MX2014004209A - Uso de fosfocetolasa en la produccion de mevalonato, precursores de isoprenoides e isopreno. - Google Patents

Uso de fosfocetolasa en la produccion de mevalonato, precursores de isoprenoides e isopreno.

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Abstract

La presente invención proporciona métodos para producir mavalonato, isopreno, moléculas precursoras de isoprenoides y/o isoprenoides en células por medio de la expresión heteróloga de enzimas de fosfocetolasa.

Description

USO DE FOSFOCETOLASA EN LA PRODUCCION DE MEVALONATO, PRECURSORES DE ISOPRENOIDES E ISOPRENO CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con células recombinantes cultivadas que comprenden un polipéptido de fosfocetolasas y uno o más polipéptidos de la ruta del mevalonato (MVA) con la capacidad de producir mevalonato, precursores de isoprenoides , isopreno y isoprenoides y composiciones que incluyen estas células cultivadas, asi como métodos de producción y uso de estas.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El . -mevalonato es un intermedio de la ruta biosintética dependiente de mevalonato que convierte acetil-CoA a isopentenil difosfato y dimetilalil difosfato. La conversión de acetil-CoA a mevalonato puede estar catalizada por actividades de la tiolasa, HMG-CoA sintasa y la HMG-CoA reductasa de la ruta biosintética dependiente de mevalonato superior (ruta del MVA) . Comercialmente, el mevalonato se ha usado como un aditivo en cosmética, para la producción de polímeros biodegradables , y puede tener valor como una unidad estructural quiral para la síntesis de otras sustancias químicas. La ruta biosintética dependiente de mevalonato inferior usa mevalonato como sustrato para producir isopentenil pirofosfato (IPP) y dimetilalil difosfato REF: 247939 (DMAPP) , que son los productos terminales de la ruta dependiente de mevalonato. El IPP y el DMAPP son precursores para isopreno, así como para isoprenoides .
El isopreno (2-metil-l, 3-butadieno) es la materia prima fundamental para una gran variedad de polímeros sintéticos, particularmente, cauchos sintéticos. El isopreno se puede obtener al fraccionar petróleo; sin embargo, la purificación de este material es costosa y toma mucho tiempo. El craqueo de petróleo de la corriente C5 de hidrocarburos produce únicamente aproximadamente 15% de isopreno. Por año se produce aproximadamente 7.2 kg (800,000 toneladas) de cis-poliisopreno de la polimerización de isopreno; la mayor parte de este poliisopreno se usa en la industria de neumáticos y caucho. El isopreno se copolimeriza, además, para usar como un elastómero sintético en otros productos, tales como calzado, productos mecánicos, productos médicos, artículos deportivos y látex. El isopreno se puede producir, además, naturalmente, mediante una gran variedad de especies microbianas, vegetales y animales. Particularmente, se ha identificado dos rutas para la biosíntesis natural de isopreno: la ruta del mevalonato (MVA) y la ruta alternativa (DXP) . Los productos de la ruta del mevalonato y la ruta alternativa son isopentenil pirofosfato (IPP) y dimetilalil difosfato (DMAPP) . El DMAPP se puede convertir directamente a isopreno. El IPP y el DMAPP se pueden convertir a isoprenoides .
Se ha identificado más de 29,000 compuestos isoprenoides y cada año se descubre nuevos isoprenoides. Los isoprenoides se pueden aislar de productos naturales, tales como microorganismos y especies de plantas que usan moléculas precursoras de isoprenoides como una unidad estructural básica para formar las estructuras relativamente complejas de isoprenoides. Los isoprenoides son fundamentales para la mayoría de organismos vivos y células y proporcionan un medio para mantener la fluidez de la membrana celular y el transporte de electrones. En la naturaleza, los isoprenoides desempeñan funciones como pesticidas diversos como naturales en plantas para contribuir con los aromas asociados con canela, clavos y jengibre. Además, las comunidades farmacéuticas y químicas usan los isoprenoides como productos farmacéuticos, nutracéuticos , agentes saborizantes y agentes para el control de plagas agrícolas. Debido a su importancia en los sistemas biológicos y su utilidad en una amplia variedad de aplicaciones, los isoprenoides han sido el centro de atención de los científicos.
Los medios convencionales para obtener mevalonato e isoprenoides incluyen la extracción de materiales biológicos (por ejemplo, plantas, microbios y animales) y la síntesis orgánica parcial o total en el laboratorio. Sin embargo, se ha probado que tales medios son, generalmente, insatisfactorios . Particularmente, para isoprenoides, debido a la naturaleza compleja frecuente de su estructura molecular, la síntesis orgánica es poco práctica porque, usualmente, se requiere diversas etapas para obtener el producto deseado. Adicionalmente , estas etapas de síntesis química pueden incluir el uso de solventes tóxicos así como la extracción de isoprenoides a partir de materiales biológicos. Además, estos métodos de extracción y purificación producen, usualmente, un rendimiento relativamente bajo del isoprenoide deseado porque los materiales biológicos contienen, típicamente, únicamente cantidades diminutas de estas moléculas. Desafortunadamente, la dificultad implicada para obtener cantidades relativamente grandes de isoprenoides ha limitado su uso práctico.
Los avances recientes en la producción de isopreno, moléculas precursoras de isoprenoides, e isoprenoides describen métodos para producir isopreno e isoprenoides a índices, títulos y purezas que pueden ser suficientes para satisfacer la demanda de procesos comerciales consistentes (ver, por ejemplo, la publicación de la solicitud de patente internacional núm. WO 2009/076676 A2 y la patente de los Estados Unidos núm. 7,915,026); sin embargo, aún se requiere rutas alternas para mejorar la producción y rendimientos de estos .
La presente descripción proporciona células recombinantes cultivadas, composiciones de estas células y métodos para usar estas células para incrementar la producción de mevalonato como un intermedio de la ruta biosintética dependiente de mevalonato, así como para incrementar la producción de moléculas derivadas de mevalonato, tales como precursores de isoprenoides , isopreno y/o isoprenoides.
A lo largo de esta descripción, se menciona diversas patentes, solicitudes de patentes y otros tipos de publicaciones (por ejemplo, artículos de publicaciones periódicas) . La descripción de todas las patentes, solicitudes de patentes, y publicaciones mencionadas en la presente descripción se incorporan en la presente descripción como referencia en su totalidad para cualquier propósito.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención proporcionada en la presente descripción describe, entre otros, composiciones de materia que comprenden células recombinantes y métodos para producir y usar estas células recombinantes para la producción de mevalonato, isopreno, moléculas precursoras de isoprenoides, y/o isoprenoides. Las células recombinantes que se han sometido a ingeniería genética pueden usarse para expresar un polipéptido de fosfocetolasas . Las enzimas de fosfocetolasa de la presente invención pueden usar diversos sustratos, como se describirá detalladamente posteriormente. Por lo tanto, en un aspecto, la presente invención proporciona células recombinantes con la capacidad de producir isopreno, en donde las células comprenden uno o más ácidos nucleicos heterologos que codifican un . polipéptido que tiene actividad de fosfocetolasa y (i) uno o más ácidos nucleicos que codifican uno o más polipéptidos de la ruta completa del MVA y (ii) un ácido nucleico heterólogo que codifica un polipéptido de isopreno sintasa, en donde cultivar tales células recombinantes en un medio adecuado permite la producción de isopreno. En una modalidad, uno o más ácidos nucleicos heterologos que codifican un polipéptido que tiene actividad de fosfocetolasa tiene la capacidad de sintetizar gliceraldehído 3-fosfato y acetilfosfato a partir de xilulosa 5-fosfato. En otra modalidad, uno o más ácidos nucleicos heterologos que codifican un polipéptido que tiene actividad de fosfocetolasa tienen la capacidad de sintetizar eritrosa 4-fosfato y acetilfosfato a partir de fructosa 6-fosfato. En otra modalidad, el ácido nucleico heterólogo que codifica un polipéptido que tiene actividad de fosfocetolasa se selecciona del grupo que consiste en: Bifidobacterium longum, Enterococcus galliniarum, Clostridium acetobutilicum, Nostoc punctiforme, Rhodopseudomonas palustris, Pantoea, Mucilaginibacter paludis, Thermobifida fusca, Bifidobacterium breve, Rahnella aquatili, Bifidobacterium animalis, Gardnerella vaginalis, Streptomyces avermitilis, Lactobacillus plantarum y Lactobacillus reuteri . En otra modalidad, el ácido nucleico heterólogo que codifica un polipéptido que tiene actividad de fosfocetolasa se selecciona del grupo que consiste en: Bifidobacterium longum, Enterococcus galliniarum y Clostridium acetobutilicum. En otra modalidad, el ácido nucleico heterólogo que codifica un polipéptido de isopreno sintasa es un polipéptido de isopreno sintasa vegetal. En otra modalidad, el polipéptido de isopreno sintasa es un polipéptido de Pueraria o Populus o un híbrido, Populus alba x Populus trémula . En otra modalidad, el polipéptido de isopreno sintasa se selecciona del grupo que consiste en Pueraria montana o Pueraria lobata, Populus tremuloides, Populus alba, Populus nigra y Populus trichocarpa. En otra modalidad, uno o más polipéptidos de la ruta completa del MVA se selecciona de (a) una enzima que condensa dos moléculas de acetil-CoA para formar acetoacetil-CoA; (b) una enzima que condensa acetoacetil-CoA con acetil-CoA para formar HMG-CoA (por ejemplo, HMG sintasa) ; (c) una enzima que convierte HMG-CoA a mevalonato; (d) una enzima que fosforiza mevalonato a mevalonato 5-fosfato; (e) una enzima que convierte mevalonato 5-fosfato a mevalonato 5-pirofos ato; y (f) una enzima que convierte mevalonato 5-pirofosfato a isopentenil pirofosfato. En otra modalidad, las células recombinantes comprenden, además, uno o más ácidos nucleicos que codifican uno o más polipéptidos de la ruta de 1-desoxi-D-xilulosa 5 -fosfato (DXP) . En otra modalidad, el o los ácidos nucleicos se colocan bajo un promotor inducible o un promotor constitutivo. En otra modalidad, el o los ácidos nucleicos se clonan en uno o más plásmidos multicopia. En otra modalidad, el o los ácidos nucleicos se integran en un cromosoma de las células. En otra modalidad, las células recombinantes son células bacterianas gram positivas, células bacterianas gram negativas, células fúngicas, células fúngicas filamentosas, células de algas o células de levadura. En otra modalidad, las células recombinantes se seleccionan del grupo que consiste en Bacillus subtilis, Streptomyces lividans, Streptomyces coelicolor, Streptomyces griseus, Escherichia coli, Pantoea citrea, Trichoderma reesei, Aspergillus oryzae y Aspergillus niger, Saccharomyces cerevisieae y Yarrowia lipolytica .
En otro aspecto, la presente invención proporciona células recombinantes con la capacidad de producir precursores de isoprenoides, en donde las células comprenden uno o más ácidos nucleicos heterologos que codifican un polipéptido que tiene actividad de fosfocetolasa y uno o más ácidos nucleicos que codifican uno o más polipéptidos de la ruta completa del MVA, en donde cultivar tales células recombinantes en un medio adecuado permite la producción de precursores de isoprenoides. En una modalidad, el o los ácidos nucleicos heterologos que codifican un polipéptido que tiene actividad de fosfocetolasa tienen la capacidad de sintetizar gliceraldehído 3-fosfato y acetil fosfato a partir de xilulosa 5-fosfato. En otra modalidad, el o los ácidos nucleicos heterólogos que codifican un polipéptido que tiene actividad de fosfocetolasa tienen la capacidad de sintetizar eritrosa 4-fosfato y acetilfosfato a partir de fructosa 6-fosfato. En otra modalidad, el ácido nucleico heterologo que codifica un polipéptido que tiene actividad de fosfocetolasa se selecciona del grupo que consiste en: Bifidobacterium longum, Enterococcus galliniarum, Clostridium acetobutilicum, Nostoc punctiforme, Rhodopseudomonas palustris, Pantoea, Mucilaginibacter paludis, Thermobifida fusca, Bifidobacterium breve, Rahnella aquatili , Bifidobacterium animalis, Gardnerella vaginalis, Streptomyces avermitilis, Lactobacillus plantaru y Lactobacillus reuteri . En otra modalidad, el ácido nucleico heterologo que codifica un polipéptido que tiene actividad de fosfocetolasa se selecciona del grupo que consiste en: Bifidobacterium longum, Enterococcus galliniarum y Clostridium acetobutilicum. En otra modalidad, uno o más polipéptidos de la ruta completa del MVA se selecciona de (a) una enzima que condensa dos moléculas de acetil-CoA para formar acetoacetil-CoA; (b) una enzima que condensa acetoacetil-CoA con acetil-CoA para formar HMG-CoA (por ejemplo, HMG sintasa) ; (c) una enzima que convierte HMG-CoA a mevalonato; (d) una enzima que fosforiza mevalonato a mevalonato 5-fosfato; (e) una enzima que convierte mevalonato 5-fosfato a mevalonato 5-pirofosfato; y (f) una enzima que convierte mevalonato 5-pirofosfato a isopentenil pirofosfato. En otra modalidad, el o los ácidos nucleicos se colocan bajo un promotor inducible o un promotor constitutivo. En otra modalidad, uno o más ácidos nucleicos se clonan en uno o más plásmidos multicopia. En otra modalidad, uno o más ácidos nucleicos se integran en un cromosoma de las células. En otra modalidad, las células recombinantes son células bacterianas gram positivas, células bacterianas gram negativas, células fúngicas, células fúngicas filamentosas, células de algas o células de levadura. En otra modalidad, las células recombinantes se seleccionan del grupo que consiste en Bacillus subtilis, Streptomyces lividans, Streptomyces coelicolor, Streptomyces griseus, Escherichia coli, Pantoea citrea, Trichoderma reesei, Aspergillus oryzae y Aspergillus niger, Saccharomyces cerevisieae y Yarrowia lipolytica.
En otro aspecto, la presente invención proporciona células recombinantes con la capacidad de producir isoprenoides, en donde las células comprenden uno o más ácidos nucleicos heterologos que codifican un polipéptido que tiene actividad de fosfocetolasa y (i) uno o más ácidos nucleicos que codifican uno o más polipéptidos de la ruta completa del MVA y (ii) un ácido nucleico heterólogo que codifica un polipéptido de poliprenil pirofosfato sintasa, en donde cultivar tales células recombinantes en un medio adecuado permite la producción de isoprenoides . En una modalidad, uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican un polipéptido que tiene actividad de fosfocetolasa tiene la capacidad de sintetizar gliceraldehído 3-fosfato y acetilfosfato a partir de xilulosa 5-fosfato. En otra modalidad, uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican un polipéptido que tiene actividad de fosfocetolasa tienen la capacidad de sintetizar eritrosa 4-fosfato y acetilfosfato a partir de fructosa 6-fosfato. En otra modalidad, el ácido nucleico heterólogo que codifica un polipéptido que tiene actividad de fosfocetolasa se selecciona del grupo que consiste en: Bifidobacterium longum, Enterococcus galliniarum, Clostridium acetobutilicum, Nostoc punctiforme, Rhodopseudomonas palustris, Pantoea, Mucilaginibacter paludis, Thermobifida fusca, Bifidobacterium breve, Rahnella aquatili, Bifidobacterium animalis, Gardnerella vaginalis, Streptomyces avermitilis, Lactobacillus plantarum y Lactobacillus reuteri. En otra modalidad, el ácido nucleico heterólogo que codifica un polipéptido que tiene actividad de fosfocetolasa se selecciona del grupo que consiste en: Bifidobacterium longum, Enterococcus galliniarum y Clostridium acetobutilicum. En otra modalidad, el isoprenoide se selecciona del grupo que consiste en monoterpenos , diterpenos, triterpenos, tetraterpenos , sequiterpeno y politerpeno. En otra modalidad, el isoprenoide es un sesquiterpeno . En otra modalidad, el isoprenoide se selecciona del grupo que consiste en abietadieno, amorfadieno, careno, a-fameseno, ß-farneseno, farnesol, geraniol, geranilgeraniol , linalol, limoneno, mirceno, nerolidol, ocimeno, patchoulol, ß-pineno, sabineno, ?-terpineno, terpindeno y valenceno. En otra modalidad, uno o más polipéptidos de la ruta completa del MVA se selecciona de (a) una enzima que condensa dos moléculas de acetil-CoA para formar acetoacetil-CoA; (b) una enzima que condensa acetoacetil-CoA con acetil-CoA para formar HMG-CoA (por ejemplo, HMG sintasa) ; (c) una enzima que convierte HMG-CoA a mevalonato; (d) una enzima que fosforiza mevalonato a mevalonato 5-fosfato; (e) una enzima que convierte mevalonato 5-fosfato a mevalonato 5-pirofosfato; y (f) una enzima que convierte mevalonato 5-pirofosfato a isopentenil pirofosfato. En otra modalidad, el o los ácidos nucleicos se colocan bajo un promotor inducible o un promotor constitutivo. En otra modalidad, uno o más ácidos nucleicos se clonan en uno o más plásmidos multicopia. En otra modalidad, uno o más ácidos nucleicos se integran en un cromosoma de las células. En otra modalidad, las células hospederas recombinantes son células bacterianas gram positivas, células bacterianas gram negativas, células fúngicas, células fúngicas filamentosas, células de algas o células de levadura. En otra modalidad, las células hospederas recombinantes se seleccionan del grupo que consiste en Bacillus subtilis, Streptomyces lividans, Streptomyces coelicolor, Streptomyces griseus, Escherichia coli, Pantoea citrea, Trichoderma reesei, Aspergillus oryzae y Aspergillus niger, Saccharomyces cerevisieae y Yarrowia lipolytica .
En otro aspecto, la presente invención proporciona métodos para producir isopreno; los métodos comprenden: (a) cultivar cualquiera de las células recombinantes mencionadas anteriormente y descritas en la presente descripción en condiciones adecuadas para producir isopreno y (b) producir isopreno. En otro aspecto, la presente invención proporciona métodos para producir un precursor de isoprenoides ; los métodos comprenden: (a) cultivar cualquiera de las células recombinantes mencionadas anteriormente y descritas en la presente descripción en condiciones adecuadas para producir un precursor de isoprenoides y (b) producir un precursor de isoprenoides. En otro aspecto, la presente invención proporciona métodos para producir un isoprenoide; los métodos comprenden: (a) cultivar cualquiera de las células recombinantes mencionadas anteriormente y descritas en la presente descripción en condiciones adecuadas para producir un isoprenoide y (b) producir un isoprenoide.
En algunos aspectos, la célula recombinante comprende uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican un polipéptido de fosfocetolasas y uno o más ácidos nucleicos que codifican una o más enzimas de la ruta del MVA. En algunos aspectos, las células recombinantes comprenden un ácido nucleico heterologo que codifica un polipéptido con la capacidad de sintetizar gliceraldehído 3 -fosfato y acetilfosfato a partir de xilulosa 5-fosfato, en donde el acetilfosfato se convierte a mevalonato, precursores de isoprenoides , isopreno y/o isoprenoides . En otros aspectos, las células recombinantes comprenden un ácido nucleico heterologo que codifica un polipéptido con la capacidad de sintetizar eritrosa 4-fosfato y acetilfosfato a partir de fructosa 6-fosfato, en donde el acetilfosfato se convierte a mevalonato, precursores de isoprenoides, isopreno y/o isoprenoides.
Por lo tanto, en ciertos aspectos, la presente invención proporciona células recombinantes con la capacidad de mejorar la producción de mevalonato, en donde las células comprenden uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican un polipéptido que tiene actividad de fosfocetolasa y uno o más ácidos nucleicos que codifican uno o más polipéptidos de la ruta del MVA superior, en donde cultivar tales células recombinantes en un medio adecuado permite la producción de tales polipéptidos y mevalonato. En ciertas modalidades, las células producen cantidades mayores de mevalonato en comparación con las células productoras de mevalonato que no comprenden el o los ácidos nucleicos heterólogos que codifican un polipéptido que tiene actividad de fosfocetolasa . En ciertas modalidades, la copia o copias de un ácido nucleico heterologo que codifica péptido de fosfocetolasa se seleccionan de Lactobacillus reuteri, Bifidobacterium longum, Ferrimonas baleárica, Pedobactor saltans, Streptomyces griseus y/o Nocardiopsis dassonvillei . En una modalidad, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterologo que codifica una fosfocetolasa aislada de Lactobacillus reuteri. En otra modalidad, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterologo que codifica fosfocetolasa aislada de Bifidobacterium longum. En otra modalidad adicional, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterologo que codifica una fosfocetolasa aislada de Ferrimonas baleárica . En otra modalidad adicional, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterologo que codifica una fosfocetolasa aislada de Pedobactor saltans. En otra modalidad, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterologo que codifica una fosfocetolasa aislada de Streptomyces griseus. En otra modalidad adicional, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterologo que codifica una fosfocetolasa aislada de Nocardiopsis dassonvillei .
En otros aspectos, la presente invención proporciona células recombinantes con la capacidad de producir precursores de isoprenoides, en donde las células comprenden uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican un polipéptido que tiene actividad de fosfocetolasa y uno o más ácidos nucleicos que codifican uno o más polipéptidos de la ruta completa del MVA, en donde cultivar tales células recombinantes en un medio adecuado permite la producción de tales polipéptidos y precursores de isoprenoides. En ciertas modalidades, las células producen cantidades mayores de precursores de isoprenoides en comparación con las células productoras de precursores de isoprenoides que no comprenden el o los ácidos nucleicos heterólogos que codifican un polipéptido que tiene actividad de fosfocetolasa . En ciertas modalidades, la copia o copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica péptido de fosfocetolasa se seleccionan de Lactobacillus reuteri, Bifidobacterium longum, Ferrimonas baleárica, Pedobactor saltans, Streptomyces griseus y/o Nocardiopsis dassonvillei. En una modalidad, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica una fosfocetolasa aislada de Lactobacillus reuteri. En otra modalidad, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica una fosfocetolasa aislada de Bifidobacterium longum. En otra modalidad adicional, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterologo que codifica una fosfocetolasa aislada de Ferrimonas baleárica. En otra modalidad adicional, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterologo que codifica una fosfocetolasa aislada de Pedojbactor saltans. En otra modalidad, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica una fosfocetolasa aislada de Streptomyces griseus . En otra modalidad adicional, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica una fosfocetolasa aislada de Nocardiopsis dassonvillei .
En otros aspectos adicionales, la presente invención proporciona células recombinantes con la capacidad de producir isopreno, en donde las células comprenden uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican un polipéptido que tiene actividad de fosfocetolasa y (i) uno o más ácidos nucleicos que codifican uno o más polipéptidos de la ruta completa del MVA y (ii) un ácido nucleico heterólogo que codifica un polipéptido de isopreno sintasa, en donde cultivar tales células recombinantes en un medio adecuado permite la producción de tales polipéptidos e isopreno. En ciertas modalidades, la presente invención proporciona células recombinantes con la capacidad de mejorar la producción de isopreno, en donde las células comprenden uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican un polipéptido que tiene actividad de fosfocetolasa y (i) uno o más ácidos nucleicos que codifican uno o más polipéptidos de la ruta completa del MVA y (ii) un ácido nucleico -heterólogo que codifica un polipéptido de isopreno sintasa, en donde las células producen cantidades mayores de isopreno en comparación con las células productoras de isopreno que no comprenden el ácido o ácidos nucleicos heterólogos que codifican un polipéptido que tiene actividad de fosfocetolasa . En ciertas modalidades, la copia o copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica péptido de fosfocetolasa se seleccionan de Lactobacillus reuteri, Bifidobacterium longum, Ferrimonas baleárica, Pedobactor saltans, Streptomyces griseus y/o Nocardiopsis dassonvillei . En una modalidad, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica una fosfocetolasa aislada de Lactobacillus reuteri. En otra modalidad, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica una fosfocetolasa aislada de Bifidobacterium longum. En otra modalidad adicional, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica una fosfocetolasa aislada de Ferrimonas baleárica . En otra modalidad adicional, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterologo que codifica una fosfocetolasa aislada de Pedobactor saltans. En otra modalidad, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterologo que codifica una fosfocetolasa aislada de Streptomyces griseus. En otra modalidad adicional, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterologo que codifica una fosfocetolasa aislada de Nocardiopsis dassonvillei .
En otros aspectos adicionales, la presente invención proporciona células recombinantes con la capacidad de producir isoprenoides , en donde las células comprenden uno o más ácidos nucleicos heterologos que codifican un polipéptido que tiene actividad de fosfocetolasa y (i) uno o más ácidos nucleicos que codifican uno o más polipéptidos de la ruta completa del VA y (ii) un ácido nucleico heterologo que codifica un polipéptido de poliprenil pirofosfato sintasa, en donde cultivar tales células recombinantes en un medio adecuado permite la producción de tales polipéptidos, en donde las células tienen la capacidad de producir cantidades recuperables de isoprenoides. En ciertas modalidades, la presente invención proporciona células recombinantes con la capacidad de mejorar la producción de isoprenoides, en donde las células comprenden uno o más ácidos nucleicos heterologos que codifican un polipéptido que tiene actividad de fosfocetolasa y (i) uno o más ácidos nucleicos que codifican uno o más polipéptidos de la ruta completa del MVA y (ii) un ácido nucleico heterologo que codifica un polipéptido de poliprenil pirofosfato sintasa, en donde las células producen cantidades mayores de isoprenoides en comparación con las células productoras de isoprenoides que no comprenden el ácido o ácidos nucleicos heterólogos que codifican un polipéptido que tiene actividad de fosfocetolasa . En ciertas modalidades, la copia o copias de un ácido nucleico heterologo que codifica péptido de fosfocetolasa se seleccionan de Lactobacillus reuteri, Bifidobacterium longum, Ferrimonas baleárica, Pedobactor saltans, Streptomyces griseus y/o Nocardiopsis dassonvillei . En una modalidad, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterologo que codifica una fosfocetolasa aislada de Lactobacillus reuteri. En otra modalidad, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterologo que codifica una fosfocetolasa aislada de Bifidobacterium longum. En otra modalidad adicional, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterologo que codifica una fosfocetolasa aislada de Ferrimonas baleárica. En otra modalidad adicional, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterologo que codifica una fosfocetolasa aislada de Pedojbactor saltans. En otra modalidad, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterologo que codifica una fosfocetolasa aislada de Streptomyces griseus . En otra modalidad adicional, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterologo que codifica una fosfocetolasa aislada de Nocardiopsis dassonvillei . En cualquiera de los aspectos de la presente invención, el isoprenoide se selecciona del grupo que consiste en monoterpenos, diterpenos, triterpenos, tetraterpenos, sequiterpeno y politerpeno. En un aspecto, el isoprenoide es un sesquiterpeno . En otro aspecto, el isoprenoide se selecciona del grupo que consiste en abietadieno, amorfadieno, careno, a-fameseno, ß-farneseno, farnesol, geraniol, geranilgeraniol , linalol, limoneno, mirceno, nerolidol, ocimeno, patchoulol, ß-pineno, sabineno, ?-terpineno, terpindeno y valenceno.
En ciertas modalidades, las células recombinantes con la capacidad de producir mevalonato, isopreno, moléculas precursoras de isoprenoides, y/o isoprenoides comprenden uno o más ácidos nucleicos que codifican un polipéptido con la capacidad de sintetizar gliceraldehído 3 -fosfato y acetilfosfato a partir de xilulosa 5-fosfato. En un aspecto, el o los ácidos nucleicos que codifican un polipéptido con la capacidad de sintetizar gliceraldehído 3-fosfato y acetilfosfato a partir de xilulosa 5-fosfato son genes de fosfocetolasa . En otro aspecto, el gen de fosfocetolasa es un gen de Lactobacillus . En otro aspecto, el gen de fosfocetolasa es del género Lactobacillus reuteri . En otro aspecto, el gen de fosfocetolasa codifica una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos de: MAVDYDSKKYLESVDAYWRAANYLSVGTLYLMGDPLLRQPLKAEDVKPKPIGHWGTIVPQN FIYAHLNRVIKKYDLDMFYIEGSGHGGQVMV NSYLDGSYTEIYPEYTQDT GMAKLFKHF SFPGGTASHAAPETPGSIHEGGELGYSLSHGVGAILDNPEVIAAVEIGDGEAETGPL ASW FSDKFINPIKDGAVLPI IQV GFKISNPTILSWMSDEELTKYFEGMGWKPYFVSAYKEADR DGEFKGYKPHMEVHEEMAKTLDKVVEEIKAIQK ARE NDNSLPQWPMIIFRAPKG TGPK TDLDGNPIENSFRAHQIPVPVSQDDMEHKDILVDWLKSYKPEELFDEDGHPVALVEENTPE GNRRMAM PITNGGIDPKPLVLPNYRDFAIDVQNPGSWKQDMLE GKYLNK AELNPTNF RGFGPDESKSNRLYAFLDGQKRQ MESVHEPNDEDVAPQGRMIDSQLSEHQAEGFLEGYTL TGRHGFFATYEAFGRWDSMLTQH KWLRKAKDLYWRHQYPALNFVDTSTVFQQDHNGYTH QDPGLLTHLFEKERPDLVKEYLPADTNSLMAVSNKAFRNQECINLFVTSKHPRAQWFSIDE ATQLADNGLGYIDWASTDQGTEPDWFASSGTEPTEEALAAIDILHDNFPELKIRYIN11E IMRLMNTDKNPEGLTDAEFNSYFTTDKPVIFAWHGFRDMIQALFFDRANRNVHIHSYEENG DITTPFDMRVLNELDRFHLAKDAIQSVPGYEQKSAAFVAK DNMINKHNHYIRSEGKDLPE VTNWTWKGLK (sec. con núm. de ident.:2) .
En otras modalidades, las células recombinantes con la capacidad de producir mevalonato, isopreno, moléculas precursoras de isoprenoides, y/o isoprenoides comprenden uno o más ácidos nucleicos que codifican un polipéptido con la capacidad de sintetizar eritrosa 4-fosfato y acetilfosfato a partir de fructosa-6-fosfato. En un aspecto, el o los ácidos nucleicos que codifican un polipéptido con la capacidad de sintetizar eritrosa 4-fosfato y acetilfosfato a partir de fructosa 6 -fosfato son genes de fosfocetolasa . En otro aspecto, el gen de fosfocetolasa es un gen de Bifidobacterium. En otro aspecto, el gen de fosfocetolasa es del género Bifidobacterium longum subespecie infantis. En otro aspecto, el gen de fosfocetolasa codifica una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos de: MTSPVIGTPWKKLSAPVSEEALEGVDKYWRVANYLSIGQIYLRSNPLMKEPFTREDVKHRL VGHWGTTPGLNFLIGHINRFIADHGQNTVIIMGPGHGGPAGTSQSYLDGTYTETFPKITKD EAGLQKFFRQFSYPGGIPSHFAPETPGSIHEGGELGYALSHAYGAIMDNPSLFVPAIVGDG EAETGPLATGWQSNKLVNPRTDGIVLPILHLNGYKIANPTILSRISDEELHEFFHGMGYEP YEFVAGFDDEDHMSIHRRFAELWETIWDEICDIKATAQTDNVHRPFYPMLIFRTPKGWTCP KYIDGKKTEGSWRSHQVPLASARDTEAHFEVLKNWLESYKPEELFDANGAVKDDVLAFMPK GELRIGANPNANGGVIRDDLKLPNLEDYEVKEVAEFGHGWGQLEATRSLGAYTRDIIKNNP RDFRIFGPDETASNRLQASYEVTNKQWDAGYISDEVDEHMRVSGQWEQLSEHQMEGFLEA YLLTGRHGIWSSYESFVHVIDSMLNQHAKWLEATVREIPWRKPIASMNLLVSSHVWRQDHN GFSHQDPGVTSVLLNKCFHNDHVIGIYFATDANMLLAIAEKCYKSTNKINAIIAGKQPAAT WLTLDEARAELEKGAAAWDWASTAKTNDEAEIVLAAAGDVPTQEIMAASDKLKELGIKFKV VNWDLLSLQSAKENDEALSNEEFADIFTADKPVLFAYHSYAHDVRGLIYDRPNHDNFNVH GYEEEGSTTTPYDMVRVNRIDRYELTAEALRMIDADKYADKIDELEKFRDEAFQFAVDKGY DHPDYTDWVYSGVNTGKKGAVTATAATAGDNE (sec. con núm. de ident. :4) .
En un aspecto, la invención descrita en la presente descripción proporciona células recombinantes con la capacidad de producir mevalonato, precursor de isoprenoides, isopreno y/o isoprenoides que comprenden uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican un polipéptido con la capacidad de sintetizar gliceraldehído 3-fosfato y acetilfosfato a partir de xilulosa 5 -fosfato y uno o más ácidos nucleicos que codifican: (a) un péptido que sintetiza acetoacetil-CoA a partir de malonil-CoA y acetil-CoA; (b) uno o más polipéptidos de la ruta del mevalonato (MVA) ; en donde cultivar tales células recombinantes en un medio adecuado permite la producción de tales polipéptidos y la síntesis de mevalonato, precursor de isoprenoides , isopreno y/o isoprenoides . En un aspecto, el o los ácidos nucleicos que codifican un polipéptido con la capacidad de sintetizar gliceraldehído 3-fosfato y acetilfosfato a partir de xilulosa 5-fosfato son genes de fosfocetolasa . En un aspecto, el péptido que sintetiza acetoacetil-CoA a partir de malonil-CoA y acetil-CoA es un péptido derivado de la especie Streptomyces . CL190. En un aspecto, el péptido que sintetiza acetoacetil-CoA a partir de malonil-CoA y acetil-CoA es un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la sec . con núm . de ident . : 5.
En otro aspecto, la presente invención proporciona células recombinantes con la capacidad de producir mevalonato, precursor de isoprenoides, isopreno y/o isopreno de isoprenoides que comprenden uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican un polipéptido con la capacidad de sintetizar eritrosa 4-fosfato y acetilfosfato a partir de fructosa 6 -fosfato y uno o más ácidos nucleicos que codifican: (a) un péptido que sintetiza acetoacetil-CoA a partir de malonil-CoA y acetil-CoA; (b) uno o más polipéptidos de la ruta del mevalonato (MVA) ; en donde cultivar tales células recombinantes en un medio adecuado permite la producción de tales polipéptidos y la síntesis de mevalonato, precursor de isoprenoides , isopreno y/o isoprenoides . En un aspecto, el o los ácidos nucleicos que codifican un polipéptido con la capacidad de sintetizar eritrosa 4-fosfato y acetilfosfato a partir de fructosa 6-fosfato son genes de fosfocetolasa . En un aspecto, el péptido que sintetiza acetoacetil-CoA a partir de malonil-CoA y acetil-CoA es un péptido derivado de la especie Streptomyces . CL190. En un aspecto, el péptido que sintetiza acetoacetil-CoA a partir de malonil-CoA y acetil-CoA es un péptido que tiene la secuencia de ácidos de la sec . con núm. de ident . : 5.
En otro aspecto, el o los ácidos nucleicos heterólogos que codifican un polipéptido que tiene actividad de fosfocetolasa codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos con 80% o más identidad con la secuencia de aminoácidos de la sec. con núm. de ident .: 2 y que tiene una función de sintetizar gliceraldehído 3-fosfato y acetilfosfato a partir de xilulosa 5-fosfato. En ciertas modalidades, el o los ácidos nucleicos heterólogos que codifican un polipéptido que tiene actividad de fosfocetolasa codifica un polipéptido que tiene 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencias con la secuencia de aminoácidos de la sec . con núm. de ident . :2. En otro aspecto, el o los ácidos nucleicos heterólogos que codifican un polipéptido que tiene actividad de fosfocetolasa codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos con 80% o más identidad con la secuencia de aminoácidos de la sec. con núm. de ident.: 4 y que tiene una función de sintetizar eritrosa 4-fosfato y acetilfosfato a partir de fructosa 6-fosfato. En ciertas modalidades, el o los ácidos nucleicos heterólogos que codifican un polipéptido que tiene actividad de fosfocetolasa codifica un polipéptido que tiene 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencias con la secuencia de aminoácidos de la sec. con núm. de ident. :4.
En cualquiera de los aspectos de la presente invención, el ácido nucleico heterólogo que codifica un polipéptido de isopreno sintasa es un polipéptido de isopreno sintasa vegetal. En cualquiera de los aspectos de la presente invención, el polipéptido de isopreno sintasa es un polipéptido de Pueraria o Populus o un híbrido, Populus alba x Populus trémula. En cualquiera de los aspectos de la presente invención, el polipéptido de isopreno sintasa se selecciona del grupo que consiste en Pueraria montana o Pueraria lobata, Populus tremuloides, Populus alba, Populus nigra y Populus trichocarpa. En otro aspecto, el polipéptido de isopreno sintasa vegetal es un polipéptido de isopreno sintasa de kudzu. En otro aspecto, la isopreno sintasa es una isopreno sintasa modificada genéticamente, tal como las descritas en la publicación de la patente de los Estados Unidos núm. 2010/0003716 y la publicación de la patente de los Estados Unidos núm. 2011/0076743.
En cualquiera de los aspectos de la presente invención, la presente invención proporciona una célula hospedera recombinante, o progenie de esta, que comprende células modificadas genéticamente para un flujo de carbono incrementado para la producción de mevalonato, en donde se modula la actividad de una o más enzimas del grupo que consiste en: (a) citrato sintasa, (b) fosfotransacetilasa ; (c) acetato cinasa; (d) lactato deshidrogenasa ; (e) gliceraldehído 3 -fosfato deshidrogenasa, (f) piruvato deshidrogenasa, (g) fosfogluconato deshidratasa, (h) 2-ceto-3-desoxigluconato 6-fosfato aldolasa, (i) fosfofructocinasa, (j) transquetolasa, (k) transaldolasa, (1) ribulosa-5-fosfato-epimerasa y/o (m) ribosa-5 -fosf to epimerasa.
En cualquiera de los aspectos de la presente invención, las células pueden comprender, además, un gen mvaE y un gen mvaS seleccionado del grupo que consiste en: (a) un gen mvaE y un gen vaS de L. grayi; (b) un gen mvaE y un gen mvaS de E. faecium; (c) un gen mvaE y un gen mvaS de E. gallinarum; (d) un gen mvaE y un gen mvaS de E. casseliflavus; y (e) un gen mvaE y un gen mvaS de E. faecalis.
En ciertos aspectos, el o los ácidos nucleicos que codifican uno o más polipéptidos de la ruta del MVA son ácidos nucleicos heterólogos . En otros aspectos, el o los ácidos nucleicos que codifican uno o más polipéptidos de la ruta del MVA son copias de un ácido nucleico endógeno. En cualquiera de los aspectos de la presente invención, uno o más polipéptidos de la ruta del MVA pueden seleccionarse de (a) una enzima que condensa dos moléculas de acetil-CoA para formar acetoacetil-CoA; (b) una enzima que condensa acetoacetil-CoA con acetil-CoA para formar HMG-CoA (por ejemplo, HMG sintasa) ; (c) una enzima que convierte HMG-CoA a mevalonato; (d) una enzima que fosforiza mevalonato a mevalonato 5-fosfato; (e) una enzima que convierte mevalonato 5-fosfato a mevalonato 5-pirofosfato; (f) una enzima que convierte mevalonato 5-pirofosfato a isopentenil pirofosfato; y (g) una enzima que convierte isopentenil pirofosfato a dimetilalil difosfato. En cualquiera de los aspectos de la presente invención, uno o más polipéptidos de la ruta del MVA se seleccionan de (a) una enzima que condensa acetoacetil-CoA con acetil-CoA para formar HMG-CoA (por ejemplo, HMG sintasa) ; (b) una enzima que convierte HMG-CoA a mevalonato; (c) una enzima que fosforiza mevalonato a mevalonato 5-fosfato; (d) una enzima que convierte mevalonato 5-fosfato a mevalonato 5-pirofosfato; y (e) una enzima que convierte mevalonato 5-pirofosfato a isopentenil pirofosfato.
En cualquiera de los aspectos de la presente invención, la enzima que fosforiza mevalonato a mevalonato 5-fosfato se puede seleccionar del grupo que consiste en mevalonato cinasa de M. mazei, polipéptido de mevalonato cinasa de Lactobacillus, polipéptido de mevalonato cinasa de Lactobacillus sakei, polipéptido de mevalonato cinasa de levadura, polipéptido de mevalonato cinasa de Saccharomyces cerevisiae, polipéptido de mevalonato cinasa de Streptococcus, polipéptido de mevalonato cinasa de Streptococcus pneumoniae y polipéptido de mevalonato cinasa de Streptomyces, polipéptido de mevalonato cinasa de Streptomyces CL190 o mevalonato cinasa de M. burtonii. En cualquiera de los aspectos de la presente invención, la enzima que fosforiza mevalonato a mevalonato 5-fosfato es mevalonato cinasa de M. mazei.
En cualquiera de los aspectos de la presente invención, las células recombinantes pueden comprender, además, uno o más ácidos nucleicos que codifican uno o más polipéptidos de la ruta de 1-desoxi-D-xilulosa 5-fosfato (DXP) . En un aspecto, uno o más ácidos nucleicos que codifican uno o más polipéptidos de la ruta de DXP son ácidos nucleicos heterólogos. En otro aspecto, el o los ácidos nucleicos que codifican uno o más polipéptidos de la ruta de DXP son copias de un ácido nucleico endógeno. En otro aspecto, el polipéptido o polipéptidos de la ruta de DXP se seleccionan de (a) l-desoxi-D-xilulosa-5-fosfato sintasa (DXS) , (b) 1-desoxi-D-xilulosa-5-fosfato reductoisomerasa (DXR) , (c) 4-difosfocitidil-2C-metil-D-eritritol sintasa (MCT) , (d) 4-difosfocitidil-2-C-metil-D-eritritol cinasa (C K) , (e) 2C-metil-D-eritritol 2 , 4-ciclodifosfato sintasa (MCS) , (f) 1-hidroxi-2 -metil -2 - (E) -butenil 4-difosfato sintasa (HDS) y (g) l-hidroxi-2-metil-2- (E) -butenil 4-difosfato reductasa (HDR) . En otro aspecto, el polipéptido de la ruta de DXP es DXS.
En cualquiera de los aspectos de la presente invención, el o los ácidos nucleicos heterólogos se colocan bajo un promotor inducible o un promotor constitutivo. En cualquiera de los aspectos de la presente invención, el o los ácidos nucleicos heterólogos se clonan en uno o más plásmidos multicopia. En cualquiera de los aspectos de la presente invención, el o los ácidos nucleicos heterólogos se integran en un cromosoma de las células.
En cualquiera de los aspectos de la presente invención, la célula hospedera recombinante es una célula bacteriana, de algas, fúngica, de levadura o cianobacteriana . En un aspecto, la célula hospedera es una célula bacteriana. En otro aspecto, la célula bacteriana es una célula bacteriana gram positiva o célula bacteriana gram negativa. En otro aspecto, la célula bacteriana se selecciona del grupo que consiste en células de E. coli, L. acidophilus, P. citrea, B. subtilis, B. licheniformis, B. lentus, B. brevis, B. stearothermophilus, B. alkalophilus, B. amyloliquefaciens, B. clausii, B. halodurans, B. megaterium, B. coagulans, B. circulans, B. lautus, B. thuringiensis, S. albus, S. lividans, S. coelicolor, S. griseus, Pseudomonas especie y P. alcaligenes . En otro aspecto, la célula bacteriana es una célula de E. coli. En otro aspecto, la célula bacteriana es una célula de L. acidophilus . En otro aspecto, la célula hospedera es una célula de alga. En otro aspecto, la célula de alga se selecciona del grupo que consiste en algas verdes, algas rojas, glaucofitas, cloraracniofitas , euglénidos, cromistas o dinoflagelados . En otro aspecto, la célula hospedera es una célula fúngica. En otro aspecto, la célula fúngica es un hongo filamentoso. En otro aspecto, la célula hospedera es una célula de levadura. En otro aspecto, la célula de levadura se selecciona del grupo que consiste en la especie Saccharomyces, especie Schizosaccharomyces, especie Pichia o especie Candida. En otro aspecto, la célula de levadura es una célula de Saccharomyces cerevisiae.
En otro aspecto, la presente invención proporciona una célula hospedera recombinante con la capacidad de producir un isoprenoide que comprende uno o más ácidos nucleicos que codifican un polipéptido con la capacidad de sintetizar gliceraldehído 3-fosfato y acetilfosfato a partir de xilulosa 5-fosfato y uno o más ácidos nucleicos que codifican: (a) uno o más ácidos nucleicos que codifican una poliprenil pirofosfato sintasa; y (b) uno o más ácidos nucleicos que codifican uno o más polipéptidos de la ruta del mevalonato ( VA) , en donde cultivar tal célula hospedera recombinante en un medio adecuado permite la producción de tales polipéptidos y la síntesis de uno o más isoprenoides . En un aspecto, el o los ácidos nucleicos que codifican uno o más polipéptidos de la ruta del MVA de (b) es un ácido nucleico heterólogo. En cualquiera de los aspectos de la presente invención, el polipéptido o polipéptidos de la ruta del MVA se seleccionan del grupo que consiste en (a) una enzima que convierte acetoacetil-CoA a HMG-Co-A; (b) una enzima que convierte HMG-CoA a mevalonato; (c) una enzima que fosforiza mevalonato a mevalonato 5-fosfato; (d) una enzima que convierte mevalonato 5-fosfato a mevalonato 5 -pirofosfato; y (e) una enzima que convierte mevalonato 5 -pirofosfato a isopentenil pirofosfato.
En otro aspecto, la presente invención proporciona una célula hospedera recombinante con la capacidad de producir un isoprenoide que comprende uno o más ácidos nucleicos que codifican un polipéptido con la capacidad de sintetizar eritrosa 4 -fosfato y acetilfosfato a partir de fructosa 6-fosfato y uno o más ácidos nucleicos que codifican: (a) uno o más ácidos nucleicos que codifican una poliprenil pirofosfato sintasa; y (b) uno o más ácidos nucleicos que codifican uno o más polipéptidos de la ruta del mevalonato (MVA) , en donde cultivar tal célula hospedera recombinante en un medio adecuado permite la producción de tales polipéptidos y la síntesis de uno o más isoprenoides . En un aspecto, el o los ácidos nucleicos que codifican uno o más polipéptidos de la ruta del MVA de (b) es un ácido nucleico heterólogo. En cualquiera de los aspectos de la presente invención, el polipéptido o polipéptidos de la ruta del MVA se selecciona del grupo que consiste en (a) una enzima que convierte acetoacetil-CoA para formar HMG-Co-A; (b) una enzima que convierte HMG-CoA a mevalonato; (c) una enzima que fosforiza mevalonato a mevalonato 5-fosfato; (d) una enzima que convierte mevalonato 5-fosfato a mevalonato 5-pirofosfato; y (e) una enzima que convierte mevalonato 5-pirofosfato a isopentenil pirofosfato.
En otro aspecto, la presente invención proporciona métodos para producir mevalonato; los métodos comprenden: (a) cultivar una célula hospedera recombinante que comprende uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican (i) un polipéptido que tiene actividad de fosfocetolasa; (ii) y (b) producir mevalonato. En un aspecto, el método comprende, además, recuperar el mevalonato producido por la célula hospedera recombinante. En ciertas modalidades, los métodos permiten la producción de cantidades mayores de mevalonato en comparación con las células productoras de mevalonato que no comprenden el o los ácidos nucleicos heterólogos que codifican un polipéptido que tiene actividad de fosfocetolasa . En ciertas modalidades, la copia o copias de un ácido nucleico heterologo que codifica péptido de fosfocetolasa se seleccionan de Lactobacillus reuteri, Bifidobacterium longum, Ferrimonas baleárica, Pedobactor saltans, Streptomyces griseus y/o Nocardiopsis dassonvillei. En una modalidad, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterologo que codifica una fosfocetolasa aislada de Lactobacillus reuteri. En otra modalidad, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterologo que codifica una fosfocetolasa aislada de Bifidobacterium longum. En otra modalidad adicional, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterologo que codifica una fosfocetolasa aislada de Ferrimonas baleárica . En otra modalidad adicional, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterologo que codifica una fosfocetolasa aislada de Pedojbactor saltans. En otra modalidad, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterologo que codifica una fosfocetolasa aislada de Streptomyces griseus . En otra modalidad adicional, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterologo que codifica una fosfocetolasa aislada de Nocardiopsis dassonvillei .
En otros aspectos, la presente invención proporciona métodos para producir precursores de isoprenoides; los métodos comprenden: (a) cultivar una célula hospedera recombinante que comprende (i) uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican un polipéptido que tiene actividad de fosfocetolasa ; (ii) y uno o más ácidos nucleicos que codifican uno o más polipéptidos de la ruta completa del MVA, y (b) producir un precursor de isoprenoides. En un aspecto, el método comprende, además, recuperar el isoprenoide producido por la célula hospedera recombinante. En ciertas modalidades, los métodos comprenden células recombinantes que producen cantidades mayores de precursores de isoprenoides en comparación con las células productoras de precursores de isoprenoides que no comprenden el o los ácidos nucleicos heterólogos que codifican un polipéptido que tiene actividad de fosfocetolasa . En ciertas modalidades, la copia o copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica péptido de fosfocetolasa se seleccionan de Lactobacillus reuteri, Bifidobacterium longum, Ferrimonas baleárica, Pedobactor saltans, Streptomyces griseus y/o Nocardiopsis dassonvillei . En una modalidad, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica una fosfocetolasa aislada de Lactobacillus reuteri. En otra modalidad, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica una fosfocetolasa aislada de Bifidobacterium longum. En otra modalidad adicional, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica una fosfocetolasa aislada de Ferrimonas bale rica. En otra modalidad adicional, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica una fosfocetolasa aislada de Pedobactor saltans. En otra modalidad, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica una fosfocetolasa aislada de Streptomyces griseus. En otra modalidad adicional, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica una fosfocetolasa aislada de Nocardiopsis dassonvillei .
En otros aspectos adicionales, la presente invención proporciona métodos para producir isopreno; los métodos comprenden: (a) cultivar una célula hospedera recombinante que comprende: (i) uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican un polipéptido que tiene actividad de fosfocetolasa; (ii) uno o más ácidos nucleicos que codifican uno o más polipéptidos de la ruta completa del MVA; y (iii) un ácido nucleico heterólogo que codifica un polipéptido de isopreno sintasa, y (b) producir isopreno. En un aspecto, el método comprende, además, recuperar el isoprenoide producido por la célula hospedera recombinante. En ciertas modalidades, los métodos comprenden células recombinantes con la capacidad de mejorar la producción de isopreno, en donde las células comprenden uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican un polipéptido que tiene actividad de fosfocetolasa y (i) uno o más ácidos nucleicos que codifican uno o más polipéptidos de la ruta completa del MVA y (ii) un ácido nucleico heterólogo que codifica un polipéptido de isopreno sintasa, en donde las células producen cantidades mayores de isopreno en comparación con las células productoras de isopreno que no comprenden el ácido o ácidos nucleicos heterólogos que codifican un polipéptido que tiene actividad de fosfocetolasa . En ciertas modalidades, la copia o copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica péptido de fosfocetolasa se seleccionan de Lactobacillus reuteri, Bifidobacterium longum, Ferrimonas baleárica, Pedobactor saltans, Streptomyces griseus y/o Nocardiopsis dassonvillei . En una modalidad, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica una fosfocetolasa aislada de Lactobacillus reuteri. En otra modalidad, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica una fosfocetolasa aislada de Bifidobacterium longum. En otra modalidad adicional, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica una fosfocetolasa aislada de Ferrimonas baleárica. En otra modalidad adicional, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterologo que codifica una fosfocetolasa aislada de Pedobactor saltans. En otra modalidad, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterologo que codifica una fosfocetolasa aislada de Streptomyces griseus. En otra modalidad adicional, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterologo que codifica una fosfocetolasa aislada de Nocardiopsis dassonvillei .
En otros aspectos adicionales, la presente invención proporciona métodos para producir isoprenoides ; los métodos comprenden: (a) cultivar una célula hospedera recombinante que comprende: (i) uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican un polipéptido que tiene actividad de fosfocetolasa ; (ii) uno o más ácidos nucleicos que codifican uno o más polipéptidos de la ruta completa del MVA; y (iii) un ácido nucleico heterologo que codifica un polipéptido de poliprenil pirofosfato sintasa, y (b) producir un isoprenoide. En un aspecto, el método comprende, además, recuperar el isoprenoide producido por la célula hospedera recombinante. En ciertas modalidades, los métodos comprenden células recombinantes con la capacidad de mejorar la producción de isoprenoides, en donde las células comprenden uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican un polipéptido que tiene actividad de fosfocetolasa y (i) uno o más ácidos nucleicos que codifican uno o más polipéptidos de la ruta completa del MVA y (ii) un ácido nucleico heterólogo que codifica un polipéptido de poliprenil pirofosfato sintasa, en donde las células producen cantidades mayores de isoprenoides en comparación con las células productoras de isoprenoides que no comprenden el ácido o ácidos nucleicos heterólogos que codifican un polipéptido que tiene actividad de fosfocetolasa . En ciertas modalidades, la copia o copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica péptido de fosfocetolasa se seleccionan de Lactobacillus reuteri, Bifidobacterium longum, Ferrimonas baleárica, Pedobactor saltans, Streptomyces griseus y/o Nocardiopsis dassonvillei . En una modalidad, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica una fosfocetolasa aislada de Lactobacillus reuteri. En otra modalidad, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica una fosfocetolasa aislada de Bifidobacterium longum. En otra modalidad adicional, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica una fosfocetolasa aislada de Ferrimonas baleárica . En otra modalidad adicional, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica una fosfocetolasa aislada de Pedobactor saltans. En otra modalidad, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica una fosfocetolasa aislada de Streptomyces griseus. En otra modalidad adicional, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica una fosfocetolasa aislada de Nocardiopsis dassonvillei . En cualquiera de los aspectos de la presente invención, el isoprenoide se selecciona del grupo que consiste en monoterpenos , diterpenos, triterpenos, tetraterpenos, sequiterpeno y politerpeno. En un aspecto, el isoprenoide es un sesquiterpeno . En otro aspecto, el isoprenoide se selecciona del grupo que consiste en abietadieno, amorfadieno, careno, a-fameseno, ß-farneseno, farnesol, geraniol, geranilgeraniol , linalol, limoneno, mirceno, nerolidol, ocimeno, patchoulol, ß-pineno, sabineno, ?-terpineno, terpindeno y valenceno.
En otro aspecto, la presente invención proporciona métodos para producir mevalonato con el uso de cualquiera de las células recombinantes descritas en la presente descripción. En otro aspecto, la presente invención proporciona métodos para producir precursores de isoprenoides con el uso de cualquiera de las células recombinantes descritas en la presente descripción. En otro aspecto, la presente invención proporciona métodos para producir isopreno con el uso de cualquiera de las células recombinantes descritas en la presente descripción. En otro aspecto, la presente invención proporciona métodos para producir precursores de isoprenoides con el uso de cualquiera de las células recombinantes descritas en la presente descripción. En otro aspecto, la presente invención proporciona métodos para producir isoprenoides con el uso de cualquiera de las células recombinantes descritas en la presente descripción.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 representa la ruta metabólica para el metabolismo de glucosa en E. coli. Se representa las reacciones asociadas con la producción de ATP o NADH o el uso, así como las enzimas clave que participan en el flujo de carbono. La abreviatura ' P5P' indica la fuente de metabolitos que consisten en xilulosa 5 fosfato, ribulosa-5 fosfato y ribosa-5 fosfato. La abreviatura ' triosa-3P' indica la fuente de metabolitos que consiste en gliceraldehído 3 fosfato y dihidroxiacetona fosfato.
La Figura 2 representa una ruta metabólica modificada genéticamente con fosfocetolasa (PKT) presente. Las PKT se han clasificado en dos tipos en base a la preferencia del sustrato: fosfocetolasas de xilulosa-5-fosfato (X5P) (EC 4.1.2.9), que únicamente actúan sobre X5P, y fosfocetolasas de xilulosa-5-fosfato/fructosa-6-fosfato (F6P) (EC 4.1.2.22), que actúan tanto sobre X5P como F6P con actividades comparables. El acetilfosfato (Ac-P) formado a partir de F6P y/o X5P en una reacción o reacciones catalizadas con PKT se convierte posteriormente a acetil-CoA para usar en la ruta del VA. Otros productos de una reacción catalizada por PKT, particularmente, gliceraldehído 3-fosfato (GAP) y eritrosa 4-fosfato (E4P) que se producen a partir de X5P y F6P, respectivamente, se pueden reciclar por medio de rutas metabólicas manipuladas para maximizar el rendimiento.
Las Figuras 3A-3C representan las reacciones que incluyen reactantes y productos de fosfocetolasas . Las reacciones fig. 3A y fig. 3B representan las reacciones catalizadas por enzimas fosfocetolasas . La reacción de la fig. 3C representa la conversión de acetil-P a acetil-Coa, que está catalizada por la enzima fosfotransacetilasa (pta) .
La Figura 4 es una tabla que contiene una lista representativa de polipéptidos de fosfocetolasas . Esta tabla es meramente representativa y no pretende ser limitante porque cualquier polipéptido de fosfocetolasas que convierte xilulosa 5-fosfato a gliceraldehído 3-fosfato y acetilfosfato y/o convierte fructosa 6-fosfato a eritrosa 4-fosfato y acetilfosfato se contempla para usar en la presente invención .
La Figura 5 representa una ruta modificada genéticamente en la que la eritrosa 4 fosfato (E4P) y la glucosa-3 fosfato (G3P) que se producen en la reacción catalizada por fosfocetolasa (PKT) se convierten nuevamente a sustratos de PKT por medio de sedoheptulosa-1 , 7 -bisfosfatasa/fructosa-1 , 6 -bisfosfato aldolasa (SFA) y sedoheptulosa-1, 7- bisfosfatasa/fructosa- 1 , 6 -bisfosfato fosfatasa (SFP) . Otras abreviaturas usadas en esta figura indican xilulosa 5 -fosfato (X5P) , sedoheptulosa-1, 7-bisfosfato (S1,7BP), sedoheptulosa-7-fosfato (S7P) , fructosa-1,6 -bisfosfato (F1,6BP), fructosa-6 -fosfato (F6P) , dihidroxiacetona fosfato (DHAP) . X indica las reacciones enzimáticas atenuadas o eliminadas.
La Figura 6 representa el mapa plasmídico de pCMP1090, que expresa fosfocetolasa de Bifidobacterium infantis .
La Figura 7 representa el mapa plasmídico de pCMP1029, que expresa fosfocetolasa de Lactobacillus reuteri .
La Figura 8 representan los resultados de acetil-fosfato intracelular (mM) en la expresión de fosfocetolasa a partir de B. infantis o L. reuteri, y la cepa control.
La Figura 9 representa la curva de crecimiento (determinada como OD en función de tiempo) de las cepas que expresan fosfocetolasa a partir de B. infantis o L. reuteri, y la cepa control .
La Figura 10 representa la concentración de mevalonato (g/1) en los matraces de agitación de cepas que expresan fosfocetolasa a partir de B. infantis o L. reuteri, y la cepa control .
La Figura 11 representa el rendimiento de mevalonato en glucosa que se obtiene por la cepa de expresión de fosfocetolasa (cuadrados negros cerrados) en comparación con la cepa control (diamantes abiertos) en la fermentación de 15 1 con el tiempo. Las cepas se produjeron en las mismas condiciones. El rendimiento global se calculó con el uso de la siguiente fórmula :% en peso del rendimiento en glucosa = mevalonato total (t) /[ (peso del suministro ( 0 ) -peso del suministro (t) +83) *0.59) ] , en donde 0.59 es el% en peso de glucosa en la solución de suministro de glucosa y 83 son los gramos de este suministro en lotes en el agente fermentador a t=0.
La Figura 12 representa el título de mevalonato obtenido por la cepa de expresión de fosfocetolasa (cuadrados negros cerrados) en comparación con la cepa control (diamantes abiertos) en la fermentación de 15 1 con el tiempo. Las cepas se produjeron en las mismas condiciones. El título se calculó con el uso de la siguiente fórmula: título = gramos de mevalonato / litro de caldo fermentador completo.
La Figura 13 representa el índice de productividad celular (CPI, por sus siglas en inglés) , que se obtiene por la cepa de expresión de fosfocetolasa (cuadrados negros cerrados) en comparación con la cepa control (diamantes abiertos) en la fermentación de 15 1 con el tiempo. Las cepas se produjeron en las mismas condiciones. El índice de productividad celular (CPI) se calculó con el uso de la siguiente fórmula: CPI = total de mevalonato en gramos / total de peso seco celular en gramos.
La Figura 14 proporciona una gráfica que muestra que la cantidad de acetato acumulado en el caldo de fermentación fue sustancialmente menor con el uso de la cepa de expresión de fosfocetolasa (cuadrados negros cerrados) en comparación con la cepa control (diamantes abiertos) en la fermentación de 15 1 con el tiempo. Las cepas se produjeron en las mismas condiciones. El acetato se determinó por HPLC y la concentración se reportó con el uso de la siguiente fórmula: [acetato] = gramos de acetato / litro de caldo termentador completo .
La Figura 15 proporciona la secuencia de nucleótidos para la secuencia de ácido nucleico que codifica una fosfocetolasa de Lactobacillus reuteri (sec. con núm. de ident . : 1) .
La Figura 16 proporciona la secuencia de aminoácidos para una enzima de fosfocetolasa de Lactobacillus reuteri (sec. con núm. de ident. :2) .
La Figura 17 proporciona la secuencia de nucleótidos para la secuencia de ácido nucleico que codifica una fosfocetolasa de Bifidobacterium longum (sec. con núm. de ident. :3) .
La Figura 18 proporciona la secuencia de aminoácidos para una enzima de fosfocetolasa de Bifidobacterium longum (sec. con núm. de ident. :4) .
La Figura 19 proporciona la secuencia de aminoácidos para una enzima de aceto-acetil-CoA sintasa de la especie Streptomyces CL190 (sec. con núm. de ident. :5) .
La Figura 20 proporciona la secuencia de nucleótidos para la secuencia de ácido nucleico que codifica mvaE de L. grayi (sec. con núm. de ident.:6) .
La Figura 21 proporciona la secuencia de nucleótidos para la secuencia de ácido nucleico que codifica mvaE de E. faecium (sec. con núm. de ident. :7) .
La Figura 22 proporciona la secuencia de nucleótidos para la secuencia de ácido nucleico que codifica mvaE de E. gallinarum (sec. con núm. de ident.:8) .
La Figura 23 proporciona la secuencia de nucleótidos para la secuencia de ácido nucleico que codifica mvaE de E. casseliflavus (sec. con núm. de ident. :9) .
La Figura 24 proporciona la secuencia de nucleótidos para la secuencia de ácido nucleico que codifica mvaS de L. grayi (sec. con núm. de ident.:10) .
La Figura 25 proporciona la secuencia de nucleótidos para la secuencia de ácido nucleico que codifica mvaS de E. faecium (sec. con núm. de ident. :ll) .
La Figura 26 proporciona la secuencia de nucleótidos para la secuencia de ácido nucleico que codifica mvaS de E. gallinarum (sec. con núm. de ident.:12) .
La Figura 27 proporciona la secuencia de nucleótidos para la secuencia de ácido nucleico que codifica mvaS de E. casseliflavus (sec. con núm. de ident. :13) .
La Figura 28 proporciona la secuencia de nucleótidos para pCMP1090 (sec. con núm. de ident. :15) .
La Figura 29 proporciona la secuencia de nucleótidos para pCMP1029 (sec. con núm. de ident.:16) .
La Figura 30 proporciona la secuencia de ácido nucleico que codifica una fosfocetolasa de E. gallinarum (sec. con núm. de ident . :17) .
La Figura 31 proporciona la secuencia de ácido nucleico que codifica una fosfocetolasa de N. punctiforme (sec. con núm. de ident. :18) .
La Figura 32 proporciona la secuencia de ácido nucleico que codifica una fosfocetolasa de R. palustris (sec. con núm. de iden . : 19) .
La Figura 33 proporciona la secuencia de ácido nucleico que codifica una fosfocetolasa de Pantoea (sec. con núm. de ident. :20) .
La Figura 34 proporciona la secuencia de ácido nucleico que codifica una fosfocetolasa de M. paludis (sec. con núm. de ident . : 21) .
La Figura 35 proporciona la secuencia de ácido nucleico que codifica una fosfocetolasa de T. fusca (sec. con núm. de ident . : 22) .
La Figura 36 proporciona la secuencia de ácido nucleico que codifica una fosfocetolasa de B. breve (sec. con núm. de ident. :23) .
La Figura 37 proporciona la secuencia de ácido nucleico que codifica una fosfocetolasa de R. aquatilís (sec. con núm. de ident . : 24) .
La Figura 38 proporciona la secuencia de ácido nucleico que codifica una fosfocetolasa de B. animalis (sec. con núm. de ident . : 25) .
La Figura 39 proporciona la secuencia de ácido nucleico que codifica una fosfocetolasa de G. vaginalis (sec. con núm. de ident . :26) .
La Figura 40 proporciona la secuencia de ácido nucleico que codifica una fosfocetolasa de S. avermitilis (sec. con núm. de ident. :27) .
La Figura 41 proporciona la secuencia de ácido nucleico que codifica una fosfocetolasa de C. acetobutylicum (sec. con núm. de ident. :28) .
La Figura 42 proporciona la secuencia de ácido nucleico que codifica una fosfocetolasa de L. paraplantarum (sec. con núm. de ident. :29) .
La Figura 43 es una gráfica que muestra la actividad de PKL de B. longum y E. gallinarum en presencia de sustrato de F6P.
La Figura 44 es una gráfica que muestra la actividad de PKL de E. gallinarum en presencia de sustratos de F6P y X5P.
La Figura 45 es una gráfica que muestra la formación de metabolitos por una cepa que expresa PKL de B. longum en 4 presencia de sustrato de S7P.
La Figura 46 es un grupo de gráficas que muestran el rendimiento de MVA por las cepas que expresan PKL de B. longum (E L1319) , PKL de E. gallinarum (EWL1341) , PKL de N. punctiforme (EWL1344), PKL de R. palustris (EWL1347) , PKL de Pantoea (EWL1350) o PKL de T. fusca (EWL1353) en comparación con una cepa control que no expresa PKL (CHL875) .
Las Figuras 47A-47D son series de geles teñidos con Coomasie de SDS-PAGE que muestran la expresión proteica en cepas que expresan fosfocetolasa . Fig. 47A La cepa control CHL875 no expresa PKL y la cepa EWL1319 expresa PKL de B . longum, Fig. 47B la cepa EWL1341 expresa PKL de E. gallinarum y la cepa E L1344 expresa PKL de N. punctiforme, Fig. 47C la cepa EWL1347 expresa PKL de R. palustris y la cepa EWL1350 expresa PKL de Pantoea y Fig. 47D la cepa EWL1353 expresa PKL de T. fusca con inducción de IPTG cada vez mayor.
