CN105518130A - 用于梭菌转化的组合物和方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供用于梭菌的组合物和方法，所述梭菌被工程化为生成工业生物产物和/或提高工业生物产物的生成效率。

Description

用于梭菌转化的组合物和方法

相关专利申请的交叉引用

本申请要求于2013年6月21日提交的美国临时专利申请No.61/838,224的优先权；将该专利申请的内容以引用的方式整体并入本文。

技术领域

本发明提供用于梭菌的基因工程的组合物和方法，所述组合物和方法用于生成工业生物产物和/或提高工业生物产物的生成效率。

背景技术

细菌限制修饰(R-M)系统具有多种特异性和策略，但其一般功能是保护细菌免受外源DNA(例如来自噬菌体的DNA)的影响。R-M系统可由DNA甲基转移酶和限制性核酸内切酶构成。DNA甲基转移酶催化甲基从供体S-腺苷-L-甲硫氨酸(也称为“SAM”或“AdoMet”)转移到细菌宿主的特定DNA序列内的腺嘌呤或胞嘧啶残基上，该特定DNA序列被称为识别序列。根据所生成的产物的性质将DNA甲基转移酶分成三大类。第一类由催化腺嘌呤的环外氨基的甲基化以形成产物N6-甲基腺嘌呤的氨基甲基转移酶构成。第二类由催化胞嘧啶的环外氨基以形成产物N4-甲基胞嘧啶的氨基甲基转移酶构成，而第三类由使胞嘧啶环上的5-碳原子甲基化以形成5-甲基胞嘧啶的甲基转移酶构成。这些甲基化碱基在细菌R-M系统中发挥重要功能，因为它们保护宿主染色体免受伙伴限制性酶的另外有害作用，所述有害作用切割未经甲基化的识别序列DNA，但不作用于完全甲基化的DNA。因此，正是DNA甲基转移酶及其同源限制性核酸内切酶的组合作用保护细菌宿主免受任何未经修饰的外源DNA的影响。虽然R-M系统发挥着重要的保护功能，但它们还抑制菌种之间甚至相同菌种的不同菌株之间的质粒转移，因为单个细菌菌株内的多个R-M系统可全部参与限制屏障。因此，R-M系统充当了多种细菌(包括在生物技术上具有重要性的梭菌属(Clostridium))的基因操纵屏障。

梭菌属由多个具有宽泛的生物化学和生理性状的菌种构成。参见Catoetal.,1986,GenusClostridium,pp.1141-1200,inP.H.Sneathetal.(eds.),Bergey’sManualofSystematicBacteriology,Vol.2,WilliamsandWilkins,Baltimore,MD(Cato等人，1986年，梭菌属，第1141-1200页，载于P.H.Sneath等人编，《伯杰氏系统细菌学手册》，第2卷，威廉斯和威尔金斯出版公司，马里兰州巴尔的摩)。归类于梭菌属的分离株需要达到四个标准：(1)能够形成内生孢子，(2)厌氧能量代谢，(3)不能发生异化硫酸盐还原作用，以及(4)具有革兰氏阳性细胞壁。参见Andressonetal.,1989,IntroductiontothephysiologyandbiochemistryofthegenusClostridium,pp.27-62,inMintonandClarke(eds.),Clostridia,PlenumPress,NewYork(Andresson等人，1989年，梭菌属的生理学和生物化学导论，第27-62页，载于Minton和Clarke编，《梭菌》，普莱南出版社，纽约)。梭菌属的产乙酸菌使用合成气作为碳源和在厌氧条件下生长的还原力。合成气由H₂、CO和CO₂的混合物构成，它通过从城市废物到农业副产物的任何有机材料的气化生成。由于合成气的低成本以及衍生来源的广泛性和灵活性，使用合成气作为商品酶和化学品的生物性生产的原料具有很大的吸引力。然而，相对而言，梭菌属中的产乙酸菌未得到鉴定，并且基因操纵(尤其是通过引入稳定的且不被梭菌限制性核酸内切酶切割的异源核酸来基因操纵)这些生物体的能力很大程度上未得到开发。转化梭菌的能力是梭菌有效用于生成工业生物产物(例如，异戊二烯、丁二烯和乙醇)的第一个必要和基本的步骤。

克服梭菌中R-M系统的努力通常涉及在转化前体内甲基化异源DNA，以保护异源DNA不被宿主细胞中的限制性核酸内切酶降解；例如，甲基化可通过将穿梭质粒转化到表达一种或多种异源甲基转移酶(例如，来自枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)噬菌体Φ3T的甲基转移酶)的菌株(例如，大肠杆菌(E.coli))而在体内进行。在分离到甲基化DNA后，可通过电穿孔、原生质体转化、接合转化、基因枪或本领域已知的其他方法将其转化到厌氧宿主细胞(例如，乙酸梭菌(Clostridiumaceticum)细胞)中。

克服梭菌R-M系统的其他方法涉及使用一种或多种从商业供应商(例如，新英格兰生物实验室(NewEnglandBioLabs))商购获得的纯化甲基转移酶在体外使异源DNA甲基化，或涉及创建和使用限制修饰系统中至少一个限制性核酸内切酶基因缺失的梭菌宿主细胞。参见，例如，Dongetal.,PLoSONE20105(2):e9038(Dong等人，《科学公共图书馆ONE》，2010年，第5卷，第2期，第e9038页)。在Dong等人(2010)中，使用ClosTron基于II型内含子插入的基因敲除系统来破坏从可公开获得的丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)ATCC824基因组鉴定的推定II型限制性核酸内切酶(Cac824I)。ClosTron系统类似于大多数II型内含子方法，使用衍生自宿主范围广泛的乳乳球菌(Lactococcuslactis)LI.LtrB内含子的元件。参见，例如，Kuehneetal.,2011,ClosTron-mediatedengineeringofClostridium.MethodsinMolecularBiology,Vol.765:389-407(Kuehne等人，2011年，ClosTron介导的梭菌工程改造，《分子生物学方法》，第765卷，第389-407页)。所得的Cac824I缺失的细胞可通过电穿孔用未经甲基化的DNA(例如，未经甲基化的质粒DNA)转化。

然而，这些克服梭菌限制修饰系统的方法取决于鉴定所关注的梭菌中存在的特定甲基转移酶和限制性核酸内切酶。例如，如果宿主细胞内部的限制性核酸内切酶具有与异源甲基转移酶相同的DNA识别序列，则为了用所关注的质粒转化梭菌菌种，用异源甲基转移酶(例如，用枯草芽孢杆菌噬菌体Φ3T甲基转移酶)体内或体外处理所需的质粒只能保护质粒免受切割。为了改善此类方法的有效性，可使用多种异源甲基转移酶，每种异源甲基转移酶具有不同的DNA识别序列；然而，这增加了每次转化尝试的时间和成本。如果所用的甲基转移酶不识别与所关注的梭菌细胞内部存在的限制性核酸内切酶相同的序列，则不能保护异源DNA免受切割。

因此，仍然需要鉴定和规避梭菌限制修饰系统，以促进它们在生成工业生物产物中的应用，这些生物产物包括但不限于：异戊二烯、丁二烯和乙醇。

在整个说明书中，公开了各种出版物(包括序列)、专利和专利申请。出于所有目的，所有这些公开内容据此以引用的方式整体并入。

发明内容

本发明尤其阐明了梭菌(例如，乙酸梭菌)中在CCWGG位点(W可为A或T)切割的特定限制修饰系统，以及可用于避免切割的甲基转移酶，如本文进一步描述。对该限制修饰系统的认识允许对能够生物性生成各种工业产物(例如，生物产物)的梭菌进行工程改造。

因此，在一个方面，本发明提供与SEQIDNO:1具有至少90％序列同一性的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码具有甲基转移酶活性的多肽。在本文所述的任何实施例中，所述多核苷酸是SEQIDNO:2。在本文所述的任何实施例中，所述编码多肽在包含CCWGG的序列处使多核苷酸甲基化。在本文所述的任何实施例中，所述包含CCWGG的序列选自CCAGG(SEQIDNO:9)和/或CCTGG(SEQIDNO:10)。在本文所述的任何实施例中，所述编码多肽在SEQIDNO:9和/或SEQIDNO:10处使多核苷酸甲基化。

在另一个方面，本发明提供质粒，所述质粒包含一种或多种分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸与SEQIDNO:1具有至少90％的序列同一性，所述分离的多核苷酸可操作地连接至一种或多种控制序列，使得所述编码多肽能够在表达宿主中表达。在本文所述的任何实施例中，所述表达宿主是大肠杆菌。在本文所述的任何实施例中，所述质粒还包含SEQIDNO:14。在本文所述的任何实施例中，所述质粒转化到大肠杆菌S17-1细胞中。

在另一个方面，本发明提供重组宿主细胞，所述重组宿主细胞包含分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸与SEQIDNO:1具有至少90％的序列同一性，其中所述多核苷酸编码具有甲基转移酶活性的多肽。

在另一个方面，本发明提供重组宿主细胞，所述重组宿主细胞包含质粒，所述质粒包含一种或多种分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸与SEQIDNO:1具有至少90％的序列同一性，所述分离的多核苷酸可操作地连接至一种或多种控制序列，使得所述编码多肽能够在表达宿主中表达。

在另一个方面，本发明提供分离的多肽，所述分离的多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:3具有至少90％的序列同一性，其中所述多肽能够在包含CCWGG的序列处使多核苷酸甲基化。在本文所述的任何实施例中，所述多肽能够在包含SEQIDNO:9和/或SEQIDNO:10的序列处使多核苷酸甲基化。在本文所述的任何实施例中，所述多肽能够在SEQIDNO:9和/或SEQIDNO:10处使多核苷酸甲基化。

在另一个方面，本发明提供分离的多肽，所述分离的多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:3具有至少90％的序列同一性，其中所述多肽能够在包含CCWGG的序列处使多核苷酸甲基化。在本文所述的任何实施例中，所述多肽能够在包含SEQIDNO:9和/或SEQIDNO:10的序列处使多核苷酸甲基化。在本文所述的任何实施例中，所述多肽能够在SEQIDNO:9和/或SEQIDNO:10处使多核苷酸甲基化。在本文所述的任何实施例中，所述多肽是SEQIDNO:3。

在另一个方面，本发明提供分离的多肽，所述分离的多肽通过多核苷酸生成，所述多核苷酸与SEQIDNO:1具有至少90％的序列同一性，其中所述多肽具有甲基转移酶活性。

在另一个方面，本发明提供生成DNA甲基转移酶的方法，所述方法包括：(a)培养重组宿主细胞，所述重组宿主细胞包含分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸与SEQIDNO:1具有至少90％的序列同一性，其中所述多核苷酸编码具有甲基转移酶活性的多肽，其中所述宿主细胞在合适的条件下培养，以生成所述编码DNA甲基转移酶，以及(b)回收所述DNA甲基转移酶。

在另一个方面，本发明提供生成重组梭菌转化体的方法，所述方法包括：将编码DNA甲基转移酶的多核苷酸引入埃希氏菌(Escherichia)宿主细胞，(a)在适于表达所述DNA甲基转移酶的条件下培养所述埃希氏菌宿主细胞，(b)将所述甲基化的多核苷酸从所述埃希氏菌宿主细胞转移到梭菌宿主细胞，其中使用该方法转化的所述细菌选自乙酸梭菌、杨氏梭菌(Clostridiumljungdahlii)、丙酮丁醇梭菌和合成气发酵梭菌(Clostridiumautoethanogenum)。

在另一个方面，本发明提供分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸与SEQIDNO:4具有至少90％的序列同一性，其中所述多核苷酸编码具有核酸内切酶活性的多肽。在本文所述的任何实施例中，所述编码多肽能够在包含CCWGG的序列处切割多核苷酸。在本文所述的任何实施例中，所述编码多肽能够在包含SEQIDNO:9和/或SEQIDNO:10的序列处切割多核苷酸。在本文所述的任何实施例中，所述编码多肽能够在SEQIDNO:9和/或SEQIDNO:10处切割多核苷酸。在本文所述的任何实施例中，所述多核苷酸是SEQIDNO:4。

在另一个方面，本发明提供质粒，所述质粒包含分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸与SEQIDNO:4具有至少90％的序列同一性，其中所述多核苷酸编码具有核酸内切酶活性的多肽，并且其中所述质粒可操作地连接至一种或多种控制序列，使得所述编码多肽能够在表达宿主中表达。在本文所述的任何实施例中，所述编码多肽能够在大肠杆菌表达宿主中表达。

在另一个方面，本发明提供重组宿主细胞，所述重组宿主细胞包含分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸与SEQIDNO:4具有至少90％的序列同一性，其中所述多核苷酸编码具有核酸内切酶活性的多肽。

在另一个方面，本发明提供重组宿主细胞，所述重组宿主细胞包含质粒，所述质粒包含分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸与SEQIDNO:4具有至少90％的序列同一性，其中所述多核苷酸编码具有核酸内切酶活性的多肽，并且其中所述质粒可操作地连接至一种或多种控制序列，使得所述编码多肽能够在表达宿主中表达。

在另一个方面，本发明提供减少梭菌宿主细胞中核酸内切酶切割异源核酸的方法，所述方法包括使包含CCWGG的序列甲基化。在本文所述的任何实施例中，所述方法包括使所述异源核酸中包含SEQIDNO:9和/或SEQIDNO:10的序列甲基化。在本文所述的任何实施例中，所述方法包括使SEQIDNO:9和/或SEQIDNO:10甲基化。在本文所述的任何实施例中，所述核酸内切酶与SEQIDNO:5具有至少90％的序列同一性。在本文所述的任何实施例中，所述核酸内切酶是SEQIDNO:5。在本文所述的任何实施例中，所述甲基转移酶是SEQIDNO:3。

在另一个方面，本发明提供穿梭质粒，所述穿梭质粒包含pDW280(SEQIDNO:15)。

在另一个方面，本发明提供穿梭质粒，所述穿梭质粒包含pMCS537(SEQIDNO:16)。

在另一个方面，本发明提供穿梭质粒，所述穿梭质粒包含pMCS200(SEQIDNO:17)。

在另一个方面，本发明提供穿梭质粒，所述穿梭质粒包含pMCS201(SEQIDNO:18)。

在另一个方面，本发明提供穿梭质粒，所述穿梭质粒包含pMCS444(SEQIDNO:19)。

在另一个方面，本发明提供穿梭质粒，所述穿梭质粒包含pMCS445(SEQIDNO:20)。

在另一个方面，本发明提供穿梭质粒，所述穿梭质粒包含pMCS94(SEQIDNO:22)。

在另一个方面，本发明提供质粒，所述质粒包含pMCS466(SEQIDNO:23)。

在另一个方面，本发明提供将一种或多种所关注的核酸递送到梭菌细胞中的方法，所述方法包括以下步骤：

用以下质粒共转化大肠杆菌细胞：

包含多核苷酸的质粒，所述多核苷酸编码多肽，所述多肽具有甲基转移酶活性，以及

至少一种穿梭质粒，所述穿梭质粒选自pDW280、pMCS537、pMCS200、pMCS201、pMCS444或pMCS445，其中所述穿梭质粒还包含所述一种或多种所关注的核酸；

在允许(a)(1)和(a)(2)接合转移的条件下使步骤(a)的所述大肠杆菌细胞与梭菌细胞一起培养，从而将一种或多种核酸递送到梭菌细胞中。

在本文所述的任何实施例中，所述梭菌细胞选自：乙酸梭菌、杨氏梭菌、丙酮丁醇梭菌和合成气发酵梭菌。在本文所述的任何实施例中，所述大肠杆菌细胞是S17-1菌株。

在另一个方面，本发明提供重组梭菌细胞，所述重组梭菌细胞包含：

a)包含pDW268(SEQIDNO:14)的质粒，以及

b)至少一种穿梭质粒，所述穿梭质粒选自pDW280(SEQIDNO:15)、pMCS537(SEQIDNO:16)、pMCS200(SEQIDNO:17)、pMCS201(SEQIDNO:18)、pMCS444(SEQIDNO:19)或pMC4245(SEQIDNO:20)，其中所述穿梭质粒还包含一种或多种所关注的核酸。

在另一个方面，本发明提供重组梭菌细胞，所述重组梭菌细胞通过以下步骤生成：(a)用以下质粒共转化大肠杆菌细胞：(1)包含多核苷酸的质粒，所述多核苷酸编码具有甲基转移酶活性的多肽，以及(2)至少一种穿梭质粒，所述穿梭质粒选自pDW280、pMCS537、pMCS200、pMCS201、pMCS444或pMCS445，其中所述穿梭质粒还包含所述一种或多种所关注的核酸；(b)在允许(a)(1)和(a)(2)接合转移的条件下使步骤(a)的所述大肠杆菌细胞与梭菌细胞一起培养，从而将一种或多种核酸递送到梭菌细胞中。

在另一个方面，本发明提供梭菌表达系统，所述梭菌表达系统用于表达一种或多种所关注的核酸，所述系统包含：

a)包含pDW268(SEQIDNO:14)的质粒，

b)穿梭质粒，所述穿梭质粒选自pDW280(SEQIDNO:15)、pMCS537(SEQIDNO:16)、pMCS200(SEQIDNO:17)、pMCS201(SEQIDNO:18)、pMCS444(SEQIDNO:19)或pMC4245(SEQIDNO:20)，其中所述穿梭质粒还包含一种或多种所关注的用于表达的核酸，

c)埃希氏菌细胞，所述埃希氏菌细胞能够与梭菌细胞相互作用，以允许(a)和(b)的转移；以及

d)梭菌细胞，所述梭菌细胞能够与埃希氏菌细胞相互作用，使得所述一种或多种核酸在所述梭菌细胞中表达。

在本文所述的任何实施例中，所述梭菌细胞选自乙酸梭菌、杨氏梭菌、丙酮丁醇梭菌和合成气发酵梭菌。在本文所述的任何实施例中，所述梭菌细胞是乙酸梭菌。

附图说明

图1示出了乙酸梭菌DNA甲基转移酶(M.CacI)的密码子优化的DNA序列(1422bp)，该序列优化为在大肠杆菌中表达(SEQIDNO:1)。

图2示出了乙酸梭菌甲基转移酶(M.CacI,RYBO02455)的野生型DNA序列(1425bp)(SEQIDNO.2)。

图3示出了乙酸梭菌DNA甲基转移酶(M.CacI)的推导氨基酸序列(474aa)(SEQIDNO.3)。

图4A示出了来自乙酸梭菌菌株ATCC35044(CacI,RYBO02454)的限制性核酸内切酶的野生型DNA序列(714bp)(SEQIDNO.4)。图4B和图4C分别示出了乙酸梭菌菌株ATCC35044中M.CacI(图4B，RYBO02455-SEQIDNO.2)和CacI(图4C，RYBO02454；SEQIDNO.4)的基因组定位和注解。M.CacI和CacI彼此相邻定位，但在乙酸梭菌染色体的相对链上(图4B-C)。图4C还示出CacI(圆圈箭头)被Genbank数据库错误注解为糖基水解酶。

图5示出了乙酸梭菌限制性核酸内切酶CacI的推导氨基酸序列(237aa)(SEQIDNO.5)。

图6示出了pCA1的质粒图谱。

图7A-B示出了pCA1DNA序列(5720bp)(SEQIDNO.6)。

图8示出了pMCS203的质粒图谱。

图9示出了pMCS203DNA序列(3729bp)(SEQIDNO.7)。

图10A示出了pMCS244的质粒图谱。图10B示出了pMCS244的质粒图谱，箭头指示出其四个CacI限制性位点(用加粗箭头标记)的大概定位。质粒的ColE1RNA11区域中的两个CacI位点的定位彼此靠近，并只用一个箭头表示。

图11示出了pMCS244DNA序列(3270bp)(SEQIDNO.8)。

图12A示出了限制性核酸内切酶分析结果，该分析使用1μL乙酸梭菌裂解物、1μLHindIII限制性核酸内切酶、1μLApaLI限制性核酸内切酶或它们的指定组合处理500ngpMCS244进行。从左到右，第1道：RocheDNA分子量标准X，第2道：未经切割的pMCS244，第3道：pMCS244和乙酸梭菌裂解物，第4道：pMCS244和HindIII，第5道：pMCS244和ApaLI，第6道：乙酸梭菌裂解物和HindIII处理的pMCS244，第7道：乙酸梭菌裂解物和ApaLI处理的pMCS244，第8道：乙酸梭菌裂解物处理的pMCS244，第9道：乙酸梭菌裂解物、HindIII和ApaLI组合处理的pMCS44。

图12B示出了精确图谱分析的结果。第1道：500ngpMCS244和1μL乙酸梭菌裂解物，第2道：RocheDNA分子量标准X，第3道：100ng使用引物M13R和oMCS25从pMCS244生成的线性PCR产物，第4道：100ng使用引物M13R和oMCS25以及1μLHindIII从pMCS244生成的线性PCR产物，第5道：100ng使用引物M13R和oMCS25以及1μL乙酸梭菌裂解物从pMCS244生成的线性PCR产物。

图13示出了使用引物M13R和oMCS25从pMCS244生成的线性PCR产物中邻近HindIII切割位点的CCWGG(W＝T或A)II型限制性核酸内切酶识别序列。CCAGG(SEQIDNO.9)和CCTGG(SEQIDNO.10)二者均被CacI和M.CacI识别。

图14示出了pDW265的质粒图谱，其中指出了四个突变CacIDNA识别位点的定位。

图15示出了pDW265的DNA序列(3270bp)(SEQIDNO.11)。

图16示出了限制性核酸内切酶分析结果，该分析使用1μL乙酸梭菌裂解物、1μLHindIII或它们二者处理500ng对照质粒pMCS244或500ngpDW265质粒(四个CacIDNA识别位点均为突变的)进行。第1道：RocheDNA分子量标准X，第2道：对照质粒pMCS244；第3道：未经处理的pDW265质粒；第4道：乙酸梭菌裂解物处理的pMCS244对照；第5道：乙酸梭菌裂解物处理的pDW265质粒；第6道：HindIII处理的pMCS244；第7道：HindIII处理的pDW265；第8道：乙酸梭菌裂解物和HindIII二者处理的pMCS244质粒；第9道：乙酸梭菌裂解物和HindIII二者处理的pDW265。

图17A示出了pMCS244与乙酸梭菌裂解物一起温育，然后转化到大肠杆菌中时的结果，pMCS244包含4个CacI识别序列位点。图17B示出了pDW265与乙酸梭菌裂解物一起温育，然后转化到大肠杆菌中时的结果，除四个CacI位点均突变之外，pDW265与pMCS244相同。

