JP6711278B2 - イソプレノイド化合物の製造方法 - Google Patents
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Description
また、誘導剤の代わりに、光または温度等の環境因子を利用する方法が知られている。例えば、光を利用してイソプレンを生産する方法(非特許文献1)、および温度を利用して、目的タンパク質(例、インターフェロンγ、インスリン)を生産する方法が知られている(非特許文献2)。
〔1〕以下を含む、イソプレノイド化合物の製造方法:
1)十分な濃度の増殖促進剤の存在下でイソプレノイド化合物生成微生物を培養して、イソプレノイド化合物生成微生物を増殖させること;
2)増殖促進剤の十分な濃度を減少させて、イソプレノイド化合物生成微生物によるイソプレノイド化合物の生成を誘導すること;および
3)イソプレノイド化合物生成微生物を培養してイソプレノイド化合物を生成すること。
〔2〕イソプレノイド化合物生成微生物が、増殖促進剤逆依存性プロモーターに依存してイソプレノイド化合物を生成する能力を有する、上記方法。
〔3〕増殖促進剤が酸素である、上記方法。
〔4〕イソプレノイド化合物生成微生物が好気性微生物である、上記方法。
〔5〕前記プロモーターが微好気誘導型プロモーターである、上記方法。
〔6〕微好気誘導型プロモーターが、乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子のプロモーター、またはα−アセトラクテイトデカルボシラーゼをコードする遺伝子のプロモーターである、上記方法。
〔7〕イソプレノイド化合物がモノテルペンであり、イソプレノイド化合物生成微生物がモノテルペン生成微生物である、上記方法。
〔8〕イソプレノイド化合物がリモネンであり、イソプレノイド化合物生成微生物がリモネン生成微生物である、上記方法。
〔9〕イソプレノイド化合物がリナノールであり、イソプレノイド化合物生成微生物がリナノール生成微生物である、上記方法。
〔10〕イソプレノイド化合物がイソプレンモノマーであり、イソプレノイド化合物生成微生物がイソプレン生成微生物である、上記方法。
〔11〕以下を含む、イソプレノイド化合物の製造方法:
1’)イソプレノイド化合物生成微生物を含む液相、および気相を備える系における液相中に酸素を供給して、十分な濃度の溶存酸素の存在下でイソプレノイド化合物生成微生物を増殖させること;
2’)液相中の溶存酸素濃度を減少させて、イソプレノイド化合物生成微生物によるイソプレノイド化合物の生成を液相中で誘導すること;
3’)イソプレン生成微生物を液相中で培養してイソプレノイド化合物を生成すること;および
4’)イソプレノイド化合物を回収すること。
〔12〕上記イソプレノイド化合物がイソプレンである、上記方法。
〔13〕気相中の酸素濃度が液相中の溶存酸素濃度に依存して制御され、
液相中の溶存酸素濃度を減少させて、気相中でのイソプレン爆発を回避する、上記方法。
〔14〕2’)および3’)において、液相中の溶存酸素濃度が0.34ppm以下である、上記方法。
〔15〕誘導期のイソプレン生成速度が80ppm/vvm/h以下である、上記方法。
〔16〕増殖促進剤がリン化合物である、上記方法。
〔17〕前記プロモーターがリン欠乏型誘導プロモーターである、上記方法。
〔18〕リン欠乏誘導型プロモーターが、酸性フォスファターゼをコードする遺伝子のプロモーター、またはリン取り込み担体をコードする遺伝子のプロモーターである、上記方法。
〔19〕50mg/L以下の総リン濃度の存在下でイソプレノイド生成微生物によるイソプレノイドの生成が誘導される、上記方法。
〔20〕誘導期のイソプレノイド生成速度が600ppm/vvm/h以下である、上記方法。
〔21〕上記イソプレノイド化合物がイソプレンである、上記方法。
〔22〕イソプレノイド化合物生成微生物が、メチルエリスリトールリン酸経路によるジメチルアリル二リン酸の合成能を有する、上記方法。
〔23〕イソプレノイド化合物生成微生物が、メバロン酸経路によるジメチルアリル二リン酸の合成能を有する、上記方法。
〔24〕イソプレノイド化合物生成微生物が、腸内細菌科に属する微生物である、上記方法。
〔25〕イソプレノイド化合物生成微生物が、パントエア属、エンテロバクター属またはエシェリヒア属に属する微生物である、上記方法。
〔26〕イソプレノイド化合物生成微生物が、パントエア・アナナティス、エンテロバクター・アエロゲネスまたはエシェリヒア・コリである、上記方法。
〔27〕以下(I)および(II)を含む、イソプレンポリマーの製造方法:
(I)上記方法によりイソプレンモノマーを生成すること;
(II)イソプレンモノマーを重合してイソプレンポリマーを生成すること。
〔28〕上記方法により製造されるイソプレンモノマーに由来するポリマー。
〔29〕上記ポリマーを含むゴム組成物。
〔30〕上記ゴム組成物を使用することにより製造されるタイヤ。
好ましくは、イソプレノイド化合物は、イソプレン(モノマー)である。
1)十分な濃度の増殖促進剤の存在下でイソプレノイド化合物生成微生物を培養して、イソプレン生成微生物を増殖させること;
2)増殖促進剤の濃度を減少させて、イソプレノイド化合物生成微生物によるイソプレノイド化合物の生成を誘導すること;および
3)イソプレノイド化合物生成微生物を培養してイソプレノイド化合物を生成すること。
バシラス(Bacillus)属細菌としては、例えば、枯草菌(Bacillus subtilis)、炭疽菌(Bacillus anthracis)、セレウス菌(Bacillus cereus)等が挙げられ、枯草菌(Bacillus subtilis)がより好ましい。
コリネバクテリウム(Corynebacterium)属細菌としては、例えば、コリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)、コリネバクテリウム・エフィシエンス(Corynebacterium efficiens)、コリネバクテリウム・カルナエ(Corynebacterium callunae)等が挙げられ、コリネバクテリウム・グルタミカムがより好ましい。
エシェリヒア(Escherichia)属細菌としては、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)が好ましい。
パントエア(Pantoea)属細菌としては、例えば、パントエア・アナナティス(Pantoea ananatis)、パントエア・スチューアルティ(Pantoea stewartii)、パントエア・アグロメランス(Pantoea agglomerans)、パントエア・シトレア(Pantoea citrea)等が挙げられ、パントエア・アナナティス(Pantoea ananatis)、パントエア・シトレア(Pantoea citrea)が好ましい。また、パントエア属細菌としては、欧州特許出願公開0952221号に例示された株を使用してもよい。パントエア属細菌の代表的な株としては、例えば、欧州特許出願公開0952221号に開示されるパントエア・アナナティスAJ13355株(FERM BP−6614)、パントエア・アナナティスAJ13356株(FERM BP−6615)、パントエア・アナナティスSC17株(FERMBP−11902)、およびパントエア・アナナティスSC17(0)株(VKPM B−9246;Katashikina JI et al.,BMC Mol Biol 2009;10:34)が挙げられる。
エンテロバクター(Enterobacter)属細菌としては、例えば、エンテロバクター・アグロメランス(Enterobacter agglomerans)、エンテロバクター・アエロゲネス(Enterobacter aerogenes)等が挙げられ、エンテロバクター・アエロゲネス(Engerobacter aerogenes)が好ましい。また、エンテロバクター属細菌としては、欧州特許出願公開0952221号に例示された菌株を使用してもよい。エンテロバクター属細菌の代表的な株としては、例えば、エンテロバクター・アグロメランスATCC12287株、エンテロバクター・アエロゲネスATCC13048株、エンテロバクター・アエロゲネスNBRC12010株(Biotechnol Bioeng. 2007 Mar 27;98(2):340−348)、エンテロバクター・アエロゲネスAJ110637(FERM BP−10955)株等が挙げられる。エンテロバクター・アエロゲネスAJ110637株は、2007年8月22日付で国立研究開発法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター(〒305−8566 日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1 中央第6;現在、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許生物寄託センター(IPOD NITE) 〒292-0818 千葉県木更津市かずさ鎌足2−5−8 120号室)に受託番号FERM P−21348として寄託され、2008年3月13日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、FERM BP−10955の受領番号が付与されている。
サッカロミセス(Saccharomyces)属の微生物としては、例えば、サッカロミセス・カールスベルゲンシス(Saccharomyces carlsbergensis)、サッカロミセス・セレビシエー(Saccharomyces cerevisiae)、サッカロミセス・ディアスタティクス(Saccharomyces diastaticus)、サッカロミセス・ドウグラシー(Saccharomyces douglasii)、サッカロミセス・クルイベラ(Saccharomyces kluyveri)、サッカロミセス・ノルベンシス(Saccharomyces norbensis)、サッカロミセス・オビフォルミス(Saccharomyces oviformis)が挙げられ、サッカロミセス・セレビシエー(Saccharomyces cerevisiae)が好ましい。
シゾサッカロミセス(Schizosaccharomyces)属の微生物としては、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)が好ましい。
ヤロウイア(Yarrowia)属の微生物としては、ヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)が好ましい。
トリコデルマ(Trichoderma)属の微生物としては、例えば、トリコデルマ・ハルジアヌム(Ttichoderma harzianum)、トリコデルマ・コニンギー(Trichoderma koningii)、トリコデルマ・ロンギフラキアム(Trichoderma longibrachiatum)、トリコデルマ・リーゼイ(Trichoderma reesei)、トリコデルマ・ビリデ(Trichoderma viride)が挙げられ、トリコデルマ・リーゼイ(Trichoderma reesei)が好ましい。
気相中の酸素濃度の制御は、酸素濃度を調節した気体を系中に供給することにより行うことができる。系中に供給される気体は、窒素、二酸化炭素、アルゴン等の酸素以外の気体成分を含んでいてもよい。より具体的には酸素濃度が爆発範囲を持つガスの限界酸素濃度以下になるよう不活性ガスを加える事で気相中の酸素濃度を制御できる。酸素以外の気体成分として不活性ガスであることが望ましい。好ましくは、酸素濃度を調節した気体は液相中に供給され、それにより気相中の酸素濃度が間接的に制御される。気相中の酸素濃度は、以下のとおり、液相中の溶存酸素濃度の調節により制御できるためである。
液相中に供給された気体中の酸素は液相中に溶存し、やがて飽和濃度に達する。一方、微生物が存在する系においては、液相中の溶存酸素は、培養される微生物の代謝活動により消費され、その結果、溶存酸素濃度は飽和濃度以下に低下する。飽和濃度以下の酸素を含む液相において、気液平衡により気相中の酸素、あるいは新たに供給する気体中の酸素は液相への移動が可能である。すなわち、微生物の酸素消費速度に依存して、気相中の酸素濃度は低下する。また、培養される微生物の酸素消費速度を制御する事により、気相中の酸素濃度を制御することも可能である。
