ES2716231T3 - Procedimientos para producir isopreno - Google Patents

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Joseph Mcauliffe
Michael Miller
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Erin Webster
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Gregory Whited
Duca Richard La
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Abstract

Un procedimiento para la producción de isopreno, comprendiendo el procedimiento: (a) cultivar células en condiciones de cultivo adecuadas para la producción de isopreno, en el que la fase gaseosa comprende menos del 9,5% (en volumen) de oxígeno o el 9,5% (en volumen) de oxígeno, y (b) producir isopreno, en el que las células producen más de 400 nmoles/gwcm/h de isopreno, en el que las células comprenden un ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido de isopreno sintasa y en el que las células comprenden además uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican para uno o más polipéptidos de la ruta de mevalonato (MVA) y/o una o más copias de ácidos nucleicos endógenos que codifican para uno o más polipéptidos de la ruta de MVA, y/o en el que las células comprenden además un ácido nucleico que codifica para un polipéptido de difosfato de isopentilo delta isomerasa (IDI), y/o en el que las células comprenden además un ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido de 1-desoxixilulosa-5-fosfato sintasa (DXS), y/o en el que las células comprenden además una copia de un ácido nucleico endógeno que codifica para un polipéptido de DXS.

Description

DESCRIPCIÓN
Procedimientos para producir isopreno
Antecedentes de la invención
El isopreno (2-metil-1,3-butadieno) es el material de partida crítico para una diversidad de polímeros sintéticos, lo más notablemente cauchos sintéticos. El isopreno se produce de manera natural por una diversidad de especies microbianas, vegetales y animales. En particular, se han identificado dos rutas para la biosíntesis de isopreno: la ruta de mevalonato (MVA) y la ruta no de mevalonato (DXP) (figura 19). Sin embargo, el rendimiento de isopreno de organismos que se producen de manera natural no es comercialmente atractivo. Aproximadamente se producen 800.000 toneladas al año de c/s-poliisopreno a partir de la polimerización de isopreno; la mayor parte de este poliisopreno se usa en la industria de neumáticos y caucho. El isopreno también se copolimeriza para su uso como elastómero sintético en otros productos tales como calzado, productos mecánicos, productos médicos, artículos deportivos y látex.
Actualmente, la industria de neumáticos y caucho se basa en el uso de caucho natural y sintético. El caucho natural se obtiene a partir del jugo lechoso de árboles o plantas de caucho encontrados en las selvas de África. El caucho sintético se basa principalmente en polímeros de butadieno. Para estos polímeros, se obtiene butadieno como coproducto de la fabricación de etileno y propileno.
Aunque el isopreno puede obtenerse mediante fraccionamiento de petróleo, la purificación de este material es costosa y requiere mucho tiempo. El craqueo de petróleo de la corriente C5 de hidrocarburos sólo produce aproximadamente el 15% de isopreno. Por tanto, se necesitan procedimientos más económicos para producir isopreno. En particular, son deseables procedimientos que produzcan isopreno a velocidades, títulos y pureza que son suficientes para cumplir las demandas de un procedimiento comercial robusto. También se desean sistemas para producir isopreno a partir de materiales de partida económicos. En la técnica anterior se conocen procedimientos para producir isopreno usando células genéticamente modificadas, por ejemplo de los documentos WO 2007/140339 o WO 2008/003078.
Breve sumario de la invención
La invención proporciona:
[1] Un procedimiento de producción de isopreno, comprendiendo el procedimiento
(a) cultivar células en condiciones de cultivo adecuadas para la producción de isopreno, en el que la fase gaseosa comprende menos del 9,5% (en volumen) de oxígeno o el 9,5% (en volumen) de oxígeno, y
(b) producir isopreno, en el que las células producen más de 400 nmoles/gwcm/h de isopreno,
en el que las células comprenden un ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido de isopreno sintasa y en el que las células comprenden además uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican para uno o más polipéptidos de la ruta de mevalonato (MVA) y/o una o más copias de ácidos nucleicos endógenos que codifican para uno o más polipéptidos de la ruta de MVA, y/o en el que las células comprenden además un ácido nucleico que codifica para un polipéptido de difosfato de isopentilo delta-isomerasa (IDI), y/o en el que las células comprenden además un ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido de 1-desoxixilulosa-5-fosfato sintasa (DXS), y/o en el que las células comprenden además una copia de un ácido nucleico endógeno que codifica para un polipéptido de DXS.
[2] El procedimiento de [1], en el que la concentración de oxígeno limitante es del 9,5% en volumen de oxígeno, la temperatura está entre 25°C y 55°C, y la presión está entre 101,325 kPa y 303,975 kPa.
[3] El procedimiento de uno cualquiera de [1] o [2], en el que el polipéptido de isopreno sintasa es un polipéptido de isopreno sintasa vegetal.
[4] El procedimiento de uno cualquiera de [1] - [3], en el que las células son células bacterianas.
[5] El procedimiento de [4], en el que las células bacterianas se seleccionan del grupo que consiste en células de Escher/ch/a col/, Pantoea c/trea, Bac/llus subt/l/s, Bac/llus l/chen/form/s, Bac/llus lentus, Bac/llus brev/s, Bac/llus stearothermoph/lus, Bac/llus alkaloph/lus, Bac/llus amylol/quefac/ens, Bac/llus claus//, Bac/llus halodurans, Bac/llus megater/um, Bac/llus coagulans, Bac/llus c/rculans, Bac/llus lautus, Bac/llus thur/ng/ens/s, Streptomyces l/v/dans, Streptomyces coel/color, Streptomyces gr/seus, Pseudomonas sp. y Pseudomonas alcal/genes.
[6] El procedimiento de uno cualquiera de [1] - [3], en el que las células son células fúngicas.
[7] El procedimiento de [6], en el que las células fúngicas se seleccionan del grupo que consiste en células de Aspergillus sp., levadura, Trichoderma sp., Yarrowia sp., Saccharomyces sp., Schizosaccharomyces sp., Pichia sp., Candida sp., Aspergillus oryzae, Aspergillus niger, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Trichoderma reesei, H. insolens, H. lanuginose, H. grisea, Candida lucknowense, Aspergillus sojae, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus aculeatus, Aspergillus awamori, Fusarium roseum, Fusarium graminum, Fusarium cerealis, Fusarium oxysporum, F. venenatum, Neurospora crassa, Mucor miehei, Trichoderma viride, Fusarium oxysporum y Fusarium solani.
[8] El procedimiento de uno cualquiera de [1] - [3], en el que las células son células de algas.
[9] El procedimiento de [8], en el que las células de algas se seleccionan del grupo que consiste en algas verdes, algas rojas, glaucofitas, cloraracniofitas, euglenoideos, cromistas y dinoflagelados.
[10] El procedimiento de uno cualquiera de [1] - [9], en el que el ácido nucleico que codifica para el polipéptido de IDI es un ácido nucleico heterólogo.
[11] El procedimiento de uno cualquiera de [1] - [10], en el que el polipéptido de IDI es un polipéptido de IDI de levadura.
[12] El procedimiento de uno cualquiera de [1] - [9] y [11], en el que el ácido nucleico que codifica para el polipéptido de IDI es una copia de un ácido nucleico endógeno que codifica para un polipéptido de IDI.
[13] El procedimiento de uno cualquiera de [1] - [12], en el que las células comprenden además uno o más ácidos nucleicos que codifican para los polipéptidos de toda la ruta de MVA.
[14] El procedimiento de uno cualquiera de [1] - [13], en el que las células se hacen crecer en condiciones de glucosa limitada.
[15] El procedimiento de uno cualquiera de [1] - [14], en el que la cantidad de isopreno producido durante la fase estacionaria es mayor de 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, o más veces o es 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, o más veces la cantidad de isopreno producido durante la fase de crecimiento para la misma duración de tiempo.
[16] El procedimiento de uno cualquiera de [1] - [15], comprendiendo el procedimiento además la etapa de recuperar el isopreno.
[17] El procedimiento de uno cualquiera de [1] - [16], comprendiendo el procedimiento además la etapa de purificar el isopreno.
En un aspecto, la divulgación presenta células en cultivo que producen isopreno. En algunas realizaciones, la divulgación proporciona células en cultivo que producen más de aproximadamente 400 nmoles de isopreno/gramo de células para el peso húmedo de las células/hora (nmoles/gwcm/h) de isopreno. En algunas realizaciones, las células tienen un ácido nucleico heterólogo que (i) codifica para un polipéptido de isopreno sintasa y (ii) está unido operativamente a un promotor. En algunas realizaciones, las células se cultivan en un medio de cultivo que incluye una fuente de carbono, tal como, pero sin limitarse a, un hidrato de carbono, glicerol, glicerina, dihidroxiacetona, fuente de un carbono, aceite, grasa animal, aceite animal, ácido graso, lípido, fosfolípido, glicerolípido, monoglicérido, diglicérido, triglicérido, fuente de carbono renovable, polipéptido (por ejemplo, una proteína o péptido microbiano o vegetal), extracto de levadura, componente de un extracto de levadura, o cualquier combinación de dos o más de los anteriores. En algunas realizaciones, las células se cultivan en condiciones de glucosa limitada. En algunas realizaciones, la divulgación proporciona células en cultivo que convierten más de aproximadamente el 0,002% del carbono en un medio de cultivo celular en isopreno. En algunas realizaciones, las células tienen un ácido nucleico heterólogo que (i) codifica para un polipéptido de isopreno sintasa y (ii) está unido operativamente a un promotor. En algunas realizaciones, las células se cultivan en un medio de cultivo que incluye una fuente de carbono, tal como, pero sin limitarse a, un hidrato de carbono, glicerol, glicerina, dihidroxiacetona, fuente de un carbono, aceite, grasa animal, aceite animal, ácido graso, lípido, fosfolípido, glicerolípido, monoglicérido, diglicérido, triglicérido, fuente de carbono renovable, polipéptido (por ejemplo, una proteína o péptido microbiano o vegetal), extracto de levadura, componente de un extracto de levadura, o cualquier combinación de dos o más de los anteriores. En algunas realizaciones, las células se cultivan en condiciones de glucosa limitada.
En algunas realizaciones, la divulgación proporciona células en cultivo que comprenden un ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido de isopreno sintasa. En algunas realizaciones, las células tienen un ácido nucleico heterólogo que (i) codifica para un polipéptido de isopreno sintasa y (ii) está unido operativamente a un promotor. En algunas realizaciones, las células se cultivan en un medio de cultivo que incluye una fuente de carbono, tal como, pero sin limitarse a, un hidrato de carbono, glicerol, glicerina, dihidroxiacetona, fuente de un carbono, aceite, grasa animal, aceite animal, ácido graso, lípido, fosfolípido, glicerolípido, monoglicérido, diglicérido, triglicérido, fuente de carbono renovable, polipéptido (por ejemplo, una proteína o péptido microbiano o vegetal), extracto de levadura, componente de un extracto de levadura, o cualquier combinación de dos o más de los anteriores. En algunas realizaciones, las células se cultivan en condiciones de glucosa limitada.
En un aspecto, la divulgación presenta procedimientos de producir isopreno, tal como procedimientos de usar cualquiera de las células descritas en el presente documento para producir isopreno. En algunas realizaciones, el procedimiento implica cultivar células en condiciones suficientes para producir más de aproximadamente 400 nmoles/gwcm/h de isopreno. En algunas realizaciones, el procedimiento también incluye recuperar isopreno producido por las células. En algunas realizaciones, el procedimiento incluye purificar isopreno producido por las células. En algunas realizaciones, el procedimiento incluye polimerizar el isopreno. En algunas realizaciones, las células tienen un ácido nucleico heterólogo que (i) codifica para un polipéptido de isopreno sintasa y (ii) está unido operativamente a un promotor. En algunas realizaciones, las células se cultivan en un medio de cultivo que incluye una fuente de carbono, tal como, pero sin limitarse a, un hidrato de carbono, glicerol, glicerina, dihidroxiacetona, fuente de un carbono, aceite, grasa animal, aceite animal, ácido graso, lípido, fosfolípido, glicerolípido, monoglicérido, diglicérido, triglicérido, fuente de carbono renovable, polipéptido (por ejemplo, una proteína o péptido microbiano o vegetal), extracto de levadura, componente de un extracto de levadura, o cualquier combinación de dos o más de los anteriores. En algunas realizaciones, las células se cultivan en condiciones de glucosa limitada. En diversas realizaciones, la cantidad de isopreno producido (tal como la cantidad total de isopreno producido o la cantidad de isopreno producido por litro de caldo por hora por DO600) durante la fase estacionaria es mayor de o aproximadamente 2 o más veces la cantidad de isopreno producido durante la fase de crecimiento para la misma duración de tiempo. En algunas realizaciones, la fase gaseosa comprende más de o aproximadamente el 9,5% (en volumen) de oxígeno, y la concentración de isopreno en la fase gaseosa es menor que el límite de inflamabilidad inferior o mayor que el límite de inflamabilidad superior. En realizaciones particulares, (i) la concentración de isopreno en la fase gaseosa es menor que el límite de inflamabilidad inferior o mayor que el límite de inflamabilidad superior, y (ii) las células producen más de aproximadamente 400 nmoles/gwcm/h de isopreno.
En algunas realizaciones, el procedimiento incluye cultivar células en condiciones suficientes para convertir más de aproximadamente el 0,002% del carbono (mol/mol) en un medio de cultivo celular en isopreno. En algunas realizaciones, el procedimiento también incluye recuperar isopreno producido por las células. En algunas realizaciones, el procedimiento incluye purificar isopreno producido por las células. En algunas realizaciones, el procedimiento incluye polimerizar el isopreno. En algunas realizaciones, las células tienen un ácido nucleico heterólogo que (i) codifica para un polipéptido de isopreno sintasa y (ii) está unido operativamente a un promotor. En algunas realizaciones, las células se cultivan en un medio de cultivo que incluye una fuente de carbono, tal como, pero sin limitarse a, un hidrato de carbono, glicerol, glicerina, dihidroxiacetona, fuente de un carbono, aceite, grasa animal, aceite animal, ácido graso, lípido, fosfolípido, glicerolípido, monoglicérido, diglicérido, triglicérido, fuente de carbono renovable, polipéptido (por ejemplo, una proteína o péptido microbiano o vegetal), extracto de levadura, componente de un extracto de levadura, o cualquier combinación de dos o más de los anteriores. En algunas realizaciones, las células se cultivan en condiciones de glucosa limitada.
En algunas realizaciones, sólo se produce isopreno en la fase estacionaria. En algunas realizaciones, se produce isopreno tanto en la fase de crecimiento como en la fase estacionaria. En diversas realizaciones, la cantidad de isopreno producido (tal como la cantidad total de isopreno producido o la cantidad de isopreno producido por litro de caldo por hora por DO600) durante la fase estacionaria es mayor de o aproximadamente 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, o más veces la cantidad de isopreno producido durante la fase de crecimiento para la misma duración de tiempo.
En un aspecto, la divulgación presenta composiciones y sistemas que comprenden isopreno. En algunas realizaciones, la composición comprende más de o aproximadamente 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, o 1000 mg de isopreno. En algunas realizaciones, la composición comprende más de o aproximadamente 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 g de isopreno (p/p) de la fracción orgánica volátil de la composición es isopreno.
En algunas realizaciones, la composición comprende más de o aproximadamente el 99,90, el 99,92, el 99,94, el 99,96, el 99,98 o el 100% de isopreno en peso en comparación con el peso total de todos los hidrocarburos C5 en la composición. En algunas realizaciones, la composición comprende menos de o aproximadamente el 0,12, el 0,10, el 0,08, el 0,06, el 0,04, el 0,02, el 0,01, el 0,005, el 0,001, el 0,0005, el 0,0001, el 0,00005 o el 0,00001% de hidrocarburos C5 distintos de isopreno (tal como 1,3-ciclopentadieno, c/s-1,3-pentadieno, frans-1,3-pentadieno, 1-pentino, 2-pentino, 1-penteno, 2-metil-1-buteno, 3-metil-1-butino, frans-piperileno, c/s-piperileno, pent-4-en-1-ino, frans-pent-3-en-1-ino, o c/s-pent-3-en-1-ino) en peso en comparación con el peso total de todos los hidrocarburos C5 en la composición. En algunas realizaciones, la composición tiene menos de o aproximadamente el 0,12, el 0,10, el 0,08, el 0,06, el 0,04, el 0,02, el 0,01, el 0,005, el 0,001, el 0,0005, el 0,0001, el 0,00005 o el 0,00001% para 1,3-ciclopentadieno, c/s-1,3-pentadieno, frans-1,3-pentadieno, 1-pentino, 2-pentino, 1-penteno, 2-metil-1-buteno, 3-metil-1-butino, frans-piperileno, c/s-piperileno, pent-4-en-1-ino, frans-pent-3-en-1-ino, o c/s-pent-3-en-1-ino en peso en comparación con el peso total de todos los hidrocarburos C5 en la composición. En realizaciones particulares, la composición tiene más de aproximadamente 2 mg de isopreno y tiene más de o aproximadamente el 99,90, el 99,92, el 99,94, el 99,96, el 99,98 o el 100% de isopreno en peso en comparación con el peso total de todos los hidrocarburos C5 en la composición.
En algunas realizaciones, la composición tiene menos de o aproximadamente 50, 40, 30, 20, 10, 5, 1, 0,5, 0,1, 0,05, 0,01, o 0,005 ug/l de un compuesto que inhibe la polimerización de isopreno para cualquier compuesto en la composición que inhibe la polimerización de isopreno. En realizaciones particulares, la composición también tiene más de aproximadamente 2 mg de isopreno.
En algunas realizaciones, la composición tiene uno o más compuestos seleccionados del grupo que consiste en etanol, acetona, alcoholes prenílicos C5, y compuestos isoprenoides con 10 o más átomos de carbono. En algunas realizaciones, la composición tiene más de o aproximadamente 0,005, 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1, 5, 10, 20, 30, 40, 60, 80, 100, o 120 ug/l de etanol, acetona, un alcohol prenílico C5 (tal como 3-metil-3-buten-1-ol o 3-metil-2-buten-1-ol), 0 dos cualesquiera o más de los anteriores. En realizaciones particulares, la composición tiene más de aproximadamente 2 mg de isopreno y tiene uno o más compuestos seleccionados del grupo que consiste en etanol, acetona, alcoholes prenílicos C5, y compuestos isoprenoides con 10 o más átomos de carbono.
En algunas realizaciones, la composición incluye isopreno y uno o más segundos compuestos seleccionados del grupo que consiste en 2-heptanona, 6-metil-5-hepten-2-ona, 2,4,5-trimetilpiridina, 2,3,5-trimetilpirazina, citronelal, acetaldehído, metanotiol, acetato de metilo, 1-propanol, diacetilo, 2-butanona, 2-metil-3-buten-2-ol, acetato de etilo, 2-metil-1-propanol, 3-metil-1-butanal, 3-metil-2-butanona, 1-butanol, 2-pentanona, 3-metil-1-butanol, isobutirato de etilo, 3-metil-2-butenal, acetato de butilo, acetato de 3-metilbutilo, acetato de 3-metil-3-but-1-enilo, acetato de 3-metil-2-but-1-enilo, (E)-3,7-dimetil-1,3,6-octatrieno, (Z)-3,7-dimetil-1,3,6-octatrieno y 2,3-cicloheptenolpiridina. En diversas realizaciones, la cantidad de uno de estos segundos componentes en relación con la cantidad de isopreno en unidades de porcentaje en peso (es decir, peso del componente dividido entre el peso de isopreno multiplicado por 100) es mayor de o aproximadamente el 0,01, el 0,02, el 0,05, el 0,1, el 0,5, el 1, el 5, el 10, el 20, el 30, el 40, el 50, el 60, el 70, el 80, el 90, el 100 o el 110% (p/p).
En algunas realizaciones, la composición comprende (i) una fase gaseosa que comprende isopreno y (ii) células en cultivo que producen más de aproximadamente 400 nmoles/gwcm/h de isopreno. En algunas realizaciones, la composición comprende un sistema cerrado, y la fase gaseosa comprende más de o aproximadamente 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 ug/l de isopreno cuando se normaliza con 1 ml de 1 DO600 cultivado durante 1 hora. En algunas realizaciones, la composición comprende un sistema abierto, y la fase gaseosa comprende más de o aproximadamente 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 ug/l de isopreno cuando se burbujea a una velocidad de 1 vvm. En algunas realizaciones, la fracción orgánica volátil de la fase gaseosa comprende más de o aproximadamente el 99,90, el 99,92, el 99,94, el 99,96, el 99,98 o el 100% de isopreno en peso en comparación con el peso total de todos los hidrocarburos C5 en la fracción orgánica volátil. En algunas realizaciones, la fracción orgánica volátil de la fase gaseosa comprende menos de o aproximadamente el 0,12, el 0,10, el 0,08, el 0,06, el 0,04, el 0,02, el 0,01, el 0,005, el 0,001, el 0,0005, el 0,0001, el 0,00005 o el 0,00001% de hidrocarburos C5 distintos de isopreno (tales como 1,3-ciclopentadieno, c/s-1,3-pentadieno, frans-1,3-pentadieno, 1-pentino, 2-pentino, 1-penteno, 2-metil-1-buteno, 3-metil-1-butino, frans-piperileno, c/s-piperileno, pent-4-en-1-ino, frans-pent-3-en-1-ino, o c/s-pent-3-en-1-ino) en peso en comparación con el peso total de todos los hidrocarburos C5 en la fracción orgánica volátil. En algunas realizaciones, la fracción orgánica volátil de la fase gaseosa tiene menos de o aproximadamente el 0,12, el 0,10, el 0,08, el 0,06, el 0,04, el 0,02, el 0,01, el 0,005, el 0,001, el 0,0005, el 0,0001, el 0,00005 o el 0,00001% para 1,3-ciclopentadieno, c/s-1,3-pentadieno, frans-1,3-pentadieno, 1-pentino, 2-pentino, 1-penteno, 2-metil-1-buteno, 3-metil-1-butino, frans-piperileno, c/s-piperileno, pent-4-en-1-ino, frans-pent-3-en-1-ino, o c/s-pent-3-en-1-ino en peso en comparación con el peso total de todos los hidrocarburos C5 en la fracción orgánica volátil. En realizaciones particulares, la fracción orgánica volátil de la fase gaseosa tiene más de aproximadamente 2 mg de isopreno y tiene más de o aproximadamente el 99,90, el 99,92, el 99,94, el 99,96, el 99,98 o el 100% de isopreno en peso en comparación con el peso total de todos los hidrocarburos C5 en la fracción orgánica volátil.
En algunas realizaciones, la fracción orgánica volátil de la fase gaseosa tiene menos de o aproximadamente 50, 40, 30, 20, 10, 5, 1, 0,5, 0,1, 0,05, 0,01, o 0,005 ug/l de un compuesto que inhibe la polimerización de isopreno para cualquier compuesto en la fracción orgánica volátil de la fase gaseosa que inhibe la polimerización de isopreno. En realizaciones particulares, la fracción orgánica volátil de la fase gaseosa también tiene más de aproximadamente 2 mg de isopreno.
En algunas realizaciones, la fracción orgánica volátil de la fase gaseosa tiene uno o más compuestos seleccionados del grupo que consiste en etanol, acetona, alcoholes prenílicos C5, y compuestos isoprenoides con 10 o más átomos de carbono. En algunas realizaciones, la fracción orgánica volátil de la fase gaseosa tiene más de o aproximadamente 0,005, 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1, 5, 10, 20, 30, 40, 60, 80, 100, o 120 ug/l de etanol, acetona, un alcohol prenílico C5 (tal como 3-metil-3-buten-1-ol o 3-metil-2-buten-1-ol), o dos cualesquiera o más de los anteriores. En realizaciones particulares, la fracción orgánica volátil de la fase gaseosa tiene más de aproximadamente 2 mg de isopreno y tiene uno o más compuestos seleccionados del grupo que consiste en etanol, acetona, alcoholes prenílicos C5, y compuestos isoprenoides con 10 o más átomos de carbono.
En algunas realizaciones, la fracción orgánica volátil de la fase gaseosa incluye isopreno y uno o más segundos compuestos seleccionados del grupo que consiste en 2-heptanona, 6-metil-5-hepten-2-ona, 2,4,5-trimetilpiridina, 2,3,5-trimetilpirazina, citronelal, acetaldehído, metanotiol, acetato de metilo, 1-propanol, diacetilo, 2-butanona, 2-metil-3-buten-2-ol, acetato de etilo, 2-metil-1-propanol, 3-metil-1-butanal, 3-metil-2-butanona, 1-butanol, 2 pentanona, 3-metiM-butanol, isobutirato de etilo, 3-metil-2-butenal, acetato de butilo, acetato de 3-metilbutilo, acetato de 3-metil-3-but-1-enilo, acetato de 3-metil-2-but-1-enilo, (E)-3,7-dimetil-1,3,6-octatrieno, (Z)-3,7-dimetil-1,3,6-octatrieno y 2,3-cicloheptenolpiridina. En diversas realizaciones, la cantidad de uno de estos segundos componentes en relación con la cantidad de isopreno en unidades de porcentaje en peso (es decir, peso del componente dividido entre el peso de isopreno multiplicado por 100) es mayor de o aproximadamente el 0,01, el 0,02, el 0,05, el 0,1, el 0,5, el 1, el 5, el 10, el 20, el 30, el 40, el 50, el 60, el 70, el 80, el 90, el 100 o el 110% (p/p) en la fracción orgánica volátil de la fase gaseosa.
En algunas realizaciones de cualquiera de las composiciones de la divulgación, al menos una porción del isopreno está en una fase gaseosa. En algunas realizaciones, al menos una porción del isopreno está en una fase líquida (tal como un condensado). En algunas realizaciones, al menos una porción del isopreno está en una fase sólida. En algunas realizaciones, al menos una porción del isopreno se adsorbe a un soporte sólido, tal como un soporte que incluye sílice y/o carbono activado. En algunas realizaciones, la composición incluye etanol. En algunas realizaciones, la composición incluye entre aproximadamente el 75 y aproximadamente el 90% en peso de etanol, tal como entre aproximadamente el 75 y aproximadamente el 80%, entre aproximadamente el 80 y aproximadamente el 85%, o entre aproximadamente el 85 y aproximadamente el 90% en peso de etanol. En algunas realizaciones, la composición incluye entre aproximadamente el 4 y aproximadamente el 15% en peso de isopreno, tal como entre aproximadamente el 4 y aproximadamente el 8%, entre aproximadamente el 8 y aproximadamente el 12%, o entre aproximadamente el 12 y aproximadamente el 15% en peso de isopreno.
En algunas realizaciones, la divulgación también presenta sistemas que incluyen cualquiera de las células y/o composiciones descritas en el presente documento. En algunas realizaciones, el sistema incluye un reactor cuya cámara comprende células en cultivo que producen más de aproximadamente 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1.000, 1.250, 1.500, 1.750, 2.000, 2.500, 3.000, 4.000, 5.000, o más nmoles/gwcm/h de isopreno. En algunas realizaciones, el sistema no es un sistema cerrado. En algunas realizaciones, al menos una porción del isopreno se retira del sistema. En algunas realizaciones, el sistema incluye una fase gaseosa que comprende isopreno. En diversas realizaciones, la fase gaseosa comprende cualquiera de las composiciones descritas en el presente documento.
En un aspecto, la divulgación proporciona un neumático que comprende poliisopreno. En algunas realizaciones, el poliisopreno se produce (i) polimerizando isopreno en cualquiera de las composiciones descritas en el presente documento o (ii) polimerizando isopreno recuperado de cualquiera de las composiciones descritas en el presente documento. En algunas realizaciones, el poliisopreno comprende c/s-1,4-poliisopreno.
En los procedimientos de la invención, se produce una concentración no inflamable de isopreno en la fase gaseosa. La fase gaseosa comprende menos de aproximadamente el 9,5% (en volumen) de oxígeno o el 9,5% (en volumen) de oxígeno. En algunas realizaciones de la divulgación, el gas comprende más de o aproximadamente el 9,5% (en volumen) de oxígeno, y la concentración de isopreno en la fase gaseosa es menor que el límite de inflamabilidad inferior o mayor que el límite de inflamabilidad superior. En algunas realizaciones, la porción de la fase gaseosa distinta de isopreno comprende entre aproximadamente el 0% y aproximadamente el 100% (en volumen) de oxígeno, tal como entre aproximadamente el 10% y aproximadamente el 100% (en volumen) de oxígeno. En algunas realizaciones, la porción de la fase gaseosa distinta de isopreno comprende entre aproximadamente el 0% y aproximadamente el 99% (en volumen) de nitrógeno. En algunas realizaciones, la porción de la fase gaseosa distinta de isopreno comprende entre aproximadamente el 1% y aproximadamente el 50% (en volumen) de CO2.
En la invención, las células en cultivo producen isopreno a más de o aproximadamente 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1.000, 1.250, 1.500, 1.750, 2.000, 2.500, 3.000, 4.000, 5.000, o más nmoles/gwcm/h de isopreno. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos de la invención, las células en cultivo convierten más de o aproximadamente el 0,002, el 0,005, el 0,01, el 0,02, el 0,05, el 0,1, el 0,12, el 0,14, el 0,16, el 0,2, el 0,3, el 0,4, el 0,5, el 0,6, el 0,7, el 0,8, el 0,9, el 1,0, el 1,2, el 1,4, el 1,6%, o más del carbono en el medio de cultivo celular en isopreno. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos de la divulgación, las células en cultivo producen isopreno a más de o aproximadamente 1, 10, 25, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1.000, 1.250, 1.500, 1.750, 2.000, 2.500, 3.000, 4.000, 5.000, 10.000, 100.000, o más ng de isopreno/gramo de células para el peso húmedo de las células/h (ng/gwcm/h). En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos de la invención, las células en cultivo producen un título acumulativo (cantidad total) de isopreno a más de o aproximadamente 1, 10, 25, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1.000, 1.250, 1.500, 1.750, 2.000, 2.500, 3.000, 4.000, 5.000, 10.000, 50.000, 100.000, o más mg de isopreno/lcaldo (mg/lcaldo, en el que el volumen de caldo incluye el volumen de las células y el medio celular). Otras tasas a modo de ejemplo de producción de isopreno y cantidades totales de producción de isopreno se divulgan en el presente documento.
En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos de la invención, las células comprenden además un ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido de IDI. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos de la invención, las células comprenden además una inserción de una copia de un ácido nucleico endógeno que codifica para un polipéptido de IDI. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos de la invención, las células comprenden además un ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido de DXS. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos de la invención, las células comprenden además una inserción de una copia de un ácido nucleico endógeno que codifica para un polipéptido de DXS. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos de la invención, las células comprenden además uno o más ácidos nucleicos que codifican para un polipéptido de IDI y un polipéptido de DXS. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos de la invención, un ácido nucleico codifica para el polipéptido de isopreno sintasa, polipéptido de IDI y polipéptido de DXS. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos de la invención, un vector codifica para el polipéptido de isopreno sintasa, polipéptido de IDI y polipéptido de DXS. En algunas realizaciones, el vector comprende un marcador selectivo, tal como un ácido nucleico de resistencia a antibióticos.
En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos de la invención, el ácido nucleico de isopreno sintasa heterólogo se une operativamente a un promotor T7, tal como un promotor T7 contenido en un plásmido de copia media o alta. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos de la invención, el ácido nucleico de isopreno sintasa heterólogo se une operativamente a un promotor Trc, tal como un promotor Trc contenido en un plásmido de copia media o alta. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos de la invención, el ácido nucleico de isopreno sintasa heterólogo se une operativamente a un promotor Lac, tal como un promotor Lac contenido en un plásmido de copia baja. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos de la invención, el ácido nucleico de isopreno sintasa heterólogo se une operativamente a un promotor endógeno, tal como un promotor de serina proteasa alcalino endógeno. En algunas realizaciones, el ácido nucleico de isopreno sintasa heterólogo se integra en un cromosoma de las células sin un marcador selectivo.
En algunas realizaciones, uno o más ácidos nucleicos de isopreno, DXP, IDI o de la ruta de MVA se ponen bajo el control de un promotor o factor que es más activo en la fase estacionaria que en la fase de crecimiento. Por ejemplo, uno o más ácidos nucleicos de isopreno, DXP, IDI o de la ruta de MVA pueden ponerse bajo el control de un factor sigma de fase estacionaria, tal como RpoS. En algunas realizaciones, uno o más ácidos nucleicos de isopreno, DXP, IDI o de la ruta de MVA se ponen bajo el control de un promotor inducible en la fase estacionaria, tal como un promotor inducible por un regulador de respuesta activo en la fase estacionaria.
En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos de la invención, al menos una porción de las células mantiene el ácido nucleico de isopreno sintasa heterólogo durante al menos o aproximadamente 5, 10, 20, 40, 50, 60, 65, o más divisiones celulares en un cultivo continuo (tal como un cultivo continuo sin dilución). En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos de la invención, el ácido nucleico que comprende el ácido nucleico de DXS, IDI o isopreno sintasa también comprende un marcador selectivo, tal como un ácido nucleico de resistencia a antibióticos.
En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos de la invención, las células comprenden además un ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido de la ruta de MVA (tal como un polipéptido de la ruta de MVA de Saccharomyces cerevisiae o Enterococcus faecalis). En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos de la invención, las células comprenden además una inserción de una copia de un ácido nucleico endógeno que codifica para un polipéptido de la ruta de MVA (tal como un polipéptido de la ruta de MVA de Saccharomyces cerevisiae o Enterococcus faecalis). En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos de la invención, las células comprenden un ácido nucleico de isopreno sintasa, DXS y la ruta de MVA. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos de la invención, las células comprenden un ácido nucleico de isopreno sintasa, un ácido nucleico de DXS, un ácido nucleico de IDI y un ácido nucleico de la ruta de MVA (además del ácido nucleico de IDI).
En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos de la invención, el polipéptido de isopreno sintasa es un polipéptido que se produce de manera natural de una planta tal como Pueraria (por ejemplo, Pueraria montana o Pueraria lobata).
En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos de la invención, las células son células bacterianas, tales como células bacterianas Gram positivas (por ejemplo, células de Bacillus tales como células de Bacillus subtilis o células de Streptomyces tales como células de Streptomyces lividans, Streptomyces coelicolor o Streptomyces griseus). En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos de la invención, las células son células bacterianas Gram negativas (por ejemplo, células de Escherichia tales como células de Escherichia coli o células de Pantoea tales como células de Pantoea citrea). En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos de la invención, las células son células fúngicas tales como células fúngicas filamentosas (por ejemplo, células de Trichoderma tales como células de Trichoderma reesei o células de Aspergillus tales como Aspergillus oryzae y Aspergillus niger) o células de levadura (por ejemplo, células de Yarrowia tales como células de Yarrowia lipolytica).
En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos de la invención, la fuente de carbono de polipéptido microbiano incluye uno o más polipéptidos de levadura o bacterias. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos de la invención, la fuente de carbono de polipéptido vegetal incluye uno o más polipéptidos de soja, maíz, canola, Jatropha, palma, cacahuete, girasol, coco, mostaza, colza, semilla de algodón, palmiste, oliva, girasol, sésamo o linaza.
En un aspecto, la invención presenta un producto producido por cualquiera de las composiciones o procedimientos de la invención.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 es la secuencia de nucleótidos de un gen de isopreno de kudzu optimizado por codones para la expresión en E. coli (SEQ ID NO: 1). El codón de inicio atg está en cursiva, el codón de terminación está en negrita y el sitio PstI añadido está subrayado.
La figura 2 es un mapa de pTrcKudzu.
La figura 3 es la secuencia de nucleótidos de pTrcKudzu (SEQ ID NO: 2). El RBS está subrayado, el codón de inicio de isopreno sintasa de kudzu está en letras mayúsculas en negrita y el codón de terminación está en letras mayúsculas, en cursiva y negrita. La estructura principal del vector es pTrcHis2B.
La figura 4 es un mapa de pETNHisKudzu.
La figura 5 es la secuencia de nucleótidos de pETNHisKudzu (SEQ ID NO: 5).
La figura 6 es un mapa de pCL-lac-Kudzu.
La figura 7 es la secuencia de nucleótidos de pCL-lac-Kudzu (SEQ ID NO: 7).
La figura 8A es un gráfico que muestra la producción de isopreno en células de E. coli BL21 sin vector.
La figura 8B es un gráfico que muestra la producción de isopreno en células de E. coli BL21 con pCL-lac-Kudzu. La figura 8C es un gráfico que muestra la producción de isopreno en células de E. coli BL21 con pTrcKudzu.
La figura 8D es un gráfico que muestra la producción de isopreno en células de E. coli BL21 con pETN-HisKudzu. La figura 9A es un gráfico que muestra la DO a lo largo del tiempo de fermentación de E. coli BL21/pTrcKudzu en una fermentación semicontinua de 14 l.
La figura 9B es un gráfico que muestra la producción de isopreno a lo largo del tiempo de fermentación de E. coli BL21/pTrcKudzu en una fermentación semicontinua de 14 l.
La figura 10A es un gráfico que muestra la producción de isopreno en Panteoa citrea. Células de control sin isopreno sintasa de kudzu recombinante. Los rombos grises representan la síntesis de isopreno, los cuadrados negros representan DO600.
La figura 10B es un gráfico que muestra la producción de isopreno en Panteoa citrea que expresa pCL-lac Kudzu. Los rombos grises representan la síntesis de isopreno, los cuadrados negros representan DO600.
La figura 10C es un gráfico que muestra la producción de isopreno en Panteoa citrea que expresa pTrcKudzu. Los rombos grises representan la síntesis de isopreno, los cuadrados negros representan DO600.
La figura 11 es un gráfico que muestra la producción de isopreno en Bacillus subtilis que expresa isopreno sintasa recombinante. BG3594comK es una cepa de B. subtilis sin plásmido (producción de isopreno nativo). CF443-BG3594comK es una cepa de B. subtilis con pBSKudzu (producción de isopreno recombinante). IS en el eje y indica isopreno.
La figura 12 es la secuencia de nucleótidos de pBS Kudzu n.° 2 (SEQ ID NO: 57).
La figura 13 es la secuencia de nucleótidos de isopreno sintasa de kudzu optimizada por codones para la expresión en Yarrowia (SEQ ID NO: 8).
La figura 14 es un mapa de pTrex3g que comprende un gen de isopreno sintasa de kudzu optimizado por codones para la expresión en Yarrowia.
La figura 15 es la secuencia de nucleótidos de vector pSPZ1(MAP29Spb) (SEQ ID NO: 11).
La figura 16 es la secuencia de nucleótidos del gen de isopreno de kudzu (Pueraria montana) sintético optimizado por codones para la expresión en Yarrowia (SEQ ID NO: 12).
La figura 17 es la secuencia de nucleótidos del gen de isopreno sintasa polar híbrido sintético (Populus alba x Populus tremula) (SEQ ID NO: 13). El codón de inicio a Tg está en negrita y el codón de terminación está subrayado.
La figura 18A muestra una construcción esquemática de los vectores pYLA 1, pYL1 y pYL2.
La figura 18B muestra una construcción esquemática del vector pYLA(POPI).
La figura 18C muestra una construcción esquemática del vector pYLA (KZ1)
La figura 18D muestra una construcción esquemática del vector pYLI(KZ1)
La figura 18E muestra una construcción esquemática del vector pYLI(MAP29)
La figura 18F muestra una construcción esquemática del vector pYLA(MAP29)
La figura 19 muestra las rutas metabólicas de MVA y DXP para isopreno (basándose en F. Bouvier et al., Progress en lípido Res. 44: 357-429, 2005). La siguiente descripción incluye nombres alternativos para cada polipéptido en las rutas y una referencia que da a conocer un ensayo para medir la actividad del polipéptido indicado (se hace referencia a cada una de estas referencias, particularmente con respecto a ensayos para la actividad de polipéptido para polipéptidos en las rutas de MVA y DXP). Ruta de mevalonato: AACT; acetil-CoA acetiltransferasa, MvaE, EC 2.3.1.9. Ensayo: J. Bacteriol., 184: 2116-2122, 2002; HMGS; Hidroximetilglutaril-CoA sintasa, MvaS, EC 2.3.3.10. Ensayo: J. Bacteriol., 184: 4065-4070, 2002; HMGR; 3-Hidroxi-3-metilglutaril-CoA reductasa, MvaE, EC 1.1.1.34. Ensayo: J. Bacteriol., 184: 2116-2122, 2002; MVK; mevalonato cinasa, ERG12, EC 2.7.1.36. Ensayo: Curr Genet 19:9-14, 1991. PMK; Fosfomevalonato cinasa, ERG8, EC 2.7.4.2, Ensayo: Mol Cell Biol., 11:620-631, 1991; DPMDC; Difosfomevalonato descarboxilasa, MVD1, EC 4.1.1.33. Ensayo: Biochemistry, 33:13355-13362, 1994; IDI; Difosfato de isopentilo delta-isomerasa, IDI1, EC 5.3.3.2. Ensayo: J. Biol. Chem. 264:19169-19175, 1989. Ruta de DXP: DXS; 1-Desoxixilulosa-5-fosfato sintasa, dxs, EC 2.2.1.7. Ensayo: PNAS, 94:12857-62, 1997; DXR; 1-Desoxi-D-xilulosa 5-fosfato reductoisomerasa, dxr, EC 2.2.1.7. Ensayo: Eur. J. Biochem. 269:4446-4457, 2002; MCT; 4-Difosfocitidil-2C-metil-D-eritritol sintasa, IspD, EC 2.7.7.60. Ensayo: PNAS, 97: 6451-6456, 2000; CMK; 4-Difosfocitidil-2-C-metil-D-eritritol cinasa, IspE, EC 2.7.1.148. Ensayo: PNAS, 97:1062-1067, 2000; MCS; 2C-Metil-D-eritritol 2,4-ciclodifosfato sintasa, IspF, EC 4.6.1.12. Ensayo: PNAS, 96:11758-11763, 1999; HDS; 1-Hidroxi-2-metil-2-(E)-butenilo 4-difosfato sintasa, ispG, EC 1.17.4.3. Ensayo: J. Org. Chem., 70:9168-9174, 2005; HDR; 1-Hidroxi-2-metil-2-(E)-butenilo 4-difosfato reductasa, IspH, EC 1.17.1.2. Ensayo: JACS, 126:12847-12855, 2004.
La figura 20 muestra gráficos que representan resultados del análisis de CG-EM de producción de isopreno mediante cepas de Y. lipolytica recombinantes sin (izquierda) o con (derecha) un gen de isopreno sintasa de kudzu. Las flechas indican el tiempo de elución del patrón de isopreno auténtico.
La figura 21 es un mapa de pTrcKudzu yIDI DXS Kan.
La figura 22 es la secuencia de nucleótidos de pTrcKudzu yIDI DXS Kan (SEQ ID NO: 20).
La figura 23A es un gráfico que muestra la producción de isopreno a partir de glucosa en BL21/pTrcKudzukan. Tiempo 0 es el tiempo de inducción con IPTG (400 |imol). El eje x es el tiempo tras la inducción; el eje y es DO600 y el eje y2 es la productividad total de isopreno (|ig/l de espacio de cabeza) o productividad específica (|ig/l de espacio de cabeza/DO). Los rombos representan DO600, los círculos representan la productividad de isopreno total (|ig/l) y los cuadrados representan la productividad específica de isopreno (|ig/l/DO).
La figura 23B es un gráfico que muestra la producción de isopreno a partir de glucosa en BL21/pTrcKudzu yIDI kan. Tiempo 0 es el tiempo de inducción con IPTG (400 |imol). El eje x es el tiempo tras la inducción; el eje y es DO600 y el eje y2 es la productividad total de isopreno (|ig/l de espacio de cabeza) o productividad específica (|ig/l de espacio de cabeza/DO). Los rombos representan DO600, los círculos representan la productividad de isopreno total (|ig/l) y los cuadrados representan la productividad específica de isopreno (|ig/l/DO).
La figura 23C es un gráfico que muestra la producción de isopreno a partir de glucosa en BL21/pTrcKudzu DXS kan. Tiempo 0 es el tiempo de inducción con IPTG (400 |imol). El eje x es el tiempo tras la inducción; el eje y es DO600 y el eje y2 es la productividad total de isopreno (|ig/l de espacio de cabeza) o productividad específica (|ig/l de espacio de cabeza/DO). Los rombos representan DO600, los círculos representan la productividad de isopreno total (|ig/l) y los cuadrados representan la productividad específica de isopreno (|ig/l/DO).
La figura 23D es un gráfico que muestra la producción de isopreno a partir de glucosa en BL21/pTrcKudzu yIDI DXS kan. Tiempo 0 es el tiempo de inducción con IPTG (400 |imol). El eje x es el tiempo tras la inducción; el eje y es DO600 y el eje y2 es la productividad total de isopreno (|ig/l de espacio de cabeza) o productividad específica (|ig/l de espacio de cabeza/DO). Los rombos representan DO600, los círculos representan la productividad de isopreno total (|ig/l) y los cuadrados representan la productividad específica de isopreno (|ig/l/DO).
La figura 23E es un gráfico que muestra la producción de isopreno a partir de glucosa en BL21/pCL PtrcKudzu. Tiempo 0 es el tiempo de inducción con IPTG (400 |imol). El eje x es el tiempo tras la inducción; el eje y es DO600 y el eje y2 es la productividad total de isopreno (|ig/l de espacio de cabeza) o productividad específica (|ig/l de espacio de cabeza/DO). Los rombos representan DO600, los círculos representan la productividad de isopreno total (|ig/l) y los cuadrados representan la productividad específica de isopreno (|ig/l/DO).
La figura 23F es un gráfico que muestra la producción de isopreno a partir de glucosa en BL21/pCL PtrcKudzu yIDI. Tiempo 0 es el tiempo de inducción con IPTG (400 |imol). El eje x es el tiempo tras la inducción; el eje y es DO600 y el eje y2 es la productividad total de isopreno (|ig/l de espacio de cabeza) o productividad específica (|ig/l de espacio de cabeza/DO). Los rombos representan DO600, los círculos representan la productividad de isopreno total (|ig/l) y los cuadrados representan la productividad específica de isopreno (|ig/l/DO).
La figura 23G es un gráfico que muestra la producción de isopreno a partir de glucosa en BL21/pCL PtrcKudzu DXS. Tiempo 0 es el tiempo de inducción con IPTG (400 |imol). El eje x es el tiempo tras la inducción; el eje y es DO600 y el eje y2 es la productividad total de isopreno (|ig/l de espacio de cabeza) o productividad específica (|ig/l de espacio de cabeza/DO). Los rombos representan DO600, los círculos representan la productividad de isopreno total (|ig/l) y los cuadrados representan la productividad específica de isopreno (|ig/l/DO).
La figura 23H es un gráfico que muestra la producción de isopreno a partir de glucosa en BL21/pTrcKudzuIDIDXSkan. La flecha indica el tiempo de inducción con IPTG (400 |imol). El eje x es el tiempo tras la inducción; el eje y es DO600 y el eje y2 es la productividad total de isopreno (|ig/l de espacio de cabeza) o productividad específica (|ig/l de espacio de cabeza/DO). Los rombos negros representan DO600, los triángulos negros representan la productividad de isopreno (|ig/l) y los cuadrados blancos representan la productividad específica de isopreno (|ig/l/DO).
La figura 24 es un mapa de pTrcKKDyIkIS kan.
La figura 25 es una secuencia de nucleótidos de pTrcKKDyIkIS kan (SEQ ID NO: 33).
La figura 26 es un mapa de pCL PtrcUpperPathway.
Las figuras 27A-27D son una secuencia de nucleótidos de pCL PtrcUpperPathway (SEQ ID NO: 46).
La figura 28 muestra un mapa del casete que contiene la ruta de MVA inferior e idi de levadura para integración en el cromosoma de B. subtilis en el locus nprE. nprE en el sentido 5'/en el sentido 3' indica 1 kb cada de secuencia del locus nprE para integración. El promotor aprE (promotor de serina proteasa alcalina) indica el promotor (-35, -10, 1 sitio de inicio de la transcripción, RBS) del gen aprE. MVK1 indica el gen de mevalonato cinasa de levadura. RBS-PMK indica el gen de fosfomevalonato cinasa de levadura con un RBS de Bacillus en el sentido 5' del sitio de inicio. RBS-MPD indica el gen de difosfomevalonato descarboxilasa de levadura con un RBS de Bacillus en el sentido 5' del sitio de inicio. RBS-IDI indica el gen idi de levadura con un RBS de Bacillus en el sentido 5' del sitio de inicio. Terminador indica el terminador de la transcripción de serina proteasa alcalina de B. amyliquefaciens. SpecR indica el marcador de resistencia a espectinomicina. “Repetición en el sentido 5' de nprE para amp.” indica una repetición directa de la región en el sentido 5' usada para amplificación.
La figura 29 es una secuencia de nucleótidos del casete que contiene la ruta de MVA inferior e idi de levadura para la integración en el cromosoma de B. subtilis en el locus nprE (SEQ ID NO: 47).
La figura 30 es un mapa de p9796-chopo.
La figura 31 es una secuencia de nucleótidos de p9796-chopo (SEQ ID NO: 48).
La figura 32 es un mapa de pTrcPoplar.
La figura 33 es una secuencia de nucleótidos de pTrcPoplar (SEQ ID NO: 49).
La figura 34 es un mapa de pTrcKudzu yIDI Kan.
La figura 35 es una secuencia de nucleótidos de pTrcKudzu yIDI Kan (SEQ ID NO: 50).
La figura 36 es un mapa de pTrcKudzuDXS Kan.
La figura 37 es una secuencia de nucleótidos de pTrcKudzuDXS Kan (SEQ ID NO: 51).
La figura 38 es un mapa de pCL PtrcKudzu.
La figura 39 es una secuencia de nucleótidos de pCL PtrcKudzu (SEQ ID NO: 52).
La figura 40 es un mapa de pCL PtrcKudzu A3.
La figura 41 es una secuencia de nucleótidos de pCL PtrcKudzu A3 (SEQ ID NO: 53).
La figura 42 es un mapa de pCL PtrcKudzu yIDI.
La figura 43 es una secuencia de nucleótidos de pCL PtrcKudzu yIDI (SEQ ID NO: 54).
La figura 44 es un mapa de pCL PtrcKudzu DXS.
La figura 45 es una secuencia de nucleótidos de pCL PtrcKudzu DXS (SEQ ID NO: 55).
La figura 46 muestra gráficos que representan la producción de isopreno de materia prima de biomasa. El panel A muestra la producción de isopreno a partir de rastrojo de maíz, el panel B muestra la producción de isopreno a partir de bagazo, el panel C muestra la producción de isopreno a partir de pasta de coníferas, el panel D muestra la producción de isopreno a partir de glucosa, y el panel E muestra la producción de isopreno a partir de células sin materia prima adicional. Los cuadrados grises representan mediciones de DO600 de los cultivos a los tiempos indicados tras la inoculación y los triángulos negros representan la producción de isopreno a los tiempos indicados tras la inoculación.
La figura 47A muestra un gráfico que representa la producción de isopreno por BL21 (XDE3) pTrcKudzu yIDI DXS (kan) en un cultivo sin glucosa añadida. Los cuadrados representan DO600, y los triángulos representan isopreno producido (|ig/ml).
La figura 47B muestra un gráfico que representa la producción de isopreno a partir de azúcar invertido de materia prima de glucosa al 1% por BL21 (XDE3) pTrcKudzu yIDI DXS (kan). Los cuadrados representan DO600, y los triángulos representan isopreno producido (|ig/ml).
La figura 47C muestra un gráfico que representa la producción de isopreno a partir de materia prima de azúcar invertido al 1% por BL21 (XDE3) pTrcKudzu yIDI DXS (kan). Los cuadrados representan DO600, y los triángulos representan isopreno producido (|ig/ml).
La figura 47D muestra un gráfico que representa la producción de isopreno a partir de materia prima de rastrojo de maíz AFEX al 1% por BL21 (XDE3) pTrcKudzu yIDI DXS (kan). Los cuadrados representan DO600, y los triángulos representan isopreno producido (|ig/ml).
La figura 48 muestra gráficos que demuestran el efecto de extracto de levadura de producción de isopreno. El panel A muestra el transcurso de tiempo de la densidad óptica dentro de fermentadores alimentados con cantidades variables de extracto de levadura. El panel B muestra el transcurso de tiempo del título de isopreno dentro de fermentadores alimentados con cantidades variables de extracto de levadura. El título se define como la cantidad de isopreno producido por litro de caldo de fermentación. El panel C muestra el efecto de extracto de levadura sobre la producción de isopreno en E. coli hecha crecer en cultivo semicontinuo.
La figura 49 muestra gráficos que demuestran la producción de isopreno de un biorreactor de 500 l con células de E. coli que contiene el plásmido pTrcKudzu yIDI DXS. El panel A muestra el transcurso de tiempo de la densidad óptica dentro de un biorreactor de 500 l alimentado con glucosa y extracto de levadura. El panel B muestra el transcurso de tiempo del título de isopreno dentro de un biorreactor de 500 l alimentado con glucosa y extracto de levadura. El título se define como la cantidad de isopreno producido por litro de caldo de fermentación. El panel C muestra el transcurso de tiempo del isopreno total producido del biorreactor de 500 l alimentado con glucosa y extracto de levadura.
La figura 50 es un mapa de pJMupperpathway2.
La figura 51 es la secuencia de nucleótidos de pJMupperpathway2 (SEQ ID NO: 56).
La figura 52 es un mapa de pBS Kudzu #2.
La figura 53A es un gráfico que muestra el crecimiento durante el tiempo de fermentación de Bacillus que expresa isopreno sintasa de kudzu recombinante en fermentación semicontinua de 14 litros. Los rombos negros representan una cepa de control (BG3594comK) sin isopreno sintasa recombinante (producción de isopreno nativo) y los triángulos grises representan Bacillus con pBSKudzu (producción de isopreno recombinante).
La figura 53B es un gráfico que muestra la producción de isopreno durante el tiempo de fermentación de Bacillus que expresa isopreno sintasa de kudzu recombinante en fermentación semicontinua de 14 litros. Los rombos negros representan una cepa de control (BG3594comK) sin isopreno sintasa recombinante (producción de isopreno nativo) y los triángulos grises representan Bacillus con pBSKudzu (producción de isopreno recombinante).
La figura 54 es un transcurso de tiempo de la densidad óptica dentro del biorreactor de 15 l alimentado con glucosa. La figura 55 es un transcurso de tiempo del título de isopreno dentro del biorreactor de 15 l alimentado con glucosa. El título se define como la cantidad de isopreno producido por litro de caldo de fermentación.
La figura 56 es un transcurso de tiempo del isopreno total producido a partir del biorreactor de 15 l alimentado con glucosa.
La figura 57 es un transcurso de tiempo de la densidad óptica dentro del biorreactor de 15 l alimentado con glicerol. La figura 58 es un transcurso de tiempo del título de isopreno dentro del biorreactor de 15 l alimentado con glicerol. El título se define como la cantidad de isopreno producido por litro de caldo de fermentación.
La figura 59 es un transcurso de tiempo del isopreno total producido a partir del biorreactor de 15 l alimentado con glicerol.
Las figuras 60A-60C son los transcursos de tiempo de la densidad óptica, título de ácido mevalónico y productividad específica dentro del biorreactor de 150 l alimentado con glucosa.
Las figuras 61A-61C son los transcursos de tiempo de la densidad óptica, título de ácido mevalónico y productividad específica dentro del biorreactor de 15 l alimentado con glucosa.
Las figuras 62A-62C son los transcursos de tiempo de la densidad óptica, título de ácido mevalónico y productividad específica dentro del biorreactor de 15 l alimentado con glucosa.
La figura 63A-63C son los transcursos de tiempo de la densidad óptica, título de isopreno y productividad específica dentro del biorreactor de 15 l alimentado con glucosa.
Las figuras 64A-64C son los transcursos de tiempo de la densidad óptica, título de isopreno y productividad específica dentro del biorreactor de 15 l alimentado con glucosa.
Las figuras 65A-65C son los transcursos de tiempo de la densidad óptica, título de isopreno y productividad específica dentro del biorreactor de 15 l alimentado con glucosa.
Las figuras 66A-66C son los transcursos de tiempo de la densidad óptica, título de isopreno y productividad específica dentro del biorreactor de 15 l alimentado con glucosa.
La figura 67A-67C son los transcursos de tiempo de la densidad óptica, título de isopreno y productividad específica dentro del biorreactor de 15 l alimentado con glucosa.
La figura 68 es un gráfico de las temperaturas de llama adiabáticas calculadas para la serie A como función de la concentración de combustible para diversos niveles de oxígeno. La leyenda de la figura enumera las curvas en el orden en el que aparecen en el gráfico. Por ejemplo, la primera entrada en la leyenda de las figuras (isopreno en aire a 40°C) se corresponde con la curva más alta en el gráfico.
La figura 69 es un gráfico de las temperaturas de llama adiabáticas calculadas para la serie B como función de la concentración de combustible para diversos niveles de oxígeno con el 4% de agua. La leyenda de la figura enumera las curvas en el orden en el que aparecen en el gráfico.