图18示出了使用引物oMCS418至oMCS423(表4)从质粒扩增的PCR产物，分别确认整个异源序列(pDW280上)、乙酸梭菌复制起点和红霉素抗性盒的存在，所述质粒从接合转化的乙酸梭菌菌株分离。

图19示出了pDW263的质粒图谱。

图20A-C示出了pDW263的DNA序列(8285bp)(SEQIDNO.12)。

图21示出了pDW264的质粒图谱。

图22A-C示出了pDW264的DNA序列(8285)(SEQIDNO.13)。

图23示出了pDW268的质粒图谱。

图24A-C示出了pDW268的DNA序列(6758bp)(SEQIDNO.14)。

图25示出了质粒pDW265与乙酸梭菌裂解物一起温育，并且转化到大肠杆菌中时的结果。

图26示出了未经甲基化的pMCS244与乙酸梭菌裂解物一起温育，并且转化到大肠杆菌中时的结果。

图27示出了pDW280的质粒图谱。

图28A-C示出了pDW280的DNA序列(8398bp)(SEQIDNO.15)。

图29示出了与大肠杆菌S17-1细胞成功接合后，在AcM培养基上生长的多次传代乙酸梭菌，所述培养基包含10μg/ml萘啶酸和20μg/ml红霉素，所述大肠杆菌S17-1细胞具有pDW268和pDW280质粒。

图30示出了pMCS537的质粒图谱。

图31A-B示出了pMCS537的DNA序列(SEQIDNO.16)。

图32示出了pMCS200的质粒图谱，pMCS200也称为pMTL82151。

图33A-B示出了pMCS200的DNA序列(5254bp)(SEQIDNO.17)。

图34示出了pMCS201的质粒图谱，pMCS201也称为pMTL83151。

图35A-B示出了pMCS201的DNA序列(4476bp)(SEQIDNO.18)。

图36A-B示出了抗生素甲砜霉素(Thi)和红霉素(Em)对液体培养物中生长的乙酸梭菌(图36A)或乙酸梭菌生长培养基(AcM培养基)上生长的乙酸梭菌(图36B)的最小抑制浓度的测定结果。

图37示出了乙酸梭菌的果糖滴定结果，图中显示10g/l果糖无限制，果糖仅在浓度小于～1.5g/l时有限制。

图38A-B示出了抗生素甲砜霉素(Thi)和红霉素(Em)对液体培养物中生长的杨氏梭菌(图38A)或平板上生长的杨氏梭菌(图38B)的最小抑制浓度的测定结果。

图39示出了可通过细胞途径从合成气生成的微生物燃料。

图40示出了经典和改进的MVA途径。1。乙酰-CoA乙酰转移酶(AACT)；2.HMG-CoA合酶(HMGS)；3.HMG-CoA还原酶(HMGR)；4。甲羟戊酸激酶(MVK)；5。磷酸甲羟戊酸激酶(PMK)；6。焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶(MVD或DPMDC)；7。异戊烯基焦磷酸异构酶(IDI)；8。磷酸甲羟戊酸脱羧酶(PMDC)；9。异戊烯基磷酸激酶(IPK)。经典的MVA途径经由反应5和6来从反应1进行到反应7，而改进的MVA途径经历反应8和9。在结构式中的P和PP分别是磷酸根和焦磷酸根。该图取自KogaandMorii,MicrobiologyandMol.BiologyReviews,71:97-120,2007(Koga和Morii，《微生物学与分子生物学评论》，第71卷，第97-120页，2007年)，将该文献以引用的方式整体并入，尤其是关于改进的MVA途径的核酸和多肽的内容。改进的MVA途径存在于例如一些古细菌生物体(例如马氏甲烷八叠球菌(Methanosarcinamazei))中。

图41示出了专性厌氧菌的示意图，所述专性厌氧菌表达(a)异源IspS多肽、(b)异源DXS多肽和(c)异源IDI多肽，以增加DXP途径通量和异戊二烯产量。

图42示出了专性厌氧菌的示意图，所述专性厌氧菌用mvaE和mvaS工程化为表达上游MVA途径。

图43示出了专性厌氧菌中的下游MVA途径的表达示意图，包括在表达异源IDI多肽和异源IspS多肽的细胞中表达(a)异源MVK多肽、(b)异源PMK多肽和(c)异源MVD多肽，以增加异戊二烯产量。

图44示出了专性厌氧菌中的整个MVA途径的表达示意图，该表达过程通过在表达(a)异源MVK多肽、(b)异源PMK多肽、(c)异源MVD多肽、(d)异源IDI多肽和(e)异源IspS多肽的细胞中引入mvaE和mvaS而进行，以增加异戊二烯产量。

图45示出了碳通量重定向为偏离乙酸的示意图，该偏离通过减少ack和adhE的表达而进行，以减少碳生成副产物所导致的损失。用于生成乙酸和乙醇的Ack或AdhE旁的箭头分别表示用于生成发酵产物(例如乙酸、乙醇或任何其他醇或含碳终产物)的途径的活性或酶表达降低。目的是通过基因操纵使通向异戊二烯的碳最大化。

图46示出了从乙酰-CoA、戊烯二酰-CoA、戊二酰-CoA、3-氨基丁酰-CoA或4-羟基丁酰-CoA经由巴豆醇生成丁二烯的示例性途径。将所识别的底物转化为产物的酶包括：A。乙酰-CoA：乙酰-CoA酰基转移酶、B。乙酰乙酰-CoA还原酶、C.3-羟基丁酰-CoA脱水酶、D。巴豆酰-CoA还原酶(生成醛)、E。巴豆醛还原酶(生成醇)、F。巴豆醇激酶、G.2-丁烯基-4-磷酸激酶、H。丁二烯合酶、I。巴豆酰-CoA水解酶、合成酶、转移酶、J。巴豆酸还原酶、K。巴豆酰-CoA还原酶(生成醇)、L。戊烯二酰-CoA脱羧酶、M。戊二酰-CoA脱氢酶、N.3-氨基丁酰-CoA脱氨酶、O.4-羟基丁酰-CoA脱水酶、P。巴豆醇焦磷酸激酶。

图47示出了从赤藓糖-4-磷酸生成丁二烯的示例性途径。将所识别的底物转化为产物的酶包括：A。赤藓糖-4-磷酸还原酶、B。赤藓糖醇-4-磷酸胞苷转移酶、C.4-(胞苷5'-二磷酸)-赤藓糖醇激酶、D。赤藓糖醇2,4-环焦磷酸合酶、E.1-羟基-2-丁烯基4-焦磷酸合酶、F.1-羟基-2-丁烯基4-焦磷酸还原酶、G。丁烯基4-焦磷酸异构酶、H。丁二烯合酶、I。赤藓糖-4-磷酸激酶、J。赤藓糖还原酶、K。赤藓糖醇激酶。

图48示出了从丙二酰-CoA加上乙酰-CoA生成丁二烯的示例性途径。将所识别的底物转化为产物的酶包括：A。丙二酰-CoA：乙酰-CoA酰基转移酶、B.3-酮戊二酰-CoA还原酶(还原酮)、C.3-羟基戊二酰-CoA还原酶(生成醛)、D.3-羟基-5-酮戊酸还原酶、E.3,5-二羟基戊酸激酶、F.3H5PP激酶、G.3H5PDP脱羧酶、H。丁烯基4-焦磷酸异构酶、I。丁二烯合酶、J.3-羟基戊二酰-CoA还原酶(生成醇)、K.3-酮戊二酰-CoA还原酶(生成醛)、L.3,5-二酮戊酸还原酶(还原酮)、M.3,5-二酮戊酸还原酶(还原醛)、N.5-羟基-3-酮戊酸还原酶、O.3-酮戊二酰-CoA还原酶(还原CoA和生成醇)。化合物缩写包括：3H5PP＝3-羟基-5-膦酸氧基戊酸和3H5PDP＝3-羟基-5-[羟基(膦酰氧基)磷酰基]氧戊酸。

图49示出了质粒pMCS444的质粒图谱。

图50示出了pMCS444的DNA序列(5367bp)。

图51示出了质粒pMCS445的质粒图谱。

图52示出了pMCS445的DNA序列(4589bp)。

图53示出了质粒PMCljs的质粒图谱。

图54示出了pMCljs的DNA序列(7571bp)。

图55示出了pMCS94的质粒图谱。

图56示出了pMCS94的DNA序列(5056bp)。

图57示出了pMCS466的质粒图谱。

图58示出了pMCS466的DNA序列(6334bp)。

具体实施方式

本发明尤其阐明了梭菌(例如，乙酸梭菌)中在CCWGG位点(W可为A或T)处切割的特定限制修饰系统，以及可用于避免切割的甲基转移酶，如本文进一步描述。对该限制修饰系统的认识允许对能够生物性生成各种工业产物(例如，生物产物)的梭菌进行工程改造。

通用技术

除非另外指明，实施本发明将利用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术，它们在本领域技术范围内。此类技术在文献中有详细解释，例如HandbookonClostridia(P.Durre,ed.,2004)(《梭菌手册》，P.Durre编，2004年)、Biotechnology:A TextbookofIndustrialMicrobiology(Brock,SinauerAssociates,Inc.,SecondEdition,1989)(《生物技术：工业微生物学教科书》，Brock，希诺联合出版公司，第二版，1989年)、MolecularCloning:ALaboratoryManual(Sambrooketal.,1989,2^nded.)(《分子克隆：实验室手册》，Sambrook等人，1989年，第2版)、OligonucleotideSynthesis(M.J.Gait,ed.,1984)(《寡核苷酸合成》，M.J.Gait编，1984年)、MethodsinEnzymology(AcademicPress,Inc.)(《酶学方法》，学术出版公司)、CurrentProtocols inMolecularBiology(F.M.Ausubeletal.,eds.,1987,andperiodicupdates)(《分子生物学实验室指南》，F.M.Ausubel等人编，1987年，及定期更新)、PCR:ThePolymeraseChainReaction(Mullisetal.,eds.,1994)(《PCR：聚合酶链式反应》，Mullis等人编，1994年)、Dictionaryof MicrobiologyandMolecularBiology(Singletonetal.,2^nded.,J.WileyandSons,NewYork,NY,1994)(《微生物学和分子生物学词典》，Singleton等人，第2版，约翰·威利父子出版公司，纽约州纽约市，1994年)和Advanced OrganicChemistryReactions,MechanismsandStructure(March,4^thed.,JohnWileyandSons,NewYork,NY,1992)(《高等有机化学：反应、机制和结构》，March，第4版，约翰·威利父子出版公司，纽约州纽约市，1992年)，这些文献为本领域技术人员提供了可用于本公开的多个术语和方法的通用指导。

除非另外定义，否则本文使用的技术和科学术语具有本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

定义

“异戊二烯”是指2-甲基-1,3-丁二烯(CAS#78-79-5)。它可以指由3,3-二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)除去焦磷酸所得的直接和最终挥发性C5烃产物。它可不涉及一个或多个异戊烯二磷酸(IPP)分子与一个或多个DMAPP分子的连接或聚合。异戊二烯不受其制造方法的限制。

“工业生物产物”可包括但不限于：异戊二烯、类异戊二烯、类异戊二烯前体、丁二烯和乙醇。工业产物还可包括但不限于直接或间接衍生自2-酮酸、丙二酰-CoA和乙酰乙酰-CoA的生物产物。工业生物产物还可包括但不限于：单萜、二萜、三萜、四萜、倍半萜、多萜、松香二烯、紫穗槐二烯、蒈烯、α-金合欢烯、β-金合欢烯、金合欢醇、香叶醇、香叶基香叶醇、里哪醇、柠檬烯、月桂烯、橙花叔醇、罗勒烯、广藿香醇、β-蒎烯、香烩烯、γ-萜品烯、松油烯、瓦伦烯。工业生物产物还可包括但不限于：非发酵醇类(如，1-丙醇、1-丁醇、异丁醇、2-甲基-1-丁醇、3-甲基-1-丁醇、3-甲基-1-戊醇、4-甲基-1-戊醇和1-己醇)、脂肪酸来源烃类(脂肪醇类、脂肪酯类、烯烃类和烷烃类)和发酵醇类(如，丁醇)。

“核酸”或“多核苷酸”是指单链或双链形式的两个或更多个脱氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸。

“所关注的核酸”是指编码作为任何工业产物的合成途径一部分的多肽的多核苷酸。

“内源性核酸”是核酸序列天然存在于宿主细胞中的核酸。在一些方面，内源性核酸与天然存在于宿主细胞中的野生型核酸相同。在一些方面，将内源性核酸的一个或多个拷贝引入宿主细胞。

“异源核酸”可以是这样的核酸，其核酸序列来自与宿主细胞不同的另一物种，或相同宿主细胞物种的另一菌株。在一些方面，该序列不同于天然存在于相同宿主细胞中的另一种核酸的序列。在一些方面，异源核酸不同于天然存在于相同宿主细胞中的野生型核酸。在本发明的各种实施例中，异源核酸编码一种或多种工业生物产物。

“多肽”包括多肽、蛋白质、肽、多肽的片段、融合多肽和变体。

“内源性多肽”为其氨基酸序列天然存在于宿主细胞中的多肽。在一些方面，内源性多肽与天然存在于宿主细胞中的野生型多肽相同。

“异源多肽”是异源核酸编码的多肽。在一些方面，该序列不同于由天然存在于相同宿主细胞中的核酸编码的另一种多肽的序列。

除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域普通技术人员所一般理解的含义相同的含义。

如本文所用，单数形式“一个/一种”和“该/所述”包括复数涵义，除非上下文中清楚地另有指明。

梭菌限制修饰系统的鉴定

本发明人已发现梭菌中的特定限制修饰(R-M)系统。在一个方面，R-M系统是乙酸梭菌中识别序列CCWGG的系统，其中W可以是A或T。在此发现前，此R-M系统是异源核酸引入梭菌(例如，乙酸梭菌)的主要屏障。异源核酸可编码在梭菌中生成的所需工业产物。然而，试图在梭菌中生物生成工业产物的一些挑战是，异源核酸在梭菌细胞中被内源性核酸内切酶消化，或者异源核酸以不能生成所需工业生物产物的方式受到不利影响。本发明提供核酸内切酶和甲基转移酶的限制性位点鉴定，所述核酸内切酶可结合到限制性位点，所述甲基转移酶可保护所关注的核酸免受不期望的切割。应当理解，构成和使用这些方面和/或实施例的组合物和/或系统、方法涵盖在本发明的范围之内。

组合物及使用方法

作为该发现的结果，本发明人根据该梭菌限制甲基化系统的组分创建了(并且在本文中描述了)多核苷酸、多肽、质粒、载体、表达系统、宿主细胞等，以及制备和使用这些组分的方法，这些组分的制备和使用促进梭菌(例如，乙酸梭菌、丙酮丁醇梭菌、杨氏梭菌和合成气发酵梭菌)的基因操纵，以生成工业生物产物，例如(但不限于)异戊二烯、丁二烯和乙醇。

限制性核酸内切酶

本发明提供特定限制性核酸内切酶的组合物，以及鉴定和使用所述限制性核酸内切酶的方法，所述限制性核酸内切酶在梭菌细胞中发挥作用，以切割核酸。若干示例性限制性核酸内切酶在本文以及实例部分有所描述(例如CacI限制性核酸内切酶)。这些限制性核酸内切酶识别CCWGG序列(其中W可以是A或T)。在本发明的一个实施例中，所公开的CacI限制性核酸内切酶的多核苷酸和氨基酸序列可用于鉴定其他相关的、与CacI同源的、具有相同功能的限制性核酸内切酶。在本发明的另一个实施例中，CacI的核酸序列或氨基酸序列可用于根据本领域熟知的方法设计核酸探针，以从不同属或种的菌株鉴定和克隆编码具有限制性核酸内切酶活性的多肽的DNA。

然后可使这些鉴定的同源物失活，以促进将一种或多种所关注的多核苷酸引入宿主细胞。如本文所用，“同源性”指序列相似性或同一性，其中同一性是优选的。该同源性可使用本领域已知的标准技术确定(参见，例如，SmithandWaterman,AdvApplMath,2:482,1981(Smith和Waterman，《应用数学进展》，第2卷，第482页，1981年)；NeedlemanandWunsch,JMolBiol,48:443,1970(Needleman和Wunsch，《分子生物学杂志》，第48卷，第443页，1970年)；PearsonandLipman,ProcNatlAcadSciUSA,85:2444,1988(Pearson和Lipman，《美国科学院院刊》，第85卷，第2444页，1988年)；威斯康辛遗传学软件包(WisconsinGeneticsSoftwarePackage)中的程序如GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA(遗传计算小组公司(GeneticsComputerGroup)，威斯康辛州麦迪逊(Madison,WI))；和Devereuxetal.,NuclAcidRes,12:387-395,1984(Devereux等人，《核酸研究》，第12卷，第387-395页，1984年))。

限制性核酸内切酶的失活可通过本领域熟知的方法实现，例如插入、断裂、置换或缺失细胞中存在的全部限制性核酸内切酶基因(一个或多个)或该基因的片段(例如，通过基因破坏技术消除或降低基因表达，例如基于II型内含子插入的ClosTron方法)。参见，例如，Dongetal.,PLoSONE20105(2):e9038(Dong等人，《科学公共图书馆ONE》，2010年，第5卷，第2期，第e9038页)。在Dong等人(2010)中，使用ClosTron基于II型内含子插入的基因敲除系统破坏从可公开获得的丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)ATCC824基因组鉴定的推定II型限制性核酸内切酶(Cac824I)。所得的Cac824I缺失的细胞可通过电穿孔用未经甲基化的DNA(例如，未经甲基化的质粒DNA)转化。ClosTron系统类似于大多数II型内含子方法，使用衍生自宿主范围广泛的乳乳球菌(Lactococcuslactis)LI.LtrB内含子的元件。参见，例如，Kuehneetal.,2011,ClosTron-mediatedengineeringofClostridium.MethodsinMolecularBiology,Vol.765:389-407(Kuehne等人，2011年，ClosTron介导的梭菌工程，《分子生物学方法》，第765卷，第389-407页)。

类似的基因破坏方法可用于使梭菌属中其他细菌的CacI基因失活，从而促进该细菌限制修饰系统(一个或多个)的规避。使用本领域熟知的方法(例如，序列比对程序，例如BLAST或CLUSTALW)，可发现其他梭菌中的CacI同源物，并使用ClosTron或类似的基因靶向系统使该同源物失活。失活基因的部分可以是，例如，编码区或编码区表达所需的调控元件。此类调控序列的例子可以是启动子序列或其功能部分，例如，足以影响核苷酸序列表达的部分。用于可能的修饰的其他控制序列包括但不限于：前导序列、前肽序列、信号序列、转录终止子和转录激活因子。

限制性核酸内切酶的失活也可使用化学诱变(参见，例如，Hopwood,TheIsolationofMutants,MethodsofMicrobiologyJ.R.NorrisandD.W.Ribbons,eds.,pp.363-433,AcademicPress,NewYork,1970(Hopwood，突变体的分离，《微生物学方法》，J.R.Norris和D.W.Ribbons编，第363-433页，学术出版社，纽约，1970年))和转座(例如，Youngmanetal.,1983,PNAS80:2305-2309(Youngman等人，1983年，《美国国家科学院院刊》，第80卷，第2305-2309页))通过随机或定点诱变实现。限制性核酸内切酶基因的修饰可通过以下方法进行：使亲代细胞经受诱变，并筛选其中限制性核酸内切酶的表达降低或消除的突变细胞。诱变可以是定点的或随机的，可通过例如以下方法进行：使用合适的物理或化学诱变剂，使用合适的寡核苷酸，或使DNA序列经受PCR生成诱变。此外，诱变可通过使用这些诱变方法的任何组合进行。

在另一个方面，梭菌核酸内切酶可用作结合分子(例如抗体)的靶标。梭菌核酸内切酶的抗体可用作研究工具(例如，检测梭菌裂解物中核酸内切酶的存在)、实验室工具或医疗工具。

CacI识别位点的修饰

可修饰CacI识别位点，以使得它们不再被梭菌细胞中的核酸内切酶识别。这些CacI识别位点可位于所关注的核酸中，例如编码各种工业生物产物的异源核酸中。在本发明的一些实施例中，将所关注的多核苷酸引入梭菌细胞可通过以下方法实现：修饰所关注的多核苷酸，以使任何所识别的CacI-特异性DNA识别位点突变或缺失(例如，通过突变任何CCWGGCacIDNA识别序列)，从而使所引入的多核苷酸不被细菌宿主细胞的限制性核酸内切酶降解。在本发明的其他实施例中，修饰所关注的多核苷酸，以使一条或多条CCWGGCacIDNA识别序列突变或缺失。在本发明的其他实施例中，修饰所关注的多核苷酸，以使一个或多个CCAGG(SEQIDNO:9)位点突变或缺失。在本发明的其他实施例中，使所关注的多核苷酸突变，以使一个或多个CCTGG(SEQIDNO:10)位点缺失。

所关注的多核苷酸(例如，用于大肠杆菌和一种或多种梭菌菌种之间的穿梭质粒，所述梭菌菌种包含来自DXP途径的基因，所述DXP途径用于异戊二烯合成)上存在的任何CacI位点可使用本领域已知的或本文所公开的测序方法测定。所关注的多核苷酸的修饰可使用本领域熟知的方法通过诱变(包括但不限于定点诱变或PCR生成诱变)来实现。参见，例如，Shimada,1996,MethodsinMolecularBiology,Vol.57:157-165(Shimada，1996年，《分子生物学方法》，第57卷，第157-165页)，该文献据此整体并入本文，尤其是涉及定点诱变的内容。

修饰的多核苷酸可包含存在于DNA识别序列CCWGG中的一个或多个核苷酸的插入、置换或缺失。在一些实施例中，所关注的修饰的多核苷酸可包含存在于DNA识别序列CCAGG(SEQIDNO:9)中的一个或多个核苷酸的插入、置换或缺失。在一些实施例中，所关注的修饰的多核苷酸可包含存在于DNA识别序列CCTGG(SEQIDNO:10)中的一个或多个核苷酸的插入、置换或缺失。在一些实施例中，所关注的修饰的多核苷酸可包含存在于DNA识别序列CCAGG(SEQIDNO:9)中的一个或多个核苷酸的插入、置换或缺失，并且可包含存在于DNA识别序列CCTGG(SEQIDNO:10)中的一个或多个核苷酸的插入、置换或缺失，例如本专利申请的实例6中公开的CacI-耐性质粒pDW265。此外，诱变可使用诱变方法的任何组合进行。