Las Figuras 48A-48C es una gráfica que muestra la expresión proteica y el rendimiento de MVA por una cepa que expresa PKL de B. longum. Fig. 48A Rendimiento de MVA por una cepa productora de MVA que expresa PKL de B. longum (cuadrado cerrado) en comparación con una cepa control productora de MVA que no expresa PKL (diamantes cerrados) con una inducción de IPTG cada vez mayor. Fig. 48B Expresión proteica de PKL de B. longum en la fracción soluble de lisados celulares completos a partir de la cepa EWL1319. Fig. 48C Expresión proteica de PKL de 23. longum en la fracción insoluble de lisados celulares completos a partir de la cepa EWL1319.
Las Figuras 49A-49B contienen un gel teñido con Coomaise de SDS-PAGE y las gráficas muestran la expresión proteica y el rendimiento de VA por una cepa que expresa PKL de E. gallinarum. Fig. 9A Rendimiento de MVA por una cepa productora de MVA que expresa PKL de E. gallinarum (cuadrado cerrado) en comparación con una cepa control productora de MVA que no expresa PKL (diamantes cerrados) con una inducción de IPTG cada vez mayor. Fig. 49B Expresión proteica en lisados celulares completos a partir de la cepa EWL1341 que expresa E. gallinarum.
Las Figuras 50A-50B contienen un gel teñido con Coomaise de SDS-PAGE y la gráfica muestra la expresión proteica y el rendimiento de MVA por una cepa que expresa PKL de C. acetojbutylicum. Fig. 50A Rendimiento de MVA por una cepa productora de MVA que expresa PKL de C. acetobutylicum (cuadrado cerrado) en comparación con una cepa control productora de MVA que no expresa PKL (diamantes cerrados) con una inducción de IPTG cada vez mayor. Fig. 50B Expresión proteica en lisados celulares completos a partir de la cepa EWL1341 que expresa C. acetobutylicum.
La Figura 51 es una gráfica que muestra el rendimiento acumulativo de MVA en glucosa que se obtiene por una cepa que expresa PKL de C. acetobutylicum en cada fermentación de 15 1 con el tiempo. El círculo cerrado indica el segmento 20121058: EWL1359 inducido a 400 µ? de IPTG; el símbolo x indica el segmento 20121057: EWL1359 inducido a 100 µ? de IPTG; el triángulo abierto indica el segmento 20121056: EWL1359 sin adición de IPTG; y el diamante abierto indica el segmento 20121059: CHL875 inducido a 100 µ? de IPTG.
La Figura 52 es una gráfica que muestra el rendimiento acumulativo de MVA en glucosa que se obtiene por una cepa que expresa PKL de E. gallinarum en cada fermentación de 15 1 con el tiempo. El cuadrado cerrado indica 20120979: EWL1341 inducido a 100 µ? de IPTG; el símbolo x indica el segmento 20120978: EWL1341 inducido a 50 uM de IPTG; el cuadrado abierto indica el segmento 20120977: EWL1341 sin adición de IPTG; el diamante abierto indica el segmento 20120976: CHL875 sin adición de IPTG; y el diamante cerrado indica el segmento 20120821: CHL875 sin adición de IPTG.
La Figura 53 es una gráfica que muestra el rendimiento acumulativo de MVA en glucosa que se obtiene por una cepa que expresa PKL de E. gallinarum o PKL de C. acetojbu ylicum que se representa en comparación con la cantidad de IPTG agregada. Los triángulos cerrados indican la cepa EWL1359. Los cuadrados cerrados indican la cepa EWL1341. Los diamantes abiertos indican la cepa CHL875.
La Figura 54 es una gráfica que muestra el rendimiento acumulativo de MVA en glucosa que se obtiene por una cepa que expresa PKL de E. gallinarum o PKL de C. acetobutylicum que se representa en comparación con la actividad de fosfocetolasa . Los triángulos cerrados indican la cepa EWL1359. Los cuadrados cerrados indican la cepa EWL1341. Los diamantes abiertos indican la cepa CHL875.
La Figura 55 es una gráfica que muestra el índice de desempeño celular que se obtiene por una cepa que expresa PKL de C. acetobutylicum en cada fermentación de 15 1 con el tiempo. El círculo cerrado indica el segmento 20121058: EWL1359 inducido a 400 µ? de IPTG; el símbolo x indica el segmento 20121057: EWL1359 inducido a 100 µ? de IPTG; el triángulo abierto indica el segmento 20121056: EWL1359 sin adición de IPTG; y el diamante abierto indica el segmento 20121059: CHL875 inducido a 100 µ? de IPTG.
La Figura 56 es una gráfica que muestra el índice de desempeño celular que se obtiene por una cepa que expresa PKL de E. gallinarum en cada fermentación de 15 1 con el tiempo. El cuadrado cerrado indica 20120979: EWL1341 inducido a 100 µ? de IPTG; el símbolo x indica el segmento 20120978: EWL1341 inducido a 50 µ? de IPTG; el cuadrado abierto indica el segmento 20120977: EWL1341 sin adición de IPTG; el diamante abierto indica el segmento 20120976: CHL875 sin adición de IPTG; y el diamante cerrado indica el segmento 20120821: CHL875 sin adición de IPTG.
La Figura 57 representa el mapa plasmídico de pEWL1418 que expresa fosfocetolasa de B. longum y variante de isopreno sintasa de P. alba.
La Figura 58 representa el mapa plasmídico de pEWL1421 que expresa fosfocetolasa de E. gallinarum y variante de isopreno sintasa de P. alba.
La Figura 59 representa el mapa plasmídico de pEWL1438 que expresa fosfocetolasa de E. gallinarum, variante de isopreno sintasa de P. alba y mevanolato cinasa de M. mazei.
La Figura 60 representa el mapa plasmídico de pEWL1436 que expresa fosfocetolasa de C. acetobutylicum y variante de isopreno sintasa de P. alba.
La Figura 61 representa el mapa plasmídico de pEWL1440 que expresa fosfocetolasa de C. acetobutylicum, variante de isopreno sintasa de P. alba y mevanolato cinasa de M. mazei.
Las Figuras 62A-62B son grupos de gráficas que muestran el rendimiento de isopreno por las cepas que expresan fosfocetolasa . Fig. 62A Rendimiento de isopreno por las cepas que expresan PKL de B. longum (cepa EWL1427) o PKL de E. gallinarum (cepa EWL1430) . Fig. 62B Rendimiento de isopreno por las cepas que expresan PKL de C. acetojbutylicum (EWL1446) . La cepa control CM2158 no expresa PKL.
Las Figuras 63A-63B son series de geles teñidos con Coomasie de SDS-PAGE que muestran la expresión proteica inducida por IPTG. Fig. 63A Cepas que expresan PKL de B . longum (EWL1427) o PKL de E. gallinarum (EWL1430) . Fig. 63B Cepas que expresan PKL de C. acetobutylicum (EWL1446) . La cepa control MCM2158 no expresa PKL.
Las Figuras 64A-64B incluyen un gel teñido con Coomaise de SDS-PAGE y las gráficas muestran la expresión proteica y el rendimiento de isopreno por las cepas que expresan una PKL. Fig. 64A) Rendimiento de isopreno por una cepa productora de isopreno que expresa PKL de E. gallinarum (cepa EWL1449) o PKL de C. acetojutylicum (EWL1452) en comparación con una cepa control productora de MVA que no expresa PKL (cepa DW719) con una inducción de IPTG cada vez mayor. Fig. 64B Expresión proteica en lisados celulares completos a partir de la cepa EWL1452 y E L1449.
La Figura 65 es una gráfica que muestra el rendimiento acumulativo de isopreno en glucosa que se obtiene por las cepas que expresan PKL de B. longum (cepa EWL1427) o PKL de E. gallinarum (cepa EWL1430) en cada fermentación de 15 1 con el tiempo. El triángulo cerrado indica el segmento 20121136: EWL1430 inducido a 100 µ? de IPTG; el cuadrado cerrado indica el segmento 20121135: EWL1427 inducido a 100 µ? de IPTG; y el diamante abierto indica 20121134: MCM2158 inducido a 100 µ? de IPTG.
La Figura 66 es una gráfica que muestra el rendimiento instantáneo de isopreno en glucosa que se obtiene por las cepas que expresan PKL de B . longum (cepa E L1427) o PKL de E. gallinarum (cepa EWL1430) en cada fermentación de 15 1 con el tiempo. El triángulo abierto indica el segmento 20121136: EWL1430 inducido a 100 µ? de IPTG; el cuadrado abierto indica el segmento 20121135: EWL1427 inducido a 100 µ? de IPTG; y el diamante abierto indica 20121134: MCM2158 inducido a 100 µ de IPTG.
La Figura 67 es una gráfica que muestra el índice de desempeño celular que se obtiene por una cepa que expresa PKL de B. longum (cepa EWL1427) o PKL de E. gallinarum (cepa EWL1430) en cada fermentación de 15 1 con el tiempo. El triángulo cerrado indica el segmento 20121136: EWL1430 inducido a 100 µ? de IPTG; el cuadrado cerrado indica el segmento 20121135: EWL1427 inducido a 100 µ? de IPTG; y el diamante abierto indica el segmento 20121134: MCM2158 inducido a 100 µ? de IPTG. gDCW indica el peso seco celular total en gramos .
Las Figuras 68A-68B son series de gráficas que muestran la actividad in vitro de PKL de E. gallinarum. Fig. 68A Productividad específica de AcP in vitro. Fig. 68B Actividad específica de PKL in vitro.
Las Figuras 69A-69B son series de gráficas que muestran la actividad in vitro de PKL de C. acetobutylicum. Fig. 69A Productividad específica de AcP in vitro. Fig. 69B Actividad específica de PKL in vitro.
La Figura 70 es una gráfica que muestra la productividad específica de AcP in vitro en cepas productoras de isopreno que expresan PKL de B. longum o PKL de E. gallinarum.
La Figura 71 es una gráfica que muestra la actividad de PKL in vitro en cepas productoras de isopreno que expresan PKL de B. longum o PKL de E. gallinarum.
La Figura 72 es un diagrama que representa las mutaciones de células hospederas que, preferentemente, se regulan a la alta para incrementar el flujo de carbono a través de la ruta de fosfocetolasas . Los genes de interés para modular el flujo de carbono incluyen moduribosa-5-fosfato isomerasa A (rpiA) , D-ribulosa-5-fosfato 3-epimerasa (rpe) , transquetolasa A (tktA) , transaldolasa B (tal B) y/o fosfato acetiltransferasa (pta) .
La Figura 73 es un diagrama que representa mutaciones de células hospederas que, preferentemente, se regulan a la baja para incrementar el flujo de carbono a través de la ruta de fosfocetolasas . Los genes de interés para modular el flujo de carbono incluyen glucosa-6 -fosfato deshidrogenasa (zwf) , 6-fosfofructocinasa-1 (pfkA) , fructosa bisfosfato aldolasa (fba) , gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa A (gapA) , acetato cinasa (ackA) , citrato sintasa (gltA) y/o el operón pts .
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención proporcionada en la presente descripción describe, entre otros, composiciones y métodos para producir mevalonato, moléculas precursoras de isoprenoides, isopreno y/o isoprenoides en células recom inantes que se han sometido a ingeniería genética para expresar un polipéptido de fosfocetolasas . Las enzimas fosfocetolasas de la presente invención pueden usar diversos sustratos, como se describirá detalladamente posteriormente. En ciertas modalidades, la presente invención proporciona composiciones y métodos para producir mevalonato, moléculas precursoras de isoprenoides, isopreno y/o isoprenoides en células recombinantes que se han sometido a ingeniería genética para expresar un polipéptido de fosfocetolasas con la capacidad de catalizar la conversión de xilulosa 5-fosfato a gliceraldehído 3-fosfato y acetilfosfato . En otras modalidades, la presente invención proporciona composiciones y métodos para producir mevalonato, moléculas precursoras de isoprenoides, isopreno y/o isoprenoides en células recombinantes que se han sometido a ingeniería genética para expresar un polipéptido de fosfocetolasas con la capacidad de catalizar la conversión de fructosa 6-fosfato a eritrosa 4-fosfato y acetilfosfato. En otras modalidades adicionales, la presente invención proporciona composiciones y métodos para producir mevalonato, moléculas precursoras de isoprenoides, isopreno y/o isoprenoides en células recombinantes que se han sometido a ingeniería genética para expresar un polipéptido de fosfocetolasas con la capacidad de catalizar la conversión de sedoheptulosa-7-fosfato a ribosa-5-fosfato y acetilfosfato . En otras modalidades adicionales, la presente invención proporciona composiciones y métodos para producir mevalonato, moléculas precursoras de isoprenoides , isopreno y/o isoprenoides en células recombinantes que se han sometido a ingeniería genética para expresar un polipéptido de fosfocetolasas con la capacidad de catalizar la conversión de xilulosa 5-fosfato a gliceraldehído 3-fosfato y acetilfosfato y/o la conversión de fructosa 6 -fosfato a eritrosa -fosfato y acetilfosfato y/o la conversión de sedoheptulosa-7 -fosfato a ribosa-5-fosfato y acetilfosfato .
Se ha usado fosfocetolasa expresada de manera recombinante para modificar rutas metabólicas en células hospederas. Ver la patente de los Estados Unidos núm. 7,785,858. Sonderegger et al. (Applied and Environmental Microbiology, 2004, 70:5, 2892-97) describen el uso de fosfocetolasa en Saccharomyces cerevisiae para la sobreproducción de etanol . Fleige et al. (Appl Microbial Biotechnol . , 2011, 91:3, 769-76) describen la expresión de un gen de bifidobacterium fosfocetolasa (Meile et al., supra) en una cepa modificada de Ralstonia eutropha que restauró la capacidad del organismo de usar fructosa como una única fuente de carbono para crecimiento. Sin embargo, el uso de una fosfocetolasa para incrementar el flujo de carbono en la ruta del mevalonato no se ha descrito.
La ruta biosintética dependiente de mevalonato es particularmente importante para la producción del mevalonato y otras moléculas precursoras de isoprenoides, por ejemplo, dimetilalil difosfato (DMAPP) e isopentenil pirofosfato (IPP) . Las enzimas de la ruta de mevalonato superior convierten acetil CoA, producido a partir de glucosa, a mevalonato por medio de tres reacciones enzimáticas. Sin limitarse a la teoría, se cree que la biosíntesis incrementada de acetil CoA con el uso de un polipéptido de fosfocetolasas puede resultar en una productividad incrementada de la ruta biosintética dependiente de mevalonato superior que incrementa sustancialmente la biosíntesis de mevalonato y, por lo tanto, de moléculas precursoras de isoprenoides corriente abajo, tales como DMAPP y IPP. Por lo tanto, el rendimiento incrementado de la producción de mevalonato por medio de esta ruta alterna es favorable para aplicaciones comerciales.
Teóricamente, tres moléculas de acetil-CoA pueden derivarse de una sola molécula de glucosa en una reacción balanceada. Sin embargo, los organismos producen, típicamente, únicamente hasta dos moléculas de acetil-CoA y la masa restante se pierde como C02. La liberación de C02 se produce durante la formación de acetil-CoA a partir de piruvato, una reacción catalizada por piruvato deshidrogenasa . La pérdida de un átomo de carbono resulta en menores rendimientos de producción de moléculas de mevalonato, precursores de isoprenoides , isopreno e isoprenoides . Una excepción a esta pérdida de la reacción es la ruta de Wood-Ljungdahl , la cual depende de las enzimas monóxido de carbono deshidrogenasa y acetil-CoA sintasa para reducir el dióxido de carbono a acetil-CoA en acetogenes anaerobios .
La presente invención proporciona un proceso metabólico alterno que puede producir potencialmente tres moléculas de acetil-CoA a partir de una molécula de glucosa con el uso de una ruta que no depende de las enzimas de la ruta de Wood-Ljungdahl. En cambio, usa una enzima fosfocetolasa que se encuentra en ciertos organismos, particularmente, entre bifidobacterias [ver, por ejemplo, Biology of the Prokaryotes (ed. Lengeler, Drews and Schlegel) ; Blackwell Science, New York, 1999, págs . 299-301; Meile et al., J. of Bacteriology, 2001, 183:9, 2929-36; Jeong et al., J. Microbiol. Biotechnol., 2007, 17:5, 822-829]. Las enzimas fosfocetolasas permiten la formación de acetil-CoA (por medio de acetil-fosfato) a partir de xilulosa 5-fosfato o fructosa 6-fosfato y no por oxidación de piruvato como en el metabolismo típico.
Las fosfocetolasas se han clasificado en dos tipos en base a su preferencia de sustrato: xilulosa-5-fosfato (X5P) fosfocetolasas, que actúan únicamente en X5P, y X5P/f uctosa-6 -fosfato (F6P) fosfocetolasas , que pueden actuar tanto en X5P como en F6P (Suzuki et al., Acta Cryst. F66, 2010, 66:8, 941-43) . Las fosfocetolasas catalizan el clivaje de X5P o F6P con el uso de fosfato inorgánico (Pi) para producir acetilfosfato (acetil-P) , H20 y gliceraldehído 3-fosfato o eritrosa 4-fosfato. El metabolito de alta energía acetil-P se convierte posteriormente a ácido acético por acetato cinasa para producir ATP a partir de ADP en la ruta. Además de acetil-fosfato, el gliceraldehído 3-fosfato producido a partir de la reacción enzimática se puede reciclar por medio de rutas metabólicas manipuladas para lograr el rendimiento máximo de 3 acetil-CoA por glucosa. Significativamente, la producción de acetil-CoA por fosfocetolasa elimina la pérdida de carbono (por ejemplo, C02) como se observó de las reacciones mediadas por piruvato deshidrogenasa .
Como se describe detalladamente en la presente descripción, las fosfocetolasas pueden actuar, además, con sedoheptulosa-7-fosfato para convertirlo a ribosa-5-fosfato y acetilfosfato . Un ejemplo no limitante de tal fosfocetolasa es fosfocetolasa de Bifidobacterium longum, la cual tiene actividad catalítica con sedoheptulosa- 7- fosfato.
La presente invención está dirigida al uso de enzimas fosfocetolasas para producir mevalonato, precursores de isoprenoides , isopreno y/o isoprenoides para mejorar el rendimiento del producto. Particularmente, el rendimiento teórico del producto de isopreno se mejora como se representa por medio de las siguientes ecuaciones balanceadas (suponiendo un organismo tiene la capacidad de producir ATP a partir de la oxidación completa de 1 mol de glucosa hasta 6 moles de C02) : Ruta del MVA únicamente 1.5 de glucosa + 2.00 de 02 1.00 de isopreno + 4.00 de C02 + 5.00 de H20 Rendimiento teórico - 0.252 g de isopreno/g de glucosa Ruta de DXP 1.25 de glucosa + 0.50 de 02 1.00 de isopreno + 2.50 de C02 + 3.50 de H20 Rendimiento teórico - 0.302 g de isopreno/g de glucosa Rutas MVA + fosfocetolasa 1.22 de glucosa + 0.33 de 02 -> 1.00 de isopreno + 2.33 de C02 + 3.32 de H20 Rendimiento teórico - 0.309 g de isopreno/g de glucosa Por lo tanto, en ciertos aspectos, la presente invención proporciona células recombinantes con la capacidad de mejorar la producción de mevalonato, en donde las células comprenden uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican un polipéptido que tiene actividad de fosfocetolasa y uno o más ácidos nucleicos que codifican uno o más polipéptidos de la ruta del MVA superior, en donde las células producen cantidades mayores de mevalonato en comparación con células que no comprenden el o los ácidos nucleicos heterólogos que codifican un polipéptido que tiene actividad de fosfocetolasa .
En otros aspectos, la presente invención proporciona células recombinantes con la capacidad de mejorar la producción de precursores de isoprenoides , en donde las células comprenden uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican un polipéptido que tiene actividad de fosfocetolasa y uno o más ácidos nucleicos que codifican uno o más polipéptidos de la ruta completa del MVA, en donde las células producen cantidades mayores de precursores de isoprenoides en comparación con células que no comprenden el ácido o ácidos nucleicos heterólogos que codifican un polipéptido que tiene actividad de fosfocetolasa .
En otros aspectos adicionales, la presente invención proporciona células recombinantes con la capacidad de producir isopreno, en donde las células comprenden uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican un polipéptido que tiene actividad de fosfocetolasa y (i) uno o más ácidos nucleicos que codifican uno o más polipéptidos de la ruta completa del MVA y (ii) un ácido nucleico heterólogo que codifica un polipéptido de isopreno sintasa, en donde las células tienen la capacidad de producir cantidades recuperables de isopreno. En ciertas modalidades, la presente invención proporciona células recombinantes con la capacidad de mejorar la producción de isopreno, en donde las células comprenden uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican un polipéptido que tiene actividad de fosfocetolasa y (i) uno o más ácidos nucleicos que codifican uno o más polipéptidos de la ruta completa del MVA y (ii) un ácido nucleico heterólogo que codifica un polipéptido de isopreno sintasa, en donde las células producen cantidades mayores de isopreno en comparación con las células productoras de isopreno que no comprenden el ácido o ácidos nucleicos heterólogos que codifican un polipéptido que tiene actividad de fosfocetolasa .
En otros aspectos adicionales, la presente invención proporciona células recombinantes con la capacidad de producir isoprenoides , en donde las células comprenden uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican un polipéptido que tiene actividad de fosfocetolasa y (i) uno o más ácidos nucleicos que codifican uno o más polipéptidos de la ruta completa del MVA y (ii) un ácido nucleico heterólogo que codifica un polipéptido de poliprenil pirofosfato sintasa, en donde las células tienen la capacidad de producir cantidades recuperables de isoprenoides. En ciertas modalidades, la presente invención proporciona células recombinantes con la capacidad de mejorar la producción de isoprenoides, en donde las células comprenden uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican un polipéptido que tiene actividad de fosfocetolasa y (i) uno o más ácidos nucleicos que codifican uno o más polipéptidos de la ruta completa del MVA y (ii) un ácido nucleico heterólogo que codifica un polipéptido de poliprenil pirofosfato sintasa, en donde las células producen cantidades mayores de isoprenoides en comparación con las células productoras de isoprenoides que no comprenden el ácido o ácidos nucleicos heterólogos que codifican un polipéptido que tiene actividad de fosfocetolasa .
En cualquiera de los aspectos de la presente invención, la presente invención proporciona células recombinantes , en donde las células comprenden uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican un polipéptido que tiene actividad de fosfocetolasa y pueden modificarse genéticamente aún más para modular la actividad de uno o más de los siguientes genes que incluyen ribosa-5-fosfato isomerasa {rpiA y/o rpiB) , D-ribulosa-5-fosfato 3-epimerasa {rpe) , transquetolasa (tktA y/o tktB) , transaldolasa B (tal B) , fosfato acetiltransferasa (pta y/o eutD) , glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (zwf) , 6 - fosfofructocinasa-1 (pfkA y/o pfkB), fructosa bisfosfato aldolasa (fba, fbaA, fbaB y/o fbaC) , gliceraldehído-3 - fosfato deshidrogenasa (gapA y/o gapB) , acetato cinasa (ackA) , citrato sintasa (gltA) , El {ptsl) , EIICBGlc (ptsG) , EIIAGlc (crr) y/o HPr (ptsH) para mejorar el flujo de carbono por medio de la ruta de fosfocetolasas .
En algunas modalidades, la presente invención proporciona células recombinantes con la capacidad de producir isopreno, en donde las células comprenden uno o más ácidos nucleicos heterologos que codifican un polipéptido que tiene actividad de fosfocetolasa y (i) uno o más ácidos nucleicos que codifican uno o más polipéptidos de la ruta completa del MVA, (ii) un ácido nucleico heterólogo que codifica un polipéptido de isopreno sintasa, y (iii) se modifican genéticamente aún más para modular la actividad de Uno o más genes para incrementar el flujo de carbono por medio de la ruta de fosfocetolasas , en donde las células producen cantidades mayores de isopreno en comparación con las células productoras de isopreno que no comprenden el ácido o ácidos nucleicos heterologos que codifican un polipéptido que tiene actividad de fosfocetolasa .
En algunas modalidades, la presente invención proporciona células recombinantes con la capacidad de producir isoprenoides , en donde las células comprenden uno o más ácidos nucleicos heterologos que codifican un polipéptido que tiene actividad de fosfocetolasa y (i) uno o más ácidos nucleicos que codifican uno o más polipéptidos de la ruta completa del MVA, (ii) un ácido nucleico heterólogo que codifica un polipéptido de isopreno sintasa, (iii) se puede modificar genéticamente aún más para modular la actividad de uno o más genes para incrementar el flujo de carbono por medio de la ruta de fosfocetolasas , y (iv) un ácido nucleico heterólogo que codifica un polipéptido de poliprenil pirofosfato sintasa, en donde las células producen cantidades mayores de isoprenoides en comparación con las células productoras de isoprenoides que no comprenden el ácido o ácidos nucleicos heterologos que codifican un polipéptido que tiene actividad de fosfocetolasa .
Técnicas generales La práctica de la presente invención usará, a menos que se indique de otra manera, técnicas convencionales de biología molecular (que incluyen técnicas recombinantes) , microbiología, biología celular, bioquímica e inmunología, las cuales se encuentran dentro de las capacidades de la técnica. Tales técnicas se explican completamente en la literatura, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" , segunda edición (Sambrook et al., 1989); "Oligonucleotide Synthesis" (M. J. Gait, ed., 1984); "Animal Cell Culture" (R. I. Freshney, ed. , 1987); "Methods in Enzymology" (Academic Press, Inc.); "Current Protocols in Molecular Biology" (F. M. Ausubel et al., eds . , 1987, y actualizaciones periódicas) ,-"PCR: The Polymerase Chain Reaction" , (Mullis et al., eds., 1994). Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2.° ed. , J. Wiley & Sons (New York, N.Y. 1994) y March, Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanis s and Structure, 4.° ed., John Wiley & Sons (New York, N.Y. 1992) y proporcionan a una persona con experiencia en la técnica una guía general de muchos de los términos usados en la presente solicitud.
Definiciones El término "isopreno" se refiere a 2-metil-l, 3-butadieno (CAS núm. 78-79-5) . Puede ser el producto de hidrocarburo de C5 volátil directo y final de la eliminación de pirofosfato a partir de 3 , 3 -dimetilalil difosfato (DMAPP) . Puede no incluir el enlace o polimerización de moléculas de IPP a moléculas de DMAPP. El término "isopreno" no pretende, generalmente, limitarse a su método de producción, a menos que se indique de otra manera en la presente descripción.
Como se usa en la presente descripción, el término "polipéptidos" incluye polipéptidos, proteínas, péptidos, fragmentos de polipéptidos, y polipéptidos de fusión.
Como se usa en la presente descripción, un "polipéptido aislado" no es parte de una biblioteca de polipéptidos, tal como una biblioteca de 2, 5, 10, 20, 50 o más polipéptidos diferentes y se separa de por lo menos un componente con el cual se produce en la naturaleza. Un polipéptido aislado puede obtenerse, por ejemplo, al expresar un ácido nucleico recombinante que codifica el polipéptido.
"Polipéptido heterólogo" se refiere a un polipéptido codificado por una secuencia de ácido nucleico derivado de un organismo, especie o cepa diferente a la célula hospedera. En algunas modalidades, un polipéptido heterólogo no es idéntico a un polipéptido silvestre que no se encuentra en la misma célula hospedera en la naturaleza.
Como se usa en la presente descripción, un "ácido nucleico" se refiere a dos o más desoxirribonucleótidos y/o ribonucleótidos unidos covalentemente ya sea en forma de cadena sencilla o doble. "Ácido nucleico recombinante" se refiere a un ácido nucleico de interés que se encuentra libre de uno o más ácidos nucleicos (por ejemplo, genes) que, en el genoma que se produce de naturaleza del organismo del cual se deriva el ácido nucleico de interés, flanquean el ácido nucleico de interés. Por lo tanto, el término incluye, por ejemplo, un ADN recombinante que se incorpora en un vector, en un plásmido o virus en replicación autónoma o en el ADN genómico de un organismo procariota o eucariota o que existe como una molécula separada (por ejemplo, un ADNc, un fragmento de ADN genómico o un fragmento de ADNc producido por PCR o por digestión de endonucleasas de restricción) independiente de otras secuencias. "Ácido nucleico heterólogo" se refiere a una secuencia de ácido nucleico derivada de un organismo, especie o cepa diferente a la célula hospedera. En algunas modalidades, el ácido nucleico heterólogo no es idéntico a un ácido nucleico silvestre que se encuentra en la misma célula hospedera en la naturaleza. Por ejemplo, un ácido nucleico codificado por el gen de fosfocetolasa a partir de Lactobacillus reuteri, Bifidobacterium longum, Ferrimonas baleárica, Pedobactor saltans, Streptomyces griseus y/o Nocardiopsis dassonvillei y usado para transformar un E. coli es un ácido nucleico heterólogo .
Como se usa en la presente descripción, los términos "fosfocetolasa" , "enzima fosfocetolasa" o "polipéptido de fosfocetolasas" se usan indistintamente y se refieren a un polipéptido que convierte 5-fosfato a gliceraldehído 3-fosfato y acetilfosfato y/o convierte fructosa 6-fosfato a eritrosa -fosfato y acetilfosfato . Generalmente, las fosfocetolasas actúan con acetosas. En ciertas modalidades, el polipéptido de fosfocetolasas cataliza la conversión de xilulosa 5-fosfato a gliceraldehído 3-fosfato y acetilfosfato . En otras modalidades, el polipéptido de fosfocetolasas cataliza la conversión de fructosa 6-fosfato a eritrosa 4-fosfato y acetilfosfato . En otras modalidades, el polipéptido de fosfocetolasas cataliza la conversión de sedoheptulosa-7-fosfato a un producto (por ejemplo, ribosa-5-fosfato) y acetilfosfato .
Como se usa en la presente descripción, una "secuencia control de expresión" se refiere a una secuencia de ácido nucleico que dirige la transcripción de un ácido nucleico de interés. Una secuencia control de expresión puede ser un promotor, tal como un promotor constitutivo o un promotor inducible, o un potenciador. Una secuencia control de expresión puede ser "natural" o heteróloga. Una secuencia control de expresión natural se deriva del mismo organismo, especie o cepa que el gen que se expresa. Una secuencia control de expresión heteróloga se deriva de una organismo, especie o cepa diferente al gen que se expresa. Un "promotor inducible" es un promotor que es activo bajo regulación ambiental o de desarrollo.
La frase "unida operativamente" se refiere a un enlace funcional entre una secuencia control de expresión de ácido nucleico (tal como un promotor) y una segunda secuencia de ácido nucleico, en donde la secuencia control de expresión dirige la transcripción del ácido nucleico correspondiente a la segunda secuencia.
Como se usa en la presente descripción, los términos "medio mínimo" o "medios mínimos" se refieren a los medios de crecimiento que contienen los mínimos nutrientes posibles para crecimiento celular, generalmente, sin la presencia de aminoácidos. El medio mínimo contiene, típicamente: (1) una fuente de carbono para crecimiento bacteriano; (2) diversas sales, las cuales pueden variar entre las especies bacterianas y las condiciones de crecimiento; y (3) agua. La fuente de carbono puede variar significativamente desde azúcares simples, como glucosa, hasta hidrolisatos más complejos de otra biomasa, tales como extracto de levadura, como se describe detalladamente a continuación. Las sales proporcionan, generalmente, elementos esenciales, tales como magnesio, nitrógeno, fósforo y azufre, para permitir que las células sinteticen proteínas y ácidos nucleicos. El medio mínimo puede, además, estar suplementado con agentes selectivos, tales como antibióticos, para seleccionar para el mantenimiento de ciertos plásmidos y similares. Por ejemplo, si un microorganismo es resistente a cierto antibiótico, tal como ampicilina o tetraciclina, entonces ese antibiótico se puede agregar al medio para prevenir que las células que carecen de resistencia crezcan. El medio puede estar suplementado con otros compuestos como sea necesario para seleccionar las características fisiológicas o bioquímicas deseadas, tales como aminoácidos particulares y similares.
Como se usa en la presente descripción, el término "isoprenoide" se refiere a una amplia y diversa clase de compuestos orgánicos de origen natural compuestos de dos o más unidades de hidrocarburos, en donde cada unidad consiste de cinco átomos de carbono dispuestos en un patrón específico. Como se usa en la presente descripción, el término "isopreno" se excluye expresamente de la definición de "isoprenoide" .
Como se usa en la presente descripción, el término "terpenoide" se refiere a una amplia y diversa clase de moléculas orgánicas derivadas de unidades de isoprenoides de cinco carbonos ensambladas y modificadas en una gran variedad de maneras y clasificadas en grupos en base a la cantidad de unidades de isoprenoides usada en los miembros del grupo. Los hemiterpenoides tienen una unidad de isoprenoides. Los monoterpenoides tienen dos unidades de isoprenoides. Los sesquiterpenoides tienen tres unidades de isoprenoides. Los diterpenoides tienen cuatro unidades de isopreno. Los sesterterpenoides tienen cinco unidades de isoprenoides. Los triterpenoides tienen seis unidades de isoprenoides. Los tetraterpenoides tienen ocho unidades de isoprenoides. Los politerpenoides tienen más de ocho unidades de isoprenoides.
Como se usa en la presente descripción, "precursor de isoprenoides" se refiere a cualquier molécula que usan los organismos en la biosíntesis de terpenoides o isoprenoides. Los ejemplos no limitantes de moléculas precursoras de isoprenoides incluyen, por ejemplo, mevalonato (por ejemplo, ácido mevalónico (MVA) ) , isopentenil pirofosfato (IPP) y dimetilalil difosfato (DMAPP) .
Como se usa en la presente descripción, el término "rendimiento de masa" se refiere a la masa del producto que producen las células recombinantes dividida por la masa de la glucosa consumida por las células recombinantes y se expresa como porcentaj e .
"Productividad específica" se refiere a la masa del producto que produce la célula recombinante dividida por el producto del tiempo para la producción, la densidad celular y el volumen del cultivo.
"Título" se refiere a la masa del producto que producen las células recombinantes dividida por el volumen del cultivo.
Como se usa en la presente descripción, el término "índice de productividad celular (CPI)" se refiere a la masa del producto que producen las células recombinantes dividida por la masa de las células recombinantes producida en el cultivo.
A menos que se defina de otra manera en la presente descripción, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente descripción tienen el mismo significado que comprende comúnmente una persona con experiencia en la técnica a la que pertenece la presente invención.
Como se usa en la presente descripción, los términos singulares "un", "una", "el" y "la" incluyen la referencia plural, a menos que el contexto lo indique claramente de otra manera.
Se pretende que todo límite numérico máximo dado a lo largo de esta descripción incluya todo límite numérico inferior, como si tales límites numéricos inferiores estuvieran escritos expresamente en la presente descripción. Todo límite numérico mínimo dado a lo largo de esta descripción incluye todo límite numérico superior, como si tales límites numéricos superiores estuvieran escritos expresamente en la presente descripción. Todo intervalo numérico dado a lo largo de esta descripción incluye todo intervalo numérico más estrecho que se encuentra dentro de tal intervalo numérico más amplio, como si tales intervalos numéricos más estrechos estuvieran escritos expresamente en la presente descripción.
Células recombinantes que expresan un polipéptido de fosfocetolasas y uno o más polipéptidos de la ruta del MVA La ruta biosintética dependiente de mevalonato (ruta del MVA) es una ruta metabólica clave presente en todos los organismos eucariotas superiores y ciertas bacterias. Además de ser importante para la producción de moléculas usadas en los procesos tan diversos como prenilación proteica, mantenimiento de la membrana celular, anclaje de proteínas y N-glicosilación, la ruta del mevalonato proporciona una fuente principal de las moléculas precursoras de isoprenoides DMAPP y IPP, que funcionan como la base para la biosíntesis de terpenos, terpenoides, isoprenoides e isopreno.
La ruta completa del MVA se puede subdividir en dos grupos: una ruta superior y una inferior. En la porción superior de la ruta del MVA, el acetil Co-A producido durante el metabolismo celular se convierte a mevalonato por medio de las acciones de polipéptidos que tienen ya sea: (a) (i) actividad de tiolasa o (ii) actividad de acetoacetil-CoA sintasa, (b) HMG-CoA reductasa y (c) actividad enzimática de HMG-CoA sintasa. Primero, el acetil Co-A se convierte a acetoacetil CoA por medio de la acción de una tiolasa o una acetoacetil-CoA sintasa (que usa acetil-CoA y malonil-CoA) . Después, el acetoacetil-CoA se convierte a 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA (HMG-CoA) por la acción enzimática de HMG-CoA sintasa. Este derivado de Co-A se reduce a mevalonato por medio de HMG-CoA reductasa, que es la etapa limitante de velocidad de la ruta del mevalonato de producción de isoprenoides . En la ruta inferior del MVA, después, el mevalonato se convierte a mevalonato-5-fosfato por medio de la acción de la mevalonato cinasa que, posteriormente, se transforma a 5-difosfomevalonato por la actividad enzimática de fosfomevalonato cinasa. Finalmente, el IPP se forma a partir de 5-difosfomevalonato por la actividad de la enzima mevalonato-5-pirofosfato decarboxilasa .
Por lo tanto, en ciertas modalidades, las células recombinantes de la presente invención son células recombinantes que tienen la capacidad de producir mevalonato, precursores de isoprenoides, isopreno o isoprenoides por medio de la ruta del MVA, en donde las células recombinantes comprenden: (i) un gen heterólogo que codifica una fosfocetolasa con la capacidad de sintetizar gliceraldehído 3-fosfato y acetilfosfato a partir de xilulosa 5-fosfato, (ii) uno o más genes heterólogos que codifican uno o más polipéptidos de MVA y (iii) uno o más genes heterólogos que participan en la biosíntesis de mevalonato, precursores de isoprenoides o isopreno o isoprenoides que permite la síntesis de mevalonato, precursores de isoprenoides, isopreno o isoprenoides a partir de acetoacetil-CoA en la célula hospedera. En otras modalidades, las células recombinantes de la presente invención son células recombinantes que tienen la capacidad de producir mevalonato, precursores de isoprenoides, isopreno o isoprenoides, en donde las células recombinantes comprenden: (i) un gen heterólogo que codifica una fosfocetolasa con la capacidad de sintetizar eritrosa 4-fosfato y acetilfosfato a partir de fructosa 6-fosfato, (ii) uno o más genes heterólogos que codifican uno o más polipéptidos de MVA y (iii) uno o más genes heterólogos que participan en la biosíntesis de mevalonato, precursores de isoprenoides, isopreno o isoprenoides que permite la síntesis de mevalonato, precursores de isoprenoides, isopreno o isoprenoides a partir de acetoacetil-CoA en la célula hospedera.
Polipéptidos de fosfocetolasas y ácidos nucleicos ilustrativos Las enzimas fosfocetolasas catalizan la conversión de xilulosa 5-fosfato a gliceraldehído 3-fosfato y acetilfosfato y/o la conversión de fructosa 6-fosfato a eritrosa 4-fosfato y acetilfosfato. En ciertas modalidades, la enzima fosfocetolasa tiene la capacidad de catalizar la conversión de xilulosa 5-fosfato a gliceraldehído 3-fosfato y acetilfosfato . En otras modalidades, la enzima fosfocetolasa tiene la capacidad de catalizar la conversión de fructosa 6-fosfato a eritrosa 4-fosfato y acetilfosfato. En otras modalidades, el polipéptido de fosfocetolasas cataliza la conversión de sedoheptulosa-7-fosfato a un producto (por ejemplo, ribosa-5-fosfato) y acetilfosfato. Por lo tanto, sin estar limitados por la teoría, la expresión de fosfocetolasa como se expone en la presente descripción puede producir un incremento en la cantidad de acetilfosfato producido a partir de una fuente de carbohidrato. Este acetilfosfato se puede convertir a acetil-CoA que, después, se puede usar por las actividades enzimáticas de la ruta del MVA para producir mevalonato, moléculas precursoras de isoprenoides , isopreno y/o isoprenoides. Por lo tanto, la cantidad de estos compuestos producidos a partir de un sustrato de carbohidratos se puede incrementar. Alternativamente, la producción de acetil-P y AcCoA se puede incrementar sin que el incremento se refleje en una concentración intracelular mayor. En ciertas modalidades, las concentraciones intracelulares de acetil-P o acetil-CoA permanecen sin alteración o incluso disminuyen, aunque la reacción de la fosfocetolasa se esté llevando a cabo.
Los ácidos nucleicos de fosfocetolasas ilustrativos incluyen ácidos nucleicos que codifican un polipéptido, fragmento de un polipéptido, péptido o polipéptido de fusión que tiene por lo menos una actividad de un polipéptido de fosfocetolasas . Los polipéptidos y ácidos nucleicos de fosfocetolasas ilustrativos incluyen polipéptidos y ácidos nucleicos de origen natural a partir de cualquiera de los organismos de recurso descritos en la presente descripción, así como polipéptidos y ácidos nucleicos mutantes derivados de cualquiera de los organismos de recurso descritos en la presente descripción (ver, por ejemplo, la Figura 4) . Adicionalmente, la Tabla 1 proporciona una lista no limitante de especies y características bioquímicas de ciertas fosfocetolasas ilustrativas que se pueden usar dentro de las modalidades de la presente invención.
Las características bioquímicas de las fosfocetolasas ilustrativas incluyen, pero no se limitan a, expresión proteica, solubilidad y actividad de proteínas. Las fosfocetolasas se pueden seleccionar, además, en base a otras características que incluyen, pero no se limitan a, diversidad entre tipos diferentes de organismos (por ejemplo, bacterias gram positivas, cianobacterias , actinomyces) , especies facultativas aerobias, de temperatura baja cercanas a una especie deseada (por ejemplo, E. coli) y termotolerancia .
Como se proporciona en la presente descripción, la actividad de fosfocetolasa puede mejorar la producción de precursores de isoprenoides (por ejemplo, mevalonato) , isopreno y/o isoprenoides. La presente descripción proporciona un huésped recombinante que comprende fosfocetolasa, en donde las células muestran por lo menos una propiedad de interés para mejorar la producción de precursores de isoprenoides (por ejemplo, mevalonato), isopreno y/o isoprenoides. En algunos aspectos, por lo menos una propiedad de interés se selecciona del, pero no se limita al, grupo que consiste en productividad específica, rendimiento, título e índice de rendimiento celular.
En ciertas modalidades, las fosfocetolasas adecuadas para usar en la presente descripción incluyen fosfocetolasas solubles. Las técnicas para determinar la solubilidad de proteínas son muy conocidas en la técnica. Las técnicas para determinar la solubilidad de proteínas incluyen las descritas en la presente descripción en los ejemplos. En algunas modalidades, una fosfocetolasa para usar en la presente invención incluye aquellas con una solubilidad de por lo menos 20%. En algunas modalidades, la solubilidad de fosfocetolasa se encuentra en cualquier intervalo de aproximadamente 5% a aproximadamente 100%, de aproximadamente 10% a aproximadamente 100%, de aproximadamente 15% a aproximadamente 100%, de aproximadamente 20% a aproximadamente 100%, de aproximadamente 25% a aproximadamente 100%, de aproximadamente 30% a aproximadamente 100%, de aproximadamente 35% a aproximadamente 100%, de aproximadamente 40% a aproximadamente 100%, de aproximadamente 45% a aproximadamente 100%, de aproximadamente 50% a aproximadamente 100%, de aproximadamente 55% a aproximadamente 100%, de aproximadamente 60% a aproximadamente 100%, de aproximadamente 65% a aproximadamente 100%, de aproximadamente 70% a aproximadamente 100%, de aproximadamente 75% a aproximadamente 100%, de aproximadamente 80% a aproximadamente 100%, de aproximadamente 85% a aproximadamente 100% o de aproximadamente 90% a aproximadamente 100%. En algunas modalidades, la solubilidad de fosfocetolasa se encuentra entre aproximadamente 5% y aproximadamente 100%. En algunas modalidades, la solubilidad se encuentra entre 5% y 100%. En algunas modalidades, la solubilidad de fosfocetolasa es menor que aproximadamente cualquiera de 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20 o 10, pero no menor que aproximadamente 5%. En algunas modalidades, la solubilidad es mayor que aproximadamente cualquiera de 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 O 95%.
Las fosfocetolasas con una característica cinética deseada incrementan la producción de isopreno. Las características cinéticas incluyen, pero no se limitan a, actividad específica, Kcat Ki y I En algunos aspectos, el kcat es por lo menos aproximadamente 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0, 1.2, 1.4, 1.6, 1.8, 2.0, 2.2, 2.4, 2.6, 2.8, 3.0, 3.2, 3.4, 3.6, 3.8, 4.0, 4.2, 4.4, 4.6, 4.8, 5.0, 5.2, 5.4, 5.6, 5.8, 6.0, 6.2, 6.4, 6.6, 6.8, 7.0, 7.2, 7.4, 7.6, 7.8, 8.0, 8.1, 8.2, 8.4, 8.6, 8.8, 9.0, 9.2, 9.4, 9.6, 9.8, 10.0, 10.2, 10.4, 10.6, 10.8, 11.0, 11.2, 11.4, 11.6, 11.8, 12.0, 12.2, 12.4, 12.6, 12.8, 13.0, 13.2, 13.4, 13.6, 13.8, 14.0, 14.2, 14.4, 14.6, 14.8, 15.0, 15.2, 15.4, 15.6, 15.8, 16.0, 16.2, 16.4, 16.6, 16.8, 17.0, 17.2, 17.4, 17.6, 17.8, 18.0, 18.2, 18.4, 18.6, 18.8, 19.0, 19.2, 19.4, 19.6, 19.8, 20.0, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700 u 800. En otros aspectos, el kcat es por lo menos aproximadamente 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, I.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3.0, 3.2, 3.4, 3.6, 3.8, 4.0, 4.2, 4.4, 4.6, 4.8, 5.0, 5.2, 5.4, 5.6, 5.8, 6.0, 6.2, 6.4, 6.6, 6.8, 7.0, 7.2, 7.4, 7.6, 7.8, 8.0, 8.1, 8.2, 8.4, 8.6, 8.8, 9.0, 9.2, 9.4, 9.6, 9.8, 10.0, 10.2, 10.4, 10.6, 10.8, 11.0, 11.2, II.4, 11.6, 11.8, 12.0, 12.2, 12.4, 12.6, 12.8, 13.0, 13.2, 13.4, 13.6, 13.8, 14.0, 14.2, 14.4, 14.6, 14.8, 15.0, 15.2, 15.4, 15.6, 15.8, 16.0, 16.2, 16.4 o 16.6.
En algunos aspectos, la Km es por lo menos aproximadamente 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10, 10.5, 11, 11.5, 12, 12.5, 13, 13.5, 14, 14.5, 15, 16, 17, 17.5, 18, 18.5, 19, 19.5, 20, 20.5, 21, 21.5, 22, 22.5, 23, 23.5, 24, 24.5, 25, 25.5, 26, 26.5, 27, 27.5, 28, 28.5, 29, 29.5, 30, 30.5, 31, 31.5, 32, 32.5, 33, 33.5, 34, 34.5, 35, 35.5, 36, 36.5, 37, 37.5, 38, 38.5, 39, 39.5, 40, 40.5, 41, 41.5, 42, 42.5, 43, 43.5, 44, 44.5, 45, 45.5, 46, 46.5, 47, 47.5, 48, 48.5, 49, 49.5, 50, 50.5, 51, 51.5, 52, 52.5, 53, 53.5, 54, 54.5, 55, 55.5 o 56. En otros aspectos, la Km es por lo menos aproximadamente 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10, 10.5, 11, 11.5, 12, 12.5, 13, 13.5, 14, 14.5, 15, 16, 17, 17.5, 18, 18.5, 19, 19.5, 20, 20.5, 21, 21.5 o 22.
Las propiedades de interés incluyen, pero no se limitan a: actividad intracelular incrementada, productividad específica, rendimiento e índice de rendimiento celular en comparación con una célula recombinante que no comprende el polipéptido de fosfocetolasas . En algunas modalidades, la productividad específica incrementa por lo menos aproximadamente 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 3, 4, 5, 6 7, 8, 9, 10 veces o más. En una modalidad, la productividad específica es aproximadamente 40 mg/l/OD/h. En algunas modalidades, el rendimiento incrementa por lo menos aproximadamente 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 3, 4, 5 veces o más. En otras modalidades, el rendimiento de MVA incrementa por lo menos aproximadamente 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 3, 4, 5 veces o más. En otras modalidades, el rendimiento de isopreno incrementa por lo menos aproximadamente 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 3, 4, 5 veces o más. En otras modalidades, el índice de desempeño celular incrementa por lo menos aproximadamente 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 3, 4, 5 veces o más. En otras modalidades, la actividad intracelular incrementa por lo menos aproximadamente 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 veces o más.
Tabla 1. Características cinéticas de fosfocetolasas reportadas en la literatura Otras fosfocetolasas que se pueden usar incluyen, pero no se limitan a, B. longum, L. plantarum, C. acetobutylicum, L. reuteri, L. paraplantarum, R. palustris, Nostoc punctiforme, B. animalis, B. breve, G. vaginalis, E. gallinarum, M. paludis, especie Panteoa, R. aquatilis, N. punctiforme, S. avermetilis y T. fusca.
Se puede usar métodos convencionales para determinar si un polipéptido tiene actividad de péptido fosfocetolasa al determinar la capacidad del péptido para convertir D-fructosa 6-fosfato o D-xilulosa 5-fosfato a acetil-P. Después, el acetil-P se puede convertir a ferril acetil hidroxamato, que puede detectarse por espectrofotometría (Meile et al., J. Bact. 183:2929-2936, 2001) . Cualquier polipéptido que se identifique que tiene actividad de péptido fosfocetolasa como se describe en la presente descripción es adecuado para usar en la presente invención. En algunas modalidades, el polipéptido de fosfocetolasas cataliza la conversión de xilulosa 5-fosfato a gliceraldehído 3-fosfato y acetilfosfato . En otras modalidades, el polipéptido de fosfocetolasas cataliza la conversión de fructosa 6-fosfato a eritrosa 4-fosfato y acetilfosfato . En otras modalidades adicionales, el polipéptido de fosfocetolasas con la capacidad de catalizar la conversión de sedoheptulosa-7-fosfato a ribosa-5-fosfato y acetilfosfato . En otras modalidades adicionales, el polipéptido de fosfocetolasas cataliza la conversión de xilulosa 5-fosfato a gliceraldehído 3-fosfato y acetilfosfato y/o la conversión de fructosa 6-fosfato a eritrosa 4-fosfato y acetilfosfato y/o la conversión de sedoheptulosa-7-fosfato a ribosa- 5-fosfato y acetilfosfato .
La presente descripción proporciona una fosfocetolasa aislada de un microorganismo. En algunos aspectos, una fosfocetolasa aislada del grupo que consiste en una bacteria gram positiva, una bacteria gram negativa, una bacteria aerobia, una bacteria anerobia, una bacteria termofílica, una bacteria sicrofílica, una bacteria halofílica o una cianobacteria . En algunos aspectos, una fosfocetolasa aislada de un hongo. En otros aspectos, los ácidos nucleicos de fosfocetolasas ilustrativos incluyen, por ejemplo, una fosfocetolasa aislada de Lactobacillus reuteri, Bifidobacterium longum, Ferrimonas baleárica, Pedobactor saltans, Streptomyces griseus y/o Nocardiopsis dassonvillei. En otros aspectos, los ácidos nucleicos de fosfocetolasas ilustrativos incluyen, por ejemplo, una fosfocetolasa aislada de Clostridium acetobutylicum, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus paraplantarum, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium animalis, Bifidobacterium breve, Enterococcus gallinarum, Gardnerella vaginalis, Ferrimonas baleárica, Mucilaginibacter paludis, Nostoc punctiforme, Nostoc punctiforme PCC 73102, especie Pantoea, Pedobactor saltans, Rahnella aquatilis, Rhodopseudomonas palustris, Streptomyces griseus, Streptomyces avermitilis, Nocardiopsis dassonvillei y/o Thermobifida fusca. En otros aspectos, los ácidos nucleicos de fosfocetolasas ilustrativos incluyen, por ejemplo, una fosfocetolasa aislada de Clostridium acetobutylicum, Bifidobacterium longum y/o Enterococcus gallinarum. En cualquiera de los aspectos descritos en la presente descripción, un ácido nucleico de fosfocetolasas puede tener por lo menos aproximadamente 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 95%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86% u 85% de identidad de secuencias con cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos de fosfocetolasas que se describen en la presente descripción. El ácido nucleico de fosfocetolasas codificado por el gen de fosfocetolasa de Lactobacillus reuteri puede tener por lo menos aproximadamente 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 95%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86% u 85% de identidad de secuencias con la sec. con núm. de ident . : 1. El ácido nucleico de fosfocetolasas codificado por el gen de fosfocetolasa de Bifidobacterium longum puede tener por lo menos aproximadamente 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 95%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86% u 85% de identidad de secuencias con la sec . con núm. de ident.:3. El ácido nucleico de fosfocetolasas codificado por el gen de fosfocetolasa de Enterococcus gallinarum puede tener por lo menos aproximadamente 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 95%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86% u 85% de identidad de secuencias con la sec. con núm. de ident.:17. El ácido nucleico de fosfocetolasas codificado por el gen de fosfocetolasa de Nostoc punctiforme puede tener por lo menos aproximadamente 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 95%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86% u 85% de identidad de secuencias con la sec. con núm. de ident.:18. El ácido nucleico de fosfocetolasas codificado por el gen de fosfocetolasa de Rhodopseudomonas palustris puede tener por lo menos aproximadamente 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 95%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86% u 85% de identidad de secuencias con la sec. con núm. de ident.:19. El ácido nucleico de fosfocetolasas codificado por el gen de fosfocetolasa de especie Pantoea puede tener por lo menos aproximadamente 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 95%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86% u 85% de identidad de secuencias con la sec. con núm. de ident . :20. El ácido nucleico de fosfocetolasas codificado por el gen de fosfocetolasa de Mucilaginibacter paludis puede tener por lo menos aproximadamente 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 95%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86% u 85% de identidad de secuencias con la sec. con núm. de ident.:21. El ácido nucleico de fosfocetolasas codificado por el gen de fosfocetolasa de Thermobifida fusca puede tener por lo menos aproximadamente 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 95%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86% u 85% de identidad de secuencias con la sec. con núm. de ident.:22. El ácido nucleico de fosfocetolasas codificado por el gen de fosfocetolasa de Bifidobacterium breve puede tener por lo menos aproximadamente 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 95%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86% u 85% de identidad de secuencias con la sec. con núm. de ident.:23. El ácido nucleico de fosfocetolasas codificado por el gen de fosfocetolasa de Rahnella aquatilis puede tener por lo menos aproximadamente 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 95%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86% u 85% de identidad de secuencias con la sec. con núm. de ident.:24. El ácido nucleico de fosfocetolasas codificado por el gen de fosfocetolasa de Bifidobacterium animalis puede tener por lo menos aproximadamente 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 95%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86% u 85% de identidad de secuencias con la sec. con núm. de ident.:25. El ácido nucleico de fosfocetolasas codificado por el gen de fosfocetolasa de Gardnerella vaginalis puede tener por lo menos aproximadamente 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 95%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86% u 85% de identidad de secuencias con la sec. con núm. de ident.:26. El ácido nucleico de fosfocetolasas codificado por el gen de fosfocetolasa de Streptomyces avermitilis puede tener por lo menos aproximadamente 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 95%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86% u 85% de identidad de secuencias con la sec. con núm. de ident.:27. El ácido nucleico de fosfocetolasas codificado por el gen de fosfocetolasa de Clostridium acetobutylicum puede tener por lo menos aproximadamente 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 95%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86% u 85% de identidad de secuencias con la sec. con núm. de ident.:28. El ácido nucleico de fosfocetolasas codificado por el gen de fosfocetolasa de Lactobacillus paraplantarum puede tener por lo menos aproximadamente 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 95%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86% u 85% de identidad de secuencias con la sec. con núm. de ident. :29.
En algunas modalidades, el polipéptido de fosfocetolasas puede tener por lo menos aproximadamente 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 95%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86% u 85% de identidad de secuencias con el polipéptido de fosfocetolasas codificado por la secuencia de ácido nucleico de fosfocetolasas de Lactobacillus reuteri de la sec. con núm. de ident. :1. En algunas modalidades, el polipéptido de fosfocetolasas puede tener por lo menos aproximadamente 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 95%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86% u 85% de identidad de secuencias con el polipéptido de fosfocetolasas codificado por la secuencia de ácido nucleico de fosfocetolasas de Bifidobacterium longum de la sec . con núm. de ident . : 3. En algunas modalidades, el polipéptido de fosfocetolasas puede tener por lo menos aproximadamente 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 95%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86% u 85% de identidad de secuencias con el polipéptido de fosfocetolasas codificado por la secuencia de ácido nucleico de fosfocetolasas de Enterococcus gallinarum de la sec. con núm. de ident. :17. En algunas modalidades, el polipéptido de fosfocetolasas puede tener por lo menos aproximadamente 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 95%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86% u 85% de identidad de secuencias con el polipéptido de fosfocetolasas codificado por la secuencia de ácido nucleico de fosfocetolasas de Nostoc punctiforme de la sec. con núm. de ident. :18. En algunas modalidades, el polipéptido de fosfocetolasas puede tener por lo menos aproximadamente 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 95%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86% u 85% de identidad de secuencias con el polipéptido de fosfocetolasas codificado por la secuencia de ácido nucleico de fosfocetolasas de Rhodopseudomonas palustris de la sec. con núm. de ident.: 19. En algunas modalidades, el polipéptido de fosfocetolasas puede tener por lo menos aproximadamente 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 95%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86% u 85% de identidad de secuencias con el polipéptido de fosfocetolasas codificado por la secuencia de ácido nucleico de fosfocetolasas de la especie Pantoea de la sec. con núm. de ident.:20. En algunas modalidades, el polipéptido de fosfocetolasas puede tener por lo menos aproximadamente 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 95%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86% u 85% de identidad de secuencias con el polipéptido de fosfocetolasas codificado por la secuencia de ácido nucleico de fosfocetolasas de Mucilaginibacter paludis de la sec. con núm. de ident.:21. En algunas modalidades, el polipéptido de fosfocetolasas puede tener por lo menos aproximadamente 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 95%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86% u 85% de identidad de secuencias con el polipéptido de fosfocetolasas codificado por la secuencia de ácido nucleico de fosfocetolasas de Thermobifida fusca de la sec. con núm. de ident.:22. En algunas modalidades, el polipéptido de fosfocetolasas puede tener por lo menos aproximadamente 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 95%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86% u 85% de identidad de secuencias con el polipéptido de fosfocetolasas codificado por la secuencia de ácido nucleico de fosfocetolasas de Bifidobacterium breve de la sec. con núm. de ident.:23. En algunas modalidades, el polipéptido de fosfocetolasas puede tener por lo menos aproximadamente 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 95%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86% u 85% de identidad de secuencias con el polipéptido de fosfocetolasas codificado por la secuencia de ácido nucleico de fosfocetolasas de Rahnella aquatilis de la sec. con núm. de ident.:24. En algunas modalidades, el polipéptido de fosfocetolasas puede tener por lo menos aproximadamente 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 95%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86% u 85% de identidad de secuencias con el polipéptido de fosfocetolasas codificado por la secuencia de ácido nucleico de fosfocetolasas de Bifidobacterium animalis de la sec. con núm. de ident.:25. En algunas modalidades, el polipéptido de fosfocetolasas puede tener por lo menos aproximadamente 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 95%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86% u 85% de identidad de secuencias con el polipéptido de fosfocetolasas codificado por la secuencia de ácido nucleico de fosfocetolasas deGardnerella vaginalis de la sec. con núm. de ident.:26. En algunas modalidades, el polipéptido de fosfocetolasas puede tener por lo menos aproximadamente 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 95%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86% u 85% de identidad de secuencias con el polipéptido de fosfocetolasas codificado por la secuencia de ácido nucleico de fosfocetolasas de Streptomyces avermitilis de la sec. con núm. de ident.:27. En algunas modalidades, el polipéptido de fosfocetolasas puede tener por lo menos aproximadamente 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 95%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86% u 85% de identidad de secuencias con el polipéptido de fosfocetolasas codificado por la secuencia de ácido nucleico de fosfocetolasas deClostridium acetobutylicum de la sec . con núm. de ident.:28. En algunas modalidades, el polipéptido de fosfocetolasas puede tener por lo menos aproximadamente 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 95%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86% u 85% de identidad de secuencias con el polipéptido de fosfocetolasas codificado por el polipéptido de fosfocetolasas de Lactobacillus paraplantarum puede tener la secuencia de ácido nucleico de la sec. con núm. de ident.:29. En cualquiera de los aspectos descritos en la presente descripción, un polipéptido de fosfocetolasas puede tener por lo menos aproximadamente 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 95%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86% u 85% de identidad de secuencias con cualquiera de los polipéptidos de fosfocetolasas codificados por cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos de fosfocetolasas que se describen en la presente descripción.
Otros ejemplos adicionales de las enzimas fosfocetolasas que pueden usarse en la presente descripción se describen en la patente de los Estados Unidos núm. 7,785,858 y en la patente núm. WO 2011/159853, que se incorporan como referencia en la presente descripción, especialmente, con respecto a toda la descripción acerca de las enzimas fosfocetolasas .
Polipéptidos de la ruta superior del MVA La porción superior de la ruta del MVA usa acetil Co-A producido durante el metabolismo celular como el sustrato inicial para la conversión a mevalonato por medio de las acciones de polipéptidos que tienen ya sea: (a) (i) actividad de tiolasa o (ii) actividad de acetoacetil-CoA, (b) HMG-CoA reductasa y (c) actividad enzimática de HMG-CoA sintasa. Primero, el acetil Co-A se convierte a acetoacetil CoA por medio de la acción de una tiolasa o una acetoacetil-CoA sintasa (que usa acetil-CoA y malonil-CoA) . Después, el acetoacetil-CoA se convierte a 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA (HMG-CoA) por la acción enzimática de HMG-CoA sintasa. Este derivado de Co-A se reduce a mevalonato por medio de HMG-CoA reductasa, que es la etapa limitante de velocidad de la ruta del mevalonato de producción de isoprenoides.
Los ejemplos no limitantes de polipéptidos de la ruta superior del MVA incluyen acetil-CoA acetiltransferasa (AA-CoA tiolasa) polipéptidos, polipéptidos de acetoacetil-CoA sintasa, 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA sintasa (HMG-CoA sintasa) polipéptidos, polipéptidos de 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA reductasa (HMG-CoA reductasa) . Los polipéptidos de la ruta superior del MVA pueden incluir polipéptidos, fragmentos de polipéptidos, péptidos y polipéptidos de fusión que tienen por lo menos una actividad de un polipéptido de la ruta superior del MVA. Los ácidos nucleicos ilustrativos de la ruta superior del MVA incluyen ácidos nucleicos que codifican un polipéptido, fragmento de un polipéptido, péptido o polipéptido de fusión que tiene por lo menos una actividad de un polipéptido de la ruta superior del MVA. Los polipéptidos y ácidos nucleicos de la ruta del MVA ilustrativos incluyen polipéptidos y ácidos nucleicos de origen natural a partir de cualquiera de los organismos de recurso descritos en la presente descripción. Por lo tanto, en la presente descripción se contempla que cualquier gen que codifica un polipéptido de la ruta superior del MVA puede usarse en la presente invención.
En ciertas modalidades, diversas opciones de genes mvaE y mvaS a partir de L. grayi, E. faecium, E. gallinarum, E. casseliflavus y/o E. faecalis solos o en combinación con uno o más genes mvaE y mvaS que codifican proteínas a partir de la ruta superior del MVA se contemplan dentro del alcance de la presente invención. En otras modalidades, un gen de acetoacetil-CoA sintasa se contempla dentro del alcance de la presente invención en combinación con uno o más genes adicionales que codifican: (i) polipéptidos de 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA sintasa (HMG-CoA sintasa) y polipéptidos de 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA reductasa (HMG-CoA reductasa) . Por lo tanto, en ciertos aspectos, cualquiera de las combinaciones de los genes contemplados puede expresarse en células recombinantes en cualquiera de las maneras descritas en la presente descripción.
Otros ejemplos no limitantes de polipéptidos de la ruta superior del MVA que pueden usarse en la presente descripción se describen en la publicación de la solicitud de patente internacional núm. WO2009/076676 ; patentes núms .
WO2010/003007 y WO2010/148150.
Genes que codifican polipéptidos mvaE y mvaS En ciertas modalidades, diversas opciones de genes mvaE y mvaS a partir de L. grayi, E. faecium, E. gallinarum, E. casseliflavus y/o E. faecalis solos o en combinación con uno o más genes mvaE y mvaS que codifican proteínas a partir de la ruta superior del MVA se contemplan dentro del alcance de la presente invención. En L. grayi, E. faecium, E. gallinarum, E. casseliflavus y E. faecalis, el gen mvaE codifica un polipéptido que tiene tanto actividad de tiolasa como de HMG-CoA reductasa. De hecho, el producto del gen mvaE representó la primera enzima bifuncional de la biosíntesis de IPP que se encuentra en eubacterias y el primer ejemplo de HMG-CoA reductasa fusionada a otra proteína en la naturaleza (Hedí, et al., J Bacteriol . abril de 2002; 184(8): 2116-2122) . El gen mvaS, por otro lado, codifica un polipéptido que tiene una actividad de HMG-CoA sintasa.
Por lo tanto, las células recombinantes (por ejemplo, E. coli) pueden modificarse genéticamente para expresar uno o más genes mvaE y mvaS de L. grayi, E. faecium, E. gallinarum, E. casseliflavus y/o E. faecalis para producir mevalonato. El o los genes mvaE y mvaS se pueden expresar sobre un plásmido multicopia. El plásmido puede ser un plásmido de copia alta, un plásmido de copia baja o un plásmido de copia media. Alternativamente, el o los genes mvaE y mvaS se pueden integrar en el cromosoma de la célula hospedera. Para la expresión heteróloga del gen o genes mvaE y mvaS sobre un plásmido o como parte integrada del cromosoma de la célula hospedera, la expresión de los genes se puede dirigir ya sea por un promotor inducible o por un promotor de expresión constitutiva. El promotor puede ser un impulsor fuerte de expresión, puede ser un impulsor débil de expresión o puede ser un impulsor medio de expresión de uno o más genes mvaE y mvaS.