La figura 70 es un gráfico de las temperaturas de llama adiabáticas calculadas para la serie C como función de la concentración de combustible para diversos niveles de oxígeno con el 5% de CO2. La leyenda de la figura enumera las curvas en el orden en el que aparecen en el gráfico.
La figura 71 es un gráfico de las temperaturas de llama adiabáticas calculadas para la serie D como función de la concentración de combustible para diversos niveles de oxígeno con el 10% de CO2. La leyenda de la figura enumera las curvas en el orden en el que aparecen en el gráfico.
La figura 72 es un gráfico de las temperaturas de llama adiabáticas calculadas para la serie E como función de la concentración de combustible para diversos niveles de oxígeno con el 15% de CO2. La leyenda de la figura enumera las curvas en el orden en el que aparecen en el gráfico.
La figura 73 es un gráfico de las temperaturas de llama adiabáticas calculadas para la serie F como función de la concentración de combustible para diversos niveles de oxígeno con el 20% de CO2. La leyenda de la figura enumera las curvas en el orden en el que aparecen en el gráfico.
La figura 74 es un gráfico de las temperaturas de llama adiabáticas calculadas para la serie G como función de la concentración de combustible para diversos niveles de oxígeno con el 30% de CO2. La leyenda de la figura enumera las curvas en el orden en el que aparecen en el gráfico.
La figura 75A es una tabla de la conversión de los resultados del modelo CAFT del porcentaje en peso al porcentaje en volumen para la serie A.
La figura 75B es un gráfico de los resultados de inflamabilidad del modelo CAFT para la serie A en la figura 68 representado como porcentaje en volumen.
La figura 76A es una tabla de la conversión de los resultados del modelo CAFT del porcentaje en peso al porcentaje en volumen para la serie B.
La figura 76B es un gráfico de los resultados de inflamabilidad del modelo CAFT para la serie B en la figura 69 representado como porcentaje en volumen.
La figura 77 es una figura del recipiente de prueba de inflamabilidad.
La figura 78A es un gráfico de la curva de inflamabilidad para la serie de prueba 1: 0% de vapor, 0 psig y 40°C. La figura 78B es una tabla que resume los puntos de datos de explosión y no explosión para la serie de prueba 1. La figura 78C es un gráfico de la curva de inflamabilidad para la serie de prueba 1 en comparación con el modelo CAFT.
La figura 79A es un gráfico de la curva de inflamabilidad para la serie de prueba 2: 4% de vapor, 0 psig y 40°C. La figura 79B es una tabla que resume los puntos de datos de explosión y no explosión para la serie de prueba 2. La figura 79C es un gráfico de la curva de inflamabilidad para la serie de prueba 2 en comparación con el modelo CAFT.
Las figuras 80A y 80B son una tabla de las condiciones y resultados experimentales detallados para la serie de prueba 1.
La figura 81 es una tabla de las condiciones y resultados experimentales detallados para la serie de prueba 2.
La figura 82 es un gráfico de la temperatura de llama adiabática calculada representada como una función de la concentración de combustible para diversas razones de nitrógeno/oxígeno a 3 atmósferas de presión.
La figura 83 es un gráfico de la temperatura de llama adiabática calculada representada como una función de la concentración de combustible para diversas razones de nitrógeno/oxígeno a 1 atmósfera de presión.
La figura 84 es un gráfico de la envoltura de inflamabilidad construida usando datos de la figura 82 y siguiendo la metodología descrita en el ejemplo 13. Los puntos de datos experimentales (círculos) son de pruebas descritas en el presente documento que se llevaron a cabo a 1 atmósfera de presión del sistema inicial.
La figura 85 es un gráfico de la envoltura de inflamabilidad construida usando datos de la figura 83 y siguiendo la metodología descrita en el ejemplo 13. Los puntos de datos experimentales (círculos) son de pruebas descritas en el presente documento que se llevaron a 1 atmósfera de presión del sistema inicial.
La figura 86A es un cromatograma de CG/EM de gas residual de fermentación.
La figura 86B es una expansión de la figura 86A para mostrar volátiles menores presentes en gas residual de fermentación.
La figura 87A es un cromatograma de CG/EM de volátiles traza presentes en gas residual tras atrapamiento criogénico a -78 °C.
La figura 87B es un cromatograma de CG/EM de volátiles traza presentes en gas residual tras atrapamiento criogénico a -196 °C.
La figura 87C es una expansión de la figura 87B.
La figura 87D es una expansión de la figura 87C.
Las figuras 88A y 88B son un cromatograma de CG/EM que compara hidrocarburos C5 de isopreno derivado de petróleo (figura 88A) e isopreno producido de manera biológica (figura 88B). El patrón contiene tres impurezas de hidrocarburos C5 que eluyen a largo del pico de isopreno principal (figura 88A). En cambio, el isopreno producido de manera biológica contiene cantidades de etanol y acetona (tiempo de ejecución de 3,41 minutos) (figura 88A).
La figura 89 es un gráfico del análisis de gas residual de fermentación de una cepa de E. coli BL21 (DE3) pTrcIS que expresa una isopreno sintasa de Kudzu ya la que se le alimentó glucosa con extracto de levadura 3g/l.
La figura 90 muestra las estructuras de varias impurezas que son estructuralmente similares a isopreno y pueden actuar también como venenos para el catalizador de la polimerización.
La figura 91 es un mapa de pTrcHis2AUpperPathway (también denominado pTrcUpperMVA).
Las figuras 92A-92C son la secuencia de nucleótidos de pTrcHis2AUpperPathway (también denominada pTrcUpperMVA) (SEQ ID NO: 86).
La figura 93 es un transcurso de tiempo de la densidad óptica dentro del biorreactor de 15 l alimentado con glucosa. La figura 94 es un transcurso de tiempo del título de isopreno dentro del biorreactor de 15 l alimentado con glucosa. El título se define como la cantidad de isopreno producido por litro de caldo de fermentación.
La figura 95 es un transcurso de tiempo del isopreno total producido a partir del biorreactor de 15 l alimentado con glucosa.
La figura 96 es un transcurso de tiempo de la densidad óptica dentro del biorreactor de 15 l alimentado con azúcar invertido.
La figura 97 es un transcurso de tiempo del título de isopreno dentro del biorreactor de 15 l alimentado con azúcar invertido. El título se define como la cantidad de isopreno producido por litro de caldo de fermentación.
La figura 98 es un transcurso de tiempo del isopreno total producido a partir del biorreactor de 15 l alimentado con azúcar invertido.
La figura 99 es un transcurso de tiempo de la densidad óptica dentro del biorreactor de 15 l alimentado con glucosa. La figura 100 es un transcurso de tiempo del título de isopreno dentro del biorreactor de 15 l alimentado con glucosa. El título se define como la cantidad de isopreno producido por litro de caldo de fermentación.
La figura 101 es un transcurso de tiempo de la actividad específica de isopreno a partir del biorreactor de 15 l alimentado con glucosa.
La figura 102 es un mapa de pCLPtrcUpperPathwayHGS2.
Las figuras 103A-103C son la secuencia de nucleótidos de pCLPtrcUpperPathwayHGS2 (SEQ ID NO: 87).
La figura 104 es un transcurso de tiempo de la densidad óptica dentro del biorreactor de 15 l alimentado con glucosa.
La figura 105 es un transcurso de tiempo del título de isopreno dentro del biorreactor de 15 l alimentado con glucosa. El título se define como la cantidad de isopreno producido por litro de caldo de fermentación.
La figura 106 es un transcurso de tiempo del isopreno total producido a partir del biorreactor de 15 l alimentado con glucosa.
La figura 107 es un mapa de plásmido MCM330.
Las figuras 108A-108C son la secuencia de nucleótidos de plásmido MCM330 (SEQ ID NO: 90).
La figura 109 es un mapa de pET24D-Kudzu.
Las figuras 110A y 110B son la secuencia de nucleótidos de pET24D-Kudzu (SEQ ID NO: 101).
La figura 111A es un transcurso de tiempo de la densidad óptica dentro del biorreactor de 15 l alimentado con glucosa.
La figura 111B es un transcurso de tiempo del título de isopreno dentro del biorreactor de 15 l alimentado con glucosa. El título se define como la cantidad de isopreno producido por litro de caldo de fermentación.
La figura 111C es un transcurso de tiempo de productividad específica de isopreno en el biorreactor de 15 l alimentado con glucosa.
Descripción detallada de la invención
En un aspecto, la divulgación presenta composiciones y procedimientos para la producción de isopreno en cantidades y/o pureza aumentadas. Tal como se usa en el presente documento, el término “isopreno” o “2-metil-1,3-butadieno” (n.° de CAS 78-79-5) se refiere al producto de hidrocarburo C5 volátil final y directo de la eliminación de pirofosfato de 3,3-dimetilallilo pirofosfato (DMAPP), y no implica la unión o polimerización de una o más moléculas de difosfato de isopentenilo (IPP) a una o más moléculas de DMAPP.
La gran mayoría del isopreno se deriva de fuentes petroquímicas como una facción de hidrocarburos C5 impura que requiere purificación extensa antes de que el material sea adecuado para polimerización. Diversas impurezas son particularmente problemáticas dada su similitud estructural con isopreno y el hecho de que pueden actuar como venenos para el catalizador de la polimerización. Tales compuestos incluyen 1,3-ciclopentadieno, cis- y trans-1,3-pentadieno, 1-pentino, 2-pentino, 3-metil-1-butino, trans-piperileno, cis-piperileno, pent-4-en-1-ino, trans-pent-3-en-1-ino y cis-pent-3-en-1-ino (figura 90). En algunas realizaciones, la composición de isopreno de la divulgación está libre sustancialmente de cualquier hidrocarburo C5 insaturado contaminante. Tal como se describe además en el ejemplo 10, no se encontró cantidad detectable de hidrocarburos C5 insaturados distintos de isopreno (tales como 1,3-ciclopentadieno, cis-1,3-pentadieno, trans-1,3-pentadieno, 1-pentino, 2-pentino, 1-penteno, 2-metil-1-buteno, 3-metil-1-butino, trans-piperileno, cis-piperileno, pent-4-en-1-ino, trans-pent-3-en-1-ino o cis-pent-3-en-1-ino) en composiciones de isopreno producidas usando los procedimientos descritos en el presente documento. Algunas composiciones de isopreno producidas usando los procedimientos descritos en el presente documento contienen etanol, acetona, y alcoholes prenílicos C5 tal como se determina mediante análisis de CG/EM. Todos estos componentes se retiran mucho más rápidamente de la corriente de isopreno que las fracciones de hidrocarburos C5 isoméricas que están presentes en composiciones de isopreno derivadas de fuentes petroquímicas. Por consiguiente, en algunas realizaciones, las composiciones de isopreno de la divulgación requieren tratamiento mínimo con el fin de ser de calidad para polimerización.
En un aspecto, composiciones y procedimientos de la divulgación aumentan la tasa de producción de isopreno y aumentan la cantidad total de isopreno que se produce. Por ejemplo, se han producido los sistemas de cultivo celular que generan 4,8 x 104 nmoles/gwcm/h de isopreno (tabla 1). La eficacia de estos sistemas se demuestra mediante la conversión de aproximadamente el 2,2% del carbono que las células consumen de un medio de cultivo celular en isopreno. Tal como se muestra en los ejemplos y la tabla 2, se generaron aproximadamente 3 g de isopreno por litro de caldo. Si se desea, pueden obtenerse incluso mayores cantidades de isopreno usando otras condiciones, tales como las descritas en el presente documento. En algunas realizaciones, se usa una fuente de carbono renovable para la producción de isopreno. En algunas realizaciones, la producción de isopreno se desacopla del crecimiento de las células. En algunas realizaciones, las concentraciones de isopreno y cualesquiera oxidantes están dentro de los intervalos no inflamables para reducir o eliminar el riesgo de que pueda producirse un fuego durante la producción o recuperación de isopreno. Los procedimientos de la presente invención son deseables porque permiten un alto rendimiento de isopreno por célula, alto rendimiento de carbono, alta pureza de isopreno, alta productividad, bajo uso de energía, baja inversión y coste de producción, y reacciones secundarias mínimas. Este procedimiento eficaz, a gran escala y biosintético para la producción de isopreno proporciona una fuente de isopreno para caucho a base de isopreno sintético y proporciona una alternativa deseable de bajo coste al uso de caucho natural.
Tal como se comenta además a continuación, la cantidad de isopreno producido por células puede aumentarse en gran medida introduciendo un ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido de isopreno sintasa (por ejemplo, un polipéptido de isopreno sintasa vegetal) en las células. Los polipéptidos de isopreno sintasa convierten difosfato de dimetilalilo (DMAPP) en isopreno. Tal como se muestra en los ejemplos, se expresó un polipéptido de isopreno sintasa de Pueraria montana (kudzu) heterólogo en una diversidad de células huésped, tales como Escherichia coli, Panteoa citrea, Bacillus subtilis, Yarrowia lipolytica y Trichoderma reesei. Todas estas células produjeron más isopreno que las correspondientes células sin el polipéptido de isopreno sintasa heterólogo. Tal como se ilustra en las tablas 1 y 2, se producen grandes cantidades de isopreno usando los procedimientos descritos en el presente documento. Por ejemplo, células de B. subtilis con un ácido nucleico de isopreno sintasa heterólogo produjeron aproximadamente 10 veces más isopreno en un fermentador de 14 litros que las correspondientes células de B. subtilis de control sin el ácido nucleico heterólogo (tabla 2). La producción de 300 mg de isopreno por litro de caldo (mg/l, en el que el volumen de caldo incluye tanto el volumen del medio celular como el volumen de las células) por E. coli y 30 mg/l por B. subtilis en fermentadores indica que pueden generarse cantidades de isopreno significativas (tabla 2). Si se desea, puede producirse isopreno a una escala incluso mayor o pueden usarse otras condiciones descritas en el presente documento para aumentar adicionalmente la cantidad de isopreno. Los vectores indicados en las tablas 1 y 2 y las condiciones experimentales se describen con más detalle a continuación y en la sección de ejemplos.
Tabla 1: Rendimientos a modo de ejemplo de isopreno a partir de un matraz de agitación usando los cultivos celulares y procedimientos de la invención. El ensayo para medir la producción de isopreno se describe en el ejemplo I, parte II. Para este ensayo, se retiró una muestra en uno o más puntos de tiempo del matraz de agitación y se cultivó durante 30 minutos. Entonces se midió la cantidad de isopreno producido en esta muestra. La concentración de espacio de cabeza y tasa específica de producción de isopreno se enumeran en la tabla 1 y se describen adicionalmente en el presente documento.
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*Se normalizó con 1 ml de 1 DO600, se cultivó durante 1 hora en un vial de espacio de cabeza sellado con una razón de volumen de líquido con respecto a espacio de cabeza de 1:19.
Tabla 2: Rendimientos a modo de ejemplo de isopreno en un fermentador usando los cultivos celulares y procedimientos de la invención. El ensayo para medir la producción de isopreno se describe en el ejemplo I, parte II. Para este ensayo, se tomó una muestra del gas residual del fermentador y se analizó para determinar la cantidad de isopreno. La concentración de espacio de cabeza máxima (que es la concentración de espacio de cabeza más alta durante la fermentación), título (que es la cantidad total acumulativa de isopreno producido por litro de caldo) y la tasa específica máxima de producción de isopreno (que es la tasa específica más alta durante la fermentación) se enumeran en la tabla 2 y se describen adicionalmente en el presente documento.
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**Se normalizó con una velocidad de flujo de gas residual de 1 vvm (1 volumen de gas residual por 1 Icaido por minuto).
Además, la producción de isopreno por células que contienen un ácido nucleico de isopreno sintasa heterólogo puede potenciarse aumentando la cantidad de un polipéptido de 1-desoxi-D-xilulosa-5-fosfato sintasa (DXS) y/o un polipéptido de difosfato de isopentenilo isomerasa (IDl) expresado por las células. Por ejemplo, un ácido nucleico de DXS y/o un ácido nucleico de IDI pueden introducirse en las células. El ácido nucleico DXS puede ser un ácido nucleico heterólogo o una copia duplicada de un ácido nucleico endógeno. De manera similar, el ácido nucleico de IDI puede ser un ácido nucleico heterólogo o una copia duplicada de un ácido nucleico endógeno. En algunas realizaciones, la cantidad de DXS y/o polipéptido de IDI se aumenta reemplazando los promotores o regiones reguladoras de DXS y/o IDI endógenos con otros promotores y/o regiones reguladoras que dan como resultado mayor transcripción de los ácidos nucleicos de DXS y/o IDI. En algunas realizaciones, las células contienen tanto un ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido de isopreno sintasa (por ejemplo, un ácido nucleico de isopreno sintasa vegetal) y una copia duplicada de un ácido nucleico endógeno que codifica para un polipéptido de isopreno sintasa.
Los polipéptidos de DXS e IDI codificados son parte de la ruta de DXP para la biosíntesis de isopreno (figura 19). Los polipéptidos de DXS convierten piruvato y D-gliceraldehído-3-fosfato en 1-desoxi-D-xilulosa-5-fosfato. Aunque no pretende limitarse a ninguna teoría particular, se cree que aumentar la cantidad de polipéptido de DXS aumenta el flujo de carbono a través de la ruta de DXP, lo que conduce a una mayor producción de isopreno. Los polipéptidos de iDi catalizan la interconversión de difosfato de isopentenilo (IPP) y difosfato de dimetilalilo (DMAPP). Aunque no se pretende limitarse a ninguna teoría particular, se cree que aumentar la cantidad de polipéptido de IDI en células aumenta la cantidad (y tasa de conversión) de IPP que se convierte en DMAPP, que a su vez se convierte en isopreno.
Por ejemplo, se usó la fermentación de células de E. coli con una isopreno sintasa de kudzu, ácido nucleicos de IDI de S. cerevisiae y DXS de E. coli DXS para producir isopreno. Los niveles de isopreno variaron entre 50 y 300 |ig/l durante un periodo de tiempo de 15 horas (ejemplo 7, parte VII).
En algunas realizaciones, la presencia de ácidos nucleicos de isopreno sintasa, IDI y DXS heterólogos o extra endógenos provoca que las células crezcan más de manera más reproducible o permanezcan viables durante más tiempo en comparación con la correspondiente célula con sólo uno o dos de estos ácidos nucleicos heterólogos o extra endógenos. Por ejemplo, células que contienen ácidos nucleicos de isopreno sintasa, IDI y DXS heterólogos crecen mejor que células con sólo ácidos nucleicos de isopreno sintasa y DXS heterólogos o con sólo un ácido nucleico de isopreno sintasa heterólogo. Además, los ácidos nucleicos de isopreno sintasa, IDI y DXS heterólogos se unieron satisfactoriamente de manera operativa a un promotor fuerte en un plásmido de copias altas que se mantuvo mediante células de E. coli, lo que sugiere que podían expresarse grandes cantidades de estos polipéptidos en las células sin provocar una cantidad excesiva de toxicidad a las células. Aunque no se pretende limitarse a ninguna teoría particular, se cree que la presencia de ácidos nucleicos de isopreno sintasa e IDI heterólogos o extra endógenos puede reducir la cantidad de uno o más productos intermedios potencialmente tóxicos que de otro modo se acumularían si sólo estuviera presente un ácido nucleico de DXS heterólogo o extra endógeno en las células.
En algunas realizaciones, la producción de isopreno por células que contienen un ácido nucleico de isopreno sintasa heterólogo se incrementa aumentando la cantidad de un polipéptido de MVA expresado por las células (figura 19). Los polipéptidos de rutas de MVA a modo de ejemplo incluyen cualquiera de los siguientes polipéptidos: polipéptidos de acetil-CoA acetiltransferasa (AA-CoA tiolasa), polipéptidos de 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA sintasa (HMG-CoA sintasa), polipéptidos de 3-hidroxi-3-metilglutaril- CoA reductasa (HMG-CoA reductasa), polipéptidos de mevalonato cinasa (MVK), polipéptidos de fosfomevalonato cinasa (PMK), polipéptidos de difosfomevalonato descarboxilasa (MVD), polipéptidos de IDI, y polipéptidos (por ejemplo, polipéptidos de fusión) que tienen una actividad de dos o más polipéptidos de la ruta de MVA. Por ejemplo, pueden introducirse uno o más ácidos nucleicos de la ruta de MVA en las células. En algunas realizaciones, las células contienen la ruta de MVA superior, que incluye ácidos nucleicos de AA-CoA tiolasa, HMG-CoA sintasa, y HMG-CoA reductasa. En algunas realizaciones, las células contienen la ruta de MVA inferior, que incluye ácidos nucleicos de MVK, PMK, MVD e IDI. En algunas realizaciones, las células contienen toda la ruta de MVA, que incluye ácidos nucleicos de AA-CoA tiolasa, HMG-CoA sintasa, HMG-CoA reductasa, MVK, PMK, MVD e IDI. Los ácidos nucleicos de la ruta de MVA pueden ser ácidos nucleicos heterólogos o copias duplicadas de ácidos nucleicos endógenos. En algunas realizaciones, la cantidad de uno o más polipéptidos de la ruta de MVA se aumenta reemplazando los promotores endógenos o regiones reguladoras para los ácidos nucleicos de la ruta de MVA con otros promotores y/o regiones reguladoras que dan como resultado mayor transcripción de los ácidos nucleicos de la ruta de MVA. En algunas realizaciones, las células contienen tanto un ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido de isopreno sintasa (por ejemplo, un ácido nucleico de isopreno sintasa vegetal) como una copia duplicada de un ácido nucleico endógeno que codifica para un polipéptido de isopreno sintasa.
Por ejemplo, células de E. coli que contienen un ácido nucleico que codifica para un polipéptido de isopreno sintasa de kudzu y ácidos nucleicos que codifican para polipéptidos de MVK, PMK, MVD e IDI de Saccharomyces cerevisiae generaron isopreno a una velocidad de 6,67 x 10-4 mol/lcaldo/DO600/h (véase el ejemplo 8). Además, una fermentación de 14 litros de células de E. coli con ácidos nucleicos que codifican para polipéptidos de AA-CoA tiolasa, HMG-CoA sintasa y HMG-CoA reductasa de Enterococcus faecalis produjo 22 gramos de ácido mevalónico (un producto intermedio de la ruta de MVA). Un matraz de agitación de estas células produjo 2-4 gramos de ácido mevalónico por litro. Estos resultados indican que ácidos nucleicos de rutas de MVA heterólogos son activos en E. coli. Células de E. coli que contienen ácidos nucleicos para tanto la ruta de MVA superior como para la ruta de MVA inferior así como una isopreno sintasa de Kudzu (cepa MCM 127) produjeron significativamente más isopreno (874 ug/l) en comparación con células de E. coli con ácidos nucleicos para sólo la ruta de MVA inferior y la isopreno sintasa de kudzu (cepa MCM 131) (véase la tabla 3 y el ejemplo 8, parte VIII).
En algunas realizaciones, al menos una porción de las células mantiene el ácido nucleico de isopreno sintasa, DXS, IDI y/o la ruta de MVA heterólogo para al menos aproximadamente 5, 10, 20, 50, 75, 100, 200, 300, o más divisiones celulares en un cultivo continuo (tal como un cultivo continuo sin dilución). En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos de la invención, el ácido nucleico que comprende la copia heteróloga o duplicada de un ácido nucleico de isopreno sintasa, DXS, IDI y/o la ruta de MVA endógeno también comprende un marcador selectivo, tal como un ácido nucleico de resistencia a antibióticos, kanamicina, ampicilina, carbenicilina, gentamicina, higromicina, fleomicina, bleomicina, neomicina o cloranfenicol.
Tal como se indica en el ejemplo 7, parte VI, la cantidad de isopreno producido puede aumentarse adicionalmente añadiendo extracto de levadura al medio de cultivo celular. En este ejemplo, la cantidad de isopreno producido fue proporcional de manera lineal a la cantidad de extracto de levadura en el medio celular para las concentraciones sometidas a prueba (figura 48C). Además, se produjeron aproximadamente 0,11 gramos de isopreno por litro de caldo a partir de un medio celular con extracto de levadura y glucosa (ejemplo 7, parte VIII). Ambos de estos experimentos usaron células de E. coli con ácidos nucleicos de isopreno sintasa de kudzu, IDI de S. cerevisiae y DXS de E. coli para producir isopreno. Aumentar la cantidad de extracto de levadura en presencia de glucosa dio como resultado que se produjera más isopreno que aumentando la cantidad de glucosa en presencia de extracto de levadura. Además, aumentar la cantidad de extracto de levadura permitió que las células produjeran un alto nivel de isopreno durante una mayor duración de tiempo y mejoró la salud de las células.
También se demostró la producción de isopreno usando tres tipos de biomasa hidrolizada (bagazo, rastrojo de maíz y pasta de coníferas) como fuente de carbono (figuras 46A-C). Las células de E. coli con ácidos nucleicos de isopreno sintasa de kudzu, IDI de S. cerevisiae y DXS de E. coli produjeron tanto isopreno a partir de estas fuentes de carbono de biomasa hidrolizada que a partir de la cantidad equivalente de glucosa (por ejemplo, el 1% de glucosa, p/v). Si se desea, puede usarse cualquier otra fuente de carbono de biomasa en los procedimientos de la invención. Las fuentes de carbono de biomasa son deseables porque son más económicas que muchos medios celulares convencionales, facilitando de ese modo la producción económica de isopreno.
Además, se demostró que el azúcar invertido funciona como una fuente de carbono para la generación de isopreno (figuras 47C y 96-98). Por ejemplo, se produjeron 2,4 g/l de isopreno a partir de células que expresan polipéptidos de la ruta de MVA y una isopreno sintasa de Kudzu (ejemplo 8, parte XV). También se usó glicerol como una fuente de carbono para la generación de 2,2 mg/l de isopreno a partir de células que expresan una isopreno sintasa de Kudzu (Ejemplo 8, parte XIV). Expresar un ácido nucleico de DXS, un ácido nucleico de IDI, y/o uno o más ácidos nucleicos de la ruta de MVA (tales como ácidos nucleicos que codifican para toda la ruta de MVA) además de un ácido nucleico de isopreno sintasa puede aumentar la producción de isopreno a partir de glicerol.
En algunas realizaciones, se incluye un aceite en el medio celular. Por ejemplo, células de B. subtilis que contienen un ácido nucleico de isopreno sintasa de kudzu produjeron isopreno cuando se cultivaban en un medio celular que contenía un aceite y una fuente de glucosa (ejemplo 4, parte III). En algunas realizaciones, se incluye más de un aceite (tal como 2, 3, 4, 5, o más aceites) en el medio celular. Aunque no se pretende limitarse a ninguna teoría particular, se cree que (i) el aceite puede aumentar la cantidad de carbono en las células que está disponible para la conversión a isopreno, (ii) el aceite puede aumentar la cantidad de acetil-CoA en las células, aumentando de ese modo el flujo de carbono a través de la ruta de MVA, y/o (ii) el aceite puede proporcionar nutrientes extra a las células, lo cual es deseable puesto que gran parte del carbono en las células se convierte en isopreno en vez de otros productos. En algunas realizaciones, células que se cultivan en un medio celular que contiene aceite usan de manera natural la ruta de MVA para producir isopreno o se modifican por ingeniería genética para contener ácidos nucleicos para toda la ruta de MVA. En algunas realizaciones, el aceite se hidroliza parcial o completamente antes de añadirse al medio de cultivo celular para facilitar el uso del aceite por las células huésped.
Uno de los principales obstáculos para la producción comercial de pequeñas moléculas tales como isopreno en células (por ejemplo, bacterias) es el desacoplamiento de la producción de la molécula del crecimiento de las células. En algunas realizaciones para la producción comercialmente viable de isopreno, una cantidad significativa del carbono a partir de la materia prima se convierte en isopreno, en vez de en el crecimiento y mantenimiento de las células (“eficacia de carbono”). En diversas realizaciones, las células convierten más de o aproximadamente el 0,0015, el 0,002, el 0,005, el 0,01, el 0,02, el 0,05, el 0,1, el 0,12, el 0,14, el 0,16, el 0,2, el 0,3, el 0,4, el 0,5, el 0,6, el 0,7, el 0,8, el 0,9, el 1,0, el 1,2, el 1,4, el 1,6, el 1,8, el 2,0, el 2,5, el 3,0, el 3,5, el 4,0, el 5,0, el 6,0, el 7,0 o el 8,0% del carbono en el medio de cultivo celular en isopreno. En realizaciones particulares, una porción significativa del carbono a partir de la materia prima que se convierte en productos posteriores se convierte en isopreno. Tal como se describe además en el ejemplo 11, células de E. coli que expresan ácidos nucleicos de la ruta de MVA e isopreno sintasa de kudzu presentaron desacoplamiento de la producción de isopreno o el ácido mevalónico intermedio del crecimiento, que da como resultado alta eficacia de carbono. En particular, se formó ácido mevalónico a partir de células que expresan la ruta de MVA superior de Enterococcus faecalis. Se formó isopreno a partir de células que expresan la ruta de MVA superior de Enterococcus faecalis, la ruta de MVA inferior de Saccharomyces cerevisiae y la isopreno sintasa de Pueraria montana (Kudzu). Este desacoplamiento de la producción de isopreno o ácido mevalónico del crecimiento se demostró en cuatro cepas diferentes de E. coli: BL21(LDE3), Tuner BL21(LDE3), FM5 y MG1655. Las dos primeras cepas de E. coli son cepas B, y las últimas dos son cepas K12. También se demostró el desacoplamiento de producción del crecimiento en una variante de MG1655 con los genes ack y pta delecionados. Esta variante también demostró menos producción de acetato.
Polipéptidos y ácidos nucleicos a modo de ejemplo
Pueden usarse diversos ácidos nucleicos y polipéptidos de isopreno sintasa, DXS, IDI y/o la ruta de MVA en los procedimientos de la invención.
Tal como se usa en el presente documento, los “polipéptidos” incluyen polipéptidos, proteínas, péptidos, fragmentos de polipéptidos y polipéptidos de fusión. En algunas realizaciones, el polipéptido de fusión incluye parte o todo de un primer polipéptido (por ejemplo, un polipéptido de isopreno sintasa, DXS, IDI y/o la ruta de MVA o fragmento catalíticamente activo de los mismos) y puede incluir opcionalmente parte o todo de un segundo polipéptido (por ejemplo, un péptido que facilita la purificación o detección del polipéptido de fusión, tal como una etiqueta His). En algunas realizaciones, el polipéptido de fusión tiene una actividad de dos o más polipéptidos de la ruta de MVA (tales como polipéptidos de a A-CoA tiolasa y HMG-CoA reductasa). En algunas realizaciones, el polipéptido es un polipéptido que se produce de manera natural (tal como el polipéptido codificado por un ácido nucleico mvaE de Enterococcus faecalis) que tiene una actividad de dos o más polipéptidos de la ruta de MVA.
En diversas realizaciones, un polipéptido tiene al menos o aproximadamente 50, 100, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, o más aminoácidos. En algunas realizaciones, el fragmento de polipéptido contiene al menos o aproximadamente 25, 50, 75, 100, 150, 200, 300, o más aminoácidos contiguos de un polipéptido de longitud completa y tiene al menos o aproximadamente el 5%, el 10%, el 20%, el 30%, el 40%, el 50%, el 60%, el 70%, el 80%, el 90%, el 95% o el 100% de una actividad de un correspondiente polipéptido de longitud completa. En realizaciones particulares, el polipéptido incluye un segmento de o toda la secuencia de aminoácidos de cualquier polipéptido de isopreno sintasa, DXS, IDI o de la ruta de MVA que se produce de manera natural. En algunas realizaciones, el polipéptido tiene una o más mutaciones en comparación con la secuencia de un polipéptido de isopreno sintasa, dXs , IDI o de la ruta de MVA de tipo natural (es decir, una secuencia que se produce en la naturaleza).
En algunas realizaciones, el polipéptido es un polipéptido aislado. Tal como se usa en el presente documento, un “polipéptido aislado” no es parte de una biblioteca de polipéptidos, tal como una biblioteca de 2, 5, 10, 20, 50 o más polipéptidos diferentes y se separa de al menos un componente con el que se produce en la naturaleza. Puede obtenerse un polipéptido aislado, por ejemplo, mediante la expresión de un ácido nucleico recombinante que codifica para el polipéptido.
En algunas realizaciones, el polipéptido es un polipéptido heterólogo. Por “polipéptido heterólogo” quiere decirse un polipéptido cuya secuencia de aminoácidos no es idéntica a la de otro polipéptido que se expresa de manera natural en la misma célula huésped. En particular, un polipéptido heterólogo no es idéntico a un ácido nucleico de tipo natural que se encuentra en la misma célula huésped en la naturaleza.
Tal como se usa en el presente documento, un “ácido nucleico” se refiere a dos o más desoxirribonucleótidos y/o ribonucleótidos en forma o bien monocatenaria o bien bicatenaria. En algunas realizaciones, el ácido nucleico es un ácido nucleico recombinante. Por “ácido nucleico recombinante” quiere decirse un ácido nucleico de interés que está libre de uno o más ácidos nucleicos (por ejemplo, genes) que, en el genoma que se produce en la naturaleza del organismo del que se deriva el ácido nucleico de interés, flanquean el ácido nucleico de interés. Por tanto, el término incluye, por ejemplo, un ADN recombinante que se incorpora en un vector, en un virus o plásmido de replicación autónoma, o en el ADN genómico de un procariota o eucariota, o que existe como molécula separada (por ejemplo, un ADNc, un fragmento de ADN genómico, o un fragmento de ADNc producido por PCR o digestión de endonucleasa de restricción) independiente de otras secuencias. En diversas realizaciones, un ácido nucleico es un ácido nucleico recombinante. En algunas realizaciones, un ácido nucleico de isopreno sintasa, DXS, IDI o de la ruta de MVA se une operativamente a otro ácido nucleico que codifica para todo o una porción de otro polipéptido de modo que el ácido nucleico recombinante codifica para un polipéptido de fusión que incluye un polipéptido de isopreno sintasa, DXS, IDI o de la ruta de MVA y todo o parte de otro polipéptido (por ejemplo, un péptido que facilita la purificación o detección del polipéptido de fusión, tal como una etiqueta His). En algunas realizaciones, parte o todo de un ácido nucleico recombinante se sintetiza químicamente.
En algunas realizaciones, el ácido nucleico es un ácido nucleico heterólogo. Por “ácido nucleico heterólogo” quiere decirse un ácido nucleico cuya secuencia de ácido nucleico no es idéntica a la de otro ácido nucleico encontrado de manera natural en la misma célula huésped.
En realizaciones particulares, el ácido nucleico incluye un segmento de o toda la secuencia de ácido nucleico de cualquier ácido nucleico de isopreno sintasa, DXS, iDi o de la ruta de MVA que se produce de manera natural. En algunas realizaciones, el ácido nucleico incluye al menos o aproximadamente 50, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, o más nucleótidos contiguos de un ácido nucleico de isopreno sintasa, DXS, IDI o de la ruta de MVA que se produce de manera natural. En algunas realizaciones, el ácido nucleico tiene una o más mutaciones en comparación con la secuencia de un ácido nucleico de isopreno sintasa, DXS, IDI o de la ruta de MVA de tipo natural (es decir, una secuencia que se produce en la naturaleza). En algunas realizaciones, el ácido nucleico tiene una o más mutaciones (por ejemplo, una mutación silenciosa) que aumentan la transcripción o traducción de ácido nucleico de isopreno sintasa, dXs , IDI o de la ruta de MVA. En algunas realizaciones, el ácido nucleico es una variante degenerada de cualquier ácido nucleico que codifica para un polipéptido de isopreno sintasa, DXS, IDI o de la ruta de MVA.
“Degeneración de codón” se refiere a divergencia en el código genético que permite la variación de la secuencia de nucleótidos sin afectar a la secuencia de aminoácidos de un polipéptido codificado. El experto en la técnica es consciente del “sesgo de codón” presentado por una célula huésped específica en el uso de codones de nucleótido para especificar un aminoácido dado. Por tanto, cuando se sintetiza un ácido nucleico para expresión mejorada en una célula huésped, es deseable en algunas realizaciones diseñar el ácido nucleico de modo que su frecuencia de uso de codón se aproxime a la frecuencia de uso de codón preferido de la célula huésped.
Los números de registro de ácidos nucleicos y polipéptidos a modo de ejemplo de isopreno sintasa, DXS, IDI y/o la ruta de MVA se enumeran en el apéndice 1 (los números de registro del apéndice 1 y sus correspondientes secuencias se denominan en el presente documento, particularmente con respecto a las secuencias de aminoácido y ácido nucleico de ácidos nucleicos y polipéptidos de isopreno sintasa, DXS, IDI y/o la ruta de MVA). La base de datos Kegg también contiene las secuencias de aminoácidos y ácidos nucleicos de numerosos ácidos nucleicos y polipéptidos a modo de ejemplo de isopreno sintasa, DXS, IDI y/o la ruta de MVA (véase, por ejemplo, el sitio web “genome.jp/kegg/pathway/map/map00100.html” y las secuencias en el mismo, a las que se hace referencia a cada una, particularmente con respecto a las secuencias de aminoácidos y ácidos nucleicos de ácidos nucleicos y polipéptidos de isopreno sintasa, DXS, IDI y/o la ruta de MVA). En algunas realizaciones, uno o más de los polipéptidos y/o ácido nucleicos de isopreno sintasa, DXS, IDI o de la ruta de MVA tienen una secuencia idéntica a una secuencia disponible públicamente el 12 de diciembre de 2007, tal como cualquiera de las secuencias que se corresponden con cualquiera de los números de registro en el apéndice 1 o cualquiera de las secuencias presentes en la base de datos Kegg. A continuación se describen además ácidos nucleicos y polipéptidos adicionales a modo de ejemplo de isopreno sintasa, DXS, IDI y/o la ruta de MVA.
Polipéptidos y ácidos nucleicos de isopreno sintasa a modo de ejemplo
Tal como se indicó anteriormente, los polipéptidos de isopreno sintasa convierten difosfato de dimetilalilo (DMAPP) en isopreno. Los polipéptidos de isopreno sintasa a modo de ejemplo incluyen polipéptidos, fragmentos de polipéptidos, péptidos, y polipéptidos de fusión que tienen al menos una actividad de un polipéptido de isopreno sintasa. Pueden usarse procedimientos convencionales para determinar si un polipéptido tiene actividad de polipéptido de isopreno sintasa midiendo la capacidad del polipéptido de convertir DMAPP en isopreno in vitro, en un extracto celular, o in vivo. En un ensayo a modo de ejemplo, se preparan extractos celulares haciendo crecer una cepa (por ejemplo, la cepa E. coli/pTrcKudzu descrita en el presente documento) en el procedimiento de matraz de agitación tal como se describe en el ejemplo 1. Tras completarse la inducción, se sedimentan aproximadamente 10 ml de células mediante centrifugación a 7000 x g durante 10 minutos y se resuspenden en 5 ml de PEB sin glicerol. Las células se lisan usando una célula de presión francesa usando procedimientos convencionales. Alternativamente, las células se tratan con lisozima (disolución de lisozima Ready-Lyse; EpiCentre) tras una congelación/descongelación a -80°C.
Puede medirse la actividad de polipéptido de isopreno sintasa en el extracto celular, por ejemplo, tal como se describe en Silver et al., J. Biol. Chem. 270:13010-13016, 1995 y referencias en el mismo, a las que se hace referencia, particularmente con respecto ensayos para actividad de polipéptido de isopreno sintasa. Se evapora DMAPP (Sigma) hasta sequedad bajo una corriente de nitrógeno y vuelve a hidratarse hasta una concentración de 100 mM en tampón fosfato de potasio 100 mM pH 8,2 y se almacena a -20°C. Para realizar el ensayo, se añade una disolución de 5 |il de MgCl2 1 M, DMAPP 1 mM (250 |ig/ml), 65 |il de tampón de extracto vegetal (PEB) (Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, MgCh 20 mM, el 5% de glicerol y DTT 2 mM) a 25 |il de extracto celular en un vial de espacio de cabeza de 20 ml con un tapón de rosca metálico y septo de silicio recubierto con teflón (Agilent Technologies) y se cultiva a 37°C durante 15 minutos con agitación. La reacción se extingue añadiendo 200 |il de EDTA 250 mM y se cuantifica mediante CG/EM tal como se describe en el ejemplo 1, parte II.
Los ácidos nucleicos de isopreno sintasa a modo de ejemplo incluyen ácidos nucleicos que codifican para un polipéptido, un fragmento de un polipéptido, un péptido o un polipéptido de fusión que tiene al menos una actividad de un polipéptido de isopreno sintasa. Los polipéptidos y ácidos nucleicos de isopreno sintasa a modo de ejemplo incluyen polipéptidos y ácidos nucleicos que se producen de manera natural a partir de cualquiera de los organismos fuente descritos en el presente documento así como polipéptidos y ácidos nucleicos mutantes derivados de cualquiera de los organismos fuente descritos en el presente documento.
En algunas realizaciones, el polipéptido o ácido nucleico de isopreno sintasa es de la familia Fabaceae, tal como la subfamilia Faboideae. En algunas realizaciones, el polipéptido o ácido nucleico de isopreno sintasa es un polipéptido o ácido nucleico que se produce de manera natural a partir de Pueraria montana (kudzu) (Sharkey et al., Plant Physiology 137: 700-712, 2005), Pueraria lobata, chopo (tal como Populus alba x trémula CAC35696) Miller et al., Planta 213: 483-487, 2001), álamo (tal como Populus tremuloides) Silver et al., JBC 270(22): 13010-1316, 1995), o roble común (Quercus robur) (Zimmer et al., documento WO 98/02550), a los que se hace referencia a cada uno, particularmente con respecto a ácidos nucleicos de isopreno sintasa y la expresión de polipéptidos de isopreno sintasa. Las isopreno sintasas adecuadas incluyen, pero no se limitan a, las identificadas con los n.os AY341431, AY316691, AY279379, AJ457070 y AY182241 del registro Genbank, a las que se hace referencia a cada una, particularmente con respecto a secuencias de ácidos nucleicos y polipéptidos de isopreno sintasa. En algunas realizaciones, el polipéptido o ácido nucleico de isopreno sintasa no es un polipéptido o ácido nucleico que se produce de manera natural a partir de Quercus robur (es decir, el polipéptido o ácido nucleico de isopreno sintasa es un polipéptido o ácido nucleico de isopreno sintasa distinto de un polipéptido o ácido nucleico que se produce de manera natural a partir de Quercus robur). En algunas realizaciones, el ácido nucleico o polipéptido de isopreno sintasa no es un polipéptido o ácido nucleico que se produce de manera natural a partir de chopo (tal como Populus alba x tremula CAC35696).
Polipéptidos y ácidos nucleicos de DXS a modo de ejemplo
Tal como se indicó anteriormente, los polipéptidos de 1-desoxi-D-xilulosa-5-fosfato sintasa (DXS) convierten piruvato y D-gliceraldehído-3-fosfato en 1-desoxi-D-xilulosa-5-fosfato. Los polipéptidos de DXS a modo de ejemplo incluyen polipéptidos, fragmentos de polipéptidos, péptidos y polipéptidos de fusión que tienen al menos una actividad de un polipéptido de DXS. Pueden usarse procedimientos convencionales (tales como los descritos en el presente documento) para determinar si un polipéptido tiene actividad de polipéptido de DXS midiendo la capacidad del polipéptido para convertir piruvato y D-gliceraldehído-3-fosfato en 1-desoxi-D-xilulosa-5-fosfato in vitro, en un extracto celular, o in vivo. Los ácidos nucleicos de DXS a modo de ejemplo incluyen ácidos nucleicos que codifican para un polipéptido, un fragmento de un polipéptido, un péptido o un polipéptido de fusión que tiene al menos una actividad de un polipéptido de DXS. Los polipéptidos y ácidos nucleicos de DXS a modo de ejemplo incluyen polipéptidos y ácidos nucleicos que se producen de manera natural a partir de cualquiera de los organismos fuente descritos en el presente documento así como polipéptidos y ácidos nucleicos mutantes derivados de cualquiera de los organismos fuente descritos en el presente documento.
Polipéptidos y ácidos nucleicos de IDI a modo de ejemplo
Los polipéptidos de difosfato de isopentenilo isomerasa (difosfato de isopentilo delta-isomerasa o IDI) catalizan la interconversión de difosfato de isopentenilo (IPP) y difosfato de dimetilalilo (DMAPP) (por ejemplo, convirtiendo IPP en DMAPP y/o convirtiendo DMAPP en IPP). Los polipéptidos de IDI a modo de ejemplo incluyen polipéptidos, fragmentos de polipéptidos, péptidos y polipéptidos de fusión que tienen al menos una actividad de un polipéptido de IDI. Pueden usarse procedimientos convencionales (tal como los descritos en el presente documento) para determinar si un polipéptido tiene actividad de polipéptido de IDI midiendo la capacidad del polipéptido para interconvertir IPP y DMAPP in vitro, en un extracto celular, o in vivo. Los ácidos nucleicos de IDI a modo de ejemplo incluyen ácidos nucleicos que codifican para un polipéptido, un fragmento de un polipéptido, un péptido o un polipéptido de fusión que tiene al menos una actividad de un polipéptido de IDI. Los polipéptidos y ácidos nucleicos de IDI a modo de ejemplo incluyen polipéptidos y ácidos nucleicos que se producen de manera natural a partir de cualquiera de los organismos fuente descritos en el presente documento así como polipéptidos y ácidos nucleicos mutantes derivados de cualquiera de los organismos fuente descritos en el presente documento.
Polipéptidos y ácidos nucleicos de la ruta de MVA a modo de ejemplo
Los polipéptidos de la ruta de MVA a modo de ejemplo incluyen polipéptidos de acetil-CoA acetiltransferasa (AA-CoA tiolasa), polipéptidos de 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA sintasa (HMG-CoA sintasa), polipéptidos de 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA reductasa (HMG-CoA reductasa), polipéptidos de mevalonato cinasa (MVK), polipéptidos de fosfomevalonato cinasa (PMK), polipéptidos de difosfomevalonato descarboxilasa (MVD), polipéptidos de IDI, y polipéptidos (por ejemplo, polipéptidos de fusión) que tienen una actividad de dos o más polipéptidos de la ruta de MVA. En particular, los polipéptidos de la ruta de MVA incluyen polipéptidos, fragmentos de polipéptidos, péptidos y polipéptidos de fusión que tienen al menos una actividad de un polipéptido de la ruta de MVA. Los ácidos nucleicos de la ruta de MVA a modo de ejemplo incluyen ácidos nucleicos que codifican para un polipéptido, un fragmento de un polipéptido, un péptido o un polipéptido de fusión que tiene al menos una actividad de un polipéptido de la ruta de MVA. Los polipéptidos y ácidos nucleicos de la ruta de MVA a modo de ejemplo incluyen polipéptidos y ácidos nucleicos que se producen de manera natural a partir de cualquiera de los organismos fuente descritos en el presente documento así como polipéptidos y ácidos nucleicos mutantes derivados de cualquiera de los organismos fuente descritos en el presente documento.
En particular, los polipéptidos de acetil-CoA acetiltransferasa (AA-CoA tiolasa o AACT) convierten dos moléculas de acetil-CoA en acetoacetil-CoA. Pueden usarse procedimientos convencionales (tal como los descritos en el presente documento) para determinar si un polipéptido tiene actividad de polipéptido de AA-CoA tiolasa midiendo la capacidad del polipéptido para convertir dos moléculas de acetil-CoA en acetoacetil-CoA in vitro, en un extracto celular, o in vivo.
Los polipéptidos de 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA sintasa (HMG-CoA sintasa o HMGS) convierten acetoacetil-CoA en 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA. Pueden usarse procedimientos convencionales (tal como los descritos en el presente documento) para determinar si un polipéptido tiene actividad de polipéptido de HMG-CoA sintasa midiendo la capacidad del polipéptido para convertir acetoacetil-CoA en 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA in vitro, en un extracto celular, o in vivo.
Los polipéptidos de 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA reductasa (HMG-CoA reductasa o HMGR) convierten 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA en mevalonato. Pueden usarse procedimientos convencionales (tales como los descritos en el presente documento) para determinar si un polipéptido tiene actividad de polipéptido de HMG-CoA reductasa midiendo la capacidad del polipéptido para convertir 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA en mevalonato in vitro, en un extracto celular, o in vivo.
Los polipéptidos de mevalonato cinasa (MVK) fosforilan mevalonato para formar mevalonato-5-fosfato. Pueden usarse procedimientos convencionales (tales como los descritos en el presente documento) para determinar si un polipéptido tiene actividad de polipéptido de MVK midiendo la capacidad del polipéptido para convertir mevalonato en mevalonato-5-fosfato in vitro, en un extracto celular, o in vivo.
Los polipéptidos de fosfomevalonato cinasa (PMK) fosforilan mevalonato-5-fosfato para formar mevalonato-5-difosfato. Pueden usarse procedimientos convencionales (tales como los descritos en el presente documento) para determinar si un polipéptido tiene actividad de polipéptido de PMK midiendo la capacidad del polipéptido para convertir mevalonato-5-fosfato en mevalonato-5-difosfato in vitro, en un extracto celular, o in vivo.
Los polipéptidos de difosfomevalonato descarboxilasa (MVD o DPMDC) convierten mevalonato-5-difosfato en polipéptidos de difosfato de isopentenilo (IPP). Pueden usarse procedimientos convencionales (tales como los descritos en el presente documento) para determinar si un polipéptido tiene actividad de polipéptido de MVD midiendo la capacidad del polipéptido para convertir mevalonato-5-difosfato en IPP in vitro, en un extracto celular, o in vivo.
Anteriormente se describen polipéptidos y ácidos nucleicos de IDI a modo de ejemplo.
Procedimientos a modo de ejemplo para aislar ácidos nucleicos
Pueden aislarse ácidos nucleicos de isopreno sintasa, DXS, IDI y/o de la ruta de MVA usando procedimientos convencionales. Los procedimientos de obtención de ácidos nucleicos deseados a partir de un organismo fuente de interés (tal como un genoma bacteriano) son comunes y se conocen bien en la técnica de biología molecular (véase, por ejemplo, el documento WO 2004/033646 y las referencias citadas en el mismo, a las que se hace referencia, particularmente con respecto al aislamiento de ácidos nucleicos de interés). Por ejemplo, si la secuencia del ácido nucleico se conoce (tal como cualquiera de los ácidos nucleicos conocidos descritos en el presente documento), pueden crearse bibliotecas genómicas adecuadas mediante digestión de endonucleasa de restricción y pueden examinarse con sondas complementarias a la secuencia de ácido nucleico deseada. Una vez se aísla la secuencia, el ADN puede amplificarse usando procedimientos de amplificación dirigidos a cebador convencionales tales como reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (patente estadounidense n.° 4.683.202, a la que se hace referencia, particularmente con respecto a procedimientos de PCR) para obtener cantidades de ADN adecuadas para transformación usando vectores apropiados.
Alternativamente, pueden sintetizarse químicamente ácidos nucleicos de isopreno sintasa, DXS, IDI y/o de la ruta de MVA (tales como cualesquiera ácidos nucleicos de isopreno sintasa, DXS, IDI y/o de la ruta de MVA con una secuencia conocida de ácido nucleico) usando procedimientos convencionales.
Pueden identificarse polipéptidos y ácidos nucleicos adicionales de isopreno sintasa, DXS, IDI o de la ruta de MVA que pueden ser adecuados para su uso en las composiciones y procedimientos descritos en el presente documento usando procedimientos convencionales. Por ejemplo, pueden construirse bibliotecas de cósmidos del ADN cromosómico de organismos que se sabe que producen isopreno de manera natural en organismos tales como E. coli, y después se examinan para determinar la producción de isopreno. En particular, pueden crearse bibliotecas de cósmidos cuando se empaquetan grandes segmentos de ADN genómico (35-45 kb) en vectores y usarse para transformar huéspedes apropiados. Los vectores de cósmidos son únicos en que son capaces de acomodar grandes cantidades de a Dn . Generalmente, los vectores de cósmidos tienen al menos una copia de la secuencia de ADN cos que se necesita para el empaquetamiento y posterior circularización del ADN heterólogo. Además de la secuencia cos, estos vectores también contienen un origen de replicación tal como ColEI y marcadores de resistencia a fármacos tales como un ácido nucleico resistente a ampicilina o neomicina. Se describen bien procedimientos de uso de los vectores de cósmidos para la transformación de huéspedes bacterianos adecuados en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed., Cold Spring Harbor, 1989, al que se hace referencia, particularmente con respecto a procedimientos de transformación.
Normalmente para clonar cósmidos, se aísla ADN heterólogo usando las endonucleasas de restricción apropiadas y ligadas adyacentes a la región cos del vector de cósmidos usando las ligasas apropiadas. Entonces, se hacen reaccionar vectores de cósmidos que contienen el ADN heterólogo linealizado con un vehículo de empaquetamiento de ADN tal como bacteriófago. Durante el proceso de empaquetamiento, los sitios cos se escinden y el ADN heterólogo se empaqueta en la porción de cabeza de la partícula viral bacteriana. Estas partículas se usan entonces para transfectar células huésped adecuadas tales como E. coli. Una vez inyectado en la célula, el ADN heterólogo circulariza bajo la influencia de los extremos pegajosos cos. De esta manera, pueden introducirse grandes segmentos de ADN heterólogo y expresarse en células huésped.
Los procedimientos adicionales para obtener ácidos nucleicos de isopreno sintasa, DXS, IDI y/o de la ruta de MVA incluyen examen de una biblioteca metagenómica mediante ensayo (tal como el ensayo de espacio de cabeza descrito en el presente documento) o mediante PCR usando cebadores dirigidos contra nucleótidos que codifican para una longitud de aminoácidos conservados (por ejemplo, al menos 3 aminoácidos conservados). Pueden identificarse aminoácidos conservados alineando secuencias de aminoácidos de polipéptidos de isopreno sintasa, DXS, IDI y/o de la ruta de MVA conocidos. Pueden identificarse aminoácidos conservados para polipéptidos de isopreno sintasa basándose en secuencias alineadas de polipéptidos de isopreno sintasa conocidos. Un organismo que se ha encontrado que produce isopreno de manera natural puede someterse a procedimientos de purificación de proteína convencionales (que se conocen bien en la técnica) y el polipéptido purificado resultante puede secuenciarse usando procedimientos convencionales. Se encuentran otros procedimientos en la bibliografía (véase, por ejemplo, Julsing et al., Applied. Microbiol. Biotechnol. 75: 1377-84, 2007; Withers et al., Appl Environ Microbiol.
73(l9):6277-83, 2007, a los que se hace referencia, particularmente con respecto a la identificación de ácidos nucleicos implicados en la síntesis de isopreno).
Además, pueden usarse programas de alineación de secuencia y/o de predicción de estructura convencionales para identificar polipéptidos y ácidos nucleicos de DXS, IDI o de la ruta de MVA adicionales basándose en la similitud de su estructura primaria y/o secundaria predicha de polipéptido con la de polipéptidos y ácidos nucleicos de DXS, IDI o de la ruta de MVA conocidos. También pueden usarse bases de datos convencionales tales como la base de datos swissprot-trembl (sitio web “expasy.org”, Swiss Institute of Bioinformatics Swiss-Prot grupo CMU - 1 rue Michel Servet CH-1211 Génova 4, Suiza) para identificar polipéptidos y ácidos nucleicos de isopreno sintasa, DXS, IDI o de la ruta de MVA. La estructura secundaria y/o terciaria de un polipéptido de isopreno sintasa, DXS, IDI o de la ruta de MVA puede predecirse usando los ajustes por defecto de programas de predicción de la estructura convencionales, tales como PredictProtein (630 West, 168 Street, BB217, Nueva York, N.Y. 10032, EE.UU.). Alternativamente, la estructura secundaria y/o terciaria real de un polipéptido de isopreno sintasa, DXS, IDI o de la ruta de MVA puede determinarse usando procedimientos convencionales. También pueden identificarse ácidos nucleicos de isopreno sintasa, DXS, IDI o de la ruta de MVA adicionales mediante hibridación a sondas generadas a partir de ácidos nucleicos de isopreno sintasa, DXS, IDI o de la ruta de MVA conocidos.
Promotores y vectores a modo de ejemplo
Cualquiera del ácido nucleico de isopreno sintasa, DXS, IDI o de la ruta de MVA descrito en el presente documento puede incluirse en uno o más vectores. Por consiguiente, la divulgación también presenta vectores con un ácido nucleico más que codifican para cualquiera de los polipéptidos de isopreno sintasa, DXS, IDI o de la ruta de MVA que se describen en el presente documento. Tal como se usa en el presente documento, un “vector” significa un constructo que es capaz de administrar, y expresar de manera deseable uno o más ácidos nucleicos de interés en una célula huésped. Los ejemplos de los vectores incluyen, pero no se limitan a, plásmidos, vectores virales, vectores de expresión de a Dn o ARN, cósmidos y vectores de fago. En algunas realizaciones, el vector contiene un ácido nucleico bajo el control de una secuencia de control de la expresión.