甲基转移酶

本发明还提供特定甲基转移酶的组合物，以及鉴定和使用所述甲基转移酶的方法，所述甲基转移酶在梭菌细胞中发挥作用，以保护核酸免受核酸内切酶的切割。在本发明的一个实施例中，M.CacI的核酸序列或氨基酸序列可用于根据本领域熟知的方法设计核酸探针，以从不同属或种的菌株鉴定和克隆编码具有甲基转移酶活性的多肽的DNA。

本发明的甲基转移酶可得自各种梭菌菌种，例如乙酸梭菌和杨氏梭菌。具体地讲，此类探针可用于与所关注的属或种的基因组DNA杂交，然后进行标准Southern印迹程序，以鉴定和分离其中对应的基因。此类探针的长度可明显短于整个序列，但长度应为至少14，优选地至少25，更优选地至少35，以及最优选地至少70个核苷酸。可使用DNA和RNA探针二者，并且可标记探针，以检测对应的基因(例如，用32P、3H、35S、生物素或亲和素标记)。此类探针涵盖在本发明中。

甲基化可以各种方式使用，例如体外甲基化或体内甲基化。

体外甲基化

梭菌限制修饰系统的规避可使用以下方法实现：体外甲基化一种或多种所关注的多核苷酸，然后将它们引入梭菌宿主细胞。

首先分析所关注的多核苷酸，以确认存在一个或多个CacI限制性核酸内切酶DNA识别序列CCWGG。在一些实施例中，所关注的多核苷酸包含一个或多个CCAGG(SEQIDNO.9)DNA识别序列。在一些实施例中，多核苷酸包含一个或多个CCTGG(SEQIDNO:10)DNA识别序列。在一些实施例中，所关注的多核苷酸包含一个或多个CCAGG(SEQIDNO:9)和CCTGG(SEQIDNO:10)DNA识别序列。

序列分析方法的非限制性例子包括：Maxam-Gilbert测序、Sanger测序、毛细管阵列DNA测序、热循环测序(Searsetal.,Biotechniques,13:626-633(1992)(Sears等人，《生物技术》，第13卷，第626-633页，1992年))、固相测序(Zimmermanetal.,MethodsinMolecularCellBiology,3:39-42(1992)(Zimmerman等人，《分子细胞生物学方法》，第3卷，第39-42页，1992年))、用质谱例如基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱测序(MALDI-TOF/MS；Fuetal.,NaureBiotechnology,16:381-384(1998)(Fu等人，《自然生物技术》，第16卷，第381-384页，1998年))以及杂交测序。Cheeetal.,Science,274:610-614(1996)(Chee等人，《科学》，第274卷，第610-614页，1996年)；Drmanacetal.,Science,260:1649-1652(1993)(Drmanac等人，《科学》，第260卷，第1649-1652页，1993年)；Drmanacetal.,NatureBiotechnology,16:54-58(1998)(Drmanac等人，《自然生物技术》，第16卷，第54-58页，1998年)。

一旦确认所关注的多核苷酸中存在一个或多个CacIDNA识别序列，甲基转移酶即可用于体外甲基化CCWGG序列(W＝T或A)。这可例如通过将甲基转移酶(例如，与SEQIDNO:2具有至少90％的序列同一性的甲基转移酶)的编码序列转化到能够在重组宿主细胞中表达的载体(例如，能够在大肠杆菌中表达的阿拉伯糖诱导型pBAD33载体)实现，所述甲基转移酶识别DNA识别序列CCWGG(W＝T或A)。该载体包含编码甲基转移酶的多核苷酸，所述甲基转移酶特异性识别CCWGG(W＝T或A)，该载体可转化到重组宿主细胞(例如，大肠杆菌细胞)中，并在合适的条件下培养(例如如本专利申请的实例4中所描述)，以生成编码的DNA甲基转移酶。然后可使用本领域熟知的方法，例如色谱法(例如，离子交换色谱、亲和色谱、疏水色谱、层析聚焦色谱和尺寸排阻色谱)、电泳程序(例如，制备性等电聚焦)和差异溶解度法(例如，硫酸铵沉淀)回收和纯化所生成的DNA甲基转移酶。参见，例如，ProteinPurification,J.C.JansonandLarsRyden,(eds),VCHPublishers,NewYork,NY1989(《蛋白质纯化》，J.C.Janson和LarsRyden编，VCH出版社，纽约，1989年)和Lodishetal.(eds.),2000.Purifying,Detecting,andCharacterizingProteins,inMolecularBiologyoftheCell,4^thedition(Lodish等人编，2000年，蛋白质的纯化、检测和鉴定，载于《细胞的分子生物学》，第4版)，这些文献据此整体并入，尤其是涉及蛋白质纯化的内容。然后纯化的甲基转移酶可用于体外甲基化所关注的多核苷酸，所述体外甲基化使用S-腺苷-L-甲硫氨酸和本领域熟知的DNA甲基化方案进行，从而生成S-腺苷-L-高半胱氨酸和甲基化的多核苷酸。所关注的多核苷酸的甲基化可使用具有[³H]S-腺苷甲硫氨酸的放射性标记和单个甲基化位点的图谱分析和测序(例如，Bitinaiteetal.,1992,NucleicAcidsResearch,Vol.20:4981-4985(Bitinaite等人，1992年，《核酸研究》，第20卷，第4981-4985页))进行确认，以及基于Sanger测序(例如，Bartetal.,2005,NucleicAcidsResearch,Vol.33:e124(Bart等人，2005年，《核酸研究》，第33卷，第e124页))或单分子实时(SMRT)DNA测序(例如，Clarketal.,2012,NucleicAcidsResearch,Vol.40,No.4,e29(Clark等人，2012年，《核酸研究》，第40卷，第4期，第e29页))的测定法进行确认。本文引用的所有参考文献据此整体并入，尤其是涉及甲基化分析和甲基化位点的图谱分析的内容。

在本发明的一些实施例中，可使用编码甲基转移酶的多核苷酸，所述甲基转移酶与SEQIDNO:1具有至少90％的序列同一性，并特异性识别CCWGG(W＝T或A)DNA识别位点。在其他实施例中，可使用编码甲基转移酶的多核苷酸，所述甲基转移酶与SEQIDNO:2具有至少90％的序列同一性，并特异性识别CCWGG(W＝T或A)DNA识别位点。在其他实施例中，编码甲基转移酶的多核苷酸可通过化学合成方法(例如，DNA2.0)获得或使用标准分子生物学技术创建，所述甲基转移酶与SEQIDNO:1或SEQIDNO:2具有至少90％的序列同一性。

在本发明的一些实施例中，可使用与SEQIDNO.1具有至少约20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％或100％中的任何一者的核酸序列同一性的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码具有甲基转移酶活性并特异性识别CCWGG(W＝T或A)的多肽。在本发明的其他实施例中，可使用与SEQIDNO.2具有至少约20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％或100％中的任何一者的核酸序列同一性的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码具有甲基转移酶活性并特异性识别CCWGG(W＝T或A)的多肽。

在一些实施例中，本发明涉及这样的分离的多肽，其包含的氨基酸序列与SEQIDNO.3具有至少90％的序列同一性，其中所述多肽能够在SEQIDNO.9和/或SEQIDNO.10处使多核苷酸甲基化。在其他实施例中，本发明涉及这样的分离的多肽，其与SEQIDNO.3具有至少约20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％或100％中的任何一者的氨基酸序列同一性，其中所述多肽能够在SEQIDNO.9和/或SEQIDNO.10处使多核苷酸甲基化。在其他实施例中，具有甲基转移酶活性、能够在包含CCWGG的序列处使多核苷酸甲基化的分离的多肽是SEQIDNO.3。

一旦一种或多种所关注的多核苷酸被甲基化后，即可使用转化方法，例如电穿孔、接合转化、原生质体转化、基因枪或本领域已知的或本专利申请的任何实例中讨论的其他转化方法将这些所关注的多核苷酸引入梭菌宿主细胞。参见，例如，Davisetal.，“GenecloninginClostridia”(P.Durre,P.,ed.2005HandbookonClostridia)(Davis等人，“梭菌中的基因克隆”，P.Durre,P.编，2005年，《梭菌手册》)；CurrentProtocolsin MolecularBiology(F.M.Ausubeletal.(eds)Chapter9,1987)(《分子生物学实验室指南》，F.M.Ausubel等人编，第9章，1987年)；Sambrooketal.,MolecularCloning:ALaboratoryManual,2^nded.,ColdSpringHarbor,1989(Sambrook等人，《分子克隆：实验室手册》，第2版，冷泉港，1989年)；Campbelletal.,CurrentGenetics,Vol.16:53-56,1989(Campbell等人，《当今遗传学》，第16卷，第53-56页，1989年)。

体内甲基化(穿梭载体)

在本发明的一些实施例中，梭菌限制修饰系统的规避可使用体内甲基化和能够在两种或更多种不同宿主物种中传播的穿梭载体实现。除包含任何所关注的多核苷酸(例如，编码异戊二烯合酶和/或DXP途径的任何组分的多核苷酸)之外，穿梭载体还可包含编码甲基转移酶的多核苷酸，所述甲基转移酶特异性识别CCWGG(W＝T或A)。或者，特异性识别CCWGG的甲基转移酶可提供于单独的质粒中(例如，如实例7-10中所描述)。

示例性穿梭载体能够在大肠杆菌中以及在专性厌氧菌例如乙酸梭菌中复制。参见，例如Heapetal.,2009,JournalofMicrobiologicalMethods,Vol.78:79-85(Heap等人，2009年，《微生物学方法杂志》，第78卷，第79-85页)，该文献据此以引用方式整体并入，尤其是关于用在大肠杆菌和梭菌菌种之间的穿梭载体的创建和组成的内容。

用于连接包含所关注的多核苷酸(例如，甲基转移酶或核酸内切酶核酸)、启动子、终止子和其他序列的构建体(例如，DNA构建体)并将它们插入到合适的载体中的方法是本领域熟知的。例如，限制性酶可用于基因操纵甲基转移酶或核酸内切酶核酸，以使得它们可插入到一个或多个载体中。然后，可连接切割后的甲基转移酶或核酸内切酶核酸和切割后的载体的相容末端。连接通常通过在便利的限制性位点处的连接来实现。如果不存在这种位点，则按照常规做法使用合成的寡核苷酸接头。参见Sambrooketal.,(1989),MolecularCloning:ALaboratoryManual(2^nded.,ColdSpringHarbor)(Sambrook等人，1989年，《分子克隆：实验室手册》，第2版，冷泉港)，该文献据此以引用方式整体并入，尤其是关于DNA的分离、载体的构建以及寡核苷酸接头的使用的内容。另外，载体可使用已知的重组技术(例如，英杰生命技术公司(InvitrogenLifeTechnologies)的Gateway技术)构建，或它们可购自化学合成的多核苷酸的商业供应商(例如，DNA2.0)。受权利要求书保护的本发明的穿梭质粒可使用本领域熟知的方法(包括本专利申请的任何实例中描述的那些方法)的任何组合创建。

例如，为成功用异源DNA转化乙酸梭菌，可根据本专利申请的实例7中所描述构建在大肠杆菌中传播的穿梭载体。简而言之，大肠杆菌和各种梭菌菌种之间的一系列模块化穿梭载体(称为“pMTL80000系列”)的构建在Heapetal.,2009JournalofMicrobiologicalMethods,Vol.78:79-85(Heap等人，2009年，《微生物学方法杂志》，第78卷，第79-85页)中有所描述。这些pMTL80000载体携带四个革兰氏阳性复制子中的一者、大肠杆菌中的p15A或ColE1复制起点、具有侧翼转录终止子的多克隆位点以及选自catP、ermB、aad9或tetA的抗生素抗性标记。一些载体还携带生孢梭菌(C.sporogenes)铁氧还蛋白启动子(Pfdx)和核糖体结合位点(RBS)或丙酮丁醇梭菌硫解酶启动子和RBS以用于基因表达。

为创建穿梭载体pDW280，使用表4中所示的引物对(例如，GACA1_1203For和GACA1_1203Rev)通过PCR(PfuUltraII，安捷伦科技公司(AgilentTechnologies))扩增pMCS203(也称为质粒pMTL85151)的质粒骨架。pMCS203的质粒图谱和DNA序列分别提供于图8和图9A-B。pCA1质粒使用所示的引物对(例如，GACA1_1PlasmidFor和GACA1_1PlasmidRev，如表4中所列出)扩增。pCA1的质粒图谱和DNA序列分别提供于图6和图7A-B。通过凝胶电泳纯化(凯杰公司(Qiagen))适当分子量的PCR产物，并使用GeneArt无缝克隆试剂盒(生命技术公司(LifeTechnologies))进行组合。然后，根据制造商推荐的方案，将这些PCR产物转化到化学感受态大肠杆菌TOP10细胞(生命技术公司(LifeTechnologies))中。回收细胞并接种于选择性培养基上，选择具有氯霉素抗性的转化体用于进一步分析。使多个单菌落在选择性LB培养基中生长过夜，第二天纯化质粒(凯杰公司(Qiagen))，通过凝胶电泳将纯化质粒的分子量与亲代pCA1质粒比较。这得到质粒pDW264。

如图20中示出的pDW264质粒图谱所示，pDW264穿梭载体包含天然乙酸梭菌pCA1质粒和DNA盒，所述DNA盒允许在大肠杆菌中复制、接合转移以及耐受抗生素氯霉素。pDW264的DNA序列在图22A-C中示出。然后，用FseI和PmeI限制性酶(新英格兰生物实验室(NewEnglandBiolabs))切割pDW264，根据制造商推荐的方案移除氯霉素抗性盒。然后，将该载体连接(T4连接酶，新英格兰生物实验室(NEB))到红霉素抗性盒，并使用标准分子生物学技术转化到Top10化学感受态大肠杆菌细胞(生命技术公司(LifeTechnologies))中，所述红霉素抗性盒已通过FseI、PmeI和AscI限制性消化从模板pDW265分离。所得的接合穿梭质粒pDW280包含整个乙酸梭菌pCA1天然序列、转移起点、大肠杆菌复制起点和红霉素抗性盒。pDW280的质粒图谱和序列分别提供于图27和图28A-C。

所得的穿梭载体可引入宿主细胞以用于使穿梭载体甲基化，所述宿主细胞包含特异性识别CCWGGDNA识别序列的甲基转移酶(例如，表达来自pDW268质粒的M.CacI甲基转移酶的大肠杆菌S17-1宿主细胞)。在一些实施例中，穿梭载体可在包含CCWGG的序列处甲基化。在一些实施例中，穿梭载体可在包含CCAGG(SEQIDNO:9)的序列处甲基化。在一些实施例中，穿梭载体可在包含CCTGG(SEQIDNO:10)的序列处甲基化。在一些实施例中，穿梭载体可在CCWGG处甲基化。在一些实施例中，穿梭载体可在DNA识别序列CCAGG(SEQIDNO:9)处和/或DNA识别序列CCTGG(SEQIDNO:10)处甲基化。

然后，可分离甲基化的穿梭载体，并引入梭菌宿主细胞，用于表达所关注的多核苷酸。将甲基化的DNA引入梭菌宿主细胞可通过本专利申请的任何实例中描述的方法(例如，实例10中描述的接合)，或者使用或改进本领域熟知的其他转化方法实现。参见，例如，D.Parke,1990.ConstructionofmobilizablevectorsderivedfromplasmidsRP4,pUC18andpUC19.Gene,Vol.93:135-137(D.Parke，1990年，衍生自质粒RP4、pUC18和pUC19的移动载体的构建，《基因》，第93卷，第135-137页)；Simonetal.,1983.Abroadhostrangemobilizationsystemforinvivogeneticengineering:transposonmutagenesisinGramnegativebacteria.Bio-Technology,Vol.1:784-791(Simon等人，1983年，用于体内基因工程的广泛宿主范围移动系统：革兰氏阴性菌中的转座子诱变，《生物技术》，第1卷，第784-791页)；以及McFalaneetal.,AsimplifiedmethodforconjugalgenetransferintothefilamentouscyanobacteriumAnabaenasp.ATCC27893.JournalofMicrobiologicalMethods,Vol.6:301-305(McFalane等人，基因接合转移到状蓝细菌鱼腥蓝细菌属(Anabaenasp)ATCC27893的简易方法，《微生物学方法杂志》，第6卷，第301-305页)，所有这些文献整体并入本文，尤其是关于接合、大肠杆菌S17-1细胞以及细菌穿梭载体的创建和使用的内容。

可使用任何合适的穿梭载体或质粒，例如本公开中描述的任何穿梭质粒(例如，pDW280、pMCS537、pMCS244、pMCS245、pMCS200或pMCS201)和/或Heapetal.,(2009),JournalofMicrobiologicalMethods,Vol.78:79-85(Heap等人，2009年，《微生物学方法杂志》，第78卷，第79-85页)中描述的任何穿梭质粒。

多种宿主细胞可用于包含、转移或表达甲基转移酶。示例性宿主细胞包括但不限于埃希氏菌菌株，例如大肠杆菌S17-1细胞。在其他实施例中，属于梭菌属的任何菌种均可用于包含、转移或表达甲基转移酶。在一些实施例中，甲基转移酶得自和/或来源于梭菌菌种，例如乙酸梭菌和/或杨氏梭菌。

示例性核酸和多肽

在本发明的组合物和方法中可使用各种甲基转移酶、限制性核酸内切酶以及其他多肽和核酸(单独或以任何组合)。

在一些实施例中，编码甲基转移酶或限制性核酸内切酶的核酸可操作地连接至另一个编码一种或多种控制序列的核酸，所述控制序列促进编码多肽的表达。“可操作地连接”是指置于启动子的调节控制下的一个或多个基因，然后启动子控制这些基因的转录以及任选地控制这些基因的翻译。在异源启动子/结构基因组合的构建中，如下定位基因序列或启动子与基因转录起始位点的距离通常是优选的：所述距离大约等于该基因序列或启动子与其在天然环境中所控制的基因之间的距离；所述天然环境即该基因序列或启动子来源的基因。如本领域所知，在不丧失功能的情况下，可对该距离作出一些调整。相似地，调控序列元件相对于将置于该元件控制下的异源基因的优选定位由天然环境中该元件的定位限定；所述天然环境即该元件来源的基因。

在一些实施例中，与野生型(即，天然存在的序列)甲基转移酶或核酸内切酶核酸的序列相比，核酸具有一个或多个突变。在一些实施例中，核酸具有一个或多个增加核酸的转录或翻译的突变(如，沉默突变)。在一些实施例中，核酸为编码甲基转移酶或核酸内切酶的任何核酸的简并变体。

如本领域的技术人员所理解，本发明的多核苷酸序列可包括表达或可适于表达蛋白质、多肽、肽等等的基因组序列、基因组外和质粒编码序列以及小工程化基因片段。此类片段可以是天然分离的，或人工合成修饰的。

多核苷酸可以是单链的(编码或反义)或双链的，并且可以是DNA(基因组、cDNA或合成的)或RNA分子。另外的编码或非编码序列可以但不必存在于本发明的多核苷酸中，并且多核苷酸可以但不必连接到其他分子和/或载体材料。

多核苷酸可包括天然序列(即，内源性序列)，或可包括此类序列的变体或生物功能等同物。多核苷酸变体可包含一个或多个置换、添加、缺失和/或插入。在一些实施例中，所编码的多肽的酶活性相对于未修饰的多肽基本上不降低。在一些实施例中，所编码的多肽的酶活性相对于未修饰的多肽增加(例如，优化)。在其他实施例中，所编码的多肽的酶活性相对于未修饰的多肽显著降低。对所编码的多肽的酶活性的影响通常可如本文所述进行评估。

如本领域的技术人员所理解，在一些情况下可能有利的是，生成具有非天然存在的密码子的编码多肽的核苷酸序列。例如，可选择特定原核或真核宿主偏爱的密码子，以提高蛋白质表达速率，或生成具有所需性质的重组RNA转录物，例如长于从天然存在的序列生成的转录物半衰期的半衰期。此类核苷酸通常称为“密码子优化的”。本文所述的任何核苷酸序列均可用于此类“密码子优化的”形式。此外，本发明的多核苷酸序列可使用本领域通常已知的方法工程化，以便出于多种原因而改变多肽编码序列，包括但不限于修改基因产物的克隆、加工、表达和/或活性的改变。

多核苷酸可包括“异源核酸”，所述异源核酸的序列来自与宿主细胞不同的另一物种，或相同宿主细胞物种的另一菌株。在一些实施例中，该序列不同于天然存在于相同宿主细胞中的另一种核酸的序列。在一些实施例中，异源核酸不同于存在于自然界中的相同宿主细胞中的野生型核酸。

本发明的多核苷酸，无论编码序列本身多长，均可与其他DNA序列，例如启动子、另外的限制性酶位点、多克隆位点、其他编码片段等等加以组合，以使得多核苷酸的总长度显著变化。因此，设想可使用几乎任何长度的多核苷酸片段，总长度优选地受预期重组DNA方案中的制备和使用难易程度的限制。

可使用本领域已知和可用的任何多种公认技术制备、操纵和/或表达多核苷酸及其融合体。例如，编码本发明的多肽或其融合蛋白或功能等同物的多核苷酸序列可用于重组DNA分子，以引导所选的酶在适当的宿主细胞中表达。由于遗传密码固有的简并性，可生成编码基本上相同或功能等同的氨基酸序列的其他DNA序列，并且这些序列可用于克隆和表达给定的多肽。

在一些实施例中，多肽是分离的多肽。如本文所用，“分离的多肽”不是多肽文库的一部分，例如2、5、10、20、50或更多种不同多肽的文库，并且该多肽从与其一起天然存在的至少一个组分中分离。分离的多肽可例如通过编码该多肽的重组核酸的表达来获得。

在一些实施例中，多肽是异源多肽。所谓“异源多肽”，是指氨基酸序列与相同宿主细胞中天然表达的另一种多肽的氨基酸序列不同的多肽。具体地讲，异源多肽不同于存在于自然界中的相同宿主细胞中的野生型多肽。

为了表达所需的多肽，可将编码该多肽或功能等同物的核苷酸序列插入适当的表达载体，即包含所插入的编码序列的转录和翻译的必要元件的载体。可使用本领域的技术人员熟知的方法构建表达载体，所述表达载体包含编码所关注的多肽的序列以及适当的转录和翻译控制元件。这些方法包括体外重组DNA技术、合成技术和体内基因重组。此类技术在Sambrooketal.,MolecularCloning,ALaboratoryManual(1989)(Sambrook等人，《分子克隆：实验室手册》，1999年)和Ausubeletal.,CurrentProtocolsinMolecularBiology(1989)(Ausubel等人，《分子生物学实验室指南》，1989年)中有所描述。