例えば、微生物の炭素源の代謝速度を上げることにより、酸素消費速度をあげ、気相中の酸素濃度を9%(v/v)以下(例、5%(v/v)以下、0.8%(v/v)以下、0.6%(v/v)以下、0.5%(v/v)以下、0.4%(v/v)以下、0.3%(v/v)以下、0.2%(v/v)以下、もしくは0.1%(v/v)以下)または実質的に0%(v/v)に設定することができる。あるいは、初期に供給する気体中の酸素濃度を、低く設定することでも成し得る。したがって、気相中の酸素濃度の設定は、液相中の微生物による酸素の消費速度と供給する気体中の酸素濃度を考慮した上で、設定ができる。
例えば、酸素が増殖促進剤として用いられる場合、好気性微生物等の微生物の増殖に好適である溶存酸素濃度が液相中で維持されるように、酸素濃度を調節した気体を液相中に供給することができる。液相中に供給された気体は、攪拌により液相中に溶存することができる。液相中の溶存酸素濃度は、イソプレン生成微生物の十分な増殖を可能にするものであれば特に限定されず、溶存酸素濃度は、好気性微生物等の利用される微生物の種類に依存して変動し得る。例えば、好気性微生物の増殖に十分である培地中の溶存酸素の濃度として上述したような濃度を採用することができる。具体的には、酸素が増殖促進剤として用いられる場合、イソプレン生成微生物を含む液相、および気相を備える系における液相中に酸素を供給して、十分な濃度の溶存酸素の存在下でイソプレン生成微生物を増殖させることができる。
例えば、酸素が増殖促進剤として用いられる場合には、上述した観点、およびイソプレン生成微生物によるイソプレンモノマーの生成を液相中で誘導する観点から、系中の酸素濃度が調節される。例えば、液相中の溶存酸素濃度は、上記観点を達成できるようなものであれば特に限定されず、利用されるイソプレン生成微生物および利用されるプロモーターの種類等によっても異なるが、例えば0.35ppm以下、0.25ppm以下、0.15ppm、0.10ppm以下、または0.05ppm以下であってもよい。液相中の溶存酸素濃度はまた、上述したような微好気条件下の濃度であってもよい。液相中の溶存酸素濃度の減少は、液相中への酸素の供給量を低下させることにより、行うことができる。液相中の溶存酸素濃度の減少はまた、液相中への酸素の供給量を1)2)を通じて一定にした場合であっても、培養される微生物の増殖を利用して行うことができる。1)における微生物の増殖の初期では、微生物が十分に増殖しておらず、培地中の微生物数が少ないため、微生物による酸素消費も相対的に少ない。したがって、増殖の初期では、液相中の溶存酸素濃度、および気相中の酸素濃度は、相対的に高い。一方、1)における微生物の増殖の後期では、微生物が十分に増殖しており、培地中の微生物数が相対的に多いため、微生物による酸素消費も相対的に多い。したがって、増殖の後期では、液相中の溶存酸素濃度、および気相中の酸素濃度は、相対的に低くなる。このように、一定濃度の酸素を含む気体を、1)2)を通じて液相中に供給し続けた場合、微生物の増殖と反比例して、液相中の溶存酸素濃度は減少する。この減少した液相中の酸素濃度をトリガーとして、イソプレン生成微生物によるイソプレンモノマーの生成を誘導することができる。
例えば、酸素が増殖促進剤として用いられる場合、2)で上述したような液相中の酸素濃度条件下でイソプレン生成微生物を液相中で培養することにより、イソプレンモノマーを生成することができる。この場合、2)で上述したような液相中の酸素濃度、および3)で上述したような気相中の酸素濃度を両立させることが所望される。液相中の微生物の種類およびその増殖の程度などを考慮しつつ、酸素を含む気体の供給量を調節することにより、2)で上述したような液相中の酸素濃度、および3)で上述したような気相中の酸素濃度を両立させることができる。
二糖類としては、スクロース、ラクトース、マルトース、トレハロース、ツラノース、セロビオース等が挙げられ、スクロース、ラクトースが好ましい。
オリゴ糖類としては、ラフィノース、メレジトース、マルトトリオース等の三糖類;アカルボース、スタキオース等の四糖類;フラクトオリゴ糖(FOS)、ガラクトオリゴ糖(GOS)、マンナンオリゴ糖(MOS)等のその他のオリゴ糖類が挙げられる。
多糖類としては、グリコーゲン、デンプン(アミロース、アミロペクチン)、セルロース、デキストリン、グルカン(β−1,3−グルカン)が挙げられ、デンプン、セルロースが好ましい。
植物性タンパク質としては、大豆、コーン、キャノーラ、ジャトロファ、パーム、ピーナッツ、ヒマワリ、ココナッツ、マスタード、綿実、パーム核油、オリーブ、紅花、ゴマ、亜麻仁由来のポリペプチドが挙げられる。
不飽和脂肪酸は、上記の基「R」における2つの炭素原子間に少なくとも1つの炭素−炭素二重結合を有する化合物であり、オレイン酸、バクセン酸、リノール酸、パルミテライジン酸、アラキドン酸等が挙げられる。
飽和脂肪酸は、「R」が飽和脂肪族基である化合物であり、ドコサン酸、イコサン酸、オクタデカン酸、ヘキサデカン酸、テトラデカン酸、ドデカン酸等が挙げられる。
中でも、脂肪酸としては、1以上のC2からC22の脂肪酸が含まれるものが好ましく、C12脂肪酸、C14脂肪酸、C16脂肪酸、C18脂肪酸、C20脂肪酸、C22脂肪酸が含まれるものがより好ましい。
また、炭素源としては、これら脂肪酸の塩、誘導体、誘導体の塩も挙げられる。塩としては、リチウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩等が挙げられる。
バイオマス炭素源としては、木、紙、及びパルプの廃材、葉状植物、果肉等のセルロース系基質;柄、穀粒、根、塊茎等の植物の一部分が挙げられる。
バイオマス炭素源として用いられる植物としては、コーン、小麦、ライ麦、ソルガム、トリティケイト、コメ、アワ、大麦、キャッサバ、エンドウマメ等のマメ科植物、ジャガイモ、サツマイモ、バナナ、サトウキビ、タピオカ等が挙げられる。
再生可能な炭素源を細胞培地に添加する前に、その全部または一部を加水分解することが好ましい。
培養培地としては、特に限定されず、Luria Bertani(LB)ブロス、Sabouraud Dextrose(SD)ブロス、Yeast medium(YM)ブロス等の一般的に市販されている既成の培地が挙げられる。特定の宿主細胞の培養に適した培地を適宜選択して用いることができる。
培養温度としては、20℃〜40℃であり得、pHが、約4.5〜約9.5であり得る。
また、イソプレノイド化合物生成微生物の宿主の性質に応じて好気性、無酸素性、又は嫌気性条件下で培養を行うことが好ましい。培養方法としては、バッチ培養法、流加培養法、連続培養法等の公知の発酵方法を適宜用いることができる。
(I)本発明の方法によりイソプレンモノマーを生成すること;
(II)イソプレンモノマーを重合してイソプレンポリマーを生成すること。
本発明のゴム組成物は、本発明のイソプレンの製造方法により製造されるイソプレンに由来するポリマーを含む。イソプレンに由来するポリマーは、同種ポリマー(即ち、イソプレンポリマー)、またはイソプレンモノマー単位およびイソプレンモノマー単位以外の1以上のモノマー単位を含む異種ポリマー(例、ブロック共ポリマー等の共ポリマー)であり得る。好ましくは、イソプレンに由来するポリマーは、本発明のイソプレンポリマーの製造方法により製造される同種ポリマー(即ち、イソプレンポリマー)である。本発明のゴム組成物はさらに、上記ポリマー以外の1以上のポリマー、1以上のゴム成分、および/または他の成分を含んでいてもよい。本発明のゴム組成物は、イソプレンに由来するポリマーを用いて製作することができる。例えば、本発明のゴム組成物は、イソプレンに由来するポリマーを、このポリマー以外の1以上のポリマー、1以上のゴム成分、ならびに/または他の成分(例、補強材、架橋剤、加硫促進剤、および抗酸化剤)と混合することにより調製することができる。
本発明のタイヤは、本発明のゴム組成物を用いることにより製作される。本発明のゴム組成物は、制限されることなく、タイヤの任意の部分に利用することができ、その目的に応じて適切に選択され得る。例えば、本発明のゴム組成物は、タイヤのトレッド、ベーストレッド、サイドウォール、サイド補強ゴムおよびビードフィラーにおいて用いてもよい。タイヤを製造する方法としては、慣用の方法を用いることができる。例えば、タイヤ未加硫ゴムから構成されるカーカス層、ベルト層、トレッド層、および通常のタイヤ製造に用いられる他の部材をタイヤ成形用ドラム上に順次貼り重ね、ドラムを抜き去ってグリーンタイヤとする。次いで、このグリーンタイヤを常法に従って加熱加硫することにより、所望のタイヤ(例、空気式タイヤ)を製造することができる。
エンテロバクター・アエロゲネスAJ110637(FERM BP−10955)株から構築したES04株(US2010−0297716A1)の染色体上のlld遺伝子を、E.coli MG1655 Ptac−KDyI株由来(参考例1を参照)のPtac−KDyI遺伝子で置換することにより、エンテロバクター・アエロゲネスGI05(ES04Δlld::Ptac−KDyI)株を構築した。配列番号1にエンテロバクター・アエロゲネスAJ110637(FERM BP−10955)株のlld遺伝子の塩基配列を記載する。
MG1655 Ptac−KDyI株由来のPtac−KDyI遺伝子は、tacプロモーターの制御下にサッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)由来のホスホメバロン酸キナーゼ(遺伝子名PMK)とジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ(遺伝子名MVD)、更にはイソペンテニル二リン酸イソメラーゼ(遺伝子名yIDI)がコードされている。MG1655 Ptac−KDyI株のゲノムDNAを鋳型に、上記塩基配列を基に設計した配列番号2と配列番号3に記載したプライマーを用いてPCR反応(TaKaRa Prime star(登録商標),94℃・10sec.,54℃・20sec.,72℃・420sec.,30cycle)を実施し、両端にD−乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子(遺伝子名lld)の組み換え配列を有したλattL−TetR−λattR−Ptac−KDyI遺伝子断片を得た。
ES04株(US20100297716A1)をLB液体培地にて終夜培養した。その後、培養液100μLを新たなLB液体培地4mLに植菌し、34℃で3時間振盪培養を行った。菌体を回収した後、10%グリセロールで3回洗浄したものをコンピテントセルとし、エレクトロポレーション法により、RSFRedTERを導入した(Katashkina JI et al.,BMC Mol Biol.2009;10:34)。尚、エレクトロポレーションはGENE PULSER II(BioRad社製)を用い、電場強度20kV/cm、コンデンサー容量25μF、抵抗値200Ωの条件で行った。SOC培地(バクトトリプトン 20g/L、イーストエキストラクト 5g/L、NaCl 0.5g/L、グルコース 10g/L)で2時間培養後、40mg/Lのクロラムフェニコールを含むLB培地に塗布し、16時間培養を行った。その結果、クロラムフェニコール耐性を示す形質転換体を取得し、ES04/RSFRedTER株と命名した。