Tal como se usa en el presente documento, una “secuencia de control de la expresión” significa una secuencia de ácido nucleico que dirige la transcripción de un ácido nucleico de interés. Una secuencia de control de la expresión puede ser un promotor, tal como un promotor constitutivo o inducible, o un potenciador. Un “promotor inducible” es un promotor que es activo bajo regulación ambiental o de desarrollo. La secuencia de control de la expresión se une operativamente al segmento de ácido nucleico que va a transcribirse.
En algunas realizaciones, el vector contiene un marcador selectivo. El término “marcador selectivo” se refiere a un ácido nucleico capaz de expresión en una célula huésped que permite la facilidad de selección de aquellas células huésped que contienen un ácido nucleico o vector introducido. Los ejemplos de marcadores seleccionables incluyen, pero no se limitan a, ácidos nucleicos de resistencia a antibióticos (por ejemplo, kanamicina, ampicilina, carbenicilina, gentamicina, higromicina, fleomicina, bleomicina, neomicina o cloranfenicol) y/o ácidos nucleicos que confieren una ventaja metabólica, tal como una ventaja nutricional a la célula huésped. Los marcadores selectivos nutricionales a modo de ejemplo incluyen los marcadores conocidos en la técnica como amdS, argB y pyr4. En la técnica se conocen marcadores útiles en sistemas de vector para la transformación de Trichoderma (véase, por ejemplo, Finkelstein, capítulo 6 en Biotechnology of Filamentous Fungi, Finkelstein et al., eds. Butterworth-Heinemann, Boston, MA, cap. 6., 1992; y Kinghorn et al., Applied Molecular Genetics of Filamentous Fungi, Blackie Academic and Professional, Chapman and Hall, Londres, 1992, a los que se hace referencia, particularmente con respecto a marcadores selectivos). En algunas realizaciones, el marcador selectivo es el ácido nucleico amdS, que codifica para la enzima acetamidasa, lo que permite que células transformadas crezcan sobre acetamida como una fuente de nitrógeno. El uso de un ácido nucleico amdS de A. nidulans como marcador selectivo se describe en Kelley et al., EMBO J. 4:475-479, 1985 y Penttila et al., Gene 61:155-164, 1987 (a los que se hace referencia, particularmente con respecto a marcadores selectivos). En algunas realizaciones, un ácido nucleico de isopreno sintasa, DXS, IDI o de la ruta de MVA se integra en un cromosoma de las células sin un marcador selectivo.
Vectores adecuados son aquellos que son compatibles con la célula huésped empleada. Pueden derivarse vectores adecuados, por ejemplo, de una bacteria, un virus (tal como bacteriófago T7 o un fago derivado de M-13), un cósmido, una levadura o una planta. Los expertos en la técnica conocen protocolos para obtener y usar tales vectores (véase, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed., Cold Spring Harbor, 1989, al que se hace referencia, particularmente con respecto al uso de vectores).
Los promotores se conocen bien en la técnica. Cualquier promotor que funcione en la célula huésped puede usarse para la expresión de un ácido nucleico de isopreno sintasa, DXS, IDI o de la ruta de MVA en la célula huésped. Las regiones o promotores de control de la iniciación, que son útiles para impulsar la expresión de ácidos nucleicos de isopreno sintasa, DXS, IDI o de la ruta de MVA en diversas células huésped son numerosos y resultan familiares para los expertos en la técnica (véase, por ejemplo, el documento WO 2004/033646 y las referencias citadas en el mismo, a los que se hace referencia, particularmente con respecto a vectores para la expresión de ácidos nucleicos de interés). Prácticamente cualquier promotor capaz de impulsar estos ácidos nucleicos es adecuado para la presente invención incluyendo, pero sin limitarse a, CYC1, HIS3, GAL1, GAL10, ADH1, PGK, PHO5, GAPDH, ADCI, TRP1, URA3, LEU2, ENO y TPI (útiles para la expresión en Saccharomyces); AOX1 (útil para la expresión en Pichia); y lac, trp, XPL, XPR, T7, tac y trc (útiles para la expresión en E. coli).
En algunas realizaciones, se usa un promotor de glucosa isomerasa (véase, por ejemplo, la patente estadounidense n.° 7.132.527 y referencias citadas en la misma, a las que se hace referencia, particularmente con respecto a promotores y sistemas de plásmido para expresar polipéptidos de interés). Pueden usarse mutantes de promotor de glucosa isomerasa notificados para variar el nivel de expresión del polipéptido codificado por un ácido nucleico unido operativamente al promotor de glucosa isomerasa (patente estadounidense n.° 7.132.527). En diversas realizaciones, el promotor de glucosa isomerasa está contenido en un plásmido de copia baja, media o alta (patente estadounidense n.° 7.132.527).
En diversas realizaciones, un ácido nucleico de isopreno sintasa, DXS, IDI y/o de la ruta de MVA está contenido en un plásmido de copia baja (por ejemplo, un plásmido que se mantiene a de aproximadamente 1 a aproximadamente 4 copias por célula), plásmido de copia media (por ejemplo, un plásmido que se mantiene a aproximadamente de 10 a aproximadamente 15 copias por célula), o plásmido de copia alta (por ejemplo, un plásmido que se mantiene a de aproximadamente 50 o más copias por célula). En algunas realizaciones, el ácido nucleico heterólogo o extra endógeno de isopreno sintasa, DXS, IDI o de la ruta de MVA se une operativamente a un promotor T7. En algunas realizaciones, el ácido nucleico heterólogo o extra endógeno de isopreno sintasa, DXS, IDI o de la ruta de MVA unido operativamente a un promotor T7 está contenido en un plásmido de copia media o alta. En algunas realizaciones, el ácido nucleico heterólogo o extra endógeno de isopreno sintasa, DXS, IDI o de la ruta de MVA se une operativamente a un promotor Trc. En algunas realizaciones, el ácido nucleico heterólogo o extra endógeno de isopreno sintasa, DXS, iDi o de la ruta de MVA unido operativamente a un promotor Trc está contenido en un plásmido de copia media o alta. En algunas realizaciones, el ácido nucleico heterólogo o extra endógeno de isopreno sintasa, DXS, IDI o de la ruta de MVA se une operativamente a un promotor Lac. En algunas realizaciones, el ácido nucleico heterólogo o extra endógeno de isopreno sintasa, DXS, IDI o de la ruta de MVA unido operativamente a un promotor Lac está contenido en un plásmido de copia baja. En algunas realizaciones, el ácido nucleico heterólogo o extra endógeno de isopreno sintasa, DXS, IDI o de la ruta de MVA se une operativamente a un promotor endógeno, tal como un promotor de Escherichia, Panteoa, Bacillus, Yarrowia, Streptomyces o Trichoderma endógeno o un promotor de serina proteasa alcalina, isopreno sintasa, DXS, IDI o de la ruta de MVA endógeno. En algunas realizaciones, el ácido nucleico heterólogo o extra endógeno de isopreno sintasa, DXS, IDI o de la ruta de MVA unido operativamente a un promotor endógeno está contenido en un plásmido de copia alta. En algunas realizaciones, el vector es un plásmido de replicación que no se integra en un cromosoma en las células. En algunas realizaciones, parte o todo el vector se integra en un cromosoma en las células.
En algunas realizaciones, el vector es cualquier vector que, cuando se introduce en una célula huésped fúngica se integra en el genoma de la célula huésped y se replica. Se hace referencia al Fungal Genetics Stock Center Catalogue of Strains (FGSC, sitio web “fgsc.net” y las referencias citadas en el mismo, a las que se hace referencia a cada una, particularmente con respecto a vectores) para una lista de vectores. Ejemplos adicionales de vectores de expresión y/o integración adecuados se proporcionan en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed., Cold Spring Harbor, 1989, Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel et al. (eds) 1987, suplemento 30, sección 7.7.18); van den Hondel et al. en Bennett y Lasure (eds.) More Gene Manipulations in Fungi, Academic Press págs. 396-428, 1991; y la patente estadounidense n.° 5.874.276, a los que se hace referencia a cada uno, particularmente con respecto a vectores. Los vectores particularmente útiles incluyen pFB6, pBR322, PUC18, pUC100 y pENTR/D.
En algunas realizaciones, un ácido nucleico de isopreno sintasa, DXS, IDI o de la ruta de MVA se une operativamente a un promotor adecuado que muestra actividad transcripcional en una célula huésped fúngica. El promotor puede derivarse de uno o más ácidos nucleicos que codifican para un polipéptido que es o bien endógeno o bien heterólogo a la célula huésped. En algunas realizaciones, el promotor es útil en un huésped de Trichoderma. Los ejemplos no limitativos de promotores adecuados incluyen cbh1, cbh2, egl1, egl2, pepA, hfb1, hfb2, xyn1 y amy. En algunas realizaciones, el promotor es uno que es nativo a la célula huésped. Por ejemplo, en algunas realizaciones cuando T. reesei es el huésped, el promotor es un promotor de T. reesei nativo. En algunas realizaciones, el promotor es cbhl de T. reesei, que es un promotor inducible y se ha depositado en GenBank con el n.° de registro D86235, al que se hace referencia, particularmente con respecto a promotores. En algunas realizaciones, el promotor es uno que es heterólogo a la célula huésped fúngica. Otros ejemplos de promotores útiles incluyen promotores de los genes de glucoamilasa de A. awamori y A. niger (glaA) (Nunberg et al., Mol. Cell Biol. 4:2306-2315, 1984 y Boel et al., EMBO J. 3:1581-1585, 1984, a los que se hace referencia a cada uno, particularmente con respecto a promotores); alfa amilasas de Aspergillus niger, TAKA amilasa de Aspergillus oryzae, xln1 de T. reesei, y la celobiohidrolasa 1 de T. reesei (documento EP 137280, al que se hace referencia, particularmente con respecto a promotores).
En algunas realizaciones, el vector de expresión también incluye una secuencia de terminación. Las regiones de control de la terminación también pueden derivarse de diversos genes nativos a la célula huésped. En algunas realizaciones, la secuencia de terminación y la secuencia de promotor se derivan de la misma fuente. En otra realización, la secuencia de terminación es endógena a la célula huésped. Una secuencia de terminador particularmente adecuada es cbh1 derivada de una cepa de Trichoderma (tal como T. reesei). Otros terminadores fúngicos útiles incluyen el terminador de un ácido nucleico de glucoamilasa de A. niger o A. awamori (Nunberg et al., Mol. Cell Biol. 4:2306-2315, 1984 y Boel et al., EMBO J. 3:1581-1585, 1984; a los que se hace referencia a cada uno, particularmente con respecto a terminadores fúngicos). Opcionalmente, puede incluirse un sitio de terminación. Para la expresión eficaz de los polipéptidos, ADN que codifica para el polipéptido se une operativamente a través de codones de iniciación a regiones de control de la expresión seleccionadas de modo que la expresión da como resultado la formación del ARN mensajero apropiado.
En algunas realizaciones, el promotor, región codificante y terminador, se originan todos del ácido nucleico de isopreno sintasa, DXS, IDI o de la ruta de MVA que va a expresarse. En algunas realizaciones, la región codificante para un ácido nucleico de isopreno sintasa, DXS, IDI o de la ruta de MVA se inserta en un vector de expresión de uso general de modo que está bajo el control transcripcional de las secuencias de terminador y promotor de constructo de expresión. En algunas realizaciones, genes o parte de los mismos se insertan en el sentido 3' del promotor cbh1 fuerte.
Un ácido nucleico de isopreno sintasa, DXS, IDI o de la ruta de MVA puede incorporarse en un vector, tal como un vector de expresión, usando técnicas convencionales (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, 1982, al que se hace referencia, particularmente con respecto al examen de secuencias de ADN apropiadas y la construcción de vectores). En la técnica se conocen bien procedimientos usados para ligar el constructo de ADN que comprende un ácido nucleico de interés (tal como un ácido nucleico de isopreno sintasa, DXS, IDI o de la ruta de mVa ), un promotor, un terminador, y otras secuencias y para insertarlos en un vector adecuado. Por ejemplo, pueden usarse enzimas de restricción para escindir el ácido nucleico de isopreno sintasa, DXS, IDI o de la ruta de MVA y el vector. Entonces, los extremos compatibles del ácido nucleico escindido de isopreno sintasa, DXS, IDI o de la ruta de MVA y el vector escindido pueden ligarse. La unión se logra generalmente mediante ligación en sitios de restricción convenientes. Si tales sitios no existen, se usan los ligadores de oligonucleótidos sintéticos según la práctica convencional (véase, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed., Cold Spring Harbor, 1989, y Bennett y Lasure, More Gene Manipulations in Fungi, Academic Press, San Diego, págs. 70-76, 1991, a los que se hace referencia, particularmente con respecto a ligadores de oligonucleótido). Además, pueden construirse vectores usando técnicas de recombinación conocidas (por ejemplo, Invitrogen Life Technologies, Gateway Technology).
En algunas realizaciones, puede ser deseable sobreexpresar ácidos nucleicos de isopreno sintasa, DXS, IDI o de la ruta de MVA a niveles mucho mayores que los encontrados actualmente en células que se producen de manera natural. Este resultado puede lograrse mediante la clonación selectiva de los ácidos nucleicos que codifican para esos polipéptidos en plásmidos de copia múltiple o colocando esos ácidos nucleicos bajo un fuerte promotor inducible o constitutivo. Procedimientos para sobreexpresar polipéptidos deseados son comunes y se conocen bien en la técnica de biología molecular y pueden encontrarse ejemplos en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed., Cold Spring Harbor, 1989, al que se hace referencia, particularmente con respecto a técnicas de clonación.
Los siguientes recursos incluyen descripciones de metodología general adicional útil según la invención: Kreigler, Gene Transfer and Expression; A Laboratory Manual, 1990 y Ausubel et al., eds. Current Protocols in Molecular Biology, 1994, a los que se hace referencia a cada uno, particularmente con respecto a biología molecular y técnicas de clonación.
Organismos fuente a modo de ejemplo
Pueden obtenerse ácidos nucleicos de isopreno sintasa, DXS, IDI o de la ruta de MVA (y sus polipéptidos codificados) a partir de cualquier organismo que contenga de manera natural ácidos nucleicos de isopreno sintasa, DXS, IDI y/o de la ruta de MVA. Tal como se indicó anteriormente, se forma isopreno de manera natural por una diversidad de organismos, tales como bacterias, levadura, plantas y animales. Los organismos contienen la ruta de MVA, ruta de DXP, o tanto las rutas de MVA como de DXP para producir isopreno (figura 19). Por tanto, pueden obtenerse ácidos nucleicos de DXS, por ejemplo, a partir de cualquier organismo que contenga la ruta de DXP o contenga tanto las rutas de MVA como de DXP. Pueden obtenerse ácidos nucleicos de IDI e isopreno sintasa, por ejemplo, a partir de cualquier organismo que contenga la ruta de MVA, ruta de DXP, o tanto las rutas de MVA como de DXP. Pueden obtenerse ácidos nucleicos de la ruta de MVA, por ejemplo, a partir de cualquier organismo que contenga la ruta de MVA o contenga tanto las rutas de MVA como de dXp .
En algunas realizaciones, la secuencia de ácido nucleico del ácido nucleico de isopreno sintasa, DXS, IDI o de la ruta de MVA es idéntica a la secuencia de un ácido nucleico que se produce por cualquiera de los siguientes organismos en la naturaleza. En algunas realizaciones, la secuencia de aminoácidos del polipéptido de isopreno sintasa, DXS, IDI o de la ruta de MVA es idéntica a la secuencia de un polipéptido que se produce por cualquiera de los siguientes organismos en la naturaleza. En algunas realizaciones, el ácido nucleico o polipéptido de isopreno sintasa, DXS, IDI o de la ruta de MVA es un ácido nucleico o polipéptido mutante derivado de cualquiera de los organismos descritos en el presente documento. Tal como se usa en el presente documento, “derivado de” se refiere a la fuente del ácido nucleico o polipéptido en el que se introducen una o más mutaciones. Por ejemplo, un polipéptido que se “deriva a partir de un polipéptido vegetal” se refiere a un polipéptido de interés que resulta de introducir una o más mutaciones en la secuencia de un polipéptido vegetal de tipo natural (es decir, una secuencia que se produce en la naturaleza).
En algunas realizaciones, el organismo fuente es un hongo, ejemplos del cual son especies de Aspergillus tales como A. oryzae y A. niger, especies de Saccharomyces tales como S. cerevisiae, especies de Schizosaccharomyces tales como S. pombe, y especies de Trichoderma tales como T. reesei. En algunas realizaciones, el organismo fuente es una célula fúngica filamentosa. El término “hongos filamentosos” se refiere a todas las formas filamentosas de la subdivisión Eumycotina (véase, Alexopoulos, C. J. (1962), Introductory Mycology, Wiley, Nueva York). Estos hongos se caracterizan por un micelio vegetativo con una pared celular que se compone de quitina, celulosa, y otros polisacáridos complejos. Los hongos filamentosos son morfológica, fisiológica y genéticamente distintos de levaduras. El crecimiento vegetativo por hongos filamentosos es mediante elongación de las hifas y el catabolismo de carbono es obligatoriamente aerobio. La célula parental fúngica filamentosa puede ser una célula de una especie de, pero sin limitarse a, Trichoderma, (por ejemplo, Trichoderma reesei, la forma asexual de Hypocrea jecorina, clasificada previamente como T. longibrachiatum, Trichoderma viride, Trichoderma koningii, Trichoderma harzianum) (Sheir-Neirs et al., Appl. Microbiol. Biotechnol 20: 46-53, 1984; n.° de ATCC 56765 y n.° de ATCC 26921); Penicillium sp., Humicola sp. (por ejemplo, H. insolens, H. lanuginose o H. grisea); Chrysosporium sp. (por ejemplo, C. lucknowense), Gliocladium sp., Aspergillus sp. (por ejemplo, A. oryzae, A. niger, A sojae, A. japonicus, A. nidulans, o A. awamori) (Ward et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 39: 7380743, 1993 y Goedegebuur et al., Genet 41: 89-98, 2002), Fusarium sp., (por ejemplo, F. roseum, F. graminum F. cerealis, F. oxysporum, o F. venenatum), Neurospora sp., (por ejemplo, N. crassa), Hypocrea sp., Mucor sp., (por ejemplo, M. miehei), Rhizopus sp. y Emericella sp. (véase también, Innis et al., Sci. 228: 21-26, 1985). El término “Trichoderma” o “Trichoderma sp.” o “Trichoderma spp.” se refiere a cualquier género fúngico previa o actualmente conocido como Trichoderma.
En algunas realizaciones, el hongo es A. nidulans, A. awamori, A. oryzae, A. aculeatus, A. niger, A. japonicus, T. reesei, T. viride, F. oxysporum, o F. solani. Las cepas de Aspergillus se divulgan en Ward et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 39:738-743, 1993 y Goedegebuur et al., Curr Gene 41:89-98, 2002, a las que se hace referencia a cada una, particularmente con respecto a hongos. En realizaciones particulares, el hongo es una cepa de Trichoderma, tal como una cepa de T. reesei. Se conocen cepas de T. reesei y los ejemplos no limitativos incluyen n.° de ATCC 13631, n.° de ATCC 26921, n.° de ATCC 56764, n.° de ATCC 56765, n.° de ATCC 56767, y NRRL 15709, a los que se hace referencia a cada uno, particularmente con respecto a cepas de T. reesei. En algunas realizaciones, la cepa huésped es un derivado de RL-P37. RL-P37 se divulga en Sheir-Neiss et al., Appl. Microbiol. Biotechnology 20:4653, 1984, al que se hace referencia, particularmente con respecto a cepas de T. reesei.
En algunas realizaciones, el organismo fuente es una levadura, tal como Saccharomyces sp., Schizosaccharomyces sp., Pichia sp., o Candida sp.
En algunas realizaciones, el organismo fuente es una bacteria, tal como cepas de Bacillus tales como B. lichenformis o B. subtilis, cepas de Pantoea tales como P. citrea, cepas de Pseudomonas tales como P. alcaligenes, cepas de Streptomyces tales como S. lividans o S. rubiginosus, o cepas de Escherichia tales como E. coli.
Tal como se usa en el presente documento, “el género Bacillus” incluye todas las especies dentro del género “Bacillus”, tal como conocen los expertos en la técnica, incluyendo pero sin limitarse a B. subtilis, B. licheniformis, B. lentus, B. brevis, B. stearothermophilus, B. alkalophilus, B. amyloliquefaciens, B. clausii, B. halodurans, B. megaterium, B. coagulans, B. circulans, B. lautus y B. thuringiensis. Se reconoce que el género Bacillus continúa experimentando reorganización taxonómica. Por tanto, se pretende que el género incluya especies que se han reclasificado, incluyendo pero sin limitarse a tales organismos como B. stearothermophilus, que ahora se denomina “Geobacillus stearothermophilus”. La producción de endosporas resistentes en presencia de oxígeno se considera la característica distintiva del género Bacillus, aunque esa característica también se aplica a los recientemente denominados Alicyclobacillus, Amphibacillus, Aneurinibacillus, Anoxybacillus, Brevibacillus, Filobacillus, Gracilibacillus, Halobacillus, Paenibacillus, Salibacillus, Thermobacillus, Ureibacillus y Virgibacillus.
En algunas realizaciones, el organismo fuente es una bacteria Gram positiva. Los ejemplos no limitativos incluyen cepas de Streptomyces (por ejemplo, S. lividans, S. coelicolor, o S. griseus) y Bacillus. En algunas realizaciones, el organismo fuente es una bacteria Gram negativa, tal como E. coli o Pseudomonas sp.
En algunas realizaciones, el organismo fuente es una planta, tal como una planta de la familia Fabaceae, tal como la subfamilia Faboideae. En algunas realizaciones, el organismo fuente es kudzu, chopo (tal como Populus alba x tremula CAC35696), álamo (tal como Populus tremuloides) o Quercus robur.
En algunas realizaciones, el organismo fuente es un alga, tal como algas verdes, algas rojas, glaucofitas, cloraracniofitas, euglenoideos, cromistas, o dinoflagelados.
En algunas realizaciones, el organismo fuente es una cianobacteria, tal como cianobacteria clasificada en cualquiera de los siguientes grupos basándose en la morfología: Chroococcales, Pleurocapsales, Oscillatoriales, Nostocales o Stigonematales.
Células huésped a modo de ejemplo
Puede usarse una diversidad de células huésped para expresar polipéptidos de isopreno sintasa, DXS, IDI y/o de la ruta de MVA y para producir isopreno en los procedimientos de la invención reivindicada. Las células huésped a modo de ejemplo incluyen células de cualquiera de los organismos indicados en la sección anterior bajo el encabezado “Organismos fuente a modo de ejemplo.” La célula huésped puede ser una célula que produce de manera natural isopreno o una célula que no produce de manera natural isopreno. En algunas realizaciones, la célula huésped produce de manera natural isopreno usando la ruta de DXP, y se añade un ácido nucleico de isopreno sintasa, DXS y/o IDI para potenciar la producción de isopreno usando esta ruta. En algunas realizaciones, la célula huésped produce de manera natural isopreno usando la ruta de MVA, y se añaden una isopreno sintasa y/o uno o más ácidos nucleicos de la ruta de MVA para potenciar la producción de isopreno usando esta ruta. En algunas realizaciones, la célula huésped produce de manera natural isopreno usando la ruta de DXP y se añaden uno o más ácidos nucleicos de la ruta de MVA para producir isopreno usado parte o toda la ruta de MVA así como la ruta de DXP. En algunas realizaciones, la célula huésped produce de manera natural isopreno usando tanto las rutas de DXP como de MVA y se añaden uno o más ácidos nucleicos de isopreno sintasa, DXS, IDI o de la ruta de MVA para potenciar la producción de isopreno por una o ambas de estas rutas.
Procedimientos de transformación a modo de ejemplo
Pueden insertarse ácidos nucleicos de isopreno sintasa, DXS, IDI y/o de la ruta de MVA o vectores que los contienen en una célula huésped (por ejemplo, una célula vegetal, una célula fúngica, una célula de levadura, o una célula bacteriana descrita en el presente documento) usando técnicas convencionales para la expresión del polipéptido de isopreno sintasa, DXS, IDI y/o de la ruta de MVA codificado. La introducción de un constructo de ADN o vector en una célula huésped puede realizarse usando técnicas tales como transformación, electroporación, microinyección nuclear, transducción, transfección (por ejemplo, transfección mediada por lipofección o mediada por DEAE-dextrina o transfección usando un virus de fago recombinante), incubación con precipitado de ADN de fosfato de calcio, bombardeo a alta velocidad con microproyectiles recubiertos con ADN, y fusión de protoplastos. Técnicas de transformación generales se conocen en la técnica (véase, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel et al. (eds) capítulo 9, 1987; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed., Cold Spring Harbor, 1989; y Campbell et al., Curr. Genet. 16:53-56, 1989, a los que se hace referencia a cada uno, particularmente con respecto a procedimientos de transformación). La expresión de polipéptido heterólogo en Trichoderma se describe en la patente estadounidense n.° 6.022.725; patente estadounidense n.° 6.268.328; patente estadounidense n.° 7.262.041; documento WO 2005/001036; Harkki et al.; Enzyme Microb. Technol. 13:227-233, 1991; Harkki et al., Bio Technol. 7:596-603, 1989; documentos EP 244.234; EP 215.594; y Nevalainen et al., “The Molecular Biology of Trichoderma and its Application to the expression of Both Homologous and Heterologous Genes”, en Molecular Industrial Mycology, eds. Leong y Berka, Marcel Dekker Inc., NY págs. 129-148, 1992, a los que se hace referencia, particularmente con respecto a procedimientos de transformación y expresión). También se hace referencia a Cao et al., (Sci. 9:991-1001,2000; documento EP 238023; y Yelton et al., Proceedings. Natl. Acad. Sci. USA 81:1470-1474, 1984 (a los que se hace referencia, particularmente con respecto a procedimientos de transformación) para la transformación de cepas de Aspergillus. Los ácidos nucleicos introducidos pueden integrarse en ADN cromosómico o mantenerse como secuencias replicantes extracromosómicas.
Puede usarse cualquier procedimiento conocido en la técnica para seleccionar transformantes. En un ejemplo no limitativo, se distinguen transformantes estables incluyendo un marcador de amdS de transformantes inestables por su tasa de crecimiento más rápida y la formación de colonias circulares con un perfil suave, en lugar de desigual sobre medio de cultivo sólido que contiene acetamida. Además, en algunos casos, se lleva a cabo una prueba adicional de estabilidad haciendo crecer los transformantes sobre un medio sólido no selectivo (por ejemplo, un medio que carece de acetamida), recogiendo esporas de este medio de cultivo, y determinando el porcentaje de estas esporas que posteriormente germinan y crecen sobre medio selectivo que contiene acetamida.
En algunas realizaciones, se transforman células fúngicas mediante un proceso que implica formación de protoplastos y transformación de los protoplastos seguida por regeneración de la pared celular de manera conocida. En una realización específica, la preparación de Trichoderma sp. para la transformación implica la preparación de protoplastos a partir de micelios fúngicos (véase, Campbell et al., Curr. Genet. 16:53-56, 1989, al que se hace referencia, particularmente con respecto a procedimientos de transformación). En algunas realizaciones, los micelios se obtienen de esporas vegetativas germinadas. Los micelios se tratan con una enzima que digiere la pared celular dando como resultado protoplastos. Los protoplastos se protegen entonces mediante la presencia de un estabilizador osmótico en el medio de suspensión. Estos estabilizadores incluyen sorbitol, manitol, cloruro de potasio, sulfato de magnesio, y similares. Habitualmente, la concentración de estos estabilizadores varía entre 0,8 M y 1,2 M. Es deseable usar aproximadamente una disolución 1,2 M de sorbitol en el medio de suspensión.
La captación de ADN en la cepa de Trichoderma sp. huésped depende de la concentración de iones calcio. Generalmente, se usa entre aproximadamente CaCl2 10 mM y CaCl2 50 mM en una disolución de captación. Además del ion calcio en la disolución de captación, otros compuestos incluidos generalmente son un sistema de tamponamiento tal como tampón TE (Tris 10 Mm, pH 7,4; EdTa 1 mM) o tampón MOPS 10 mM, pH 6,0 (ácido morfolinopropanosulfónico) y polietilenglicol (PEG). Aunque no se pretende limitarse a ninguna teoría particular, se cree que el polietilenglicol actúa para fusionar las membranas celulares, permitiendo por tanto que los contenidos del medio se liberen en el citoplasma de la cepa de Trichoderma sp. y el ADN plasmídico que va a transferirse al núcleo. Esta fusión deja frecuentemente múltiples copias del ADN plasmídico integradas en el cromosoma del huésped. Habitualmente, se usa una suspensión que contiene los protoplastos o células de Trichoderma sp. que se han sometido a un tratamiento de permeabilidad a una densidad de 105 a 107/ml (tal como 2 x 106/ml) en la transformación. Se mezcla un volumen de 100 |il de estos protoplastos o células en una disolución apropiada (por ejemplo, sorbitol 1,2 M y CaCl250 mM) con el ADN deseado. Generalmente, se añade una concentración elevada de PEG a la disolución de captación. Pueden añadirse desde 0,1 hasta 1 volúmenes de PEG 4000 al 25% a la suspensión de protoplastos. En algunas realizaciones, se añaden aproximadamente 0,25 volúmenes a la suspensión de protoplastos. También pueden añadirse aditivos tales como dimetilsulfóxido, heparina, espermidina, cloruro de potasio, y similares a la disolución de captación y ayudar en la transformación. Están disponibles procedimientos similares para otras células fúngicas huésped (véanse, por ejemplo, las patentes estadounidenses n.os 6.022.725 y 6.268.328, a las que se hace referencia, particularmente con respecto a procedimientos de transformación).
Generalmente, la mezcla se cultiva entonces a aproximadamente 0°C durante un periodo de entre 10 y 30 minutos. Se añade entonces PEG adicional a la mezcla para potenciar además la captación de la secuencia deseada de ácido nucleico. Se añade generalmente el PEG 4000 al 25% en volúmenes de 5 a 15 veces el volumen de la mezcla de transformación; sin embargo, pueden ser adecuados volúmenes mayores o menores. El PEG 4000 al 25% es de manera deseable aproximadamente 10 veces el volumen de la mezcla de transformación. Después de que se añada el PEG, la mezcla de transformación se cultiva entonces o bien a temperatura ambiente o bien sobre hielo antes de la adición de una disolución de sorbitol y CaCl2. La suspensión de protoplastos se añade entonces adicionalmente a alícuotas fundidas de un medio de crecimiento. Cuando el medio de crecimiento incluye una selección de crecimiento (por ejemplo, acetamida o un antibiótico), permite sólo el crecimiento de transformantes.
La transformación de células bacterianas puede realizarse según procedimientos convencionales, por ejemplo, tal como se describe en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, 1982, al que se hace referencia, particularmente con respecto a procedimientos de transformación.
Medios de cultivo celular a modo de ejemplo
La divulgación también incluye una célula o una población de células en cultivo que producen isopreno. Por “células en cultivo” quiere decirse dos o más células en una disolución (por ejemplo, un medio celular) que permite que las células experimenten una o más divisiones celulares. “Células en cultivo” no incluyen células vegetales que son parte de una planta viva multicelular que contiene células que se han diferenciado en tejidos vegetales. En diversas realizaciones, el cultivo celular incluye al menos o aproximadamente 10, 20, 50, 100, 200, 500, 1.000, 5.000, 10.000 o más células.
Puede usarse cualquier fuente de carbono para cultivar las células huésped. El término “fuente de carbono” se refiere a uno o más compuestos que contienen carbono que pueden metabolizarse por una célula u organismo huésped. Por ejemplo, el medio celular usado para cultivar las células huésped puede incluir cualquier fuente de carbono adecuada para mantener la viabilidad o crecimiento de las células huésped.
En algunas realizaciones, la fuente de carbono es un hidrato de carbono (tal como monosacárido, disacárido, oligosacárido, o polisacáridos), azúcar invertido (por ejemplo, jarabe de sacarosa tratado enzimáticamente), glicerol, glicerina (por ejemplo, un subproducto de glicerina de un procedimiento de elaboración de jabón o biodiésel), dihidroxiacetona, fuente de un carbono, aceite (por ejemplo, una planta o aceite vegetal tal como aceite de maíz, palma o soja), grasa animal, aceite animal, ácido graso (por ejemplo, un ácido graso saturado, ácido graso insaturado, o ácido graso poliinsaturado), lípido, fosfolípido, glicerolípido, monoglicérido, diglicérido, triglicérido, polipéptido (por ejemplo, una proteína o péptido microbiano o vegetal), fuente de carbono renovable (por ejemplo, una fuente de carbono de biomasa tal como una fuente de carbono de biomasa hidrolizada), extracto de levadura, componente de un extracto de levadura, polímero, ácido, alcohol, aldehído, cetona, aminoácido, succinato, lactato, acetato, etanol, o cualquier combinación de dos o más de los anteriores. En algunas realizaciones, la fuente de carbono es un producto de la fotosíntesis, incluyendo, pero sin limitarse a, glucosa.
Los monosacáridos a modo de ejemplo incluyen glucosa y fructosa; los oligosacáridos a modo de ejemplo incluyen lactosa y sacarosa, y los polisacáridos a modo de ejemplo incluyen almidón y celulosa. Los hidratos de carbono a modo de ejemplo incluyen azúcares C6 (por ejemplo, fructosa, manosa, galactosa o glucosa) y azúcares C5 (por ejemplo, xilosa o arabinosa). En algunas realizaciones, el medio celular incluye un hidrato de carbono así como una fuente de carbono distinta de un hidrato de carbono (por ejemplo, glicerol, glicerina, dihidroxiacetona, fuente de un carbono, aceite, grasa animal, aceite animal, ácido graso, lípido, fosfolípido, glicerolípido, monoglicérido, diglicérido, triglicérido, fuente de carbono renovable, o un componente de un extracto de levadura). En algunas realizaciones, el medio celular incluye un hidrato de carbono así como un polipéptido (por ejemplo, una proteína o péptido microbiano o vegetal). En algunas realizaciones, el polipéptido microbiano es un polipéptido de levadura o bacterias. En algunas realizaciones, el polipéptido vegetal es un polipéptido de soja, maíz, canola, Jatropha, palma, cacahuete, girasol, coco, mostaza, colza, semilla de algodón, palmiste, oliva, girasol, sésamo o linaza.
En algunas realizaciones, la concentración del hidrato de carbono es de al menos o aproximadamente 5 gramos por litro de caldo (g/l, en el que el volumen de caldo incluye tanto el volumen del medio celular como el volumen de las células), tal como al menos o aproximadamente 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 80, 100, 150, 200, 300, 400, o más g/l. En algunas realizaciones, la concentración del hidrato de carbono está entre aproximadamente 50 y aproximadamente 400 g/l, tal como entre aproximadamente 100 y aproximadamente 360 g/l, entre aproximadamente 120 y aproximadamente 360 g/l, o entre aproximadamente 200 y aproximadamente 300 g/l. En algunas realizaciones, esta concentración de hidrato de carbono incluye la cantidad total de hidrato de carbono que se añade antes y/o durante el cultivo de las células huésped.
En algunas realizaciones, las células se cultivan en condiciones de glucosa limitada. Por “condiciones de glucosa limitada” quiere decirse que la cantidad de glucosa que se añade es menos de o aproximadamente el 105% (tal como aproximadamente el 100%) de la cantidad de glucosa que se consume por las células. En realizaciones particulares, la cantidad de glucosa que se añade al medio de cultivo es aproximadamente la misma que la cantidad de glucosa que se consume por las células durante un periodo de tiempo específico. En algunas realizaciones, la velocidad de crecimiento celular se controla limitando la cantidad de glucosa añadida de modo que las células crecen a la velocidad que puede soportarse por la cantidad de glucosa en el medio celular. En algunas realizaciones, la glucosa no se acumula durante el tiempo que se cultivan las células. En diversas realizaciones, las células se cultivan en condiciones de glucosa limitada durante más de o aproximadamente 1, 2, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60 ó 70 horas. En diversas realizaciones, las células se cultivan en condiciones de glucosa limitada durante más de o aproximadamente el 5, el 10, el 15, el 20, el 25, el 30, el 35, el 40, el 50, el 60, el 70, el 80, el 90, el 95 o el 100% de la longitud total de tiempo que se cultivan las células. Aunque no pretende limitarse a ninguna teoría particular, se cree que condiciones de glucosa limitada pueden permitir una regulación más favorable de las células.
En algunas realizaciones, las células se cultivan en presencia de un exceso de glucosa. En realizaciones particulares, la cantidad de glucosa que se añade es mayor de aproximadamente el 105% (tal como aproximadamente o más del 110, el 120, el 150, el 175, el 200, el 250, el 300, el 400 o el 500%) o más de la cantidad de glucosa que se consume por las células durante un periodo de tiempo específico. En algunas realizaciones, la glucosa se acumula durante el tiempo que se cultivan las células.
Lípidos a modo de ejemplo son cualquier sustancia que contiene uno o más ácidos grasos que son ácidos grasos C4 y superiores que están saturados, insaturados o ramificados.
Aceites a modo de ejemplo son lípidos que son líquidos a temperatura ambiente. En algunas realizaciones, el lípido contiene uno o más ácidos grasos C4 o superiores (por ejemplo, contiene uno o más ácidos grasos saturados, insaturados o ramificados con cuatro o más carbonos). En algunas realizaciones, el aceite se obtiene de soja, maíz, canola, Jatropha, palma, cacahuete, girasol, coco, mostaza, colza, semilla de algodón, palmiste, oliva, girasol, sésamo, linaza, células microbianas oleaginosas, árbol de sebo, o cualquier combinación de dos o más de los anteriores.
Los ácidos grasos a modo de ejemplo incluyen compuestos de la fórmula RCOOH, donde “R” es un hidrocarburo. Los ácidos grasos insaturados a modo de ejemplo incluyen compuestos donde “R” incluye al menos un doble enlace carbono-carbono. Los ácidos grasos insaturados a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, ácido oleico, ácido vaccénico, ácido linoleico, ácido palmitelaídico y ácido araquidónico. Los ácidos grasos poliinsaturados a modo de ejemplo incluyen compuestos donde “R” incluye una pluralidad de dobles enlaces carbono-carbono. Los ácidos grasos saturados a modo de ejemplo incluyen compuestos donde “R” es un grupo alifático saturado. En algunas realizaciones, la fuente de carbono incluye uno o más ácidos grasos C12-C22, tales como un ácido graso saturado C12, un graso saturado C14, un ácido graso saturado C16, un ácido graso saturado C18, un ácido graso saturado C20 o un ácido graso saturado C22. En una realización a modo de ejemplo, el ácido graso es ácido palmítico. En algunas realizaciones, la fuente de carbono es una sal de un ácido graso (por ejemplo, un ácido graso insaturado), un derivado de un ácido graso (por ejemplo, un ácido graso insaturado), o una sal de un derivado de ácido graso (por ejemplo, un ácido graso insaturado). Las sales adecuadas incluyen, pero no se limitan a, sales de litio, sales de potasio, sales de sodio, y similares. Di- y triglicéridos son ésteres de ácido graso de glicerol.
En algunas realizaciones, la concentración del lípido, aceite, grasa, ácido graso, monoglicérido, diglicérido o triglicérido es de al menos o aproximadamente 1 gramo por litro de caldo (g/l, en el que el volumen de caldo incluye tanto el volumen del medio celular como el volumen de las células), tal como al menos o aproximadamente 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 80, 100, 150, 200, 300, 400, o más g/l. En algunas realizaciones, la concentración del lípido, aceite, grasa, ácido graso, monoglicérido, diglicérido o triglicérido es de entre aproximadamente 10 y aproximadamente 400 g/l, tal como entre aproximadamente 25 y aproximadamente 300 g/l, entre aproximadamente 60 y aproximadamente 180 g/l, o entre aproximadamente 75 y aproximadamente 150 g/l. En algunas realizaciones, la concentración incluye la cantidad total del lípido, aceite, grasa, ácido graso, monoglicérido, diglicérido o triglicérido que se añade antes y/o durante el cultivo de las células huésped. En algunas realizaciones, la fuente de carbono incluye tanto (i) un lípido, aceite, grasa ácido graso, monoglicérido, diglicérido o triglicérido como (ii) un hidrato de carbono, tal como glucosa. En algunas realizaciones, la razón del lípido, aceite, grasa, ácido graso, monoglicérido, diglicérido o triglicérido con respecto al hidrato de carbono es de aproximadamente 1:1 en una base de carbono (es decir, un carbono en el lípido, aceite, grasa, ácido graso, monoglicérido, diglicérido o triglicérido por hidrato de carbono). En realizaciones particulares, la cantidad del lípido, aceite, grasa ácido graso, monoglicérido, diglicérido o triglicérido es de entre aproximadamente 60 y 180 g/l, y la cantidad del hidrato de carbono es de entre aproximadamente 120 y 360 g/l.
Las fuentes de carbono de polipéptido microbiano a modo de ejemplo incluyen uno o más polipéptidos de levadura o bacterias. Las fuentes de carbono de polipéptido vegetal a modo de ejemplo incluyen uno o más polipéptidos de soja, maíz, canola, Jatropha, palma, cacahuete, girasol, coco, mostaza, colza, semilla de algodón, palmiste, oliva, girasol, sésamo o linaza.
Las fuentes de carbono renovables a modo de ejemplo incluyen permeado de suero de queso, licor de maíz, melaza de remolacha azucarera, malta de cebada, y componentes de cualquiera de los anteriores. Las fuentes de carbono renovables a modo de ejemplo también incluyen glucosa, hexosa, pentosa y xilosa presentes en biomasa, tales como maíz, pasto varilla, caña de azúcar, residuo celular de procesos de fermentación, y subproductos de proteína de la molienda de soja, maíz o trigo. En algunas realizaciones, la fuente de carbono de biomasa es un material lignocelulósico, hemicelulósico o celulósico tal como, pero sin limitarse a, un césped, trigo, paja de trigo, bagazo, bagazo de caña de azúcar, pasta de coníferas, maíz, hoja o mazorca de maíz, grano de maíz, fibra de granos de maíz, rastrojo de maíz, pasto varilla, producto de cascarilla de arroz, o un subproducto de la molienda en húmedo o seco de granos (por ejemplo, maíz, sorgo, centeno, triticale, cebada, trigo, y/o granos de destilación). Los materiales celulósicos a modo de ejemplo incluyen residuo de madera, papel y pasta, plantas herbáceas y pulpa de fruta. En algunas realizaciones, la fuente de carbono incluye cualquier parte vegetal, tal como tallos, granos, raíces o tubérculos. En algunas realizaciones, se usa todo o parte de cualquiera de las siguientes plantas como fuente de carbono: maíz, trigo, centeno, sorgo, triticale, arroz, mijo, cebada, yuca, legumbres, tales como judías y guisantes, patatas, batatas, plátanos, caña de azúcar, y/o tapioca. En algunas realizaciones, la fuente de carbono es un hidrolisado de biomasa, tal como un hidrolisado de biomasa que incluye tanto xilosa como glucosa o que incluye tanto sacarosa como glucosa.
En algunas realizaciones, la fuente de carbono renovable (tal como biomasa) se trata previamente antes de añadirse al medio de cultivo celular. En algunas realizaciones, el pretratamiento incluye pretratamiento enzimático, pretratamiento químico, o una combinación de tanto pretratamiento enzimático como químico (véase, por ejemplo, Farzaneh et al., Bioresource Technology 96 (18): 2014-2018, 2005; patente estadounidense n.° 6.176.176; patente estadounidense n.° 6.106.888; a las que se hace referencia, particularmente con respecto al pretratamiento de fuentes de carbono renovables). En algunas realizaciones, la fuente de carbono renovable se hidroliza parcial o completamente antes de añadirse al medio de cultivo celular.
En algunas realizaciones, la fuente de carbono renovable (tal como rastrojo de maíz) experimenta pretratamiento de expansión de fibras de amoníaco (AFEX) antes de añadirse al medio de cultivo celular (véase, por ejemplo, Farzaneh et al., Bioresource Technology 96 (18): 2014-2018, 2005). Durante el pretratamiento de AFEX, se trata una fuente de carbono renovable con amoníaco anhidro líquido a temperaturas moderadas (tal como aproximadamente de 60 a aproximadamente 100°C) y alta presión (tal como de aproximadamente 250 a aproximadamente 300 psi) durante aproximadamente 5 minutos. Entonces, la presión se libera rápidamente. En este proceso, los efectos químicos y físicos combinados de solubilización de lignina, hidrólisis de hemicelulosa, descristalización de celulosa, y área de superficie aumentada permite casi conversión enzimática completa de celulosa y hemicelulosa en azúcares fermentables. El pretratamiento de AFEX tiene la ventaja de que casi todo el amoníaco puede recuperarse y reutilizarse, mientras que el resto sirve como fuente de nitrógeno para microbios en los procesos posteriores. Además, no se requiere una corriente de lavado para el pretratamiento de AFEX. Por tanto, la recuperación de materia seca tras el tratamiento de AFEX es esencialmente del 100%. AFEX es básicamente un procedimiento seco. La fuente de carbono renovable tratada es estable durante largos periodos y puede alimentarse a cargas sólidas muy altas en procesos de fermentación o hidrólisis enzimática. La celulosa y hemicelulosa están bien conservadas en el proceso de AFEX, con poca o ninguna degradación. No existe necesidad de neutralización antes de la hidrólisis enzimática de una fuente de carbono renovable que ha experimentado pretratamiento de AFEX. La hidrólisis enzimática de fuentes de carbono tratadas con AFEX produce corrientes de azúcar limpias para posterior uso de fermentación.
En algunas realizaciones, la concentración de la fuente de carbono (por ejemplo, una fuente de carbono renovable) es equivalente a al menos o aproximadamente el 0,1, el 0,5, el 1, el 1,5, el 2, el 3, el 4, el 5, el 10, el 15, el 20, el 30, el 40 o el 50% de glucosa (p/v). La cantidad equivalente de glucosa puede determinarse usando procedimientos de HPLC convencionales con glucosa como referencia para medir la cantidad de glucosa generada a partir de la fuente de carbono. En algunas realizaciones, la concentración de la fuente de carbono (por ejemplo, una fuente de carbono renovable) es equivalente a entre aproximadamente el 0,1 y aproximadamente el 20% de glucosa, tal como entre aproximadamente el 0,1 y aproximadamente el 10% de glucosa, entre aproximadamente el 0,5 y aproximadamente el 10% de glucosa, entre aproximadamente el 1 y aproximadamente el 10% de glucosa, entre aproximadamente el 1 y aproximadamente el 5% de glucosa, o entre aproximadamente el 1 y aproximadamente el 2% de glucosa.
En algunas realizaciones, la fuente de carbono incluye extracto de levadura o uno o más componentes de extracto de levadura. En algunas realizaciones, la concentración de extracto de levadura es de al menos 1 gramo de extracto de levadura por litro de caldo (g/l, en el que el volumen de caldo incluye tanto el volumen del medio celular como el volumen de las células), tal como al menos o aproximadamente 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 80, 100, 150, 200, 300, o más g/l. En algunas realizaciones, la concentración de extracto de levadura es de entre aproximadamente 1 y aproximadamente 300 g/l, tal como entre aproximadamente 1 y aproximadamente 200 g/l, entre aproximadamente 5 y aproximadamente 200 g/l, entre aproximadamente 5 y aproximadamente 100 g/l, o entre aproximadamente 5 y aproximadamente 60 g/l. En algunas realizaciones, la concentración incluye la cantidad total de extracto de levadura que se añade antes y/o durante el cultivo de las células huésped. En algunas realizaciones, la fuente de carbono incluye tanto extracto de levadura (o uno o más componentes del mismo) como otra fuente de carbono, tal como glucosa. En algunas realizaciones, la razón de extracto de levadura con respecto a la otra fuente de carbono es de aproximadamente 1:5, aproximadamente 1:10, o aproximadamente 1:20 (p/p).
Además, la fuente de carbono también puede ser sustratos de un carbono tales como dióxido de carbono, o metanol. La producción de glicerol a partir de fuentes de carbono individuales (por ejemplo, metanol, formaldehído o formiato) se ha notificado en levaduras metilotróficas (Yamada et al., Agric. Biol. Chem., 53(2) 541-543, 1989, al que se hace referencia, particularmente con respecto a fuentes de carbono) y en bacterias (Hunter et. al., Biochemistry, 24, 4148-4155, 1985, al que se hace referencia, particularmente con respecto a fuentes de carbono). Estos organismos pueden asimilar compuestos de un único carbono, que varían en el estado de oxidación entre metano y formiato, y producen glicerol. La ruta de asimilación de carbono puede ser a través de ribulosa monofosfato, a través de serina, o a través de xilulosa-monofosfato (Gottschalk, Bacterial Metabolism, segunda edición, Springer-Verlag: Nueva York, 1986, al que se hace referencia, particularmente con respecto a fuentes de carbono). La ruta de ribulosa monofosfato implica la condensación de formiato con ribulosa-5-fosfato para formar un azúcar de seis carbonos que se convierte en fructosa y finalmente el producto de tres carbonos gliceraldehído-3-fosfato. Asimismo, la ruta de serina asimila el compuesto de un carbono en la ruta glicolítica por medio de metilentetrahidrofolato.
Además de uno y dos sustratos de carbono, también se sabe que los organismos metilotróficos utilizan otros compuestos que contienen carbono tales como metilamina, glucosamina y una diversidad de aminoácidos para la actividad metabólica. Por ejemplo, las levaduras metilotróficas se sabe que utilizan el carbono de metilamina para formar trehalosa o glicerol (Bellion et al., Microb. Growth Cl Compd., [Int. Symp.], 7a ed., 415-32. Editores: Murrell et al., editorial: Intercept, Andover, R.U., 1993, al que se hace referencia, particularmente con respecto a fuentes de carbono). De manera similar, diversas especies de Candida metabolizan alanina o ácido oleico (Sulter et al., Arch.
Microbiol. 153(5), 485-9, 1990, al que se hace referencia, particularmente con respecto a fuentes de carbono).
En algunas realizaciones, se cultivan células en un medio convencional que contiene sales y nutrientes fisiológicos (véase, por ejemplo, Pourquie, J. et al., Biochemistry and Genetics of Cellulose Degradation, eds. Aubert et al., Academic Press, págs. 71-86, 1988 e Ilmen et al., Appl. Environ. Microbiol. 63:1298-1306, 1997, a los que se hace referencia, particularmente con respecto a medios celulares). Medios de crecimiento a modo de ejemplo son medios comunes preparados comercialmente tales como caldo Luria Bertani (LB), caldo Sabouraud dextrosa (SD), o caldo de medio de levadura (YM). También pueden usarse otros medios de crecimiento definidos o sintéticos, y un experto en la técnica de microbiología o ciencia de fermentación conoce el medio apropiado para el crecimiento de células huésped particulares.
Además de una fuente de carbono apropiada, el medio celular contiene de manera deseable minerales, sales, cofactores, tampones y otros componentes adecuados conocidos para los expertos en la técnica adecuados para el crecimiento de los cultivos o la potenciación de la producción de isopreno (véase, por ejemplo, el documento WO 2004/033646 y las referencias citadas en el mismo y el documento WO 96/35796 y las referencias citadas en el mismo, a los que se hace referencia, particularmente con respecto a medios celulares y condiciones de cultivo celular). En algunas realizaciones, cuando un ácido nucleico de isopreno sintasa, DXS, IDI y/o de la ruta de MVA está bajo el control de un promotor inducible, el agente de inducción (por ejemplo, un azúcar, sal de metal o antimicrobiano), se añade de manera deseable al medio a una concentración eficaz para inducir la expresión de un polipéptido de isopreno sintasa, DXS, IDI y/o de la ruta de MVA. En algunas realizaciones, el medio celular tiene un antibiótico (tal como kanamicina) que se corresponde con el ácido nucleico de resistencia a antibióticos (tal como un ácido nucleico de resistencia a kanamicina) en un vector que tiene uno o más ácidos nucleicos de DXS, IDI o de la ruta de MVA.
Condiciones de cultivo celular a modo de ejemplo
Materiales y procedimientos adecuados para el mantenimiento y crecimiento de cultivos bacterianos se conocen bien en la técnica. Técnicas a modo de ejemplo pueden encontrarse en Manual of Methods for General Bacteriology Gerhardt et al., eds), American Society for Microbiology, Washington, D.C. (1994) o Brock en Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology, segunda edición (1989) Sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA, a los que se hace referencia a cada uno, particularmente con respecto a técnicas de cultivo celular. En algunas realizaciones, las células se cultivan en un medio de cultivo en condiciones que permiten la expresión de uno o más polipéptidos de isopreno sintasa, DXS, IDI o de la ruta de MVA codificados por un ácido nucleico insertado en las células huésped. Pueden usarse condiciones de cultivo celular convencionales para cultivar las células (véase, por ejemplo, el documento WO 2004/033646 y las referencias citadas en el mismo, a los que se hace referencia, particularmente con respecto a condiciones de cultivo celular y fermentación). Las células se hacen crecer y se mantienen a una temperatura, mezcla de gas y pH apropiados (tal como a de aproximadamente 20 a aproximadamente 37°C, a de aproximadamente el 6% a aproximadamente el 84% de CO2, y a un pH entre aproximadamente 5 y aproximadamente 9). En algunas realizaciones, las células se hacen crecer a 35°C en un medio celular apropiado. En algunas realizaciones, por ejemplo, se cultivan cultivos a aproximadamente 28°C en medio apropiado en cultivos o fermentadores en agitación hasta que se logra la cantidad deseada de producción de isopreno. En algunas realizaciones, los intervalos de pH para la fermentación están entre aproximadamente pH 5,0 y aproximadamente pH 9,0 (tal como de aproximadamente pH 6,0 a aproximadamente pH 8,0 o de aproximadamente 6,5 a aproximadamente 7,0). Pueden realizarse reacciones en condiciones aerobias, anóxicas o anaerobias basándose en los requisitos de las células huésped. Condiciones de cultivo a modo de ejemplo para un hongo filamentoso dado se conocen en la técnica y pueden encontrarse en la bibliografía científica y/o de la fuente de los hongos tal como la American Type Culture Collection y Fungal Genetics Stock Center.
En diversas realizaciones, las células se hacen crecer usando cualquier modo conocido de fermentación, tal como procesos discontinuos, semicontinuos o continuos. En algunas realizaciones, se usa un procedimiento de fermentación discontinua. La fermentación discontinua clásica es un sistema cerrado en el que la composición de los medios se establece al comienzo de la fermentación y no está sujeta a alteraciones artificiales durante la fermentación. Por tanto, al comienzo de la fermentación el medio celular se inocula con las células huésped deseadas y se permite que la fermentación se produzca sin añadir nada al sistema. Normalmente, sin embargo, fermentación “discontinua” es discontinua con respecto a la adición de fuente de carbono y a menudo se realizan intentos por controlar factores tales como pH y concentración de oxígeno. En sistemas discontinuos, las composiciones de metabolito y biomasa del sistema cambian constantemente hasta que se detiene el momento de la fermentación. Dentro de cultivos discontinuos, las células se moderan mediante una fase de retraso estático hasta una fase de alto crecimiento logarítmico y finalmente hasta una fase estacionaria en la que la tasa de crecimiento disminuye o se detiene. En algunas realizaciones, las células en fase logarítmica son responsables de la mayor parte de la producción de isopreno. En algunas realizaciones, las células en la fase estacionaria producen isopreno. En algunas realizaciones, se usa una variación en el sistema discontinuo convencional, tal como el sistema semicontinuo. Los procesos de fermentación semicontinuos comprenden un sistema discontinuo típico con la excepción de que la fuente de carbono se añade en incrementos según avanza la fermentación. Los sistemas semicontinuos son útiles cuando la represión de catabolitos es apta para inhibir el metabolismo de las células y cuando es deseable tener cantidades limitadas de fuente de carbono en el medio celular. Pueden realizarse fermentaciones semicontinuas con la fuente de carbono (por ejemplo, glucosa) en una cantidad limitada o en exceso. La medición de la concentración de la fuente de carbono real en sistemas semicontinuos es difícil y, por tanto se estima basándose en los cambios de factores medibles tales como pH, oxígeno disuelto, y la presión parcial de gases residuales tales como CO2. Las fermentaciones discontinuas y semicontinuas son comunes y se conocen bien en la técnica y pueden encontrarse ejemplos en Brock, Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology, segunda edición (1989) Sinauer Associates, Inc., al que se hace referencia, particularmente con respecto a condiciones de cultivo celular y fermentación.
En algunas realizaciones, se usan procedimientos de fermentación continua. La fermentación continua es un sistema abierto en el que se añade continuamente un medio de fermentación definido a un biorreactor y una cantidad igual de medio acondicionado se retira simultáneamente para el procesamiento. La fermentación continua mantiene generalmente los cultivos a una densidad elevada constante donde las células están principalmente en crecimiento en fase logarítmica.
