ES2735331T3 - Fosfocetolasas para mejorar la producción de metabolitos derivados de acetil-coenzima A, isopreno, precursores de isoprenoides e isoprenoides - Google Patents

Fosfocetolasas para mejorar la producción de metabolitos derivados de acetil-coenzima A, isopreno, precursores de isoprenoides e isoprenoides Download PDF

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Abstract

Célula recombinante capaz de aumentar el flujo de carbono a través de la ruta de la fosfocetolasa, en la que la célula recombinante comprende (A) (i) una secuencia de ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa, en la que el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 65% con SEQ ID NO: 8 y (ii) uno o más ácidos nucleicos que codifican para uno o más polipéptidos de la ruta de MVA completa, en la que dicha célula recombinante que comprende dicho polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa de (i) tiene un valor de índice de rendimiento mayor de 1,0 en uno o más de los siguientes parámetros: (a) crecimiento celular en glucosa, (b) crecimiento celular en xilosa, (c) producción de acetil-fosfato intracelular 15 o (d) crecimiento celular en glucosa-6-fosfato; o (B) (i) una secuencia de ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido que tiene actividad 20 fosfocetolasa, en la que el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 65% con SEQ ID NO: 8 y (ii) uno o más ácidos nucleicos que codifican para uno o más polipéptidos de la ruta de MVA completa, en la que dicho polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa de (i) tiene un valor de índice de rendimiento mayor de 1,0 en el siguiente parámetro: actividad específica de fructosa-6-fosfato (F6P); en la que el valor de índice de rendimiento es la actividad calculada por unidad en relación con la fosfocetolasa de E. gallinarum de SEQ ID NO: 93.

Description

DESCRIPCIÓN
Fosfocetolasas para mejorar la producción de metabolitos derivados de acetil-coenzima A, isopreno, precursores de isoprenoides e isoprenoides
Referencia cruzada a solicitudes relacionadas
Esta solicitud reivindica prioridad de la solicitud de patente provisional estadounidense n.° 61/810.696, presentada el 10 de abril de 2013y la solicitud de patente provisional estadounidense n.° 61/834.359, presentada el 12 de junio de 2013.
Campo de la invención
Esta presente invención se refiere a células recombinantes cultivadas según se reivindica que comprenden un polipéptido de fosfocetolasa (PKL) heterólogo que son capaces de aumentar la producción de metabolitos derivados de acetil-coenzima A, así como a métodos de producción de y usar los mismos. En algunas realizaciones, las células recombinantes comprenden además uno o más polipéptidos de la ruta del mevalonato (MVA) para la producción de precursores de isoprenoides, isopreno e isoprenoides.
Antecedentes de la invención
La glicólisis permite la conversión metabólica de una fuente de carbono en compuestos intermedios tales como la acetil-coenzima A (acetil-CoA), que es un producto intermedio importante en la síntesis de compuestos biológicos esenciales, incluidos policétidos, ácidos grasos, aminoácidos, vitaminas, isopreno, isoprenoides, compuestos fenólicos y alcaloides. Varios de estos metabolitos derivados de acetil-CoA tienen utilidad industrial. Por ejemplo, el isopreno (2-metil-1,3-butadieno) es el material de partida crítico para una variedad de polímeros sintéticos, de la manera más particular los cauchos sintéticos. El isopreno se puede obtener fraccionando el petróleo; sin embargo, la purificación de este material es costosa y requiere mucho tiempo. El craqueo de petróleo de la corriente de hidrocarburos C5 produce solo alrededor del 15% de isopreno. Cerca de 800.000 toneladas por año de cispoliisopreno se producen a partir de la polimerización del isopreno; la mayor parte de este poliisopreno se usa en la industria de los neumáticos y el caucho. El isopreno también se copolimeriza para su uso como elastómero sintético en otros productos tales como calzado, productos mecánicos, productos médicos, artículos deportivos y látex. El isopreno también puede producirse de manera natural por una variedad de especies microbianas, de plantas y animales. En particular, se han identificado dos rutas para la biosíntesis natural del isopreno: la ruta del mevalonato (MVA) y la ruta alternativa al mevalonato (DXP).
Los isoprenoides también son metabolitos derivados de acetil-CoA que demuestran utilidad industrial. Por ejemplo, los isoprenoides se usan en productos farmacéuticos y como biocombustibles, aditivos alimentarios y otros productos químicos especializados. Se han identificado más de 29.000 compuestos isoprenoides y se descubren nuevos isoprenoides cada año. Los isoprenoides se pueden aislar de productos naturales, tales como microorganismos y especies de plantas que usan moléculas precursoras de isoprenoides como elemento estructural básico para formar las estructuras relativamente complejas de los isoprenoides. Los isoprenoides son vitales para la mayoría de las células y organismos vivos, y proporcionan un medio para mantener el transporte de electrones y la fluidez de la membrana celular. En la naturaleza, los isoprenoides funcionan en papeles tan diversos como pesticidas naturales en las plantas para contribuir a los aromas asociados con la canela, el clavo y el jengibre. Además, las comunidades farmacéuticas y químicas usan isoprenoides como productos farmacéuticos, nutracéuticos, agentes aromatizantes y agentes de control de plagas agrícolas. Debido a su importancia en los sistemas biológicos y su utilidad en una amplia gama de aplicaciones, los científicos han prestado mucha atención a los isoprenoides.
Los desarrollos recientes en la producción de isopreno, moléculas precursoras de isoprenoides e isoprenoides divulgan métodos para la producción de isopreno e isoprenoides a tasas, títulos y purezas que pueden ser suficientes para satisfacer las demandas de procesos comerciales robustos (véase, por ejemplo, la publicación de solicitud de patente internacional n.° WO 2009/076676 A2 y la patente estadounidense n.° 7.915.026); sin embargo, todavía se necesitan rutas alternativas para mejorar la producción y los rendimientos de los mismos.
Por ejemplo, teóricamente, pueden derivarse tres moléculas de acetil-CoA a partir de una única molécula de glucosa en una reacción equilibrada. Sin embargo, los organismos normalmente solo producen hasta dos moléculas de acetil-CoA, y perdiéndose masa restante como CO2. La liberación de CO2 se produce durante la formación de acetil-CoA a partir de piruvato, una reacción catalizada por la piruvato deshidrogenasa. La pérdida de un átomo de carbono da como resultado una disminución de los rendimientos de producción de metabolitos derivados de acetil-CoA, precursores de isoprenoides, isopreno y moléculas de isoprenoides. Una excepción a esta pérdida de reacción es la ruta de Wood-Ljungdahl, que se basa en las enzimas monóxido de carbono deshidrogenasa y acetil-CoA sintasa para reducir el dióxido de carbono a acetil-CoA en acetógenos anaerobios.
El documento US 8415 136 se refiere a la producción de isoprenoides derivados de acetil-coenzima A.
MARTA PAPINI ET AL (Applied Microbiology and Biotechnology, SPRINGER, BERLIN, DE, vol. 95, n.° 4, 26 de febrero de 2012, páginas 1001-1010) se refiere a la caracterización de Saccharomyces cerevisiae recombinante que expresa la ruta de la fosfocetolasa de Aspergillus nidulans .
La entrada de la base de datos UniProt [en línea] 15 de junio de 2010 (15-06-2010), “RecName: completo = Probable fosfocetolasa; EC = 4.1.2,-;”, recuperada a partir del número de registro de EBI UNIPROT: ¡D4SNE7, acceso a la base de datos n.° D4SN E7 se refiere a una secuencia de una fosfocetolasa de Enterococcus faecium. La entrada de la base de datos UniProt [en línea] 22 de noviembre de 2005 (22-11-2005), “Sub-nombre: completo = D-xilulosa 5-fosfato/D-fructosa 6- fosfato fosfocetolasa; etiquetas: fragmento;”, recuperada a partir del número de registro EBI UNIPROT:O3D7K0, acceso a la base de datos n.° Q3D7K0 se refiere a una secuencia de una fosfocetolasa de Streptococcus agalactiae.
Lo que se necesita, por tanto, son células recombinantes que usan un proceso metabólico alternativo que puede producir potencialmente tres moléculas de acetil-CoA a partir de una molécula de glucosa usando una ruta que no se basa en las enzimas de la ruta de Wood-Ljungdahl en la producción de isopreno, moléculas precursoras de isoprenoides e isoprenoides.
La invención descrita en el presente documento aborda estos problemas y también proporciona beneficios adicionales.
A lo largo de toda esta memoria descriptiva, se hace referencia a diversas patentes, solicitudes de patentes y otros tipos de publicaciones (por ejemplo, artículos de revistas).
Sumario de la invención
[1] Una célula recombinante capaz de aumentar el flujo de carbono a través de la ruta de la fosfocetolasa, en la que la célula recombinante comprende
(A)
(i) una secuencia de ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa, en la que el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 65% con SEQ ID NO: 8 y
(ii) uno o más ácidos nucleicos que codifican para uno o más polipéptidos de la ruta de MVA completa, en la que dicha célula recombinante que comprende dicho polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa de (i) tiene un valor de índice de rendimiento mayor de 1,0 en uno o más de los siguientes parámetros: (a) crecimiento celular en glucosa, (b) crecimiento celular en xilosa, (c) producción de acetil-fosfato intracelular o (d) crecimiento celular en glucosa-6-fosfato; o
(B)
(i) una secuencia de ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa, en la que el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 65% con SEQ ID NO: 8 y
(ii) uno o más ácidos nucleicos que codifican para uno o más polipéptidos de la ruta de MVA completa, en la que dicho polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa de (i) tiene un valor de índice de rendimiento mayor de 1,0 en el siguiente parámetro: actividad específica de fructosa-6-fosfato (F6P);
en la que el valor de índice de rendimiento es la actividad calculada por unidad en relación con una fosfocetolasa de E. gallinarum (SEQ ID NO: 93).
[2] La célula recombinante de [1], en la que el polipéptido comprende
(i) una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 23; o
(ii) una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 24; o
(iii) una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 25; o
(iv) una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 26; o
(v) una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 27; o
(vi) una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 28; o
(vii) una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 29; o
(viii) una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 30; o
(ix) una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 31.
[3] Una célula recombinante capaz de aumentar el flujo de carbono a través de la ruta de la fosfocetolasa, en la que la célula recombinante comprende
(A)
(i) una secuencia de ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa, en la que el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 65% con SEQ ID NO: 11 y
(ii) uno o más ácidos nucleicos que codifican para uno o más polipéptidos de la ruta de MVA completa, en la que dicha célula recombinante que comprende dicho polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa de (i) tiene un valor de índice de rendimiento mayor de 1,0 en uno o más de los siguientes parámetros: (a) crecimiento celular en glucosa, (b) crecimiento celular en xilosa, (c) producción de acetil-fosfato intracelular o (d) crecimiento celular en glucosa-6-fosfato; o
(B)
(i) una secuencia de ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa, en la que el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 65% con SEQ ID NO: 11 y
(ii) uno o más ácidos nucleicos que codifican para uno o más polipéptidos de la ruta de MVA completa, en la que dicho polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa de (i) tiene un valor de índice de rendimiento mayor de 1,0 en el siguiente parámetro: actividad específica de fructosa-6-fosfato (F6P);
en la que el valor de índice de rendimiento es la actividad calculada por unidad en relación con una fosfocetolasa de E. gallinarum (SEQ ID NO: 93).
[4] La célula recombinante de [3], en la que el polipéptido comprende
(i) una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 32; o
(ii) una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 33; o
(iii) una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 34; o
(iv) una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 35; o
(v) una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 36; o
(vi) una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 37; o
(vii) una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 38; o
(viii) una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 39; o
(ix) una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 40; o
(x) una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 41; o
(xi) una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 42; o
(xii) una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 43; o
(xiii) una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 44; o
(xiv) una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 45; o
(xv) una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 46.
[5] La célula recombinante de uno cualquiera de [1] -[4], en la que
(i) el cultivo de la célula recombinante en un medio adecuado aumenta uno o más de una cantidad intracelular de eritrosa 4-fosfato, una cantidad intracelular de gliceraldehído 3-fosfato o una cantidad intracelular de fosfato; o
(ii) el polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa es capaz de sintetizar gliceraldehído 3-fosfato y acetil-fosfato a partir de xilulosa 5-fosfato; o
(iii) el polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa es capaz de sintetizar eritrosa 4-fosfato y acetilfosfato a partir de fructosa 6-fosfato.
[6] La célula recombinante de uno cualquiera de [1] -[5], en la que uno o más polipéptidos de la ruta completa del MVA se selecciona de (a) una enzima que condensa dos moléculas de acetil-CoA para formar acetoacetil-CoA; (b) una enzima que condensa acetoacetil-CoA con acetil-CoA para formar HMG-CoA (por ejemplo, HMG sintasa); (c) una enzima que convierte HMG-CoA en mevalonato; (d) una enzima que fosforila mevalonato a mevalonato 5-fosfato; (e) una enzima que convierte mevalonato 5-fosfato en mevalonato 5-pirofosfato; y (f) una enzima que convierte mevalonato 5-pirofosfato en isopentenil pirofosfato.
[7] Una célula recombinante capaz de producir isopreno, en la que la célula recombinante de uno cualquiera de [1 ] -[4] comprende además un ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido de isopreno sintasa, en la que el cultivo de la célula recombinante en un medio adecuado proporciona la producción de isopreno con un valor de índice de rendimiento mayor de 1,0 en uno o más de los siguientes parámetros: (a) rendimiento de isopreno o (b) productividad específica de isopreno.
[8] La célula recombinante de [7], en la que
(i) el ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido de isopreno sintasa codifica para un polipéptido de isopreno sintasa de planta, en la que opcionalmente el polipéptido de isopreno sintasa de planta es un polipéptido de Pueraria o Populus o un híbrido, Populus alba x Populus trémula, o en la que opcionalmente es el polipéptido de isopreno sintasa es de Pueraria montana, Pueraria lobata, Populus tremuloides, Populus alba, Populus nigra o Populus trichocarpa; o
(ii) las células recombinantes comprenden además uno o más ácidos nucleicos que codifican para uno o más polipéptidos de la ruta de 1-desoxi-D-xilulosa 5-fosfato (DXP).
[9] Una célula recombinante capaz de producir.
(A) precursores de isoprenoides, en la que la célula recombinante de uno cualquiera de [1] -[6] se cultiva en un medio adecuado y produce dichos precursores de isoprenoides; o
(B) isoprenoides, en la que la célula recombinante de uno cualquiera de [1] -[6] comprende además un ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido de poliprenil pirofosfato sintasa, en la que el cultivo de la célula recombinante en un medio adecuado proporciona la producción de isoprenoides; o (C) un metabolito derivado de acetil-CoA, en la que el cultivo de la célula recombinante de uno cualquiera de [1] -[6] en un medio adecuado proporciona la producción del metabolito derivado de acetil-CoA.
[10] La célula recombinante de uno cualquiera de [1] -[9], en la que
(i) el ácido nucleico se coloca bajo un promotor inducible o un promotor constitutivo; o
(ii) el ácido nucleico se clona en uno o más plásmidos multicopia; o
(iii) el ácido nucleico se integra en un cromosoma de las células; o
(iv) las células recombinantes son células bacterianas gram-positivas, células bacterianas gramnegativas, células fúngicas, células fúngicas filamentosas, células de algas o células de levadura; o (v) las células recombinantes se seleccionan del grupo que consiste en Corynebacteria, Bacillus subtilis, Streptomyces lividans, Streptomyces coelicolor, Streptomyces griseus, Escherichia coli, Pantoeo citrea, Trichoderma reesei, Aspergillus oryzae, Aspergillus niger, Saccharomyces cerevisiae y Yarrowia lipolytica.
[11] La célula recombinante de [9](B), en la que el isoprenoide
(i) se selecciona de un grupo que consiste en monoterpenos, diterpenos, triterpenos, tetraterpenos, sesquiterpeno y politerpeno; o
(ii) es un sesquiterpeno; o
(iii) se selecciona del grupo que consiste en abietadieno, amorfadieno, careno, a-farneseno, pfarneseno, farnesol, geraniol, geranilgeraniol, linalool, limoneno, mirceno, nerolidol, ocimeno, pachulol, p-pineno, sabineno, y-terpineno, terpindeno y valenceno.
[12] La célula recombinante de [9](C), en la que
(i) el metabolito derivado de acetil-CoA se selecciona del grupo que consiste en policétidos, polihidroxibutirato, alcoholes grasos y ácidos grasos; o
(ii) el metabolito derivado de acetil-CoA se selecciona del grupo que consiste en ácido glutámico, glutamina, aspartato, asparagina, prolina, arginina, metionina, treonina, cisteína, succinato, lisina, leucina e isoleucina; o
(iii) el metabolito derivado de acetil-CoA se selecciona del grupo que consiste en acetona, isopropanol, isobuteno y propeno.
[13] Un método para producir isopreno que comprende: (a) cultivar la célula recombinante de [7] en condiciones adecuadas para producir isopreno y (b) producir isopreno.
[14] Un método de producción de un precursor de isoprenoides que comprende: (a) cultivar la célula recombinante de [9](A) en condiciones adecuadas para producir un precursor de isoprenoides y (b) producir un precursor de isoprenoides.
[15] Un método de producción de un isoprenoide que comprende: (a) cultivar la célula recombinante de [9](B) en condiciones adecuadas para producir un isoprenoide y (b) producir un isoprenoide.
[16] Un método de producción de un metabolito derivado de acetil-CoA que comprende: (a) cultivar la célula recombinante de [9](C) en condiciones adecuadas para producir un metabolito derivado de acetil-CoA y (b) producir un metabolito derivado de acetil-CoA.
La divulgación proporcionada en el presente documento describe, entre otros, células recombinantes cultivadas, composiciones de estas células y métodos de uso de estas células para aumentar la producción de productos intermedios metabólicos tales como eritrosa 4-fosfato (E4P), gliceraldehído 3-fosfato (GAP) y acetil-fosfato (Ac-P), así como para aumentar la producción de precursores de isoprenoides, isopreno, isoprenoides y/o moléculas derivadas de acetil-CoA, tales como aminoácidos.
Por consiguiente, en un aspecto, se proporciona en el presente documento una célula recombinante capaz de aumentar el flujo de carbono a través de la ruta de la fosfocetolasa, en la que la célula recombinante comprende una secuencia de ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa, en la que el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 65% para SEQ ID NO: 1.
En otro aspecto, se proporciona en el presente documento una célula recombinante capaz de aumentar el flujo de carbono a través de la ruta de la fosfocetolasa, en la que la célula recombinante comprende una secuencia de ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa, en la que el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 65% con SEQ ID NO: 2.
En otro aspecto, se proporciona en el presente documento una célula recombinante capaz de aumentar el flujo de carbono a través de la ruta de la fosfocetolasa, en la que la célula recombinante comprende una secuencia de ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa, en la que el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 65% con SEQ ID NO: 3.
En otro aspecto, se proporciona en el presente documento una célula recombinante capaz de aumentar el flujo de carbono a través de la ruta de la fosfocetolasa, en la que la célula recombinante comprende una secuencia de ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa, en la que el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 65% con SEQ ID NO. 4.
En otro aspecto, se proporciona en el presente documento una célula recombinante capaz de aumentar el flujo de carbono a través de la ruta de la fosfocetolasa, en la que la célula recombinante comprende una secuencia de ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa, en la que el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 65% con SEQ ID NO: 5.
En otro aspecto, se proporciona en el presente documento una célula recombinante capaz de aumentar el flujo de carbono a través de la ruta de la fosfocetolasa, en la que la célula recombinante comprende una secuencia de ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa, en la que el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 65% con SEQ ID NO: 6.
En otro aspecto, se proporciona en el presente documento una célula recombinante capaz de aumentar el flujo de carbono a través de la ruta de la fosfocetolasa, en la que la célula recombinante comprende una secuencia de ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa, en la que el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 65% con SEQ ID NO: 7.
En otro aspecto, se proporciona en el presente documento una célula recombinante capaz de aumentar el flujo de carbono a través de la ruta de la fosfocetolasa, en la que la célula recombinante comprende una secuencia de ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa, en la que el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 65% con SEQ ID NO: 8.
En otro aspecto, se proporciona en el presente documento una célula recombinante capaz de aumentar el flujo de carbono a través de la ruta de la fosfocetolasa, en la que la célula recombinante comprende una secuencia de ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa, en la que el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 65% con SEQ ID NO: 9.
En otro aspecto, se proporciona en el presente documento una célula recombinante capaz de aumentar el flujo de carbono a través de la ruta de la fosfocetolasa, en la que la célula recombinante comprende una secuencia de ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa, en la que el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 65% con SEQ ID NO: 10.
En otro aspecto, se proporciona en el presente documento una célula recombinante capaz de aumentar el flujo de carbono a través de la ruta de la fosfocetolasa, en la que la célula recombinante comprende una secuencia de ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa, en la que el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 65% con SEQ ID NO: 11.
En otro aspecto, se proporciona en el presente documento una célula recombinante capaz de aumentar el flujo de carbono a través de la ruta de la fosfocetolasa, en la que la célula recombinante comprende una secuencia de ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa, en la que el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 65% con SEQ ID NO: 12.
En otro aspecto, se proporciona en el presente documento una célula recombinante capaz de aumentar el flujo de carbono a través de la ruta de la fosfocetolasa, en la que la célula recombinante comprende una secuencia de ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa, en la que el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 65% con SEQ ID NO: 13.
En otro aspecto, se proporciona en el presente documento una célula recombinante capaz de aumentar el flujo de carbono a través de la ruta de la fosfocetolasa, en la que la célula recombinante comprende una secuencia de ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa, en la que el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 65% con SEQ ID NO: 14.
En otro aspecto, se proporciona en el presente documento una célula recombinante capaz de aumentar el flujo de carbono a través de la ruta de la fosfocetolasa, en la que la célula recombinante comprende una secuencia de ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa, en la que el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 65% con SEQ ID NO: 15.
En otro aspecto, se proporciona en el presente documento una célula recombinante capaz de aumentar el flujo de carbono a través de la ruta de la fosfocetolasa, en la que la célula recombinante comprende una secuencia de ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa, en la que el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 65% con SEQ ID NO:16
En otro aspecto, se proporciona en el presente documento una célula recombinante capaz de aumentar el flujo de carbono a través de la ruta de la fosfocetolasa, en la que la célula recombinante comprende una secuencia de ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa, en la que el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 65% con SEQ ID NO: 17.
En otro aspecto, se proporciona en el presente documento una célula recombinante capaz de aumentar el flujo de carbono a través de la ruta de la fosfocetolasa, en la que la célula recombinante comprende una secuencia de ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa, en la que el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 65% con SEQ ID NO: 18.
En otro aspecto, se proporciona en el presente documento una célula recombinante capaz de aumentar el flujo de carbono a través de la ruta de la fosfocetolasa, en la que la célula recombinante comprende una secuencia de ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa, en la que el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 65% con SEQ ID NO: 19.
En otro aspecto, se proporciona en el presente documento una célula recombinante capaz de aumentar el flujo de carbono a través de la ruta de la fosfocetolasa, en la que la célula recombinante comprende una secuencia de ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa, en la que el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 65% con SEQ ID NO: 20.
En otro aspecto, se proporciona en el presente documento una célula recombinante capaz de aumentar el flujo de carbono a través de la ruta de la fosfocetolasa, en la que la célula recombinante comprende una secuencia de ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa, en la que el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 65% con SEQ ID NO: 21.
En otro aspecto, se proporciona en el presente documento una célula recombinante capaz de aumentar el flujo de carbono a través de la ruta de la fosfocetolasa, en la que la célula recombinante comprende una secuencia de ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa, en la que el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 65% con SEQ ID NO: 22.
En otro aspecto, se proporciona en el presente documento una célula recombinante capaz de aumentar el flujo de carbono a través de la ruta de la fosfocetolasa, en la que la célula recombinante comprende una secuencia de ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa, en la que el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 65% con SEQ ID NO: 23.
En otro aspecto, se proporciona en el presente documento una célula recombinante capaz de aumentar el flujo de carbono a través de la ruta de la fosfocetolasa, en la que la célula recombinante comprende una secuencia de ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa, en la que el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 65% con SEQ ID NO: 24.
En otro aspecto, se proporciona en el presente documento una célula recombinante capaz de aumentar el flujo de carbono a través de la ruta de la fosfocetolasa, en la que la célula recombinante comprende una secuencia de ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa, en la que el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 65% con SEQ ID NO: 25.
En otro aspecto, se proporciona en el presente documento una célula recombinante capaz de aumentar el flujo de carbono a través de la ruta de la fosfocetolasa, en la que la célula recombinante comprende una secuencia de ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa, en la que el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 65% con SEQ ID NO: 26.
En otro aspecto, se proporciona en el presente documento una célula recombinante capaz de aumentar el flujo de carbono a través de la ruta de la fosfocetolasa, en la que la célula recombinante comprende una secuencia de ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa, en la que el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 65% con SEQ ID NO: 27.
En otro aspecto, se proporciona en el presente documento una célula recombinante capaz de aumentar el flujo de carbono a través de la ruta de la fosfocetolasa, en la que la célula recombinante comprende una secuencia de ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa, en la que el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 65% con SEQ ID NO: 28.
En otro aspecto, se proporciona en el presente documento una célula recombinante capaz de aumentar el flujo de carbono a través de la ruta de la fosfocetolasa, en la que la célula recombinante comprende una secuencia de ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa, en la que el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 65% con SEQ ID NO: 29.
En otro aspecto, se proporciona en el presente documento una célula recombinante capaz de aumentar el flujo de carbono a través de la ruta de la fosfocetolasa, en la que la célula recombinante comprende una secuencia de ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa, en la que el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 65% con SEQ ID NO: 30.
En otro aspecto, se proporciona en el presente documento una célula recombinante capaz de aumentar el flujo de carbono a través de la ruta de la fosfocetolasa, en la que la célula recombinante comprende una secuencia de ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa, en la que el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 65% con SEQ ID NO: 31.
En otro aspecto, se proporciona en el presente documento una célula recombinante capaz de aumentar el flujo de carbono a través de la ruta de la fosfocetolasa, en la que la célula recombinante comprende una secuencia de ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa, en la que el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 65% con SEQ ID NO: 32.
En otro aspecto, se proporciona en el presente documento una célula recombinante capaz de aumentar el flujo de carbono a través de la ruta de la fosfocetolasa, en la que la célula recombinante comprende una secuencia de ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa, en la que el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 65% con SEQ ID NO: 33.
En otro aspecto, se proporciona en el presente documento una célula recombinante capaz de aumentar el flujo de carbono a través de la ruta de la fosfocetolasa, en la que la célula recombinante comprende una secuencia de ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa, en la que el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 65% con SEQ ID NO: 34.
En otro aspecto, se proporciona en el presente documento una célula recombinante capaz de aumentar el flujo de carbono a través de la ruta de la fosfocetolasa, en la que la célula recombinante comprende una secuencia de ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa, en la que el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 65% con SEQ ID NO: 35.
En otro aspecto, se proporciona en el presente documento una célula recombinante capaz de aumentar el flujo de carbono a través de la ruta de la fosfocetolasa, en la que la célula recombinante comprende una secuencia de ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa, en la que el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 65% con SEQ ID NO: 36.
En otro aspecto, se proporciona en el presente documento una célula recombinante capaz de aumentar el flujo de carbono a través de la ruta de la fosfocetolasa, en la que la célula recombinante comprende una secuencia de ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa, en la que el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 65% con SEQ ID NO: 37.
En otro aspecto, se proporciona en el presente documento una célula recombinante capaz de aumentar el flujo de carbono a través de la ruta de la fosfocetolasa, en la que la célula recombinante comprende una secuencia de ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa, en la que el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 65% con SEQ ID NO: 38.
En otro aspecto, se proporciona en el presente documento una célula recombinante capaz de aumentar el flujo de carbono a través de la ruta de la fosfocetolasa, en la que la célula recombinante comprende una secuencia de ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa, en la que el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 65% con SEQ ID NO: 39.
En otro aspecto, se proporciona en el presente documento una célula recombinante capaz de aumentar el flujo de carbono a través de la ruta de la fosfocetolasa, en la que la célula recombinante comprende una secuencia de ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa, en la que el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 65% con SEQ ID NO: 40.
En otro aspecto, se proporciona en el presente documento una célula recombinante capaz de aumentar el flujo de carbono a través de la ruta de la fosfocetolasa, en la que la célula recombinante comprende una secuencia de ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa, en la que el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 65% con SEQ ID NO: 41.
En otro aspecto, se proporciona en el presente documento una célula recombinante capaz de aumentar el flujo de carbono a través de la ruta de la fosfocetolasa, en la que la célula recombinante comprende una secuencia de ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa, en la que el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 65% con SEQ ID NO: 42.
En otro aspecto, se proporciona en el presente documento una célula recombinante capaz de aumentar el flujo de carbono a través de la ruta de la fosfocetolasa, en la que la célula recombinante comprende una secuencia de ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa, en la que el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 65% con SEQ ID NO: 43.
En otro aspecto, se proporciona en el presente documento una célula recombinante capaz de aumentar el flujo de carbono a través de la ruta de la fosfocetolasa, en la que la célula recombinante comprende una secuencia de ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa, en la que el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 65% con SEQ ID NO: 44.
En otro aspecto, se proporciona en el presente documento una célula recombinante capaz de aumentar el flujo de carbono a través de la ruta de la fosfocetolasa, en la que la célula recombinante comprende una secuencia de ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa, en la que el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 65% con SEQ ID NO: 45.
En otro aspecto, se proporciona en el presente documento una célula recombinante capaz de aumentar el flujo de carbono a través de la ruta de la fosfocetolasa, en la que la célula recombinante comprende una secuencia de ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa, en la que el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 65% con SEQ ID NO: 46.
En otro aspecto, se proporciona en el presente documento una célula recombinante capaz de aumentar el flujo de carbono a través de la ruta de la fosfocetolasa, en la que la célula recombinante comprende una secuencia de ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa, en la que el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 65% con SEQ ID NO: 47.
En otro aspecto, se proporciona en el presente documento una célula recombinante capaz de aumentar el flujo de carbono a través de la ruta de la fosfocetolasa, en la que la célula recombinante comprende una secuencia de ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa, en la que el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 65% con SEQ ID NO: 48.
En otro aspecto, se proporciona en el presente documento una célula recombinante capaz de aumentar el flujo de carbono a través de la ruta de la fosfocetolasa, en la que la célula recombinante comprende una secuencia de ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa, en la que el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 65% con SEQ ID NO: 49.
En otro aspecto, se proporciona en el presente documento una célula recombinante capaz de aumentar el flujo de carbono a través de la ruta de la fosfocetolasa, en la que la célula recombinante comprende una secuencia de ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa, en la que el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 65% con SEQ ID NO: 50.
En otro aspecto, se proporciona en el presente documento una célula recombinante capaz de aumentar el flujo de carbono a través de la ruta de la fosfocetolasa, en la que la célula recombinante comprende una secuencia de ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa, en la que el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 65% con SEQ ID NO: 51.
En algunos aspectos, en cualquiera de las realizaciones anteriores y/o en el presente documento, el cultivo de la célula recombinante en un medio adecuado aumenta uno o más de una cantidad intracelular de eritrosa 4-fosfato, una cantidad intracelular de gliceraldehído 3-fosfato o una cantidad intracelular de fosfato. En otros aspectos, en cualquiera de las realizaciones anteriores y/o en el presente documento, el polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa es capaz de sintetizar gliceraldehído 3-fosfato y acetil-fosfato a partir de xilulosa 5-fosfato. En otros aspectos, en cualquiera de las realizaciones anteriores y/o en el presente documento, el polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa es capaz de sintetizar eritrosa 4-fosfato y acetil-fosfato a partir de fructosa 6-fosfato.
En otros aspectos, se proporciona en el presente documento una célula recombinante divulgada en cualquiera de las realizaciones anteriores y/o en el presente documento capaz de producir isopreno, en la que la célula recombinante comprende además (i) uno o más ácidos nucleicos que codifican para uno o más polipéptidos de la ruta de MVA completa y (ii) un ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido de isopreno sintasa, en la que el cultivo de la célula recombinante en un medio adecuado proporciona la producción de isopreno. En otro aspecto de las células divulgadas en cualquiera de las realizaciones anteriores y/o en el presente documento, el uno o más polipéptidos de la ruta de MVA completa se selecciona de (a) una enzima que condensa dos moléculas de acetil-CoA para formar acetoacetil-CoA; (b) una enzima que condensa acetoacetil-CoA con acetil-CoA para formar HMG-CoA (por ejemplo, HMG sintasa); (c) una enzima que convierte HMG-CoA en mevalonato; (d) una enzima que fosforila mevalonato a mevalonato 5-fosfato; (e) una enzima que convierte mevalonato 5-fosfato en mevalonato 5-pirofosfato; y (f) una enzima que convierte mevalonato 5-pirofosfato en isopentenil pirofosfato. En otro aspecto de las células divulgadas en cualquiera de las realizaciones anteriores y/o en el presente documento, el ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido de isopreno sintasa es un polipéptido de isopreno sintasa de planta. En otro aspecto de las células divulgadas en cualquiera de las realizaciones anteriores y/o en el presente documento, el polipéptido de isopreno sintasa de planta es un polipéptido de Pueraria o Populus o un híbrido, Populus alba x Populus trémula. En otro aspecto de las células divulgadas en cualquiera de las realizaciones anteriores y/o en el presente documento, el polipéptido de isopreno sintasa se selecciona del grupo que consiste en Pueraria montana o Pueraria lobata, Populus tremuloides, Populus alba, Populus nigra y Populus trichocarpa. En otro aspecto de las células divulgadas en cualquiera de las realizaciones anteriores y/o en el presente documento, las células recombinantes comprenden además uno o más ácidos nucleicos que codifican para uno o más polipéptidos de la ruta de 1-desoxi-D-xilulosa 5-fosfato (DXP).
En otros aspectos, se proporciona en el presente documento una célula recombinante divulgada en cualquiera de las realizaciones anteriores y/o en el presente documento capaz de producir precursores de isoprenoides, en la que la célula recombinante comprende además uno o más ácidos nucleicos que codifican para uno o más polipéptidos de la ruta de MVA completa, en la que el cultivo de la célula recombinante en un medio adecuado proporciona la producción de precursores de isoprenoides.
En otros aspectos, se proporciona en el presente documento una célula recombinante divulgada en cualquiera de las realizaciones anteriores y/o en el presente documento capaz de producir isoprenoides, en la que la célula recombinante comprende además (i) uno o más ácidos nucleicos que codifican para uno o más polipéptidos de la ruta de MVA completa y (ii) un ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido de poliprenil pirofosfato sintasa, en la que el cultivo de la célula recombinante en un medio adecuado proporciona la producción de isoprenoides.
En otros aspectos, se proporciona en el presente documento una célula recombinante capaz de producir un metabolito derivado de acetil-CoA, en la que el cultivo de las células recombinantes divulgadas en cualquiera de las realizaciones anteriores y/o en el presente documento en un medio adecuado proporciona la producción del metabolito derivado de acetil-CoA.