ES04/RSFRedTER株をLB液体培地にて終夜培養した。その後、培養液1mLを、終濃度1mMのIPTGと40mg/Lのクロラムフェニコールを含むLB液体培地100mLに植菌して、34℃で3時間振盪培養を行った。菌体を回収した後、10%グリセロールで3回洗浄したものをコンピテントセルとした。増幅したλattL−TetR−λattR−Ptac−KDyI遺伝子断片をWizard PCR Prep DNA Purification System(Promega社製)を用いて精製したものをエレクトロポレーション法によりコンピテントセルに導入した。SOC培地で2時間培養後、テトラサイクリン30mg/Lを含むLB培地に塗布し、16時間培養を行った。出現したコロニーを同培地で純化した後、配列番号4と配列番号5に記載したプライマーを用いてコロニーPCR(TaKaRa Speed star(登録商標),92℃・10sec.,56℃・10sec.,72℃・60sec.,40cycle)を行い、染色体上のlld遺伝子がλattL−TetR−λattR−Ptac−KDyI遺伝子に置換している事を確認した。得られた株を、10%シュークロース、1mM IPTGを含むLB寒天培地に塗布し、RSFRedTERプラスミドを脱落させ、ES04Δlld::λattL−TetR−λattR−Ptac−KDyI株を得た。
ES04Δlld::λattL−TetR−λattR−Ptac−KDyI株からテトラサイクリン耐性遺伝子を除去する為に、RSF−int−xis(US20100297716A1)プラスミドを用いた。ES04Δlld::λattL−TetR−λattR−Ptac−KDyI株にRSF−int−xisをエレクトロポレーション法で導入し、40mg/Lクロラムフェニコールを含有するLB培地に塗布後30℃で培養し、ES04Δlld::λattL−TetR−λattR−Ptac−KDyI/RSF−int−xis株を得た。得られたプラスミド保持株を、40mg/Lクロラムフェニコール及び1mM IPTGを含有するLB培地で純化し、シングルコロニーを複数得た。その後、30mg/Lのテトラサイクリンを加えた培地に塗布し、37℃で一晩培養し、生育出来ない事を確認する事で、テトラサイクリン耐性遺伝子が除去された株である事を確認した。次に、得られた株からRSF−int−xisプラスミドを脱落させるため、10%シュークロース及び1mM IPTGを添加したLB培地に塗布し、37℃で一晩培養した。出現したコロニーの中から、クロラムフェニコール感受性を示した株をGI05(ES04Δlld::Ptac−KDyI)株と命名した。
エンテロバクター・アエロゲネスGI05株の染色体上のピルビン酸オキシダーゼ遺伝子(遺伝子名poxB)を、E.coli MG1655 Ptac−KDyI株由来のホスホメバロン酸キナーゼ(PMK)遺伝子で置換することにより、エンテロバクター・アエロゲネスGI06(ES04Δlld::Ptac−KDyIΔpoxB::Ptac−PMK)株を構築した。配列番号6にエンテロバクター・アエロゲネスAJ110637(FERM BP−10955)株のpoxB遺伝子の塩基配列を記載する。手順を以下に示す。
E.coli MG1655 Ptac−KDyI株由来のゲノムDNAを鋳型に、上記塩基配列を基に設計した配列番号7と配列番号8に記載したプライマーを用いてPCR反応(TaKaRa Prime star(登録商標),94℃・10sec.,54℃・20sec.,72℃・120sec.,30cycle)を実施し、PMKのORF領域を含むDNA断片を取得した。また、λattL−Kmr−λattR−Ptac(WO2008090770A1)を含むDNA断片を鋳型に、配列番号9と配列番号10に記載したプライマーを用いてPCR反応(TaKaRa Prime star(登録商標),94℃・10sec.,54℃・20sec.,72℃・90sec.,30cycle)を実施し、λattL−Kmr−λattR−Ptacを含むDNA断片を取得した。次に、PMKのORF領域を含むDNA断片とλattL−Kmr−λattR−Ptacを含むDNA断片を鋳型にして、配列番号7と配列番号9に記載したプライマーを用いてOverlapping−PCR反応(TaKaRa Prime star(登録商標),94℃・10sec.,54℃・20sec.,72℃・180sec.,35cycle)を行い、両端にピルビン酸オキシダーゼをコードする遺伝子(遺伝子名poxB)の組み換え配列を有したλattL−Kmr−λattR−Ptac−PMK遺伝子断片を得た。
前述のGI05株を構築した手順と同様に、GI05株にRSFRedTERを導入し、λ−Red法にてλattL−Kmr−λattR−Ptac−PMK遺伝子断片をpoxBに導入し、100mg/Lのカナマイシンを含むLB培地にて選択し、カナマイシン耐性を示すGI05ΔpoxB::λattL−Kmr−λattR−Ptac−PMKを取得した。取得したコロニーを同培地で純化した後、配列番号11と配列番号12に記載したプライマーを用いてコロニーPCR(TaKaRa Speed star(登録商標),92℃・10sec.,56℃・10sec.,72℃・60sec.,40cycle)を行い、染色体上のpoxB遺伝子がλattL−KmR−λattR−Ptac−PMK遺伝子に置換している事を確認した。つづいてRSFRedTERが脱落したGI05ΔpoxB::λattL−KmR−λattR−Ptac−PMK株からカナマイシン耐性遺伝子を除去する為に、pRSF−int−xisを導入し、GI05株を構築した手順と同様に薬剤耐性遺伝子を除去し、カナマイシン感受性を示した株をGI06(GI05ΔpoxB::Ptac−PMK)株と命名した。
エンテロバクター・アエロゲネスGI06株の染色体上のピルビン酸ギ酸リアーゼB遺伝子(遺伝子名pflB)を、E.coli MG1655 Ptac−KDyI株由来のジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ(MVD)遺伝子で置換することにより、エンテロバクター・アエロゲネスGI07(GI06 ΔpflB::Ptac−MVD)株を構築した。配列番号13にエンテロバクター・アエロゲネスAJ110637(FERM BP−10955)株のpflB遺伝子の塩基配列を記載する。手順を以下に示す。
E.coli MG1655 Ptac−KDyI株由来のゲノムDNAを鋳型に、上記塩基配列を基に設計した配列番号14と配列番号15に記載したプライマーを用いてPCR反応(TaKaRa Prime star(登録商標),94℃・10sec.,54℃・20sec.,72℃・120sec.,30cycle)を実施し、MVDのORF領域を含むDNA断片を取得した。また、λattL−Kmr−λattR−Ptac(WO2008090770A1)を含むDNA断片を鋳型に、配列番号16と配列番号17に記載したプライマーを用いてPCR反応(TaKaRa Prime star(登録商標),94℃・10sec.,54℃・20sec.,72℃・90sec.,30cycle)を実施し、λattL−Kmr−λattR−Ptacを含むDNA断片を取得した。次に、MVDのORF領域を含むDNA断片とλattL−Kmr−λattR−Ptacを含むDNA断片を鋳型にして、配列番号15と配列番号16に記載したプライマーを用いてOverlapping−PCR反応(TaKaRa Prime star(登録商標),94℃・10sec.,54℃・20sec.,72℃・240sec.,35cycle)を行い、両端にピルビン酸ギ酸リアーゼBをコードする遺伝子(遺伝子名pflB)の組み換え配列を有したλattL−Kmr−λattR−Ptac−MVD遺伝子断片を得た。
前述のGI05株を構築した手順と同様に、GI06株にRSFRedTERを導入し、λ−Red法にてλattL−Kmr−λattR−Ptac−MVD遺伝子断片をpflBに導入し、100mg/Lのカナマイシンを含むLB培地にて選択し、カナマイシン耐性を示すGI06ΔpflB::λattL−Kmr−λattR−Ptac−MVD株を取得した。取得したコロニーを同培地で純化した後、配列番号18と配列番号19に記載したプライマーを用いてコロニーPCR(TaKaRa Speed star(登録商標),92℃・10sec.,56℃・10sec.,72℃・60sec.,40cycle)を行い、染色体上のpflB遺伝子がλattL−KmR−λattR−Ptac−MVD遺伝子に置換している事を確認した。つづいてRSFRedTERが脱落したGI06ΔpflB::λattL−KmR−λattR−Ptac−MVD株からカナマイシン耐性遺伝子を除去する為に、pRSF−int−xisを導入し、GI05株を構築した手順と同様に薬剤耐性遺伝子を除去し、カナマイシン感受性を示した株をGI07(GI06ΔpflB::Ptac−MVD)株と命名した。
エンテロバクター・アエロゲネスGI07株の染色体上のピルビン酸ギ酸リアーゼA遺伝子(遺伝子名pflA)を、E.coli MG1655 Ptac−KDyI株由来のイソペンテニル二リン酸イソメラーゼ(yIDI)遺伝子で置換することにより、エンテロバクター・アエロゲネスGI08(GI07 ΔpflA::Ptac−yIDI)株を構築した。配列番号20にエンテロバクター・アエロゲネスAJ110637(FERM BP−10955)株のpflA遺伝子の塩基配列を記載する。手順を以下に示す。
E.coli MG1655 Ptac−KDyI株由来のゲノムDNAを鋳型に、上記塩基配列を基に設計した配列番号21と配列番号22に記載したプライマーを用いてPCR反応(TaKaRa Prime star(登録商標),94℃・10sec.,54℃・20sec.,72℃・120sec.,30cycle)を実施し、yIDIのORF領域を含むDNA断片を取得した。また、λattL−Kmr−λattR−Ptac(WO2008090770A1)を含むDNA断片を鋳型に、配列番号23と配列番号24に記載したプライマーを用いてPCR反応(TaKaRa Prime star(登録商標),94℃・10sec.,54℃・20sec.,72℃・90sec.,30cycle)を実施し、λattL−Kmr−λattR−Ptacを含むDNA断片を取得した。次に、yIDIのORF領域を含むDNA断片とλattL−Kmr−λattR−Ptacを含むDNA断片を鋳型にして、配列番号23と配列番号24に記載したプライマーを用いてPCR反応(TaKaRa Prime star(登録商標),94℃・10sec.,54℃・20sec.,72℃・240sec.,35cycle)を行い、両端にピルビン酸ギ酸リアーゼAをコードする遺伝子(遺伝子名pflA)の組み換え配列を有したλattL−Kmr−λattR−Ptac−yIDI遺伝子断片を得た。
前述のGI05株を構築した手順と同様に、GI07株にRSFRedTERを導入し、λ−Red法にてλattL−Kmr−λattR−Ptac−yIDI遺伝子断片をpflAに導入し、100mg/Lのカナマイシンを含むLB培地にて選択し、カナマイシン耐性を示すGI07ΔpflA::λattL−Kmr−λattR−Ptac−yIDI株を取得した。取得したコロニーを同培地で純化した後、配列番号25と配列番号26に記載したプライマーを用いてコロニーPCR(TaKaRa Speed star(登録商標),92℃・10sec.,56℃・10sec.,72℃・60sec.,40cycle)を行い、染色体上のpflA遺伝子がλattL−KmR−λattR−Ptac−yIDI遺伝子に置換している事を確認した。つづいてRSFRedTERが脱落したGI07ΔpflA::λattL−Kmr−λattR−Ptac−yIDI株からカナマイシン耐性遺伝子を除去する為に、pRSF−int−xisを導入し、GI05株を構築した手順と同様に薬剤耐性遺伝子を除去し、カナマイシン感受性を示した株をGI08(GI07ΔpflA::Ptac−yIDI)株と命名した。
GI08株にイソプレノイド化合物生産能を付与する為、pMW−Para−mvaES−Ttrp(参考例2を参照)とpSTV28−Ptac−ispSK(WO2013/179722参照)をエレクトロポレーション法にて導入した。上記の方法に従った、GI08株のコンピテントセルを調整後、pMW−Para−mvaES−TtrpとpSTV28−Ptac−ispSKをエレクトロポレーション法にて導入し、カナマイシン100mg/Lとクロラムフェニコール 60mg/LのLB培地で選択をし、両プラスミドを保持したGI08株/pMW−Para−mvaES−Ttrp/pSTV28−Ptac−ispSKをGI08−Para/ispSK株と命名した。