“多肽”、“多肽片段”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，是指氨基酸残基的聚合物及其变体和合成类似物。因此，这些术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是合成的非天然存在的氨基酸(例如相应的天然存在的氨基酸的化学类似物)的氨基酸聚合物，以及适用于天然存在的氨基酸聚合物。多肽包括通常催化各种化学反应(即，提高化学反应速率)的酶多肽或“酶”(例如，DNA甲基转移酶或限制性核酸内切酶)。

如本文所用，“序列同一性”是指在比较窗口上的基于逐个核苷酸或基于逐个氨基酸的序列同一程度。因此，“序列同一性百分比”可通过以下方法计算：在比较窗口上比较两条最佳比对序列，确定两条序列中出现的相同的核酸碱基(例如，A、T、C、G、I)或相同的氨基酸残基(例如，Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys和Met)的位置数以得到匹配位置数，用匹配位置数除以比较窗口中的总位置数(即，窗口大小)，然后将结果乘以100得到序列同一性百分比。

用于描述两条或更多条多核苷酸或多肽之间序列关系的术语包括“参考序列”、“比较窗口”、“序列同一性”、“序列同一性百分比”和“基本上相同”。“参考序列”的长度为至少12，但很多情况下为15至18，通常为至少25个单体单元，包括核苷酸和氨基酸残基在内。因为两条多核苷酸中的每条可包含(1)两条多核苷酸之间类似的序列(即，仅完整的多核苷酸序列的一部分)以及(2)两条多核苷酸之间趋异的序列，所以两条(或更多条)多核苷酸之间的序列比较通常通过在“比较窗口”上比较两条多核苷酸的序列来进行，以鉴定和比较序列相似的局部区域。“比较窗口”是指在两条序列最佳比对后，至少6、通常约50至约100、更通常约100至约150个连续位置的概念片段，其中序列与相同数量连续位置的参考序列比较。对于两条序列的最佳比对，与参考序列(不包含添加或缺失)相比，比较窗口可包含约20％或更少的添加或缺失(即，空位)。用于对比较窗口进行比对的最佳序列比对可通过算法的计算机化实施形式(威斯康辛遗传学软件包7.0版(WisconsinGeneticsSoftwarePackageRelease7.0)中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，遗传计算小组公司(GeneticsComputerGroup)，美国威斯康辛州麦迪逊科学径575号(575ScienceDriveMadison,WI,USA))或通过任何多种所选方法生成的检测和最佳比对(即，在比较窗口上得到最高百分比同源性)来进行。

还可参考BLAST程序家族，如例如由Altschuletal.,1997,Nucl.AcidsRes.25:3389(Altschul等人，1997年，《核酸研究》，第25卷，第3389页)所公开。序列分析的详细讨论可见于Unit19.3ofAusubeletal.,“CurrentProtocolsinMolecularBiology”,JohnWiley&SonsInc.,1994-1998,Chapter15(Ausubel等人，《分子生物学实验室指南》，约翰·威利父子出版公司，1994-1998年，第15章，第19.3单元)。

另外，标准序列比对和/或结构预测程序可用于根据甲基转移酶或核酸内切酶多肽和核酸与已知甲基转移酶或核酸内切酶多肽和核酸的一级和/或预测多肽二级结构相似性，来鉴定另外的甲基转移酶或核酸内切酶多肽和核酸。标准数据库例如SwissProt-Trembl数据库(万维网地址“expasy.org”，瑞士生物信息学研究所，Swiss-Prot集团，瑞士日内瓦，CMU-1rueMichelServetCH-1211(SwissInstituteofBioinformaticsSwiss-ProtgroupCMU-1rueMichelServetCH-1211Geneva4,Switzerland))也可用于鉴定甲基转移酶或核酸内切酶多肽和核酸。甲基转移酶或核酸内切酶多肽的二级和/或三级结构可使用标准结构预测程序例如PredictProtein的默认设置预测。或者，甲基转移酶或核酸内切酶多肽的实际二级和/或三级结构可使用标准方法测定。

分离核酸的示例性方法

编码甲基转移酶或限制性核酸内切酶的核酸可使用标准方法分离。从所关注的来源生物体(例如细菌基因组)获得所需核酸的方法是分子生物学领域常见和熟知的(参见，例如，WO2004/033646和其中所引用的参考文献，它们均据此以引用方式整体并入，尤其是关于所关注的核酸的分离的内容)。例如，如果核酸的序列已知(例如本文描述的任何已知核酸)，则可以通过限制性内切酶消化来创建合适的基因组文库并且可以用与所需核酸序列互补的探针来筛选。序列一旦分离后，即可使用标准引物引导的扩增方法例如聚合酶链式反应(PCR)(美国专利No.4,683,202，该专利以引用方式整体并入，尤其是关于PCR方法的内容)来扩增DNA，以获得适于使用适当载体转化的量的DNA。

或者，编码甲基转移酶或核酸内切酶的多核苷酸可使用标准方法(例如，DNA2.0)化学合成，其中所述甲基转移酶或核酸内切酶特异性识别CCWGG(W＝T或A)。

示例性载体、启动子和其他元件

载体

本文所述的任何甲基转移酶或核酸内切酶核酸(单独或以任何组合)均可包括在一种或多种载体中。因此，本发明还涉及具有一种或多种核酸的载体，所述核酸编码本文所描述的任何甲基转移酶或核酸内切酶多肽。如本文所用，“载体”意指能够在宿主细胞中递送并有利地表达一种或多种所关注核酸的构建体。载体的例子包括但不限于质粒、病毒载体、DNA或RNA表达载体、粘粒和噬菌体载体。在一些实施例中，载体包含受表达控制序列控制的核酸。

如本文所用，“表达控制序列”是指引导所关注的核酸转录的核酸序列。表达控制序列可以是启动子(例如组成型或诱导型启动子)或增强子。“诱导型启动子”是在环境或发育调控下有活性的启动子，例如阿拉伯糖诱导型启动子。表达控制序列可操作地连接至待转录的核酸片段。

在一些实施例中，载体包含选择性标记。术语“选择性标记”是指能够在宿主细胞中表达以使得易于选择那些包含所引入的核酸或载体的宿主细胞的核酸。选择性标记的例子包括但不限于：抗生素抗性核酸(例如，红霉素、氯霉素、甲砜霉素、卡那霉素、氨苄青霉素、羧苄青霉素、庆大霉素、潮霉素、链霉素、腐草霉素、博莱霉素或新霉素)和/或赋予代谢优势的核酸，例如在宿主细胞上的营养优势。

合适的载体是与所采用的宿主细胞相容的那些。合适的载体可来源于例如细菌、病毒(例如噬菌体T7或M-13来源噬菌体)、粘粒、酵母或植物。获得和使用此类载体的方案是本领域已知的(参见，例如Sambrooketal.,MolecularCloning:ALaboratoryManual,2^nded.,ColdSpringHarbor,1989(Sambrook等人，《分子克隆：实验室手册》，第2版，冷泉港，1989年)，该文献据此以引用方式整体并入，尤其是关于载体使用的内容)。

启动子

合适的启动子用于表达本文所述的任何异源核酸。合适的启动子可用于驱动甲基转移酶或核酸内切酶多肽的生成，或用于减少宿主细胞中甲基转移酶或核酸内切酶多肽的降解。

合适的启动子可用于优化宿主细胞中甲基转移酶或核酸内切酶多肽的表达。本文所述的任何核酸(例如，编码甲基转移酶或核酸内切酶多肽的核酸)可以可操作地连接至启动子。可使用本文所述的任何启动子，例如质粒pCA1(SEQIDNO.6)中包含的天然乙酸梭菌启动子。

在某些梭菌细胞中，高表达水平可导致工程化多肽(一种或多种)的降解，所述工程化多肽包括甲基转移酶或核酸内切酶。为提高甲基转移酶或核酸内切酶的产量，可使用诱导型表达系统，该系统允许控制工程化多肽(一种或多种)的表达时序和数量。更严格的控制可促进工程化多肽(一种或多种)在细胞生长期间以对细胞有害的浓度和周期表达，并且生成更大量的所需多肽。

用于本文所述的任何细胞的启动子可以是诱导型启动子。可使用阿拉伯糖诱导型表达系统；例如Guzmanetal.，“TightRegulation,Modulation,andHigh-LevelExpressionbyVectorsContainingtheArabinosePBADPromoter。”JournalofBacteriology,Vol.177,No.14:4121-4130(July1995)(Guzman等人，“通过包含阿拉伯糖PBAD启动子的载体进行严格调控、调节和高水平表达”，《细菌学杂志》，第177卷，第14期，第4121-4130页，1995年7月)中描述的P_BAD阿拉伯糖诱导型系统，该文献据此以引用方式整体并入，尤其是其关于使用阿拉伯糖诱导型P_BAD启动子的pBAD载体的公开内容。或者，可使用葡萄糖酸诱导型表达系统，例如杨氏梭菌内源性葡萄糖酸诱导型表达系统。据预测，开放阅读框(ORF)clju19880和clju30510编码以下转录因子，该转录因子抑制葡萄糖酸输入和代谢中涉及到的基因的表达。在存在葡萄糖酸的情况下，葡萄糖酸结合并抑制这些转录因子，从而允许葡萄糖酸输入和代谢中涉及到的基因表达。在杨氏梭菌基因组中，ORFclju11610注解为“葡萄糖酸激酶”。在谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)中，葡萄糖酸激酶(也称为葡糖酸激酶)启动子表现出响应于葡萄糖酸诱导的表达增加最大(Frunzkeetal.2008,MolMicrobiol.,67(2):305-22(Frunzke等人，2008年，《分子微生物学》，第67卷，第2期，第305-22页))。因此，在一些方面，启动子可以是葡萄糖酸诱导型启动子。在一些方面，启动子可来自丙酮丁酸梭菌、杨氏梭菌、合成气发酵梭菌或乙酸梭菌。在一些方面，启动子可以是存在于厌氧细胞(例如，杨氏梭菌)中的clju19880ORF、clju11610ORF或clju30510ORF的启动子。在一些方面，启动子可以是天然乙酸梭菌启动子，例如存在于pCA1质粒(SEQIDNO.6)中的启动子。在一些方面，启动子是存在于pCA1中的启动子。在一些方面，启动子是阿拉伯糖诱导型启动子。在一些方面，启动子是葡萄糖酸诱导型启动子，例如葡萄糖酸激酶启动子。启动子也可以是当细胞在存在合成气、碳水化合物(例如，果糖或葡萄糖)或它们的任何组合的情况下培养时被诱导的启动子。

用于本文所述的任何细胞的启动子可以是组成型启动子。组成型启动子不需要通过人工方式(例如用于诱导lac操纵子的IPTG)诱导，因此对于大规模发酵可显著降低成本。可使用在厌氧菌(例如，丙酮丁酸梭菌、乙酸梭菌和杨氏梭菌)中发挥功能的组成型启动子。在某些实施例中，低表达启动子可以是所需的。丙酮丁酸梭菌的ptb(磷酸转丁酰酶)启动子在丙酮丁酸梭菌培养物的指数生长期期间具有强活性。可用于本发明的启动子具有的活性可小于ptb(磷酸转丁酰酶)启动子。同样来自丙酮丁酸梭菌的spoIIE(II期孢子形成蛋白E)启动子在中稳定期显示出具有瞬时活性。本发明可使用spoIIE(StageII孢子形成蛋白E)启动子。因此，在一些方面，启动子是spoIIE启动子(例如，丙酮丁醇梭菌spoIIE启动子)。在一些方面，启动子的强度水平低于ptb(例如，与ptb例如丙酮丁醇梭菌ptb相比，启动子具有的表达驱动能力降低)。在一些方面，启动子具有的强度水平类似于spoIIE(例如，启动子具有的表达驱动能力类似于spoIIE)。在一些方面，启动子在指数生长后期具有活性。在一些方面，启动子在线性生长期期间具有活性。在一些方面，启动子在稳定期具有活性。在一些方面，用于本文所述的任何细胞的启动子仅在存在合成气的情况下具有活性。在一些方面，启动子表达低水平的甲基转移酶或核酸内切酶。在一些方面，启动子表达甲基转移酶或核酸内切酶的水平使得甲基转移酶或核酸内切酶不被蛋白酶切割，或降低甲基转移酶或核酸内切酶被蛋白酶切割的百分比。在一些方面，启动子驱动低水平表达。

可使用本公开的实例中表征或使用的启动子中的任一者。

启动子是本领域熟知的，并且在宿主细胞中发挥功能的任何启动子均可用于在宿主细胞中表达甲基转移酶或核酸内切酶核酸。可用于驱动多肽在各种宿主细胞中表达的启动控制区或启动子有许多种，并且是本领域的技术人员熟知的(参见，例如WO2004/033646和其中引用的参考文献，它们均据此以引用方式整体并入，尤其是关于用于表达所关注的核酸的载体的内容)。事实上，能够驱动这些核酸的任何启动子均适用于本发明，它们包括但不限于：lac、trp、T7、tac和trc(可用于在大肠杆菌中表达)。

质粒

在各种实施例中，甲基转移酶或核酸内切酶核酸包含在低拷贝质粒(例如，保持在约1至约4个拷贝/细胞的质粒)、中拷贝质粒(例如，保持在约10至约15个拷贝/细胞的质粒)或高拷贝质粒(例如，保持在约50或更多个拷贝/细胞的质粒)中。在一些实施例中，甲基转移酶或核酸内切酶核酸可操作地连接至P_BAD启动子。在一些实施例中，可操作地连接至P_BAD启动子的甲基转移酶或核酸内切酶核酸包含在中或高拷贝质粒中。在一些实施例中，甲基转移酶或核酸内切酶核酸可操作地连接至天然乙酸梭菌启动子，例如包含在pCA1质粒中的启动子。在一些实施例中，可操作地连接至启动子的甲基转移酶或核酸内切酶核酸包含在中或高拷贝质粒中。

在一些实施例中，载体是未整合到细胞中的染色体的复制质粒。在一些实施例中，载体的一部分或全部整合到细胞中的染色体中。合适的表达和/或整合载体的另外例子提供于Sambrooketal.,MolecularCloning:A LaboratoryManual,2^nded.,ColdSpringHarbor,1989(Sambrook等人，《分子克隆：实验室手册》，第2版，冷泉港，1989年)和CurrentProtocolsin MolecularBiology(F.M.Ausubeletal.(eds)1987,Supplement30,section7.7.18)(《分子生物学实验室指南》，F.M.Ausubel等人编，1987年，附录30，第7.7.18部分)，这两篇文献据此以引用方式整体并入，尤其是关于载体的内容。特别有用的载体包括pFB6、pBR322、PUC18、pUC100和pENTR/D。

其他元件

也可使用其他分子生物学元件，例如终止序列、复制起点等等。

在一些实施例中，表达载体还包括终止序列。终止控制区还可衍生自宿主细胞中天然存在的各种基因。在一些实施例中，终止序列和启动子序列衍生自相同来源。在另一个实施例中，终止序列对于宿主细胞是内源性的。任选地，可包括终止位点。为了有效表达多肽，将编码该多肽的DNA通过起始密码子可操作地连接至所选的表达控制区，使得表达导致形成适当的信使RNA。

甲基转移酶或核酸内切酶核酸可使用标准技术并入载体，例如表达载体中(Sambrooketal.,MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarbor,1982(Sambrook等人，《分子克隆：实验室手册》，冷泉港，1982年)，该文献据此以引用方式整体并入，尤其是关于适当DNA序列的筛选和载体的构建的内容)。用于连接包含所关注核酸(例如甲基转移酶或核酸内切酶核酸)、启动子、终止子和其他序列的DNA构建体并将它们插入到合适的载体中的方法是本领域熟知的。例如，限制性酶可用于切割甲基转移酶或核酸内切酶核酸和载体。然后，可连接切割后的甲基转移酶或核酸内切酶核酸和切割后的载体的相容末端。连接通常通过在便利的限制性位点处的连接来实现。如果不存在这种位点，则按照常规做法使用合成的寡核苷酸接头(参见，Sambrooketal.,MolecularCloning:A LaboratoryManual,2^nded.,ColdSpringHarbor,1989(Sambrook等人，《分子克隆：实验室手册》，第2版，冷泉港，1989年)和BennettandLasure,MoreGeneManipulationsinFungi,AcademicPress,SanDiego,pp.70-76,1991(Bennett和Lasure，《真菌中的更多基因操纵》，学术出版社，圣迭戈，第70-76页，1991年)，这两篇文献据此以引用方式整体并入，尤其是关于寡核苷酸接头的内容)。另外，可使用已知的重组技术构建载体(例如，英杰生命技术公司(InvitrogenLifeTechnologies)的Gateway技术)。

可使用不同类型的复制起点。可使用一个、两个或更多个复制起点。复制起点可来自不同的生物体和/或革兰氏阳性或革兰氏阴性生物体。使用复制起点实施本发明的示例性用途在实例中进一步描述。

梭菌转化方法

目前，梭菌转化方法包括但不限于：(i)电穿孔，细胞由此暴露到高强度电场，导致细胞膜瞬时穿孔，从而允许DNA进入细胞；(ii)质粒DNA的接合转移(或接合)，所述质粒DNA来自供体生物体，例如大肠杆菌，DNA由此通过细胞间接触从供体细胞转移到受体细胞；(iii)原生质体转化，由此以酶学或化学方式剥离梭菌细胞壁，形成原生质体，当原生质体与DNA一起温育时将质粒整合到原生质体的细胞质；和/或(iv)基因枪(生物弹道颗粒递送系统)，由此用质粒DNA包被小重金属颗粒，随后高速推进到细菌细胞。这些和其他转化技术在本领域中已有所描述。参见，例如，Davisetal.，“GenecloninginClostridia”(P.Durre,P.,ed.2005)HandbookonClostridia(Davis等人，“梭菌中的基因克隆”，P.Durre,P.编，2005年，《梭菌手册》)；CurrentProtocolsinMolecularBiology(F.M.Ausubeletal.(eds)Chapter9,1987)(《分子生物学实验室指南》，F.M.Ausubel等人编，第9章，1987年)；Sambrooketal.,MolecularCloning:A LaboratoryManual,2^nded.,ColdSpringHarbor,1989(Sambrook等人，《分子克隆：实验室手册》，第2版，冷泉港，1989年)；Campbelletal.,CurrentGenetics,Vol.16:53-56,1989(Campbell等人，《当今遗传学》，第16卷，第53-56页，1989年)。

本发明所用的引物、寡核苷酸和多核苷酸可使用本领域已知的标准技术生成。

梭菌表达系统

本发明提供用于生成一种或多种工业生物产物(例如，异戊二烯、丁二烯或乙醇)的梭菌表达系统。表达系统可包括生成一种或多种工业生物产物所需的元件的任何组合。在一些实施例中，该系统可包括以下一者或多者：(a)甲基转移酶(例如，包括pDW268或pMCS466的质粒)，(b)穿梭质粒(例如，pDW280、pMCS537、pMCS200、pMCS201、pMCS444或PMCS445)，(c)大肠杆菌细胞，所述大肠杆菌细胞能够与梭菌细胞相互作用，以允许(a)和(b)的转移；以及(d)梭菌细胞，所述梭菌细胞能够与埃希氏菌细胞相互作用，使得一种或多种核酸在梭菌细胞中表达。在一些实施例中，能够与梭菌细胞相互作用的大肠杆菌细胞是大肠杆菌S17-1细胞。在一些实施例中，能够与埃希氏菌细胞相互作用的梭菌细胞选自乙酸梭菌、杨氏梭菌、合成气发酵梭菌或丙酮丁醇梭菌。在一些实施例中，该系统提供一种或多种所关注的核酸(例如，编码异戊二烯合酶或从乙酰-CoA生成乙醇中涉及到的酶的核酸)的表达。

用于生成工业生物产物的宿主细胞

各种类型的梭菌细胞可用作生成工业生物产物的宿主细胞。示例性宿主细胞包括但不限于例如以下梭菌属的种：乙酸梭菌、杨氏梭菌、丙酮丁醇梭菌、合成气发酵梭菌。示例性宿主细胞还包括但不限于例如以下梭菌属的种：食一氧化碳梭菌(Clostridiumcarboxydivorans)、艰难梭菌(Clostridiumdifficile)、肉毒梭菌(Clostridiumbotulinum)、破伤风梭菌(Clostridiumtetani)、产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens)、热乙酸梭菌(Clostridiumthermoaceticum)(也称为热醋穆尔氏菌(Moorellathermoacetica))、氨基丁酸梭菌(Clostridiumaminobutyricum)、拜氏梭菌(Clostridiumbeijerinckii)、拜氏梭菌NCIMB8052、拜氏梭菌NRRLB593、克氏梭菌(Clostridiumkluyveri)、克氏梭菌DSM555、诺氏梭菌(Clostridiumnovyi)NT、丙酸梭菌(Clostridiumpropionicum)和糖全丁基乙酸梭菌(Clostridiumsaccharoperbutylacetonicum)。

生长和/或生成参数

可对梭菌细胞以及它们的组合物进行工程改造以在发酵系统中生成工业生物产物。在一个实施例中，系统基本上不含氧气。在一些实施例中，发酵系统包含作为能源和/或碳源的碳水化合物。在一些实施例中，发酵系统包含作为能源和/或碳源的碳水化合物和氢气。

本发明的组合物和方法利用基本上不含氧气的条件。在一个方面，基本上不含氧气的条件是厌氧生物体可生长和/或生成所需产物的条件。该条件可以指除培养基之外的发酵系统(例如，生物反应器)。在其他方面，基本上不含氧气的条件是指其中氧气低于约5、4、3、2、1、0.5、0.2或0.1重量％中的任何一者的发酵系统。在一些方面，发酵系统包含低于约0.01重量％的氧气。在一些方面，发酵系统包含低于约0.001重量％的氧气。

在一些方面，发酵系统包含低于约100ppm的氧气。在一些方面，发酵系统包含低于约90、80、70、60、50、40、30、20、10、5、2或1ppm的氧气。在一些方面，发酵系统中氧气的量为足够低的水平，以使得专性厌氧菌能够再生成和/或生成异戊二烯。在一些方面，发酵系统中氧气的量为足够低的水平，以使得兼性厌氧菌偏爱厌氧发酵，而不是有氧呼吸。