Polipéptidos y ácidos nucleicos de mvaE ilustrativos El gen mvaE codifica un polipéptido que tiene tanto actividad de tiolasa como de HMG-CoA reductasa. La actividad de tiolasa del polipéptido codificado por el gen mvaE convierte acetil Co-A a acetoacetil CoA, mientras que la actividad enzimática de HMG-CoA reductasa del polipéptido convierte 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA a mevalonato. Los polipéptidos y ácidos nucleicos de mvaE ilustrativos incluyen polipéptidos y ácidos nucleicos de origen natural a partir de cualquiera de los organismos de recurso descritos en la presente descripción, así como polipéptidos y ácidos nucleicos mutantes derivados de cualquiera de los organismos de recurso descritos en la presente descripción que tienen por lo menos una actividad de un polipéptido de mvaE.
Los polipéptidos de mvaE mutantes incluyen aquellos en los que uno o más residuos de aminoácidos han experimentado una sustitución de aminoácidos mientras retienen la actividad del polipéptido de mvaE (por ejemplo, la capacidad de convertir acetil Co-A a acetoacetil CoA, así como la capacidad de convertir 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA a mevalonato) . Las sustituciones de aminoácidos pueden ser conservadoras o no conservadoras y tales residuos de aminoácidos sustituidos pueden o no estar codificados por el código genético. El "alfabeto" de veinte aminoácidos estándar se ha dividido en familias químicas según la similitud de sus cadenas laterales. Esas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina) , cadenas laterales acídicas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico) , cadenas laterales polares sin carga (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína) , cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano) , cadenas laterales beta-ramificadas (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina) . Una "sustitución de aminoácidos conservativa" es aquella en la cual el residuo de aminoácidos se reemplaza con un residuo de aminoácidos que tiene una cadena lateral químicamente similar (es decir, reemplaza un aminoácido que tiene una cadena lateral básica con otro aminoácido que tiene una cadena lateral básica) . Una "sustitución de aminoácido no conservativa" es aquella en la cual el residuo de aminoácidos se reemplaza con un residuo de aminoácidos que tiene una cadena lateral químicamente diferente (es decir, reemplaza un aminoácido que tiene una cadena lateral básica con otro aminoácido que tiene una cadena lateral aromática) .
Las sustituciones de aminoácidos en el polipéptido de mvaE se pueden introducir para mejorar la funcionalidad de la molécula. Por ejemplo, las sustituciones de aminoácidos que incrementan la afinidad de unión del polipéptido de mvaE para su sustrato o que mejoran su capacidad para convertir acetil Co-A a acetoacetil CoA y/o la capacidad de convertir 3-hidroxi-3 -metilglutaril-CoA a mevalonato se pueden introducir en el polipéptido de mvaE. En algunos aspectos, los polipéptidos de mvaE mutantes contienen una o más sustituciones conservadoras de aminoácidos.
En un aspecto, proteínas de mvaE que no se degradan o menos propensas a la degradación pueden usarse para la producción de mevalonato, precursores de isoprenoides , isopreno y/o isoprenoides. Los ejemplos de productos del gen de mvaEs que no se degradan o menos propensos a la degradación que pueden usarse incluyen, pero no se limitan a, los de los organismos E. faecium, E. gallinarum, E. casseliflavus, E. faecalis y L. grayi . Un experto en la técnica puede expresar proteína de mvaE en BL21 (DE3) de E. coli y examinar la ausencia de fragmentos por medio de cualquiera de las técnicas convencionales de biología molecular. Por ejemplo, la ausencia de fragmentos puede identificarse en geles de SDS-PAGE teñidos con SafeStain seguido por purificación mediada con His-Tag o cuando se expresan en BL21 de E. coli que produce mevalonato, isopreno o isoprenoides con el uso de los métodos de detección descritos en la presente descripción.
Se puede usar métodos convencionales, tales como los descritos en Hedí et al., (J Bacteriol . abril de 2002; 184(8): 2116-2122) para determinar si un polipéptido tiene actividad de mvaE al determinar la actividad de acetoacetil-CoA tiolasa así como de HMG-CoA reductasa. En un ensayo ilustrativo, la actividad de acetoacetil-CoA tiolasa se determina por espectrofotometro para monitorear el cambio en la absorbancia a 302 nm que acompaña la formación o tiólisis de acetoacetil-CoA. Las condiciones convencionales de ensayo para cada reacción para determinar la síntesis de acetoacetil-CoA son 1 mM de acetil-CoA, 10 mM de MgCl2, 50 mM de Tris, pH de 10.5 y la reacción se inicia por adición de enzima. Los ensayos pueden usar un volumen final de 200 µ? . Para el ensayo, 1 unidad enzimática (eu, por sus siglas en inglés) representa la síntesis o tiólisis en 1 min de 1 µp??? de acetoacetil-CoA. En otro ensayo ilustrativo, la actividad de HMG-CoA reductasa se puede monitorear por espectrofotómetro por la aparición o desaparición de NADP(H) a 340 nm. Las condiciones convencionales de ensayo para cada reacción determinada para mostrar una desacilación reductora de HMG-CoA a mevalonato son 0.4 mM de NADPH, 1.0 mM de (R,S)-HMG-CoA, 100 mM de KCl y 100 mM de K XP04, pH de 6.5. Los ensayos usaron un volumen final de 200 µ? . Las reacciones se inician al agregar la enzima. Para el ensayo, 1 eu representa la productividad, en 1 min, de 1 µp??? de NADP(H) . Esto corresponde a la productividad de 0.5 µp??? de HMG-CoA o mevalonato .
Alternativamente, la producción de mevalonato en células recombinantes se puede determinar por, sin limitarse a, cromatografía de gases (ver la publicación de la solicitud de patente de los Estados Unidos núm. : US 2005/0287655 Al) o por HPLC (ver la publicación de la solicitud de patente de los Estados Unidos núm. : 2011/0159557 Al) . Como un ensayo ilustrativo, los cultivos se pueden inocular en tubos de agitación que contienen caldo de cultivo de LB suplementado con uno o más antibióticos e incubar durante 14 h a 34 °C a 250 rpm. Después, los cultivos se pueden diluir en placas de pocilios que contienen medio TM3 suplementado con glucosa al i%, extracto de levadura al 0.1% y 200 µ? de IPTG para una OD final de 0.2. Después, las placas se sellan con una membrana Breath Easier (Diversified Biotech) y se incuban a 34 °C en un agitador/incubador a 600 rpm durante 24 horas. Después, 1 mi de cada cultivo se centrifuga a 3,000 x g durante 5 min. Después, el sobrenadante se agrega a ácido sulfúrico a 20% y se incuba en hielo durante 5 min. Después, la mezcla se centrifuga durante 5 min. a 3000 x g y el sobrenadante se recolectó para análisis de HPLC. La concentración de mevalonato en las muestras se determina por comparación con una curva estándar de mevalonato (Sigma) . La concentración de glucosa se puede determinar, adicionalmente, al realizar un ensayo de glucosa oxidasa de conformidad con cualquier método conocido en la técnica. Con el uso de la HPLC, las concentraciones de mevalonato pueden cuantificarse al comparar la respuesta del índice de refracción de cada muestra contra una curva de calibración generada al correr diversas soluciones que contienen mevalonato de concentración conocida .
Los ácidos nucleicos de mvaE ilustrativos incluyen ácidos nucleicos que codifican un polipéptido, fragmento de un polipéptido, péptido o polipéptido de fusión que tiene por lo menos una actividad de un polipéptido de mvaE. Los polipéptidos y ácidos nucleicos de mvaE ilustrativos incluyen polipéptidos y ácidos nucleicos de origen natural a partir de cualquiera de los organismos de recurso descritos en la presente descripción, así como polipéptidos y ácidos nucleicos mutantes derivados de cualquiera de los organismos de recurso descritos en la presente descripción. Los ácidos nucleicos de mvaE ilustrativos incluyen, por ejemplo, ácidos nucleicos de mvaE aislados de Listeria grayi_DSM 20601, Enterococcus faecium, Enterococcus gallinarum EG2, Enterococcus faecalis y/o Enterococcus casseliflavus. El ácido nucleico de mvaE codificado por el gen mvaE DSM 20601 de Listeria grayi puede tener por lo menos aproximadamente 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 95%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86% u 85% de identidad de secuencias con la sec. con núm. de ident.:6. El ácido nucleico de mvaE codificado por el gen mvaE de Enterococcus faecium puede tener por lo menos aproximadamente 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 95%, 9.3%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86% u 85% de identidad de secuencias con la sec. con núm. de ident.:7. El ácido nucleico de mvaE codificado por el gen mvaE EG2 de Enterococcus gallinarum puede tener por lo menos aproximadamente 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 95%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86% u 85% de identidad de secuencias con la sec. con núm. de ident . : 8. El ácido nucleico de mvaE codificado por el gen mvaE de Enterococcus casseliflavus puede tener por lo menos aproximadamente 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 95%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86% u 85% de identidad de secuencias con la sec. con núm. de ident. :9. El ácido nucleico de mvaE codificado por el gen mvaE de Enterococcusfaecalis puede tener por lo menos aproximadamente 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 95%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86% u 85% de identidad de secuencias con el gen mvaE descrito anteriormente en E. coli para producir mevalonato (ver la patente de los Estados Unidos núm. 2005/0287655 Al; Tabata, K. and Hashimoto, S.-I. Biotechnology Letters 26: 1487-1491, 2004) .
El ácido nucleico de mvaE se puede expresar en una célula recombinante sobre un plásmido multicopia. El plásmido puede ser un plásmido de copia alta, un plásmido de copia baja o un plásmido de copia media. Alternativamente, el ácido nucleico de mvaE se puede integrar en el cromosoma de la célula hospedera. Para la expresión heteróloga de un ácido nucleico de mvaE sobre un plásmido o como parte integrada del cromosoma de la célula hospedera, la expresión del ácido nucleico se puede dirigir ya sea por un promotor inducible o por un promotor de expresión constitutiva. El promotor puede ser un impulsor fuerte de expresión, puede ser un impulsor débil de expresión o puede ser un impulsor medio de expresión del ácido nucleico de mvaE.
Polipéptidos y ácidos nucleicos de mvaS ilustrativos El gen mvaS codifica un polipéptido que tiene actividad de H G-CoA sintasa. Este polipéptido puede convertir acetoacetil CoA a 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA (HMG-CoA) .
Los polipéptidos y ácidos nucleicos de mvaS ilustrativos incluyen polipéptidos y ácidos nucleicos de origen natural a partir de cualquiera de los organismos de recurso descritos en la presente descripción, así como polipéptidos y ácidos nucleicos mutantes derivados de cualquiera de los organismos de recurso descritos en la presente descripción que tienen por lo menos una actividad de un polipéptido de mvaS.
Los polipéptidos de mvaS mutantes incluyen aquellos en los cuales uno o más residuos de aminoácidos han experimentado una sustitución de aminoácidos mientras retienen la actividad del polipéptido de mvaS (por ejemplo, la capacidad de convertir acetoacetil CoA a 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA) . Las sustituciones- de aminoácidos en el polipéptido de mvaS se pueden introducir para mejorar la funcionalidad de la molécula. Por ejemplo, las sustituciones de aminoácidos que incrementan la afinidad de unión del polipéptido de mvaS para su sustrato o que mejoran su capacidad para convertir acetoacetil CoA a 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA se pueden introducir en el polipéptido de mvaS . En algunos aspectos, los polipéptidos de mvaS mutantes contienen una o más sustituciones conservadoras de aminoácidos .
Se puede usar métodos convencionales, tales como los descritos en Quant et al. (Biochem J. , 1989, 262:159-164), para determinar si un polipéptido tiene actividad de mvaS al determinar la actividad de HMG-CoA sintasa. En un ensayo ilustrativo, la actividad de HMG-CoA sintasa se puede analizar por espectrofotometría al determinar la desaparición de la forma de enol de acetoacetil-CoA al monitorear el cambio de absorbancia a 303 nm. Un sistema convencional de ensayos de 1 mi que contienen 50 mm-Tris/HCl, pH de 8.0, 10 mM-MgCl2 y 0.2 mM-ditiotreitol a 30°C; Se puede agregar muestras de 5 mM-acetilfosfato, 10, M-acetoacetil- CoA y 5 µ? de extractos, seguido por la adición simultánea de acetil-CoA (100 µ?) y 10 unidades de PTA. Después, la actividad de HMG-CoA sintasa se determina como la diferencia en la velocidad antes y después de agregar acetil-CoA. El coeficiente de absorción de acetoacetil-CoA en las condiciones usadas (pH de 8.0, 10 mM-MgCl2) es 12.2 x 103 M"1 cm"1. Por definición, 1 unidad de actividad enzimática produce 1 µ???? de acetoacetil-CoA para transformar por minuto.
Alternativamente, la producción de mevalonato en células recombinantes se puede determinar por, sin limitarse a, cromatografía de gases (ver la publicación de la solicitud de patente de los Estados Unidos núm. : US 2005/0287655 Al) o por HPLC (ver la publicación de la solicitud de patente de los Estados Unidos núm. : 2011/0159557 Al) . Como un ensayo ilustrativo, los cultivos se pueden inocular en tubos de agitación que contienen caldo de cultivo de LB suplementado con uno o más antibióticos e incubar durante 14 h a 34 °C a 250 rpm. Después, los cultivos se pueden diluir en placas de pocilios que contienen medio TM3 suplementado con glucosa al 1%, extracto de levadura al 0.1% y 200 µ? de IPTG para una OD final de 0.2. Después, las placas se sellan con una membrana Breath Easier (Diversified Biotech) y se incuban a 34 °C en un agitador/incubador a 600 rpm durante 24 horas. Después, 1 mi de cada cultivo se centrifuga a 3,000 x g durante 5 min. Después, el sobrenadante se agrega a ácido sulfúrico a 20% y se incuba en hielo durante 5 min. Después, la mezcla se centrifuga durante 5 min. a 3000 x g y el sobrenadante se recolectó para análisis de HPLC. La concentración de mevalonato en las muestras se determina por comparación con una curva estándar de mevalonato (Sigma) . La concentración de glucosa se puede determinar, adicionalmente , al realizar un ensayo de glucosa oxidasa de conformidad con cualquier método conocido en la técnica. Con el uso de la HPLC, las concentraciones de mevalonato pueden cuantificarse al comparar la respuesta del índice de refracción de cada muestra contra una curva de calibración generada al correr diversas soluciones que contienen mevonato de concentración conocida .
Los ácidos nucleicos de mvaS ilustrativos incluyen ácidos nucleicos que codifican un polipéptido, fragmento de un polipéptido, péptido o polipéptido de fusión que tiene por lo menos una actividad de un polipéptido de mvaS . Los polipéptidos y ácidos nucleicos de mvaS ilustrativos incluyen polipéptidos y ácidos nucleicos de origen natural a partir de cualquiera de los organismos de recurso descritos en la presente descripción, así como polipéptidos y ácidos nucleicos mutantes derivados a partir de cualquiera de los organismos de recurso descritos en la presente descripción. Los ácidos nucleicos de mvaS ilustrativos incluyen, por ejemplo, ácidos nucleicos de mvaS aislados de histeria grayi_DSM 20601, Enterococcus faecium, Enterococcus gallínarum EG2, Enterococcus faecalis y/o Enterococcus casseliflavus. El ácido nucleico de mvaS codificado por el gen mvaS DSM 20601 de Listeria grayi puede tener por lo menos aproximadamente 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 95%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86% u 85% de identidad de secuencias con la sec . con núm. de ident.:10. El ácido nucleico de mvaS codificado por el gen mvaS de Enterococcus faecium puede tener por lo menos aproximadamente 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 95%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86% u 85% de identidad de secuencias con la sec. con núm. de ident.rll. El ácido nucleico de mvaS codificado por el gen mvaS EG2 de Enterococcus gallínarum puede tener por lo menos aproximadamente 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 95%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86% u 85% de identidad de secuencias con la sec. con núm. de ident . : 12. El ácido nucleico de mvaS codificado por el gen mvaS de Enterococcus casseliflavus puede tener por lo menos aproximadamente 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 95%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86% u 85% de identidad de secuencias con la sec . con núm. de ident.:13. El ácido nucleico de mvaS codificado por el gen mvaS de Bnterococcus faecalis puede tener por lo menos aproximadamente 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 95%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86% u 85% de identidad de secuencias con el gen de mvaE descrito anteriormente en E. coli para producir mevalonato (ver la patente de los Estados Unidos núm. 2005/0287655 Al; Tabata, K. and Hashimoto, S . - I . Biotechnology Letters 26: 1487-1491, 2004).
El ácido nucleico de mvaS se puede expresar en una célula recombinante en un plásmido multicopia. El plásmido puede ser un plásmido de copia alta, un plásmido de copia baja o un plásmido de copia media. Alternativamente, el ácido nucleico de mvaS se puede integrar en el cromosoma de la célula hospedera. Para la expresión heteróloga de un ácido nucleico de mvaS sobre un plásmido o como parte integrada del cromosoma de la célula hospedera, la expresión del ácido nucleico se puede dirigir ya sea por un promotor inducible o por un promotor de expresión constitutiva. El promotor puede ser un impulsor fuerte de expresión, puede ser un impulsor débil de expresión o puede ser un impulsor medio de expresión del ácido nucleico de mvaS.
Gen de acetoacetil-CoA sintasa El gen de acetoacetil-CoA sintasa (conocido, además, como nphT7) es un gen que codifica una enzima que tiene la actividad de sintetizar acetoacetil-CoA a partir de malonil-CoA y acetil-CoA y que tiene una actividad mínima (por ejemplo, no tiene actividad) de sintetizar acetoacetil-CoA a partir de dos moléculas de acetil-CoA. Ver, por ejemplo, Okamura et al., PNAS volumen 107, núm. 25, págs . 11265-11270 (2010) , cuyo contenido se incorpora expresamente en la presente descripción para enseñar acerca de nphT7. Un gen de acetoacetil-CoA sintasa a partir de un actinomiceto de la cepa CL190 del género Streptomyces se describió en publicación de la patente JP (Kokai) núm. 2008-61506 A y en la patente núm. US2010/0285549. La acetoacetil-CoA sintasa puede mencionarse, además, como acetil CoA:malonil CoA aciltransferasa . Una acetoacetil-CoA sintasa (o acetil CoA:malonil CoA aciltransferasa) representativa que puede usarse es la correspondiente al núm. del Genbank AB540131.1.
En cualquiera de los aspectos o modalidades que se describen en la presente descripción, se puede usar una enzima que tiene la capacidad de sintetizar acetoacetil-CoA a partir de malonil-CoA y acetil-CoA. Los ejemplos no limitantes de tal enzima se describen en la presente descripción. En ciertas modalidades descritas en la presente descripción, se puede usar un gen de acetoacetil-CoA sintasa derivado de un actinomiceto del género Streptomyces que tiene la actividad de sintetizar acetoacetil-CoA a partir de malonil-CoA y acetil-CoA. Un ejemplo de tal gen de acetoacetil-CoA sintasa es el gen que codifica una proteína que tiene el amino. Tal proteína que tiene la secuencia de aminoácidos de la sec. con núm. de ident.:5 corresponde a una acetoacetil-CoA sintasa que tiene la actividad de sintetizar acetoacetil-CoA a partir de malonil-CoA y acetil-CoA y que no tiene la actividad de sintetizar acetoacetil-CoA a partir de dos moléculas de acetil-CoA.
En una modalidad, el gen que codifica una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos de la sec. con núm. de ident.:5 se puede obtener por un método de amplificación de ácido nucleico (por ejemplo, PCR) con el uso de ADN genómico obtenido de un actinomiceto de la especie Streptomyces. La cepa CL190 como una plantilla y un par de iniciadores que se pueden diseñar con referencia a la publicación de la patente JP (Kokai) núm. 2008-61506 A.
Como se describe en la presente descripción, un gen de acetoacetil-CoA sintasa para usar en la presente invención no se limita a un gen que codifica una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos de la sec. con núm. de ident.:5 a partir de un actinomiceto de la cepa CL190 de la especie Streptomyces. Se puede usar cualquier gen que codifica una proteína que tiene la capacidad de sintetizar acetoacetil-CoA a partir de malonil-CoA y acetil-CoA y que no sintetiza acetoacetil-CoA a partir de dos moléculas de acetil-CoA en los métodos descritos actualmente. En ciertas modalidades, el gen de acetoacetil-CoA sintasa puede ser un gen que codifica una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos con una similitud alta o prácticamente idéntica con la secuencia de aminoácidos de la sec . con núm. de ident.:5 y que tiene la función de sintetizar acetoacetil-CoA a partir de malonil-CoA y acetil-CoA. La expresión "altamente similar" o "prácticamente idéntica" se refiere a, por ejemplo, por lo menos aproximadamente 80% de identidad, por lo menos aproximadamente 85%, por lo menos aproximadamente 90%, por lo menos aproximadamente 91%, por lo menos aproximadamente 92%, por lo menos aproximadamente 93%, por lo menos aproximadamente 94%, por lo menos aproximadamente 95%, por lo menos aproximadamente 96%, por lo menos aproximadamente 97%, por lo menos aproximadamente 98% y por lo menos aproximadamente 99% de identidad. Como se usó anteriormente, el valor de identidad corresponde al porcentaje de identidad entre los residuos de aminoácidos en una secuencia de aminoácidos diferente y la secuencia de aminoácidos de la sec. con núm. de ident . : 5 , el cual se calcula al realizar el alineamiento de la secuencia de aminoácidos de la sec. con núm. de ident.: 5 y la secuencia de aminoácidos diferente con el uso de un programa para buscar una similitud de secuencias .
En otras modalidades, el gen de acetoacetil-CoA sintasa puede ser un gen que codifica una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos derivada de la secuencia de aminoácidos de la sec . con núm. de ident . : 5 por sustitución, deleción, adición o inserción de uno o más aminoácidos y que tiene la función de sintetizar acetoacetil-CoA a partir de malonil-CoA y acetil-CoA. En la presente descripción, la expresión "más aminoácidos" se refiere a, por ejemplo, 2 a 30 aminoácidos, preferentemente, 2 a 20 aminoácidos, con mayor preferencia, 2 a 10 aminoácidos y, con la máxima preferencia, 2 a 5 aminoácidos.
En otras modalidades adicionales, el gen de acetoacetil-CoA sintasa puede constar de un polinucleótido con la capacidad de hibridizar para una porción o la totalidad de un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de la sec. con núm. de ident.: 5 en condiciones rigurosas y con la capacidad de codificar una proteína que tiene la función de sintetizar acetoacetil-CoA a partir de malonil-CoA y acetil-CoA. En la presente descripción, la hibridación en condiciones rigurosas corresponde al mantenimiento de la unión en condiciones de lavado a 60°C dos veces SSC. La hibridación se puede llevar a cabo por métodos convencionalmente conocidos, tales como el método descrito en J. Sambrook et al. Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3.° ed., Cold Spring Harbor Laboratory (2001) .
Como se describe en la presente descripción, un gen que codifica una acetoacetil-CoA sintasa que tiene una secuencia de aminoácidos que difiere de la secuencia de aminoácidos de la sec . con núm. de ident . : 5 puede aislarse potencialmente de cualquier organismo, por ejemplo, un actinomiceto que no se obtiene de la cepa CL190 de la especie Sfcreptomyces . Además, los genes de acetoacetil-CoA sintasa para usar en la presente descripción se pueden obtener al modificar un polinucleótido que codifica la secuencia de aminoácidos de la sec. con núm. de ident .: 5 por un método conocido en la técnica. La mutagénesis de una secuencia de nucleótidos se puede llevar a cabo mediante un método conocido, tal como el método de Kunkel o el método dúplex con interrupciones o por un método similar a cualquiera de estos. Por ejemplo, la mutagénesis se puede llevar a cabo con el uso de un kit de mutagénesis (por ejemplo, nombres de los productos; mutante-K y mutante-G (TAKARA Bio) ) para mutagénesis específica del sitio, nombre del producto; un kit de la serie de mutagénesis in vitro de LA PCR (TAKARA Bio), y similares.
La actividad de una acetoacetil -CoA sintasa que tiene una secuencia de aminoácidos que difiere de la secuencia de aminoácidos de la sec. con núm. de ident. :5 se puede evaluar como se describe a continuación. Específicamente, un gen que codifica una proteína a evaluar se introduce, primero, en una célula hospedera de manera que el gen pueda expresarse en esta, seguido por purificación de la proteína por medio de una técnica tal como cromatografía. Se agrega malonil-CoA y acetil-CoA como sustratos a un regulador que contiene la proteína obtenida a evaluar, seguido por, por ejemplo, la incubación a una temperatura deseada (por ejemplo, de 10°C a 60°C) . Después de terminar la reacción, se determina la cantidad de sustrato perdido y/o la cantidad de producto (acetoacetil-CoA) producido. Por lo tanto, es posible evaluar si la proteína que se está analizando tiene o no la función de sintetizar acetoacetil-CoA a partir de malonil-CoA y acetil-CoA y para evaluar el grado de síntesis. En tal caso, es posible examinar si la proteína tiene o no la actividad de sintetizar acetoacetil-CoA a partir de dos moléculas de acetil-CoA al agregar acetil-CoA sola como un sustrato a un regulador que contiene la proteína obtenida a evaluar y determinar la cantidad de sustrato perdido y/o la cantidad de producto producido de manera similar.
Células recombinantes con la capacidad de una producción incrementada de mevalonato Las células recombinantes (por ejemplo, células bacterianas recombinantes) descritas en la presente descripción pueden producir mevalonato a una cantidad y/o concentración mayor que la de las mismas células sin ninguna manipulación en las diversas rutas enzimáticas descritas en la presente descripción. Por lo tanto, las células recombinantes (por ejemplo, células bacterianas) que se han sometido a ingeniería genética para la modulación en las diversas rutas descritas en la presente descripción son útiles para mejorar la producción de mevalonato.
Por lo tanto, en ciertos aspectos, la presente invención proporciona células recombinantes con la capacidad de mejorar la producción de mevalonato, en donde las células comprenden uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican un polipéptido que tiene actividad de fosfocetolasa y uno o más ácidos nucleicos que codifican uno o más polipéptidos de la ruta del MVA superior, en donde las células producen cantidades mayores de mevalonato en comparación con células que no comprenden el o los ácidos nucleicos heterólogos que codifican un polipéptido que tiene actividad de fosfocetolasa.
En ciertos aspectos, las células recombinantes descritas en la presente descripción comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica una fosfocetolasa aislada de Lactobacillus reuteri, Bifidobacterium longum, Ferrimonas baleárica, Pedobactor saltans, Streptomyces griseus y/o Nocardiopsis dassonvillei . En una modalidad, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterologo que codifica una fosfocetolasa aislada de Lactobacillus reuteri. En otra modalidad, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterologo que codifica una fosfocetolasa aislada de Bifidobacterium longum. En otra modalidad adicional, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterologo que codifica una fosfocetolasa aislada de Ferrimonas baleárica. En otra modalidad adicional, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterologo que codifica una fosfocetolasa aislada de Pedobactor saltans. En otra modalidad, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterologo que codifica una fosfocetolasa aislada de Streptomyces griseus. En otra modalidad adicional, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterologo que codifica una fosfocetolasa aislada de Nocardiopsis dassonvillei . En otros aspectos, las células recombinantes descritas en la presente descripción comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterologo que codifica una fosfocetolasa aislada de Clostridium acetobutylicum, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus paraplantarum, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium animalis, Bifidobacterium breve, Enterococcus gallinarum, Gardnerella vaginalis, Ferrimonas baleárica, Mucilaginibacter paludis, Nostoc punctiforme, Nostoc punctiforme PCC 73102, Pantoea, Pedobactor saltans, Rahnella aquatilis, Rhodopseudomonas palustris, Streptomyces griseus, Streptomyces avermitilis, Nocardiopsis dassonvillei y/o Thermobifida fusca. En otros aspectos adicionales, las células recombinantes descritas en la presente descripción comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterologo que codifica una fosfocetolasa aislada de Clostridium acetobutylicum, Bifidobacterium longum y/o Enterococcus gallinarum. En una modalidad, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterologo que codifica una fosfocetolasa aislada de Clostridium acetobutylicum. En otra modalidad, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterologo que codifica una fosfocetolasa aislada de Bifidobacterium longum. En otra modalidad adicional, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterologo que codifica una fosfocetolasa aislada de Enterococcus gallinarum.
En una modalidad, las células recombinantes comprenden, además, una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica los polipéptidos mvaE y mvaS de L. grayi, E. faecium, E. gallinarum, E. casseliflavus y/o E. faecalis . En otra modalidad, las células recombinantes comprenden, además, una acetoacetil-CoA sintasa y uno o más ácidos nucleicos que codifican uno o más polipéptidos de la ruta del MVA superior.
En una modalidad, las células recombinantes se pueden modificar genéticamente para incrementar la actividad de uno o más de los siguientes genes seleccionados del grupo que consiste en ribosa-5-fosfato isomerasa (rpiA y/o rpiS) , D-ribulosa-5-fosfato 3-epimerasa (rpe) , transquetolasa {tktA y/o tktB) , transaldolasa B (tal B) , fosfato acetiltransferasa (pta y/o eutD) . En otra modalidad, las células recombinantes se pueden modificar genéticamente para reducir la actividad de uno o más de los siguientes genes que incluyen glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (zwf) , 6-fosfofructocinasa-1 (pfkA y/o pfkB) , fructosa bisfosfato aldolasa (fba, fbaA, fbaB y/o fbaC) , gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (gapA y/o gapB) , acetato cinasa (ackA) , citrato sintasa (gltA) , El (ptsl) , EIICBGlc (ptsG) , EIIAGlc (crr) y/o HPr (ptstí) .
En un aspecto, las células recombinantes descritas en la presente descripción pueden producir mevalonato a una productividad volumétrica mayor que la de las mismas células que carecen de una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica un polipéptido que tiene actividad de fosfocetolasa . En ciertas modalidades, la célula recombinante puede producir más de 2.00 g/l/h de mevalonato. Alternativamente, las células recombinantes pueden producir más de aproximadamente 1.0 g/l/h, 1.2 g/l/h, 1.4 g/l/h, 1.6 g/l/h, 1.8 g/l/h, 2.0 g/l/h, 2.2 g/l/h, 2.4 g/l/h, 2.6 g/l/h, 2.8 g/l/h, 3.0 g/l/h, 3.2 g/l/h, 3.4 g/l/h, 3.6 g/l/h, 3.8 g/l/h, 4.0 g/l/h. 4.2 g/l/h, 4.4 g/l/h, 4.6 g/l/h, 4.8 g/l/h, 5.0 g/l/h, 5.2 g/l/h, 5.4 g/l/h, 5.6 g/l/h, 5.8 g/l/h, 6.0 g/l/h de mevalonato, no excluyente, así como cualquier valor numérico entre estos números.
En un aspecto, las células recombinantes descritas en la presente descripción pueden producir mevalonato a un título mayor que el de las mismas células que carecen de una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica un polipéptido que tiene actividad de fosfocetolasa . Estas células recombinantes pueden producir más de aproximadamente 100 g/1 de título pico de mevalonato después de 48 horas de fermentación. Alternativamente, las células recombinantes pueden producir más de aproximadamente 50 g/1, 60 g/1, 70 g/1, 80 g/1, 90 'g/1, 100 g/1, 110 g/1, 120 g/1, 130 g/1, 140 g/1, 150 g/1, 160 g/1, 170 g/1, 180 g/1, 190 g/1, 200 g/1, 210 g/1, 220 g/1, 230 g/1, 240 g/1, 250 g/1, 260 g/1, 270 g/1, 280 g/1, 290 g/1, 300 g/1 de título pico de mevalonato después de 48 horas de fermentación, no excluyente, así como cualquier valor numérico entre estos números.
En otras modalidades, las células recombinantes descritas en la presente descripción comprenden, además, una o más mutaciones que incrementan el flujo de carbono hacia la ruta del MVA y, por lo tanto, pueden producir títulos mayores de mevalonato en comparación con las células que no se han modificado genéticamente de la misma manera. En tales modalidades, las células recombinantes descritas en la presente descripción producen mevalonato a un título pico mayor que el de las mismas células que carecen de una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica polipéptido de fosfocetolasa que tiene actividad de fosfocetolasa . En una modalidad, las células recombinantes se pueden modificar genéticamente para incrementar la actividad de uno o más de los siguientes genes seleccionados del grupo que consiste en ribosa-5-fosfato isomerasa (rpiA y/o rpiB) , D-ribulosa-5-fosfato 3-epimerasa (rpe) , transquetolasa ( tktA y/o tktB) , transaldolasa B (tal B) , fosfato acetiltransferasa (pta y/o eut£>) . En otra modalidad, las células recombinantes se pueden modificar genéticamente aún más para reducir la actividad de uno o más de los siguientes genes que incluyen glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (zwf) , 6-fosfofructocinasa-1 {pfkA y/o pfkB) , fructosa bisfosfato aldolasa (fba, fbaA, fbaB y/o fbaC) , gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (gapA y/o gapB) , acetato cinasa {ackA) , citrato sintasa {gltA) , El (ptsl) , EIICBGl (ptsG) , EIIAGlc (crr) y/o HPr (ptsH) .
En un aspecto, las células recombinantes descritas en la presente descripción pueden producir mevalonato a un índice de productividad celular (CPI) mayor para mevalonato que el de las mismas células que carecen de una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica un polipéptido que tiene actividad de fosfocetolasa . Las células recombinantes pueden tener un CPI para mevalonato de por lo menos aproximadamente 3.0 (g/g) . Alternativamente, las células recombinantes pueden tener un CPI para mevalonato de por lo menos aproximadamente 1 (g/g) , 2 (g/g) , 3 (g/g) , 4 (g/g) , 5 (g/g) , 6 (g/g) , 7 (g/g) , 8 (g/g) , 9 (g/g) , 10 (g/g) , 11 (g/g) , 12 (g/g) , 13 (g/g) , 14 (g/g) , 15 (g/g) , 20 (g/g) , 25 (g/g) o 30 (g/g) , no excluyente, así como cualquier valor numérico entre estos números.
En ciertas modalidades, las células recombinantes descritas en la presente descripción comprenden, además, una o más mutaciones que incrementan el flujo de carbono hacia la ruta del MVA lo cual produce un índice de productividad celular (CPI) mayor para mevalonato en comparación con las células que no se han modificado genéticamente de la misma manera. Adicionalmente , las células recombinantes descritas en la presente descripción tienen un CPI mayor que el de las mismas células que carecen de una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica el polipéptido de fosfocetolasa que tiene actividad de fosfocetolasa . En una modalidad, las células recombinantes se pueden modificar genéticamente para incrementar la actividad de uno o más de los siguientes genes seleccionados del grupo que consiste en ribosa-5-fosfato isomerasa (rpiA y/o rpiB) , D-ribulosa-5-fosfato 3-epimerasa (rpe) , transquetolasa (tktA y/o tktB) , transaldolasa B (tal S) , fosfato acetiltransferasa (pta y/o eutD) . En otra modalidad, estas células recombinantes se pueden modificar genéticamente para reducir la actividad de uno o más de los siguientes genes que incluyen glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (zwf) , 6 - fosfofructocinasa-1 (pfkA y/o pfkB) , fructosa bisfosfato aldolasa {fba, fbaA, fbaB y/o fbaC), gliceraldehído-3 -fosfato deshidrogenasa (gapA y/o gapB) , acetato cinasa (ackA) , citrato sintasa (gltA) , El (ptsl) , EIICBGlc (ptsG) , EIIAGlc (crr) y/o HPr (ptsíí) .
Adicionalmente , las células descritas en la presente descripción tienen un rendimiento de masa de mevalonato a partir de glucosa mayor que el de las mismas células que carecen de una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica polipéptido de fosfocetolasa que tiene actividad de fosfocetolasa . Las células recombinantes pueden producir un rendimiento de masa de mevalonato a partir de glucosa de por lo menos aproximadamente 28%. Alternativamente, las células recombinantes pueden producir un rendimiento de masa de mevalonato a partir de glucosa de por lo menos aproximadamente 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50% o 55%, no excluyente, así como cualquier valor numérico entre estos números.
En ciertas modalidades, las células recombinantes descritas en la presente descripción comprenden, además, una o más mutaciones que incrementan el flujo de carbono hacia la ruta del MVA lo cual produce un mayor rendimiento de masa de mevalonato en comparación con las células que no se han modificado genéticamente de la misma manera. Adicionalmente , las células recombinantes descritas en la presente descripción tienen un rendimiento de masa de mevalonato mayor que el de las mismas células que carecen de una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica el polipéptido de fosfocetolasa que tiene actividad de fosfocetolasa . En una modalidad, las células recombinantes se pueden modificar genéticamente aún más para aumentar la actividad de uno o más de los siguientes genes seleccionados del grupo que consiste en ribosa-5-fosfato isomerasa (rpiA y/o rpiB) , D-ribulosa-5-fosfato 3-epimerasa (rpe) , transcetolasa {tktA y/o tktB) , transaldolasa B {tal B) , fosfato acetiltransferasa (pta y/o eutD) . En otra modalidad, estas células recombinantes se pueden modificar genéticamente para reducir la actividad de uno o más de los siguientes genes que incluyen glucosa- 6-fosfato deshidrogenasa {zwf) , 6-fosfofructocinasa-1 (pfkA y/o pfkB) , fructosa bisfosfato aldolasa {fba, fbaA, fbaB y/o fbaC) , gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (gapA y/o gapB) , acetato cinasa (ackA) , citrato sintasa {gltA) , El (ptsl) , EIICBGlc {ptsG) , EIIAGlc (crr) y/o HPr (ptsH) .
En un aspecto, las células recombinantes descritas en la presente descripción producen mevalonato mientras acumulan menos acetato en el caldo de fermentación en comparación con las mismas células que carecen de una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica un polipéptido que tiene actividad de fosfocetolasa . Las células recombinantes pueden producir concentraciones elevadas de mevalonato mientras acumulan menos de 4.5 g/1 de acetato en el caldo de fermentación durante una fermentación de 48 h. Alternativamente, las células recombinantes pueden producir concentraciones elevadas de mevalonato mientras acumulan menos de aproximadamente 8.0 g/1, 7.5 g/1, 7.0 g/1, 6.5 g/1, 6.0 g/1, 5.5 g/1, 5.0 g/1, 4.5 g/1, 4.0 g/1, 3.5 g/1, 3.0 g/1, 2.5 g/1, 2.0 g/1 o 1.5 g/1 de acetato en el caldo de fermentación durante una fermentación de 48 h, no excluyente, así como cualquier valor numérico entre estos números. En ciertas modalidades, la acumulación reducida de acetato en el caldo de fermentación puede mejorar la viabilidad celular durante el ciclo de fermentación.
En ciertas modalidades, las células recombinantes descritas en la presente descripción comprenden, además, una o más mutaciones que incrementan el flujo de carbono hacia la ruta del MVA lo cual produce concentraciones elevadas de mevalonato mientras acumulan menos acetato en el caldo de fermentación en comparación con las células que no se han modificado genéticamente de la misma manera. En ciertas modalidades, la acumulación reducida de acetato en el caldo de fermentación puede mejorar la viabilidad celular durante el ciclo de fermentación.
Métodos para usar células recombinantes para producir cantidades incrementadas de mevalonato La presente descripción proporciona, además, métodos para producir mevalonato. En algunos aspectos, el método para producir mevalonato comprende: (a) cultivar una composición que comprende células recombinantes que se han modificado genéticamente para incrementar el flujo de carbono como se describe en la presente descripción (que incluye cualquiera de las células recombinantes descritas anteriormente) , o progenie de estas, con la capacidad de producir mevalonato; y (b) producir mevalonato. En algunos aspectos, el método para producir mevalonato comprende las etapas de cultivar cualquiera de las células recombinantes descritas en la presente descripción en condiciones adecuadas para la producción de mevalonato y dejar que las células recombinantes produzcan mevalonato. En algunos aspectos, el método para producir mevalonato comprende, además, una etapa de recuperar el mevalonato.
Como se describe en la presente descripción, los métodos para producir mevalonato comprenden las siguientes etapas: (a) cultivar células recombinantes (que incluyen, pero no se limitan a, células de E. coli) que no expresan de manera endógena un polipéptido de fosfocetolasas, en donde las células expresan de manera heteróloga una o más copias de un gen que codifica un polipéptido de fosfocetolasas junto con uno o más ácidos nucleicos heterólogos que expresan uno o más péptidos de la ruta del MVA; y (b) producir mevalonato. En cierta modalidad, el polipéptido de fosfocetolasas es de Lactobacillus reuteri, Bifidobacterium longum, Ferrimonas baleárica, Pedobactor saltans, Streptomyces griseus y/o Nocardiopsis dassonvillei . En una modalidad, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterologo que codifica una fosfocetolasa aislada de Lactobacillus reuteri. En otra modalidad, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterologo que codifica una fosfocetolasa aislada de Bifidobacterium longum. En otra modalidad adicional, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterologo que codifica una fosfocetolasa aislada de Ferrimonas baleárica . En otra modalidad adicional, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterologo que codifica una fosfocetolasa aislada de Pedobactor saltans. En otra modalidad, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterologo que codifica una fosfocetolasa aislada de Streptomyces griseus. En otra modalidad adicional, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterologo que codifica una fosfocetolasa aislada de Nocardiopsis dassonvillei. Adicionalmente, las células recombinantes pueden producir mevalonato en concentraciones mayores que la de las mismas células que carecen de una o más copias heterólogas de un gen que codifica un polipéptido de fosfocetolasas de Lactobacillus reuteri, Bifidobacterium longu , Ferrimonas baleárica, Pedobactor saltans, Streptomyces griseus y/o Nocardiopsis dassonvillei junto con uno o más ácidos nucleicos heterólogos que expresan uno o más péptidos de la ruta del MVA, cuando las células se cultivan en medio mínimo. En ciertas modalidades, la copia o copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica un polipéptido de fosfocetolasas a partir de Lactobacillus reuteri, Bifidobacterium longum, Ferrimonas baleárica, Pedobactor saltans, Streptomyces griseus y/o Nocardiopsis dassonvillei es un ácido nucleico heterólogo que se integra en el cromosoma de la célula hospedera.
En ciertas modalidades, el polipéptido de fosfocetolasas es de Clostridium acetobutylicum, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus paraplantarum, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium animalis, Bifidobacterium breve, Enterococcus gallinarum, Gardnerella vaginalis, Ferrimonas baleárica, Mucilaginibacter paludis, Nostoc punctiforme, Nostoc punctiforme PCC 73102, Pantoea, Pedobactor saltans, Rahnella aquatilis, Rhodopseudomonas palustris, Streptomyces griseus, Streptomyces avermitilis, Nocardiopsis dassonvillei y/o Thermobifida fusca. En otras modalidades, el polipéptido de fosfocetolasas es de Clostridium acetobutylicum, Bifidobacterium longum y/o Enterococcus gallinarum. En una modalidad, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica una fosfocetolasa aislada de Clostridium acetobutylicum. En otra modalidad, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica una fosfocetolasa aislada de Bifidobacterium longum. En otra modalidad adicional, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica una fosfocetolasa aislada de Enterococcus gallinarum. Adicionalmente , las células recombinantes pueden producir mevalonato en concentraciones mayores que la de las mismas células que carecen de una o más copias heterólogas de un gen que codifica un polipéptido de fosfocetolasas a partir de Clostridium acetobutylicum, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus paraplantarum, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium animalis, Bifidobacterium breve, Enterococcus gallinarum, Gardnerella vaginalis, Ferrimonas baleárica, Mucilaginibacter paludis, Nostoc punctiforme, Nostoc punctiforme PCC 73102, Pantoea, Pedobactor saltans, Rahnella aquatilis, Rhodopseudomonas palustris, Streptomyces griseus, Streptomyces avermitilis, Nocardiopsis dassonvillei y/o Thermobifida fusca junto con uno o más ácidos nucleicos heterólogos que expresan uno o más péptidos de la ruta del MVA, cuando las células se cultivan en un medio mínimo. En ciertas modalidades, la copia o copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica un polipéptido de fosfocetolasas a partir de Clostridium acetobutylicum, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus paraplantarum, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium animalis, Bifidobacterium breve, Enterococcus gallinaru , Gardnerella vaginalis, Ferrimonas baleárica, Mucilaginibacter paludis, Nostoc punctiforme, Nostoc punctiforme PCC 73102, Pantoea, Pedobactor saltans, Rahnella aquatilis, Rhodopseudomonas palustris, Streptomyces griseus, Streptomyces avermitilis, Nocardiopsis dassonvillei y/o Thermobifida fusca son ácidos nucleicos heterólogos que se integran en el cromosoma de la célula hospedera.
Los métodos instantáneos para la producción de mevalonato pueden producir mevalonato con el uso de células que tienen una productividad volumétrica mayor que 2.00 g/l/h de mevalonato. Alternativamente, las células recombinantes pueden producir más de aproximadamente 1.0 g/l/h, 1.2 g/l/h, 1.4 g/l/h, 1.6 g/l/h, 1.8 g/l/h, 2.0 g/l/h, 2.2 g/l/h, 2.4 g/l/h, 2.6 g/l/h, 2.8 g/l/h, 3.0 g/l/h, 3.2 g/l/h, 3.4 g/l/h, 3.6 g/l/h, 3.8 g/l/h, 4.0 g/l/h. 4.2 g/l/h, 4.4 g/l/h, 4.6 g/l/h, 4.8 g/l/h, 5.0 g/l/h, 5.2 g/l/h, 5.4 g/l/h, 5.6 g/l/h, 5.8 g/l/h, 6.0 g/l/h de mevalonato, no excluyente, así como cualquier valor numérico entre estos números. En algunos aspectos, el método para producir mevalonato comprende, además, una etapa de recuperar el mevalonato.
En otras modalidades, los métodos para producir mevalonato pueden comprender las siguientes etapas: (a) cultivar células recombinantes (que incluyen, pero no se limitan a, células de E. coli) que no expresan de manera endógena un polipéptido de fosfocetolasas , en donde las células expresan de manera heteróloga una o más copias de un gen que codifica un polipéptido de fosfocetolasas junto con uno o más ácidos nucleicos heterologos que expresan uno o más péptidos de la ruta del MVA; y (b) producir mevalonato, en donde las células recombinantes producen mevalonato con un título pico más alto después de 48 horas de fermentación en comparación con el de las mismas células que carecen de una o más copias heterólogas de un gen que codifica un polipéptido de fosfocetolasas . En ciertas modalidades, el polipéptido de fosfocetolasas es de Lactobacillus reuteri, Bifidobacterium longum, Ferri onas baleárica, Pedobactor saltans, Streptomyces griseus y/o Nocardiopsis dassonvillei . En una modalidad, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica una fosfocetolasa aislada de Lactobacillus reuteri. En otra modalidad, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica una fosfocetolasa aislada de Bifidobacterium longum. En otra modalidad adicional, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica una fosfocetolasa aislada de Ferrimonas baleárica. En otra modalidad adicional, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica una fosfocetolasa aislada de Pedobactor saltans . En otra modalidad, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica una fosfocetolasa aislada de Streptomyces griseus. En otra modalidad, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica una fosfocetolasa aislada de Nocardiopsis dassonvillei . En otras modalidades, las células recombinantes descritas en la presente descripción comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica una fosfocetolasa aislada de Clostridium acetobutylicum, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus paraplantarum, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium animalis, Bifidobacterium breve, Enterococcus gallinarum, Gardnerella vaginalis, Ferrimonas baleárica, Mucilaginibacter paludis, Nostoc punctiforme, Nostoc punctiforme PCC 73102, Pantoea, Pedobactor saltans, Rahnella aquatilis, Rhodopseudomonas palustris, St eptomyces griseus, Streptomyces avermitilis, Nocardiopsis dassonvillei y/o Thermobifida fusca. En otras modalidades adicionales, las células recombinantes descritas en la presente descripción comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica una fosfocetolasa aislada de Clostridium acetobutylicum, Bifidobacterium longum y/o Enterococcus gallinarum. En una modalidad, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica una fosfocetolasa aislada de Clostridium acetobutylicum. En otra modalidad, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica una fosfocetolasa aislada de Bifidobacterium longum. En otra modalidad adicional, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica una fosfocetolasa aislada de Enterococcus gallinarum.
Los métodos instantáneos para la producción de mevalonato pueden producir mevalonato con el uso de células que pueden producir un título pico mayor que aproximadamente 100 g/1 de título pico de mevalonato después de 48 horas de fermentación. Alternativamente, las células recombinantes pueden producir más de aproximadamente 50 g/1, 60 g/1, 70 g/1, 80 g/1, 90 g/1, 100 g/1, 110 g/1, 120 g/1, 130 g/1, 140 g/1, 150 g/1, 160 g/1, 170 g/1, 180 g/1, 190 g/1, 200 g/1, 210 g/1, 220 g/1, 230 g/1, 240 g/1, 250 g/1, 260 g/1, 270 g/1, 280 g/1, 290 g/1, 300 g/1 de título pico de mevalonato después de 48 horas de fermentación, no excluyente, así como cualquier valor numérico entre estos números. En algunos aspectos, el método para producir mevalonato comprende, además, una etapa de recuperar el mevalonato .
En otras modalidades, los métodos para producir mevalonato pueden comprender las siguientes etapas: (a) cultivar células recombinantes (que incluyen, pero no se limitan a, células de E. coli) que no expresan de manera endógena un polipéptido de fosfocetolasas, en donde las células expresan de manera heteróloga una o más copias de un gen que codifica un polipéptido de fosfocetolasas junto con uno o más ácidos nucleicos heterologos que expresan uno o más péptidos de la ruta del MVA; y (b) producir mevalonato, en donde las células recombinantes tienen un CPI para mevalonato mayor que el de las mismas células que carecen de una o más copias heterólogas de un gen que codifica un polipéptido de fosfocetolasas . En ciertas modalidades, el polipéptido de fosfocetolasas es de Lactobacillus reuteri, Bifidobacterium longum, Ferrimonas baleárica, Pedobactor saltans, Streptomyces griseus y/o Nocardiopsis dassonvillei . En una modalidad, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica una fosfocetolasa aislada de Lactobacillus reuteri. En otra modalidad, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterologo que codifica una fosfocetolasa aislada de Bifidobacterium longum. En otra modalidad adicional, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterologo que codifica una fosfocetolasa aislada de Ferrimonas baleárica. En otra modalidad adicional, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterologo que codifica una fosfocetolasa aislada de Pedobactor saltans . En otra modalidad, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterologo que codifica una fosfocetolasa aislada de Streptomyces griseus. En otra modalidad adicional, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterologo que codifica una fosfocetolasa aislada de Nocardiopsis dassonvillei . En otras modalidades, las células recombinantes descritas en la presente descripción comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterologo que codifica una fosfocetolasa aislada de Clostridium acetobutylicum, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus paraplantarum, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium ani alis, Bifidobacterium breve, Enterococcus gallinarum, Gardnerella vaginalis, Ferrimonas baleárica, Mucilaginibacter paludis, Nostoc punctiforme, Nostoc punctiforme PCC 73102, Pantoea, Pedojbactor saltans, Rahnella aquatilis, Rhodopseudomonas palustris, Streptomyces griseus, Streptomyces avermitilis, Nocardiopsis dassonvillei y/o Thermobifida fusca. En otras modalidades adicionales, las células recombinantes descritas en la presente descripción comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterologo que codifica una fosfocetolasa aislada de Clostridium acetobutylicum, Bifidobacterium longum y/o Enterococcus gallinarum. En una modalidad, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterologo que codifica una fosfocetolasa aislada de Clostridium acetobutylicum. En otra modalidad, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterologo que codifica una fosfocetolasa aislada de Bifidobacterium longum. En otra modalidad adicional, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterologo que codifica una fosfocetolasa aislada de Enterococcus gallinarum.
Los métodos instantáneos para la producción de mevalonato pueden producir mevalonato con el uso de células con un CPI para mevalonato de por lo menos aproximadamente 3.0 (g/g) . Alternativamente, las células recombinantes pueden tener un CPI para mevalonato de por lo menos aproximadamente 1 (g/g) , 2 (g/g) , 3 (g/g) , 4 (g/g) , 5 (g/g) , 6 (g/g) , 7 (g/g), 8 (g/g), 9 (g/g), 10 (g/g), 11 (g/g), 12 (g/g), 13 (g/g) , 14 (g/g) , 15 (g/g) , 20 (g/g) , 25 (g/g) o 30 (g/g) , no excluyente, así como cualquier valor numérico entre estos números. En algunos aspectos, el método para producir mevalonato comprende, además, una etapa de recuperar el mevalonato .
En ciertas modalidades, los métodos para producir mevalonato pueden comprender las siguientes etapas: (a) cultivar células recombinantes (que incluyen, pero no se limitan a, células de E. coli) que no expresan de manera endógena un polipéptido de fosfocetolasas , en donde las células expresan de manera heteróloga una o más copias de un gen que codifica un polipéptido de fosfocetolasas junto con uno o más ácidos nucleicos heterologos que expresan uno o más péptidos de la ruta del MVA; y (b) producir mevalonato, en donde las células recombinantes muestran una velocidad de captación de oxígeno reducida (OUR, por sus siglas en inglés) en comparación con la de las mismas células que carecen de una o más copias heterólogas de un gen que codifica un polipéptido de fosfocetolasas . En ciertas modalidades, las células recombinantes que expresan una o más copias heterólogas de un gen que codifica un polipéptido de fosfocetolasas muestran una reducción de hasta 1 vez, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 6 veces o 7 veces en la OUR en comparación con las células recombinantes que no expresan una fosfocetolasa .
La presente descripción proporciona métodos para usar cualquiera de las células descritas anteriormente para una producción mejorada de mevalonato. La producción de mevalonato por las células se puede mejorar por la expresión de uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican un polipéptido de fosfocetolasas . En ciertas modalidades, el polipéptido de fosfocetolasas es de Lactobacillus reuteri, Bifidobacterium longum, Ferrimonas baleárica, Pedobactor saltans, Streptomyces griseus y/o Nocardiopsis dassonvillei . En una modalidad, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterologo que codifica una fosfocetolasa aislada de Lactobacillus reuteri. En otra modalidad, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterologo que codifica una fosfocetolasa aislada de Bifidobacterium longum. En otra modalidad adicional, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterologo que codifica una fosfocetolasa aislada de Ferrimonas baleárica . En otra modalidad adicional, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterologo que codifica una fosfocetolasa aislada de Pedobactor saltans. En otra modalidad, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterologo que codifica una fosfocetolasa aislada de Streptomyces griseus. En otra modalidad adicional, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterologo que codifica una fosfocetolasa aislada de Nocardiopsis dassonvillei. En otras modalidades, las células recombinantes descritas en la presente descripción comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterologo que codifica una fosfocetolasa aislada de Clostridium acetobutylicum, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus paraplantarum, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium animalis, Bifidobacterium breve, Enterococcus gallinarum, Gardnerella vaginalis, Ferrimonas baleárica, Mucilaginibacter paludis, Nostoc punctiforme, Nostoc punctiforme PCC 73102, Pantoea, Pedo£>actor saltans, Rahnella aquatilis, Rhodopseudomonas palustris, Streptomyces griseus, Streptomyces avermitilis, Nocardiopsis dassonvillei y/o Thermobifida fusca. En otras modalidades adicionales, las células recombinantes descritas en la presente descripción comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterologo que codifica una fosfocetolasa aislada de Clostridium acetobutylicum, Bifidobacterium longum y/o Enterococcus gallinarum. En una modalidad, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterologo que codifica una fosfocetolasa aislada de Clostridium acetobutylicum. En otra modalidad, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterologo que codifica una fosfocetolasa aislada de Bifidobacterium longum. En otra modalidad adicional, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterologo que codifica una fosfocetolasa aislada de Enterococcus gallinarum.
La producción de mevalonato puede mejorarse por al menos 1,000,000 veces (por ej emplo , de aproximadamente 1 a aproximadamente 500,000 veces , de aproximadamente 1 a aproximadamente 50, 000 veces , de aproximadamente 1 a aproximadamente 5, 000 veces, de aproximadamente 1 a aproximadamente 1, 000 veces, de aproximadamente 1 a aproximadamente 500 veces , de aproximadamente 1 a aproximadamente 100 veces , de aproximadamente 1 a aproximadamente 50 veces , de aproximadamente 5 a aproximadamente 100,000 veces , de aproximadamente 5 a aproximadamente 10, 000 veces. de aproximadamente 5 a aproximadamente 1, 000 veces , de aproximadamente 5 a aproximadamente 500 veces , de aproximadamente 5 a aproximadamente 100 veces , de aproximadamente 10 a aproximadamente 50, 000 veces , de aproximadamente 50 a aproximadamente 10, 000 veces , de aproximadamente 100 a aproximadamente 5, 000 veces, de aproximadamente 200 a aproximadamente 1, 000 veces, de aproximadamente 50 a aproximadamente 500 veces o de aproximadamente 50 a aproximadamente 200 veces) en comparación con la producción de mevalonato por células productoras de mevalonato sin la expresión de uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican un polipéptido de fosfocetolasas . En ciertas modalidades descritas en la presente descripción, las células hospederas se han modificado genéticamente aún más para un flujo de carbono incrementado para la producción de MVA. En otras modalidades, las células recombinantes descritas en la presente descripción comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterologo que codifica una fosfocetolasa aislada de Clostridium acetobutylicum, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus paraplantarum, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium animalis, Bifidobacterium breve, Enterococcus gallinarum, Gardnerella vaginalis, Ferrimonas baleárica, Mucilaginibacter paludis, Nostoc punctiforme, Nostoc punctiforme PCC 73102, Pantoea, Pedobactor saltans, Rahnella aquatilis, Rhodopseudomonas palustris, Streptomyces griseus, Streptomyces avermitilis, Nocardiopsis dassonvillei y/o Ther obifida fusca. En otras modalidades adicionales, las células recombinantes descritas en la presente descripción comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterologo que codifica una fosfocetolasa aislada de Clostridium acetobutylicum, Bifidobacterium longum y/o Enterococcus gallinarum. En una modalidad, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterologo que codifica una fosfocetolasa aislada de Clostridium acetobutylicum. En otra modalidad, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterologo que codifica una fosfocetolasa aislada de Bifidobacterium longum. En otra modalidad adicional, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica una fosfocetolasa aislada de Enterococcus gallinarum.
En otros aspectos, los métodos descritos en la presente descripción pueden facilitar la producción mejorada de mevalonato por al menos aproximadamente cualquiera de 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 1 vez, 2 veces, 5 veces, 10 veces, 20 veces, 50 veces, 100 veces, 200 veces, 500 veces, 1000 veces, 2000 veces, 5000 veces, 10,000 veces, 20,000 veces, 50,000 veces, 100,000 veces, 200,000 veces, 500,000 veces o 1,000,000 veces en comparación con la producción de mevalonato por células productoras de mevalonato sin la expresión de uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican un polipéptido de fosfocetolasas . En ciertas modalidades descritas en la presente descripción, las células hospederas se han modificado genéticamente aún más para un flujo de carbono incrementado para la producción de VA.
Adicionalmente , se puede usar condiciones de cultivo celular más específicas para cultivar las células en los métodos descritos en la presente descripción. Por ejemplo, en algunos aspectos, el método para producir mevalonato comprende las etapas de (a) cultivar células recombinantes (que incluyen, pero no se limitan a, células de E. coli) que no tienen de manera endógena un gen de fosfocetolasa en medio mínimo a 3 °C, en donde las células recombinantes expresan de manera heteróloga una o más copias de un gen heterologo que codifica un polipéptido de fosfocetolasas en un plásmido de copia baja a media y bajo el control de un promotor fuerte; y (b) producir mevalonato. En ciertas modalidades, el polipéptido de fosfocetolasas es de Lactobacillus reuteri, Bifidobacterium longum, Ferrimonas baleárica, Pedobactor saltans, Streptomyces griseus y/o Nocardiopsis dassonvillei . En una modalidad, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterologo que codifica una fosfocetolasa aislada de Lactobacillus reuteri. En otra modalidad, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterologo que codifica una fosfocetolasa aislada de Bifidobacterium longum. En otra modalidad adicional, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterologo que codifica una fosfocetolasa aislada de Ferrimonas baleárica. En otra modalidad adicional, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterologo que codifica una fosfocetolasa aislada de Pedojbactor saltans. En otra modalidad, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterologo que codifica una fosfocetolasa aislada de Streptomyces griseus. En otra modalidad adicional, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterologo que codifica una fosfocetolasa aislada de Nocardiopsis dassonvillei . En otras modalidades, las células recombinantes descritas en la presente descripción comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterologo que codifica una fosfocetolasa aislada de Clostridium acetobutylicum, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus paraplantarum, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium animalis, Bifidobacterium breve, Enterococcus gallinarum, Gardnerella vaginalis, Ferrimonas baleárica, Mucilaginibacter paludis, Nostoc punctifor e, Nostoc punctiforme PCC 73102, Pantoea, Pedobactor saltans, Rahnella aguatilis, Rhodopseudomonas palustris, Streptomyces griseus, Streptomyces avermitilis, Nocardiopsis dassonvillei y/o Thermobifida fusca. En otras modalidades adicionales, las células recombinantes descritas en la presente descripción comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterologo que codifica una fosfocetolasa aislada de Clostridium acetobutylicum, Bifidobacterium longum y/o Enterococcus gallinarum. En una modalidad, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterologo que codifica una fosfocetolasa aislada de Clostridium acetobutylicum. En otra modalidad, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterologo que codifica una fosfocetolasa aislada de Bifidobacterium longum. En otra modalidad adicional, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterologo que codifica una fosfocetolasa aislada de Enterococcus gallinarum. En algunos aspectos, el método para producir mevalonato comprende, además, una etapa de recuperar el mevalonato.
Células recombinantes con la capacidad de producir isopreno El isopreno (2-metil-l, 3-butadieno) es un compuesto orgánico importante usado en una amplia variedad de aplicaciones. Por ejemplo, el isopreno se usa como un intermedio o una materia prima en la síntesis de muchas composiciones químicas y polímeros, que incluyen la producción de caucho sintético. El isopreno es, además, un material biológico importante sintetizado naturalmente por muchas plantas y animales.
El isopreno se produce a partir de D APP por la acción enzimática de isopreno sintasa. Por lo tanto, sin limitaciones teóricas, se cree que el incremento en la producción celular de mevalonato en células recombinantes por cualquiera de las composiciones y métodos descritos anteriormente resultará, de igual manera, en la producción de cantidades mayores de isopreno. El incremento en el rendimiento molar de la producción de mevalonato a partir de glucosa representa rendimientos molares más altos de precursores de isoprenoides, isopreno y/o isoprenoides producidos a partir de glucosa cuando se combina con los niveles adecuados de actividad enzimática de mevalonato cinasa, fosfomevalonato cinasa, difosfomevalonato descarboxilasa, isopentenil difosfato isomerasa (por ejemplo, la ruta inferior del MVA) y otras enzimas adecuadas para la producción de isopreno e isoprenoides .
Como se describe en la presente descripción, la presente invención proporciona células recombinantes con la capacidad de producir de isopreno, en donde las células comprenden uno o más ácidos nucleicos heterologos que codifican un polipéptido que tiene actividad de fosfocetolasa y (i) uno o más ácidos nucleicos que codifican uno o más polipéptidos de la ruta completa del MVA (es decir, la ruta superior del MVA y la ruta inferior del MVA) y (ii) un ácido nucleico heterólogo que codifica un polipéptido de isopreno sintasa, en donde las células tienen la capacidad de producir cantidades recuperables de isopreno. En ciertas modalidades, la presente invención proporciona células recombinantes con la capacidad de mejorar la producción de isopreno, en donde las células comprenden uno o más ácidos nucleicos heterologos que codifican un polipéptido que tiene actividad de fosfocetolasa y (i) uno o más ácidos nucleicos que codifican uno o más polipéptidos de la ruta completa del MVA y (ii) un ácido nucleico heterólogo que codifica un polipéptido de isopreno sintasa, en donde las células producen cantidades mayores de isopreno en comparación con las células productoras de isopreno que no comprenden el ácido o ácidos nucleicos heterologos que codifican un polipéptido que tiene actividad de fosfocetolasa .
La producción de isopreno se puede llevar a cabo, además, con el uso de cualquiera de las células hospederas recombinantes descritas en la presente descripción que comprenden, además, una o más de las manipulaciones de rutas enzimáticas, en donde la actividad enzimática se modula para incrementar el flujo de carbono hacia la producción de mevalonato. Las células recombinantes descritas en la presente descripción que tienen diversas rutas enzimáticas manipuladas para un flujo de carbono incrementado para la producción de mevalonato pueden usarse para producir isopreno. En una modalidad, las células recombinantes se pueden modificar genéticamente aún más para aumentar la actividad de uno o más de los siguientes genes seleccionados del grupo que consiste en ribosa-5-fosfato isomerasa (rpiA y/o rpiB) , D-ribulosa-5-fosfato 3-epimerasa (rpe) , transcetolasa {tktA y/o tktB) , transaldolasa B (tal B) , fosfato acetiltransferasa (pta y/o eutD) . En otra modalidad, estas células recombinantes se pueden modificar genéticamente aún más para reducir la actividad de uno o más de los siguientes genes que incluyen glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (zwf) , 6-fosfofructocinasa-1 {pfkA y/o pfkB) , fructosa bisfosfato aldolasa {iba, fbaA, fbaB y/o fbaC) , gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (gapA y/o gapB) , acetato cinasa {ackA) , citrato sintasa (gltA) , El (ptsl) , EIICBGlc (ptsG) , EIIAGlc (crr) y/o HPr [ptsH) . Ácidos nucleicos que codifican polipéptidos de la ruta inferior del MVA En algunos aspectos de la presente invención, las células descritas en cualquiera de las composiciones o métodos descritos en la presente descripción comprenden, además, uno o más ácidos nucleicos que codifican uno o más polipéptidos de la ruta inferior del mevalonato (MVA) . En algunos aspectos, el polipéptido de la ruta inferior del MVA es un polipéptido endógeno. En algunos aspectos, el ácido nucleico endógeno que codifica un polipéptido de la ruta inferior del MVA se une operativamente a un promotor constitutivo. En algunos aspectos, el ácido nucleico endógeno que codifica un polipéptido de la ruta inferior del MVA se une operativamente a un promotor inducible. En algunos aspectos, el ácido nucleico endógeno que codifica un polipéptido de la ruta inferior del MVA se une operativamente a un promotor fuerte. En un aspecto particular, las células se modifican genéticamente para sobreexpresar el polipéptido endógeno de la ruta inferior del MVA con relación a las células silvestres. En algunos aspectos, el ácido nucleico endógeno que codifica un polipéptido de la ruta inferior del MVA se une operativamente a un promotor débil.