En algunos aspectos, en cualquiera de las realizaciones anteriores y/o en el presente documento, el ácido nucleico se coloca bajo un promotor inducible o un promotor constitutivo. En otros aspectos de cualquiera de las realizaciones anteriores y/o en el presente documento, el ácido nucleico se clona en uno o más plásmidos multicopia. En otros aspectos de cualquiera de las realizaciones anteriores y/o en el presente documento, el ácido nucleico se integra en un cromosoma de las células.
En otros aspectos de cualquiera de las realizaciones anteriores y/o en el presente documento, las células recombinantes son células bacterianas gram-positivas, células bacterianas gram-negativas, células fúngicas, células fúngicas filamentosas, células de algas o células de levadura. En otros aspectos de cualquiera de las realizaciones anteriores y/o en el presente documento, las células recombinantes se seleccionan del grupo que consiste en Corynebacteria spp. (por ejemplo, C. glutamicum), Bacillus subtilis, Streptomyces lividans, Streptomyces coelicolor, Streptomyces griseus, Escherichia coli, Pantoea citrea, Trichoderma reesei, Aspergillus oryzae y Aspergillus niger, Saccharomyces cerevisia y Yarrowia lipolytica.
En otros aspectos de cualquiera de las realizaciones anteriores y/o en el presente documento, el isoprenoide se selecciona de un grupo que consiste en monoterpenos, diterpenos, triterpenos, tetraterpenos, sesquiterpeno y politerpeno. En otros aspectos de cualquiera de las realizaciones anteriores y/o en el presente documento, el isoprenoide es un sesquiterpeno. En otros aspectos de cualquiera de las realizaciones anteriores y/o en el presente documento, el isoprenoide se selecciona del grupo que consiste en abietadieno, amorfadieno, careno, a-farneseno, P-farneseno, farnesol, geraniol, geranilgeraniol, linalol, limoneno, mirceno, nerolidol, ocimeno, pachulol, p-pineno, sabineno, y-terpineno, terpindeno y valenceno.
En otros aspectos de cualquiera de las realizaciones anteriores y/o en el presente documento, el metabolito derivado de acetil-CoA se selecciona del grupo que consiste en policétidos, polihidroxibutirato, alcoholes grasos y ácidos grasos. En otros aspectos de cualquiera de las realizaciones anteriores y/o en el presente documento, el metabolito derivado de acetil-CoA se selecciona del grupo que consiste en ácido glutámico, glutamina, aspartato, asparagina, prolina, arginina, metionina, treonina, cisteína, succinato, lisina, leucina e isoleucina. En otros aspectos de cualquiera de las realizaciones anteriores y/o en el presente documento, el metabolito derivado de acetil-CoA se selecciona del grupo que consiste en acetona, isopropanol, isobuteno y propeno.
En otros aspectos de cualquiera de las realizaciones anteriores y/o en el presente documento, el medio adecuado comprende una fuente de carbono. En otros aspectos de cualquiera de las realizaciones anteriores y/o en el presente documento, la fuente de carbono es un hidrato de carbono seleccionado del grupo que consiste en monosacárido, disacárido, oligosacárido, polisacárido, azúcar C6, azúcar C5 y azúcar invertido.
En otros aspectos, se proporciona en el presente documento un método para producir isopreno que comprende: (a) cultivar la célula recombinante divulgada en cualquiera de las realizaciones anteriores y/o en el presente documento en condiciones adecuadas para producir isopreno y (b) producir isopreno.
En otros aspectos, se proporciona en el presente documento un método de producción de un precursor de isoprenoides que comprende: (a) cultivar la célula recombinante divulgada en cualquiera de las realizaciones anteriores y/o en el presente documento en condiciones adecuadas para producir un precursor de isoprenoides y (b) producir un precursor de isoprenoides.
En otros aspectos, se proporciona en el presente documento un método de producción de un isoprenoide que comprende: (a) cultivar la célula recombinante divulgada en cualquiera de las realizaciones anteriores y/o en el presente documento en condiciones adecuadas para producir un isoprenoide y (b) producir un isoprenoide.
En otros aspectos, se proporcionan en el presente documento métodos para producir un metabolito derivado de acetil-CoA que comprende: (a) cultivar la célula recombinante divulgada en cualquiera de las realizaciones anteriores y/o en el presente documento en condiciones adecuadas para producir un metabolito derivado de acetil-CoA y (b) producir un metabolito derivado de acetil-CoA.
En otros aspectos, se proporcionan en el presente documento métodos para detectar la actividad in vivo fosfocetolasa de un polipéptido en una célula recombinante que comprenden (a) cultivar una célula recombinante que comprende un ácido nucleico heterólogo que codifica para dicho polipéptido en los que la célula recombinante es defectuosa en la actividad transcetolasa (tktAB) en condiciones de cultivo con glucosa o xilosa como fuente de carbono; (b) evaluar el crecimiento celular de la célula recombinante y (c) detectar la actividad fosfocetolasa in vivo de dicho polipéptido se basa en la presencia de crecimiento celular.
En otros aspectos, se proporcionan en el presente documento polipéptidos aislados con actividad fosfocetolasa producidos mediante cualquier método de examen, identificación y/o detección divulgados en el presente documento.
En otros aspectos, se proporcionan en el presente documento células recombinantes capaces de aumentar el flujo de carbono a través de la ruta de la fosfocetolasa, en las que las células recombinantes comprenden una secuencia de ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa, en las que el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 65% con SEQ ID NO: 8. En otros aspectos, se proporcionan en el presente documento células recombinantes capaces de aumentar el flujo de carbono a través de la ruta de la fosfocetolasa, en las que las células recombinantes comprenden: (i) una secuencia de ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa, en las que el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 65% con SEQ ID NO: 8 y (ii) uno o más ácidos nucleicos que codifican para uno o más polipéptidos de la ruta de MVA completa, en las que dicha célula recombinante que comprende dicho polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa de (i) tiene un valor de índice de rendimiento mayor de 1,0 en uno o más de los siguientes parámetros: (a) crecimiento celular en glucosa, (b) crecimiento celular en xilosa, (c) producción de acetil-fosfato intracelular o (d) crecimiento celular en glucosa-6-fosfato. En otros aspectos, se proporcionan en el presente documento células recombinantes capaces de aumentar el flujo de carbono a través de la ruta de la fosfocetolasa, en las que la célula recombinante comprende: (i) una secuencia de ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa, en las que el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 65% con SEQ ID NO: 8 y (ii) uno o más ácidos nucleicos que codifican para uno o más polipéptidos de la ruta de MVA completa, en las que dicho polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa de (i) tiene un valor de índice de rendimiento mayor de 1,0 en uno o más de los siguientes parámetros: (a) solubilidad de proteínas, (b) expresión de proteínas o (c) actividad específica de fructosa-6-fosfato (F6P). En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos anteriormente o en el presente documento, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 23. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos anteriormente o en el presente documento, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 24. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos anteriormente o en el presente documento, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 25. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos anteriormente o en el presente documento, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 26. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos anteriormente o en el presente documento, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 27. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos anteriormente o en el presente documento, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 28. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos anteriormente o en el presente documento, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 29. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos anteriormente o en el presente documento, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 30. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos anteriormente o en el presente documento, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 31.
En otro aspecto, se proporcionan en el presente documento células recombinantes capaces de aumentar el flujo de carbono a través de la ruta de la fosfocetolasa, en las que las células recombinantes comprenden una secuencia de ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa, en las que el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 65% con SEQ ID NO: 11. En otro aspecto, se proporcionan en el presente documento células recombinantes capaces de aumentar el flujo de carbono a través de la ruta de la fosfocetolasa, en las que las células recombinantes comprenden: (i) una secuencia de ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa, en las que el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 65% con SEQ ID NO: 11 y (ii) uno o más ácidos nucleicos que codifican para uno o más polipéptidos de la ruta de MVA completa, en las que dicha célula recombinante que comprende dicho polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa de (i) tiene un valor de índice de rendimiento mayor de 1,0 en uno o más de los siguientes parámetros: (a) crecimiento celular en glucosa, (b) crecimiento celular en xilosa, (c) producción de acetilfosfato intracelular o (d) crecimiento celular en glucosa-6-fosfato. En otro aspecto, se proporcionan en el presente documento células recombinantes capaces de aumentar el flujo de carbono a través de la ruta de la fosfocetolasa, en las que las células recombinantes comprenden: (i) una secuencia de ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa, en las que el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 65% con SEQ ID NO: 11 y (ii) uno o más ácidos nucleicos que codifican para uno o más polipéptidos de la ruta de MVA completa, en las que dicho polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa de (i) tiene un valor de índice de rendimiento mayor de 1,0 en uno o más de los siguientes parámetros: (a) solubilidad de proteínas, (b) expresión de proteínas o (c) actividad específica de fructosa-6-fosfato (F6P). En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos anteriormente o en el presente documento, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 32. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos anteriormente o en el presente documento, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 33. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos anteriormente o en el presente documento, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 34. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos anteriormente o en el presente documento, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 35. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos anteriormente o en el presente documento, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 36. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos anteriormente o en el presente documento, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 37. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos anteriormente o en el presente documento, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 38. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos anteriormente o en el presente documento, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 39. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos anteriormente o en el presente documento, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 40. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos anteriormente o en el presente documento, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 41. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos anteriormente o en el presente documento, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 42. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos anteriormente o en el presente documento, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 43. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos anteriormente o en el presente documento, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 44. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos anteriormente o en el presente documento, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 45. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos anteriormente o en el presente documento, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 46.
En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos anteriormente o en el presente documento, el cultivo de la célula recombinante en un medio adecuado aumenta uno o más de una cantidad intracelular de eritrosa 4-fosfato, una cantidad intracelular de gliceraldehído 3-fosfato o una cantidad de acetil-fosfato intracelular. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos anteriormente o en el presente documento, el polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa es capaz de sintetizar gliceraldehído 3-fosfato y acetil-fosfato a partir de xilulosa 5-fosfato. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos anteriormente o en el presente documento, el polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa es capaz de sintetizar eritrosa 4-fosfato y acetil-fosfato a partir de fructosa 6-fosfato.
En otras realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos anteriormente o en el presente documento, el uno o más polipéptidos de la ruta de MVA completa se selecciona de (a) una enzima que condensa dos moléculas de acetil-CoA para formar acetoacetil-CoA; (b) una enzima que condensa acetoacetil-CoA con acetil-CoA para formar HMG-CoA (por ejemplo, HMG sintasa); (c) una enzima que convierte HMG-CoA en mevalonato; (d) una enzima que fosforila mevalonato a mevalonato 5-fosfato; (e) una enzima que convierte mevalonato 5-fosfato en mevalonato 5-pirofosfato; y (f) una enzima que convierte mevalonato 5-pirofosfato en isopentenil pirofosfato.
En otros aspectos, se proporcionan en el presente documento células recombinantes capaces de producir isopreno, en las que la célula recombinante (tal como cualquier célula recombinante proporcionada en el presente documento) comprende además un ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido de isopreno sintasa, en las que el cultivo de la célula recombinante en un medio adecuado proporciona la producción de isopreno con un valor de índice de rendimiento mayor de 1,0 en uno o más de los siguientes parámetros: (a) rendimiento de isopreno o (b) productividad específica de isopreno. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos anteriormente o en el presente documento, el ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido de isopreno sintasa es un polipéptido de isopreno sintasa de planta. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos anteriormente o en el presente documento, el polipéptido de isopreno sintasa de planta es un polipéptido de Pueraria o Populus o un híbrido, Populus alba x Populus trémula. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos anteriormente o en el presente documento, el polipéptido de isopreno sintasa se selecciona del grupo que consiste en Pueraria montana, Pueraria lobata, Populus tremuloides, Populus alba, Populus nigra y Populus trichocarpa. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos anteriormente o en el presente documento, las células recombinantes comprenden además uno o más ácidos nucleicos que codifican para uno o más polipéptidos de la ruta de 1-desoxi-D-xilulosa 5-fosfato (DXP).
En otros aspectos, se proporcionan en el presente documento células recombinantes capaces de producir precursores de isoprenoides, en las que la célula recombinante (tal como cualquier célula recombinante proporcionada en el presente documento) se cultiva en un medio adecuado y produce dichos precursores de isoprenoides.
En otros aspectos, se proporcionan en el presente documento células recombinantes que producen isoprenoides, en las que la célula recombinante (tal como cualquier célula recombinante proporcionada en el presente documento) comprende además un ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido de poliprenil pirofosfato sintasa, en las que el cultivo de la célula recombinante en un medio adecuado proporciona la producción de isoprenoides.
En aún otros aspectos, se proporcionan en el presente documento células recombinantes capaces de producir un metabolito derivado de acetil-CoA, en las que el cultivo de la célula recombinante (tal como cualquier célula recombinante proporcionada en el presente documento) en un medio adecuado proporciona la producción del metabolito derivado de acetil-CoA.
En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos anteriormente o en el presente documento, el ácido nucleico se coloca bajo un promotor inducible o un promotor constitutivo. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos anteriormente o en el presente documento, el ácido nucleico se clona en uno o más plásmidos multicopia. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos anteriormente o en el presente documento, el ácido nucleico se integra en un cromosoma de las células.
En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos anteriormente o en el presente documento, las células recombinantes son células bacterianas gram-positivas, células bacterianas gram-negativas, células fúngicas, células fúngicas filamentosas, células de algas o células de levadura. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos anteriormente o en el presente documento, las células recombinantes se seleccionan del grupo que consiste en Corynebacteria, Bacillus subtilis, Streptomyces lividans, Streptomyces coelicolor, Streptomyces griseus, Escherichia coli, Pantoea citrea, Trichoderma reesei, Aspergillus oryzae y Aspergillus niger, Saccharomyces cerevisiae y Yarrowia lipolytica.
En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos anteriormente o en el presente documento, el isoprenoide se selecciona del grupo que consiste en monoterpenos, diterpenos, triterpenos, tetraterpenos, sesquiterpeno y politerpeno. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos anteriormente o en el presente documento, el isoprenoide es un sesquiterpeno. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos anteriormente o en el presente documento, el isoprenoide se selecciona del grupo que consiste en abietadieno, amorfadieno, careno, a-farneseno, p-farneseno, farnesol, geraniol, geranilgeraniol, linalol, limoneno, mirceno, ocimeno, pachulol, p-pineno, sabineno, y-terpineno, terpindeno y valenceno.
En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos anteriormente o en el presente documento, el metabolito derivado de acetil-CoA se selecciona del grupo que consiste en policétidos, polihidroxibutirato, alcoholes grasos y ácidos grasos. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos anteriormente o en el presente documento, el metabolito derivado de acetil-CoA se selecciona del grupo que consiste en ácido glutámico, glutamina, aspartato, asparagina, prolina, arginina, metionina, treonina, cisteína, succinato, lisina, leucina e isoleucina. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos anteriormente o en el presente documento, el metabolito derivado de acetil-CoA se selecciona del grupo que consiste en acetona, isopropanol, isobuteno y propeno.
En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos anteriormente o en el presente documento, el medio adecuado comprende una fuente de carbono. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos anteriormente o en el presente documento, la fuente de carbono es un hidrato de carbono seleccionado del grupo que consiste en monosacárido, disacárido, oligosacárido, polisacárido, azúcar C6, azúcar C5 y azúcar invertido.
En otros aspectos, también se proporcionan en el presente documento métodos para producir isopreno que comprenden: (a) cultivar la célula recombinante (tal como cualquier célula recombinante proporcionada en el presente documento) en condiciones adecuadas para producir isopreno y (b) producir isopreno. En otros aspectos, también se proporcionan en el presente documento métodos para producir un precursor de isoprenoides que comprenden: (a) cultivar la célula recombinante (tal como cualquier célula recombinante proporcionada en el presente documento) en condiciones adecuadas para producir un precursor de isoprenoides y (b) producir un precursor de isoprenoides.
En otros aspectos, también se proporcionan en el presente documento métodos para producir un isoprenoide que comprende: (a) cultivar la célula recombinante (tal como cualquier célula recombinante proporcionada en el presente documento) en condiciones adecuadas para producir un isoprenoide y (b) producir un isoprenoide.
En otros aspectos, también se proporcionan en el presente documento métodos para producir un metabolito derivado de acetil-CoA que comprende: (a) cultivar la célula recombinante (como cualquier célula recombinante proporcionada en el presente documento) en condiciones adecuadas para producir un metabolito derivado de acetil-CoA y (b) producir un metabolito derivado de acetil-CoA.
En otros aspectos, también se proporcionan en el presente documento métodos para detectar la actividad fosfocetolasa in vivo de un polipéptido en una célula recombinante que comprende (a) cultivar una célula recombinante que comprende una secuencia de ácido nucleico heterólogo que codifica para dicho polipéptido en los que la célula recombinante es defectuosa en la actividad transcetolasa (tktAB) en condiciones de cultivo con glucosa o xilosa como fuente de carbono; (b) evaluar el crecimiento celular de la célula recombinante y (c) detectar la actividad fosfocetolasa in vivo de dicho polipéptido basándose en la presencia de crecimiento celular.
En otros aspectos, también se proporcionan en el presente documento polipéptidos aislados con actividad fosfocetolasa detectados mediante cualquiera de los métodos descritos anteriormente o en el presente documento. Breve descripción de los dibujos
La figura 1 representa una ruta metabólica modificada por ingeniería genética con presencia de fosfocetolasa (PKL). Las PKL se han clasificado en dos tipos según la preferencia de sustrato: xilulosa-5-fosfato (X5P) fosfocetolasas (EC 4.1.2.9), que solo actúan sobre X5P, y xilulosa-5-fosfato/fructosa-6-fosfato (F6P) fosfocetolasas (EC 4.1.2.22), que actúan tanto sobre X5P como sobre F6P con actividades comparables, el acetil-fosfato (Ac-P) formado a partir de F6P y/o X5P en reacción/reacciones catalizada(s) por PKL se convierte posteriormente en acetil-CoA para su uso en la ruta de MVA o se puede convertir en acetato. Otros productos de la reacción catalizada por PKL, a saber, gliceraldehído 3-fosfato (GAP) y eritrosa 4-fosfato (E4P) producidos a partir de X5P y F6P, respectivamente, pueden recircularse a través de rutas metabólicas manipuladas para maximizar el rendimiento. La acetil-CoA se puede convertir en muchos productos, tales como policétidos, ácidos grasos y aminoácidos, tales como lisina.
La figura 2 es un diagrama de las secuencias representativas centrales de las 22 agrupaciones (clusters) de PKL identificadas.
La figura 3 es un diagrama de las fosfocetolasas identificadas en la agrupación 1.
La figura 4 es un diagrama de las fosfocetolasas identificadas en la agrupación 2.
La figura 5 es un diagrama de las fosfocetolasas identificadas en la agrupación 3.
La figura 6 es un diagrama de las fosfocetolasas identificadas en la agrupación 4.
La figura 7 es un diagrama de las fosfocetolasas identificadas en la agrupación 5.
La figura 8 es un diagrama de las fosfocetolasas identificadas en la agrupación 6.
La figura 9 es un diagrama de las fosfocetolasas identificadas en la agrupación 7.
La figura 10 es un diagrama de las fosfocetolasas identificadas en la agrupación 8.
La figura 11 es un diagrama de las fosfocetolasas identificadas en la agrupación 9.
La figura 12 es un diagrama de las fosfocetolasas identificadas en la agrupación 10
La figura 13 es un diagrama de las fosfocetolasas identificadas en la agrupación 11
La figura 14 es un diagrama de las fosfocetolasas identificadas en la agrupación 12
La figura 15 es un diagrama de las fosfocetolasas identificadas en la agrupación 13
La figura 16 es un diagrama de las fosfocetolasas identificadas en la agrupación 14
La figura 17 es un diagrama de las fosfocetolasas identificadas en la agrupación 15
La figura 18 es un diagrama de las fosfocetolasas identificadas en la agrupación 16
La figura 19 es un diagrama de las fosfocetolasas identificadas en la agrupación 17
La figura 20 es un diagrama de las fosfocetolasas identificadas en la agrupación 18.
La figura 21 es un diagrama de las fosfocetolasas identificadas en la agrupación 19.
La figura 22 es un diagrama de las fosfocetolasas identificadas en la agrupación 20.
La figura 23 es un diagrama de las fosfocetolasas identificadas en la agrupación 21.
La figura 24 es un diagrama de las fosfocetolasas identificadas en la agrupación 22.
La figura 25 representa el mapa plasmídico de pCMP1321, que expresa fosfocetolasa de Enterococcus gallinarum.
La figura 26 representa el mapa plasmídico de pMCS530, que expresa fosfocetolasa de Bifidobacterium dentium. La figura 27 representa el mapa plasmídico de pMCS531, que expresa fosfocetolasa de Bifidobacterium bifidum. La figura 28 representa el mapa plasmídico de pMCS532, que expresa fosfocetolasa de Bifidobacterium gallicum. La figura 29 representa el mapa plasmídico de pMCS533, que expresa fosfocetolasa de Lactobacillus buchneri. La figura 30 representa el mapa plasmídico de pMCS534, que expresa fosfocetolasa de Burkholderia phytofirmans.
La figura 31 representa el mapa plasmídico de pMCS535, que expresa fosfocetolasa de Clostridium acetobutylicum optimizada.
La figura 32 es una serie de geles teñidos con Coomasie de SDS-PAGE que muestran la expresión de proteínas en cepas que expresan fosfocetolasa. A) proteína soluble y B) proteína insoluble de células que expresan PKL de B. longum (carril 1), PKL de E. gallinarum (carril 2), PKL de C. acetobutylicum (carril 3), PKL de B. dentium (carril 4), PKL de B. bifidum (carril 5), PKL de B. gallicum (carril 6), PKL de L. buchneri (carril 7), PKL de B. phytofirmans (carril 8) y PKL con optimización de codones de C. acetobutylicum (carril 9).
La figura 33 es un gráfico que muestra la actividad in vitro de PKL de B. longum, PKL de E. gallinarum, PKL de C. acetobutylicum, PKL de B. dentium, PKL de B. bifidum, PKL de B. gallicum, PKL de L. buchneri, B. phytofermens PKL y PKL con optimización de codones de C. acetobutylicum en presencia de sustrato de F6P medido por el rendimiento de Ac-P.
La figura 34 es un gráfico que muestra que el mutante de la transcetolasa creció en glucosa solo con un complemento que contiene seis compuestos aromáticos y piridoxina.
La figura 35 es un gráfico que muestra que las fosfocetolasas de E. gallinarum y C. acetobutylicum restauraron el crecimiento del mutante de la transcetolasa en glucosa sin complemento.
La figura 36 es un gráfico que muestra que el mutante de transcetolasa no creció en xilosa con o sin complemento que contiene seis compuestos aromáticos y piridoxina.
La figura 37 es un gráfico que muestra que las fosfocetolasas de E. gallinarum y C. acetobutylicum restauraron el crecimiento del mutante de transcetolasa en xilosa sin complemento.
La figura 38 es un diagrama que representa las mutaciones del huésped que están preferiblemente reguladas por incremento para aumentar el flujo de carbono a través de la ruta de la fosfocetolasa. Los genes de interés para modular el flujo de carbono incluyen moduribosa-5-fosfato isomerasa A (rpiA), D-ribulosa-5-fosfato 3-epimerasa (rpe), transcetolasa A (tktA), transaldolasa B (tal B) y/o fosfato acetiltransferasa (pta).
La figura 39 es un diagrama que representa las mutaciones del huésped que están preferiblemente reguladas por disminución para aumentar el flujo de carbono a través de la ruta de la fosfocetolasa. Los genes de interés para modular el flujo de carbono incluyen glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (zwf), 6-fosfofructocinasa-1 (pfkA), fructosa bisfosfato aldolasa (fba), gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa A (gapA), acetato cinasa (ackA), citrato sintasa (gltA) y/o el operón pts.
La figura 40 representa el rendimiento de isopreno acumulativo de diversas enzimas PKL en un huésped MD891 (ackA-).
La figura 41 representa el título de isopreno al final de la fermentación (EOF) de diversas enzimas PKL en un huésped MD891 (ackA-).
La figura 42 representa un mapa plasmídico genérico de un plásmido adecuado para la coexpresión de PKL según cualquiera de las composiciones, células o métodos divulgados en el presente documento.
Descripción detallada
La divulgación proporcionada en el presente documento describe, entre otros, composiciones y métodos para la producción de metabolitos derivados de acetil-coenzima A, moléculas precursoras de isoprenoides, isopreno y/o isoprenoides en células recombinantes que se han modificado por ingeniería genética para expresar un polipéptido de fosfocetolasa. Las enzimas fosfocetolasa para su uso según esta invención pueden usar diversos sustratos, tal como se describe con mayor detalle a continuación. En determinadas realizaciones, la divulgación proporciona composiciones y métodos para la producción de metabolitos derivados de acetil-coenzima A, moléculas precursoras de isoprenoides, isopreno y/o isoprenoides en células recombinantes que se han modificado por ingeniería genética para expresar un polipéptido de fosfocetolasa capaz de catalizar la conversión de xilulosa 5-fosfato en gliceraldehído 3-fosfato y acetil-fosfato. En otras realizaciones, la divulgación proporciona composiciones y métodos para la producción de metabolitos derivados de acetil-coenzima A, moléculas precursoras de isoprenoides, isopreno y/o isoprenoides en células recombinantes que se han modificado por ingeniería genética para expresar un polipéptido de fosfocetolasa capaz de catalizar la conversión de fructosa 6-fosfato en eritrosa 4-fosfato y acetil-fosfato. En todavía otras realizaciones, la divulgación proporciona composiciones y métodos para la producción de metabolitos derivados de acetil-coenzima A, moléculas precursoras de isoprenoides, isopreno y/o isoprenoides en células recombinantes que se han modificado por ingeniería genética para expresar un polipéptido de fosfocetolasa capaz de catalizar la conversión de sedoheptulosa 7-fosfato en ribosa 5-fosfato y acetil-fosfato. En todavía otras realizaciones, la divulgación proporciona composiciones y métodos para la producción de metabolitos derivados de acetil-coenzima A, moléculas precursoras de isoprenoides, isopreno y/o isoprenoides en células recombinantes que se han modificado por ingeniería genética para expresar un polipéptido de fosfocetolasa capaz de catalizar la conversión de xilulosa 5-fosfato en gliceraldehído 3-fosfato y acetil-fosfato y/o la conversión de fructosa 6-fosfato en eritrosa 4-fosfato y acetil-fosfato y/o la conversión de sedoheptulosa 7-fosfato en ribosa 5-fosfato y acetil-fosfato.
Se ha usado fosfocetolasa expresada de forma recombinante para modificar por ingeniería genética rutas metabólicas en células huésped. Véase el documento U.S. 7.785.858. Sonderegger et al. (Applied and Environmental Microbiology, 2004, 70: 5, 2892-97) describen el uso de fosfocetolasa en Saccharomyces cerevisiae para la sobreproducción de etanol. Fleige et al. (Appl Microbial Biotechnol., 2011, 91: 3, 769-76) describen la expresión de un gen de la fosfocetolasa de bifidobacteria (Meile et al., citado anteriormente) en una cepa de Ralstonia eutropha modificada que restauró la capacidad del organismo para usar la fructosa como única fuente de carbono para el crecimiento.
Teóricamente, pueden derivarse tres moléculas de acetil-CoA a partir de una única molécula de glucosa en una reacción equilibrada. Sin embargo, los organismos normalmente solo producen hasta dos moléculas de acetil-CoA, perdiéndose la masa restante como CO2. La liberación de CO2 se produce durante la formación de acetil-CoA a partir de piruvato, una reacción catalizada por la piruvato deshidrogenasa. La pérdida de un átomo de carbono da como resultado una disminución de los rendimientos de producción de metabolitos derivados de acetil-CoA, precursores de isoprenoides, isopreno y moléculas de isoprenoides. Una excepción a esta pérdida de reacción es la ruta de Wood-Ljungdahl, que se basa en las enzimas monóxido de carbono deshidrogenasa y acetil-CoA sintasa para reducir el dióxido de carbono a acetil-CoA en acetógenos anaerobios.
La presente divulgación proporciona un proceso metabólico alternativo que puede producir potencialmente tres moléculas de acetil-CoA a partir de una molécula de glucosa usando una ruta que no se basa en las enzimas de la ruta de Wood-Ljungdahl. En su lugar, hace uso de una enzima fosfocetolasa que se encuentra en determinados organismos [véase, por ejemplo, Biology of the Prokaryotes (ed. Lengeler, Drews y Schlegel); Blackwell Science, Nueva York, 1999, págs. 299-301; Meile et al., J. of Bacteriology, 2001, 183: 9, 2929-36.; Jeong et al., J. Microbiol. Biotechnol., 2007, 17: 5, 822-829]. Las enzimas fosfocetolasa permiten la formación de acetil-CoA (a través de acetil-fosfato) a partir de xilulosa 5-fosfato o fructosa 6-fosfato en lugar de a través de la oxidación del piruvato como en el metabolismo normal.
Las fosfocetolasas se han clasificado en dos tipos según su preferencia de sustrato: fosfocetolasas de xilulosa-5-fosfato (X5P), que solo actúan sobre X5P, y fosfocetolasas de X5P/fructosa-6-fosfato (F6P), que pueden actuar tanto sobre X5P como sobre F6P (Suzuki et al., Acta Cryst. F66, 2010, 66: 8, 941-43). Las fosfocetolasas catalizan la escisión de X5P o F6P usando fosfato inorgánico (Pi) para producir acetil-fosfato (acetil-P), H2O y gliceraldehído 3-fosfato o eritrosa 4-fosfato. El metabolito de alta energía acetil-P se convierte posteriormente en ácido acético mediante acetato cinasa para producir ATP a partir de ADP en la ruta (figura 1). Además del acetil-fosfato, el gliceraldehído 3-fosfato producido a partir de la reacción enzimática se puede recircular a través de rutas metabólicas manipuladas, de modo que se pueda lograr el rendimiento máximo de 3-acetil-CoA por glucosa. Significativamente, la producción de acetil-CoA por la fosfocetolasa elimina la pérdida de carbono (por ejemplo, CO2) tal como se observa en las reacciones mediadas por la piruvato deshidrogenasa.
Las fosfocetolasas también pueden actuar sobre la sedoheptulosa-7-fosfato para convertirla en ribosa-5-fosfato y acetil-fosfato. Un ejemplo no limitativo de dicha fosfocetolasa es la fosfocetolasa de Bifidobacterium longum, que tiene actividad catalítica con sedoheptulosa-7-fosfato.
La presente invención se refiere al uso de enzimas fosfocetolasa en la producción de metabolitos derivados de acetil-CoA, precursores de isoprenoides, isopreno y/o isoprenoides para mejorar el rendimiento de producto. En particular, el rendimiento teórico del producto de isopreno se mejora según lo representado por las siguientes ecuaciones equilibradas (con la suposición de que un organismo es capaz de producir ATP a partir de la oxidación completa de 1 mol de glucosa a 6 moles de CO2):
Sólo ruta de MVA
1,5 Glucosa 2,00 O2 ^ 1,00 Isopreno 4,00 CO2 + 5,00 H2O
Rendimiento teórico - 0,252 g de isopreno/g de glucosa
Ruta de DXP
1,25 Glucosa 0,50 O2 ^ 1,00 Isopreno 2,50 CO2 + 3,50 H2O
Rendimiento teórico - 0,302 g de isopreno/g de glucosa
Rutas de MVA fosfocetolasa
1,22 Glucosa 0,33 O2 ^ 1,00 Isopreno 2,33 CO2 + 3,32 H2O
Rendimiento teórico - 0,309 g de isopreno/g de glucosa
La ruta de biosíntesis dependiente de mevalonato es particularmente importante para la producción de moléculas precursoras de isoprenoides, por ejemplo, dimetilalil difosfato (DMAPP) e isopentenil pirofosfato (IPP). Las enzimas de la ruta del mevalonato superior convierten la acetil-CoA, producida a partir de glucosa, en mevalonato a través de tres reacciones enzimáticas. Sin querer restringirse a la teoría, se cree que el aumento de las reservas intracelulares de E4P, GAP y Ac-P producidos mediante el uso de un polipéptido de fosfocetolasa para el aumento de la biosíntesis de acetil-CoA puede dar como resultado un aumento de la productividad de la ruta de biosíntesis superior dependiente de mevalonato, lo que aumentará sustancialmente la biosíntesis de mevalonato y, en consecuencia, de moléculas precursoras de isoprenoides posteriores, tales como DMAPP e IPP (figura 1). Además, el aumento de la biosíntesis de acetil-CoA puede dar como resultado el aumento de la síntesis de metabolitos derivados de acetil-CoA, tales como ácidos grasos, aminoácidos y acetona (figura 1). El aumento de la producción de CoA de la cantidad intracelular por esta ruta de PKL alternativa es, por tanto, ventajoso para aplicaciones comerciales.
Se produce acetona por determinados microorganismos, tales como Clostridium acetobutylicum. Comienza con la condensación de dos moléculas de acetil-CoA en acetoacetil-CoA mediante acetil-CoA acetiltransferasa (EC 2.3.1.9). Luego se convierte acetoacetil-CoA en acetoacetato mediante una reacción con ácido acético o ácido butírico que da como resultado la producción de acetil-CoA o butiril-CoA. Esta reacción está catalizada por una enzima como la acetoacetilCoA transferasa (EC 2.8.3.8). La acetoacetilCoA transferasa se conoce de diversos organismos, como E. coli o C. acetobutylicum. Sin embargo, también otras enzimas pueden catalizar esta reacción, tales como 3-oxoácido CoA transferasa (EC 2.8.3.5) o la succinato CoA ligasa (EC 6.2.1.5). En la última etapa de la reacción, se convierte acetoacetato en acetona mediante una etapa de descarboxilación catalizada por acetoacetato descarboxilasa (EC 4.1.1.4). La acetona se puede convertir posteriormente en isopropanol, isobuteno y/o propeno tal como se describe en el documento WO 2013/07786 a cuyo contenido se hace referencia expresamente, en particular con respecto a la acetona, el isopreno y el propeno.
Por consiguiente, en determinados aspectos, la invención proporciona células recombinantes según se reivindican con una cantidad intracelular aumentada de 4-fosfato de eritrosa, una cantidad intracelular aumentada de gliceraldehído 3-fosfato y/o una cantidad intracelular aumentada de fosfato, en las que las células comprenden uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican para un polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa, y en las que las células producen una cantidad intracelular aumentada de eritrosa 4-fosfato, una cantidad intracelular aumentada de gliceraldehído 3-fosfato y/o una cantidad intracelular aumentada de fosfato en comparación con células que no comprenden el uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican para un polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa.
En algunos aspectos, la invención proporciona células recombinantes según se reivindican con una cantidad intracelular aumentada de acetil-CoA, en las que las células comprenden uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican para un polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa, y en las que las células producen una cantidad intracelular aumentada de acetil-CoA en comparación con células que no comprenden el uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican para un polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa.
