时间产生的异戊二烯的量，和
(b)产生异戊二烯。
24.权利要求23的方法，其中所述细胞在葡萄糖受限条件下生长。
25.权利要求23的方法，其中所述异戊二烯回收自细胞培养的废气部分。
26.系统，其包含气相中不可燃浓度的异戊二烯，其中所述气相包含小于或约9.5％(体积)的氧，或大于或约9.5％(体积)的氧，且气相中异戊二烯的浓度小于自燃的下限或大于自燃的上限。
27.权利要求26的系统，其中所述气相的非异戊二烯部分包含约10％至约100％(体积)的氧。
28.权利要求26的系统，其中所述气相的非异戊二烯部分包含约0％至约99％(体积)的氮。
29.权利要求26的系统，其中所述气相的非异戊二烯部分包含约1％至约50％(体积)的CO2。
30.产生异戊二烯的方法，所述方法包括：
(a)在合适异戊二烯产生的培养条件下培养细胞，其中所述气相包含大于或约9.5％(体积)的氧，和
(b)产生异戊二烯，其中所述气相中异戊二烯的浓度小于自燃的下限或大于自燃的上限，且所述细胞产生大于约400nmole/gwcm/hr的异戊二烯。
31.产生异戊二烯的方法，所述方法包括：
(a)在合适异戊二烯产生的培养条件下培养细胞，其中所述气相包含大于或约9.5％(体积)的氧，和
(b)产生异戊二烯，其中所述细胞产生大于约400nmole/gwcm/hr的异戊二烯。
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