La ruta biosintética inferior de mevalonato comprende mevalonato cinasa (MVK) , fosfomevalonato cinasa (PMK) y difosfomevalonato descarboxilasa (MVD) . En algunos aspectos, la ruta inferior del MVA puede comprender, además, isopentenil difosfato isomerasa (IDI) . Las células proporcionadas en la presente invención pueden comprender por lo menos un ácido nucleico que codifica isopreno sintasa, uno o más polipéptidos de la ruta superior del MVA y/o uno o más polipéptidos de la ruta inferior del MVA. Los polipéptidos de la ruta inferior del MVA pueden ser cualquier enzima (a) que fosforiza mevalonato a mevalonato 5- fosfato; (b) que convierte mevalonato 5-fosfato a mevalonato 5-pirofosfato; y (c) que convierte mevalonato 5-pirofosfato a isopentenil pirofosfato. Más particularmente, la enzima que fosforiza mevalonato a mevalonato 5-fosfato puede ser del grupo que consiste en mevalonato cinasa de M. mazei, polipéptido de mevalonato cinasa de Lactobacillus, polipéptido de mevalonato cinasa de Lactobacillus sakei, polipéptido de mevalonato cinasa de levadura, polipéptido de mevalonato cinasa de Saccharomyces cerevisiae, polipéptido de mevalonato cinasa de Streptococcus, polipéptido de mevalonato cinasa de Streptococcus pneumoniae, polipéptido de mevalonato cinasa de Streptomyces, polipéptido de mevalonato cinasa de Streptomyces CL190 y polipéptido de mevalonato cinasa de M. Burtonii . En otro aspecto, la enzima que fosforiza mevalonato a mevalonato 5-fosfato es mevalonato cinasa de M. mazei.
En algunos aspectos, el polipéptido de la ruta inferior del MVA es un polipéptido heterólogo. En algunos aspectos, las células comprenden más de una copia de un ácido nucleico heterólogo que codifica un polipéptido de la ruta inferior del MVA. En algunos aspectos, el ácido nucleico heterólogo que codifica un polipéptido de la ruta inferior del MVA se une operativamente a un promotor constitutivo. En algunos aspectos, el ácido nucleico heterólogo que codifica un polipéptido de la ruta inferior del MVA se une operativamente a un promotor inducible. En algunos aspectos, el ácido nucleico heterólogo que codifica un polipéptido de la ruta inferior del MVA se une operativamente a un promotor fuerte. En algunos aspectos, el ácido nucleico heterólogo que codifica un polipéptido de la ruta inferior del MVA se une operativamente a un promotor débil. En algunos aspectos, el polipéptido heterólogo de la ruta inferior del MVA es un polipéptido de Saccharomyces cerevisiae, Enterococcus faecalis o Methanosarcina mazei.
Los ácidos nucleicos que codifican uno o más polipéptidos de la ruta inferior del MVA se pueden integrar en un genoma de las células o se pueden expresar de manera estable en las células. Los ácidos nucleicos que codifican uno o más polipéptidos de la ruta inferior del MVA pueden ser, adicionalmente, en un vector.
Los polipéptidos de la ruta inferior del MVA ilustrativos se proporcionan, además, a continuación: (i) mevalonato cinasa (MVK) ; (ii) fosfomevalonato cinasa (PMK) ; (iii) difosfomevalonato descarboxilasa (MVD) ; y (iv) isopentenil difosfato isomerasa (IDI) . Particularmente, el polipéptido de la ruta inferior del MVK puede ser del género Methanosarcina y, más específicamente, el polipéptido de la ruta inferior del MVK puede ser de Methanosarcina mazei. En algunas modalidades, el polipéptido de la ruta inferior del MVK puede ser de M. burtonii . Otros ejemplos adicionales de polipéptidos de la ruta inferior del MVA se pueden encontrar en la publicación de la solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 2010/0086978, cuyo contenido se incorpora expresamente en la presente descripción como referencia en su totalidad con respecto a los polipéptidos de la ruta inferior del MVK y variante de polipéptidos de la ruta inferior del MVK.
Los polipéptidos de la ruta inferior del MVA incluyen polipéptidos, fragmentos de polipéptidos, péptidos y polipéptidos de fusión que tienen por lo menos una actividad de un polipéptido de la ruta inferior del MVA. Los ácidos nucleicos ilustrativos de la ruta inferior del MVA incluyen ácidos nucleicos que codifican un polipéptido, fragmento de un polipéptido, péptido o polipéptido de fusión que tiene por lo menos una actividad de un polipéptido de la ruta inferior del MVA. Los polipéptidos y ácidos nucleicos ilustrativos de la ruta inferior del MVA incluyen polipéptidos y ácidos nucleicos de origen natural a partir de cualquiera de los organismos de origen descritos en la presente descripción. Adicionalmente, se puede usar, ademas, las variantes de los polipéptidos de la ruta inferior del MVA que confieren el resultado de una producción mejorada de isopreno.
En algunos aspectos, el polipéptido de la ruta inferior del MVA es un polipéptido de Saccharomyces cerevisiae, Enterococcus faecalis o Methanosarcina mazei. En algunos aspectos, el polipéptido de MVK se selecciona del grupo que consiste en polipéptido de mevalonato cinasa de Lactobacillus, polipéptido de mevalonato cinasa de Lactobacillus sakei, polipéptido de mevalonato cinasa de levadura, polipéptido de mevalonato cinasa de Saccharomyces cerevisiae, polipéptido de mevalonato cinasa de Streptococcus, polipéptido de mevalonato cinasa de Streptococcus pneumoniae, polipéptido de mevalonato cinasa de Streptomyces, polipéptido de mevalonato cinasa de Streptomyces CL190, polipéptido de mevalonato cinasa de Methanosarcina mazei y polipéptido de mevalonato cinasa de M. Burtonii. Cualquiera de los promotores descritos en la presente descripción (por ejemplo, los promotores descritos en la presente descripción e identificados en los ejemplos de la presente descripción que incluyen promotores inducibles y promotores constitutivos) pueden usarse para dirigir la expresión de cualquiera de los polipéptidos de MVA descritos en la presente descripción.
Cualquiera de las células descritas en la presente descripción pueden comprender ácido nucleico o ácidos nucleicos de IDI (por ejemplo, ácido nucleico o ácidos nucleicos endógenos o heterólogos que codifican IDI) . Los polipéptidos de isopentenil difosfato isomerasa (isopentenil-difosfato delta- isomerasa o IDI) catalizan la conversión de isopentenil difosfato (IPP) y dimetilalil difosfato (DMAPP) (por ejemplo, para convertir IPP a DMAPP y/o para convertir DMAPP a IPP) . Los polipéptidos de IDI ilustrativos incluyen polipéptidos, fragmentos de polipéptidos, péptidos y polipéptidos de fusión que tienen por lo menos una actividad de un polipéptido de IDI. Los métodos convencionales (tales como los descritos en la presente descripción) pueden usarse para determinar si un polipéptido tiene actividad de polipéptido de IDI al determinar la capacidad del polipéptido para convertir IPP y DMAPP in vitro, en un extracto celular o in vivo. Los ácidos nucleicos de IDI ilustrativos incluyen ácidos nucleicos que codifican un polipéptido, fragmento de un polipéptido, péptido o polipéptido de fusión que tiene por lo menos una actividad de un polipéptido de IDI. Los polipéptidos y ácidos nucleicos de IDI ilustrativos incluyen polipéptidos y ácidos nucleicos de origen natural a partir de cualquiera de los organismos de recurso descritos en la presente descripción, así como polipéptidos y ácidos nucleicos mutantes derivados de cualquiera de los organismos de recurso descritos en la presente descripción. Ácidos nucleicos que codifican polipéptidos de isopreno sintasa En algunos aspectos de . la presente invención, las células descritas en cualquiera de las composiciones o métodos descritos en la presente descripción (que incluyen células hospederas que se han modificado genéticamente para un flujo de carbono incrementado hacia la ruta del MVA como se describe en la presente descripción) comprenden, además, uno o más ácidos nucleicos que codifican un polipéptido de isopreno sintasa o un polipéptido que tiene actividad de isopreno sintasa. En algunos aspectos, el polipéptido de isopreno sintasa es un polipéptido endógeno. En algunos aspectos, el ácido nucleico endógeno que codifica un polipéptido de isopreno sintasa se une operativamente a un promotor constitutivo. En algunos aspectos, el ácido nucleico endógeno que codifica un polipéptido de isopreno sintasa se une operativamente a un promotor inducible. En algunos aspectos, el ácido nucleico endógeno que codifica un polipéptido de isopreno sintasa se une operativamente a un promotor fuerte. En un aspecto particular, las células se modifican genéticamente para sobreexpresar el polipéptido endógeno de la ruta de isopreno sintasa con relación a las células silvestres. En algunos aspectos, el ácido nucleico endógeno que codifica un polipéptido de isopreno sintasa se une operativamente a un promotor débil. En algunos aspectos, el polipéptido de isopreno sintasa es un polipéptido de Pueraria o Populus o un híbrido, tal como Populus alba x Populus trémula.
En algunos aspectos, el polipéptido de isopreno sintasa es un polipéptido heterologo. En algunos aspectos, las células comprenden más de una copia de un ácido nucleico heterologo que codifica un polipéptido de isopreno sintasa. En algunos aspectos, el ácido nucleico heterologo que codifica un polipéptido de isopreno sintasa se une operativamente a un promotor constitutivo. En algunos aspectos, el ácido nucleico heterologo que codifica un polipéptido de isopreno sintasa se une operativamente a un promotor inducible. En algunos aspectos, el ácido nucleico heterologo que codifica un polipéptido de isopreno sintasa se une operativamente a un promotor fuerte. En algunos aspectos, el ácido nucleico heterologo que codifica un polipéptido de isopreno sintasa se une operativamente a un promotor débil.
Los ácidos nucleicos que codifican un polipéptido o polipéptidos de isopreno sintasa se pueden integrar en un genoma de las células hospederas o se pueden expresar de manera estable en las células. Los ácidos nucleicos que codifican un polipéptido o polipéptidos de isopreno sintasa pueden estar, adicionalmente, sobre un vector.
Los ácidos nucleicos de isopreno sintasa ilustrativos incluyen ácidos nucleicos que codifican un polipéptido, fragmento de un polipéptido, péptido o polipéptido de fusión que tiene por lo menos una actividad de un polipéptido de isopreno sintasa. Los polipéptidos de isopreno sintasa convierten dimetilalil difosfato (DMAPP) a isopreno. Los polipéptidos de isopreno sintasa ilustrativos incluyen polipéptidos, fragmentos de polipéptidos, péptidos y polipéptidos de fusión que tienen por lo menos una actividad de un polipéptido de isopreno sintasa. Los polipéptidos y ácidos nucleicos de isopreno sintasa ilustrativos incluyen polipéptidos y ácidos nucleicos de origen natural a partir de cualquiera de los organismos de origen descritos en la presente descripción. Adicionalmente, las variantes de isopreno sintasa pueden tener una actividad mejorada, tal como actividad enzimática mejorada. En algunos aspectos, una variante de isopreno sintasa tiene otras propiedades mejoradas, tales como estabilidad mejorada (por ejemplo, termoestabilidad) y/o solubilidad mejorada.
Se puede usar métodos convencionales para determinar si un polipéptido tiene actividad de polipéptidos de isopreno sintasa al determinar la capacidad del polipéptido para convertir DMAPP a isopreno in vitro en un extracto celular o in vivo. La actividad de polipéptidos de isopreno sintasa en el extracto celular se puede determinar, por ejemplo, como se describe en Silver et al., J. Biol . Chem. 270:13010-13016, 1995. En un ensayo ilustrativo, el DMAPP (Sigma) se puede evaporar hasta secar completamente en una corriente de nitrógeno y rehidratar hasta una concentración de 100 mM en 100 mM de regulador de fosfato potásico con un pH de 8.2 y almacenar a -20°C. Para realizar el ensayo, una solución de 5 µ? de MgCl2 1 M, 1 mM (250 ug/ml) de DMAPP, 65 µ? de regulador de extracto vegetal (PEB, por sus siglas en inglés) (50 mM de Tris-HCl, pH 8.0 , 20 mM de MgCl2, glicerol al 5% y 2 mM de DTT) se puede agregar a 25 µ? de extracto celular en un vial con un espacio libre de 20 mi con una tapa de rosca metálica y tabique de silicio recubierto de Teflon (Agilent Technologies) y cultivar a 37°C durante 15 minutos con agitación. La reacción se puede templar al agregar 200 µ? de EDTA 250 mM y cuantificar por GC/MS.
En algunos aspectos, el polipéptido de isopreno sintasa es un polipéptido de isopreno sintasa vegetal o una variante de este. En algunos aspectos, el polipéptido de isopreno sintasa es una isopreno sintasa de Pueraria o una variante de esta. En algunos aspectos, el polipéptido de isopreno sintasa es una isopreno sintasa de Populus o una variante de esta. En algunos aspectos, el polipéptido de isopreno sintasa es un polipéptido de isopreno sintasa de álamo o una variante de este. En algunos aspectos, el polipéptido de isopreno sintasa es un polipéptido de isopreno sintasa de kudzu o una variante de este. En algunos aspectos, el polipéptido de isopreno sintasa es un polipéptido de Pueraria o Populus o un híbrido, Populus alba x Populus trémula, o una variante de este.
En algunos aspectos, el polipéptido o ácido nucleico de isopreno sintasa es de la familia Fabaceae, tal como la subfamilia Faboideae. En algunos aspectos, el polipéptido o ácido nucleico de isopreno sintasa es un polipéptido o ácido nucleico de Pueraria montana (kudzu) (Sharkey et al., Plant Physiology 137: 700-712, 2005), Pueraria lobata, álamo (tal como Populus alba, Populus nigra, Populus trichocarpa o Populus alba x trémula (CAC35696) (Miller et al., Planta 213: 483-487, 2001), álamo temblón (tal como Populus tremuloides) (Silver et al., JBC 270(22): 13010-1316, 1995), roble común (Quercus robur) (Zimmer et al., patente núm. O 98/02550) o una variante de estos. En algunos aspectos, el polipéptido de isopreno sintasa es una isopreno sintasa de Pueraria montana, Pueraria lobata, Populus tremuloides, Populus alba, Populus nigra o Populus trichocarpa o una variante de estos. En algunos aspectos, el polipéptido de isopreno sintasa es una isopreno sintasa de Populus alba o una variante de esta. En algunos aspectos, el ácido nucleico que codifica la isopreno sintasa (por ejemplo, isopreno sintasa de Populus alba o una variante de esta) está optimizado por codones.
En algunos aspectos, el ácido nucleico o polipéptido de isopreno sintasa es un polipéptido o ácido nucleico de origen natural (por ejemplo, polipéptido o ácido nucleico de origen natural de Populus) . En algunos aspectos, el ácido nucleico o polipéptido de isopreno sintasa no es un polipéptido o ácido nucleico silvestre o de origen natural. En algunos aspectos, el ácido nucleico o polipéptido de isopreno sintasa es una variante de un polipéptido o ácido nucleico silvestre o de origen natural (por ejemplo, una variante de un polipéptido o ácido nucleico silvestre o de origen natural de Populus) .
En algunos aspectos, el polipéptido de isopreno sintasa es una variante. En algunos aspectos, el polipéptido de isopreno sintasa es una variante de una isopreno sintasa silvestre o de origen natural. En algunos aspectos, la variante tiene una actividad mejorada tal como actividad catalítica mejorada en comparación con la isopreno sintasa silvestre o de origen natural. El incremento en la actividad (por ejemplo, la actividad catalítica) puede ser de por lo menos aproximadamente cualquiera de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 95%. En algunos aspectos, el incremento en la actividad, tal como la actividad catalítica, es por lo menos aproximadamente cualquiera de 1 vez, 2 veces, 5 veces, 10 veces, 20 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces, 75 veces o 100 veces. En algunos aspectos, el incremento en la actividad, tal como la actividad catalítica, es de aproximadamente 10% a aproximadamente 100 veces (por ejemplo, de aproximadamente 20% a aproximadamente 100 veces, de aproximadamente 50% a aproximadamente 50 veces, de aproximadamente 1 vez a aproximadamente 25 veces, de aproximadamente 2 veces a aproximadamente 20 veces o de aproximadamente 5 veces a aproximadamente 20 veces) . En algunos aspectos, la variante tiene una solubilidad mejorada en comparación con la isopreno sintasa silvestre o de origen natural. El incremento en la solubilidad puede ser por lo menos aproximadamente cualquiera de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 95%. El incremento en la solubilidad puede ser por lo menos aproximadamente cualquiera de 1 vez, 2 veces, 5 veces, 10 veces, 20 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces, 75 veces o 100 veces. En algunos aspectos, el incremento en la solubilidad es de aproximadamente 10% a aproximadamente 100 veces (por ejemplo, de aproximadamente 20% a aproximadamente 100 veces, de aproximadamente 50% a aproximadamente 50 veces, de aproximadamente 1 vez a aproximadamente 25 veces, de aproximadamente 2 veces a aproximadamente 20 veces o de aproximadamente 5 veces a aproximadamente 20 veces) . En algunos aspectos, el polipéptido de isopreno sintasa es una variante de isopreno sintasa de origen natural y tiene una estabilidad mejorada (tales como la termoestabilidad) en comparación con la isopreno sintasa de origen natural.
En algunos aspectos, la variante tiene por lo menos aproximadamente 10%, por lo menos aproximadamente 20%, por lo menos aproximadamente 30%, por lo menos aproximadamente 40%, por lo menos aproximadamente 50%, por lo menos aproximadamente 60%, por lo menos aproximadamente 70%, por lo menos aproximadamente 80%, por lo menos aproximadamente 90%, por lo menos aproximadamente 100%, por lo menos aproximadamente 110%, por lo menos aproximadamente 120%, por lo menos aproximadamente 130%, por lo menos aproximadamente 140%, por lo menos aproximadamente 150%, por lo menos aproximadamente 160%, por lo menos aproximadamente 170%, por lo menos aproximadamente 180%, por lo menos aproximadamente 190%, por lo menos aproximadamente 200% de la actividad de una isopreno sintasa silvestre o de origen natural. La variante puede compartir similitud de secuencias con una isopreno sintasa silvestre o de origen natural. En algunos aspectos, una variante de una isopreno sintasa silvestre o de origen natural puede tener por lo menos aproximadamente cualquiera de 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% o 99.9% de identidad de secuencias de aminoácidos como la de la isopreno sintasa silvestre o de origen natural. En algunos aspectos, una variante de una isopreno sintasa silvestre o de origen natural tiene cualquiera de aproximadamente 70% a aproximadamente 99.9%, de aproximadamente 75% a aproximadamente 99%, de aproximadamente 80% a aproximadamente 98%, de aproximadamente 85% a aproximadamente 97% o de aproximadamente 90% a aproximadamente 95% de identidad de secuencias de aminoácidos como la de la isopreno sintasa silvestre o de origen natural.
En algunos aspectos, la variante comprende una mutación en la isopreno sintasa silvestre o de origen natural. En algunos aspectos, la variante tiene por lo menos una sustitución de aminoácidos, por lo menos una inserción de aminoácidos y/o por lo menos una deleción de aminoácidos. En algunos aspectos, la variante tiene por lo menos una sustitución de aminoácidos. En algunos aspectos, el número de residuos de aminoácidos diferentes entre la variante y la isopreno sintasa silvestre o de origen natural puede ser uno o más, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50 o más residuos de aminoácidos. Las isopreno sintasas de origen natural pueden incluir cualquier isopreno sintasa de plantas, por ejemplo, isopreno sintasas de kudzu, isopreno sintasas de álamo, isopreno sintasas de roble común e isopreno sintasas de sauce. En algunos aspectos, la variante es una variante de isopreno sintasa de Populus alba. En algunos aspectos, la variante de isopreno sintasa de Populus alba tiene por lo menos una sustitución de aminoácidos, por lo menos una inserción de aminoácidos y/o por lo menos una deleción de aminoácidos. En algunos aspectos, la variante es una isopreno sintasa de Populus alba truncada. En algunos aspectos, el ácido nucleico que codifica una variante (por ejemplo, variante de isopreno sintasa a partir de Populus alba) está optimizado por codones (por ejemplo, optimizado por codones en base a las células hospederas en donde se expresa la isopreno sintasa heteróloga) .
El polipéptido de isopreno sintasa proporcionados en la presente descripción puede ser cualquiera de las isopreno sintasas o variantes de isopreno sintasas descritas en la patente núm. WO 2009/132220, patente núm. O 2010/124146 y publicación de la solicitud de patente de los Estados Unidos núm.: 2010/0086978, cuyos contenidos se incorporan expresamente en la presente descripción como referencia en su totalidad con respecto a las isopreno sintasas y variantes de isopreno sintasas.
Cualquiera de los promotores descritos en la presente descripción {por ejemplo, los promotores descritos en la presente descripción e identificados en los ejemplos de la presente descripción que incluyen promotores inducibles y promotores constitutivos) puede usarse para dirigir la expresión de cualquiera de las isopreno sintasas descritas en la presente descripción.
Las isopreno sintasas adecuadas incluyen, pero no se limitan a, las identificadas por los números de registro del GenBank AY341431, AY316691, AY279379, AJ457070 y AY182241. Los tipos de isopreno sintasas que pueden usarse en cualquiera de las composiciones o métodos que incluyen métodos para producir células que codifican isopreno sintasa que se describen en la presente descripción se describen, además, en las publicaciones de las solicitudes de patentes internacionales núms . WO2009/076676 , WO2010/003007 , WO2009/132220, WO2010/031062 , WO2010/031068 , WO2010/031076 , WO2010/013077, WO2010/031079 , WO2010/148150 , WO2010/124146 , WO2010/078457, WO2010/148256, WO 2012/058494 y en la patente de los Estados Unidos núm. 8,173,410. Ácidos nucleicos que codifican polipéptidos de la ruta de DXP En algunos aspectos de la presente invención, las células descritas en cualquiera de las composiciones o métodos descritos en la presente descripción (que incluyen células hospederas que se han modificado genéticamente para un flujo de carbono incrementado hacia la ruta del MVA como se describe en la presente descripción) comprenden, además, uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican un polipéptido de DXS u otros polipéptidos de la ruta de DXP. En algunos aspectos, las células comprenden, además, una copia cromosómica de un ácido nucleico endógeno que codifica un polipéptido de DXS u otros polipéptidos de la ruta de DXP. En algunos aspectos, las células de E. coli comprenden, además, uno o más ácidos nucleicos que codifican un polipéptido de IDI y un polipéptido de DXS u otros polipéptidos de la ruta de DXP. En algunos aspectos, un ácido nucleico codifica el polipéptido de isopreno sintasa, polipéptido de IDI y polipéptido de DXS u otros polipéptidos de la ruta de DXP. En algunos aspectos, un plásmido codifica el polipéptido de isopreno sintasa, polipéptido de IDI y polipéptido de DXS u otros polipéptidos de la ruta de DXP. En algunos aspectos, múltiples plásmidos codifican el polipéptido de isopreno sintasa, polipéptido de IDI y polipéptido de DXS u otros polipéptidos de la ruta de DXP.
Los polipéptidos de DXS ilustrativos incluyen polipéptidos, fragmentos de polipéptidos, péptidos y polipéptidos de fusión que tienen por lo menos una actividad de un polipéptido de DXS. Los métodos convencionales (tales como los descritos en la presente descripción) pueden usarse para determinar si un polipéptido tiene actividad del polipéptido de DXS al determinar la capacidad del polipéptido para convertir piruvato y D-gliceraldehído 3 -fosfato a 1-desoxi-D-xilulosa-5-fosfato in vitro, en un extracto celular o in vivo. Los polipéptidos y ácidos nucleicos de DXS ilustrativos y los métodos para determinar la actividad de DXS se describen detalladamente en las publicaciones internacionales núms . WO 2009/076676, WO 2010/003007, O 2009/132220 y en las publicaciones de patentes de los Estados Unidos núms. US 2009/0203102, 2010/0003716 y 2010/0048964.
Los polipéptidos de las rutas de DXP ilustrativos incluyen, pero no se limitan a, cualquiera de los siguientes polipéptidos : polipéptidos de DXS, polipéptidos DXR, polipéptidos MCT, polipéptidos CMK, polipéptidos MCS, polipéptidos HDS, polipéptidos HDR y polipéptidos (por ejemplo, polipéptidos de fusión) que tienen una actividad de uno, dos o más de los polipéptidos de la ruta de DXP. Particularmente, los polipéptidos de la ruta de DXP incluyen polipéptidos, fragmentos de polipéptidos, péptidos y polipéptidos de fusión que tienen por lo menos una actividad de un polipéptido de la ruta de DXP. Los ácidos nucleicos de la ruta de DXP ilustrativos incluyen ácidos nucleicos que codifican un polipéptido, fragmento de un polipéptido, péptido o polipéptido de fusión que tiene por lo menos una actividad de un polipéptido de la ruta de DXP. Los polipéptidos y ácidos nucleicos de la ruta de DXP ilustrativos incluyen polipéptidos y ácidos nucleicos de origen natural a partir de cualquiera de los organismos de recurso descritos en la presente descripción, así como polipéptidos y ácidos nucleicos mutantes derivados de cualquiera de los organismos de recurso descritos en la presente descripción. Los polipéptidos y ácidos nucleicos de la ruta de DXP ilustrativos y los métodos para determinar la actividad de los polipéptidos de la ruta de DXP se describen detalladamente en la publicación internacional núm. WO 2010/148150 Los polipéptidos de DXS ilustrativos incluyen polipéptidos, fragmentos de polipéptidos, péptidos y polipéptidos de fusión que tienen por lo menos una actividad de un polipéptido de DXS. Los métodos convencionales (tales como los descritos en la presente descripción) pueden usarse para determinar si un polipéptido tiene actividad del polipéptido de DXS al determinar la capacidad del polipéptido para convertir piruvato y D-gliceraldehído 3 -fosfato a 1-desoxi-D-xilulosa-5-fosfato in vitro, en un extracto celular o in vivo. Los polipéptidos y ácidos nucleicos de DXS ilustrativos y los métodos para determinar la actividad de DXS se describen detalladamente en la publicación internacional núm. WO 2009/076676, WO 2010/003007, WO 2009/132220 y en las publicaciones de patentes de los Estados Unidos núms. US 2009/Q203102 , 2010/0003716 y 2010/0048964.
Particularmente, los polipéptidos de DXS convierten piruvato y D-gliceraldehído 3-fosfato a 1-desoxi-D-xilulosa 5-fosfato (DXP) . Se puede usar métodos convencionales para determinar si un polipéptido tiene actividad del polipéptido de DXS al determinar la capacidad del polipéptido para convertir piruvato y D-gliceraldehído 3-fosfato in vitro, en un extracto celular o in vivo.
Los polipéptidos DXR convierten 1-desoxi-D-xilulosa 5-fosfato (DXP) a 2-C-metil-D-eritritol 4-fosfato (MEP) . Se puede usar métodos convencionales para determinar si un polipéptido tiene actividad de polipéptidos DXR al determinar la capacidad del polipéptido para convertir DXP in vitro, en un extracto celular o in vivo.
Los polipéptidos MCT convierten 2-C-metil-D-eritritol 4-fosfato (MEP) a 4-(citidina 5' -difosfo) -2-metil-D-eritritol (CDP-ME) . Se puede usar métodos convencionales para determinar si un polipéptido tiene actividad de polipéptidos MCT al determinar la capacidad del polipéptido para convertir MEP in vitro, en un extracto celular o in vivo.
Los polipéptidos CMK convierten 4-(citidina 5' -difosfo) - 2-C-metil-D-eritritol (CDP-ME) a 2-fosfo-4- (citidina 5'-difosfo) -2-C-metil-D-eritritol (CDP-MEP) . Se puede usar métodos convencionales para determinar si un polipéptido tiene actividad de polipéptidos CMK al determinar la capacidad del polipéptido para convertir CDP-ME in vitro, en un extracto celular o in vivo.
Los polipéptidos MCS convierten 2 -fosfo-4 - (citidina 5'-difosfo) -2-C-metil-D-eritritol (CDP-MEP) a 2-C-metil-D-eritritol 2, 4-ciclodifosfato (ME-CPP o cMEPP) . Se puede usar métodos convencionales para determinar si un polipéptido tiene actividad de polipéptidos MCS al determinar la capacidad del polipéptido para convertir CDP-MEP in vitro, en un extracto celular o in vivo.
Los polipéptidos HDS convierten 2-C-metil-D-eritritol 2, 4-ciclodifosfato a (E) -4 -hidroxi-3 -metilbut-2 -en-1- il difosfato (HMBPP o HDMAPP) . Se puede usar métodos convencionales para determinar si un polipéptido tiene actividad de polipéptidos HDS al determinar la capacidad del polipéptido para convertir ME-CPP in vitro, en un extracto celular o in vivo.
Los polipéptidos HDR convierten (E) -4-hidroxi-3-metilbut-2-en-l-il difosfato a isopentenil difosfato (IPP) y dimetilalil difosfato (DMAPP) . Se puede usar métodos convencionales para determinar si un polipéptido tiene actividad de polipéptidos HDR al determinar la capacidad del polipéptido para convertir HMBPP in vitro, en un extracto celular o in vivo.
Organismos de recurso para polipéptidos de la ruta inferior del MVA, de isopreno sintasa, de IDI y de la ruta de DXP Los ácidos nucleicos de la ruta de isopreno sintasa, de IDI, de DXP y/o de la ruta inferior del MVA (y sus polipéptidos codificados) se pueden obtener a partir de cualquier organismo que contiene naturalmente ácidos nucleicos de la ruta de isopreno sintasa, de IDI, de DXP y/o de la ruta inferior del MVA. El isopreno se forma naturalmente por una gran variedad de organismos, tales como bacterias, levadura, plantas y animales. Algunos organismos contienen la ruta del MVA para producir isopreno. Los ácidos nucleicos de isopreno sintasa se pueden obtener, por ejemplo, a partir de cualquier organismo que contiene una isopreno sintasa. Los ácidos nucleicos de la ruta del MVA se pueden obtener, por ejemplo, a partir de cualquier organismo que contiene la ruta del MVA. Los ácidos nucleicos de la ruta de IDI y de DXP se pueden obtener, por ejemplo, a partir de cualquier organismo que contiene la ruta de IDI y de DXP.
La secuencia de ácido nucleico de los ácidos nucleicos de la ruta de isopreno sintasa, ruta de DXP, de IDI y/o de la ruta del MVA se puede aislar de una bacteria, hongo, planta, alga o cianobacteria . Los organismos de recurso ilustrativos incluyen, por ejemplo, levaduras, tales como la especies de Saccharomyces (por ejemplo, S. cerevisiae) , bacterias, tales como la especies de Escherichia (por ejemplo, E. coli) o la especies de Methanosarcina (por ejemplo, Methanosarcina mazei) , plantas, tales como kudzu o álamo (por ejemplo, Populus alba o Populus alba x trémula CAC35696) o álamo temblón (por ejemplo, Populus tremuloides) . Las fuentes ilustrativas para polipéptidos de la ruta de isopreno sintasas, de IDI y/o de la ruta del MVA que pueden usarse se describen, además, en las publicaciones de las solicitudes de patentes internacionales núms . WO2009/076676 , WO2010/003007, O2009/132220 , WO2010/031062 , WO2010/031068 , WO2010/031076, W02010/013077 , WO2010/031079 , WO2010/148150 , WO2010/078457 y WO2010/148256.
En algunos aspectos, el organismo de recurso es una levadura, tal como Saccharomyces sp. , Schizosaccharomyces sp. , Pichia sp. , o Candida sp.
En algunos aspectos, el organismo de recurso es una bacteria, tal como cepas de Bacillus, tales como 23. lichenformis o B. subtilis, cepas de Pantoea, tales como P. citrea, cepas de Pseudomonas, tales como P. alcaligenes, cepas de Streptomyces, tales como S. lividans o S. rubiginosus, cepas de Escherichia, tales como E. coli, cepas de Snterojbacter, cepas de Streptococcus o cepas de Archaea, tales como Methanosarcina mazei .
Como se usa en la presente descripción, "el género Bacillus" incluye todas las especies dentro del género "Bacillus" , como saben los expertos en la técnica, que incluye, pero no se limita a, B. subtilis, B. licheniformis, B. lentus, B. brevis, B. stearothermophilus, B. alkalophilus, B. amyloliquefaciens, B. clausii, B. halodurans, B. megaterium, B. coagulans, B. circulans, B. lautus y B. thuringiensis . Se reconoce que el género Bacillus continúa experimentando una reestructuración taxonómica. Por lo tanto, se prevé que el género incluye la especies que se han reclasificado, que incluyen, pero no se limitan a, tales organismos, como B. stearothermophilus, que ahora se denomina "Geobacillus stearothermophilus" . Se considera que la producción de endosporas resistentes en presencia de oxígeno es la característica decisiva del género Bacillus, aunque esta característica aplica, además, para los recientemente denominados Alicyclobacillus, Amphibacillus, Aneurinibacillus, Anoxybacillus, Brevibacillus, Filobacillus, Gracilibacillus, Halobacillus, Paenibacillus, Salibacillus, Thermobacillus, Ureibacillus y Virgibacillus .
En algunos aspectos, el organismo de recurso es una bacteria gram positiva. Los ejemplos no limitantes incluyen cepas de Streptomyces (por ejemplo, S. lividans, S. coelicolor o S. griseus) y Bacillus . En algunos aspectos, el organismo de recurso es una bacteria gram negativa, tal como E. coli o Pseudomonas sp.
En algunos aspectos, el organismo de recurso es una planta, tal como una planta de la familia Fabaceae, tal como la subfamilia Faboideae. En algunos aspectos, el organismo de recurso es kudzu, álamo (tal como Populus alba x tr mula CAC35696) , álamo temblón (tal como Populus tremuloides) o Quercus robur.
En algunos aspectos, el organismo de recurso es un alga, tal como un alga verde, alga roja, glaucofitas, cloraracniofitas , euglénidos, cromistas o dinoflagelados .
En algunos aspectos, el organismo de recurso es una cianobacteria, tal como cianobacterias clasificadas en cualquiera de los siguientes grupos en base a la morfología: Chroococcales, Pleurocapsales, Oscillatoriales, Nostocales o Stigonematales .
Células recombinantes con la capacidad de una producción incrementada de isopreno Las células recombinantes descritas en la presente descripción (que incluyen células hospederas que se han modificado genéticamente para un flujo de carbono incrementado como se describe en la presente descripción) tienen la capacidad para producir una concentración de isopreno mayor que la de las mismas células que carecen de una o más copias de polipéptidos de fosfocetolasa de un ácido nucleico heterólogo, una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica un polipéptido de la ruta del MVA y uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican un polipéptido de isopreno sintasa cuando se cultivan en las mismas condiciones. Las células pueden comprender, además, uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican un polipéptido de IDI . En ciertas modalidades, el polipéptido de fosfocetolasas es de Lactobacillus reuteri, Bifidobacteriu longum, Ferrimonas baleárica, Pedobactor saltans, Streptomyces griseus y/o Nocardiopsis dassonvillei . En una modalidad, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica una fosfocetolasa aislada de Lactobacillus reuteri. En otra modalidad, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica una fosfocetolasa aislada de Bifidobacterium longum. En otra modalidad adicional, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterologo que codifica una fosfocetolasa aislada de Ferrimonas baleárica. En otra modalidad adicional, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterologo que codifica una fosfocetolasa aislada de Pedojbactor saltans. En otra modalidad, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterologo que codifica una fosfocetolasa aislada de Streptomyces griseus. En otra modalidad adicional, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterologo que codifica una fosfocetolasa aislada de Nocardiopsis dassonvillei . En otras modalidades, las células recombinantes descritas en la presente descripción comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterologo que codifica una fosfocetolasa aislada de Clostridium acetobutylicum, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus paraplantarum, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium ani alis, Bifidobacterium breve, Enterococcus gallinarum, Gardnerella vaginalis, Ferrimonas baleárica, Mucilaginibacter paludis, Nostoc punctiforme, Nostoc punctiforme PCC 73102, Pantoea, Pedobactor saltans, Rahnella aquatilis, Rhodopseudomonas palustris, Streptomyces griseus, Streptomyces avermitilis, Nocardiopsis dassonvillei y/o Thermobifida fusca. En otras modalidades adicionales, las células recombinantes descritas en la presente descripción comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterologo que codifica una fosfocetolasa aislada de Clostridium acetobutylicu , Bifidobacterium longum y/o Enterococcus gallinarum. En una modalidad, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterologo que codifica una fosfocetolasa aislada de Clostridium acetobutylicum. En otra modalidad, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterologo que codifica una fosfocetolasa aislada de Bifidobacterium longum. En otra modalidad adicional, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterologo que codifica una fosfocetolasa aislada de Enterococcus gallinarum.
En algunos aspectos, la copia o copias de un ácido nucleico heterologo que codifica fosfocetolasa, una o más copias de un ácido nucleico heterologo que codifica un polipéptido de la ruta del MVA y uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican un polipéptido de isopreno sintasa son ácidos nucleicos heterólogos que se integran en la secuencia de nucleótidos cromosómicos de la célula hospedera. En otros aspectos, el o los ácidos nucleicos heterólogos se integran en el plásmido. En otros aspectos adicionales, por lo menos uno de los ácidos nucleicos heterólogos se integra en la secuencia de nucleótidos cromosómicos de la célula mientras que por lo menos una de las secuencias de ácidos nucleicos heterólogos se integra en un plásmido. Las células recombinantes pueden producir cantidades por lo menos 5% mayores de isopreno en comparación con las células productoras de isopreno que no comprenden el polipéptido de fosfocetolasas . Alternativamente, las células recombinantes pueden producir más de aproximadamente 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14% o 15% de isopreno, no excluyente, así como cualquier valor numérico entre estos números .
En un aspecto de la presente invención, la presente invención proporciona células recombinantes que comprenden uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican un polipéptido de fosfocetolasas , uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican uno o más polipéptidos de la ruta del mevalonato (MVA) , uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican uno o más polipéptidos de la ruta de DXP y uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican un polipéptido de isopreno sintasa. Las células pueden comprender, además, uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican un polipéptido de IDI . En ciertas modalidades, el polipéptido de fosfocetolasas es de Lactobacillus reuteri, Bifidobacterium longum, Ferrimonas baleárica , Pedobactor saltans, Streptomyces griseus y/o Nocardiopsis dassonvillei . En una modalidad, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica una 7 fosfocetolasa aislada de Lactobacillus reuteri. En otra modalidad, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica una fosfocetolasa aislada de Bifidobacterium longum. En otra modalidad adicional, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica una fosfocetolasa aislada de Ferrimonas baleárica. En otra modalidad adicional, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica una fosfocetolasa aislada de Pedobactor saltans . En otra modalidad, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica una fosfocetolasa aislada de Streptomyces griseus. En otra modalidad adicional, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica una fosfocetolasa aislada de Nocardiopsis dassonvillei . En otras modalidades, las células recombinantes descritas en la presente descripción comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica una fosfocetolasa aislada de Clostridium acetobutylicum, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus plantaru , Lactobacillus paraplantarum, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium animalis, Bifidobacterium breve, Enterococcus gallinarum, Gardnerella vaginalis, Ferrimonas baleárica, Mucilaginibacter paludis, Nostoc punctiforme, Nostoc punctiforme PCC 73102, Pantoea, Pedobactor saltans, Rahnella aquatilis, Rhodopseudomonas palustris, Streptomyces griseus, Streptomyces avermitilis, Nocardiopsis dassonvillei y/o Thermobifida fusca. En otras modalidades adicionales, las células recombinantes descritas en la presente descripción comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterologo que codifica una fosfocetolasa aislada de Clostridium acetobutylicum, Bifidobacterium longum y/o Enterococcus gallinarum. En una modalidad, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterologo que codifica una fosfocetolasa aislada de Clostridium acetobutylicum. En otra modalidad, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterologo que codifica una fosfocetolasa aislada de Bifidobacterium longum. En otra modalidad adicional, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterologo que codifica una fosfocetolasa aislada de Enterococcus gallinarum. Cualquiera de los ácidos nucleicos heterólogos puede estar unido operativamente a promotores constitutivos, puede estar unido operativamente a promotores inducibles o puede estar unido operativamente a una combinación de promotores inducibles y constitutivos. El o los ácidos nucleicos heterólogos pueden, adicionalmente, estar unidos operativamente a promotores fuertes, promotores débiles y/o promotores medios. Uno o más de los ácidos nucleicos heterólogos que codifican fosfocetolasa, uno o más polipéptidos de la ruta del mevalonato (MVA) , uno o más polipéptidos de la ruta de DXP y un polipép ido de isopreno sintasa se pueden integrar en un genoma de las células hospederas o se pueden expresar de manera estable en las células. El o los ácidos nucleicos heterólogos pueden estar, adicionalmente, sobre un vector.
La producción de isopreno por las células de conformidad con cualquiera de las composiciones o métodos descritos en la presente descripción se puede mejorar (por ejemplo, por la expresión de uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican un polipéptido de fosfocetolasas , un polipéptido de isopreno sintasa, uno o más polipéptidos de la ruta del MVA y/o uno o más polipéptidos de la ruta de DXP) . Como se usa en la presente descripción, producción de isopreno "mejorada" se refiere a un índice de productividad celular (CPI) incrementado para isopreno, un título de isopreno incrementado, un rendimiento de masa de isopreno incrementado y/o una productividad específica de isopreno incrementada por las células descritas por cualquiera de las composiciones y métodos descritos en la presente descripción en comparación con las células que no tienen uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican un péptido de fosfocetolasa . En ciertas modalidades descritas en la presente descripción, las células hospederas se han modificado genéticamente aún más para un flujo de carbono incrementado para la producción de MVA.
La producción de isopreno por las células recombinantes descritas en la presente descripción puede mejorarse por al menos 5% hasta aproximadamente 1,000,000 veces. En ciertos aspectos, la producción de isopreno puede mejorarse por al menos 10% a aproximadamente 1,000,000 veces (por ejemplo, de aproximadamente 1 a aproximadamente 500, 000 veces, de aproximadamente 1 a aproximadamente 50, 000 veces , de aproximadamente 1 a aproximadamente 5, 000 veces , de aproximadamente 1 a aproximadamente 1, 000 veces , de aproximadamente 1 a aproximadamente 500 veces , de aproximadamente 1 a aproximadamente 100 veces , de aproximadamente 1 a aproximadamente 50 veces, de aproximadamente 5 a aproximadamente 100, 000 veces , de aproximadamente 5 a aproximadamente 10, 000 veces , de aproximadamente 5 a aproximadamente 1,000 veces , de aproximadamente 5 a aproximadamente 500 veces, de aproximadamente 5 a aproximadamente 100 veces , de aproximadamente 10 a aproximadamente 50, 000 veces , de aproximadamente 50 a aproximadamente 10, 000 veces , de aproximadamente 100 a aproximadamente 5, 000 veces, de aproximadamente 200 a aproximadamente 1, 000 veces , de aproximadamente 50 a aproximadamente 500 veces o de aproximadamente 50 a aproximadamente 200 veces) en comparación con la producción de isopreno por células que no expresan uno o más ácidos nucleicos heterologos que codifican péptido de fosfocetolasa . En ciertas modalidades descritas en la presente descripción, las células hospederas se han modificado genéticamente aún más para un flujo de carbono incrementado para la producción de MVA para proporcionar una producción mejorada de isopreno en comparación con la producción de isopreno por células que no expresan uno o más ácidos nucleicos heterologos que codifican péptido de fosfocetolasa y que no se han modificado genéticamente para un flujo de carbono incrementado para la producción de mevalonato .
En otros aspectos, la producción de isopreno por las células recombinantes descritas en la presente descripción se puede mejorar, además, por al menos aproximadamente cualquiera de 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 1 vez, 2 veces, 5 veces, 10 veces, 20 veces, 50 veces, 100 veces, 200 veces, 500 veces, 1000 veces, 2000 veces, 5000 veces, 10,000 veces, 20,000 veces, 50,000 veces, 100,000 veces, 200,000 veces, 500,000 veces o 1,000,000 veces en comparación con la producción de isopreno por células que no expresan uno o más ácidos nucleicos heterologos que codifican péptido de fosfocetolasa . En ciertas modalidades descritas en la presente descripción, las células hospederas se han modificado genéticamente aún más para un flujo de carbono incrementado para la producción de MVA para proporcionar una producción mejorada de isopreno en comparación con la producción de isopreno por células que no expresan uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican péptido de fosfocetolasa y que no se han modificado genéticamente para un flujo de carbono incrementado para la producción de mevalonato .
Métodos para usar las células recombinantes para producir isopreno La presente descripción proporciona, además, métodos para producir isopreno; los métodos comprenden cultivar cualquiera de las células recombinantes descritas en la presente descripción. En un aspecto, se puede producir isopreno al cultivar células recombinantes que comprenden uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican un polipéptido de fosfocetolasas , uno o más polipéptidos de la ruta del MVA y un polipéptido de isopreno sintasa. En ciertas modalidades, el polipéptido de fosfocetolasas es de Lactobacillus reuteri, Bifidobacterium longu , Ferrimonas baleárica, Pedobactor saltans, Streptomyces griseus y/o Nocardiopsis dassonvillei . En una modalidad, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterologo que codifica una fosfocetolasa aislada de Lactobacillus reuteri. En otra modalidad, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterologo que codifica una fosfocetolasa aislada de Bifidobacterium longum. En otra modalidad adicional, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterologo que codifica una fosfocetolasa aislada de Ferrimonas baleárica . En otra modalidad adicional, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterologo que codifica una fosfocetolasa aislada de Pedobactor saltans. En otra modalidad, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterologo que codifica una fosfocetolasa aislada de Streptomyces griseus . En otra modalidad adicional, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterologo que codifica una fosfocetolasa aislada de Nocardiopsis dassonvillei . En otras modalidades, las células recombinantes descritas en la presente descripción comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterologo que codifica una fosfocetolasa aislada de Clostridium acetobutylicum, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus paraplantarum, Bi idobacterium longum, Bifídobacterium animalis, Bifidobacterium breve, Enterococcus gallinarum, Gardnerella vaginalis, Ferrimonas baleárica, Mucilaginibacter paludis, Nostoc punctiforme, Nostoc punctiforme PCC 73102, Pantoea, Pedobactor saltans, Rahnella aquatilis, Rhodopseudomonas palustris, Streptomyces griseus, Streptomyces avermitilis, Nocardiopsis dassonvillei y/o Thermobifida fusca. En otras modalidades adicionales, las células recombinantes descritas en la presente descripción comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica una fosfocetolasa aislada de Clostridium acetobutylicum, Bifidobacterium longum y/o Enterococcus ga.llina.rum. En una modalidad, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica una fosfocetolasa aislada de Clostridium acetobutylicum. En otra modalidad, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica una fosfocetolasa aislada de Bifidobacterium longum. En otra modalidad adicional, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica una fosfocetolasa aislada de Enterococcus gallinarum.
En otro aspecto, se puede producir isopreno al cultivar células recombinantes que comprenden la modulación en cualquiera de las rutas enzimáticas descritas en la presente descripción y uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican un péptido de fosfocetolasa, un polipéptido de la ruta del MVA y un polipéptido de isopreno sintasa. En ciertas modalidades, el polipéptido de fosfocetolasas es de Lactobacillus reuteri , Bifidobacterium longum, Ferrimonas baleárica, Pedobactor saltans, Streptomyces griseus y/o Nocardiopsis dassonvillei . En otras modalidades, las células recombinantes descritas en la presente descripción comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterologo que codifica una fosfocetolasa aislada de Clostridium acetobutylicum, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus paraplantarum, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium animalis, Bifidobacterium breve, Enterococcus gallinarum, Gardnerella vaginalis, Ferrimonas baleárica, Mucilaginibacter paludis, Nostoc punctiforme, Nostoc punctiforme PCC 73102, Pantoea, Pedobactor saltans, Rahnella aquatilis, Rhodopseudomonas palustris, Streptomyces griseus, Streptomyces avermitilis, Nocardiopsis dassonvillei y/o Thermobifida fusca. En otras modalidades adicionales, las células recombinantes descritas en la presente descripción comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterologo que codifica una fosfocetolasa aislada de Clostridium acetobutylicum, Bifidobacterium longum y/o Enterococcus gallinarum. En una modalidad, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterologo que codifica una fosfocetolasa aislada de Clostridium acetobutylicum. En otra modalidad, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterologo que codifica una fosfocetolasa aislada de Bifidobacterium longum. En otra modalidad adicional, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterologo que codifica una fosfocetolasa aislada de Enterococcus gallinarum. El isopreno se puede producir a partir de cualquiera de las células descritas en la presente descripción y de conformidad con cualquiera de los métodos descritos en la presente descripción. Se puede usar cualquiera de las células con el fin de producir isopreno a partir de carbohidratos que incluyen, pero no se limitan a, seis azúcares de carbono, tales como glucosa. En otras modalidades, el polipéptido de fosfocetolasas es de Clostridium acetobutylicum, Bifidobacterium longum y/o Enterococcus gallinarum. En una modalidad, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterologo que codifica una fosfocetolasa aislada de Clostridium acetobutylicum. En otra modalidad, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterologo que codifica una fosfocetolasa aislada de Bifidobacterium longum. En otra modalidad adicional, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterologo que codifica una fosfocetolasa aislada de Enterococcus gallinarum.
Por lo tanto, la presente invención proporciona métodos para producir isopreno; los métodos comprenden cultivar células que comprenden uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican un polipéptido de fosfocetolasas y una isopreno sintasa en una condición adecuada para producir isopreno y (b) producir isopreno. En ciertas modalidades, el polipéptido de fosfocetolasas es de Lactobacillus reuteri, Bifidobacterium longum, Ferrimonas baleárica, Pedobactor saltans, Streptomyces griseus y/o Nocardiopsis dassonvillei. En una modalidad, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica una fosfocetolasa aislada de Lactobacillus reuteri . En otra modalidad, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica una fosfocetolasa aislada de Bifidobacterium longum. En otra modalidad adicional, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica una fosfocetolasa aislada de Ferrimonas baleárica . En otra modalidad adicional, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica una fosfocetolasa aislada de Pedobactor saltans. En otra modalidad, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica una fosfocetolasa aislada de Streptomyces griseus. En otra modalidad adicional, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica una fosfocetolasa aislada de Nocardiopsis dassonvillei. En otras modalidades, las células recombinantes descritas en la presente descripción comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica una fosfocetolasa aislada de Clostridium acetobutylicum, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus paraplantarum, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium animalis, Bifidobacterium breve, Enterococcus gallinarum, Gardnerella vaginalis, Ferrimonas baleárica, Mucilaginibacter paludis, Nostoc punctiforme, Nostoc punctiforme PCC 73102, Pantoea, Pedobactor saltans, Rahnella aquatilis, Rhodopseudomonas palustris, Streptomyces griseus, Streptomyces avermitilis, Nocardiopsis dassonvillei y/o Thermobifida fusca. En otras modalidades adicionales, las células recombinantes descritas en la presente descripción comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica una fosfocetolasa aislada de Clostridium acetobutylicum, Bifidobacterium longum y/o Enterococcus gallinarum. En una modalidad, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica una osfocetolasa aislada de Clostridium acetobutylicum. En otra modalidad, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica una fosfocetolasa aislada de Bifidojbacterium longum. En otra modalidad adicional, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica una fosfocetolasa aislada de Enterococcus gallinarum.
Las células pueden comprender, además, una o más moléculas de ácido nucleico que codifican el o los polipéptidos de la ruta del MVA descritos anteriormente (por ejemplo, la ruta completa del MVA) y cualquiera del o los polipéptidos de isopreno sintasa descritos anteriormente (por ejemplo, isopreno sintasa de Pueraria) . En algunos aspectos, las células recombinantes pueden ser cualquiera de las células descritas en la presente descripción. Cualquiera de las isopreno sintasas o variantes de estas descritas en la presente descripción, cualquiera de las cepas de células hospederas descritas en la presente descripción, cualquiera de los promotores descritos en la presente descripción y/o cualquiera de los vectores descritos en la presente descripción pueden usarse, además, para producir isopreno con el uso de cualquiera de las fuentes de energía (por ejemplo, glucosa o cualquiera de las otras seis azúcares de carbono) descritas en la presente descripción pueden usarse en los métodos descritos en la presente descripción. En algunos aspectos, el método para producir isopreno comprende, además, una etapa de recuperar el isopreno. En otras modalidades, el polipéptido de fosfocetolasas es de Clostridium acetobutylicum, Bifidobacterium longum y/o Enterococcus gallinarum. En una modalidad, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica una fosfocetolasa aislada de Clostridium acetobutylicum. En otra modalidad, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica una fosfocetolasa aislada de Bifidobacterium longum. En otra modalidad adicional, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterologo que codifica una fosfocetolasa aislada de Enterococcus gallinarum.
En ciertos aspectos, la presente invención proporciona métodos para producir isopreno; los métodos comprenden cultivar células recombinantes que comprenden uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican un polipéptido de fosfocetolasas a partir de Clostridium acetobutylicum, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus paraplantarum, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium animalis, Bifidobacterium breve, Enterococcus gallinarum, Gardnerella vaginalis, Ferrimonas baleárica, Mucilaginibacter paludis, Nostoc punctiforme, Nostoc punctiforme PCC 73102, Pantoea, Pedobactor saltans, Rahnella aquatilis, Rhodopseudo onas palustris, Streptomyces griseus, Streptomyces avermitilis, Nocardiopsis dassonvillei y/o Thermobifida fusca, un polipéptido mvaE y un polipéptido mvaS a partir de L. grayi, E. faecium, E. gallinarum, E. casseliflavus y/o E. faecalis, en una condición adecuada para producir isopreno y (b) producir isopreno. Las células pueden comprender, además, una o más moléculas de ácido nucleico que codifican el o los polipéptidos de la ruta inferior del MVA descritos anteriormente (por ejemplo, MVK, PMK, MVD y/o IDI) y cualquiera de los polipéptidos de isopreno sintasa descritos anteriormente. En algunos aspectos, las células recombinantes pueden ser cualquiera de las células descritas en la presente descripción.
En ciertos aspectos, la presente invención proporciona métodos para producir isopreno; los métodos comprenden cultivar células recombinantes que comprenden uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican un polipéptido de fosfocetolasas a partir de Clostridium acetobutylicum, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus paraplantarum, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium ani alis, Bifidobacterium breve, Enterococcus gallinarum, Gardnerella vaginalis, Ferrimonas baleárica, Mucilaginibacter paludis, Nostoc punctiforme, Nostoc punctiforme PCC 73102, Pantoea, Pedobactor saltans, Rahnella aquatilis, Rhodopseudomonas palustris, Streptomyces griseus, Streptomyces avermitilis, Nocardiopsis dassonvillei y/o Ther obifida fusca, en una condición adecuada para producir isopreno y (b) producir isopreno. Las células pueden comprender, además, una o más moléculas de ácido nucleico que codifican el o los polipéptidos de la ruta inferior del MVA descritos anteriormente (por ejemplo, MVK, PMK, MVD y/o IDI) y cualquiera de los polipéptidos de isopreno sintasa descritos anteriormente. En algunos aspectos, las células recombinantes pueden ser cualquiera de las células descritas en la presente descripción. Las células recombinantes descritas en la presente descripción que tienen diversas rutas enzimáticas manipuladas para un flujo de carbono incrementado para la producción de mevalonato pueden usarse para producir isopreno. En algunos aspectos, las células recombinantes se pueden modificar genéticamente aún más para aumentar la actividad de uno o más de los siguientes genes seleccionados - del grupo que consiste en ribosa-5-fosfato isomerasa (rpiA y/o rpiB) , D-ribulosa-5-fosfato 3-epimerasa (rpe) , transcetolasa ( tktA y/o tktB) , transaldolasa B (tal B) , fosfato acetiltransferasa (pfca y/o eutD) . En otra modalidad, estas células recombinantes se pueden modificar genéticamente aún más para reducir la actividad de uno o más de los siguientes genes que incluyen glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (zwf), 6-fosfofructocinasa-1 (pfkA y/o pfkB) , fructosa bisfosfato aldolasa (fba, fbaA, fbaB y/o fbaC) , gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (gapA y/o gapB) , acetato cinasa (ackA) , citrato sintasa [gltA) , El (ptsl) , EIICBGlc (ptsG) , EIIAGlc (crr) y/o HPr (ptsff) .
En ciertos aspectos, la presente invención proporciona métodos para producir isopreno; los métodos comprenden cultivar células recombinantes que comprenden uno o más ácidos nucleicos heterologos que codifican un polipéptido de fosfocetolasas a partir de Clostridium acetobutylicum, Bifidobacterium longum y/o Enterococcus gallinarum, en una condición adecuada para producir isopreno y (b) producir isopreno. Las células pueden comprender, además, una o más moléculas de ácido nucleico que codifican el o los polipéptidos de la ruta inferior del MVA descritos anteriormente (por ejemplo, MVK, PMK, MVD y/o IDI) y cualquiera de los polipéptidos de isopreno sintasa descritos anteriormente. En algunos aspectos, las células recombinantes pueden ser cualquiera de las células descritas en la presente descripción. Las células recombinantes descritas en la presente descripción que tienen diversas rutas enzimáticas manipuladas para un flujo de carbono incrementado para la producción de mevalonato pueden usarse para producir isopreno. En algunos aspectos, las células recombinantes se pueden modificar genéticamente aún más para aumentar la actividad de uno o más de los siguientes genes seleccionados del grupo que consiste en rpiA, rpe, tktA, tal B, pta y/o eutD. En otro aspecto, estas cepas se pueden modificar genéticamente aún más para reducir la actividad de uno o más de los siguientes genes que incluyen zwf, pfkA, fba, gapA, ackA, gltA y/o pts.
En algunos aspectos, la cantidad de isopreno producida se determina en el momento de productividad absoluta pico. En algunos aspectos, la productividad absoluta pico para las células es de aproximadamente cualquier de las cantidades de isopreno descritas en la presente descripción. En algunos aspectos, la cantidad de isopreno producida se determina en el momento de productividad específica pico. En algunos aspectos, la productividad específica pico para las células es de aproximadamente cualquiera de las cantidades de isopreno por célula descritas en la presente descripción. En algunos aspectos, se determina la cantidad acumulativa, total de isopreno producida. En algunos aspectos, la productividad total acumulativa para las células es aproximadamente cualquiera de las cantidades de isopreno descritas en la presente descripción.
En algunos aspectos, cualquiera de las células descritas en la presente descripción (por ejemplo, las células en cultivo) produce isopreno a más de aproximadamente cualquiera de o aproximadamente cualquiera de 1, 10, 25, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1,000, 1,250, 1,500, 1,750, 2,000, 2,500, 3,000, 4,000, 5,000 o más nmol de isopreno/gramo de células para el peso en húmedo de las células/hora (nmol/gwcm/h) . En algunos aspectos, la cantidad de isopreno se encuentra entre aproximadamente 2 y aproximadamente 5,000 nmol/gwcm/h, tal como entre aproximadamente 2 y aproximadamente 100 nmol/gwcm/h, de aproximadamente 100 a aproximadamente 500 nmol/gwcm/h, de aproximadamente 150 a aproximadamente 500 nmol/gwcm/h, de aproximadamente 500 a aproximadamente 1,000 nmol/gwcm/h, de aproximadamente 1,000 a aproximadamente 2,000 nmol/gwcm/h o de aproximadamente 2,000 a aproximadamente 5,000 nmol/gwcm/h. En algunos aspectos, la cantidad de isopreno se encuentra entre aproximadamente 20 a aproximadamente 5,000 nmol/gwcm/h, de aproximadamente 100 a aproximadamente 5,000 nmol/gwcm/h, de aproximadamente 200 a aproximadamente 2,000 nmol/gwcm/h, de aproximadamente 200 a aproximadamente 1,000 nmol/gwcm/h, de aproximadamente 300 a aproximadamente 1,000 nmol/gwcm/h o de aproximadamente 400 a aproximadamente 1,000 nmol/gwcm/h.
En algunos aspectos, las células en cultivo producen isopreno a más de o aproximadamente 1, 10, 25, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1,000, 1,250, 1,500, 1,750, 2,000, 2,500, 3,000, 4,000, 5,000, 10,000, 100,000 o más ng de isopreno/gramo de células para el peso en húmedo de las células/h (ng/gwcm/h) . En algunos aspectos, la cantidad de isopreno se encuentra entre aproximadamente 2 y aproximadamente 5,000 ng/gwcm/h, tal como entre aproximadamente 2 y aproximadamente 100 ng/gwcm/h, de aproximadamente 100 a aproximadamente 500 ng/gwcm/h, de aproximadamente 500 a aproximadamente 1,000 ng/gwcm/h, de aproximadamente 1,000 a aproximadamente 2,000 ng/gwcm/h o de aproximadamente 2,000 a aproximadamente 5,000 ng/gwcm/h. En algunos aspectos, la cantidad de isopreno se encuentra entre aproximadamente 20 y aproximadamente 5,000 ng/gwcm/h, de aproximadamente 100 a aproximadamente 5,000 ng/gwcm/h, de aproximadamente 200 a aproximadamente 2,000 ng/gwcra/h, de aproximadamente 200 a aproximadamente 1,000 ng/gwcm/h, de aproximadamente 300 a aproximadamente 1,000 ng/gwcm/h o de aproximadamente 400 a aproximadamente 1,000 ng/gwcm/h.
En algunos aspectos, las células en cultivo producen un título acumulativo (cantidad total) de isopreno a más de aproximadamente cualquiera de o aproximadamente cualquiera de 1, 10, 25, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1,000, 1,250, 1,500, 1,750, 2,000, 2,500, 3,000, 4,000, 5,000, 10,000, 50,000, 100,000 o más mg de isopreno/1 de caldo de cultivo (mg/lde caido de cultivo/ en donde el volumen de caldo de cultivo incluye el volumen de las células y el medio celular) . En algunos aspectos, la cantidad de isopreno se encuentra entre aproximadamente 2 y aproximadamente 5,000 mg/lde caído de cultivo/ tal como entre aproximadamente 2 y aproximadamente 100 mg/lde caido de cultivo, de aproximadamente 100 a aproximadamente 500 mg/lde caído de cultivo de aproximadamente 500 a aproximadamente 1,000 mg/lde caído de cultivo/ de aproximadamente 1,000 a aproximadamente 2,000 mg/lde caido de cultivo o de aproximadamente 2,000 a aproximadamente 5,000 mg/lde caído de cultivo- En algunos aspectos, la cantidad de isopreno se encuentra entre aproximadamente 20 y aproximadamente 5,000 mg/lde caido de cultivo/ de aproximadamente 100 a aproximadamente 5,000 mg/lde caído de cultivo, de aproximadamente 200 a aproximadamente 2,000 mg/lde caído de cultivo / de aproximadamente 200 a aproximadamente 1,000 mg/lde caldo de cultivo/ de aproximadamente 300 a aproximadamente 1,000 mg/lde caído de cultivo o de aproximadamente 400 a aproximadamente 1,000 mg/lde caído de cultivo- En algunos aspectos, el isopreno producido por las células en cultivo comprende por lo menos aproximadamente 1, 2, 5, 10, 15, 20 o 25% en volumen de emisión de gas de la fermentación. En algunos aspectos, el isopreno comprende entre aproximadamente 1 y aproximadamente 25% en volumen de la emisión de gas, tal como entre aproximadamente 5 y aproximadamente 15%, de aproximadamente 15 a aproximadamente 25%, de aproximadamente 10 a aproximadamente 20% o de aproximadamente 1 a aproximadamente 10%.
En ciertas modalidades, los métodos para producir isopreno pueden comprender las siguientes etapas: (a) cultivar células recombinantes (que incluyen, pero no se limitan a, células de E. coli) que no expresan de manera endógena un polipéptido de fosfocetolasas , en donde las células expresan de manera heteróloga una o más copias de un gen que codifica un polipéptido de fosfocetolasas junto con (i) uno o más ácidos nucleicos que expresan uno o más péptidos de la ruta del MVA y (ii) una isopreno sintasa y (b) producir isopreno, en donde las células recombinantes muestran una velocidad de captación de oxígeno reducida (OUR) en comparación con la de las mismas células que carecen de una o más copias heterólogas de un gen que codifica un polipéptido de fosfocetolasas . En ciertas modalidades, las células recombinantes que expresan una o más copias heterólogas de un gen que codifica un polipéptido de fosfocetolasas muestran una reducción de hasta 1 vez, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 6 veces o 7 veces en la OUR en comparación con las células recombinantes que no expresan una fosfocetolasa .
La presente descripción proporciona, además, métodos para producir isopreno; los métodos comprenden células que tienen capacidades mejoradas para la producción de isopreno. La producción de isopreno por las células descritas en la presente descripción se puede mejorar por la expresión de uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican un polipéptido de fosfocetolasas , una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica uno o más polipéptidos del polipéptido de la ruta completa del MVA y uno o más ácidos nucleicos heterologosque codifican un polipéptido de isopreno sintasa. En ciertas modalidades, el polipéptido de fosfocetolasas es de Lactobacillus reuteri, Bifidobacterium longum, Ferrimonas baleárica, Pedobactor saltans, Streptomyces griseus y/o Nocardiopsis dassonvillei . En una modalidad, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica una fosfocetolasa aislada de Lactobacillus reuteri. En otra modalidad, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica una fosfocetolasa aislada de Bifidobacterium longum. En otra modalidad adicional, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterologo que codifica una fosfocetolasa aislada de Ferrimonas baleárica . En otra modalidad adicional, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterologo que codifica una fosfocetolasa aislada de Pedobactor saltans. En otra modalidad, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica una fosfocetolasa aislada de Streptomyces griseus. En otra modalidad adicional, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica una fosfocetolasa aislada de Nocardiopsis dassonvillei . En otras modalidades, las células recombinantes descritas en la presente descripción comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica una fosfocetolasa aislada de Clostridium acetobutylicum, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus paraplantaruw, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium animalis, Bifidobacterium breve, Enterococcus gallinarum, Gardnerella vaginalis, Ferrimonas baleárica, Mucilaginibacter paludis, Nostoc punctiforme, Nostoc punctiforme PCC 73102, Pantoea, Pedobactor saltans, Rahnella aquatilis, Rhodopseudomonas palustris, Streptomyces griseus, Streptomyces avermitilis, Nocardiopsis dassonvillei y/o Thermobifida fusca. En otras modalidades adicionales, las células recombinantes descritas en la presente descripción comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica una fosfocetolasa aislada de Clostridium acetobutylicum, Bifidobacterium longum y/o Enterococcus gallinarum. En una modalidad, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica una fosfocetolasa aislada de Clostridium acetobutylicum. En otra modalidad, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica una fosfocetolasa aislada de Bifidobacterium longum. En otra modalidad adicional, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica una fosfocetolasa aislada de Enterococcus gallinarum. Como se usa en la presente descripción, producción de isopreno "mejorada" se refiere a un índice de productividad celular (CPI) incrementado para isopreno, un título de isopreno incrementado, un rendimiento de masa de isopreno incrementado y/o una productividad específica de isopreno incrementada por las células descritas por cualquiera de las composiciones y métodos descritos en la presente descripción en comparación con células que no tienen uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican un polipéptido de fosfocetolasas , uno o más polipéptidos de la ruta del MVA y un polipéptido de isopreno sintasa. La producción de isopreno puede mejorarse por al menos 5% a aproximadamente 1,000,000 veces. La producción de isopreno puede mejorarse por al menos 10% a aproximadamente 1,000,000 veces (por ejemplo, de aproximadamente 50% a aproximadamente 1,000,000 veces, de aproximadamente 1 a aproximadamente 500,000 veces, de aproximadamente 1 a aproximadamente 50,000 veces, de aproximadamente 1 a aproximadamente 5,000 veces. de aproximadamente 1 a aproximadamente 1, 000 veces, de aproximadamente 1 a aproximadamente 500 veces , de aproximadamente 1 a aproximadamente 100 veces, de aproximadamente 1 a aproximadamente 50 veces, de aproximadamente 5 a aproximadamente 100, 000 veces , de aproximadamente 5 a aproximadamente 10, 000 veces, de aproximadamente 5 a aproximadamente 1,000 veces, de aproximadamente 5 a aproximadamente 500 veces , de aproximadamente 5 a aproximadamente 100 veces , de aproximadamente 10 a aproximadamente 50, 000 veces , de aproximadamente 50 a aproximadamente 10, 000 veces , de aproximadamente 100 a aproximadamente 5, 000 veces , de aproximadamente 200 a aproximadamente 1, 000 veces, de aproximadamente 50 a aproximadamente 500 veces o de aproximadamente 50 a aproximadamente 200 veces) en comparación con la producción de isopreno por las células productoras de isopreno que no expresan de manera endógena enzima fosfocetolasa . En ciertas modalidades descritas en la presente descripción, los métodos descritos en la presente descripción comprenden células hospederas que se han 4 modificado genéticamente aún más para un flujo de carbono incrementado para la producción de MVA para proporcionar una producción mejorada de isopreno en comparación con la producción de isopreno por células productoras de isopreno que no expresan uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican péptido de fosfocetolasa y que no se han modificado genéticamente para un flujo de carbono incrementado para la producción de mevalonato. En ciertas modalidades, el polipéptido de fosfocetolasas es de Clostridium acetobutylicum, Bifidobacterium longum y/o Enterococcus gallinarum.