En determinados aspectos, la invención proporciona células recombinantes según se reivindican, capaces de mejorar la producción de mevalonato, en las que las células comprenden uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican para un polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa y uno o más ácidos nucleicos que codifican para uno o más polipéptidos de la ruta de MVA superior, en las que las células producen cantidades aumentadas de mevalonato en comparación con células que no comprenden el uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican para un polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa.
En otros aspectos, la presente invención proporciona células recombinantes según se reivindican capaces de mejorar la producción de precursores de isoprenoides, en las que las células comprenden uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican para un polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa y uno o más ácidos nucleicos que codifican para uno o más polipéptidos de la ruta de MVA completa, en las que las células producen cantidades aumentadas de precursores de isoprenoides en comparación con células que no comprenden el uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican para un polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa.
En todavía otros aspectos, la presente invención proporciona células recombinantes según se reivindican capaces de producir isopreno, en las que las células comprenden uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican para un polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa y (i) uno o más ácidos nucleicos que codifican para uno o más polipéptidos de la ruta de MVA completa y (ii) un ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido de isopreno sintasa, en las que las células son capaces de producir cantidades recuperables de isopreno. En determinadas realizaciones, la presente invención proporciona células recombinantes según se reivindican capaces de mejorar la producción de isopreno, en las que las células comprenden uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican para un polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa y (i) uno o más ácidos nucleicos que codifican para uno o más polipéptidos de la ruta de MVA completa y (ii) un ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido de isopreno sintasa, en las que las células producen cantidades aumentadas de isopreno en comparación con células productoras de isopreno que no comprenden el uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican para un polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa.
En aún otros aspectos, la presente invención proporciona células recombinantes según se reivindican capaces de producir isoprenoides, en las que las células comprenden uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican para un polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa y (i) uno o más ácidos nucleicos que codifican para uno o más polipéptidos de la ruta de MVA completa y (ii) un ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido de poliprenil pirofosfato sintasa, en las que las células son capaces de producir cantidades recuperables de isoprenoides. En determinadas realizaciones, la presente invención proporciona células recombinantes según se reivindican capaces de mejorar la producción de isoprenoides, en las que las células comprenden uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican para un polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa y (i) uno o más ácidos nucleicos que codifican para uno o más polipéptidos de la ruta de MVA completa y (ii) un ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido de poliprenil pirofosfato sintasa, en las que las células producen cantidades aumentadas de isoprenoides en comparación con células productoras de isoprenoides que no comprenden el uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican para un polipéptido que tiene actividad fosfocetolosa.
En otros aspectos, la presente invención proporciona células recombinantes según se reivindican capaces de producir un metabolito derivado de acetil-CoA, en las que las células comprenden uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican para un polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa, en las que las células son capaces de producir cantidades recuperables del metabolito derivado de acetil-CoA. En determinadas realizaciones, la presente invención proporciona células recombinantes según se reivindican capaces de mejorar la producción de un metabolito derivado de acetil-CoA, en las que las células comprenden uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican para un polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa, en las que las células producen cantidades aumentadas de metabolito derivado de acetil-CoA en comparación con células productoras de metabolito derivado de acetil-CoA que no comprenden el uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican para un polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa.
En cualquiera de los aspectos en el presente documento, la presente invención proporciona células recombinantes según se reivindican, en las que las células pueden comprender uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican para un polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa y pueden modificarse por ingeniería genética adicionalmente para modular la actividad de uno o más de los siguientes genes incluyendo isomerasa ribosa 5-fosfato isomerasa (rpiA y/o rpiB), D-ribulosa-5-fosfato 3-epimerasa (rpe), transcetolasa (tktA y/o tktB), transaldolasa B (tal B), fosfato acetiltransferasa (pta y/o eutD), glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (zwf), 6-fosfofructocinasa-1 (pfkA y/o pfkB), fructosa bisfosfato aldolasa (fba, fbaA, fbaBy/o fbaC), gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (gapA y/o gapB), acetato cinasa (ackA), citrato sintasa (gltA), Ei (ptsI), EIICBGlc (ptsG), EIIAGlc (crr) y/o HPr (ptsH) para mejorar el flujo de carbono a través de la ruta de la fosfocetolasa.
En algunas realizaciones, la presente invención proporciona células recombinantes según se reivindican capaces de producir isopreno, en las que las células comprenden uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican para un polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa y (i) uno o más ácidos nucleicos que codifican para uno o más polipéptidos de la ruta de MVA completa, (ii) un ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido de isopreno sintasa, y (iii) se modifica por ingeniería genética adicionalmente para modular la actividad de uno o más genes para aumentar el flujo de carbono a través de la ruta de la fosfocetolasa, en las que las células producen cantidades aumentadas de isopreno en comparación con células productoras de isopreno que no comprenden el uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican para un polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa.
En algunas realizaciones, la presente invención proporciona células recombinantes según se reivindican capaces de producir isoprenoides, en las que las células comprenden uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican para un polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa y (i) uno o más ácidos nucleicos que codifican para uno o más polipéptidos de la ruta de MVA completa, (ii) un ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido de poliprenil pirofosfato sintasa, y (iii) se modifica por ingeniería genética adicionalmente para modular la actividad de uno o más genes para aumentar el flujo de carbono a través de la ruta de la fosfocetolasa, en las que las células producen cantidades aumentadas de isoprenoides en comparación con células productoras de isoprenoides que no comprenden el uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican para un polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa.
En otras realizaciones, la presente invención proporciona células recombinantes según se reivindican, capaces de mejorar la producción de un metabolito derivado de acetil-CoA, en las que las células comprenden uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican para un polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa y se modifica por ingeniería genética adicionalmente para modular la actividad de uno o más genes para aumentar el flujo de carbono a través de la ruta de la fosfocetolasa, en las que las células producen cantidades aumentadas del metabolito derivado de acetil-CoA en comparación con células productoras de metabolitos derivados de acetil-CoA que no comprenden el uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican para un polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa.
Técnicas generales
La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de biología molecular (incluyendo técnicas recombinantes), microbiología, biología celular, bioquímica e inmunología, que están dentro de los conocimientos de la técnica. Tales técnicas se explican con detalle en la bibliografía, “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, segunda edición (Sambrook et al., 1989); “Oligonucleotide Synthesis” (M. J. Gait, ed., 1984); “Animal Cell Culture” (R. I. Freshney, ed., 1987); “Methods in Enzymology” (Academic Press, Inc.); “Current Protocols in Molecular Biology” (F. M. Ausubel et al., Eds., 1987, y actualizaciones periódicas); “PCR: The Polymerase Chain Reaction”, (Mullis et al., Eds., 1994). Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2a ed., J. Wiley & Sons (Nueva York, N.Y. 1994) y March, Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure, 4a ed., John Wiley & Sons (Nueva York, N.Y. 1992), proporcionan a un experto en la técnica una guía general de muchos de los términos usados en la presente solicitud.
Definiciones
El término “isopreno” se refiere a 2-metil-1,3-butadieno (n.° CAS 78-79-5). Puede ser el producto de hidrocarburo C5 volátil directo y final de la eliminación de pirofosfato del 3,3-dimetilalil difosfato (DMAPP). Puede que no implique la unión o polimerización de moléculas de IPP a moléculas de DMAPP. El término “isopreno” no pretende generalmente limitarse en cuanto a su método de producción a menos que se indique lo contrario en el presente documento.
Tal como se usa en el presente documento, el término “polipéptidos” incluye polipéptidos, proteínas, péptidos, fragmentos de polipéptidos y polipéptidos de fusión.
Tal como se usa en el presente documento, un “polipéptido aislado” no forma parte de una biblioteca de polipéptidos, tal como una biblioteca de 2, 5, 10, 20, 50 polipéptidos diferentes o más y está separado de al menos un componente con el que aparece en la naturaleza. Se puede obtener un polipéptido aislado, por ejemplo, mediante la expresión de un ácido nucleico recombinante que codifica para el polipéptido.
Por “polipéptido heterólogo” se entiende un polipéptido codificado por una secuencia de ácido nucleico derivada de un organismo, una especie o cepa diferente de la célula huésped. En algunas realizaciones, un polipéptido heterólogo no es idéntico a un polipéptido de tipo natural que se encuentra en la misma célula huésped en la naturaleza.
Tal como se usa en el presente documento, un “ácido nucleico” se refiere a dos o más desoxirribonucleótidos y/o ribonucleótidos unidos covalentemente entre sí en forma o bien monocatenaria o bien bicatenaria.
Por “ácido nucleico recombinante” se entiende un ácido nucleico de interés que está libre de uno o más ácidos nucleicos (por ejemplo, genes) que, en el genoma que se produce en la naturaleza del organismo del cual deriva el ácido nucleico de interés, flanquean el ácido nucleico de interés. Por tanto, el término incluye, por ejemplo, un ADN recombinante que se incorpora en un vector, en un plásmido o virus de replicación autónoma, o en el ADN genómico de una procariota o eucariota, o que existe como molécula independiente (por ejemplo, un ADNc, un fragmento de ADN genómico, o un fragmento de ADNc producido mediante PCR o mediante digestión con endonucleasas de restricción) independientemente de otras secuencias.
Por “ácido nucleico heterólogo” se entiende una secuencia de ácido nucleico derivada de un organismo, una especie o cepa diferente de la célula huésped. En algunas realizaciones, el ácido nucleico heterólogo no es idéntico a un ácido nucleico de tipo natural que se encuentra en la misma célula huésped en la naturaleza. Por ejemplo, un ácido nucleico codificado por el gen de la fosfocetolasa de Burkholderia phytofirmans, Lactobacillus buchneri, Bifidobacterium gallicum, Bifidobacterium dentium, Bifidobacterium bifidum y/o Clostridium acetobutylicum y se usa para transformar una E. coli es un ácido nucleico heterólogo.
Tal como se usa en el presente documento, los términos “fosfocetolasa”, “enzima fosfocetolasa” o “polipéptido de fosfocetolasa” se usan indistintamente y se refieren a un polipéptido que convierte 5-fosfato en gliceraldehído 3-fosfato y acetil-fosfato y/o convierte fructosa 6-fosfato en eritrosa 4-fosfato y acetil-fosfato. Generalmente, las fosfocetolasas actúan sobre las cetosas. En determinadas realizaciones, el polipéptido de fosfocetolasa cataliza la conversión de xilulosa 5-fosfato en gliceraldehído 3-fosfato y acetil-fosfato. En otras realizaciones, el polipéptido de fosfocetolasa cataliza la conversión de fructosa 6-fosfato en eritrosa 4-fosfato y acetil-fosfato. En otras realizaciones, el polipéptido de fosfocetolasa cataliza la conversión de sedoheptulosa-7-fosfato en un producto (por ejemplo, ribosa-5-fosfato) y acetil-fosfato.
Tal como se usa en el presente documento, una “secuencia de control de expresión” significa una secuencia de ácido nucleico que dirige la transcripción de un ácido nucleico de interés. Una secuencia de control de expresión puede ser un promotor, tal como un promotor constitutivo o inducible, o un potenciador. Una secuencia de control de expresión puede ser “nativa” o heteróloga. Una secuencia de control de expresión nativa deriva del mismo organismo, especie o cepa que el gen que se expresa. Una secuencia de control de expresión heteróloga deriva de un organismo, una especie o cepa diferente que el gen que se expresa. Un “promotor inducible” es un promotor que es activo según la regulación ambiental o de desarrollo.
Por “unido operativamente” se entiende una unión funcional entre una secuencia de control de expresión de ácido nucleico (tal como un promotor) y una segunda secuencia de ácido nucleico, en la que la secuencia de control de expresión dirige la transcripción del ácido nucleico correspondiente a la segunda secuencia.
Tal como se usa en el presente documento, los términos “medio mínimo” o “medios mínimos” se refieren a medios de crecimiento que contienen los nutrientes mínimos posibles para el crecimiento celular, generalmente sin la presencia de aminoácidos. El medio mínimo contiene normalmente: (1) una fuente de carbono para el crecimiento bacteriano; (2) diversas sales, que pueden variar entre especies bacterianas y condiciones de crecimiento; y (3) agua. La fuente de carbono puede variar significativamente, desde azúcares simples como la glucosa hasta hidrolizados más complejos de otra biomasa, tal como el extracto de levadura, tal como se explica con más detalle a continuación. Las sales proporcionan generalmente elementos esenciales tales como magnesio, nitrógeno, fósforo y azufre para permitir que las células puedan sintetizar proteínas y ácidos nucleicos. El medio mínimo también puede complementarse con agentes selectivos, tales como antibióticos, para seleccionar el mantenimiento de determinados plásmidos y similares. Por ejemplo, si un microorganismo es resistente a determinado antibiótico, tal como la ampicilina o la tetraciclina, entonces ese antibiótico puede añadirse al medio para impedir que crezcan células que carecen de la resistencia. El medio puede complementarse con otros compuestos según sea necesario para seleccionar las características fisiológicas o bioquímicas deseadas, tales como aminoácidos particulares y similares.
Tal como se usa en el presente documento, el término “isoprenoide” se refiere a una clase grande y diversa de clase de compuestos orgánicos que se producen de manera natural compuestos por dos o más unidades de hidrocarburos, cada una de las cuales consiste en cinco átomos de carbono dispuestos en un patrón específico. Tal como se usa en el presente documento, “isopreno” se excluye expresamente de la definición de “isoprenoide”.
Tal como se usa en el presente documento, el término “terpenoide” se refiere a una clase grande y diversa de moléculas orgánicas derivadas de unidades de isoprenoide de cinco carbonos ensambladas y modificadas de diversas maneras y clasificadas en grupos según el número de unidades de isoprenoide usadas en los miembros del grupo. Los hemiterpenoides tienen una unidad de isoprenoide. Los monoterpenoides tienen dos unidades de isoprenoide. Los sesquiterpenoides tienen tres unidades de isoprenoide. Los diterpenoides tienen cuatro unidades de isopreno. Los sesterterpenoides tienen cinco unidades de isoprenoide. Los triterpenoides tienen seis unidades de isoprenoide. Los tetraterpenoides tienen ocho unidades de isoprenoide. Los politerpenoides tienen más de ocho unidades de isoprenoide.
Tal como se usa en el presente documento, “precursor de isoprenoides” se refiere a cualquier molécula que se usa por organismos en la biosíntesis de terpenoides o isoprenoides. Los ejemplos no limitativos de moléculas precursoras de isoprenoides incluyen, por ejemplo, mevalonato (por ejemplo, ácido mevalónico (MVA)), isopentenil pirofosfato (IPP) y dimetilalil difosfato (DMAPP).
Tal como se usa en el presente documento, el término “rendimiento másico” se refiere a la masa del producto producido por las células recombinantes dividida entre la masa de la glucosa consumida por las células recombinantes expresada como porcentaje.
Por “productividad específica” se entiende la masa del producto producido por la célula recombinante dividida entre el producto del tiempo de producción, la densidad celular y el volumen del cultivo.
Por “título” se entiende la masa del producto producido por las células recombinantes dividido entre el volumen del cultivo.
Tal como se usa en el presente documento, el término “índice de productividad celular (CPI)” se refiere a la masa del producto producido por las células recombinantes dividido entre la masa de las células recombinantes producidas en el cultivo.
A menos que se defina lo contrario en el presente documento, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que entiende comúnmente un experto habitual en la técnica a la que se refiere esta invención.
Tal como se usa en el presente documento, los términos en singular “un(o)”, “una” y “el/la” incluyen la referencia en plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario.
Se pretende que cada limitación numérica máxima dada a lo largo de esta memoria descriptiva incluya todas las limitaciones numéricas inferiores, como si tales limitaciones numéricas inferiores estuvieran escritas expresamente en el presente documento. Cada limitación numérica mínima dada a lo largo de esta memoria descriptiva incluirá cada limitación numérica superior, como si tales limitaciones numéricas superiores estuvieran escritas expresamente en el presente documento. Cada intervalo numérico dado a lo largo de esta memoria descriptiva incluirá cada intervalo numérico más estrecho que se encuentre dentro de un intervalo numérico más amplio, como si tales intervalos numéricos más estrechos estuvieran escritos expresamente en el presente documento.
Células recombinantes que expresan un polipéptido de fosfocetolasa
Las enzimas fosfocetolasa catalizan la conversión de xilulosa 5-fosfato en gliceraldehído 3-fosfato y acetil-fosfato y/o la conversión de fructosa 6-fosfato en eritrosa 4-fosfato y acetil-fosfato. En determinadas realizaciones, la enzima fosfocetolasa es capaz de catalizar la conversión de xilulosa 5-fosfato en gliceraldehído 3-fosfato y acetil-fosfato. En otras realizaciones, la enzima fosfocetolasa es capaz de catalizar la conversión de fructosa 6-fosfato en eritrosa 4-fosfato y acetil-fosfato. En otras realizaciones, el polipéptido de fosfocetolasa cataliza la conversión de sedoheptulosa-7-fosfato en un producto (por ejemplo, ribosa-5-fosfato) y acetil-fosfato. Por tanto, sin querer restringirse a la teoría, la expresión de la fosfocetolasa tal como se expone en el presente documento puede dar como resultado un aumento de la cantidad de acetil-fosfato producido a partir de una fuente de hidratos de carbono. Este acetil-fosfato se puede convertir en acetil-CoA que luego puede utilizarse mediante las actividades enzimáticas de la ruta de MVA para producir mevalonato, moléculas precursoras de isoprenoides, isopreno y/o isoprenoides o puede utilizarse para producir metabolitos derivados de acetil-CoA.
Tal como se usa en el presente documento, el término “metabolito derivado de acetil-CoA” puede referirse a un metabolito resultante de la conversión catalítica de acetil-CoA en dicho metabolito. La conversión puede ser una reacción de una sola etapa o una reacción de múltiples etapas. Por ejemplo, la acetona es un metabolito derivado de acetil-CoA que se produce a partir de acetil-CoA mediante una reacción de tres etapas (por ejemplo, una reacción de múltiples etapas): 1) la condensación de dos moléculas de acetil-CoA en acetoacetil-CoA por acetil-CoA acetiltransferasa; 2) la conversión de acetoacetil-CoA en acetoacetato mediante una reacción con ácido acético o ácido butírico que da como resultado la producción de acetil-CoA o butiril-CoA; y 3) conversión de acetoacetato en acetona mediante una etapa de descarboxilación catalizada por acetoacetato descarboxilasa. La acetona se puede convertir posteriormente en isopropanol, isobuteno y/o propeno que también se contemplan expresamente en el presente documento como metabolitos derivados de acetil-CoA. En algunas realizaciones, el metabolito derivado de acetil-CoA se selecciona del grupo que consiste en policétidos, polihidroxibutirato, alcoholes grasos y ácidos grasos. En algunas realizaciones, el metabolito derivado de acetil-CoA se selecciona del grupo que consiste en ácido glutámico, glutamina, aspartato, asparagina, prolina, arginina, metionina, treonina, cisteína, succinato, lisina, leucina e isoleucina. En algunas realizaciones, el metabolito derivado de acetil-CoA se selecciona del grupo que consiste en acetona, isopropanol, isobuteno y propeno. Así, puede aumentarse la cantidad de estos compuestos (por ejemplo, acetil-CoA, metabolito derivado de acetil-CoA, acetil-P, E4P, etc.) producidos a partir de un sustrato de hidrato de carbono.
La producción de acetil-P y acetil-CoA puede aumentarse sin que el aumento se refleje en una mayor concentración intracelular. En determinadas realizaciones, las concentraciones intracelulares de acetil-P o acetil-CoA permanecerán inalteradas o incluso disminuirán, incluso aunque tenga lugar la reacción de la fosfocetolasa.
Polipéptidos y ácidos nucleicos de fosfocetolasa a modo de ejemplo
Los ácidos nucleicos de fosfocetolasa a modo de ejemplo incluyen ácidos nucleicos que codifican para un polipéptido, fragmento de un polipéptido, péptido o polipéptido de fusión que tiene al menos una actividad de un polipéptido de fosfocetolasa. Los polipéptidos y ácidos nucleicos de fosfocetolasa a modo de ejemplo incluyen polipéptidos y ácidos nucleicos que se producen de manera natural a partir de cualquiera de los organismos fuente descritos en el presente documento, así como polipéptidos y ácidos nucleicos mutantes derivados de cualquiera de los organismos fuente descritos en el presente documento (véanse, por ejemplo, las figuras 2-24 y el ejemplo 2). Además, la tabla 1 y la tabla 2 proporcionan una lista no limitativa de determinadas fosfocetolasas a modo de ejemplo de diferentes especies que pueden utilizarse dentro de realizaciones de la invención.
Las características bioquímicas de las fosfocetolasas a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, expresión de proteínas, solubilidad de proteínas y actividad. Las fosfocetolasas también pueden seleccionarse basándose en otras características, incluyendo, pero sin limitarse a, la diversidad entre diferentes tipos de organismos (por ejemplo, bacterias gram-positivas, cianobacterias, actinomicetos), organismos aerobios facultativos a baja temperatura, parientes cercanos a una especie deseada (por ejemplo, E. coli) y termotolerancia.
En algunos casos, pueden seleccionarse fosfocetolasas de determinados organismos si los organismos carecen de un gen de la fosfofructocinasa en su genoma.
En aún otro ejemplo, las fosfocetolasas pueden seleccionarse basándose en una estructura secundaria de la secuencia de aminoácidos y/o el método descrito en el ejemplo 1.
En todavía otro ejemplo, las fosfocetolasas pueden seleccionarse basándose en un ensayo in vitro tal como se describe en el ejemplo 6.
En todavía otro ejemplo, las fosfocetolasas pueden seleccionarse basándose en un ensayo in vivo tal como se describe en el ejemplo 7. En algunos aspectos, se proporciona en el presente documento un método para determinar la presencia de actividad fosfocetolasa in vivo de un polipéptido que comprende (a) cultivar una célula recombinante que comprende una secuencia de ácido nucleico heterólogo que codifica para dicho polipéptido en el que la célula recombinante es defectuosa en la actividad transcetolasa (tktAB) en condiciones de cultivo con glucosa o xilosa como fuente de carbono; (b) evaluar el crecimiento celular de la célula recombinante y (c) determinar la presencia de actividad fosfocetolasa in vivo de dicho polipéptido basándose en la cantidad de crecimiento celular observado. En algunos aspectos, se proporciona en el presente documento un método de identificación de un polipéptido con actividad fosfocetolasa que comprende (a) cultivar una célula recombinante que comprende una secuencia de ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido sospechoso de tener actividad fosfocetolasa en el que la célula recombinante es defectuosa en la actividad transcetolasa (tktAB) en condiciones de cultivo con glucosa o xilosa como fuente de carbono; (b) evaluar el crecimiento celular de la célula recombinante y (c) identificar el polipéptido con actividad fosfocetolasa cuando se observa crecimiento celular. En algunos aspectos, se proporciona en el presente documento un método para detectar la actividad fosfocetolasa in vivo de un polipéptido en una célula recombinante que comprende (a) cultivar una célula recombinante que comprende una secuencia de ácido nucleico heterólogo que codifica para dicho polipéptido en el que la célula recombinante es defectuosa en la actividad transcetolasa (tktAB) en condiciones de cultivo con glucosa o xilosa como fuente de carbono; (b) evaluar el crecimiento celular de la célula recombinante y (c) detectar la actividad fosfocetolasa in vivo de dicho polipéptido basándose en la presencia de crecimiento celular.
Tal como se proporciona en el presente documento, la actividad fosfocetolasa puede mejorar la producción de metabolitos derivados de acetil-CoA, precursores de isoprenoides (por ejemplo, IPP), isopreno y/o isoprenoides. Se proporciona en el presente documento un huésped recombinante que comprende fosfocetolasa en el que las células presentan al menos una propiedad de interés para mejorar la producción de metabolitos derivados de acetil-CoA, precursores de isoprenoides (por ejemplo, IPP), isopreno y/o isoprenoides.
En algunos aspectos, al menos una propiedad de interés se selecciona de, pero no se limita a, el grupo, que consiste en productividad específica, rendimiento, título e índice de rendimiento celular (por ejemplo, crecimiento). Tal como se usa en el presente documento, “índice de rendimiento” se refiere a la actividad calculada por unidad en relación con una molécula parental. En algunos aspectos de cualquiera de las realizaciones descritas en el presente documento, la molécula parental usada en el cálculo del índice de rendimiento es una fosfocetolasa de E. gallinarum. En algunas realizaciones, la molécula parental tiene un índice de rendimiento de uno, por definición. En otras realizaciones, un índice de rendimiento mayor de uno (PI > 1,0) indica una actividad mejorada de una fosfocetolasa en comparación con la molécula parental (por ejemplo, una fosfocetolasa de E. gallinarum).
En determinadas realizaciones, las fosfocetolasas adecuadas para su uso en el presente documento incluyen fosfocetolasas solubles. Las técnicas para medir la solubilidad de proteínas se conocen bien en la técnica. Las técnicas para medir la solubilidad de proteínas incluyen las descritas en el presente documento en los ejemplos. En algunas realizaciones, una fosfocetolasa para su uso en el presente documento incluye aquellas con una solubilidad de al menos el 20%. En algunas realizaciones, la solubilidad de la fosfocetolasa está entre aproximadamente el 5% y aproximadamente el 100%, entre aproximadamente el 10% y aproximadamente el 100%, entre aproximadamente el 15% y aproximadamente el 100%, entre aproximadamente el 20% y aproximadamente el 100%, entre aproximadamente el 25% y aproximadamente el 100%, entre aproximadamente el 30% y aproximadamente el 100%, entre aproximadamente el 35% y aproximadamente el 100%, entre aproximadamente el 40% y aproximadamente el 100%, entre aproximadamente el 45% y aproximadamente el 100%, entre aproximadamente el 50% y aproximadamente el 100%, entre aproximadamente el 55% y aproximadamente el 100%, entre aproximadamente el 60% y aproximadamente el 100%, entre aproximadamente el 65% y aproximadamente el 100%, entre aproximadamente el 70% y aproximadamente el 100%, entre aproximadamente el 75% y aproximadamente el 100%, entre aproximadamente el 80% y aproximadamente 100%, entre aproximadamente el 85% y aproximadamente el 100%, o entre aproximadamente el 90% y aproximadamente el 100%. En algunas realizaciones, la solubilidad de la fosfocetolasa está entre aproximadamente el 5% y aproximadamente el 100%. En algunas realizaciones, la solubilidad está entre el 5% y el 100%. En algunas realizaciones, la solubilidad de la fosfocetolasa es menor de aproximadamente el 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20 o el 10, pero no menor de aproximadamente el 5%. En algunas realizaciones, la solubilidad es mayor de aproximadamente el 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 o el 95%.
Las fosfocetolasas con una característica cinética deseada aumentan la producción de isopreno. Las características cinéticas incluyen, pero no se limitan a, actividad específica, Kcat, Ki y Km. En algunos aspectos, la kcat es de al menos aproximadamente 0,2, 0,4, 0,6, 0,8, 1,0, 1,2, 1,4, 1,6, 1,8, 2,0, 2,2, 2,6, 2,8, 3,0, 3,2, 3,4, 3,6, 3,8, 4,0, 4,2, 4.4, 4,6, 4,8, 5,0, 5,2, 5,4, 5,6, 5,8, 6,0, 6,2, 6,4, 6,6, 6,8, 7,0, 7,2, 7,6, 7,8, 8,0, 8,1, 8,2, 8,4, 8,6, 8,8, 9,0, 9,2, 9,4, 9,6, 9,8, 10,0, 10,2, 10,4, 10,6, 10,8, 11,0, 11,2, 11,4, 11,6, 11,8, 12,0, 12,2, 12,4, 12,6, 12,8, 13,0, 13,2, 13,4, 13,6, 13.8, 14,0, 14,2, 14,4, 14,6, 14,8, 15,0, 15,2, 15,4, 15,6, 15,8, 16,0, 16,2, 16,4, 16,6, 16,8, 17,0, 17,2, 17,4, 17,6, 17.8, 18,0, 18,2, 18,4, 18,6, 18,8, 19,0, 19,2, 19,4, 19,6, 19,8, 20,0, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 90, 95, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700 u 800 En otros aspectos, la kcat es de al menos aproximadamente 0,2, 0,4, 0,6, 0,8, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1.4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3,0, 3,2, 3,4, 3,6, 3,8, 4,0, 4,2, 4,4, 4,6, 4,8, 5,0, 5.2, 5,4, 5,6, 5,8, 6,0, 6,2, 6,4, 6,6, 6,8, 7,0, 7,2, 7,4, 7,6, 7,8, 8,0, 8,1, 8,2, 8,4, 8,6, 8,8, 9,0, 9,2, 9,4, 9,6, 9,8, 10,0, 10.2, 10,4, 10,6, 10,8, 11,0, 11,2, 11,4, 11,6, 11,8, 12,0, 12,2, 12,4, 12,6, 12,8, 13,0, 13,2, 13,4, 13,6, 13,8, 14,0, 14.2, 14,4, 14,6, 14,8, 15,0, 15,2, 15,4, 15,6, 15,8, 16,0, 16,2, 16,4 o 16,6.
En algunos aspectos, la Km es de al menos aproximadamente 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, 10, 10,5, 11, 11,5, 12, 12,5, 13, 13,5, 14, 14,5, 15, 16, 17, 17,5, 18, 18,5, 19, 19,5, 20, 20,5, 21, 21,5, 22, 22.5, 23, 23,5, 24, 24,5, 25, 25,5, 26, 26,5, 27, 27,5, 28, 28,5, 29, 29,5, 30, 30,5, 31, 31,5, 32, 32,5, 33, 33,5, 34, 34.5, 35, 35,5, 36, 36,5, 37, 37,5, 38, 38,5, 39, 39,5, 40, 40,5, 41, 41,5, 42, 42,5, 43, 43,5, 44, 44,5, 45, 45,5, 46, 46.5, 47, 47,5, 48, 48,5, 49, 49,5, 50, 50,5, 51, 51,5, 52, 52,5, 53, 53,5, 54, 54,5, 55, 55,5 o 56. En otros aspectos, la km es de al menos aproximadamente 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, 10, 10,5, 11, 11,5, 12, 12.5, 13, 13,5, 14, 14,5, 15, 16, 17, 17,5, 18, 18,5, 19, 19,5, 20, 20,5, 21, 21,5 o 22.
Las propiedades de interés incluyen, pero no se limitan a, el aumento de la actividad intracelular, la productividad específica, el rendimiento y el índice de rendimiento celular en comparación con una célula recombinante que no comprende el polipéptido de fosfocetolasa. En algunas realizaciones, la productividad específica aumenta al menos aproximadamente 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 3, 4, 5, 67, 8, 9, 10 veces o más. En una realización, la productividad específica es de aproximadamente 40 mg/l/OD/h. En algunas realizaciones, el aumento de rendimiento de al menos aproximadamente 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 3, 4, 5 veces o más. En otras realizaciones, el aumento del rendimiento de MVA de al menos aproximadamente 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1.5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 3, 4, 5 veces o más. En otras realizaciones, el aumento del rendimiento de isopreno de al menos aproximadamente 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 3, 4, 5 veces o más.
En otras realizaciones, los valores del índice de rendimiento para propiedades de interés, incluyendo, pero sin limitarse a, (a) crecimiento celular en glucosa, (b) crecimiento celular en xilosa, (c) crecimiento celular en glucosasfosfato o (d) producción de acetil-fosfato intracelular para una célula recombinante que comprende un polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa tal como se expone en el presente documento y uno o más ácidos nucleicos que codifican para uno o más polipéptidos de la ruta de MVA completa es mayor de 1, tal como mayor de 1,1, tal como mayor de 1,2, mayor de 1,4, mayor de 1,6, mayor de 1,8, mayor de 2, mayor de 2,2, mayor de 2,4, mayor de 2,6, mayor de 2,8, mayor de 3, mayor de 3,2, mayor de 3,4, mayor de 3,6, mayor de 3,8, mayor de 4, mayor de 4,2, mayor de 4,4, mayor de 4,6, mayor de 4,8, mayor de 5, mayor de 5,2, mayor de 5,4, mayor de 5,6, mayor de 5,8, mayor de 6, mayor de 6,2, mayor de 6,4, mayor de 6,6, mayor de 6,8, mayor de 7, mayor de 7,2, mayor de 7,4, mayor de 7,6, mayor de 7,8, mayor de 8, mayor de 8,2, mayor de 8,4, mayor de 8,6, mayor de 8,8, 9, mayor de 9,2, mayor de 9,4, mayor de 9,6, mayor de 9,8 o mayor de 10 o más en comparación con un polipéptido parental que tiene actividad fosfocetolasa (por ejemplo, una fosfocetolasa de E. gallinarum).
En otras realizaciones, los valores del índice de rendimiento para las propiedades de interés, incluyendo, pero sin limitarse a, (a) la solubilidad de proteínas, (b) la expresión de proteínas o (c) la actividad específica de F6P para un polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa en una célula recombinante que comprende uno o más ácidos nucleicos que codifican para uno o más polipéptidos de la ruta de MVA completa es mayor de 1, tal como mayor de 1,1, tal como mayor de 1,2, mayor de 1,4, mayor de 1,6, mayor de 1,8, mayor de 2, mayor de 2,2, mayor de 2,4, mayor de 2,6, mayor de 2,8, mayor de 3, mayor de 3,2, mayor de 3,4, mayor de 3,6, mayor de 3,8, mayor de 4, mayor de 4,2, mayor de 4,4, mayor de 4,6, mayor de 4,8, mayor de 5, mayor de 5,2, mayor de 5,4, mayor de 5,6, mayor de 5,8, mayor de 6, mayor de 6,2, mayor de 6,4, mayor de 6,6, mayor de 6,8, mayor de 7, mayor de 7,2, mayor de 7,4, mayor de 7,6, mayor de 7,8, mayor de 8, mayor de 8,2, mayor de 8,4, mayor de 8,6, mayor de 8,8, 9, mayor de 9,2, mayor de 9,4, mayor de 9,6, mayor de 9,8 o mayor de 10 o más en comparación con un polipéptido parental que tiene actividad fosfocetolasa (por ejemplo, una fosfocetolasa de E. gallinarum).
En otras realizaciones, los valores del índice de rendimiento para las propiedades de interés, incluyendo pero sin limitarse a, (a) la solubilidad de proteínas de rendimiento de isopreno o (b) la productividad específica de isopreno para una célula recombinante que comprende (i) un polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa, (ii) uno o más ácidos nucleicos que codifican para uno o más polipéptidos de la ruta de MVA completa, y (iii) un ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido de isopreno sintasa es mayor de 1, tal como mayor de 1,1, tal como mayor de 1,2, mayor de 1,4, mayor de 1,6, mayor de 1,8, mayor de 2, mayor de 2,2, mayor de 2,4, mayor de 2,6, mayor de 2,8, mayor de 3, mayor de 3,2, mayor de 3,4, mayor de 3,6, mayor de 3,8, mayor de 4, mayor de 4,2, mayor de 4,4, mayor de 4,6, mayor de 4,8, mayor de 5, mayor de 5,2, mayor de 5,4, mayor de 5,6, mayor de 5,8, mayor de 6, mayor de 6,2, mayor de 6,4, mayor de 6,6, mayor de 6,8, mayor de 7, mayor de 7,2, mayor de 7,4, mayor de 7,6, mayor de 7,8, mayor de 8, mayor de 8,2, mayor de 8,4, mayor de 8,6, mayor de 8,8, 9, mayor de 9,2, mayor de 9,4, mayor de 9,6, mayor de 9,8 o mayor de 10 o más en comparación con un polipéptido parental que tiene actividad fosfocetolasa (por ejemplo, una fosfocetolasa de E. gallinarum).