La fermentación continua permite la modulación de un factor o cualquier número de factores que afectan al crecimiento celular o producción de isopreno. Por ejemplo, un procedimiento mantiene un nutriente limitante tal como la fuente de carbono o nivel de nitrógeno a una tasa fija y permite que se moderen los demás parámetros. En otros sistemas, varios factores que afectan al crecimiento pueden alterarse continuamente mientras que la concentración celular (por ejemplo, la concentración medida mediante turbidez de los medios) se mantiene constante. Los sistemas continuos se esfuerzan por mantener condiciones de crecimiento en estado estacionario. Por tanto, la pérdida celular debida a la retirada de los medios se compara frente a la tasa de crecimiento celular en la fermentación. Procedimientos de modulación de nutrientes y factores de crecimiento para procesos de fermentación continua así como técnicas para maximizar la tasa de formación de producto se conocen bien en la técnica de microbiología industrial y una diversidad de procedimientos se detallan en Brock, Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology, segunda edición (1989) Sinauer Associates, Inc., al que se hace referencia, particularmente con respecto a condiciones de cultivo celular y fermentación.
En algunas realizaciones, las células se inmovilizan sobre un sustrato como catalizadores de células completas y se someten a condiciones de fermentación para la producción de isopreno.
En algunas realizaciones, se colocan botellas de cultivo líquido en agitadores con el fin de introducir oxígeno al líquido y mantener la uniformidad del cultivo. En algunas realizaciones, se usa un incubador para controlar la temperatura, humedad, velocidad de agitación y/u otras condiciones en las que se hace crecer un cultivo. Los incubadores más simples son cajas aisladas con un calentador ajustable, que suelen llegar normalmente hasta ~65°C. Los incubadores más elaborados también pueden incluir la capacidad de reducir la temperatura (por medio de refrigeración), o la capacidad de controlar la humedad o niveles de CO2. La mayoría de incubadores incluyen un temporizador; algunos también pueden programarse para realizar ciclos a través de diferentes temperaturas, niveles de humedad, etc. Los incubadores pueden variar en tamaño desde tableros hasta unidades del tamaño de habitaciones pequeñas.
Si se desea, una porción o todo el medio celular puede cambiarse para reponer nutrientes y/o evitar la acumulación de subproductos metabólicos potencialmente dañinos y células muertas. En el caso de cultivos en suspensión, pueden separarse las células de los medios centrifugando o filtrando el cultivo en suspensión y luego resuspendiendo las células en medios nuevos. En el caso de cultivos adherentes, los medios pueden retirarse directamente mediante aspiración y reemplazarse. En algunas realizaciones, el medio celular permite al menos que una porción de las células se divida durante al menos o aproximadamente 5, 10, 20, 40, 50, 60, 65, o más divisiones celulares en un cultivo continuo (tal como un cultivo continuo sin dilución).
En algunas realizaciones, se usa un promotor constitutivo o permeable (tal como un promotor Trc) y no se añade un compuesto (tal como IPTG) para inducir la expresión del/de los ácido(s) nucleico(s) de isopreno sintasa, DXS, IDI o de la ruta de MVA unido(s) operativamente al promotor. En algunas realizaciones, se añade un compuesto (tal como IPTG) para inducir la expresión del/de los ácido(s) nucleico(s) de isopreno sintasa, DXS, IDI o de la ruta de MVA unido(s) operativamente al promotor.
Procedimientos a modo de ejemplo para desacoplar la producción de isopreno del crecimiento celular
De manera deseable, se convierte carbono de la materia prima en isopreno en lugar de en el crecimiento y mantenimiento de las células. En algunas realizaciones, las células se hacen crecer hasta una DO600 de media a baja, entonces se inicia o aumenta la producción de isopreno. Esta estrategia permite que una gran porción del carbono se convierta en isopreno.
En algunas realizaciones, las células alcanzan una densidad óptica de modo que ya no se dividen o se dividen extremadamente despacio, pero continúan elaborando isopreno durante varias horas (tal como aproximadamente 2, 4, 6, 8, 10, 15, 20, 25, 30, o más horas). Por ejemplo, las figuras 60A-67C ilustran que las células pueden continuar produciendo una cantidad sustancial de ácido mevalónico o isopreno después de que las células alcancen una densidad óptica de modo que ya no se dividen o se dividen extremadamente despacio. En algunos casos, la densidad óptica a 550 nm disminuye a lo largo del tiempo (tal como una disminución en la densidad óptica después de que las células ya no estén en una fase de crecimiento exponencial debido a lisis celular, cese del crecimiento, carencia de nutrientes u otros factores que conducen a la carencia de crecimiento celular), y las células continúan produciendo una cantidad sustancial de ácido mevalónico o isopreno. En algunas realizaciones, la densidad óptica a 550 nm de las células aumenta en menos de o aproximadamente el 50% (tal como en menos de o aproximadamente el 40, el 30, el 20, el 10, el 5 o el 0%) a lo largo de un determinado periodo de tiempo (tal como más de o aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50 o 60 horas), y las células producen isopreno a más de o aproximadamente 1, 10, 25, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1.000; 1.250; 1.500; 1.750; 2.000; 2.500; 3.000; 4.000; 5.000; 10.000; 20.000; 30.000; 40.000; 50.000; 100.000; 200.000; 300.000; 400.000; 500.000; 600.000; 700.000; 800.000; 900.000; 1.000.000 o más nmoles de isopreno/gramo de células para el peso húmedo de las células/hora (nmoles/gwcm/h) durante este periodo de tiempo. En algunas realizaciones, la cantidad de isopreno es de entre aproximadamente 2 y aproximadamente 5.000 nmoles/gwcm/h, tal como entre aproximadamente 2 y aproximadamente 100 nmoles/gwcm/h, de aproximadamente 100 a aproximadamente 500 nmoles/gwcm/h, de aproximadamente 150 a aproximadamente 500 nmoles/gwcm/h, de aproximadamente 500 a aproximadamente 1.000 nmoles/gwcm/h, de aproximadamente 1.000 a aproximadamente 2.000 nmoles/gwcm/h, o de aproximadamente 2.000 a aproximadamente 5.000 nmoles/gwcm/h. En algunas realizaciones, la cantidad de isopreno es de entre aproximadamente 20 y aproximadamente 5.000 nmoles/gwcm/h, de aproximadamente 100 a aproximadamente 5.000 nmoles/gwcm/h, de aproximadamente 200 a aproximadamente 2.000 nmoles/gwcm/h, de aproximadamente 200 a aproximadamente 1.000 nmoles/gwcm/h, de aproximadamente 300 a aproximadamente 1.000 nmoles/gwcm/h, o de aproximadamente 400 a aproximadamente 1.000 nmoles/gwcm/h.
En algunas realizaciones, la densidad óptica a 550 nm de las células aumenta en menos de o aproximadamente el 50% (tal como en menos de o aproximadamente el 40, el 30, el 20, el 10, el 5 o el 0%) a lo largo de un determinado periodo de tiempo (tal como más de o aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50 o 60 horas), y las células producen un título acumulativo (cantidad total) de isopreno a más de o aproximadamente 1, 10, 25, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1.000, 1.250, 1.500, 1.750, 2.000, 2.500, 3.000, 4.000, 5.000, 10.000, 50.000, 100.000, o más mg de isopreno/l de caldo (mg/lcaldo, en el que el volumen de caldo incluye el volumen de las células y el medio celular) durante este periodo de tiempo. En algunas realizaciones, la cantidad de isopreno es de entre aproximadamente 2 y aproximadamente 5.000 mg/lcaldo, tal como entre aproximadamente 2 y aproximadamente 100 mg/lcaldo, de aproximadamente 100 a aproximadamente 500 mg/lcaldo, de aproximadamente 500 a aproximadamente 1.000 mg/lcaldo, de aproximadamente 1.000 a aproximadamente 2.000 mg/lcaldo, o de aproximadamente 2.000 a aproximadamente 5.000 mg/lcaldo. En algunas realizaciones, la cantidad de isopreno es de entre aproximadamente 20 y aproximadamente 5.000 mg/lcaldo, de aproximadamente 100 a aproximadamente 5.000 mg/lcaldo, de aproximadamente 200 a aproximadamente 2.000 mg/lcaldo, de aproximadamente 200 a aproximadamente 1.000 mg/lcaldo, de aproximadamente 300 a aproximadamente 1.000 mg/lcaldo, o de aproximadamente 400 a aproximadamente 1.000 mg/lcaldo.
En algunas realizaciones, la densidad óptica a 550 nm de las células aumenta en menos de o aproximadamente el 50% (tal como en menos de o aproximadamente el 40, el 30, el 20, el 10, el 5 o el 0%) a lo largo de un determinado periodo de tiempo (tal como más de o aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50 ó 60 horas), y las células convierten más de o aproximadamente el 0,0015, el 0,002, el 0,005, el 0,01, el 0,02, el 0,05, el 0,1, el 0,12, el 0,14, el 0,16, el 0,2, el 0,3, el 0,4, el 0,5, el 0,6, el 0,7, el 0,8, el 0,9, el 1,0, el 1,2, el 1,4, el 1,6, el 1,8, el 2,0, el 2,5, el 3,0, el 3,5, el 4,0, el 5,0, el 6,0, el 7,0 o el 8,0% del carbono en el medio de cultivo celular en isopreno durante este periodo de tiempo. En algunas realizaciones, el porcentaje de conversión de carbono en isopreno está entre tal como aproximadamente el 0,002 y aproximadamente el 4,0%, de aproximadamente el 0,002 a aproximadamente el 3,0%, de aproximadamente el 0,002 a aproximadamente el 2,0%, de aproximadamente el 0,002 a aproximadamente el 1,6%, de aproximadamente el 0,002 a aproximadamente el 0,005%, de aproximadamente el 0,005 a aproximadamente el 0,01%, de aproximadamente el 0,01 a aproximadamente el 0,05%, de aproximadamente el 0,05 a aproximadamente el 0,15%, de 0,15 a aproximadamente el 0,2%, de aproximadamente el 0,2 a aproximadamente el 0,3%, de aproximadamente el 0,3 a aproximadamente el 0,5%, de aproximadamente el 0,5 a aproximadamente el 0,8%, de aproximadamente el 0,8 a aproximadamente el 1,0%, o de aproximadamente el 1,0 a aproximadamente el 1,6%. En algunas realizaciones, el porcentaje de conversión de carbono en isopreno está entre aproximadamente el 0,002 y aproximadamente el 0,4%, del 0,002 a aproximadamente el 0,16%, del 0,04 a aproximadamente el 0,16%, de aproximadamente el 0,005 a aproximadamente el 0,3%, de aproximadamente el 0,01 a aproximadamente el 0,3%, o de aproximadamente el 0,05 a aproximadamente el 0,3%.
En algunas realizaciones, sólo se produce isopreno en la fase estacionaria. En algunas realizaciones, se produce isopreno tanto en la fase de crecimiento como en la fase estacionaria. En diversas realizaciones, la cantidad de isopreno producido (tal como la cantidad total de isopreno producido o la cantidad de isopreno producido por litro de caldo por hora por DO600) durante la fase estacionaria es mayor de o aproximadamente 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, o más veces la cantidad de isopreno producido durante la fase de crecimiento para la misma duración de tiempo. En diversas realizaciones, más de o aproximadamente el 5, el 10, el 20, el 30, el 40, el 50, el 60, el 70, el 80, el 90, el 95, el 99% o más de la cantidad total de isopreno que se produce (tal como la producción de isopreno durante una fermentación durante una cantidad determinada de tiempo, tal como 20 horas) se produce mientras que las células están en la fase estacionaria. En diversas realizaciones, más de o aproximadamente el 5, el 10, el 20, el 30, el 40, el 50, el 60, el 70, el 80, el 90, el 95, el 99% o más de la cantidad total de isopreno que se produce (tal como la producción de isopreno durante una fermentación durante una cantidad determinada de tiempo, tal como 20 horas) se produce mientras que las células se dividen lentamente o nada de modo que la densidad óptica a 550 nm de las células aumenta en menos de o aproximadamente el 50% (tal como en menos de o aproximadamente el 40, el 30, el 20, el 10, el 5 o el 0%). En algunas realizaciones, sólo se produce isopreno en la fase de crecimiento.
En algunas realizaciones, uno o más ácidos nucleicos de isopreno sintasa, DXP, IDI o de la ruta de MVA se ponen bajo el control de un promotor o factor que es más activo en la fase estacionaria que en la fase de crecimiento. Por ejemplo, uno o más ácidos nucleicos de isopreno sintasa, DXP, IDI o de la ruta de MVA pueden ponerse bajo el control de un factor sigma de fase estacionaria, tal como RpoS. En algunas realizaciones, uno o más ácidos nucleicos de isopreno sintasa, DXP, IDI o de la ruta de MVA se ponen bajo el control de un promotor inducible en la fase estacionaria, tal como un promotor inducible por un regulador de respuesta activo en la fase estacionaria. Producción de isopreno dentro de intervalos de funcionamiento seguros
La producción de isopreno dentro de niveles de funcionamiento seguros según sus características de inflamabilidad simplifica el diseño y construcción de instalaciones comerciales, mejora considerablemente la capacidad de funcionar de manera segura, y limita la posibilidad de que se produzcan fuegos. En particular, los intervalos óptimos para la producción de isopreno están dentro de la zona segura, es decir, el intervalo no inflamable de concentraciones de isopreno. En un aspecto de este tipo, la invención presenta un procedimiento tal como se reivindica para la producción de isopreno dentro del intervalo no inflamable de concentraciones de isopreno (fuera de la envoltura de inflamabilidad de isopreno).
Por tanto, se usaron modelación informática y pruebas experimentales para determinar los límites de inflamabilidad de isopreno (tal como isopreno en presencia de O2, N2, CO2, o cualquier combinación de dos o más de los gases anteriores) con el fin de garantizar la seguridad del proceso. La envoltura de inflamabilidad se caracteriza por el límite de inflamabilidad inferior (LFL), el límite de inflamabilidad superior (UFL), la concentración de oxígeno limitante (LOC), y la temperatura limitante. Para que un sistema sea inflamable, una cantidad mínima de combustible (tal como isopreno) debe estar en presencia de una cantidad mínima de oxidante, normalmente oxígeno. El LFL es la cantidad mínima de isopreno que debe estar presente para mantener la combustión, mientras que el UFL es la cantidad máxima de isopreno que puede estar presente. Por encima de este límite, la mezcla es rica en combustible y la fracción de oxígeno es demasiado baja para tener una mezcla inflamable. La LOC indica la fracción mínima de oxígeno que también debe estar presente para tener una mezcla inflamable. La temperatura límite se basa en el punto de inflamación de isopreno y es la temperatura más baja a la que puede propagarse la combustión de isopreno. Estos límites son específicos para la concentración de isopreno, el tipo y la concentración de oxidante, los inertes presentes en el sistema, la temperatura y la presión del sistema. Las composiciones que se encuentran dentro de los límites de la envoltura de inflamabilidad propagan la combustión y requieren precauciones de seguridad adicionales tanto en el diseño como en el funcionamiento del equipo de proceso.
Se sometieron a prueba las siguientes condiciones usando simulación informática y análisis matemático y pruebas experimentales. Si se desea, pueden someterse a prueba otras condiciones (tales como otras composiciones de temperatura, presión y gas permanente) usando los procedimientos descritos en el presente documento para determinar las concentraciones de LFL, UFL y LOC.
(1) Simulación informática y análisis matemático
Conjunto de pruebas 1:
isopreno: 0% en peso -14% en peso
O2: 6% en peso - 21% en peso
N2: 79% en peso - 94% en peso
Conjunto de pruebas 2:
isopreno: 0% en peso -14% en peso
O2: 6% en peso - 21% en peso
N2: 79% en peso - 94% en peso
Saturado con H2O
Conjunto de pruebas 3:
isopreno: 0% en peso -14% en peso
O2: 6% en peso - 21% en peso
N2: 79% en peso - 94% en peso
CO2: 5% en peso - 30% en peso
(2) Pruebas experimentales para la determinación final de límites de inflamabilidad
Conjunto de pruebas 1:
isopreno: 0% en peso -14% en peso
O2: 6% en peso - 21% en peso
N2: 79% en peso - 94% en peso
Conjunto de pruebas 2:
isopreno: 0% en peso -14% en peso
O2: 6% en peso - 21% en peso
N2: 79% en peso - 94% en peso
Saturado con H2O
Se usó software de simulación para dar una estimación de las características de inflamabilidad del sistema para varias condiciones de prueba diferentes. El CO2 no mostró un efecto significativo sobre en los límites de inflamabilidad del sistema. Los conjuntos de pruebas 1 y 2 se confirmaron mediante pruebas experimentales. Los resultados del modelado estuvieron en línea con los resultados de las pruebas experimentales. Sólo se encontraron ligeras variaciones con la adición de agua.
La LOC se determinó que era del 9,5% en volumen para una mezcla de isopreno, O2, N2 y CO2 a 40°C y 1 atmósfera. La adición de hasta el 30% de CO2 no afectó significativamente a las características de inflamabilidad de una mezcla de isopreno, O2 y N2. Se mostraron sólo ligeras variaciones en las características de inflamabilidad entre un sistema de isopreno, O2 y N2 seco y saturado de agua. La temperatura limitante es de aproximadamente -54°C. Temperaturas por debajo de aproximadamente -54°C son demasiado bajas para propagar la combustión de isopreno.
En algunas realizaciones, el LFL de isopreno oscila entre aproximadamente el 1,5% en volumen y aproximadamente el 2,0% en volumen, y el UFL de isopreno oscila entre aproximadamente el 2,0% en volumen y aproximadamente el 12,0% en volumen, según la cantidad de oxígeno en el sistema. En algunas realizaciones, la LOC es de aproximadamente el 9,5% en volumen de oxígeno. En algunas realizaciones, el LFL de isopreno es de entre aproximadamente el 1,5% en volumen y aproximadamente el 2,0% en volumen, el UFL de isopreno es de entre aproximadamente el 2,0% en volumen y aproximadamente el 12,0% en volumen, y la LOC es de aproximadamente el 9,5% en volumen de oxígeno cuando la temperatura es de entre aproximadamente 25°C y aproximadamente 55°C (tal como aproximadamente 40°C) y la presión es de entre aproximadamente 1 atmósfera y 3 atmósferas.
En algunas realizaciones, se produce isopreno en presencia de menos de aproximadamente el 9,5% en volumen de oxígeno (es decir, por debajo de la LOC requerida para tener una mezcla inflamable de isopreno). En algunas realizaciones en las que se produce isopreno en presencia de más de o aproximadamente el 9,5% en volumen de oxígeno, la concentración de isopreno está por debajo del LFL (tal como por debajo de aproximadamente el 1,5% en volumen). Por ejemplo, la cantidad de isopreno puede mantenerse por debajo del LFL diluyendo la composición de isopreno con un gas inerte (por ejemplo, añadiendo continua o periódicamente un gas inerte tal como nitrógeno para mantener la composición de isopreno por debajo del LFL). En algunas realizaciones en las que se produce isopreno en presencia de más de o aproximadamente el 9,5% en volumen de oxígeno, la concentración de isopreno está por encima del UFL (tal como por encima de aproximadamente el 12% en volumen). Por ejemplo, la cantidad de isopreno puede mantenerse por encima del UFL usando un sistema (tal como cualquiera de los sistemas de cultivo celular descritos en el presente documento) que produce isopreno a una concentración por encima del UFL. Si se desea, puede usarse un nivel relativamente bajo de oxígeno de modo que el UFL es también relativamente bajo. En este caso, se necesita una concentración de isopreno menor para permanecer por encima del UFL.
En algunas realizaciones en las que se produce isopreno en presencia de más de o aproximadamente el 9,5% en volumen de oxígeno, la concentración de isopreno está dentro de la envoltura de inflamabilidad (tal como entre el LFL y el UFL). En algunas realizaciones cuando la concentración de isopreno puede situarse dentro de la envoltura de inflamabilidad, se realizan una o más etapas para reducir la probabilidad de un fuego o explosión. Por ejemplo, pueden evitarse una o más fuentes de ignición (tal como cualquier material que pueda generar una chispa). En algunas realizaciones, se realizan una o más etapas para reducir la cantidad de tiempo que la concentración de isopreno permanece dentro de la envoltura de inflamabilidad. En algunas realizaciones, se usa un sensor para detectar cuándo la concentración de isopreno está próxima a o dentro de la envoltura de inflamabilidad. Si se desea, la concentración de isopreno puede medirse en uno o más puntos de tiempo durante el cultivo de células, y las condiciones de cultivo celular y/o la cantidad de gas inerte puede ajustarse usando procedimientos convencionales si la concentración de isopreno está próxima a o dentro de la envoltura de inflamabilidad. En realizaciones particulares, las condiciones de cultivo celular (tales como condiciones de fermentación) se ajustan para o bien disminuir la concentración de isopreno por debajo del LFL o bien aumentar la concentración de isopreno por encima del UFL. En algunas realizaciones, la cantidad de isopreno se mantiene por debajo del LFL diluyendo la composición de isopreno con un gas inerte (tal como añadiendo continua o periódicamente un gas inerte para mantener la composición de isopreno por debajo del LFL).
En algunas realizaciones, la cantidad de volátiles inflamables distintos de isopreno (tal como uno o más azúcares) es al menos aproximadamente 2, 5, 10, 50, 75 o 100 veces menor que la cantidad de isopreno producido. En algunas realizaciones, la porción de la fase gaseosa distinta de gas isopreno comprende entre aproximadamente el 0% y aproximadamente el 100% (en volumen) de oxígeno, tal como entre aproximadamente el 0% y aproximadamente el 10%, de aproximadamente el 10% a aproximadamente el 20%, de aproximadamente el 20% a aproximadamente el 30%, de aproximadamente el 30% a aproximadamente el 40%, de aproximadamente el 40% a aproximadamente el 50%, de aproximadamente el 50% a aproximadamente el 60%, de aproximadamente el 60% a aproximadamente el 70%, de aproximadamente el 70% a aproximadamente el 80%, de aproximadamente el 80% a aproximadamente el 90%, o de aproximadamente el 90% a aproximadamente el 100% (en volumen) de oxígeno. En algunas realizaciones, la porción de la fase gaseosa distinta de gas isopreno comprende entre aproximadamente el 0% y aproximadamente el 99% (en volumen) de nitrógeno, tal como entre aproximadamente el 0% y aproximadamente el 10%, de aproximadamente el 10% a aproximadamente el 20%, de aproximadamente el 20% a aproximadamente el 30%, de aproximadamente el 30% a aproximadamente el 40%, de aproximadamente el 40% a aproximadamente el 50%, de aproximadamente el 50% a aproximadamente el 60%, de aproximadamente el 60% a aproximadamente el 70%, de aproximadamente el 70% a aproximadamente el 80%, de aproximadamente el 80% a aproximadamente el 90%, o de aproximadamente el 90% a aproximadamente el 99% (en volumen) de nitrógeno.
En algunas realizaciones, la porción de la fase gaseosa distinta de gas isopreno comprende entre aproximadamente el 1% y aproximadamente el 50% (en volumen) de CO2, tal como entre aproximadamente el 1% y aproximadamente el 10%, de aproximadamente el 10% a aproximadamente el 20%, de aproximadamente el 20% a aproximadamente el 30%, de aproximadamente el 30% a aproximadamente el 40%, o de aproximadamente el 40% a aproximadamente el 50% (en volumen) de CO2.
En algunas realizaciones, una composición de isopreno también contiene etanol. Por ejemplo, puede usarse etanol para destilación extractiva de isopreno, lo que da como resultado composiciones (tales como corrientes de producto intermedio) que incluyen tanto etanol como isopreno. De manera deseable, la cantidad de etanol está fuera de la envoltura de inflamabilidad para etanol. La LOC de etanol es de aproximadamente el 8,7% en volumen, y el LFL para etanol es de aproximadamente el 3,3% en volumen a condiciones convencionales, tales como aproximadamente 1 atmósfera y aproximadamente 60°F (NFPA 69 Standard on Explosion Prevention Systems, edición de 2008, al que se hace referencia, particularmente con respecto a valores de LOC, LFL y UFL). En algunas realizaciones, las composiciones que incluyen isopreno y etanol se producen en presencia de menos de la LOC requerida para tener una mezcla inflamable de etanol (tal como menos de aproximadamente el 8,7% en volumen). En algunas realizaciones en las que se producen composiciones que incluyen isopreno y etanol en presencia de más de o aproximadamente la LOC requerida para tener una mezcla inflamable de etanol, la concentración de etanol está por debajo del LFL (tal como menos de aproximadamente el 3,3% en volumen).
En diversas realizaciones, la cantidad de oxidante (tal como oxígeno) está por debajo de la LOC de cualquier combustible en el sistema (tal como isopreno o etanol). En diversas realizaciones, la cantidad de oxidante (tal como oxígeno) es menos de aproximadamente el 60, el 40, el 30, el 20, el 10 o el 5% de la LOC de isopreno o etanol. En diversas realizaciones, la cantidad de oxidante (tal como oxígeno) es menor que la LOC de isopreno o etanol en al menos 2, 4, 5, o más puntos porcentuales absolutos (% en volumen). En realizaciones particulares, la cantidad de oxígeno es de al menos 2 puntos porcentuales absolutos (% en volumen) menos que la LOC de isopreno o etanol (tal como una concentración de oxígeno de menos del 7,5% en volumen cuando la LOC de isopreno es del 9,5% en volumen). En diversas realizaciones, la cantidad de combustible (tal como isopreno o etanol) es menos de o aproximadamente el 25, el 20, el 15, el 10 o el 5% del LFL para ese combustible.
Producción de isopreno a modo de ejemplo
En algunas realizaciones, las células se cultivan en un medio de cultivo en condiciones que permiten la producción de isopreno por las células. Por “productividad absoluta máxima” quiere decirse la cantidad absoluta máxima de isopreno en el gas residual durante el cultivo de células durante un periodo de tiempo particular (por ejemplo, el cultivo de células durante una ejecución de fermentación particular). Por “punto de tiempo de productividad absoluta máxima” quiere decirse el punto de tiempo durante una ejecución de fermentación cuando la cantidad absoluta de isopreno en el gas residual está en un máximo durante el cultivo de células durante un periodo de tiempo particular (por ejemplo, el cultivo de células durante una ejecución de fermentación particular). En algunas realizaciones, la cantidad de isopreno se mide en el punto de tiempo de productividad absoluta máxima. En algunas realizaciones, la productividad absoluta máxima para las células es aproximadamente cualquiera de las cantidades de isopreno divulgadas en el presente documento.
Por “productividad específica máxima” quiere decirse la cantidad máxima de isopreno producido por célula durante el cultivo de células durante un periodo de tiempo particular (por ejemplo, el cultivo de células durante una ejecución de fermentación particular). Por “punto de tiempo de productividad específica máxima” quiere decirse el punto de tiempo durante el cultivo de células durante un periodo de tiempo particular (por ejemplo, el cultivo de células durante una ejecución de fermentación particular) cuando la cantidad de isopreno producido por célula está en un máximo. La productividad específica se determina dividiendo la productividad total entre la cantidad de células, tal como se determina mediante densidad óptica a 600 nm (DO600). En algunas realizaciones, la cantidad de isopreno se mide en el punto de tiempo de productividad específica máxima. En algunas realizaciones, la productividad específica máxima para las células es de aproximadamente cualquiera de las cantidades de isopreno por célula divulgadas en el presente documento.
Por “productividad total acumulada” quiere decirse la cantidad total acumulada de isopreno producido durante el cultivo de células durante un periodo de tiempo particular (por ejemplo, el cultivo de células durante una ejecución de fermentación particular). En algunas realizaciones, se mide la cantidad total acumulada de isopreno. En algunas realizaciones, la productividad total acumulada para las células es aproximadamente cualquiera de las cantidades de isopreno divulgadas en el presente documento.
Por “respuesta del detector relativa” se hace referencia a la razón entre la respuesta del detector (tal como el área de CG/Em ) para un compuesto (tal como isopreno) con respecto a la respuesta del detector (tal como el área de CG/EM) de uno o más compuestos (tales como todos los hidrocarburos C5). La respuesta del detector puede medirse tal como se describe en el presente documento, tal como el análisis de CG/EM realizado con un sistema de CG/EM Agilent 6890 equipado con una columna de CG/EM Agilent HP-5MS (30 m x 250 |im; grosor de película de 0,25 |im). Si se desea, la respuesta del detector relativa puede convertirse en un porcentaje en peso usando los factores de respuesta para cada uno de los compuestos. Este factor de respuesta es una medición de cuánta señal se genera para una cantidad dada de un compuesto particular (es decir, cómo de sensible es el detector para un compuesto particular). Este factor de respuesta puede usarse como factor de corrección para convertir la respuesta del detector relativa en un porcentaje en peso cuando el detector tiene diferentes sensibilidades a los compuestos que se comparan. Alternativamente, el porcentaje en peso puede aproximarse suponiendo que los factores de respuesta son iguales para los compuestos que se comparan. Por tanto, el porcentaje en peso puede suponerse que es aproximadamente igual que la respuesta del detector relativa.
En algunas realizaciones, las células en cultivo producen isopreno a más de o aproximadamente 1,10, 25, 50,100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1.000, 1.250, 1.500, 1.750, 2.000, 2.500, 3.000, 4.000, 5.000, o más nmoles de isopreno/gramo de células para el peso húmedo de las células/hora (nmoles/gwcm/h). En algunas realizaciones, la cantidad de isopreno es de entre aproximadamente 2 y aproximadamente 5.000 nmoles/gwcm/h, tal como entre aproximadamente 2 y aproximadamente 100 nmoles/gwcm/h, de aproximadamente 100 a aproximadamente 500 nmoles/gwcm/h, de aproximadamente 150 a aproximadamente 500 nmoles/gwcm/h, de aproximadamente 500 a aproximadamente 1.000 nmoles/gwcm/h, de aproximadamente 1.000 a aproximadamente 2.000 nmoles/gwcm/h, o de aproximadamente 2.000 a aproximadamente 5.000 nmoles/gwcm/h. En algunas realizaciones, la cantidad de isopreno es de entre aproximadamente 20 y aproximadamente 5.000 nmoles/gwcm/h, de aproximadamente 100 a aproximadamente 5.000 nmoles/gwcm/h, de aproximadamente 200 a aproximadamente 2.000 nmoles/gwcm/h, de aproximadamente 200 a aproximadamente 1.000 nmoles/gwcm/h, de aproximadamente 300 a aproximadamente 1.000 nmoles/gwcm/h, o de aproximadamente 400 a aproximadamente 1.000 nmoles/gwcm/h.
La cantidad de isopreno en unidades de nmoles/gwcm/h puede medirse tal como se divulga en la patente estadounidense n.° 5.849.970, a la que se hace referencia, particularmente con respecto a la medición de producción de isopreno. Por ejemplo, se analizan dos ml de espacio de cabeza (por ejemplo, espacio de cabeza de un cultivo tal como 2 ml de cultivo cultivado en viales sellado a 32°C con agitación a 200 rpm durante aproximadamente 3 horas) para determinar isopreno usando un sistema de cromatografía de gases convencional, tal como un sistema operado isotérmicamente (85°C) con una columna de n-octano/porasil C (Alltech Associates, Inc., Deerfield, Ill.) y acoplado a un detector de gases de reducción de óxido mercúrico RGD2 (Trace Analytical, Menlo Park, CA) (véase, por ejemplo, Greenberg et al, Atmos. Environ. 27A: 2689-2692, 1993; Silver et al., Plant Physiol. 97:1588-1591, 1991, a los que se hace referencia, particularmente con respecto a la medición de producción de isopreno). Las unidades de área de cromatografía de gases se convierten en nmol de isopreno por medio de una curva de calibración de la concentración de isopreno convencional. En algunas realizaciones, el valor para los gramos de células para el peso húmedo de las células se calcula obteniendo el valor de A600 para una muestra del cultivo celular, y convirtiendo después el valor de A600 en gramos de células basándose en una curva de calibración de pesos húmedos para cultivos celulares con un valor de A600 conocido. En algunas realizaciones, los gramos de las células se estiman suponiendo que un litro de caldo (incluyendo medio celular y células) con un valor de A600 de 1 tiene un peso de células húmedo de 1 gramo. El valor también se divide entre el número de horas durante el cual se ha incubado el cultivo, tal como tres horas.
En algunas realizaciones, las células en cultivo producen isopreno a más de o aproximadamente 1, 10, 25, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1.000, 1.250, 1.500, 1.750, 2.000, 2.500, 3.000, 4.000, 5.000, 10.000, 100.000, o más ng de isopreno/gramo de células para el peso húmedo de las células/h (ng/gwcm/h). En algunas realizaciones, la cantidad de isopreno es de entre aproximadamente 2 y aproximadamente 5.000 ng/gwcm/h, tal como entre aproximadamente 2 y aproximadamente 100 ng/gwcm/h, de aproximadamente 100 a aproximadamente 500 ng/gwcm/h, de aproximadamente 500 a aproximadamente 1.000 ng/gwcm/h, de aproximadamente 1.000 a aproximadamente 2.000 ng/gwcm/h, o de aproximadamente 2.000 a aproximadamente 5.000 ng/gwcm/h. En algunas realizaciones, la cantidad de isopreno es de entre aproximadamente 20 y aproximadamente 5.000 ng/gwcm/h, de aproximadamente 100 a aproximadamente 5.000 ng/gwcm/h, de aproximadamente 200 a aproximadamente 2.000 ng/gwcm/h, de aproximadamente 200 a aproximadamente 1.000 ng/gwcm/h, de aproximadamente 300 a aproximadamente 1.000 ng/gwcm/h, o de aproximadamente 400 a aproximadamente 1.000 ng/gwcm/h. La cantidad de isopreno en ng/gwcm/h puede calcularse multiplicando el valor para la producción de isopreno en las unidades de nmoles/gwcm/h comentadas anteriormente por 68,1 (tal como se describe en la ecuación 5 a continuación).
En algunas realizaciones, las células en cultivo producen un título acumulativo (cantidad total) de isopreno a más de o aproximadamente 1, 10, 25, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1.000, 1.250, 1.500, 1.750, 2.000, 2.500, 3.000, 4.000, 5.000, 10.000, 50.000, 100.000, o más mg de isopreno/l de caldo (mg/lcaldo, en el que el volumen de caldo incluye el volumen de las células y el medio celular). En algunas realizaciones, la cantidad de isopreno es de entre aproximadamente 2 y aproximadamente 5.000 mg/lcaldo, tal como entre aproximadamente 2 y aproximadamente 100 mg/lcaldo, de aproximadamente 100 a aproximadamente 500 mg/lcaldo, de aproximadamente 500 a aproximadamente 1.000 mg/lcaldo, de aproximadamente 1.000 a aproximadamente 2.000 mg/lcaldo, o de aproximadamente 2.000 a aproximadamente 5.000 mg/lcaldo. En algunas realizaciones, la cantidad de isopreno es de entre aproximadamente 20 y aproximadamente 5.000 mg/lcaldo, de aproximadamente 100 a aproximadamente 5.000 mg/lcaldo, de aproximadamente 200 a aproximadamente 2.000 mg/lcaldo, de aproximadamente 200 a aproximadamente 1.000 mg/lcaldo, de aproximadamente 300 a aproximadamente 1.000 mg/lcaldo, o de aproximadamente 400 a aproximadamente 1.000 mg/lcaldo.
La productividad específica de isopreno en mg de isopreno/l de espacio de cabeza del matraz de agitación o cultivos similares puede medirse tomando una muestra de 1 ml del cultivo celular a un valor de DO600 de aproximadamente 1.0, colocándola en un vial de 20 ml, incubando durante 30 minutos, y midiendo después la cantidad de isopreno en el espacio de cabeza (tal como se describe, por ejemplo, en el ejemplo I, parte II). Si el valor de DO600 no es 1,0, entonces la medición puede normalizarse hasta un valor de DO600 de 1,0 dividiendo entre el valor de DO600. El valor de mg de isopreno/l de espacio de cabeza puede convertirse en mg/lcaldo/h/DO600 de caldo de cultivo multiplicando por un factor de 38. El valor en unidades de mg/lcaldo/h/DO600 puede multiplicarse por el número de horas y el valor de DO600 para obtener el título acumulativo en unidades de mg de isopreno/lcaldo.
La tasa de producción de isopreno instantánea en mg/lcaldo/h en un fermentador puede medirse tomando una muestra del gas de fermentador, analizándola para determinar la cantidad de isopreno (en unidades tales como mg de isopreno por lgas) tal como se describe, por ejemplo, en el ejemplo I, parte II y multiplicando este valor por la tasa a la que el gas residual pasa a través de cada litro de caldo (por ejemplo, a 1 vvm (volumen de aire/volumen de caldo/minuto) esto es 60 lgas por hora). Por tanto, un nivel de gas residual de 1 mg/lgas se corresponde con una tasa de producción instantánea de 60 mg/lcaldo/h a un flujo de aire de 1 vvm. Si se desea, el valor en las unidades mg/lcaldo/h puede dividirse entre el valor de DO600 para obtener la tasa específica en unidades de mg/lcaldo/h/DO. El valor promedio de mg de isopreno/lgas puede convertirse en la productividad de producto total (gramos de isopreno por litro de caldo de fermentación, mg/lcaldo) multiplicando esta concentración de isopreno de gas residual promedio por la cantidad total de gas residual burbujeado por litro de caldo de fermentación durante la fermentación. Por tanto, una concentración de isopreno de gas residual promedio de 0,5 mg/lcaldo/h a lo largo de 10 horas a 1 vvm se corresponde con una concentración de producto total de 300 mg de isopreno/lcaldo.
En algunas realizaciones, las células en cultivo convierten más de o aproximadamente el 0,0015, el 0,002, el 0,005, el 0,01, el 0,02, el 0,05, el 0,1, el 0,12, el 0,14, el 0,16, el 0,2, el 0,3, el 0,4, el 0,5, el 0,6, el 0,7, el 0,8, el 0,9, el 1,0, el 1,2, el 1,4, el 1,6, el 1,8, el 2,0, el 2,5, el 3,0, el 3,5, el 4,0, el 5,0, el 6,0, el 7,0 o el 8,0% del carbono en el medio de cultivo celular en isopreno. En algunas realizaciones, el porcentaje de conversión de carbono en isopreno es de entre tal como aproximadamente el 0,002 y aproximadamente el 4,0%, de aproximadamente el 0,002 a aproximadamente el 3,0%, de aproximadamente el 0,002 a aproximadamente el 2,0%, de aproximadamente el 0,002 a aproximadamente el 1,6%, de aproximadamente el 0,002 a aproximadamente el 0,005%, de aproximadamente 0,005 a aproximadamente el 0,01%, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente el 0,05%, de aproximadamente el 0,05 a aproximadamente el 0,15%, del 0,15 a aproximadamente el 0,2%, de aproximadamente el 0,2 a aproximadamente el 0,3%, de aproximadamente el 0,3 a aproximadamente el 0,5%, de aproximadamente el 0,5 a aproximadamente el 0,8%, de aproximadamente el 0,8 a aproximadamente el 1,0%, o de aproximadamente el 1,0 a aproximadamente el 1,6%. En algunas realizaciones, el porcentaje de conversión de carbono en isopreno es de entre aproximadamente el 0,002 a aproximadamente el 0,4%, del 0,002 a aproximadamente el 0,16%, del 0,04 a aproximadamente el 0,16%, de aproximadamente el 0,005 a aproximadamente el 0,3%, de aproximadamente el 0,01 a aproximadamente el 0,3%, o de aproximadamente el 0,05 a aproximadamente el 0,3%.
El porcentaje de conversión de carbono en isopreno (también denominado “% de rendimiento de carbono”) puede medirse dividiendo los moles carbono en el isopreno producido entre los moles carbono en la fuente de carbono (tal como los moles de carbono en extracto de levadura y glucosa en lotes y continuos). Este número se multiplica por el 100% para dar un valor en porcentaje (tal como se indica en la ecuación 1).
Ecuación 1
% de rendimiento de carbono = (moles de carbono en isopreno producido)/(moles de carbono en fuente de carbono)*100
Para este cálculo, puede suponerse que el extracto de levadura contiene el 50% p/p de carbono. Como ejemplo, para los 500 litros descritos en el ejemplo 7, parte VIII, el porcentaje de conversión de carbono en isopreno puede calcularse tal como se muestra en la ecuación 2.
Ecuación 2
% de rendimiento de carbono = (39,1 g de isopreno*1/68,1 mol/g*5C/mol)/[(181221 g de glucosa*1/180 mol/g*6C/mol) (17780 g de extracto de levadura*0,5*1/12 mol/g)]*100 = 0,042%
Para las dos fermentaciones de 500 litros descritas en el presente documento (ejemplo 7, partes VII y VIII), el porcentaje de conversión de carbono en isopreno estaba entre el 0,04-0,06%. Se ha logrado un rendimiento de carbono del 0,11-0,16% usando sistemas de 14 litros tal como se describe en el presente documento. El ejemplo 11, parte V describe el 1,53% de conversión de carbono en isopreno usando los procedimientos descritos en el presente documento.
Un experto en la técnica puede convertir fácilmente las tasas de producción de isopreno o cantidad de isopreno producido en cualquier otra unidad. A continuación se indican ecuaciones a modo de ejemplo para interconvertir entre unidades.
Unidades para la tasa de producción de isopreno (total y específica)
Ecuación 3
1 g de isopreno/lcaldo/h = 14,7 mmol de isopreno/lcaldo/h (tasa volumétrica total)
Ecuación 4
1 nmol de isopreno/gwcm/h = 1 nmol de isopreno/lcaldo/h/DO600 (esta conversión supone que un litro de caldo con un valor de DO600 de 1 tiene un peso celular húmedo de 1 gramo).
Ecuación 5
1 nmol de isopreno/gwcm/h = 68,1 ng de isopreno/gwcm/h (dado el peso molecular de isopreno)
Ecuación 6
1 nmol de isopreno/lgas O2/h = 90 nmol de isopreno/lcaldo/h (a una velocidad de flujo de O2 de 90 l/h por lcaldo de cultivo)
Ecuación 7
1 ug de isopreno/lgas isopreno en gas residual = 60 ug de isopreno/lcaldo/h a una velocidad de flujo de 60 lgas por lcaldo (1 vvM)
Unidades para el título (total y específico)
Ecuación 8
1 nmol de isopreno/mg de proteína celular = 150 nmol de isopreno/lcaldo/DO600 (esta conversión supone que un litro de caldo con un valor de DO600 de 1 tiene una proteína celular total de aproximadamente 150 mg) (productividad específica)
Ecuación 9
1 g de isopreno/lcaido = 14,7 mmol de isopreno/lcaido (título total)
Si se desea, puede usarse la ecuación 10 para convertir cualquiera de las unidades que incluyen el peso húmedo de las células en las correspondientes unidades que incluyen el peso seco de las células.
Ecuación 10
Peso seco de células = (peso seco de células)/3,3
Si se desea, puede usarse la ecuación 11 para convertir entre unidades de ppm y ug/l. En particular, “ppm” significa partes por millón definidas en términos de ug/g (p/p) o ul/l (vol/vol). Puede realizarse la conversión de ug/l en ppm (por ejemplo, ug de analito por g de gas) determinando la masa por l de gas residual (es decir, la densidad del gas). Por ejemplo, un litro de aire a STP tiene una densidad de aproximadamente 1,2 g/l. Por tanto, una concentración de 1 ppm (ug/g) es igual a 0,83 ug/l a STP (ecuación 11). La conversión de ppm (ug/g) en ug/l es una función de tanto presión, temperatura como composición global del gas residual.
Ecuación 11
1 ppm (ug/g) es igual a 0,83 ug/l a temperatura y presión estándar (STP; 101,3 kPa (1 bar) y 273,15 K).
La conversión de ug/l en ppmv (por ejemplo, ul de analito por l de gas) puede realizarse usando la ley de gases universal (ecuación 12). Por ejemplo, una concentración de gas residual de 1000 ug/lgas se corresponde con 14,7 umol/lgas. La constante de gas universal es de 0,082057 l.atm K-1mol-1, por lo que usando la ecuación 12, el volumen ocupado por 14,7 umol de HG a STP es igual a 0,329 ml. Por tanto, la concentración de HG 1000 ug/l es igual a 329 ppmv o el 0,0329% (v/v) a STP.
Ecuación 12
PV = nRT, donde “P” es presión, “V” es volumen, “n” es moles de gas, “R” es la constante de gas universal y “T” es la temperatura en Kelvin.
La cantidad de impurezas en composiciones de isopreno se mide normalmente en el presente documento en base al peso por volumen (p/v) en unidades tales como ug/l. Si se desea, pueden convertirse mediciones en unidades de ug/l a unidades de mg/m3 usando la ecuación 13.
Ecuación 13
1 ug/l = 1 mg/m3
En algunas realizaciones abarcadas por la invención, una célula que comprende un ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido de isopreno sintasa produce una cantidad de isopreno que es al menos o aproximadamente 2 veces, 3 veces, 5 veces, 10 veces, 25 veces, 50 veces, 100 veces, 150 veces, 200 veces, 400 veces o más, la cantidad de isopreno producido a partir de una célula correspondiente hecha crecer en esencialmente las mismas condiciones sin el ácido nucleico heterólogo que codifica para el polipéptido de isopreno sintasa.
En algunas realizaciones abarcadas por la invención, una célula que comprende un ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido de isopreno sintasa y uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican para un polipéptido de DXS, IDI y/o de la ruta de MVA produce una cantidad de isopreno que es al menos o aproximadamente 2 veces, 3 veces, 5 veces, 10 veces, 25 veces, 50 veces, 100 veces, 150 veces, 200 veces, 400 veces o más, la cantidad de isopreno producido a partir de una célula correspondiente hecha crecer en esencialmente las mismas condiciones sin los ácidos nucleicos heterólogos.
En algunas realizaciones, la composición de isopreno comprende más de o aproximadamente el 99,90, el 99,92, el 99,94, el 99,96, el 99,98 o el 100% de isopreno en peso en comparación con el peso total de todos los hidrocarburos C5 en la composición. En algunas realizaciones, la composición tiene una respuesta del detector relativa de más de o aproximadamente el 99,90, el 99,91, el 99,92, el 99,93, el 99,94, el 99,95, el 99,96, el 99,97, el 99,98, el 99,99 o el 100% para isopreno en comparación con la respuesta del detector para todos los hidrocarburos C5 en la composición. En algunas realizaciones, la composición de isopreno comprende entre aproximadamente 99,90 y aproximadamente 99,92, de aproximadamente 99,92 a aproximadamente 99,94, de aproximadamente 99,94 a aproximadamente 99,96, de aproximadamente 99,96 a aproximadamente 99,98, de aproximadamente el 99,98 al 100% de isopreno en peso en comparación con el peso total de todos los hidrocarburos C5 en la composición. En algunas realizaciones, la composición de isopreno comprende menos de o aproximadamente el 0,12, el 0,10, el 0,08, el 0,06, el 0,04, el 0,02, el 0,01, el 0,005, el 0,001, el 0,0005, el 0,0001, el 0,00005 o el 0,00001% de hidrocarburos C5 distintos de isopreno (tales como 1,3-ciclopentadieno, c/s-1,3-pentadieno, frans-1,3-pentadieno, 1-pentino, 2-pentino, 1-penteno, 2-metil-1-buteno, 3-metil-1-butino, frans-piperileno, c/s-piperileno, pent-4-en-1-ino, frans-pent-3-en-1-ino, o c/s-pent-3-en-1-ino) en peso en comparación con el peso total de todos los hidrocarburos C5 en la composición. En algunas realizaciones, la composición tiene una respuesta del detector relativa de menos de o aproximadamente el 0,12, el 0,10, el 0,08, el 0,06, el 0,04, el 0,02, el 0,01, el 0,005, el 0,001, el 0,0005, el 0,0001, el 0,00005 o el 0,00001% para hidrocarburos C5 distintos de isopreno en comparación con la respuesta del detector para todos los hidrocarburos C5 en la composición. En algunas realizaciones, la composición tiene una respuesta del detector relativa de menos de o aproximadamente el 0,12, el 0,10, el 0,08, el 0,06, el 0,04, el 0,02, el 0,01, el 0,005, el 0,001, el 0,0005, el 0,0001, el 0,00005 o el 0,00001% para 1,3-ciclopentadieno, c/s-1,3-pentadieno, frans-1,3-pentadieno, 1-pentino, 2-pentino, 1-penteno, 2-metil-1-buteno, 3-metil-1-butino, trans-piperileno, c/s-piperileno, pent-4-en-1-ino, frans-pent-3-en-1-ino, o c/s-pent-3-en-1-ino en comparación con la respuesta del detector para todos los hidrocarburos C5 en la composición. En algunas realizaciones, la composición de isopreno comprende entre aproximadamente el 0,02 y aproximadamente el 0,04%, de aproximadamente el 0,04 a aproximadamente el 0,06%, de aproximadamente el 0,06 al 0,08%, de aproximadamente el 0,08 al 0,10%, o de aproximadamente el 0,10 a aproximadamente el 0,12% de hidrocarburos c 5 distintos de isopreno (tales como 1,3-ciclopentadieno, c/s-1,3-pentadieno, frans-1,3-pentadieno, 1-pentino, 2-pentino, 1-penteno, 2-metil-1-buteno, 3-metil-1-butino, transpiperileno, c/s-piperileno, pent-4-en-1-ino, frans-pent-3-en-1-ino, o c/s-pent-3-en-1-ino) en peso en comparación con el peso total de todos los hidrocarburos C5 en la composición.
En algunas realizaciones, la composición de isopreno comprende menos de o aproximadamente 50, 40, 30, 20, 10, 5, 1, 0,5, 0,1, 0,05, 0,01 ó 0,005 ug/l de un compuesto que inhibe la polimerización de isopreno para cualquier compuesto en la composición que inhibe la polimerización de isopreno. En algunas realizaciones, la composición de isopreno comprende entre aproximadamente 0,005 y aproximadamente 50, tal como aproximadamente de 0,01 a aproximadamente 10, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 5, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 1, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 0,5, o de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 0,005 ug/l de un compuesto que inhibe la polimerización de isopreno para cualquier compuesto en la composición que inhibe la polimerización de isopreno. En algunas realizaciones, la composición de isopreno comprende menos de o aproximadamente 50, 40, 30, 20, 10, 5, 1, 0,5, 0,1, 0,05, 0,01 ó 0,005 ug/l de un hidrocarburo distinto de isopreno (tales como 1,3-ciclopentadieno, c/s-1,3-pentadieno, frans-1,3-pentadieno, 1-pentino, 2-pentino, 1-penteno, 2-metil-1-buteno, 3-metil-1-butino, frans-piperileno, c/s-piperileno, pent-4-en-1-ino, frans-pent-3-en-1-ino, o c/s-pent-3-en-1-ino). En algunas realizaciones, la composición de isopreno comprende entre aproximadamente 0,005 y aproximadamente 50, tal como de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 10, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 5, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 1, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 0,5, o de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 0,005 ug/l de un hidrocarburo distinto de isopreno. En algunas realizaciones, la composición de isopreno comprende menos de o aproximadamente 50, 40, 30, 20, 10, 5, 1, 0,5, 0,1, 0,05, 0,01 ó 0,005 ug/l de una proteína o ácido graso (tal como una proteína o ácido graso que se asocia de manera natural con caucho natural).
En algunas realizaciones, la composición de isopreno comprende menos de o aproximadamente 10, 5, 1, 0,8, 0,5, 0,1, 0,05, 0,01 ó 0,005 ppm de alfa acetilenos, piperilenos, acetonitrilo, o 1,3-ciclopentadieno. En algunas realizaciones, la composición de isopreno comprende menos de o aproximadamente 5, 1, 0,5, 0,1, 0,05, 0,01 ó 0. 005 ppm de azufre o alenos. En algunas realizaciones, la composición de isopreno comprende menos de o aproximadamente 30, 20, 15, 10, 5, 1, 0,5, 0,1, 0,05, 0,01 ó 0,005 ppm de todos los acetilenos (tales como pentino-1, butino-2, 2MB1-3-ino y 1-pentino-4-ino). En algunas realizaciones, la composición de isopreno comprende menos de o aproximadamente 2000, 1000, 500, 200, 100, 50, 40, 30, 20, 10, 5, 1, 0,5, 0,1, 0,05, 0,01 ó 0,005 ppm de dímeros de isopreno, tales como dímeros de isopreno cíclicos (por ejemplo, compuestos C10 cíclicos derivados de la dimerización de dos unidades de isopreno).
En algunas realizaciones, la composición de isopreno incluye etanol, acetona, un alcohol prenílico C5 (tal como 3-metil-3-buten-1-ol o 3-metil-2-buten-1-ol), o dos cualesquiera o más de los anteriores. En realizaciones particulares, la composición de isopreno comprende más de o aproximadamente 0,005, 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1, 5, 10, 20, 30, 40, 60, 80, 100 o 120 ug/l de etanol, acetona, un alcohol prenílico C5 (tal como 3-metil-3-buten-1-ol o 3-metil-2-buten-1-ol), o dos cualesquiera o más de los anteriores. En algunas realizaciones, la composición de isopreno comprende entre aproximadamente 0,005 y aproximadamente 120, tal como de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 80, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 60, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 40, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 30, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 20, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 10, de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 80, de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 60, de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 40, de aproximadamente 5 a aproximadamente 80, de aproximadamente 5 a aproximadamente 60, o de aproximadamente 5 a aproximadamente 40 ug/l de etanol, acetona, un alcohol prenílico C5, o dos cualesquiera o más de los anteriores.
En algunas realizaciones, la composición de isopreno incluye uno o más de los siguientes componentes: 2-heptanona, 6-metil-5-hepten-2-ona, 2,4,5-trimetilpiridina, 2,3,5-trimetilpirazina, citronelal, acetaldehído, metanotiol, acetato de metilo, 1-propanol, diacetilo, 2-butanona, 2-metil-3-buten-2-ol, acetato de etilo, 2-metil-1-propanol, 3metil-1-butanal, 3-metil-2-butanona, 1-butanol, 2-pentanona, 3-metil-1-butanol, isobutirato de etilo, 3-metil-2-butenal, acetato de butilo, acetato de 3-metilbutilo, acetato de 3-metil-3-but-1-enilo, acetato de 3-metil-2-but-1-enilo, (E)-3,7-dimetil-1,3,6-octatrieno, (Z)-3,7-dimetil-1,3,6-octatrieno, 2,3-cicloheptenolpiridina, o un polímero de isopreno lineal (tal como un dímero de isopreno lineal o un trímero de isopreno lineal derivado de la polimerización de múltiples unidades de isopreno). En diversas realizaciones, la cantidad de uno de estos componentes en relación con la cantidad de isopreno en unidades de porcentaje en peso (es decir, peso del componente dividido entre el peso de isopreno multiplicado por 100) es mayor de o aproximadamente el 0,01, el 0,02, el 0,05, el 0,1, el 0,5, el 1, el 5, el 10, el 20, el 30, el 40, el 50, el 60, el 70, el 80, el 90, el 100 o el 110% (p/p). En algunas realizaciones, la respuesta del detector relativa para el segundo compuesto en comparación con la respuesta del detector para isopreno es mayor de o aproximadamente el 0,01, el 0,02, el 0,05, el 0,1, el 0,5, el 1, el 5, el 10, el 20, el 30, el 40, el 50, el 60, el 70, el 80, el 90, el 100 o el 110%. En diversas realizaciones, la cantidad de uno de estos componentes en relación con la cantidad de isopreno en unidades de porcentaje en peso (es decir, peso del componente dividido entre el peso de isopreno multiplicado por 100) es de entre aproximadamente el 0,01 y aproximadamente el 105% (p/p), tal como de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 90, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 80, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 50, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 20, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 10, de aproximadamente 0,02 a aproximadamente 50, de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 50, de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 50, o del 0,1 a aproximadamente el 20% (p/p).
En algunas realizaciones, la composición de isopreno incluye uno o más de los siguientes: un alcohol, un aldehído o una cetona (tal como cualquiera de los alcoholes, aldehídos, o cetonas descritos en el presente documento). En algunas realizaciones, la composición de isopreno incluye (i) un alcohol y un aldehído, (ii) un alcohol y una cetona, (iii) un aldehído y una cetona, o (iv) un alcohol, un aldehído, y una cetona.