En otros aspectos, los métodos descritos en la presente descripción se relacionan con la producción mejorada de isopreno por las células descritas en la presente descripción (por ejemplo, mejorada por la expresión de uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican un polipéptido de fosfocetolasas) . En ciertas modalidades, el polipéptido de fosfocetolasas es de Lactobacillus reuteri, Bifidobacterium longum, Ferrimonas baleárica, Pedobactor saltans, Streptomyces griseus y/o Nocardiopsis dassonvillei . En una modalidad, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica una fosfocetolasa aislada de Lactobacillus reuteri. En otra modalidad, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica una fosfocetolasa aislada de Bifidobacterium longum. En otra modalidad adicional, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica una fosfocetolasa aislada de Ferri onas baleárica. En otra modalidad adicional, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica una fosfocetolasa aislada de Pedojbactor saltans. En otra modalidad, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica una fosfocetolasa aislada de Streptomyces griseus . En otra modalidad adicional, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica una fosfocetolasa aislada de Nocardiopsis dassonvillei . En otras modalidades, las células recombinantes descritas en la presente descripción comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica una fosfocetolasa aislada de Clostridium acetobutylicum, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus paraplantarum, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium animalis, Bifidobacterium breve, Enterococcus gallinarum, Gardnerella vaginalis, Ferrimonas baleárica, Mucilaginibacter paludis, Nostoc punctiforme, Nostoc punctiforme PCC 73102, Pantoea, Pedobactor saltans, Rahnella aquatili , Rhodopseudomonas palustris, Streptomyces griseus, Streptomyces avermitilis, Nocardiopsis dassonvillei y/o Thermobifida fusca. En otras modalidades adicionales, las células recombinantes descritas en la presente descripción comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica una fosfocetolasa aislada de Clostridium acetobutylicum, Bifidobacterium longum y/o Enterococcus gallinarum. En una modalidad, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica una fosfocetolasa aislada de Clostridium acetobutylicum. En otra modalidad, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica una fosfocetolasa aislada de Bifidobacterium longum. En otra modalidad adicional, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica una fosfocetolasa aislada de Enterococcus gallinarum. La producción de isopreno puede mejorarse por al menos 5% a aproximadamente 1,000,000 veces. La producción de isopreno puede mejorarse por al menos 10% a aproximadamente 1,000,000 veces (por ejemplo, de aproximadamente 50% a aproximadamente 1,000,000 veces, de aproximadamente 1 a aproximadamente 500,000 veces, de aproximadamente 1 a aproximadamente 50,000 veces, de aproximadamente 1 a aproximadamente 5,000 veces, de aproximadamente 1 a aproximadamente 1, 000 veces , de aproximadamente 1 a aproximadamente 500 veces, de aproximadamente 1 a aproximadamente 100 veces, de aproximadamente 1 a aproximadamente 50 veces , de aproximadamente 5 a aproximadamente 100, 000 veces , de aproximadamente 5 a aproximadamente 10, 000 veces, de aproximadamente 5 a aproximadamente 1, 000 veces, de aproximadamente 5 a aproximadamente 500 veces , de aproximadamente 5 a aproximadamente 100 veces , de aproximadamente 10 a aproximadamente 50, 000 veces , de aproximadamente 50 a aproximadamente 10, 000 veces, de aproximadamente 100 a aproximadamente 5, 000 veces, de aproximadamente 200 a aproximadamente 1, 000 veces , de aproximadamente 50 a aproximadamente 500 veces o de aproximadamente 50 a aproximadamente 200 veces) en comparación con la producción de isopreno por células productoras de isopreno sin la expresión de uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican un polipéptido de fosfocetolasas . La producción de isopreno se puede mejorar, además, en por lo menos aproximadamente cualquiera de 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 1 vez, 2 veces, 5 veces, 10 veces, 20 veces, 50 veces, 100 veces, 200 veces, 500 veces, 1000 veces, 2000 veces, 5000 veces, 10,000 veces, 20,000 veces, 50,000 veces, 100,000 veces, 200,000 veces, 500,000 veces o 1,000,000 veces en comparación con la producción de isopreno por células productoras de isopreno sin la expresión de uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican fosfocetolasa . En ciertas modalidades descritas en la presente descripción, los métodos descritos en la presente descripción comprenden células hospederas que se han modificado genéticamente aún más para un flujo de carbono incrementado para la producción de MVA para proporcionar una producción mejorada de isopreno en comparación con la producción de isopreno por células productoras de isopreno que no expresan uno o más ácidos nucleicos heterologos que codifican péptido de fosfocetolasa y que no se han modificado genéticamente para un flujo de carbono incrementado para la producción de mevalonato. En ciertas modalidades, el polipéptido de fosfocetolasas es de Clostridium acetobutylicum, Bifidobacterium longum y/o Enterococcus gallinarum.
Adicionalmente , se puede usar condiciones de cultivo celular más específicas para cultivar las células en los métodos descritos en la presente descripción. Por ejemplo, en algunos aspectos, el método para la producción de isopreno comprende las etapas de (a) cultivar células recombinantes (que incluyen, pero no se limitan a, células de E. coli) que no tienen de manera endógena un gen de fosfocetolasa en medio mínimo a 34 °C, en donde las células recombinantes expresan de manera heteróloga (i) una o más copias de un gen heterólogo que codifica un polipéptido de fosfocetolasas en un plásmido de copia baja a media y bajo el control de un promotor fuerte, (ii) una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica uno o más polipéptidos del polipéptido de la ruta del MVA (ruta superior del MVA y ruta inferior del MVA) , y (iii) uno o más ácidos nucleicos heterologos que codifican un polipéptido de isopreno sintasa; y (b) producir isopreno. En ciertas modalidades, el polipéptido de fosfocetolasas es de Lactobacillus reuteri, Bifidobacterium longum, Ferrimonas baleárica, Pedobactor saltans, Streptomyces griseus y/o Nocardiopsis dassonvillei . En una modalidad, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterologo que codifica una fosfocetolasa aislada de Lactobacillus reuteri. En otra modalidad, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterologo que codifica una fosfocetolasa aislada de Bifidobacterium longum. En otra modalidad adicional, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterologo que codifica una fosfocetolasa aislada de Ferrimonas baleárica . En otra modalidad adicional, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterologo que codifica una fosfocetolasa aislada de Pedobactor saltans. En otra modalidad, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterologo que codifica una fosfocetolasa aislada de Streptomyces griseus. En otra modalidad adicional, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterologo que codifica una fosfocetolasa aislada de Nocardiopsis dassonvillei. En otras modalidades, las células recombinantes descritas en la presente descripción comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterologo que codifica una fosfocetolasa aislada de Clostridiu acetobutylicum, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus paraplantarum, Bifidobacteriu longum, Bifidobacterium animalis, Bifidobacterium breve, Enterococcus gallinarum, Gardnerella vaginalis, Ferrimonas baleárica, Mucilaginibacter paludis, Nostoc punctiforme, Nostoc punctiforme PCC 73102, Pantoea, Pedobactor saltans, Rahnella aquatilis, Rhodopseudomonas palustris, Streptomyces griseus, Streptomyces avermitilis, Nocardiopsis dassonvillei y/o Thermobifida fusca. En otras modalidades adicionales, las células recombinantes descritas en la presente descripción comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterologo que codifica una fosfocetolasa aislada de Clostridium acetobutylicum, Bifidobacterium longum y/o Enterococcus gallinarum. En una modalidad, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterologo que codifica una fosfocetolasa aislada de Clostridium acetobutylicum. En otra modalidad, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterologo que codifica una fosfocetolasa aislada de Bifidobacterium longum. En otra modalidad adicional, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterologo que codifica una fosfocetolasa aislada de Enterococcus gallinarum. En algunos aspectos, el método para producir isopreno comprende, además, una etapa de recuperar el isopreno.
Células recombinantes con la capacidad de una producción incrementada de precursores de isoprenoides y/o isoprenoides Los isoprenoides se pueden producir en muchos organismos a partir de la síntesis de las moléculas precursoras de isoprenoides que son los productos finales de la ruta del MVA. Como se mencionó anteriormente, los isoprenoides representan una clase importante de compuestos e incluyen, por ejemplo, alimentos y suplementos alimenticios, compuestos de sabor y olor, y compuestos anticancerígenos, antipalúdicos, antifúngicos y antibacterianos.
Como una clase de moléculas, los isoprenoides se clasifican en base al número de unidades de isopreno comprendidas en el compuesto. Los monoterpenos comprenden diez carbonos o dos unidades de isopreno, los sesquiterpenos comprenden 15 carbonos o tres unidades de isopreno, los diterpenos comprenden 20 carbonos o cuatro unidades de isopreno, los sesterterpenos comprenden 25 carbonos o cinco unidades de isopreno, etcétera. Los esteroides (que comprenden, generalmente, aproximadamente 27 carbonos) son los productos de isoprenoides olivados o redispuestos.
Los isoprenoides se pueden producir a partir de las moléculas precursoras de isoprenoides IPP y DMAPP. Estos diversos compuestos se derivan de estos precursores universales, preferentemente, simples y se sintetizan por grupos de poliprenil pirofosfato sintasas conservadas (Hsieh et al., Plant Physiol. marzo de 2011; 155 (3) : 1079-90) . Las diversas longitudes de cadena de estos prenil pirofosfatos lineales, que reflejan sus funciones fisiológicas distintivas, se determinan, generalmente, por los sitios activos altamente desarrollados de poliprenil pirofosfato sintasas por medio de reacciones de condensación de sustratos alílicos (dimetilalil difosfato (C5-DMAPP) , geranil pirofosfato (C10-GPP) , farnesil pirofosfato (C15-FPP) , geranilgeranil pirofosfato (C2Q-GGPP) ) con el número correspondiente de isopentenil pirofosfatos (C5-IPP) (Hsieh et al., Plant Physiol. marzo de 2011 ; 155 (3 ): 1079-90) .
La producción de precursores de isoprenoides y/o isoprenoides se puede llevar a cabo con el uso de cualquiera de las células hospederas recombinantes que comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica una fosfocetolasa para una producción incrementada de precursores de isoprenoides y/o isoprenoides. En algunos aspectos, estas células comprenden, además, uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican polipéptidos de la ruta del MVA, IDI y/o la ruta de DXP, como se describió anteriormente, y un ácido nucleico heterólogo que codifica un polipéptido de poliprenil pirofosfato sintasa. Sin limitaciones teóricas, se cree que el incremento en la producción celular de mevalonato en células recombinantes por cualquiera de las composiciones y métodos descritos anteriormente resultará, de igual manera, en la producción de cantidades mayores de moléculas precursoras de isoprenoides y/o isoprenoides . El incremento en el rendimiento molar de producción de mevalonato a partir de glucosa representa rendimientos molares más altos de moléculas precursoras de isoprenoides y/o isoprenoides, que incluyen isopreno, producidos a partir de glucosa cuando se combina con los niveles adecuados de actividad enzimática de mevalonato cinasa, fosfomevalonato cinasa, difosfomevalonato descarboxilasa, isopentenil difosfato isomerasa y otras enzimas adecuadas para la producción de isopreno e isoprenoides. Las células recombinantes descritas en la presente descripción que tienen diversas rutas enzimáticas manipuladas para un flujo de carbono incrementado para la producción de mevalonato pueden usarse para producir precursores de isoprenoides y/o isoprenoides. En algunos aspectos, las células recombinantes se pueden modificar genéticamente aún más para aumentar la actividad de uno o más de los siguientes genes seleccionados del grupo que consiste en rpiA, rpe, tktA, tal B, pta y/o eutD. En otro aspecto, estas cepas se pueden modificar genéticamente aún más para reducir la actividad de uno o más de los siguientes genes que incluyen zwf, pfkA, fba, gapA, ackA, gltA y/o pts.
Tipos de isoprenoides Las células recombinantes de la presente invención tienen la capacidad de una producción incrementada de isoprenoides y las moléculas precursoras de isoprenoides DMAPP y IPP. Los ejemplos de isoprenoides incluyen, pero no se limitan a, hemiterpenoides, monoterpenoides , sesquiterpenoides, diterpenoides , sesterterpenoides , triterpenoides, tetraterpenoides y politerpenoides superiores. En algunos aspectos, el hemiterpenoide es prenol (por ejemplo, 3-metil-2-buten-l-ol) , isoprenol (por ejemplo, 3-metil-3-buten-l-ol) , 2-metil-3-buten-2-ol o ácido isovalérico. En algunos aspectos, el monoterpenoide puede ser, sin limitarse a, geranil pirofosfato, eucaliptol, limoneno o pineno. En algunos aspectos, el sesquiterpenoide es farnesil pirofosfato, artemisinina o bisabolol. En algunos aspectos, el diterpenoide puede ser, sin limitarse a, geranilgeranil pirofosfato, retinol, retineno, fitol, taxol, forescolina o afidicolina. En algunos aspectos, el triterpenoide puede ser, sin limitarse a, escualeno o lanosterol . El isoprenoide se puede seleccionar, además, del grupo que consiste en abietadieno, amorfadieno, careno, a-fameseno, ß-farneseno, farnesol, geraniol, geranilgeraniol , linalol, limoneno, mirceno, nerolidol, ocimeno, patchoulol, ß-pineno, sabineno, ?-terpineno, terpindeno y valenceno.
En algunos aspectos, el tetraterpenoide es licopeno o caroteno (un carotenoide) . Como se usa en la presente descripción, el término "carotenoide" se refiere a un grupo de pigmentos orgánicos de origen natural producidos en los cloroplastos y cromoplastos de plantas, de ciertos otros organismos fotosintéticos , tales como algas, en ciertos tipos de hongos y en ciertas bacterias. Los carotenoides incluyen las xantófilas que contienen oxígeno y los carotenos que no contienen oxígeno. En algunos aspectos, los carotenoides se seleccionan del grupo que consiste en xantófilas y carotenos. En algunos aspectos, la xantofila es luteína o zeaxantina. En algunos aspectos, el carotenoide es a-caroteno, ß-caroteno, ?-caroteno, ß-criptoxantina o licopeno. Ácidos nucleicos heterologos que codifican polipéptidos de poliprenil pirofosfato sintasas En algunos aspectos de la presente invención, las células descritas en cualquiera de las composiciones o métodos en la presente descripción comprenden, además, uno o más ácidos nucleicos que codifican uno o más polipéptidos de la ruta del mevalonato (MVA) , como se describió anteriormente, así como uno o más ácidos nucleicos que codifican uno o más polipéptidos de poliprenil pirofosfato sintasa. El polipéptido de poliprenil pirofosfato sintasa puede ser un polipéptido endógeno. El ácido nucleico endógeno que codifica un polipéptido de poliprenil pirofosfato sintasa puede estar unido operativamente a un promotor constitutivo o puede estar, de la misma manera, unido operativamente a un promotor inducible. El ácido nucleico endógeno que codifica un polipéptido de poliprenil pirofosfato sintasa puede, adicionalmente, estar unido operativamente a un promotor fuerte. Alternativamente, el ácido nucleico endógeno que codifica un polipéptido de poliprenil pirofosfato sintasa puede estar unido operativamente a un promotor débil. Particularmente, las células pueden modificarse genéticamente para sobreexpresar el polipéptido endógeno de poliprenil pirofosfato sintasa con relación a las células silvestres.
En algunos aspectos, el polipéptido de poliprenil pirofosfato sintasa es un polipéptido heterólogo. Las células de la presente invención pueden comprender más de una copia de un ácido nucleico heterólogo que codifica un polipéptido de poliprenil pirofosfato sintasa. En algunos aspectos, el ácido nucleico heterólogo que codifica un polipéptido de poliprenil pirofosfato sintasa se une operativamente a un promotor constitutivo. En algunos aspectos, el ácido nucleico heterólogo que codifica un polipéptido de poliprenil pirofosfato sintasa se une operativamente a un promotor inducible. En algunos aspectos, el ácido nucleico heterólogo que codifica un polipéptido de poliprenil pirofosfato sintasa se une operativamente a un promotor fuerte. En algunos aspectos, el ácido nucleico heterólogo que codifica un polipéptido de poliprenil pirofosfato sintasa se une operativamente a un promotor débil.
Los ácidos nucleicos que codifican uno o más polipéptidos de poliprenil pirofosfato sintasa se pueden integrar en un genoma de las células hospederas o se pueden expresar de manera estable en las células. Los ácidos nucleicos que codifican uno o más polipéptidos de poliprenil pirofosfato sintasa pueden estar, adicionalmente , sobre un vector.
Los ácidos nucleicos de poliprenil pirofosfato sintasa ilustrativos incluyen ácidos nucleicos que codifican un polipéptido, fragmento de un polipéptido, péptido o polipéptido de fusión que tiene por lo menos una actividad de una poliprenil pirofosfato sintasa. Los polipéptidos de poliprenil pirofosfato sintasa convierten moléculas precursoras de isoprenoides en compuestos de isoprenoides más complejos. Los polipéptidos de poliprenil pirofosfato sintasa ilustrativos incluyen polipéptidos, fragmentos de polipéptidos, péptidos y polipéptidos de fusión que tienen por lo menos una actividad de un polipéptido de isopreno sintasa. Los polipéptidos y ácidos nucleicos de poliprenil pirofosfato sintasa ilustrativos incluyen polipéptidos y ácidos nucleicos de origen natural a partir de cualquiera de los organismos de recurso descritos en la presente descripción. Adicionalmente, las variantes de poliprenil pirofosfato sintasa pueden tener una actividad mejorada, tal como actividad enzimática mejorada. En algunos aspectos, una variante de poliprenil pirofosfato sintasa tiene otras propiedades mejoradas, tales como estabilidad mejorada (por ejemplo, termoestabilidad) y/o solubilidad mejorada. Los ácidos nucleicos de poliprenil pirofosfato sintasa ilustrativos pueden incluir ácidos nucleicos que codifican polipéptidos de poliprenil pirofosfato sintasa, tales como, pero sin limitarse a, geranil difosfato (GPP) sintasa, farnesil pirofosfato (FPP) sintasa y geranilgeranil pirofosfato (GGPP) sintasa o cualquier otro polipéptido de poliprenil pirofosfato sintasa conocido.
En algunos aspectos de la presente invención, las células descritas en cualquiera de las composiciones o métodos de la presente descripción comprenden, además, uno o más ácidos nucleicos que codifican una farnesil pirofosfato (FPP) sintasa. El polipéptido de FPP sintasa puede ser un polipéptido endógeno codificado por un gen endógeno. En algunos aspectos, el polipéptido de FPP sintasa está codificado por un gen endógeno de ispA en E. coli. El ácido nucleico endógeno que codifica un polipéptido de FPP sintasa puede estar unido operativamente a un promotor constitutivo o puede estar, de la misma manera, unido operativamente a un promotor inducible. El ácido nucleico endógeno que codifica un polipéptido de FPP sintasa puede, adicionalmente , estar unido operativamente a un promotor fuerte. Particularmente, las células pueden modificarse genéticamente para sobreexpresar el polipéptido de FPP sintasa endógeno con relación a las células silvestres.
En algunos aspectos, el polipéptido de FPP sintasa es un polipéptido heterólogo. Las células de la presente invención pueden comprender más de una copia de un ácido nucleico heterólogo que codifica un polipéptido de FPP sintasa. En algunos aspectos, el ácido nucleico heterólogo que codifica un polipéptido de FPP sintasa se une operativamente a un promotor constitutivo. En algunos aspectos, el ácido nucleico heterólogo que codifica un polipéptido de FPP sintasa se une operativamente a un promotor inducible. En algunos aspectos, el ácido nucleico heterólogo que codifica un polipéptido de poliprenil pirofosfato sintasa se une operativamente a un promotor fuerte .
Los ácidos nucleicos que codifican un polipéptido de FPP sintasa se pueden integrar en un genoma de las células hospederas o se pueden expresar de manera estable en las células. Los ácidos nucleicos que codifican una FPP sintasa pueden estar, adicionalmente, sobre un vector.
Se puede usar métodos convencionales para determinar si un polipéptido tiene actividad de polipéptido de poliprenil pirofosfato sintasa al determinar la capacidad del polipéptido para convertir IPP a isoprenoides de orden superior in vitro, en un extracto celular o in vivo. Estos métodos son muy conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en la patente de los Estados Unidos núm.: 7,915,026; Hsieh et al., Plant Physiol. marzo de 2011; 155 (3 ) : 1079-90 ; Danner et al . , Phytochemistry. 12 de abril de 2011 [Publicación electrónica antes de su impresión] ; Jones et al., J Biol Chem. 24 de marzo de 2011 [publicación electrónica antes de ser impresa] ; Keeling et al., BMC Plant Biol. 7 de marzo de 2011; 11:43; Martin et al., BMC Plant Biol. 21 de octubre de 2010; 10:226; Kumeta & Ito, Plant Physiol. diciembre de 2010; 154 (4 ) : 1998-2007 ; y Kóllner & Boland, J" Org Chem. 20 de agosto de 2010; 75 (16 ) : 5590-600.
Células recombinantes con la capacidad de una producción incrementada de precursores de isoprenoides y/o isoprenoides Las células recombinantes (por ejemplo, células bacterianas recombinantes) descritas en la presente descripción tienen la capacidad para producir precursores de isoprenoides y/o isoprenoides a una cantidad y/o concentración mayor que la de las mismas células que carecen de una o más copias de un ácido nucleico heterologo que codifica fosfocetolasa, una o más copias de un ácido nucleico heterologo que codifica un polipéptido de la ruta del MVA y uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican un polipéptido de poliprenil pirofosfato sintasa cuando se cultivan en las mismas condiciones. En ciertas modalidades, la copia o copias de un ácido nucleico heterologo que codifica péptido de fosfocetolasa son de Lactobacillus reuteri, Bifidobacterium longum, Ferrimonas baleárica, Pedobactor saltans, Streptomyces grise s y/o Nocardiopsis dassonvillei . En una modalidad, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterologo que codifica una fosfocetolasa aislada de Lactobacillus reuteri. En otra modalidad, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterologo que codifica una fosfocetolasa aislada de Bifidobacterium longum. En otra modalidad adicional, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterologo que codifica una fosfocetolasa aislada de Ferrimonas baleárica . En otra modalidad adicional, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterologo que codifica una fosfocetolasa aislada de Pedobactor saltans. En otra modalidad, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterologo que codifica una fosfocetolasa aislada de Streptomyces griseus. En otra modalidad adicional, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterologo que codifica una fosfocetolasa aislada de Nocardiopsis dassonvillei. En otras modalidades, las células recombinantes descritas en la presente descripción comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterologo que codifica una fosfocetolasa aislada de Clostridium acetobutylicu , Lactobacillus reuteri, Lactobacillus plantaru , Lactobacillus paraplantarum, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium animalis, Bifidobacterium breve, Enterococcus gallinarum, Gardnerella vaginalis, Ferrimonas bale rica, Mucilaginibacter paludis, Nostoc punctiforme, Nostoe punctiforme PCC 73102, Pantoea, Pedobactor saltans, Rahnella aquatilis, Rhodopseudomonas palustris, Streptomyces griseus, Streptomyces avermitilis, Nocardiopsis dassonvillei y/o Thermobifida fusca. En otras modalidades adicionales, las células recombinantes descritas en la presente descripción comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica una fosfocetolasa aislada de Clostridium acetobutylicum, Bifidobacterium longum y/o Enterococcus gallinarum. En una modalidad, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica una fosfocetolasa aislada de Clostridium acetobutylicum. En otra modalidad, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica una fosfocetolasa aislada de Bifidobacterium longum. En otra modalidad adicional, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica una fosfocetolasa aislada de Enterococcus gallinarum. En algunos aspectos, la copia o copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica fosfocetolasa, una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica un polipéptido de la ruta del MVA y uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican un polipéptido de poliprenil pirofosfato sintasa son ácidos nucleicos heterólogos que se integran en el cromosoma de la célula hospedera. Las células recombinantes pueden producir por lo menos cantidades 5% mayores de precursores de isoprenoides y/o isoprenoides en comparación con células recombinantes productoras de isoprenoides y/o precursores de isoprenoides que no comprenden polipéptido de fosfocetolasas . Alternativamente, las células recombinantes pueden producir más de aproximadamente 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14% o 15% de precursores de isoprenoides y/o isoprenoides, no excluyentes, así como cualquier valor numérico entre estos números en comparación con la producción de isoprenoides y/o precursores de isoprenoides por células productoras de isoprenoides y/o precursores de isoprenoides que no expresan uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican una fosfocetolasa . En ciertas modalidades descritas en la presente descripción, los métodos en la presente descripción comprenden células hospederas que se han modificado genéticamente aún más para un flujo de carbono incrementado para la producción de MVA para proporcionar una producción mejorada de isoprenoides y/o precursores de isoprenoides en comparación con la producción de isoprenoides y/o precursores de isoprenoides por células productoras de isoprenoides y/o precursores de isoprenoides que no expresan uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican péptido de fosfocetolasa y que no se han modificado genéticamente para un flujo de carbono incrementado para la producción de mevalonato .
En un aspecto de la presente invención, se proporciona células recombinantes que comprenden uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican un polipéptido de fosfocetolasas , uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican uno o más polipéptidos de la ruta completa del MVA (es decir, la ruta superior del MVA y la ruta inferior del MVA) , uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican poliprenil pirofosfato sintasa y/o uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican uno o más polipéptidos de la ruta de DXP. Las células pueden comprender, además, uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican un polipéptido de IDI . Adicionalmente , el polipéptido de poliprenil pirofosfato sintasa puede ser un polipéptido de FPP sintasa. En ciertas modalidades, la copia o copias de un ácido nucleico heterologo que codifica péptido de fosfocetolasa es de Lactobacillus reuteri, Bifidobacterium longum, Ferrimonas baleárica, Pedobactor saltans, Streptomyces griseus y/o Nocardiopsis dassonvillei . En una modalidad, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterologo que codifica una fosfocetolasa aislada de Lactobacillus reuteri. En otra modalidad, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterologo que codifica una fosfocetolasa aislada de Bifidobacterium longum. En otra modalidad adicional, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterologo que codifica una fosfocetolasa aislada de Ferrimonas baleárica . En otra modalidad adicional, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterologo que codifica una fosfocetolasa aislada de Pedobactor saltans. En otra modalidad, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterologo que codifica una fosfocetolasa aislada de Streptomyces griseus . En otra modalidad adicional, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterologo que codifica una fosfocetolasa aislada de Nocardiopsis dassonvillei . En otras modalidades, las células recombinantes descritas en la presente descripción comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterologo que codifica una fos ocetolasa aislada de Clostridium acetobutylicum, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus paraplantarum, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium animalis, Bifidobacterium breve, Enterococcus gallinarum, Gardnerella vaginalis, Ferrimonas baleárica, Mucilaginibacter paludis, Nostoc punctiforme, Nostoc punctiforme PCC 73102, Pantoea, Pedobactor saltans, Rahnella aquatilis, Rhodopseudomonas palustris, Streptomyces griseus, Streptomyces avermitilis, Nocardiopsis dassonvillei y/o Thermobifida fusca. En otras modalidades adicionales, las células recombinantes descritas en la presente descripción comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterologo que codifica una fosfocetolasa aislada de Clostridium acetobutylicum, Bifidobacterium longum y/o Enterococcus gallinarum. En una modalidad, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterologo que codifica una fosfocetolasa aislada de Clostridium acetobutylicum. En otra modalidad, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterologo que codifica una fosfocetolasa aislada de Bifidobacterium longum. En otra modalidad adicional, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterologo que codifica una fosfocetolasa aislada de Enterococcus gallinarum. El o los ácidos nucleicos heterologos pueden estar unidos operativamente a promotores constitutivos, pueden estar unidos operativamente a promotores inducibles o pueden estar unidos operativamente a una combinación de promotores inducibles y promotores constitutivos. El o los ácidos nucleicos heterologos pueden, adicionalmente, estar unidos operativamente a promotores fuertes, promotores débiles y/o promotores medios. Uno o más de los ácidos nucleicos heterologos que codifican un polipéptido de fosfocetolasas , uno o más polipéptidos de la ruta completa del MVA (es decir, la ruta superior del MVA y la ruta inferior del MVA) , un polipéptido de poliprenil pirofosfato sintasa y/o uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican uno o más polipéptidos de la ruta de DXP se pueden integrar en un genoma de las células hospederas o se pueden expresar de manera estable en las células. En ciertas modalidades, la copia o copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica péptido de fosfocetolasa es de Clostridium acetobutylicum, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus paraplantarum, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium animalis, Bifidobacterium breve, Enterococcus gallinarum, Gardnerella vaginalis, Ferrimonas baleárica, Mucilaginibacter paludis, Nostoc punctiforme, Nostoc punctiforme PCC 73102, Pantoea, Pedobactor saltans, Rahnella aquatilis, Rhodopseudomonas palustris, Streptomyces griseus, Streptomyces avermitilis, Nocardiopsis dassonvillei y/o Thermobifida fusca. En otras modalidades adicionales, las células recombinantes descritas en la presente descripción comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica una fosfocetolasa aislada de Clostridium acetobutylicum, Bifidobacterium longum y/o Enterococcus gallinarum. En una modalidad, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica una fosfocetolasa aislada de Clostridium acetobutylicum. En otra modalidad, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica una fosfocetolasa aislada de Bifidobacterium longum. En otra modalidad adicional, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica una fosfocetolasa aislada de Enterococcus gallinarum. El o los ácidos nucleicos heterologos pueden estar, adicionalmente , sobre uno o más vectores .
La presente descripción proporciona células recombinantes que pueden proporcionar una producción mejorada de precursores de isoprenoides y/o isoprenoides . La producción de precursores de isoprenoides y/o isoprenoides por las células se puede mejorar por la expresión de uno o más ácidos nucleicos heterologos que codifican un polipéptido de fosfocetolasas , uno o más ácidos nucleicos heterologos que codifican uno o más polipéptidos de la ruta completa del MVA (es decir, la ruta superior del MVA y la ruta inferior del MVA) y uno o más ácidos nucleicos heterologos que codifican un polipéptido de poliprenil pirofosfato sintasa. En ciertas modalidades, la copia o copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica péptido de fosfocetolasa es de Lactobacillus reuteri, Bifidobacterium longum, Ferrimonas baleárica, Pedobactor saltans, Streptomyces griseus y/o Nocardiopsis dassonvillei . En una modalidad, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterologo que codifica una fosfocetolasa aislada de Lactobacillus reuteri. En otra modalidad, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterologo que codifica una fosfocetolasa aislada de BifidoJbac eríum longum. En otra modalidad adicional, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterologo que codifica una fosfocetolasa aislada de Ferrimonas baleárica. En otra modalidad adicional, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterologo que codifica una fosfocetolasa aislada de Pedobactor saltans. En otra modalidad, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterologo que codifica una fosfocetolasa aislada de Streptomyces griseus . En otra modalidad adicional, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterologo que codifica una fosfocetolasa aislada de Nocardíopsis dassonvillei . En otras modalidades, las células recombinantes descritas en la presente descripción comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterologo que codifica una fosfocetolasa aislada de Clostridium acetobutylicum, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus paraplantarum, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium animalis, Bifidobacterium breve, Enterococcus gallinarum, Gardnerella vaginalis, Ferrimonas baleárica, Mucilaginibacter paludis, Nostoc punctiforme, Nostoc punctiforme PCC 73102, Pantoea, Pedobactor saltans, Rahnella aquatilis, Rhodopseudomonas palustris, Streptomyces griseus, Streptomyces avermitilis, Nocardiopsis dassonvillei y/o Thermobifida fusca. En otras modalidades adicionales, las células recombinantes descritas en la presente descripción comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterologo que codifica una fosfocetolasa aislada de Clostridium acetobutylicum, Bifidobacterium longum y/o Enterococcus gallinarum. En una modalidad, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterologo que codifica una fosfocetolasa aislada de Clostridium acetobutylicum. En otra modalidad, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterologo que codifica una fosfocetolasa aislada de Bifidobacterium longum. En otra modalidad adicional, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterologo que codifica una fosfocetolasa aislada de Enterococcus gallinarum. Como se usa en la presente descripción, producción "mejorada" de precursores de isoprenoides y/o isoprenoides se refiere a un índice de productividad celular (CPI) incrementado para la producción de precursores de isoprenoides y/o isoprenoides, un título incrementado de precursores de isoprenoides y/o isoprenoides, un rendimiento de masa incrementado de precursores de isoprenoides y/o isoprenoides, y/o una productividad específica incrementada de precursores de isoprenoides y/o isoprenoides por las células descritas por cualquiera de las composiciones y métodos descritos en la presente descripción en comparación con células que no tienen uno o más ácidos nucleicos heterologos que codifican una fosfocetolasa, uno o más polipéptidos de la ruta completa del MVA, y un polipéptido de poliprenil pirofosfato sintasa. La producción de precursores de isoprenoides y/o isoprenoides puede mejorarse por al menos 5% a aproximadamente 1,000,000 veces. La producción de precursores de isoprenoides y/o isoprenoides puede mejorarse por al menos 10% a aproximadamente 1,000,000 veces (por ejemplo, de aproximadamente 1 a aproximadamente 500,000 veces, de aproximadamente 1 a aproximadamente 50,000 veces, de aproximadamente 1 a aproximadamente 5,000 veces, de aproximadamente 1 a aproximadamente 1,000 veces , de aproximadamente 1 a aproximadamente 500 veces , de aproximadamente 1 a aproximadamente 100 veces, de aproximadamente 1 a aproximadamente 50 veces, de aproximadamente 5 a aproximadamente 100, 000 veces , de aproximadamente 5 a aproximadamente 10, 000 veces, de aproximadamente 5 a aproximadamente 1, 000 veces , de aproximadamente 5 a aproximadamente 500 veces , de aproximadamente 5 a aproximadamente 100 veces , de aproximadamente 10 a aproximadamente 50, 000 veces , de aproximadamente 50 a aproximadamente 10,000 veces, de aproximadamente 100 a aproximadamente 5,000 veces, de aproximadamente 200 a aproximadamente 1,000 veces, de aproximadamente 50 a aproximadamente 500 veces o de aproximadamente 50 a aproximadamente 200 veces) en comparación con la producción de isoprenoides y/o precursores de isoprenoides por células sin la expresión de uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican una fosfocetolasa . En ciertas modalidades descritas en la presente descripción, las células hospederas recombinantes se han modificado genéticamente aún más para un flujo de carbono incrementado para la producción de MVA para proporcionar una producción mejorada de isoprenoides y/o precursores de isoprenoides en comparación con la producción de isoprenoides y/o precursores de isoprenoides por células productoras de isoprenoides y/o precursores de isoprenoides que no expresan uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican polipéptido de fosfocetolasas y que no se han modificado genéticamente para un flujo de carbono incrementado para la producción de mevalonato.
La producción de precursores de isoprenoides y/o isoprenoides por las células descritas en la presente descripción se puede mejorar (por ejemplo, mejorar por medio de la expresión de uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican los polipéptidos de fosfocetolasa a partir de Clostridium acetobutylicum, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus paraplantarum, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium animalis, Bifidobacterium breve, Enterococcus gallinarum, Gardnerella vaginalis, Ferrimonas baleárica, Mucilaginibacter paludis, Nostoc punctiforme, Nostoc punctiforme PCC 73102, Pantoea, Pedobactor saltans, Rahnella aquatilis, Rhodopseudomonas palustris, Streptomyces griseus, Streptomyces avermitilis, Nocardiopsis dassonvillei y/o Thermobifida fusca, uno o más ácidos nucleicos heterologos que codifican un polipéptido de la ruta inferior del MVA, y uno o más ácidos nucleicos heterologos que codifican un polipéptido de poliprenil pirofosfato sintasa) . La producción de precursores de isoprenoides y/o isoprenoides puede mejorarse por al menos 5% a aproximadamente 1,000,000 veces. La producción de precursores de isoprenoides y/o isoprenoides puede mejorarse por al menos 10% a aproximadamente 1,000,000 veces (por ejemplo, de aproximadamente 1 a aproximadamente 500,000 veces, de aproximadamente 1 a aproximadamente 50,000 veces, de aproximadamente 1 a aproximadamente 5, 000 veces , de aproximadamente 1 a aproximadamente 1,000 veces, de aproximadamente 1 a aproximadamente 500 veces , de aproximadamente 1 a aproximadamente 100 veces, de aproximadamente 1 a aproximadamente 50 veces , de aproximadamente 5 a aproximadamente 100,000 veces , de aproximadamente 5 a aproximadamente 10, 000 veces, de aproximadamente 5 a aproximadamente 1, 000 veces, de aproximadamente 5 a aproximadamente 500 veces , de aproximadamente 5 a aproximadamente 100 veces , de aproximadamente 10 a aproximadamente 50, 000 veces , de aproximadamente 50 a aproximadamente 10, 000 veces , de aproximadamente 100 a aproximadamente 5, 000 veces, de aproximadamente 200 a aproximadamente 1, 000 veces , de aproximadamente 50 a aproximadamente 500 veces o de aproximadamente 50 a aproximadamente 200 veces) en comparación con la producción de precursores de isoprenoides y/o isoprenoides por células de origen natural (por ejemplo, células sin la expresión de uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican polipéptido de fosfocetolasas a partir de Clostridium acetobutylicum, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus paraplantarum, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium animalis, Bi idobacterium breve, Enterococcus gallinarum, Gardnerella vaginalis, Ferrimonas baleárica, Mucilaginibacter paludis, Nostoc punctiforme, Nostoc punctiforme PCC 73102, Pantoea, Pedobactor saltans, Rahnella aquatilis, Rhodopseudomonas palustris, Streptomyces griseus, Streptomyces avermitilis, Nocardiopsis dassonvillei y/o Thermobifida fusca junto con uno o más ácidos nucleicos heterólogos que expresan uno o más péptidos de la ruta del MVA y que no se han modificado genéticamente para un flujo de carbono incrementado para la producción de mevalonato.
En otras modalidades, las células recombinantes descritas en la presente descripción pueden facilitar la producción de precursores de isoprenoides y/o isoprenoides y pueden mejorarse, además, en por lo menos aproximadamente cualquiera de 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 1 vez, 2 veces, 5 veces, 10 veces, 20 veces, 50 veces, 100 veces, 200 veces, 500 veces, 1000 veces, 2000 veces, 5000 veces, 10,000 veces, 20,000 veces, 50,000 veces, 100,000 veces, 200,000 veces, 500,000 veces o 1,000,000 veces en comparación con la producción de precursores de isoprenoides y/o isoprenoides por células recombinantes productoras de precursores de isoprenoides y/o isoprenoides que no expresan uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican un polipéptido de fosfocetolasas Métodos para usar las células recombinantes para producir isoprenoides y/o moléculas precursoras de isoprenoides La presente descripción proporciona, además, métodos para producir moléculas precursoras de isoprenoides y/o isoprenoides; los métodos comprenden cultivar células recombinantes (por ejemplo, células bacterianas recombinantes) que comprenden uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican una fosfocetolasa y un polipéptido de poliprenil pirofosfato sintasa. En ciertas modalidades, las células recombinantes comprenden, además, uno o más ácidos nucleicos heterologos que codifican un polipéptido de la ruta superior del MVA y un polipéptido de la ruta inferior del MVA. Las moléculas precursoras de isoprenoides y/o isoprenoides se pueden producir a partir de cualquiera de las células descritas en la presente descripción y de conformidad con cualquiera de los métodos descritos en la presente descripción. Se puede usar cualquiera de las células con el fin de producir moléculas precursoras de isoprenoides y/o isoprenoides a partir de carbohidratos, que incluyen seis azúcares de carbono, tales como glucosa.
En ciertos aspectos, la presente invención proporciona métodos para producir moléculas precursoras de isoprenoides y/o isoprenoides; los métodos comprenden cultivar células recombinantes que comprenden uno o más ácidos nucleicos heterologos que codifican un polipéptido de fosfocetolasas a partir de Lactobacillus reuteri , Bifidobacterium longum, Ferrimonas baleárica, Pedobactor saltans, Streptomyces griseus, y/o Nocardiopsis dassonvillei , un polipéptido mvaE y un mvaS a partir de L. grayi, E. faecium, E. gallinarum, E. casseliflavus y/o E. faecalis en una condición adecuada para producir moléculas precursoras de isoprenoides y/o isoprenoides, y (b) producir moléculas precursoras de isoprenoides y/o isoprenoides. Las células pueden comprender, además, una o más moléculas de ácido nucleico que codifican el o los polipéptidos de la ruta inferior del MVA descritos anteriormente (por ejemplo, MVK, P K, MVD y/o IDI) y cualquiera de los polipéptidos de poliprenil pirofosfato sintasa descritos anteriormente. En algunos aspectos, las células recombinantes pueden ser cualquiera de las células descritas en la presente descripción. Cualquiera de las poliprenil pirofosfato sintasas o variantes de estas descritas en la presente descripción, cualquiera de las cepas de células hospederas descritas en la presente descripción, cualquiera de los promotores descritos en la presente descripción y/o cualquiera de los vectores descritos en la presente descripción pueden usarse, además, para producir moléculas precursoras de isoprenoides y/o isoprenoides con el uso de cualquiera de las fuentes de energía (por ejemplo, glucosa o cualquiera de las otras seis azúcares de carbono) descritas en la presente descripción. En algunos aspectos, el método para producir moléculas precursoras de isoprenoides y/o isoprenoides comprende, además, una etapa de recuperar las moléculas precursoras de isoprenoides y/o isoprenoides.
En ciertos aspectos, la presente invención proporciona métodos para producir moléculas precursoras de isoprenoides y/o isoprenoides; los métodos comprenden cultivar células recombinantes que comprenden uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican un polipéptido de fosfocetolasas a partir de Clostridium acetobutylicum, Bifidobacterium longum y/o Enterococcus gallinarum, un polipéptido mvaE y un mvaS a partir de L. grayi, E. faecium, E. gallinarum, E. casseliflavus y/o E. faecalis, en una condición adecuada para producir moléculas precursoras de isoprenoides y/o isoprenoides, y (b) producir moléculas precursoras de isoprenoides y/o isoprenoides. Las células pueden comprender, además, una o más moléculas de ácido nucleico que codifican el o los polipéptidos de la ruta inferior del MVA descritos anteriormente (por ejemplo, MVK, PMK, MVD y/o IDI) y cualquiera de los polipéptidos de poliprenil pirofosfato sintasa descritos anteriormente. En algunos aspectos, las células recombinantes pueden ser cualquiera de las células descritas en la presente descripción. Cualquiera de las poliprenil pirofosfato sintasas o variantes de estas descritas en la presente descripción, cualquiera de las cepas de células hospederas descritas en la presente descripción, cualquiera de los promotores descritos en la presente descripción y/o cualquiera de los vectores descritos en la presente descripción pueden usarse, además, para producir moléculas precursoras de isoprenoides y/o isoprenoides con el uso de cualquiera de las fuentes de energía (por ejemplo, glucosa o cualquiera de las otras seis azúcares de carbono) descritas en la presente descripción. En algunos aspectos, el método para producir moléculas precursoras de isoprenoides y/o isoprenoides comprende, además, una etapa de recuperar las moléculas precursoras de isoprenoides y/o isoprenoides.
El método para producir moléculas precursoras de isoprenoides y/o isoprenoides puede comprender, de igual manera, las etapas de: (a) cultivar células recombinantes (que incluyen, pero no se limitan a, células de E. coli) que no tienen de manera endógena una fosfocetolasa, en donde las células recombinantes expresan de manera heteróloga una o más copias de un gen que codifica un polipéptido de fosfocetolasas ; y (b) producir moléculas precursoras de isoprenoides y/o isoprenoides, en donde las células recombinantes producen cantidades mayores de precursores de isoprenoides y/o isoprenoides en comparación con células productoras de isoprenoides y/o precursores de isoprenoides que no comprenden el polipéptido de fosfocetolasas .
Los métodos instantáneos para la producción de moléculas precursoras de isoprenoides y/o isoprenoides pueden producir cantidades por lo menos 5% mayores de precursores de isoprenoides y/o isoprenoides en comparación con células recombinantes productoras de isoprenoides y/o precursores de isoprenoides que no comprenden un polipéptido de fosfocetolasas . Alternativamente, las células recombinantes pueden producir más de aproximadamente 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14% o 15% de precursores de isoprenoides y/o isoprenoides, no excluyentes . En algunos aspectos, el método para producir moléculas precursoras de isoprenoides y/o isoprenoides comprende, además, una etapa de recuperar las moléculas precursoras de isoprenoides y/o isoprenoides .
La presente descripción proporciona métodos para usar cualquiera de las células descritas anteriormente para mejorar la producción de isoprenoides y/o moléculas precursoras de isoprenoides. La producción de moléculas precursoras de isoprenoides y/o isoprenoides por las células se puede mejorar por la expresión de uno o más ácidos nucleicos heterologos que codifican fosfocetolasa y/o los polipéptidos mvaE y mvaS a partir de L. grayi, E. faecium, E. gallínarum, E. casseliflavus y/o E. faecalis, uno o más ácidos nucleicos heterologos que codifican un polipéptido de la ruta inferior del MVA, y uno o más ácidos nucleicos heterologos que codifican un polipéptido de poliprenil pirofosfato sintasa. Como se usa en la presente descripción, producción "mejorada" de precursores de isoprenoides y/o isoprenoides se refiere a un índice de productividad celular (CPI) incrementado para la producción de precursores de isoprenoides y/o isoprenoides, un título incrementado de precursores de isoprenoides y/o isoprenoides, un rendimiento de masa incrementado de precursores de isoprenoides y/o isoprenoides, y/o una productividad específica incrementada de precursores de isoprenoides y/o isoprenoides por las células descritas por cualquiera de las composiciones y métodos descritos en la presente descripción en comparación con células que no tienen uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican una fosfocetolasa, un polipéptido de poliprenil pirofosfato sintasa, uno o más polipéptidos de la ruta inferior del MVA, los polipéptidos de mvaE y mvaS a partir de L. grayi, E. faecium, E. gallinarum, E. casseliflavus. La producción de moléculas precursoras de isoprenoides y/o isoprenoides puede mejorarse por al menos 5% a aproximadamente 1,000,000 veces. La producción de moléculas precursoras de isoprenoides y/o isoprenoides puede mejorarse por al menos 10% a aproximadamente 1,000,000 veces (por ejemplo, de aproximadamente 1 a aproximadamente 500,000 veces, de aproximadamente 1 a aproximadamente 50,000 veces, de aproximadamente 1 a aproximadamente 5, 000 veces , de aproximadamente 1 a aproximadamente 1,000 veces , de aproximadamente 1 a aproximadamente 500 veces, de aproximadamente 1 a aproximadamente 100 veces , de aproximadamente 1 a aproximadamente 50 veces, de aproximadamente 5 a aproximadamente 100,000 veces. de aproximadamente 5 a aproximadamente 10,000 veces , de aproximadamente 5 a aproximadamente 1,000 veces , de aproximadamente 5 a aproximadamente 500 veces, de aproximadamente 5 a aproximadamente 100 veces, de aproximadamente 10 a aproximadamente 50,000 veces, de aproximadamente 50 a aproximadamente 10, 000 veces , de aproximadamente 100 a aproximadamente 5,000 veces, de aproximadamente 200 a aproximadamente 1,000 veces, de aproximadamente 50 a aproximadamente 500 veces o de aproximadamente 50 a aproximadamente 200 veces) en comparación con la producción de moléculas precursoras de isoprenoides y/o isoprenoides por células sin la expresión de uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican un polipéptido de fosfocetolasas . En ciertas modalidades descritas en la presente descripción, los métodos comprenden células hospederas recombinantes que se han modificado genéticamente aún más para un flujo de carbono incrementado para la producción de MVA para proporcionar una producción mejorada de isoprenoides y/o precursores de isoprenoides en comparación con la producción de isoprenoides y/o precursores de isoprenoides por células productoras de isoprenoides y/o precursores de isoprenoides que no expresan uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican péptido de fosfocetolasa y que no se han modificado genéticamente para un flujo de carbono incrementado para la producción de mevalonato.
La producción de moléculas precursoras de isoprenoides y/o isoprenoides se puede mejorar, además, mediante los métodos descritos en la presente descripción en por lo menos aproximadamente cualquiera de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 1 vez, 2 veces, 5 veces, 10 veces, 20 veces, 50 veces, 100 veces, 200 veces, 500 veces, 1000 veces, 2000 veces, 5000 veces, 10,000 veces, 20,000 veces, 50,000 veces, 100,000 veces, 200,000 veces, 500,000 veces o 1,000,000 veces en comparación con la producción de moléculas precursoras de isoprenoides y/o isoprenoides por células productoras de precursores de isoprenoides y/o isoprenoides sin la expresión de uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican un polipéptido de fosfocetolasas . En ciertas modalidades descritas en la presente descripción, los métodos comprenden células hospederas recombinantes que se han modificado genéticamente aún más para un flujo de carbono incrementado para la producción de MVA para proporcionar una producción mejorada de isoprenoides y/o precursores de isoprenoides en comparación con la producción de isoprenoides y/o precursores de isoprenoides por células productoras de isoprenoides y/o precursores de isoprenoides que no expresan uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican péptido de fosfocetolasa y que no se han modificado genéticamente para un flujo de carbono incrementado para la producción de mevalonato.
Adicionalmente, se puede usar condiciones de cultivo celular más específicas para cultivar las células en los métodos descritos en la presente descripción. Por ejemplo, en algunos aspectos, el método para la producción de moléculas precursoras de isoprenoides y/o isoprenoides comprende las etapas de (a) cultivar células recombinantes (que incluyen, pero no se limitan a, células de E. coli) que comprenden un ácido nucleico heterólogo que codifica un polipéptido de fosfocetolasas y que no tienen de manera endógena un gen de mvaE y un gen de mvaS a partir de L. grayi, E. faecium, E. gallinarum, E. casseliflavus y/o E. faecalis en medio mínimo a 34 °C, en donde las células recombinantes expresan de manera heteróloga una o más copias de un gen que codifica un polipéptido de fosfocetolasas a partir de Clostridium acetobutylicum, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus paraplantarum, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium animalis, Bifidobacterium breve, Enterococcus gallinarum, Gardnerella vaginalis, Ferrimonas baleárica, Mucilaginibacter paludis, Nostoc punctiforme, Nostoc punctiforme PCC 73102, Pantoea, Pedobactor saltans, Rahnella aquatilis, Rhodopseudomonas palustris, Streptomyces griseus, Streptomyces avermitilis, Nocardiopsis dassonvillei y/o Thermobifida fusca en un plásmido de copia baja a media y bajo el control de un promotor fuerte; y (b) producir moléculas precursoras de isoprenoides y/o isoprenoides . En algunos aspectos, los métodos comprenden, además, una etapa de recuperar las moléculas precursoras de isoprenoides y/o isoprenoides. En algunos aspectos, en donde las células recombinantes expresan de manera heteróloga una o más copias de un gen que codifica un polipéptido de fosfocetolasas a partir de Clostridium acetobutylicum, Bifidobacterium longum y/o Enterococcus gallinarum.
Vectores Se puede usar los vectores adecuados para cualquiera de las composiciones y métodos descritos en la presente descripción. Por ejemplo, se puede usar los vectores adecuados para optimizar la expresión de una o más copias de un gen que codifica una fosfocetolasa, un polipéptido de la ruta superior del MVA que incluyen, pero no se limitan a, un polipéptido de mvaE y uno de mvaS, un polipéptido de la ruta inferior del MVA, una isopreno sintasa o una poliprenil pirofosfato sintasa en una célula hospedera particular (por ejemplo, E. coli) . En algunos aspectos, el vector contiene un marcador selectivo. Los ejemplos de marcadores seleccionables incluyen, pero no se limitan a, ácidos nucleicos con resistencia a antibióticos (por ejemplo, canamicina, ampicilina, carbenicilina, gentamicina, higromicina, fleomicina, bleomicina, neomicina o cloranfenicol) y/o ácidos nucleicos que confieren una ventaja metabólica, tal como una ventaja nutricional sobre la célula hospedera. En algunos aspectos, una o más copias de una fosfocetolasa, un polipéptido de la ruta superior del MVA que incluyen, pero no se limitan a, un polipéptido de mvaE y un polipéptido de mvaS, un polipéptido de la ruta inferior del MVA, un ácido nucleico de mvaE y un ácido nucleico de mvaS a partir de L. grayi, E. faecium, E. gallinarum, E. casseliflavus y/o E. faecalis, una isopreno sintasa o uno o más ácidos nucleicos de poliprenil pirofosfato sintasa integrados en el genoma de células hospederas sin un marcador selectivo.
Cualquiera de los vectores caracterizados en la presente descripción o usados en los ejemplos de la presente descripción pueden usarse en la presente invención.
Métodos de transformación Los ácidos nucleicos que codifican una o más copias de una fosfocetolasa, un polipéptido de la ruta superior del MVA que incluyen, pero no se limitan a, un polipéptido de mvaE y un polipéptido de mvaS, un polipéptido de la ruta inferior del MVA y/o polipéptidos de la ruta inferior del MVA se pueden insertar en una célula con el uso de las técnicas adecuadas. Adicionalmente, los ácidos nucleicos de isopreno sintasa, de IDI , de la ruta de DXP y/o de poliprenil pirofosfato sintasa o vectores que los contienen se pueden insertar en una célula hospedera (por ejemplo, una célula vegetal, una célula de hongos, una célula de levadura o una célula bacteriana, que se describe en la presente descripción) con el uso de técnicas convencionales para introducir un constructo de ADN o vector en una célula hospedera, tal como transformación, electroporación, microinyección nuclear, transducción, transfección (por ejemplo, transfección mediada por electroporación o por DEAE-dextrina o transfección con el uso de un virus fago recombinante) , incubación con precipitado de ADN de fosfato cálcico, bombardeo de velocidad alta con microproyectiles recubiertos con ADN y fusión de protoplastos . Las técnicas generales de transformación son conocidas en la técnica {ver, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel et al. (eds.) capítulo 9, 1987; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2.° ed. , Cold Spring Harbor, 1989; y Campbell et al., Curr. Genet . 16:53-56, 1989) . Los ácidos nucleicos introducidos se pueden integrar en el ADN cromosómico o se pueden mantener como secuencias de réplica extracromosómica . Los transformantes se pueden seleccionar mediante cualquier método conocido en la técnica. Los métodos adecuados para seleccionar transformantes se describen en la publicación internacional núm. WO 2009/076676, la publicación de patente de los Estados Unidos núm. 2009/0203102, patente núm. WO 2010/003007, publicación de patente de los Estados Unidos núm. 2010/0048964, patente núm. WO 2009/132220 y publicación de patente de los Estados Unidos núm. 2010/0003716.
Células hospederas ilustrativas Un experto en la técnica reconocerá que los vectores de expresión están diseñados para contener ciertos componentes que optimizan la expresión génica para ciertas cepas huésped. Tales componentes de optimización incluyen, pero no se limitan a, origen de replicación, promotores y potenciadores . Los vectores y componentes mencionados en la presente descripción se describen para fines ilustrativos y no pretenden limitar el alcance de la presente invención.
Cualquier célula o progenie de esta que puede usarse para expresar de manera heteróloga genes puede usarse para expresar una o más fosfocetolasas aisladas de Lactobacillus reuteri, Bifidobacterium longum, Ferrimonas baleárica, Pedobactor saltans, Streptomyces griseus y/o Nocardiopsis dassonvillei junto con uno o más ácidos nucleicos heterologos que expresan uno o más péptidos de la ruta del MVA, polipéptidos de isopreno sintasa, de IDI, de la ruta de DXP, y/o polipéptidos de poliprenil pirofosfato sintasa. En algunas modalidades, la célula hospedera es una bacteria gram positiva. Los ejemplos no limitantes incluyen cepas de Streptomyces (por ejemplo, S. lividans, S. coelicolor o S. griseus) , Bacillus, Listeria (por ejemplo, L. monocytogenes) o Lactobacillus (por ejemplo, L. spp) . En algunas modalidades, el organismo de recurso es una bacteria gram negativa, tal como E. coli, Pseudomonas sp o H. pylori .
Se puede usar células bacterianas, que incluyen bacterias gram positivas o gram negativas, para expresar cualquiera de los genes heterologos descritos anteriormente. Particularmente, los genes mvaE y mvaS se pueden expresar en cualquiera de las células de P. citrea, B. subtilis, B. licheniformis, B. lentus, B. brevis, B. stearothermophilus, B . alkalophilus, B. amyloliquefaciens, B. clausii, B. halodurans, B. megaterium, B. coagulans, B. circulans, B. lautus, B. thuringiensis, S. albus, S. lividans, S. coelicolor, S. griseus, Pseudomonas sp. y P. alcaligenes .
Hay muchos tipos de células anaerobias que pueden usarse como células hospederas en las composiciones y métodos de la presente invención. En un aspecto de la presente invención, las células descritas en cualquiera de las composiciones o métodos descritos en la presente descripción son células anaerobias obligadas y progenie de estas. Típicamente, los microorganismos anaerobios obligados no crecen bien, si llegan a crecer, en condiciones con oxígeno presente. Se debe comprender que una pequeña cantidad de oxígeno puede estar presente, es decir, que los microorganismos anaerobios obligados tienen cierto nivel de tolerancia para un nivel bajo de oxígeno. En un aspecto, los microorganismos anaerobios obligados modificados genéticamente para producir mevalonato, precursores de isoprenoides, isopreno e isoprenoides pueden funcionar como células hospederas para cualquiera de los métodos y/o composiciones que se describen en la presente descripción y se cultivan en condiciones sustancialmente libres de oxígeno, en donde la cantidad de oxígeno presente no es nociva para el crecimiento, mantenimiento y/o fermentación de los microorganismos anaerobios .
En otro aspecto de la presente invención, las células hospederas descritas y/o usadas en cualquiera de las composiciones o métodos descritos en la presente descripción son células anaerobias facultativas y progenie de estas. Los microorganismos anaerobios facultativos pueden generar ATP celular por respiración aerobia (por ejemplo, con el uso del ciclo del ATC) si hay oxígeno presente. Sin embargo, los microorganismos anaerobios facultativos pueden crecer, además, en ausencia de oxígeno. Esto es en contraste con los microorganismos anaerobios obligados que mueren o crecen deficientemente en presencia de cantidades mayores de oxígeno. Por lo tanto, en un aspecto, los microorganismos anaerobios facultativos pueden funcionar como células hospederas para cualquiera de las composiciones y/o métodos que se proporcionan en la presente descripción y pueden modificarse genéticamente para producir mevalonato, precursores de isoprenoides , isopreno e isoprenoides . Las células hospederas anaerobias facultativas se pueden cultivar en condiciones sustancialmente libres de oxígeno, en donde la cantidad de oxígeno presente no es nociva para el crecimiento, mantenimiento y/o fermentación de los microorganismos anaerobios o se pueden cultivar, alternativamente, en presencia de cantidades mayores de oxígeno .
La célula hospedera puede ser, además, una célula fúngica filamentosa y progenie de esta. (Ver, por ejemplo, Berka & Barnett, Biotechnology Advances, (1989), 7(2):127- 154) . En algunos aspectos, la célula fúngica filamentosa puede ser cualquiera de Trichoderma longibrachiatum, T. viride, T. koningii, T. harzianum, Penicillium sp., Humicola insolens, H. lanuginose, H. grísea, Chrysosporium sp., C. lucknowense, Gliocladium sp., Aspergillus sp. , tal como A. oryzae, A. niger, A sojae, A. japonicus, A. nidulans o A. awamori, Fusarium sp. , tal como F. roseum, F. graminum F. cerealis, F. oxysporuim o F. venenatum, Neurospora sp. , tal como N. crassa, Hypocrea sp., Mucor sp . , tal como M. miehei, Rhizopus sp. o Emericella sp. En algunos aspectos, el hongo es A. nidulans, A. awamori, A. oryzae, A. aculeatus, A. niger, A. japonicus, T. reesei, T. viride, F. oxysporum o F. solani . En ciertas modalidades, los plásmidos o componentes de plásmidos para usar en la presente descripción incluyen los descritos en la publicación de patente de los Estados Unidos núm. US 2011/0045563.
La célula hospedera puede ser, además, una levadura, tal como Saccharomyces sp., Schizosaccharomyces sp., Pichia sp. o Candida sp. En algunos aspectos, la especie Saccharomyces es Saccharomyces cerevisiae (ver, por ejemplo, Romanos et al., Yeast, (1992), 8 (6 ) : 423 -488) . En ciertas modalidades, los plásmidos o componentes de plásmidos para usar en la presente descripción incluyen los descritos en la patente de los Estados Unidos núm. 7,659,097 y la publicación de patente de los Estados Unidos núm. US 2011/0045563.
La célula hospedera puede ser, además, una especie de algas, tal como algas verdes, algas rojas, glaucofitas, cloraracniofitas, euglénidos, cromistas o dinoflagelados . (Ver, por ejemplo, Saunders & Warmbrodt, "Gene Expression in Algae and Fungí, Including Yeast" , (1993), National Agricultural Library, Beltsville, MD) . En ciertas modalidades, los plásmidos o componentes de plásmidos para usar en la presente descripción incluyen los descritos en la publicación de patente de los Estados Unidos núm. US 2011/0045563. En algunos aspectos, la célula hospedera es una cianobacteria, tal como cianobacteria clasificada en cualquiera de los siguientes grupos en base a la morfología: Chlorococcales, Pleurocapsales, Oscillatoríales, Nostocales o Stigonematales (ver, por ejemplo, Lindberg et al., Metab. Eng., (2010) 12 (1) : 70-79) . En ciertas modalidades, los plásmidos o componentes de plásmidos para usar en la presente descripción incluyen los descritos en la publicación de patente de los Estados Unidos núm. US 2010/0297749; patente de los Estados Unidos núm. 2009/0282545 y solicitud de la patente internacional núm. WO 2011/034863.
Las células hospederas de E. coli pueden usarse para expresar una o más enzimas de fosfocetolasa a partir de Clostridium acetobutylicum, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus paraplantarum, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium animalis, Bifidobacterium breve, Enterococcus gallinarum, Gardnerella vaginalis, Ferrimonas baleárica, Mucilaginibacter paludis, Nostoc punctiforme, Nostoc punctiforme PCC 73102, Pantoea, Pedobactor saltans, Rahnella aquatilis, Rhodopseudomonas palustris, Streptomyces griseus, Streptomyces avermitilis, Nocardiopsis dassonvillei y/o Thermobifida fusca junto con uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican uno o más polipéptidos de la ruta del MVA, polipéptidos de isopreno sintasa, IDI, de la ruta de DXP y/o polipéptidos de poliprenil pirofosfato sintasa. En un aspecto, la célula hospedera es una célula recombinante de una cepa de Escherichia coli (E. coli) o progenie de esta, con la capacidad de producir mevalonato que expresa uno o más ácidos nucleicos que codifican fosfocetolasa a partir de Clostridium acetobutylicum, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus plantaru , Lactobacillus paraplantarum, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium animalis, Bifidobacterium breve, Enterococcus gallinarum, Gardnerella vaginalis, Ferrimonas baleárica, Mucilaginibacter paludis, Nostoc punctiforme, Nostoc punctiforme PCC 73102, Pantoea, Pedobactor saltans, Rahnella aquatilis, Rhodopseudomonas palustris, Streptomyces griseus, Streptomyces avermitilis, Nocardiopsis dassonvillei y/o Thermobifida fusca junto con uno o más ácidos nucleicos heterólogos que expresan uno o más péptidos de la ruta del MVA. Las células hospederas de E. coli pueden producir mevalonato en cantidades, títulos pico y productividades de células mayores que las de las mismas células que carecen de uno o más ácidos nucleicos que se expresan de manera heteróloga que codifican polipéptidos de fosfocetolasa a partir de Clostridium acetobutylicum, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus paraplantarum, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium animalis, Bifidobacterium breve, Enterococcus gallinarum, Gardnerella vaginalis, Ferrimonas baleárica, Mucilaginibacter paludis, Nostoc punctiforme, Nostoc punctiforme PCC 73102, Pantoea, Pedobactor saltans, Rahnella aquatilis, Rhodopseudomonas palustris, Streptomyces griseus, Streptomyces avermitilis, Nocardiopsis dassonvillei y/o Thermobifida fusca junto con uno o más ácidos nucleicos heterologos que expresan uno o más péptidos de la ruta del MVA. Adicionalmente, el o los ácidos nucleicos que se expresan de manera heteróloga que codifican polipéptido de fosfocetolasas a partir de Clostridium acetobutylicum, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus paraplantarum, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium animalis, Bifidobacterium breve, Enterococcus gallinarum, Gardnerella vaginalis, Ferrimonas baleárica, Mucilaginibacter paludis, Nostoc punctiforme, Nostoc punctiforme PCC 73102, Pantoea, Pedobactor saltans, Rahnella aquatilis, Rhodopseudomonas palustris, Streptomyces griseus, Streptomyces avermitilis, Nocardiopsis dassonvillei y/o Thermobifida fusca junto con uno o más ácidos nucleicos heterólogos que expresan uno o más péptidos de la ruta del MVA en E. coli pueden ser copias cromosómicas (por ejemplo, integradas en el cromosoma de E. coli) . En otros aspectos, las células de E. coli están en cultivo. En algunos aspectos, la enzima o enzimas de fosfocetolasa son de Clostridium acetobutylicum, Bifidobacterium longum y/o Enterococcus gallinaru . En cualquier aspecto, la enzima o enzimas de fosfocetolasa son cualquiera de las enzimas de fosfocetolasa como se describe en la presente descripción.