En otras realizaciones, un aumento del índice de rendimiento celular de al menos aproximadamente 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 3, 4, 5 veces o más en comparación con una molécula parental. En otras realizaciones, el índice de rendimiento celular es mayor de cualquiera de aproximadamente 0,1 a 0,5, de aproximadamente 0,25 a 0,75, de aproximadamente 0,5 a 1, de aproximadamente 0,75 a 1,25, de aproximadamente 1 a 1,5, de aproximadamente 1,25 a 1,75, de aproximadamente 1,5 a 2, de aproximadamente 1,75 a 2,25, de aproximadamente 2 a 2,5, de aproximadamente 2,25 a 2,75, de aproximadamente 2.5 a 3, de aproximadamente 2,75 a 3,25, de aproximadamente 3 a 3,5, de aproximadamente 3,25 a 3,75, de aproximadamente 3,5 a 4, de aproximadamente 3,75 a 4,25, de aproximadamente 4 a 4,5, de aproximadamente 4,25 a 4,75, de aproximadamente 4,5 a 5, de aproximadamente 4,75 a 5,25, de aproximadamente 5 a 5,5, de aproximadamente 5,25 a 5,75, de aproximadamente 5,5 a 6, de aproximadamente 6,25 a 6,75, de aproximadamente 6.5 a 7, de aproximadamente 6,75 a 7,25, de aproximadamente 7 a 7,5, de aproximadamente 7,75 a 8,25, de aproximadamente 8 a 8,5, de aproximadamente 8,25 a 8,75, de aproximadamente 8,5 a 9, de aproximadamente 8,75 a 9,25, de aproximadamente 9 a 9,5, de aproximadamente 9,25 a 9,75 o de aproximadamente 9,5 a 10 o más en comparación con una molécula parental. En otras realizaciones, el índice de rendimiento celular es mayor de cualquiera de aproximadamente 0,1 a 2, aproximadamente 1-3, aproximadamente 2-4, aproximadamente 3-5, aproximadamente 4-6, aproximadamente 5-7, aproximadamente 6-8, aproximadamente 7-9 o aproximadamente 8­ 10 o más en comparación con una molécula parental. En algunas realizaciones, la molécula parental es una fosfocetolasa de E. gallinarum. En otras realizaciones, la actividad intracelular aumenta al menos aproximadamente 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 veces o más.
Se proporciona en el presente documento una fosfocetolasa aislada de un microorganismo. En algunos aspectos, una fosfocetolasa aislada del grupo que consiste en una bacteria gram-positiva, una bacteria gram-negativa, una bacteria aerobia, una bacteria anaerobia, una bacteria termófila, una bacteria psicrófila, una bacteria halófila o una cianobacteria. En algunos aspectos, una fosfocetolasa aislada de un hongo. En otros aspectos, los ácidos nucleicos de fosfocetolasa a modo de ejemplo incluyen, por ejemplo, una fosfocetolasa aislada de Burkholderia phytofirmans, Lactobacillus buchneri, Bifidobacterium gallicum, Bifidobacterium dentium, Bifidobacterium bifidum y/o Clostridium acetobutylicum. En otros aspectos, los ácidos nucleicos de fosfocetolasa a modo de ejemplo incluyen, por ejemplo, una fosfocetolasa aislada de Mycobacterium gilvum, Shewanella baltica, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus crispatus, Bifidobacterium longum, Leuconostoc citreum, Bradyrhizobium sp., Enterococcus faecium, Brucella microti, Lactobacillus salivarius, Streptococcus agalactiae, Rhodococcus imtechensis, Burkholderia xenovorans, Mycobacterium intracellulare, Nitrosomonas sp., Schizosaccharomyces pombe, Leuconostoc mesenteroides, Streptomyces sp., Lactobacillus buchneri, Streptomyces ghanaensis, Cyanothece sp. y/o Neosartorya fischeri. En otros aspectos, los ácidos nucleicos de fosfocetolasa a modo de ejemplo incluyen, por ejemplo, una fosfocetolasa aislada de Enterococcus faecium, Listeria grayi, Enterococcus gallinarum, Enterococcus saccharolyticus, Enterococcus casseliflavus, Mycoplasma alligatoris, Carnobacterium sp., Melissococcus plutonius, Tetragenococcus halophilusy/o Mycoplasma arthritidis. En otros aspectos más, los ácidos nucleicos de fosfocetolasa a modo de ejemplo incluyen, por ejemplo, una fosfocetolasa aislada de Streptococcus agalactiae, Mycoplasma agalactiae, Streptococcus gordonii, Kingella oralis, Mycoplasma fermentans, Granulicatella adiacens, Mycoplasma hominis, Mycoplasma crocodyli, Mycobacterium bovis, Neisseria sp., Streptococcus sp., Eremococcus coleocola, Granulicatella elegans, Streptococcus parasanguinis, Aerococcus urinae, Kingella kingae, Streptococcus australis, Streptococcus criceti y/o Mycoplasma columbinum.
Otras fosfocetolasas que pueden usarse incluyen, pero no se limitan a, B. longum, L. plantarum, C. acetobutylicum, L. reuteri, L. paraplantarum, R. palustris, Nostoc punctiforme, B. animalis, B. breve, G. vaginalis, E. gallinarum, M. paludis, Panteoa sp., R. aquatilis, N. punctiforme, S. avermetilis y T. fusca. Las fosfocetolasas adicionales que pueden usarse incluyen, pero no se limitan a, Burkholderia phytofirmans, Lactobacillus buchneri, Bifidobacterium gallicum, Bifidobacterium dentium, Bifidobacterium bifidum y Clostridium acetobutylicum.
Pueden usarse métodos convencionales para determinar si un polipéptido tiene actividad de péptido de fosfocetolasa midiendo la capacidad del péptido para convertir D-fructosa 6-fosfato o D-xilulosa 5-fosfato en acetil-P. El acetil-P puede convertirse luego en ferrilacetil-hidroxamato, que puede detectarse espectrofotométricamente (Meile et al., J. Bact. 183: 2929-2936, 2001). Cualquier polipéptido identificado como que tiene actividad de péptido de fosfocetolasa tal como se describe en el presente documento es adecuado para su uso en la presente invención. En algunas realizaciones, el polipéptido de fosfocetolasa cataliza la conversión de xilulosa 5-fosfato en gliceraldehído 3-fosfato y acetil-fosfato. En otras realizaciones, el polipéptido de fosfocetolasa cataliza la conversión de fructosa 6-fosfato en eritrosa 4-fosfato y acetil-fosfato. En todavía otras realizaciones, el polipéptido de fosfocetolasa capaz de catalizar la conversión de sedoheptulosa-7-fosfato en ribosa-5-fosfato y acetil-fosfato. En todavía otras realizaciones, el polipéptido de fosfocetolasa cataliza la conversión de xilulosa 5-fosfato en gliceraldehído 3-fosfato y acetil-fosfato y/o la conversión de fructosa 6-fosfato en eritrosa 4-fosfato y acetil-fosfato y/o la conversión de sedoheptulosa-7-fosfato en ribosa-5-fosfato y acetil-fosfato.
En cualquiera de las realizaciones descritas en el presente documento, un ácido nucleico de fosfocetolasa puede tener una identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 95%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86% o el 85% con cualquiera de las secuencias de ácido nucleico de fosfocetolasa descritas en el presente documento. En algunas realizaciones, el ácido nucleico de fosfocetolasa codificado por el gen de la fosfocetolasa de Mycobacterium gilvum puede tener una identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 95%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86% o el 85% con SEQ ID NO: 52. En algunas realizaciones, el ácido nucleico de fosfocetolasa codificado por el gen de la fosfocetolasa de Shewanella baltica puede tener una identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 95%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86% o el 85% con SEQ ID NO: 53. En algunas realizaciones, el ácido nucleico de fosfocetolasa codificado por el gen de la fosfocetolasa de Lactobacillus rhamnosus puede tener una identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 95%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86% o el 85% con SEQ ID NO: 54. En algunas realizaciones, el ácido nucleico de fosfocetolasa codificado por el gen de la fosfocetolasa de Lactobacillus crispatus puede tener una identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 95%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86% o el 85% con SEQ ID NO: 55. En algunas realizaciones, el ácido nucleico de fosfocetolasa codificado por el gen de la fosfocetolasa de Leuconostoc citreum puede tener una identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 95%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86% o el 85% con SEQ ID NO: 56. En algunas realizaciones, el ácido nucleico de fosfocetolasa codificado por el gen de la fosfocetolasa de Bradyrhizobium sp. puede tener una identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 95%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86% o el 85% con SEQ ID NO: 57. En algunas realizaciones, el ácido nucleico de fosfocetolasa codificado por el gen de la fosfocetolasa de Brucella microti puede tener una identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 95%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86% o el 85% con SEQ ID NO: 58. En algunas realizaciones, el ácido nucleico de fosfocetolasa codificado por el gen de la fosfocetolasa de Lactobacillus salivarius puede tener una identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 95%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86% o el 85% con SEQ ID NO: 59. En algunas realizaciones, el ácido nucleico de fosfocetolasa codificado por el gen de la fosfocetolasa de Rhodococcus imtechensis puede tener una identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 95%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86% o el 85% con SEQ ID NO: 60. En algunas realizaciones, el ácido nucleico de fosfocetolasa codificado por el gen de la fosfocetolasa de Burkholderia xenovorans puede tener una identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 95%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86% o el 85% con SEQ ID NO: 61. En algunas realizaciones, el ácido nucleico de fosfocetolasa codificado por el gen de la fosfocetolasa de Mycobacterium intracellulare puede tener una identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 95%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86% o el 85% con SEQ ID NO: 62. En algunas realizaciones, el ácido nucleico de fosfocetolasa codificado por el gen de la fosfocetolasa de Nitrosomonas sp. puede tener una identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 95%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86% o el 85% con SEQ ID NO: 63. En algunas realizaciones, el ácido nucleico de fosfocetolasa codificado por el gen de la fosfocetolasa de Schizosaccharomyces pombe puede tener una identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 95%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86% o el 85% con SEQ ID NO: 64. En algunas realizaciones, el ácido nucleico de fosfocetolasa codificado por el gen de la fosfocetolasa de Lactobacillus buchneri puede tener una identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 95%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86% o el 85% con SEQ ID NO: 65. En algunas realizaciones, el ácido nucleico de fosfocetolasa codificado por el gen de la fosfocetolasa de Streptomyces ghanaensis puede tener una identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 95%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86% o el 85% con SEQ ID NO: 66. En algunas realizaciones, el ácido nucleico de fosfocetolasa codificado por el gen de la fosfocetolasa de Cyanothece sp. puede tener una identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 95%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86% o el 85% con SEQ ID NO: 67. En algunas realizaciones, el ácido nucleico de fosfocetolasa codificado por el gen de la fosfocetolasa de Neosartorya fischeri puede tener una identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 95%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86% o el 85% con SEQ ID NO: 68. En algunas realizaciones, el ácido nucleico de fosfocetolasa codificado por el gen de la fosfocetolasa de Enterococcus faecium puede tener una identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 95%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86% o el 85% con SEQ ID NO: 69. En algunas realizaciones, el ácido nucleico de fosfocetolasa codificado por el gen de la fosfocetolasa de Listeria grayi puede tener una identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 95%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86% o el 85% con SEQ ID NO: 70. En algunas realizaciones, el ácido nucleico de fosfocetolasa codificado por el gen de la fosfocetolasa de Enterococcus casseliflavus puede tener una identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 95%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86% o el 85% con SEQ ID NO: 71. En algunas realizaciones, el ácido nucleico de fosfocetolasa codificado por el gen de la fosfocetolasa de Mycoplasma alligatoris puede tener una identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 95%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86% o el 85% con SEQ ID NO: 72. En algunas realizaciones, el ácido nucleico de fosfocetolasa codificado por el gen de la fosfocetolasa de Carnobacterium sp. puede tener una identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 95%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86% o el 85% con SEQ ID NO: 73. En algunas realizaciones, el ácido nucleico de fosfocetolasa codificado por el gen de la fosfocetolasa de Melissococcus plutonius puede tener una identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 95%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86% o el 85% con cualquiera de las SEQ ID NO: 74 y 76. En algunas realizaciones, el ácido nucleico de fosfocetolasa codificado por el gen de la fosfocetolasa de Tetragenococcus halophilus puede tener una identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 95%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86% o el 85% con SEQ ID NO: 75. En algunas realizaciones, el ácido nucleico de fosfocetolasa codificado por el gen de la fosfocetolasa de Mycoplasma arthritidis puede tener una identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 95%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86% o el 85% con SeQ ID NO: 77. En algunas realizaciones, el ácido nucleico de fosfocetolasa codificado por el gen de la fosfocetolasa de Streptococcus agalactiae puede tener una identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 95%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86% o el 85% con SEQ ID NO: 78. En algunas realizaciones, el ácido nucleico de fosfocetolasa codificado por el gen de la fosfocetolasa de Mycoplasma agalactiae puede tener una identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 95%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86% o el 85% con SEQ ID NO: 79. En algunas realizaciones, el ácido nucleico de fosfocetolasa codificado por el gen de la fosfocetolasa de Streptococcus gordonii puede tener una identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 95%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86% o el 85% con SEQ ID NO: 80. En algunas realizaciones, el ácido nucleico de fosfocetolasa codificado por el gen de la fosfocetolasa de Kingella oralis puede tener una identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 95%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86% o el 85% con SEQ ID NO: 81. En algunas realizaciones, el ácido nucleico de fosfocetolasa codificado por el gen de la fosfocetolasa de Mycoplasma fermentans puede tener una identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 95%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86% o el 85% con SEQ ID NO: 82. En algunas realizaciones, el ácido nucleico de fosfocetolasa codificado por el gen de la fosfocetolasa de Granulicatella adiacens puede tener una identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 95%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86% o el 85% con SEQ ID NO: 83. En algunas realizaciones, el ácido nucleico de fosfocetolasa codificado por el gen de la fosfocetolasa de Mycoplasma hominis puede tener una identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 95%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86% o el 85% con SEQ ID NO: 84. En algunas realizaciones, el ácido nucleico de fosfocetolasa codificado por el gen de la fosfocetolasa de Mycoplasma crocodyli puede tener una identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 95%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86% o el 85% con SeQ ID NO: 85. En algunas realizaciones, el ácido nucleico de fosfocetolasa codificado por el gen de la fosfocetolasa de Neisseria sp. puede tener una identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 95%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86% o el 85% con SEQ ID NO: 86. En algunas realizaciones, el ácido nucleico de fosfocetolasa codificado por el gen de la fosfocetolasa de Eremococcus coleocola puede tener una identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 95%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86% o el 85% con SEQ ID NO: 87. En algunas realizaciones, el ácido nucleico de fosfocetolasa codificado por el gen de la fosfocetolasa de Aerococcus urinae puede tener una identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 95%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86% o el 85% con SEQ ID NO: 88. En algunas realizaciones, el ácido nucleico de fosfocetolasa codificado por el gen de la fosfocetolasa de Kingella kingae puede tener una identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 95%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86% o el 85% con SEQ ID NO: 89. En algunas realizaciones, el ácido nucleico de fosfocetolasa codificado por el gen de la fosfocetolasa de Streptococcus criceti puede tener una identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 95%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86% o el 85% con cualquiera de las SEQ ID NO: 90 y 91. En algunas realizaciones, el ácido nucleico de fosfocetolasa codificado por el gen de la fosfocetolasa de Mycoplasma columbinum puede tener una identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 95%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86% o el 85% con SEQ ID NO: 92.
En algunas realizaciones, el polipéptido de fosfocetolasa puede tener una identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 95%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 80%, 75%, 70% o el 65% con el polipéptido de fosfocetolasa codificado por la secuencia de aminoácidos de la fosfocetolasa de Mycobacterium gilvum SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, el polipéptido de fosfocetolasa puede tener una identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 95%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 80%, 75% o el 70% con el polipéptido de fosfocetolasa codificado por la secuencia de aminoácidos de la fosfocetolasa de Shewanella baltica SEQ ID NO: 2. En algunas realizaciones, el polipéptido de fosfocetolasa puede tener una identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 95%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 80%, 75% o el 70% con el polipéptido de fosfocetolasa codificado por la secuencia de aminoácidos de la fosfocetolasa de Lactobacillus rhamnosus SEQ ID NO: 3. En algunas realizaciones, el polipéptido de fosfocetolasa puede tener una identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 95%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 80%, 75% o el 70% con el polipéptido de fosfocetolasa codificado por la secuencia de aminoácidos de la fosfocetolasa de Lactobacillus crispatus SEQ ID NO: 4. En algunas realizaciones, el polipéptido de fosfocetolasa puede tener una identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 95%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 80%, 75%, 70% o el 65% con el polipéptido de fosfocetolasa codificado por la secuencia de aminoácidos de la fosfocetolasa de Bifidobacterium longum SEQ ID NO: 5. En algunas realizaciones, el polipéptido de fosfocetolasa puede tener una identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 95%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 80%, 75% o el 70% con el polipéptido de fosfocetolasa codificado por la secuencia de aminoácidos de la fosfocetolasa de Leuconostoc citreum SEQ ID NO: 6. En algunas realizaciones, el polipéptido de fosfocetolasa puede tener una identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 95%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65% o el 60% con el polipéptido de fosfocetolasa codificado por la secuencia de aminoácidos de la fosfocetolasa de Bradyrhizobium sp. SEQ ID NO: 7. En algunas realizaciones, el polipéptido de fosfocetolasa puede tener una identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 95%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 80%, 75%, 70% o el 65% con el polipéptido de fosfocetolasa codificado por la secuencia de aminoácidos de la fosfocetolasa de Enterococcus faecium SEQ ID NO: 8. En algunas realizaciones, el polipéptido de fosfocetolasa puede tener una identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 95%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 80%, 75% o el 70% con el polipéptido de fosfocetolasa codificado por la secuencia de aminoácidos de la fosfocetolasa de Brucella microti SEQ iD NO: 9. En algunas realizaciones, el polipéptido de fosfocetolasa puede tener una identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 95%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65% o el 60% con el polipéptido de fosfocetolasa codificado por la secuencia de aminoácidos de la fosfocetolasa de Lactobacillus salivarius SEQ ID NO: 10. En algunas realizaciones, el polipéptido de fosfocetolasa puede tener una identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 95%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 80%, 75%, 70% o el 65% con el polipéptido de fosfocetolasa codificado por la secuencia de aminoácidos de la fosfocetolasa de Streptococcus agalactiae SEQ ID NO: 11. En algunas realizaciones, el polipéptido de fosfocetolasa puede tener una identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 95%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 80%, 75%, 70% o el 65% con el polipéptido de fosfocetolasa codificado por la secuencia de aminoácidos de la fosfocetolasa de Rhodococcus imtechensis SEQ ID NO: 12. En algunas realizaciones, el polipéptido de fosfocetolasa puede tener una identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 95%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 80%, 75%, 70% o el 65% con el polipéptido de fosfocetolasa codificado por la secuencia de aminoácidos de la fosfocetolasa de Burkholderia xenovorans SEQ ID NO: 13. En algunas realizaciones, el polipéptido de fosfocetolasa puede tener una identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 95%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65% o el 60% con el polipéptido de fosfocetolasa codificado por la secuencia de aminoácidos de la fosfocetolasa de Mycobacterium intracellulare SEQ ID NO: 14. En algunas realizaciones, el polipéptido de fosfocetolasa puede tener una identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 95%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65% o el 60% con el polipéptido de fosfocetolasa codificado por la secuencia de aminoácidos de la fosfocetolasa de Nitrosomonas sp. SEQ ID NO: 15. En algunas realizaciones, el polipéptido de fosfocetolasa puede tener una identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 95%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55% o el 50% con el polipéptido de fosfocetolasa codificado por la secuencia de aminoácidos de la fosfocetolasa de Schizosaccharomyces pombe SEQ ID NO: 16. En algunas realizaciones, el polipéptido de fosfocetolasa puede tener una identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 95%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 80%, 75% o el 70% con el polipéptido de fosfocetolasa codificado por la secuencia de aminoácidos de la fosfocetolasa de Leuconostoc mesenteroides SEQ ID NO: 17. En algunas realizaciones, el polipéptido de fosfocetolasa puede tener una identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 95%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55% o el 50% con el polipéptido de fosfocetolasa codificado por la secuencia de aminoácidos de la fosfocetolasa de Streptomyces sp. SEQ ID NO: 18. En algunas realizaciones, el polipéptido de fosfocetolasa puede tener una identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 95%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 80%, 75%, 70% o el 65% con el polipéptido de fosfocetolasa codificado por la secuencia de aminoácidos de la fosfocetolasa de Lactobacillus buchneri SEQ ID NO: 19. En algunas realizaciones, el polipéptido de fosfocetolasa puede tener una identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 95%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55% o el 50% con el polipéptido de fosfocetolasa codificado por la secuencia de aminoácidos de la fosfocetolasa de Streptomyces ghanaensis SEQ ID NO: 20. En algunas realizaciones, el polipéptido de fosfocetolasa puede tener una identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 95%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65% o el 60% con el polipéptido de fosfocetolasa codificado por la secuencia de aminoácidos de la fosfocetolasa de Cyanothece sp. SEQ ID NO: 21. En algunas realizaciones, el polipéptido de fosfocetolasa puede tener una identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 95%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 80%, 75% o el 70% con el polipéptido de fosfocetolasa codificado por la secuencia de aminoácidos de la fosfocetolasa de Neosartorya fischeri SEQ ID NO: 22. En algunas realizaciones, el polipéptido de fosfocetolasa puede tener una identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 95%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 80%, 75%, 70% o el 65% con el polipéptido de fosfocetolasa codificado por la secuencia de aminoácidos de la fosfocetolasa de Enterococcus faecium SEQ ID NO: 23. En algunas realizaciones, el polipéptido de fosfocetolasa puede tener una identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 95%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 80%, 75%, 70% o el 65% con el polipéptido de fosfocetolasa codificado por la secuencia de aminoácidos de la fosfocetolasa de Listeria grayi s Eq ID NO: 24. En algunas realizaciones, el polipéptido de fosfocetolasa puede tener una identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 95%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 80%, 75%, 70% o el 65% con el polipéptido de fosfocetolasa codificado por la secuencia de aminoácidos de la fosfocetolasa de Enterococcus casseliflavus SEQ ID NO: 25. En algunas realizaciones, el polipéptido de fosfocetolasa puede tener una identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 95%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 80%, 75%, 70% o el 65% con el polipéptido de fosfocetolasa codificado por la secuencia de aminoácidos de la fosfocetolasa de Mycoplasma alligatoris SEQ ID NO: 26. En algunas realizaciones, el polipéptido de fosfocetolasa puede tener una identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 95%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 80%, 75%, 70% o el 65% con el polipéptido de fosfocetolasa codificado por la secuencia de aminoácidos de la fosfocetolasa de Carnobacterium sp. SEQ ID NO: 27. En algunas realizaciones, el polipéptido de fosfocetolasa puede tener una identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 95%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 80%, 75%, 70% o el 65% con el polipéptido de fosfocetolasa codificado por la secuencia de aminoácidos de la fosfocetolasa de Melissococcus plutonius SEQ ID NO: 28. En algunas realizaciones, el polipéptido de fosfocetolasa puede tener una identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 95%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 80%, 75%, 70% o el 65% con el polipéptido de fosfocetolasa codificado por la secuencia de aminoácidos de la fosfocetolasa de Tetragenococcus halophilus SEQ ID NO: 29. En algunas realizaciones, el polipéptido de fosfocetolasa puede tener una identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 95%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 80%, 75%, 70% o el 65% con el polipéptido de fosfocetolasa codificado por la secuencia de aminoácidos de la fosfocetolasa de Melissococcus plutonius SEQ ID NO: 30. En algunas realizaciones, el polipéptido de fosfocetolasa puede tener una identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 95%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 80%, 75%, 70% o el 65% con el polipéptido de fosfocetolasa codificado por la secuencia de aminoácidos de la fosfocetolasa de Mycoplasma arthritidis SEQ ID NO: 31. En algunas realizaciones, el polipéptido de fosfocetolasa puede tener una identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 95%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 80%, 75%, 70% o el 65% con el polipéptido de fosfocetolasa codificado por la secuencia de aminoácidos de la fosfocetolasa de Streptococcus agalactiae SEQ ID NO: 32. En algunas realizaciones, el polipéptido de fosfocetolasa puede tener una identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 95%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 80%, 75%, 70% o el 65% con el polipéptido de fosfocetolasa codificado por la secuencia de aminoácidos de la fosfocetolasa de Mycoplasma agalactiae SEQ ID NO: 33. En algunas realizaciones, el polipéptido de fosfocetolasa puede tener una identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 95%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 80%, 75%, 70% o el 65% con el polipéptido de fosfocetolasa codificado por la secuencia de aminoácidos de la fosfocetolasa de Streptococcus gordonii SEQ ID NO: 34. En algunas realizaciones, el polipéptido de fosfocetolasa puede tener una identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 95%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 80%, 75%, 70% o el 65% con el polipéptido de fosfocetolasa codificado por la secuencia de aminoácidos de la fosfocetolasa de Kingella oralis SEQ ID NO: 35. En algunas realizaciones, el polipéptido de fosfocetolasa puede tener una identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 95%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 80%, 75%, 70% o el 65% con el polipéptido de fosfocetolasa codificado por la secuencia de aminoácidos de la fosfocetolasa de Mycoplasma fermentans SEQ ID NO: 36. En algunas realizaciones, el polipéptido de fosfocetolasa puede tener una identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 95%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 80%, 75%, 70% o el 65% con el polipéptido de fosfocetolasa codificado por la secuencia de aminoácidos de la fosfocetolasa de Granulicatella adiacens SEQ ID NO: 37. En algunas realizaciones, el polipéptido de fosfocetolasa puede tener una identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 95%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 80%, 75%, 70% o el 65% con el polipéptido de fosfocetolasa codificado por la secuencia de aminoácidos de la fosfocetolasa de Mycoplasma hominis SEQ ID NO: 38. En algunas realizaciones, el polipéptido de fosfocetolasa puede tener una identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 95%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 80%, 75%, 70% o el 65% con el polipéptido de fosfocetolasa codificado por la secuencia de aminoácidos de la fosfocetolasa de Mycoplasma crocodyli SEQ ID NO: 39. En algunas realizaciones, el polipéptido de fosfocetolasa puede tener una identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 95%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 80%, 75%, 70% o el 65% con el polipéptido de fosfocetolasa codificado por la secuencia de aminoácidos de la fosfocetolasa de Neisseria sp. SEQ ID NO: 40. En algunas realizaciones, el polipéptido de fosfocetolasa puede tener una identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 95%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 80%, 75%, 70% o el 65% con el polipéptido de fosfocetolasa codificado por la secuencia de aminoácidos de la fosfocetolasa de Eremococcus coleocola SEQ ID NO: 41. En algunas realizaciones, el polipéptido de fosfocetolasa puede tener una identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 95%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 80%, 75%, 70% o el 65% con el polipéptido de fosfocetolasa codificado por la secuencia de aminoácidos de la fosfocetolasa de Aerococcus urinae SEQ ID NO: 42. En algunas realizaciones, el polipéptido de fosfocetolasa puede tener una identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 95%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 80%, 75%, 70% o el 65% con el polipéptido de fosfocetolasa codificado por la secuencia de aminoácidos de la fosfocetolasa de Kingella kingae SEQ ID NO: 43. En algunas realizaciones, el polipéptido de fosfocetolasa puede tener una identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 95%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 80%, 75%, 70% o el 65% con el polipéptido de fosfocetolasa codificado por la secuencia de aminoácidos de la fosfocetolasa de Streptococcus criceti SEQ ID NO: 44. En algunas realizaciones, el polipéptido de fosfocetolasa puede tener una identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 95%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 80%, 75%, 70% o el 65% con el polipéptido de fosfocetolasa codificado por la secuencia de aminoácidos de la fosfocetolasa de Streptococcus criceti SEQ ID NO: 45. En algunas realizaciones, el polipéptido de fosfocetolasa puede tener una identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 95%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 80%, 75%, 70% o el 65% con el polipéptido de fosfocetolasa codificado por la secuencia de aminoácidos de la fosfocetolasa de Mycoplasma columbinum SEQ ID NO: 46. En algunas realizaciones, el polipéptido de fosfocetolasa puede tener una identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 95%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 80%, 75% o el 70% con el polipéptido de fosfocetolasa codificado por la secuencia de aminoácidos de la fosfocetolasa de Burkholderia phytofirmans SEQ ID NO: 47. En algunas realizaciones, el polipéptido de fosfocetolasa puede tener una identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 95%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 80%, 75% o el 70% con el polipéptido de fosfocetolasa codificado por la secuencia de aminoácidos de la fosfocetolasa de Lactobacillus buchneri SEQ ID NO: 48. En algunas realizaciones, el polipéptido de fosfocetolasa puede tener una identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 95%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 80%, 75% o el 70% con el polipéptido de fosfocetolasa codificado por la secuencia de aminoácidos de la fosfocetolasa de Bifidobacterium gallicum SEQ ID NO: 49. En algunas realizaciones, el polipéptido de fosfocetolasa puede tener una identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 95%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%. 86%, 85%, 80%, 75% o el 70% con el polipéptido de fosfocetolasa codificado por la secuencia de aminoácidos de la fosfocetolasa de Bifidobacterium dentium SEQ ID NO: 50. En algunas realizaciones, el polipéptido de fosfocetolasa puede tener una identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 95%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 80%, 75% o el 70% con el polipéptido de fosfocetolasa codificado por la secuencia de aminoácidos de la fosfocetolasa de Bifidobacterium bifidum SeQ ID NO: 51.
Ejemplos adicionales de enzimas fosfocetolasa que pueden usarse en el presente documento se describen en los documentos U.S. 7.785.858 y WO 2011/159853, a los que se hace referencia, especialmente con respecto a toda la divulgación sobre enzimas fosfocetolasa.
En algunos aspectos, se proporciona en el presente documento una célula recombinante capaz de aumentar el flujo de carbono a través de la ruta de la fosfocetolasa, en la que la célula recombinante comprende una secuencia de ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa tal como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, el polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa se aísla de Burkholderia phytofirmans, Lactobacillus buchneri, Bifidobacterium gallicum, Bifidobacterium dentium, Bifidobacterium bifidum y/o Clostridium acetobutylicum. En otros aspectos, el polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa se aisló de Mycobacterium gilvum, Shewanella baltica, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus crispatus, Bifidobacterium longum, Leuconostoc citreum, Bradyrhizobium sp., Enterococcus faecium, Brucella microti, Lactobacillus salivarius, Streptococcus agalactiae, Rhodococcus imtechensis, Burkholderia xenovorans, Mycobacterium intracellulare, Nitrosomonas sp., Schizosaccharomyces pombe, Leuconostoc mesenteroides, Streptomyces sp., Lactobacillus buchneri, Streptomyces ghanaensis, Cyanothece sp. y/o Neosartorya fischeri. En otros aspectos, el polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa se aisló de Enterococcus faecium, Listeria grayi, Enterococcus gallinarum, Enterococcus saccharolyticus, Enterococcus casseliflavus, Mycoplasma alligatoris, Carnobacterium sp., Melissococcus plutonius, Tetragenococcus halophilus y/o Mycoplasma arthritidis. En aún otros aspectos, el polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa se aisló de Streptococcus agalactiae, Mycoplasma agalactiae, Streptococcus gordonii, Kingella oralis, Mycoplasma fermentans, Granulicatella adiacens, Mycoplasma hominis, Mycoplasma crocodyli, Mycobacterium bovis, Neisseria sp., Streptococcus sp., Eremococcus coleocola, Granulicatella elegans, Streptococcus parasanguinis, Aerococcus urinae, Kingella kingae, Streptococcus australis, Streptococcus criceti y/o Mycoplasma columbinum.
En cualquiera de las realizaciones en el presente documento, las células recombinantes pueden modificarse por ingeniería genética adicionalmente para aumentar la actividad de uno o más de los siguientes genes seleccionados del grupo que consiste en ribosa-5-fosfato isomerasa (rpiA y/o rpiB), D-ribulosa-5-fosfato 3-epimerasa (rpe), transcetolasa (tktA y/o tktB), transaldolasa B (tal B), fosfato acetiltransferasa (pta y/o eutD). En otra realización, las células recombinantes pueden modificarse por ingeniería genética adicionalmente para disminuir la actividad de uno o más genes de los siguientes genes, incluyendo glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (zwf), 6-fosfofructocinasa-1 (pfkA y/o pfkB), fructosa bisfosfato aldolasa (fba, fbaA, fbaB y/o fbaC), gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (gapA y/o gapB), acetato cinasa (ackA), citrato sintasa (gltA), IE (ptsI), EIiCbGIc (ptsG), EIIAGlc (crr) y/o HPr (ptsH).
Métodos de uso de células recombinantes para producir cantidades aumentadas de metabolitos derivados de acetilo y acetil-CoA
También se proporcionan en el presente documento métodos para la producción de acetil-CoA. En algunos aspectos, el método para producir acetil-CoA comprende: (a) cultivar una composición que comprende células recombinantes que se han modificado por ingeniería genética para aumentar el flujo de carbono a través de la ruta de la fosfocetolasa tal como se describe en el presente documento (incluyendo cualquiera de las células recombinantes descritas anteriormente), o progenie de las mismas, capaces de producir acetil-CoA; y (b) producir mevalonato. En algunos aspectos, el método para producir acetil-CoA comprende las etapas de cultivar cualquiera de las células recombinantes descritas en el presente documento en condiciones adecuadas para la producción de acetil-CoA y permitir que las células recombinantes produzcan acetil-CoA. En algunos aspectos, el método para producir acetil-CoA comprende además una etapa de recuperación de la acetil-CoA.