En algunas realizaciones, la composición de isopreno contiene uno o más de lo siguiente: metanol, acetaldehído, etanol, metanotiol, 1-butanol, 3-metil-1-propanol, acetona, ácido acético, 2-butanona, 2-metil-1-butanol, o indol. En algunas realizaciones, la composición de isopreno contiene 1 ppm o más de uno o más de lo siguiente: metanol, acetaldehído, etanol, metanotiol, 1-butanol, 3-metil-1-propanol, acetona, ácido acético, 2-butanona, 2-metil-1-butanol, o indol. En algunas realizaciones, la concentración de más de uno o más de lo siguiente: metanol, acetaldehído, etanol, metanotiol, 1-butanol, 3-metil-1-propanol, acetona, ácido acético, 2-butanona, 2-metil-1-butanol, o indol, es de entre aproximadamente 1 y aproximadamente 10.000 ppm en una composición de isopreno (tal como gas residual antes de que se purifique). En algunas realizaciones, la composición de isopreno (tal como gas residual después de que se someta a una o más etapas de purificación) incluye uno o más de lo siguiente: metanol, acetaldehído, etanol, metanotiol, 1-butanol, 3-metil-1-propanol, acetona, ácido acético, 2-butanona, 2-metil-1-butanol, o indol, a una concentración entre aproximadamente 1 y aproximadamente 100 ppm, tal como de aproximadamente 1 a aproximadamente 10 ppm, de aproximadamente 10 a aproximadamente 20 ppm, de aproximadamente 20 a aproximadamente 30 ppm, de aproximadamente 30 a aproximadamente 40 ppm, de aproximadamente 40 a aproximadamente 50 ppm, de aproximadamente 50 a aproximadamente 60 ppm, de aproximadamente 60 a aproximadamente 70 ppm, de aproximadamente 70 a aproximadamente 80 ppm, de aproximadamente 80 a aproximadamente 90 ppm, o de aproximadamente 90 a aproximadamente 100 ppm. Pueden analizarse compuestos orgánicos volátiles de cultivos celulares (tales como compuestos orgánicos volátiles en el espacio de cabeza de cultivos celulares) usando procedimientos convencionales tales como los descritos en el presente documento u otros procedimientos convencionales tales como reacción de transferencia de protonesespectrometría de masas (véase, por ejemplo, Bunge et al., Applied and Environmental Microbiology, 74(7):2179-2186, 2008 al que se hace referencia, en particular con respecto al análisis de compuestos orgánicos volátiles).
En algunas realizaciones, la composición comprende más de aproximadamente 2 mg de isopreno, tal como más de o aproximadamente 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 ó 1000 mg de isopreno. En algunas realizaciones, la composición comprende más de o aproximadamente 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 g de isopreno. En algunas realizaciones, la cantidad de isopreno en la composición es de entre aproximadamente 2 y aproximadamente 5.000 mg, tal como entre aproximadamente 2 y aproximadamente 100 mg, de aproximadamente 100 a aproximadamente 500 mg, de aproximadamente 500 a aproximadamente 1.000 mg, de aproximadamente 1.000 a aproximadamente 2.000 mg, o de aproximadamente 2.000 a aproximadamente 5.000 mg. En algunas realizaciones, la cantidad de isopreno en la composición es de entre aproximadamente 20 a aproximadamente 5.000 mg, de aproximadamente 100 a aproximadamente 5.000 mg, de aproximadamente 200 a aproximadamente 2.000 mg, de aproximadamente 200 a aproximadamente 1.000 mg, de aproximadamente 300 a aproximadamente 1.000 mg, o de aproximadamente 400 a aproximadamente 1.000 mg. En algunas realizaciones, más de o aproximadamente el 20, el 25, el 30, el 40, el 50, el 60, el 70, el 80, el 90 o el 95% en peso de la fracción orgánica volátil de la composición es isopreno.
En algunas realizaciones, la composición incluye etanol. En algunas realizaciones, la composición incluye entre aproximadamente el 75 y aproximadamente el 90% en peso de etanol, tal como entre aproximadamente el 75 y aproximadamente el 80%, de aproximadamente el 80 a aproximadamente el 85%, o de aproximadamente el 85 a aproximadamente el 90% en peso de etanol. En algunas realizaciones en las que la composición incluye etanol, la composición también incluye entre aproximadamente el 4 y aproximadamente el 15% en peso de isopreno, tal como entre aproximadamente el 4 y aproximadamente el 8%, de aproximadamente el 8 a aproximadamente el 12%, o de aproximadamente el 12 a aproximadamente el 15% en peso de isopreno.
En algunas realizaciones abarcadas por la invención, una célula que comprende uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican para un polipéptido de isopreno sintasa, polipéptido de DXS, polipéptido de IDI, y/o polipéptido de ruta de MVA produce una cantidad de un compuesto isoprenoide (tal como un compuesto con 10 o más átomos de carbono que se forma a partir de la reacción de una o más moléculas de IPP con una o más moléculas de DMAPP) que es mayor de o aproximadamente 2 veces, 3 veces, 5 veces, 10 veces, 25 veces, 50 veces, 100 veces, 150 veces, 200 veces, 400 veces, o mayor que la cantidad del compuesto isoprenoide producido a partir de una célula correspondiente hecha crecer en esencialmente las mismas condiciones sin el uno o más ácidos nucleicos heterólogos. En algunas realizaciones abarcadas por la invención, una célula que comprende uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican para un polipéptido de isopreno sintasa, polipéptido de DXS, polipéptido de IDI y/o polipéptido de la ruta de MVA produce una cantidad de un alcohol prenílico C5 (tal como 3-metil-3-buten-1-ol o 3-metil-2-buten-1-ol) que es mayor de o aproximadamente 2 veces, 3 veces, 5 veces, 10 veces, 25 veces, 50 veces, 100 veces, 150 veces, 200 veces, 400 veces o más, la cantidad del alcohol prenílico C5 producido a partir de una célula correspondiente hecha crecer en esencialmente las mismas condiciones sin el uno o más ácidos nucleicos heterólogos.
Procedimientos de purificación de isopreno a modo de ejemplo
En algunas realizaciones, cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento incluye además recuperar el isopreno. Por ejemplo, el isopreno producido usando los procedimientos de la invención pueden recuperarse usando técnicas convencionales tales como arrastre de gas, separación potenciada por membrana, fraccionamiento, adsorción/desorción, pervaporación, desorción térmica o a vacío de isopreno de una fase sólida, o extracción de isopreno inmovilizado o absorbido a una fase sólida con un disolvente (véanse, por ejemplo, las patentes estadounidenses n.os 4.703.007 y 4.570.029, a las que se hace referencia a cada una, particularmente con respecto a procedimientos de purificación y recuperación de isopreno). En realizaciones particulares, se usa destilación extractiva con un alcohol (tal como etanol, metanol, propanol, o una combinación de los mismos) para recuperar el isopreno. En algunas realizaciones, la recuperación de isopreno implica el aislamiento de isopreno en una forma líquida (tal como una disolución limpia de isopreno o una disolución de isopreno en un disolvente). El arrastre de gas implica la eliminación de vapor de isopreno del gas residual de la corriente de fermentación de manera continua. Tal eliminación puede lograrse de varias formas diferentes incluyendo, pero sin limitarse a, adsorción a una fase sólida, reparto en una fase líquida, o condensación directa (tal como condensación debida a la exposición a una bobina de condensación o debida a un aumento de la presión). En algunas realizaciones, el enriquecimiento de la membrana de una corriente de vapor de isopreno diluida por encima del punto de rocío del vapor que resulta en la condensación de isopreno líquido. En algunas realizaciones, el isopreno se comprime y se condensa.
La recuperación de isopreno puede implicar una etapa o múltiples etapas. En algunas realizaciones, la eliminación del vapor de isopreno del gas de fermentación y la conversión de isopreno en una fase líquida se realizan simultáneamente. Por ejemplo, el isopreno puede condensarse directamente de la corriente de gases de escape para formar un líquido. En algunas realizaciones, la eliminación del vapor de isopreno del gas de fermentación y la conversión de isopreno en una fase líquida se realizan de forma secuencial. Por ejemplo, el isopreno puede adsorberse a una fase sólida y luego extraerse de la fase sólida con un disolvente.
En algunas realizaciones, cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento incluye además purificar el isopreno. Por ejemplo, el isopreno producido usando los procedimientos de la invención puede purificarse usando técnicas convencionales. Purificación se refiere a un proceso mediante el cual el isopreno se separa de uno o más componentes que están presentes cuando se produce el isopreno. En algunas realizaciones, el isopreno se obtiene como un líquido sustancialmente puro. Los ejemplos de procedimientos de purificación incluyen (i) destilación de una disolución en un disolvente de extracción líquido y (ii) cromatografía. Tal como se usa en el presente documento, “isopreno purificado” significa isopreno que se ha separado de uno o más componentes que están presentes cuando se produce el isopreno. En algunas realizaciones, el isopreno está al menos aproximadamente el 20%, en peso, libre de otros componentes que están presentes cuando se produce el isopreno. En diversas realizaciones, el isopreno es al menos o aproximadamente el 25%, el 30%, el 40%, el 50%, el 60%, el 70%, el 75%, el 80%, el 90%, el 95% o el 99%, en peso, puro. La pureza puede someterse a ensayo mediante cualquier procedimiento apropiado, por ejemplo, mediante cromatografía en columna, análisis de HPLC o análisis de CG-EM.
En algunas realizaciones, al menos una porción de la fase gaseosa que permanece después de una o más etapas de recuperación para la eliminación de isopreno se recicla introduciendo la fase gaseosa en un sistema de cultivo celular (tal como un fermentador) para la producción de isopreno.
En algunas realizaciones, cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento incluye además polimerizar el isopreno. Por ejemplo, pueden usarse procedimientos convencionales para polimerizar el isopreno purificado para formar cis-poliisopreno u otros productos posteriores usando procedimientos convencionales. Por consiguiente, la divulgación también presenta un neumático que comprende poliisopreno, tal como cis-1,4-poliisopreno y/o trans-1,4-poliisopreno elaborado a partir de cualquiera de las composiciones de isopreno divulgadas en el presente documento.
Ejemplos
Los ejemplos, que se pretende que sean puramente a modo de ejemplo de la invención y, por tanto, no deben considerarse que limitan la invención en modo alguno, también describen y detallan aspectos y realizaciones de la invención comentados anteriormente. A menos que se indique lo contrario, la temperatura está en grados centígrados y la presión es o es casi atmosférica. Los siguientes ejemplos y descripción detallada se ofrecen a modo de ilustración y no a modo de limitación.
Ejemplo 1: Producción de isopreno en E. coli que expresa isopreno sintasa de kudzu recombinante
I. Construcción de los vectores para la expresión de la isopreno sintasa de kudzu en E. coli
Se obtuvo la secuencia de proteína para el gen de isopreno sintasa de kudzu (Pueraria montana) (IspS) de GenBank (AAQ84170). Se adquirió un gen de isopreno sintasa de kudzu, optimizado para el uso de codón de E. coli, de DNA2.0 (SEQ ID NO: 1). Se retiró el gen de isopreno sintasa del plásmido proporcionado mediante digestión de endonucleasa de restricción con BspLU11I/PstI, se purificó en gel y se ligó en pTrcHis2B (Invitrogen) que se había digerido con NcoI/PstI. Se diseñó el constructo de modo que el codón de terminación en el gen de isopreno sintasa 5' al sitio PstI. Como resultado, cuando se expresó el constructo la etiqueta His no se une a la proteína de isopreno sintasa. Se comprobó el plásmido resultante, pTrcKudzu, mediante secuenciación (figuras 2 y 3).
También se clonó el gen de isopreno sintasa en pET16b (Novagen). En este caso, se insertó el gen de isopreno sintasa en pET16b de modo que la proteína de isopreno sintasa recombinante contenía la etiqueta His N-terminal. Se amplificó el gen de isopreno sintasa de pTrcKudzu mediante PCR usando el conjunto de cebadores pET-His-Kudzu-2F: 5'-CGTGAGATCATATGTGTGCGACCTCTTCTCAATTTAC (SEQ ID NO: 3) y pET-His-Kudzu-R: 5'-CGGTCGACGGATCCCTGCAGTTAGACATACATCAGCTG (SEQ ID NO: 4). Estos cebadores añadieron un sitio NdeI en el extremo 5' y un sitio SamH1 en el extremo 3' del gen respectivamente. Se usó el plásmido pTrcKudzu, descrito anteriormente, como ADN molde, polimerasa Herculase (Stratagene) según las instrucciones del fabricante, y se añadieron cebadores a una concentración de 10 pMol. Se llevó a cabo la PCR en un volumen total de 25 pl. Se digirió el producto de PCR con NdeI/SamH1 y se clonó en pET16b digerido con las mismas enzimas. Se transformó la mezcla de ligación en E. coli Top 10 (Invitrogen) y se seleccionó el clon correcto mediante secuenciación. El plásmido resultante, en el que se expresó el gen de isopreno sintasa de kudzu del promotor T7, se designó pETNHisKudzu (figuras 4 y 5).
También se clonó el gen de isopreno sintasa de kudzu en el plásmido de bajo número de copias pCL1920. Se usaron cebadores para amplificar el gen de isopreno sintasa de kudzu a partir de pTrcKudzu descrito anteriormente. El cebador directo añadió un sitio HindIII y un RBS de consenso de E. coli al extremo 5'. El sitio de clonación PstI ya estaba presente en pTrcKudzu justo en 3' del codón de terminación de modo que el cebador inverso se construyó de modo que el producto de PCR final incluye el sitio PstI. Las secuencias de los cebadores fueron: HindIII-rbs-Kudzu F: 5'-CATATGAAAGCTTGTATCGATTAAATAAGGAGGAATAAACC (SEQ ID NO: 6) y BamH1-Kudzu R:
5'-CGGTCGACGGATCCCTGCAGTTAGACATACATCAGCTG (SEQ ID NO: 4). Se amplificó el producto de PCR usando polimerasa Herculase con cebadores a una concentración de 10 pmol y con 1 ng de ADN molde (pTrcKudzu). El protocolo de amplificación incluía 30 ciclos de (95°C durante 1 minuto, 60°C durante 1 minuto, 72°C durante 2 minutos). Se digirió el producto con HindIII y PstI y se ligó en pCL1920 que también se había digerido con HindIII y PstI. Se transformó la mezcla de ligación en E. coli Top10. Se comprobaron varios transformantes mediante secuenciación. El plásmido resultante se designó pCL-lac-Kudzu (figuras 6 y 7).
II. Determinación de la producción de isopreno
Para los cultivos en matraz de agitación, se transfirió un ml de un cultivo de matraces de agitación a viales de espacio de cabeza CTC de 20 ml (n.° de cat. del vial Agilent 5188 2753; n.° de cat. de la tapa 5188 2759). Se enroscó firmemente la tapa y se incubaron los viales a la temperatura equivalente con agitación a 250 rpm. Después de 30 minutos, se retiraron los viales del incubador y se analizaron tal como se describe a continuación (véase la tabla 1 para algunos valores experimentales de este ensayo).
En casos en los que se determinó la producción de isopreno en fermentadores, se tomaron muestras del gas residual del fermentador y se analizaron directamente tal como se describe a continuación (véase la tabla 2 para algunos valores experimentales de este ensayo).
Se realizó el análisis usando un sistema de CG/EM Agilent 6890 conectado con un inyector automático CombiPAL de CTC Analytics (Suiza) que funciona en modo de espacio de cabeza. Se usó una columna de CG/EM Agilent HP-5MS (30 m x 0,25 mm; grosor de película de 0,25 pm) para la separación de los analitos. Se estableció el inyector para inyectar 500 pl de gas de espacio de cabeza. El procedimiento de CG/EM utilizó helio como el gas portador a un flujo de 1 ml/min. Se mantuvo el puerto de inyección a 250°C con una razón de división de 50:1. Se mantuvo la temperatura del horno a 37°C durante la duración de 2 minutos del análisis. Se ejecutó el detector selectivo de masas Agilent 5793N en modo de monitorización de ion único (SIM) en m/z 67. Se desconectó el detector desde 1,4 hasta 1,7 minutos para permitir la elución de gases permanentes. En estas condiciones se observó que isopreno (2-metil-1,3-butadieno) eluía a 1,78 minutos. Se usó una tabla de calibración para cuantificar la cantidad absoluta de isopreno y se encontró que era lineal desde 1 |ig/l hasta 2000 |ig/l. Se estimó que el límite de detección era de 50 a 100 ng/l usando este procedimiento.
III. Producción de isopreno en matraces de agitación que contienen células de E. coli que expresan isopreno sintasa recombinante
Se introdujeron los vectores descritos anteriormente en la cepa BL21 de E. coli (Novagen) para producir cepas BL21/ptrcKudzu, BL21/pCL-lac-Kudzu y BL21/pETisKudzu. Se extendieron las cepas para aislamiento sobre LA (agar Luria) carbenicilina (50 |ig/ml) y se incubaron durante la noche a 37°C. Se inocularon colonias individuales en matraces de agitación con deflectores de 250 ml que contienen 20 ml de caldo Luria Bertani (LB) y carbenicilina (100 |ig/ml). Se hicieron crecer los cultivos durante la noche a 20°C con agitación a 200 rpm. Se midieron las DO600 de los cultivos durante la noche y se diluyeron los cultivos en un matraz de agitación con deflectores de 250 ml que contiene 30 ml de MagicMedia (Invitrogen) carbenicilina (100 |ig/ml) hasta una DO600 ~ 0,05. Se incubó el cultivo a 30°C con agitación a 200 rpm. Cuando la DO600 ~ 0,5-0,8, se añadió IPTG 400 |iM y se incubaron las células durante 6 horas adicionales a 30°C con agitación a 200 rpm. A las 0, 2, 4 y 6 horas tras la inducción con IPTG, se recogió 1 ml de alícuotas de los cultivos, se determinó la DO600 y se midió la cantidad de isopreno producido tal como se describió anteriormente. Se muestran los resultados en la figura 8.
IV. Producción de isopreno a partir de BL21/ptrcKudzu en fermentación de 14 litros
Se determinó la producción a gran escala de isopreno a partir de E. coli que contiene el gen de isopreno sintasa de kudzu recombinante de un cultivo semicontinuo. La composición para los medios de fermentación (TM2) por litro de medio de fermentación fue tal como sigue: K2HPO4 13,6 g, KH2PO4 13,6 g, MgSO4 * 7H2O 2 g, ácido cítrico monohidratado 2 g, citrato de amonio férrico 0,3 g, (NH4)2SO43,2 g, extracto de levadura 5 g, disolución de metales traza modificada 1000X 1 ml. Se añadieron todos los componentes juntos y se disolvieron en diH2O. Se ajustó el pH a 6,8 con hidróxido de potasio (KOH) y c.s.p. volumen. Se estilizó por filtración el producto final con filtro de 0,22 |i (solamente, sin someter a autoclave). La composición para la disolución de metales traza modificada 1000X fue tal como sigue: ácidos cítricos * H2O 40 g, MnSO4 * H2O 30 g, NaCl 10 g, FeSO4 * 7H2O 1 g, CoCl2 * 6H2O 1 g, ZnSO * 7H2O 1 g, CuSO4 * 5H2O 100 mg, H3BO3100 mg, NaMoO4 * 2H2O 100 mg. Se disolvió cada componente de uno en uno en diH2O, pH a 3,0 con HCl/NaOH, luego c.s.p. volumen y se esterilizaron por filtración con un filtro de 0,22 |i.
Se llevó a cabo este experimento en un biorreactor de 14 l para monitorizar la formación de isopreno a partir de glucosa a la fermentación deseada, pH 6,7 y temperatura 34°C. Se preparó un inóculo de cepa BL21/ptrcKudzu de E. coli tomado de un vial congelado en medio de hidrolizado enzimático de soja-extracto de levadura-glucosa. Después de que el inóculo creciera hasta DO550 = 0,6, se centrifugaron dos matraces de 600 ml y se resuspendió el contenido en 70 ml de sobrenadante para transferir el sedimento celular (70 ml de material DO 3.1) al biorreactor. A diversos momentos tras la inoculación, se retiraron muestras y se determinó la cantidad de isopreno producido tal como se describió anteriormente. Se muestran los resultados en la figura 9.
Ejemplo 2: Producción de isopreno en E. coli que expresa isopreno sintasa de chopo recombinante
Se obtuvo la secuencia de proteína para la isopreno sintasa de chopo (Populus alba x Populus trémula) (Schnitzler, J-P, et al. (2005) Planta 222:777-786) de GenBank (CAC35696). Se adquirió un gen, optimizado por codones para E. coli, de DNA2.0 (p9796-chopo, figuras 30 y 31). Se retiró el gen de isopreno sintasa del plásmido proporcionado mediante digestión de endonucleasa de restricción con BspLU11I/PstI, se purificó en gel y se ligó en pTrcHis2B que se había digerido con NcoI/PstI. El constructo se clona de modo que el codón de terminación en el inserto está antes del sitio PstI, que da como resultado un constructo en el que la etiqueta His no se une a la proteína de isopreno sintasa. Se comprobó el plásmido resultante pTrc-chopo (figuras 32 y 33), mediante secuenciación.
Ejemplo 3: Producción de isopreno en Panteoa citrea que expresa isopreno sintasa de kudzu recombinante
Se electroporaron los plásmidos pTrcKudzu y pCL-lac Kudzu descritos en el ejemplo 1 en P. citrea (patente estadounidense n.° 7.241.587). Se seleccionaron transformantes sobre LA que contenía carbenicilina (200 |ig/ml) o espectinomicina (50 |ig/ml) respectivamente. Se realizó la producción de isopreno a partir de matraces de agitación y determinación de la cantidad de isopreno producido tal como se describe en el ejemplo 1 para cepas de E. coli que expresan isopreno sintasa de kudzu recombinante. Se muestran los resultados en la figura 10.
Ejemplo 4: Producción de isopreno en Bacillus subtilis que expresa isopreno sintasa de kudzu recombinante
I. Construcción de un plásmido de replicación de B. subtilis para la expresión de isopreno sintasa de kudzu Se expresó el gen de isopreno sintasa de kudzu en la cepa aprEnprE Pxil-comK de Bacillus subtilis (BG3594comK) usando un plásmido de replicación (pBS19 con un casete de resistencia a cloranfenicol) bajo el control del promotor aprE. El gen de isopreno sintasa, el promotor aprE y el terminador de la transcripción se amplificaron por separado y se fusionaron usando PCR. El constructo se clonó entonces en pBS19 y se transformó en B. subtilis.
a) Amplificación del promotor aprE
Se amplificó el promotor aprE a partir de ADN cromosómico de Bacillus subtilis usando los siguientes cebadores: CF 797 (+) iniciar promotor aprE MfeI
5'-GACATCAATTGCTCCATTTTCTTCTGCTATC (SEQ ID NO: 58)
CF 07-43 (-) fusionar promotor aprE con ispS de Kudzu
5'-ATTGAGAAGAGGTCGCACACACTCTTTACCCTCTCCTTTTA (SEQ ID NO: 59)
b) Amplificación del gen de isopreno sintasa
Se amplificó el gen de isopreno sintasa de kudzu a partir de plásmido pTrcKudzu (SEQ ID NO: 2). El gen se había optimizado por codones para E. coli y sintetizado por DNA 2.0. Los siguientes cebadores se usaron:
CF 07-42 (+) fusionar el promotor aprE con gen de isopreno sintasa de kudzu (codón de iniciación GTG)
5'-TAAAAGGAGAGGGTAAAGAGTGTGTGCGACCTCTTCTCAAT (SEQ ID NO: 60)
CF 07-45 (-) fusionar el extremo 3' de gen de isopreno sintasa de kudzu con el terminador
5'-CCAAGGCCGGTTTTTTTTAGACATACATCAGCTGGTTAATC (SEQ ID NO: 61)
c) Amplificación del terminador de la transcripción
Se amplificó el terminador de la serina proteasa alcalina de Bacillus amyliquefaciens a partir de un plásmido secuenciado previamente pJHPms382 usando los siguientes cebadores:
CF 07-44 (+) fusionar el extremo 3' de isopreno sintasa de kudzu con el terminador
5'-GATTAACCAGCTGATGTATGTCTAAAAAAAACCGGCCTTGG (SEQ ID NO: 62)
CF 07-46 (-) fin del terminador de B. amyliquefaciens (BamHI)
5'- GACATGACGGATCCGATTACGAATGCCGTCTC (SEQ ID NO: 63)
Se fusionó el fragmento de kudzu con el fragmento terminador usando PCR con los siguientes cebadores:
CF 07-42 (+) fusionar el promotor aprE con gen de isopreno sintasa de kudzu (codón de iniciación GTG)
5'-TAAAAGGAGAGGGTAAAGAGTGTGTGCGACCTCTTCTCAAT (SEQ ID NO: 61)
CF 07-46 (-) fin de terminador de B. amyliquefaciens (BamHI)
5'-GACATGACGGATCCGATTACGAATGCCGTCTC (SEQ ID NO: 63)
Se fusionó el fragmento terminador de kudzu con el fragmento de promotor usando PCR con los siguientes cebadores:
CF 797 (+) iniciar promotor aprE MfeI
5'-GACATCAATTGCTCCATTTTCTTCTGCTATC (SEQ ID NO: 64)
CF 07-46 (-) fin de terminador de B. amyliquefaciens (BamHI)
5'-GACATGACGGATCCGATTACGAATGCCGTCTC (SEQ ID NO: 63)
Se purificó el fragmento de PCR de fusión usando un kit de Qiagen y se digirió con las enzimas de restricción MfeI y BamHI. Este fragmento de ADN digerido se purificó en gel usando un kit de Qiagen y se ligó con un vector conocido como pBS19, que se había digerido con EcoRI y BamHI y purificado en gel.
Se transformó la mezcla de ligación en células de E. coli Top 10 y se seleccionaron colonias sobre placas de LA+50 carbenicilina. Se escogió un total de seis colonias y se hicieron crecer durante la noche en LB+50 carbenicilina y entonces los plásmidos se aislaron usando un kit de Qiagen. Se digirieron los plásmidos con EcoRI y BamHI para comprobar insertos y se enviaron tres de los plásmidos correctos para secuenciación con los siguientes cebadores: CF 149 (+) EcoRI inicio de promotor aprE
5'-GACATGAATTCCTCCATTTTCTTCTGC (SEQ ID NO: 65)
CF 847 (+) Secuencia en pXX 049 (fin de promotor aprE)
5'-AGGAGAGGGTAAAGAGTGAG (SEQ ID NO: 66)
CF 07-45 (-) fusionar el extremo 3' de isopreno sintasa de kudzu con el terminador
5'-CCAAGGCCGGTTTTTTTTAGACATACATCAGCTGGTTAATC (SEQ ID NO: 61)
CF 07-48 (+) secuenciar cebador para isopreno sintasa de kudzu
5'-CTTTTCCATCACCCACCTGAAG (SEQ ID NO: 67)
CF 07-49 (+) secuenciación en isopreno sintasa de kudzu
5'-GGCGAAATGGTCCAACAACAAAATTATC (SEQ ID NO: 68)
Se corrigió el plásmido designado pBS Kudzu n.° 2 (figuras 52 y 12) mediante secuenciación y se transformó en BG 3594 comK, una cepa huésped de Bacillus subtilis. Se realizó la selección sobre placas de lA 5 cloranfenicol. Se escogió un transformante y se dio con colonias individuales sobre LA 5 cloranfenicol, entonces se hizo crecer en LB+5 cloranfenicol hasta que alcanzó una DO600 de 1,5. Se almacenó congelado en un vial a -80°C en presencia de glicerol. La cepa resultante se designó CF 443.
II. Producción de isopreno en matraces de agitación que contienen células de B. subtilis que expresan isopreno sintasa recombinante
Durante la noche se inocularon cultivos con una colonia individual de CF 443 a partir de un LA cloranfenicol (Cm, 25 |ig/ml). Se hicieron crecer los cultivos en LB Cm a 37°C con agitación a 200 rpm. Estos cultivos durante la noche (1 ml) se usaron para inocular matraces de agitación con deflectores de 250 ml que contienen 25 ml de medios Grants II y cloranfenicol a una concentración final de 25 |ig/ml. La composición de los medios Grants II fue de 10 g de hidrolizado enzimático de soja, 3 ml de K2HPO4 1M, 75 g de glucosa, 3,6 g de urea, 100 ml de 10X MOPS, c.s.p. 1 l con H2O, pH 7,2; la composición de 10X MOPS fue de 83,72 g de MOPS, 7,17 g de tricina, 12 g de sedimentos de KOH, 10 ml de disolución de K2SO40,276 M, 10 ml de disolución de MgCh 0,528 M, 29,22 g de NaCl, 100 ml de 100X micronutrientes, c.s.p. 1 l con H2O; y la composición de 100X micronutrientes fue de 1,47 g de CaCl2*2H2O, 0,4 g de FeSO4*7H2O, 0,1 g de MnSO4*H2O, 0,1 g de ZnSO4*H2O, 0,05 g de CuCl2*2H2O, 0,1 g de CoCl2*6H2O, 0,1 g de Na2MoO4*2H2O, c.s.p. 1 l con H2O. Se incubaron matraces de agitación a 37°C y se tomaron muestras a las 18, 24 y 44 horas. A las 18 horas se muestrearon los espacios de cabeza de CF443 y la cepa de control. Esto representó 18 horas de acumulación de isopreno. La cantidad de isopreno se determinó mediante cromatografía de gases tal como se describe en el ejemplo 1. Se potenció la producción de isopreno significativamente expresando isopreno sintasa recombinante (figura 11).
III. Producción de isopreno por CF443 en fermentación de 14 l
Se determinó la producción a gran escala de isopreno a partir de B. subtilis que contiene el gen de isopreno sintasa de kudzu recombinante sobre un plásmido de replicación a partir de un cultivo semicontinuo. Se cultivó cepa CF 443 de Bacillus, que expresa un gen de isopreno sintasa de kudzu, o cepa de control que no expresa un gen de isopreno sintasa de kudzu mediante fermentación semicontinua convencional en un medio de nutrientes que contiene harina de soja (Cargill), fosfato de sodio y potasio, sulfato de magnesio y una disolución de ácido cítrico, cloruro férrico y cloruro de manganeso. Antes de la fermentación los medios se maceran durante 90 minutos usando una mezcla de enzimas incluyendo celulasas, hemicelulasas y pectinasas (véase el documento WO95/04134). Se alimentan fermentaciones discontinuas de 14 l con el 60% p/p de glucosa (Cargill DE99 dextrosa, ADM Versadex greens o azúcar invertido Danisco) y el 99% p/p de aceite (aceite de soja Western Family, donde el 99% p/p es la concentración de aceite antes de añadirse al medio de cultivo celular). Se inició la alimentación cuando la glucosa en el lote no era detectable. Se incrementó la tasa de alimentación a lo largo de varias horas y se ajustó para añadir aceite en una base de carbono igual. Se controló el pH a 6,8-7,4 usando el 28% p/v de hidróxido de amonio. En caso de espumación, se añadió un agente antiespumación a los medios. La temperatura de fermentación se controló a 37°C y se agitó el cultivo de fermentación a 750 rpm. Se monitorizaron otros diversos parámetros tales como pH, % de DO, flujo de aire y presión en la totalidad de todo el proceso. El % de DO se mantiene por encima de 20. Se tomaron muestras a lo largo del transcurso de tiempo de 36 horas y se analizaron para determinar el crecimiento celular (DO550) y la producción de isopreno. Se presentan los resultados de estos experimentos en las figuras 53A y 53B.
IV. Integración del isopreno sintasa de kudzu (ispS) en B. subtilis.
Se clonó el gen de isopreno sintasa de kudzu en un plásmido de integración (pJH101-cmpR) bajo el control del promotor aprE. En las condiciones sometidas a prueba, no se detectó isopreno.
Ejemplo 5: Producción de isopreno en Trichoderma
I. Construcción de los vectores para la expresión de la isopreno sintasa de kudzu en Trichoderma reesei
Se sintetizó el gen de IS de kudzu optimizado por codón de Yarrowia lipolytica por DNA 2.0 (SEQ ID NO: 8) (figura 13). Este plásmido sirvió como molde para la siguiente reacción de amplificación de PCR: 1 |il de plásmido molde (20 ng/ul), 1 |il de cebador EL-945 (10 uM) 5'-GCTTATGGATCCTCTAGACTATTACACGTACATCAATTGG (SEQ ID NO: 9), 1 |il de cebador EL-965 (10uM) 5'-CACCATGTGTGCAACCTCCTCCCAGTTTAC (SEQ ID NO: 10), 1 |il de dNTP (10 mM), 5 |il 10x tampón de ADN polimerasa PfuUltra II Fusion HS, 1 |il de ADN polimerasa PfuUltra II Fusion HS, 40 |il de agua en un volumen de reacción total de 50 |il. El cebador directo contenía 4 nucleótidos adicionales en el extremo 5' que no se correspondían con el gen de isopreno sintasa de kudzu optimizado por codón de Y. lipolytica, pero se requería para clonar en el vector pENTR/D-TOPO. El cebador inverso contenía 21 nucleótidos adicionales en el extremo 5' que no se correspondían con el gen de isopreno sintasa de kudzu optimizado por codón de Y. lipolytica, pero se insertaron para clonar en otras estructuras principales de vector. Usando el termociclador MJ Research PTC-200, se realizó la reacción de PCR tal como sigue: 95°C durante 2 minutos (primer ciclo sólo), 95°C durante 30 segundos, 55°C durante 30 segundos, 72°C durante 30 segundos (repetir durante 27 ciclos), 72°C durante 1 minuto después del último ciclo. Se analizó el producto de PCR en un E-gel al 1,2% para confirmar la amplificación ventajosa del gen de isopreno sintasa de kudzu optimizado por codón de Y. lipolytica.
Entonces se clonó el producto de PCR usando el kit de clonación TOPO pENTR/D-TOPO siguiendo el protocolo del fabricante: 1 |il de reacción de PCR, 1 |il de disolución salina, 1 |il de vector TOPO pENTR/D-TOPO y 3 |il de agua en un volumen de reacción total de 6 |il. Se incubó la reacción a temperatura ambiente durante 5 minutos. Se transformó un microlitro de reacción TOPO en células de E. coli TOP10 químicamente competentes. Se seleccionaron los transformantes sobe placas de LA kanamicina 50 |ig/ml. Se escogieron varias colonias y se inoculó cada una en un tubo de 50 ml que contenía LB kanamicina 50 |ig/ml y los cultivos se hicieron crecer durante la noche a 37°C con agitación a 200 rpm. Se aislaron los plásmidos de los tubos de cultivo durante la noche usando el kit QIAprep Spin Miniprep, siguiendo protocolo del fabricante. Se secuenciaron varios plásmidos para verificar que la secuencia de ADN era correcta.
Se usó un único plásmido pENTR/D-TOPO, que codifica para un gen de isopreno sintasa de kudzu optimizado por codón de Y. lipolytica, para clonación Gateway en un vector a medida pTrex3g. La construcción de pTrex3g se describe en el documento WO 2005/001036 A2. La reacción se realizó siguiendo el protocolo del fabricante para el kit de mezcla enzimático Gateway LR Clonase II (Invitrogen): 1 |il de vector donador pENTR/D-TOPO de gen de isopreno sintasa de kudzu optimizado por codón de Y. lipolytica, 1 |il de vector de destinación pTrex3g, 6 |il de tampón TE, pH 8,0 en un volumen de reacción total de 8 |il. Se incubó la reacción a temperatura ambiente durante 1 hora y después se añadió 1 |il de disolución de proteinasa K y la incubación continuó a 37°C durante 10 minutos. Entonces se transformó 1 |il de reacción en células de E. coli TOP10 químicamente competentes. Se seleccionaron los transformantes sobre placas de LA carbenicilina 50 |ig/ml. Se escogieron varias colonias y se inoculó cada una en un tubo de 5 ml que contenía LB 50 |ig/ml carbenicilina y los cultivos se hicieron crecer durante la noche a 37°C con agitación a 200 rpm. Se aislaron plásmidos a partir de los tubos de cultivo durante la noche usando el kit QIAprep Spin Miniprep (Qiagen, Inc.), siguiendo el protocolo del fabricante. Se secuenciaron varios plásmidos para verificar que la secuencia de ADN era correcta.
Se realizó transformación biolística de plásmido pTrex3g isopreno sintasa de kudzu optimizado por codón de Y. lipolytica (figura 14) en una cepa de Trichoderma reesei de borrado cuádruple usando el sistema de suministro de partículas PDS-1000/HE biolístico (véase el documento WO 2005/001036 A2). Se realizó aislamiento de transformantes estables y evaluación de matraz de agitación usando el protocolo indicado en el ejemplo 11 de la publicación de patente WO 2005/001036 A2.
II. Producción de isopreno en cepas de T. reesei recombinantes
Se transfirió un ml de cultivos de 15 y 36 horas de transformantes de isopreno sintasa descritos anteriormente a viales de espacio de cabeza. Se sellaron los viales y se incubaron durante 5 horas a 30°C. Se midió el gas de espacio de cabeza y se identificó isopreno mediante el procedimiento descrito en el ejemplo 1. Dos de los transformantes mostraron trazas de isopreno. La cantidad de isopreno pudo aumentarse mediante una incubación de 14 horas. Las dos muestras positivas mostraron isopreno a niveles de aproximadamente 0,5 |ig/l durante la incubación de 14 horas. El control no transformado no mostró niveles detectables de isopreno. Este experimento muestra que T. reesei puede producir isopreno a partir de precursor endógeno cuando se proporciona con una isopreno sintasa exógena.
Ejemplo 6: Producción de isopreno en Yarrowia
I. Construcción de los vectores para la expresión de la isopreno sintasa de kudzu en Yarrowia lipolytica.
El punto de partida para la construcción de los vectores para la expresión del gen de isopreno sintasa de kudzu en Yarrowia lipolytica fue el vector pSPZ1(MAP29Spb). La secuencia completa de este vector (SEQ ID NO: 11) se muestra en la figura 15.
Se amplificaron los siguientes fragmentos mediante PCR usando ADN cromosómico de una cepa GICC 120285 de Y. lipolytica como molde: una forma sin promotor del gen URA3, un fragmento de gen de ARN ribosómico 18S, un terminador de la transcripción del gen XPR2 de Y. lipolytica y dos fragmentos de ADN que contenían los promotores de genes XPR2 y ICL1. Se usaron los siguientes cebadores de PCR:
ICL13
5'-GGTGAATTCAGTCTACTGGGGATTCCCAAATCTATATATACTGCAGGTGAC (SEQ ID NO: 69)
ICL15
5'-GCAGGTGGGAAACTATGCACTCC (SEQ ID NO: 70)
XPR 3
5'-CCTGAATTCTGTTGGATTGGAGGATTGGATAGTGGG (SEQ ID NO: 71)
XPR 5
5'-GGTGTCGACGTACGGTCGAGCTTATTGACC (SEQ ID NO: 72)
XPRT3
5'-GGTGGGCCCGCATTTTGCCACCTACAAGCCAG (SEQ ID NO: 73)
XPRT 5
5'-GGTGAATTCTAGAGGATCCCAACGCTGTTGCCTACAACGG (SEQ ID NO: 74)
Y18S3
5'-GGTGCGGCCGCTGTCTGGACCTGGTGAGTTTCCCCG (SEQ ID NO: 75)
Y18S 5
5'-GGTGGGCCCATTAAATCAGTTATCGTTTATTTGATAG (SEQ ID NO: 76)
YURA3
5'-GGTGACCAGCAAGTCCATGGGTGGTTTGATCATGG (SEQ ID NO: 77)
YURA 50
5'-GGTGCGGCCGCCTTTGGAGTACGACTCCAACTATG (SEQ ID NO: 78)
YURA 51
5'-GCGGCCGCAGACTAAATTTATTTCAGTCTCC (SEQ ID NO: 79)
Para amplificación de PCR, se usaron la polimerasa PfuUltraII (Stratagene), tampón proporcionado por el proveedor y dNTP, cebadores 2,5 mM y el molde de ADN indicado según las instrucciones del fabricante. La amplificación se realizó usando el siguiente ciclo: 95°C durante 1 min; 34x (95°C durante 30 s; 55°C durante 30 s; 72°C durante 3 min) y 10 min a 72°C seguido por una incubación a 4°C.
Se obtuvieron moléculas de ADN sintéticas que codifican para el gen de isopreno sintasa de kudzu, optimizado por codón para la expresión en Yarrowia, de d Na 2.0 (figura 16; SEQ ID NO: 12). En la figura 18 se presentan los detalles completos del esquema de construcción de los plásmidos pILA(KZ1) y pILI(KZ1) que llevan el gen sintético de isopreno sintasa de kudzu bajo el control de promotores XPR2 y ICL1 respectivamente. También se construyeron plásmidos de control en los que se inserta un gen de factor de apareamiento (MAP29) en lugar de un gen de isopreno sintasa (figura 18E y 18F).
Puede usarse un procedimiento de clonación similar para expresar un gen de isopreno sintasa de chopo (Populus alba x Populus trémula). La secuencia del isopreno de chopo se describe en Miller B. et al. (2001) Planta 213, 483­ 487 y se muestra en la figura 17 (SEQ ID NO: 13). En la figura 18A y B se presenta un esquema de construcción para la generación los plásmidos pILA(POP1) y pILI(POP1) que llevan el gen de isopreno sintasa de chopo sintético bajo el control de promotores XPR2 e ICL1 respectivamente.
II. Producción de isopreno por cepas de Y. lipolytica recombinantes.
Se digirieron vectores pILA(KZ1), pILI(KZ1), pILA(MAP29) y pILI(MAP29) con SacII y se usaron para transformar la cepa CLIB 122 de Y. lipolytica mediante un procedimiento de acetato de litio/polietilenglicol convencional para prototrofia de uridina. En resumen, las células de levadura se hicieron crecer en y Ep D (1% de extracto de levadura, 2% de peptona, 2% de glucosa) durante la noche, se recogieron mediante centrifugación (4000 rpm, 10 min), se lavaron una vez con agua estéril y se suspendieron en acetato de litio 0,1 M, pH 6,0. Se mezclaron alícuotas de dos cientos de |il de la suspensión celular con disolución de ADN plasmídico linealizado (10-20 |ig), se incubaron durante 10 minutos a temperatura ambiente y se mezclaron con 1 ml de PEG 4000 al 50% en el mismo tampón. Se incubaron las suspensiones adicionalmente durante 1 hora a temperatura ambiente seguido por un choque térmico de 2 minutos a 42°C. Entonces se sembraron las células en placa sobre placas SC his leu (0,67% de base de nitrógeno de levadura, 2% de glucosa, 100 mg/l cada una de leucina e histidina). Los transformantes aparecían tras 3-4 días de incubación a 30°C.
Se hicieron crecer tres aislados de la transformación pILA(KZ1), tres aislados de la transformación pILI(KZ1), dos aislados de la transformación pILA(MAP29) y dos aislados de la transformación pILI(MAP29) durante 24 horas en medio YEP7 (1% de extracto de levadura, 2% de peptona, pH 7,0) a 30°C con agitación. Se recogieron células de 10 ml de cultivo mediante centrifugación, se resuspendieron en 3 ml de YEP7 nuevo y se colocaron en viales de tapa de rosca de 15 ml. Los viales se incubaron durante la noche a temperatura ambiente con agitación suave (60 rpm). Se analizó el contenido en isopreno en el espacio de cabeza de estos viales mediante cromatografía de gases usando detector espectrométrico de masas tal como se describe en el ejemplo 1. Todos los transformantes obtenidos con pILA(KZ1) y pILI(KZ1) produjeron cantidades fácilmente detectables de isopreno (de 0,5 |ig/l a 1 |ig/l, figura 20). No se detectó isopreno en el espacio de cabeza de las cepas de control que llevan el gen de fitasa en lugar de un gen de isopreno sintasa.
Ejemplo 7: Producción de isopreno en E. coli que expresa isopreno sintasa de kudzu e idi, o dxs, o idi y dxs I. Construcción de los vectores que codifican para isopreno sintasa de kudzu e idi, o dxs, o idi y dxs para la producción de isopreno en E. coli
i) Construcción de pTrcKudzuKan
Se reemplazó el gen bla de pTrcKudzu (descrito en el ejemplo 1) con el gen que confiere resistencia a kanamicina. Para retirar el gen bla, se digirió pTrcKudzu con SspHI, se trató con fosfatasa alcalina de gamba (SAP), se destruyó con calor a 65°C, luego se llenó el extremo con fragmento Klenow y dNTP. El fragmento grande de 5 kpb se purificó a partir de un gel de agarosa y se ligó con el gen kanr que se había amplificado por PCR a partir de pCR-Blunt-II-TOPO usando los cebadores MCM225'-GATCAAGCTTAACCGGAATTGCCAGCTG (SEQ ID NO: 14) y MCM235'-GATCCGATCGTCAGAAGAACTCGTCAAGAAGGC (SEQ ID NO: 15), se digirió con HindIII y Pvu I, y se llenó el extremo. Se seleccionó un transformante que lleva un plásmido que confiere resistencia a kanamicina (pTrcKudzuKan) sobre LA que contenía kanamicina 50 |ig/ml.
ii) Construcción de pTrcKudzu yIDI Kan
Se digirió pTrcKudzuKan con PstI, se trató con SAP, se destruyó por calor y se purificó en gel. Se ligó con un producto de PCR que codifica para idi de S. cerevisiae con un r Bs sintético. Los cebadores para PCR fueron NsiI-YIDI 1 F 5'-CATCAATGCATCGCCCTTAGGAGGTAAAAAAAAATGAC (SEQ ID NO: 16) y PstI-YIDI 1 R 5'-CCTTCTGCAGGACGCGTTGTTATAGC (SEQ ID NO: 17); y el molde fue Ad N genómico de S. cerevisiae. Se digirió el producto de PCR con NsiI y PstI y se purificó en gel antes de la ligación. La mezcla de ligación se transformó en células TOP10 químicamente competentes y se seleccionó sobre LA que contenía kanamicina 50 |ig/ml. Se aislaron varios transformantes y se secuenciaron y el plásmido resultante se denominó pTrcKudzu-ylDI(kan) (figuras 34 y 35).
iii) Construcción de pTrcKudzu DXS Kan
Se digirió el plásmido pTrcKudzuKan con PstI, se trató con SAP, se destruyó por calor y se purificó en gel. Se ligó con un producto de PCR que codifica para dxs de E. coli con un RBS sintético. Los cebadores para PCR fueron MCM13 5'-GATCATGCATTCGCCCTTAGGAGGTAAAAAAACATGAGTTTTGATATTGCCAAATACCCG (SEQ ID NO: 18) y MCM14 5'-CATGCTGCAGTTATGCCAGCCAGGCCTTGAT (SEQ ID NO: 19); y el molde fue ADN genómico de E. coli. Se digirió el producto de PCR con NsiI y PstI y se purificó en gel antes de la ligación. La reacción de transformación resultante se transformó en células TOP10 y se seleccionó sobre LA con kanamicina 50 pg/ml. Se aislaron varios transformantes y se secuenciaron y el plásmido resultante se denominó pTrcKudzu-DXS(kan) (figuras 36 y 37).
iv) Construcción de pTrcKudzu-yIDI-dxs (kan)
Se digirió pTrcKudzu-yIDI(kan) con PstI, se trató con SAP, se destruyó por calor y se purificó en gel. Se ligó con un producto de PCR que codifica para E. coli dxs con un RBS sintético (cebadores MCM13 5'-GATCATGCATTCGCCCTTAGGAGGTAAAAAAACATGAGTTTTGATATTGCCAAATACCCG (SEQ ID NO: 18) y MCM14 5'-CATGCTGCAGTTATGCCAGCCAGGCCTTGAT (SEQ ID NO: 19); molde células TOP10) que se había digerido con NsiI y PstI y purificado en gel. El plásmido final se denominó pTrcKudzu-yIDI-dxs (kan) (figuras 21 y 22). v) Construcción de pCL PtrcKudzu
Se digirió un fragmento de ADN que contenía el promotor, gen estructural y terminador del ejemplo 1 anterior a partir de pTrcKudzu usando SspI y se purificó en gel. Se ligó con pCL1920 que se había digerido con PvuII, se trató con SAP y se destruyó por calor. La mezcla resultante de ligación se transformó en células TOP10 y se seleccionó en LA que contenía espectinomicina 50 pg/ml. Se aislaron varios clones y se secuenciaron y se seleccionaron dos. pCL PtrcKudzu y pCL PtrcKudzu (A3) tienen el inserto en orientaciones opuestas (figuras 38-41).
vi) Construcción de pCL PtrcKudzu yIDI
Se ligó el amplicón de PCR IDI digerido con NsiI-PstI, purificado en gel a partir de (ii) anterior en pCL PtrcKudzu que se había digerido con PstI, se trató con SAP y se destruyó por calor. La mezcla de ligación se transformó en células TOP10 y se seleccionó en LA que contenía espectinomicina 50 pg/ml. Se aislaron varios clones y se secuenciaron y el plásmido resultante se denomina pCL PtrcKudzu yIDI (figuras 42 y 43).
vii) Construcción de pCL PtrcKudzu DXS
Se ligó el amplicón de PCR DXS digerido con NsiI-PstI, purificado en gel a partir de (iii) anterior en pCL PtrcKudzu (A3) que se había digerido con PstI, se trató con SAP y se destruyó por calor. La mezcla de ligación se transformó en células TOP10 y se seleccionó en LA que contenía espectinomicina 50 pg/ml. Se aislaron varios clones y se secuenciaron y el plásmido resultante se denomina pCL PtrcKudzu DXS (figuras 44 y 45).
II. Medición de isopreno en espacio de cabeza a partir de cultivos que expresan isopreno sintasa de kudzu, idi, y/o dxs a diferentes números de copia.
Se hicieron crecer cultivos de E. coli BL21(XDE3) transformados previamente con plásmidos pTrcKudzu(kan) (A), pTrcKudzu-yIDI kan (B), pTrcKudzu-DXS kan (C), pTrcKudzu-yIDI-DXS kan (D) en LB kanamicina 50 pg/ml. Se hicieron crecer cultivos de pCL PtrcKudzu (E), pCL PtrcKudzu, pCL PtrcKudzu-yIDI (F) y pCL PtrcKudzu-DXS (G) en LB espectinomicina 50 pg/ml. Se indujeron los cultivos con IPTG 400 pM en el momento 0 (DO600 aproximadamente 0,5) y se tomaron muestras para la medición del espacio de cabeza de isopreno (véase el ejemplo 1). Se muestran los resultados en la figura 23A-23G.
Se introdujo el plásmido pTrcKudzu-yIDI-dxs (kan) en la cepa BL21 de E. coli mediante transformación. La cepa resultante BL21/pTrc Kudzu IDI DXS se hizo crecer durante la noche en LB que contenía kanamicina (50 pg/ml) a 20°C y se usó para inocular matraces de agitación de TM3 (13,6 g de K2PO4, 13,6 g de KH2PO4, 2,0 g de MgSO4*7H2O, 2,0 g de ácido cítrico monohidratado, 0,3 g de citrato de amonio férrico, 3,2 g de (NH4)2SO4, 0,2 g de extracto de levadura, 1,0 ml de disolución de metales traza modificada 1000X, ajustados a pH 6,8 y c.s.p. H2O, y esterilizados por filtración) que contenían el 1% de glucosa. Se incubaron matraces a 30°C hasta que se alcanzó una DO600 de 0,8, y después se indujeron con IPTG 400 pM. Se tomaron muestras a diversos momentos tras la inducción y se midió la cantidad de isopreno en el espacio de cabeza tal como se describe en el ejemplo 1. Se muestran los resultados en la figura 23H.
III. Producción de isopreno a partir de biomasa en E. coli/pTrcKudzu yIDI DXS
Se sometió a prueba la cepa BL21 pTrcKudzuIDIDXS para determinar la capacidad de generar isopreno a partir de tres tipos de biomasa; bagazo, rastrojo de maíz y pasta de coniferas con glucosa como control. Se prepararon hidrolisados de la biomasa mediante hidrólisis enzimática (Brown, L y Torget, R., 1996, procedimiento de ensayo convencional NREL Lap-009 “Enzymatic Saccharification of Lignocellulosic Biomass”) y se usaron a una dilución basada en equivalentes de celulosa. En este ejemplo, los equivalentes de glucosa fueron iguales al 1% de glucosa. Se usó una colonia individual de una placa de células recién transformadas de BL21 (DE3) pTrcKudzu yIDI DXS (kan) para inocular 5 ml de LB más kanamicina (50 |ig/ml). Se incubó el cultivo durante la noche a 25°C con agitación. Al día siguiente, se diluyó el cultivo durante la noche hasta una DO600 de 0,05 en 25 ml de TM3 el 0,2% de YE el 1% de materia prima. La materia prima era rastrojo de maíz, bagazo o pasta de madera blanda. Se usó glucosa como control positivo y no se usó glucosa como control negativo. Se incubaron los cultivos a 30°C con agitación a 180 rpm. Se monitorizó el cultivo para DO600 y cuando alcanzó una DO600 de ~0,8, se analizaron los cultivos a 1 y 3 horas para la producción de isopreno tal como se describe en el ejemplo 1. Los cultivos no se inducen. Todos los cultivos que contienen materia prima añadida producen isopreno equivalente a aquellos del control positivo de glucosa. Se realizaron los experimentos por duplicado y se muestran en la figura 46.
IV. Producción de isopreno a partir de azúcar invertido en E. co//7pTrcKudzuIDIDXS
Se usó una colonia individual a partir de una placa de células recién transformadas de BL21 (XDE3)/pTrcKudzu yIDI DXS (kan) para inocular 5 ml de LB kanamicina (50 |ig/ml). Se incubó el cultivo durante la noche a 25°C con agitación. Al día siguiente, se diluyó el cultivo durante la noche hasta una DO600 de 0,05 en 25 ml de TM3 el 0,2% de YE el 1% de materia prima. La materia prima fue glucosa, glucosa invertida o rastrojo de maíz. Se preparó la materia prima de azúcar invertido (azúcar invertido Danisco) tratando enzimáticamente jarabe de sacarosa. Se preparó rastrojo de maíz AFEX tal como se describe a continuación (parte V). Las células se hicieron crecer a 30°C y se midió la primera muestra cuando los cultivos alcanzaron una DO600 ~0,8-1,0 (0 horas). Los cultivos se analizaron para determinar el crecimiento tal como se mide mediante DO600 y para la producción de isopreno como en el ejemplo 1 a 0, 1 y 3 horas. Se muestran los resultados en la figura 47.
V. Preparación de hidrolisado a partir de rastrojo de maíz pretratado con AFEX
Se obtuvo rastrojo de maíz pretratado con AFEX de Michigan Biotechnology Institute. Las condiciones de pretratamiento fueron el 60% de humedad, carga de amoníaco 1:1 y 90°C durante 30 minutos, luego se secó al aire. El contenido en humedad en el rastrojo de maíz pretratado con AFEX fue del 21,27%. Los contenidos de glucano y xilano en el rastrojo de maíz pretratado con AFEX fueron el 31,7% y el 19,1% (base seca), respectivamente. El proceso de sacarificación fue tal como sigue; se añadieron 20 g de rastrojo de maíz pretratado con AFEX en un matraz de 500 ml con 5 ml de tampón citrato de sodio 1 M pH 4,8, 2,25 ml de Accellerase 1000, 0,1 ml de Grindamyl H121 (producto de xilanasa Danisco de Aspergi//us niger para la industria panadera) y 72,65 ml de agua DI. Se colocó el matraz en un agitador orbital y se incubó a 50°C durante 96 horas. Se tomó una muestra del agitador y se analizó usando HPLC. El hidrolisado contenía 38,5 g/l de glucosa, 21,8 g/l de xilosa y 10,3 g/l de oligómeros de glucosa y/o xilosa.
VI. El efecto de extracto de levadura sobre la producción de isopreno en E. co/i hecha crecer en cultivo semicontinuo
Se realizó fermentación a la escala de 14 l tal como se describió previamente con células de E. co/i que contenían el plásmido pTrcKudzu yIDI DXS descrito anteriormente. Se alimentó extracto de levadura (Bio Springer, Montreal, Quebec, Canadá) a una tasa exponencial. La cantidad total de extracto de levadura suministrado al fermentador varió entre 70-830 g durante la fermentación de 40 horas. Se midió la densidad óptica del caldo de fermentación a una longitud de onda de 550 nm. La densidad óptica final dentro de los fermentadores fue proporcional a la cantidad de extracto de levadura añadido (figura 48A). Se determinó el nivel de isopreno en el gas residual del fermentador tal como se describió previamente. El título de isopreno aumentó durante el transcurso de la fermentación (figura 48B). La cantidad de isopreno producido fue proporcional de manera lineal a la cantidad de extracto de levadura alimentado (figura 48c ).
VII. Producción de isopreno en fermentación de 500 l de pTrcKudzu DXS yIDI
Se usó una fermentación de 500 litros de células de E. co/i con una isopreno sintasa de kudzu, IDI de S. cerevisiae, y ácidos nucleicos de DXS de E. co/i (E. co/i BL21 (XDE3) pTrc Kudzu dxs yidi) para producir isopreno. Los niveles de isopreno variaron entre 50 y 300 mg/l a lo largo de un periodo de tiempo de 15 horas. Basándose en las concentraciones promedio de isopreno, el flujo promedio a través del dispositivo y el grado de avance de isopreno, se calculó la cantidad de isopreno recogida para que fuera de aproximadamente 17 g.
VIII. Producción de isopreno en fermentación de 500 l de E. co/i hecha crecer en cultivo semicontinuo
Composición del medio (por litro de medio de fermentación):
K2HPO4 7,5 g, MgSO4 * 7H2O 2 g, ácido cítrico monohidratado 2 g, citrato de amonio férrico 0,3 g, extracto de levadura 0,5 g, disolución de metales traza modificada 1000X 1 ml. Se añadieron todos los componentes juntos y se disolvieron en diH2O. Se sometió a autoclave esta disolución. Se ajustó el pH a 7,0 con gas amonio (NH3) y c.s.p. volumen. Glucosa 10 g, tiamina * HCl 0,1 g, y antibiótico se añadieron tras esterilización y ajuste del pH.