Modificaciones de células hospederas ilustrativas Ruta de citrato sintasa La citrato sintasa cataliza la condensación de oxaloacetato y acetil-CoA para formar citrato, un metabolito del ciclo de ácido tricarboxílico (TCA) (Ner, S. et al . 1983. Biochemistry, 22: 5243-5249; Bhayana, V. and Duckworth, H. 1984. Biochemistry 23: 2900-2905). En E. coli, esta enzima, codificada por gltA, funciona como un trímero de subunidades diméricas. La forma hexamérica permite la regulación alostérica de la enzima por medio de NADH. Esta enzima se ha estudiado ampliamente ( iegand, G. , and Remington, S. 1986. Annual Rev. Biophysics Biophys . Chem. 15: 97-117; Duckworth et al. 1987. Biochem Soc Symp. 54:83-92; Stockell, D. et al. 2003. J. Biol. Chem. 278: 35435-43; Maurus, R. et al. 2003.
Biochemistry. 42:5555-5565). Para evitar la inhibición alostérica por medio de NADH, se ha considerado el reemplazo por o la suplementación con citrato sintasa insensible a NADH de Bacillus subtílis (Underwood et al. 2002. Appl . Environ. Microbiol. 68:1071-1081; Sánchez et al. 2005. Met . Eng. 7 :229-239) .
La reacción catalizada por citrato sintasa compite directamente con la tiolasa que cataliza la primera etapa de la ruta del mevalonato, porque ambas tienen acetil-CoA como sustrato (Hedí et al. 2002. J. Bact . 184:2116-2122). Por lo tanto, un experto en la técnica puede modular la expresión de la citrato sintasa (por ejemplo, reducir la actividad enzimática) para permitir más carbono para el flujo en la ruta del mevalonato, para incrementar la producción final de mevalonato, isopreno e isoprenoides . La reducción de la actividad de la citrato sintasa puede ser cualquier cantidad de reducción de actividad específica o actividad total en comparación con cuando no se realiza ninguna manipulación. En algunos casos, el reducción de actividad enzimática se disminuye en por lo menos aproximadamente 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8% 9% 10% , 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% . En algunos aspectos , la actividad de citrato sintasa se modula al reducir la actividad de un gen endógeno de citrato sintasa. Esto se puede lograr por reemplazo cromosómico de un gen endógeno de citrato sintasa con un transgén que codifica una citrato sintasa no sensible a NADH o con el uso de un transgén que codifica una citrato sintasa no sensible a NADH que se deriva de Bacillus subtilis . Además, la actividad de citrato sintasa se puede modular (por ejemplo, reducir) al reemplazar el promotor del gen endógeno de citrato sintasa con un promotor sintético de expresión constitutivamente baja. Además, el gen que codifica citrato sintasa se puede eliminar. La reducción de la actividad de citrato sintasa puede producir más flujo de carbono en la ruta biosintética dependiente de mevalonato en comparación con células que no tienen expresión reducida de citrato sintasa. En cualquier aspecto de la presente invención, la presente invención proporciona células recombinantes que comprenden uno o más ácidos nucleicos que se expresan de manera heteróloga que codifican polipéptidos de fosfocetolasa como se describe en la presente descripción y modificados genéticamente aún más para reducir la actividad de citrato sintasa (gltA) . La modulación (por ejemplo, reducción) de la actividad de isozimas de citrato sintasa se contempla, además, en la presente descripción. En cualquier aspecto de la presente invención, la presente invención proporciona células recombinantes que comprenden uno o más ácidos nucleicos que se expresan de manera heteróloga que codifican polipéptidos de fosfocetolasa como se describe en la presente descripción y que se modifican genéticamente aún más para reducir la actividad de una isozima de citrato sintasa.
Rutas que incluyen fosfotransacetilasa y/o acetato cinasa La fosfotransacetilasa ( (codificada en E. coli por (i) pta (Shimizu et al. 1969. Biochim. Biophys. Acta 191: 550-558 o (ii) eutD (Bologna et al. 2010. J of Microbiology. 48:629-636) cataliza la conversión reversible entre acetil-CoA y acetil fosfato (acetil-P) , mientras que la acetato cinasa (codificada en E. coli por ackA) (Kakuda, H. et al. 1994. J. Biochem. 11:916-922) usa acetil-P para formar acetato. Estos genes se pueden transcribir como un operón en E. coli. Juntos, catalizan la desasimilación de acetato con la liberación de ATP. Por lo tanto, es posible incrementar la cantidad de acetil-P que va hacia acetil-CoA al mejorar la actividad de fosfotransacetilasa . En ciertas modalidades, la mejora se logra al colocar una corriente arriba del promotor con regulación a la alta del gen en el cromosoma o al colocar una copia del gen detrás de un promotor adecuado sobre un plásmido. Para reducir la cantidad de acetil-coA que va hacia acetato, la actividad del gen de acetato cinasa (por ejemplo, el gen endógeno de acetato cinasa) se puede reducir o atenuar. En ciertas modalidades, la atenuación se logra al eliminar la acetato cinasa (ackA) . Esto se logra al reemplazar el gen con un cásete de cloranfenicol seguido por bucles fuera del cásete. En algunos aspectos, la actividad de acetato cinasa se modula al reducir la actividad de una acetato cinasa endógena. Esto se puede lograr al reemplazar el promotor del gen endógeno de acetato cinasa con un promotor sintético de expresión constitutivamente baja. En ciertas modalidades, la atenuación del gen de acetato cinasa se debería llevar a cabo al interrumpir la expresión del gen de fosfotransacetilasa (pta) . El acetato se produce por E. coli por una gran variedad de razones (Wolfe, A. 2005. Microb. Mol. Biol. Rev. 69:12-50). Sin limitaciones teóricas, la eliminación de ackA podría producir un carbono reducido que se desvía hacia la producción de acetato (debidoa a que ackA usa acetil-CoA) y, por lo tanto, incrementar el rendimiento de mevalonato, precursores de isoprenoides, isopreno y/o isoprenoides.
En algunos aspectos, las células recombinantes descritas en la presente descripción producen cantidades reducidas de acetato en comparación con células que no tienen expresión atenuada del gen endógeno de acetato cinasa o fosfotransacetilasa mejorada. La reducción en la cantidad de acetato producida se puede determinar por ensayos de rutina conocidos para un experto en la técnica. La cantidad de reducción de acetato es por lo menos aproximadamente 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% en comparación con cuando no se realiza ninguna manipulación molecular en la expresión del gen endógeno de acetato cinasa o en la expresión del gen de fosfotransacetilasa .
La actividad de fosfotransacetilasa (pta y/o eutD) se puede incrementar por medio de otras manipulaciones moleculares de las enzimas. El incremento en la actividad enzimática puede ser un incremento en cualquier cantidad de la actividad específica o la actividad total en comparación con cuando no se realiza ninguna manipulación. En algunos casos, el incremento de actividad enzimática se incrementa en por lo menos aproximadamente 1%, 2% 3% 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99%.
En una modalidad, la actividad de pta se incrementa al alterar el promotor y/o rbs en el cromosoma o al expresarlo desde un plásmido. En cualquier aspecto de la presente invención, la presente invención proporciona células recombinantes que comprenden uno o más ácidos nucleicos que se expresan de manera heteróloga que codifican polipéptidos de fosfocetolasa como se describe en la presente descripción y que se modifican genéticamente aún más para incrementar la actividad de fosfotransacetilasa (pta y/o eutD) . La modulación (por ejemplo, el incremento) de la actividad de isozimas de fosfotransacetilasa se contempla, además, en la presente descripción. En cualquier aspecto de la presente invención, la presente invención proporciona células recombinantes que comprenden uno o más ácidos nucleicos que se expresan de manera heteróloga que codifican polipéptidos de fosfocetolasa como se describe en la presente descripción y que se modifican genéticamente aún más para incrementar la actividad de una isozima de fosfotransacetilasa (pta y/o eutD) .
La actividad de acetato cinasa (ackA) se puede reducir, además, por otras manipulaciones moleculares de las enzimas. La reducción de la actividad enzimática puede ser cualquier cantidad de reducción de actividad específica o actividad total en comparación con cuando no se realiza ninguna manipulación. En algunos casos, la actividad enzimática se disminuye en por lo menos aproximadamente 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99%. En cualquier aspecto de la presente invención, la presente invención proporciona células recombinantes que comprenden uno o más ácidos nucleicos que se expresan de manera heteróloga que codifican polipéptidos de fosfocetolasa como se describe en la presente descripción y que se modifican genéticamente aún más para reducir la actividad de acetato cinasa (ackA) . La modulación (por ejemplo, reducción) de la actividad de isozimas de acetato cinasa se contempla, además, en la presente descripción. En cualquier aspecto de la presente invención, la presente invención proporciona células recombinantes que comprenden uno o más ácidos nucleicos que se expresan de manera heteróloga que codifican polipéptidos de fosfocetolasa como se describe en la presente descripción y que se modifican genéticamente aún más para reducir la actividad de una isozima de acetato cinasa.
En algunos casos, atenuar la actividad del gen endógeno de acetato cinasa produce más flujo de carbono hacia la ruta biosintética dependiente de mevalonato en comparación con células que no tienen expresión atenuada del gen endógeno de acetato.
Rutas que incluyen lactato deshidrogenasa En E. coli, el D-lactato se produce a partir de piruvato por medio de la enzima lactato deshidrogenasa (codificada por ldhA - Figura 1) (Bunch, P. et al. 1997. Microbiol . 143:187-195) . La producción de lactato se acompaña con oxidación de NADH, por lo tanto, el lactato se produce cuando el oxígeno está limitado y no puede acomodar todos los equivalentes reductores. Por lo tanto, la producción de lactato puede ser una fuente para el consumo de carbono. Por lo tanto, para mejorar el flujo de carbono por medio de la producción de mevalonato (y la producción de isopreno, precursores de isoprenoides e isoprenoides, si se desea) , un experto en la técnica puede modular la actividad de lactato deshidrogenasa, como mediante la reducción de la actividad de la enzima.
Por lo tanto, en un aspecto, la actividad de lactato deshidrogenasa se puede modular al atenuar la actividad de un gen endógeno de lactato deshidrogenasa. Tal atenuación se puede lograr por la eliminación del gen endógeno de lactato deshidrogenasa. Se puede usar, además, otras maneras de atenuar la actividad del gen de lactato deshidrogenasa conocidas para un experto en la técnica. Al manipular la ruta que incluye lactato deshidrogenasa, la célula recombinante produce cantidades reducidas de lactato en comparación con células que no tienen expresión atenuada del gen endógeno de lactato deshidrogenasa. La reducción en la cantidad de lactato producida se puede determinar por ensayos de rutina conocidos para un experto en la técnica. La cantidad de reducción de lactato es por lo menos aproximadamente 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% en comparación con cuando no se realiza ninguna manipulación molecular.
La actividad de lactato deshidrogenasa se puede disminuir, además, por otras manipulaciones moleculares de la enzima. La reducción de la actividad enzimática puede ser cualquier cantidad de reducción de actividad especifica o actividad total en comparación con cuando no se realiza ninguna manipulación. En algunos casos, la actividad enzimática se disminuye en por lo menos aproximadamente 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99%.
Por lo tanto, en algunos casos, la atenuación de la actividad del gen endógeno de lactato deshidrogenasa produce más flujo de carbono hacia la ruta biosintética dependiente de mevalonato en comparación con células que no tienen expresión atenuada del gen endógeno de lactato deshidrogenasa .
Rutas que incluyen gliceraldehído 3 -fosfato La gliceraldehído 3 -fosfato deshidrogenasa (gapA y/o gapB) es una enzima importante de glicólisis que cataliza la conversión de gliceraldehído 3-fosfato a 1 , 3-bifosfo-D-glicerato (Branlant G. and Branlant C. 1985. Eur. J. Biochem. 150 : 61-66) .
Para dirigir el carbono hacia la enzima de fosfocetolasa, la expresión de gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa se puede modular (por ejemplo, se puede disminuir la actividad enzimática) para permitir que más carbono fluya hacia el fructosa 6-fosfato y el xilulosa 5-fosfato, para incrementar la producción final de mevalonato, isopreno e isoprenoides . La reducción de la actividad de la gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa puede ser cualquier cantidad de reducción de actividad específica o actividad total en comparación con cuando no se realiza ninguna manipulación. En algunos casos, la disminución de la actividad enzimática se disminuye en por lo menos aproximadamente 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100%. En algunos aspectos, la actividad de gliceraldehído 3 -fosfato deshidrogenasa se modula al reducir la actividad de una gliceraldehído 3 -fosfato deshidrogenasa endógena. Esto se puede lograr al reemplazar el promotor del gen endógeno de gliceraldehído 3 -fosfato deshidrogenasa con un promotor sintético de expresión constitutivamente baja. Además, se puede eliminar el gen que codifica gliceraldehído 3 -fosfato deshidrogenasa. El gen que codifica gliceraldehído 3 -fosfato deshidrogenasa se puede reemplazar, además, por una enzima Bacillus que cataliza la misma reacción pero produce NADPH en vez de NADH. La reducción de la actividad de gliceraldehído 3 -fosfato deshidrogenasa puede producir más flujo de carbono hacia la ruta biosintética dependiente de mevalonato en comparación con células que no tienen expresión reducida de gliceraldehído 3 -fosfato deshidrogenasa. En cualquier aspecto de la presente invención, la presente invención proporciona células recombinantes que comprenden uno o más ácidos nucleicos que se expresan de manera heteróloga que codifican polipéptidos de fosfocetolasa como se describe en la presente descripción y que se modifican genéticamente aún más para reducir la actividad de gliceraldehído 3 -fosfato deshidrogenasa (gapA y/o gapB) . En la presente descripción se contempla, además, la modulación (por ejemplo, reducción) de la actividad de isozimas de gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa. En cualquier aspecto de la presente invención, la presente invención proporciona células recombinantes que comprenden uno o más ácidos nucleicos que se expresan de manera heteróloga que codifican polipéptidos de fosfocetolasa como se describe en la presente descripción y que se modifican genéticamente aún más para reducir la actividad de una isozima de gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa {gapA y/o gapB) .
Rutas que incluyen la ruta de Entner-Doudoroff La ruta de Entner-Doudoroff (ED) es una alternativa para la ruta de Emden-Meyerhoff-Parnass (EMP -glicólisis) . Algunos organismos, como E. coli, contienen tanto la ruta de ED como la de EMP, mientras que otros tienen únicamente una o la otra. El Bacillus subtilis tiene únicamente la ruta de EMP, mientras que el Zymomonas mobilis tiene únicamente la ruta de ED (Peekhaus and Conway. 1998. J. Bact . 180:3495-3502; Stulke and Hillen. 2000. Annu. Rev. Microbiol . 54, 849-880; Dawes et al. 1966. Biochem. J. 98:795-803). La fructosa bisfofato aldolasa (fba, fbaA, fbaB y/o fbaC) interactúa con la ruta de Entner-Doudoroff y cataliza de manera reversible la conversión de fructosa 1 , 6 -bisfosfato a dihidroxiacetona fosfato (DHAP) y gliceraldehído 3-fosfato (GAP) (Baldwin S.A., et. al., Biochem J. (1978) 169 (3) : 633-41) .
La fosfogluconato deshidratasa (edd) elimina una molécula de H20 de 6-fosfo-D-gluconato para formar 2-dehidro-3 -deoxi-D-gluconato 6-fosfato, mientras que la 2-ceto-3-deoxigluconato 6-fosfato aldolasa (eda) cataliza un clivaje de aldol (Egan et al. 1992. J. Bact . 174:4638-4646). Los dos genes están en un operón.
Los metabolitos que se pueden dirigir hacia la ruta de fosfocetolasa se pueden, además, desviar hacia la ruta de ED. Para evitar la pérdida de metabolitos hacia la ruta de ED, se atenúa la actividad del gen de fosfogluconato deshidratasa (por ejemplo, el gen endógeno defosfogluconato deshidratasa) y/o un gen de 2-ceto-3-deoxigluconato 6-fosfato aldolasa (por ejemplo, el gen endógeno de 2-ceto-3-deoxigluconato 6-fosfato aldolasa) . Una manera para lograr la atenuación consiste en eliminar lafosfogluconato deshidratasa (edd) y/o 2-ceto-3-deoxigluconato 6-fosfato aldolasa (eda) . Esto se puede lograr al reemplazar uno o ambos genes con un cásete de cloranfenicol o canamicina, seguido por bucles fuera del cásete. Sin estas actividades enzimáticas, más carbono puede fluir por medio de la enzima fosfocetolasa, para incrementar el rendimiento de mevalonato, isopreno o isoprenoides .
Además, la actividad de fosfogluconato deshidratasa (edd) y/o 2-ceto-3-deoxigluconato 6-fosfato aldolasa (eda) se puede reducir por medio de otras manipulaciones moleculares de las enzimas. La reducción de la actividad enzimática puede ser cualquier cantidad de reducción de actividad específica o actividad total en comparación con cuando no se realiza ninguna manipulación. En algunos casos, la reducción de la actividad enzimática se disminuye en por lo menos aproximadamente 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99%.
En algunos casos, atenuar la actividad del gen endógeno defosfogluconato deshidratasa y/o del gen endógeno de 2-ceto-3 -deoxigluconato 6-fosfato aldolasa produce más flujo de carbono hacia la ruta biosintética dependiente de mevalonato en comparación con células que no tienen atenuada la expresión del gen endógeno de fosfogluconato deshidratasa y/o del gen endógeno de acetato cinasa2-ceto-3-deoxigluconato 6-fosfato aldolasa.
Los metabolitos que se pueden dirigir hacia la ruta de fosfocetolasa se pueden, además, desviar hacia la ruta de ED o ruta de EMP. Para evitar la pérdida de metabolitos y para incrementar la concentración de fructosa-6-fosfato (F6P) , se atenúa la actividad de fructosa bisfofato aldolasa (por ejemplo, de fructosa bisfofato aldolasa endógena) . En algunos casos, atenuar la actividad del gen endógeno de fructosa bisfofato aldolasa (fba, fbaA, fbaB y/o fbaC) produce más flujo de carbono hacia la ruta biosintética dependiente de mevalonato en comparación con células que no tienen atenuada la expresión del gen endógeno de fructosa bisfofato aldolasa (fba, fbaA, fbaB y/o fbaC) . En algunos aspectos, la atenuación se logra al eliminar la fructosa bisfofato aldolasa (fba, fbaA, fbaB y/o fbaC) . La eliminación se puede lograr al reemplazar el gen con un cásete de cloranfenicol o canamicina, seguido por bucles fuera del cásete. En algunos aspectos, la actividad de fructosa bisfofato aldolasa se modula al reducir la actividad de una fructosa bisfofato aldolasa endógena. Esto se puede lograr al reemplazar el promotor del gen endógeno de fructosa bisfofato aldolasa con un promotor sintético de expresión constitutivamente baja. Sin estas actividades enzimáticas, puede fluir más carbono por medio de la enzima fosfocetolasa, para incrementar el rendimiento de mevalonato, isopreno o isoprenoides . La actividad de fructosa bisfofato aldolasa se puede reducir, además, por otras manipulaciones moleculares de la enzima. La reducción de la actividad enzimática puede ser cualquier cantidad de reducción de actividad específica o actividad total en comparación con cuando no se realiza ninguna manipulación. En algunos casos, la reducción de la actividad enzimática se disminuye en por lo menos aproximadamente 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99%. En cualquier aspecto de la presente invención, la presente invención proporciona células recombinantes que comprenden uno o más ácidos nucleicos que se expresan de manera heterologa que codifican polipéptidos de fosfocetolasa como se describe en la presente descripción y que se modifican genéticamente aún más para reducir la actividad de fructosa bisfofato aldolasa {fba, fbaA, fbaB y/o fbaC) . La presente descripción contempla, además, la modulación (por ejemplo, reducción) de la actividad de isozimas de fructosa bisfofato aldolasa. En cualquier aspecto de la presente invención, la presente invención proporciona células recombinantes que comprenden uno o más ácidos nucleicos que se expresan de manera heterologa que codifican polipéptidos de fosfocetolasa como se describe en la presente descripción y que se modifican genéticamente aún más para reducir la actividad de una isozima de fructosa bisfofato aldolasa .
Rutas que incluyen la rama oxidativa de la ruta de la pentosa fosfato El E. coli usa la ruta de la pentosa fosfato para descomponer hexosas y pentosas y para proporcionar células con intermedios para diversas rutas anabólicas. Es, además, un productor principal de NADPH. La ruta de la pentosa fosfato se compone de una rama oxidativa (con enzimas como glucosa 6-fosfato 1-deshidrogenasa [zwf) , 6- fosfogluconolactonasa (pgl) o 6-fosfogluconato deshidrogenasa (gnd) ) y una rama no oxidativa (con enzimas tales como trancetolasa (tktA y/o tktB) , transaldolasa (talA o talB) , ribulosa-5-fosfato-epimerasa y (o) ribosa-5-fosfato epimerasa, ribosa-5-fosfato isomerasa (rpiA y/o rpiB) y/o ribulosa-5-fosfato 3-epimerasa (rpe) ) (Sprenger. 1995. Arch. Microbiol. 164:324-330).
Para dirigir el carbono hacia la enzima fosfocetolasa, la rama no oxidativa de la expresión de la ruta de la pentosa fosfato (trancetolasa, transaldolasa, ribulosa-5-fosfato-epimerasa y (o) ribosa-5-fosfato epimerasa, ribosa-5-fosfato isomerasa A, ribosa-5-fosfato isomerasa B y/o ribulosa-5-fosfato 3-epimerasa) se puede modular (por ejemplo, incrementa la actividad enzimática) para permitir más carbono para el flujo hacia fructosa 6-fosfato y xilulosa 5-fosfato para incrementar la producción eventual de mevalonato, isopreno e isoprenoides . El incremento de la actividad de trancetolasa, transaldolasa, ribulosa-5-fosfato-epimerasa y (o) ribosa-5-fosfato epimerasa puede ser cualquier cantidad de incremento de actividad específica o actividad total en comparación con el momento cuando no hubo manipulación. En otros casos, la actividad enzimática se incrementa en por lo menos aproximadamente 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100%.
En algunos aspectos, la actividad de trancetolasa, transaldolasa, ribulosa-5-fosfato-epimerasa y (o) ribosa-5-fosfato epimerasa se modula al incrementar la actividad de una trancetolasa, transaldolasa, ribulosa-5-fosfato-epimerasa y (o) ribosa-5-fosfato epimerasa endógena. Esto se puede lograr al reemplazar el promotor del gen de la trancetolasa, transaldolasa, ribulosa-5-fosfato-epimerasa y (o) ribosa-5-fosfato epimerasa endógena con un promotor sintético de expresión constitutivamente alta. Los genes que codifican trancetolasa, transaldolasa, ribulosa-5-fosfato-epimerasa y (o) ribosa-5-fosfato epimerasa se pueden clonar, además, en un plásmido detrás de un promotor adecuado. El incremento de la actividad de trancetolasa, transaldolasa, ribulosa-5-fosfato-epimerasa y (o) ribosa-5-fosfato epimerasa puede producir más flujo de carbono en la ruta biosintética dependiente de mevalonato en comparación con células que no tienen una expresión incrementada de trancetolasa, transaldolasa, ribulosa-5-fosfato-epimerasa y (o) ribosa-5-fosfato epimerasa.
En cualquier aspecto de la presente invención, la presente invención proporciona células recombinantes que comprenden uno o más ácidos nucleicos expresados de manera heteróloga que codifican polipéptidos de fosfocetolasa como se describe en la presente descripción y modificados genéticamente aún más para incrementar la actividad de trancetolasa (tktA y/o tktB) . En cualquier aspecto de la presente invención, la presente invención proporciona células recombinantes que comprenden uno o más ácidos nucleicos expresados de manera heterologa que codifican polipéptidos de fosfocetolasa como se describe en la presente descripción y modificados genéticamente aún más para reducir la actividad de trancetolasa (tktA y/o tktB) . En cualquier aspecto de la presente invención, la presente invención proporciona células recombinantes que comprenden uno o más ácidos nucleicos expresados de manera heterologa que codifican polipéptidos de fosfocetolasa como se describe en la presente descripción y modificados genéticamente aún más para incrementar la actividad de transaldolasa (talA o talB) . En cualquier aspecto de la presente invención, la presente invención proporciona células recombinantes que comprenden uno o más ácidos nucleicos expresados de manera heterologa que codifican polipéptidos de fosfocetolasa como se describe en la presente descripción y modificados genéticamente aún más para incrementar la actividad de ribosa-5-fosfato isomerasa (rpiA y/o rpiB) . En cualquier aspecto de la presente invención, la presente invención proporciona células recombinantes que comprenden uno o más ácidos nucleicos expresados de manera heterologa que codifican polipéptidos de fosfocetolasa como se describe en la presente descripción y modificados genéticamente aún más para incrementar la actividad de ribulosa-5-fosfato 3-epimerasa (rpe) . La presente invención contempla, además, la modulación (por ejemplo, reducción o aumento) de la actividad de isozimas de glucosa 6-fosfato 1-deshidrogenasa {zwf) , 6-fosfogluconolactonasa (pgl) , 6-fosfogluconato deshidrogenasa (gnd) , trancetolasa (tktA y/o tktB) , transaldolasa (talA o talB) , ribulosa-5-fosfato-epimerasa, ribosa-5-fosfato epimerasa, ribosa-5-fosfato isomerasa (rpiA y/o rpiB) y/o ribulosa-5-fosfato 3-epimerasa (rpe) . En cualquier aspecto de la presente invención, la presente invención proporciona células recombinantes que comprenden uno o más ácidos nucleicos expresados de manera heteróloga que codifican polipéptidos de fosfocetolasa como se describe en la presente descripción y modificados genéticamente aún más para incrementar la actividad de una isozima de glucosa 6-fosfato 1-deshidrogenasa (zwf) . En cualquier aspecto de la presente invención, la presente invención proporciona células recombinantes que comprenden uno o más ácidos nucleicos expresados de manera heteróloga que codifican polipéptidos de fosfocetolasa como se describe en la presente descripción y modificados genéticamente aún más para incrementar la actividad de una isozima de trancetolasa (tktA y/o tktB) . En cualquier aspecto de la presente invención, la presente invención proporciona células recombinantes que comprenden uno o más ácidos nucleicos expresados de manera heteróloga que codifican polipéptidos de fosfocetolasa como se describe en la presente descripción y modificados genéticamente aún más para reducir la actividad de una isozima trancetolasa ( tktA y/o tktB) . En cualquier aspecto de la presente invención, la presente invención proporciona células recombinantes que comprenden uno o más ácidos nucleicos expresados de manera heterologa que codifican polipéptidos de fosfocetolasa como se describe en la presente descripción y modificados genéticamente aún más para incrementar la actividad de una isozima transaldolasa ( talA o talB) . En cualquier aspecto de la presente invención, la presente invención proporciona células recombinantes que comprenden uno o más ácidos nucleicos expresados de manera heterologa que codifican polipéptidos de fosfocetolasa como se describe en la presente descripción y modificados genéticamente aún más para incrementar la actividad de una isozima ribosa-5-fosfato isomerasa (rpiA y/o rpiB) . En cualquier aspecto de la presente invención, la presente invención proporciona células recombinantes que comprenden uno o más ácidos nucleicos expresados de manera heterologa que codifican polipéptidos de fosfocetolasa como se describe en la presente descripción y modificados genéticamente aún más para incrementar la actividad de una isozima ribulosa-5-fosfato 3-epimerasa (rpe) .
Para dirigir carbono hacia la enzima fosfocetolasa, se puede modular la glucosa 6-fosfato l-deshidrogenasa (por ejemplo, reducir la actividad enzimática) . En algunos aspectos, la actividad de glucosa 6-fosfato l-deshidrogenasa {zwf) (por ejemplo, el gen endógeno de glucosa 6-fosfato 1-deshidrogenasa) se puede reducir o atenuar. En ciertas modalidades, la atenuación se logra al eliminar glucosa 6-fosfato l-deshidrogenasa. En algunos aspectos, la actividad de glucosa 6-fosfato l-deshidrogenasa se modula al reducir la actividad de una glucosa 6-fosfato l-deshidrogenasa endógena. Esto se puede lograr al reemplazar el promotor del gen endógeno de glucosa 6-fosfato l-deshidrogenasa con un promotor sintético de expresión constitutivamente baja. En cualquier aspecto de la presente invención, la presente invención proporciona células recombinantes que comprenden uno o más ácidos nucleicos expresados de manera heteróloga que codifican polipéptidos de fosfocetolasa como se describe en la presente descripción y modificados genéticamente aún más para reducir la actividad de glucosa 6-fosfato 1-deshidrogenasa (zwf) . En la presente invención se contempla, además, la modulación (por ejemplo, reducción) de la actividad de isozimas glucosa 6-fosfato l-deshidrogenasa. En cualquier aspecto de la presente invención, la presente invención proporciona células recombinantes que comprenden uno o más ácidos nucleicos expresados de manera heteróloga que codifican polipéptidos de fosfocetolasa como se describe en la presente descripción y modificados genéticamente aún más para reducir la actividad de una isozima de glucosa 6-fosfato l-deshidrogenasa .
Rutas que incluyen fosfofructocinasa La fosfofructocinasa es una enzima de glicólisis importante, la cual cataliza la fosforilación de fructosa 6-fosfato. E. coli tiene dos isozimas codificadas por pfkA y pfkB. La mayor parte de la actividad de fosfofructocinasa en la célula se debe a pfkA (Kotlarz et al. 1975 Biochim. Biophys. Acta 381:257-268) .
Para dirigir carbono hacia la enzima fosfocetolasa, la expresión de fosfofructocinasa se puede modular (por ejemplo, reducir la actividad enzimática) para permitir que más carbono fluya hacia el fructosa 6-fosfato y xilulosa 5-fosfato, para incrementar la producción final de mevalonato, isopreno e isoprenoides . La reducción de la actividad de fosfofructocinasa puede ser cualquier cantidad de reducción de actividad específica o actividad total en comparación con cuando no se realiza ninguna manipulación. En otros casos, la reducción de la actividad enzimática se reduce en por lo menos aproximadamente 1% 2% 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8% 9% 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 35%, 40% , 45% , 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100%.
En algunos aspectos, la actividad de fosfofructocinasa se modula al reducir la actividad de una fosfofructocinasa endógena. Esto se puede lograr al reemplazar el promotor del gen endógeno de fosfof uctocinasa con un promotor sintético de expresión constitutivamente baja. Además, el gen que codifica fosfofructocinasa se puede eliminar. La reducción de la actividad de fosfofructocinasa puede producir más flujo de carbono en la ruta biosintética dependiente de mevalonato en comparación con células que no tienen expresión reducida de osfofructocinasa .
En cualquier aspecto de la presente invención, la presente invención proporciona células recombinantes que comprenden uno o más ácidos nucleicos expresados de manera heteróloga que codifican polipéptidos de fosfocetolasa, como se describe en la presente descripción, y modificados genéticamente aún más para reducir la actividad de fructosa 6-fosfato (pfkA y/o pfkB) . La presente descripción contempla, además, la modulación (por ejemplo, reducción) de la actividad de isozimas de fructosa 6-fosfato. En cualquier aspecto de la presente invención, la presente invención proporciona células recombinantes que comprenden uno o más ácidos nucleicos expresados de manera heteróloga que codifican polipéptidos de fosfocetolasa como se describe en la presente descripción y modificados genéticamente aún más para reducir la actividad de una isozima de fructosa 6-fosfato.
Rutas que incluyen el complejo de piruvato deshidrogenasa El complejo de piruvato deshidrogenasa, que cataliza la descarboxilación de piruvato a acetil-CoA, se compone de las proteínas codificadas por los genes aceE, aceF y lpdA. La transcripción de esos genes se regula por diversos reguladores. Por lo tanto, un experto en la técnica puede incrementar acetil-CoA al modular la actividad del complejo de piruvato deshidrogenasa . La modulación puede ser para incrementar la actividad y/o expresión (por ejemplo, expresión constante) del complejo de piruvato deshidrogenasa. Esto se puede lograr por diversas maneras, por ejemplo, al reemplazar un promotor constitutivo fuerte, como PL.6 (aattcatataaaaaacatacagataaccatctgcggtgataaattatctctggcggtgtt gacataaataccactggcggtgatactgagcacatcagcaggacgcactgaccaccatgaa ggtg - promotor lambda, GenBank NC_001416, sec. con núm. de ident.:14), frente al operón o con el uso de uno o más promotores de expresión constitutivamente sintética.
Por lo tanto, en un aspecto, la actividad de piruvato deshidrogenasa se modula al incrementar la actividad de una o más enzimas del complejo de piruvato deshidrogenasa que consiste en (a) piruvato deshidrogenasa (El) , (b) dihidrolipoil transacetilasa y (c) dihidrolipoil deshidrogenasa. Se debe comprender que uno, dos o tres de cualquiera de los genes que codifican estas enzimas se pueden manipular para incrementar la actividad de piruvato deshidrogenasa. En otro aspecto, la actividad del complejo de piruvato deshidrogenasa se puede modular al atenuar la actividad de un represor del complejo de piruvato deshidrogenasa endógena, que se describe adicionalmente a continuación. La actividad de un represor del complejo de piruvato deshidrogenasa endógena puede atenuarse por la eliminación del gen represor del complejo de piruvato deshidrogenasa endógena.
En algunos casos, uno o más genes que codifican el complejo de piruvato deshidrogenasa son genes endógenos. Otra manera para incrementar la actividad del complejo de piruvato deshidrogenasa consiste en introducir en la célula uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican uno o más polipéptidos del grupo que consiste en (a) piruvato deshidrogenasa (El) , (b) dihidrolipoil transacetilasa y (c) dihidrolipoil deshidrogenasa.
Con el uso de cualquiera de estos métodos, las células recombinantes pueden producir cantidades incrementadas de acetil Co-A en comparación con células en donde no se modula la actividad de piruvato deshidrogenasa Modular la actividad de piruvato deshidrogenasa puede producir más flujo de carbono en la ruta biosintética dependiente de mevalonato en comparación con células que no tienen modulada la expresión de piruvato deshidrogenasa.
Rutas que incluyen el sistema de fosfotransferasa El sistema de fosfotransferasa dependiente de fosfoenolpiruvato (PTS) es un sistema multicomponente que transporta y fosforiza simultáneamente sus sustratos de carbohidrato por una membrana en un proceso dependiente de energía proporcionada por el fosfoenolpiruvato intermedio glicolítico (PEP) . Los genes que regulan el PTS se agrupan principalmente en operones . Por ejemplo, el operón PTS (ptsHIcrr) de Escherichia coli se compone de los genes ptsH, ptsl y crr que codifican tres proteínas centrales para el sistema de fosfotransferasa dependiente de fosfoenolpiruvato (PTS) , el HPr (ptsH) , la enzima I (ptsl) y las proteínas EIIIGlc (crr) . Estos tres genes se organizan en un operón complejo en donde la parte principal de expresión del gen distal, crr, se inicia desde una región promotora dentro del ptsl. Además de los genes del operón PTS, ptsG codifica el transportador específico de glucosa del sistema de fosfotransferasa, ptsG. La transcripción desde esta región promotora está bajo el control positivo de AMP cíclico (cAMP) de la proteína activadora por catabolitos (CAP) y se mejora durante el crecimiento en presencia de glucosa (un sustrato de PTS) . Además, el gen ppsA codifica para fosfoenolpiruvato sintetasa para la producción de fosfoenolpiruvato (PEP) que se requiere para la actividad del sistema de fosfotransferasa (PTS) . El flujo de carbono se dirige por la fosfoenolpiruvato sintetasa por medio de la ruta de piruvato deshidrogenasa o la ruta de PTS. Ver Postma, P.W., et al., Microbiol Rev. (1993), 57 (3) : 543-94) que se incorpora en la presente descripción como referencia en su totalidad.
En ciertas modalidades descritas en la presente descripción, la regulación a la baja (por ejemplo, atenuación) del operón PTS puede mejorar el uso de acetato por las células hospederas. La regulación a la baja de la actividad del operón PTS puede ser cualquier cantidad de reducción de actividad específica o actividad total en comparación con cuando no se realiza ninguna manipulación. En otros casos, la reducción de la actividad del complejo se reduce en por lo menos aproximadamente 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99%. En ciertas modalidades, la atenuación se logra al eliminar el operón PTS. En algunos aspectos, la actividad del sistema de PTS se modula al reducir la actividad de un operón PTS endógeno. Esto se puede lograr al reemplazar el o los promotores endógenos dentro del operón PTS con uno o más promotores sintéticos de expresión constitutivamente baja. En cualquier aspecto de la presente invención, la presente invención proporciona células recombinantes que comprenden uno o más ácidos nucleicos expresados de manera heteróloga que codifican polipéptidos de fosfocetolasa como se describe en la presente descripción y modificados genéticamente aún más para reducir la actividad del operón PTS. En cualquier aspecto de la presente invención, la presente invención proporciona células recombinantes que comprenden uno o más ácidos nucleicos expresados de manera heteróloga que codifican polipéptidos de fosfocetolasa como se describe en la presente descripción y modificados genéticamente aún más para reducir la actividad de El (pfcsT) . En cualquier aspecto de la presente invención, la presente invención proporciona células recombinantes que comprenden uno o más ácidos nucleicos expresados de manera heteróloga que codifican polipéptidos de fosfocetolasa como se describe en la presente descripción y modificados genéticamente aún más para reducir la actividad de EIICBGlc (ptsG) . En cualquier aspecto de la presente invención, la presente invención proporciona células recombinantes que comprenden uno o más ácidos nucleicos expresados de manera heteróloga que codifican polipéptidos de fosfocetolasa como se describe en la presente descripción y modificados genéticamente aún más para reducir la actividad de EIIAGlc (crr) . En cualquier aspecto de la presente invención, la presente invención proporciona células recombinantes que comprenden uno o más ácidos nucleicos expresados de manera heteróloga que codifican polipéptidos de fosfocetolasa como se describe en la presente descripción y modificados genéticamente aún más para reducir la actividad de HPr (ptsH) . Para reducir la pérdida de carbono por medio de piruvato deshidrogenasa mientras se incrementa la fuente de PEP para la captación de glucosa, se puede aumentar la actividad de fosfoenolpiruvato sintetasa {ppsA) . En cualquier aspecto de la presente invención, la presente invención proporciona células recombinantes que comprenden uno o más ácidos nucleicos expresados de manera heteróloga que codifican polipéptidos de fosfocetolasa como se describe en la presente descripción y modificados genéticamente aún más para incrementar la actividad de fosfoenolpiruvato sintetasa (ppsA) . En cualquier otro aspecto adicional de la presente invención, el PTS se regula a la baja y una ruta de transporte de glucosa se regula a la alta. Una ruta de transporte de glucosa incluye, pero no se limita a, galactosa (galP) y glucocinasa iglk) . En algunas modalidades, el operón PTS se regula a la baja, the galactose {galP) gene se regula a la alta y the glucokinase (glk) gene se regula a la alta. La presente descripción contempla, además, la modulación (por ejemplo, reducción) de la actividad de isozimas del PTS. En cualquier aspecto de la presente invención, la presente invención proporciona células recombinantes que comprenden uno o más ácidos nucleicos expresados de manera heteróloga que codifican polipéptidos de fosfocetolasa como se describe en la presente descripción y modificados genéticamente aún más para reducir la actividad de isozimas de PTS.
Rutas que incluyen el uso de xilosa En ciertas modalidades descritas en la presente descripción, se prefiere el uso de xilosa para convertir azúcar derivada de biomasa vegetal a los productos deseados, tales como mevalonato, tal como precursores de isoprenoides , isopreno y/o isoprenoides. En ciertos organismos, el uso de xilosa requiere el uso de la ruta de pentosa fosfato para la conversión a fructosa-6-fosfato para metabolismo. Los organismos se pueden modificar genéticamente para un uso mejorado de xilosa, ya sea al desactivar la represión por catabolito por glucosa o por expresión heteróloga de genes a partir del operón de xilosa que se encuentra en otros organismos. La ruta de la xilulosa se puede modificar genéticamente como se describe a continuación para mejorar la producción de mevalonato, precursores de isoprenoides, isopreno y/o isoprenoides por medio de la ruta de fosfocetolasa .
La mejora de la captación de xilosa y la conversión a xilulosa-5-fosfato seguidas por la entrada directa en la ruta de fosfocetolasa sería un beneficio. Sin limitaciones teóricas, esto permite que el flujo de carbono pase de largo la ruta de pentosa fosfato (aunque cierta parte del gliceraldehído-3-fosfato puede pasar por el ciclo en PPP según sea necesario) . Se puede usar la expresión mejorada de xiulocinasa para incrementar la producción global de xilulosa-5-fosfato . Se puede usar la optimización de la expresión y actividad de xiluocinasa para mejorar el uso de xilosa en una cepa con una ruta de fosfocetolasa . La xiulocinasa deseada puede ser ya sea la enzima de la célula hospedera endógena, o cualquier xiulocinasa heteróloga compatible con la célula hospedera. En una modalidad, otros componentes del operón de xilosa se pueden sobreexpresar para un mayor beneficio (por ejemplo, xilosa isomerasa) . En otra modalidad, otras enzimas de la ruta de xilosa (por ejemplo xilosa reductasa) pueden ser necesarias para atenuar (por ejemplo, reducir o eliminar actividad) .
Por lo tanto, las células hospederas modificadas genéticamente para tener enzimas de fosfocetolasa como se describe en la presente descripción se pueden modificar genéticamente aún más para sobreexpresar xilulosa isomerasa y/o xiulocinasa, ya sea las formas endógenas o las formas heterólogas, para mejorar el rendimiento global y la productividad de mevalonato, precursores de isoprenoides , isopreno y/o isoprenoides.
Rutas que incluyen enzimas transaldolasa y trancetolasa de la ruta de pentosa fosfato Algunos microorganismos con la capacidad de crecimiento anaerobio o heterofermentativo incorporan una ruta de fosfocetolasa en lugar de o además de una ruta glicolítica. Esta ruta depende de la actividad de la ruta de enzimas de pentosa fosfato, transaldolasa y trancetolasa. Por lo tanto, las células hospederas modificadas genéticamente para tener enzimas de fosfocetolasa como se describe en la presente descripción se pueden modificar genéticamente aún más para sobreexpresar una trancetolasa y transaldolasa, ya sea las formas endógenas o formas heterólogas, para mejorar el flujo de la ruta, reducir las concentraciones de intermedios potencialmente tóxicos, reducir la desviación de intermedios hacia rutas no productivas y mejorar el rendimiento global y la productividad de mevalonato, precursores de isoprenoides, isopreno y/o isoprenoides.
Combinaciones de mutaciones Se comprende que para cualquiera de las enzimas y/o rutas de enzimas descritas en la presente descripción, las manipulaciones moleculares que modulan cualquier combinación (dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece o catorce) de las enzimas y/o rutas de enzimas descritas en la presente descripción se contemplan expresamente. Para hacer más fácil la enumeración de las combinaciones, citrato sintasa (gltA) se denomina A, fosfotransacetilasa (pta) se denomina B, acetato cinasa (ackA) se denomina C, lactato deshidrogenasa (ldhA) se denomina D, gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (gap) se denomina E, y piruvato descarboxilasa (aceE, aceF y/o lpdA) se denomina F, fosfogluconato deshidratasa (edd) se denomina G, 2-ceto-3-desoxigluconato 6-fosfato aldolasa (eda) se denomina H fosfofructocinasa se denomina I, transaldolasa se denomina J, trancetolasa se denomina K, ribulosa-5-fosfato-epimerasa se denomina L, ribosa-5-fosfato epimerasa se denomina M, xilucinasa se denomina N, xilosa isomerasa se denomina O y xilitol reductasa se denomina P, ribosa-5-fosfato isomerasa (rpi) se denomina Q, D-ribulosa-5-fosfato 3-epimerasa (rpe) se denomina R, fosfoenolpiruvato sintetasa (pps) se denomina S, fructosa bisfosfato aldolasa (fba) se denomina T, El (ptsl) se denomina U, EIICBGlc (ptsG) se denomina V, EIIAGlc (crr) se denomina W, HPr (ptsH) se denomina X, galactosa (galP) se denomina Y, glucocinasa (glk) se denomina Z, glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (zwf) se denomina AA. Como se mencionó anteriormente, las enzimas aceE, aceF y/o IpdA del complejo de piruvato descarboxilasa pueden usarse individualmente o dos de tres enzimas o tres de tres enzimas para aumentar la actividad de piruvato descarboxilasa. Por lo tanto, cualquier combinación o todas las combinaciones de enzimas denominadas A-M en la presente descripción se contemplan expresamente, así como cualquier combinación y todas las combinaciones de enzimas denominadas A-AA. Además, cualquier combinación descrita anteriormente puede usarse en combinación con cualquiera de las enzimas y/o rutas de enzimas descritas en la presente descripción (por ejemplo, fosfocetolasa, polipéptidos de la ruta del MVA, isopreno sintasa, polipéptidos de la ruta de DXP) .
Otros reguladores y factores para una producción incrementada Se puede usar otras manipulaciones moleculares para incrementar el flujo de carbono hacia la producción de mevalonato. Un método consiste en reducir, disminuir o eliminar los efectos de los reguladores negativos para las rutas que alimentan la ruta del mevalonato. Por ejemplo, en algunos casos, los genes aceEF-lpdA se encuentran en un operón, con un cuarto gen corriente arriba pdhR. El gen pdhR es un regulador negativo de la transcripción de su operón. En ausencia de piruvato, se une a su promotor objetivo y reprime la transcripción. Además, regula ndh y cyoABCD de la misma manera (Ogasawara, H. et al. 2007. J. Bact. 189:5534-5541). En un aspecto, la eliminación del regulador pdhR puede mejorar el suministro de piruvato y, por lo tanto, la producción de mevalonato, precursores de isoprenoides, isopreno e isoprenoides.
En otras modalidades, cualquiera de las cepas resultantes descritas anteriormente se puede modificar genéticamente aún más para modular la actividad de la ruta de Entner-Doudoroff . El gen que codifica fosfogluconato deshidratasa o aldolasa se puede atenuar o eliminar. En otras modalidades, cualquiera de las cepas resultantes descritas anteriormente se puede, además, modificar genéticamente para reducir o eliminar la actividad de acetato cinasa o citrato sintasa. En otras modalidades, cualquiera de las cepas resultantes se puede, además, modificar genéticamente para reducir o eliminar la actividad de fosfofructocinasa . En otras modalidades, cualquiera de las cepas resultantes descritas anteriormente se puede, además, modificar genéticamente para modular la actividad de gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa . La actividad de gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa se puede modular al reducir su actividad. En otras modalidades, las enzimas de la rama no oxidativa de la ruta de pentosa fosfato, tales como trancetolasa, transaldolasa, ribulosa-5-fosfato-epimerasa y (o) ribosa-5-fosfato epimerasa, pueden sobreexpresarse .
En otros aspectos, las células hospederas se pueden modificar genéticamente aún más para incrementar las concentraciones intracelulares de acetil-fosfato al introducir ácidos nucleicos heterólogos que codifican sedoheptulosa-1, 7-bisfosfatasa/fructosa-1 , 6 -bisfosfato aldolasa y sedoheptulosa-1, 7-bisfosfatasa/fructosa-1, 6-bisfosfato fosfatasa. En ciertas modalidades, las células hospederas que tienen estas manipulaciones moleculares se pueden combinar con genes de transaldolasa (talB) y fosfofructocinasa (pfkA y/o pfkB) atenuados o eliminados para permitir una conversión más rápida de eritrosa 4-fosfato, dihidroxiacetona fosfato y gliceraldehído 3-fosfato a sedoheptulosa 7-fosfato y fructosa 1-fosfato (ver la Figura 5) .
En otros aspectos, la introducción de 6-fosfogluconolactonasa (PGL) en células (tales como diversas cepas de E. coli) que carecen de PGL puede usarse para mejorar la producción de mevalonato, precursores de isoprenoides , isopreno e isoprenoides . La PGL se puede introducir por medio de la introducción del gen codificante con el uso de integración cromosómica o vehículos extracromosómicos , tales como plásmidos .
Además de la célula hospedera (por ejemplo, célula hospedera bacteriana) , las mutaciones para modular diversas rutas enzimáticas descritas en la presente descripción que incrementan el flujo de carbono hacia la producción de mevalonato, las células hospederas descritas en la presente descripción comprenden genes que codifican polipéptido de fosfocetolasa , así como otras enzimas de la ruta superior e inferior del MVA, que incluyen, pero no se limitan a, los productos de los genes vaE y mvaS . Los ejemplos no limitantes de polipéptidos de la ruta del MVA incluyen polipéptidos de acetil-CoA acetiltransferasa (AA-CoA tiolasa) , polipéptidos de 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA sintasa (HMG-CoA sintasa) , polipéptidos de 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA reductasa (HMG-CoA reductasa) , polipéptidos de mevalonato cinasa (MVK) , polipéptidos de fosfomevalonato cinasa (PMK) , polipéptidos de difosfomevalonato decarboxilasa (MVD) , polipéptidos de fosfomevalonato decarboxilasa (P DC) , polipéptidos de isopentenil fosfato cinasa (IPK) , polipéptidos de IDI y polipéptidos (por ejemplo, polipéptidos de fusión) que tienen una actividad de dos o más polipéptidos de la ruta del MVA. Los polipéptidos de la ruta del MVA pueden incluir polipéptidos, fragmentos de polipéptidos, péptidos y polipéptidos de fusión que tienen por lo menos una actividad de un polipéptido de la ruta del MVA. Los ácidos nucleicos de la ruta del MVA ilustrativos incluyen ácidos nucleicos que codifican un polipéptido, fragmento de un polipéptido, péptido o polipéptido de fusión que tiene por lo menos una actividad de un polipéptido de la ruta del MVA. Los polipéptidos y ácidos nucleicos de la ruta del MVA ilustrativos incluyen polipéptidos y ácidos nucleicos de origen natural a partir de cualquiera de los organismos de recurso descritos en la presente descripción.
Los ejemplos no limitantes de polipéptidos de la ruta del MVA que pueden usarse se describen en la publicación de la solicitud de patente internacional núm. WO2009/076676 ; patentes núms . WO2010/003007 y WO2010/148150 Medios de cultivo celular ilustrativos Como se usa en la presente descripción, los términos "medio mínimo" y "medios mínimos" se refieren a medios de crecimiento que contienen los nutrientes mínimos posibles para el crecimiento celular, generalmente, pero no siempre, sin la presencia de uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más aminoácidos) . El medio mínimo contiene, típicamente: (1) una fuente de carbono para crecimiento bacteriano; (2) diversas sales, las cuales pueden variar entre las especies bacterianas y las condiciones de crecimiento; y (3) agua. La fuente de carbono puede variar significativamente desde azúcares simples, como glucosa, hasta hidrolisatos más complejos de otra biomasa, tales como extracto de levadura, como se describe detalladamente a continuación. Las sales proporcionan, generalmente, elementos esenciales, tales como magnesio, nitrógeno, fósforo y azufre, para permitir que las células sinteticen proteínas y ácidos nucleicos. El medio mínimo puede, además, estar suplementado con agentes selectivos, tales como antibióticos, para seleccionar para el mantenimiento de ciertos plásmidos y similares. Por ejemplo, si un microorganismo es resistente a cierto antibiótico, tal como ampicilina o tetraciclina, entonces ese antibiótico se puede agregar al medio para prevenir que las células que carecen de resistencia crezcan. El medio puede estar suplementado con otros compuestos como sea necesario para seleccionar las características fisiológicas o bioquímicas deseadas, tales como aminoácidos particulares y similares.
Se puede usar cualquier formulación de medio mínimo para cultivar las células hospederas. Las formulaciones de medio mínimo ilustrativas incluyen, por ejemplo, medio mínimo M9 y medio mínimo TM3. Cada litro de medio mínimo M9 contiene (1) 200 mi de sales M9 estériles (64 g de Na2HP04-7H20, 15 g de KH2P04, 2.5 g de NaCl y 5.0 g de NH4C1 por litro); (2) 2 mi de MgS04 1 M (estéril) ; (3) 20 mi de glucosa al 20% (w/v) (u otra fuente de carbono) ; y (4) 100 µ? de CaCl2 1 M (estéril) . Cada litro de medio mínimo TM3 contiene (1) 13.6 g de K2HP04; (2) 13.6 g de KH2P04; (3) 2 g de MgS04*7H20; (4) 2 g de monohidrato de ácido cítrico; (5) 0.3 g de citrato férrico amónico; (6) 3.2 g de (NH4)2S04; (7) 0.2 g de extracto de levadura; y (8) 1 mi de solución de oligoelementos 1000X; el pH se ajusta hasta -6.8 y la solución se esteriliza por filtro. Cada litro de oligoelementos 1000X contiene: (1) 40 g de monohidrato de ácido cítrico; (2) 30 g de MnS04*H20; (3) 10 g de NaCl; (4) 1 g de FeS04*7H20; (4)1 g de CoCl2*6H20; (5) 1 g de ZnS04*7H20; (6) 100 mg de CuS04*5H20; (7) 100 mg de H3B03; y (8) 100 mg de NaMo04*2H20; el pH se ajusta hasta -3.0.
Un medio mínimo ilustrativo adicional incluye (1) fosfato potásico K2HP04, (2) sulfato magnésico MgS04 * 7H20, (3) monohidrato de ácido cítrico C6H807*H20, (4) citrato férrico amónico NH4FeC6H507, (5) extracto de levadura (de biospringer) , (6) solución de metales traza modificada 1000X, (7) ácido sulfúrico al 50% w/v, (8) Foam Blast 882 (Emerald Performance Materials) y (9) solución de sales macro 3.36 mi. Todos los componentes se juntan y se disuelven en H20 desionizada y, después, se esterilizan con calor. Después de enfriar hasta temperatura ambiente, el pH se ajusta hasta 7.0 con hidróxido amónico (28%) y q.s. hasta volumen. La solución de vitaminas y espectinomicina se agregan después de la esterilización y del ajuste de pH.
Se puede usar cualquier fuente de carbono para cultivar las células hospederas. El término "fuente de carbono" se refiere a uno o más compuestos que contienen carbono con la capacidad de ser metabolizados por una célula u organismo huésped. Por ejemplo, el medio celular usado para cultivar las células hospederas pueden incluir cualquier fuente de carbono adecuada para mantener la viabilidad o para cultivar las células hospederas. En algunos aspectos, la fuente de carbono es un carbohidrato (tal como monosacárido, disacárido, oligosacárido o polisacáridos) o azúcar invertido (por ejemplo, jarabe de sacarosa tratado enzimáticamente) .
En algunos aspectos, la fuente de carbono incluye extracto de levadura o uno o más componentes de extracto de levadura. En algunos aspectos, la concentración de extracto de levadura es 0.1% (w/v) , 0.09% (w/v) , 0.08% (w/v) , 0.07% (w/v) , 0.06% (w/v), 0.05% (w/v), 0.04% (w/v), 0.03% (w/v), 0.02% (w/v) o 0.01% (w/v) . En algunos aspectos, la fuente de carbono incluye tanto extracto de levadura (o uno o más componentes de este) como otra fuente de carbono, tal como glucosa.
Los monosacáridos ilustrativos incluyen glucosa y fructosa; Los oligosacáridos ilustrativos incluyen lactosa y sacarosa, y los polisacáridos ilustrativos incluyen almidón y celulosa. Los carbohidratos ilustrativos incluyen azúcares C6 (por ejemplo, fructosa, mañosa, galactosa o glucosa) y azúcares C5 (por ejemplo, xilosa o arabinosa) .
En algunos aspectos, las células descritas en la presente descripción tienen la capacidad de usar gas de síntesis como fuente de energía y/o carbono. En algunas modalidades, el gas de síntesis incluye por lo menos monóxido de carbono e hidrógeno. En algunas modalidades, el gas de síntesis incluye, además, adicionalmente uno o más de dióxido de carbono, agua o nitrógeno. En algunas modalidades, la relación molar de hidrógeno y monóxido de carbono en el gas de síntesis es 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 3.0, 4.0, 5.0 o 10.0. En algunas modalidades, el gas de síntesis comprende 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 o 90% en volumen de monóxido de carbono. En algunas modalidades, el gas de síntesis comprende 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 o 90% en volumen de hidrógeno. En algunas modalidades, el gas de síntesis comprende 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 o 90% en volumen de dióxido de carbono. En algunas modalidades, el gas de síntesis comprende 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 o 90% en volumen de agua. En algunas modalidades, el gas de síntesis comprende 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 o 90% en volumen de nitrógeno .
El gas de síntesis puede derivarse de fuentes naturales o sintéticas. La fuente de donde se deriva el gas de síntesis se denomina "materia prima". En algunas modalidades, el gas de síntesis se deriva de biomasa (por ejemplo, madera, pasto varilla, desechos agrícolas, desechos municipales) o carbohidratos (por ejemplo, azúcares) . En otras modalidades, el gas de síntesis se deriva de hulla, petróleo, kerogeno, alquitrán de arenas, esquisto aceitoso o gas natural. En otras modalidades, el gas de síntesis se deriva de caucho, tal como neumáticos de cauchos.
El gas de síntesis se puede derivar de una materia prima por una gran variedad de procesos, que incluyen reformado de metano, licuefacción de hulla, coactivación, reacciones fermentativas, reacciones enzimáticas y gasificación de biomasa. La gasificación de biomasa se logra al someter biomasa a oxidación parcial en un reactor a temperaturas mayores que aproximadamente 700°C en presencia de menos de una cantidad estequiométrica de oxígeno. El oxígeno se introduce en el biorreactor en forma de aire, oxígeno puro o vapor. La gasificación puede ocurrir en tres etapas principales: 1) calentamiento inicial hasta eliminar cualquier humedad integrada en la biomasa; 2) pirólisis, en donde la biomasa se calienta hasta 300-500°C en ausencia de agentes oxidantes para producir gas, alquitranes, aceites y residuo de char sólido; y 3) gasificación de char sólido, alquitranes y gas para producir los componentes primarios de gas de síntesis. La coactivación se logra por gasificación de una mezcla de hulla/biomasa . La composición del gas de síntesis, tal como la identidad y las relaciones molares de los componentes del gas de síntesis, puede variar según la materia prima de la cual se deriva y el método por el cual la materia prima se convierte a gas de síntesis.
El gas de síntesis puede contener impurezas, cuyas naturaleza y cantidad pueden variar de conformidad con la materia prima y el proceso usado en la producción. Las fermentaciones pueden ser tolerantes a ciertas impurezas, pero persiste la necesidad de eliminarlas de los materiales del gas de síntesis, tales como alquitranes y particulados que pueden estropear el agente termentador y equipo relacionado. Se aconseja, además, eliminar los compuestos que pueden contaminar el producto de isopreno, tal como compuestos orgánicos volátiles, gases ácidos, metano, benceno, tolueno, etilbenceno, xilenos, H2S, COS, CS2, HC1, 03, compuestos organosulfúricos, amoníaco, óxidos de nitrógeno, compuestos orgánicos que contienen nitrógeno y vapores de metales pesados. La eliminación de las impurezas del gas de síntesis se puede lograr por uno de diversos medios, que incluyen depuración de gas, tratamiento con absorbentes de fase sólida y purificación con el uso de membranas permeables al gas.
Condiciones de cultivos celulares ilustrativas Los materiales y métodos adecuados para el mantenimiento y crecimiento de las células recombinantes de la presente invención se describen más abajo, por ejemplo, en la sección Ejemplos. Otros materiales y métodos adecuados para el mantenimiento y crecimiento de cultivos bacterianos son muy conocidos en la técnica. Las técnicas ilustrativas pueden encontrarse en la publicación internacional núm. WO 2009/076676, la publicación de la patente de los Estados Unidos núm. 2009/0203102, patente núm. WO 2010/003007, publicación de patente de los Estados Unidos núm. 2010/0048964, la patente núm. WO 2009/132220, publicación de la patente de los Estados Unidos núm. 2010/0003716, Manual of Methods for General Bacteriology Gerhardt et al., eds) , American Society for Microbiology, Washington, D.C. (1994) o Brock en Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology, Segunda edición (1989) Sinauer Associates, Inc., Sunderland, A. En algunos aspectos, las células se cultivan en un medio de cultivo en condiciones que permiten la expresión de polipéptido de fosfocetolasa, así como otras enzimas a partir de la rutas superior e inferior del MVA, que incluyen, pero no se limitan a, los productos de los genes mvafí y mvaS, isopreno sintasa, ruta de DXP (por ejemplo, DXS) , polipéptidos de IDI o PGL codificados por un ácido nucleico insertado en las células hospederas.
Se puede usar condiciones convencionales de cultivo celular para cultivar las células (ver, por ejemplo, la patente núm. WO 2004/033646 y las referencias mencionadas en esta) . En algunos aspectos, las células se cultivan y se mantienen a una temperatura adecuada, mezcla de gases y pH (tal como a aproximadamente 20°C hasta aproximadamente 37 °C, a aproximadamente 6% hasta aproximadamente 84% C02 y a un pH entre aproximadamente 5 y aproximadamente 9) . En algunos aspectos, las células se cultivan a 35°C en un medio celular adecuado. En algunos aspectos, el pH se encuentra en el intervalo para fermentación entre aproximadamente 5.0 y aproximadamente 9.0 (tal como de aproximadamente 6.0 a aproximadamente 8.0 o de aproximadamente 6.5 a aproximadamente 7.0). Las células se pueden cultivar en condiciones aerobias, anóxicas o anaerobias en base a los requisitos de las células hospederas. Adicionalmente, se puede usar condiciones de cultivo celular más específicas para cultivar las células. Por ejemplo, en algunas modalidades, las células recombinantes (tales como células de E. coli) comprenden uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican un polipéptido de fosfocetolasa, así como enzimas a partir de la ruta superior, que incluyen, pero no se limitan a, los productos de los genes mvaE y mvaS mvaE y polipéptidos de mvaS a partir de L. grayi, E. faecium, E. gallinarum, E. casseliflavus y/o E. faecalis bajo el control de un promotor fuerte en un plásmido de copia baja a media y se cultivan a 34 °C.
Las condiciones de cultivo y modos de fermentación convencionales, tales como fermentación discontinua, semicontinua o continua, que pueden usarse se describen en la publicación internacional núm. WO 2009/076676, publicación de la patente de los Estados Unidos núm. 2009/0203102, patente núm. WO 2010/003007, publicación de patente de los Estados Unidos núm. 2010/0048964, la patente núm. WO 2009/132220, publicación de la patente de los Estados Unidos núm. 2010/0003716. Las fermentaciones discontinuas y semicontinuas son comunes y muy conocidas en la técnica y los ejemplos pueden encontrarse en Brock, Biotechnolog : A Textbook of Industrial Microbiology, segunda edición (1989) Sinauer Associates, Inc.
En algunos aspectos, las células se cultivan en condiciones de glucosa limitada. "Condiciones de glucosa limitada" se refiere a que la cantidad de glucosa que se agrega es menor que o aproximadamente 105% (tal como aproximadamente 100%, 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20% o 10%) de la cantidad de glucosa que las células consumen. En aspectos particulares, la cantidad de glucosa que se agrega al medio de cultivo es aproximadamente igual que la cantidad de glucosa que las células consumen durante un período de tiempo específico. En algunos aspectos, la velocidad de crecimiento celular se controla al limitar la cantidad de glucosa agregada de manera que las células crecen a la velocidad que puede soportar la cantidad de glucosa en el medio celular. En algunos aspectos, la glucosa no se acumula durante el tiempo en que las células se cultivan. En diversos aspectos, las células se cultivan en condiciones de glucosa limitada durante más de o aproximadamente 1, 2, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60 o 70 horas. En diversos aspectos, las células se cultivan en condiciones de glucosa limitada durante más de o aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95 o 100% de la duración total del cultivo de las células. Sin pretender limitarse a ninguna teoría, se cree que las condiciones de glucosa limitada pueden permitir una regulación más favorable de las células.
En algunos aspectos, las células recombinantes se cultivan en cultivo discontinuo. Las células recombinantes se pueden cultivar, además, en cultivo semicontinuo o continuo de células. Adicionalmente, las células recombinantes se pueden cultivar en medio mínimo, que incluyen, pero no se limitan a, cualquiera de los medios mínimos descritos anteriormente . El medio mínimo se puede suplementar adicionalmente con 1.0% (w/v) de glucosa o cualquier otro de los seis azúcares de carbono o menos. Específicamente, el medio mínimo se puede suplementar con 1% (w/v) , 0.9% (w/v) , 0.8% (w/v), 0.7% (w/v), 0.6% (w/v), 0.5% (w/v), 0.4% (w/v), 0.3% (w/v), 0.2% (w/v) o 0.1% (w/v) de glucosa. Adicionalmente, el medio mínimo se puede suplementar con 0.1% (w/v) o menos de extracto de levadura. Específicamente, el medio mínimo se puede suplementar con 0.1% (w/v), 0.09% (w/v), 0.08% (w/v), 0.07% (w/v), 0.06% (w/v), 0.05% (w/v), 0.04% (w/v), 0.03% (w/v), 0.02% (w/v) o 0.01% (w/v) de extracto de levadura. Alternativamente, el medio mínimo se puede suplementar con 1% (w/v), 0.9% (w/v), 0.8% (w/v), 0.7% (w/v), 0.6% (w/v), 0.5% (w/v), 0.4% (w/v), 0.3% (w/v), 0.2% (w/v) o 0.1% (w/v) de glucosa y con 0.1% (w/v), 0.09% (w/v), 0.08% (w/v), 0.07% (w/v), 0.06% (w/v), 0.05% (w/v), 0.04% (w/v), 0.03% (w/v), 0.02% (w/v) o 0.01% (w/v) de extracto de levadura.
Métodos de purificación ilustrativos En algunos aspectos, cualquiera de los métodos descritos en la presente descripción incluye, además, una etapa de recuperar los compuestos producidos. En algunos aspectos, cualquiera de los métodos descritos en la presente descripción incluye, además, una etapa de recuperar el isopreno. En algunos aspectos, el isopreno se recupera por separación por absorción (ver, por ejemplo, la publicación de la patente de los Estados Unidos núm. 2011/0178261) . En algunos aspectos, cualquiera de los métodos descritos en la presente descripción incluye, además, una etapa de recuperar el polipéptido heterólogo. En algunos aspectos, cualquiera de los métodos descritos en la presente descripción incluye, además, una etapa de recuperar el terpenoide o carotenoide.