Tal como se describe en el presente documento, los métodos de producción de acetil-CoA comprenden las etapas de: (a) cultivar células recombinantes (incluyendo, pero sin limitarse a, células de E. coli) que no expresan de manera endógena un polipéptido de fosfocetolasa, en los que las células expresan de manera heteróloga una o más copias de un gen que codifica para un polipéptido de fosfocetolasa; y (b) producir acetil-CoA. En determinadas realizaciones, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica para una fosfocetolasa aislada de Burkholderia phytofirmans, Lactobacillus buchneri, Bifidobacterium gallicum, Bifidobacterium dentium, Bifidobacterium bifidum y/o Clostridium acetobutylicum. En algunas realizaciones, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica para una fosfocetolasa aislada de Mycobacterium gilvum, Shewanella baltica, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus crispatus, Bifidobacterium longum, Leuconostoc citreum, Bradyrhizobium sp., Enterococcus faecium, Brucella microti, Lactobacillus salivarius, Streptococcus agalactiae, Rhodococcus imtechensis, Burkholderia xenovorans, Mycobacterium intracellulare, Nitrosomonas sp., Schizosaccharomyces pombe, Leuconostoc mesenteroides, Streptomyces sp., Lactobacillus buchneri, Streptomyces ghanaensis, Cyanothece sp. y/o Neosartorya fischeri. En algunas realizaciones, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica para una fosfocetolasa aislada de Enterococcus faecium, Listeria grayi, Enterococcus gallinarum, Enterococcus saccharolyticus, Enterococcus casseliflavus, Mycoplasma alligatoris, Carnobacterium sp., Melissococcus plutonius, Tetragenococcus halophilus y/o Mycoplasma arthritidis. En algunas realizaciones, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica para una fosfocetolasa aislada de Streptococcus agalactiae, Mycoplasma agalactiae, Streptococcus gordonii, Kingella oralis, Mycoplasma fermentans, Granulicatella adiacens, Mycoplasma hominis, Mycoplasma crocodyli, Mycobacterium bovis, Neisseria sp., Streptococcus sp., Eremococcus coleocola, Granulicatella elegans, Streptococcus parasanguinis, Aerococcus urinae, Kingella kingae, Streptococcus australis, Streptococcus criceti y/o Mycoplasma columbinum. En algunas realizaciones, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica para una fosfocetolasa aislada de un organismo listado en la tabla 1, la tabla 2 y/o las figuras 3-24. En algunas realizaciones, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica para una fosfocetolasa identificada a partir de un ensayo de examen in vivo tal como se describe en el ejemplo 7. Además, las células recombinantes pueden producir acetil-CoA en concentraciones mayores que las de las mismas células que carecen de una o más copias heterólogas de un gen que codifica para un polipéptido de fosfocetolasa de Burkholderia phytofirmans, Lactobacillus buchneri, Bifidobacterium gallicum, Bifidobacterium dentium, Bifidobacterium bifidum, Clostridium acetobutylicum, Mycobacterium gilvum, Shewanella baltica, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus crispatus, Bifidobacterium longum, Leuconostoc citreum, Bradyrhizobium sp., Enterococcus faecium, Brucella microti, Lactobacillus salivarius, Streptococcus agalactiae, Rhodococcus imtechensis, Burkholderia xenovorans, Mycobacterium intracellulare, Nitrosomonas sp., Schizosaccharomyces pombe, Leuconostoc mesenteroides, Streptomyces sp., Lactobacillus buchneri, Streptomyces ghanaensis, Cyanothece sp., Neosartorya fischeri, Enterococcus faecium, Listeria grayi, Enterococcus gallinarum, Enterococcus saccharolyticus, Enterococcus casseliflavus, Mycoplasma alligatoris, Carnobacterium sp., Melissococcus plutonius, Tetragenococcus halophilus, Mycoplasma arthritidis, Streptococcus agalactiae, Mycoplasma agalactiae, Streptococcus gordonii, Kingella oralis, Mycoplasma fermentans, Granulicatella adiacens, Mycoplasma hominis, Mycoplasma crocodyli, Mycobacterium bovis, Neisseria sp., Streptococcus sp., Eremococcus coleocola, Granulicatella elegans, Streptococcus parasanguinis, Aerococcus urinae, Kingella kingae, Streptococcus australis, Streptococcus criceti y/o Mycoplasma columbinum, cuando las células se cultivan en medio mínimo. En determinadas realizaciones, la una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido de fosfocetolasa descrito en el presente documento es un ácido nucleico heterólogo que se integra en el cromosoma de la célula huésped.
También se proporcionan en el presente documento métodos para la producción de metabolitos derivados de acetil-CoA. En algunos aspectos, el método para producir metabolitos derivados de acetil-CoA comprende: (a) cultivar una composición que comprende células recombinantes que se han modificado por ingeniería genética para aumentar el flujo de carbono a través de la ruta de la fosfocetolasa tal como se describe en el presente documento (incluyendo cualquiera de las células recombinantes descritas anteriormente), o progenie de las mismas, capaces de producir metabolitos derivados de acetil-CoA; y (b) producir mevalonato. En algunos aspectos, el método para producir metabolitos derivados de acetil-CoA comprende las etapas de cultivar cualquiera de las células recombinantes descritas en el presente documento en condiciones adecuadas para la producción de metabolitos derivados de acetil-CoA y permitir que las células recombinantes produzcan metabolitos derivados de acetil-CoA. En algunos aspectos, el método para producir acetil-CoA comprende además una etapa de recuperación de los metabolitos derivados de acetil-CoA.
Tal como se describe en el presente documento, los métodos de producción de metabolitos derivados de acetil-CoA comprenden las etapas de: (a) cultivar células recombinantes (incluyendo, pero sin limitarse a, células de E. coli) que no expresan de manera endógena un polipéptido de fosfocetolasa, en los que las células expresan de manera heteróloga una o más copias de un gen que codifica para un polipéptido de fosfocetolasa; y (b) producir metabolitos derivados de acetil-CoA. En determinadas realizaciones, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica para una fosfocetolasa aislada de Burkholderia phytofirmans, Lactobacillus buchneri, Bifidobacterium gallicum, Bifidobacterium dentium, Bifidobacterium bifidum y/o Clostridium acetobutylicum. En algunas realizaciones, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica para una fosfocetolasa aislada de Mycobacterium gilvum, Shewanella baltica, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus crispatus, Bifidobacterium longum, Leuconostoc citreum, Bradyrhizobium sp., Enterococcus faecium, Brucella microti, Lactobacillus salivarius, Streptococcus agalactiae, Rhodococcus imtechensis, Burkholderia xenovorans, Mycobacterium intracellulare, Nitrosomonas sp., Schizosaccharomyces pombe, Leuconostoc mesenteroides, Streptomyces sp., Lactobacillus buchneri, Streptomyces ghanaensis, Cyanothece sp. y/o Neosartorya fischeri. En algunas realizaciones, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica para una fosfocetolasa aislada de Enterococcus faecium, Listeria grayi, Enterococcus gallinarum, Enterococcus saccharolyticus, Enterococcus casseliflavus, Mycoplasma alligatoris, Carnobacterium sp., Melissococcus plutonius, Tetragenococcus halophilus y/o Mycoplasma arthritidis. En algunas realizaciones, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica para una fosfocetolasa aislada de Streptococcus agalactiae, Mycoplasma agalactiae, Streptococcus gordonii, Kingella oralis, Mycoplasma fermentans, Granulicatella adiacens, Mycoplasma hominis, Mycoplasma crocodyli, Mycobacterium bovis, Neisseria sp., Streptococcus sp., Eremococcus coleocola, Granulicatella elegans, Streptococcus parasanguinis, Aerococcus urinae, Kingella kingae, Streptococcus australis, Streptococcus criceti y/o Mycoplasma columbinum. En algunas realizaciones, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica para una fosfocetolasa aislada de un organismo enumerado en la tabla 1, la tabla 2 y/o las figuras 3-24. En algunas realizaciones, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica para una fosfocetolasa identificada a partir de un ensayo de examen in vivo tal como se describe en el ejemplo 7. Además, las células recombinantes pueden producir metabolitos derivados de acetil-CoA en concentraciones mayores que las de las mismas células que carecen de una o más copias heterólogas de un gen que codifica para un polipéptido de fosfocetolasa de Burkholderia phytofirmans, Lactobacillus buchneri, BiHdobacterium gallicum, Bifidobacterium dentium, Bifidobacterium bifidum, Clostridium acetobutylicum, Mycobacterium gilvum, Shewanella baltica, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus crispatus, Bifidobacterium longum, Leuconostoc citreum, Bradyrhizobium sp., Enterococcus faecium, Brucella microti, Lactobacillus salivarius, Streptococcus agalactiae, Rhodococcus imtechensis, Burkholderia xenovorans, Mycobacterium intracellulare, Nitrosomonas sp., Schizosaccharomyces pombe, Leuconostoc mesenteroides, Streptomyces sp., Lactobacillus buchneri, Streptomyces ghanaensis, Cyanothece sp., Neosartorya fischeri, Enterococcus faecium, Listeria grayi, Enterococcus gallinarum, Enterococcus saccharolyticus, Enterococcus casseliflavus, Mycoplasma alligatoris, Carnobacterium sp., Melissococcus plutonius, Tetragenococcus halophilus, Mycoplasma arthritidis, Streptococcus agalactiae, Mycoplasma agalactiae, Streptococcus gordonii, Kingella oralis, Mycoplasma fermentans, Granulicatella adiacens, Mycoplasma hominis, Mycoplasma crocodyli, Mycobacterium bovis, Neisseria sp., Streptococcus sp., Eremococcus coleocola, Granulicatella elegans, Streptococcus parasanguinis, Aerococcus urinae, Kingella kingae, Streptococcus australis, Streptococcus criceti y/o Mycoplasma columbinum, cuando las células se cultivan en medio mínimo. En determinadas realizaciones, la una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido de fosfocetolasa descrito en el presente documento es un ácido nucleico heterólogo que se integra en el cromosoma de la célula huésped.
En cualquiera de las realizaciones del presente documento, el metabolito derivado de acetil-CoA puede ser uno o más de policétidos, polihidroxibutirato, alcoholes grasos o ácidos grasos. En cualquiera de las realizaciones en el presente documento, el metabolito derivado de acetil-CoA puede ser uno o más de un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en: ácido glutámico, glutamina, aspartato, asparagina, prolina, arginina, metionina, treonina, cisteína, lisina, leucina e isoleucina. En algunas realizaciones, el metabolito derivado de acetil-CoA es succinato. En cualquiera de las realizaciones en el presente documento, el metabolito derivado de acetil-CoA puede ser uno o más de acetona, isopropanol, isobuteno o propeno.
También se proporcionan en el presente documento métodos de producción de metabolitos derivados de acetil-CoA que comprenden cultivar una célula recombinante capaz de aumentar el flujo de carbono a través de la ruta de la fosfocetolasa, en los que la célula recombinante comprende: (i) una secuencia de ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa, en los que el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 65% con SEQ ID NO: 8 y (ii) uno o más ácidos nucleicos que codifican para uno o más polipéptidos de la ruta de MVA completa, en los que dicha célula recombinante que comprende dicho polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa de (i) tiene un valor de índice de rendimiento mayor de 1,0 en uno o más de los siguientes parámetros: (a) crecimiento celular en glucosa, (b) crecimiento celular en xilosa, (c) producción de acetilfosfato intracelular o (d) crecimiento celular en glucosa-6-fosfato y la producción de dichos metabolitos derivados de acetil-CoA. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 23. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 24. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 25. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 26. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 27. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 28. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 29. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 30. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 31. En otras realizaciones, dicho valor de índice de rendimiento para cualquiera de dichos parámetros es cualquiera de tal como mayor de 1,1, tal como mayor de 1,2, mayor de 1,4, mayor de 1,6, mayor de 1,8, mayor de 2, mayor de 2,2, mayor de 2,4, mayor de 2,6, mayor de 2,8, mayor de 3, mayor de 3,2, mayor de 3,4, mayor de 3,6, mayor de 3,8, mayor de 4, mayor de 4,2, mayor de 4,4, mayor de 4,6, mayor de 4,8, mayor de 5, mayor de 5,2, mayor de 5,4, mayor de 5,6, mayor de 5,8, mayor de 6, mayor de 6,2, mayor de 6,4, mayor de 6,6, mayor de 6,8, mayor de 7, mayor de 7,2, mayor de 7,4, mayor de 7,6, mayor de 7,8, mayor de 8, mayor de 8,2, mayor de 8,4, mayor de 8,6, mayor de 8,8, 9, mayor de 9,2, mayor de 9,4, mayor de 9,6, mayor de 9,8 o mayor de 10 o más en comparación con un polipéptido parental que tiene actividad fosfocetolasa (por ejemplo, una fosfocetolasa de E. gallinarum). En otras realizaciones, el índice de rendimiento celular aumenta al menos aproximadamente 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 3, 4, 5 veces o más en comparación con una molécula parental. En otras realizaciones, el índice de rendimiento celular es mayor de cualquiera de aproximadamente 0,1 a 0,5, de aproximadamente 0,25 a 0,75, de aproximadamente 0,5 a 1, de aproximadamente 0,75 a 1,25, de aproximadamente 1 a 1,5, de aproximadamente 1,25 a 1,75, de aproximadamente 1,5 a 2, de aproximadamente 1,75 a 2,25, de aproximadamente 2 a 2,5, de aproximadamente 2,25 a 2,75, de aproximadamente 2,5 a 3, de aproximadamente 2,75 a 3,25, de aproximadamente 3 a 3,5, de aproximadamente 3,25 a 3,75, de aproximadamente 3,5 a 4, de aproximadamente 3,75 a 4,25, de aproximadamente 4 a 4,5, de aproximadamente 4,25 a 4,75, de aproximadamente 4,5 a 5, de aproximadamente 4,75 a 5,25, de aproximadamente 5 a 5,5, de aproximadamente 5,25 a 5,75, de aproximadamente 5,5 a 6, de aproximadamente 6,25 a 6,75, de aproximadamente 6,5 a 7, de aproximadamente 6,75 a 7,25, de aproximadamente 7 a 7,5, de aproximadamente 7,75 a 8,25, de aproximadamente 8 a 8,5, de aproximadamente 8,25 a 8,75, de aproximadamente 8,5 a 9, de aproximadamente 8,75 a 9,25, de aproximadamente 9 a 9,5, de aproximadamente 9,25 a 9,75 o de aproximadamente 9,5 a 10 o más en comparación con una molécula parental. En otras realizaciones, el índice de rendimiento celular es mayor de cualquiera de aproximadamente 0,1 a 2, aproximadamente 1-3, aproximadamente 2-4, aproximadamente 3-5, aproximadamente 4-6, aproximadamente 5-7, aproximadamente 6-8, aproximadamente 7-9 o aproximadamente 8-10 o más en comparación con una molécula parental. En algunas realizaciones, la molécula parental es una fosfocetolasa de E. gallinarum. En otras realizaciones, la actividad intracelular aumenta al menos aproximadamente 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 veces o más.
Adicionalmente, se proporcionan en el presente documento métodos para producir metabolitos derivados de acetil-CoA que comprenden cultivar una célula recombinante capaz de aumentar el flujo de carbono a través de la ruta de la fosfocetolasa, en los que las células recombinantes comprenden: (i) una secuencia de ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa, en los que el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 65% con SEQ ID NO: 8 y (ii) uno o más ácidos nucleicos que codifican para uno o más polipéptidos de la ruta de MVA completa, en los que dicho polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa de (i) tiene un valor de índice de rendimiento mayor de 1,0 en uno o más de los siguientes parámetros: (a) solubilidad de proteínas, (b) expresión de proteínas o (c) actividad específica de fructosa-6-fosfato (F6P) y producir dichos metabolitos derivados de acetil-CoA. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 23. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 24. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 25. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 26. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 27. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 28. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 29. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 30. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 31. En otras realizaciones, dicho valor de índice de rendimiento para cualquiera de dichos parámetros es cualquiera de tal como mayor de 1,1, tal como mayor de 1,2, mayor de 1,4, mayor de 1,6, mayor de 1,8, mayor de 2, mayor de 2,2, mayor de 2,4, mayor de 2,6, mayor de 2,8, mayor de 3, mayor de 3,2, mayor de 3,4, mayor de 3,6, mayor de 3,8, mayor de 4, mayor de 4,2, mayor de 4,4, mayor de 4,6, mayor de 4,8, mayor de 5, mayor de 5,2, mayor de 5,4, mayor de 5,6, mayor de 5,8, mayor de 6, mayor de 6,2, mayor de 6,4, mayor de 6,6, mayor de 6,8, mayor de 7, mayor de 7,2, mayor de 7,4, mayor de 7,6, mayor de 7,8, mayor de 8, mayor de 8,2, mayor de 8,4, mayor de 8,6, mayor de 8,8, 9, mayor de 9,2, mayor de 9,4, mayor de 9,6, mayor de 9,8 o mayor de 10 o más en comparación con un polipéptido parental que tiene actividad fosfocetolasa (por ejemplo, una fosfocetolasa de E. gallinarum). En otras realizaciones, el índice de rendimiento celular aumenta al menos aproximadamente 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 3, 4, 5 veces o más en comparación con una molécula parental. En otras realizaciones, el índice de rendimiento celular es mayor de cualquiera de aproximadamente 0,1 a 0,5, de aproximadamente 0,25 a 0,75, de aproximadamente 0,5 a 1, de aproximadamente 0,75 a 1,25, de aproximadamente 1 a 1,5, de aproximadamente 1,25 a 1,75, de aproximadamente 1,5 a 2, de aproximadamente 1,75 a 2,25, de aproximadamente 2 a 2,5, de aproximadamente 2,25 a 2,75, de aproximadamente 2.5 a 3, de aproximadamente 2,75 a 3,25, de aproximadamente 3 a 3,5, de aproximadamente 3,25 a 3,75, de aproximadamente 3,5 a 4, de aproximadamente 3,75 a 4,25, de aproximadamente 4 a 4,5, de aproximadamente 4.25 a 4,75, de aproximadamente 4,5 a 5, de aproximadamente 4,75 a 5,25, de aproximadamente 5 a 5,5, de aproximadamente 5,25 a 5,75, de aproximadamente 5,5 a 6, de aproximadamente 6,25 a 6,75, de aproximadamente 6.5 a 7, de aproximadamente 6,75 a 7,25, de aproximadamente 7 a 7,5, de aproximadamente 7,75 a 8,25, de aproximadamente 8 a 8,5, de aproximadamente 8,25 a 8,75, de aproximadamente 8,5 a 9, de aproximadamente 8,75 a 9,25, de aproximadamente 9 a 9,5, de aproximadamente 9,25 a 9,75 o de aproximadamente 9,5 a 10 o más en comparación con una molécula parental. En otras realizaciones, el índice de rendimiento celular es mayor de cualquiera de aproximadamente 0,1 a 2, aproximadamente 1-3, aproximadamente 2-4, aproximadamente 3-5, aproximadamente 4-6, aproximadamente 5-7, aproximadamente 6-8, aproximadamente 7-9 o aproximadamente 8­ 10 o más en comparación con una molécula parental. En algunas realizaciones, la molécula parental es una fosfocetolasa de E. gallinarum. En otras realizaciones, la actividad intracelular aumenta al menos aproximadamente 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 veces o más.
Además, se proporcionan en el presente documento métodos para producir metabolitos derivados de acetil-CoA que comprenden cultivar una célula recombinante capaz de aumentar el flujo de carbono a través de la ruta de la fosfocetolasa, en los que las células recombinantes comprenden: (i) una secuencia de ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa, en los que el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 65% con SEQ ID NO: 11 y (ii) uno o más ácidos nucleicos que codifican para uno o más polipéptidos de la ruta de MVA completa, en los que dicha célula recombinante que comprende dicho polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa de (i) tiene un valor de índice de rendimiento mayor de 1,0 en uno o más de los siguientes parámetros: (a) crecimiento celular en glucosa, (b) crecimiento celular en xilosa, (c) producción de acetilfosfato intracelular o (d) crecimiento celular en glucosa-6-fosfato y producir dichos metabolitos derivados de acetil-CoA. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 32. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 33. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 34. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 35. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 36. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 37. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 38. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 39. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 40. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 41. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 42. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 43. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 44. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 45. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 46. En otras realizaciones, dicho valor de índice de rendimiento para cualquiera de dichos parámetros es cualquiera de tal como mayor de 1,1, tal como mayor de 1,2, mayor de 1,4, mayor de 1,6, mayor de 1,8, mayor de 2, mayor de 2,2, mayor de 2,4, mayor de 2,6, mayor de 2,8, mayor de 3, mayor de 3,2, mayor de 3,4, mayor de 3,6, mayor de 3,8, mayor de 4, mayor de 4,2, mayor de 4,4, mayor de 4,6, mayor de 4,8, mayor de 5, mayor de 5,2, mayor de 5,4, mayor de 5,6, mayor de 5,8, mayor de 6, mayor de 6,2, mayor de 6,4, mayor de 6,6, mayor de 6,8, mayor de 7, mayor de 7,2, mayor de 7,4, mayor de 7,6, mayor de 7,8, mayor de 8, mayor de 8,2, mayor de 8,4, mayor de 8,6, mayor de 8,8, 9, mayor de 9,2, mayor de 9,4, mayor de 9,6, mayor de 9,8 o mayor de 10 o más en comparación con un polipéptido parental que tiene actividad fosfocetolasa (por ejemplo, una fosfocetolasa de E. gallinarum). En otras realizaciones, el índice de rendimiento celular aumenta al menos aproximadamente 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 3, 4, 5 veces o más en comparación con una molécula parental. En otras realizaciones, el índice de rendimiento celular es mayor de cualquiera de aproximadamente 0,1 a 0,5, de aproximadamente 0,25 a 0,75, de aproximadamente 0,5 a 1, de aproximadamente 0,75 a 1,25, de aproximadamente 1 a 1,5, de aproximadamente 1,25 a 1,75, de aproximadamente 1,5 a 2, de aproximadamente 1,75 a 2,25, de aproximadamente 2 a 2,5, de aproximadamente 2,25 a 2,75, de aproximadamente 2.5 a 3, de aproximadamente 2,75 a 3,25, de aproximadamente 3 a 3,5, de aproximadamente 3,25 a 3,75, de aproximadamente 3,5 a 4, de aproximadamente 3,75 a 4,25, de aproximadamente 4 a 4,5, de aproximadamente 4.25 a 4,75, de aproximadamente 4,5 a 5, de aproximadamente 4,75 a 5,25, de aproximadamente 5 a 5,5, de aproximadamente 5,25 a 5,75, de aproximadamente 5,5 a 6, de aproximadamente 6,25 a 6,75, de aproximadamente 6.5 a 7, de aproximadamente 6,75 a 7,25, de aproximadamente 7 a 7,5, de aproximadamente 7,75 a 8,25, de aproximadamente 8 a 8,5, de aproximadamente 8,25 a 8,75, de aproximadamente 8,5 a 9, de aproximadamente 8,75 a 9,25, de aproximadamente 9 a 9,5, de aproximadamente 9,25 a 9,75 o de aproximadamente 9,5 a 10 o más en comparación con una molécula parental. En otras realizaciones, el índice de rendimiento celular es mayor de cualquiera de aproximadamente 0,1 a 2, aproximadamente 1-3, aproximadamente 2-4, aproximadamente 3-5, aproximadamente 4-6, aproximadamente 5-7, aproximadamente 6-8, aproximadamente 7-9 o aproximadamente 8­ 10 o más en comparación con una molécula parental. En algunas realizaciones, la molécula parental es una fosfocetolasa de E. gallinarum. En otras realizaciones, la actividad intracelular aumenta al menos aproximadamente 0. 1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 veces o más.
Se proporcionan en el presente documento métodos para producir metabolitos derivados de acetil-CoA que comprenden cultivar una célula recombinante capaz de aumentar el flujo de carbono a través de la ruta de la fosfocetolasa, en los que las células recombinantes comprenden: (i) una secuencia de ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa, en los que el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 65% con SEQ ID NO: 11 y (ii) uno o más ácidos nucleicos que codifican para uno o más polipéptidos de la ruta de MVA completa, en los que dicho polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa de (i) tiene un valor de índice de rendimiento mayor de 1,0 en uno o más de los siguientes parámetros: (a) solubilidad de proteínas, (b) expresión de proteínas o (c) actividad específica de fructosa-6-fosfato (F6P) y producir dichos metabolitos derivados de acetil-CoA. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 32. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 33. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 34. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 35. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 36. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 37. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 38. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 39. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 40. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 41. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 42. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 43. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 44. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 45. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 46. En otras realizaciones, dicho valor de índice de rendimiento para cualquiera de dichos parámetros es cualquiera de tal como mayor de 1,1, tal como mayor de 1,2, mayor de 1,4, mayor de 1,6, mayor de 1,8, mayor de 2, mayor de 2,2, mayor de 2,4, mayor de 2,6, mayor de 2,8, mayor de 3, mayor de 3,2, mayor de 3,4, mayor de 3,6, mayor de 3,8, mayor de 4, mayor de 4,2, mayor de 4,4, mayor de 4,6, mayor de 4,8, mayor de 5, mayor de 5,2, mayor de 5,4, mayor de 5,6, mayor de 5,8, mayor de 6, mayor de 6,2, mayor de 6,4, mayor de 6,6, mayor de 6,8, mayor de 7, mayor de 7,2, mayor de 7,4, mayor de 7,6, mayor de 7,8, mayor de 8, mayor de 8,2, mayor de 8,4, mayor de 8,6, mayor de 8,8, 9, mayor de 9,2, mayor de 9,4, mayor de 9,6, mayor de 9,8 o mayor de 10 o más en comparación con un polipéptido parental que tiene actividad fosfocetolasa (por ejemplo, una fosfocetolasa de E. gallinarum). En otras realizaciones, el índice de rendimiento celular aumenta al menos aproximadamente 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 3, 4, 5 veces o más en comparación con una molécula parental. En otras realizaciones, el índice de rendimiento celular es mayor de cualquiera de aproximadamente 0,1 a 0,5, de aproximadamente 0,25 a 0,75, de aproximadamente 0,5 a 1, de aproximadamente 0,75 a 1,25, de aproximadamente 1 a 1,5, de aproximadamente 1,25 a 1,75, de aproximadamente 1,5 a 2, de aproximadamente 1,75 a 2,25, de aproximadamente 2 a 2,5, de aproximadamente 2.25 a 2,75, de aproximadamente 2,5 a 3, de aproximadamente 2,75 a 3,25, de aproximadamente 3 a 3,5, de aproximadamente 3,25 a 3,75, de aproximadamente 3,5 a 4, de aproximadamente 3,75 a 4,25, de aproximadamente 4 a 4,5, de aproximadamente 4,25 a 4,75, de aproximadamente 4,5 a 5, de aproximadamente 4,75 a 5,25, de aproximadamente 5 a 5,5, de aproximadamente 5,25 a 5,75, de aproximadamente 5,5 a 6, de aproximadamente 6.25 a 6,75, de aproximadamente 6,5 a 7, de aproximadamente 6,75 a 7,25, de aproximadamente 7 a 7,5, de aproximadamente 7,75 a 8,25, de aproximadamente 8 a 8,5, de aproximadamente 8,25 a 8,75, de aproximadamente 8.5 a 9, de aproximadamente 8,75 a 9,25, de aproximadamente 9 a 9,5, de aproximadamente 9,25 a 9,75 o de aproximadamente 9,5 a 10 o más en comparación con una molécula parental. En otras realizaciones, el índice de rendimiento celular es mayor de cualquiera de aproximadamente 0,1 a 2, aproximadamente 1-3, aproximadamente 2-4, aproximadamente 3-5, aproximadamente 4-6, aproximadamente 5-7, aproximadamente 6-8, aproximadamente 7-9 o aproximadamente 8-10 o más en comparación con una molécula parental. En algunas realizaciones, la molécula parental es una fosfocetolasa de E. gallinarum. En otras realizaciones, la actividad intracelular aumenta al menos aproximadamente 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 veces o más.
Células recombinantes que expresan un polipéptido de fosfocetolasa y uno o más polipéptidos de la ruta de MVA
La ruta de biosíntesis dependiente de mevalonato (ruta de MVA) es una ruta metabólica clave presente en todos los eucariotas superiores y determinadas bacterias. Además de ser importantes para la producción de moléculas usadas en procesos tan diversos como la prenilación de proteínas, el mantenimiento de la membrana celular, el anclaje de proteínas y la N-glicosilación, la ruta del mevalonato proporciona una fuente importante de las moléculas precursoras de isoprenoides DMAPP e IPP, que sirven como base para la biosíntesis de terpenos, terpenoides, isoprenoides e isopreno.
La ruta de MVA completa se puede subdividir en dos grupos: una ruta superior y una inferior. En la parte superior de la ruta de MVA, la acetil-coA producida durante el metabolismo celular se convierte en mevalonato a través de las acciones de polipéptidos que tienen: (a) (i) actividad tiolasa o (ii) actividad acetoacetil-CoA sintasa, (b) HMG-CoA reductasa y (c) actividad enzimática de HMG-CoA sintasa. En primer lugar, la acetil-coA se convierte en acetoacetil-CoA a través de la acción de una tiolasa o una acetoacetil-CoA sintasa (que utiliza acetil-CoA y malonil-CoA). A continuación, la acetoacetil-CoA se convierte en 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA (HMG-CoA) mediante la acción enzimática de la HMG-CoA sintasa. Este derivado de Co-A se reduce a mevalonato por la HMG-CoA reductasa, que es la etapa limitante de la velocidad de la ruta del mevalonato de la producción de isoprenoides. En la ruta de MVA inferior, el mevalonato se convierte luego en mevalonato-5-fosfato a través de la acción de la mevalonato cinasa, que posteriormente se transforma en 5-difosfomevalonato mediante la actividad enzimática de la fosfomevalonato cinasa. Finalmente, el IPP se forma a partir del 5-difosfomevalonato mediante la actividad enzimática mevalonato-5-pirofosfato descarboxilasa.
Por tanto, en determinadas realizaciones, las células recombinantes de la presente invención son células recombinantes según se reivindican que tienen la capacidad de producir mevalonato, precursores de isoprenoides, isopreno o isoprenoides a través de la ruta de MVA en las que las células recombinantes comprenden: (i) un gen heterólogo que codifica para una fosfocetolasa capaz de sintetizar gliceraldehído 3-fosfato y acetil-fosfato a partir de xilulosa 5-fosfato, (ii) uno o más genes heterólogos que codifican para uno o más polipéptidos de MVA, y (iii) uno o más genes heterólogos involucrados en la biosíntesis de mevalonato, precursores de isoprenoides, isopreno o isoprenoides que permite la síntesis de mevalonato, precursores de isoprenoides, isopreno o isoprenoides a partir de acetoacetil-CoA en la célula huésped. En otras realizaciones, las células recombinantes de la presente invención son células recombinantes según se reivindican que tienen la capacidad de producir mevalonato, precursores de isoprenoides, isopreno o isoprenoides, en las que las células recombinantes comprenden: (i) un gen heterólogo que codifica para una fosfocetolasa capaz de sintetizar eritrosa 4-fosfato y acetil-fosfato a partir de fructosa 6-fosfato, (ii) uno o más genes heterólogos que codifican para uno o más polipéptidos de MVA y (iii) uno o más genes heterólogos involucrados en la biosíntesis de mevalonato, precursores de isoprenoides, isopreno o isoprenoides que permite la síntesis de productos mevalonato, precursores de isoprenoides, isopreno o isoprenoides a partir de acetoacetil-CoA en la célula huésped.
Polipéptidos de la ruta de MVA superior
La parte superior de la ruta de MVA usa la acetil-Co-A producida durante el metabolismo celular como el sustrato inicial para la conversión en mevalonato a través de las acciones de polipéptidos que tienen cualquiera de: (a) (i) actividad tiolasa o (ii) actividad acetoacetil-CoA sintasa, (b) HMG-CoA reductasa y (c) actividad enzimática de HMG-CoA sintasa. En primer lugar, la acetil-coA se convierte en acetoacetil-CoA a través de la acción de una tiolasa o una acetoacetil-CoA sintasa (que utiliza acetil-CoA y malonil-CoA). A continuación, la acetoacetil-CoA se convierte en 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA (HMG-CoA) mediante la acción enzimática de la HMG-CoA sintasa. Este derivado de Co­ A se reduce a mevalonato por la HMG-CoA reductasa, que es la etapa limitante de la velocidad de la ruta del mevalonato de la producción de isoprenoides.
Los ejemplos no limitativos de polipéptidos de la ruta de MVA superior incluyen polipéptidos de acetil-CoA acetiltransferasa (AA-CoA tiolasa), polipéptidos de acetoacetil-CoA sintasa, polipéptidos de 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA sintasa (HMG-CoA sintasa), polipéptidos de 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA reductasa (HMG-CoA reductasa). Los polipéptidos de la ruta de MVA superior pueden incluir polipéptidos, fragmentos de polipéptidos, péptidos y polipéptidos de fusión que tienen al menos una actividad de un polipéptido de la ruta de MVA superior. Los ácidos nucleicos de la ruta de MVA superior a modo de ejemplo incluyen ácidos nucleicos que codifican para un polipéptido, fragmento de un polipéptido, péptido o polipéptido de fusión que tiene al menos una actividad de un polipéptido de la ruta de MVA superior. Los polipéptidos y ácidos nucleicos de la ruta de MVA a modo de ejemplo incluyen polipéptidos y ácidos nucleicos que se producen de manera natural a partir de cualquiera de los organismos fuente descritos en el presente documento. Por tanto, se contempla en el presente documento que cualquier gen que codifique para un polipéptido de la ruta de MVA superior puede usarse en la presente invención.
En determinadas realizaciones, diversas opciones de genes mvaE y mvaS de L. grayi, E. faecium, E. gallinarum, E. casseliflavus y/o E. faecalis solos o en combinación con uno o más genes mvaE y mvaS que codifican para proteínas de la ruta de MVA superior se contemplan dentro del alcance de la invención. En otras realizaciones, se contempla un gen de la acetoacetil-CoA sintasa dentro del alcance de la presente invención en combinación con uno o más genes que codifican para: (i) polipéptidos de 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA sintasa (HMG-CoA sintasa) y polipéptidos de 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA reductasa (HMG-CoA reductasa). Por tanto, en determinados aspectos, cualquiera de las combinaciones de genes contempladas puede expresarse en células recombinantes en cualquiera de las formas descritas en el presente documento.
Ejemplos adicionales no limitativos de polipéptidos de la ruta de MVA superior que pueden usarse en el presente documento se describen en la publicación de solicitud de patente internacional n°. WO2009/076676; W02010/003007 y WO2010/148150.
Genes que codifican para polipéptidos de mvaE y mvaS
En determinadas realizaciones, diversas opciones de genes mvaE y mvaS de L. grayi, E. faecium, E. gallinarum, E. casseliflavus y/o E. faecalis solos o en combinación con uno o más genes mvaE y mvaS que codifican para proteínas de la ruta de MVA superior se contemplan dentro del alcance de la invención. En L. grayi, E. faecium, E. gallinarum, E. casseliflavus, y E. faecalis, el gen mvaE codifica para un polipéptido que presenta actividades tanto de tiolasa como de HMG-CoA reductasa de hecho, el producto génico de mvaE representó la primera enzima bifuncional de la biosíntesis de IPP hallada en eubacterias y el primer ejemplo de HMG-CoA reductasa fusionada a otra proteína en la naturaleza (Hedl, et al., J. Bacteriol. abril de 2002; 184 (8): 2116-2122). El gen mvaS, por otro lado, codifica para un polipéptido que tiene una actividad HMG-CoA sintasa.