エンテロバクター・アエロゲネスは微好気条件下で2,3−butandiolを生成することが知られている(Converti, A et al.,Biotechnol.Bioeng.,82,370−377,2003)。2,3−butandiolの生成経路と触媒反応に関わる酵素群は、既に明らかとなっており、エンテロバクター・アエロゲネスKCTC2190のゲノム配列(NC_015663)から、それらの遺伝子情報やアミノ酸配列も明らかである。2,3−butandiol生成経路は、α−アセトラクテイトデカルボキシラーゼ(遺伝子名budA)、アセトラクテイトシンターゼ(遺伝子名budB)、更にはアセトインレダクターゼ(遺伝子名budC)より構成される。これらの遺伝子はゲノム配列上でオペロンを形成しており、その発現量を転写因子であるBudR(遺伝子名budR)が制御している。BudRとbudオペロンのプロモーター領域を以下の手順でpMW−Para−mvaES−Ttrpにクローニングした。BudRとbudオペロンのプロモーター領域を配列番号29に示す。
エンテロバクター・アエロゲネスAJ11063株由来のゲノムDNAを鋳型に、配列番号27と配列番号28に記載したプライマーを用いてPCR反応(TaKaRa Prime star(登録商標),94℃・10sec.,54℃・20sec.,72℃・120sec.,30cycle)を実施し、BudRのORF領域とbudオペロンのプロモーター領域を含むDNA断片を取得した。
次に、pMW−Para−mvaES−Ttrpを鋳型に配列番号30と配列番号31に記載したプライマーを用いてPCR反応(TaKaRa Prime star GXL(登録商標),94℃・10sec.,54℃・20sec.,72℃・240sec.,30cycle)を実施し、アラビノースプロモーターが欠落したpMW−Para−mvaES−TtrpのDNA断片を取得した。上記、BudRのORF領域とbudオペロンのプロモーター領域を含むDNA断片とアラビノースプロモーターが欠落したpMW−Para−mvaES−TtrpのDNA断片をIn−Fusion HD Cloning Kit(Clontech社製)を用いて連結した。アラビノースプロモーターがBudRのORF領域とbudオペロンのプロモーター領域に置換されたプラスミドをpMW−Pbud−mvaES−Ttrpと名付けた。
GI08株にイソプレノイド化合物生産能を付与する為、pMW−Pbud−mvaES−TtrpとpSTV28−Ptac−ispSK(WO2013/179722参照)をエレクトロポレーション法にて導入した。上記の方法に従った、GI08株のコンピテントセルを調整後、pMW−Pbud−mvaES−TtrpとpSTV28−Ptac−ispSKをエレクトロポレーション法にて導入し、カナマイシン100mg/Lとクロラムフェニコール 60mg/LのLB培地で選択をし、両プラスミドを保持したGI08株/pMW−Pbud−mvaES/pSTV28−Ptac−ispSKをGI08−Pbud/ispSK株と命名した。
イソプレノイド化合物生成微生物GI08−Para/ispSK株とGI08−Pbud/ispSK株の菌体増殖のため、ジャー培養を行った。ジャー培養には1L容積の発酵槽(液相および気相を備える系)を使用した。グルコース培地は表1に示す組成になるように調整した。クロラムフェニコール(60mg/L)およびカナマイシン(50mg/L)を含むLBプレートにイソプレノイド化合物生成微生物GI08−Para/ispSK株とGI08−Pbud/ispSK株を塗布し、37℃にて16時間培養を実施した。0.3Lのグルコース培地を1L容積の発酵槽に投入後、充分に増殖したプレート1枚分の菌体を接種し、培養を開始した。培養条件は、pH7.0(アンモニアガスにて制御)、30℃であり、150mL/min(酸素濃度:20%(v/v)の空気を培地中に供給した。ガルバニ式DOセンサーSDOU型(エイブル株式会社)を用いて培養液中の溶存酸素(Dissolved Oxigen,DO)濃度を測定し、DOが任意の濃度になるように撹拌による制御を行った。培養中は、培地中のグルコース濃度が10g/L以上になるよう500g/Lに調整したグルコースを連続的に添加した。OD値(微生物の増殖の指標)は分光光度計(HITACHI U−2900)によって600nmで測定した。
3.1.イソプレン生成期への誘導
アラビノース誘導型イソプレノイド化合物生成微生物(GI08−Para/ispSK)は、メバロン酸経路上流遺伝子をアラビノースプロモーターにて発現させるため、L−アラビノース(和光純薬工業)存在下でイソプレン生産量が顕著に向上する。イソプレン生成期への誘導のため、培養液を経時的に分析し、OD値が16になった時点で終濃度20mMとなるようにL−アラビノースを添加した。
微好気誘導型イソプレノイド化合物生成微生物(GI08−Pbud/ispSK)は、メバロン酸経路上流遺伝子を微好気誘導型プロモーターであるbudオペロンのプロモーターにて発現制御させるため、微好気条件下でイソプレン生産量が顕著に向上する。本実施例では、通気量と撹拌数を一定の条件で培養を行い、菌体の増加に伴って培地中の溶存酸素濃度を検出限界以下(DO≒0ppm)とすることで、イソプレン生成期へ誘導した。
上記のとおりイソプレノイド化合物生成微生物によるイソプレン生成を誘導した後、イソプレン生成のためイソプレノイド化合物生成微生物の培養を継続した。
イソプレンは水に不溶性であり容易に揮発するため、液相(培地)中で生成したイソプレンは、速やかに気相中に発酵ガスとして移行する。したがって、生成したイソプレンの測定は、発酵ガス中のイソプレン濃度の定量により行った。具体的には、イソプレン誘導後から適時、発酵ガスをガスバッグにて収集し、ガスクロマトグラフィー(島津社製 GC−2010 Plus AF)により、イソプレン濃度を定量した。イソプレンの検量線は以下のイソプレン標準試料を用いて作成した。以下にガスクロマトグラフィーの分析条件を記載する。
試薬イソプレン(東京化成、比重0.681)を冷却したメタノールで10、100、1000、10000、100000倍希釈し、添加用標準溶液を調整した。その後、水1mLを入れたヘッドスペースバイアルに各添加用標準溶液を、それぞれ1μL添加し、標準試料とした。
バイアル保温温度 40℃
バイアル保温時間 30min
加圧時間 3.0min
注入時間 0.02min
ニードル温度 70℃
トランスファー温度 80℃
キャリアガス圧力(高純度ヘリウム) 124kPa
カラム(Rxi(登録商標)−1ms: 長さ30m、内径0.53mm、液相膜厚1.5μm cat♯13370)
カラム温度 37℃
圧力 24.8kPa
カラム流量 5mL/min
流入方法 スプリット 1:0(実測1:18)
トランスファー流量 90mL
GC注入量 1.8mL(トランスファー流量×注入時間)
カラムへの試料注入量 0.1mL
注入口温度 250℃
検出機 FID(水素 40mL/min、空気 400mL/min、メイクアップガス ヘリウム 30mL/min)
検出器温度 250℃
アラビノース誘導型イソプレノイド化合物生成微生物(GI08−Para/ispSK)および微好気誘導型イソプレノイド化合物生成微生物(GI08−Pbud/ispSK)を上記実施例2に記載されるジャー培養条件にて培養を行い、イソプレンの生成量を測定した。図1で示すように培養中の撹拌数を調節する事により、GI08−Para/ispSKを培養した培地中の溶存酸素濃度は培養14時間目から1.7ppmを維持し、GI08−Pbud/ispSKを培養した培地中の溶存酸素濃度は培養9時間目から検出限界以下(DO≒0ppm)となった。図2(A)に示すように、GI08−Para/ispSKおよび GI08−Pbud/ispSKは、発酵槽(液相および気相を備える系)を用いたジャー培養条件下で良好に増殖した。図2(B)に示すようにGI08−Pbud/ispSKは培養11時間目から、GI08−Para/ispSKは培養8時間目からイソプレン生産が検出され、イソプレン生産が誘導されたことが示された。培養21時間におけるイソプレンの生成量はGI08−Para/ispSKが63mg、GI08−Pbud/ispSKが66mgであった。この結果から、微好気誘導型イソプレノイド化合物生成微生物はアラビノース誘導型イソプレノイド化合物生成微生物と同等のイソプレン生産能を有していることが示された。
酸素濃度20%(v/v)の空気を培地中に供給し、培養中の撹拌数を調節することにより、微好気誘導型イソプレノイド化合物生成微生物(GI08−Pbud/ispSK)をDO≒0ppm、DO=0.7ppm、DO=1.7ppm、DO=3.4ppmの溶存酸素条件下で培養した。培地における溶存酸素濃度の経時変化を図3に示す。培養中のOD値(微生物の増殖の指標)はそれぞれDO≒0ppm条件下で35、DO=0.7ppm条件下で55、DO=1.7ppm条件下で57、DO=3.4ppm条件下で57となり、DO≒0ppm条件に比べて好気培養条件下でOD値が高かった(図4)。DO≒0ppm条件下ではDO≒0ppmとなる培養9時間目以降でイソプレン生産が誘導され、OD値が頭打ちになる培養13時間目以降で高いイソプレン生産性を示した。培養21時間におけるイソプレン生成量は、DO≒0ppm条件下で66mg、DO=0.7ppm条件下で21mg、DO=1.7ppm条件下で24mg、DO=3.4ppm条件下で25mgであった(図4)。この結果から、微好気誘導型イソプレノイド化合物生成微生物においては溶存酸素濃度が検出限界以下になることでイソプレン生成期に移行し、その後もイソプレン生産が維持されることが示された。
5−1)pMW−Para−mvaES−Ttrpの構築
5−1−1)Enterococcus faecalis由来mvaE遺伝子の化学合成
acetyl−CoA acetyltransferaseとhydroxymethlglutaryl−CoAreductaseをコードするEnterococcus faecalis由来mvaEの塩基配列、及びアミノ酸配列はすでに知られている(塩基配列のACCESSION番号:AF290092.1、(1479..3890)、アミノ酸配列のACCESSION番号:AAG02439)(J.Bacteriol.182(15),4319−4327(2000))。Enterococcus faecalis由来mvaEタンパク質のアミノ酸配列、及び遺伝子の塩基配列を配列番号32、及び配列番号33にそれぞれ示す。mvaE遺伝子をE.coliで効率的に発現させるためにE.coliのコドン使用頻度に最適化したmvaE遺伝子を設計し、これをEFmvaEと名付けた。この塩基配列を配列番号34に示す。mvaE遺伝子は化学合成された後、pUC57(GenScript社製)にクローニングされ、得られたプラスミドをpUC57−EFmvaEと名付けた。
hydroxymethylglutaryl−CoA synthaseをコードするEnterococcus faecalis由来mvaSの塩基配列、及びアミノ酸配列はすでに知られている(塩基配列のACCESSION番号:AF290092.1、complement(142..1293)、アミノ酸配列のACCESSION番号:AAG02438)(J.Bacteriol.182(15),4319−4327(2000))。Enterococcus faecalis由来mvaSタンパク質のアミノ酸配列、及び遺伝子の塩基配列を配列番号35、及び配列番号36にそれぞれ示す。mvaS遺伝子をE.coliで効率的に発現させるためにE.coliのコドン使用頻度に最適化したmvaS遺伝子を設計し、これをEFmvaSと名付けた。この塩基配列を配列番号37に示す。mvaS遺伝子は化学合成された後、pUC57(GenScript社製)にクローニングされ、得られたプラスミドをpUC57−EFmvaSと名付けた。