Disolución de metales traza modificada 1000X:
Ácidos cítricos * H2O 40 g, MnSO4 * H2O 30 g, NaCl 10 g, FeSO4 * 7H2O 1 g, CoCh * 6H2O 1 g, ZnSO * 7H2O 1 g, CuSO4 * 5H2O 100 mg, H3BO3100 mg, NaMoO4 * 2H2O 100 mg. Se disuelve cada componente de uno en uno en H2O DI, pH a 3,0 con HCl/NaOH, después c.s.p. volumen y se esteriliza por filtración con filtro de 0,22 micrómetros. Se realizó la fermentación en un biorreactor de 500 l con células de E. coli que contenían el plásmido pTrcKudzu yIDI DXS. Se llevó a cabo este experimento para monitorizar la formación de isopreno a partir de glucosa y extracto de levadura a la fermentación deseada a pH 7,0 y temperatura 30°C. Se preparó un inóculo de la cepa E. coli tomado de un vial congelado en medio de hidrolizado enzimático de soja-extracto de levadura-glucosa. Después de que el inóculo creciera hasta DO 0,15, medida a 550 nm, se usaron 20 ml para inocular un biorreactor que contenía 2,5 l de medio de hidrolizado enzimático de soja-extracto de levadura-glucosa. Se hizo crecer el biorreactor de 2,5 l a 30°C hasta DO 1,0 y se transfirieron 2,0 l al biorreactor de 500 l.
Se alimentaron extracto de levadura (Bio Springer, Montreal, Quebec, Canadá) y glucosa a tasas exponenciales. La cantidad total de glucosa y extracto de levadura administrados al biorreactor durante la fermentación de 50 horas fue de 181,2 kg y 17,6 kg, respectivamente. La densidad óptica dentro del biorreactor a lo largo del tiempo se muestra en la figura 49A. Se determinó el nivel de isopreno en el gas residual del biorreactor tal como se describió previamente. El título de isopreno aumentó durante el transcurso de la fermentación (figura 49B). La cantidad total de isopreno producido durante la fermentación de 50 horas fue de 55,1 g y el transcurso de tiempo de producción se muestra en la figura 49C.
Ejemplo 8: Producción de isopreno en E. coli que expresa genes de isopreno sintasa de kudzu y de la ruta de ácido mevalónico recombinantes
I. Clonación de la ruta de MVA inferior
La estrategia para clonar la ruta mevalónica inferior fue tal como sigue. Se amplificaron cuatro genes de la ruta de biosíntesis de ácido mevalónico; genes de mevalonato cinasa (MVK), fosfomevalonato cinasa (PMK), difosfomevalonato descarboxilasa (MVD) y difosfato de isopentenilo isomerasa mediante PCR a partir de ADN cromosómico de S. cerevisiae y se clonaron individualmente en el plásmido pCR BluntlI TOPO (Invitrogen). En algunos casos, se amplificó el gen idi a partir de ADN cromosómico de E. coli. Se diseñaron los cebadores de modo que se insertó un RbS de consenso de E. coli (AGGAGGT (SEQ ID NO: 80) o AAGGAGG (SEQ ID NO: 81)) en el extremo 5', 8 pb en el sentido 5' del codón de iniciación y se añadió un sitio PstI en el extremo 3'. Entonces se clonaron los genes uno a uno en el vector pTrcHis2B hasta que se ensambló toda la ruta.
Se obtuvo ADN cromosómico a partir de S288C de S. cerevisiae de ATCC (ATCC 204508D). Se amplificó el gen MVK a partir del cromosoma de S. cerevisiae usando cebadores MVKF (5'-AGGAGGTAAAAAAACATGTCATTACCGTTCTTAACTTCTGC, SEQ ID NO: 21) y MVK-Pstl-R (5'-ATGGCTGCAGGCCTATCGCAAATTAGCTTATGAAGTCCATGGTAAATTCGTG, SEQ ID NO: 22) usando PfuTurbo según las instrucciones del fabricante. Se identificó el producto de tamaño correcto de PCR (1370 pb) mediante electroforesis a través de un E-gel al 1,2% (Invitrogen) y se clonó en pZeroBLUNT TOPO. El plásmido resultante se designó pMVK1. Se digirió el plásmido pMVK1 con endonucleasas de restricción SacI y Taq1 y el fragmento se purificó en gel y se ligó en pTrcHis2B digerido con SacI y BstBI. El plásmido resultante se denominó pTrcMVK1. Se amplificó el segundo gen en la ruta de biosíntesis de ácido mevalónico, PMK, mediante PCR usando cebadores: PstIPMK1 R (5'-GAATTCGCCCTTCTGCAGCTACC, SEQ ID NO: 23) y BsiHKA I-PMK1 F (5'-CGACTGGTGCACCCTTAAGGAGGAAAAAAACATGTCAG, SEQ ID NO: 24). La reacción de PCR se realizó usando polimerasa Pfu Turbo (Stratagene) según las instrucciones del fabricante. Se digirió el producto de tamaño correcto (1387 pb) con PstI y BsiHKI y se ligó en pTrcMVK1 digerido con PstI. El plásmido resultante se denominó pTrcKK. Se clonaron los genes MVD e idi de la misma manera. Se llevó a cabo PCR usando los pares de cebador PstI-MVD 1 R (5'-GTGCTGGAATTCGCCCTTCTGCAGC, SEQ ID NO: 25) y NsiI-MVD 1 F (5'-GTAGATGCATGCAGAATTCGCCCTTAAGGAGG, SEQ ID NO: 26) para amplificar el gen MVD y PstI-YIDI 1 R (5'-CCTTCTGCAGGACGCGTTGTTATAGC, SEQ ID NO: 27) y NsiI-YIDI 1 F (5'-CATCAATGCATCGCCCTTAGGAGGTAAAAAAAAATGAC, SEQ ID NO: 28) para amplificar el gen yIDI. En algunos casos se usó el gen de IPP isomerasa, idi de E. coli. Para amplificar idi a partir de a Dn cromosómico de E. coli, se usó el siguiente conjunto de cebadores: PstI-CIDI 1 R (5'-GTGTGATGGATATCTGCAGAATTCG, SEQ ID NO: 29) y NsiI-CIDI 1 F (5'-CATCAATGCATCGCCCTTAGGAGGTAAAAAAACATG, SEQ ID NO: 30). El ADN molde fue ADN cromosómico aislado mediante procedimientos convencionales a partir de FM5 de E. coli (documentos WO 96/35796 y WO 2004/033646, a los que se hace referencia a cada uno, particularmente con respecto a aislamiento de ácidos nucleicos). Los plásmidos finales se denominaron pKKDIy para el constructo que codifica el gen idi de levadura o pKKDIc para el constructo que codifica el gen idi de E. coli. Se transformaron los plásmidos en huéspedes BL21 de E. coli para análisis posterior. En algunos casos, se clonó la isopreno sintasa de kudzu en pKKDIy produciendo plásmido pKKDIyIS.
También se clonó la ruta de MVA inferior en pTrc que contiene un marcador de resistencia a antibiótico kanamicina. Se digirió el plásmido pTrcKKDIy con endonucleasas de restricción ApaI y PstI, se separó el fragmento de 5930 pb sobre un E-gel de agarosa al 1,2% y se purificó usando el kit de purificación en gel de Qiagen según las instrucciones del fabricante. Se digirió el plásmido pTrcKudzuKan, descrito en el ejemplo 7, con endonucleasas de restricción ApaI y PstI, y se purificó el fragmento de 3338 pb que contiene el vector a partir de un E-gel al 1,2% usando el kit de purificación en gel de Qiagen. Se ligaron fragmento de vector de 3338 pb y el fragmento de la ruta de MVA inferior de 5930 pb usando el kit de ligación Roche Quick. Se transformó la mezcla de ligación en células de E. coli TOP10 y se hicieron crecer transformantes a 37°C durante la noche con selección sobre LA que contenía kanamicina (50 |ig/ml). Se comprobaron los transformantes mediante digestión de enzimas de restricción y uno se congeló como reserva. El plásmido se designó pTrcKanKKDIy.
II. Clonación de un gen de isopreno sintasa de kudzu en pTrcKanKKDIy
Se amplificó el gen de isopreno sintasa de kudzu mediante PCR de pTrcKudzu, descrito en el ejemplo 1, usando los cebadores MCM50 5'-GATCATGCATTCGCCCTTAGGAGGTAAAAAAACATGTGTGCGACCTCTTCTCAATTTACT (SEQ ID NO: 31) y MCM53 5'-CGGTCGACGGATCCCTGCAGTTAGACATACATCAGCTG (SEQ ID NO: 32). Se clonó el fragmento de PCR resultante en pCR2.1 y se transformó en E. coli TOP10. Este fragmento contiene la secuencia codificante para isopreno sintasa de kudzu y una región en el sentido 5' que contiene un RBS de E. coli. Se incubaron transformantes durante la noche a 37°C con selección sobre LA que contenía carbenicilina (50 |ig/ml). Se comprobó la inserción correcta del fragmento mediante secuenciación y esta cepa se designó MCM93.
Se digirió el plásmido de la cepa MCM93 con endonucleasas de restricción NsiI y PstI para liberar un inserto de 1724 pb que contiene el RBS e isopreno sintasa de kudzu. Se separó el fragmento de 1724 pb sobre un E-gel de agarosa al 1,2% y se purificó usando el kit de purificación en gel de Qiagen según las instrucciones del fabricante. Se digirió plásmido pTrcKanKKDIy con la endonucleasa de restricción PstI, se trató con SAP durante 30 minutos a 37°C y se purificó usando el kit de limpieza de PCR de Qiagen. Se ligaron el plásmido e isopreno sintasa de kudzu que codifican para fragmento de ADN usando el kit de ligación Roche Quick. Se transformó la mezcla de ligación en células de E. coli TOP10 y se hicieron crecer transformantes durante la noche a 37°C con selección sobre LA que contenía kanamicina a 50 |ig/ml. Se comprobó el transformante correcto mediante digestión de restricción y el plásmido se designó pTrcKKDyIkISKan (figuras 24 y 25). Este plásmido se transformó en células BL21(XDE3) (Invitrogen).
III. Producción de isopreno a partir de mevalonato en E. coli que expresa la ruta de mevalonato inferior recombinante e isopreno sintasa a partir de kudzu.
Se cultivó la cepa BL21/pTrcKKDyIkISKan en medio MOPS (Neidhardt et al., (1974) J. Bacteriology 119:736-747) se ajustó a pH 7,1 y se complementó con el 0,5% de glucosa y el 0,5% de ácido mevalónico. También se estableció un cultivo de control usando condiciones idénticas pero sin la adición del 0,5% de ácido mevalónico. Se inició el cultivo a partir de un cultivo de siembra durante la noche con un 1% de inóculo y se indujo con IPTG 500 |iM cuando el cultivo había alcanzado una DO600 de 0,3 a 0,5. Los cultivos se hicieron crecer a 30°C con agitación a 250 rpm. La producción de isopreno se analizó 3 horas tras la inducción usando el ensayo de espacio de cabeza descrito en el ejemplo 1. La producción de isopreno máxima fue de 6,67 x 10-4 mol/lcaldo/DO600/h donde lcaldo es el volumen de caldo e incluye tanto el volumen del medio celular como el volumen de las células. El cultivo de control no complementado con ácido mevalónico no produjo isopreno medible.
IV. Clonación de la ruta de MVA superior
Se clonó la ruta biosintética de mevalonato superior, que comprende dos genes que codifican para tres actividades enzimáticas, de Enterococcus faecalis. El gen mvaE codifica para una proteína con las actividades enzimáticas de tanto acetil-CoA acetiltransferasa como 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA (HMG-CoA) reductasa, las proteínas primera y tercera en la ruta, y el gen mvaS codifica para una segunda enzima en la ruta, HMG-CoA sintasa. Se amplificó el gen mvaE a partir de ADN genómico de E. faecalis (ATCC 700802D-5) con un sitio de unión a ribosomas de E. coli y un espaciador delante usando los siguientes cebadores:
CF 07-60 (+) inicio de mvaE w/ RBS codón de iniciación ATG SacI
5'-GAGACATGAGCTCAGGAGGTAAAAAAACATGAAAACAGTAGTTATTATTG (SEQ ID NO: 34)
CF 07-62 (-) fusionar mvaE con mvaS con RBS entre medias
5'-TTTATCAATCCCAATTGTCATGTTTTTTTACCTCCTTTATTGTTTTCTTAAATC (SEQ ID NO: 35)
Se amplificó el gen mvaS a partir de ADN genómico de E. faecalis (ATCC 700802D-5) con un RBS y espaciador de E. coli delante usando los siguientes cebadores:
CF 07-61 (+) fusionar mvaE con mvaS con RBS entre medias
5'-GATTTAAGAAAACAATAAAGGAGGTAAAAAAACATGACAATTGGGATTGATAAA (SEQ ID NO: 36)
CF 07-102 (-) fin de gen mvaS BglII
5'-GACATGACATAGATCTTTAGTTTCGATAAGAACGAACGGT (SEQ ID NO: 37)
Se fusionaron juntos los fragmentos de PCR con PCR usando los siguientes cebadores:
CF 07-60 (+) inicio de mvaE w/ RBS codón de iniciación ATG SacI
5'-GAGACATGAGCTCAGGAGGTAAAAAAACATGAAAACAGTAGTTATTATTG (SEQ ID NO: 34)
CF 07-102 (-) fin de gen mvaS BglII
5'-GACATGACATAGATCTTTAGTTTCGATAAGAACGAACGGT (SEQ ID NO: 37)
Se purificó el fragmento de PCR de fusión usando un kit de Qiagen y se digirió con las enzimas de restricción SacI y BglII. Se purificó en gel este fragmento de ADN digerido usando un kit de Qiagen y se ligó en el vector comercialmente disponible pTrcHis2A, que se había digerido con SacI y BglII y purificado en gel.
Se transformó la mezcla de ligación en células de E. coli Top 10 y se seleccionaron colonias sobre placas de LA+carbenicilina 50 |ig/ml. Se escogió un total de seis colonias y se hicieron crecer durante la noche en LB+carbenicilina 50 |ig/ml y se aislaron plásmidos usando un kit de Qiagen. Se digirieron los plásmidos con SacI y BglII para comprobar insertos y se secuenció un plásmido correcto con los siguientes cebadores:
CF 07-58 (+) inicio de gen mvaE
5'-ATGAAAACAGTAGTTATTATTGATGC (SEQ ID NO: 38)
CF 07-59 (-) fin de gen mvaE
5'-ATGTTATTGTTTTCTTAAATCATTTAAAATAGC (SEQ ID NO: 39)
CF 07-82 (+) inicio de gen mvaS
5'-ATGACAATTGGGATTGATAAAATTAG (SEQ ID NO: 40)
CF 07-83 (-) fin de gen mvaS
5'-TTAGTTTCGATAAGAACGAACGGT (SEQ ID NO: 41)
CF 07-86 (+) Secuencia en mvaE
5'-GAAATAGCCCCATTAGAAGTATC (SEQ ID NO: 42)
CF 07-87 (+) Secuencia en mvaE
5'-TTGCCAATCATATGATTGAAAATC (SEQ ID NO: 43)
CF 07-88 (+) Secuencia en mvaE
5'-GCTATGCTTCATTAGATCCTTATCG (SEQ ID NO: 44)
CF 07-89 (+) Secuencia mvaS
5'-GAAACCTACATCCAATCTTTTGCCC (SEQ ID NO: 45)
Se corrigió el plásmido denominado pTrcHis2AUpperPathway#1 mediante secuenciación y se transformó en la cepa comercialmente disponible BL21 de E. coli. Se realizó la selección sobre LA+ carbenicilina 50 |ig/ml. Se escogieron dos transformantes y se hicieron crecer en LB+ carbenicilina 50 |ig/ml hasta que alcanzaron una DO600 de 1,5. Se congelaron ambas cepas en un vial a -80°C en presencia de glicerol. Las cepas se designaron CF 449 para pTrcHis2AUpperPathway#1 en BL21, aislado n.° 1 y CF 450 para pTrcHis2AUpperPathway#1 en BL21, aislado n.° 2. Se encontró que ambos clones se comportaban de manera idéntica al analizarlos.
V. Clonación de ruta de MVA superior en pCL1920
Se digirió el plásmido pTrcHis2AUpperPathway con la endonucleasa de restricción SspI para liberar un fragmento que contenía terminador pTrc-mvaE-mvaS-(etiqueta His). En este fragmento, no se tradujo la etiqueta his. Se purificó este fragmento de 4,5 kpb de extremo romo a partir de un E-gel al 1,2% usando el kit de purificación en gel de Qiagen. Se preparó un fragmento de 4,2 kpb de extremo romo desfosforilado a partir de pCL1920 digiriendo el vector con la endonucleasa de restricción PvuII, tratando con SAP y purificando en gel a partir de un E-gel al 1,2% usando el kit de purificación en gel de Qiagen. Se ligaron los dos fragmentos usando el kit de ligación Roche Quick y se transformaron en células TOP10 químicamente competentes. Se seleccionaron transformantes sobre LA que contenía espectinomicina (50 pg/ml). Se identificó una colonia correcta mediante examen para determinar la presencia del inserto mediante PCR. Se designó el plásmido pCL PtrcUpperPathway (figuras 26 y 27A-27D).
VI. Cepas que expresan las rutas de ácido mevalónico superior e inferior combinadas
Para obtener una cepa con una ruta de ácido mevalónico completa más isopreno sintasa de kudzu, se transformaron tanto plásmidos pTrcKKDyIkISkan como pCLpTrcUpperPathway en células competentes BL21(XDE3) (Invitrogen) y se seleccionaron transformantes sobre LA que contenía kanamicina (50 pg/ml) y espectinomicina (50 pg/ml). Se comprobaron los transformantes mediante preparación de plásmido para garantizar que ambos plásmidos se retuvieron en el huésped. La cepa se designó MCM127.
VII. Producción de ácido mevalónico a partir de glucosa en E. co//7pUpperpathway
Se inoculan colonias individuales de BL21/pTrcHis2A-mvaE/mvaS o FM5/p pTrcHis2A-mvaE/mvaS en LB carbenicilina (100 pg/ml) y se hacen crecer durante la noche a 37°C con agitación a 200 rpm. Estos cultivos se diluyeron en 50 ml de medio en matraces con deflectores de 250 ml hasta una DO600 de 0,1. El medio era TM3 1 o 2% de glucosa carbenicilina (100 ug/ml) o TM3 1% de glucosa aceite de soja hidrolizada carbenicilina (100 ug/ml) o TM3 biomasa (bagazo, rastrojo de maíz o pasto varilla preparados). Se hicieron crecer los cultivos a 30°C con agitación a 200 rpm durante aproximadamente 2-3 horas hasta que se alcanzó una DO600 de 0,4. En este momento, se indujo la expresión del constructo mvaE mvaS mediante la adición de IPTG (400 pM). Se incubaron los cultivos durante 20 ó 40 horas adicionales con muestras tomadas a intervalos de 2 horas a 6 horas tras la inducción y después a las 24, 36 y 48 horas según sea necesario. Se realizó muestreo retirando 1 ml de cultivo, midiendo la DO600, sedimentando las células en una microcentrífuga, retirando el sobrenadante y analizándolo para determinar ácido mevalónico.
Una fermentación de 14 litros de células de E. co/i con ácidos nucleicos que codifican para polipéptidos de AA-CoA tiolasa, HMGCoA sintasa y HMG-CoA reductasa de Enterococcus faeca/is produjo 22 gramos de ácido mevalónico con medio TM3 y el 2% de glucosa como medio celular. Un matraz de agitación de estas células produjo 2-4 gramos de ácido mevalónico por litro con medio LB y el 1% de glucosa como medio de cultivo celular. La producción de ácido mevalónico en estas cepas indicó que la ruta de MVA era funcional en E. co/i.
VIII. Producción de isopreno a partir de BL21 de E. co/i que contiene la ruta de MVA superior e inferior más isopreno sintasa de kudzu.
Se crearon las siguientes cepas mediante transformación en diversas combinaciones de plásmidos que contenían la ruta de MVA superior e inferior y el gen de isopreno sintasa de kudzu tal como se describió anteriormente y los plásmidos que contenían los genes de idi, dxs, y dxr e isopreno sintasa descritos en el ejemplo 7. Las células huésped usadas fueron BL21(XDE3) químicamente competentes y se realizaron las transformaciones mediante procedimientos convencionales. Se seleccionaron transformantes sobre agar L que contenía kanamicina (50 pg/ml) o kanamicina más espectinomicina (ambas a una concentración de 50 pg/ml). Se hicieron crecer las placas a 37°C. Las cepas resultantes se designaron tal como sigue:
Hechas crecer en kanamicina más espectinomicina (50 pg/ml cada una)
MCM127 - pCL MVA superior pTrcKKDyIkIS (kan) en BL21(XDE3)
MCM131 - pCL1920 pTrcKKDyIkIS (kan) en BL21(XDE3)
MCM125 - pCL MVA superior pTrcHis2B (kan) en BL21(XDE3)
Hechas crecer en kanamicina (50 pg/ml)
MCM64 - pTrcKudzu yIDI DXS (kan) en BL21(XDE3)
MCM50 - pTrcKudzu (kan) en BL21(XDE3)
MCM123 - pTrcKudzu yIDI DXS DXR (kan) en BL21(XDE3)
Se sembraron en banda las cepas anteriores de reservas de congelador a LA antibiótico apropiado y se hicieron crecer durante la noche a 37°C. Se usó una colonia individual de cada placa para inocular matraces de agitación (25 ml de LB el antibiótico apropiado). Se incubaron los matraces a 22°C durante la noche con agitación a 200 rpm. A la mañana siguiente, se transfirieron los matraces a un incubador a 37°C y se hicieron crecer durante 4,5 horas adicionales con agitación a 200 rpm. Se centrifugaron los cultivos de 25 ml para sedimentar las células y se resuspendieron las células en 5 ml de LB el antibiótico apropiado. Entonces se diluyeron los cultivos en 25 ml de LB+1% de glucosa el antibiótico apropiado hasta una DO600 de 0,1. Se establecieron dos matraces para cada cepa, un conjunto para inducción con IPTG (800 |iM) y el segundo conjunto no se indujo. Los cultivos se incubaron a 37°C con agitación a 250 rpm. Un conjunto de los cultivos se indujo tras 1,50 horas (inmediatamente tras el punto de tiempo de muestreo 1). En cada punto de tiempo de muestreo, se midió la DO600 y la cantidad de isopreno se determinó tal como se describe en el ejemplo 1. Los resultados se presentan en la tabla 3. La cantidad de isopreno elaborado se presenta como la cantidad a la producción máxima para la cepa particular.
IX. Análisis de ácido mevalónico
Tabla 3. Producción de isopreno en cepas de E. coli
Figure imgf000058_0001
ND: no detectado
Traza: pico presente pero no integrable.
Se suministró mevalonolactona (1,0 g, 7,7 mmol) (n.° de CAS 503-48-0) de Sigma-Aldrich (WI, EE.UU.) como un jarabe que se disolvía en agua (7,7 ml) y se trató con hidróxido de potasio (7,7 mmol) con el fin de generar la sal de potasio de ácido mevalónico. La conversión a ácido mevalónico se confirmó mediante análisis de 1H RMN. Se prepararon muestras para análisis de HPLC mediante centrifugación a 14.000 rpm durante 5 minutos para retirar células, seguido por la adición de una alícuota de 300 |il de sobrenadante a 900 |il de H2O. Entonces se añadió ácido perclórico (36 |il de una disolución al 70%) seguido por mezclado y enfriamiento sobre hielo durante 5 minutos. Entonces se centrifugaron las muestras de nuevo (14.000 rpm durante 5 min) y se transfirió el sobrenadante a HPLC. Se prepararon patrones de ácido mevalónico (20, 10, 5, 1 y 0,5 g/l) de la misma manera. Se realizó análisis de ácido mevalónico (20 ul de volumen de inyección) mediante HPLC usando una columna BioRad Aminex 87-H+ (300 mm por 7,0 mm) eluida con ácido sulfúrico 5 mM a 0,6 ml/min con detección de índice de refracción (RI). En estas condiciones eluyó ácido mevalónico como la forma de lactona a los 18,5 minutos.
X. Producción de isopreno a partir de BL21 de E. coli que contiene la ruta de MVA superior más isopreno sintasa de kudzu
Se usó una fermentación a escala de 15 l de E. coli que expresa polipéptidos de la ruta de ácido mevalónico e isopreno sintasa de kudzu para producir isopreno a partir de células en cultivo semicontinuo. Este experimento demuestra que hacer crecer células en condiciones limitantes de glucosa dio como resultado la producción de 2,2 g/l de isopreno.
Composición del medio (por litro de medio de fermentación):
Se generó el medio usando los siguientes componentes por litro de medio de fermentación: K2HPO47,5 g, MgSO4 * 7H2O 2 g, ácido cítrico monohidratado 2 g, citrato de amonio férrico 0,3 g, extracto de levadura 0,5 g, y disolución de metales traza modificada 1000X 1 ml. Se añadieron todos los componentes juntos y se disolvieron en diH2O. Se sometió a autoclave esta disolución. Se ajustó el pH a 7,0 con hidróxido de amonio (30%) y c.s.p. volumen. Se añadieron glucosa 10 g, tiamina * HCl 0,1 g, y antibióticos tras esterilización y ajuste del pH.
Disolución de metales traza modificada 1000X:
Se generó la disolución de metales traza modificada 1000X usando los siguientes componentes: ácidos cítricos * H2O 40 g, MnSO4 * H2O 30 g, NaCI 10 g, FeSO4 * 7H2O 1 g, C0CI2 * 6H2O 1 g, ZnSO * 7H2O 1 g, CUSO4 * 5H2O 100 mg, H3BO3100 mg, y NaMoO4 * 2H2O 100 mg. Se disolvió cada componente de uno en uno en diH2O, pH a 3,0 con HCl/NaOH, después c.s.p. volumen y se esterilizó por filtración con un filtro de 0,22 micrómetros.
Se realizó la fermentación en un biorreactor de 15 l con células de E. coli BL21 (DE3) que contenían los plásmidos pCL PtrcUpperPathway (figura 26) y pTrcKKDyIkIS. Se llevó a cabo este experimento para monitorizar la formación de isopreno a partir de glucosa a la fermentación deseada a pH 7,0 y temperatura 30°C. Se sembró en banda un inóculo de cepa de E. coli tomado de un vial congelado sobre una placa de agar con caldo LB (con antibióticos) y se incubó a 37°C. Se inoculó una colonia individual en medio de hidrolizado enzimático de soja-extracto de levaduraglucosa. Después de que el inóculo creciera hasta DO 1,0 cuando se midió a 550 nm, se usaron 500 ml para inocular un biorreactor de 5 l.
Se alimentó glucosa a una tasa exponencial hasta que las células alcanzaron la fase estacionaria. Después de este tiempo la alimentación de glucosa disminuyó para cumplir las demandas metabólicas. La cantidad total de glucosa suministrada al biorreactor durante la fermentación de 54 horas fue de 3,7 kg. Se logró inducción añadiendo isopropil-beta-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG). La concentración de IPTG se llevó a 25 uM cuando la densidad óptica a 550 nm (DO550) alcanzó un valor de 10. Se elevó la concentración de IPTG hasta 50 uM cuando la DO550 alcanzó 190. Se elevó la concentración de IPTG hasta 100 uM a las 38 horas de fermentación. Se muestra el perfil de DO550 dentro del biorreactor a lo largo del tiempo en la figura 54. Se determinó el nivel de isopreno en el gas residual del biorreactor tal como se describió en el presente documento. El título de isopreno aumentó durante el transcurso de la fermentación hasta un valor final de 2,2 g/l (figura 55). La cantidad total de isopreno producido durante la fermentación de 54 horas fue de 15,9 g, y el transcurso de tiempo de producción se muestra en la figura 56.
XI. Fermentación de isopreno a partir de E. coli que expresa genes de la ruta de ácido mevalónico y hecha crecer en cultivo semicontinuo a la escala de 15 l
Se usó una fermentación a escala de 15 l de E. coli que expresa polipéptidos de la ruta de ácido mevalónico e isopreno sintasa de kudzu para producir isopreno a partir de células en cultivo semicontinuo. Este experimento demuestra que hacer crecer células en condiciones limitantes de glucosa dio como resultado la producción de 3,0 g/l de isopreno.
Composición del medio (por litro de medio de fermentación):
Se generó el medio usando los siguientes componentes por litro de medio de fermentación: K2HPO47,5 g, MgSO4 * 7H2O 2 g, ácido cítrico monohidratado 2 g, citrato de amonio férrico 0,3 g, extracto de levadura 0,5 g, y disolución de metales traza modificada 1000X 1 ml. Se añadieron todos los componentes juntos y se disolvieron en diH2O. Se sometió a autoclave esta disolución. Se ajustó el pH a 7,0 con hidróxido de amonio (30%) y c.s.p. volumen. Se añadieron glucosa 10 g, tiamina * HCl 0,1 g, y antibióticos tras esterilización y ajuste del pH.
Disolución de metales traza modificada 1000X:
Se generó la disolución de metales traza modificada 1000X usando los siguientes componentes: ácidos cítricos * H2O 40 g, MnSO4 * H2O 30 g, NaCl 10 g, FeSO4 * 7H2O 1 g, CoCh * 6H2O 1 g, ZnSO * 7H2O 1 g, CuSO4 * 5H2O 100 mg, H3BO3100 mg, y NaMoO4 * 2H2O 100 mg. Se disolvió cada componente de uno en uno en diH2O, pH a 3,0 con HCl/NaOH, después c.s.p. volumen y se esterilizó por filtración con un filtro de 0,22 micrómetros.
Se realizó fermentación en un biorreactor de 15 l con células BL21 (DE3) de E. coli que contienen los plásmidos pCL PtrcUpperMVA y pTrc KKDyIkIS. Se llevó a cabo este experimento para monitorizar la formación de isopreno a partir de glucosa a la fermentación deseada a pH 7,0 y temperatura 30°C. Se sembró en banda un inóculo de cepa de E. coli tomado de un vial congelado sobre una placa de agar con caldo LB (con antibióticos) y se incubó a 37°C. Se inoculó una colonia individual en medio de triptona-extracto de levadura. Después de que el inóculo creciera hasta DO 1,0, medida a 550 nm, se usaron 500 ml para inocular un biorreactor de 5 l.
Se alimentó glucosa a una tasa exponencial hasta que las células alcanzaron la fase estacionaria. Después de este tiempo, la alimentación de glucosa se disminuyó para cumplir las demandas metabólicas. La cantidad total de glucosa suministrada al biorreactor durante la fermentación de 59 horas fue de 2,2 kg. Se logró inducción añadiendo IPTG. Se llevó la concentración de IPTG a 25 uM cuando la densidad óptica a 550 nm (DO550) alcanzó un valor de 10. Se elevó la concentración de IPTG hasta 50 uM cuando la DO550 alcanzó 190. Se muestra el perfil de DO550 dentro del biorreactor a lo largo del tiempo en la figura 93. El nivel de isopreno en el gas residual del biorreactor se determinó tal como se describió en el presente documento. El título de isopreno aumentó en el transcurso de la fermentación hasta un valor final de 3,0 g/l (figura 94). La cantidad total de isopreno producido durante la fermentación de 59 horas fue de 22,8 g, y el transcurso de tiempo de producción se muestra en la figura 95. El rendimiento molar de carbono utilizado que entró en la producción de isopreno durante la fermentación fue del 2,2%. El rendimiento de porcentaje en peso de isopreno a partir de glucosa fue del 1,0%.
XII. Fermentación de isopreno a partir de E. coli que expresa genes de la ruta de ácido mevalónico y hecha crecer en cultivo semicontinuo a la escala de 15 l
Se usó una fermentación a escala de 15 l de E. coli que expresa polipéptidos de la ruta de ácido mevalónico, isopreno sintasa de Pueraria lobata e isopreno sintasa de kudzu para producir isopreno a partir de células en cultivo semicontinuo. Este experimento demuestra que hacer crecer células en condiciones limitantes de glucosa dio como resultado la producción de 3,3 g/l de isopreno.
i) Construcción de pCLPtrcUpperPathwayHGS2
Se amplificó por PCR el gen que codifica para isopreno sintasa de Pueraria lobata usando los cebadores NsiI-RBS-HGS F (CTTGATGCATCCTGCATTCGCCCTTAGGAGG, SEQ ID NO: 88) y pTrcR (CCAGGCAAATTCTGTTTTATCAG, SEQ ID NO: 89), y pTrcKKDyIkIS como molde. Se digirió por restricción el producto de PCR así obtenido con NsiI y PstI y se purificó en gel. Se digirió por restricción el plásmido pCL PtrcUpperPathway con PstI y se desfosforiló usando fostasa alcalina rAPid (Roche) según las instrucciones del fabricante.
Se ligaron juntos estos fragmentos de ADN y la reacción de ligación se transformó en células de E. coli Top10 químicamente competentes (Invitrogen), sembradas en placa sobre agar L que contenía espectinomicina (50 ug/ml) y se incubó durante la noche a 37°C. Se preparó a Dn plasmídico a partir de 6 clones usando el kit de mini­ preparación Qiaquick Spin. El ADN plasmídico se digirió con enzimas de restricción EcoRV y MluI para identificar un clon en el que el inserto tenía la orientación correcta (es decir, el gen orientado de la misma manera que el promotor pTrc).
Se designó el plásmido correcto resultante pCLPtrcUpperPathwayHGS2. Este plásmido se sometió a ensayo usando el ensayo de espacio de cabeza descrito en el presente documento y se encontró que producía isopreno en E. coli Top10, validando por tanto la funcionalidad del gen. El plásmido se transformó en BL21(LDE3) que contenía pTrcKKDyIkIS para proporcionar la cepa BL21/pCLPtrcUpperPathwayHGS2-pTrcKKDyIkIS. Esta cepa tiene una copia extra de la isopreno sintasa en comparación con la cepa BL21/pCL PtrcUpperMVA y pTrc KKDyIkIS (ejemplo 8, parte XI). Esta cepa también tenía expresión y actividad de HMGs aumentadas en comparación con la cepa BL2l/pCL PtrcUpperMVA y pTrc KKDyIkIS usada en el ejemplo 8, parte XI.
ii) Fermentación de isopreno a partir de E. coli que expresa pCLPtrcUpperPathwayHGS2-pTrcKKDyIkIS y hecha crecer en cultivo semicontinuo a la escala de 15 l
Composición del medio (por litro de medio de fermentación):
Se generó el medio usando los siguientes componentes por litro de medio de fermentación: K2HPO47,5 g, MgSO4 * 7H2O 2 g, ácido cítrico monohidratado 2 g, citrato de amonio férrico 0,3 g, extracto de levadura 0,5 g, y disolución de metales traza modificada 1000X 1 ml. Se añadieron todos los componentes juntos y se disolvieron en diH2O. Se sometió a autoclave esta disolución. Se ajustó el pH a 7,0 con hidróxido de amonio (30%) y c.s.p. volumen. Se añadieron glucosa 10 g, tiamina * HCl 0,1 g y antibióticos tras esterilización y ajuste del pH.
Disolución de metales traza modificada 1000X:
Se generó la disolución de metales traza modificada 1000X usando los siguientes componentes: ácidos cítricos * H2O 40 g, MnSO4 * H2O 30 g, NaCl 10 g, FeSO4 * 7H2O 1 g, CoCh * 6H2O 1 g, ZnSO * 7H2O 1 g, CuSO4 * 5H2O 100 mg, H3BO3100 mg, y NaMoO4 * 2H2O 100 mg. Se disuelve cada componente de uno en uno en H2O Di, pH a 3,0 con HCl/NaOH, después c.s.p. volumen y se esteriliza por filtración con filtro de 0,22 micrómetros.
Se realizó la fermentación en un biorreactor de 15 l con células BL21 (DE3) de E. coli que contenían los plásmidos pCLPtrcUpperPathwayHGS2 y pTrc KKDyIkIS. Se llevó a cabo este experimento para monitorizar la formación de isopreno a partir de glucosa a la fermentación deseada a pH 7,0 y temperatura 30°C. Se sembró en banda un inóculo de cepa de E. coli tomado de un vial congelado sobre una placa de agar con caldo LB (con antibióticos) y se incubó a 37°C. Se inoculó una colonia individual en medio de triptona-extracto de levadura. Después de que el inóculo creciera hasta DO 1,0 medida a 550 nm, se usaron 500 ml para inocular un biorreactor de 5 l.
Se alimentó glucosa a una tasa exponencial hasta que las células alcanzaron la fase estacionaria. Después de este tiempo la alimentación de glucosa se disminuyó para cumplir las demandas metabólicas. La cantidad total de glucosa suministrada al biorreactor durante la fermentación de 58 horas fue de 2,1 kg. Se logró inducción añadiendo IPTG. Se llevó la concentración de IPTG a 25 uM cuando la densidad óptica a 550 nm (DO550) alcanzó un valor de 9. Se elevó la concentración de IPTG hasta 50 uM cuando la DO550 alcanzó 170. El perfil de DO550 dentro del biorreactor a lo largo del tiempo se muestra en la figura 104. Se determinó el nivel de isopreno en el gas residual del biorreactor tal como se describió en el presente documento. El título de isopreno aumentó durante el transcurso de la fermentación hasta un valor final de 3,3 g/l (figura 105). La cantidad total de isopreno producido durante la fermentación de 58 horas fue de 24,5 g y el transcurso de tiempo de producción se muestra en la figura 106. El rendimiento molar de carbono utilizado que entró en la producción de isopreno durante la fermentación fue del 2,5%. El rendimiento de porcentaje en peso de isopreno a partir de glucosa fue del 1,2%. El análisis mostró que la actividad de la isopreno sintasa aumentó en aproximadamente 3-4 veces en comparación con BL21 que expresaba los plásmidos CL PtrcUpperMVA y pTrc KKDyIkIS (datos no mostrados).
XIII. Integración cromosómica de la ruta de mevalonato inferior en E. coli.
Se integró un operón sintético que contenía mevalonato cinasa, mevalonato fosfato cinasa, mevalonato pirofosfato descarboxilasa y la IPP isomerasa en el cromosoma de E. coli. Si se desea, puede alterarse la expresión integrando diferentes promotores 5' del operón.
La tabla 9 enumera cebadores usados para este experimento.
Tabla 9. Cebadores
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i) Construcción de vector diana
Se seleccionó el sitio attTn7 para integración. Se amplificaron regiones de homología en el sentido 5' (attTn7 arriba) (cebadores MCM78 y MCM79) y en el sentido 3' (attTn7 abajo) (cebadores MCM88 y MCM89) mediante PCR a partir de células MG1655. Se desnaturalizó una reacción de 50 ul con 1 ul de cebadores 10 uM, 3 ul de ddH2O, 45 ul de Invitrogen Platinum PCR Supermix High Fidelity, y una colonia raspada de MG1655 durante 2:00 a 94°C, se sometió a ciclo 25 veces (2:00 a 94°C, 0:30 a 50°C y 1:00 a 68°C), se amplió durante 7:00 a 72°C, y se enfrió hasta 4°C. Se clonó este ADN resultante en pCR2.1 (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante, dando como resultado plásmidos MCM278 (attTn7 arriba) y m Cm 252 (attTn7 abajo). Se clonó el fragmento ApaIPvuI de 832 pb digerido y purificado en gel a partir de MCM252 en plásmido pR6K digerido por ApaI-PvuI y purificado en gel, creando el plásmido MCM276. Se clonó el fragmento de PstI-NotI de 825 pb digerido y purificado en gel a partir de MCM278 en MCM276 digerido por PstI-NotI y purificado en gel, creando plásmido MCM281.
ii) Clonación de la ruta inferior y promotor
Se amplificaron los genes MVK-PMK-MVD-IDI a partir de pTrcKKDyIkIS con los cebadores MCM104 y MCM105 usando el sistema de PCR Roche Expand Long según las instrucciones del fabricante. Este producto se digirió con NotI y ApaI y se clonó en MCM281 que se había digerido con NotI y ApaI y purificado en gel. Se usaron los cebadores MCM120 y MCM127 para amplificar un casete de CMR a partir del ADn molde GeneBridges FRT-gb2-Cm-FRT usando Stratagene Pfu Ultra II. Se usó un programa de PCR de desnaturalización a 95°C durante 4:00, 5 ciclos de 95°C durante 0:20, 55°C durante 0:20, 72°C durante 2:00, 25 ciclos de 95°C durante 0:20, 58°C durante 0:20, 72°C durante 2:00, 72°C durante 10:00, y se enfrió después hasta 4°C con cuatro reacciones de PCR de 50 ul que contenían 1 ul ~10 ng/ul de molde, 1 ul de cada cebador, 1,25 ul de dNTP 10 mM, 5 ul de tampón 10x, 1 ul de enzima y 39,75 ul de ddH2O. Se agruparon las reacciones, se purificaron sobre una columna de limpieza de PCR de Qiagen, y se usaron para electroporar células Pir1 lavadas con agua que contenían el plásmido MCM296. Se llevó a cabo electroporación en cubetas de 2 mM a 2,5V y 200 ohmios. Se recuperaron reacciones de electroporación en LB durante 3 h a 30°C. Se seleccionó el transformante MCM330 sobre LA con CMP5, Kan50 (figuras 107 y 108A-108C).
iii) Integración en cromosoma de E. coli
Se digirió ADN minipreparado (kit Qiaquick Spin) a partir de MCM330 con SnaBI y se usó para electroporar BL21(DE3) (Novagen) o MG1655 que contienen el plásmido pRedET Carb de GeneBridges. Se hicieron crecer las células a 30°C hasta ~ DO1, entonces se indujeron con L-arabinosa al 0,4% a 37°C durante 1,5 horas. Estas células se lavaron tres veces en ddH2O a 4°C antes de la electroporación con 2 ul de ADN. Se seleccionaron los integrantes sobre agar L que contenía cloranfenicol (5 ug/ml) y se confirmó posteriormente que no crecían sobre agar L kanamicina (50 ug/ml). Se congelaron el integrante de BL21 MCM331 y el integrante de MG1655 MCM333.
iv) Construcción de pET24D-Kudzu que codifica para isopreno sintasa de kudzu
Se subclonó el gen de isopreno sintasa de kudzu en el vector pET24d (Novagen) a partir del vector pCR2.1 (Invitrogen). En particular, se amplificó el gen de isopreno sintasa de kudzu a partir del ADN molde pTrcKudzu usando los cebadores MCM50 5'-GATCATGCAT TCGCCCTTAG GAGGTAAAAA AACATGTGTG CGACCTCTTC TCAATTTACT (SEQ ID NO: 99) y MCM535'-CGGTCGACGG ATCCCTGCAG TTAGACATAC ATCAGCTG (SEQ ID NO: 100). Se llevaron a cabo reacciones de PCR usando ADN polimerasa Taq (Invitrogen), y se clonó el producto de PCR resultante en vector de clonación pCR2.1-TOPO TA (Invitrogen), y se transformó en células de E. coli Top10 químicamente competentes (Invitrogen). Se sembraron en placa los transformantes sobre agar L que contenía carbenicilina (50 |ig/ml) y se incubaron durante la noche a 37°C. Se inocularon cinco ml de cultivos de caldo Luria que contenían carbenicilina 50 |ig/ml con transformantes individuales y se hicieron crecer durante la noche a 37°C. Se examinaron cinco colonias para determinar el inserto correcto mediante secuenciación de ADN plasmídico aislado de 1 ml de cultivo líquido (caldo Luria) y purificado usando el kit de mini-preparación QIAprep Spin (Qiagen). El plásmido resultante, designado MCM93, contiene la secuencia codificante de isopreno sintasa de kudzu en una estructura principal pCR2.1.
Se retiró la secuencia codificante de kudzu mediante digestión de endonucleasa de restricción con PciI y BamH1 (Roche) y se purificó en gel usando el kit de extracción en gel QIAquick (Qiagen). Se digirió el ADN de vector pET24d con NcoI y BamHI (Roche), se trató con fosfatasa alcalina de gamba (Roche), y se purificó usando el kit de mini-preparación QIAprep Spin (Qiagen). Se ligó el fragmento de isopreno sintasa de kudzu con el pET24d digerido por NcoI/BamH1 usando el kit de ligación de ADN rápido (Roche) a una razón de fragmento con respecto a vector 5:1 en un volumen total de 20 |il. Se transformó una porción de la mezcla de ligación (5 |il) en células de E. coli Top 10 químicamente competentes y se sembraron sobre agar L que contenía kanamicina (50 |ig/ml). El transformante correcto se confirmó mediante secuenciación y se transformó en células BL21(XDE3)pLysS químicamente competentes (Novagen). Se seleccionó una colonia individual después de crecimiento durante la noche a 37°C sobre agar L que contenía kanamicina (50 |ig/ml). Un mapa del plásmido resultante designado pET24D-kudzu se muestra en la figura 109. La secuencia de pET24D-Kudzu (SEQ ID NO: 101) se muestra en las figuras 110A y 110B. Se confirmó la actividad isopreno sintasa usando un ensayo de espacio de cabeza.
v) Cepas de producción
Se cotransformaron cepas MCM331 y MCM333 con los plásmidos pCLPtrcupperpathway y o bien pTrcKudzu o bien pETKudzu, dando como resultado las cepas mostradas en la tabla 10.
Tabla 10. Cepas de producción
Figure imgf000062_0001
vi) Fermentación de isopreno a partir de E. coli que expresa genes de la ruta de ácido mevalónico y hecha crecer en cultivo semicontinuo a la escala de 15 l.
Composición del medio (por litro de medio de fermentación):
Se generó el medio usando los siguientes componentes por litro de medio de fermentación: K2HPO47,5 g, MgSO4 * 7H2O 2 g, ácido cítrico monohidratado 2 g, citrato de amonio férrico 0,3 g, extracto de levadura 0,5 g, y disolución de metales traza modificada 1000X 1 ml. Se añadieron todos los componentes juntos y se disolvieron en diH2O. Se sometió a autoclave esta disolución. Se ajustó el pH a 7,0 con hidróxido de amonio (30%) y c.s.p. volumen. Se añadieron glucosa 10 g, tiamina * HCl 0,1 g y antibióticos tras esterilización y ajuste del pH.
Disolución de metales traza modificada 1000X:
Se generó la disolución de metales traza modificada 1000X usando los siguientes componentes: ácidos cítricos * H2O 40 g, MnSO4 * H2O 30 g, NaCl 10 g, FeSO4 * 7H2O 1 g, CoCh * 6H2O 1 g, ZnSO * 7H2O 1 g, CuSO4 * 5H2O 100 mg, H3BO3100 mg, y NaMoO4 * 2H2O 100 mg. Se disuelve cada componente de uno en uno en Di H2O, pH a 3,0 con HCl/NaOH, después c.s.p. volumen y se esteriliza por filtración con un filtro de 0,22 micrómetros.
Se realizó la fermentación en un biorreactor de 15 l con células BL21 (DE3) de E. coli que contenían la ruta de MVA inferior integrada gi1.2 descrita anteriormente y los plásmidos pCL PtrcUpperMVA y pTrcKudzu. Se llevó a cabo este experimento para monitorizar la formación de isopreno a partir de glucosa a la fermentación deseada a pH 7,0 y temperatura 30°C. Se sembró en banda un inóculo de cepa de E. coli tomado de un vial congelado sobre una placa de agar con caldo LB (con antibióticos) y se incubó a 37°C. Se inoculó una colonia individual en medio de triptonaextracto de levadura. Después de que el inóculo creciera hasta DO 1,0, medida a 550 nm, se usaron 500 ml para inocular un biorreactor de 5 l.
Se alimentó glucosa a una tasa exponencial hasta que las células alcanzaron la fase estacionaria. Después de este tiempo, la alimentación de glucosa se disminuyó para cumplir las demandas metabólicas. La cantidad total de glucosa suministrada al biorreactor durante la fermentación de 57 horas fue de 3,9 kg. Se logró inducción añadiendo IPTG. Se llevó la concentración de IPTG a 100 uM cuando la tasa de evolución de dióxido de carbono alcanzó 100mmol/L/h. El perfil de DO550 dentro del biorreactor a lo largo del tiempo se muestra en la figura 111A. Se determinó el nivel de isopreno en el gas residual del biorreactor tal como se describió en el presente documento. El título de isopreno aumentó durante el transcurso de la fermentación hasta un valor final de 1,6 g/l (figura 111B). La productividad específica de isopreno durante el transcurso de la fermentación se muestra en la figura 111C y tuvo un máximo a 1,2 mg/DO/h. La cantidad total de isopreno producido durante la fermentación de 57 horas fue de 16,2 g. El rendimiento molar de carbono utilizado que entró en la producción de isopreno durante fermentación fue del 0,9%. El rendimiento de porcentaje en peso de isopreno a partir de glucosa fue del 0,4%.
XIV. Producción de isopreno a partir de BL21 de E. coli que contiene la isopreno sintasa de kudzu usando glicerol como fuente de carbono
Se usó una fermentación a escala de 15 l de E. coli que expresa isopreno sintasa de kudzu para producir isopreno a partir de células alimentadas con glicerol en cultivo semicontinuo. Este experimento demuestra que hacer crecer células en presencia de glicerol (sin glucosa) dio como resultado la producción de 2,2 mg/l de isopreno.
Composición del medio (por litro de medio de fermentación):
Se generó el medio se usando los siguientes componentes por litro de medio de fermentación: K2HPO4 7,5 g, MgSO4 * 7H2O 2 g, ácido cítrico monohidratado 2 g, citrato de amonio férrico 0,3 g, y disolución de metales traza modificada 1000X 1 ml. Se añadieron todos los componentes juntos y se disolvieron en diH2O. Se sometió a autoclave esta disolución. El pH se ajustó a 7,0 con hidróxido de amonio (30%) y c.s.p. volumen. Glicerol 5,1 g, tiamina * HCl 0,1 g, y antibióticos se añadieron tras esterilización y ajuste del pH.
Disolución de metales traza modificada 1000X:
Se generó el medio usando los siguientes componentes por litro de medio de fermentación: ácidos cítricos * H2O 40 g, MnSO4 * H2O 30 g, NaCl 10 g, FeSO4 * 7H2O 1 g, CoCh * 6H2O 1 g, ZnSO * 7H2O 1 g, CuSO4 * 5H2O 100 mg, H3BO3 100 mg, y NaMoO4 * 2H2O 100 mg. Se disolvió cada componente de uno en uno en diH2O, pH a 3,0 con HCl/NaOH, después c.s.p. volumen y se esterilizó por filtración con un filtro de 0,22 micrómetros.
Se realizó la fermentación en un biorreactor de 15 l con células BL21 (DE3) de E. coli que contenían el plásmido pTrcKudzu. Se llevó a cabo este experimento para monitorizar la formación de isopreno a partir de glicerol a la fermentación deseada a pH 7,0 y temperatura 35°C. Se sembró en banda un inóculo de cepa de E. coli tomado de un vial congelado sobre una placa de agar con caldo LA (con antibióticos) y se incubó a 37°C. Se inoculó una colonia individual en medio de hidrolizado enzimático de soja-extracto de levadura-glucosa y se hizo crecer a 35°C. Después de que el inóculo creciera hasta DO 1,0, medida a 550 nm, se usaron 600 ml para inocular un biorreactor de 7,5 l.
Se alimentó glicerol a una tasa exponencial hasta que las células alcanzaron una densidad óptica a 550 nm (DO550) de 153. La cantidad total de glicerol suministrada al biorreactor durante la fermentación de 36 horas fue de 1,7 kg. Aparte de la glucosa en el inóculo, no se añadió glucosa al biorreactor. Se logró inducción añadiendo IPTG. Se llevó la concentración de IPTG a 20 uM cuando la DO550 alcanzó un valor de 50. El perfil de DO550 dentro del biorreactor a lo largo del tiempo se muestra en la figura 57. Se determinó el nivel de isopreno en el gas residual del biorreactor tal como se describió en el presente documento. El título de isopreno aumentó durante el transcurso de la fermentación hasta un valor final de 2,2 mg/l (figura 58). La cantidad total de isopreno producido durante la fermentación de 54 horas fue de 20,9 mg, y el transcurso de tiempo de producción se muestra en la figura 59.
XV. Fermentación de isopreno a partir de E. coli que expresa genes de la ruta de ácido mevalónico y hecha crecer en cultivo semicontinuo a la escala de 15 l usando azúcar invertido como fuente de carbono
Se usó una fermentación a escala de 15 l de E. coli que expresa polipéptidos de la ruta de ácido mevalónico e isopreno sintasa de kudzu para producir isopreno a partir de células alimentadas con azúcar invertido en cultivo semicontinuo. Este experimento demuestra que hacer crecer células en presencia de azúcar invertido dio como resultado la producción de 2,4 g/l de isopreno.
Composición del medio (por litro de medio de fermentación):
Se generó el medio se generó usando los siguientes componentes por litro de medio de fermentación: K2HPO47,5 g, MgSO4 * 7H2O 2 g, ácido cítrico monohidratado 2 g, citrato de amonio férrico 0,3 g, extracto de levadura 0,5 g, y disolución de metales traza modificada 1000X 1 ml. Se añadieron todos los componentes juntos y se disolvieron en diH2O. Se sometió a autoclave esta disolución. Se ajustó el pH a 7,0 con hidróxido de amonio (30%) y c.s.p. volumen. Se añadieron azúcar invertido 10 g, tiamina * HCl 0,1 g, y antibióticos tras esterilización y ajuste del pH. Disolución de metales traza modificada 1000X:
Se generó la disolución de metales traza modificada 1000X usando los siguientes componentes: ácidos cítricos * H2O 40 g, MnSO4 * H2O 30 g, NaCl 10 g, FeSO4 * 7H2O 1 g, CoCh * 6H2O 1 g, ZnSO * 7H2O 1 g, CuSO4 * 5H2O 100 mg, H3BO3100 mg, y NaMoO4 * 2H2O 100 mg. Se disuelve cada componente de uno en uno en H2O Di, pH a 3,0 con HCl/NaOH, después c.s.p. volumen y se esteriliza por filtración con filtro de 0,22 micrómetros.
Se realizó la fermentación en un biorreactor de 15 l con células BL21 (DE3) de E. coli que contenían los plásmidos pCL PtrcUpperMVA y pTrc KKDyIkIS. Se llevó a cabo este experimento para monitorizar la formación de isopreno a partir de azúcar invertido a la fermentación deseada a pH 7,0 y temperatura 30°C. Se sembró en banda un inóculo de cepa de E. coli tomado de un vial congelado sobre una placa de agar con caldo LB (con antibióticos) y se incubó a 37°C. Se inoculó una colonia individual en medio de triptona-extracto de levadura. Después de que el inóculo creciera hasta DO 1,0, medida a 550 nm, se usaron 500 ml para inocular un biorreactor de 5 l.
Se alimentó azúcar invertido a una tasa exponencial hasta que las células alcanzaron la fase estacionaria. Después de este tiempo la alimentación de azúcar invertido se disminuyó para cumplir las demandas metabólicas. La cantidad total de azúcar invertido suministrada al biorreactor durante la fermentación de 44 horas fue de 2,4 kg. Se logró inducción añadiendo IPTG. Se llevó la concentración de IPTG a 25 uM cuando la densidad óptica a 550 nm (DO550) alcanzó un valor de 9. Se elevó la concentración de IPTG hasta 50 uM cuando la DO550 alcanzó 200. El perfil de DO550 dentro del biorreactor a lo largo del tiempo se muestra en la figura 96. Se determinó el nivel de isopreno en el gas residual del biorreactor tal como se describió en el presente documento. El título de isopreno aumentó durante el transcurso de la fermentación hasta un valor final de 2,4 g/l (figura 97). La cantidad total de isopreno producido durante la fermentación de 44 horas fue de 18,4 g y el transcurso de tiempo de producción se muestra en la figura 98. El rendimiento molar de carbono utilizado que entró en la producción de isopreno durante la fermentación fue del 1,7%. El rendimiento de porcentaje en peso de isopreno a partir de glucosa fue del 0,8%.
Ejemplo 9. Construcción de la ruta de MVA superior e inferior para la integración en Bacillus subtilis
I. Construcción de la ruta de MVA superior en Bacillus subtilis
La ruta superior de Enterococcus faecalis se integra en B. subtilis bajo el control del promotor aprE. La ruta superior consiste en dos genes; mvaE, que codifica para AACT y HMGR, y mvaS, que codifica para h Mg S. Los dos genes se fusionan juntos con un codón de terminación entre medias, un sitio RBS delante de mvaS, y están bajo el control del promotor aprE. Se sitúa un terminador después del gen mvaE. Se clona el marcador de resistencia a cloranfenicol después de que el mvaE y el constructo se integren en el locus aprE por doble cruzamiento usando regiones flanqueantes de homología.
Se amplifican cuatro fragmentos de ADN mediante PCR de modo que contienen salientes que les permitirán fusionarse juntos mediante una reacción de PCR. Se llevan a cabo amplificaciones de PCR usando polimerasa Herculase según las instrucciones del fabricante.