En consecuencia, pueden modificarse por ingeniería genética células recombinantes (por ejemplo, E. coli) para expresar uno o más genes mvaE y mvaS de L. grayi, E. faecium, E. gallinarum, E. casseliflavus y/o E. faecalis para producir mevalonato. El uno o más genes mvaE y mvaS pueden expresarse en un plásmido multicopia. El plásmido puede ser un plásmido de alto número de copias, un plásmido de bajo número de copias o un plásmido de número medio de copias. Alternativamente, el uno o más genes mvaE y mvaS pueden integrarse en el cromosoma de la célula huésped. Tanto para la expresión heteróloga del uno o más genes mvaE y mvaS en un plásmido o como parte integrada del cromosoma de la célula huésped, la expresión de los genes puede estar dirigida o bien por un promotor inducible o bien por un promotor que exprese de forma constitutiva. El promotor puede ser un fuerte impulsor de la expresión, puede ser un débil impulsor de la expresión, o puede ser un impulsor medio de la expresión de uno o más genes mvaE y mvaS.
Polipéptidos y ácidos nucleicos de mvaE a modo de ejemplo.
El gen mvaE codifica para un polipéptido que presenta actividades tanto de tiolasa como de HMG-CoA reductasa. La actividad tiolasa del polipéptido codificado por el gen mvaE convierte la acetil-coA en acetoacetil-CoA, mientras que la actividad enzimática de la HMG-CoA reductasa del polipéptido convierte el 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA en mevalonato. Los polipéptidos y ácidos nucleicos de mvaE a modo de ejemplo incluyen polipéptidos y ácidos nucleicos que se producen de manera natural a partir de cualquiera de los organismos fuente descritos en el presente documento, así como polipéptidos y ácidos nucleicos mutantes derivados de cualquiera de los organismos fuente descritos en el presente documento que tienen al menos una actividad de un polipéptido de mvaE.
Los polipéptidos de mvaE mutantes incluyen aquellos en los que uno o más residuos de aminoácidos han experimentado una sustitución de aminoácidos mientras retienen la actividad del polipéptido de mvaE (es decir, la capacidad de convertir acetil-Co-A en acetoacetil-CoA, así como la capacidad de convertir 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA en mevalonato). Las sustituciones de aminoácidos pueden ser conservativas o no conservativas y tales residuos de aminoácidos sustituidos pueden ser o no uno codificado por el código genético. El “alfabeto” convencional de veinte aminoácidos se ha dividido en familias químicas basándose en la similitud de sus cadenas laterales. Esas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares sin carga (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadenas laterales apolares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano), cadenas laterales beta-ramificadas (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). Una “sustitución de aminoácidos conservativa” es aquella en la que el residuo de aminoácido se reemplaza por un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral químicamente similar (es decir, reemplazar un aminoácido que tiene una cadena lateral básica por otro aminoácido que tiene una cadena lateral básica). Una “sustitución de aminoácido no conservativa” es aquella en la que el residuo de aminoácido se reemplaza por un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral químicamente diferente (es decir, reemplazar un aminoácido que tiene una cadena lateral básica por otro aminoácido que tiene una cadena lateral aromática).
Pueden introducirse sustituciones de aminoácidos en el polipéptido de mvaE para mejorar la funcionalidad de la molécula. Por ejemplo, pueden introducirse sustituciones de aminoácidos que aumentan la afinidad de unión del polipéptido de mvaE por su sustrato, o que mejoran su capacidad para convertir acetil-Co-A en acetoacetil-CoA y/o la capacidad de convertir 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA en mevalonato en el polipéptido de mvaE. En algunos aspectos, los polipéptidos de mvaE mutantes contienen una o más sustituciones de aminoácidos conservativas.
En un aspecto, pueden usarse proteínas mvaE que no están degradadas o son menos propensas a la degradación para la producción de mevalonato, precursores de isoprenoides, isopreno y/o isoprenoides. Ejemplos de productos genéticos de mvaE que no están degradados o son menos propensos a la degradación que pueden usarse incluyen, pero no se limitan a, los de los organismos E. faecium, E. gallinarum, E. casseliflavus, E. faecalis, y L. grayi. Un experto en la técnica puede expresar la proteína mvaE en E. coli BL21 (DE3) y examinar la ausencia de fragmentos mediante cualquier técnica de biología molecular convencional. Por ejemplo, la ausencia de fragmentos puede identificarse en geles de SDS-PAGE teñidos con Safestain después de la purificación mediada por la etiqueta His o cuando se expresa en E. coli BL21 productor de mevalonato, isopreno o isoprenoides usando los métodos de detección descritos en el presente documento.
Pueden usarse métodos convencionales, tales como los descritos en Hedl et al., (J Bacteriol. 2002, abril; 184 (8): 2116-2122) para determinar si un polipéptido tiene actividad de mvaE, midiendo la acetoacetil-CoA tiolasa así como la actividad HMG-CoA reductasa. En un ensayo a modo de ejemplo, la actividad acetoacetil-CoA tiolasa se mide mediante un espectrofotómetro para monitorizar el cambio en la absorbancia a 302 nm que acompaña a la formación o tiólisis de acetoacetil-CoA. Las condiciones de ensayo convencionales para cada reacción para determinar la síntesis de acetoacetil-CoA, son acetil-CoA 1 mM, MgCb 10 mM, Tris 50 mM, pH 10,5 y la reacción se inicia mediante la adición de enzima. Los ensayos pueden emplear un volumen final de 200 pl. Para el ensayo, 1 unidad de enzima (ue) representa la síntesis o tiólisis en 1 minuto de 1 pmol de acetoacetil-CoA. En otro ensayo a modo de ejemplo, la actividad HMG-CoA reductasa puede monitorizarse mediante espectrofotómetro por la aparición o desaparición de NADP(H) a 340 nm. Las condiciones de ensayo convencionales para cada reacción medida para mostrar la desacilación reductora de HMG-CoA a mevalonato son NADPH 0,4 mM, (R,S)-HMG-CoA 1,0 mM, KCl 100 mM y KXPO4100 mM, pH 6,5, Los ensayos emplean un volumen final de 200 pl. Las reacciones se inician añadiendo la enzima. Para el ensayo, 1 ue representa el recambio, en 1 minuto, de 1 pmol de NADP(H). Esto corresponde al recambio de 0,5 pmol de HMG-CoA o mevalonato.
Alternativamente, la producción de mevalonato en células recombinantes puede medirse mediante, sin limitación, cromatografía de gases (véase la publicación de patente estadounidense n.° US 2005/0287655 A1) o HPLC (véase la publicación de patente estadounidense n.°: 2011/0159557 A1). Como ensayo a modo de ejemplo, los cultivos se pueden inocular en tubos de agitación que contienen caldo LB complementado con uno o más antibióticos y se incuban durante 14 horas a 34°C a 250 rpm. A continuación, los cultivos pueden diluirse en placas de pocillos que contienen medios TM3 complementados con glucosa al 1%, extracto de levadura al 0,1% e IPTG 200 pM hasta una DO final de 0,2, Luego, la placa se sella con una membrana Breath Easier (Diversified Biotech) y se incuban a 34°C en un agitador/incubador a 600 rpm durante 24 horas. Luego se centrifuga 1 ml de cada cultivo a 3.000 x g durante 5 min. Luego se añade el sobrenadante a ácido sulfúrico al 20% y se incuba en hielo durante 5 min. La mezcla se centrifuga a continuación durante 5 minutos a 3000 x g y el sobrenadante se recogió para el análisis de HPLC. La concentración de mevalonato en las muestras se determina mediante comparación con una curva patrón de mevalonato (Sigma). La concentración de glucosa puede medirse adicionalmente realizando un ensayo de glucosa oxidasa según cualquier método conocido en la técnica. Usando HPLC, los niveles de mevalonato se pueden cuantificar comparando la respuesta del índice de refracción de cada muestra frente a una curva de calibración generada al ejecutar diversas disoluciones que contienen mevalonato de concentración conocida.
Los ácidos nucleicos de mvaE a modo de ejemplo incluyen ácidos nucleicos que codifican para un polipéptido, fragmento de un polipéptido, péptido o polipéptido de fusión que tiene al menos una actividad de un polipéptido de mvaE. Los polipéptidos y ácidos nucleicos de mvaE a modo de ejemplo incluyen polipéptidos y ácidos nucleicos que se producen de manera natural a partir de cualquiera de los organismos fuente descritos en el presente documento, así como polipéptidos y ácidos nucleicos mutantes derivados de cualquiera de los organismos fuente descritos en el presente documento. Los ácidos nucleicos de mvaE a modo de ejemplo incluyen, por ejemplo, ácidos nucleicos de mvaE aislados de Listeria grayi_DSM 20601, Enterococcus faecium, Enterococcus gallinarum EG2, Enterococcus faecalis y/o Enterococcus casseliflavus. El ácido nucleico de mvaE codificado por el gen mvaE de Listeria grayi_DSM 20601 puede tener una identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 95%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86% o el 85% con SEQ ID NO: 95. El ácido nucleico de mvaE codificado por el gen mvaE de Enterococcus faecium puede tener una identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 95%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86% o el 85% a SEQ ID NO: 96. El ácido nucleico de mvaE codificado por el gen mvaE de Enterococcus gallinarum EG2 puede tener una identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 95%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86% o el 85% con SEQ ID NO: 97. El ácido nucleico de mvaE codificado por el gen mvaE de Enterococcus casseliflavus puede tener una identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 95%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86% o el 85% con SEQ ID NO: 98. El ácido nucleico de mvaE codificado por el gen mvaE de Enterococcus faecalis puede tener una identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 95%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86% o el 85% con el gen mvaE divulgado previamente en E. coli para producir mevalonato (véase el documento US 2005/0287655 A1; Tabata, K. y Hashimoto, S.-I. Biotecnology Letters 26: 1487-1491, 2004).
El ácido nucleico de mvaE puede expresarse en una célula recombinante en un plásmido multicopia. El plásmido puede ser un plásmido de alto número de copias, un plásmido de bajo número de copias o un plásmido de número medio de copias. Alternativamente, el ácido nucleico de mvaE puede integrarse en el cromosoma de la célula huésped. Tanto para la expresión heteróloga de un ácido nucleico de mvaE en un plásmido o como parte integrada del cromosoma de la célula huésped, la expresión del ácido nucleico puede estar dirigida o bien por un promotor inducible o bien por un promotor que exprese constitutivamente. El promotor puede ser un fuerte impulsor de la expresión, puede ser un débil impulsor de la expresión, o puede ser un impulsor medio de la expresión del ácido nucleico de mvaE.
Polipéptidos y ácidos nucleicos de mvaS a modo de ejemplo.
El gen mvaS codifica para un polipéptido que presenta actividad HMG-CoA sintasa. Este polipéptido puede convertir acetoacetil-CoA en 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA (HMG-CoA). Los ejemplos de polipéptidos y ácidos nucleicos de mvaS incluyen polipéptidos y ácidos nucleicos que se producen de manera natural a partir de cualquiera de los organismos fuente descritos en el presente documento, así como polipéptidos y ácidos nucleicos mutantes derivados de cualquiera de los organismos fuente descritos en el presente documento que tienen al menos una actividad de un polipéptido de mvaS.
Los polipéptidos de mvaS mutantes incluyen aquellos en los que uno o más residuos de aminoácidos han experimentado una sustitución de aminoácidos mientras retienen la actividad del polipéptido de mvaS (es decir, la capacidad de convertir acetoacetil-CoA en 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA). Pueden introducirse sustituciones de aminoácidos en el polipéptido de mvaS para mejorar la funcionalidad de la molécula. Por ejemplo, pueden introducirse sustituciones de aminoácidos que aumentan la afinidad de unión del polipéptido de mvaS por su sustrato, o que mejoran su capacidad para convertir acetoacetil-CoA en 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA en el polipéptido de mvaS. En algunos aspectos, los polipéptidos de mvaS mutantes contienen una o más sustituciones de aminoácidos conservativas.
Pueden usarse métodos convencionales, tales como los descritos en Quant et al. (Biochem J., 1989, 262: 159-164), para determinar si un polipéptido tiene actividad de mvaS, midiendo la actividad HMG-CoA sintasa. En un ensayo a modo de ejemplo, la actividad HMG-CoA sintasa puede someterse a ensayo mediante la medición espectrofotométrica de la desaparición de la forma enólica de acetoacetil-CoA mediante la monitorización del cambio de absorbancia a 303 nm. Un sistema de ensayo de 1 ml convencional que contiene Tris/HCl 50 mM, pH 8,0, MgCb 10 mM y ditiotreitol 0,2 mM a 30°C; pueden añadirse acetil-fosfato 5 mM, acetoacetil-CoA 10 M y muestras de 5 pl de extractos, seguido de la adición simultánea de acetil-CoA (100 pM) y 10 unidades de PTA. La actividad HMG-CoA sintasa se mide entonces como la diferencia en la velocidad antes y después de la adición de acetil-CoA. El coeficiente de absorción de acetoacetil-CoA en las condiciones usadas (pH 8,0, MgCb 10 mM) es de 12,2 x 103 M'1 cirr1. Por definición, 1 unidad de actividad enzimática provoca la transformación de 1 pmol de acetoacetil-CoA por minuto.
Alternativamente, la producción de mevalonato en células recombinantes puede medirse mediante, sin limitación, cromatografía de gases (véase la publicación de la patente estadounidense n.° US 2005/0287655 A1) o HPLC (véase la publicación de patente estadounidense n.°: 2011/0159557 A1). Como ensayo a modo de ejemplo, pueden inocularse cultivos en tubos de agitación que contienen caldo LB complementado con uno o más antibióticos y se incuban durante 14 horas a 34°C a 250 rpm. A continuación, los cultivos pueden diluirse en placas de pocillos que contienen medios TM3 complementados con glucosa al 1%, extracto de levadura al 0,1% e IPTG 200 pM hasta una DO final de 0,2, Luego, la placa se sella con una membrana Breath Easier (Diversified Biotech) y se incuba a 34°C en un agitador/incubador a 600 rpm durante 24 horas. Luego se centrifuga 1 ml de cada cultivo a 3.000 x g durante 5 min. Luego se añade el sobrenadante a ácido sulfúrico al 20% y se incuba en hielo durante 5 min. La mezcla se centrifuga a continuación durante 5 minutos a 3000 x g y el sobrenadante se recogió para el análisis de HPLC. La concentración de mevalonato en las muestras se determina mediante comparación con una curva patrón de mevalonato (Sigma). La concentración de glucosa puede medirse adicionalmente realizando un ensayo de glucosa oxidasa según cualquier método conocido en la técnica. Usando HPLC, los niveles de mevalonato se pueden cuantificar comparando la respuesta del índice de refracción de cada muestra frente a una curva de calibración generada al ejecutar varias disoluciones que contienen mevalonato de concentración conocida.
Los ejemplos de ácidos nucleicos de mvaS incluyen ácidos nucleicos que codifican para un polipéptido, fragmento de un polipéptido, péptido o polipéptido de fusión que tiene al menos una actividad de un polipéptido de mvaS. Los ejemplos de polipéptidos y ácidos nucleicos de mvaS incluyen polipéptidos y ácidos nucleicos que se producen de manera natural a partir de cualquiera de los organismos fuente descritos en el presente documento, así como polipéptidos y ácidos nucleicos mutantes derivados de cualquiera de los organismos fuente descritos en el presente documento. Los ácidos nucleicos de mvaS a modo de ejemplo incluyen, por ejemplo, ácidos nucleicos de mvaS aislados de Listeria grayi_DSM 20601, Enterococcus faecium, Enterococcus gallinarum EG2, Enterococcus faecalis y/o Enterococcus casseliflavus. El ácido nucleico de mvaS codificado por el gen mvaS de Listeria grayi_DSM 20601 puede tener una identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 95%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86% o el 85% con SEQ ID NO: 99. El ácido nucleico de mvaS codificado por el gen mvaS de Enterococcus faecium puede tener una identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 95%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86% o el 85% con SEQ ID NO: 100. El ácido nucleico de mvaS codificado por el gen mvaS de Enterococcus gallinarum EG2 puede tener una identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 95%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86% o el 85% con SEQ ID NO: 101. El ácido nucleico de mvaS codificado por el gen mvaS de Enterococcus casseliflavus puede tener una identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 95%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86% o el 85% con SEQ ID NO: 102. El ácido nucleico de mvaS codificado por el gen mvaS de Enterococcus faecalis puede tener una identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 95%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86% o el 85% con el gen mvaE divulgado previamente en E. coli para producir mevalonato (véase el documento US 2005/0287655 A1; Tabata, K. y Hashimoto, S.-I. Biotecnology Letters 26: 1487-1491, 2004).
El ácido nucleico de mvaS puede expresarse en una célula recombinante en un plásmido multicopia. El plásmido puede ser un plásmido de alto número de copias, un plásmido de bajo número de copias o un plásmido de número medio de copias. Alternativamente, el ácido nucleico de mvaS puede integrarse en el cromosoma de la célula huésped. Tanto para la expresión heteróloga de un ácido nucleico de mvaS en un plásmido o como parte integrada del cromosoma de la célula huésped, la expresión del ácido nucleico puede dirigirse o bien por un promotor inducible o bien por un promotor que se exprese de manera constitutiva. El promotor puede ser un fuerte impulsor de la expresión, puede ser un débil impulsor de la expresión, o puede ser un impulsor medio de la expresión del ácido nucleico de mvaS.
Gen de la acetoacetil-CoA sintasa
El gen de la acetoacetil-CoA sintasa (también conocido como nphT7) es un gen que codifica para una enzima que tiene la actividad de sintetizar acetoacetil-CoA a partir de malonil-CoA y acetil-CoA y que tiene una actividad mínima (por ejemplo, sin actividad) de sintetizar acetoacetil-CoA a partir de dos moléculas de acetil-CoA. Véase, por ejemplo, Okamura et al., PNAS vol. 107, n.° 25, págs. 11265-11270 (2010), a cuyo contenido se hace referencia expresamente para la enseñanza sobre nphT7. Un gen de la acetoacetil-CoA sintasa de un actinomiceto del género Streptomyces cepa CL190 se describió en la publicación de patente JP (Kokai) n.° 2008-61506 A y el documento US2010/0285549. La acetoacetil-CoA sintasa también puede denominarse acetil-CoA:malonil CoA aciltransferasa. Una acetoacetil-CoA sintasa representativa (o acetil-CoA:malonil CoA aciltransferasa) que puede usarse es Genbank AB540131.1.
En cualquiera de los aspectos o realizaciones descritos en el presente documento, puede usarse una enzima que tiene la capacidad de sintetizar acetoacetil-CoA a partir de malonil-CoA y acetil-CoA. Los ejemplos no limitativos de tal enzima se describen en el presente documento. En determinadas realizaciones descritas en el presente documento, puede usarse un gen de la acetoacetil-CoA sintasa derivado de un actinomiceto del género Streptomyces que tiene la actividad de sintetizar acetoacetil-CoA a partir de malonil-CoA y acetil-CoA. Un ejemplo de tal gen de la acetoacetil-CoA sintasa es el gen que codifica para una proteína que tiene el amino. Una proteína de este tipo que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 103 corresponde a una acetoacetil-CoA sintasa que tiene actividad de sintetizar acetoacetil-CoA a partir de malonil-CoA y acetil-CoA y que no tiene actividad de sintetizar acetoacetil-CoA a partir de dos moléculas de acetil-CoA.
En una realización, el gen que codifica para una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 103 puede obtenerse mediante un método de amplificación de ácido nucleico (por ejemplo, PCR) con el uso de ADN genómico obtenido de un actinomiceto de Streptomyces sp. cepa CL190 como molde y un par de cebadores que pueden diseñarse con referencia a la publicación de patente JP (Kokai) n.° 2008-61506 A.
Tal como se describe en el presente documento, un gen de la acetoacetil-CoA sintasa para su uso en la presente invención no se limita a un gen que codifica para una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 103 de un actinomiceto de Streptomyces sp. cepa CL190. Cualquier gen que codifique para una proteína que tenga la capacidad de sintetizar acetoacetil-CoA a partir de malonil-CoA y acetil-CoA y que no sintetice acetoacetil-CoA a partir de dos moléculas de acetil-CoA puede usarse en los métodos descritos actualmente. En determinadas realizaciones, el gen de la acetoacetil-CoA sintasa puede ser un gen que codifica para una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos con alta similitud o sustancialmente idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 103 y que tiene la función de sintetizar acetoacetil-CoA a partir de malonil-CoA y acetil-CoA. La expresión “altamente similar” o “sustancialmente idéntico” se refiere a, por ejemplo, una identidad de al menos aproximadamente el 80%, al menos aproximadamente el 85%, al menos aproximadamente el 90%, al menos aproximadamente el 91%, al menos aproximadamente el 92%, al menos aproximadamente el 93%, al menos aproximadamente el 94%, al menos aproximadamente el 95%, al menos aproximadamente el 96%, al menos aproximadamente el 97%, al menos aproximadamente el 98% y una identidad de al menos aproximadamente el 99%. Tal como se usó anteriormente, el valor de identidad corresponde al porcentaje de identidad entre los residuos de aminoácidos en una secuencia de aminoácidos diferente y la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 103, que se calcula realizando la alineación de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 103 y la secuencia de aminoácidos diferente con el uso de un programa para buscar una similitud de secuencia.
En otras realizaciones, el gen de la acetoacetil-CoA sintasa puede consistir en un gen que codifica para una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos derivada de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 103 por sustitución, deleción, adición o inserción de 1 o más aminoácidos y que tiene la función de sintetizar acetoacetil-CoA a partir de malonil-CoA y acetil-CoA. En el presente documento, la expresión “más aminoácidos” se refiere, por ejemplo, a de 2 a 30 aminoácidos, preferiblemente de 2 a 20 aminoácidos, más preferiblemente de 2 a 10 aminoácidos, y lo más preferiblemente de 2 a 5 aminoácidos.
En aún otras realizaciones, el gen de la acetoacetil-CoA sintasa puede consistir en un polinucleótido capaz de hibridar con una porción o la totalidad de un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de nucleótidos que codifica para la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 103 en condiciones rigurosas y capaces de codificar para una proteína que tiene la función de sintetizar acetoacetil-CoA a partir de malonil-CoA y acetil-CoA. En el presente documento, la hibridación en condiciones rigurosas corresponde al mantenimiento de la unión en condiciones de lavado a 60°C dos veces SSC. La hibridación se puede llevar a cabo mediante métodos conocidos convencionalmente, tales como el método descrito en J. Sambrook et al. Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3a Ed., Cold Spring Harbor Laboratory (2001).
Tal como se describe en el presente documento, un gen que codifica para una acetoacetil-CoA sintasa que tiene una secuencia de aminoácidos que difiere de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 103 puede aislarse potencialmente de cualquier organismo, por ejemplo, un actinomiceto que no se obtiene de Streptomyces sp. cepa CL190. Además, pueden obtenerse genes de acetoacetil-CoA sintasa para su uso en el presente documento modificando un polinucleótido que codifica para la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 103 mediante un método conocido en la técnica. La mutagénesis de una secuencia de nucleótidos se puede llevar a cabo mediante un método conocido tal como el método de Kunkel o el método dúplex con huecos o mediante un método similar a cualquiera de los mismos. Por ejemplo, la mutagénesis se puede llevar a cabo con el uso de un kit de mutagénesis (por ejemplo, nombres de producto; Mutant-K y Mutant-G (TAKARA Bio)) para mutagénesis específica del sitio, nombre de producto; un kit de la serie de mutagénesis in vitro LA PCR (TAKARA Bio) y similares.
La actividad de una acetoacetil-CoA sintasa que tiene una secuencia de aminoácidos que difiere de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 103 se puede evaluar tal como se describe a continuación. Específicamente, un gen que codifica para una proteína que va a evaluarse se introduce en primer lugar en una célula huésped de manera que el gen pueda expresarse en ella, seguido de la purificación de la proteína mediante una técnica como la cromatografía. Se añaden malonil-CoA y acetil-CoA como sustratos a un tampón que contiene la proteína obtenida que va a evaluarse, seguido, por ejemplo, de incubación a una temperatura deseada (por ejemplo, de 10°C a 60°C). Una vez completada la reacción, se determinan la cantidad de sustrato perdido y/o la cantidad de producto (acetoacetil-CoA) producido. Por tanto, es posible evaluar si la proteína que está sometiéndose a prueba tiene la función de sintetizar acetoacetil-CoA a partir de malonil-CoA y acetil-CoA y evaluar el grado de síntesis. En tal caso, es posible examinar si la proteína tiene o no la actividad de sintetizar acetoacetil-CoA a partir de dos moléculas de acetil-CoA añadiendo acetil-CoA solo como sustrato a un tampón que contiene la proteína obtenida para evaluar y determinar la cantidad de sustrato perdido y/o la cantidad de producto producido de manera similar.
Células recombinantes capaces de aumentar la producción de mevalonato
Las células recombinantes (por ejemplo, células bacterianas recombinantes) descritas en el presente documento pueden producir mevalonato en una cantidad y/o concentración mayor que la de las mismas células sin ninguna manipulación a las diversas rutas enzimáticas descritas en el presente documento. Por tanto, las células recombinantes (por ejemplo, células bacterianas) que se han modificado por ingeniería genética para la modulación en las diversas rutas descritas en el presente documento son útiles para mejorar la producción de mevalonato.
Por consiguiente, en determinados aspectos, la invención proporciona células recombinantes según se reivindican capaces de mejorar la producción de mevalonato, en las que las células comprenden uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican para un polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa y uno o más ácidos nucleicos que codifican para uno o más polipéptidos de la ruta de MVA superior, en las que las células producen cantidades aumentadas de mevalonato en comparación con células que no comprenden el uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican para un polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa.
En determinados aspectos, las células recombinantes descritas en el presente documento comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica para una fosfocetolasa aislada de Burkholderia phytofirmans, Lactobacillus buchneri, Bifidobacterium gallicum, Bifidobacterium dentium, Bifidobacterium bifidum y/o Clostridium acetobutylicum. En algunas realizaciones, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica para una fosfocetolasa aislada de Mycobacterium gilvum, Shewanella baltica, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus crispatus, Bifidobacterium longum, Leuconostoc citreum, Bradyrhizobium sp., Enterococcus faecium, Brucella microti, Lactobacillus salivarius, Streptococcus agalactiae, Rhodococcus imtechensis, Burkholderia xenovorans, Mycobacterium intracellulare, Nitrosomonas sp., Schizosaccharomyces pombe, Leuconostoc mesenteroides, Streptomyces sp., Lactobacillus buchneri, Streptomyces ghanaensis, Cyanothece sp. y/o Neosartorya fischeri. En otra realización, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica para una fosfocetolasa aislada de Enterococcus faecium, Listeria grayi, Enterococcus gallinarum, Enterococcus saccharolyticus, Enterococcus casseliflavus, Mycoplasma alligatoris, Carnobacterium sp., Melissococcus plutonius, Tetragenococcus halophilus y/o Mycoplasma arthritidis. En todavía otra realización, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica para una fosfocetolasa aislada de Streptococcus agalactiae, Mycoplasma agalactiae, Streptococcus gordonii, Kingella oralis, Mycoplasma fermentans, Granulicatella adiacens, Mycoplasma hominis, Mycoplasma crocodyli, Mycobacterium bovis, Neisseria sp., Streptococcus sp., Eremococcus coleocola, Granulicatella elegans, Streptococcus parasanguinis, Aerococcus urinae, Kingella kingae, Streptococcus australis, Streptococcus criceti y/o Mycoplasma columbinum. En algunas realizaciones, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica para una fosfocetolasa aislada de un organismo enumerado en la tabla 1, la tabla 2 y/o las figuras 3-24.
En una realización, las células recombinantes comprenden además una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica para los polipéptidos de mvaE y mvaS de L. grayi, E. faecium, E. gallinarum, E. casseliflavus y/o E. faecalis. En otra realización, las células recombinantes comprenden además una acetoacetil-CoA sintasa y uno o más ácidos nucleicos que codifican para uno o más polipéptidos de la ruta de MVA superior.
En una realización, las células recombinantes pueden modificarse por ingeniería genética adicionalmente para aumentar la actividad de uno o más de los siguientes genes seleccionados del grupo que consiste en ribosa-5-fosfato isomerasa (rpiA y/o rpiB), D-ribulosa-5-fosfato 3-epimerasa (rpe), transcetolasa (tktA y/o tktB), transaldolasa B (tal B), fosfato acetiltransferasa (pta y/o eutD). En otra realización, las células recombinantes pueden modificarse por ingeniería genética adicionalmente para disminuir la actividad de uno o más genes de los siguientes genes, incluyendo glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (zwf), 6-fosfofructocinasa-1 (pfkA y/o pfkB), fructosa bisfosfato aldolasa (fba, fbaA, fbaBy/o fbaC), gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (gapA y/o gapB), acetato cinasa (ackA), citrato sintasa (gltA), EI (ptsI), EIiCbGIc (ptsG), EIIAGlc (crr) y/o HPr (ptsH).
En un aspecto, las células recombinantes descritas en el presente documento pueden producir mevalonato a una productividad volumétrica mayor que la de las mismas células que carecen de una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa. En determinadas realizaciones, la célula recombinante puede producir más de 2,00 g/l/h de mevalonato. Alternativamente, las células recombinantes pueden producir más de aproximadamente 1,0 g/l/h, 1,2 g/l/h, 1,4 g/l/h, 1,6 g/l/h, 1,8 g/l/h, 2,0 g/l/h, 2,2 g/l/h, 2,4 g/l/h, 2,6 g/l/h, 2,8 g/l/h, 3,0 g/l/h, 3,2 g/l/h, 3,4 g/l/h, 3,6 g/l/h, 3,8 g/l/h, 4,0 g/l/h, 4,2 g/l/h, 4,4 g/l/h, 4,6 g/l/h, 4,8 g/l/h, 5,0 g/l/h, 5,2 g/l/h, 5,4 g/l/h, 5,6 g/l/h, 5,8 g/l/h, 6,0 g/l/h de mevalonato, inclusive, así como cualquier valor numérico entre estos números.
En un aspecto, las células recombinantes descritas en el presente documento pueden producir mevalonato en un título mayor que el de las mismas células que carecen de una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa. Estas células recombinantes pueden producir más de aproximadamente 100 g/l de título de mevalonato después de 48 horas de fermentación. Alternativamente, las células recombinantes pueden producir más de aproximadamente 50 g/l, 60 g/l, 70 g/l, 80 g/l, 90 g/l, 100 g/l, 110 g/l, 120 g/l, 130 g/l, 140 g/l, 150 g/l, 160 g/l, 170 g/l, 180 g/l, 190 g/l, 200 g/l, 210 g/l, 220 g/l, 230 g/l, 240 g/l, 250 g/l, 260 g/l, 270 g/l, 280 g/l, 290 g/l, 300 g/l de título máximo de mevalonato después de 48 horas de fermentación, inclusive, así como cualquier valor numérico entre estos números.
En otras realizaciones, las células recombinantes descritas en el presente documento comprenden además una o más mutaciones que aumentan el flujo de carbono hacia la ruta de MVA y, por tanto, pueden producir mayores títulos de mevalonato en comparación con células que no se han modificado por ingeniería genética de manera similar. En tales realizaciones, las células recombinantes descritas en el presente documento producen mevalonato a un título máximo mayor que el de las mismas células que carecen de una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica para el polipéptido de fosfocetolasa que tiene actividad fosfocetolasa. En una realización, las células recombinantes pueden modificarse por ingeniería genética para aumentar la actividad de uno o más de los siguientes genes seleccionados del grupo que consiste en ribosa-5-fosfato isomerasa (rpiA y/o rpiB), D-ribulosa-5-fosfato 3-epimerasa (rpe), transcetolasa (tktA y/o tktB), transaldolasa B (tal B), fosfato acetiltransferasa (pta y/o eutD). En otra realización, las células recombinantes pueden modificarse por ingeniería genética adicionalmente para disminuir la actividad de uno o más genes de los siguientes genes, incluyendo glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (zwf), 6-fosfofructocinasa-1 (pfkA y/o pfkB), fructosa bisfosfato aldolasa (fba, fbaA, fbaB y/o fbaC), gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (gapA y/o gapB), acetato cinasa (ackA), citrato sintasa (gltA), EI (ptsI), EIICBGlc (ptsG), EIIAGlc (crr) y/o HPr (ptsH).
En un aspecto, las células recombinantes descritas en el presente documento pueden producir mevalonato a un mayor índice de productividad celular (CPI por sus siglas en inglés) para mevalonato que el de las mismas células que carecen de una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa. Las células recombinantes pueden tener un CPI para mevalonato de al menos aproximadamente 3,0 (g/g). Alternativamente, las células recombinantes pueden tener un CPI para mevalonato de al menos aproximadamente 1 (g/g), 2 (g/g), 3 (g/g), 4 (g/g), 5 (g/g), 6 (g/g), 7 (g/g), 8 (g/g), 9 (g/g), 10 (g/g), 11 (g/g), 12 (g/g), 13 (g/g), 14 (g/g), 15 (g/g), 20 (g/g), 25 (g/g) o 30 (g/g) inclusive, así como cualquier valor numérico en entre estos números.
En determinadas realizaciones, las células recombinantes descritas en el presente documento comprenden además una o más mutaciones que aumentan el flujo de carbono hacia la ruta de MVA que da como resultado un mayor índice de productividad celular (CPI) para mevalonato en comparación con células que no se han modificado por ingeniería genética de manera similar. Además, las células recombinantes descritas en el presente documento tienen un CPI mayor que el de las mismas células que carecen de una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica para el polipéptido de fosfocetolasa que tiene actividad fosfocetolasa. En una realización, las células recombinantes pueden modificarse por ingeniería genética adicionalmente para aumentar la actividad de uno o más de los siguientes genes seleccionados del grupo que consiste en ribosa-5-fosfato isomerasa (rpiA y/o rpiB), D-ribulosa-5-fosfato 3-epimerasa (rpe), transcetolasa (tktA y/o tktB), transaldolasa B (tal B), fosfato acetiltransferasa (pta y/o eutD). En otra realización, estas células recombinantes pueden modificarse por ingeniería genética adicionalmente para disminuir la actividad de uno o más genes de los siguientes genes, incluyendo glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (zwf), 6-fosfofructocinasa-1 (pfkA y/o pfkB), fructosa bisfosfato aldolasa (fba, fbaA, fbaB y/o fbaC), gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (gapA y/o gapB), acetato cinasa (ackA), citrato sintasa (gltA), EI (ptsI), EIICBGlc (ptsG), EIIAGlc (crr) y/o HPr (ptsH).
Además, las células descritas en el presente documento tienen un rendimiento másico mayor de mevalonato a partir de glucosa que el de las mismas células que carecen de una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica para el polipéptido de fosfocetolasa que tiene actividad fosfocetolasa. Las células recombinantes pueden producir un rendimiento másico de mevalonato a partir de glucosa de al menos aproximadamente el 28%. Alternativamente, las células recombinantes pueden producir un rendimiento másico de mevalonato a partir de glucosa de al menos aproximadamente el 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50% o 55%, inclusive, así como cualquier valor numérico entre estos números.