アラビノース誘導型メバロン酸経路上流遺伝子発現ベクターは次の手順で構築した。プラスミドpKD46を鋳型として配列番号38と配列番号39に示す合成オリゴヌクレオチドをプライマーとしたPCRによりE.coli由来araCとaraBADプロモーター配列からなるParaを含むPCR断片を得た。プラスミドpUC57−EFmvaEを鋳型として配列番号40と配列番号41に示す合成オリゴヌクレオチドをプライマーとしたPCRによりEFmvaE遺伝子を含むPCR断片を得た。プラスミドpUC57−EFmvaSを鋳型として配列番号42と配列番号43に示す合成オリゴヌクレオチドをプライマーとしたPCRによりEFmvaS遺伝子を含むPCR断片を得た。プラスミドpSTV−Ptac−Ttrp(WO2013069634A1)を鋳型として配列番号44と配列番号45に示す合成オリゴヌクレオチドをプライマーとしたPCRによりTtrp配列を含むPCR断片を取得した。これら4つのPCR断片を得るためのPCRにはPrime Starポリメラーゼ(タカラバイオ社製)を用いた。反応溶液はキットに添付された組成に従って調整し、98℃にて10秒、55℃にて5秒、72℃にて1分/kbの反応を30サイクル行った。精製したParaを含むPCR産物とEFmvaE遺伝子を含むPCR産物を鋳型として配列番号38と配列番号41に示す合成オリゴヌクレオチドを、精製したEFmvaS遺伝子を含むPCR産物とTtrpを含むPCR産物を鋳型として配列番号42と配列番号45に示す合成オリゴヌクレオチドをプライマーとしてPCRを行った。その結果、ParaとEFmvaE遺伝子、EFmvaSとTtrp含むPCR産物を取得した。プラスミドpMW219(ニッポンジーン社製)は常法に従ってSmaI消化した。SmaI消化後pMW219と精製したParaとEFmvaE遺伝子を含むPCR産物、EFmvaS遺伝子とTtrpを含むPCR産物はIn−Fusion HD Cloning Kit(Clontech社製)を用いて連結した。得られたプラスミドは、pMW−Para−mvaES−Ttrpと命名した。
5−2−1)
メバロン酸経路の上流および下流遺伝子を保有する組込み型プラスミドを構築するため、pAH162−λattL−TcR−λattR vector(Minaeva NI et al.,BMC Biotechnol.2008;8:63)を用いた。
tetAR遺伝子を含むpAH162−λattL−TcR−λattR(Minaeva NI et al.,BMC Biotechnol.,2008;8:63)のAatII−ApaIフラグメントを、プライマー9および10(表2)、ならびにpUC4Kプラスミド(Taylor LAおよびRose RE.,Nucleic Acids Res.,16,358,1988)を鋳型として用いたPCRで得られたDNAフラグメントと置換した。その結果、pAH162−λattL−KmR−λattRが得られた(図9)。
attLphi80およびattRphi80に隣接したkan遺伝子、ならびに標的染色体部位に相同な40bp配列を含むPCR増幅DNAフラグメントのλRed依存的な組込み(Katashkina JI et al.,BMC Mol Biol.,2009;10:34)、続いて、カナマイシン耐性マーカーのファージphi80 Int/Xis依存的な除去(Andreeva IG et al.,FEMS Microbiol Lett.,2011;318(1):55−60)を含む2段階の手法を用いて、ΔampH::attBphi80およびΔampC::attBphi80染色体改変を、P.ananatis SC17(0)株に段階的に導入した。SC17(0)は、P.ananatis AJ13355のλRed耐性誘導体である(Katashkina JI et al.,BMC Mol Biol.,2009;10:34);P.ananatis AJ13355の注釈付完全ゲノム配列は、PRJDA162073またはGenBankアクセッション番号AP012032.1およびAP012033.1として利用可能である。pMWattphiプラスミド[Minaeva NI et al.,BMC Biotechnol.,2008;8:63]を鋳型として用いて、プライマー11および12、ならびにプライマー13および14(表2)をプライマーとして用いて、それぞれampHおよびampC遺伝子領域への組込みに使用されるDNAフラグメントを生成した。プライマー15および16、ならびにプライマー17および18(表2)を、得られた染色体改変物のPCR検証に用いた。
その後、ゲノムDNAエレクトロポレーション手法(Katashkina JI et al.,BMC Mol Biol.,2009;10:34)を介してSC17(0)Δcrt::pAH162−Ptac−mvk(M.paludicola)の遺伝形質をSC17(0) ΔampC::attBphi80 ΔampH::attBphi80へ移行させた。得られた株はテトラサイクリン耐性遺伝子tetRAをマーカーとして利用している。tetRAマーカー遺伝子を含むpAH162−Ptac−mvk(M.paludicola)組込み型プラスミドのベクター部分を、既報のpMW−intxis−catヘルパープラスミド[Katashkina JI et al.,BMC Mol Biol.,2009;10:34]を用いて除去した。その結果、マーカー遺伝子欠損株SC17(0) ΔampH::attBφ80 ΔampC::attBφ80 Δcrt::Ptac−mvk(M.paludicola)を得た。Δcrt::Ptac−mvk(M.paludicola)ゲノム改変物のマップを、図15(B)に示す。
pAH162−Km−Ptac−KDyIプラスミドを、既報のプロトコル(Andreeva IG et al. FEMS Microbiol Lett. 2011;318(1):55−60)にしたがい、SC17(0)ΔampH::attBφ80 ΔampC::attBφ80 Δcrt::Ptac−mvk(M.paludicola)/pAH123−cat株の染色体に組み込んだ。50mg/Lカナマイシンを含むLBアガー上に細胞を撒いた。増殖したKmRクローンを、プライマー11および15、ならびにプライマー11および17(表2)を用いたPCR反応で試験した。ΔampH::attBφ80またはΔampC::attBφ80mに組み込まれたpAH162−Km−Ptac−KDyIプラスミドを保持する株を選択した。ΔampH::pAH162−Km−Ptac−KDyIおよびΔampC::pAH162−Km−Ptac−KDyI染色体改変物のマップを、図16(A)および(B)に示す。
pAH162−Px−mvaES(ここで、Pxは、以下の調節領域のうちの一つである:araC−Para(E.coli)、PlldD、PphoC、PpstS)を、既報のプロトコル[Andreeva IG et al.,FEMS Microbiol Lett.,2011;318(1):55−60]にしたがってpAH123−catヘルパープラスミドを用いてSC17(0) ΔampC::pAH162−Km−Ptac−KDyI ΔampH::attBphi80 Δcrt::Ptac−mvk(M.paludicola)およびSC17(0) ΔampC::attBphi80 ΔampH::pAH162−Km−Ptac−KDyI Δcrt::Ptac−mvk(M.paludicola)レシピエント株のattBphi80部位に挿入した。その結果、SWITCH−Px−1およびSWITCH−Px−2とそれぞれ名付けられた2セットの株を得た。ΔampH::pAH162−Px−mvaESおよびΔampC::pAH162−Px−mvaES染色体改変物のマップを図17に示す。
常法に従いSWITCH菌のコンピテントセルを作成し、エレクトロポレーションによりムクナ由来イソプレンシンターゼの発現プラスミドであるpSTV28−Ptac−IspSM(WO2013/179722)を導入した。得られたイソプレノイド化合物生成微生物をそれぞれ、SWITCH−Para/IspSM、SWITCH−Plld/IspSM、SWITCH−PpstS/IspSM、SWITCH−PphoC/IspSMと命名した。
6−1)イソプレノイド化合物生成微生物(SWITCH−Para/ispSM、SWITCH−PphoC/ispSM、SWITCH−PpstS/ispSM)の培養
イソプレノイド化合物生成微生物(SWITCH−Para/ispSM、SWITCH−PphoC/ispSM、SWITCH−PpstS/ispSM)の培養には1L容積の発酵槽を使用した。グルコース培地は表3に示す組成になるように調整した。クロラムフェニコール(60mg/L)を含むLBプレートにこれらのイソプレノイド化合物生成微生物それぞれ塗布し、34℃にて16時間培養した。0.3Lのグルコース培地を1L容積の発酵槽に投入後、充分に生育したプレート1枚分の菌体を接種し、培養を開始した。培養条件は、pH7.0(アンモニアガスにて制御)、30℃、150mL/minとなるように通気した。好気培養を行う場合には、ガルバニ式DOセンサーSDOU型(エイブル株式会社)を用いて培養液中の酸素濃度(Dissolved Oxigen,DO)を測定し、DOが任意の濃度になるように撹拌による制御を行った。培養中は、培地中のグルコース濃度が10g/L以上になるよう500g/Lに調整したグルコースを連続的に添加した。ODは分光光度計(HITACHI U−2900)によって600nmで測定した。
アラビノース誘導型イソプレノイド化合物生成微生物は、メバロン酸経路上流遺伝子をアラビノース誘導型プロモーターにて発現させるため、L−アラビノース(和光純薬工業)存在下でイソプレン生産量が顕著に向上する。イソプレン生産期への誘導方法として、培養液を経時的に分析し、OD値が16になった時点で終濃度20mMとなるようにL−アラビノースを添加した。
リン欠乏型イソプレノイド化合物生成微生物は、メバロン酸経路上流遺伝子をリン欠乏型誘導プロモーターにて発現させるため、培地中のリンがある一定濃度以下になることでイソプレン生産量が顕著に向上する。
発酵ガス中のイソプレン濃度はマルチガスアナライザー(GASERA社製 F10)を用いて測定した。培養液中の総リン濃度はホスファC−テストワコー(和光純薬工業株式会社)を用いて測定した。
アラビノース誘導型イソプレノイド化合物生成微生物(SWITCH−Para/ispSM)およびリン欠乏型イソプレノイド化合物生成微生物(SWITCH−PphoC/ispSM、SWITCH−PpstS/ispSM)を上記のジャー培養条件にて培養を行い、イソプレンの生成量(mg/Batch)、および発酵ガス中のイソプレン濃度(ppm)を測定した(図19、20)。培養液中の総リン濃度は図18に示すように培養9時間目でSWITCH−PphoC/ispSM、SWITCH−PpstS/ispSMともに50mg/L以下となり、タイミングを同じくしてイソプレンの生産が検出された。SWITCH−PphoC/ispSMおよびSWITCH−PpstS/ispSMは、SWITCH−Para/ispSMと比較してイソプレンの生成開始からイソプレン生成最大速度を示すまでの時間が短く、急激にイソプレン生成速度が増加した(図19)。培養48時間におけるイソプレンの生成量はSWITCH−Para/ispSMが563mg、SWITCH−PphoC/ispSMが869mg、SWITCH−PpstS/ispSMが898mgであった(図19)。この結果から、リン欠乏型イソプレノイド化合物生成微生物は総リン濃度が50mg/L以下となる条件下でイソプレン生成が誘導され、アラビノース誘導型イソプレノイド化合物生成微生物よりも優れたイソプレン生産能を有していることが示された。
7−1)イソプレノイド化合物生成微生物(SWITCH−Para/ispSM、SWITCH−lld/ispSM)の培養
イソプレノイド化合物生成微生物(SWITCH−Para/ispSM、SWITCH−lld/ispSM)の培養は6−1)と同様の条件にて行った。
アラビノース誘導型イソプレノイド化合物生成微生物は、6−2)と同様の方法にてイソプレン生産期へ誘導した。
微好気誘導型イソプレノイド化合物生成微生物(SWITCH−lld/ispSM)は、酸素濃度20%(v/v)の空気を培地中に供給し培養中の撹拌数を調節することにより、培地中の溶存酸素をDO≒0ppmとすることでイソプレン生産期へ誘導した。培地における溶存酸素濃度の経時変化を図21に示す。