在一些方面，采取步骤从培养基移除氧气。氧气可通过向培养基添加催化剂，以及任选地添加氢气来移除。在一些方面，催化剂是铜。

原料

各种类型的原料可用于本文所述的重组梭菌细胞。原料可以是碳源或合成气。关于示例性原料的信息在下文提供。

碳源

任何碳源均可用于培养宿主细胞。术语“碳源”是指一种或多种含碳化合物，它们能够被本文所述的重组梭菌细胞代谢。例如，用于培养本文所述的重组梭菌细胞的细胞培养基可包括任何适于维持活力或使细胞生长的碳源。

在一些实施例中，碳源是碳水化合物(例如单糖、二糖、寡糖或多糖)、转化糖(例如，酶处理的蔗糖浆)、甘油、丙三醇(例如，生物柴油或皂制造工艺的甘油副产物)、二羟基丙酮、一碳源、油(例如，植物或植物油，例如玉米、棕榈或大豆油)、动物脂、动物油、脂肪酸(例如，饱和脂肪酸、不饱和脂肪酸或多不饱和脂肪酸)、脂质、磷脂、甘油脂、甘油单酯、甘油二酯、三甘油酯、多肽(例如，微生物或植物蛋白质或肽)、可再生碳源(例如，生物质碳源，例如水解生物质碳源)、酵母提取物、来自酵母提取物的组分、聚合物、酸、醇、醛、酮、氨基酸、琥珀酸、乳酸、乙酸、乙醇或两种或更多种上述组分的任何组合。在一些实施例中，碳源为光合作用的产物，包括但不限于葡萄糖。

示例性单糖包括葡萄糖和果糖；示例性寡糖包括乳糖和蔗糖，并且示例性多糖包括淀粉和纤维素。示例性碳水化合物包括C6糖(例如果糖、甘露糖、半乳糖或葡萄糖)和C5糖(例如木糖或阿拉伯糖)。在一些实施例中，细胞培养基包含碳水化合物以及除碳水化合物之外的碳源(如，丙三醇、甘油、二羟基丙酮、一碳源、油、动物脂、动物油、脂肪酸、类脂、磷脂、甘油脂、单甘油酯、甘油二酯、甘油三酯、可再生碳源或来自酵母提取物的组分)。在一些实施例中，细胞培养基包含碳水化合物以及多肽(例如，微生物或植物蛋白或肽)。在一些实施例中，微生物多肽为来自酵母或细菌的多肽。在一些实施例中，植物多肽为来自大豆、玉米、卡诺拉油菜、麻风树、棕榈、花生、向日葵、椰子、芥菜、油菜籽、棉籽、棕榈仁、橄榄、红花、芝麻或亚麻籽的多肽。

在一些实施例中，细胞在限制的葡萄糖条件下进行培养。所谓“限制的葡萄糖条件”是指加入的葡萄糖量少于或为约细胞消耗的葡萄糖量的105％(例如约100％)。在特定实施例中，加入培养基的葡萄糖量大约与在特定时期内细胞消耗的葡萄糖量相同。在一些实施例中，细胞生长速率通过限制葡萄糖的加入量而控制，使得细胞以细胞培养基中的葡萄糖量可支持的速率生长。在一些实施例中，葡萄糖在细胞培养期间不蓄积。在各种实施例中，将细胞在限制的葡萄糖条件下培养大于或为约1、2、3、5、10、15、20、25、30、35、40、50、60或70小时。在各种实施例中，将细胞在限制的葡萄糖条件下培养大于或为约5、10、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、95或100％的总细胞培养时间。虽然不旨在受任何具体理论的约束，但据信限制的葡萄糖条件可允许更有利的细胞调控。

在一些实施例中，细胞在存在过量葡萄糖的情况下培养。在特定实施例中，葡萄糖加入量比在特定时期细胞消耗的葡萄糖量大约105％(例如为约或大于110、120、150、175、200、250、300、400或500％)或更多。在一些实施例中，葡萄糖在细胞培养期间蓄积。

示例性脂质为包含一种或多种脂肪酸的任何物质，所述脂肪酸为饱和的、不饱和的或支链的C4和更高级的脂肪酸。

示例性油为在室温下为液体的脂质。在一些实施例中，脂质包含一种或多种C4或更高级的脂肪酸(例如，包含一种或多种具有四个或更多个碳的饱和的、不饱和的或支链的脂肪酸)。在一些实施例中，油得自大豆、玉米、卡诺拉油菜、麻风树、棕榈、花生、向日葵、椰子、芥菜、油菜籽、棉籽、棕榈仁、橄榄、红花、芝麻、亚麻籽、油质微生物细胞、乌桕油或两种或更多种上述组分的任何组合。

示例性的脂肪酸包括式RCOOH的化合物，其中“R”为烃。示例性的不饱和脂肪酸包括其中“R”包括至少一个碳-碳双键的化合物。示例性的不饱和脂肪酸包括但不限于油酸、异油酸、亚油酸、棕榈烯酸和花生四烯酸。示例性的多不饱和脂肪酸包括其中“R”包括多个碳-碳双键的化合物。示例性的饱和脂肪酸包括其中“R”为饱和脂族基团的化合物。在一些实施例中，碳源包括一种或多种C₁₂-C₂₂脂肪酸，例如C₁₂饱和脂肪酸、C₁₄饱和脂肪酸、C₁₆饱和脂肪酸、C₁₈饱和脂肪酸、C₂₀饱和脂肪酸或C₂₂饱和脂肪酸。在示例性的实施例中，脂肪酸为棕榈酸。在一些实施例中，碳源为脂肪酸(例如，不饱和脂肪酸)的盐、脂肪酸(例如，不饱和脂肪酸)的衍生物或脂肪酸(例如，不饱和脂肪酸)的衍生物的盐。合适的盐包括但不限于锂盐、钾盐、钠盐等。二甘油和三甘油为甘油的脂肪酸酯。

在一些实施例中，脂质、油、脂肪、脂肪酸、甘油单酯、甘油二酯或甘油三酯的浓度为至少或约1克/升培养液(g/L，其中培养液的体积包括细胞培养基的体积和细胞的体积二者)，例如为至少或约5、10、15、20、30、40、50、60、80、100、150、200、300、400或更多g/L。在一些实施例中，脂质、油、脂肪、脂肪酸、甘油单酯、甘油二酯或甘油三酯的浓度在约10和约400g/L之间，例如在约25和约300g/L之间，在约60和约180g/L之间，或在约75和约150g/L之间。在一些实施例中，浓度包括在宿主细胞培养之前和/或期间添加的脂质、油、脂肪、脂肪酸、甘油单酯、甘油二酯或甘油三酯的总量。在一些实施例中，碳源不仅包括(i)脂质、油、脂肪、脂肪酸、甘油单酯、甘油二酯或甘油三酯，还包括(ii)碳水化合物，例如葡萄糖。在一些实施例中，脂质、油、脂肪、脂肪酸、甘油单酯、甘油二酯或甘油三酯与碳水化合物的基于碳的比率为约1:1(即，每个碳水化合物碳对应脂质、油、脂肪、脂肪酸、甘油单酯、甘油二酯或甘油三酯中的一个碳)。在特定实施例中，脂质、油、脂肪、脂肪酸、甘油单酯、甘油二酯或甘油三酯的量在约60和180g/L之间，碳水化合物的量在约120和360g/L之间。

示例性的微生物多肽碳源包括来自酵母或细菌的一种或多种多肽。示例性的植物多肽碳源包括来自大豆、玉米、卡诺拉油菜、麻风树、棕榈、花生、向日葵、椰子、芥菜、油菜籽、棉籽、棕榈仁、橄榄、红花、芝麻或亚麻籽的一种或多种多肽。

示例性的可再生碳源包括干酪乳清透过液、玉米浆、糖用甜菜糖蜜、大麦麦芽以及来自前述任一者的组分。示例性的可再生碳源还包括生物质(如玉米、柳枝稷、甘蔗)中存在的葡萄糖、己糖、戊糖和木糖，发酵过程的细胞废物以及研磨大豆、玉米或小麦产生的蛋白质副产物。在一些实施例中，生物质碳源是木质纤维素、半纤维素或纤维素材料，例如但不限于：草、小麦、小麦秸秆、甜菜渣、甘蔗渣、软木浆、玉米、玉米芯或壳、玉米籽粒、玉米籽粒纤维、玉米秸秆、柳枝稷、稻壳产物，或湿磨或干磨谷物(例如，玉米、高粱、裸麦、黑小麦、大麦、小麦和/或酒糟)的副产物。示例性纤维质材料包括木材、纸材和纸浆废物、草本植物和果肉。在一些实施例中，碳源包括任何植物部分，例如茎、谷物、根或块茎。在一些实施例中，将任何以下植物的全部或部分用作碳源：玉米、小麦、裸麦、高粱、黑小麦、稻米、粟、大麦、木薯、豆类例如菜豆和豌豆、土豆、甘薯、香蕉、甘蔗和/或木薯。在一些实施例中，碳源是生物质水解产物，例如包括木糖和葡萄糖二者或包括蔗糖和葡萄糖二者的生物质水解产物。

在一些实施例中，在将可再生碳源(例如生物质)加入细胞培养基中之前对其进行预处理。在一些实施例中，预处理包括酶预处理、化学预处理或酶和化学预处理二者的组合(参见，例如，Farzanehetal.,BioresourceTechnology96(18):2014-2018,2005(Farzaneh等人，《生物资源技术》，第96卷，第18期，第2014-2018页，2005年)；美国专利No.6,176,176；美国专利No.6,106,888；它们均据此以引用方式整体并入，尤其是关于可再生碳源的预处理的内容)。在一些实施例中，可再生碳源在被加入细胞培养基中之前被部分或完全水解。

在一些实施例中，可再生碳源(例如玉米秸秆)在加入细胞培养基之前经受氨纤维膨胀(AFEX)预处理(参见，例如，Farzanehetal.,BioresourceTechnology96(18):2014-2018,2005(Farzaneh等人，《生物资源技术》，第96卷，第18期，第2014-2018页，2005年))。在AFEX预处理过程中，用液态无水氨在适度温度(例如约60至约100℃)和高压(例如约250至约300psi)下将可再生碳源处理约5分钟。然后，迅速释放压力。在该处理中，木质素溶解作用、半纤维素水解、纤维素去晶作用和增大的表面积的组合化学和物理效应能够使纤维素和半纤维素几乎完全酶转化成可发酵糖。AFEX预处理的优点是几乎所有的氨都可以回收和再利用，同时仍然在下游处理中充当微生物的氮源。另外，AFEX预处理不需要洗涤流。因此，AFEX处理之后的干物质回收为基本上100％。AFEX基本上为干-干处理。处理过的可再生碳源长期稳定，并可以在酶水解或发酵处理中以非常高的固相含量进料。纤维素和半纤维素在AFEX处理中保存完好，只有极少降解或没有降解。在经过AFEX预处理的可再生碳源的酶水解之前不需要进行中和。AFEX处理过的碳源的酶水解产生供后续发酵使用的清洁糖流。

在一些实施例中，碳源(例如，可再生碳源)的浓度相当于至少或为约0.1、0.5、1、1.52、3、4、5、10、15、20、30、40或50％葡萄糖(重量体积比)。可以通过使用标准HPLC方法用葡萄糖作为基准测量碳源产生的葡萄糖量来确定等量的葡萄糖。在一些实施例中，碳源(如，可再生碳源)的浓度相当于在约0.1和约20％葡萄糖之间，例如在约0.1和约10％葡萄糖之间，在约0.5和约10％葡萄糖之间，在约1和约10％葡萄糖之间，在约1和约5％葡萄糖之间，或在约1和约2％葡萄糖之间。

在一些实施例中，碳源包括酵母提取物或酵母提取物的一种或多种组分。在一些实施例中，酵母提取物的浓度为至少1克酵母提取物/升培养液(g/L，其中培养液的体积包括细胞培养基的体积和细胞的体积二者)，例如为至少或约5、10、15、20、30、40、50、60、80、100、150、200、300或更多g/L。在一些实施例中，酵母提取物的浓度在约1和约300g/L之间，例如在约1和约200g/L之间，在约5和约200g/L之间，在约5和约100g/L之间，或在约5和约60g/L之间。在一些实施例中，浓度包括在宿主细胞培养之前和/或期间添加的酵母提取物的总量。在一些实施例中，碳源包括酵母提取物(或它的一种或多种组分)和另一种碳源，例如葡萄糖二者。在一些实施例中，酵母提取物与其他碳源的比率为约1:5、约1:10或约1:20(重量比)。

另外，碳源也可以是一碳底物，例如二氧化碳或甲醇。据报道，在甲醇营养型酵母(Yamadaetal.,Agric.Biol.Chem.,53(2)541-543,1989(Yamada等人，《农业和生物化学》，第53卷，第2期，第541-543页，1989年)，该文献据此以引用方式整体并入，尤其是关于碳源的内容)和细菌(Hunteret.al.,Biochemistry,24,4148-4155,1985(Hunter等人，《生物化学》，第24卷，第4148-4155页，1985年)，该文献据此以引用方式整体并入，尤其是关于碳源的内容)中，甘油从单碳源(例如，甲醇、甲醛或甲酸)生成。这些生物体可以同化从甲烷到甲酸盐以不同氧化状态存在的单碳化合物，并产生甘油。碳同化途径可通过核酮糖单磷酸，通过丝氨酸或通过木酮糖单磷酸进行(Gottschalk,BacterialMetabolism,SecondEdition,Springer-Verlag:NewYork,1986(Gottschalk，《细菌代谢》，第二版，施普林格出版社，纽约，1986年)，该文献据此以引用方式整体并入，尤其是关于碳源的内容)。核酮糖单磷酸途径涉及使甲酸盐与核酮糖-5-磷酸缩合形成六碳糖，其变成果糖，并最终变成三碳产物甘油醛-3-磷酸。同样，丝氨酸途径通过亚甲基四氢叶酸将一碳化合物同化到糖酵解途径中。

合成气

合成气可用作本文所述的任何重组梭菌细胞的能源和/或碳源。合成气可包括CO和H₂。在一些方面，合成气包括CO、CO₂和H₂。在一些方面，合成气还包括H₂O和/或N₂。例如，合成气可包括CO、H₂和H₂O(例如，CO、H₂、H₂O和N₂)。合成气可包括CO、H₂和N₂。合成气可包括CO、CO₂、H₂和H₂O(例如，CO、CO₂、H₂、H₂O和N₂)。合成气可包括CO、CO₂、H₂和N₂。合成气中的CO和/或CO₂可用作细胞的碳源。

在一些方面，合成气中氢气与一氧化碳的摩尔比为约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、3.0、4.0、5.0或10.0中的任何一者。在一些方面，合成气包含约10、20、30、40、50、60、70、80或90体积％中的任何一者的一氧化碳。在一些方面，合成气包含约10、20、30、40、50、60、70、80或90体积％中的任何一者的氢气。在一些方面，合成气包含约10、20、30、40、50、60、70、80或90体积％中的任何一者的二氧化碳。在一些方面，合成气包含约10、20、30、40、50、60、70、80或90体积％中的任何一者的水。在一些方面，合成气包含约10、20、30、40、50、60、70、80或90体积％中的任何一者的氮气。

本发明的合成气可来源于天然或合成来源。在一些方面，合成气来源于生物质(例如，木材、柳枝稷、农业废料、城市废料)或碳水化合物(例如，糖)。在其他方面，合成气来源于煤、石油、油母质、焦油砂、油页岩、天然气或它们的混合物。在其他方面，合成气来源于橡胶，例如来源于橡胶轮胎。在一些方面，合成气来源于生物质和煤的混合物(例如共混物)。在一些方面，该混合物具有约或至少约1％、2％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、90％、95％或99％中的任何一者的生物质。在一些方面，该混合物具有约或至少约1％、2％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、90％、95％或99％中的任何一者的煤。在一些方面，混合物中生物质与煤的比率为约5:95、10:90、15:85、20:80、25:75、30:70、35:65、40:60、45:55、50:50、55:45、60:40、65:35、70:30、75:25、80:20、85:15、90:10或95:5中的任何一者。

合成气可通过多种工艺，包括甲烷重整、煤的液化、混烧、发酵反应、酶促反应和生物质气化从原料获得。生物质气化通过使生物质在低于化学计量的氧气的存在下，在反应器中在高于约700℃的温度下经受部分氧化而实现。氧气以空气、纯氧或蒸气的形式引入生物反应器。气化可通过三个主要步骤进行：1)初始加热，使生物质内部的所有水分干透；2)高温分解，其中将生物质在不存在氧化剂的情况下加热到300-500℃，得到瓦斯、焦油、油和固体木炭残留物；以及3)气化固体木炭、焦油和瓦斯，得到合成气的主要组分。混烧通过煤/生物质混合物的气化实现。合成气的组成，例如合成气组分的成分和摩尔比，可根据其来源的原料以及原料转化为合成气的方法而变化。

合成气可包含杂质，该杂质的性质和量可根据原料和制造所用的工艺而变化。发酵可容许存在一些杂质，但杂质仍需要从合成气物质移除，所述杂质例如为可堵塞发酵罐和相关设备的焦油和颗粒。移除可污染异戊二烯产物的化合物，例如挥发性有机化合物、酸性气体、甲烷、苯、甲苯、乙苯、二甲苯、H₂S、COS、CS₂、HCl、O₃、有机硫化合物、氨气、氮氧化物、含氮有机化合物和重金属蒸气也是可取的。从合成气移除杂质可通过多种方式中的一种实现，包括气体洗涤、用固相吸附剂处理以及使用气体渗透膜纯化。

可使用的其他发酵系统和培养条件的例子在国际专利申请公布No.WO2009/076676、WO2010/003007、WO2009/132220、WO2010/031062、WO2010/031068、WO2010/031076、WO2010/013077、WO2010/031079、WO2010/148150、WO2010/078457和WO2010/148256中有所描述，它们据此整体并入，尤其是关于梭菌的发酵系统和培养条件的内容。

在一些方面，培养基使用缺氧技术制备。在一些方面，培养基包含NH₄Cl、NaCl、KCl、KH₂PO₄、MgSO₄·7H₂O、CaCl₂·2H₂O、NaHCO₃、酵母提取物、半胱氨酸盐酸盐、Na₂S·9H₂O、痕量金属和维生素中的一者或多者。在一些方面，每升培养基包含约1.0gNH₄Cl、约0.8gNaCl、约0.1gKCl、约0.1gKH₂PO₄、约0.2gMgSO₄·7H₂O、约0.02gCaCl₂·2H₂O、约1.0gNaHCO₃、约1.0g酵母提取物、约0.2g半胱氨酸盐酸盐、约0.2gNa₂S·9H₂O、约10mL痕量金属溶液和约10mL维生素溶液。在一些方面，培养条件包括甲羟戊酸。

生长条件、碳源、能源和培养基可遵循本公开的实例中描述的生长条件、碳源、能源和培养基中的任何一者。

梭菌表达系统

本发明提供用于生成一种或多种工业生物产物(例如，异戊二烯、丁二烯或乙醇)的梭菌表达系统。在一些实施例中，该系统可包括以下一者或多者：(a)甲基转移酶(例如，包括pDW268或pMCS466的质粒)，(b)穿梭质粒(例如，pDW280、pMCS537、pMCS200、pMCS201、pMCS444或PMCS445)，(c)大肠杆菌细胞，所述大肠杆菌细胞能够与梭菌细胞相互作用，以允许(a)和(b)的转移；以及(d)梭菌细胞，所述梭菌细胞能够与埃希氏菌细胞相互作用，使得一种或多种核酸在梭菌细胞中表达。在一些实施例中，能够与梭菌细胞相互作用的大肠杆菌细胞是大肠杆菌S17-1细胞。在一些实施例中，能够与埃希氏菌细胞相互作用的梭菌细胞选自乙酸梭菌、杨氏梭菌、合成气发酵梭菌或丙酮丁醇梭菌。在一些实施例中，该系统提供一种或多种所关注的核酸(例如，编码异戊二烯合酶或从乙酰-CoA生成乙醇中涉及到的酶的核酸)的表达。如本文所述，可使用梭菌限制修饰系统来工程改造梭菌细胞，以使得可以绕过限制修饰系统。该工程改造允许使用梭菌细胞生成各种工业生物产物，包括但不限于：异戊二烯、丁二烯、乙醇、丙二醇(例如，1,2-丙二醇、1,3-丙二醇)、氢气、乙酸、微生物燃料、非发酵醇、脂肪醇、脂肪酸酯、类异戊二烯醇、烯烃、烷烃、类萜、类异戊二烯、类胡萝卜素或其他C5、C10、C15、C20、C25、C30、C35或C40产物。这些工业生物产物的生成在下文和本文中进一步详细描述。

使用工程化梭菌生成工业生物产物的方法

如本文所述，可使用梭菌限制修饰系统来工程改造梭菌细胞，以使得可以绕过限制修饰系统。该工程改造允许使用梭菌细胞生成各种工业生物产物，包括但不限于：异戊二烯、丁二烯、乙醇、丙二醇(例如，1,2-丙二醇、1,3-丙二醇)、氢气、乙酸、微生物燃料、非发酵醇、脂肪醇、脂肪酸酯、类异戊二烯醇、烯烃、烷烃、类萜、类异戊二烯、类胡萝卜素或其他C5、C10、C15、C20、C25、C30、C35或C40产物。这些工业生物产物的生成在下文和本文中进一步详细描述。

异戊二烯的生成

在一些实施例中，本文所公开的组合物和方法可用于使用一种或多种异源多核苷酸来转化梭菌，所述梭菌包含一条或多条异戊二烯生成途径(例如，梭菌包含图41至图45中示出的途径)，所述异源多核苷酸编码一种或多种异戊二烯途径酶，所述异戊二烯途径酶足量表达以生成异戊二烯。

示例性异戊二烯合酶多肽和核酸

在一些实施例中，本文所公开的组合物和方法可用于使用编码异戊二烯合酶多肽的多核苷酸来转化梭菌。异戊二烯合酶多肽将二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP)转化成异戊二烯。示例性的异戊二烯合酶多肽包括具有异戊二烯合酶多肽的至少一种活性的多肽、多肽片段、肽和融合多肽。可将标准方法用于测定多肽是否具有异戊二烯合酶多肽活性，所述测定通过测量多肽在体外、在细胞提取物中或在体内将DMAPP转化为异戊二烯的能力而进行(例如，如US420360B2的实例1中所描述，该专利整体并入本文，尤其是关于评估异戊二烯合酶活性的方法的内容)。细胞提取物中的异戊二烯合酶多肽活性可例如按以下文献中所述进行测量：Silveretal.,J.Biol.Chem.270:13010-13016,1995(Silver等人，《生物化学杂志》，第270卷，第13010-13016页，1995年)以及其中的参考文献，它们均据此以引用方式整体并入，尤其是关于异戊二烯合酶多肽活性的测定法的内容。