En determinadas realizaciones, las células recombinantes descritas en el presente documento comprenden además una o más mutaciones que aumentan el flujo de carbono hacia la ruta de MVA que da como resultado un mayor rendimiento másico de mevalonato en comparación con células que no se han modificado por ingeniería genética de manera similar. Además, las células recombinantes descritas en el presente documento tienen un rendimiento de mevalonato en masa mayor que el de las mismas células que carecen de una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica para el polipéptido de fosfocetolasa que tiene actividad fosfocetolasa. En una realización, las células recombinantes pueden ser diseñadas para aumentar la actividad de uno o más de los siguientes genes seleccionados del grupo que consiste en la ribosa 5-fosfato isomerasa (rpiA y/o rpiB), D-ribulosa-5-fosfato 3-epimerasa (rpe) transcetolasa (tktA y/o tktB), transaldolasa B (tal B), fosfato acetiltransferasa (pta y/o eutD). En otra realización, estas células recombinantes pueden modificarse por ingeniería genética adicionalmente para disminuir la actividad de uno o más genes de los siguientes genes, incluyendo glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (zwf), 6-fosfofructocinasa-1 (pfkA y/o pfkB), fructosa bisfosfato aldolasa (fba, fbaA, fbaB y/o fbaC), gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (gapA y/o gapB), acetato cinasa (ackA), citrato sintasa (gltA), EI (ptsI), EIICBGlc (ptsG), EIIAGlc (crr) y/o HPr (ptsH).
En un aspecto, las células recombinantes descritas en el presente documento producen mevalonato mientras acumulan menos acetato en el caldo de fermentación en comparación con las mismas células que carecen de una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa. Las células recombinantes pueden producir niveles aumentados de mevalonato mientras acumulan menos de 4,5 g/l de acetato en el caldo de fermentación durante una fermentación de 48 horas. Alternativamente, las células recombinantes pueden producir niveles aumentados de mevalonato mientras acumulan menos de aproximadamente 8,0 g/l, 7,5 g/l, 7,0 g/l, 6,5 g/l, 6,0 g/l, 5,5 g/l, 5,0 g/l, 4,5 g/l, 4,0 g/l, 3,5 g/l, 3,0 g/l, 2,5 g/l, 2,0 g/l, o 1,5 g/l, de acetato en el caldo de fermentación durante 48 horas, incluida la fermentación, así como cualquier valor numérico entre estos números. En determinadas realizaciones, la disminución de la acumulación de acetato en el caldo de fermentación puede mejorar la viabilidad celular durante la ejecución de la fermentación.
En determinadas realizaciones, las células recombinantes descritas en el presente documento comprenden además una o más mutaciones que aumentan el flujo de carbono hacia la ruta de MVA que produce mayores niveles de mevalonato mientras que acumulan menos acetato en el caldo de fermentación en comparación con células que no se han diseñado de forma similar. En determinadas realizaciones, la disminución de la acumulación de acetato en el caldo de fermentación puede mejorar la viabilidad celular durante la ejecución de la fermentación.
También se proporcionan en el presente documento células recombinantes productoras de mevalonato capaces de aumentar el flujo de carbono a través de la ruta de la fosfocetolasa, en las que las células recombinantes comprenden: (i) una secuencia de ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa, en las que el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 65% con SEQ ID NO: 8 y (ii) uno o más ácidos nucleicos que codifican para uno o más polipéptidos de la ruta de MVA superior, en las que dicha célula recombinante que comprende dicho polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa de (i) tiene un valor de índice de rendimiento mayor de 1,0 en uno o más de los siguientes parámetros: (a) crecimiento celular en glucosa, (b) crecimiento celular en xilosa, (c) producción de acetil-fosfato intracelular o (d) crecimiento celular en glucosa-6-fosfato. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 23. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 24. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 25. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 26. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 27. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 28. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 29. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 30. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 31. En otras realizaciones, dicho valor de índice de rendimiento para cualquiera de dichos parámetros es cualquiera de tal como mayor de 1,1, tal como mayor de 1,2, mayor de 1,4, mayor de 1,6, mayor de 1,8, mayor de 2, mayor de 2,2, mayor de 2,4, mayor de 2,6, mayor de 2,8, mayor de 3, mayor de 3,2, mayor de 3,4, mayor de 3,6, mayor de 3,8, mayor de 4, mayor de 4,2, mayor de 4,4, mayor de 4,6, mayor de 4,8, mayor de 5, mayor de 5,2, mayor de 5,4, mayor de 5,6, mayor de 5,8, mayor de 6, mayor de 6,2, mayor de 6,4, mayor de 6,6, mayor de 6,8, mayor de 7, mayor de 7,2, mayor de 7,4, mayor de 7,6, mayor de 7,8, mayor de 8, mayor de 8,2, mayor de 8,4, mayor de 8,6, mayor de 8,8, 9, mayor de 9,2, mayor de 9,4, mayor de 9,6, mayor de 9,8 o mayor de 10 o más en comparación con un polipéptido parental que tiene actividad fosfocetolasa (por ejemplo, una fosfocetolasa de E. gallinarum). En otras realizaciones, el índice de rendimiento celular aumenta al menos aproximadamente 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 3, 4, 5 veces o más en comparación con una molécula parental. En otras realizaciones, el índice de rendimiento celular es mayor de cualquiera de aproximadamente 0,1 a 0,5, de aproximadamente 0,25 a 0,75, de aproximadamente 0,5 a 1, de aproximadamente 0,75 a 1,25, de aproximadamente 1 a 1,5, de aproximadamente 1,25 a 1,75, de aproximadamente 1,5 a 2, de aproximadamente 1,75 a 2,25, de aproximadamente 2 a 2,5, de aproximadamente 2,25 a 2,75, de aproximadamente 2,5 a 3, de aproximadamente 2,75 a 3,25, de aproximadamente 3 a 3,5, de aproximadamente 3,25 a 3,75, de aproximadamente 3,5 a 4, de aproximadamente 3.75 a 4,25, de aproximadamente 4 a 4,5, de aproximadamente 4,25 a 4,75, de aproximadamente 4,5 a 5, de aproximadamente 4,75 a 5,25, de aproximadamente 5 a 5,5, de aproximadamente 5,25 a 5,75, de aproximadamente 5.5 a 6, de aproximadamente 6,25 a 6,75, de aproximadamente 6,5 a 7, de aproximadamente 6,75 a 7,25, de aproximadamente 7 a 7,5, de aproximadamente 7,75 a 8,25, de aproximadamente 8 a 8,5, de aproximadamente 8,25 a 8,75, de aproximadamente 8,5 a 9, de aproximadamente 8,75 a 9,25, de aproximadamente 9 a 9,5, de aproximadamente 9,25 a 9,75 o de aproximadamente 9,5 a 10 o más en comparación con una molécula parental. En otras realizaciones, el índice de rendimiento celular es mayor de cualquiera de aproximadamente 0,1 a 2, aproximadamente 1-3, aproximadamente 2-4, aproximadamente 3-5, aproximadamente 4-6, aproximadamente 5-7, aproximadamente 6-8, aproximadamente 7-9 o aproximadamente 8-10 o más en comparación con una molécula parental. En algunas realizaciones, la molécula parental es una fosfocetolasa de E. gallinarum. En otras realizaciones, la actividad intracelular aumenta al menos aproximadamente 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 veces o más.
Adicionalmente, se proporcionan en el presente documento células recombinantes productoras de mevalonato capaces de aumentar el flujo de carbono a través de la ruta de la fosfocetolasa, en las que las células recombinantes comprenden: (i) una secuencia de ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa, en las que el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 65% con SEQ ID NO: 8 y (ii) uno o más ácidos nucleicos que codifican para uno o más polipéptidos de la ruta de MVA superior, en las que dicho polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa de (i) tiene un valor de índice de rendimiento mayor de 1,0 en uno o más de los siguientes parámetros: (a) solubilidad de proteínas, (b) expresión de proteínas o (c) actividad específica de fructosa-6-fosfato (F6P). En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 23. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 24. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 25. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 26. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 27. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 28. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 29. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 30. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 31. En otras realizaciones, dicho valor de índice de rendimiento para cualquiera de dichos parámetros es cualquiera de tal como mayor de 1,1, tal como mayor de 1,2, mayor de 1,4, mayor de 1,6, mayor de 1,8, mayor de 2, mayor de 2,2, mayor de 2,4, mayor de 2,6, mayor de 2,8, mayor de 3, mayor de 3,2, mayor de 3,4, mayor de 3,6, mayor de 3,8, mayor de 4, mayor de 4,2, mayor de 4,4, mayor de 4,6, mayor de 4,8, mayor de 5, mayor de 5,2, mayor de 5,4, mayor de 5,6, mayor de 5,8, mayor de 6, mayor de 6,2, mayor de 6,4, mayor de 6,6, mayor de 6,8, mayor de 7, mayor de 7,2, mayor de 7,4, mayor de 7,6, mayor de 7,8, mayor de 8, mayor de 8,2, mayor de 8,4, mayor de 8,6, mayor de 8,8, 9, mayor de 9,2, mayor de 9,4, mayor de 9,6, mayor de 9,8 o mayor de 10 o más en comparación con un polipéptido parental que tiene actividad fosfocetolasa (por ejemplo, una fosfocetolasa de E. gallinarum). En otras realizaciones, el índice de rendimiento celular aumenta al menos aproximadamente 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 3, 4, 5 veces o más en comparación con una molécula parental. En otras realizaciones, el índice de rendimiento celular es mayor de cualquiera de aproximadamente 0,1 a 0,5, de aproximadamente 0,25 a 0,75, de aproximadamente 0,5 a 1, de aproximadamente 0,75 a 1,25, de aproximadamente 1 a 1,5, de aproximadamente 1,25 a 1,75, de aproximadamente 1,5 a 2, de aproximadamente 1.75 a 2,25, de aproximadamente 2 a 2,5, de aproximadamente 2,25 a 2,75, de aproximadamente 2,5 a 3, de aproximadamente 2,75 a 3,25, de aproximadamente 3 a 3,5, de aproximadamente 3,25 a 3,75, de aproximadamente 3.5 a 4, de aproximadamente 3,75 a 4,25, de aproximadamente 4 a 4,5, de aproximadamente 4,25 a 4,75, de aproximadamente 4,5 a 5, de aproximadamente 4,75 a 5,25, de aproximadamente 5 a 5,5, de aproximadamente 5.25 a 5,75, de aproximadamente 5,5 a 6, de aproximadamente 6,25 a 6,75, de aproximadamente 6,5 a 7, de aproximadamente 6,75 a 7,25, de aproximadamente 7 a 7,5, de aproximadamente 7,75 a 8,25, de aproximadamente 8 a 8,5, de aproximadamente 8,25 a 8,75, de aproximadamente 8,5 a 9, de aproximadamente 8,75 a 9,25, de aproximadamente 9 a 9,5, de aproximadamente 9,25 a 9,75 o de aproximadamente 9,5 a 10 o más en comparación con una molécula parental. En otras realizaciones, el índice de rendimiento celular es mayor de cualquiera de aproximadamente 0,1 a 2, aproximadamente 1-3, aproximadamente 2-4, aproximadamente 3-5, aproximadamente 4­ 6, aproximadamente 5-7, aproximadamente 6-8, aproximadamente 7-9 o aproximadamente 8-10 o más en comparación con una molécula parental. En algunas realizaciones, la molécula parental es una fosfocetolasa de E. gallinarum. En otras realizaciones, la actividad intracelular aumenta al menos aproximadamente 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 veces o más.
Además, se proporcionan en el presente documento células recombinantes productoras de mevalonato capaces de aumentar el flujo de carbono a través de la ruta de la fosfocetolasa, en las que las células recombinantes comprenden: (i) una secuencia de ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa, en las que el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 65% con SEQ ID NO: 11 y (ii) uno o más ácidos nucleicos que codifican para uno o más polipéptidos de la ruta de MVA superior, en las que dicha célula recombinante que comprende dicho polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa de (i) tiene un valor de índice de rendimiento mayor de 1,0 en uno o más de los siguientes parámetros: (a) crecimiento celular en glucosa, (b) crecimiento celular en xilosa, (c) producción de acetil-fosfato intracelular o (d) crecimiento celular en glucosa-6-fosfato. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 32. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 33. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 34. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 35. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 36. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 37. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 38. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 39. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 40. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 41. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 42. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 43. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 44. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 45. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 46. En otras realizaciones, dicho valor de índice de rendimiento para cualquiera de dichos parámetros es cualquiera de tal como mayor de 1,1, tal como mayor de 1,2, mayor de 1,4, mayor de 1,6, mayor de 1,8, mayor de 2, mayor de 2,2, mayor de 2,4, mayor de 2,6, mayor de 2,8, mayor de 3, mayor de 3,2, mayor de 3,4, mayor de 3,6, mayor de 3,8, mayor de 4, mayor de 4,2, mayor de 4,4, mayor de 4,6, mayor de 4,8, mayor de 5, mayor de 5,2, mayor de 5,4, mayor de 5,6, mayor de 5,8, mayor de 6, mayor de 6,2, mayor de 6,4, mayor de 6,6, mayor de 6,8, mayor de 7, mayor de 7,2, mayor de 7,4, mayor de 7,6, mayor de 7,8, mayor de 8, mayor de 8,2, mayor de 8,4, mayor de 8,6, mayor de 8,8, 9, mayor de 9,2, mayor de 9,4, mayor de 9,6, mayor de 9,8 o mayor de 10 o más en comparación con un polipéptido parental que tiene actividad fosfocetolasa (por ejemplo, una fosfocetolasa de E. gallinarum). En otras realizaciones, el índice de rendimiento celular aumenta al menos aproximadamente 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 3, 4, 5 veces o más en comparación con una molécula parental. En otras realizaciones, el índice de rendimiento celular es mayor de cualquiera de aproximadamente 0,1 a 0,5, de aproximadamente 0,25 a 0,75, de aproximadamente 0,5 a 1, de aproximadamente 0,75 a 1,25, de aproximadamente 1 a 1,5, de aproximadamente 1,25 a 1,75, de aproximadamente 1,5 a 2, de aproximadamente 1,75 a 2,25, de aproximadamente 2 a 2,5, de aproximadamente 2.25 a 2,75, de aproximadamente 2,5 a 3, de aproximadamente 2,75 a 3,25, de aproximadamente 3 a 3,5, de aproximadamente 3,25 a 3,75, de aproximadamente 3,5 a 4, de aproximadamente 3,75 a 4,25, de aproximadamente 4 a 4,5, de aproximadamente 4,25 a 4,75, de aproximadamente 4,5 a 5, de aproximadamente 4,75 a 5,25, de aproximadamente 5 a 5,5, de aproximadamente 5,25 a 5,75, de aproximadamente 5,5 a 6, de aproximadamente 6.25 a 6,75, de aproximadamente 6,5 a 7, de aproximadamente 6,75 a 7,25, de aproximadamente 7 a 7,5, de aproximadamente 7,75 a 8,25, de aproximadamente 8 a 8,5, de aproximadamente 8,25 a 8,75, de aproximadamente 8,5 a 9, de aproximadamente 8,75 a 9,25, de aproximadamente 9 a 9,5, de aproximadamente 9,25 a 9,75 o de aproximadamente 9,5 a 10 o más en comparación con una molécula parental. En otras realizaciones, el índice de rendimiento celular es mayor de cualquiera de aproximadamente 0,1 a 2, aproximadamente 1-3, aproximadamente 2-4, aproximadamente 3-5, aproximadamente 4-6, aproximadamente 5-7, aproximadamente 6-8, aproximadamente 7-9 o aproximadamente 8-10 o más en comparación con una molécula parental. En algunas realizaciones, la molécula parental es una fosfocetolasa de E. gallinarum. En otras realizaciones, la actividad intracelular aumenta al menos aproximadamente 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 veces o más.
Se proporcionan en el presente documento células recombinantes productoras de mevalonato capaces de aumentar el flujo de carbono a través de la ruta de la fosfocetolasa, en las que las células recombinantes comprenden: (i) una secuencia de ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa, en las que el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 65% para SEQ ID NO: 11 y (ii) uno o más ácidos nucleicos que codifican para uno o más polipéptidos de la ruta de MVA superior, en las que dicho polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa de (i) tiene un valor de índice de rendimiento mayor de 1,0 en uno o más de los parámetros siguientes: (a) solubilidad de proteínas, (b) expresión de proteínas o (c) actividad específica de fructosa-6- fosfato (F6P). En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 32. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 33. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 34. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 35. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 36. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 37. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 38. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 39. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 40. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 41. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 42. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 43. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 44. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 45. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 46. En otras realizaciones, dicho valor de índice de rendimiento para cualquiera de dichos parámetros es cualquiera de tal como mayor de 1,1, tal como mayor de 1,2, mayor de 1,4, mayor de 1,6, mayor de 1,8, mayor de 2, mayor de 2,2, mayor de 2,4, mayor de 2,6, mayor de 2,8, mayor de 3, mayor de 3,2, mayor de 3,4, mayor de 3,6, mayor de 3,8, mayor de 4, mayor de 4,2, mayor de 4,4, mayor de 4,6, mayor de 4,8, mayor de 5, mayor de 5,2, mayor de 5,4, mayor de 5,6, mayor de 5,8, mayor de 6, mayor de 6,2, mayor de 6,4, mayor de 6,6, mayor de 6,8, mayor de 7, mayor de 7,2, mayor de 7,4, mayor de 7,6, mayor de 7,8, mayor de 8, mayor de 8,2, mayor de 8,4, mayor de 8,6, mayor de 8,8, 9, mayor de 9,2, mayor de 9,4, mayor de 9,6, mayor de 9,8 o mayor de 10 o más en comparación con un polipéptido parental que tiene actividad fosfocetolasa (por ejemplo, una fosfocetolasa de E. gallinarum). En otras realizaciones, el índice de rendimiento celular aumenta al menos aproximadamente 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 3, 4, 5 veces o más en comparación con una molécula parental. En otras realizaciones, el índice de rendimiento celular es mayor de cualquiera de aproximadamente 0,1 a 0,5, de aproximadamente 0,25 a 0,75, de aproximadamente 0,5 a 1, de aproximadamente 0,75 a 1,25, de aproximadamente 1 a 1,5, de aproximadamente 1,25 a 1,75, de aproximadamente 1,5 a 2, de aproximadamente 1,75 a 2,25, de aproximadamente 2 a 2,5, de aproximadamente 2.25 a 2,75, de aproximadamente 2,5 a 3, de aproximadamente 2,75 a 3,25, de aproximadamente 3 a 3,5, de aproximadamente 3,25 a 3,75, de aproximadamente 3,5 a 4, de aproximadamente 3,75 a 4,25, de aproximadamente 4 a 4,5, de aproximadamente 4,25 a 4,75, de aproximadamente 4,5 a 5, de aproximadamente 4,75 a 5,25, de aproximadamente 5 a 5,5, de aproximadamente 5,25 a 5,75, de aproximadamente 5,5 a 6, de aproximadamente 6.25 a 6,75, de aproximadamente 6,5 a 7, de aproximadamente 6,75 a 7,25, de aproximadamente 7 a 7,5, de aproximadamente 7,75 a 8,25, de aproximadamente 8 a 8,5, de aproximadamente 8,25 a 8,75, de aproximadamente 8,5 a 9, de aproximadamente 8,75 a 9,25, de aproximadamente 9 a 9,5, de aproximadamente 9,25 a 9,75 o de aproximadamente 9,5 a 10 o más en comparación con una molécula parental. En otras realizaciones, el índice de rendimiento celular es mayor de cualquiera de aproximadamente 0,1 a 2, aproximadamente 1-3, aproximadamente 2-4, aproximadamente 3-5, aproximadamente 4-6, aproximadamente 5-7, aproximadamente 6-8, aproximadamente 7- 9 o aproximadamente 8-10 o más en comparación con una molécula parental. En algunas realizaciones, la molécula parental es una fosfocetolasa de E. gallinarum. En otras realizaciones, la actividad intracelular aumenta al menos aproximadamente 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 veces o más.
Métodos de uso de células recombinantes para producir cantidades aumentadas de mevalonato
También se proporcionan en el presente documento métodos para la producción de mevalonato. En algunos aspectos, el método para producir mevalonato comprende: (a) cultivar una composición que comprende células recombinantes que se han modificado por ingeniería genética para aumentar el flujo de carbono a través de la ruta de la fosfocetolasa tal como se describe en el presente documento (incluyendo cualquiera de las células recombinantes descritas anteriormente), o progenie de las mismas, capaces de producir mevalonato; y (b) producir mevalonato. En algunos aspectos, el método para producir mevalonato comprende las etapas de cultivar cualquiera de las células recombinantes descritas en el presente documento en condiciones adecuadas para la producción de mevalonato y permitir que las células recombinantes produzcan mevalonato. En algunos aspectos, el método para producir mevalonato comprende además una etapa de recuperación del mevalonato.
Tal como se describe en el presente documento, los métodos de producción de mevalonato comprenden las etapas de: (a) cultivar células recombinantes (incluyendo, pero sin limitarse a, células de E. coli) que no expresan de manera endógena un polipéptido de fosfocetolasa, en los que las células expresan de manera heteróloga una o más copias de un gen que codifica para un polipéptido de fosfocetolasa junto con uno o más ácidos nucleicos heterólogos que expresan uno o más péptidos de la ruta de MVA; y (b) producir mevalonato. En determinadas realizaciones, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica para una fosfocetolasa aislada de Burkholderia phytofirmans, Lactobacillus buchneri, Bifidobacterium gallicum, Bifidobacterium dentium, Bifidobacterium bifidum y/o Clostridium acetobutylicum. En algunas realizaciones, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica para una fosfocetolasa aislada de Mycobacterium gilvum, Shewanella baltica, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus crispatus, Bifidobacterium longum, Leuconostoc citreum, Bradyrhizobium sp., Enterococcus faecium, Brucella microti, Lactobacillus salivarius, Streptococcus agalactiae, Rhodococcus imtechensis, Burkholderia xenovorans, Mycobacterium intracellulare, Nitrosomonas sp., Schizosaccharomyces pombe, Leuconostoc mesenteroides, Streptomyces sp., Lactobacillus buchneri, Streptomyces ghanaensis, Cyanothece sp. y/o Neosartorya fischeri. En algunas realizaciones, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica para una fosfocetolasa aislada de Enterococcus faecium, Listeria grayi, Enterococcus gallinarum, Enterococcus saccharolyticus, Enterococcus casseliflavus, Mycoplasma alligatoris, Carnobacterium sp., Melissococcus plutonius, Tetragenococcus halophilus y/o Mycoplasma arthritidis. En algunas realizaciones, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica para una fosfocetolasa aislada de Streptococcus agalactiae, Mycoplasma agalactiae, Streptococcus gordonii, Kingella oralis, Mycoplasma fermentans, Granulicatella adiacens, Mycoplasma hominis, Mycoplasma crocodyli, Mycobacterium bovis, Neisseria sp., Streptococcus sp., Eremococcus coleocola, Granulicatella elegans, Streptococcus parasanguinis, Aerococcus urinae, Kingella kingae, Streptococcus australis, Streptococcus criceti y/o Mycoplasma columbinum. En algunas realizaciones, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica para una fosfocetolasa aislada de un organismo enumerado en la tabla 1, la tabla 2 y/o las figuras 3-24. Además, las células recombinantes pueden producir mevalonato en concentraciones mayores que las de las mismas células que carecen de una o más copias heterólogas de un gen que codifica para un polipéptido de fosfocetolasa de Burkholderia phytofirmans, Lactobacillus buchneri, Bifidobacterium gallicum, Bifidobacterium dentium, Bifidobacterium bifidum, Clostridium acetobutylicum, Mycobacterium gilvum, Shewanella baltica, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus crispatus, Bifidobacterium longum, Leuconostoc citreum, Bradyrhizobium sp., Enterococcus faecium, Brucella microti, Lactobacillus salivarius, Streptococcus agalactiae, Rhodococcus imtechensis, Burkholderia xenovorans, Mycobacterium intracellulare, Nitrosomonas sp., Schizosaccharomyces pombe, Leuconostoc mesenteroides, Streptomyces sp., Lactobacillus buchneri, Streptomyces ghanaensis, Cyanothece sp., Neosartorya fischeri, Enterococcus faecium, Listeria grayi, Enterococcus gallinarum, Enterococcus saccharolyticus, Enterococcus casseliflavus, Mycoplasma alligatoris, Carnobacterium sp., Melissococcus plutonius, Tetragenococcus halophilus, Mycoplasma arthritidis, Streptococcus agalactiae, Mycoplasma agalactiae, Streptococcus gordonii, Kingella oralis, Mycoplasma fermentans, Granulicatella adiacens, Mycoplasma hominis, Mycoplasma crocodyli, Mycobacterium bovis, Neisseria sp., Streptococcus sp., Eremococcus coleocola. y/o Mycoplasma columbinum junto con uno o más ácidos nucleicos heterólogos que expresan uno o más péptidos de la ruta de MVA, cuando las células se cultivan en medio mínimo. En determinadas realizaciones, la una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido de fosfocetolasa de Burkholderia phytofirmans, Lactobacillus buchneri, Bifidobacterium gallicum, Bifidobacterium dentium, Bifidobacterium bifidum, Clostridium acetobutylicum, Mycobacterium gilvum, Shewanella baltica, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus crispatus, Bifidobacterium longum, Leuconostoc citreum, Bradyrhizobium sp., Enterococcus faecium, Brucella microti, Lactobacillus salivarius, Streptococcus agalactiae, Rhodococcus imtechensis, Burkholderia xenovorans, Mycobacterium intracellulare, Nitrosomonas sp., Schizosaccharomyces pombe, Leuconostoc mesenteroides, Streptomyces sp., Lactobacillus buchneri, Streptomyces ghanaensis, Cyanothece sp., Neosartorya fischeri, Enterococcus faecium, Listeria grayi, Enterococcus gallinarum, Enterococcus saccharolyticus, Enterococcus casseliflavus, Mycoplasma alligatoris, Carnobacterium sp., Melissococcus plutonius, Tetragenococcus halophilus, Mycoplasma arthritidis, Streptococcus agalactiae, Mycoplasma agalactiae, Streptococcus gordonii, Kingella oralis, Mycoplasma fermentans, Granulicatella adiacens, Mycoplasma hominis, Mycoplasma crocodyli, Mycobacterium bovis, Neisseria sp., Streptococcus sp., Eremococcus coleocola, Granulicatella elegans, Streptococcus parasanguinis, Aerococcus urinae, Kingella kingae, Streptococcus australis, Streptococcus criceti y/o Mycoplasma columbinum es un ácido nucleico heterólogo que se integra en el cromosoma de la célula huésped.
Los presente métodos para la producción de mevalonato pueden producir mevalonato usando células que tienen una productividad volumétrica mayor de 2,00 g/l/h de mevalonato. Alternativamente, las células recombinantes pueden producir más de aproximadamente 1,0 g/l/h, 1,2 g/l/h, 1,4 g/l/h, 1,6 g/l/h, 1,8 g/l/h, 2,0 g/l/h, 2,2 g/l/h, 2,4 g/l/h, 2,6 g/l/h, 2,8 g/l/h, 3,0 g/l/h, 3,2 g/l/h, 3,4 g/l/h, 3,6 g/l/h, 3,8 g/l/h, 4,0 g/l/h, 4,2 g/l/h, 4,4 g/l/h, 4,6 g/l/h, 4,8 g/l/h, 5,0 g/l/h, 5,2 g/l/h, 5,4 g/l/h, 5,6 g/l/h, 5,8 g/l/h, 6,0 g/l/h de mevalonato, inclusive, así como cualquier valor numérico entre estos números. En algunos aspectos, el método para producir mevalonato comprende además una etapa de recuperación del mevalonato.
En otras realizaciones, los métodos de producción de mevalonato pueden comprender las etapas de: (a) cultivar células recombinantes (incluyendo, pero sin limitarse a, células de E. coli) que no expresan de manera endógena un polipéptido de fosfocetolasa, en los que las células expresan de manera heteróloga una o más copias de un gen que codifica para un polipéptido de fosfocetolasa junto con uno o más ácidos nucleicos heterólogos que expresan uno o más péptidos de la ruta de MVA; y (b) producir mevalonato, en los que las células recombinantes producen mevalonato con un título máximo mayor después de 48 horas de fermentación que el de las mismas células que carecen de una o más copias heterólogas de un gen que codifica para un polipéptido de fosfocetolasa. En determinadas realizaciones, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica para una fosfocetolasa aislada de Burkholderia phytofirmans, Lactobacillus buchneri, Bifidobacterium gallicum, Bifidobacterium dentium, Bifidobacterium bifidum y/o Clostridium acetobutylicum. En algunas realizaciones, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica para una fosfocetolasa aislada de Mycobacterium gilvum, Shewanella baltica, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus crispatus, Bifidobacterium longum, Leuconostoc citreum, Bradyrhizobium sp., Enterococcus faecium, Brucella microti, Lactobacillus salivarius, Streptococcus agalactiae, Rhodococcus imtechensis, Burkholderia xenovorans, Mycobacterium intracellulare, Nitrosomonas sp., Schizosaccharomyces pombe, Leuconostoc mesenteroides, Streptomyces sp., Lactobacillus buchneri, Streptomyces ghanaensis, Cyanothece sp. y/o Neosartorya fischeri. En algunas realizaciones, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica para una fosfocetolasa aislada de Enterococcus faecium, Listeria grayi, Enterococcus gallinarum, Enterococcus saccharolyticus, Enterococcus casseliflavus, Mycoplasma alligatoris, Carnobacterium sp., Melissococcus plutonius, Tetragenococcus halophilus y/o Mycoplasma arthritidis. En algunas realizaciones, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica para una fosfocetolasa aislada de Streptococcus agalactiae, Mycoplasma agalactiae, Streptococcus gordonii, Kingella oralis, Mycoplasma fermentans, Granulicatella adiacens, Mycoplasma hominis, Mycoplasma crocodyli, Mycobacterium bovis, Neisseria sp., Streptococcus sp., Eremococcus coleocola, Granulicatella elegans, Streptococcus parasanguinis, Aerococcus urinae, Kingella kingae, Streptococcus australis, Streptococcus criceti y/o Mycoplasma columbinum. En algunas realizaciones, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica para una fosfocetolasa aislada de un organismo enumerado en la tabla 1, la tabla 2 y/o las figuras 3-24.
Los presente métodos para la producción de mevalonato pueden producir mevalonato usando células que pueden producir un título máximo mayor de aproximadamente 100 g/l de título máximo de mevalonato después de 48 horas de fermentación. Alternativamente, las células recombinantes pueden producir más de aproximadamente 50 g/l, 60 g/l, 70 g/l, 80 g/l, 90 g/l, 100 g/l, 110 g/l, 120 g/l, 130 g/l, 140 g/l, 150 g/l, 160 g/l, 170 g/l, 180 g/l, 190 g/l, 200 g/l, 210 g/l, 220 g/l, 230 g/l, 240 g/l, 250 g/l, 260 g/l, 270 g/l, 280 g/l, 290 g/l, 300 g/l de título máximo de mevalonato después de 48 horas de fermentación, ambos inclusive, así como cualquier valor numérico entre estos números. En algunos aspectos, el método para producir mevalonato comprende además una etapa de recuperación del mevalonato.
En otras realizaciones, los métodos de producción de mevalonato pueden comprender las etapas de: (a) cultivar células recombinantes (incluyendo, pero sin limitarse a, células de E. coli) que no expresan de manera endógena un polipéptido de fosfocetolasa, en los que las células expresan de manera heteróloga una o más copias de un gen que codifica para un polipéptido de fosfocetolasa junto con uno o más ácidos nucleicos heterólogos que expresan uno o más péptidos de la ruta de MVA; y (b) producir mevalonato, en los que las células recombinantes tienen un CPI para mevalonato mayor que el de las mismas células que carecen de una o más copias heterólogas de un gen que codifica para un polipéptido de fosfocetolasa. En determinadas realizaciones, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica para una fosfocetolasa aislada de Burkholderia phytofirmans, Lactobacillus buchneri, Bifidobacterium gallicum, Bifidobacterium dentium, Bifidobacterium bifidum y/o Clostridium acetobutylicum. En algunas realizaciones, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica para una fosfocetolasa aislada de Mycobacterium gilvum, Shewanella baltica, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus crispatus, Bifidobacterium longum, Leuconostoc citreum, Bradyrhizobium sp., Enterococcus faecium, Brucella microti, Lactobacillus salivarius, Streptococcus agalactiae, Rhodococcus imtechensis, Burkholderia xenovorans, Mycobacterium intracellulare, Nitrosomonas sp., Schizosaccharomyces pombe, Leuconostoc mesenteroides, Streptomyces sp., Lactobacillus buchneri, Streptomyces ghanaensis, Cyanothece sp. y/o Neosartorya fischeri. En algunas realizaciones, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica para una fosfocetolasa aislada de Enterococcus faecium, Listeria grayi, Enterococcus gallinarum, Enterococcus saccharolyticus, Enterococcus casseliflavus, Mycoplasma alligatoris, Carnobacterium sp., Melissococcus plutonius, Tetragenococcus halophilus y/o Mycoplasma arthritidis. En algunas realizaciones, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica para una fosfocetolasa aislada de Streptococcus agalactiae, Mycoplasma agalactiae, Streptococcus gordonii, Kingella oralis, Mycoplasma fermentans, Granulicatella adiacens, Mycoplasma hominis, Mycoplasma crocodyli, Mycobacterium bovis, Neisseria sp., Streptococcus sp., Eremococcus coleocola, Granulicatella elegans, Streptococcus parasanguinis, Aerococcus urinae, Kingella kingae, Streptococcus australis, Streptococcus criceti y/o Mycoplasma columbinum. En algunas realizaciones, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica para una fosfocetolasa aislada de un organismo enumerado en la tabla 1, la tabla 2 y/o las figuras 3-24.
Los presente métodos para la producción de mevalonato pueden producir mevalonato usando células con un CPI para mevalonato de al menos aproximadamente 3,0 (g/g). Alternativamente, las células recombinantes pueden tener un CPI para mevalonato de al menos aproximadamente 1 (g/g), 2 (g/g), 3 (g/g), 4 (g/g), 5 (g/g), 6 (g/g), 7 (g/g), 8 (g/g), 9 (g/g), 10 (g/g), 11 (g/g), 12 (g/g), 13 (g/g), 14 (g/g), 15 (g/g), 20 (g/g), 25 (g/g) o 30 (g/g) inclusive, así como cualquier valor numérico en entre estos números. En algunos aspectos, el método para producir mevalonato comprende además una etapa de recuperación del mevalonato.