発酵ガス中のイソプレン濃度はマルチガスアナライザー(GASERA社製 F10)を用いて測定した。培養液中の溶存酸素濃度はガルバニ式DOセンサーSDOU型(エイブル株式会社)を用いて測定した。
アラビノース誘導型イソプレノイド化合物生成微生物(SWITCH−Para/ispSM)および微好気誘導型イソプレノイド化合物生成微生物(SWITCH−lld/ispSM)を上記のジャー培養条件にて培養を行い、イソプレンの生成量(mg/Batch)、および発酵ガス中のイソプレン濃度(ppm)を測定した(図22、23)。培養液中の溶存酸素濃度は図21に示すように培養8時間目でDO≒0ppmとなり、間もなくしてイソプレンの生産が検出された。培養48時間におけるイソプレンの生成量はSWITCH−Para/ispSMが563mg、SWITCH−Plld/ispSMが642mgであった(図22)。この結果から、微好気誘導型イソプレノイド化合物生成微生物はDO≒0ppm以下となる条件でイソプレンの生成が誘導され、アラビノース誘導型イソプレノイド化合物生成微生物と同等のイソプレン生産能を有していることが示された。
E.coli MG1655 Ptac−KDyI株は、MG1655 Ptac−KKDyI株〔WO2013/179722の実施例7−5)を参照〕においてERG12遺伝子を欠損させることにより作製した。具体的には以下のとおりである。
アラビノース誘導型メバロン酸経路上流遺伝子発現ベクター(pMW−Para−mvaES−Ttrp)は次の手順で構築した。プラスミドpKD46を鋳型としてWO2013/179722の配列番号49と配列番号50に示す合成オリゴヌクレオチドをプライマーとしたPCRによりE.coli由来araCとaraBADプロモーター配列からなるParaを含むPCR断片を得た。プラスミドpUC57−EFmvaEを鋳型としてWO2013/179722の配列番号51と配列番号52に示す合成オリゴヌクレオチドをプライマーとしたPCRによりEFmvaE遺伝子を含むPCR断片を得た。プラスミドpUC57−EFmvaSを鋳型としてWO2013/179722の配列番号53と配列番号54に示す合成オリゴヌクレオチドをプライマーとしたPCRによりEFmvaS遺伝子を含むPCR断片を得た。プラスミドpSTV−Ptac−Ttrpを鋳型(プラスミド源)としてWO2013/179722の配列番号55と配列番号56に示す合成オリゴヌクレオチドをプライマーとしたPCRによりTtrp配列を含むPCR断片を取得した。これら4つのPCR断片を得るためのPCRにはPrime Starポリメラーゼ(タカラバイオ社製)を用いた。反応溶液はキットに添付された組成に従って調整し、98℃にて10秒、55℃にて5秒、72℃にて1分/kbの反応を30サイクル行った。精製したParaを含むPCR産物とEFmvaE遺伝子を含むPCR産物を鋳型として配列番号49と配列番号52に示す合成オリゴヌクレオチドを、精製したEFmvaS遺伝子を含むPCR産物とTtrpを含むPCR産物を鋳型としてWO2013/179722の配列番号53と配列番号56に示す合成オリゴヌクレオチドをプライマーとしてPCRを行った。その結果、ParaとEFmvaE遺伝子、EFmvaSとTtrp含むPCR産物を取得した。プラスミドpMW219(ニッポンジーン社製)は常法に従ってSmaI消化した。SmaI消化後pMW219と精製したParaとEFmvaE遺伝子を含むPCR産物、EFmvaS遺伝子とTtrpを含むPCR産物はIn−Fusion HD Cloning Kit(Clontech社製)を用いて連結した。得られたプラスミドは、pMW−Para−mvaES−Ttrpと命名した。
(背景)
本検討では細胞増殖期から物質生産期への移行をリン酸飢餓応答の代謝スイッチにより実現させようとしたものである。一般的に、増殖期と物質生産期では最適な代謝状態は異なっている。従来、各期で最適な代謝状態を実現する方法は知られているが、増殖期に最適な培養条件から物質生産期に最適な培養条件に切り替えても細胞活性の低下等の理由により切り替えがうまくいかないことが多い。
リン酸飢餓応答が遺伝子の発現制御に対し迅速に作用する事は文献等で知られている(Baek JH et al.,J Microbiol Biotechnol. 2007 Feb;17(2):244−52;WO 2003054140 A2)が、リン酸飢餓応答と恒常発現型の遺伝子発現制御を組み合わせた上で、酵素レベルでの阻害などが知られた条件において、リン酸飢餓応答により代謝が迅速に切り替わり、物質生産レベルで素早い応答が観測されることは容易に期待しえない。
我々の構築したリン酸飢餓誘導型イソプレン生産菌では、対照であるアラビノース誘導型イソプレン生産菌よりも、高いイソプレン濃度が確認された。
(背景)
本検討では細胞増殖期から物質生産期への移行を溶存酸素濃度の欠乏により引き起こされる代謝の変化により実現させようとしたものである。一般的に、微生物が酸素を利用可能な培養条件と利用できない培養条件では細胞の代謝状態が大きく異なっていることが知られている(Martinez I., Bennett G. N., San K. Y.. 2010. Metabolic impact of the level of aeration during cell growth on anaerobic succinate production by an engineered Escherichia coli strain. Metab. Eng. 12:499−509)。従来、好気的な条件や嫌気的な条件にて最適な代謝状態を実現する方法は知られている。このことを応用し、培養中の酸素濃度条件を変更する事により、増殖期に最適な培養条件から物質生産期に最適な培養条件に切り替える事は、コハク酸やアルコール発酵など本質的に嫌気条件の発酵を行うために検討されることが多い(Blombach B, Riester T, Wieschalka S, Ziert C, Youn JW, Wendisch VF, Eikmanns BJ. Corynebacterium glutamicum tailored for efficient isobutanol production. Appl Environ Microbiol. 2011 May;77(10):3300−10)。これに対し、イソプレンやグルタミン酸など余剰還元力を酸素呼吸により再酸化する事が要求される発酵においては、溶存酸素濃度が欠乏した条件が物質生産に適した代謝状態をもたらす条件と見なさない為、同業他社が積極的に採用する細胞増殖期から物質生産期への移行方法ではない。
E.aerogenesをイソプレン生産菌の親株として用いた場合、GI08/Pbud/IspSKは溶存酸素濃度(DO)がほぼゼロの場合に、成功裏に増殖期からイソプレン生産期に移行する事が示された(実施例4、図4)。
イソプレンを、発酵排気管を通過させることにより液体窒素冷却トラップで回収する。回収したイソプレンを、十分に乾燥した100mLガラス容器中で、窒素雰囲気下で35gのヘキサン(Sigma−Aldrich)、ならびに10gのシリカゲル(Sigma−Aldrich,カタログ番号236772)、および10gのアルミナ(Sigma−Aldrich,カタログ番号267740)と混合する。得られた混合液を、室温で5時間放置する。次いで、上清液を採取し、十分に乾燥した50mLガラス容器中に加える。
表5に示されるように処方されるゴム組成物を調製し、145℃で35分間加硫処理する。
P.アナナティスのgcd遺伝子は、グルコースデヒドロゲナーゼをコードしており、P.アナナティスは好気性増殖中にグルコン酸を蓄積することが知られている(Andreeva IGら,FEMS Microbiol Lett.2011 May;318(1):55−60)。
プライマーgcd−attLおよびgcd−attR(表6)及び鋳型としてpMW118−attL−kan−attRプラスミドを用いるPCRで得られたDNAフラグメントのλRed依存的な組込み(Minaeva NIら,BMC Biotechnol.2008;8:63)により、gcd遺伝子を欠損したSC17(0)Δgcd株を構築する。組込み体を確認するため、プライマーgcd−t1およびgcd−t2(表6)を用いる。
SC17(0)Δgcd株のゲノムDNAを、Wizard Genomic DNA Purification Kit(プロメガ)を用いて単離し、既報の方法〔Katashkina JIら,BMC Mol Biol.2009;10:34〕にしたがってSWITCH−PphoC株のマーカーを含まない誘導体中に電気形質転換する。その結果、SWITCH−PphoC−Δgcd(KmR)株を得る。プライマーgcd−t1およびgcd−t2を、得られた組込み体のPCR解析に用いる。カナマイシン耐性マーカー遺伝子を、標準的なλIng/Xis媒介手法〔Katashkina JIら,BMC Mol Biol.2009;10:34〕にしたがって得る。得られた株を、SWITCH−PphoC Δgcd株と命名する。
SWITCH−PphoC Δgcd株のコンピテントセルを標準的な方法にしたがって調製し、ムクナ由来のイソプレンシンターゼ発現用ベクターであるpSTV28−Ptac−IspSM(WO2013/179722)をエレクトロポレーションにより導入した。得られたイソプレノイド化合物生成微生物を、SWITCH−PphoC Δgcd/IspSMと命名した。
11−1)イソプレノイド化合物生成微生物のジャー培養条件
イソプレノイド化合物生成微生物(SWITCH−PphoC/IspSM、SWITCH−PphoCΔgcd/IspSM)の培養には1L容積の発酵槽を使用した。グルコース培地は表7に示す組成になるように調整した。クロラムフェニコール(60mg/L)を含むLBプレートにこれらのイソプレノイド化合物生成微生物をそれぞれ塗布し、34℃にて16時間培養した。0.3Lのグルコース培地を1L容積の発酵槽に投入後、充分に生育したプレート1枚分の菌体を接種し、培養を開始した。培養条件は、pH 7.0(アンモニアガスにて制御)、温度30℃、150 mL/minとなるように通気した。好期培養を行う場合には、ガルバニ式DOセンサーSDOU型(エイブル株式会社)を用いて培養液中の酸素濃度(Dissolved Oxigen, DO)を測定し、DO値が5%になるように撹拌による制御を行った。培養中は、培地中のグルコース濃度が10 g/L以上になるよう500 g/Lに調整したグルコースを連続的に添加した。ODは分光光度計(HITACHI U−2900)によって600nmで測定した。48時間の培養でSWITCH−PphoC/IspSM、SWITCH−PphoCΔgcd/IspSMは、それぞれ63.9g、77.8gのグルコースを消費した。
リン欠乏型イソプレノイド化合物生成微生物は、メバロン酸経路上流遺伝子をリン欠乏型誘導プロモーターにて発現させるため、培地中のリンがある一定濃度以下になることでイソプレン生産量が顕著に向上する。
発酵ガス中のイソプレン濃度はマルチガスアナライザー(GASERA社製 F10)を用いて測定した。
培養上清を純水で10倍希釈し、0.45μmフィルターでろ過した後、高速液体クロマトグラフ(日立ハイテクノロジーズ)ELITE LaChromを用いて下記の方法に従って分析した。
カラム Shim−pack SCR−102H(8mmI.D.×300mmL)二本直列接続
ガードカラム SCR−102H(6mmI.D.×50mmL)
移動相 5mM p−トルエンスルホン酸
流量 0.8ml/min
温度 50℃
Injection.Volume 10μl
緩衝液 5mM p−トルエンスルホン酸および100μM EDTAを含む20mM Bis−Tris水溶液
流量 0.8ml/min
検出器 CDD−10AD polarity + response SLOW temperature 53℃(カラム温度+3℃) scale1×24μS/cm