在一些实施例中，异戊二烯合酶多肽或核酸来自豆科(Fabaceae)，例如蝶形花亚科(Faboideae)。在一些实施例中，异戊二烯合酶多肽或核酸是来自葛(Puerariamontana)(葛藤)(Sharkeyetal.,PlantPhysiology137:700-712,2005(Sharkey等人，《植物生理学》，第137卷，第700-712页，2005年))、野葛(Puerarialobata)、杨树(例如白杨与欧洲山杨的杂交种(Populusalbaxtremula)CAC35696，Milleretal.,Planta213:483-487,2001(Miller等人，《植物》，第213卷，第483-487页，2001年))、白杨(例如山杨(Populustremuloides)，Silveretal,JBC270(22):13010-1316,1995(Silver等人，《生物化学杂志》，第270卷，第22期，第13010-1316页，1995年))或欧洲栎(Quercusrobur)(Zimmeretal.(Zimmer等人)，WO98/02550)的天然存在的多肽或核酸，它们均据此以引用方式整体并入，尤其是关于异戊二烯合酶核酸和异戊二烯合酶多肽的表达的内容。合适的异戊二烯合酶包括但不限于：通过GenBank登录号AY341431、AY316691、AY279379、AJ457070和AYl82241识别的那些，它们均据此以引用方式整体并入，尤其是关于异戊二烯合酶核酸和多肽的序列的内容。在一些实施例中，异戊二烯合酶多肽或核酸不是来自欧洲栎的天然存在的多肽或核酸(即，异戊二烯合酶多肽或核酸为来自欧洲栎的天然存在的多肽或核酸之外的异戊二烯合酶多肽或核酸)。在一些实施例中，异戊二烯合酶核酸或多肽不是来自杨树(例如白杨与欧洲山杨的杂交种CAC35696)的天然存在的多肽或核酸。

示例性异戊二烯合酶核酸包括编码具有至少一种异戊二烯合酶多肽活性的多肽、多肽片段、肽或融合多肽的核酸。示例性异戊二烯合酶多肽和核酸包括来自本文所述的任何来源生物体的天然存在的多肽和核酸以及源自本文所述的任何来源生物体的突变多肽和核酸。

示例性DXS多肽和核酸

在一些实施例中，本文所公开的组合物和方法可用于使用编码1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶(DXS)多肽的多核苷酸来转化梭菌。DSX多肽将丙酮酸和D-甘油醛-3-磷酸转化为1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸。示例性DXS多肽包括具有DXS多肽的至少一种活性的多肽、多肽片段、肽和融合多肽。可将标准方法用于测定多肽是否具有DXS多肽活性，所述测定通过测量多肽在体外、在细胞提取物中或在体内将丙酮酸和D-甘油醛-3-磷酸转化为1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶的能力而进行(参见，例如，US8420360B2，该专利据此整体并入本文，尤其是关于评估DXS多肽活性的方法的内容)。示例性DXS核酸包括编码具有DXS多肽的至少一种活性的多肽、多肽片段、肽或融合多肽的核酸。示例性DXS多肽和核酸包括来自本文所述的任何来源生物体的天然多肽和核酸以及源自本文所述的任何来源生物体的突变多肽和核酸。

示例性IDI多肽和核酸

在一些实施例中，本文所公开的组合物和方法可用于使用编码异戊烯基焦磷酸异构酶多肽(异戊烯基焦磷酸δ-异构酶或IDI)的多核苷酸来转化梭菌。IDI催化异戊烯基焦磷酸(IPP)和二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)的互相转化(例如，将IPP转化为DMAPP和/或将DMAPP转化为IPP)。示例性IDI多肽包括具有IDI多肽的至少一种活性的多肽、多肽片段、肽和融合多肽。可将标准方法用于测定多肽是否具有IDI多肽活性，所述测定通过测量多肽在体外、在细胞提取物中或在体内使IPP和DMAPP相互转化的能力而进行(参见，例如，US8420360B2，该专利据此整体以引用方式并入，尤其是关于评估IDI活性的测定法的内容)。示例性IDI核酸包括编码具有至少一种IDI多肽活性的多肽、多肽片段、肽或融合多肽的核酸。示例性IDI多肽和核酸包括来自本文所述的任何来源生物体的天然存在的多肽和核酸以及源自本文所述的任何来源生物体的突变多肽和核酸。

示例性MVA途径多肽和核酸

在一些实施例中，本文所公开的组合物和方法可用于使用编码MVA途径多肽的多核苷酸来转化梭菌。MVA途径多肽包括乙酰-CoA乙酰转移酶(AA-CoA硫解酶)多肽、3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA合酶(HMG-CoA合酶)多肽、3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA还原酶(HMG-CoA还原酶)多肽、甲羟戊酸激酶(MVK)多肽、磷酸甲羟戊酸激酶(PMK)多肽、二磷酸甲羟戊酸脱羧酶(MVD)多肽、IDI多肽，以及具有两种或更多种MVA途径多肽的活性的多肽(例如，融合多肽)。具体地讲，MVA途径多肽包括具有MVA途径多肽的至少一种活性的多肽、多肽片段、肽和融合多肽。示例性MVA途径核酸包括编码具有至少一种MVA途径多肽活性的多肽、多肽片段、肽或融合多肽的核酸。示例性MVA途径多肽和核酸包括来自本文所述的任何来源生物体的天然存在的多肽和核酸以及源自本文所述的任何来源生物体的突变多肽和核酸。

具体地讲，乙酰-CoA乙酰转移酶多肽(AA-CoA硫解酶或AACT)将两分子乙酰-CoA转化为乙酰乙酰-CoA。可将标准方法(例如本文所述的那些)用于测定多肽是否具有AA-CoA硫解酶多肽活性，所述测定通过测量多肽在体外、在细胞提取物中或在体内将两分子乙酰-CoA转化为乙酰乙酰-CoA的能力而进行。3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA合酶(HMG-CoA合酶或HMGS)多肽将乙酰乙酰-CoA转化为S-羟基-S-甲基戊二酰-CoA。可将标准方法(例如本文所述的那些)用于测定多肽是否具有HMG-CoA合酶多肽活性，所述测定通过测量多肽在体外、在细胞提取物中或在体内将乙酰乙酰-CoA转化为3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA的能力而进行。

3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA还原酶(HMG-CoA还原酶或HMGR)多肽将3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA转化为甲羟戊酸。可将标准方法(例如本文所述的那些)用于测定多肽是否具有HMG-CoA还原酶多肽活性，所述测定通过测量多肽在体外、在细胞提取物中或在体内将3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA转化为甲羟戊酸的能力而进行。

甲羟戊酸激酶(MVK)多肽使甲羟戊酸磷酸化以形成甲羟戊酸-5-磷酸。可将标准方法(例如本文所述的那些)用于测定多肽是否具有MVK多肽活性，所述测定通过测量多肽在体外、在细胞提取物中或在体内将甲羟戊酸转化为甲羟戊酸-5-磷酸的能力而进行。

磷酸甲羟戊酸激酶(PMK)多肽使甲羟戊酸-5-磷酸磷酸化以形成甲羟戊酸-5-焦磷酸。可将标准方法(例如本文所述的那些)用于测定多肽是否具有PMK多肽活性，所述测定通过测量多肽在体外、在细胞提取物中或在体内将甲羟戊酸-5-磷酸转化为甲羟戊酸-5-焦磷酸的能力而进行。

焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶(MVD或DPMDC)多肽将甲羟戊酸-5-焦磷酸转化为异戊烯基焦磷酸多肽(IPP)。可将标准方法(例如本文所述的那些)用于测定多肽是否具有MVD多肽活性，所述测定通过测量多肽在体外、在细胞提取物中或在体内将甲羟戊酸-5-焦磷酸转化为IPP的能力而进行。

在一些实施例中，本文所述的组合物和方法可用于转化梭菌，所述梭菌经过工程化以从合成气和/或从碳水化合物或它们的混合物生成异戊二烯。

使用工程化梭菌细胞生成丁二烯的方法

在一些实施例中，本文所公开的组合物和方法可用于使用一种或多种异源多核苷酸来转化梭菌，所述梭菌包含一条或多条丁二烯生成途径(如图46至图48中所示出)，所述异源多核苷酸编码一种或多种丁二烯途径酶，所述丁二烯途径酶足量表达以生成丁二烯。丁二烯途径包括乙酰-CoA：乙酰-CoA酰基转移酶、乙酰乙酰-CoA还原酶、3-羟基丁酰-CoA脱水酶、巴豆酰-CoA还原酶(生成醛)、巴豆醛还原酶(生成醇)、巴豆醇激酶、2-丁烯基-4-磷酸激酶、丁二烯合酶、巴豆酰-CoA水解酶、合成酶或转移酶、巴豆酸还原酶、巴豆酰-CoA还原酶(生成醇)、戊烯二酰-CoA脱羧酶、戊二酰-CoA脱氢酶、3-氨基丁酰-CoA脱氨酶、4-羟基丁酰-CoA脱水酶或巴豆醇焦磷酸激酶。从细菌生成丁二烯在WO2011/140171A2中有所描述，该专利据此整体以引用方式并入，尤其是关于从乙酰-CoA(图46)、从赤藓糖-4-磷酸(图47)以及从丙二酰-CoA加上乙酰-CoA(图48)生成丁二烯的途径的内容。

使用工程化梭菌细胞生成乙醇的方法

已知梭菌属中的若干种细菌可通过乙酰-CoA途径生成乙醇，所述乙酰-CoA途径可利用一氧化碳和氢气二者作为碳源和能源。从梭菌生成乙醇在Kopkeetal.,2011,Fermentativeproductionofethanolfromcarbonmonoxide,CurrentOpinioninBiotechnology,Vol.22:320-323(Kopke等人，2011年，从一氧化碳发酵生成乙醇，《生物技术当今观点》，第22卷，第320-323页)和Wilkinsetal.,2011,Microbialproductionofethanolfromcarbonmonoxide,CurrentOpinioninBiotechnology,Vol.22:326-330(Wilkins等人，2011年，通过微生物从一氧化碳生成乙醇，《生物技术当今观点》，第22卷，第326-330页)中有所描述，这两篇文献据此整体并入，尤其是关于梭菌中从乙酰-CoA生成乙醇的途径的讨论内容。

在一些实施例中，本文所公开的组合物和方法可用于使用一种或多种异源多核苷酸来转化梭菌，所述梭菌包含乙醇途径(包括但不限于：乙酸梭菌、杨氏梭菌、丙酮丁醇梭菌或合成气发酵梭菌)，所述异源多核苷酸编码一种或多种乙醇途径酶，所述乙醇途径酶足量表达以生成乙醇。在梭菌中，从乙酰-CoA生成乙醇的途径包括醛脱氢酶和醇脱氢酶(参见，例如，图41)。

使用工程化梭菌细胞生成其他工业生物产物的方法

在本发明的一些方面，本文所述的任何方法可用于生成除异戊二烯、丁二烯和乙醇之外的产物。此类产物可以是排泄的、分泌的或细胞内产物。本文所述的方法中的任何一者可用于生成异戊二烯和/或一种或多种其他产物。本文所述的产物可以是例如丙二醇(例如，1,2-丙二醇、1,3-丙二醇)、氢气、乙酸或微生物燃料。示例性微生物燃料是发酵醇(例如，乙醇或丁醇)、非发酵醇(例如，异丁醇、甲基丁醇、1-丙醇、1-丁醇、甲基戊醇或1-己醇)、脂肪醇、脂肪酸酯、类异戊二烯醇、烯烃和烷烃。本文所述的产物也可以是类萜、类异戊二烯(例如，金合欢烯)或类胡萝卜素或其他C5、C10、C15、C20、C25、C30、C35或C40产物。

在一些方面，类萜选自类半萜、类单萜、类倍半萜、类二萜、类二倍半萜、类三萜、类四萜和高级类多萜。在一些方面，类半萜是戊二烯醇、异戊二烯醇或异戊酸。在一些方面，类单萜是香叶基焦磷酸、桉叶脑、柠檬烯或蒎烯。在一些方面，类倍半萜化合物为法尼基焦磷酸、青蒿素或没药醇。在一些方面，二萜是香叶基香叶基焦磷酸、视黄醇、视黄醛、植醇、紫杉醇、毛喉素或蚜肠霉素。在一些方面，类三萜是角鲨烯或羊毛甾醇。在一些方面，类四萜是番茄红素或胡萝卜素。在一些方面，类胡萝卜素选自叶黄素类和胡萝卜素类。在一些方面，叶黄素类为叶黄素或玉米黄质。在一些方面，胡萝卜素是α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、γ-胡萝卜素、β-隐黄质或番茄红素。

本文所述的产物可来源于通过合成气发酵或通过其他碳源例如果糖发酵生成的乙酰-CoA。在一些方面，细胞在适于生成除异戊二烯之外的其他产物的条件下生长。

本文所述的产物可由细胞天然生成。在一些方面，细胞天然生成一种或多种产物，包括排泄的、分泌的或细胞内产物。在一些方面，细胞天然生成乙醇、丙二醇、氢气或乙酸。在一些方面，天然存在的产物的产量相对于野生型细胞提高。本领域已知的提高代谢细胞产物的产量的任何方法均可用于提高天然存在的产物的产量。在一些方面，编码生成本文所述的产物的途径的全部或一部分的核酸可操作地连接至启动子，例如强启动子。在一些方面，编码生成本文所述的产物的途径的全部或一部分的核酸可操作地连接至组成型启动子。在一些方面，细胞经工程改造成包含内源性核酸的另外拷贝，所述内源性核酸编码生成本文所述的产物的多肽。在一些方面，本文所述的产物不由细胞天然生成。在一些方面，细胞包含一种或多种异源核酸，所述异源核酸编码一种或多种生成本文所述的产物的多肽。

在正常生长条件下，产乙酸菌生成乙酸和乙醇。乙酸在两步反应中生成，其中首先通过磷酸转乙酰酶(pta)将乙酰-CoA转化为乙酰磷酸，然后通过乙酸激酶(ack)使乙酰磷酸脱磷酸化形成乙酸。乙醇通过两步过程形成，其中通过多功能酶醇脱氢酶(adhE)将乙酰-CoA转化为乙醛，然后转化为乙醇。在产异戊二烯的细胞中，生成乙酸和乙醇可能不是期望的，因为碳通量远离异戊二烯，最终导致异戊二烯产量下降。因此，可以破坏编码磷酸转乙酰酶(pta)、乙酸激酶(ack)和醇脱氢酶(adhE)的一些或所有基因，或出于使碳通量偏离乙酸和/或乙醇和提高异戊二烯产量的目的，使它们在厌氧细胞中的表达下降。

在一些方面，细胞缺失至少一种在乙酸、乙醇、琥珀酸和/或甘油生成中涉及到的多肽。在一些方面，一条或多条生成除异戊二烯之外的代谢物(例如，乳酸、乙酸、乙醇(或其他醇)、琥珀酸或甘油)的途径被阻断，例如，除异戊二烯之外的代谢物的生成可减少至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％中的任何一者。在一些方面，一条或多条生成乳酸、乙酸、乙醇、琥珀酸或甘油的途径被阻断，例如，乳酸、乙酸、乙醇、琥珀酸和/或甘油的生成减少至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％中的任何一者。在一些方面，细胞缺失至少一种乙酸、乙醇、琥珀酸和/或甘油生成途径中的多肽。可降低乙酸、乙醇、琥珀酸和/或甘油生成途径中的多肽的活性，或降低它们的表达。可以破坏编码乙酸、乙醇、琥珀酸和/或甘油生成途径中的多肽的核酸。各种途径(例如，乙醇和/或乙酸生成途径)中涉及到的多肽是本领域技术人员已知的，包括例如Misophetal.1996,JournalofBacteriology,178(11):3140-45(Misoph等人，1996年，《细菌学杂志》，第178卷，第11期，第3140-45页)中描述的那些，该文献关于琥珀酸、乙酸、乳酸和/或乙醇生成途径中涉及到的多肽的全部内容明确地以引用方式并入。

在一些方面，细胞缺失pta。在一些方面，细胞缺失ack。在一些方面，细胞缺失adhE。在一些方面，细胞缺失pta、ack和/或adhE。在一些方面，磷酸转乙酰酶、乙酸激酶和/或醇脱氢酶的表达下降。在一些方面，磷酸转乙酰酶、乙酸激酶和/或醇脱氢酶的活性降低。在一些方面，细胞缺失具有与磷酸转乙酰酶、乙酸激酶和/或醇脱氢酶类似的活性的多肽。pta、ack、adhE和/或具有与磷酸转乙酰酶、乙酸激酶和/或醇脱氢酶类似的活性的多肽的表达可通过本领域技术人员已知的任何方法降低，例如表达可通过反义RNA(例如，本文所述的任何启动子，例如任何诱导型启动子驱动的反义RNA)降低。在一些方面，反义RNA可操作地连接至合适的启动子，例如本文所述的任何启动子，包括诱导型启动子。

在一些方面，异戊二烯和除异戊二烯之外的产物(一种或多种)均从气相回收。在一些方面，异戊二烯从气相(例如，从瓦斯发酵物)回收，而其他产物(一种或多种)从液相(例如，从细胞培养液)回收。

生物反应器

多种不同类型的反应器可用于生成异戊二烯或其他工业生物产物。在一些实施例中，将碳水化合物用作能源和/或碳源。在一些实施例中，将碳水化合物和氢气用作能源和/或碳源。在一些实施例中，将合成气用作能源和/或碳源。有众多不同类型的发酵工艺在商业上使用。用于本发明的生物反应器应能经受厌氧条件。可设计生物反应器以优化细胞的保留时间、液体的停留时间和合成气的喷射速率。

在各种方面，使用任何已知的发酵方式来培养细胞，如分批发酵、分批补料发酵、连续发酵和带再循环过程的连续发酵。在一些方面，使用分批发酵方法。传统的分批发酵是封闭系统，其中培养基组成在发酵开始时设定，并且在发酵过程中不进行人为改变。因此，在发酵开始时，用所需的宿主细胞接种细胞培养基，并在不向系统添加任何物质的情况下进行发酵。然而，通常“分批”发酵是针对添加碳源而言的分批，而通常会尝试控制诸如pH和氧气浓度的因素。在分批系统中，直到发酵停止以前，系统的代谢物和生物质组成都不断改变。在分批培养中，细胞慢慢通过静息迟滞期进入高速对数生长期，并最终到达生长速率降低或停止的稳定期。在一些方面，对数期中的细胞负责生成大部分异戊二烯。在一些方面，稳定期中的细胞生产异戊二烯。

在一些方面，使用标准的分批系统的变型，例如分批补料系统。分批补料发酵工艺包括典型的分批系统，不同的是碳源(例如，合成气、葡萄糖、果糖)随着发酵的进行逐步添加。在分解代谢物阻遏倾向于抑制细胞的代谢时和在需要在细胞培养基中具有有限量的碳源的情况下，分批补料系统是有用的。分批补料发酵可以在碳源(例如合成气、葡萄糖、果糖)处于有限量或过量的情况下进行。分批补料系统中实际碳源浓度的测量是困难的，因此根据诸如pH、溶氧、尾气(例如CO₂)分压的可测量因素的变化进行估计。分批发酵和分批补料发酵是常见的并为本领域所熟知，其例子可见于Brock,Biotechnology:ATextbookofIndustrialMicrobiology,SecondEdition(1989)SinauerAssociates,Inc.(Brock，《生物技术：工业微生物学教科书》，第二版，1989年，希诺联合出版公司)。

在一些方面，使用连续发酵方法。连续发酵是开放系统，其中限定的发酵培养基被连续地添加到生物反应器，并同时移取等量的经调理的培养基进行加工。连续发酵通常以恒定的高密度维持培养物，其中细胞主要处于对数生长期。

连续发酵使得可以调节影响细胞生长或异戊二烯生产的一个因素或多个因素。例如，一种方法以固定的速率维持限制性营养物如碳源或氮源水平，同时允许所有其他参数适度。在其他系统中，可连续地改变多个影响生长的因素，同时保持细胞浓度(例如，通过培养基浊度测量的浓度)恒定。连续系统旨在维持稳态生长条件。因此，使由于移取培养基导致的细胞损失与发酵中的细胞生长速率保持平衡。连续发酵工艺的营养物质和生长因子的调节方法，以及使产物形成速率最大化的技术是工业微生物学领域熟知的，并且多种方法由Brock,Biotechnology:ATextbookofIndustrialMicrobiology,SecondEdition(1989)SinauerAssociates,Inc.(Brock，《生物技术：工业微生物学教科书》，第二版，1989年，希诺联合出版公司)进行了详细描述，该文献据此以引用方式整体并入，尤其是关于细胞培养和发酵条件的内容。

连续发酵方法的一种变型是带再循环的连续方法(continuouswithrecyclemethod)。这个系统与连续生物反应器相似，差别在于通过细胞量分离装置将随同液体内容物一起去除的细胞返回到生物反应器。使用错流过滤装置、离心机、沉降罐、木片、水凝胶和/或中空纤维来进行细胞量分离或保留。这个工艺通常用来提高连续生物反应器系统的生产率，并且对于厌氧菌可能特别有用-氧菌可能比需氧菌生长更慢且浓度更低。

在一个方面，可使用膜生物反应器进行本文所述的厌氧细胞的生长和/或发酵，特别是如果预期细胞生长缓慢的话。可将膜过滤器如错流过滤器或切向流过滤器与生产异戊二烯气体的液体发酵生物反应器一起共同操作。通过将发酵与本来会被弃去的选定发酵液组分的再循环相结合，这种膜生物反应器能增加异戊二烯气体的发酵产量。MBR过滤发酵液并将非透过性组分(过滤器“截留液”)返回至反应器，从而有效地增加细胞、细胞碎片和其他发酵液固形物的反应器浓度，同时维持细胞的比生产率。这能显著改善异戊二烯的滴度、总产量和体积生产率，从而使得投资和运行成本更低。

滤液(或“透过液”)不返回反应器，从而使反应器体积有利地减小，这类似于收集发酵液排出物(brothdraw-off)。然而，与发酵液排出物不同的是，收集的透过液为澄清的液体，其在普通容器中保藏后可通过过滤容易地进行灭菌。因此，该透过液可以容易地作为营养物和/或水再循环来源进行再利用。可将含有可溶性废培养基的透过液添加至同一发酵或另一发酵以提高异戊二烯产量。