Los métodos de purificación adecuados se describen detalladamente en la publicación de la solicitud de patente de los Estados Unidos núm. US2010/0196977 Al.
A lo largo de esta descripción, se menciona diversas patentes, solicitudes de patentes y otros tipos de publicaciones (por ejemplo, artículos de publicaciones periódicas) . La descripción de todas las patentes, solicitudes de patentes, y publicaciones mencionadas en la presente descripción se incorporan en la presente descripción como referencia en su totalidad para cualquier propósito.
La presente invención se puede comprender, adicionalmente, al hacer referencia a los siguientes ejemplos que se proporcionan en forma de ilustración y no pretenden ser limitantes.
EJEMPLOS Ejemplo 1. Clonación del gen que codifica la enzima fosfocetolasa a partir de Bifidobacterium infantis El ADN cromosómico de Bifidobacterium infantis se obtuvo de ATCC (núm. de la ATCC 15697D-5, ATCC, Manassas, VA) . El gen que codifica enzima fosfocetolasa (PKL) se amplificó con el uso de iniciadores CMP283: 5'- ctgtatTCATGAcgagtcctgttattggcacc-3 ' (sec. con núm. de ident. :30) y CMP284: 5 ' -ctctatGAATTCTCACTCGTTGTCGCCAGCG-3 ' (sec. con núm. de ident.:31), 100 ng de ADN como plantilla y la polimerasa Herculase II Fusión según las indicaciones del fabricante (Agilent, Santa Clara, CA) . Después de la purificación, el fragmento de 2798 pb se digirió con BspHI y EcoRI, y se ligó con pTrcHis2B digerido con NcoI/EcoRI (Invitrogen, Carlsbad, CA) para formar el plásmido pCMP1090 (sec. con núm. de ident . : 15 - Figura 6) .
Ejemplo 2. Clonación de enzima fosfocetolasa a partir de la cepa F275 deLactobacillus reuteri El ADN cromosómico de la cepa F275 de Lactobacillus reuteri se obtuvo de ATCC (núm. de la ATCC 23272D-5, ATCC, Manassas, VA) . El gen que codifica la enzima fosfocetolasa (PKL) se amplificó con el uso de iniciadores CMP34 : 5'-taaggaggaataaacATGGCAGTAGATTACGATTCCAAG-3 ' (sec. con núm. de ident. :32) y CMP335 : 5' -ttctagaaagcttcgttacttaagacccttccaagtccag-3' (sec. con núm. de ident.: 33), 100 ng de ADN como plantilla y la polimerasa Herculase II Fusión según las indicaciones del fabricante (Agilent, Santa Clara, CA) . Después de la purificación, el fragmento de 2442 pb se ensambló en pTrcHis2B digerido con NcoI/EcoRI (Invitrogen, Carlsbad, CA) con el uso del kit de clonación integrada GEMEART (Invitrogen, Carlsbad, CA) para formar el plásmido pCMP1029 (sec. con núm. de ident.: 16 -Figura 7) .
Ejemplo 3. Construcción de las cepas CMP451, CMP674, CMP1015 y CMP1047 (BL21 GI1.2gltA ldhA) El promotor frente al gen de citrato sintasa {gltA) en la cepa BL21 de E. coli (Novagen) se reemplazó previamente por un promotor constitutivo de expresión baja, particularmente Gil.2 (patente de los Estados Unidos núm. 7,371,558). Dos promotores silvestres se han descrito para gltA (Wilde, R y J. Guest. 1986. J. Gen. Microbiol . 132:3239-3251) . El promotor sintético se insertó justo después de la región -35 del promotor distal. Se obtuvo un producto de PCR con el uso de iniciadores UpgltACm-F (5'- TATTTAATTTTTAATCATCTAATTTGACAATCATTCAACAAAGTTGTTACAATTAACCCTC ACTAAAGGGCGG-3 ' (sec. con núm. de ident.:34)) y DngltAl .xgiCm-R (5'-TCAACAGCTGTATCCCCGTTGAGGGTGAGTTTTGCTTTTGTATCAGCCATATATTCCACCA GCTATTTGTTAGTGAATAAAAGTGGTTGAATTATTTGCTCAGGATGTGGCATHGTCAAGGG CTAATACGACTCACTATAGGGCTCG-3 ' (sec. con núm. de ident.:35)) y el plásmido FRT-gb2 -Cm-FRT de Gene Bridges (Heidelberg, Alemania) como plantilla. El producto de PCR se purificó y se usó en una recombinación mediada con lambda rojo como lo describe el fabricante (Gene Bridges, Heidelberg, Alemania) . Diversas colonias se seleccionaron para una caracterización adicional. La región promotora se amplificó por PCR con el uso de iniciadores gltAPromSeqF : 5'-GGCAGTATAGGCTGTTCACAAAATC-3 ' (sec. con núm. de ident.:36) y gltApromSeqR: 5 ' -cttgacccagcgtgcctttcagc-3 ' (sec. con núm. de ident.:37) y, como una plantilla, el ADN se extrajo al resuspender una colonia en 30 ul de H20, con calentamiento a 95°C durante 4 min. , desactivación y se usó 2 ul de ese material como una plantilla en una reacción de 50 µ? . Después de observar los resultados de la secuenciación de los productos de PCR obtenidos, una colonia que contiene el promotor Gil.2 (patente de los Estados Unidos núm. 7,371,558) se denominó CMP141.
La cepa MD09-313 se construyó al transducir CMP258 (ver la solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 12/978,324) con un lisado Pl a partir de la cepa C 521 (ver la solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 12/978,324) y seleccionar las colonias en placas con Luria-Bertani que contienen 20 µg/ml de canamicina. Los lisados Pl se prepararon de conformidad con el método descrito en Ausubel, et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc. El marcador de canamicina se eliminó con el uso del protocolo recomendado por el fabricante (Gene Bridges, Heidelberg, Alemania) para formar la cepa MD09-314.
Un lisado Pl se produjo a partir de la cepa CMP141, se usó para transducir la cepa MD09-314 para formar CMP440. El marcador de cloranfenicol se eliminó con el uso del protocolo recomendado por el fabricante (Gene Bridges, Heidelberg, Alemania) para formar las cepas CMP451.
Un fragmento de ADN que contiene un marcador de cloranfenicol flanqueado por ADN homólogo con las regiones corriente arriba y corriente abajo del sitio de unión a ? attB se amplificó por PCR con el uso del plásmido pKD3 (Datsenko, K. y Wanner, B. 2000. PNAS 97:6640-6645) como una plantilla y los iniciadores CMP171 (5'- AAAATTTTCATTCTGTGACAGAGAAAAAGTAGCCGAAGATGACGGTTTGTCACATGGAGTT GGCAGGATGTTTGATTACATGGGAATTAGCCATGGTCC-3 ' (sec. con núm. de ident.:38)) y CMP172 (5'-GACCAGCCGCGTAACCTGGCAAAATCGGTTACGGTTGAGTAATAAATGGATGCCCTGCGTA AG CGG GGCATT TTTCTTGGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG-3 ' (sec. con núm. de ident.:39)). El producto de PCR obtenido se usó en una reacción de ingeniería genética mediada por recombinación en BL21 (Novagen) según las recomendaciones del fabricante (Gene Bridges, Heidelberg, Alemania) para integrar el producto de PCR en el sitio de unión a ? attB. Por lo tanto, se produjo la cepa CMP646, seleccionada en LB + 5 g/ml de cloranfenicol . Se produjo un lisado Pl de CMP646 y se usó en una reacción de transducción en la cepa CMP451 para eliminar los genes de la ruta inferior de mevalonato (que codifican mevalonato cinasa, fosfomevalonato cinasa, difosfomevalonato descarboxilasa e isopentenil difosfato isomerasa) del cromosoma de esa cepa. La reacción de transducción se colocó en placas con LB + 5 µg/ml de cloranfenicol y una colonia para cada transducción se seleccionó y se denominó CMP674.
Tabla 2. Descripción de cepas de E. coli Un fragmento de ADN que contiene el gen ldhA interrumpido por un marcador de canamicina se amplificó por PCR con el uso de la cepa JW 1375 a partir de la recolección Keio (Baba et al. 2006. Mol. Syst . Biol . 2: 2006.0008) como una plantilla y los iniciadores ldhAseqR (5'-GGCTTACCGTTTACGCTTTCCAGC-3 ' (sec. con núm. de ident.:40)) y ldhAseqF2 (5 ' -CTAATGCAATACGTGTCCCGAGC-3 ' (sec. con núm. de ident.:41)). El producto de PCR obtenido se usó en una reacción de ingeniería genética mediada por recombinación según las recomendaciones del fabricante (Gene Bridges, Heidelberg, Alemania) para integrar el producto de PCR en el locus ldhA en la cepa CMP674. Esa cepa se denominó CMP1015. Los marcadores de cloranfenicol y canamicina circularon fuera simultáneamente por electroporación de pCP20 (Datsenko and Wanner. 2000. PNAS 97:6640-6645) en la cepa, se seleccionó dos colonias en LB + 50 g/ml de carbenicilina a 30°C, después, se rayó esas colonias otra vez para transferirlas en una placa con LB a 42 °C. Se seleccionó una colonia de Cms y Kans de esas placas y se denominó CMP1047.
Ejemplo 4. Construcción de las cepas CMP1036, 1038 y 1040 La cepa CMP674 se electroporó en presencia de los plásmidos pTrcHis2B, pCMP1090 (PKL a partir de Bifidobacterium infantis) y pCMP1029 (PKL a partir de Lactobacillus reuteri) . Las colonias se aislaron en LB + 50 g/ml de carbenicilina. Se seleccionó una colonia de cada transformación y se denominó CMP1036, CMP1038 y CMP1040, respectivamente.
Ejemplo 5. Medición de acetil fosfato en las cepas CMP1036, 1038 y 1040 (i) Materiales Receta del medio TM3 (por litro de medio de fermentación) : K2HP04 13.6 g, KH2P04 13.6 g, MgS04*7H20 2 g, monohidrato de ácido cítrico 2 g, citrato de amonio férrico 0.3 g, (NH ) S04 3.2 g, extracto de levadura 0.2 g, solución de metales traza 1000X 1 mi. Todos los componentes se agregan y se disuelven en diH20. El pH se ajusta hasta 6.8 con hidróxido de amonio (30%) y se lleva hasta volumen. El medio se esterilizó con un filtro de 0.22 micrones . Se agrega glucosa 10.0 g y antibiótico después de ajustar el pH y de la esterilización.
Solución de metales traza 1000X (por litro de medio de fermentación) Ácido cítrico*H20 40 g, MnS04*H20 30 g, NaCl 10 g, FeS04*7H20 1 g, CoCl2.6H20 1 g, ZnS04*7H20 1 g, CuS04*5H20 100 mg, H3BO3 100 mg, NaMo04*2H20 100 mg. Cada componente se disuelve uno a la vez en diH20. El pH se ajusta hasta 3.0 con HCl/NaOH y, después, la solución se lleva hasta volumen y se esteriliza con un filtro de 0.22 micrones. (ii) Procedimiento experimental Las células se cultivaron durante la noche en caldo de cultivo Luria-Bertani + antibióticos. Un día después, se diluyeron hasta una OD600 de 0.05 en 20 mi de medio TM3 que contiene 50 ug/ml de carbenicilina (en un matraz Erlenmeyer con deflectores de 250 mi) y se incubaron a 34°C y 200 rpm. Después de 2 h de crecimiento, la OD600 se determinó y se agregó 200 uM de IPTG. Después de 3.5 horas más, se centrifugó una muestra de 1.5 mi, el sobrenadante se eliminó y el comprimido se resuspendió en 100 µ? de metanol frío con hielo seco. (iii) Medición de acetil fosfato intracelular .
Para extraer el acetil fosfato, 1.5 mi de células de E. coli cultivadas hasta OD 0.57-2.26 se desactivaron por centrif gación y se agregó 100 µ? de metanol frío con hielo seco a los comprimidos . Se almacenó muestras templadas con metanol a -20°C durante varios días. El procesamiento adicional de las muestras incluyó resuspensión celular moderada, 5 min de centrifugación a -9°C y aspiración del sobrenadante en viales limpios. El comprimido se reextrajo dos veces con 75 µ? de agua que contiene ácido acético al 2%. Después de cada extracción, los detritos celulares se agruparon por centrifugación a -9°C, los sobrenadantes de las tres extracciones se agruparon y se aumentaron con 1 µ? de tributilamina . El análisis espectrométrico de masas de acetil fosfato por LCMS se llevó a cabo con el uso de un sistema Thermo Finnigan TSQ (Thermo Electron Corporation, San José, CA) . El control del sistema, la adquisición de datos y la evaluación de datos espectrales de masa se llevaron a cabo con el uso del programa XCalibur y LCQuan (Thermo Electron Corp) . Se aplicó un gradiente de fase móvil en una columna de HPLC Synergi MAX-RP de 5 µ? (150 x 2 mm, Phenomenex) a una velocidad de flujo de 0.4 ml/min. El perfil de gradiente aplicado fue 99% A y 1% B a t=0-l min; 80% A y 20% B a t=ll min; 75% B y 25% C a t=12-14 min; 99% A y 1% B a t=15-16 min, en donde el solvente A fue 15 mM de tributilamina/10 mM de ácido acético en agua, el solvente B fue metanol y el solvente C fue agua. La detección de masas de acetil fosfato se llevó a cabo con el uso de ionización por electroatomización (ESI-MS/MS) en modo negativo (voltaje de rocío de ESI de 2.5-3.0 kV, temperatura del tubo de transferencia de iones 390°C) con un valor m/z para el ion precursor de 138.9. La concentración de acetil fosfato se determinó en base a la intensidad integrada de pico generado por ion del producto P03" (m/z =79.0, energía de colisión 20 V, presión de gas de colisión 0.22 kPa (1.7 mTorr) , Rt=13.2 min). La curva de calibración obtenida por inyección de acetil fosfato convencional (Sigma-Aldrich) se usó para calcular la concentración del metabolito en extractos celulares. La concentración intracelular de acetil fosfato se determinó en base a la suposición que en 1 mi del cultivo a OD=200 el volumen integrado de todas las células es 50 µ? (Figura 8) . (iv) Resultados Las cepas que expresan fosfocetolasa tenían concentraciones intracelulares de acetil fosfato (CMP1040 y CMP1038) más altas que la cepa control que no expresa fosfocetolasa (Figura 8) .
Ejemplo 6. Construcción de las cepas CMP1053, 1055 y 1057 Los plásmidos pTrcHis2B (Invitrogen, Carlsbad, CA) , pCMP1090 (PKL a partir de Bifidobacterium infantis) o pCMP1029 (PKL a partir de Lactobacillus reuteri) se usaron para transformar CMP1047 junto con el plásmido pMCM82 (vector de expresión MCM82 (publicación de la solicitud de patente de los Estados Unidos núm. US2010/0196977) . El huésped CMP1047 se cultivó hasta la mitad de la fase de crecimiento logarítmico en LB a 34°C y se preparó para electroporacion al lavar 2x en un volumen de cultivo de ddH20 helada y se resuspendió en una décima parte del volumen de este. 100 µ? de suspensión celular se combinaron con 1 µ? de cada ADN de plásmidos, se trasladaron a una cubeta de electroporacion de 2 mm, se electroporaron a 25 uFD, 200 Ohms, 2.5 kV y se templaron inmediatamente con 1 mi de LB. Las células se recuperaron con agitación a 34 °C durante 1 h y, después, los transformantes se seleccionaron durante la noche en placas con LB con 50 µ9 /mi de espectinomicina + 50 pg/ml de carbenicilina a 34°C. Se seleccionó una colonia para cada transformación y se denominó CMP1053, 1055 y 1057, respectivamente.
En otras modalidades, cualquiera de las cepas resultantes descritas anteriormente se puede modificar genéticamente aún más para modular la actividad de la ruta de Entner-Doudoroff . El gen que codifica fosfogluconato deshidratasa o aldolasa se puede atenuar o eliminar. En otras modalidades, cualquiera de las cepas resultantes descritas anteriormente se puede, además, modificar genéticamente para reducir o eliminar la actividad de acetato cinasa o citrato sintasa. En otras modalidades, cualquiera de las cepas resultantes se puede, además, modificar genéticamente para reducir o eliminar la actividad de fosfofructocinasa . En otras modalidades, cualquiera de las cepas resultantes descritas anteriormente se puede modificar genéticamente para modular la actividad de gliceraldehídos-3-fosfato deshidrogenasa . La actividad de gliceraldehídos 3 -fosfato deshidrogenasa se puede modular al reducir su actividad. En otras modalidades, las enzimas de la rama no oxidativa de la ruta de pentosa fosfato, tales como trancetolasa, transaldolasa, ribulosa-5-fosfato-epimerasa y (0) ribosa-5- fosfato epimerasa, pueden sobreexpresarse .
Ejemplo 7. Producción de mevalonato por las cepas CMP1053, 1055 y 1057 (1) Materiales Receta del medio TM3 (por litro de medio de fermentación) : K2HP04 13.6 g, KH2PO4 13.6 g, MgS04*7H20 2 g, monohidrato de ácido cítrico 2 g, citrato de amonio férrico 0.3 g, ( H4)2S04 3.2 g, extracto de levadura 0.2 g, solución de metales traza 1000X 1 mi. Todos los componentes se agregan y se disuelven en diH20. El pH se ajusta hasta 6.8 con hidróxido de amonio (30%) y se lleva hasta volumen. El medio se esteriliza con un filtro de 0.22 micrones . Se agrega glucosa 10.0 g y antibiótico después de ajustar el pH y de la esterilización.
Solución de metales traza 1000X (por litro de medio de fermentación) Ácido cítrico*H20 40 g, MnSO4*H20 30 g, NaCl 10 g, FeS04*7H20 1 g, CoCl2*6H20 1 g, ZnS04*7H20 1 g, CuS04*5H20 100 mg, H3BO3 100 mg, NaMo04*2H20 100 mg. Cada componente se disuelve uno a la vez en diH20. El pH se ajusta hasta 3.0 con HCl/NaOH y, después, la solución se lleva hasta volumen y se esteriliza con un filtro de 0.22 micrones. (ii) Procedimiento experimental Las células se cultivan durante la noche en caldo de cultivo Luria-Bertani + antibióticos. Un día después, se diluyeron hasta una OD600 de 0.05 en 20 mi de medio TM3 que contiene 50 yg/ml de espectinomicina y 50 ug/ml de carbenicilina (en un matraz Erlenmeyer con deflectores de 250 mi) y se incubaron a 34°C y 200 rpm. Después de 2 h de crecimiento, la OD600 se determina y se agrega 200 uM de IPTG. Las muestras se toman con regularidad durante el transcurso de la fermentación. En cada momento específico, se determina la OD600. Después de 24 h, el mevalonato se analiza por HPLC. El análisis por HPLC se realizó de la siguiente manera: se agregó 54 µ? de H2S04 al 10% (w/v) a 300 µ? de caldo de cultivo y la mezcla se incubó en hielo durante 5 minutos. Después, la mezcla se centrifugó a 14,000xg durante 5 minutos y el sobrenadante se recolectó para el análisis por HPLC que se realizó en las siguiente condiciones: (1) BioRad - columna de exclusión de iones Aminex HPX-87H (300 mm x 7.8 mm) (catálogo núm. 125-0140) (BioRad, Hercules, California) ; (2) temperatura de la columna = 50°C; (3) BioRad - rellenado de la columna protectora de catión H Microguard (30 mm x 4.6 mm) (catálogo núm. 125-0129) (BioRad); (4) regulador en uso = H2S04 0.01 N; (5) velocidad de flujo del regulador en uso = 0.6 mi / min; (6) presión aproximada en uso = -6550.01 kPa (-950 psi) ; (7) volumen de inyección = 20 microlitros ; (8) tiempo de ejecución = 26 minutos. (iii) Resultados: Las cepas que expresan fosfocetolasa crecieron más despacio que la cepa control (Figura 9) . CMP1057 (que expresa el gen de fosfocetolasa de L. reuteri) produjo más mevalonato que las cepas que contienen el plásmido vacío control o la fosfocetolasa a partir de B. infantis (Figura 10) .
Ejemplo 8. Construcción de las cepas que producen isopreno y que expresan fosfocetolasa Una ruta inferior de mevalonato se introduce por transducción en CMP674 con el uso de un lisado de CM521 (ver la Tabla 2) . El marcador de canamicina se circula fuera según las indicaciones del fabricante (Gene Bridges, Heidelberg, Alemania) . La ruta inferior de MCM521 se puede modificar al cambiar el promotor corriente arriba del operón al modificar el rbs frente a cada gen con el uso de genes alternos. Un plásmido de expresión que expresa lacl, isopreno sintasa y mevalonato cinasa de M. mazei, plásmido pMCM82 (Vector de expresión. MCM82 (publicación de la solicitud de patente de los Estados Unidos núm. US2010/0196977) ) y plásmido pCMP1090 (PKL a partir de Bifidobacterium infantis) , pC P1029 (PKL a partir de Lactobacillus reuteri) o pTrcHis2B se electroporan (en dos etapas) en CMP1047. Las colonias se seleccionan en LB+ espectinomicina 50 g/ml + carbenicilina 50 yg/ml + cloranfenicol 25 µg/ml.
En otras modalidades, cualquiera de las cepas resultantes descritas anteriormente se puede modificar genéticamente aún más para modular la actividad de la ruta de Entner-Doudoroff . El gen que codifica fosfogluconato deshidratasa o aldolasa se puede atenuar o eliminar. En otras modalidades, cualquiera de las cepas resultantes descritas anteriormente se puede, además, modificar genéticamente para reducir o eliminar la actividad de acetato cinasa o citrato sintasa. En otras modalidades, cualquiera de las cepas resultantes se puede, además, modificar genéticamente para reducir o eliminar la actividad de fosfofructocinasa . En otras modalidades, cualquiera de las cepas resultantes descritas anteriormente se puede, además, modificar genéticamente para modular la actividad de gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa . La actividad de gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa se puede modular al reducir su actividad. En otras modalidades, las enzimas de la rama no oxidativa de la ruta de pentosa fosfato, tales como trancetolasa, transaldolasa, ribulosa-5-fosfato-epimerasa y (o) ribosa-5-fosfato epimerasa, pueden sobreexpresarse .
Ejemplo 9. Producción de isopreno por las cepas que contienen un plásmido que expresa la ruta superior de mevalonato, un plásmido que expresa lacl, isopreno sintasa y mevalonato cinasa y un plásmido que expresa fosfocetolasa en comparación con células que contienen un plásmido que expresa la ruta superior de mevalonato, un plásmido que expresa lacl, isopreno sintasa y mevalonato cinasa y un plásmido vacío (pTrcHis2B) (i) Materiales Receta del medio TM3 (por litro de medio de fermentación) : K2HP04 13.6 g, KH2P04 13.6 g, MgS04*7H20 2 g, monohidrato de ácido cítrico 2 g, citrato de amonio férrico 0.3 g, (NH4)2S04 3.2 g, extracto de levadura 0.2 g, solución de metales traza 1000X 1 mi. Todos los componentes se agregan y se disuelven en diH20. El pH se ajusta hasta 6.8 con hidróxido de amonio (30%) y se llevó hasta volumen. El medio se esterilizó con un filtro de 0.22 micrones. Se agrega glucosa 10.0 g y antibiótico después de ajustar el pH y de la esterilización.
Solución de metales traza 1000X (por litro de medio de fermentación) Ácido cítrico*H20 40 g, MnS04*H20 30 g, NaCl 10 g, FeS04*7H20 1 g, CoCl2*6H20 1 g, ZnS04*7H20 1 g, CuS04*5H20 100 mg, H3BO3 100 mg, NaMo04*2H20 100 mg. Cada componente se disuelve uno a la vez en diH20. El pH se ajusta hasta 3.0 con HCl/NaOH y, después, la solución se lleva hasta volumen y se esteriliza con un filtro de 0.22 micrones. (ii) Procedimiento experimental Las células se cultivan durante la noche en caldo de cultivo Luria-Bertani + antibióticos. Un día después, se diluyeron hasta una OD600 de 0.1 en 20 mi de medio TM3 que contiene 50 yg/ml de espectinomicina, 25 g/ml de cloranfenicol y 50 ug/ml de carbenicilina (en un matraz Erlenmeyer con deflectores de 250 mi) y se incubaron a 34 °C y 200 rpm. Después de 2 h de crecimiento, la OD600 se determina y se agrega 200 uM de IPTG. Las muestras se toman con regularidad durante el transcurso de la fermentación. En cada momento específico, se determina la OD600. Además, se realiza el análisis de emisión de gases de isopreno con el uso de un ensayo de cromatógrafo de gases-espectrómetro de masas (GC- S) (Agilent) con espacio vacío. Cien microlitros de caldo de cultivo completo se colocan en un vial de GC sellado y se incuban a 3 °C y 200 rpm durante un tiempo ajustado de 30 minutos. Después de una etapa de eliminación por calor, que consiste de incubación a 70°C durante 7 minutos, la muestra se coloca en el GC. La productividad específica reportada es la cantidad de isopreno en ug/l según el GC dividida por el tiempo de incubación (30 min) y la OD600 determinada . (iii) Resultados: Las cepas que expresan fosfocetolasa crecen con más lentitud que la cepa control que no expresa fosfocetolasa . Las cepas que expresan el polipéptido de fosfocetolasa muestran una producción mejorada de isopreno en comparación con las cepas que contienen el plásmido vacío control (por ejemplo, la cepa que no expresa fosfocetolasa) debido a la observancia de mayor productividad específica, rendimiento, CPI y/o título de isopreno en las cepas que expresan el polipéptido de fosfocetolasa .
Ejemplo 10. Construcción de las cepas que expresan fosfocetolasa y producen amorfadieno o farneseno Una ruta inferior de mevalonato se introduce por transducción en CMP674 con el uso de un lisado de MCM521 (ver la Tabla 2) . El marcador de canamicina se circula fuera según las indicaciones del fabricante (Gene Bridges, Heidelberg, Alemania) . La ruta inferior de MC 521 se puede modificar al cambiar el promotor corriente arriba del operón al modificar el rbs frente a cada gen con el uso de genes alternos. La farnesil difosfato sintasa (ispA) se sobreexpresa, ya sea al alterar el promotor y/o rbs en el cromosoma o al expresarlo desde un plásmido.
El plásmido de expresión que expresa lacl, isopreno sintasa y mevalonato cinasa de M. mazei del Ejemplo 8 se modifica para reemplazar el gen que codifica isopreno sintasa por un gen optimizado por codones que codifica farneseno sintasa o amorfadieno sintasa. Los siguientes plásmidos de expresión se electroporan (en dos etapas) en células hospederas competentes: (i) el plásmido que tiene lacl, farneseno sintasa o amorfadieno sintasa y mevalonato cinasa de M. mazei, (ii) pMCM82 (vector de expresión MCM82 (publicación de la solicitud de patente de los Estados Unidos núm. US2010/0196977) y (iii) pCMP1090 (PKL a partir de Bifidobacterium infantis) o pCMP1029 (PKL a partir de Lactobacillus reuteri) o pTrcHis2B. Las colonias se seleccionan en LB+ espectinomicina 50 pg/ml + carbenicilina 50 µg/ml + cloranfenicol 25 g/ml.
En otras modalidades, cualquiera de las cepas resultantes descritas anteriormente se puede modificar genéticamente aún más para modular la actividad de la ruta de Entner-Doudoroff . El gen que codifica fosfogluconato deshidratasa o aldolasa se puede atenuar o eliminar. En otras modalidades, cualquiera de las cepas resultantes descritas anteriormente se puede, además, modificar genéticamente para reducir o eliminar la actividad de acetato cinasa o citrato sintasa. En otras modalidades, cualquiera de las cepas resultantes se puede, además, modificar genéticamente para reducir o eliminar la actividad de fosfofructocinasa. En otras modalidades, cualquiera de las cepas resultantes descritas anteriormente se puede, además, modificar genéticamente para modular la actividad de gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa . La actividad de gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa se puede modular al reducir su actividad. En otras modalidades, las enzimas de la rama no oxidativa de la ruta de pentosa fosfato, tales como trancetolasa, transaldolasa, ribulosa-5-fosfato-epimerasa y (o) ribosa-5-fosfato epimerasa, pueden sobreexpresarse .
Ejemplo 11. Producción de amorfadieno o farneseno en las cepas que contienen un plásmido que expresa fosfocetolasa en comparación con la cepa control (i) Materiales Receta del medio TM3 (por litro de medio de fermentación) : K2HP04 13.6 g, KH2P04 13.6 g, MgS04*7H20 2 g, monohidrato de ácido cítrico 2 g, citrato de amonio férrico 0.3 g, (NH4)2S04 3.2 g, extracto de levadura 0.2 g, solución de 4 metales traza 1000X 1 mi. Todos los componentes se agregan y se disuelven en diH20. El pH se ajusta hasta 6.8 con hidróxido de amonio (30%) y se llevó hasta volumen. Después, el medio se esteriliza con un filtro de 0.22 micrones. Se agrega glucosa 10.0 g y antibióticos después de la esterilización y el ajuste de pH.
Solución de metales traza 1000X (por litro de medio de fermentación) : Ácido cítrico*H20 40 g, MnS04*H20 30 g, NaCl 10 g, FeS04*7H20 1 g, CoCl2*6H20 1 g, ZnS04*7H20 1 g, CuS04*5H20 100 mg, H3BO3 100 mg, NaMo04*2H20 100 mg. Cada componente se disuelve uno a la vez en diH20. El pH se ajusta hasta 3.0 con HCl/NaOH y, después, la solución se lleva hasta volumen y se esteriliza con un filtro de 0.22 micrones. (ii) Procedimiento experimental Las células se cultivan durante la noche en caldo de cultivo Luria-Bertani + antibióticos. Un día después, se diluyeron hasta una OD600 de 0.05 en 20 mi de medio TM3 que contiene 50 µg/ml de espectinomicina, 25 ug/ml de cloranfenicol y 50 µg/ml de carbenicilina (en un matraz Erlenmeyer con deflectores de 250 mi) y se incubaron a 34°C y 200 rpm. Antes de la inoculación, se agregó un revestimiento de dodecano al 20% (v/v) (Sigma-Aldrich) en cada matraz de cultivo para atrapar el producto de sesquiterpeno volátil como se describió previamente (Newman et. al., 2006).
Después de 2 h de crecimiento, se determina la OD600 y se agrega 0.05-0.40 mM de isopropilo ß-D-l-tiogalactopiranosida (IPTG) . Las muestras se toman con regularidad durante el transcurso de la fermentación. En cada momento específico, se determina la OD600. Además, se analiza la concentración de amorfadieno o farneseno en la capa orgánica al diluir el revestimiento de dodecano en acetato de etilo. Los extractos de dodecano/acetato de etilo se analizan por métodos de GC-MS como se describió previamente (Martin et. al., Nat . Biotechnol . 2003, 21:96-802) al monitorear el ion molecular (204 m/z) y el ion del fragmento 189 m/z para amorfadieno o el ion molecular (204 m/z) para farneseno. Las muestras de amorfadieno o farneseno de concentración conocida se inyectan para producir curvas convencionales para amorfadieno o farneseno, respectivamente. La cantidad de amorfadieno o farneseno en las muestras se calcula con el uso de las curvas de amorfadieno o farneseno convencionales, respectivamente . (iii) Resultados Las cepas que expresan el polipéptido de fosfocetolasa se comparan con las cepas que contienen un plásmido vacío (por ejemplo, que carece de polipéptido de fosfocetolasa) con la misma cadena principal. Las cepas que expresan el polipéptido de fosfocetolasa muestran una producción mejorada de amorfadieno o farneseno en comparación con las cepas que contienen el plásmido vacío control (por ejemplo, la cepa que no expresa fosfocetolasa) debido a la observancia de mayor productividad específica, rendimiento, CPI y/o título de amorfadieno o farneseno en las cepas que expresan el polipéptido de fosfocetolasa . (iv) Referencias Newman, J.D., arshal, J.L., Chang, M.C.Y., Nowroozi, F., Paradise, E.M., Pitera, D.J., Newman, K.L., Keasling, J.D., 2006. High-level production of amorpha-4 , 11-diene in a two-phase partitioning bioreactor of metabolically engineered E. coli. Biotechnol . Bioeng.95 , 684-691.
Martin, V.J., Pitera, D.J., Withers, S.T., Newman, J.D., Keasling, J.D.,2003. Engineering a mevalonate pathway in E. coli for production of terpenoids . Nat . Biotechnol. 21, 796-802.
Ejemplo 12. Producción de mevalonato (MVA) en células hospederas recombinantes que expresan fosfocetolasa a escala de 15 1 La producción de mevalonato se evaluó en E. coli que expresa un gen heterólogo que codifica un polipéptido de fosfocetolasa así como genes a partir de la ruta de mevalonato y se cultivó en cultivo semicontinuo a escala de 15 1.
Una cepa productora de MVA SHG0863 (CMP1053 -HMB GI1.2gltA attB ldhA, pTrcHis2B, pCLPtrcUpperEfaecalis) se usó en un proceso convencional de producción de MVA. Los indicadores de rendimiento (productividad de MVA y rendimiento de MVA en glucosa) se comparan aquí con una cepa experimental SHG0864 (CMP1057-HMB GI1.2gltA attB ldhA, pTrcPKL_Lreuteri , pCLPtrcUpperEfaecalis) sometida a las mismas condiciones para determinar la mejoría en el rendimiento atribuible a la expresión del polipéptido de fosfocetolasa .
Métodos .
Receta del medio (por litro de medio de fermentación) : K2HP04 7.5 g, MgS04 * 7H20 2 g, monohidrato de ácido cítrico 2 g, citrato de amonio férrico 0.3 g, extracto de levadura 0.5 g, ácido sulfúrico al 50% 1.6 mi, solución de metales traza modificada 1000X 1 mi. Todos los componentes se agregaron junto y se disolvieron en Di H20. Esta solución se esterilizó con calor (123°C durante 20 minutos) . El pH se ajustó hasta 7.0 con hidróxido de amonio (28%) y q.s. hasta volumen. Se agregó glucosa 10 g, solución de vitaminas 8 mi y antibióticos después de la esterilización y ajuste de pH.
Solución de metales traza modificada 1000X (por litro) : ácidos cítricos * H20 40 g, MnS04 * H20 30 g, NaCl 10 g, FeS04 * 7H20 1 g, CoCl2 * 6H20 1 g, ZnSO * 7H20 1 g, CuS04 * 5H20 100 mg, H3B03 100 mg, NaMo04 * 2H20 100 mg . Cada componente se disolvió uno a la vez en Di H20, el pH se ajustó hasta 3.0 con HCl/NaOH y, después, la solución se llevó hasta volumen y se esterilizó con un filtro de 0.22 micrones.
Solución de vitaminas (por litro) : Hidrocloruro de tiamina 1.0 g, D- (+) -biotina 1.0 g, ácido nicotínico 1.0 g, clorhidrato de piridoxina 4.0 g. Cada componente se disolvió uno a la vez en Di H20, el pH se ajustó hasta 3.0 con HCl/NaOH y, después, la solución se llevó hasta volumen y se esterilizó con un filtro de 0.22 micrones.
Solución de suministro (por kilogramo) : glucosa 0.590 kg. Di H20 0.393 kg, K2HP04 7.4 g y 100% Foamblast 882 8.9 g. Todos los componentes se mezclaron y se esterilizaron en autoclave.
Solución de sales macro (por litro) : MgS04 * 7H20 296 g, monohidrato de ácido cítrico 296 g, citrato de amonio férrico 49.6 g. Todos los componentes se disolvieron en agua, se llevaron hasta volumen y se esterilizaron con un filtro de 0.22 micrones. Se agrega 16.8 mis directamente en el medio del depósito antes de la esterilización, sin ninguna adición adicional.
Este experimento se llevó a cabo para monitorear la formación de mevalonato a partir de glucosa al pH de fermentación deseado de 7.0 y temperatura de 34 °C. Un vial congelado de la cepa de E. coli se descongeló y se inoculó en un matraz con medio de triptona-extracto de levadura y los antibióticos adecuados. Después de que el inoculo creció hasta la densidad óptica de 1.0, determinada a 550 nm (OD550) , se usó 500 mi para inocular un biorreactor de 15 1 y llevar el volumen de depósito inicial hasta 5 1.
El medio discontinuo tenía glucosa en lotes a 9.7 g/1.
La iniciación se logró al agregar isopropil-beta-D-1-tiogalactopiranosida (IPTG) . Se agregó una dosis de IPTG en el depósito para llevar la concentración hasta 250 uM cuando las células estaban en una OD550 de 6. Se agregó una segunda dosis de IPTG en el depósito para llevar la concentración hasta 500 uM cuando las células estaban en una OD550 de 100. Una vez que el cultivo consumiera la glucosa, lo cual se indicó con un aumento del pH, se suministró la solución de suministro de glucosa para satisfacer las demandas metabólicas a velocidades menores o iguales que 10 g/min. La fermentación se llevó a cabo durante el tiempo suficiente para determinar el rendimiento máximo de masa de mevalonato en glucosa, un total de 48 horas de tiempo de fermentación transcurrido.
Análisis .
La concentración de mevalonato en el caldo de cultivo de agente termentador se determinó en muestras de caldo de cultivo tomadas a intervalos de 4 horas por un análisis por HPLC. La concentración de mevalonato en muestras de caldo de cultivo se determinó por comparación de la respuesta del índice de refracción contra una curva de calibración generada previamente .
Información de la HPLC Sistema: aters Alliance 2695 Columna: BioRad - columna de exclusión de iones Aminex HPX-87H 300 mm x 7.8 mm catálogo núm. 125-0140 Temperatura de la columna: 50 °C Columna protectora: BioRad - rellenado de catión H Microguard 30 mm x 4.6 mm catálogo núm. 125-0129 Regulador en uso: H2S04 0.01 N Velocidad de flujo del regulador en uso: 0.6 mi / min Presión aproximada en uso: -7.5-8.2 MPa (-1100-1200 psi) Volumen de inyección: 20 microlitros Detector: índice de refracción (Knauer K-2301) Tiempo de ejecución: 26 minutos Resultados .
La fermentación con la cepa que expresa fosfocetolasa (CMP1057) tuvo un rendimiento de mevalonato en glucosa mayor que la cepa control de plásmido vacío (CMP1053) . Ver las Figuras 11-13 y la Tabla 3 a continuación. Adicionalmente , el caldo de fermentación con la cepa que expresa fosfocetolasa (CMP1057) tuvo una acumulación de acetato menor en el caldo de fermentación en comparación con la cepa control de plásmido vacío (CMP1053) . Ver la Figura 1 .
Tabla 3. Indicadores de la productividad de MVA Ejemplo 13. Producción de isopreno por Saccharomyces cerevisiae que expresa fosfocetolasa Las variaciones de los constructos genéticos descritos anteriormente para la expresión de isopreno sintasa, la ruta superior del MVA, la ruta inferior del MVA y una fosfocetolasa se prepararon con el uso de un sistema de expresión de levadura de Life Technologies (que incluye S. cerevisiae competente, silvestre (I VScl (catálogo número C810-00)) y el plásmido pYES2/CT (catálogo número V8251-20) .
Los genes que codifican la isopreno sintasa, la ruta superior del MVA, la ruta inferior del MVA y una fosfocetolasa se subclonan, primero, en los vectores pYES2/CT. Después, los plásmidos se propagan en células de E. coli. Después, el S. cerevisiae (INVScl) se transforman con el ADN de plásmidos purificado. Las cepas de levadura que contienen el plásmido se seleccionan y se mantienen en medio mínimo SC con glucosa al 2% suplementado con el marcador selectivo indicado. Las colonias aisladas que contienen el plásmido se seleccionan para experimentación adicional.
Se determina la productividad específica de isopreno a partir de las cepas de levadura modificadas genéticamente. Para inducir la expresión de los genes codificados por el plásmido, los cultivos se cultivan durante la noche en medio mínimo SC líquido suplementado con el marcador selectivo. Después, los cultivos se diluyen hasta una OD50o de aproximadamente 0.2 y se cultivan durante 2-3 horas. Una muestra de 100 µ? del caldo de cultivo se incuba en un vial con espacio libre de 2 mi a 34°C durante 30 minutos, seguido por eliminación por calor a 70°C durante 12 minutos. Se determina las concentraciones de isopreno en el espacio vacío, por ejemplo, por el detector de ionización de llama acoplado al cromatógrafo de gases (modelo G1562A, Agilent Technologies) (Mergen et al., LC GC North America, 28(7) :540-543, 2010) .
Ejemplo 14. Clonación de la enzima fosfocetolasa a partir de diversas bacterias ADN cromosómico de la cepa ATCC15697, subespecie Bifidobacterium longum infantis se obtuvo de ATCC (Manassas, VA) . El gen que codifica PKL de B . longhum (sec. con núm. de ident.:3) se amplificó por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) a partir del ADN cromosómico con el uso de iniciadores CMP283: 5 ' -ctgtatTCATGAcgagtcctgttattggcacc-3 ' (sec. con núm. de ident.:42) y CMP284: 5'-ctctatGAATTCTCACTCGTTGTCGCCAGCG-3 ' (sec. con núm. de ident.:43) y la polimerasa Herculase de conformidad con el protocolo del fabricante (Life Technologies, Carlsbad, CA) . El producto de PCR se digirió con las enzimas de restricción EcoRI y BspHI antes de la purificación. Después de la purificación, el fragmento de aproximadamente 2500 pb se ensambló en pTrcHis2B digerido con EcoRl/NcoI (Invitrogen, Carlsbad, CA) con el uso del kit de clonación integrada GENEART (Invitrogen, Carlsbad, CA) para formar el plásmido pCMP1090 (sec. con núm. de ident.:15, Figura 6).
El ADN cromosómico de la cepa F275 de Lactobacillus reuteri se obtuvo de ATCC (núm. de la ATCC 23272D-5, ATCC, Manassas, VA) . El gen que codifica PKL de Lactobacillus reuteri (sec. con núm. de ident . :1) se amplificó con el uso de iniciadores CMP3 : 5'-taaggaggaataaacATGGCAGTAGATTACGATTCCAAG-3 ' (sec. con núm. de ident.: 44) y CMP335: 5'-ttctagaaagcttcgttacttaagacccttccaagtccag-3 ' (sec. con núm. de ident.: 45), 100 ng de ADN como plantilla y la polimerasa Herculase II Fusión según las indicaciones del fabricante (Agilent, Santa Clara, CA) . Después de la purificación, el fragmento de 2442 pb se ensambló en pTrcHis2B digerido con Ncol/EcoRI (Invitrogen, Carlsbad, CA) con el uso del kit de clonación integrada GENEART (Invitrogen, Carlsbad, CA) para formar el plásmido pC P1029 (sec. con núm. de ident.:16, Figura 7) .
La secuencia de aminoácidos de PKL de Enterococcus gallinarum se obtuvo del GeneBank y se procesó en el programa de optimización GeneArt para una expresión optimizada en E. coli. Se agregó dos pares de bases frente al gen de PKL para formar un sitio Ncol y un sitio SacI se insertó justo después del codón de terminación. El gen de PKL sintetizado se clonó en plásmido de clonación resistente a canamicina GeneArt. El gen de PKL de E. gallinarum (sec. con núm. de ident.:17) se subclonó, después, en un vector de pTrcHis2B digerido con BspHI/SacI (Life Technologies, Carlsbad, CA) para formar el plásmido pCMP1321.
El ADN cromosómico de la cepa ATCC27893, Nostoc punctiforme se obtuvo de ATCC (Manassas, VA) . El gen que codifica PKL de N. punctiforme (sec. con núm. de ident.:18) se amplificó por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) desde el ADN cromosómico con el uso de los iniciadores NostocpTrcHis2BF : 5 ' -taaggaggaataaaccatgacattagccagtcctctacaaac-3 ' (sec. con núm. de ident.:46) y NostocpTrcHis2BR : 5'- TTCTAGAAAGCTTCGTTAATAGGGCCACTTCCAGTCACG-3 ' (sec. con núm. de ident.:47) y la polimerasa Herculase de conformidad con el protocolo del fabricante (Life Technologies, Carlsbad, CA) . El producto de PCR se digirió con las enzimas de restricción EcoRI y BspHI antes de la purificación. Después de la purificación, el fragmento de aproximadamente 2500 pb se ensambló en pTrcHis2B digerido con EcoRl/NcoI (Invitrogen, Carlsbad, CA) con el uso del kit de clonación integrada GENEART (Invitrogen, Carlsbad, CA) para formar el plásmido pCMP1305.
El ADN cromosómico de la cepa ATCC BAA-98, Rhodopseudomonas palustris se obtuvo de ATCC (Manassas, VA) . El gen que codifica PKL de R. palustris (sec. con núm. de ident.:19) se amplificó por reacción en cadena de la polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés) desde el ADN cromosómico con el uso de los iniciadores RpalpTrcHis2BF : 5'-taaggaggaataaaccatgtccgacgtgttgtccaacgatc-3 ' (sec. con núm. de ident.:48) y RpalpTrcHis2BR : 5 ' TTCTAGAAAGCTTCGTCAGGCCGACCAGCGCCAG-3 ' (sec. con núm. de ident.:49) y la polimerasa Herculase de conformidad con el protocolo del fabricante (Life Technologies, Carlsbad, CA) . El producto de PCR se digirió con las enzimas de restricción EcoRI y BspHI antes de la purificación. Después de la purificación, el fragmento de aproximadamente 2500 pb se ensambló en pTrcHis2B digerido con EcoRI/NcoI (Invitrogen, Carlsbad, CA) con el uso del kit de clonación integrada GENEART (Invitrogen, Carlsbad, CA) para formar el plásmido pCMP1306.
La secuencia de aminoácidos de PKL de Pantoea sp . se obtuvo del GeneBank y se procesó en un programa de optimización GeneArt para una expresión optimizada en E. coli. Se agregó dos pares de bases frente al gen de PKL para formar un sitio Ncol y un sitio SacI se insertó justo después del codón de terminación. El gen de PKL sintetizado se clonó en plásmido de clonación resistente a canamicina GeneArt. El gen de PKL de Pantoea sp. (sec. con núm. de ident.:20) se subclonó, después, en un vector de pTrcHis2B digerido con BspHl/SacI (Life Technologies, Carlsbad, CA) para formar el plásmido pCMP1324.
La secuencia de aminoácidos de PKL de Mucilaginibacter paludis se obtuvo del GeneBank y se procesó en el programa de optimización GeneArt para una expresión optimizada en E. coli. Se agregó dos pares de bases frente al gen de PKL para formar un sitio Ncol y un sitio SacI se insertó justo después del codón de terminación. El gen de PKL sintetizado se clonó en plásmido de clonación resistente a canamicina GeneArt. El gen de PKL de M. paludis (sec. con núm. de ident.:21) se subclonó, después, en un vector de pTrcHis2B digerido con BspHI/SacI (Life Technologies, Carlsbad, CA) para formar el plásmido pCMP1323.
La secuencia de aminoácidos de PKL de Thermobífida fusca se obtuvo del GeneBank y se procesó en el programa de optimización GeneArt para una expresión optimizada en E. coli. Se agregó dos pares de bases frente al gen de PKL para formar un sitio Ncol y un sitio SacI se insertó justo después del codón de terminación. El gen de PKL sintetizado se clonó en plásmido de clonación resistente a canamicina GeneArt. El gen de PKL de T. fusca (sec. con núm. de ident.:22) se subclonó, después, en un vector de pTrcHis2B digerido con BspHl/SacI (Life Technologies, Carlsbad, CA) para formar el plásmido pCMP1326.
La secuencia de aminoácidos de PKL de Bfidobacterium breve se obtuvo del GeneBank y se procesó en el programa de optimización GeneArt para una expresión optimizada en E. coli. Se agregó dos pares de bases frente al gen de PKL para formar un sitio Ncol y un sitio SacI se insertó justo después del codón de terminación. El gen de PKL sintetizado se clonó en plásmido de clonación resistente a canamicina GeneArt. El gen de PKL de B . breve (sec. con núm. de ident.:23) se subclonó, después, en un vector de pTrcHis2B digerido con BspHl/SacI (Life Technologies, Carlsbad, CA) para formar el plásmido pCMP1322.
La secuencia de aminoácidos de PKL de Rahnella aquatilis se obtuvo del GeneBank y se procesó en el programa de optimización GeneArt para una expresión optimizada en E. coli. Se agregó dos pares de bases frente al gen de PKL para formar un sitio Ncol y un sitio SacI se insertó justo después del codón de terminación. El gen de PKL sintetizado se clonó en plásmido de clonación resistente a canamicina GeneArt. El gen de PKL de R. aquatilis (sec. con núm. de ident.:24) se subclonó, después, en un vector de pTrcHis2B digerido con BspHl/SacI (Life Technologies, Carlsbad, CA) para formar el plásmido pCMP1325.
La secuencia de aminoácidos de PKL de Bifidobacterium animalis se obtuvo del GeneBank y se procesó en el programa de optimización GeneArt para una expresión optimizada en E. coli. Se agregó dos pares de bases frente al gen de PKL para formar un sitio Ncol y un sitio SacI se insertó justo después del codón de terminación. El gen de PKL sintetizado se clonó en plásmido de clonación resistente a canamicina GeneArt. El gen de PKL de B. animalis (sec. con núm. de ident.:25) se subclonó, después, en un vector de pTrcHis2B digerido con BspHI/SacI (Life Technologies, Carlsbad, CA) para formar el plásmido pCMP1320.
La secuencia de aminoácidos de PKL de Gardnerella vaginalis se obtuvo del GeneBank y se procesó en el programa de optimización GeneArt para una expresión optimizada en E. coli. Se agregó dos pares de bases frente al gen de PKL para formar un sitio Ncol y un sitio SacI se insertó justo después del codón de terminación. El gen de PKL sintetizado se clonó en plásmido de clonación resistente a canamicina GeneArt. El gen de PKL de G. vaginalis (sec. con núm. de ident.:26) se subclonó, después, en un vector de pTrcHis2B digerido con BspHl/SacI (Life Technologies, Carlsbad, CA) para formar el plásmido pCMP1309.
La secuencia de aminoácidos de PKL de Streptomyces avermitilis se obtuvo del GeneBank y se procesó en el programa de optimización GeneArt para una expresión optimizada en E. coli. Se agregó dos pares de bases frente al gen de PKL para formar un sitio Ncol y un sitio SacI se insertó justo después del codón de terminación. El gen de PKL sintetizado se clonó en plásmido de clonación resistente a canamicina GeneArt. El gen de PKL de S. avermitilis (sec. con núm. de ident.:27) se subclonó, después, en un vector de pTrcHis2B digerido con BspHl/SacI (Life Technologies, Carlsbad, CA) para formar el plásmido pEWL1362.
El ADN cromosómico de la cepa ATCC BAA-98, Clostridium acetobutylicum se obtuvo de ATCC (Manassas, VA) . El gen que codifica PKL de Clostridium acetobutylicum (sec. con núm. de ident.:28) se amplificó por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) desde el ADN cromosómico con el uso de los iniciadores CacetpTrcHisBF : 5 ' -taaggaggaataaaccatgcaaagtataataggaaaacataaggatgaagg-3 ' (sec . con núm. de ident.:50) y CacetpTrcHisBR: 5'- ttctagaaagcttcgttatacatgccactgccaattagttatttc-3 ' (sec. con núm. de ident.:51) y la polimerasa Herculase de conformidad con el protocolo del fabricante (Life Technologies, Carlsbad, CA) . El producto de PCR se digirió con las enzimas de restricción EcoRI y BspHI antes de la purificación. Después de la purificación, el fragmento de aproximadamente 2500 pb se ensambló en pTrcHis2B digerido con EcoRI/Ncol (Invitrogen, Carlsbad, CA) con el uso del kit de clonación integrada GENEART (Invitrogen, Carlsbad, CA) para formar el plásmido pCMP1364.
La secuencia de aminoácidos de PKL de Lactobacillus paraplantarum se obtuvo del GeneBank y Jeong et al., (J. Microbiol. Biotechnol . 2007, 17:822-829) y se procesó en el programa de optimización GeneArt para una expresión optimizada en E. coli. El gen de PKL sintetizado se clonó en plásmido de clonación resistente a canamicina GeneArt. Después, el gen de PKL de L. paraplantarum (sec. con núm. de ident.:29) se amplificó con el uso de los iniciadores SML_NcoI_PhosphokLplantF (taaggaggaataaacatgaccaccgattatagcagtcc) y v2SML_EcoRI_PhosphokLplantR (ttctagaaagcttcgTTA TTT CAG ACC TTT CCA CTG CC) y Herculase (Life Technologies, Carlsbad, CA) como polimerasa de conformidad con el protocolo del fabricante. Después, las PCR obtenidas se ensamblaron con un plásmido pTrcHis2B digerido con EcoRI/NcoI (Life Technologies, Carlsbad, CA) con el uso del kit de clonación integrada y ensamblaje de GeneArt® (Life Technologies, Carlsbad, CA) para formar el plásmido pCMP1184.
Ejemplo 15. Construcción de las cepas CMP1183, CMP1328, C P 1366, CMP1182, C P1308, C P1309, CMP1331, CMP1330, CMP1333, CMP1329, CMP1184 y C P1332.
Las cepas que expresan PKL se construyeron al transformar la cepa CMP1133 (BL21, Apgl PL .2mKKDyl , GI1.2gltA, yhfSFRTPyddVIspAyhfS, thiFRTtruncIspA) y al seleccionar las colonias en placas con Luria-Bertani que contienen 20 g/ml de canamicina. El marcador de canamicina se eliminó con el uso del protocolo recomendado por el fabricante (Gene Bridges, Heidelberg, Alemania) para formar las cepas indicadas (Tabla 4) .
Tabla 4. Descripción de cepas de E. coli Ejemplo 16. Comparación de expresión, solubilidad y actividad enzimática de fosfocetolasas aisladas de diversas bacterias.
Las cepas que expresan pTrcPKL B. longum (cepa CMP1183) , pTrcPKL E. gallinarum (cepa CMP1328) , pTrcPKL C. acetobutylicum (cepa CMP1328) , pTrcPKL L. reuteri (cepa CMP1182) , pTrcPKL N. punctiforme (cepa CMP1308) , pTrcPKL R. palustris (CMP1309) , pTrcPKL Pantaoea (CMP1331) , pTrcPKL M. paludis (CMP1330) y pTrcPKL T. fusca (CMP1333) se cultivaron en medio LB, inducido a OD6oo ~ 0.5 con 200 µ? de IPTG y se indujo durante 4 horas a una temperatura de 30°C o 34°C. Las células se recolectaron al centrifugar 4 mi de caldo de cultivo a 3000 rpm durante 10 minutos. Los comprimidos celulares se resuspendieron en 2 mi de MES 50 m , NaCl 50 mM pH de 6.0 con ADNasa al 0.1% y AEBSF 0.5 mM. La suspensión celular se lisó con el uso de una prensa francesa de células a 96.5 MPa (14,000 psi) (American Instrument Company) . Después, el lisado se centrifugó a 15,000 RPM durante 10 minutos a 4°C en una centrifugadora Eppendorf 5804R. El sobrenadante y el comprimido se separaron. Los comprimidos se resuspendieron en la lisis del regulador de MES 50 mM, NaCl 50 mM con un pH de 6.0. Las muestras de sobrenadante y comprimidos se analizaron por electroforesis en gel SDS-PAGE al 4-12%. La solubilidad se evaluó por comparación de fracciones de fosfocetolasa soluble y en comprimidos (insoluble) .
Los resultados mostraron que la PKL de E. longum, PKL de E. gallinarum, PKL de C. acetobutylicum, PKL de L. reuteri, PKL de N. punctiforme, PKL de R. palustris y PKL de T. fusca tenían una solubilidad mayor que 70% a una temperatura de 30°C. La solubilidad de la PKL de Pantaoea y la PKL de M. paludis incrementó hasta aproximadamente 50% a una temperatura de 34 °C (Tabla 5) .
Tabla 5. Resultados del análisis bioquímico Ejemplo 17. Análisis cinético de fosfocetolasa aislada de Bifidobacterium longum y de Enterococcus gallinarum.
La fosfocetolasa (PKL) de B. longum se purificó para usar en experimentos de cinética posteriores. La PKL de B. longum se expresó en una cepa de BL21 (CMP1183) de un plásmido pTrc His2B. Las células se cultivaron en medio de Luria-Bertani con 50 yg/ml de carbenicilina a 34 °C antes de la inducción. Después de la inducción con 200 µ? de IPTG, los cultivos se trasladaron a un agitador a temperatura ambiente durante 5 horas. Las células se recolectaron por centrifugación a 10,000 rpm durante 10 min, 4°C. Los comprimidos celulares se almacenaron a -80°C antes de la purificación. Para la purificación, los comprimidos celulares de PKL de B. longu se resuspendieron en HEPES 20 mM, pH de 7.0, NaCl 60 mM, AEBSF 0.5 mM, MgCl2 0.5 mM, 0.1 mg/ml de DNasal . Las células se lisaron por repetidos cambios de cultivo a través de la prensa francesa de células y se aclararon por ultracentrifugación a 50,000 rpm durante 30 minutos. El lisado aclarado que contiene PKL de B . longum se colocó inicialmente en una columna MonoQ 10/100GL (GE Healthcare) se equilibró en Tris 50 mM, NaCl 50 mM, pH de 7 y se eluyó con un gradiente hasta Tris 50 mM, NaCl 1 M, pH de 7. Las fracciones resultantes se analizaron por SDS-PAGE. La PKL de B. longum se purificó adicionalmente con el uso de Superdex 200 10/300GL equilibrado en Tris 50 mM, NaCl 50 mM, pH de 7 y MonoQ 10/300 GL a un pH de 6.0 con el uso de un gradiente de regulador desde MES 50 mM, NaCl 50 mM hasta NaCl 1 M. La PKL de B. longum se cuantificó con el uso de A280 y un coeficiente de extinción molar determinado de 149550 (determinado por VectorNTI) y, además, por el método de densitometría de gel. La purificación con el uso de cromatografía de intercambio de iones y de filtración de gel produjo > 95% de homogeneidad evidente de la PKL. Las fracciones que contienen PKL de B. longum se agruparon para usar en la evaluación de la actividad de la PKL con el uso del ensayo de hidroxamato férrico.
La fosfocetolasa (PKL) a partir de E. gallinarum se purificó para usar en experimentos de cinética posteriores. La PKL a partir de E. gallinarum se expresó en una cepa BL21 (CMP1328) de un plásmido pTrc His2B. Las células se cultivaron en medio de LB con 50 g/ml de carbenocilina a 37°C antes de la inducción. Después de la inducción con 200 µ? de IPTG, los cultivos se trasladaron a un agitador a 30°C durante 5 horas. Las células se recolectaron por centrifugación a 10,000 rpm durante 10 min, 4°C. Los comprimidos celulares se almacenaron a -80°C antes de la purificación. Para la purificación, los comprimidos celulares de PKL de E. gallinarum se resuspendieron en MES 50 mM, pH de 6.0, NaCl 50 mM, AEBSF 0.5 mM, 0.1 mg/ml de DNasal . Las células se lisaron por repetidos cambios de cultivo a través de una prensa francesa y se aclararon por ultracentrifugación a 50,000 rpm durante 60 min. El lisado aclarado que contiene PKL de E. gallinarum se colocó en una columna DEAE HiTrap FF equilibrada en MES 50 mM, NaCl 50 mM, pH de 6 y se eluyó con un gradiente hasta MES 50 mM, NaCl 1 M, pH de 6. Las fracciones resultantes se analizaron por SDS-PAGE. La facciones que contienen PKL se agruparon y se desalaron con el uso de una columna de desalación G25 en MES 50 mM, NaCl 50 mM, pH de 6.0. La purificación adicional se logró con el uso de una columna MonoQ 10/100 GL equilibrada en MES 50 mM, NaCl 50 mM, pH de 6 con un gradiente de sal hasta NaCl 1 M. Las fracciones que contienen PKL se agruparon y se analizaron por SDS PAGE, la cuantificación se alcanzó con el uso de A280 un coeficiente de extinción molar de 136980 determinado por Vector NTI . La purificación con el uso de cromatografía de intercambio de iones y de filtración en gel produjo >95% de homogeneidad evidente de la PKL. Las fracciones que contienen PKL de E. gallinarum se agruparon para usar para evaluar la actividad de PKL con el uso del ensayo de hidroxamato férrico .
Las fracciones agrupadas que contienen PKL ya sea de E. longum o de E. gallinarum se analizaron para evaluar la actividad de PKL con el uso del ensayo de hidroxamato férrico. Las actividades catalíticas de las PKL se determinaron con el uso de una versión reducida del ensayo de hidroxamato descrito en L. Meile et. al., Bacteriol . , 2001, 183:2929-2936 y Frey et . al., Bioorganic Chem. , 2008, 36:121-127, que se incorporan en la presente descripción como referencia en su totalidad. Los ensayos se realizaron en un formato de placa de 96 pocilios (Costar catálogo núm. 9017) , a 37°C. Cada reacción de 300 µ? contenía TPP 1 mM, fosfato potásico 10 mM pH de 6.0, MES 50 mM pH de 6, MgC12 10 mM, F6P 5 mM y PKL a una concentración de 250 nM. Los momentos específicos se tomaron a varios intervalos. Para detener la reacción se mezcló 60 µ? de la mezcla de reacción con 60 µ? de hidroxilamina 2 M a un pH de 6.5, se incubaron durante ío min a temperatura ambiente. La adición de 40 µ? de TCA al 15%, 40 µ? de HCl 4 M y 40 µ? de FeCl3 al 5% en HCl 0.1 M se usó para precipitar la proteína y permitir la detección de AcP. Después, las muestras se centrifugaron a 3000 rpm por 10 min. Una muestra de 200 µ? de sobrenadante se trasladó a una placa de microtitulación y se usó un lector de placas para determinar A505. Una curva estándar de AcP en el intervalo de 12.5 y 0.2 mM se generó para la cuantificación. La constante de Michaelis, 2¾ para PKL de B. longum y E. gallinarum se determinó a una concentración de saturación de Pi (20 mM) y con concentraciones de F6P en el intervalo de 0.3 mM a 20 mM. La reacción se inició con la adición de 250 nM (7 g) de B. longum purificado o 500 nM (4 ug) de PKL de E. gallinarum. Los cambios de absorbancia asociados con la cantidad de AcP formada se monitorearon a 505 nm y se representaron en comparación con el tiempo para determinar la velocidad de las reacciones de PKL.
Se evaluó los parámetros de cinética para PKL de B. longum y de E. gallinarum en comparación con F6P a concentraciones de saturación de Pi y para PKL de E. gallinarum en comparación con X5P a concentraciones de saturación de Pi . Las velocidades de reacción se adecuaron a la ecuación de Michaelis-Menten para calcular las constantes cinéticas (Tabla 6, Figura 43 y Figura 44) . La PKL de B. longum tuvo una K¡»¡ mayor para el sustrato de F6P de 21.16 mM, en donde como PKL de E. gallinarum tuvo una KM de 2.86 mM para el sustrato de F6P y de 5.81 mM para el sustrato de X5P. La kcat de PKL de B. longum fue 16.6 s"1 y la kcat de PKL de E. gallinarum fue 1.4 s-1 en comparación con F6P y 4.4 s"1 en comparación con X5P.
Tabla 6. Resumen de parámetros de cinética Ejemplo 18 La fosfocetolasa aislada de Bifidobacterium longum tiene actividad catalítica de sedoheptulosa-7-fosfato .
Las células que expresan fructosa 6-fosfato (control positivo) , ribosa 5-fosfato (control negativo) o sedoheptulosa 7-fosfato solo o con fosfocetolasa de B. longum se cultivaron y se analizaron para evaluar la producción de metabolitos por detección de LC-MS.
El análisis de detección de metabolitos por LC-MS indicó que en células que únicamente expresan fructosa 6-fosfato (F6P) , ribosa 5-fosfato (R5P) o sedoheptulosa 7-fosfato (S7P) , los metabolitos F6P , R5P o S7P, respectivamente, se detectaron principalmente (Figura 45) .
Las células que coexpresan R5P con fosfocetolasa de B. longum mostraron que principalmente se retuvo como R5P con cierta producción de AcP. En contraste, las células que coexpresan F6P con fosfocetolasa de B. longum mostraron que la detección de F6P desapareció y se detectó la formación de AcP (Figura 45) . De la misma manera, las células que coexpresan S7P con fosfocetolasa de B. longum mostraron que desapareció la detección de S7P y se detectó la formación de AcP (Figura 45) .
Ejemplo 19. Producción de mevalonato (MVA) en células hospederas recombinantes que expresan fosfocetolasa a pequeña escala Las cepas de E. coli productoras de mevalonato (MVA) se construyeron al expresar fosfocetolasa a partir de Bifidobacterium longum, Enterococcus gallinarum, Clostridium acetubutylicum, Nostoc, Rhodopseudomonas palustris, Pantoea o Thermobifida fusca además de los genes que codifican tiolasa, HMG-CoA sintasa y HMG-CoA reductasa (Tabla 7) . Una cepa productora de MVA que no expresó una fosfocetolasa se usó como control (Tabla 7) . Las cepas que expresan fosfocetolasa se analizaron para evaluar la expresión de fosfocetolasa y el rendimiento de ácido mevalónico cuando se cultivan en glucosa en comparación con una cepa control que no expresa fosfocetolasa en un experimento a pequeña escala.
Tabla 7. Cepas productoras de MVA que expresan fosfocetolasa (i) Materiales Receta del medio TM3 modificado sin extracto de levadura y MgS04 (por litro de medio de fermentación) : K2HP04 13.6 g, KH2P04 13.6 g, monohidrato de ácido cítrico 2 g, citrato de amonio férrico 0.3 g, (NH4)2S04 3.2 g, solución de metales traza 1000X 1 mi. Todos los componentes se agregan y se disuelven en diH20. El pH se ajusta hasta 6.8 con hidróxido de amonio (30%) y se lleva hasta volumen. El medio se esterilizó con un filtro de 0.22 micrones. Se agrega glucosa 10.0 g y antibiótico después de ajustar el pH y de la esterilización.