イソプレノイド化合物生成微生物(SWITCH−PphoC/IspSM、SWITCH−PphoCΔgcd/IspSM)を上記のジャー培養条件に従って培養を行い、イソプレンの生成量を測定した。SWITCH−PphoC/IspSMはイソプレン生成開始後にO.D.値が低下し(図25(A))、培養48時間で2-ケトグルコン酸を30.9g/L蓄積した(図26)。SWITCH−PphoCΔgcd/IspSMはイソプレン生成開始後もO.D.は一定の値を示し(図25(A))、培養48時間の2-ケトグルコン酸蓄積は1.4g/Lと極めて低い値であった(図26)。培養48時間におけるイソプレンの生成量はSWITCH−PphoC/IspSMが1771mg、SWITCH−PphoCΔgcd/IspSMが2553mgであった(図25(B))。この結果から、SWITCH−PphoCΔgcd/IspSMは2-ケトグルコン酸の生成が抑えられ、イソプレンの生成量が向上することが示された。
12−1)Actinidia arguta(サルナシ)由来リナロールシンターゼ遺伝子の取得
Actinidia arguta由来リナロールシンターゼ(AaLINS)遺伝子の塩基配列(GenBank accession number:GQ338153)、及びアミノ酸配列(GenPept accession number: ADD81294)は既に知られている。Actinidia arguta由来リナロールシンターゼタンパク質のアミノ酸配列、及び遺伝子の塩基配列を配列番号75、及び配列番号76に示す。AaLINS遺伝子を効率的に発現させる為、二次構造を解消させるようにコドンを最適化し、さらに葉緑体移行シグナルが切断されたAaLINS遺伝子を設計し、これをopt_AaLINSと名付けた。opt_AaLINSの塩基配列を配列番号77に示す。opt_AaLINS遺伝子にtacプロモーター領域(deBoer,et al.,(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,80,21−25)を付加したDNAは化学合成された後、pUC57(GenScript社製)にクローニングされ、得られたプラスミドをpUC57−Ptac−opt_AaLINSと名付けた。
Coriandrum sativum由来リナロールシンターゼ(CsLINS)遺伝子の塩基配列(GenBank accession number:KF700700)、及びアミノ酸配列(GenPept accession number: AHC54051)は既に知られている。Coriandrum sativum由来リナロールシンターゼタンパク質のアミノ酸配列、及び遺伝子配列を配列番号78、及び配列番号79に示す。CsLINS遺伝子を効率的に発現させる為、二次構造を解消させるようにコドンを最適化し、さらに葉緑体移行シグナルが切断されたCsLINS遺伝子を設計し、これをopt_CsLINSと名付けた。opt_CsLINSの塩基配列を配列番号80に示す。opt_CsLINS遺伝子にtacプロモーター領域(deBoer, et al.,(1983) Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,80,21−25)を付加したDNAは化学合成された後、pUC57(GenScript社製)にクローニングされ、得られたプラスミドをpUC57−Ptac−opt_CsLINSと名付けた。
Escherichia coliのファルネシル二リン酸シンターゼは、ispA遺伝子(配列番号81)によりコードされている(Fujisaki S., et al.(1990) J.Biochem.(Tokyo) 108:995−1000.)。Bacillus stearothermophilus由来のファルネシル二リン酸シンターゼにおいて、菌体内のゲラニル二リン酸の濃度を高める変異が明らかにされている(Narita K.,et al.(1999) J Biochem 126(3):566−571.)。本知見を基にEscherichia coliのファルネシル二リン酸シンターゼにおいても、同様の変異体が作出されている(Reiling KK et al.(2004) Biotechnol Bioeng.87(2) 200−212.)。ゲラニル二リン酸生成活性の高いispA変異体(S80F)遺伝子を効率的に発現させるため、二次構造を解消させるようにコドンを最適化した配列を設計し、これをispA*と名付けた。ispA*の塩基配列を配列番号82に示す。ispA*遺伝子は化学合成された後、pUC57(GenScript社製)にクローニングされ、得られたプラスミドをpUC57−ispA*と名付けた。
配列番号83に示したプライマーと配列番号85に示したプライマーを用いてpUC57−Ptac−opt_AaLINSを鋳型にPCRを行い、Ptac−opt_AaLINS断片を得た。さらに、配列番号86に示したプライマーと配列番号87に示したプライマーを用いてpUC57−ispA*を鋳型にPCRを行い、ispA*断片を得た。精製したPtac−opt_AaLINS断片、及びispA*断片を制限酵素PstIとScaIで消化したpACYC177(ニッポンジーン社製)にIn−Fusion HD cloning kit(クロンテック社製)を用いて連結し、pACYC177−Ptac−opt_AaLINS−ispA*を構築した。
配列番号83に示したプライマーと配列番号88に示したプライマーを用いてpUC57−Ptac−opt_CsLINSを鋳型にPCRを行い、Ptac−opt_CsLINS断片を得た。さらに、配列番号89に示したプライマーと配列番号87に示したプライマーを用いてpUC57−ispA*を鋳型にPCRを行い、ispA*断片を得た。精製したPtac−opt_CsLINS断片、及びispA*断片を制限酵素PstIとScaIで消化したpACYC177(ニッポンジーン社製)にIn−Fusion HD cloning kit(クロンテック社製)を用いて連結し、pACYC177−Ptac−opt_CsLINS−ispA*を構築した。
SWITCH−PphoC Δgcdのコンピテントセルを調製し、エレクトロポレーションによりpACYC177、pACYC177−Ptac−opt_AaLINS−ispA*あるいはpACYC177−Ptac−opt_CsLINS−ispA*を導入した。得られた株をそれぞれ、SWITCH−PphoC Δgcd/pACYC177、SWITCH−PphoC Δgcd/AaLINS−ispA*、SWITCH−PphoC Δgcd/CsLINS−ispA*と命名した。
実施例12で得られたSWITCH−PphoC Δgcd/AaLINS−ispA*株、SWITCH−PphoC Δgcd/CsLINS−ispA*株、及びSWITCH−PphoC Δgcd/pACYC177株のグリセロールストックを融解し、各株の菌体懸濁液50μLを50mg/Lのカナマイシンを含むLBプレートに均一に塗布し、34℃にて16時間培養した。得られたプレート上の菌体を、イノキュレーティングループ10μL(Thermo Fisher Scientific社製)のループ部分1/4程度の量を掻き取り、AGCテクノグラス社製試験管(直径×長さ×肉厚(mm)=25×200×1.2)中の、50mg/Lのカナマイシンを含む以下に記載の発酵培地5mLに接種し、往復振とう培養装置で30℃、120rpmの条件にて24時間培養した。
注入量 1.0μL
注入モード スプリット 1:10
キャリアガス He
制御モード 線速度
圧力 125.5kPa
全流量 20.5mL/min
カラム流量 1.59mL/min
線速度 36.3cm/sec
パージ流量 3.0mL/min
レート(℃/min) 温度(℃) ホールド時間(min)
65.0 5.0
5.0 105.0 0.5
35.0 297.5 2.5
検出器温度 375.0℃
検出器 FID
メイクアップガス He(30.0mL/min)
水素流量 40.0mL/min
空気 400.0mL/min
14−1)Picea sitchensis(アラスカトウヒ)由来リモネンシンターゼ遺伝子の取得
Picea sitchensis由来リモネンシンターゼ(PsLMS)遺伝子の塩基配列(GenBank accession number:DQ195275.1)、及びアミノ酸配列(GenPept accession number:ABA86248.1.)は、既に知られている。P.sitchensis由来リモネンシンターゼタンパク質のアミノ酸配列、及び遺伝子の塩基配列を配列番号90、及び配列番号91に示す。PsLMS遺伝子を効率的に発現させる為、二次構造を解消させP.ananatisのコドン使用頻度と同一となるようにコドンを最適化した。さらに葉緑体移行シグナルを切断した。得られる遺伝子をopt_PsLMSと名付けた。opt_PsLMSの塩基配列を配列番号92に示す。opt_PsLMS遺伝子を化学合成した後、pUC57(GenScript社製)にクローニングし、得られたプラスミドをpUC57−opt_PsLMSと名付けた。
Abies grandis由来リモネンシンターゼ(AgLMS)遺伝子の塩基配列(GenBank accession number:AF006193.1)、及びアミノ酸配列(GenPept accession number:AAB70907.1.)は既に知られている。A.grandis由来リモネンシンターゼタンパク質のアミノ酸配列、及び遺伝子配列を配列番号93、及び配列番号94に示す。AgLMS遺伝子を効率的に発現させる為、二次構造を解消させP.ananatisのコドン使用頻度と同一となるようにコドンを最適化した。さらに葉緑体移行シグナルを切断した。得られる遺伝子をopt_AgLMSと名付けた。opt_AgLMSの塩基配列を配列番号95に示す。opt_AgLMS遺伝子を化学合成した後、pUC57(GenScript社製)にクローニングし、得られたプラスミドをpUC57−opt_AgLMSと名付けた。
Mentha spicata由来リモネンシンターゼ(MsLMS)遺伝子の塩基配列(GenBank accession number:L13459.1)、及びアミノ酸配列(GenPept accession number:AAC37366.1)は既に知られている。M.spicata由来リモネンシンターゼタンパク質のアミノ酸配列、及び遺伝子配列を配列番号96、及び配列番号97に示す。MsLMS遺伝子を効率的に発現させる為、二次構造を解消させP.ananatisのコドン使用頻度と同一となるようにコドンを最適化した。さらに葉緑体移行シグナルを切断した。得られる遺伝子をopt_MsLMSと名付けた。opt_MsLMSの塩基配列を配列番号98に示す。opt_MsLMS遺伝子を化学合成した後、pUC57(GenScript社製)にクローニングし、得られたプラスミドをpUC57−opt_MsLMSと名付けた。
Citrus unshiu由来リモネンシンターゼ(CuLMS)遺伝子の塩基配列(GenBank accession number:AB110637.1)、及びアミノ酸配列(GenPept accession number:BAD27257.1)は既に知られている。C.unshiu由来リモネンシンターゼタンパク質のアミノ酸配列、及び遺伝子配列を配列番号99、及び配列番号100に示す。CuLMS遺伝子を効率的に発現させる為、二次構造を解消させP.ananatisのコドン使用頻度と同一となるようにコドンを最適化した。さらに葉緑体移行シグナルを切断した。得られる遺伝子をopt_CuLMSと名付けた。opt_CuLMSの塩基配列を配列番号101に示す。opt_CuLMS遺伝子を化学合成した後、pUC57(GenScript社製)にクローニングし、得られたプラスミドをpUC57−opt_CuLMSと名付けた。
Citrus limon由来リモネンシンターゼ(ClLMS)遺伝子の塩基配列(GenBank accession number:AF514287.1)、及びアミノ酸配列(GenPept accession number:AAM53944.1.)は既に知られている。C.limon由来リモネンシンターゼタンパク質のアミノ酸配列、及び遺伝子配列を配列番号102、及び配列番号103に示す。ClLMS遺伝子を効率的に発現させる為、二次構造を解消させP.ananatisのコドン使用頻度と同一となるようにコドンを最適化した。さらに葉緑体移行シグナルを切断した。得られる遺伝子をopt_ClLMSと名付けた。opt_ClLMSの塩基配列を配列番号104に示す。opt_ClLMS遺伝子を化学合成した後、pUC57(GenScript社製)にクローニングし、得られたプラスミドをpUC57−opt_ClLMSと名付けた。