1. PaprE
CF 07-134 (+) inicio de promotor aprE PstI
5'-GACATCTGCAGCTCCATTTTCTTCTGC (SEQ ID NO: 82)
CF 07-94 (-) fusionar PaprE con mvaE
5'-CAATAATAACTACTGTTTTCACTCTTTACCCTCTCCTTTTAA (SEQ ID NO: 83) Molde: ADN cromosómico de Bacillus subtilis
2. mvaE
CF 07-93 (+) fusionar mvaE con el promotor aprE (codón de iniciación GTG)
5'-TTAAAAGGAGAGGGTAAAGAGTGAAAACAGTAGTTATTATTG (SEQ ID NO: 84)
CF 07-62 (-) fusionar mvaE con mvaS con RBS entre medias
5'-TTTATCAATCCCAATTGTCATGTTTTTTTACCTCCTTTATTGTTTTCTTAAATC (SEQ ID NO: 35) Molde: ADN cromosómico de Enterococcus faecalis (de ATCC)
3. mvaS
CF 07-61 (+) fusionar mvaE con mvaS con RBS entre medias
5'-GATTTAAGAAAACAATAAAGGAGGTAAAAAAACATGACAATTGGGATTGATAAA (SEQ ID NO: 36) CF 07-124 (-) fusionar el fin de mvaS con el terminador
5'-CGGGGCCAAGGCCGGTTTTTTTTAGTTTCGATAAGAACGAACGGT (SEQ ID NO: 85) Molde: ADN cromosómico de Enterococcus faecalis
4. Terminador de serina proteasa alcalina de B. amyliquefaciens
CF 07-123 (+) fusionar el fin de mvaS con el terminador
5'-ACCGTTCGTTCTTATCGAAACTAAAAAAAACCGGCCTTGGCCCCG (SEQ ID NO: 86)
CF 07-46 (-) fin de terminador de B. amyliquefaciens BamHI
5'-GACATGACGGATCCGATTACGAATGCCGTCTC (SEQ ID NO: 63)
Molde: ADN cromosómico de Bacillus amyliquefaciens
Reacciones de fusión de PCR
5. Fusionar mvaE con mvaS
CF 07-93 (+) fusionar mvaE con el promotor aprE (codón de iniciación GTG)
5'-TTAAAAGGAGAGGGTAAAGAGTGAAAACAGTAGTTATTATTG (SEQ ID NO: 84)
CF 07-124 (-) fusionar el fin de mvaS con el terminador
5'-CGGGGCCAAGGCCGGTTTTTTTTAGTTTCGATAAGAACGAACGGT (SEQ ID NO: 85) Molde: n.° 2 y 3 de lo anterior
6. Fusionar mvaE-mvaS con promotor aprE
CF 07-134 (+) inicio de promotor aprE PstI
5'-GACATCTGCAGCTCCATTTTCTTCTGC (SEQ ID NO: 82)
CF 07-124 (-) fusionar el fin de mvaS con el terminador
5'-CGGGGCCAAGGCCGGTTTTTTTTAGTTTCGATAAGAACGAACGGT (SEQ ID NO: 85) Molde n.° 1 y n.° 4 de lo anterior
7. Fusionar PaprE-mvaE-mvaS con terminador
CF 07-134 (+) inicio de promotor aprE PstI
5'-GACATCTGCAGCTCCATTTTCTTCTGC (SEQ ID NO: 82)
CF 07-46 (-) fin de terminador de B. amyliquefaciens BamHI
5'-GACATGACGGATCCGATTACGAATGCCGTCTC (SEQ ID NO: 63)
Molde: n.° 4 yn.° 6
El producto se digiere con endonucleasas de restricción PstI/BamHI y se liga con pJM102 (Perego, M. 1993. Integrational vectors for genetic manipulation in Bacillus subtilis, p. 615-624. En A. L. Sonenshein, J. A. Hoch, y R. Losick (ed.), Bacillus subtilis and other gram-positive bacteria: biochemistry, physiology, and molecular genetics. American Society for Microbiology, Washington, D.C.) que se digiere con PstI/BamHI. La ligación se transforma en células de E.coli TOP 10 químicamente competentes y se seleccionan transformantes sobre LA que contenía carbenicilina (50 |ig/ml). Se identifica el plásmido correcto mediante secuenciación y se designa pJMUpperpathway2 (figuras 50 y 51). Se transforma ADN plasmídico purificado en Bacillus subtilis aprEnprE Pxil-comK y se seleccionan transformantes sobre agar L que contenía cloranfenicol (5 |ig/ml). Se selecciona una colonia correcta y se siembra en placa secuencialmente sobre agar L que contenía cloranfenicol 10, 15 y 25 |ig/ml para amplificar el número de copias del casete que contiene la ruta superior.
La cepa resultante se somete a prueba para determinar la producción de ácido mevalónico mediante crecimiento en LB que contiene el 1% de glucosa y el 1% de cultivos se analizan mediante CG para la producción de ácido mevalónico.
Esta cepa se usa posteriormente como huésped para la integración de la ruta de ácido mevalónico inferior.
Los siguientes cebadores se usan para secuenciar los diversos constructos anteriores.
Cebadores de secuenciación:
CF 07-134 (+) inicio de promotor aprE PstI
5'-GACATCTGCAGCTCCATTTTCTTCTGC (SEQ ID NO: 82)
CF 07-58 (+) inicio de gen mvaE
5'-ATGAAAACAGTAGTTATTATTGATGC (SEQ ID NO: 38)
CF 07-59 (-) fin de gen mvaE
5'-ATGTTATTGTTTTCTTAAATCATTTAAAATAGC (SEQ ID NO: 39)
CF 07-82 (+) inicio de gen mvaS
5'-ATGACAATTGGGATTGATAAAATTAG (SEQ ID NO: 40)
CF 07-83 (-) fin de gen mvaS
5'-TTAGTTTCGATAAGAACGAACGGT (SEQ ID NO: 41)
CF 07-86 (+) Secuencia en mvaE
5'-GAAATAGCCCCATTAGAAGTATC (SEQ ID NO: 42)
CF 07-87 (+) Secuencia en mvaE
5'-TTGCCAATCATATGATTGAAAATC (SEQ ID NO: 43)
CF 07-88 (+) Secuencia en mvaE
5'-GCTATGCTTCATTAGATCCTTATCG (SEQ ID NO: 44)
CF 07-89 (+) Secuencia mvaS
5'-GAAACCTACATCCAATCTTTTGCCC (SEQ ID NO: 45)
Se seleccionan transformantes sobre LA que contenía cloranfenicol a una concentración de 5 |ig/ml. Se confirma que una colonia tiene la integración correcta mediante secuenciación y se siembra en placa sobre LA que contenía concentraciones crecientes de cloranfenicol a lo largo de varios días, hasta un nivel final de 25 |ig/ml. Esto da como resultado la amplificación del casete que contiene los genes de interés. La cepa resultante se designa CF 455: pJMupperpathway#1 X Bacillus subtilis aprEnprE Pxilo comK (amplificada para crecer sobre LA que contenía cloranfenicol 25 |ig/ml).
II. Construcción de la ruta de MVA inferior en Bacillus subtilis
Se combinan la ruta de MVA inferior, que consiste en los genes mvk1, pmk, mpd e idi en un casete que consiste en regiones de ADN flanqueantes de la región nprE del cromosoma de B. subtilis (sitio de integración), el promotor aprE y el marcador de resistencia de espectinomicina (véanse las figuras 28 y 29). Este casete se sintetiza mediante DNA2.0 y se integra en el cromosoma de B. subtilis que contiene la ruta de MVA superior integrada en el locus aprE. El gen de isopreno sintasa de kudzu se expresa a partir del plásmido de replicación descrito en el ejemplo 4 y se transforma en la cepa con tanto la ruta superior como inferior integradas.
Ejemplo 10: Composiciones de isopreno a modo de ejemplo y procedimientos de elaborarlas
I. Análisis de composición de gas residual de fermentación que contiene isopreno
Se realizó una fermentación a escala de 14 l con una cepa BL21 de E. coli (DE3) recombinante que contenía dos plásmidos (pCL upperMev; pTrcKKDyIkIS que codifican para la ruta de mevalonato completa para biosíntesis de precursor de isoprenoides, una pirofosfato de isoprenilo isomerasa de levadura, y una isopreno sintasa de Kudzu. Se recogió gas residual de fermentación del tanque de 14 l en viales de espacio de cabeza de 20 ml a aproximadamente el momento de productividad de isopreno máxima (27,9 horas de tiempo de fermentación transcurridas, “EFT”) y se analizó mediante CG/EM de espacio de cabeza para determinar componentes volátiles.
Se realizó análisis de espacio de cabeza con un sistema de CG/EM Agilent 6890 equipado con una columna de CG/EM Agilent HP-5MS (30 m x 250 mm; grosor de película de 0,25 |im). Se usó un inyector automático combiPAL para muestrear 500 ul de alícuotas de viales de espacio de cabeza de 20 ml. El procedimiento de CG/EM utilizó helio como gas portador a un flujo de 1 ml/min. Se mantuvo el puerto de inyección a 250°C con una razón de división de 50:1. Se mantuvo la temperatura del horno a 37°C durante un periodo inicial de 2 minutos, seguido por un aumento hasta 237°C a una velocidad de 25°C/min durante un tiempo de procedimiento total de 10 minutos. El detector selectivo de masas Agilent 5793N escaneó desde m/z 29 hasta m/z 300. El límite de detección de este sistema es de aproximadamente 0,1 ug/lgas o aproximadamente 0,1 ppm. Si se desea, puede usarse un equipo más sensible con un límite de detección inferior.
El gas residual consistía en el 99,925% (v/v) de gases permanentes (N2, CO2 y O2), aproximadamente el 0,075% de isopreno (2-metil-1,3-butadieno) (~750 ppmv, 2100 mg/l) y pequeñas cantidades (<50 ppmv) de etanol, acetona, y dos alcoholes prenílicos C5. La cantidad de vapor de agua no se determinó, pero se estimó que era igual a la presión de vapor en equilibrio a 0°C. La composición de la fracción orgánica volátil se determinó mediante integración del área bajo los picos en el cromatograma de CG/EM (figuras 86A y 86B) y se enumeró en la tabla 6. Las curvas de calibración para patrones de etanol y acetona permitieron la conversión de área de CG en concentración de fase gaseosa en unidades de ug/l usando procedimientos convencionales.
Tabla 6. Composición de componentes orgánicos volátiles en gas residual de fermentación. Se analizó el gas residual en el punto de tiempo 27,9 horas de una fermentación usando una cepa BL21 (DE3) de E. coli que expresa una ruta de mevalonato heteróloga, una pirofosfato de isoprenilo isomerasa de levadura, y una isopreno sintasa de Kudzu.
Figure imgf000067_0001
II. Medición de compuestos orgánicos volátiles traza (COV) producidos conjuntamente con isopreno durante la fermentación de una cepa de E. coli recombinante
Se realizó una fermentación a escala de 14 l con una cepa BL21 de E. coli (DE3) recombinante que contenía dos plásmidos (pCL upperMev; pTrcKKDyIkIS) que codifican para la ruta de mevalonato completa para biosíntesis de precursor de isoprenoides, una pirofosfato de isoprenilo isomerasa de levadura, y una isopreno sintasa de Kudzu. Se hizo pasar gas residual de fermentación a través de viales de espacio de cabeza enfriados con el fin de concentrar e identificar componentes orgánicos volátiles traza. Se muestreó el gas residual de esta fermentación a una velocidad de 1 l/min durante 10 minutos a través de un vial de espacio de cabeza de 20 ml lleno de lana de cuarzo (2 g) y enfriado hasta -78°C con hielo seco. Se volvió a tapar el vial con una tapa de vial nueva y se analizó mediante CG/EM de espacio de cabeza para determinar COV atrapados usando las condiciones descritas en el ejemplo 10, parte I. Las razones de compuestos observados en las figuras 87A-87D son una combinación de nivel global en el gas residual de fermentación, la presión de vapor relativa a -78°C, y la respuesta del detector del espectrómetro de masas. Por ejemplo, el bajo nivel de isopreno en relación con compuestos volátiles oxigenados (por ejemplo, acetona y etanol) es una función de la alta volatilidad de este material de modo que no se acumula en el vial de espacio de cabeza a -78 °C.
La presencia de muchos de estos compuestos es única para composiciones de isopreno derivadas de fuentes biológicas. Los resultados se representan en las figuras 87A-87D y se resumen en las tablas 7A y 7B.
Tabla 7A: Compuestos volátiles traza presentes en gas residual producido por BL21 de E. coli (DE3) (pCL upperMev; pTrcKKDyIkIS) tras atrapamiento criogénico a -78°C.
Figure imgf000068_0001
1 El área de CG es el área no corregida bajo el pico correspondiente al compuesto enumerado.
2 El % de área es el área de pico expresada como un % en relación con el área de pico total de todos los compuestos.
3 % de razón es el área de pico expresada como un % en relación con el área de pico de 2-metil-1,3-butadieno. Tabla 7B. Compuestos volátiles traza presentes en gas residual producido por BL21 de E. coli (DE3) (pCL upperMev; pTrcKKDyIkIS) tras atrapamiento criogénico a -196°C.
Figure imgf000068_0002
Figure imgf000069_0001
1 El área de CG es el área no corregida bajo el pico correspondiente al compuesto enumerado.
2 El % de área es el área de pico expresada como un % en relación con el área de pico total de todos los compuestos.
3 % de razón es el área de pico expresada como un % en relación con el área de pico de 2-metil-1,3-butadieno. III. Ausencia de isómeros de hidrocarburos C5 en isopreno derivado de fermentación.
Se realizó atrapamiento criogénico de isopreno presente en gas residual de fermentación usando un vial de espacio de cabeza de 2 ml enfriado en nitrógeno líquido. Se hizo pasar en primer lugar el gas residual (1 l/min) a través de un vial de 20 ml que contenía gránulos de hidróxido de sodio con el fin de minimizar la acumulación de hielo y CO2 sólido en el vial de 2 ml (-196°C). Aproximadamente 10 l de gas residual se hicieron pasar a través del vial, tras lo cual se permitió que se calentara hasta -78°C con ventilado, seguido por resellado con una tapa de vial nueva y análisis mediante CG/EM.
Se realizó análisis de espacio de cabeza de CG/EM con un sistema de CG/EM Agilent 6890 usando una jeringa estanca a gas de 100 ul en modo de espacio de cabeza. Se usó una columna de CG/EM Zebron ZB-624 (3o m x 250 |im; grosor de película de 1,40 |im) para separación de analitos. Se equipó el inyector automático de CG con una jeringa de 100 ul hermética a gas, y se ajustó la altura de la jeringa para permitir la inyección de una muestra de espacio de cabeza de 50 ul de un vial de CG de 2 ml. El procedimiento de CG/EM utilizó helio como gas portador a un flujo de 1 ml/min. Se mantuvo el puerto de inyección a 200°C con una razón de división de 20:1. Se mantuvo la temperatura del horno a 37°C durante la duración de 5 minutos del análisis. Se ejecutó el detector selectivo de masas Agilent 5793N en modo de monitorización de ion único (SIM) en m/z 55, 66, 67 y 70. En estas condiciones, se observó que el isopreno eluía a 2,966 minutos (figura 88B). También se analizó un patrón de isopreno derivado de petróleo (Sigma-Aldrich) usando este procedimiento y se encontró que contenía isómeros adicionales de hidrocarburos C5, que eluían poco antes o después del pico principal y se cuantificaron basándose en el área de CG corregida (figura 88A).
Tabla 8A: Análisis de CG/EM de isopreno derivado de petróleo
Figure imgf000069_0002
Tabla 8B: Análisis de CG/EM de isopreno derivado de fermentación (% de hidrocarburos C5 totales)
Figure imgf000070_0001
En un experimento diferenciado, se analizó una mezcla convencional de hidrocarburos C5 para determinar si la respuesta del detector fue la misma para cada uno de los compuestos. Los compuestos fueron 2-metiM-buteno, 2-metil-1,3-butadieno, (E)-2-penteno, (Z)-2-penteno y (E)-1,3-pentadieno. En este caso, se realizó el análisis sobre una columna Agilent DB-Petro (100 m x 0,25 mm, grosor de película de 0,50 um) mantenida a 50°C durante 15 minutos. El procedimiento de CG/EM utilizó helio como gas portador a un flujo de 1 ml/min. Se mantuvo el puerto de inyección a 200°C con una razón de división de 50:1. Se ejecutó el detector selectivo de masas Agilent 5793N en modo de barrido completo desde m/z 19 hasta m/z 250. En estas condiciones, una concentración de 100 ug/l de cada patrón produjo la misma respuesta del detector dentro del error experimental.
IV. Composiciones que comprenden isopreno adsorbido a una fase sólida.
Se adsorbió isopreno producido de manera biológica a carbono activado dando como resultado una fase sólida que contenía del 50 al 99,9% de carbono, del 0,1% al 50% de isopreno, del 0,01% al 5% de agua, y pequeñas cantidades (<0,1%) de otros componentes orgánicos volátiles.
Se ejecutó el gas residual de fermentación a través de una bobina de condensación de cobre mantenida a 0°C, seguido por un filtro de desecante de sílice granulada con el fin de eliminar vapor de agua. Entonces se ejecutó el gas residual deshumidificado a través de filtros que contenían carbono (Koby Jr, Koby Filters, MA) hasta el punto en que se detectó el avance del isopreno en el escape del filtro mediante CG/EM. Puede determinarse la cantidad de isopreno adsorbida al cartucho indirectamente mediante el cálculo de la concentración en el gas residual, la velocidad de flujo global y el porcentaje de avance a lo largo del periodo de recogida. Alternativamente, el isopreno adsorbido puede recuperarse de filtros mediante desorción térmica, a vacío o mediada por disolvente.
V. Recogida y análisis de isopreno condensado.
Se deshumidifica el gas residual de fermentación, y se elimina el CO2 mediante filtración a través de un adsorbente adecuado (por ejemplo, Ascarite). La corriente de gas residual resultante se ejecuta entonces a través de un condensador enfriado por nitrógeno líquido con el fin de condensar los COV en la corriente. El recipiente de recogida contiene catecol de t-butilo para inhibir el condensado de isopreno resultante. El condensado se analiza mediante CG/EM y RMN con el fin de determinar la pureza usando procedimientos convencionales, tales como los descritos en el presente documento.
VI. Producción de alcoholes prenílicos mediante fermentación
El análisis de gas residual a partir de una cepa BL21 (DE3) de E. coli que expresa una isopreno sintasa de Kudzu reveló la presencia de tanto isopreno como 3-metil-3-buten-1-ol (isoprenol). Los niveles de los dos compuestos en el gas residual de fermentación a lo largo de la fermentación se muestran en la figura 89 tal como se determina mediante CG/EM de espacio de cabeza. Los niveles de isoprenol (3-metil-3-buten-1-ol, 3-MBA) obtenidos fueron prácticamente de 10 ug/lgas residual en este experimento. Experimentos adicionales produjeron niveles de aproximadamente 20 ug/lgas residual en el gas residual de fermentación.
Ejemplo 11: El desacoplamiento del crecimiento y la producción de isopreno en E. coli que expresa genes de la ruta de ácido mevalónico y fermentó en un cultivo semicontinuo
El ejemplo 11 ilustra el desacoplamiento del crecimiento celular de ácido mevalónico y la producción de isopreno. I. Condiciones de fermentación
Composición del medio (por litro de medio de fermentación):
El medio se generó usando los siguientes componentes por litro de medio de fermentación: K2HPO47,5 g, MgSO4 * 7H2O 2 g, ácido cítrico monohidratado 2 g, citrato de amonio férrico 0,3 g, extracto de levadura 0,5 g, y disolución de metales traza modificada 1000X 1 ml. Se añadieron todos los componentes juntos y se disolvieron en diH2O. Se sometió a autoclave esta disolución. Se ajustó el pH a 7,0 con hidróxido de amonio (30%) y c.s.p. volumen. Se añadieron glucosa 10 g, tiamina * HCl 0,1 g y antibióticos tras esterilización y ajuste del pH.
Disolución de metales traza modificada 1000X:
Se generó la disolución de metales traza modificada 1000X usando los siguientes componentes: ácidos cítricos * H2O 40 g, MnSO4 * H2O 30 g, NaCI 10 g, FeSO4 * 7H2O 1 g, C0CI2 * 6H2O 1 g, ZnSO * 7H2O 1 g, CUSO4 * 5H2O 100 mg, H3BO3100 mg, y NaMoO4 * 2H2O 100 mg. Se disolvió cada componente de uno en uno en H2O Di, pH a 3,0 con HCI/NaOH, después c.s.p. volumen y se esterilizó por filtración con un filtro de 0,22 micrómetros.
Se realizó la fermentación con células de E. coli que contenían los plásmidos pTrcHis2AUpperPathway (también denominado pTrcUpperMVA, figuras 91 y 92A-92C) (carbenicilina 50 |ig/ml) o los plásmidos pCL PtrcUpperMVA (también denominado pCL PtrcUpperPathway (figura 26)) (50 |ig/ml espectinomicina). Para experimentos en los que se produjo isopreno, las células de E. coli también contenían el plásmido pTrc KKDyIkIS (kanamicina 50 |ig/ml). Estos experimentos se llevaron a cabo para monitorizar la formación de ácido mevalónico o isopreno a partir de glucosa a la fermentación deseada a pH 7,0 y temperatura 30°C. Se sembró en banda un inóculo de una cepa de E. coli tomado de un vial congelado sobre una placa de agar con caldo LA (con antibióticos) y se incubó a 37°C. Se inoculó una colonia individual en medio de triptona-extracto de levadura. Después de que el inóculo creciera hasta una densidad óptica 1,0 cuando se medía a 550 nm, se usó para inocular el biorreactor.
Se alimentó glucosa a una tasa exponencial hasta que las células alcanzaron la fase estacionaria. Después de este tiempo la alimentación de glucosa se disminuyó para cumplir las demandas metabólicas. Se logró inducción añadiendo IPTG. La concentración de ácido mevalónico en el caldo de fermentación se determinó aplicando muestras tratadas con ácido perclórico (Sigma-Aldrich n.° 244252) (0,3 M incubadas a 4°C durante 5 minutos) a una columna de HPLC de ácidos orgánicos (BioRad n.° 125-0140). La concentración se determinó comparando el tamaño máximo de ácido mevalónico en caldo con una curva de calibración generada a partir de mevalonolacetona (Sigma-Aldrich n.° M4667) tratada con ácido perclórico para formar D,L-mevalonato. Se determinó el nivel de isopreno en el gas residual del biorreactor tal como se describió en el presente documento. El título de isopreno se define como la cantidad de isopreno producido por litro de caldo de fermentación.
II. Producción de ácido mevalónico a partir de células BL21 (DE3) de E. coli que expresan el plásmido pTrcUpperMVA a una escala de 150 l
Se inocularon células BL21 (DE3) que se hicieron crecer sobre una placa tal como se explicó anteriormente en el ejemplo 11, parte I en un matraz que contenía 45 ml de medio de triptona-extracto de levadura y se incubaron a 30°C con agitación a 170 rpm durante 5 horas. Esta disolución se transfirió a un biorreactor de 5 l de medio de triptona-extracto de levadura, y las células se hicieron crecer a 30°C y 27,5 rpm hasta que el cultivo alcanzó una DO550 de 1,0. Se sembraron los 5 l de inóculo en un biorreactor de 150 l que contenía 45 kg de medio. Se llevó la concentración de IPTG a 1,1 mM cuando la DO550 alcanzó un valor de 10. El perfil de DO550 dentro del biorreactor a lo largo del tiempo se muestra en la figura 60A. El título de ácido mevalónico aumentó durante el transcurso de la fermentación hasta un valor final de 61,3 g/l (figura 60B). El perfil de productividad específica en toda la fermentación se muestra en la figura 60C y una comparación con la figura 60A ilustra el desacoplamiento del crecimiento y la producción de ácido mevalónico. La cantidad total de ácido mevalónico producido durante la fermentación de 52,5 horas fue de 4,0 kg a partir de 14,1 kg de glucosa utilizada. El rendimiento molar de carbono utilizado que entró en la producción de ácido mevalónico durante la fermentación fue del 34,2%.
III. Producción de ácido mevalónico a partir de células BL21 (DE3) de E. coli que expresan el plásmido pTrcUpperMVA a una escala de 15 l
Se inocularon células BL21 (DE3) que se hicieron crecer sobre una placa tal como se explicó anteriormente en el ejemplo 11, parte I en un matraz que contenía 500 ml de medio de triptona-extracto de levadura y se hicieron crecer a 30°C a 160 rpm hasta DO5501,0. Se sembró este material en un biorreactor de 15 l que contenía 4,5 kg de medio. Se llevó la concentración de IPTG a 1,0 mM cuando la DO550 alcanzó un valor de 10. El perfil de DO550 dentro del biorreactor a lo largo del tiempo se muestra en la figura 61A. El título de ácido mevalónico aumentó durante el transcurso de la fermentación hasta un valor final de 53,9 g/l (figura 61B). El perfil de productividad específica en toda la fermentación se muestra en la figura 61C y una comparación con la figura 61A ilustra el desacoplamiento del crecimiento y la producción de ácido mevalónico. La cantidad total de ácido mevalónico producido durante la fermentación de 46,6 horas fue de 491 g a partir de 2,1 kg de glucosa utilizada. El rendimiento molar de carbono utilizado que entró en la producción de ácido mevalónico durante la fermentación fue del 28,8%.
IV. Producción de ácido mevalónico a partir de células FM5 de E. coli que expresan el plásmido pTrcUpperMVA a una escala de 15 l
Se inocularon células FM5 que se hicieron crecer sobre una placa tal como se explicó anteriormente en el ejemplo 11, parte I en un matraz que contenía 500 ml de medio de triptona-extracto de levadura y se hicieron crecer a 30°C a 160 rpm hasta DO5501,0. Se sembró este material en un biorreactor de 15 l que contenía 4,5 kg de medio. Se llevó la concentración de IPTG a 1,0 mM cuando la DO550 alcanzó un valor de 30. El perfil de DO550 dentro del biorreactor a lo largo del tiempo se muestra en la figura 62A. El título de ácido mevalónico aumentó durante el transcurso de la fermentación hasta un valor final de 23,7 g/l (figura 62B). El perfil de productividad específica en toda la fermentación se muestra en la figura 62C y una comparación con la figura 62A ilustra el desacoplamiento del crecimiento y la producción de ácido mevalónico. La cantidad total de ácido mevalónico producido durante la fermentación de 51,2 horas fue de 140 g a partir de 1,1 kg de glucosa utilizada. El rendimiento molar de carbono utilizado que entró en la producción de ácido mevalónico durante la fermentación fue del 15,2%.
V. Producción de isopreno a partir de células BL21 (DE3) de E. coli que expresan los plásmidos pCL PtrcUpperMVA y pTrc KKDyIkIS a una escala de 15 l
Se inocularon células BL21 (DE3) que expresan los plásmidos pCL PtrcUpperMVA y pTrc KKDyIkIS que se hicieron crecer sobre una placa tal como se explicó anteriormente en el ejemplo 11, parte I en un matraz que contenía 500 ml de medio de triptona-extracto de levadura y se hicieron crecer a 30°C a 160 rpm hasta DO5501,0. Se sembró este material en un biorreactor de 15 l que contenía 4,5 kg de medio. Se llevó la concentración de IPTG a 25 mM cuando la DO550 alcanzó un valor de 10. Se elevó la concentración de IPTG hasta 50 uM cuando la DO550 alcanzó 190. Se elevó la concentración de IPTG hasta 100 uM a las 38 horas de fermentación. El perfil de DO550 dentro del biorreactor a lo largo del tiempo se muestra en la figura 63A. El título de isopreno aumentó durante el transcurso de la fermentación hasta un valor final de 2,2 g/l caldo (figura 63B). El perfil de productividad específica en toda la fermentación se muestra en la figura 63C y una comparación con la figura 63A ilustra el desacoplamiento del crecimiento y la producción de isopreno. La cantidad total de isopreno producido durante la fermentación de 54,4 horas fue de 15,9 g a partir de 2,3 kg de glucosa utilizada. El rendimiento molar de carbono utilizado que entró en la producción de isopreno durante fermentación fue del 1,53%.
VI. Producción de isopreno a partir de células Tuner BL21 (DE3) de E. coli que expresan los plásmidos pCL PtrcUpperMVA y pTrc KKDyIkIS a una escala de 15 l
Se inocularon células Tuner BL21 (DE3) que expresan los plásmidos pCL PtrcUpperMVA y pTrc KKDyIkIS que se hicieron crecer sobre una placa tal como se explicó anteriormente en el ejemplo 11, parte I en un matraz que contenía 500 ml de medio de triptona-extracto de levadura y se hicieron crecer a 30°C a 160 rpm hasta DO5501,0. Se sembró este material en un biorreactor de 15 l que contenía 4,5 kg de medio. Se llevó la concentración de IPTG a 26 |iM cuando la DO550 alcanzó un valor de 10. Se elevó la concentración de IPTG hasta 50 uM cuando la DO550 alcanzó 175. El perfil de DO550 dentro del biorreactor a lo largo del tiempo se muestra en la figura 64A. El título de isopreno aumentó durante el transcurso de la fermentación hasta un valor final de 1,3 g/l caldo (figura 64B). El perfil de productividad específica en toda la fermentación se muestra en la figura 64C y una comparación con la figura 64A ilustra el desacoplamiento del crecimiento y la producción de isopreno. La cantidad total de isopreno producido durante la fermentación de 48,6 horas fue de 9,9 g a partir de 1,6 kg de glucosa utilizada. El rendimiento molar de carbono utilizado que entró en la producción de isopreno durante fermentación fue del 1,34%.
VII. Producción de isopreno a partir de células MG1655 de E. coli que expresan los plásmidos pCL PtrcUpperMVA y pTrc KKDyIkIS a una escala de 15 l
Se inocularon células MG1655 que expresan los plásmidos pCL PtrcUpperMVA y pTrc KKDyIkIS que se hicieron crecer sobre una placa tal como se explicó anteriormente en el ejemplo 11, parte I en un matraz que contenía 500 ml de medio de triptona-extracto de levadura y se hicieron crecer a 30°C a 160 rpm hasta DO5501,0. Se sembró este material en un biorreactor de 15 l que contenía 4,5 kg de medio. Se llevó la concentración de IPTG a 24 |iM cuando la DO550 alcanzó un valor de 45. El perfil de DO550 dentro del biorreactor a lo largo del tiempo se muestra en la figura 65A. El título de isopreno aumentó durante el transcurso de la fermentación hasta un valor final de 393 mg/l caldo (figura 65B). El perfil de productividad específica en toda la fermentación se muestra en la figura 65C y una comparación con la figura 65A ilustra el desacoplamiento del crecimiento y la producción de isopreno. La cantidad total de isopreno producido durante la fermentación de 67,4 horas fue de 2,2 g a partir de 520 g de glucosa utilizada. El rendimiento molar de carbono utilizado que entró en la producción de isopreno durante fermentación fue del 0,92%.
VIII. Producción de isopreno a partir de células MG1655ack-pta de E. coli que expresan los plásmidos pCL PtrcUpperMVA y pTrc KKDyIkIS a una escala de 15 l
Se inocularon células MG1655ack-pta que expresan los plásmidos pCL PtrcUpperMVA y pTrc KKDyIkIS que se hicieron crecer sobre una placa tal como se explicó anteriormente en el ejemplo 11, parte I en un matraz que contenía 500 ml de medio de triptona-extracto de levadura y se hicieron crecer a 30°C a 160 rpm hasta DO5501,0. Se sembró este material en un biorreactor de 15 l que contenía 4,5 kg de medio. Se llevó la concentración de IPTG a 30 |iM cuando la DO550 alcanzó un valor de 10. El perfil de DO550 dentro del biorreactor a lo largo del tiempo se muestra en la figura 66A. El título de isopreno aumentó durante el transcurso de la fermentación hasta un valor final de 368 mg/l caldo (figura 66B). El perfil de productividad específica en toda la fermentación se muestra en la figura 66C y una comparación con la figura 66A ilustra el desacoplamiento del crecimiento y la producción de isopreno. La cantidad total de isopreno producido durante la fermentación de 56,7 horas fue de 1,8 g a partir de 531 g de glucosa utilizada. El rendimiento molar de carbono utilizado que entró en la producción de isopreno durante fermentación fue del 0,73%.
IX. Producción de isopreno a partir de células FM5 de E. coli que expresan los plásmidos pCL PtrcUpperMVA y pTrc KKDyIkIS a una escala de 15 l
Se inocularon células FM5 que expresan los plásmidos pCL PtrcUpperMVA y pTrc KKDyIkIS que se hicieron crecer sobre una placa tal como se explicó anteriormente en el ejemplo 11, parte I en un matraz que contenía 500 ml de medio de triptona-extracto de levadura y se hicieron crecer a 30°C a 160 rpm hasta DO550 1,0. Se sembró este material en un biorreactor de 15 l que contenía 4,5 kg de medio. Se llevó la concentración de IPTG a 27 |iM cuando la DO550 alcanzó un valor de 15. El perfil de DO550 dentro del biorreactor a lo largo del tiempo se muestra en la figura 67A. El título de isopreno aumentó durante el transcurso de la fermentación hasta un valor final de 235 mg/l caldo (figura 67B). El perfil de productividad específica en toda la fermentación se muestra en la figura 67C y una comparación con la figura 67A ilustra el desacoplamiento del crecimiento y la producción de isopreno. La cantidad total de isopreno producido durante la fermentación de 52,3 horas fue de 1,4 g a partir de 948 g de glucosa utilizada. El rendimiento molar de carbono utilizado que entró en la producción de isopreno durante fermentación fue del 0,32%.
Ejemplo 12: Producción de isopreno durante la fase de crecimiento exponencial de E. coli que expresa genes de la ruta de ácido mevalónico y fermentó en un cultivo semicontinuo
El ejemplo 12 ilustra la producción de isopreno durante la fase de crecimiento exponencial de células.
Composición del medio (por litro de medio de fermentación):
El medio se generó usando los siguientes componentes por litro de medio de fermentación: K2HPO47,5 g, MgSO4 * 7H2O 2 g, ácido cítrico monohidratado 2 g, citrato de amonio férrico 0,3 g, extracto de levadura 0,5 g, y disolución de metales traza modificada 1000X 1 ml. Se añadieron todos los componentes juntos y se disolvieron en diH2O. Se sometió a autoclave esta disolución. Se ajustó el pH a 7,0 con hidróxido de amonio (30%) y c.s.p. volumen. Se añadieron glucosa 10 g, tiamina * HCl 0,1 g y antibióticos tras esterilización y ajuste del pH.
Disolución de metales traza modificada 1000X:
Se generó la disolución de metales traza modificada 1000X usando los siguientes componentes: ácidos cítricos * H2O 40 g, MnSO4 * H2O 30 g, NaCl 10 g, FeSO4 * 7H2O 1 g, CoCh * 6H2O 1 g, ZnSO * 7H2O 1 g, CuSO4 * 5H2O 100 mg, H3BO3100 mg, y NaMoO4 * 2H2O 100 mg. Se disuelve cada componente de uno en uno en H2O Di, pH a 3,0 con HCl/NaOH, después c.s.p. volumen y se esteriliza por filtración con filtro de 0,22 micrómetros.
Se realizó la fermentación en un biorreactor de 15 l con células de E. coli ATCC11303 que contenían los plásmidos pCL PtrcUpper- MVA y pTrc KKDyIkIS. Se llevó a cabo este experimento para monitorizar la formación de isopreno a partir de glucosa a la fermentación deseada a pH 7,0 y temperatura 30°C. Se sembró en banda un inóculo de cepa de E. coli tomado de un vial congelado sobre una placa de agar con caldo LB (con antibióticos) y se incubó a 37°C. Se inoculó una colonia individual en medio de triptona-extracto de levadura. Después de que el inóculo creciera hasta DO 1,0, medida a 550 nm, se usaron 500 ml para inocular un biorreactor de 5 l.
Se alimentó glucosa a una tasa exponencial hasta que las células alcanzaron la fase estacionaria. Después de este tiempo la alimentación de glucosa se disminuyó para cumplir las demandas metabólicas. La cantidad total de glucosa suministrada al biorreactor durante la fermentación de 50 horas fue de 2,0 kg. Se logró inducción añadiendo IPTG. Se llevó la concentración de IPTG a 25 uM cuando la densidad óptica a 550 nm (DO550) alcanzó un valor de 10. Se elevó la concentración de IPTG hasta 50 uM cuando la DO550 alcanzó 190. El perfil de DO550 dentro del biorreactor a lo largo del tiempo se muestra en la figura 99. Se determinó el nivel de isopreno en el gas residual del biorreactor tal como se describió en el presente documento. El título de isopreno aumentó durante el transcurso de la fermentación hasta un valor final de 1,4 g/l (figura 100). La cantidad total de isopreno producido durante la fermentación de 50 horas fue de 10,0 g. El perfil de la productividad específica de isopreno a lo largo del tiempo dentro del biorreactor se muestra en la figura 101. El rendimiento molar de carbono utilizado que contribuyó a producir isopreno durante fermentación fue del 1,1%. El rendimiento de porcentaje en peso de isopreno a partir de glucosa fue del 0,5%.
Ejemplo 13: Modelado de inflamabilidad y pruebas de isopreno
I. Resumen del modelado de inflamabilidad y pruebas de isopreno
Se realizaron experimentos y modelado de inflamabilidad para diversas mezclas de hidrocarburo/oxígeno/nitrógeno/agua/dióxido de carbono. Este modelado y pruebas experimentales se dirigieron para definir curvas de inflamabilidad de isopreno y oxígeno/nitrógeno bajo una corriente especificada y concentraciones de monóxido de carbono a una presión y temperatura fijas. Se muestra una matriz de las condiciones de modelo en la tabla 4, y se muestra una matriz de los experimentos realizados en la tabla 5.
Tabla 4. Resumen de inflamabilidad de isopreno modelada
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Tabla 5. Resumen de pruebas de inflamabilidad de isopreno
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II. Descripción de modelo de temperatura de llama adiabática calculada (CAFT)
Se usaron temperaturas de llama adiabática calculadas (CAFT) junto con una temperatura de llama límite seleccionada para la propagación de la combustión para determinar la envoltura de inflamabilidad para isopreno. El programa informático usado en este estudio para calcular las temperaturas de llama es el software CEA (Chemical Equilibrium with Applications) del Centro de Investigación Glenn de la NASA.
Hay cinco etapas implicadas en la determinación de la envoltura de inflamabilidad usando un modelo de temperatura de llama adiabática para un mecanismo de combustión homogéneo (en el que tanto el combustible como el oxidante están en el estado gaseoso): selección de los reactivos deseados, selección de la condición de prueba, selección de la temperatura de llama límite, modificación de los reactivos, y construcción de una envoltura de inflamabilidad a partir de los cálculos.
En esta primera etapa, selección de reactivos deseados, debe tomarse una decisión sobre las especies de reactivo que estarán presentes en el sistema y las cantidades de cada una. En muchos casos, los programas informáticos usados para los cálculos tienen una lista de especies de reactivo y producto. Si no se encuentra ninguno de los datos para las especies que van a estudiarse en el programa, pueden obtenerse de otras fuentes tales como las tablas JANAF o de internet. En este modelo actual, estaban presentes datos para agua, nitrógeno, oxígeno y dióxido de carbono en la base de datos del programa. La base de datos del programa no tuvo isopreno como especie; por tanto, las propiedades termodinámicas se incorporaron manualmente.
La siguiente etapa es decidir si las condiciones de presión y temperatura iniciales en las que tiene lugar el proceso de combustión. En este modelo, la presión fue de 1 atmósfera (absoluta) y la temperatura fue de 40°C, el punto de ebullición de isopreno.
La temperatura de llama límite para la combustión puede o bien seleccionarse basándose en principios teóricos o bien determinarse de manera experimental. Cada procedimiento tiene sus propias limitaciones.
Basándose en estudios anteriores, las temperaturas de llama límite de hidrocarburos se encuentran en el intervalo de 1000 K a 1500 K. Para este modelo, se seleccionó el valor de 1500 K. Esta es la temperatura a la que la reacción de monóxido de carbono a dióxido de carbono (una reacción muy exotérmica y constituye una proporción significativa de la energía de la llama) se vuelve autosuficiente.
Una vez que se ha decidido la temperatura de llama límite, se realizan cálculos de modelo en la mezcla de reactivos dada (concentraciones de especies) y se determina la temperatura de llama adiabática. La propagación de llama se considera que se ha producido sólo si la temperatura es mayor que la temperatura de llama límite. La composición de mezcla de reactivos se modifica entonces para crear conjuntos de datos para mezclas de propagación y no propagación.
Este tipo de modelo muestra buena aceptación con los límites de inflamabilidad determinados de manera experimental. Las regiones fuera de la envoltura derivada no son inflamables y las regiones dentro de la misma sí lo son. La conformación de la envoltura forma una nariz. La nariz de la envoltura se refiere a la concentración de oxígeno limitante (COL) para combustibles gaseosos.
III. Resultados del modelo de temperatura de llama adiabática calculada (CAFT)
En las figuras 68 a 74 se representan gráficamente los resultados del modelo de CAFT para la serie A G, respectivamente. Las figuras representan gráficamente la temperatura de llama adiabática calculada (usando el programa CEA de la NASA) como una función de la concentración de combustible (en peso) para varias razones oxígeno/nitrógeno (en peso). Las partes de la curva que están por encima de 1500 K, la temperatura de llama límite seleccionada, contienen niveles de combustible suficientes para la propagación de llama. Los resultados pueden ser difíciles de interpretar en la forma presentada en las figuras 68 a 74. Además, la forma actual no es propicia para la comparación con datos experimentales que generalmente se presentan en términos de porcentaje en volumen. Usando la serie A como ejemplo, los datos en la figura 68 pueden representarse gráficamente en forma de una envoltura de inflamabilidad tradicional. Usando la figura 68 y leyendo a través de la línea de temperatura de 1500 K en la ordenada, puede determinarse la concentración de combustible para esta temperatura de llama límite dejando una tangente a la abscisa para cada curva (razón de oxígeno con respecto a nitrógeno) que interseca. Estos valores pueden entonces tabularse como porcentaje en peso de combustible para un porcentaje en peso dado de oxidante (figura 75A). Después, conociendo la composición del combustible (el 100% en peso de isopreno) y la composición del oxidante (contenido relativo de agua, oxígeno y nitrógeno), pueden establecerse las cantidades molares.
A partir de estas cantidades molares, pueden calcularse concentraciones de porcentaje en volumen. Las concentraciones en cuando a porcentaje en volumen pueden entonces representarse gráficamente para generar una envoltura de inflamabilidad (figura 75B). El área limitada por la envoltura es el intervalo explosivo y el área excluida es el intervalo no explosivo. La “nariz” de la envoltura es la concentración de oxígeno limitante. Las figuras 76A y 76B contienen las concentraciones de volumen calculadas para la envoltura de inflamabilidad para la serie B generada a partir de los datos presentados en la figura 69. Puede usarse un enfoque similar en los datos presentados en las figuras 70-74.
IV. Equipo y procedimiento experimental de pruebas de inflamabilidad
Se llevaron a cabo pruebas de inflamabilidad en un recipiente a alta presión de 4 litros. El recipiente era de forma cilíndrica con un diámetro interno de 6” y una altura interna de 8,625”. La temperatura del recipiente (y los gases en el interior) se mantuvo usando calentadores externos que se controlaron mediante un controlador PID. Para evitar pérdidas de calor, se envolvieron lana cerámica y aislante reflectante alrededor del recipiente a presión. Se usaron termopares de tipo K para medir la temperatura del espacio de gas así como la temperatura del propio recipiente. La figura 77 ilustra el recipiente de prueba.
Antes de que se ejecutara una prueba, se evacuó el recipiente y se purgó con nitrógeno para garantizar que se retiró cualquiera de los gases de las pruebas anteriores. Entonces se aplicó un vació al recipiente. La presión después de que esto se realizara era normalmente de alrededor de 0,06 bar(a). Debido al purgado con nitrógeno, se supuso que el gas responsable de esta presión inicial era nitrógeno. Usando presiones parciales, se añadieron entonces agua, isopreno, nitrógeno y oxígeno en las cantidades apropiadas para lograr las condiciones de prueba en cuestión. Un ventilador de mezcla accionado magnéticamente dentro del recipiente aseguró la mezcla del contenido gaseoso. Se permitió que los gases se mezclaran durante aproximadamente 2 minutos con el ventilador apagado aproximadamente 1 minuto antes de la ignición.
El encendedor está compuesto por una bobina de Ni-cromo de 1,5 omh y una fuente de corriente alterna en un circuito de temporizador. Usando un osciloscopio, se determinó que se suministraron 34,4 VAC al encendedor durante 3,2 segundos. Se produjo una corriente máxima de 3,8 amperios aproximadamente a la mitad del ciclo de ignición. Por tanto, la potencia máxima fue de 131 W y la energía total proporcionada a lo largo del ciclo de ignición fue de aproximadamente 210 J.
Se adquirieron datos de deflagración usando un transductor de presión DP215 de Validyne de reluctancia variable conectado a un sistema de adquisición de datos. Se consideró que una mezcla de gases se había deflagrado si el aumento de presión era mayor o igual al 5%.
V. Resultados de las pruebas de inflamabilidad
Se ejecutó la primera serie experimental (series 1) a 40°C y 0 psig sin vapor. Ejecutar las pruebas a concentraciones variables de isopreno y oxígeno produjo la curva de inflamabilidad mostrada en la figura 78A. Los puntos de datos mostrados en esta curva son sólo aquellos que bordean la curva. En las figuras 80A y 80B se muestra una lista detallada de todos los puntos de datos tomados para esta serie.
La figura 78B resume los puntos de datos de explosividad mostrados en la figura 78A. La figura 78C es una comparación de los datos experimentales con la envoltura de inflamabilidad predicha por el modelo de CAFT. El modelo tiene muy buena aceptación con los datos experimentales. Las discrepancias pueden deberse a la naturaleza no adiabática de la cámara de prueba y a limitaciones del modelo. El modelo contempla un horizonte temporal infinito para la reacción de oxidación y no tiene en cuenta ninguna limitación cinética de la reacción.
Además, el modelo está limitado por el número de especies químicas en equilibrio que se encuentran en esta base de datos y, por tanto, puede que no predigan adecuadamente las especies pirolíticas. Además, la envoltura de inflamabilidad desarrollada por el modelo usa un valor para una temperatura de llama límite (1500 K). La temperatura de llama límite puede estar en el intervalo de valores de desde 1.000 K hasta 1.500 K según las especies químicas que reaccionan. La compleja naturaleza de las especies químicas pirolíticas formadas a concentraciones de combustible por encima del nivel de combustible/oxidante estequiométrico es un motivo por el que el modelo puede no predecir con exactitud el límite de inflamabilidad superior para este sistema.
Se ejecutó la segunda serie experimental (series 2) a 40°C y 0 psig con una concentración de vapor fija del 4%. Ejecutar las pruebas a concentraciones variables de isopreno y oxígeno produjo la curva de inflamabilidad mostrada en la figura 79A. Los puntos de datos mostrados en esta curva son sólo aquellos que bordean la curva. En la figura 81 se muestra una lista detallada de todos los puntos de datos tomados para esta serie. Debido a la similitud entre los datos en la serie 1 sólo se sometieron a prueba los puntos clave del límite de inflamabilidad inferior, concentración de oxígeno limitante y límites de inflamabilidad superiores. La adición del 4% de vapor a la mezcla de prueba no cambió significativamente los límites clave de la envoltura de inflamabilidad. Debe indicarse que mayores concentraciones de vapor/agua y/u otros agentes inertes pueden influir en la envoltura de inflamabilidad.
La figura 79B resume los puntos de datos de explosividad mostrados en la figura 79A. La figura 79C es una comparación de los datos experimentales con la envoltura de inflamabilidad predicha por el modelo de CAFT. El modelo tiene buena aceptación con los datos experimentales. Las discrepancias pueden deberse a los mismos factores descritos en la serie 1.
V. Cálculo de los límites de inflamabilidad de isopreno en aire a 3 atmósferas de presión
Los procedimientos descritos en el ejemplo 13, partes I a IV también se usaron para calcular los límites de inflamabilidad de isopreno a una presión del sistema absoluta de 3 atmósferas y 40°C. Estos resultados se compararon con los del ejemplo 13, partes I a IV a una presión del sistema absoluta de 1 atmósfera y 40°C. Esta presión mayor se sometió a prueba porque la envoltura de inflamabilidad se expande o se hace más grande a medida que se aumenta la presión del sistema inicial. El límite de inflamabilidad superior es el más afectado, seguido por la composición de oxígeno limitante. El límite de inflamabilidad inferior es el menos afectado (véase, por ejemplo, “Bulletin 627 - Flammability Characteristics of Combustible Gases and Vapors” escrito por Michael G. Zabetakis y publicado por la antigua Oficina de Minas de Estados Unidos (1965), al que se hace referencia, en particular con respecto al cálculo de los límites de inflamabilidad).
En la figura 82, la temperatura de llama adiabática calculada se representa gráficamente como una función de la concentración de isopreno (combustible), expresada en porcentaje en peso del combustible/nitrógeno/oxígeno total, donde la presión del sistema fue inicialmente de 3 atmósferas. Las temperaturas de llama calculadas son muy similares a las determinadas inicialmente en el sistema a 1 atmósfera (figura 83). Como resultado, cuando se generan envoltura de inflamabilidad usando los datos de inflamabilidad adiabática calculados, las curvas son muy similares (véanse las figuras 84 y 85). Por tanto, basándose en estos cálculos teóricos, un aumento de la presión del sistema desde 1 atmósfera hasta 3 atmósferas no da como resultado un aumento/ensanchamiento significativo de la envoltura de inflamabilidad. Si se desea, estos resultados del modelo pueden validarse usando pruebas experimentales (tales como las pruebas experimentales descritas en el presente documento a una presión de 1 atmósfera).
VII. Resumen de los estudios de inflamabilidad
Se desarrolló un modelo de temperatura adiabática calculada para la envoltura de inflamabilidad del sistema de isopreno/oxígeno/nitrógeno/agua/dióxido de carbono a 40°C y 0 psig. El modelo de CAFT que se desarrolló tenía buena aceptación con los datos experimentales generados por las pruebas llevadas a cabo en este trabajo. Los resultados experimentales de las series 1 y 2 validaron los resultados del modelo de las series A y B.
A menos que se defina lo contrario, los significados de todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento son aquellos que entiende comúnmente un experto en la técnica a la que pertenece esta invención. Singleton, et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, 2a ed., John Wiley & Sons, Nueva York (1994), y Hale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology, Harper Perennial, N.Y. (1991) proporcionan a un experto un diccionario general de muchos de los términos usados en esta invención. Debe entenderse que esta invención no está limitada a la metodología, los protocolos y los reactivos particulares descritos, dado que estos pueden variar. Un experto en la técnica también apreciará que cualesquiera de los procedimientos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento también pueden usarse para poner en práctica o someter a prueba la invención.
Los encabezados proporcionados en el presente documento no son limitaciones de los diversos aspectos o realizaciones de la invención que pueden tenerse como referencia a la memoria descriptiva como un todo.
Para uso en el presente documento, a menos que claramente se indique lo contrario, el uso de los términos “un”, “una”, y similares, hace referencia a uno o más.
La referencia a “aproximadamente” un valor o parámetro en el presente documento incluye (y describe) realizaciones que se refieren a ese valor o parámetro en sí. Por ejemplo, una descripción que hace referencia a “aproximadamente X” incluye una descripción de “X.” Los intervalos numéricos incluyen los números que definen el intervalo.
Se entiende que los aspectos y realizaciones de la invención descritos en el presente documento incluyen “que comprende”, “que consiste en” y “que consiste esencialmente en” aspectos y realizaciones.