回收方法

本文所述的任何方法还包括回收工业生物产物(例如，异戊二烯、丁二烯、乙醇等)。例如，可以用标准技术回收用本发明的组合物和方法生成的异戊二烯，例如气提、膜增强分离、分馏、吸附/解吸、蒸发、从固相热解吸或真空解吸异戊二烯，或用溶剂萃取被固定或吸收至固相的异戊二烯(参见，例如，美国专利No.4,703,007和4,570,029)。在一个方面，异戊二烯通过吸收反萃取回收(参见，例如，国际专利申请No.PCT/US2010/060552(WO2011/075534))。在特定方面，将通过醇(例如，乙醇、甲醇、丙醇或它们的组合)进行的萃取蒸馏用于回收异戊二烯。在一些方面，异戊二烯的回收涉及分离液体形式的异戊二烯(诸如异戊二烯的纯溶液或异戊二烯在溶剂中的溶液)。气提涉及以连续方式从发酵尾气流中移除异戊二烯蒸气。这种移除可以多种不同的方式实现，包括但不限于吸附到固相、分配进液相或直接冷凝(诸如因暴露于冷凝盘管或因压力升高而冷凝)。在一些方面，在高于蒸气露点的条件下对稀的异戊二烯蒸气流进行薄膜富集会造成液体异戊二烯的冷凝。在一些方面，将异戊二烯压缩并冷凝。

异戊二烯的回收可涉及一个步骤或多个步骤。在一些方面，从发酵尾气中移除异戊二烯蒸气和异戊二烯转化成液相同时地进行。例如，异戊二烯可直接从尾气流冷凝形成液体。在一些方面，从发酵尾气中移除异戊二烯蒸气和异戊二烯转化成液相相继地进行。例如，异戊二烯可吸附到固相，然后通过溶剂从固相提取。

在一些方面，任何本文所述方法还包括回收所产生的化合物的步骤。在一些方面，本文所述的任何方法还包括回收异戊二烯的步骤。在一些方面，通过吸收反萃取回收异戊二烯(参见例如美国专利公布No.2011/0178261)。

从厌氧生物体发酵中回收的异戊二烯组合物可包含杂质。异戊二烯组合物中杂质的种类和水平可通过标准方法(例如GC/MS、GC/FID和¹HNMR)分析。杂质可以是微生物来源的，或可以是合成气进料或其他发酵原材料中的污染物。

在一些方面，从厌氧生物体发酵中回收的异戊二烯组合物包含以下杂质中的一者或多者：硫化氢、硫化羰、二硫化碳、乙醇、丙酮、甲醇、乙醛、甲基丙烯醛、甲基乙烯基酮、2-甲基-2-乙烯基环氧乙烷、顺式-和反式-3-甲基-1,3-戊二烯、C5异戊二烯醇(例如，3-甲基-3-丁烯-1-醇或3-甲基-2-丁烯-1-醇)、2-庚酮、6-甲基-5-庚烯-2-酮、2,4,5-三甲基吡啶、2,3,5-三甲基吡嗪、香茅醛、甲硫醇、乙硫醇、乙酸甲酯、1-丙醇、双乙酰、2-丁酮、2-甲基-3-丁烯-2-醇、乙酸乙酯、2-甲基-1-丙醇、3-甲基-1-丁醛、3-甲基-2-丁酮、1-丁醇、2-戊酮、3-甲基-1-丁醇、异丁酸乙酯、3-甲基-2-丁烯醛、乙酸丁酯、乙酸3-甲基丁基醇酯、乙酸3-甲基-3-丁烯-1-醇酯、乙酸3-甲基-2-丁烯-1-醇酯、(E)-3,7-二甲基-1,3,6-辛三烯、(Z)-3,7-二甲基-1,3,6-辛三烯、(E,E)-3,7,11-三甲基-1,3,6,10-十二碳四烯和(E)-7,11-二甲基-3-亚甲基-1,6,10-十二碳三烯、3-己烯-1-醇、乙酸3-己烯-1-醇酯、柠檬烯、香叶醇(反式-3,7-二甲基-2,6-辛二烯-1-醇)、香茅醇(3,7-二甲基-6-辛烯-1-醇)、(E)-3-甲基-1,3-戊二烯、(Z)-3-甲基-1,3-戊二烯、硫醇、一硫化物和二硫化物或气体例如CS₂和COS。从厌氧生物体的合成气发酵中回收的异戊二烯组合物可包含一种或多种RimbaultAetal.1986,JofChromatography,375:11-25(种RimbaultA等人，1986年，《色谱杂志》，第375卷，第11-25页)中描述的组分，该文献的关于梭菌培养物气体中的各种组分的全部内容明确地以引用方式并入本文。

在一些方面，本文所述的任何方法还包括纯化异戊二烯。例如，使用本发明的组合物和方法产生的异戊二烯可使用标准技术纯化。纯化是指将异戊二烯与生成异戊二烯时存在的一种或多种组分分离的过程。在一些方面，异戊二烯作为基本上纯的液体获得。纯化方法的例子包括(i)从溶于液体萃取剂的溶液蒸馏和(ii)层析。如本文所用，“纯化的异戊二烯”是指已与生成异戊二烯时存在的一种或多种组分分离的异戊二烯。在一些方面，异戊二烯的至少约20重量％不含产生异戊二烯时存在的其他组分。在各个方面，异戊二烯的纯度为至少或为约25重量％、30重量％、40重量％、50重量％、60重量％、70重量％、75重量％、80重量％、90重量％、95重量％或99重量％。可以用任何合适的方法分析纯度，例如，通过柱层析、HPLC分析或GC-MS分析。

在一些方面，将移除异戊二烯的一个或多个回收步骤后剩余的气相的至少一部分回收利用，方式是将气相引入细胞培养系统(诸如发酵罐)以产生异戊二烯。

在一些实施例中，工业酶的回收可使用本领域技术人员已知的任何方法和/或以下专利中公开的任何示例性方案：美国专利申请公布No.2009/0311764、2009/0275080、2009/0252828、2009/0226569、2007/0259397和美国专利No.7,629,451、7,604,974、7,541,026和7,527,959以及对于类药剂营养品(参见，例如，美国专利No.7,622,290)和抗微生物剂(参见，例如，美国专利申请公布No.2009/0275103)。

以下实例的提供仅用于说明性目的，并不旨在限制本发明。

实例

实例1：方法和材料

用于本文所述的实例的细菌菌株列于下表1中。

表1：细菌菌株

所有质粒在大肠杆菌TOP10细胞中构建，并且列于表2中。

表2：质粒

实例2：梭菌中核酸内切酶的鉴定

为鉴定乙酸梭菌中的活性限制性核酸内切酶，通过离心收集AcM液体培养基(表3)中生长的野生型细菌的过夜培养物，并重悬于包含溶菌酶、青霉素G和0.6M蔗糖的溶液中，以诱导原生质体形成。在数小时后，使悬浮的原生质体通过离心经受低渗裂解，并重悬于包含100mMTrispH7.4、50mMNaCl和1mMPMSF的缓冲液中。通过离心移除裂解的细胞，将上清液用于所有后续实验，以检验和鉴定核酸内切酶活性。所用的所有技术和方法均遵循标准微生物学和分子生物学操作。

表3：AcM配方

组分	1L AcM中的量
		NH4Cl	10ml
KH2PO4	3.3ml
		K2HPO4	4.5ml
MgSO4·7H2O	1ml
		半胱氨酸盐酸盐	10ml
Wolfe矿物质溶液	20ml
		Wolfe维生素溶液	20ml
刃天青(0.1％溶液)	1ml
		NaHCO3	10g
酵母提取物	2g
		pH	7.4
H2O	至1L

实例3：限制性核酸内切酶的DNA识别序列的鉴定

将质粒pMCS244(一种用于转化大肠杆菌以赋予红霉素抗性的erm^R载体)与1μl乙酸梭菌裂解物(溶解于NEB缓冲液2，最终体积为20μl)一起在30℃下温育30分钟，通过凝胶电泳(E-gel，生命技术公司(LifeTechnologies))观察限制性消化图案。观察到离散的限制性图案(图12A)，根据限制性酶常规命名法，未鉴定的乙酸梭菌核酸内切酶称为“CacI”。还相对于pMCS244中的HindIII和ApaLI限制性酶切割位点(图12A，分别为第4和5道)标绘了CacI切割位点。HindIII和ApaLI是商购获得的限制性核酸内切酶，分别具有公认的DNA识别序列AAGCTT和GTGCAC。限制性图谱通过以下方法进一步改善：使用引物M13R和oMCS25(表4)生成线性PCR产物，经受乙酸梭菌裂解物的消化，并确定所有切割位点相对于HindIII的邻近度。图12B示出了PCR产物的限制性消化图案。使用该序列信息，将识别序列CCWGG(W＝T或A)鉴定为乙酸梭菌裂解物中存在的CacI酶的识别位点。邻近HindIII识别序列AAGCTT的CCTGG序列(SEQIDNO:10)示于图13中。

因此，本实例示出了乙酸梭菌裂解物中存在的限制性核酸内切酶CacI的DNA识别序列CCWGG(W＝T或A)的鉴定。

表4.引物名称和序列

实例4：乙酸梭菌甲基转移酶(M.CacI,RYBO02455)的鉴定及其活性表 征

乙酸梭菌开放阅读框RYBO02455(SEQIDNO:2)编码与变异微球菌(Micrococcusvarians)甲基转移酶M.MvaI同源的酶，该酶将甲基转移到识别序列CCWGG(W＝T或A)的第二个胞嘧啶残基的4-氨基部分上(Butkusetal.,1985,Nucl.AcidsRes.,Vol.13,No.16:5727-5746(Butkus等人，1995年，《核酸研究》，第13卷，第16期，第5727-5746页))。为测定RYBO02455的蛋白质产物是否能甲基化CCWGG，从而保护该识别序列免受乙酸梭菌裂解物中CacI活性的切割，使RYBO02455的编码序列通过DNA2.0公司进行密码子优化，以在大肠杆菌中表达，并通过GeneArt无缝克隆(生命技术公司(LifeTechnologies))克隆到pBAD33阿拉伯糖诱导型载体中，以创建pDW268质粒。所用的引物提供于表4中，pDW268的质粒图谱及其DNA序列分别示于图23和图24A-C(SEQIDNO.14)中。

然后将pDW268与pMCS244一起共转化到大肠杆菌Top10化学感受态细胞(生命技术公司(LifeTechnologies))中。细胞在具有适当抗生素的LB中生长过夜，第二天以1:1的比率返稀释到新鲜培养基中，并用阿拉伯糖诱导(将120μl15％w/v溶液加入5mlLB)3小时。然后纯化质粒(凯杰公司(Qiagen))，并经受乙酸梭菌裂解物的切割。图25示出，RYBO02455甲基化的DNA耐受CacI的切割，因为pMCS244在乙酸梭菌裂解物中温育后可再转化到大肠杆菌中。相反地，图26示出，在乙酸梭菌裂解物中温育后，由于被CacI的核酸内切酶活性完全切割，用未经甲基化的pMCS244转化大肠杆菌细胞是不可能的。根据限制修饰系统中的甲基转移酶的常规命名系统，将RYBO02455编码的酶命名为“M.CacI”。

实例5：编码CacI限制性核酸内切酶的开放阅读框(ORF)的鉴定

RYBO02454是与RYBO02455(M.CacI)紧邻的并且以相反方向转录的ORF。RYBO02454编码与来自变异微球菌的限制性核酸内切酶M.MvaI具有低序列同一性的酶，该酶切割CCWGG。由于RYBO02454邻近M.CacI，与已知可切割CCWGG识别序列的酶同源性，以及限制性酶/甲基化酶对将共定位在细菌基因组中的趋势，它被视为编码乙酸梭菌裂解物中的限制性酶CacI的候选物。

实例6：CacI抗性质粒pDW265的构建

为确定靶向CCWGG的CacI在乙酸梭菌裂解物中是否为主要的限制性核酸内切酶活性，使用GeneArt无缝克隆试剂盒(生命技术公司(LifeTechnologies))和QuikChangePCR诱变(Stratagene公司(Stratagene))二者，根据制造商推荐的方案(参见表4的引物)组装其中全部4个经鉴定的CCWGG识别位点均发生突变的质粒pDW265。pDW265的质粒图谱提供于图14中，pDW265的DNA序列提供于图15A(SEQIDNO.11)中。

图16示出了限制性核酸内切酶分析结果，该分析使用对照质粒pMCS244或乙酸梭菌裂解物、HindIII限制性核酸内切酶或它们二者处理的pDW265质粒(全部四个CCWGGCacIDNA识别位点均发生突变)进行。第1道：RocheDNA分子量标准X；第2道：对照质粒pMCS244；第3道：未经处理的pDW265质粒；第4道：乙酸梭菌裂解物处理的pMCS244对照；第5道：乙酸梭菌裂解物处理的pDW265质粒；第6道：HindIII处理的pMCS244；第7道：HindIII处理的pDW265；第8道：乙酸梭菌裂解物和HindIII二者处理的pMCS244质粒；第9道：乙酸梭菌裂解物和HindIII二者处理的pDW265。

图16的第5、7和9道示出，pDW265与乙酸梭菌裂解物一起温育时(第5道)、与HindIII一起温育时(第7道)或与它们二者一起温育时(第9道)耐受切割。相反地，图16还示出，除仍包含全部4个经鉴定的CCWGG识别位点之外，与pDW265相同的质粒pMCS244与乙酸梭菌裂解物(将第2道的未处理的pMCS244与第4道的乙酸梭菌处理的pMCS244比较)、HindIII(第6道)或它们二者(第8道)一起温育时不耐受切割。

然后，如上所述，将pDW265和pMCS244与乙酸梭菌裂解物一起温育，并根据制造商推荐的方案转化到Top10化学感受态大肠杆菌细胞(生命技术公司(LifeTechnologies))中。第二天，存在用pDW265转化的红霉素抗性菌落(图17)，而完全不存在用pMCS244转化的抗性菌落(图18)，从而确认，保护了pDW265免受乙酸梭菌裂解物的切割，所述乙酸梭菌裂解物包含特异性识别CCWGG的CacI。

实例7：接合大肠杆菌乙酸梭菌穿梭粒pDW280的构建

为成功用异源DNA转化乙酸梭菌，首先构建用于在大肠杆菌中传播的穿梭载体。大肠杆菌和各种梭菌菌种之间的一系列模块化穿梭载体(称为“pMTL80000系列”)的构建在Heapetal.,2009JournalofMicrobiologicalMethods,Vol.78:79-85(Heap等人，2009年，《微生物学方法杂志》，第78卷，第79-85页)中有所描述。这些pMTL80000载体携带四个革兰氏阳性复制子中的一者、大肠杆菌p15A或ColE1复制起点、具有侧翼转录终止子的多克隆位点以及抗生素抗性标记catP、ermB、aad9或tetA。一些载体还携带生孢梭菌铁氧还蛋白启动子(Pfdx)和核糖体结合位点(RBS)或丙酮丁醇梭菌硫解酶启动子和RBS以用于基因表达。

为创建穿梭载体pDW280，使用表4中所示的引物对(例如，GACA1_1203For和GACA1_1203Rev)通过PCR(PfuUltraII，安捷伦科技公司(AgilentTechnologies))扩增pMCS203(pMTL85151)的质粒骨架。pMCS203的质粒图谱和DNA序列分别提供于图8和图9A-B。pCA1质粒使用所示的引物对(例如，GACA1_1PlasmidFor和GACA1_1PlasmidRev，如表4中所列出)扩增。pCA1的质粒图谱和DNA序列分别提供于图6和图7A-B。通过凝胶电泳纯化(凯杰公司(Qiagen))适当分子量的PCR产物，并使用GeneArt无缝克隆试剂盒(生命技术公司(LifeTechnologies))进行组合。然后，根据制造商推荐的方案，将这些PCR产物转化到化学感受态大肠杆菌TOP10细胞(生命技术公司(LifeTechnologies))中。回收细胞并接种于选择性培养基上，选择具有氯霉素抗性的转化体用于进一步分析。使多个单菌落在选择性LB培养基中生长过夜，第二天纯化质粒(凯杰公司(Qiagen))，通过凝胶电泳将纯化质粒的分子量与亲代pCA1质粒比较。这得到质粒pDW264。如图20中示出的pDW264质粒图谱所示，pDW264穿梭载体包含天然乙酸梭菌pCA1质粒和DNA盒，所述DNA盒允许在大肠杆菌中复制、接合转移以及耐受抗生素氯霉素。pDW264的DNA序列示于图22A-C中。

然后，根据制造商推荐的方案用FseI和PmeI限制性酶(新英格兰生物实验室(NewEnglandBiolabs))切割pDW264，以移除氯霉素抗性盒。然后，将这些载体连接(T4连接酶，新英格兰生物实验室(NEB))到红霉素抗性盒，并使用标准分子生物学技术转化到Top10化学感受态大肠杆菌细胞(生命技术公司(LifeTechnologies))中，所述红霉素抗性盒通过FseI、PmeI和AscI限制性消化从模板pDW265分离。所得的接合穿梭质粒pDW280包含整个乙酸梭菌pCA1天然序列、转移起点、大肠杆菌复制起点和红霉素抗性盒。pDW280的质粒图谱和序列分别提供于图27和图28A-C。

实例8：接合大肠杆菌乙酸梭菌穿梭质粒pMCS537、pMCS244和 pMCS245的构建

将接合穿梭质粒pDW280(图27中示出了未修饰的形式)通过移除其四个假定蛋白，以及通过移除repB下游的转座酶开放阅读框进行修饰，从而创建较小的接合大肠杆菌-乙酸梭菌穿梭质粒pMCS537。简而言之，将质粒pDW280使用引物oMCS426和oMCS427(表4)通过PCR扩增，然后纯化并使用InvitrogenGeneArt无缝克隆试剂盒进行自我连接。

pMCS444和pMCS445通过用质粒pMCS200和pMCS201上的emR盒替换catP盒创建。这使用针对模块化质粒收集(clostron.com)所述的或如Heapetal.,2009(Heap等人，2009年)所指出的消化-连接方法进行。pMCS444的质粒图谱示于图49中，pMCS444的DNA序列提供于图50中，而pMCS445的质粒图谱示于图51中，pMCS445的DNA序列提供于图52中。

实例9：接合大肠杆菌杨氏梭菌穿梭质粒pMCS200和pMCS201的 创建

为成功用异源DNA转化杨氏梭菌，首先构建用于在大肠杆菌中传播的穿梭载体。大肠杆菌和各种梭菌菌种之间的一系列模块化穿梭载体(称为“pMTL80000系列”)的构建在Heapetal.,2009JournalofMicrobiologicalMethods,Vol.78:79–85(Heap等人，2009年，《微生物学方法杂志》，第78卷，第79-85页)中有所描述。这些pMTL80000载体携带四个革兰氏阳性复制子中的一者、大肠杆菌p15A或ColE1复制起点、具有侧翼转录终止子的多克隆位点以及抗生素抗性标记catP、ermB、aad9或tetA。一些载体还携带生孢梭菌铁氧还蛋白启动子(Pfdx)和核糖体结合位点(RBS)或丙酮丁醇梭菌硫解酶启动子和RBS以用于基因表达。

将载体pMTL82151重命名为pMCS200，它携带pCB102革兰氏阳性复制起点、catP氯霉素抗性标记和ColE1大肠杆菌复制起点。pMCS201/pMTL83151的质粒图谱提供于图32中，DNA序列提供于图33A-B和SEQIDNO:17中。

将载体pMTL83151重命名为pMCS201，它携带pCB102革兰氏阳性复制起点、catP氯霉素抗性标记和ColE1大肠杆菌复制起点。pMCS201/pMTL83151的质粒图谱提供于图34中，DNA序列提供于图35A-B和SEQIDNO:18中。

实例10：通过接合转移(pDW268与pDW280或与pMCS537)转化乙 酸梭菌

接合转移涉及通过直接细胞间接触将DNA从一个细菌细胞转移到另一个细菌细胞。用于本专利申请的实例的动员供体菌株是大肠杆菌S17-1菌株，它包含RP4质粒整合到其染色体DNA中的衍生物，并且缺乏大肠杆菌K12-特异性DNA限制性酶，从而允许外源克隆DNA的有效摄入(McFarlaneetal.,1987,JournalofMicrobiologicalMethods,Vol.6:301-305(McFarlane等人，1987年，《微生物学方法杂志》，第6卷，第301-305页))。RP4的oriT位点是接合转移起点，对应于单链从供体转移到受体的准备中使DNA双链形成切口的位点(Williametal.,1990,JournalofGeneralMicrobiology,Vol.136:819-826(William等人，1990年，《普通微生物学杂志》，第136卷，第819-826页)；Burkhardtetal.,1979,JournalofGeneralMicrobiology,Vol.114:341-348(Burkhardt等人，1979年，《普通微生物学杂志》，第114卷，第341-348页))。大肠杆菌S17-1菌株还包含T7n转座子的插入，这导致该菌株对甲氧苄氨嘧啶的抗性和对低水平链霉素的抗性。

为了生成能够在大肠杆菌中甲基化并且能够从大肠杆菌接合到乙酸梭菌的大肠杆菌S17-1菌株，用编码阿拉伯糖诱导型M.CacI的质粒pDW268和pDW280或质粒pMCS537共转化(使用标准技术)大肠杆菌S17-1细胞。简而言之，使具有pDW268甲基化质粒和pDW280或pMCS537穿梭质粒二者的S17-1菌株在包含适当抗生素的液体LB培养基中过夜生长，第二天稀释到新鲜培养基中。在指数生长中期，OD600大约0.6时，通过离心收集5ml细胞，在无抗生素的液体LB培养基中洗涤三次，在接合之前重悬于含12μl15％阿拉伯糖溶液的250μlLB中。同时，通过离心收集溶于液体AcM培养基中的乙酸梭菌培养物，并重悬于100μl液体AcM中。然后将大肠杆菌细胞带入厌氧室，混合细胞悬浮液(各100μl)，并且一起接种于AcM固体培养基平板上。第二天，从接合平板的表面刮下细胞，并接种于包含萘啶酸(10μg/ml)和红霉素(5μg/ml)的新鲜AcM平板上，选择阳性转化体。使红霉素和萘啶酸抗性菌落连续传代培养，以确认转化。图29示出了生长于含有红霉素和萘啶酸的平板上的多次传代乙酸梭菌细胞。