配列番号105に示したプライマーと配列番号106に示したプライマーを用いてpUC57−opt_PsLMSを鋳型にPCRを行った。次に、得られたPCR断片を鋳型として配列番号107に示したプライマーと配列番号106に示したプライマーを用いてPCRを行い、Ptac−opt_PsLMS断片を得た。さらに、配列番号108に示したプライマーと配列番号109に示したプライマーを用いてpUC57−ispA*を鋳型にPCRを行い、ispA*断片を得た。精製したPtac−opt_PsLMS断片、及びispA*断片を制限酵素PstIとScaIで消化したpACYC177(ニッポンジーン社製)にIn−Fusion HD cloning kit(クロンテック社製)を用いて連結し、pACYC177−Ptac−opt_PsLMS−ispA*を構築した。
配列番号110に示したプライマーと配列番号111に示したプライマーを用いてpUC57−opt_AgLMSを鋳型にPCRを行った。次に、得られたPCR断片を鋳型として配列番号107に示したプライマーと配列番号111に示したプライマーを用いてPCRを行い、Ptac−opt_AgLMS断片を得た。さらに、配列番号108に示したプライマーと配列番号109に示したプライマーを用いてpUC57−ispA*を鋳型にPCRを行い、ispA*断片を得た。精製したPtac−opt_AgLMS断片、及びispA*断片を制限酵素PstIとScaIで消化したpACYC177(ニッポンジーン社製)にIn−Fusion HD cloning kit(クロンテック社製)を用いて連結し、pACYC177−Ptac−opt_AgLMS−ispA*を構築した。
配列番号112に示したプライマーと配列番号113に示したプライマーを用いてpUC57−opt_MsLMSを鋳型にPCRを行った。次に、得られたPCR断片を鋳型として配列番号107に示したプライマーと配列番号113に示したプライマーを用いてPCRを行い、Ptac−opt_MsLMS断片を得た。さらに、配列番号108に示したプライマーと配列番号109に示したプライマーを用いてpUC57−ispA*を鋳型にPCRを行い、ispA*断片を得た。精製したPtac−opt_MsLMS断片、及びispA*断片を制限酵素PstIとScaIで消化したpACYC177(ニッポンジーン社製)にIn−Fusion HD cloning kit(クロンテック社製)を用いて連結し、pACYC177−Ptac−opt_MsLMS−ispA*を構築した。
配列番号114に示したプライマーと配列番号115に示したプライマーを用いてpUC57−opt_CuLMSを鋳型にPCRを行った。次に、得られたPCR断片を鋳型として配列番号107に示したプライマーと配列番号115に示したプライマーを用いてPCRを行い、Ptac−opt_CuLMS断片を得た。さらに、配列番号108に示したプライマーと配列番号109に示したプライマーを用いてpUC57−ispA*を鋳型にPCRを行い、ispA*断片を得た。精製したPtac−opt_CuLMS断片、及びispA*断片を制限酵素PstIとScaIで消化したpACYC177(ニッポンジーン社製)にIn−Fusion HD cloning kit(クロンテック社製)を用いて連結し、pACYC177−Ptac−opt_CuLMS−ispA*を構築した。
配列番号116に示したプライマーと配列番号117に示したプライマーを用いてpUC57−opt_ClLMSを鋳型にPCRを行った。次に、得られたPCR断片を鋳型として配列番号107に示したプライマーと配列番号117に示したプライマーを用いてPCRを行い、Ptac−opt_ClLMS断片を得た。さらに、配列番号108に示したプライマーと配列番号109に示したプライマーを用いてpUC57−ispA*を鋳型にPCRを行い、ispA*断片を得た。精製したPtac−opt_ClLMS断片、及びispA*断片を制限酵素PstIとScaIで消化したpACYC177(ニッポンジーン社製)にIn−Fusion HD cloning kit(クロンテック社製)を用いて連結し、pACYC177−Ptac−opt_ClLMS−ispA*を構築した。
SWITCH−PphoC Δgcdのコンピテントセルを調製し、エレクトロポレーションによりpACYC177、pACYC177−Ptac−opt_PsLMS−ispA*、pACYC177−Ptac−opt_AgLMS−ispA*、pACYC177−Ptac−opt_MsLMS−ispA*、pACYC177−Ptac−opt_CuLMS−ispA*あるいはpACYC177−Ptac−opt_ClLMS−ispA*を導入した。得られた株をそれぞれ、SWITCH−PphoC Δgcd/pACYC177株、SWITCH−PphoC Δgcd/PsLMS−ispA*株、SWITCH−PphoC Δgcd/AgLMS−ispA*株、SWITCH−PphoC Δgcd/MsLMS−ispA*株、SWITCH−PphoC Δgcd/CuLMS−ispA*株及びSWITCH−PphoC Δgcd/ClLMS−ispA*株と命名した。
実施例14で得られたSWITCH−PphoC Δgcd/PsLMS−ispA*株、SWITCH−PphoC Δgcd/AgLMS−ispA*株、SWITCH−PphoC−Δgcd/MsLMS−ispA*株、SWITCH−PphoC Δgcd/CuLMS−ispA*株、SWITCH−PphoC Δgcd/ClLMS−ispA*株、及びSWITCH−PphoC Δgcd/pACYC177株のグリセロールストックを融解し、10μLを50mg/Lのカナマイシンを含むLBプレートに均一に塗布し、34℃にて16時間培養した。得られたプレート上の菌体を、NuncTMディスポーザブルループ1μL(Thermo Fisher Scientific社製)の1ループ程度の量を掻き取った。掻き取った菌体をヘッドスペースバイアル(Perkin Elmer社製 22mL CLEAR CRIMP TOP VIAL cat♯B0104236)中の、50mg/Lのカナマイシンを含む以下の表10に記載のリモネン発酵用培地1mLに接種し、バイアルはヘッドスペースバイアル用キャップブチルゴムセプタム付(Perkin Elmer社製CRIMPS cat♯B0104240)を用いて密栓した。往復振とう培養装置で30℃、120rpmの条件にてSWITCH−PphoC Δgcd/pACYC177株、SWITCH−PphoC Δgcd/PsLMS−ispA*株、SWITCH−PphoC Δgcd/AgLMS−ispA*株及びSWITCH−PphoC Δgcd/MsLMS−ispA*株は48時間培養した。SWITCH−PphoC Δgcd/pACYC177株、SWITCH−PphoC Δgcd/CuLMS−ispA*株及びSWITCH−PphoC Δgcd/ClLMS−ispA*株は同様に発酵を行い、これらの株の培養時間を72時間とした。
注入時間 0.02min
オーブン温度 80℃
ニードル温度 80℃
トランスファー温度 80℃
GCサイクル時間 5min
加圧時間 3min
引き上げ時間 0.2min
保温時間 5min
キャリアガス圧力 124kPa
キャリアガス He
気化室温度 200.0℃
温度条件 175℃(定温)
イオン源温度 250℃
インターフェイス温度 250℃
検出器電圧 0.1kV
検出イオン分子量 68
補助イオン分子量 93
フィラメント点灯時間 2.0−3.5min
Claims (20)
- 以下:
1)十分な濃度の増殖促進剤の存在下でイソプレノイド化合物生成微生物を培養して、イソプレノイド化合物生成微生物を増殖させること;
2)増殖促進剤の十分な濃度を減少させて、イソプレノイド化合物生成微生物によるイソプレノイド化合物の生成を誘導すること;および
3)イソプレノイド化合物生成微生物を培養してイソプレノイド化合物を生成すること
を含み、
イソプレノイド化合物生成微生物が、前記増殖促進剤に対して逆依存性であるプロモーターに依存してイソプレノイド化合物を生成する能力を有し、
イソプレノイド化合物生成微生物が、細菌であり、
増殖促進剤が、リン化合物である、
イソプレノイド化合物の製造方法。 - イソプレノイド化合物生成微生物が、前記プロモーターの制御下にあるイソプレノイド化合物合成酵素遺伝子を含む、請求項1記載の方法。
- イソプレノイド化合物生成微生物が、メチルエリスリトールリン酸経路および/またはメバロン酸経路が強化されている、請求項1または2記載の方法。
- イソプレノイド化合物がモノテルペンであり、イソプレノイド化合物生成微生物がモノテルペン生成微生物である、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
- イソプレノイド化合物がリモネンであり、イソプレノイド化合物生成微生物がリモネン生成微生物である、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
- イソプレノイド化合物がリナロールであり、イソプレノイド化合物生成微生物がリナロール生成微生物である、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
- イソプレノイド化合物がイソプレンモノマーであり、イソプレノイド化合物生成微生物がイソプレン生成微生物である、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
- 前記プロモーターがリン欠乏誘導型プロモーターである、請求項1〜7のいずれか一項記載の方法。
- リン欠乏誘導型プロモーターが、酸性フォスファターゼをコードする遺伝子のプロモーター、またはリン取り込み担体をコードする遺伝子のプロモーターである、請求項8記載の方法。
- 50mg/L以下の総リン濃度の存在下でイソプレノイド生成微生物によるイソプレノイドの生成が誘導される、請求項8または9記載の方法。
- 誘導期のイソプレノイド生成速度が600ppm/vvm/h以下である、請求項1〜10のいずれか一項記載の方法。
- 前記イソプレノイド化合物がイソプレンである、請求項1〜11のいずれか一項記載の方法。
- イソプレノイド化合物生成微生物が、メチルエリスリトールリン酸経路によるジメチルアリル二リン酸の合成能を有する、請求項1〜12のいずれか一項記載の方法。
- イソプレノイド化合物生成微生物が、メバロン酸経路によるジメチルアリル二リン酸の合成能を有する、請求項1〜13のいずれか一項記載の方法。
- イソプレノイド化合物生成微生物が、腸内細菌科に属する微生物である、請求項1〜14のいずれか一項記載の方法。
- イソプレノイド化合物生成微生物が、パントエア属、エンテロバクター属またはエシェリヒア属に属する微生物である、請求項15記載の方法。
- イソプレノイド化合物生成微生物が、パントエア・アナナティス、エンテロバクター・アエロゲネスまたはエシェリヒア・コリである、請求項16記載の方法。
- 以下(I)および(II)を含む、イソプレンポリマーの製造方法:
(I)請求項1〜17のいずれか一項記載の方法によりイソプレンモノマーを生成すること;
(II)イソプレンモノマーを重合してイソプレンポリマーを生成すること。 - 以下(A)および(B)を含む、ゴム組成物の製造方法:
(A)請求項18記載の方法によりイソプレンポリマーを調製すること;
(B)前記イソプレンポリマーを1以上のゴム組成物成分と混合すること。 - 以下(i)および(ii)を含む、タイヤの製造方法:
(i)請求項19記載の方法によりゴム組成物を生成すること;
(ii)前記ゴム組成物を利用してタイヤを製作すること。
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