Apéndice 1
Ácidos nucleicos y polipéptidos de 1-desoxi-D-xilulosa-5-fosfato sintasa a modo de ejemplo
ATH: AT3G21500(DXPS1) AT4G15560(CLA1) AT5G11380(DXPS3)
OSA: 433876843400904342614
CME: CMF089C
PFA: MAL13P1.186
TAN: TA20470
TPV: TP01_0516
ECO: b0420(dxs)
ECJ: JW0410(dxs)
ECE: Z0523(dxs)
ECS: ECs0474
ECC: c0531(dxs)
ECI: UTI89_C0443(dxs)
ECP: ECP_0479
ECV: APEC01_1590(dxs)
ECW: EcE24377A_0451(dxs)
ECX: EcHS_A0491
STY: STY0461(dxs)
STT: t2441(dxs)
SPT: SPA2301(dxs)
SEC: SC0463(dxs)
STM: STM0422(dxs)
YPE: YPO3177(dxs)
YPK: y1008(dxs)
YPM: YP_0754(dxs)
YPA: YPA_2671
YPN: YPN_0911
YPP: YPDSF 2812
Y P S : Y P T B 0939 (d xs ) YPI: YpsIP31758_3112(dxs) SFL: SF0357(dxs)
SFX: S0365(dxs)
SFV: SFV_0385(dxs) SSN: SSON_0397(dxs) SBO: SBO_0314(dxs) SDY: SDY_0310(dxs) ECA: ECA1131(dxs) PLU: plu3887(dxs)
BUC: BU464(dxs)
BAS: BUsg448(dxs) WBR: WGLp144(dxs) SGL: SG0656
KPN: KPN_00372(dxs) BFL: Bfl238(dxs)
BPN: BPEN_244(dxs) HIN: HI1439(dxs)
HIT: NTHI1691(dxs) HIP: CGSHiEE_04795 HIQ: CGSHiGG_01080 HDU: HD0441(dxs) HSO: HS_0905(dxs) PMU: PM0532(dxs) MSU: MS1059(dxs) APL: APL_0207(dxs) XFA: XF2249
XFT: PD1293(dxs)
XCC: XCC2434(dxs) XCB: XC_1678
XCV: XCV2764(dxs) XAC: XAC2565(dxs)
X O O : X O O 2017 (d x s ) XOM: XOO_1900(XOO1900) VCH: VC0889
VVU: VV1_0315
VVY: VV0868
VPA: VP0686
VFI: VF0711
PPR: PBPRA0805
PAE: PA4044(dxs)
PAU: PA14_11550(dxs) PAP: PSPA7_1057(dxs) PPU: PP_0527(dxs) PST: PSPTO_0698(dxs) PSB: Psyr_0604
PSP: PSPPH_0599(dxs) PFL: PFL_5510(dxs) PFO: Pfl_5007
PEN: PSEEN0600(dxs) PMY: Pmen_3844
PAR: Psyc_0221(dxs) PCR: Pcryo_0245
ACI: ACIAD3247(dxs) SON: SO_1525(dxs) SDN: Sden_2571
SFR: Sfri_2790
SAZ: Sama_2436
SBL: Sbal_1357
SLO: Shew_2771
SHE: Shewmr4_2731 SHM: Shewmr7_2804 SHN: Shewana3_2901 SHW: Sputw3181_2831 ILO: IL2138(dxs)
C PS: C P S _ 1088 (d xs ) PHA: P S H A a 2366 (d xs ) PAT: Patl_1319
SDE: Sde_3381
PIN: Ping_2240
MAQ: Maqu_2438
MCA: MCA0817(dxs) FTU: FTT1018c(dxs) FTF: FTF1018c(dxs) FTW: FTW_0925(dxs) FTL: FTL_1072
FTH: FTH_1047(dxs) FTA: FTA_1131(dxs) FTN: FTN_0896(dxs) NOC: Noc_1743
AEH: Mlg_1381
HCH: HCH_05866(dxs) CSA: Csal_0099
ABO: ABO_2166(dxs) AHA: AHA_3321(dxs) BCI: BCI_0275(dxs) RMA: Rmag_0386
VOK: COSY_0360(dxs) NME: NMB1867
NMA: NMA0589(dxs) NMC: NMC0352(dxs) NGO: NGO0036
CVI: CV_2692(dxs)
RSO: RSc2221(dxs) REU: Reut_A0882
REH: H16_A2732(dxs) RME: Rmet_2615
BMA: BMAA0330(dxs)
BM V: B M A S A V P 1 _ 1512 (d xs ) BM L: B M A 10299 _ 1706 (d xs ) BMN: BMA10247_A0364(dxs) BXE: Bxe_B2827
BUR: Bcep18194_B2211 BCN: Bcen_4486
BCH: Bcen2424_3879
BAM: Bamb_3250
BPS: BPSS1762(dxs)
BPM: BURPS 1710b_A0842(dxs) BPL: BURPS 1106A_A2392(dxs) BPD: BURPS668_A2534(dxs) BTE: BTH_II0614(dxs)
BPE: BP2798(dxs)
BPA: BPP2464(dxs)
BBR: BB1912(dxs)
RFR: Rfer_2875
POL: Bpro_1747
PNA: Pnap_1501
AJS: Ajs_1038
MPT: Mpe_A2631
HAR: HEAR0279(dxs)
MMS: mma_0331
NEU: NE1161(dxs)
NET: Neut_1501
NMU: Nmul_A0236
EBA: ebA4439(dxs)
AZO: azo1198(dxs)
DAR: Daro_3061
TBD: Tbd_0879
MFA: Mfla_2133
HPY: HP0354(dxs)
HPJ: jhp0328(dxs)
HPA: HPAG1 0349
H H E : H H 0608 (d xs )
HAC: Hac_0968(dxs)
WSU: WS1996
TDN: Tmden_0475
CJE: Cj0321(dxs)
CJR: CJE0366(dxs)
CJJ: CJJ81176_0343(dxs)
CJU: C8J_0298(dxs)
CJD: JJD26997_1642(dxs)
CFF: CFF8240_0264(dxs)
CCV: CCV52592_1671(dxs) CCV52592_1722 CHA: CHAB381_1297(dxs)
CCO: CCC13826_1594(dxs)
ABU: Abu_2139(dxs)
NIS: NIS_0391(dxs)
SUN: SUN_2055(dxs)
GSU: GSU0686(dxs-1) GSU1764(dxs-2) GME: Gmet_1934 Gmet_2822
PCA: Pcar_1667
PPD: Ppro_1191 Ppro_2403
DVU: DVU1350(dxs)
DVL: Dvul_1718
DDE: Dde_2200
LIP: LI0408(dsx)
DPS: DP2700
ADE: Adeh_1097
MXA: MXAN_4643(dxs)
SAT: SYN_02456
SFU: Sfum_1418
PUB: SAR11_0611(dxs)
MLO: mlr7474
MES: Meso_0735
SME: SMc00972(dxs)
A T U : A tu 0745 (d x s )
ATC: AGR_C_1351
RET: RHE_CH00913(dxs)
RLE: RL0973(dxs)
BME: BMEI1498
BMF: BAB1_0462(dxs)
BMS: BR0436(dxs)
BMB: BruAb1_0458(dxs)
BOV: BOV_0443(dxs)
BJA: bll2651(dxs)
BRA: BRADO2161(dxs)
BBT: BBta_2479(dxs)
RPA: RPA0952(dxs)
RPB: RPB_4460
RPC: RPC_1149
RPD: RPD_4305
RPE: RPE_1067
NWI: Nwi_0633
NHA: Nham_0778
BHE: BH04350(dxs)
BQU: BQ03540(dxs)
BBK: BARBAKC583_0400(dxs) CCR: CC_2068
SIL: SPO0247(dxs)
SIT: TM1040_2920
RSP: RSP_0254(dxsA) RSP_1134(dxs) JAN: Jann_0088 Jann_0170
RDE: RD1_0101(dxs) RD1_0548(dxs) MMR: Mmar10_0849
HNE: HNE_1838(dxs)
ZMO: ZMO1234(dxs) ZMO1598(dxs) NAR: Saro_0161
SAL: Sala 2354
ELI: ELI_12520
GOX: GOX0252
GBE: GbCGDNIH1-0221 GbCGDNIH1_2404 RRU: Rru_A0054 Rru_A2619
MAG: amb2904
MGM: Mmc1_1048
SUS: Acid_1783
BSU: BG11715(dxs)
BHA: BH2779
BAN: BA4400(dxs)
BAR: GBAA4400(dxs)
BAA: BA_4853
BAT: BAS4081
BCE: BC4176(dxs)
BCA: BCE_4249(dxs)
BCZ: BCZK3930(dxs)
BTK: BT9727_3919(dxs)
BTL: BALH_3785(dxs)
BLI: BL01523(dxs)
BLD: BLi02598(dxs)
BCL: ABC2462(dxs)
BAY: RBAM_022600
BPU: BPUM_2159
GKA: GK2392
GTN: GTNG_2322
LMO: lmo1365(tktB)
LMF: LMOf2365_1382(dxs)
LIN: lin1402(tktB)
LWE: lwe1380(tktB)
LLA: L108911(dxsA) L123365(dxsB) LLC: LACR_1572 LACR_1843
LLM: llmg_0749(dxsB)
SAK: SAK_0263
LPL: lp _2610 (dxs )
LJO: LJ0406
LAC: LBA0356
LSL: LSL_0209(dxs)
LGA: LGAS_0350
STH: STH1842
CAC: CAC2077 CA_P0106(dxs) CPE: CPE1819
CPF: CPF_2073(dxs)
CPR: CPR_1787(dxs)
CTC: CTC01575
CNO: NT01CX_1983
CTH: Cthe_0828
CDF: CD1207(dxs)
CBO: CBO1881(dxs)
CBA: CLB_1818(dxs)
CBH: CLC_1825(dxs)
CBF: CLI_1945(dxs)
CKL: CKL_1231(dxs)
CHY: CHY_1985(dxs)
DSY: DSY2348
DRM: Dred_1078
PTH: PTH_1196(dxs)
SWO: Swol_0582
CSC: Csac_1853
TTE: TTE1298(dxs)
MTA: Moth_1511
MPE: MYPE730
MGA: MGA_1268(dxs)
MTU: Rv2682c(dxs1) Rv3379c(dxs2) MTC: MT2756(dxs)
MBO: Mb2701c(dxs1) Mb3413c(dxs2) MLE: ML1038(dxs)
M P A : M A P 2803 c (d xs )
MAV: MAV_3577(dxs)
MSM: MSMEG_2776(dxs)
MMC: Mmcs_2208
CGL: NCg11827(cg11902)
CGB: cg2083(dxs)
CEF: CE1796
CDI: DIP1397(dxs)
CJK: jk1078(dxs)
NFA: nfa37410(dxs)
RHA: RHA1_ro06843
SCO: SCO6013(SC1C3.01) SCO6768(SC6A5.17) SMA: SAV1646(dxs1) SAV2244(dxs2)
TWH: TWT484
TWS: TW280(Dxs)
LXX: Lxx10450(dxs)
CMI: CMM_1660(dxsA)
AAU: AAur_1790(dxs)
PAC: PPA1062
TFU: Tfu_1917
FRA: Francci3_1326
FAL: FRAAL2088(dxs)
ACE: Acel_1393
SEN: SACE_1815(dxs) SACE_4351
BLO: BL1132(dxs)
BAD: BAD_0513(dxs)
FNU: FN1208 FN1464
RBA: RB2143(dxs)
CTR: CT331(dxs)
CTA: CTA_0359(dxs)
CMU: TC0608
CPN: CPn1060(tktB_2)
CPA: CP0790
CPJ: CPj1060(tktB_2) CPT: CpB1102
CCA: CCA00304(dxs) CAB: CAB301(dxs)
CFE: CF0699(dxs)
PCU: pc0619(dxs)
TPA: TP0824
TDE: TDE1910(dxs)
LIL: LA3285(dxs)
LIC: LIC10863(dxs)
LBJ: LBJ_0917(dxs)
LBL: LBL_0932(dxs) SYN: sll1945(dxs)
SYW: SYNW1292(Dxs) SYC: syc1087_c(dxs) SYF: Synpcc7942_0430 SYD: Syncc9605_1430 SYE: Syncc9902_1069 SYG: sync_1410(dxs) SYR: SynRCC307_1390(dxs) SYX: SynWH7803_1223(dxs) CYA: CYA_1701(dxs) CYB: CYB_1983(dxs) TEL: tll0623
GVI: gM0194
ANA: alr0599
AVA: Ava_4532
PMA: Pro0928(dxs) PMM: PMM0907(Dxs) PMT: PMT0685(dxs) PMN: PMN2A_0300
PMI: PMT9312_0893 PMB: A9601_09541(dxs) P M C : P 9515 _ 09901 (d xs )
PMF: P9303_15371(dxs)
PMG: P9301_09521(dxs)
PMH: P9215_09851
PMJ: P9211_08521
PME: NATL1_09721(dxs)
TER: Tery_3042
BTH: BT_1403 BT_4099
BFR: BF0873 BF4306
BFS: BF0796(dxs) BF4114
PGI: PG2217(dxs)
CHU: CHU_3643(dxs)
GFO: GFO_3470(dxs)
FPS: FP0279(dxs)
CTE: CT0337(dxs)
CPH: Cpha266_0671
PVI: Cvib_0498
PLT: Plut_0450
DET: DET0745(dxs)
DEH: cbdb_A720(dxs)
DRA: DR_1475
DGE: Dgeo_0994
TTH: TTC1614
TTJ: TTHA0006
AAE: aq_881
TMA: TM1770
PMO: Pmob_1001
Ácidos nucleicos y polipéptidos de acetil-CoA-acetiltransferasa a modo de ejemplo HSA: 38(ACAT1) 39(ACAT2)
PTR: 451528(ACAT1)
MCC: 707653(ACAT1) 708750(ACAT2)
MMU: 110446(Acat1) 110460(Acat2)
RNO: 25014(Acat1)
CFA: 484063(ACAT2) 489421(ACAT1)
GGA: 418968(ACAT1) 421587(RCJMB04_34i5)
XLA: 379569(MGC69098) 414622(MGC81403) 414639(MGC81256) 444457(MGC83664) XTR: 394562(acat2)
DRE: 30643(acat2)
SPU: 759502(LOC759502)
DME: Dmel_CG10932 Dmel_CG9149
CEL: T02G5.4 T02G5.7 T02G5.8(kat-1)
ATH: AT5G48230(ACAT2/EMB1276)
OSA: 43261364346520
CME: CMA042C CME087C
SCE: YPL028W(ERG10)
AGO: AGOS_ADR165C
PIC: PICST_31707(ERG10)
CAL: CaO19.1591(erg10)
CGR: CAGL0L12364g
SPO: SPBC215.09c
MGR: MGG_01755 MGG_13499
ANI: AN1409.2
AFM: AFUA_6G14200 AFUA_8G04000
AOR: AO090103000012 AO090103000406
CNE: CNC05280
UMA: UM03571.1
DDI: DDB_0231621
PFA: PF14_0484
TET: TTHERM_00091590 TTHERM_00277470 TTHERM_00926980
TCR: 511003.60
ECO: b2224(atoB)
ECJ: JW2218(atoB) JW5453(yqeF)
ECE: Z4164(yqeF)
ECS: ECs3701
ECC: c2767(atoB) c3441(yqeF)
ECI: UTI89_C2506(atoB) UTI89_C3247(yqeF)
ECP: ECP_2268 ECP_2857
ECV: APECO1_3662(yqeF) APECO1_4335(atoB) APECO1_43352(atoB) ECX: EcHS_A2365
STY: STY3164(yqeF)
STT: t2929(yqeF)
SPT: SPA2886(yqeF)
SEC: SC2958(yqeF)
STM: STM3019(yqeF)
SFL: SF2854(yqeF)
SFX: S3052(yqeF)
SFV: SFV_2922(yqeF)
SSN: SSON_2283(atoB) SSON_3004(yqeF)
SBO: SBO_2736(yqeF)
ECA: ECA1282(atoB)
ENT: Ent638_3299
SPE: Spro_0592
HIT: NTHI0932(atoB)
XCC: XCC1297(atoB)
XCB: XC_2943
XCV: XCV1401(thlA)
XAC: XAC1348(atoB)
XOO: XOO1881(atoB)
XOM: XOO_1778(XOO1778)
VCH: VCA0690
VCO: VC0395_0630
VVU: VV2_0494 VV2_0741
VVY: VVA1043 VVA1210
VPA: VPA0620 VPA1123 VPA1204
PPR: PBPRB1112 PBPRB1840
PAE: PA2001(atoB) PA2553 PA3454 PA3589 PA3925
PAU: PA14_38630(atoB)
PPU: PP_2051(atoB) PP_2215(fadAx) PP_3754 PP_4636
PPF: Pput_2009 Pput_2403 Pput_3523 Pput_4498
PST: PSPTO_0957(phbA-1) PSPTO_3164(phbA-2)
PSB: Psyr_0824 Psyr_3031
PSP: PSPPH_0850(phbA1) PSPPH_2209(phbA2)
PFL: PFL_1478(atoB-2) PFL_2321 PFL_3066 PFL_4330(atoB-2) PFL_5283 PFO: Pfl_1269 Pfl_1739 Pfl_2074 Pfl_2868
PEN: PSEEN3197 PSEEN3547(fadAx) PSEEN4635(phbA)
PMY: Pmen_1138 Pmen_2036 Pmen_3597 Pmen_3662 Pmen_3820 PAR: Psyc_0252 Psyc_1169
PCR: Pcryo_0278 Pcryo_1236 Pcryo_1260
PRW: PsycPRwf_2011
ACI: ACIAD0694 ACIAD1612 ACIAD2516(atoB)
SON: SO_1677(atoB)
SDN: Sden_1943
SFR: Sfri_1338 Sfri_2063
SAZ: Sama_1375
SBL: Sbal_1495
SBM: Shew185_1489
SBN: Sbal195_1525
SLO: Shew_1667 Shew_2858
SPC: Sputcn32_1397
SSE: Ssed_1473 Ssed_3533
SPL: Spea_2783
SHE: Shewmr4_2597
SHM: Shewmr7_2664
SHN: Shewana3_2771
SHW: Sputw3181_2704
ILO: IL0872
CPS: CPS_1605 CPS_2626
PHA: PSHAa0908 PSHAa1454(atoB) PSHAa1586(atoB)
PAT: Patl_2923
SDE: Sde_3149
PIN: Ping_0659 Ping_2401
MAQ: Maqu_2117 Maqu_2489 Maqu_2696 Maqu_3162
CBU: CBU_0974
LPN: lpg1825(atoB)
LPF: lpl1789
LPP: lpp1788
NOC: Noc_1891
AEH: Mlg_0688 Mlg_2706
HHA: Hhal_1685
HCH: HCH_05299
CSA: Csal_0301 Csal_3068
ABO: ABO_0648(fadAx)
MMW: Mmwil1_0073 Mmwil1_3021 Mmwil1_3053 Mmwil1_3097 Mmwil1_4182
AHA: AHA_2143(atoB)
CVI: CV_2088(atoB) CV_2790(phaA)
RSO: RSc0276(atoB) RSc1632(phbA) RSc1637(bktB) RSc1761(RS02948)
REU: Reut_A0138 Reut_A1348 Reut_A1353 Reut_B4561 Reut_B4738 Reut_B5587 Reut_C5943 Reut_C6062 REH: H16_A0170 H16_A0867 H16_A0868 H16_A0872 H16_A1297 H16_A1438(phaA) H16_A1445(bktB) H16_A1528 H16_A1713 H16_A1720 H16_A1887 H16_A2148 H16_B0380 H16_B0381 H16_B0406 H16_B0662 H16_B0668 H16_B0759 H16_B1369 H16_B1771
RME: Rmet_0106 Rmet_1357 Rmet_1362 Rmet_5156
BMA: BMA1316 BMA1321(phbA) BMA1436
BMV: BMASAVP1_A1805(bktB) BMASAVP1_A1810(phbA)
BML: BMA10299_A0086(phbA) BMA10299_A0091
BMN: BMA10247_1076(bktB) BMA10247_1081(phbA)
BXE: Bxe_A2273 Bxe_A2335 Bxe_A2342 Bxe_A4255 Bxe_B0377 Bxe_B0739 Bxe_C0332 Bxe_C0574 Bxe_C0915 BVI: Bcep1808_0519 Bcep1808_1717 Bcep1808_2877 Bcep1808_3594 Bcep1808_4015 Bcep1808_5507 Bcep1808_5644
BUR: Bcep18194_A3629 Bcep18194_A5080 Bcep18194_A5091 Bcep18194_A6102 Bcep18194_B0263 Bcep18194_B1439 Bcep18194_C6652 Bcep18194_C6802 Bcep18194_C6874 Bcep18194_C7118 Bcep18194_C7151 Bcep18194_C7332
BCN: Bcen_1553 Bcen_1599 Bcen_2158 Bcen_2563 Bcen_2998 Bcen_6289
BCH: Bcen2424_0542 Bcen2424_1790 Bcen2424_2772 Bcen2424_5368 Bcen2424_6232 Bcen2424_6276 BAM: Bamb_0447 Bamb_1728 Bamb_2824 Bamb_4717 Bamb_5771 Bamb_5969
BPS: BPSL1426 BPSL1535(phbA) BPSL1540
BPM: BURPS1710b_2325(bktB) BURPS 1710b_2330(phbA) BURPS 1710b_2453(atoB-2)
BPL: BURPS1106A_2197(bktB) BURPS1106A_2202(phbA)
BPD: BURPS668_2160(bktB) BURPS668_2165(phbA)
BTE: BTH_I2144 BTH_I2256 BTH_I2261
PNU: Pnuc_0927
BPE: BP0447 BP0668 BP2059
BPA: BPP0608 BPP1744 BPP3805 BPP4216 BPP4361
BBR: BB0614 BB3364 BB4250 BB4804 BB4947
RFR: Rfer_0272 Rfer_1000 Rfer_1871 Rfer_2273 Rfer_2561 Rfer_2594 Rfer_3839 POL: Bpro_1577 Bpro_2140 Bpro_3113 Bpro_4187
PNA: Pnap_0060 Pnap_0458 Pnap_0867 Pnap_1159 Pnap_2136 Pnap_2804 AAV: Aave_0031 Aave_2478 Aave_3944 Aave_4368
AJS: Ajs_0014 Ajs_0124 Ajs_1931 Ajs_2073 Ajs_2317 Ajs_3548 Ajs_3738 Ajs_3776 VEI: Veis_1331 Veis_3818 Veis_4193
DAC: Daci_0025 Daci_0192 Daci_3601 Daci_5988
MPT: Mpe_A1536 Mpe_A1776 Mpe_A1869 Mpe_A3367
HAR: HEAR0577(phbA)
MMS: mma_0555
NEU: NE2262(bktB)
NET: Neut_0610
EBA: ebA5202 p2A409(tioL)
AZO: azo0464(fadA1) azo0469(fadA2) azo2172(thlA)
DAR: Daro_0098 Daro_3022
HPA: HPAG1_0675
HAC: Hac_0958(atoB)
GME: Gmet_1719 Gmet_2074 Gmet_2213 Gmet_2268 Gmet_3302
GUR: Gura_3043
BBA: Bd0404(atoB) Bd2095
DOL: Dole_0671 Dole_1778 Dole_2160 Dole_2187
ADE: Adeh_0062 Adeh_2365
AFW: Anae109_0064 Anae109_1504
MXA: MXAN_3791
SAT: SYN_02642
SFU: Sfum_2280 Sfum_3582
RPR: RP737
RCO: RC1134 RC1135
RFE: RF_0163(paaJ)
RBE: RBE_0139(paaJ)
RAK: A1C_05820
RBO: A1I_07215
RCM: A1E_04760
PUB: SAR11_0428(thlA)
MLO: mlr3847
MES: Meso_3374
PLA: Plav_1573 Plav_2783
SME: SMa1450 SMc03879(phbA)
SMD: Smed_0499 Smed_3117 Smed_5094 Smed_5096
ATU: Atu2769(atoB) Atu3475
ATC: AGR_C_5022(phbA) AGR_L_2713
RET: RHE_CH04018(phbAch) RHE_PC00068(ypc00040) RHE_PF00014(phbAf)
RLE: RL4621(phaA) pRL100301 pRL120369
BME: BMEI0274 BMEII0817
BMF: BAB1_1783(phbA-1) BAB2_0790(phbA-2)
BMS: BR1772(phbA-1) BRA0448(phbA-2)
BMB: BruAb1_1756(phbA-1) BruAb2-0774(phbA-2)
BOV: BOV_1707(phbA-1)
OAN: Oant_1130 Oant_3107 Oant_3718 Oant_4020
BJA: bll0226(atoB) bll3949 bll7400 bll7819 blr3724(phbA)
BRA: BRADO0562(phbA) BRADO0983(pimB) BRADO3110 BRADO3134(atoB)
BBT: BBta_3558 BBta_3575(atoB) BBta_5147(pimB) BBta_7072(pimB) BBta_7614(phbA) RPA: RPA0513(pcaF) RPA0531 RPA3715(pimB)
RPB: RPB_0509 RPB_0525 RPB_1748
RPC: RPC_0504 RPC_0636 RPC_0641 RPC_0832 RPC_1050 RPC_2005 RPC_2194 RPC_2228 RPD: RPD_0306 RPD_0320 RPD_3105 RPD_3306
RPE: RPE_0168 RPE_0248 RPE_3827
NWI: Nwi_3060
XAU: Xaut_3108 Xaut_4665
CCR: CC_0510 CC_0894 CC_3462
SIL: SPO0142(bktB) SPO0326(phbA) SPO0773 SPO3408
SIT: TM1040_0067 TM1040_2790 TM1040_3026 TM1040_3735 RSP: RSP_0745 RSP_1354 RSP_3184
RSH: Rsph17029_0022 Rsph17029_2401 Rsph17029_3179 Rsph17029_3921 RSQ: Rsph17025_0012 Rsph17025_2466 Rsph17025_2833
JAN: Jann_0262 Jann_0493 Jann_4050
RDE: RD1_0025 RD1_0201(bktB) RD1_3394(phbA)
PDE: Pden_2026 Pden_2663 Pden_2870 Pden_2907 Pden_4811 Pden_5022 DSH: Dshi_0074 Dshi_3066 Dshi_3331
MMR: Mmar10_0697
HNE: HNE_2706 HNE_3065 HNE_3133
NAR: Saro_0809 Saro_1069 Saro_1222 Saro_2306 Saro_2349
SAL: Sala_0781 Sala_1244 Sala_2896 Sala_3158
SWI: Swit_0632 Swit_0752 Swit_2893 Swit_3602 Swit_4887 Swit_5019 Swit_5309 ELI: ELI_01475 ELI_06705 ELM2035
GBE: GbCGDNIH1_0447
ACR: Acry_1847 Acry_2256
RRU: Rru_A0274 Rru_A1380 Rru_A1469 Rru_A1946 Rru_A3387
MAG: amb0842
MGM: Mmc1_1165
ABA: Acid345_3239
BSU: BG11319(mmgA) BG13063(yhfS)
BHA: BH1997 BH2029 BH3801(mmgA)
BAN: BA3687 BA4240 BA5589
BAR: GBAA3687 GBAA4240 GBAA5589
BAA: BA_0445 BA_4172 BA_4700
BAT: BAS3418 BAS3932 BAS5193
BCE: BC3627 BC4023 BC5344
BCA: BCE_3646 BCE_4076 BCE_5475
BCZ: BCZK3329(mmgA) BCZK3780(thl) BCZK5044(atoB)
BCY: Bcer98_2722 Bcer98_3865
BTK: BT9727_3379(mmgA) BT9727_3765(thl) BT9727_5028(atoB)
BTL: BALH_3262(mmgA) BALH_3642(fadA) BALH_4843(atoB)
BLI: BL03925(mmgA)
BLD: BLi03968(mmgA)
BCL: ABC0345 ABC2989 ABC3617 ABC3891(mmgA)
BAY: RBAM_022450
BPU: BPUM_2374(yhfS) BPUM_2941 BPUM_3373
OIH: OB0676 OB0689 OB2632 OB3013
GKA: GK1658 GK3397
SAU: SA0342 SA0534(vraB)
SAV: SAV0354 SAV0576(vraB)
SAM: MW0330 MW0531(vraB)
SAR: SAR0351(thl) SAR0581
SAS: SAS0330 SAS0534
SAC: SACOL0426 SACOL0622(atoB)
SAB: SAB0304(th1) SAB0526
SAA: SAUSA300_0355 SAUSA300_0560(vraB)
SAO: SAOUHSC_00336 SAOUHSC_00558
SAJ: SaurJH9_0402
SAH: SaurJH1_0412
SEP: SE0346 SE2384
SER: SERP0032 SERP0220
SHA: SH0510(mvaC) SH2417
SSP: SSP0325 SSP2145
LMO: lmo1414
LMF: LMOf2365_1433
LIN: lin1453
LWE: lwe1431
LLA: L11745(thiL) L25946(fadA)
LLC: LACR_1665 LACR_1956
LLM: llmg_0930(thiL)
SPY: SPy_0140 SPy_1637(atoB)
SPZ: M5005_Spy_0119 M5005_Spy_0432 M5005_Spy_1344(atoB) SPM: spyM18_0136 spyM18_1645(atoB)
SPG: SpyM3_0108 SpyM3_1378(atoB)
SPS: SPs0110 SPs0484
SPH: MGAS10270_Spy0121 MGAS10270_Spy0433 MGAS10270_Spy1461(atoB) SPI: MGAS10750_Spy0124 MGAS10750_Spy0452 MGAS10750_Spy1453(atoB) SPJ: MGAS2096_Spy0123 MGAS2096_Spy0451 MGAS2096_Spy1365(atoB) SPK: MGAS9429_Spy0121 MGAS9429_Spy0431 MGAS9429_Spy1339(atoB) SPF: SpyM50447(atoB2)
SPA: M6_Spy0166 M6_Spy0466 M6_Spy1390
SPB: M28_Spy0117 M28_Spy0420 M28_Spy1385(atoB)
SAK: SAK_0568
LJO: LJ1609
LAC: LBA0626(thiL)
LSA: LSA1486
LDB: Ldb0879
LBU: LBUL_0804
LBR: LVIS_2218
LCA: LSEI_1787
LGA: LGAS_1374
LRE: Lreu_0052
EFA: EF1364
OOE: OEOE_0529
STH: STH2913 STH725 STH804
CAC: CAC2873 CA_P0078(thiL)
CPE: CPE2195(atoB)
CPF: CPF_2460
CPR: CPR_2170
CTC: CTC00312
CNO: NT01CX_0538 NT01CX_0603
CDF: CD1059(thlA1) CD2676(thlA2)
CBO: CBO3200(thl)
CBE: Cbei_0411 Cbei_3630
CKL: CKL_3696(thlA1) CKL_3697(thlA2) CKL_3698(thlA3)
AMT: Amet_4630
AOE: Clos_0084 Clos_0258
CHY: CHY_1288 CHY_1355(atoB) CHY_1604 CHY_1738
DSY: DSY0632 DSY0639 DSY1567 DSY1710 DSY2402 DSY3302
DRM: Dred_0400 Dred_1491 Dred_1784 Dred_1892
SWO: Swol_0308 Swol_0675 Swol_0789 Swol_1486 Swol_1934 Swol_2051
TTE: TTE0549(paaJ)
MTA: Moth_1260
MTU: Rv1135A Rv1323(fadA4) Rv3546(fadA5)
MTC: MT1365(phbA)
MBO: Mb1167 Mb1358(fadA4) Mb3576(fadA5) Mb3586c(fadA6)
MBB: BCG_1197 BCG_1385(fadA4) BCG_3610(fadA5) BCG_3620c(fadA6)
MLE: ML1158(fadA4)
MPA: MAP2407c(fadA3) MAP2436c(fadA4)
MAV: MAV_1544 MAV_1573 MAV_1863 MAV_5081
MSM: MSMEG_2224 MSMEG_4920
MUL: MUL_0357
MVA: Mvan_1976 Mvan_1988 Mvan_4305 Mvan_4677 Mvan_4891
MGI: Mflv_1347 Mflv_1484 Mflv_2040 Mflv_2340 Mflv_4356 Mflv_4368
MMC: Mmcs_1758 Mmcs_1769 Mmcs_3796 Mmcs_3864
MKM: Mkms_0251 Mkms_1540 Mkms_1805 Mkms_1816 Mkms_2836 Mkms_3159 Mkms_3286 Mkms_3869 Mkms_3938 Mkms_4227 Mkms_4411 Mkms_4580 Mkms_4724 Mkms_4764 Mkms_4776
MJL: Mjls_0231 Mjls_1739 Mjls_1750 Mjls_2819 Mjls_3119 Mjls_3235 Mjls_3800 Mjls_3850 Mjls_4110 Mjls_4383 Mjls_4705 Mjls_4876 Mjls_5018 Mjls_5063 Mjls_5075
CGL: NCgl2309(cg12392)
CGB: cg2625(pcaF)
CEF: CE0731 CE2295
CJK: jk1543(fadA3)
NFA: nfa10750(fadA4)
RHA: RHA1_ro01455 RHA1_ro01623 RHA1_ro01876 RHA1_ro02517(catF) RHA1_ro03022 RHA1_ro03024 RHA1_ro03391 RHA1_ro03892 RHA1_ro04599 RHA1_ro05257 RHA1_ro08871
SCO: SCO5399(SC8F4.03)
SMA: SAV1384(fadA5) SAV2856(fadA1)
ART: Arth_1160 Arth_2986 Arth_3268 Arth_4073
NCA: Noca_1371 Noca_1797 Noca_1828 Noca_2764 Noca_4142
TFU: Tfu_1520 Tfu_2394
FRA: Francci3_3687
FRE: Franeanl 1044 Franeanl 2711 Franeanl 2726 Franeanl 3929 Franeanl 4037 Franeanl 4577
FAL: FRAAL2514 FRAAL2618 FRAAL5910(atoB)
ACE: Acel_0626 Acel_0672
SEN: SACE_1192(mmgA) SACE_2736(fadA6) SACE_4011(catF) SACE_6236(fadA4)
STP: Strop_3610
SAQ: Sare_1316 Sare_3991
RXY: Rxil_1582 Rxil_1842 Rxil_2389 Rxil_2530
FNU: FN0495
BGA: BG0110(fadA)
BAF: BAPKO_0110(fadA)
LIL: LA0457(thiL1) LA0828(thiL2) LA4139(fadA)
LIC: LIC10396(phbA)
LBJ: LBJ_2862(paaJ-4)
LBL: LBL_0209(paaJ-4)
SYN: slr1993(phaA)
SRU: SRU_1211(atoB) SRU_1547
CHU: CHU_1910(atoB)
GFO: GFO_1507(atoB)
FJO: Fjoh_4612
FPS: FP0770 FP1586 FP1725
RRS: RoseRS_3911 RoseRS_4348
RCA: Rcas_0702 Rcas_3206
HAU: Haur_0522
DRA: DR_1072 DR_1428 DR_1960 DR_2480 DR_A0053
DGE: Dgeo_0755 Dgeo_1305 Dgeo_1441 Dgeo_1883
TTH:TTC0191 TTC0330
TTJ: TTHA0559
TME: Tmel_1134
FNO: Fnod_0314
PMO: Pmob_0515
HMA: rrnAC0896(acaB3) rrnAC2815(aca2) rrnAC3497(yqeF) rrnB0240(aca1) rrnB0242(acaB2) rrnB0309(acaB1) TAC: Ta0582
TVO: TVN0649
PTO: PTO1505
APE: APE_2108
SSO: SSO2377(acaB-4)
STO: ST0514
SAI: Saci_0963 Saci_1361(acaB1)
MSE: Msed_0656
PAI: PAE1220
PIS: Pisl_0029 Pisl_1301
PCL: Pcal_0781
PAS: Pars_0309 Pars_1071
CMA: Cmaq_1941
Ácidos nucleicos y polipéptidos de HMG-CoA sintasa a modo de ejemplo HSA: 3157(HMGCS1) 3158(HMGCS2)
PTR: 457169(HMGCS2) 461892(HMGCS1)
MCC: 702553(HMGCS1) 713541(HMGCS2)
MMU: 15360(Hmgcs2) 208715(Hmgcs1)
RNO: 24450(Hmgcs2) 29637(Hmgcs1)
CFA: 479344(HMGCS1) 607923(HMGCS2)
BTA: 407767(HMGCS1)
SSC: 397673(CH242-38B5.1)
GGA: 396379(HMGCS1)
XLA: 380091(hmgcs1) 447204(MGC80816)
DRE: 394060(hmgcs1)
SPU: 578259(LOC578259)
DME: Dmel_CG4311(Hmgs)
CEL: F25B4.6
ATH: AT4G11820(BAP1)
OSA: 43314184347614
CME: CMM189C
SCE: YML126C(ERG13)
AGO: AGOS_ADL356C
PIC: PICST_83020
CAL: CaO19_7312(CaO19.7312)
CGR: CAGLOH04081g
SPO: SPAC4F8.14c(hcs)
MGR: MGG_01026
ANI: AN4923.2
AFM: AFUA_3G10660 AFUA_8G07210
AOR: AO090003000611 AO090010000487 CNE: CNC05080 CNG02670
UMA: UM05362.1
ECU: ECU10_0510
DDI: DDBDRAFT_0217522 DDB_0219924(hgsA) TET: TTHERM_00691190
TBR: Tb927.8.6110
YPE: YPO1457
YPK: y2712(pksG)
YPM: YP_1349(pksG)
YPA: YPA_0750
YPN: YPN_2521
YPP: YPDSF_1517
YPS: YPTB1475
CBD: COXBU7E912_1931
TCX: Tcr_1719
DNO: DNO_0799
BMA: BMAA1212
BPS: BPSS1002
BPM: BURPS 1710b_A2613
BPL: BURPS1106A_A1384
BPD: BURPS668_A1470
BTE: BTH_II1670
MXA: MXAN_3948(tac) MXAN_4267(mvaS) BSU: BG10926(pksG)
OIH: OB2248
SAU: SA2334(mvaS)
SAV: SAV2546(mvaS)
SAM: MW2467(mvaS)
SAR: SAR2626(mvaS)
SAS: SAS2432
SAC: SACOL2561
SAB: SAB2420(mvaS)
SAA: SAUSA300_2484
SAO: SAOUHSC_02860
SAJ: SaurJH9_2569
SAH: SaurJH1_2622
SEP: SE2110
SER: SERP2122
SHA: SH0508(mvaS)
SSP: SSP0324
LMO: lmo1415
LMF: LMOf2365_1434(mvaS) LIN: lin1454
LWE: lwe1432(mvaS)
LLA: L13187(hmcM)
LLC: LACR_1666
LLM: llmg_0929(hmcM)
SPY: SPy_0881(mvaS.2)
SPZ: M5005_Spy_0687(mvaS.1) SPM: spyM18_0942(mvaS2) SPG: SpyM3_0600(mvaS.2) SPS: SPs1253
SPH: MGAS10270_Spy0745(mvaS1) SPI: MGAS10750_Spy0779(mvaS1) SPJ: MGAS2096_Spy0759(mvaS1) SPK: MGAS9429_Spy0743(mvaS1) SPF: SpyM51121(mvaS)
SPA: M6_Spy0704
SPB: M28_Spy0667(mvaS.1) SPN: SP_1727
SPR: spr1571(mvaS)
SPD: SPD_1537(mvaS) SAG: SAG1316
SAN: gbs1386
SAK: SAK_1347 SMU: SMU.943c STC: str0577(mvaS) STL: stu0577(mvaS) STE: STER_0621 SSA: SSA_0338(mvaS) SSU: SSU05_1641 SSV: SSU98_1652 SGO: SGO_0244 LPL: lp_2067(mvaS) LJO: LJ1607
LAC: LBA0628(hmcS) LSA: LSA1484(mvaS) LSL: LSL_0526
LDB: Ldb0881(mvaS) LBU: LBUL_0806 LBR: LVIS_1363 LCA: LSEI_1785 LGA: LGAS_1372 LRE: Lreu_0676 PPE: PEPE_0868 EFA: EF1363
OOE: OEOE_0968 LME: LEUM_1184 NFA: nfa22120
SEN: SACE_4570(pksG) BBU: BB0683
BGA: BG0706
BAF: BAPKO_0727 FJO: Fjoh_0678 HAL: VNG1615G(mvaB)
HMA: rrnAC1740(mvaS)
HWA: HQ2868A(mvaB)
NPH: NP2608A(mvaB_1) NP4836A(mvaB_2)
Ácidos nucleicos y polipéptidos de hidroximetilglutaril-CoA reductasa a modo de ejemplo HSA: 3156(HMGCR)
PTR: 471516(HMGCR)
MCC: 705479(HMGCR)
MMU: 15357(Hmgcr)
RNO: 25675(Hmgcr)
CFA: 479182(HMGCR)
BTA: 407159(HMGCR)
GGA: 395145(RCJMB04_14m24)
SPU: 373355(LOC373355)
DME: Dmel_CG10367(Hmgcr)
CEL: F08F8.2
OSA: 4347443
SCE: ILR450W(HMG2) YML075C(HMG1)
AGO: AGOS_AER152W
CGR: CAGL0L11506g
SPO: SPCC162.09c(hmg1)
ANI: AN3817.2
AFM: AFUA_1G11230 AFUA_2G03700
AOR: AO090103000311 AO090120000217
CNE: CNF04830
UMA: UM03014.1
ECU: ECU10_1720
DDI: DDB_0191125(hmgA) DDB_0215357(hmgB)
TBR: Tb927.6.4540
TCR: 506831.40509167.20
LMA: LmjF30.3190
VCH: VCA0723
VCO: VC0395_0662
VVU: VV2_0117
VVY: VVA0625
VPA: VPA0968
VFI: VFA0841
PAT: Patl_0427
CBU: CBU_0030 CBU_0610
CBD: COXBU7E912_0151 COXBU7E912_0622(hmgA) TCX: Tcr_1717
DNO: DNO_0797
CVI: CV_1806
SUS: Acid_5728 Acid_6132
SAU: SA2333(mvaA)
SAV: SAV2545(mvaA)
SAM: MW2466(mvaA)
SAB: SAB2419c(mvaA)
SEP: SE2109
LWE: lwe0819(mvaA)
LLA: L10433(mvaA)
LLC: LACR_1664
LLM: llmg_0931(mvaA)
SPY: SPy_0880(mvaS.1)
SPM: spyM18_0941(mvaS1)
SPG: SpyM3_0599(mvaS.1)
SPS: SPs1254
SPH: MGAS10270_Spy0744
SPI: MGAS10750_Spy0778
SPJ: MGAS2096_Spy0758
SPK: MGAS9429_Spy0742
SPA: M6_Spy0703
SPN: SP_1726
SAG: SAG1317
SAN: gbs1387
STC: str0576(mvaA)
STL: stu0576(mvaA)
STE: STER_0620
SSA: SSA_0337(mvaA)
LPL: lp_0447(mvaA)
LJO: LJ1608
LSL: LSL_0224
LBR: LVIS_0450
LGA: LGAS_1373
EFA: EF1364
NFA: nfa22110
BGA: BG0708(mvaA)
SRU: SRU_2422
FPS: FP2341
MMP: MMP0087(hmgA)
MMQ: MmarC5_1589
MAC: MA3073(hmgA)
MBA: Mbar_A1972
MMA: MM_0335
MBU: Mbur_1098
MHU: Mhun_3004
MEM: Memar_2365
MBN: Mboo_0137
MTH: MTH562
MST: Msp_0584(hmgA)
MSI: Msm_0227
MKA: MK0355(HMG1)
AFU: AF1736(mvaA)
HAL: VNG1875G(mvaA)
HMA: rrnAC3412(mvaA)
HWA: HQ3215A(hmgR)
NPH: NP0368A(mvaA_2) NP2422A(mvaA_1) TAC: Ta0406m
TVO: TVN1168
PTO: PTO1143
PAB: PAB2106(mvaA)
PFU:PF1848
TKO: TK0914
RCI: RCIX1027(hmgA) RCIX376(hmgA)
APE: APE_1869
IHO: Igni_0476
HBU: Hbut_1531
SSO: SSO0531
STO: ST1352
SAI: Saci_1359
PAI: PAE2182
PIS: Pisl_0814
PCL: Pcal_1085
PAS: Pars_0796
Ácidos nucleicos y polipéptidos de mevalonato cinasa a modo de ejemplo HSA: 4598(MVK)
MCC: 707645(MVK)
MMU: 17855(Mvk)
RNO: 81727(Mvk)
CFA: 486309(MVK)
BTA: 505792(MVK)
GGA: 768555(MVK)
DRE: 492477(zgc:103473)
SPU: 585785(LOC585785)
DME: Dmel_CG33671
OSA: 4348331
SCE: YMR208W(ERG12)
AGO: AGOS_AER335W
PIC: PICST_40742(ERG12)
CGR: CAGL0F03861g
SPO: SPAC13G6.11c
MGR: MGG_06946
ANI: AN3869.2
AFM: AFUA_4G07780
AOR: AO090023000793
CNE: CNK01740
ECU: ECU09_1780
DDI: DDBDRAFT_0168621 TET: TTHERM_00637680 TBR: Tb927.4.4070
TCR: 436521.9509237.10 LMA: LmjF31.0560
CBU: CBU_0608 CBU_0609 CBD: COXBU7E912_0620(mvk) LPN: lpg2039
LPF: lpl2017
LPP: lpp2022
BBA: Bd1027(lmbP) Bd1630(mvk) MXA: MXAN_5019(mvk)
OIH: OB0225
SAU: SA0547(mvaK1)
SAV: SAV0590(mvaK1)
SAM: MW0545(mvaK1)
SAR: SAR0596(mvaK1)
SAS: SAS0549
SAC: SACOL0636(mvk)
SAB: SAB0540(mvaK1)
SAA: SAUSA300_0572(mvk) SAO: SAOUHSC_00577
SEP: SE0361
SER: SERP0238(mvk)
SHA: SH2402(mvaK1)
SSP: SSP2122
LMO: lmo0010
LMF: LMOf2365 0011
LIN: lin0010
LWE: lwe0011(mvk)
LLA: L7866(yeaG)
LLC: LACR_0454
LLM: llmg_0425(mvk)
SPY: SPy_0876(mvaK1)
SPZ: M5005_Spy_0682(mvaK1) SPM: spyM18_0937(mvaK1) SPG: SpyM3_0595(mvaK1)
SPS: SPs1258
SPH: MGAS10270_Spy0740(mvaK1) SPI: MGAS10750_Spy0774(mvaK1) SPJ: MGAS2096_Spy0753(mvaK1) SPK: MGAS9429_Spy0737(mvaK1) SPF: SpyM51126(mvaK1)
SPA: M6_Spy0699
SPB: M28_Spy0662(mvaK1) SPN: SP_0381
SPR: spr0338(mvk)
SPD: SPD_0346(mvk)
SAG: SAG1326
SAN: gbs1396
SAK: SAK_1357(mvk)
SMU: SMU.181
STC: str0559(mvaK1)
STL: stu0559(mvaK1)
STE: STER_0598
SSA: SSA_0333(mvaK1)
SSU: SSU05_0289
SSV: SSU98_0285
SGO: SGO_0239(mvk)
LPL: lp_1735(mvaK1)
LJO: LJ1205
LAC: LBA1167(mvaK) LSA: LSA0908(mvaK1) LSL: LSL_0685(eRG) LDB: Ldb0999(mvk) LBU: LBUL_0906 LBR: LVIS_0858 LCA: LSEI_1491 LGA: LGAS_1033 LRE: Lreu_0915 PPE: PEPE_0927 EFA: EF0904(mvk) OOE: OEOE_1100 LME: LEUM_1385 NFA: nfa22070 BGA: BG0711
BAF: BAPKO_0732 FPS: FP0313 MMP: MMP1335 MAE: Maeo_0775 MAC: MA0602(mvk) MBA: Mbar_A1421 MMA: MM_1762 MBU: Mbur_2395 MHU: Mhun_2890 MEM: Memar_1812 MBN: Mboo_2213 MST: Msp_0858(mvk) MSI: Msm_1439 MKA: MK0993(ERG12) HAL: VNG1145G(mvk) HMA: rrnAC0077(mvk) HWA: HQ2925A(mvk) NPH: NP2850A(mvk) PTO: PTO1352
PHO: PH1625
PAB: PAB0372(mvk)
PFU: PF1637(mvk)
TKO: TK1474
RCI: LRC399(mvk)
APE: APE_2439
HBU: Hbut_0877
SSO: SSO0383
STO:ST2185
SAI: Saci_2365(mvk)
MSE: Msed_1602
PAI: PAE3108
PIS: Pisl_0467
PCL: Pcal_1835
Ácidos nucleicos y polipéptidos de fosfomevalonato cinasa a modo de ejemplo HSA: 10654(PMVK)
PTR: 457350(PMVK)
MCC: 717014(PMVK)
MMU: 68603(Pmvk)
CFA: 612251(PMVK)
BTA: 513533(PMVK)
DME: Dmel_CG10268
ATH: AT1G31910
OSA: 4332275
SCE: YMR220W(ERG8)
AGO: AGOS_AER354W
IC: PICST_52257(ERG8)
CGR: CAGL0F03993g
SPO: SPAC343.01c
MGR: MGG_05812
ANI: AN2311.2
AFM: AFUA 5G10680
AOR: AO090010000471 CNE: CNM00100
UMA: UM00760.1
DDI: DDBDRAFT_0184512 TBR: Tb09.160.3690
TCR: 507913.20508277.140 LMA: LmjF15.1460
MXA: MXAN_5017
OIH: OB0227
SAU: SA0549(mvaK2)
SAV: SAV0592(mvaK2) SAM: MW0547(mvaK2) SAR: SAR0598(mvaK2) SAS: SAS0551
SAC: SACOL0638
SAB: SAB0542(mvaK2) SAA: SAUSA300_0574 SAO: SAOUHSC_00579 SAJ: SaurJH9_0615
SEP: SE0363
SER: SERP0240
SHA: SH2400(mvaK2)
SSP: SSP2120
LMO: lmo0012
LMF: LMOf2365_0013
LIN: lin0012
LWE: lwe0013
LLA: L10014(yebA)
LLC: LACR_0456
LLM: llmg_0427
SPY: SPy_0878(mvaK2) SPZ: M5005_Spy_0684(mvaK2) SPM: spyM18_0939
SPG: SpyM3_0597(mvaK2)
SPS: SPs1256
SPH: MGAS10270_Spy0742(mvaK2) SPI: MGAS10750_Spy0776(mvaK2) SPJ: MGAS2096_Spy0755(mvaK2) SPK: MGAS9429_Spy0739(mvaK2) SPF: SpyM51124(mvaK2)
SPA: M6_Spy0701
SPB: M28_Spy0664(mvaK2) SPN: SP_0383
SPR: spr0340(mvaK2)
SPD: SPD_0348(mvaK2)
SAG: SAG1324
SAN: gbs1394
SAK: SAK_1355
SMU: SMU.938
STC: str0561(mvaK2)
STL: stu0561(mvaK2)
STE: STER_0600
SSA: SSA_0335(mvaK2)
SSU: SSU05_0291
SSV: SSU98_0287
SGO: SGO_0241
LPL: lp_1733(mvaK2)
LJO: LJ1207
LAC: LBA1169
LSA: LSA0906(mvaK2)
LSL: LSL_0683
LDB: Ldb0997(mvaK)
LBU: LBUL_0904
LBR: LVIS_0860
LCA: LSEI_1092
LGA: LGAS 1035
LRE: Lreu_0913
PPE: PEPE_0925
EFA: EF0902
NFA: nfa22090
BGA: BG0710
BAF: BAPKO_0731
NPH: NP2852A
SSO: SSO2988
STO: ST0978
SAI: Saci_1244
Ácidos nucleicos y polipéptidos de difosfomevalonato descarboxilasa a modo de ejemplo HSA: 4597(MVD)
PTR: 468069(MVD)
MCC: 696865(MVD)
MMU: 192156(Mvd)
RNO: 81726(Mvd)
CFA: 489663(MVD)
GGA: 425359(MVD)
DME: Dmel_CG8239
SCE: YNR043W(MVD1)
AGO: AGOS_AGL232C
PIC: PICST_90752
CGR: CAGL0C03630g
SPO: SPAC24C9.03
MGR: MGG_09750
ANI: AN4414.2
AFM: AFUA_4G07130
AOR: AO090023000862
CNE: CNL04950
UMA: UM05179.1
DDI: DDBDRAFT_0218058
TET: TTHERM_00849200
TBR: Tb10.05.0010 Tb10.61.2745
TCR: 507993.330511281.40 LMA: LmjF18.0020
CBU: CBU_0607(mvaD)
CBD: COXBU7E912_0619(mvaD) LPN: lpg2040
LPF: lpl2018
LPP: lpp2023
TCX: Tcr_1734
DNO: DNO_0504(mvaD) BBA: Bd1629
MXA: MXAN_5018(mvaD) OIH: OB0226
SAU: SA0548(mvaD)
SAV: SAV0591(mvaD)
SAM: MW0546(mvaD)
SAR: SAR0597(mvaD)
SAS: SAS0550
SAC: SACOL0637(mvaD) SAB: SAB0541(mvaD)
SAA: SAUSA300_0573(mvaD) SAO: SAOUHSC_00578
SAJ: SaurJH9_0614
SAH: SaurJH1_0629
SEP: SE0362
SER: SERP0239(mvaD)
SHA: SH2401(mvaD)
SSP: SSP2121
LMO: lmo0011
LMF: LMOf2365_0012(mvaD) LIN: lin0011
LWE: lwe0012(mvaD)
LLA: L9089(yeaH)
LLC: LACR_0455
LLM: llmg_0426(mvaD)
SPY: SPy_0877(mvaD)
SPZ: M5005_Spy_0683(mvaD) SPM: spyM18_0938(mvd)
SPG: SpyM3_0596(mvaD)
SPS: SPs1257
SPH: MGAS10270_Spy0741(mvaD) SPI: MGAS10750_Spy0775(mvaD) SPJ: MGAS2096_Spy0754(mvaD) SPK: MGAS9429_Spy0738(mvaD) SPF: SpyM51125(mvaD)
SPA: M6_Spy0700
SPB: M28_Spy0663(mvaD) SPN: SP_0382
SPR: spr0339(mvd1)
SPD: SPD_0347(mvaD)
SAG: SAG1325(mvaD)
SAN: gbs1395
SAK: SAK_1356(mvaD)
SMU: SMU.937
STC: str0560(mvaD)
STL: stu0560(mvaD)
STE: STER_0599
SSA: SSA_0334(mvaD)
SSU: SSU05_0290
SSV: SSU98_0286
SGO: SGO_0240(mvaD)
LPL: lp_1734(mvaD)
LJO: LJ1206
LAC: LBA1168(mvaD)
LSA: LSA0907(mvaD)
LSL: LSL_0684
LDB: Ldb0998(mvaD)
LBU: LBUL_0905
LBR: LVIS_0859
LCA: LSEI_1492
LGA: LGAS_1034
LRE: Lreu_0914
PPE: PEPE_0926
EFA: EF0903(mvaD)
LME: LEUM_1386
NFA: nfa22080
BBU: BB0686
BGA: BG0709
BAF: BAPKO_0730
GFO: GFO_3632
FPS: FP0310(mvaD)
HAU: Haur_1612
HAL: VNG0593G(dmd)
HMA: rrnAC1489(dmd)
HWA: HQ1525A(mvaD)
NPH: NP1580A(mvaD)
PTO: PTO0478 PTO1356
SSO: SSO2989
STO: ST0977
SAI: Saci_1245(mvd)
MSE: Msed_1576
Ácidos nucleicos y polipéptidos de difosfato de isopentilo delta-isomerasa (IDI) a modo de ejemplo HSA: 3422(IDI1) 91734(IDI2)
PTR: 450262(IDI2) 450263(IDI1)
MCC: 710052(LOC710052) 721730(LOC721730)
MMU: 319554(Idi1)
RNO: 89784(Idi1)
GGA: 420459(IDI1)
XLA: 494671(LOC494671)
XTR: 496783(idi2)
SPU: 586184(LOC586184)
CEL: K06H7.9(idi-1)
ATH: AT3G02780(IPP2)
OSA: 4338791 4343523
CME: CMB062C
SCE: YPL117C(IDI1)
AGO: AGOS_ADL268C
PIC: PICST_68990(IDI1)
CGR: CAGL0J06952g
SPO: SPBC106.15(idi1)
ANI: AN0579.2
AFM: AFUA_6G11160
AOR: AO090023000500
CNE: CNA02550
UMA: UM04838.1
ECU: ECU02_0230
DDI: DDB_0191342(ipi)
TET: TTHERM_00237280 TTHERM_00438860 TBR: Tb09.211.0700
TCR: 408799.19510431.10
LMA: LmjF35.5330
EHI: 46.t00025
ECO: b2889(idi)
ECJ: JW2857(idi)
ECE: Z4227
ECS: ECs3761
ECC: c3467
ECI: UTI89_C3274
ECP: ECP_2882
ECV: APECO1_3638
ECW: EcE24377A-3215(idi)
ECX: EcHS_A3048
STY: STY3195
STT: t2957
SPT: SPA2907(idi)
SEC: SC2979(idi)
STM: STM3039(idi)
SFL: SF2875(idi)
SFX: S3074
SFV: SFV_2937
SSN: SSON_3042 SSON_3489(yhfK) SBO: SBO_3103
SDY: SDY_3193
ECA: ECA2789
PLU: plu3987
ENT: Ent638_3307
SPE: Spro_2201
VPA: VPA0278
VFI: VF0403
PPR: PBPRA0469(mvaD)
PEN: PSEEN4850
CBU: CBU_0607(mvaD)
CBD: COXBU7E912_0619(mvaD) LPN: lpg2051
LPF: lpl2029
LPP: lpp2034
TCX: Tcr_1718
HHA: Hhal_1623
DNO: DNO_0798
EBA: ebA5678 p2A143
DVU: DVU1679(idi)
DDE: Dde_1991
LIP: LI1134
BBA: Bd1626
AFW: Anae109_4082
MXA: MXAN_5021(fni)
RPR: RP452
RTY: RT0439(idi)
RCO: RC0744
RFE: RF_0785(fni)
RBE: RBE_0731(fni)
RAK: A1C_04190
RBO: A1I_04755
RCM: A1E_02555
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Ácidos nucleicos y polipéptidos de isopreno sintasa a modo de ejemplo N.os de registro de Genbank
AY341431
AY316691
AY279379
AJ457070
AY182241

Claims (17)

  1. REIVINDICACIONES
    i . Un procedimiento para la producción de isopreno, comprendiendo el procedimiento:
    (a) cultivar células en condiciones de cultivo adecuadas para la producción de isopreno, en el que la fase gaseosa comprende menos del 9,5% (en volumen) de oxígeno o el 9,5% (en volumen) de oxígeno, y (b) producir isopreno, en el que las células producen más de 400 nmoles/gwcm/h de isopreno,
    en el que las células comprenden un ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido de isopreno sintasa y en el que las células comprenden además uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican para uno o más polipéptidos de la ruta de mevalonato (MVA) y/o una o más copias de ácidos nucleicos endógenos que codifican para uno o más polipéptidos de la ruta de MVA, y/o en el que las células comprenden además un ácido nucleico que codifica para un polipéptido de difosfato de isopentilo deltaisomerasa (IDI), y/o en el que las células comprenden además un ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido de 1-desoxixilulosa-5-fosfato sintasa (DXS), y/o en el que las células comprenden además una copia de un ácido nucleico endógeno que codifica para un polipéptido de DXS.
  2. 2. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que la concentración de oxígeno limitante es del 9,5% en volumen de oxígeno, la temperatura está entre 25°C y 55°C, y la presión está entre 101,325 kPa y 303,975 kPa.
  3. 3. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el polipéptido de isopreno sintasa es un polipéptido de isopreno sintasa vegetal.
  4. 4. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que las células son células bacterianas.
  5. 5. El procedimiento según la reivindicación 4, en el que las células bacterianas se seleccionan del grupo que consiste en células de Escherichia coli, Pantoea citrea, Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus brevis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus clausii, Bacillus halodurans, Bacillus megaterium, Bacillus coagulans, Bacillus circulans, Bacillus lautus, Bacillus thuringiensis, Streptomyces lividans, Streptomyces coelicolor, Streptomyces griseus, Pseudomonas sp. y Pseudomonas alcaligenes.
  6. 6. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que las células son células fúngicas.
  7. 7. El procedimiento según la reivindicación 6, en el que las células fúngicas se seleccionan del grupo que consiste en células de Aspergillus sp., levadura, Trichoderma sp., Yarrowia sp., Saccharomyces sp., Schizosaccharomyces sp., Pichia sp., Candida sp., Aspergillus oryzae, Aspergillus niger, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Trichoderma reesei, H. insolens, H. lanuginose, H. grisea, Candida lucknowense, Aspergillus sojae, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus aculeatus, Aspergillus awamori, Fusarium roseum, Fusarium graminum, Fusarium cerealis, Fusarium oxysporum, F. venenatum, Neurospora crassa, Mucor miehei, Trichoderma viride, Fusarium oxysporum y Fusarium solani.
  8. 8. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que las células son células de algas.
  9. 9. El procedimiento según la reivindicación 8, en el que las células de algas se seleccionan del grupo que consiste en algas verdes, algas rojas, glaucofitas, cloraracniofitas, euglenoideos, cromistas y dinoflagelados.
  10. 10. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el ácido nucleico que codifica para el polipéptido de IDI es un ácido nucleico heterólogo.
  11. 11. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el polipéptido de IDI es un polipéptido de IDI de levadura.
  12. 12. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1-9 y 11, en el que el ácido nucleico que codifica para el polipéptido de IDI es una copia de un ácido nucleico endógeno que codifica para un polipéptido de IDI.
  13. 13. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que las células comprenden además uno o más ácidos nucleicos que codifican para los polipéptidos de toda la ruta de MVA.
  14. 14. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que las células se hacen crecer en condiciones de glucosa limitada.
  15. 15. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la cantidad de isopreno producido durante la fase estacionaria es mayor de 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, o más veces o es 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, o más veces la cantidad de isopreno producido durante la fase de crecimiento para la misma duración de tiempo.
  16. 16. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, comprendiendo el procedimiento además la etapa de recuperar el isopreno.
  17. 17. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, comprendiendo el procedimiento además la etapa de purificar el isopreno.
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