通过以下方法进一步验证转化的乙酸梭菌菌株：在LB上划线接种并进行有氧生长测试(乙酸梭菌将不在有氧条件下生长)，从转化的乙酸梭菌菌株纯化质粒(凯杰公司(Qiagen))，再转化到大肠杆菌Top10化学感受态细胞中，从再转化的大肠杆菌纯化质粒，并通过完全测序进行确认(昆泰锐生物科学公司(QuintaraBioSciences))。为进一步确认，从转化的乙酸梭菌菌株分离pDW280质粒，使用引物oMCS418至oMCS423(列于表4中)从pDW280质粒扩增PCR产物，确认了分别存在整个异源序列、乙酸梭菌复制起点和红霉素抗性盒(图18)。

实例11：通过接合转移(pDW268与pMCS444或与pMCS445)转化 乙酸梭菌

为了生成能够在大肠杆菌中甲基化并且能够从大肠杆菌接合到乙酸梭菌的大肠杆菌S17-1菌株，用编码阿拉伯糖诱导型M.CacI的质粒pDW268和pMCS444或质粒pMCS445共转化(使用标准技术)大肠杆菌S17-1细胞。使具有pDW268甲基化质粒和pMCS444或pMCS445穿梭质粒二者的S17-1菌株在包含适当抗生素的液体LB培养基中过夜生长，第二天稀释到新鲜培养基中。在指数生长中期，OD600大约0.6时，通过离心收集5ml细胞，在无抗生素的液体LB培养基中洗涤三次，在接合之前重悬于含12μl15％阿拉伯糖溶液的250μlLB中。同时，通过离心收集溶于液体AcM培养基中的乙酸梭菌培养物，并重悬于100μl液体AcM中。然后将大肠杆菌细胞带入厌氧室，混合细胞悬浮液(各100μl)，并且一起接种于AcM固体培养基平板上。第二天，从接合平板的表面刮下细胞，并接种于包含萘啶酸(10μg/ml)和红霉素(5μg/ml)的新鲜AcM平板上，以选择阳性转化体。使红霉素和萘啶酸抗性菌落连续传代培养，以确认转化。

通过以下方法进一步验证转化的乙酸梭菌菌株：在LB上划线接种并进行有氧生长测试(乙酸梭菌将不在有氧条件下生长)，从转化的乙酸梭菌菌株纯化质粒(凯杰公司(Qiagen))，再转化到大肠杆菌Top10化学感受态细胞中，从再转化的大肠杆菌纯化质粒，并通过完全测序进行确认(昆泰锐生物科学公司(QuintaraBioSciences))。

实例10和11一起示出了四种质粒(pDW280、pMCS537、pMCS444和pMCS445)成功转化到乙酸梭菌中，所述质粒总共具有三个不同的复制起点。

实例12：乙酸梭菌转化方法的比较

根据Allocketal.,1982，“Clostridiumacetobutylicumprotoplastformationandregeneration，”AppliedEnvironmentalMicrobiology,Vol.43,No.3:719-721(Allock等人，1982年，“丙酮丁醇梭菌原生质体形成和再生”，《应用环境微生物学》，第43卷，第3期，第719-721页)的方法生成和回收乙酸梭菌的原生质体。

如表5所示，申请人测试了多种转化乙酸梭菌的方法，包括：(1)原生质体的电穿孔，根据Romero等人描述的转化枯草芽孢杆菌原生质体的方法；(2)聚乙二醇(PEG)介导的转化，根据Chang和Cohen所述的转化枯草芽孢杆菌原生质体的方法；(3)脂质体介导的转化(使用DOTAP)，根据Metcalf等人的转化噬乙酸甲烷八叠球菌(Methanosarcinaacetivorans)的方法以及(4)接合转移质粒pDW268和pDW280或pMCS537，如本专利申请的实例9所述。

表5尝试使用各种方法转化乙酸梭菌的结果

只有从具有阿拉伯糖诱导型质粒pDW268和接合穿梭质粒pDW280(或较小接合穿梭质粒pMCS537或pMCS444)的大肠杆菌接合(如申请人在本专利申请的实例9和10中所述)才能成功实现乙酸梭菌的转化。不能使用原生质体电穿孔、PEG介导的原生质体转化或脂质体介导的转化成功获得乙酸梭菌转化体。另外，不能使用营养细胞电穿孔成功获得乙酸梭菌转化体。

实例9和10示出了四种质粒(pDW280、pMCS537、pMCS444和pMCS445)成功转化到乙酸梭菌中，这些质粒中的三个具有不同的复制起点(pDW280和pMCS537具有repB复制起点，而pMCS444具有repA复制起点，pMCS445具有repH复制起点)。

实例13：通过接合转移(pMCS466与pMCS200或与pMCS201)转化 杨氏梭菌

为了生成能够在大肠杆菌中甲基化并且能够从大肠杆菌接合到杨氏梭菌的大肠杆菌S17-1菌株，用pMCS466和pMCS200或质粒pMCS201共转化(使用标准技术)大肠杆菌S17-1细胞。质粒pMCS466编码杨氏梭菌甲基转移酶，该酶保护DNA免受内源性杨氏梭菌限制修饰系统的降解。为创建质粒pMCS466，用引物o107和o108(表4)PCR扩增质粒pMCljS。用引物o105和o106(表4)从质粒pMCS94扩增羧苄青霉素抗性盒。用无缝克隆方法(英杰公司(invitrogen))使两个PCR产物退火，以创建质粒pMCljS的衍生物-质粒pMCS466，其中抗性标记由壮观霉素改为羧苄青霉素。

使具有pMCS466甲基化质粒和pMCS200或pMCS201穿梭质粒二者的S17-1菌株在包含适当抗生素的液体LB培养基中过夜生长，第二天稀释到新鲜培养基中。在指数生长中期，OD₆₀₀大约0.6时，通过离心收集5ml细胞，在无抗生素的液体LB培养基中洗涤三次，在接合之前重悬于含12μl15％阿拉伯糖溶液的250μlLB中。同时，通过离心收集溶于液体MES-F培养基中的杨氏梭菌培养物，并重悬于100μl液体MES-F中。然后将大肠杆菌细胞带入厌氧室，混合细胞悬浮液(各100μl)，并且一起接种于MES-F固体培养基平板上。第二天，从接合平板的表面刮下细胞，并接种于包含萘啶酸(10μg/ml)和适当抗生素的新鲜MES-F平板上，以选择阳性转化体。使抗生素和萘啶酸抗性菌落连续传代培养，以确认转化。

通过以下方法进一步验证转化的杨氏梭菌菌株：从转化的杨氏梭菌菌株纯化质粒(凯杰公司(Qiagen))，再转化到大肠杆菌Top10化学感受态细胞中，从再转化的大肠杆菌纯化质粒，并通过凝胶电泳确认。

本实例示出了用两种质粒成功转化了杨氏梭菌，这些质粒具有不同的复制起点：(1)pMCS200，具有repA复制起点(也称为pBP1)和(2)pMCS201，具有repH复制起点(也称为pCB102)。

实例14：测定抗生素对梭菌的最小抑制浓度(MIC)

最小抑制浓度(MIC)是确定对生物体的生长具有抑制作用的抗生素最低浓度。甲砜霉素和红霉素对乙酸梭菌(液体AcM培养基中)和杨氏梭菌(液体MES-F或MES-X培养基(表6)中)的最小抑制浓度通过系列稀释掺有抗生素的每种菌株特定的培养基而凭经验确定。起始浓度为30μg/ml。将乙酸梭菌过夜培养物的1:20体积种菌添加到每个系列稀释液中，并使之生长过夜。测量每个样品的OD₆₀₀，将MIC确定为未观察到过夜生长的抗生素最低浓度。乙酸梭菌的结果示于图36A中。杨氏梭菌的结果示于图38A中。

为确定琼脂固化平板中甲砜霉素或红霉素的MIC，将系列稀释的抗生素制成熔化琼脂培养基，起始浓度为30μg/ml。将培养基倾入皮氏培养皿中，使其固化，然后转移到厌氧室，使其平衡48小时。将10μl过夜培养物样品涂覆到每个琼脂平板上，并使其生长48小时。MIC是未观察到生长的抗生素最低浓度。乙酸梭菌(生长于AcM培养基上)的结果示于图36B中，杨氏梭菌(生长于MES-F培养基(在表6和7中描述)上)的结果示于图38B中。

表6：MES-果糖(MES-F)或MES-木糖(MES-X)配方

*为配制MES-X培养基，用10克木糖替代10克果糖。

表7：用于MES-F配方的杨氏梭菌痕量金属混合物

实例15：含ispS的穿梭质粒pMCS537-IspS接合转移到乙酸梭菌中

将pMCS537穿梭载体修饰为包括截短的、密码子优化的白杨(Poplusalba)ispS(异戊二烯合酶)基因拷贝，从而创建穿梭质粒pMCS537-IspS，并通过接合转移转化到乙酸梭菌中。

用编码阿拉伯糖诱导型M.CacI的质粒pDW268和pMCS537-IspS质粒共转化大肠杆菌接合转移菌株S17-1，从而生成能够在大肠杆菌中甲基化并且能够从大肠杆菌接合到乙酸梭菌的大肠杆菌S17-1菌株。

使具有pDW268甲基化质粒和pMCS537-IspS穿梭质粒二者的S17-1菌株在包含适当抗生素的液体LB培养基中过夜生长，第二天稀释到新鲜培养基中。在指数生长中期，OD600大约0.6时，通过离心收集，在无抗生素的液体LB培养基中洗涤三次，在接合之前重悬于含12μl15％阿拉伯糖溶液的250μlLB中。同时，通过离心收集溶于液体AcM培养基中的乙酸梭菌培养物，并重悬于100μl液体AcM中。然后将大肠杆菌细胞带入厌氧室，混合细胞悬浮液(各100μl)，并且一起接种于AcM固体培养基平板上。第二天，从接合平板的表面刮下细胞，并接种于包含萘啶酸(10μg/ml)和适当抗生素的新鲜平板上，选择阳性转化体。使适当抗生素和萘啶酸抗性菌落连续传代培养，以确认转化。通过以下方法进一步验证转化的乙酸梭菌菌株：在LB上划线接种并进行有氧生长测试(乙酸梭菌将不在有氧条件下生长)，从转化的乙酸梭菌菌株纯化质粒(凯杰公司(Qiagen))，再转化到大肠杆菌Top10化学感受态细胞中，从再转化的大肠杆菌纯化质粒，并通过完全测序进行确认(昆泰锐生物科学公司(QuintaraBioSciences))。为进一步确认，从转化的乙酸梭菌菌株分离质粒，从该质粒扩增PCR产物，确认分别存在整个异源序列、乙酸梭菌复制起点、白杨ispS基因和红霉素抗性盒。

实例16：用pMCS537-IspS转化乙酸梭菌并生长于果糖上生成异戊二 烯

使具有穿梭质粒pMCS537-IspS的乙酸梭菌生长于补充有果糖的DSZM培养基135中，生成异戊二烯。在生长后，通过固相微萃取(SPME)顶空取样，使用本领域已知的软件提取异戊二烯特征性m/z67离子。使用经认证的异戊二烯标准品确认光谱和保留时间，预期异戊二烯洗脱时间(以异戊二烯标准品显示)处的峰值将显示，转化的乙酸梭菌在果糖上生长时生成可检测水平的异戊二烯。

实例17：通过接合转移(pDW268与pMCS200-A1)转化杨氏梭菌

为提高野生型杨氏梭菌的乙醇生成水平，对pMCS200穿梭载体进行修饰(例如，使用本文所公开的任何技术)以包括异源醛脱氢酶和醇脱氢酶基因，从而创建穿梭载体pMCS200-A1。异源基因来自另一种梭菌生物体，或来自已知具有这两个基因的任何生物体。为了生成能够在大肠杆菌中甲基化并且能够从大肠杆菌接合到杨氏梭菌的大肠杆菌S17-1菌株，用编码阿拉伯糖诱导型M.CacI的质粒pDW268和pMCS200-A1共转化大肠杆菌S17-1细胞。简而言之，使具有pDW268甲基化质粒和pMCS200-A1穿梭质粒二者的S17-1菌株在包含适当抗生素的液体LB培养基中过夜生长，第二天稀释到新鲜培养基中。在指数生长中期，通过离心收集细胞，在无抗生素的液体LB培养基中洗涤三次，在接合之前重悬于含12μl15％阿拉伯糖溶液的250μlLB中。同时，通过离心收集溶于液体MES-F培养基(表6和7)中的杨氏梭菌培养物，并重悬于100μl液体MES-F中。将大肠杆菌细胞带入厌氧室，混合细胞悬浮液，并且一起接种于MES-F固体培养基平板上。第二天，从接合平板的表面刮下细胞，并接种于包含萘啶酸(10μg/ml)和适当抗生素的新鲜MES-F平板上，以选择阳性转化体。使适当抗生素和萘啶酸抗性菌落连续传代培养，以确认转化。

通过以下方法进一步验证转化的杨氏梭菌菌株：从转化的杨氏梭菌菌株纯化质粒(凯杰公司(Qiagen))，再转化到大肠杆菌Top10化学感受态细胞中，从再转化的大肠杆菌纯化质粒，随后进行凝胶电泳。

实例18：用pMCS200-A1转化杨氏梭菌并生长于果糖上生成乙醇

具有穿梭质粒pMCS200-A1的杨氏梭菌在MES-F培养基(表6和7)中生长，以生成乙醇。在生长后，通过固相微萃取(SPME)分析样品，使用本领域已知的软件提取乙醇特征性m/z离子。使用经认证的乙醇标准品确认光谱和保留时间，预期乙醇洗脱时间(以标准品显示)处的峰值显示，转化的杨氏梭菌在果糖上生长时生成可检测水平的乙醇。预期用pMCS200-A1转化的乙酸梭菌生长于果糖上生成的乙醇多于未用pMCS200-A1转化的野生型乙酸梭菌。

Claims (50)

1.一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸与SEQIDNO:1具有至少90％的序列同一性，其中所述多核苷酸编码具有甲基转移酶活性的多肽。

2.根据权利要求1所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸是SEQIDNO:2。

3.根据权利要求1所述的多核苷酸，其中所述所编码的多肽在包含CCWGG的序列处使多核苷酸甲基化。

4.根据权利要求3所述的多核苷酸，其中所述包含CCWGG的序列选自CCAGG(SEQIDNO:9)和/或CCTGG(SEQIDNO:10)。

5.根据权利要求1所述的多核苷酸，其中所述所编码的多肽在SEQIDNO:9和/或SEQIDNO:10处使多核苷酸甲基化。

6.一种包含根据权利要求1-5中任一项所述的多核苷酸的质粒，所述多核苷酸可操作地连接至一种或多种控制序列，使得所述所编码的多肽能够在表达宿主中表达。

7.根据权利要求6所述的质粒，其中所述表达宿主是大肠杆菌(E.coli)。

8.根据权利要求6所述的质粒，其中所述质粒还包含SEQIDNO:14。

9.根据权利要求6-8中任一项所述的质粒，其中所述质粒转化到大肠杆菌(E.coli)S17-1细胞。

10.一种包含根据权利要求1-5所述的多核苷酸中的任一者的重组宿主细胞。

11.一种包含根据权利要求5-8所述的质粒中的任一者的重组宿主细胞。

12.一种分离的多肽，所述多肽包含与SEQIDNO:3具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列，其中所述多肽能够在包含CCWGG的序列处使多核苷酸甲基化。

13.根据权利要求12所述的多肽，其中所述多肽能够在包含SEQIDNO:9和/或SEQIDNO:10的序列处使多核苷酸甲基化。

14.根据权利要求12所述的多肽，其中所述多肽能够在SEQIDNO:9和/或SEQIDNO:10处使多核苷酸甲基化。

15.一种分离的多肽，所述多肽包含与SEQIDNO:3具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列，其中所述多肽能够在包含CCWGG的序列处使多核苷酸甲基化。

16.根据权利要求15所述的多肽，其中所述多肽能够在包含SEQIDNO:9和/或SEQIDNO:10的序列处使多核苷酸甲基化。

17.根据权利要求15所述的多肽，其中所述多肽能够在SEQIDNO:9和/或SEQIDNO:10处使多核苷酸甲基化。

18.根据权利要求15所述的多肽，其中所述多肽是SEQIDNO3。

19.一种由根据权利要求1-5所述的多核苷酸中的任一者生成的分离的多肽，其中所述多肽具有甲基转移酶活性。

20.一种生成DNA甲基转移酶的方法，所述方法包括：(a)培养重组宿主细胞，所述重组宿主细胞包含根据权利要求1-5中任一项所述的多核苷酸，所述培养在合适的条件下进行，以生成所述所编码的DNA甲基转移酶，以及(b)回收所述DNA甲基转移酶。

21.一种生成重组梭菌(Clostridium)转化体的方法，所述方法包括：

将多核苷酸引入埃希氏菌(Escherichia)宿主细胞，所述多核苷酸编码DNA甲基转移酶，

a)在适于表达所述DNA甲基转移酶的条件下培养所述埃希氏菌(Escherichia)宿主细胞，

b)将所述甲基化的多核苷酸从所述埃希氏菌(Escherichia)宿主细胞转移到梭菌(Clostridium)宿主细胞，其中使用该方法转化的所述细菌选自：乙酸梭菌(Clostridiumaceticum)、杨氏梭菌(Clostridiumljungdahlii)、丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)和合成气发酵梭菌(Clostridiumautoethanogenum)。

22.一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸与SEQIDNO:4具有至少90％的序列同一性，其中所述多核苷酸编码具有核酸内切酶活性的多肽。

23.根据权利要求22所述的多核苷酸，其中所述所编码的多肽能够在包含CCWGG的序列处切割多核苷酸。

24.根据权利要求22所述的多核苷酸，其中所述所编码的多肽能够在包含SEQIDNO:9和/或SEQIDNO:10的序列处切割多核苷酸。

25.根据权利要求22所述的多核苷酸，其中所述所编码的多肽能够在SEQIDNO:9和/或SEQIDNO:10处切割多核苷酸。

26.根据权利要求22所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸是SEQIDNO:4。

27.一种包含根据权利要求22-26中任一项所述的多核苷酸的质粒，所述多核苷酸可操作地连接至一种或多种控制序列，使得所述所编码的多肽能够在表达宿主中表达。

28.根据权利要求27所述的质粒，其中所述所编码的多肽能够在大肠杆菌(E.coli)表达宿主中表达。

29.一种包含根据权利要求22-26所述的多核苷酸中的任一者的重组宿主细胞。

30.一种包含根据权利要求27所述的质粒的重组宿主细胞。

31.一种减少梭菌(Clostridium)宿主细胞中核酸内切酶切割异源核酸的方法，所述方法包括使包含CCWGG的序列甲基化。

32.根据权利要求31所述的方法，其中所述方法包括使所述异源核酸中包含SEQIDNO:9和/或SEQIDNO:10的序列甲基化。

33.根据权利要求31所述的方法，其中所述方法包括使SEQIDNO:9和/或SEQIDNO:10甲基化。

34.根据权利要求31所述的方法，其中所述核酸内切酶与SEQIDNO:5具有至少90％的序列同一性。

35.根据权利要求31所述的方法，其中所述核酸内切酶是SEQIDNO:5。

36.根据权利要求31所述的方法，其中所述甲基转移酶是SEQIDNO:3。

37.一种包含pDW280(SEQIDNO:15)的穿梭质粒。

38.一种包含pMCS537(SEQIDNO:16)的穿梭质粒。

39.一种包含pMCS200(SEQIDNO:17)的穿梭质粒。

40.一种包含pMCS201(SEQIDNO:18)的穿梭质粒。

41.一种包含pMCS444(SEQIDNO:19)的穿梭质粒。

42.一种包含pMCS445(SEQIDNO:20)的穿梭质粒。

43.一种将一种或多种所关注的核酸递送到梭菌(Clostridium)细胞中的方法，所述方法包括以下步骤：

用以下质粒共转化大肠杆菌细胞：

包含多核苷酸的质粒，所述多核苷酸编码具有甲基转移酶活性的多肽，以及

至少一种穿梭质粒，所述穿梭质粒选自pDW280、pMCS537、pMCS200、pMCS201、pMCS444或pMCS445，其中所述穿梭质粒还包含所述一种或多种所关注的核酸；

在允许(a)(1)和(a)(2)接合转移的条件下使步骤(a)的所述大肠杆菌(E.coli)细胞与梭菌(Clostridium)细胞一起培养，从而将一种或多种核酸递送到梭菌(Clostridium)细胞中。

44.根据权利要求43所述的方法，其中所述梭菌(Clostridium)细胞选自：乙酸梭菌(Clostridiumaceticum)、杨氏梭菌(Clostridiumljungdahlii)、丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)和合成气发酵梭菌(Clostridiumautoethanogenum)。

45.根据权利要求43所述的方法，其中所述大肠杆菌(E.coli)细胞是S17-1菌株。

46.一种重组梭菌(Clostridium)细胞，所述重组梭菌细胞包含：

a)包含pDW268(SEQIDNO:14)的质粒，以及

b)至少一种穿梭质粒，所述穿梭质粒选自pDW280(SEQIDNO:15)、pMCS537(SEQIDNO:16)、pMCS200(SEQIDNO:17)、pMCS201(SEQIDNO:18)、pMCS444(SEQIDNO:19)或pMC4245(SEQIDNO:20)，其中所述穿梭质粒还包含一种或多种所关注的核酸。

47.一种重组梭菌(Clostridium)细胞，所述重组梭菌细胞由根据权利要求43所述的方法生成。

48.一种梭菌(Clostridium)表达系统，所述梭菌表达系统用于表达一种或多种所关注的核酸，所述系统包括：

a)包含pDW268(SEQIDNO:14)的质粒，

b)穿梭质粒，所述穿梭质粒选自pDW280(SEQIDNO:15)、pMCS537(SEQIDNO:16)、pMCS200(SEQIDNO:17)、pMCS201(SEQIDNO:18)、pMCS444(SEQIDNO:19)或pMC4245(SEQIDNO:20)，其中所述穿梭质粒还包含一种或多种所关注的用于表达的核酸，

c)埃希氏菌(Escherichia)细胞，所述埃希氏菌细胞能够与梭菌(Clostridium)细胞相互作用，以允许(a)和(b)的转移；以及

d)梭菌(Clostridium)细胞，所述梭菌细胞能够与埃希氏菌(Escherichia)细胞相互作用，使得所述一种或多种核酸在所述梭菌(Clostridium)细胞中表达。

49.根据权利要求48所述的表达系统，其中所述梭菌(Clostridium)细胞选自：乙酸梭菌(Clostridiumaceticum)、杨氏梭菌(Clostridiumljungdahlii)、丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)和合成气发酵梭菌(Clostridiumautoethanogenum)。

50.根据权利要求48所述的表达系统，其中所述梭菌(Clostridium)细胞是乙酸梭菌(Clostridiumaceticum)。