Solución de metales traza modificada 1000X (por litro) : ácidos cítricos * H20 40 g, MnS04 * H20 30 g, NaCl 10 g, FeS04 * 7H20 1 g, CoCl2 * 6H20 1 g, ZnSO * 7H20 1 g, CuS04 * 5H20 100 mg, H3B03 100 mg, NaMo04 * 2H20 100 mg. Cada componente se disolvió uno a la vez en Di H20, el pH se ajustó hasta 3.0 con HCl/NaOH y, después, la solución se llevó hasta volumen y se esterilizó con un filtro de 0.22 micrones. (ii) Procedimiento experimental Medición del índice de crecimiento Tubos de agitación que contienen 3 mi de medio LB, con los antibióticos adecuados, se inocularon con soluciones base de cultivo de glicerol. Los cultivos se incubaron durante aproximadamente 15 horas a 30°C, 220 rpm. El medio TM3 suplementado se preparó al combinar medio TM3 (sin MgS04 y extracto de levadura) , glucosa al 1%, MgS04 8 mM, extracto de levadura al 0.02% y antibióticos adecuados. Dos mi de medio TM3 suplementado se inocularon en cada pocilio de un bloque estéril de 48 pocilios hasta una OD60o final de 0.2. Los bloques se sellaron con membranas Breathe Easier y se incubaron durante 2 horas a 34°C, 600 rpm. Después de 2 horas de crecimiento, se determinó la ODSOo en la placa de microtitulación y las células se indujeron con diversas concentraciones de IPTG. La lectura de la OD60o se tomó cada hora después de la inducción de IPTG durante 4 horas. Las mediciones de OD60o se realizaron con el uso de equipo SpectraMax Plusl90 (Molecular Devices) . Las células se cultivaron durante la noche y se determinó la OD60o · Medición de glucosa Las muestras de glucosa se recolectaron al centrifugar 300 µ? de cultivo celular en la placa de fondo cónico de 96 pocilios y se centrifugaron durante 10 min a 4°C, 3000 rpm. El sobrenadante se diluyó 10 veces en agua DI y la concentración de glucosa se determinó con el uso de un kit de ensayo de glucosa oxidasa adquirido de Pointe Scientific.
Medición de mevalonato Las muestras de mevalonato se procesaron al combinar e incubar 34 µ? de ácido sulfúrico al 10% y 300 ul de cultivo celular en hielo durante 10 min. Después de 10 minutos a 4°C, la mezcla se centrifugó durante 10 min a 4°C, 3000 rpm. Se recolectó 250 µ? de sobrenadante en la placa de fondo cónico de 96 pocilios y se selló con sellador de placas Zone-Free™ Films para la medición de mevalonato en HPLC. El rendimiento de mevalonato se determinó al calcular la cantidad de mevalonato total producida para la cantidad de glucosa usada.
Análisis de expresión proteica Una muestra de 50 µ? de cultivo celular en caldo completo de 4 horas después de la inducción se llevó a ebullición durante 5 minutos a 95°C con 50 µ? de regulador de muestras 2X SDS y 10 µ? de la muestra se colocaron en geles Bis-Tris al 4-12% para el análisis de expresión. En cada gel se agregó enzima fosfocetolasa purificada y estándar pretinción. Los geles se tiñeron con tinción SimplyBlue Coomassie® G-250 y se destiñeron con agua desionizada.
Análisis de expresión y solubilidad de fosfocetolasa Las células se recolectaron al centrifugar 4 mi de caldo de cultivo a 3000 rpm durante 10 minutos. Los comprimidos celulares se resuspendieron en 2 mi de Tris 100 mM, NaCl 100 mM con pH de 7.6 con ADNasa al 0.1% y AEBSF 0.5 mM. La suspensión celular se lisó con el uso de una prensa francesa de células a 96.5 MPa (14,000 psi) (American Instrument Company) . Después, el lisado se centrifugó a 15,000 RPM durante 10 minutos a 4°C en una centrifugadora Eppendorf 5804R. El sobrenadante y el comprimido se separaron. Los comprimidos se resuspendieron en el regulador de lisis. Se preparó muestras de gel para el comprimido y el sobrenadante para realizar la electroforesis . Con el uso del sistema de transferencia en seco iBlot®, las proteínas se trasladaron a una membrana de nitrocelulosa seguido por inmunodetección con antisuero de fosfocetolasa de Bifido longum de conejo como anticuerpo primario a una dilución de 1:10,000 e IgG anticonejo Alexa Fluor 488 de cabra como anticuerpo de detección a 2 µg/ml de concentración de acuerdo con el protocolo de los fabricantes. Se detectó bandas de proteína con el uso de un equipo para captación de imágenes moleculares Storm 860 (Molecular Dynamics) con el uso de la pantalla del escáner azul fluorescente y la concentración proteica se calculó con el uso del programa ImageQuant . (iii) Resultados El análisis de MVA producido a partir de cepas de E. coli modificadas genéticamente que expresan PKL de B . longum (EWL1319) , PKL de E. gallinarum (EWL1341) , PKL de Nostoc (EWL1344), PKL de R. palustris (EWL1347) , PKL de Pantoea (EWL1350) o PKL de T. fusca (EWL1353) demostró que un rendimiento de mevalonato cada vez mayor se correlacionaba con una inducción de IPTG cada vez mayor (Figura 46) . El análisis de expresión proteica en lisados celulares completos preparados de cepas modificadas genéticamente que expresan PKL mostró que la expresión proteica fue inducida por IPTG (Figura 47A-D) . Estos descubrimientos muestran que el rendimiento de mevalonato incrementado fue resultado de una expresión proteica de fosfocetolasa cada vez mayor. El rendimiento de mevalonato incrementado se observó, además, en las cepas que expresan PKL de B . longum (EWL1319) , PKL de E. gallinarum (EWL1341) o PKL de C. ace oJbutylicum (EWL1359) en comparación con la cepa control productora de MVA que no expresa PKL (CHL875) . El rendimiento de mevalonato incrementado en las cepas que expresan PKL de B. longum (Figura 48A) , PKL de gallinarum (Figura 49A) o PKL de C. acetobutylicum (Figura 50A) se correlacionó con la inducción de IPTG incrementada. El rendimiento máximo de mevalonato de PKL de B. longum, PKL de E. gallinarum y cepas de C. acetobutylicum que expresan fosfocetolasa demostró un rendimiento incrementado en comparación con el rendimiento máximo de mevalonato producido por la cepa control CHL875. El análisis de expresión proteica en los lisados celulares preparados a partir de cepas modificadas genéticamente que expresan PKL confirmó que la expresión de PKL de B. longum (Figuras 48B y C) , de PKL de gallinarum (Figura 49B) o de PKL de C. acetobutylicum (Figura 50B) fue inducida por IPTG. Otro análisis adicional del sobrenadante y la fracción comprimida aislados de cepas que expresan PKL de B . longum mostró que la fosfocetolasa estaba principalmente en la fracción soluble (Figura 48B) en comparación con la fracción insoluble (Figura 48C) . Estos resultados coinciden con la conclusión de que el rendimiento de mevalonato incrementado fue un resultado de la expresión de fosfocetolasa cada vez mayor.
Ejemplo 20. Producción de mevalonato (MVA) en células hospederas recombinantes que expresan fosfocetolasa a escala de 15 1 Las cepas productoras de mevalonato (MVA) que expresan fosfocetolasa a partir de Enterococcus gallinarum (cepa EWL1341) y Clostridium acetubutylicu (cepa EWL1359) se compararon con una cepa productora de MVA que no expresa fosfocetolasa (cepa CHL875) en un experimento a escala de 15 litros. El rendimiento acumulativo de MVA en glucosa, el rendimiento instantáneo en glucosa, la productividad volumétrica de MVA, la productividad específica de MVA y el índice de rendimiento celular (CPI) se determinaron y se analizaron. (i) Materiales Receta del medio (por litro de medio de fermentación) : K2HP04 7.5 g, MgS04 * 7H20 2 g, monohidrato de ácido cítrico 2 g, citrato de amonio férrico 0.3 g, extracto de levadura 0.5 g, ácido sulfúrico al 50% 1.6 mi, solución de metales traza modificada 1000X 1 mi. Todos los componentes se agregaron junto y se disolvieron en Di H20. Esta solución se esterilizó con calor (123°C durante 20 minutos) . El pH se ajustó hasta 7.0 con hidróxido de amonio (28%) y q.s. hasta volumen. Se agregó glucosa 10 g, solución de vitaminas 8 mi y antibióticos después de la esterilización y ajuste de pH.
Solución de metales traza modificada 1000X (por litro) : ácidos cítricos * H20 40 g, MnS04 * H20 30 g, NaCl 10 g, FeS04 * 7H20 1 g, CoCl2 * 6H20 1 g, ZnSO * 7H20 1 g, CuS04 * 5H20 100 mg, H3B03 100 mg, Na o04 * 2H20 100 mg. Cada componente se disolvió uno a la vez en Di H20, el pH se ajustó hasta 3.0 con HCl/NaOH y, después, la solución se llevó hasta volumen y se esterilizó con un filtro de 0.22 micrones.
Solución de vitaminas (por litro) : hidrocloruro de tiamina 1.0 g, D- (+ ) -biotina 1.0 g, ácido nicotínico 1.0 g, clorhidrato de piridoxina 4.0 g. Cada componente se disolvió uno a la vez en Di H20, el pH se ajustó hasta 3.0 con HCl/NaOH y, después, la solución se llevó hasta volumen y se esterilizó con un filtro de 0.22 micrones.
Solución de sales macro (por litro) : MgS04 * 7H20 296 g, monohidrato de ácido cítrico 296 g, citrato de amonio férrico 49.6 g. Todos los componentes se disolvieron en agua, se llevaron hasta volumen y se esterilizaron con un filtro de 0.22 micrones.
Solución de suministro (por kilogramo) : glucosa 0.590 kg, Di H20 0.393 kg, K2HP04 7.4 g y Foamblast 882 al 100% 8.9 g. Todos los componentes se mezclaron y se esterilizaron en autoclave. Después de esterilizar en autoclave la solución de suministro, se agregó suplementos de nutrientes en la botella de suministro en una campana estéril. Las adiciones postesterilización para el suministro son (por kilogramo de solución de suministro) solución de sales macro 5.54 mi, solución de vitaminas 6.55 mi, solución de metales traza modificada 1000X 0.82 mi. (ii) Procedimiento experimental La producción de mevalonato (MVA) a partir de un huésped de E. coli (BL21) modificado (CMP1133) que expresa genes introducidos a partir de la ruta de mevalonato y PKL aislada ya sea de E. gllinarum (cepa E L1341) o de C. acetobutylicum (cepa EWL1359) se evaluó al cultivar las cepas en cultivo semicontinuo a escala de 15 1 (Tabla 9) . La producción de MVA se comparó con un huésped de E. coli (BL21) modificado (CMP1133) que expresó genes introducidos a partir de la ruta de mevalonato pero no expresó una PKL (cepa CHL875) para determinar si cualquier mejoría en el rendimiento puede atribuirse al uso de una fosfocetolasa .
Tabla 9. Lista de cepas sometidas a prueba para analizar la producción de VA Se determinó la formación de mevalonato (MVA) a partir de glucosa al pH de fermentación deseado (7.0) y temperatura (34°C) . Para empezar cada experimento, el vial congelado adecuado de la cepa de E. coli (BL21) se descongeló y se inoculó en una matraz con medio de triptona-extracto de levadura (LB) y los antibióticos adecuados. Después de que el inoculo creció hasta una densidad óptica de aproximadamente 1.0, determinada a 550 nm (OD550) , se usó 500 mi para inocular un biorreactor de 15 1 y llevar el volumen de depósito inicial hasta 5 1.
Las cepas productoras de mevalonato se usaron en diversas condiciones del proceso de producción (Tabla 10) . El medio discontinuo tenía glucosa en lotes a 9.7 g/1. La iniciación se logró al agregar isopropil-beta-D-l-tiogalactopiranosida (IPTG) . Se agregó una dosis de IPTG en el depósito para llevar la concentración hasta un nivel especificado cuando las células tenían una OD550 de 6. Una vez que el cultivo consumiera la glucosa, lo cual se indicó con un aumento del pH, se suministró la solución de suministro de glucosa para satisfacer las demandas metabólicas a velocidades menores o iguales que 10 g/min. La fermentación se llevó a cabo durante el tiempo suficiente para determinar el rendimiento máximo acumulativo de masa de mevalonato en glucosa, un total de 60 a 64 horas de tiempo de fermentación transcurrido.
Las indicaciones de rendimiento de una cepa control (CHL875) se compararon con las cepas experimentales, EWL1341, EWL1359. Las indicaciones de rendimiento relevantes fueron rendimiento acumulativo de MVA en glucosa, rendimiento instantáneo de MVA en glucosa, productividad volumétrica de MVA, productividad específica de MVA e índice de rendimiento celular. Las cepas experimentales (con fosfocetolasa) se usaron en las mismas condiciones que las cepas control (sin expresión de fosfocetolasa) para determinar si alguna mejoría en el rendimiento puede atribuirse al uso de la enzima fosfocetolasa .
El rendimiento global se calculó con el uso de la siguiente fórmula: % de rendimiento en peso en glucosa = MVA total (t)/[(peso del suministro (0) -peso del suministro (t) +83.5) *0.59) ] , en donde 0.59 es el% en peso de glucosa en la solución de suministro de glucosa y 83.5 son los gramos de este suministro en lotes en el agente termentador a t=0. Cada suministro tuvo su% en peso determinado independientemente.
El CPI se calculó con el uso de la siguiente fórmula: CPI = total de MVA. en gramos/total de peso seco celular en gramos Las concentraciones de oxígeno, nitrógeno y dióxido de carbono en la emisión de gas se determinaron independientemente por dos espectrómetros de masas, un iSCAN (Hamilton Sundstrand) y un espectrómetro de masas Hiden HPR20 (Hiden Analytical) . El oxígeno disuelto en el caldo de fermentación se determina por una sonda esterilizable, sanitaria con un sensor óptico proporcionada por Hamilton Company. Las concentraciones de citrato, glucosa, acetato y mevalonato en el caldo termentador se determinaron en muestras de caldo de cultivo tomadas a intervalos de 4 horas por un análisis por HPLC. La concentración en las muestras de caldo de cultivo se determinó por comparación de la respuesta del índice de refracción contra una curva de calibración generada previamente con el uso del estándar de una concentración conocida.
Información de la HPLC Sistema: Waters Alliance 2695 Columna: BioRad - columna de exclusión de iones Aminex HPX-87H 300 mm x 7.8 mm catálogo núm. 125-0140 Temperatura de la columna: 50C Columna protectora: BioRad - rellenado de catión H Microguard 30 mm x 4.6 mm catálogo núm. 125-0129 Regulador en uso: H2S04 0.01 N Velocidad de flujo del regulador en uso: 0.6 mi / min Presión aproximada en uso: -7.5-8.2 MPa (-1100-1200 psi) Volumen de inyección: 20 microlitros Detector: índice de refracción (Knauer K-2301) Tiempo de ejecución: 26 minutos Tabla 10. Condiciones del proceso de producción (iii) Resultados La cepa que expresa la fosfocetolasa de C. acetobutylicum (E L1359, pruebas 20121056, 201201057, 20121058) alcanzó un% de rendimiento acumulativo de MVA en glucosa mayor que la cepa que no expresa fosfocetolasa (CHL875, pruebas 20120821, 20120976, 20121059) (Tabla 11 y Figura 51). El incremento del rendimiento de MVA se observó cuando se agregó por lo menos 100 µ? de IPTG en el depósito (20121057 y 20121058) .
La cepa que expresa la fosfocetolasa de E. gallinarum (EWL1341, pruebas 20120977, 201200978, 20120979) alcanzó uní de rendimiento acumulativo de MVA en glucosa mayor que la cepa que no expresa fosfocetolasa (CHL875, pruebas 20120821, 20120976, 20121059) (Tabla 11 y Figura 52) . El incremento del rendimiento de MVA se observó cuando se agregó por lo menos 50 µ? de IPTG en el depósito (20120978 y 20120979) .
Tabla 11. Indicadores de la productividad de MVA El rendimiento de MVA en todos los casos se correlacionó con la cantidad de IPTG agregada (Figura 53) . Para una comparación directa, en las pruebas en donde se agregó 100 µ? de IPTG, ambas cepas que expresan fosfocetolasa (20120979 y 20121057) alcanzaron uní de rendimiento acumulativo de MVA en glucosa significativamente mayor que la cepa que no expresa fosfocetolasa (CHL875, prueba 201201059) (Tabla 12 y Figura 53) . El rendimiento acumulativo de MVA (en ambos casos donde se expresó fosfocetolasa) se correlacionó bien con la actividad de fosfocetolasa determinada en las pruebas respectivas (Tabla 12 y Figura 54) .
Tabla 12. Rendimiento de MVA / actividad de fosfocetolasa La cepa que expresa la fosfocetolasa de C. acetobutylicum (EWL1359, prueba 20121057, inducida a 100 µ? de IPTG) alcanzó un índice de rendimiento celular ligeramente mayor (g de MVA / g de peso seco celular) que la cepa que no expresa fosfocetolasa (CHL875, prueba 20121059, inducida a 100 µ? de IPTG) . Cuando se induce con 400 µ? de IPTG (EWL1359, prueba 20121058) , el CPI fue mayor que la cepa control (CHL875, prueba 20121059, inducida a 100 µ? de IPTG) (Figura 55) .
La cepa que expresa la fosfocetolasa de E.gallinaru (EWL1341, pruebas 20120978 y 20120979, inducidas a 50 µ? de IPTG y 100 µ?, respectivamente) alcanzó un índice de rendimiento celular (g de MVA / g de peso seco celular) mayor que la cepa que no expresa fosfocetolasa (CHL875, prueba 20120976, sin dosis de IPTG) . Cuando no se agregó IPTG (E L1341, prueba 20120977) , el CPI fue únicamente ligeramente mayor que la cepa control (CHL875, prueba 20120976, sin dosis de IPTG) (Figura 56) .
Ejemplo 21. Producción de isopreno en células hospederas recombinantes que expresan fosfocetolasa a pequeña escala Se construyó cepas de E. coli productoras de isopreno que expresaron fosfocetolasa a partir de Bifidobacterium longum, Enterococcus gallinarum o Clostridium acetobutylicum. Las cepas productoras de isopreno que no expresaron una fosfocetolasa se usaron como cepas control (Tabla 13) . Las cepas que expresan fosfocetolasa se analizaron para evaluar la expresión de fosfocetolasa y el rendimiento de isopreno cuando se cultivan en glucosa en comparación con una cepa control que no expresa fosfocetolasa en un experimento a pequeña escala.
Las cepas productoras de isopreno se produjeron en una cepa de E. coli (BL21) modificada (MCM2065) que expresa PKL de B. longum al introducir el plásmido pEWL1418 (Figura 57) para producir la cepa EWL1427 (Tabla 13) . Para la producción de cepas que expresan PKL de E. gallinarum, el plásmido pEWL.1421 (Figura 58) o pEWL1438 (Figura 59) se introdujo en una cepa huésped de E. coli (BL21) modificada (MCM2065) para producir la cepa EWL1430 y la cepa EWL1449, respectivamente (Tabla 13) . Para la producción de cepas que expresan PKL de c. acetobutylicum, se usó el plásmido pEWL1436 (Figura 60) y el plásmido pEWL1440 (Figura 61) para producir la cepa EWL1446 y la cepa EWL1452, respectivamente (Tabla 13) .
Tabla 13. Cepas productoras de isopreno que expresan fosfocetolasa bMVK indica mevalonato cinasa de M. burtonii mMVK indica mevalonato cinasa de M. mazei (i) Materiales Receta del medio TM3 (por litro de medio de fermentación) : K2HPO4 13.6 g, KH2PO4 13.6 g, MgS04*7H20 2 g, monohidrato de ácido cítrico 2 g, citrato de amonio férrico 0.3 g, (NH4)2S04 3.2 g, extracto de levadura 0.2 g, solución de metales traza 1000X 1 mi . Todos los componentes se agregan y se disuelven en diH20. El pH se ajusta hasta 6.8 con hidróxido de amonio (30%) y se llevó hasta volumen. El medio se esterilizó con un filtro de 0.22 micrones . Se agrega glucosa 10.0 g y antibiótico después de ajustar el pH y de la esterilización .
Receta del medio TM3 modificado sin extracto de levadura y MgSQ4 (por litro de medio de fermentación) : 2HP04 13.6 g, KH2PO4 13.6 g, monohidrato de ácido cítrico 2 g, citrato de amonio férrico 0.3 g, (NH4)2S04 3.2 g, solución de metales traza 1000X 1 mi. Todos los componentes se agregan y se disuelven en diH20. El pH se ajusta hasta 6.8 con hidróxido de amonio (30%) y se llevó hasta volumen. El medio se esterilizó con un filtro de 0.22 micrones. Se agrega glucosa 10.0 g y antibiótico después de ajustar el pH y de la esterilización.
Solución de metales traza modificada 1000X (por litro) : ácidos cítricos * H20 40 g, MnS04 * H20 30 g, NaCl 10 g, FeS04 * 7H20 1 g, CoCl2 * 6H20 1 g, ZnSO * 7H20 1 g, CuS04 * 5H20 100 mg, H3B03 100 mg, NaMo04 * 2H20 100 mg . Cada componente se disolvió uno a la vez en Di H20, el pH se ajustó hasta 3.0 con HCl/NaOH y, después, la solución se llevó hasta volumen y se esterilizó con un filtro de 0.22 micrones. (ii) Procedimiento experimental Medición del índice de crecimiento Tubos de agitación que contienen 3 mi de medio LB, con los antibióticos adecuados, se inocularon con soluciones base de cultivo de glicerol. Los cultivos se incubaron durante aproximadamente 15 horas a 30°C, 220 rpm. El medio TM3 suplementado se preparó al combinar el medio TM3 (sin MgS04 y extracto de levadura) , glucosa al 1%, MgS04 8 mM, extracto de levadura al 0.02% y antibióticos adecuados. Dos mi de medio TM3 suplementado se inocularon en cada pocilio de un bloque estéril de 48 pocilios hasta una OD60o final de 0.2. Los bloques se sellaron con membranas Breathe Easier y se incubaron durante 2 horas a 34°C, 600 rpm. Después de 2 horas de crecimiento, se determinó la ODS00 en la placa de microtitulación y las células se indujeron con diversas concentraciones de IPTG. La lectura de la OD6oo se tomó cada hora después de la inducción de IPTG durante 4 horas. Las mediciones de OD6oo se llevaron a cabo con el uso del equipo SpectraMax Plusl90 (Molecular Devices) . Las células se cultivaron durante la noche y se determinó la OD60o- Medición de glucosa Las muestras de glucosa se recolectaron al centrifugar 300 µ? de cultivo celular en la placa de fondo cónico de 96 pocilios y se centrifugaron durante 10 min a 4°C, 3000 rpm. El sobrenadante se diluyó 10 veces en agua desionizada y la concentración de glucosa se determinó con el uso de un kit de ensayo de glucosa oxidasa adquirido de Pointe Scientific.
Medición de productividad específica de isopreno Se recolectó 100 µ? de una muestra de isopreno en un bloque de vidrio de 96 pocilios cada hora después de la inducción de IPTG durante 4 horas. El bloque de vidrio se selló con papel de aluminio y se incubó a 34 °C mientras se agitaba a 450 rpm, durante 30 minutos con el uso de un equipo Thermomixer. Depués de 30 minutos, el bloque se mantuvo en un baño de agua a 70 °C durante 2 minutos y las concentraciones de isopreno en la medición del espacio vacío se determinaron con el uso de cromatografía de gases-espectrometría de masas. Análisis de expresión proteica Una muestra de 50 µ? de cultivo celular en caldo completo de 4 horas después de la inducción se llevó a ebullición durante 5 minutos a 95 °C con 50 µ? de regulador de muestras 2X SDS y 10 µ? de la muestra se colocaron en geles Bis-Tris al 4-12% para el análisis de expresión. En cada gel se agregó enzima fosfocetolasa purificada y estándar pretinción. Los geles se tiñeron con tinción SimplyBlue Coomassie® G-250 y se destiñeron con agua desionizada. (iii) Resultados El análisis de isopreno produciddo a partir de glucosa por cepas de E. coli modificadas genéticamente que expresan PKL de B. longum en presencia de la expresión de mevalonato cinasa de M. burtonii (cepa EWL1427) , PKL de E. gallinarum en presencia de la expresión de mevalonato cinasa de M. burtonii (cepa EWL1430) o PKL de C. acetojutyücum en presencia de expresión de mevalonato cinasa de M. burtonii (cepa EWL1446) demostró que el rendimiento de isopreno cada vez mayor se correlacionó con la inducción de IPTG cada vez mayor en comparación con una cepa control que no expresó una PKL (cepa MCM2158) (Figuras 62A y B) . El análisis de expresión proteica en lisados celulares completos preparados de cepas modificadas genéticamente que expresan PKL mostró que la expresión proteica fue inducida por IPTG (Figuras 63A y B) . Estos descubrimientos indican que el rendimiento de isopreno incrementado fue resultado de la expresión proteica de fosfocetolasa cada vez mayor.
El análisis de isopreno producido de glucosa por cepas de E. coli modificadas genéticamente que expresan PKL de E. gallinarum en presencia de la expresión de mevalonato cinasa de M. mazei (cepa E L1449) o PKL de C. ace oj u ylicum en presencia de la expresión de mevalonato cinasa de M. mazei (cepa EWL1452) demostró que el rendimiento de isopreno cada vez mayor se correlacionó con la inducción de IPTG cada vez mayor en comparación con una cepa control que no expresó una PKL (cepa DW719) (Figura 64A) . El análisis de expresión proteica en lisados celulares completos preparados de cepas modificadas genéticamente que expresan PKL demostró que la expresión proteica fue inducida por IPTG (Figura 64B) . Estos descubrimientos indican que el rendimiento de isopreno incrementado fue resultado de la expresión proteica de fosfocetolasa cada vez mayor.
En general, estos resultados demostraron la producción de isopreno a partir de glucosa en las cepas que expresan genes de PKL aislados de bacterias diferentes, tales como B. longum, E. gallinarum y C. acetojbu ylicum, en presencia de genes de mevalonato cinasa diferentes.
Ejemplo 22. Producción de isopreno en células hospederas recombinantes que expresan fosfocetolasa a una escala de 15 1 Las cepas productoras de isopreno que expresan fosfocetolasa a partir de B. longum (cepa E L1427) o E. gallinarum (cepa EWL1430) se compararon con una cepa productora de isopreno que no expresa fosfocetolasa (cepa MCM2158) en un experimento a escala de 15 litros para producción de isopreno. El rendimiento de isopreno acumulativo en glucosa, el rendimiento instantáneo de isopreno en glucosa y el índice de rendimiento celular (CPI) se determinaron y se analizaron. (i) Materiales Receta del medio (por litro de medio de fermentación) : K2HP04 7.5 g, MgS04 * 7H20 2 g, monohidrato de ácido cítrico 2 g, citrato de amonio férrico 0.3 g, extracto de levadura 0.5 g, ácido sulfúrico al 50% 1.6 mi, solución de metales traza modificada 1000X 1 mi. Todos los componentes se agregaron junto y se disolvieron en Di H20. Esta solución se esterilizó con calor (123°C durante 20 minutos) . El pH se ajustó hasta 7.0 con hidróxido de amonio (28%) y q.s. hasta volumen. Se agregó glucosa 10 g, solución de vitaminas 8 mi y antibióticos después de la esterilización y ajuste de pH.
Solución de metales traza modificada 1000X (por litro) : ácidos cítricos * H20 40 g, MnS04 * H20 30 g, NaCl 10 g, FeS04 * 7H20 1 g, CoCl2 * 6H20 1 g, ZnSO * 7H20 1 g, CuS04 * 5H20 100 mg, H3B03 100 mg, NaMo04 * 2H20 100 mg. Cada componente se disolvió uno a la vez en Di H20, el pH se ajustó hasta 3.0 con HCl/NaOH y, después, la solución se llevó hasta volumen y se esterilizó con un filtro de 0.22 micrones.
Solución de vitaminas (por litro) : hidrocloruro de tiamina 1.0 g, D- (+) -biotina 1.0 g, ácido nicotínico 1.0 g, clorhidrato de piridoxina 4.0 g. Cada componente se disolvió uno a la vez en Di H20, el pH se ajustó hasta 3.0 con HCl/NaOH y, después, la solución se llevó hasta volumen y se esterilizó con un filtro de 0.22 micrones.
Solución de sales macro (por litro) : MgS04 * 7H20 296 g, monohidrato de ácido cítrico 296 g, citrato de amonio férrico 49.6 g. Todos los componentes se disolvieron en agua, se llevaron hasta volumen y se esterilizaron con un filtro de 0.22 micrones.
Solución de suministro (por kilogramo) : glucosa 0.590 kg, Di H20 0.393 kg, K2HP04 7.4 g y Foamblast 882 al 100% 8.9 g. Todos los componentes se mezclaron y se esterilizaron en autoclave. Después de esterilizar en autoclave la solución de suministro, se agregó suplementos de nutrientes en la botella de suministro en una campana estéril. Las adiciones postesterilización para el suministro son (por kilogramo de solución de suministro) solución de sales macro 5.54 mi, solución de vitaminas 6.55 mi, solución de metales traza modificada 1000X 0.82 mi. (ii) Procedimiento experimental La producción de isopreno a partir de una cepa huésped de E. coli (BL21) modificada (MCM2065) que expresa genes introducidos a partir de la ruta de mevalonato y PKL aislada ya sea de B. longum (cepa E L1427) o de E. gallinaru (cepa EWL1430) se evaluó al cultivar las cepas en cultivo semicontinuo a escala de 15 1 (Tabla 14) . La producción de isopreno se comparó con una cepa huésped de E. coli (BL21) modificada (MCM2065) que expresó genes introducidos a partir de la ruta de mevalonato pero no expresó una PKL (cepa MCM2158) para determinar si alguna mejoría en el rendimiento puede atribuirse al uso de una fosfocetolasa .
Tabla 14. Lista de cepas productoras de isopreno Nombre de Huésped Plásmido de MVA Isopreno sintasa / Números la cepa de la ruta plásmido de PKL de prueba superior EWL1430 BL21, Apgl pMCM1225 pTrc 20121136 PL.2mKKDyl , inducible P . alba (variante de GI1.2gltA, E.gallinarum MEA) minusMVK yhfSF TPyddVIspAyh superior +E.gal PKL fS, (pMCM1225 Spec (pE L1421 Carb50) thiFRTtruncIspA, 50) bMVK (MCM2065) bMVK indica mevalonato cinasa de M. burtonii Las cepas productoras de isopreno se usaron en un proceso de producción convencional (Tabla 15) . La producción de isopreno a partir de glucosa se monitoreó en la fermentación, con un pH de 7.0 y temperatura de 34°C. Para empezar el experimento, un vial congelado de la cepa de E. coli (BL21) se descongeló y se inoculó en un matraz con medio de triptona-extracto de levadura (LB) y los antibióticos adecuados. Después de que el inoculo creció hasta una densidad óptica de aproximadamente 1.0, determinada a 550 nm (OD550) , se usó 500 mi para inocular un biorreactor de 15 1 y para llevar el volumen de depósito inicial hasta 5 1. El medio discontinuo tenía glucosa en lotes a 9.7 g/1. La inducción se logró al agregar isopropil-beta-D-1-tiogalactopiranosida (IPTG) . Se agregó una dosis de IPTG en el depósito para llevar la concentración hasta un nivel especificado cuándo las células tenían una OD550 de 6. Una vez que el cultivo consumiera la glucosa, lo cual se indicó con un aumento del pH, se suministró la solución de suministro de glucosa para satisfacer las demandas metabólicas a velocidades menores o iguales que 10 g/min. La fermentación se llevó a cabo durante el tiempo suficiente para determinar el rendimiento máximo acumulativo de masa de isopreno en glucosa durante un total de 60 a 64 horas de tiempo de fermentación transcurrido.
Tabla 15. Condiciones del proceso de producción Las indicaciones de rendimiento de una cepa control, (MCM2158) , se compararon con las cepas experimentales, EWL1427 y EWL1430. Las indicaciones de rendimiento fuereon rendimiento de isopreno acumulativo en glucosa, rendimiento instantáneo de isopreno en glucosa e índice de rendimiento celular (CPI) . Las cepas experimentales (con fosfocetolasa) se usaron en las mismas condiciones que las cepas control (sin expresión de fosfocetolasa) .
El rendimiento total de isopreno se calculó con el uso de la siguiente fórmula: % de rendimiento en peso en glucosa = isopreno total (t)/[(peso del suministro (0) -peso del suministro (t) +83.5) *0.59) ] , en donde 0.59 es el% en peso de glucosa en la solución de suministro de glucosa y 83.5 son los gramos de este suministro en lotes en el agente termentador a t=0. Cada suministro tuvo su% en peso determinado independientemente.
El rendimiento instantáneo de isopreno se calculó con el uso de la siguiente fórmula: rendimiento inst. de isopreno (% de g/g) = isopreno producido (tx-t0) /glucosa consumida (tx-to) *100 El CPI se calculó con el uso de la siguiente fórmula: CPI = total de isopreno en gramos/ total de peso seco celular en gramos Las concentraciones de isopreno, oxígeno, nitrógeno y dióxido de carbono en la emisión de gas se determinaron independientemente por dos espectrómetros de masas, un iSCAN (Hamilton Sundstrand) y un espectrómetro de masas Hiden HPR20 (Hiden Analytical) . El oxígeno disuelto en el caldo de fermentación se determina por una sonda esterilizable, sanitaria con un sensor óptico proporcionada por Hamilton Company. Las concentraciones de citrato, glucosa, acetato y mevalonato en el caldo termentador se determinaron en muestras de caldo de cultivo tomadas a intervalos de 4 horas por un análisis por HPLC. La concentración en las muestras de caldo de cultivo se determinó por comparación de la respuesta del índice de refracción contra una curva de calibración generada previamente con el uso del estándar de una concentración conocida.
Información de la HPLC Sistema: Waters Alliance 2695 Columna: BioRad - columna de exclusión de iones Aminex HPX-87H 300 mm x 7.8 mm catálogo núm. 125-0140 Temperatura de la columna: 50°C Columna protectora: BioRad - rellenado de catión H Microguard 30 mm x 4.6 mm catálogo núm. 125-0129 Regulador en uso: H2S04 0.01 N Velocidad de flujo del regulador en uso: 0.6 mi / min Presión aproximada en uso: -7.5-8.2 MPa (-1100-1200 psi) Volumen de inyección: 20 microlitros Detector: índice de refracción (Knauer K-2301) Tiempo de ejecución: 26 minutos (iii) Resultados La cepa que expresa la fosfocetolasa de E.gallinarum (EWL1430, 20121136) alcanzó uní de rendimiento acumulativo de isopreno en glucosa mayor que la cepa que no expresa fosfocetolasa (MCM2158, 20121134) (Tabla 16 y Figura 65) . La cepa que expresa la fosfocetolasa de E.gallinarum (EWL1430, 20121136) alcanzó un% de rendimiento instantáneo de isopreno en glucosa mayor que la cepa que no expresa fosfocetolasa (MCM2158, 20121134) (Tabla 16 y Figura 66) y mantuvo el alto rendimiento durante un largo período de tiempo, lo que produjo un mayor rendimiento acumulativo (Tabla 16 y Figura 65) . Si bien la cepa que expresa la fosfocetolasa de B.longum (EWL1427, 20121135) tenía un rendimiento instantáneo pico tardío mayor en la prueba (Figura 66) , esta cepa tardó más tiempo en alcanzar el rendimiento pico y al final terminó con aproximadamente casi el mismo rendimiento acumulativo de isopreno en glucosa que la cepa control (MCM2158, 20121134) (Tabla 16 y Figura 65) La cepa que expresa la fosfocetolasa de E.gallinarum (EWL1430, 20121136) alcanzó un CPI ligeramente mayor que la cepa que no expresa fosfocetolasa (MCM2158, 20121134) (Figura 67) . La cepa que expresa la fosfocetolasa de B.longum (EWL1427, 20121135) tuvo un CPI ligeramente menor que la cepa que no expresa fosfocetolasa (MCM2158, 20121134) (Figura 67) . El tiempo del rendimiento acumulativo pico (60 horas de EFT) fue el momento en el cual se comparó el CPI .
Tabla 16. Medidas de productividad de isopreno Tabla 17. Resumen del rendimiento de isopreno Tabla 18. Resumen de productividades específicas de PKL en unidades de formación de AcP y actividad específica de PKL a partir de B . longum y E. gallinarum.
Ejemplo 23. Análisis in vitro de actividad específica de fosfocetolasa en células hospederas recombinantes cultivadas que expresan células cultivadas a una escala de 14 1 Las cepas que expresan fosfocetolasa (PKL) a partir de E . gallinarum (Tabla 19 y Tabla 21) , C. acetobutylicum (Tabla 20) o B. longum (Tabla 21) se sometieron a ensayos en experimentos cinéticos. Para la preparación de las muestras, los comprimidos celulares se obtuvieron de un mi de cultivo durante el transcurso de las pruebas de fermentación de 14 1 y se almacenaron a -80°C. Las muestras de comprimidos se resuspendieron y se normalizaron hasta una OD(600)=20 en MES 50 mM, pH de 6 con 1 mg/ml de lisozima, 0.2 mg/ml de DNasal y AEBSF 0.5 mM . Los comprimidos celulares con OD normalizada se Usaron por repetidos cambios de cultivo por medio de una miniprensa francesa de células a 4.8 MPa (700 psi) ajustada a relación media. Después, las muestras lisadas se aclararon por centrifugación a 14,000 rpm durante 10 min a 4°C. Los ensayos de actividad y las mediciones de proteína se realizaron en la fracción soluble del lisado. El total de proteína se determinó por el método de Bradford Bio Rad con el uso de una curva estándar preparada por titulación de BSA a concentraciones en el intervalo de 0.5 y 0.05 mg/ml.
Las actividades catalíticas de las PKL se determinaron con el uso de una versión reducida del ensayo de hidroxamato descrito en L. eile et. al., Bacteriol . , 2001, 183:2929-2936 y Frey et. al., Bioorganic Chem. , 2008, 36:121-127, que se incorporan en la presente descripción como referencia en su totalidad. Los ensayos se realizaron en un formato de placa de 96 pocilios (Costar catálogo núm. 9017), a 37°C. En el ensayo convencional, la mezcla de reacción consistió en F6P 5 mM, TPP 1 mM, fosfato potásico 10 mM, regulador MES 50 mM a un pH de 6 y MgCl2 10 mM, fluoruro sódico 20 mM, yodoacetomida 8 mM y DTT 1 mM. La reacción se empezó con la adición de F6P y se detuvo después de 30 minutos de incubación. El volumen de reacción total es, usualmente, 300 µ? (cantidades menores cuando se usa si es necesario) . Se usó AcP como una curva estándar con concentraciones en el intervalo de 15 y 0.23 mM. Para detener la reacción, se mezcló 60 µ? de la mezcla de reacción con 60 µ? de hidroxilamina 2 M a un pH de 6.5, se incubaron durante 10 min a temperatura ambiente. La adición de 40 µ? de TCA al 15%, 40 µ? de HCl 4 M y 40 µ? de FeCl3 al 5% en HCl 0.1 M se usó para precipitar la proteína y permitir la detección de AcP. Después, las muestras se centrifugaron a 3000 rpm por 10 min. Se trasladó 200 µ? del sobrenadante a una placa de microt itulación para determinar las velocidades de formación de AcP a una absorbancia de 505 nm.
Tabla 19. Pruebas a una escala de 14 1 con PKL de E. gallinarum expresada en un valor base de mevalonato constitutivo Tabla 20. Pruebas a una escala de 14 1 con PLK de C. acetobutylicum expresada en una cepa de la ruta superior constitutiva Tabla 21. Pruebas a una escala de 14 1 con PKL de E. gallinarum o PKL de B. longum expresada en una cepa con una ruta completa de mevalontao e isopreno sintasa Productivades específicas in vitro de la formación de AcP para la cepa EWL1341 que contiene PKL de E. gallinarum en el intervalo de 0.75 a 1.77 mmol/l/h/OD, según el nivel de inducción (Tabla 22 y Figura 68A) . Además, las actividades específicas in vitro de la formación de AcP para la cepa EWL1341 que contiene PKL de E. gallinarum en el intervalo de 7.1E-02 y 1. lE-01umol/mg/min, según el nivel de inducción (Tabla 22 y Figura 68B) .
Tabla 22. Resumen de productivades específicas de PKL de E. gallinarum en unidades de formación de AcP y actividad específica de PKL de E. gallinarum Productivades específicas in vitro de la formación de AcP para la cepa EWL1359 que contiene PKL de C. acetobutyiicum en el intervalo de 0.12 a 0.74 mmol/l/h/OD, según el nivel de inducción (Tabla 23 y Figura 69A) . Además, las actividades específicas in vitro de la formación de AcP para la cepa EWL1359 que contiene PKL de C. acetobutyiicum en el intervalo de 1.1E-02 y 7.6E-02 umol/mg/min, según el nivel de inducción (Tabla 23 y Figura 69B) .
Tabla 23. Resumen de las productividades específicas de PKL de C. acetobutyiicum en unidades de formación de AcP y actividad específica de PKL de C. acetojbu ylicum.
Productivades específicas in vitro de la formación de AcP para la cepa EWL1427 que contiene PKL de B . longum e inducida con 100 µ? de IPTG en el intervalo de 7.30 a 10.01 mmol/l/h/OD (Tabla 23 y Figura 70). Productivades específicas in vitro de la formación de AcP para la cepa EWL1430 que contiene PKL de E. gallinarum en el intervalo de 0.98 a 1.13 mmol/l/h/OD cuando se induce con 100 µ? de IPTG y de 1.30 a 1.38 mmol/l/h/OD cuando se induce con 200 µ? de IPTG (Tabla 24 y Figura 70) .
Actividades específicas in vitro de la formación de AcP para la cepa EWL1427 que contiene PKL de B. longum e inducida con 100 µ? de IPTG en el intervalo de 7.1E-01 a 8.7E-01 µt???/mg/min (Tabla 23 y Figura 71). Productivades específicas in vitro de la formación de AcP para la cepa EWL1430 que contiene PKL de E. gallinarum en el intervalo de 8.0E-02 a 1.0E-01 µ????/mg/min cuando se induce con 100 µ? de IPTG y de 1.1E-01 a 1.2E-01 µp???/p^/???? cuando se induce con 200 µ? de IPTG (Tabla 24 y Figura 71) .
En general, estos descubrimientos indican que la actividad de fosfocetolasa estuvo presente en todas las cepas .
Tabla 24. Resumen de productividades específicas de PKL en unidades de formación de AcP y actividad específica de PKL a partir de B. longum y E. gallinarum.
Ejemplo 24. Construcción de cepas que expresan fosfocetolasa que contiene mutaciones del huésped para producir isopreno.
Las cepas que comprenden isopreno que comprenden un polipéptido de fosfocetolasa activo como se describió anteriormente se pueden modificar genéticamente aún más para incrementar la actividad de uno o más de los siguientes genes que incluyen ribosa-5-fosfato isomerasa (rpiA y/o rpiB) , D-ribulosa-5-fosfato 3-epimerasa (rpe) , trancetolasa ( tktA y/o tktB) , transaldolasa B (tal B) , fosfoenolpiruvato sintetasa (ppsA) , fosfato acetiltransferasa (pta y/o eutD) para mejorar el flujo de carbono por medio de la ruta de fosfocetolasa (Figura 72) . En ciertos aspectos, la actividad de los siguientes genes rpiA, rpiB, rpe, tktA, tktB, tal B, ppsA, eutD, y/o pta se puede incrementar al alterar el promotor y/o rbs en el cromosoma o al expresarlo desde un plásmido. En una modalidad, la actividad de ribosa-5-fosfato isomerasa (rpiA y/o rpiB) se incrementa al alterar el promotor y/o rbs en el cromosoma o al expresarlo desde un plásmido. En otra modalidad, la actividad de D-ribulosa-5-fosfato 3-epimerasa (rpe) se incrementa al alterar el promotor y/o rbs en el cromosoma o al expresarlo desde un plásmido. En otra modalidad, la actividad de trancetolasa {tktA y/o tktB) se incrementa al alterar el promotor y/o rbs en el cromosoma o al expresarlo desde un plásmido. En otra modalidad adicional, la actividad de transaldolasa B (tal B) se incrementa al alterar el promotor y/o rbs en el cromosoma o al expresarlo desde un plásmido. En otra modalidad, la actividad de fosfoenolpiruvato sintetasa (ppsA) se incrementa al alterar el promotor y/o rbs en el cromosoma o al expresarlo desde un plásmido. En otras modalidades adicionales, la actividad de fosfato acetiltransferasa (pta y/o eutD) se incrementa al alterar el promotor y/o rbs en el cromosoma o al expresarlo desde un plásmido. En ciertos aspectos, las isozimas de los siguientes genes rpiA, rpiB, rpe, tktA, tktB, tal B, ppsA, eutD y/o pta se pueden incrementar al alterar el promotor y/o rbs en el cromosoma o al expresarlo desde un plásmido.
Estas cepas se pueden modificar genéticamente aún más para reducir la actividad de uno o más de los siguientes genes que incluyen glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (zwf) , 6-fosfofructocinasa-1 {pfkA y/o pfkB) , fructosa bisfosfato aldolasa {fba, fbaA, fbaB y/o fbaC) , gliceraldehído-3 -fosfato deshidrogenasa {gapA y/o gapB) , acetato cinasa (ackA) , citrato sintasa (gltA) , trancetolasa ( tJctA y/o tktB) , El {ptsl) , EIICBGlc (ptsG) , EIIAGlc (crr) y/o HPr (ptsH) para incrementar el flujo de carbono hacia la ruta de fosfocetolasa (Figura 73) . En una modalidad, un gen zwf que codifica glucosa-6-fosfato deshidrogenasa se regula a la baja. En otra modalidad, un gen pfkA que codifica 6-fosfofructocinasa-1 A se regula a la baja. En otra modalidad, un gen gapA que codifica gliceraldehído-3 -fosfato deshidrogenasa A se regula a la baja. En otra modalidad, un gen fba que codifica fructosa bisfosfato aldolasa se regula a la baja. En otra modalidad adicional, un gen gltA que codifica citrato sintasa se regula a la baja. En una modalidad, un gen ackA que codifica acetato cinasa se regula a la baja. En otra modalidad, un gen ptsl que codifica El se regula a la baja. En una modalidad, un gen ptsH que codifica HPr se regula a la baja. En otra modalidad, un gen ptsG que codifica EIICBGlc se regula a la baja. En otra modalidad adicional, un gen crr que codifica EIIAGlc se regula a la baja. El operón PTS codifica genes del sistema de fosfotransferasa . En algunas modalidades, las cepas se pueden modificar genéticamente para reducir la actividad del sistema de fosfotransferasa (PTS) para incrementar el flujo de carbono hacia la ruta de fosfocetolasa. En algunas modalidades, el PTS se regula a la baja al regular a la baja el operón PTS. En ciertos aspectos, el PTS se regula a la baja y una ruta de transporte de glucosa se regula a la alta. Una ruta de transporte de glucosa incluye, pero no se limita a, genes de galactosa (galP) y glucocinasa (glk) . En algunas modalidades, el operón PTS se regula a la baja, el gen de galactosa (galP) se regula a la alta y el gen de glucocinasa (glk) se regula a la alta. En ciertos aspectos, las isozimas de proteínas codificadas por los siguientes genes zwf, pfkA, fba, gapA, ackA, gltA, tktA, ptsG, ptsH, ptsl y/o crr pueden regularse a la baja para incrementar el flujo de carbono hacia la ruta de fosfocetolasa. En algunas modalidades, el gen pfkB se regula a la baja. En algunas modalidades, el gen de gliceraldehído-3 -fosfato deshidrogenasa B (gapB) se regula a la baja. En algunas modalidades, el gen de trancetolasa B (tktB) se regula a la baja.
Ejemplo 25. Producción de isopreno por cepas que expresan fosfocetolasa que contienen mutaciones del huésped a pequeña escala, (i) Materiales Receta del medio TM3 (por litro de medio de fermentación) : K2HP04 13.6 g, KH2PO4 13.6 g, MgS04*7H20 2 g, monohidrato de ácido cítrico 2 g, citrato de amonio férrico 0.3 g, (NH4)2S04 3.2 g, extracto de levadura 0.2 g, solución de metales traza 1000X 1 mi. Todos los componentes se agregan y se disuelven en diH20. El pH se ajusta hasta 6.8 con hidróxido de amonio (30%) y se llevó hasta volumen. El medio se esterilizó con un filtro de 0.22 micrones . Se agrega glucosa 10.0 g y antibiótico después de ajustar el pH y de la esterilización.
Solución de metales traza 1000X (por litro de medio de fermentación) Ácido cítrico*H20 40 g, MnS04*H20 30 g, NaCl 10 g, FeS04*7H20 1 g, CoCl2*6H20 1 g, ZnS04.7H20 1 g, CuS04*5H20 100 mg, H3BO3 100 mg, NaMo04*2H20 100 mg. Cada componente se disuelve uno a la vez en di H20. El pH se ajusta hasta 3.0 con HCl/NaOH y, después, la solución se lleva hasta volumen y se esteriliza con un filtro de 0.22 micrones. (ii) Procedimiento experimental Las células se cultivan durante la noche en caldo de cultivo Luria-Bertani + antibióticos. Un día después, se diluyeron hasta una OD600 de 0.1 en 20 mi de medio TM3 que contiene 50 ug/ml de espectinomicina, 25 g/ml de cloranfenicol y 50 g/ml de carbenicilina (en un matraz Erlenmeyer con deflectores de 250 mi) y se incubaron a 34 °C y 200 rpm. Después de 2 horas de crecimiento, se determina la OD600 y se agrega 200 µ? de IPTG. Las muestras se toman con regularidad durante el transcurso de la fermentación. En cada momento específico, se determina la OD600. Además, se realiza el análisis de emisión de gases de isopreno con el uso de un ensayo de cromatógrafo de gases-espectrómetro de masas (GC-MS) (Agilent) con espacio vacío. Cien microlitros de caldo de cultivo completo se colocan en un vial de GC sellado y se incuban a 34 °C y 200 rpm durante un tiempo ajustado de 30 minutos. Después de una etapa de eliminación por calor, que consiste de incubación a 70 °C durante 7 minutos, la muestra se coloca en el GC. La productividad específica reportada es la cantidad de isopreno en pg/l según el GC dividida por el tiempo de incubación (30 min) y la OD600 determinada .
Ejemplo 26. Producción de isopreno por cepas que expresan fosfocetolasa que contienen mutaciones del huésped a una escala de 15 1. (i) Materiales Receta del medio (por litro de medio de fermentación) : K2HP04 7.5 g, MgS04 * 7H20 2 g, monohidrato de ácido cítrico 2 g, citrato de amonio férrico 0.3 g, extracto de levadura 0.5 g, ácido sulfúrico al 50% 1.6 mi, solución de metales traza modificada 1000X 1 mi. Todos los componentes se agregaron junto y se disolvieron en Di H20. Esta solución se esterilizó con calor (123°C durante 20 minutos) . El pH se ajustó hasta 7.0 con hidróxido de amonio (28%) y q.s. hasta volumen. Se agregó glucosa 10 g, solución de vitaminas 8 mi y antibióticos después de la esterilización y ajuste de pH.
Solución de metales traza modificada 1000X (por litro) : ácidos cítricos * H20 40 g, MnS04 * H20 30 g, NaCl 10 g, FeS04 * 7H20 1 g, CoC12 * 6H20 1 g, ZnSO * 7H20 1 g, CuS04 * 5H20 100 mg, H3B03 100 mg, NaMo04 * 2H20 100 mg. Cada componente se disolvió uno a la vez en Di H20, el pH se ajustó hasta 3.0 con HCl/NaOH y, después, la solución se llevó hasta volumen y se esterilizó con un filtro de 0.22 micrones.
Solución de vitaminas (por litro) : hidrocloruro de tiamina 1.0 g, D- (+) -biotina 1.0 g, ácido nicotínico 1.0 g, clorhidrato de piridoxina 4.0 g. Cada componente se disolvió uno a la vez en Di H20, el pH se ajustó hasta 3.0 con HCl/NaOH y, después, la solución se llevó hasta volumen y se esterilizó con un filtro de 0.22 micrones.
Solución de sales macro (por litro) : MgS04 * 7H20 296 g, monohidrato de ácido cítrico 296 g, citrato de amonio férrico 49.6 g. Todos los componentes se disolvieron en agua, se llevaron hasta volumen y se esterilizaron con un filtro de 0.22 micrones.
Solución de suministro (por kilogramo) : glucosa 0.590 kg, Di H20 0.393 kg, K2HP04 7.4 g y Foamblast 882 al 100% 8.9 g. Todos los componentes se mezclaron y se esterilizaron en autoclave. Después de esterilizar en autoclave la solución de suministro, se agregó suplementos de nutrientes en la botella de suministro en una campana estéril. Las adiciones posesterilización para el suministro son (por kilogramo de solución de suministro) solución de sales macro 5.54 mi, solución de vitaminas 6.55 mi, solución de metales traza modificada 1000X 0.82 mi. (ii) Análisis Las concentraciones de isopreno, oxígeno, nitrógeno y dióxido de carbono en la emisión de gas se determinaron independientemente por dos espectrómetros de masas, un iSCAN (Hamilton Sundstrand) y un espectrómetro de masas Hiden HPR20 (Hiden Analytical) .
El oxígeno disuelto en el caldo de fermentación se determina por una sonda esterilizable, sanitaria con un sensor óptico proporcionada por Hamilton Company.
Las concentraciones de citrato, glucosa, acetato y mevalonato en el caldo fermentador se determinan en muestras de caldo de cultivo tomadas a intervalos de 4 horas por un análisis por HPLC. La concentración en las muestras de caldo de cultivo se determina por comparación de la respuesta del índice de refracción contra una curva de calibración generada previamente con el uso del estándar de una concentración conocida.
Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (43)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:
1. Células recombinantes con la capacidad de producir isopreno, caracterizadas porque las células comprenden uno o más ácidos nucleicos heterologos que codifican un polipéptido que tiene actividad de fosfocetolasa y (i) uno o más ácidos nucleicos que codifican uno o más polipéptidos de la ruta completa del MVA y (ii) un ácido nucleico heterólogo que codifica un polipéptido de isopreno sintasa, en donde cultivar las células recombinantes en un medio adecuado permite la producción de isopreno.
2. Las células de conformidad con la reivindicación 1, caracterizadas porque además el o los ácidos nucleicos heterologos que codifican un polipéptido que tiene actividad de fosfocetolasa tienen la capacidad de sintetizar gliceraldehído 3-fosfato y acetil fosfato a partir de xilulosa 5-fosfato.
3. Las células de conformidad con la reivindicación 1, caracterizadas porque además el o los ácidos nucleicos heterologos que codifican un polipéptido que tiene actividad de fosfocetolasa tienen la capacidad de sintetizar eritrosa 4-fosfato y acetil fosfato a partir de fructosa 6-fosfato.
4. Las células de conformidad con la reivindicación 1, caracterizadas porque además el ácido nucleico heterólogo que codifica un polipéptido que tiene actividad de fosfocetolasa se selecciona del grupo que consiste en: Bifidobacterium longum, Enterococcus galliniarum, Clostridium acetobutilicum, Nostoc punctiforme, Rhodopseudomonas palustris, Pantoea, Mucilaginibacter paludis, Thermobifida fusca, Bifidobacterium breve, Rahnella aquatili , Bifidobacterium animalis, Gardnerella vaginalis, Streptomyces avermitilis, Lactobacillus plantarum y Lactobacillus reuteri.
5. Las células de conformidad con la reivindicación 1, caracterizadas porque además el ácido nucleico heterólogo que codifica un polipéptido que tiene actividad de fosfocetolasa se selecciona del grupo que consiste en: Bifidobacterium longum, Enterococcus galliniarum y Clostridium acetobutilicum.
6. Las células de conformidad con la reivindicación 1, caracterizadas porque además el ácido nucleico heterólogo que codifica un polipéptido de isopreno sintasa es un polipéptido de isopreno sintasa vegetal.
7. Las células de conformidad con la reivindicación 1, caracterizadas porque además el polipéptido de isopreno sintasa es un polipéptido de Pueraria o Populus o un híbrido, Populus alba x Populus trémula.
8. Las células de conformidad con la reivindicación 1, caracterizadas porque además el polipéptido de isopreno sintasa se selecciona del grupo que consiste en Pueraria montana o Pueraria lobata, Populus tremuloides, Populus alba, Populus nigra y Populus trichocarpa.
9. Las células de conformidad con la reivindicación 1, caracterizadas porque además uno o más polipéptidos de la ruta completa del MVA se seleccionan dé (a) una enzima que condensa dos moléculas de acetil-CoA para formar acetoacetil-CoA; (b) una enzima que condensa acetoacetil-CoA con acetil-CoA para formar HMG-CoA (por ejemplo, HMG sintasa) ; (c) una enzima que convierte HMG-CoA a mevalonato; (d) una enzima que fosforiza mevalonato a mevalonato 5-fosfato; (e) una enzima que convierte mevalonato 5-fosfato a mevalonato 5-pirofosfato; y (f) una enzima que convierte mevalonato 5-pirofosfato a isopentenil pirofosfato.
10. Las células de conformidad con la reivindicación 9, caracterizadas porque además comprenden uno o más ácidos nucleicos que codifican uno o más polipéptidos de la ruta de 1-deoxi-D-xilulosa 5-fosfato (DXP) .
11. Las células de conformidad con la reivindicación 1, caracterizadas porque además el o los ácidos nucleicos se colocan bajo un promotor inducible o un promotor constitutivo .
12. Las células de conformidad con la reivindicación 1, caracterizadas porque además el o los ácidos nucleicos se clonan en uno o más plásmidos multicopia.
13. Las células de conformidad con la reivindicación 1, caracterizadas porque además el o los ácidos nucleicos se integran en un cromosoma de las células .
14. Las células de conformidad con la reivindicación 1, caracterizadas porque además las células recombinantes son células bacterianas gram positivas, células bacterianas gram negativas, células fúngicas, células fúngicas filamentosas, células de algas o células de levadura.
15. Las células de conformidad con la reivindicación 1, caracterizadas porque además se seleccionan del grupo que consiste en Bacillus subtilis, Streptomyces lividans, Streptomyces coelicolor, Streptomyces griseus, Escherichia coli, Pantoea citrea, Trichoderma reesei, Aspergillus oryzae y Aspergillus niger, Saccharomyces cerevisieae y Yarrowia lipolytica .
16. Las células recombinantes con la capacidad de producir precursores de isoprenoides, caracterizadas porque comprenden uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican un polipéptido que tiene actividad de fosfocetolasa y uno o más ácidos nucleicos que codifican uno o más polipéptidos de la ruta completa del MVA, caracterizadas porque cultivar tales células recombinantes en un medio adecuado permite la producción de precursores de isoprenoides.
17. Las células de conformidad con la reivindicación 16, caracterizadas porque además el o los ácidos nucleicos heterólogos que codifican un polipéptido que tiene actividad de fosfocetolasa tienen la capacidad de sintetizar gliceraldehído 3-fosfato y acetil fosfato a partir de xilulosa 5-fosfato.
18. Las células de conformidad con la reivindicación 16, caracterizadas porque además el o los ácidos nucleicos heterólogos que codifican un polipéptido que tiene actividad de fosfocetolasa tienen la capacidad de sintetizar eritrosa 4-fosfato y acetil fosfato a partir de fructosa 6-fosfato.
19. Las células de conformidad con la reivindicación 16, caracterizadas porque además el ácido nucleico heterólogo que codifica un polipéptido que tiene actividad de fosfocetolasa se selecciona del grupo que consiste en: Bifidobacterium longum, Enterococcus galliniarum, Clostridium acetobutilicum, Nostoc punctiforme, Rhodopseudomonas palustris, Pantoea, Mucilaginibacter paludis, Thermobifida fusca, Bifidobacterium breve, Rahnella aquatili , Bifidobacterium animalis, Gardnerella vaginalis, Streptomyces avermitilis, Lactobacillus plantarum y Lactobacillus reuteri.
20. Las células de conformidad con la reivindicación 16, caracterizadas porque además el ácido nucleico heterólogo que codifica un polipéptido que tiene actividad de fosfocetolasa se selecciona del grupo que consiste en: Bifidobacterium longum, . Enterococcus galliniarum y Clostridium acetobutilicum.
21. Las células de conformidad con la reivindicación 16, caracterizadas porque además uno o más polipéptidos de la ruta completa del MVA se seleccionan de (a) una enzima que condensa dos moléculas de acetil-CoA para formar acetoacetil-CoA; (b) una enzima que condensa acetoacetil-CoA con acetil-CoA para formar HMG-CoA (por ejemplo, HMG sintasa) ; (c) una enzima que convierte HMG-CoA a mevalonato; (d) una enzima que fosforiza mevalonato a mevalonato 5-fosfato; (e) una enzima que convierte mevalonato 5-fosfato a mevalonato 5-pirofosfato; y (f) una enzima que convierte mevalonato 5-pirofosfato a isopentenil pirofosfato.
22. Las células de conformidad con la reivindicación 16, caracterizadas porque además el o los ácidos nucleicos se colocan bajo un promotor inducible o un promotor constitutivo.
23. Las células de conformidad con la reivindicación 16, caracterizadas porque además el o los ácidos nucleicos se clonan en uno o más plásmidos multicopia.
24. Las células de conformidad con la reivindicación 16, caracterizadas porque además el o los ácidos nucleicos se integran en un cromosoma de las células.
25. Las células de conformidad con la reivindicación 16, caracterizadas porque además son células bacterianas gram positivas, células bacterianas gram negativas, células fúngicas, células fúngicas filamentosas, células de algas o células de levadura.
26. Las células de conformidad con la reivindicación 16, caracterizadas porque además se seleccionan del grupo que consiste en Bacillus subtilis, .Streptomyces lividans, Streptomyces coelicolor, Streptomyces griseus, Escherichia coli, Pantoea citrea, Trichoderma reesei, Aspergillus oryzae y Aspergillus niger, Saccharomyces cerevisieae y Yarrowia lipolytica .
27. Las células recombinantes con la capacidad de producir isoprenoides , caracterizadas porque las células comprenden uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican un polipéptido que tiene actividad de fosfocetolasa y (i) uno o más ácidos nucleicos que codifican uno o más polipéptidos de la ruta completa del VA y (ii) un ácido nucleico heterólogo que codifica un polipéptido de poliprenil pirofosfato sintasa, en donde cultivar tales células recombinantes en un medio adecuado permite la producción de isoprenoides.
28. Las células de conformidad con la reivindicación 27, caracterizadas porque además el o los ácidos nucleicos heterólogos que codifican un polipéptido que tiene actividad de fosfocetolasa tienen la capacidad de sintetizar gliceraldehído 3 -fosfato y acetil fosfato a partir de xilulosa 5-fos.fato.
29. Las células de conformidad con la reivindicación 27, caracterizadas porque además el o los ácidos nucleicos heterólogos que codifican un polipéptido que tiene actividad de fosfocetolasa tienen la capacidad de sintetizar eritrosa 4-fosfato y acetil fosfato a partir de fructosa 6-fosfato.
30. Las células de conformidad con la reivindicación 27, caracterizadas porque además el ácido nucleico heterologo que codifica un polipéptido que tiene actividad de fosfocetolasa se selecciona del grupo que consiste en: Bifidobacterium longum, Enterococcus galliniarum, Clostridium acetobutilicum, Nostoc punctiforme, Rhodopseudomonas palustris, Pantoea , Mucilaginibacter paludis, Thermobifida fusca, Bifidobacterium breve, Rahnella aquatili, Bifidobacterium animalis, Gardnerella vaginalis, Streptomyces avermitilis, Lactobacillus plantarum y Lactobacillus reuteri.
31. Las células de conformidad con la reivindicación 27, caracterizadas porque además el ácido nucleico heterologo que codifica un polipéptido que tiene actividad de fosfocetolasa se selecciona del grupo que consiste en: Bifidobacterium longum, Enterococcus galliniarum y Clostridium acetobutilicum .
32. Las células de conformidad con la reivindicación 27, caracterizadas porque el isoprenoide se selecciona del grupo que consiste en monoterpenos , diterpenos, triterpenos, tetraterpenos, sequiterpeno y politerpeno.
33. Las células de conformidad con la reivindicación 27, caracterizadas porque además el isoprenoide es un sesquiterpeno .
34. Las células de conformidad con la reivindicación 27, caracterizadas porque además el isoprenoide se selecciona del grupo que consiste en abietadieno, amorfadieno, careno, -fameseno, ß-farneseno, farnesol, geraniol, geranilgeraniol, linalol, limoneno, mirceno, nerolidol, ocimeno, patchoulol, ß-pineno, sabineno, ?-terpineno, terpindeno y valenceno.
35. Las células de conformidad con la reivindicación 27, caracterizadas porque además uno o más polipéptidos de la ruta completa del MVA se seleccionan de (a) una enzima que condensa dos moléculas de acetil-CoA para formar acetoacetil-CoA; (b) una enzima que condensa acetoacetil-CoA con acetil-CoA para formar HMG-CoA (por ejemplo, HMG sintasa) ; (c) una enzima que convierte HMG-CoA a mevalonato; (d) una enzima que fosforiza mevalonato a mevalonato 5-fosfato; (e) una enzima que convierte mevalonato 5-fosfato a mevalonato 5-pirofosfato; y (f) una enzima que convierte mevalonato 5-pirofosfato a isopentenil pirofosfato.
36. Las células de conformidad con la reivindicación 27, caracterizadas porque además el o los ácidos nucleicos se colocan bajo un promotor inducible o un promotor constitutivo .
37. Las células de conformidad con la reivindicación 27, caracterizadas porque además el o los ácidos nucleicos se clonan en uno o más plásmidos multicopia.
38. Las células de conformidad con la reivindicación 27, caracterizadas porque además el o los ácidos nucleicos se integran en un cromosoma de las células.
39. Las células de conformidad con la reivindicación 1, caracterizadas porque además las células hospederas recombinantes son células bacterianas gram positivas, células bacterianas gram negativas, células fúngicas, células fúngicas filamentosas, células de algas o células de levadura .
40. Las células de conformidad con la reivindicación 1, caracterizadas porque además las células hospederas recombinantes se seleccionan del grupo que consiste en Bacillus subtilis, Streptomyces lividans, Streptomyces coelicolor, Streptomyces griseus, Escherichia coli, Pantoea citrea, Trichoderma reesei, Aspergillus oryzae y Aspergillus niger, Saccharomyces cerevisieae y Yarrowia lipolytica.
41. Un método para producir isopreno; caracterizado porque comprende: (a) cultivar la célula recombinante de conformidad con la reivindicación 1 en condiciones adecuadas para producir isopreno y (b) producir isopreno.
42. Un método para producir un precursor de isoprenoides ; caracterizado porque comprende: (a) cultivar la célula recombinante de conformidad con la reivindicación 16 en condiciones adecuadas para producir un precursor de isoprenoides y (b) producir un precursor de isoprenoides.
43. Un método para producir un isoprenoide; caracterizado porque comprende: (a) cultivar la célula recombinante de conformidad con la reivindicación 27 en condiciones adecuadas para producir un isoprenoide y (b) producir un isoprenoide.
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