En determinadas realizaciones, los métodos de producción de mevalonato pueden comprender las etapas de: (a) cultivar células recombinantes (incluyendo, pero sin limitarse a, células de E. coli) que no expresan de manera endógena un polipéptido de fosfocetolasa, en los que las células expresan de manera heteróloga una o más copias de un gen que codifica para un polipéptido de fosfocetolasa junto con uno o más ácidos nucleicos heterólogos que expresan uno o más péptidos de la ruta de MVA; y (b) producir mevalonato, en los que las células recombinantes presentan una tasa de captación de oxígeno (OUR por sus siglas en inglés) disminuida en comparación con la de las mismas células que carecen de una o más copias heterólogas de un gen que codifica para un polipéptido de fosfocetolasa. En determinadas realizaciones, las células recombinantes que expresan una o más copias heterólogas de un gen que codifica para un polipéptido de fosfocetolasa presentan una disminución de hasta 1 vez, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 6 veces o 7 veces de la OUR en comparación con células recombinantes que no expresan una fosfocetolasa.
Se proporcionan en el presente documento métodos de uso de cualquiera de las células descritas anteriormente para mejorar la producción de mevalonato. La producción de mevalonato por células puede mejorarse mediante la expresión de uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican para un polipéptido de fosfocetolasa. En determinadas realizaciones, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica para una fosfocetolasa aislada de Burkholderia phytofirmans, Lactobacillus buchneri, Bifidobacterium gallicum, Bifidobacterium dentium, Bifidobacterium bifidum y/o Clostridium acetobutylicum. En algunas realizaciones, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica para una fosfocetolasa aislada de Mycobacterium gilvum, Shewanella baltica, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus crispatus, Bifidobacterium longum, Leuconostoc citreum, Bradyrhizobium sp., Enterococcus faecium, Brucella microti, Lactobacillus salivarius, Streptococcus agalactiae, Rhodococcus imtechensis, Burkholderia xenovorans, Mycobacterium intracellulare, Nitrosomonas sp., Schizosaccharomyces pombe, Leuconostoc mesenteroides, Streptomyces sp., Lactobacillus buchneri, Streptomyces ghanaensis, Cyanothece sp. y/o Neosartorya fischeri. En algunas realizaciones, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica para una fosfocetolasa aislada de Enterococcus faecium, Listeria grayi, Enterococcus gallinarum, Enterococcus saccharolyticus, Enterococcus casseliflavus, Mycoplasma alligatoris, Carnobacterium sp., Melissococcus plutonius, Tetragenococcus halophilus y/o Mycoplasma arthritidis. En algunas realizaciones, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica para una fosfocetolasa aislada de Streptococcus agalactiae, Mycoplasma agalactiae, Streptococcus gordonii, Kingella oralis, Mycoplasma fermentans, Granulicatella adiacens, Mycoplasma hominis, Mycoplasma crocodyli, Mycobacterium bovis, Neisseria sp., Streptococcus sp., Eremococcus coleocola, Granulicatella elegans, Streptococcus parasanguinis, Aerococcus urinae, Kingella kingae, Streptococcus australis, Streptococcus criceti y/o Mycoplasma columbinum. En algunas realizaciones, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica para una fosfocetolasa aislada de un organismo enumerado en la tabla 1, la tabla 2 y/o las figuras 3-24.
La producción de mevalonato puede mejorarse en aproximadamente 1.000.000 de veces (por ejemplo, de aproximadamente 1 a aproximadamente 500.000 veces, de aproximadamente 1 a aproximadamente 50.000 veces, de aproximadamente 1 a aproximadamente 5.000 veces, de aproximadamente 1 a aproximadamente 1.000 veces, de aproximadamente 1 a aproximadamente 500 veces, de aproximadamente 1 a aproximadamente 100 veces, de aproximadamente 1 a aproximadamente 50 veces, de aproximadamente 5 a aproximadamente 100.000 veces, de aproximadamente 5 a aproximadamente 10.000 veces, de aproximadamente 5 a aproximadamente 1.000 veces, de aproximadamente 5 a aproximadamente 500 veces, de aproximadamente 5 a aproximadamente 100 veces, de aproximadamente 10 a aproximadamente 50.000 veces, de aproximadamente 50 a aproximadamente 10.000 veces, de aproximadamente 100 a aproximadamente 5.000 veces, de aproximadamente 200 a aproximadamente 1.000 veces, de aproximadamente 50 a aproximadamente 500 veces o de aproximadamente 50 a aproximadamente 200 veces) en comparación con la producción de mevalonato por células productoras de mevalonato sin la expresión de uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican para un polipéptido de fosfocetolasa. En determinadas realizaciones descritas en el presente documento, las células huésped se han modificado por ingeniería genética adicionalmente para aumentar el flujo de carbono a la producción de MVA. En determinadas realizaciones, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica para una fosfocetolasa aislada de Burkholderia phytofirmans, Lactobacillus buchneri, Bifidobacterium gallicum, Bifidobacterium dentium, Bifidobacterium bifidum y/o Clostridium acetobutylicum. En algunas realizaciones, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica para una fosfocetolasa aislada de Mycobacterium gilvum, Shewanella baltica, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus crispatus, Bifidobacterium longum, Leuconostoc citreum, Bradyrhizobium sp., Enterococcus faecium, Brucella microti, Lactobacillus salivarius, Streptococcus agalactiae, Rhodococcus imtechensis, Burkholderia xenovorans, Mycobacterium intracellulare, Nitrosomonas sp., Schizosaccharomyces pombe, Leuconostoc mesenteroides, Streptomyces sp., Lactobacillus buchneri, Streptomyces ghanaensis, Cyanothece sp. y/o Neosartorya fischeri. En algunas realizaciones, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica para una fosfocetolasa aislada de Enterococcus faecium, Listeria grayi, Enterococcus gallinarum, Enterococcus saccharolyticus, Enterococcus casseliflavus, Mycoplasma alligatoris, Carnobacterium sp., Melissococcus plutonius, Tetragenococcus halophilus y/o Mycoplasma arthritidis. En algunas realizaciones, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica para una fosfocetolasa aislada de Streptococcus agalactiae, Mycoplasma agalactiae, Streptococcus gordonii, Kingella oralis, Mycoplasma fermentans, Granulicatella adiacens, Mycoplasma hominis, Mycoplasma crocodyli, Mycobacterium bovis, Neisseria sp., Streptococcus sp., Eremococcus coleocola, Granulicatella elegans, Streptococcus parasanguinis, Aerococcus urinae, Kingella kingae, Streptococcus australis, Streptococcus criceti y/o Mycoplasma columbinum. En algunas realizaciones, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica para una fosfocetolasa aislada de un organismo enumerado en la tabla 1, la tabla 2 y/o las figuras 3-24.
En otros aspectos, los métodos descritos en el presente documento pueden proporcionar una producción de mevalonato mejorada en al menos aproximadamente el 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%. 90%, 1 vez, 2 veces, 5 veces, 10 veces, 20 veces, 50 veces, 100 veces, 200 veces, 500 veces, 1000 veces, 2000 veces, 5000 veces, 10.000 veces, 20.000 veces, 50.000 veces, 100.000 veces 200.000 veces, 500.000 veces o 1.000.000 veces en comparación con la producción de mevalonato por células productoras de mevalonato sin la expresión de uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican para un polipéptido de fosfocetolasa. En determinadas realizaciones descritas en el presente documento, las células huésped se han modificado por ingeniería genética adicionalmente para aumentar el flujo de carbono a la producción de MVA.
Además, pueden usarse condiciones de cultivo celular más específicas para cultivar las células en los métodos descritos en el presente documento. Por ejemplo, en algunos aspectos, el método para la producción de mevalonato comprende las etapas de (a) cultivar células recombinantes (incluyendo, pero sin limitarse a, células de E. coli) que no tienen de manera endógena un gen de la fosfocetolasa en medio mínimo a 34°C, en el que las células recombinantes expresan de manera heteróloga una o más copias de un gen heterólogo que codifica para un polipéptido de fosfocetolasa en un plásmido de número de copias bajo a medio y bajo el control de un promotor fuerte; y (b) producir mevalonato. En determinadas realizaciones, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica para una fosfocetolasa aislada de Burkholderia phytofirmans, Lactobacillus buchneri, Bifidobacterium gallicum, Bifidobacterium dentium, Bifidobacterium bifidum y/o Clostridium acetobutylicum. En algunas realizaciones, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica para una fosfocetolasa aislada de Mycobacterium gilvum, Shewanella baltica, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus crispatus, Bifidobacterium longum, Leuconostoc citreum, Bradyrhizobium sp., Enterococcus faecium, Brucella microti, Lactobacillus salivarius, Streptococcus agalactiae, Rhodococcus imtechensis, Burkholderia xenovorans, Mycobacterium intracellulare, Nitrosomonas sp., Schizosaccharomyces pombe, Leuconostoc mesenteroides, Streptomyces sp., Lactobacillus buchneri, Streptomyces ghanaensis, Cyanothece sp. y/o Neosartorya fischeri. En algunas realizaciones, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica para una fosfocetolasa aislada de Enterococcus faecium, Listeria grayi, Enterococcus gallinarum, Enterococcus saccharolyticus, Enterococcus casseliflavus, Mycoplasma alligatoris, Carnobacterium sp., Melissococcus plutonius, Tetragenococcus halophilus y/o Mycoplasma arthritidis. En algunas realizaciones, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica para una fosfocetolasa aislada de Streptococcus agalactiae, Mycoplasma agalactiae, Streptococcus gordonii, Kingella oralis, Mycoplasma fermentans, Granulicatella adiacens, Mycoplasma hominis, Mycoplasma crocodyli, Mycobacterium bovis, Neisseria sp., Streptococcus sp., Eremococcus coleocola, Granulicatella elegans, Streptococcus parasanguinis, Aerococcus urinae, Kingella kingae, Streptococcus australis, Streptococcus criceti y/o Mycoplasma columbinum. En algunas realizaciones, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica para una fosfocetolasa aislada de un organismo enumerado en la tabla 1, la tabla 2 y/o las figuras 3-24. En algunos aspectos, el método de producción de mevalonato comprende además una etapa de recuperación del mevalonato.
También se proporcionan en el presente documento métodos para producir mevalonato que comprenden cultivar una célula recombinante capaz de aumentar el flujo de carbono a través de la ruta de la fosfocetolasa, en los que la célula recombinante comprende: (i) una secuencia de ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa, en los que el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 65% con SEQ ID NO: 8 y (ii) uno o más ácidos nucleicos que codifican para uno o más polipéptidos de la ruta de MVA superior, en los que dicha célula recombinante que comprende dicho polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa de (i) tiene un valor de índice de rendimiento mayor de 1,0 en uno o más de los siguientes parámetros: (a) crecimiento celular en glucosa, (b) crecimiento celular en xilosa, (c) producción de acetil-fosfato intracelular o (d) crecimiento celular en glucosa-6-fosfato y producir dicho mevalonato. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 23. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 24. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 25. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 26. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 27. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 28. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 29. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 30. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 31. En otras realizaciones, dicho valor de índice de rendimiento para cualquiera de dichos parámetros es cualquiera de tal como mayor de 1,1, tal como mayor de 1,2, mayor de 1,4, mayor de 1,6, mayor de 1,8, mayor de 2, mayor de 2,2, mayor de 2,4, mayor de 2,6, mayor de 2,8, mayor de 3, mayor de 3,2, mayor de 3,4, mayor de 3,6, mayor de 3,8, mayor de 4, mayor de 4,2, mayor de 4,4, mayor de 4,6, mayor de 4,8, mayor de 5, mayor de 5,2, mayor de 5,4, mayor de 5,6, mayor de 5,8, mayor de 6, mayor de 6,2, mayor de 6,4, mayor de 6,6, mayor de 6,8, mayor de 7, mayor de 7,2, mayor de 7,4, mayor de 7,6, mayor de 7,8, mayor de 8, mayor de 8,2, mayor de 8,4, mayor de 8,6, mayor de 8,8, 9, mayor de 9,2, mayor de 9,4, mayor de 9,6, mayor de 9,8 o mayor de 10 o más en comparación con un polipéptido parental que tiene actividad fosfocetolasa (por ejemplo, una fosfocetolasa de E. gallinarum). En otras realizaciones, el índice de rendimiento celular aumenta al menos aproximadamente 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 3, 4, 5 veces o más en comparación con una molécula parental. En otras realizaciones, el índice de rendimiento celular es mayor de cualquiera de aproximadamente 0,1 a 0,5, de aproximadamente 0,25 a 0,75, de aproximadamente 0,5 a 1, de aproximadamente 0,75 a 1,25, de aproximadamente 1 a 1,5, de aproximadamente 1,25 a 1,75, de aproximadamente 1,5 a 2, de aproximadamente 1,75 a 2,25, de aproximadamente 2 a 2,5, de aproximadamente 2.25 a 2,75, de aproximadamente 2,5 a 3, de aproximadamente 2,75 a 3,25, de aproximadamente 3 a 3,5, de aproximadamente 3,25 a 3,75, de aproximadamente 3,5 a 4, de aproximadamente 3,75 a 4,25, de aproximadamente 4 a 4,5, de aproximadamente 4,25 a 4,75, de aproximadamente 4,5 a 5, de aproximadamente 4,75 a 5,25, de aproximadamente 5 a 5,5, de aproximadamente 5,25 a 5,75, de aproximadamente 5,5 a 6, de aproximadamente 6.25 a 6,75, de aproximadamente 6,5 a 7, de aproximadamente 6,75 a 7,25, de aproximadamente 7 a 7,5, de aproximadamente 7,75 a 8,25, de aproximadamente 8 a 8,5, de aproximadamente 8,25 a 8,75, de aproximadamente 8.5 a 9, de aproximadamente 8,75 a 9,25, de aproximadamente 9 a 9,5, de aproximadamente 9,25 a 9,75 o de aproximadamente 9,5 a 10 o más en comparación con una molécula parental. En otras realizaciones, el índice de rendimiento celular es mayor de cualquiera de aproximadamente 0,1 a 2, aproximadamente 1-3, aproximadamente 2-4, aproximadamente 3-5, aproximadamente 4-6, aproximadamente 5-7, aproximadamente 6-8, aproximadamente 7-9 o aproximadamente 8-10 o más en comparación con una molécula parental. En algunas realizaciones, la molécula parental es una fosfocetolasa de E. gallinarum. En otras realizaciones, la actividad intracelular aumenta al menos aproximadamente 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 veces o más.
Adicionalmente, se proporcionan en el presente documento métodos para producir mevalonato que comprenden cultivar una célula recombinante capaz de aumentar el flujo de carbono a través de la ruta de la fosfocetolasa, en los que la célula recombinante comprende: (i) una secuencia de ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa, en los que el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 65% con SEQ ID NO: 8 y (ii) uno o más ácidos nucleicos que codifican para uno o más polipéptidos de la ruta de MVA superior, en los que dicho polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa de (i) tiene un valor de índice de rendimiento mayor de 1,0 en uno o más de los siguientes parámetros: (a) solubilidad de proteínas, (b) expresión de proteínas o (c) actividad específica de fructosa-6-fosfato (F6P) y que produce dicho mevalonato. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 23. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 24. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 25. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 26. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 27. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 28. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 29. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 30. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 31. En otras realizaciones, dicho valor de índice de rendimiento para cualquiera de dichos parámetros es cualquiera de tal como mayor de 1,1, tal como mayor de 1,2, mayor de 1,4, mayor de 1,6, mayor de 1,8, mayor de 2, mayor de 2,2, mayor de 2,4, mayor de 2,6, mayor de 2,8, mayor de 3, mayor de 3,2, mayor de 3,4, mayor de 3,6, mayor de 3,8, mayor de 4, mayor de 4,2, mayor de 4,4, mayor de 4,6, mayor de 4,8, mayor de 5, mayor de 5,2, mayor de 5,4, mayor de 5,6, mayor de 5,8, mayor de 6, mayor de 6,2, mayor de 6,4, mayor de 6,6, mayor de 6,8, mayor de 7, mayor de 7,2, mayor de 7,4, mayor de 7,6, mayor de 7,8, mayor de 8, mayor de 8,2, mayor de 8,4, mayor de 8,6, mayor de 8,8, 9, mayor de 9,2, mayor de 9,4, mayor de 9,6, mayor de 9,8 o mayor de 10 o más en comparación con un polipéptido parental que tiene actividad fosfocetolasa (por ejemplo, una fosfocetolasa de E. gallinarum). En otras realizaciones, el índice de rendimiento celular aumenta al menos aproximadamente 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 3, 4, 5 veces o más en comparación con una molécula parental. En otras realizaciones, el índice de rendimiento celular es mayor de cualquiera de aproximadamente 0,1 a 0,5, de aproximadamente 0,25 a 0,75, de aproximadamente 0,5 a 1, de aproximadamente 0,75 a 1,25, de aproximadamente 1 a 1,5, de aproximadamente 1,25 a 1,75, de aproximadamente 1,5 a 2, de aproximadamente 1,75 a 2,25, de aproximadamente 2 a 2,5, de aproximadamente 2.25 a 2,75, de aproximadamente 2,5 a 3, de aproximadamente 2,75 a 3,25, de aproximadamente 3 a 3,5, de aproximadamente 3,25 a 3,75, de aproximadamente 3,5 a 4, de aproximadamente 3,75 a 4,25, de aproximadamente 4 a 4,5, de aproximadamente 4,25 a 4,75, de aproximadamente 4,5 a 5, de aproximadamente 4,75 a 5,25, de aproximadamente 5 a 5,5, de aproximadamente 5,25 a 5,75, de aproximadamente 5,5 a 6, de aproximadamente 6.25 a 6,75, de aproximadamente 6,5 a 7, de aproximadamente 6,75 a 7,25, de aproximadamente 7 a 7,5, de aproximadamente 7,75 a 8,25, de aproximadamente 8 a 8,5, de aproximadamente 8,25 a 8,75, de aproximadamente 8.5 a 9, de aproximadamente 8,75 a 9,25, de aproximadamente 9 a 9,5, de aproximadamente 9,25 a 9,75 o de aproximadamente 9,5 a 10 o más en comparación con una molécula parental. En otras realizaciones, el índice de rendimiento celular es mayor de cualquiera de aproximadamente 0,1 a 2, aproximadamente 1-3, aproximadamente 2-4, aproximadamente 3-5, aproximadamente 4-6, aproximadamente 5-7, aproximadamente 6-8, aproximadamente 7-9 o aproximadamente 8-10 o más en comparación con una molécula parental. En algunas realizaciones, la molécula parental es una fosfocetolasa de E. gallinarum. En otras realizaciones, la actividad intracelular aumenta al menos aproximadamente 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 veces o más.
Se proporcionan además en el presente documento métodos para producir mevalonato que comprenden cultivar una célula recombinante capaz de aumentar el flujo de carbono a través de la ruta de la fosfocetolasa, en los que la célula recombinante comprende: (i) una secuencia de ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa, en los que el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 65% con SEQ ID NO: 11 y (ii) uno o más ácidos nucleicos que codifican para uno o más polipéptidos de la ruta de MVA superior, en los que dicha célula recombinante que comprende dicho polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa de (i) tiene un valor de índice de rendimiento mayor de 1,0 en uno o más de los siguientes parámetros: (a) crecimiento celular en glucosa, (b) crecimiento celular en xilosa, (c) producción de acetil-fosfato intracelular o (d) crecimiento celular en glucosa-6-fosfato y producir dicho mevalonato. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 32. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 33. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 34. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 35. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 36. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 37. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 38. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 39. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 40. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 41. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 42. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 43. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 44. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 45. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 46. En otras realizaciones, dicho valor de índice de rendimiento para cualquiera de dichos parámetros es cualquiera de tal como mayor de 1,1, tal como mayor de 1,2, mayor de 1,4, mayor de 1,6, mayor de 1,8, mayor de 2, mayor de 2,2, mayor de 2,4, mayor de 2,6, mayor de 2,8, mayor de 3, mayor de 3,2, mayor de 3,4, mayor de 3,6, mayor de 3,8, mayor de 4, mayor de 4,2, mayor de 4,4, mayor de 4,6, mayor de 4,8, mayor de 5, mayor de 5,2, mayor de 5,4, mayor de 5,6, mayor de 5,8, mayor de 6, mayor de 6,2, mayor de 6,4, mayor de 6,6, mayor de 6,8, mayor de 7, mayor de 7,2, mayor de 7,4, mayor de 7,6, mayor de 7,8, mayor de 8, mayor de 8,2, mayor de 8,4, mayor de 8,6, mayor de 8,8, 9, mayor de 9,2, mayor de 9,4, mayor de 9,6, mayor de 9,8 o mayor de 10 o más en comparación con un polipéptido parental que tiene actividad fosfocetolasa (por ejemplo, una fosfocetolasa de E. gallinarum). En otras realizaciones, el índice de rendimiento celular aumenta al menos aproximadamente 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 3, 4, 5 veces o más en comparación con una molécula parental. En otras realizaciones, el índice de rendimiento celular es mayor de cualquiera de aproximadamente 0,1 a 0,5, de aproximadamente 0,25 a 0,75, de aproximadamente 0,5 a 1, de aproximadamente 0,75 a 1,25, de aproximadamente 1 a 1,5, de aproximadamente 1.25 a 1,75, de aproximadamente 1,5 a 2, de aproximadamente 1,75 a 2,25, de aproximadamente 2 a 2,5, de aproximadamente 2,25 a 2,75, de aproximadamente 2,5 a 3, de aproximadamente 2,75 a 3,25, de aproximadamente 3 a 3,5, de aproximadamente 3,25 a 3,75, de aproximadamente 3,5 a 4, de aproximadamente 3,75 a 4,25, de aproximadamente 4 a 4,5, de aproximadamente 4,25 a 4,75, de aproximadamente 4,5 a 5, de aproximadamente 4,75 a 5,25, de aproximadamente 5 a 5,5, de aproximadamente 5,25 a 5,75, de aproximadamente 5,5 a 6, de aproximadamente 6,25 a 6,75, de aproximadamente 6,5 a 7, de aproximadamente 6,75 a 7,25, de aproximadamente 7 a 7,5, de aproximadamente 7,75 a 8,25, de aproximadamente 8 a 8,5, de aproximadamente 8,25 a 8,75, de aproximadamente 8,5 a 9, de aproximadamente 8,75 a 9,25, de aproximadamente 9 a 9,5, de aproximadamente 9.25 a 9,75 o de aproximadamente 9,5 a 10 o más en comparación con una molécula parental. En otras realizaciones, el índice de rendimiento celular es mayor de cualquiera de aproximadamente 0,1 a 2, aproximadamente 1-3, aproximadamente 2-4, aproximadamente 3-5, aproximadamente 4-6, aproximadamente 5-7, aproximadamente 6-8, aproximadamente 7-9 o aproximadamente 8-10 o más en comparación con una molécula parental. En algunas realizaciones, la molécula parental es una fosfocetolasa de E. gallinarum. En otras realizaciones, la actividad intracelular aumenta al menos aproximadamente 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 veces o más.
Se proporcionan en el presente documento métodos para producir mevalonato que comprenden cultivar una célula recombinante capaz de aumentar el flujo de carbono a través de la ruta de la fosfocetolasa, en los que las células recombinantes comprenden: (i) una secuencia de ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa, en los que el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 65% con SEQ ID NO: 11 y (ii) uno o más ácidos nucleicos que codifican para uno o más polipéptidos de la ruta de MVA superior, en los que dicho polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa de (i) tiene un valor de índice de rendimiento mayor de 1,0 en uno o más de los siguientes parámetros: (a) solubilidad de proteínas, (b) expresión de proteínas o (c) actividad específica de fructosa-6-fosfato (F6P) y que produce dicho mevalonato. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 32. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 33. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 34. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 35. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 36. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 37. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 38. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 39. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 40. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 41. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 42. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 43. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 44. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 45. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 46. En otras realizaciones, dicho valor de índice de rendimiento para cualquiera de dichos parámetros es cualquiera de tal como mayor de 1,1, tal como mayor de 1,2, mayor de 1,4, mayor de 1,6, mayor de 1,8, mayor de 2, mayor de 2,2, mayor de 2,4, mayor de 2,6, mayor de 2,8, mayor de 3, mayor de 3,2, mayor de 3,4, mayor de 3,6, mayor de 3,8, mayor de 4, mayor de 4,2, mayor de 4,4, mayor de 4,6, mayor de 4,8, mayor de 5, mayor de 5,2, mayor de 5,4, mayor de 5,6, mayor de 5,8, mayor de 6, mayor de 6,2, mayor de 6,4, mayor de 6,6, mayor de 6,8, mayor de 7, mayor de 7,2, mayor de 7,4, mayor de 7,6, mayor de 7,8, mayor de 8, mayor de 8,2, mayor de 8,4, mayor de 8,6, mayor de 8,8, 9, mayor de 9,2, mayor de 9,4, mayor de 9,6, mayor de 9,8 o mayor de 10 o más en comparación con un polipéptido parental que tiene actividad fosfocetolasa (por ejemplo, una fosfocetolasa de E. gallinarum). En otras realizaciones, el índice de rendimiento celular aumenta al menos aproximadamente 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 3, 4, 5 veces o más en comparación con una molécula parental. En otras realizaciones, el índice de rendimiento celular es mayor de cualquiera de aproximadamente 0,1 a 0,5, de aproximadamente 0,25 a 0,75, de aproximadamente 0,5 a 1, de aproximadamente 0,75 a 1,25, de aproximadamente 1 a 1,5, de aproximadamente 1,25 a 1,75, de aproximadamente 1,5 a 2, de aproximadamente 1,75 a 2,25, de aproximadamente 2 a 2,5, de aproximadamente 2,25 a 2,75, de aproximadamente 2.5 a 3, de aproximadamente 2,75 a 3,25, de aproximadamente 3 a 3,5, de aproximadamente 3,25 a 3,75, de aproximadamente 3,5 a 4, de aproximadamente 3,75 a 4,25, de aproximadamente 4 a 4,5, de aproximadamente 4,25 a 4,75, de aproximadamente 4,5 a 5, de aproximadamente 4,75 a 5,25, de aproximadamente 5 a 5,5, de aproximadamente 5,25 a 5,75, de aproximadamente 5,5 a 6, de aproximadamente 6,25 a 6,75, de aproximadamente 6.5 a 7, de aproximadamente 6,75 a 7,25, de aproximadamente 7 a 7,5, de aproximadamente 7,75 a 8,25, de aproximadamente 8 a 8,5, de aproximadamente 8,25 a 8,75, de aproximadamente 8,5 a 9, de aproximadamente 8,75 a 9,25, de aproximadamente 9 a 9,5, de aproximadamente 9,25 a 9,75 o de aproximadamente 9,5 a 10 o más en comparación con una molécula parental. En otras realizaciones, el índice de rendimiento celular es mayor de cualquiera de aproximadamente 0,1 a 2, aproximadamente 1-3, aproximadamente 2-4, aproximadamente 3-5, aproximadamente 4-6, aproximadamente 5-7, aproximadamente 6-8, aproximadamente 7-9 o aproximadamente 8­ 10 o más en comparación con una molécula parental. En algunas realizaciones, la molécula parental es una fosfocetolasa de E. gallinarum. En otras realizaciones, la actividad intracelular aumenta al menos aproximadamente 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 veces o más.
Células recombinantes capaces de producir isopreno
El isopreno (2-metil-1,3-butadieno) es un importante compuesto orgánico usado en una amplia gama de aplicaciones. Por ejemplo, el isopreno se emplea como producto intermedio o como material de partida en la síntesis de numerosas composiciones químicas y polímeros, incluida la producción de caucho sintético. El isopreno también es un importante material biológico que se sintetiza de manera natural por muchas plantas y animales.
El isopreno se produce a partir de DMAPP mediante la acción enzimática de la isopreno sintasa. Por tanto, sin querer restringirse a la teoría, se piensa que el aumento de la producción celular de e4p , GAP, Ac-P y/o acetil-CoA en células recombinantes que comprenden la ruta del mevalonato mediante cualquiera de las composiciones y los métodos descritos anteriormente también dará como resultado la producción de mayores cantidades de isopreno. El aumento del rendimiento molar de la producción de mevalonato a partir de la glucosa se traduce en rendimientos molares mayores de los precursores de isoprenoides, isopreno y/o isoprenoides producidos a partir de glucosa cuando se combina con los niveles de actividad enzimática apropiados de la mevalonato cinasa, fosfomevalonato cinasa, difosfomevalonato descarboxilasa, isopentenil difosfato isomerasa (por ejemplo, la ruta de MVA inferior) y otras enzimas apropiadas para la producción de isopreno e isoprenoides.
Tal como se describe en el presente documento, la presente invención proporciona células recombinantes según se reivindican que pueden producir isopreno, en las que las células comprenden uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican para un polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa y (i) uno o más ácidos nucleicos que codifican para uno o más polipéptidos de la ruta de MVA completa (es decir, la ruta de MVA superior y la ruta de MVA inferior) y (ii) un ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido de isopreno sintasa, en las que las células son capaces de producir cantidades recuperables de isopreno. En determinadas realizaciones, la presente invención proporciona células recombinantes según se reivindican capaces de mejorar la producción de isopreno, en las que las células comprenden uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican para un polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa y (i) uno o más ácidos nucleicos que codifican para uno o más polipéptidos de la ruta de MVA completa y (ii) un ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido de isopreno sintasa, en las que las células producen cantidades aumentadas de isopreno en comparación con células productoras de isopreno que no comprenden el uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican para un polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa.
La producción de isopreno también puede realizarse usando cualquiera de las células huésped recombinantes descritas en el presente documento, que comprenden además una o más de las manipulaciones de rutas enzimáticas en las que la actividad enzimática se modula para aumentar el flujo de carbono hacia la producción de mevalonato y la posterior producción de precursores de isoprenoides, isoprenoides y/o isopreno. Las células recombinantes descritas en el presente documento que tienen diversas rutas enzimáticas manipuladas para aumentar el flujo de carbono a través de la ruta de la fosfocetolasa para la producción de acetil-CoA pueden usarse para la producción de mevalonato y la posterior producción de precursores de isoprenoides, isoprenoides y/o isopreno. En una realización, las células recombinantes pueden modificarse por ingeniería genética adicionalmente para aumentar la actividad de uno o más de los siguientes genes seleccionados del grupo que consiste en la ribosa 5-fosfato isomerasa (rpiA y/o rpiB), D-ribulosa-5-fosfato 3-epimerasa (rpe), transcetolasa (tktA y/o tktB), transaldolasa B (tal B), fosfato acetiltransferasa (pta y/o eutD). En otra realización, estas células recombinantes pueden modificarse por ingeniería genética adicionalmente para disminuir la actividad de uno o más genes de los siguientes genes, incluyendo glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (zwf), 6-fosfofructocinasa-1 (pfkA y/o pfkB), fructosa bisfosfato aldolasa (fba, fbaA, fbaB y/o fbaC), gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (gapA y/o gapB), acetato cinasa (ackA), citrato sintasa (gltA), EI (ptsI), EIICBGlc (ptsG), EIIAGlc (crr) y/o HPr (ptsH).
Ácidos nucleicos que codifican para polipéptidos de la ruta de MVA inferior
En algunos aspectos de la divulgación, las células descritas en cualquiera de las composiciones o los métodos descritos en el presente documento comprenden además uno o más ácidos nucleicos que codifican para un(os) polipéptido(s) de la ruta del mevalonato (MVA) inferior. En algunos aspectos, el polipéptido de la ruta de MVA inferior es un polipéptido endógeno. En algunos aspectos, el ácido nucleico endógeno que codifica para un polipéptido de la ruta de MVA inferior está unido operativamente a un promotor constitutivo. En algunos aspectos, el ácido nucleico endógeno que codifica para un polipéptido de la ruta de MVA inferior está unido operativamente a un promotor inducible. En algunos aspectos, el ácido nucleico endógeno que codifica para un polipéptido de la ruta de MVA inferior está unido operativamente a un promotor fuerte. En un aspecto particular, las células se modifican por ingeniería genética para sobreexpresar el polipéptido de la ruta de MVA inferior endógeno en relación con células de tipo natural. En algunos aspectos, el ácido nucleico endógeno que codifica para un polipéptido de la ruta de MVA inferior está unido operativamente a un promotor débil.
La ruta de biosíntesis de mevalonato inferior comprende mevalonato cinasa (MVK), fosfomevalonato cinasa (PMK) y difosfomevalonato descarboxilasa (MVD). En algunos aspectos, la ruta de MVA inferior puede comprender además isopentenil difosfato isomerasa (IDI). Las células proporcionadas en el presente documento pueden comprender al menos un ácido nucleico que codifica para la isopreno sintasa, uno o más polipéptidos de la ruta de MVA superior y/o uno o más polipéptidos de la ruta de MVA inferior. Los polipéptidos de la ruta de MVA inferior pueden ser cualquier enzima (a) que fosforila mevalonato a mevalonato 5-fosfato; (b) que convierte mevalonato 5-fosfato en mevalonato 5-pirofosfato; y (c) que convierte mevalonato 5-pirofosfato en isopentenil pirofosfato. Más particularmente, la enzima que fosforila mevalonato en mevalonato 5-fosfato puede ser del grupo que consiste en mevalonato cinasa de M. Mazei, polipéptido de mevalonato cinasa de Lactobacillus, polipéptido de mevalonato cinasa de Lactobacillus sakei, polipéptido de mevalonato cinasa de levadura, polipéptido de mevalonato cinasa de Saccharomyces cerevisiae, polipéptido de mevalonato cinasa de Streptococcus, polipéptido de mevalonato cinasa de Streptococcus pneumoniae, polipéptido de mevalonato cinasa de Streptomyces, polipéptido de mevalonato cinasa de Streptomyces CL190 y polipéptido de mevalonato cinasa de M. Burtonii. En otro aspecto, la enzima que fosforila mevalonato a mevalonato 5-fosfato es mevalonato cinasa de M. Mazei.
En algunos aspectos, el polipéptido de la ruta de MVA inferior es un polipéptido heterólogo. En algunos aspectos, las células comprenden más de una copia de un ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido de la ruta de MVA inferior. En algunos aspectos, el ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido de la ruta de MVA inferior está unido operativamente a un promotor constitutivo. En algunos aspectos, el ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido de la ruta de MVA inferior está unido operativamente a un promotor inducible. En algunos aspectos, el ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido de la ruta de MVA inferior está unido operativamente a un promotor fuerte. En algunos aspectos, el ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido de la ruta de MVA inferior está unido operativamente a un promotor débil. En algunos aspectos, el polipéptido de la ruta de MVA inferior heterólogo es un polipéptido de Saccharomyces cerevisiae, Enterococcus faecalis o Methanosarcina mazei.
Los ácidos nucleicos que codifican para un(os) polipéptido(s) de la ruta de MVA inferior pueden integrarse en un genoma de las células o pueden expresarse de manera estable en las células. Los ácidos nucleicos que codifican para un(os) polipéptido(s) de la ruta de MVA inferior pueden estar adicionalmente en un vector.
Los polipéptidos de la ruta de MVA inferior a modo de ejemplo también se proporcionan a continuación: (i) mevalonato cinasa (MVK); (ii) fosfomevalonato cinasa (PMK); (iii) difosfomevalonato descarboxilasa (MVD); y (iv) isopentenil difosfato isomerasa (IDI). En particular, el polipéptido de MVK inferior puede ser del género Methanosarcina y, más específicamente, el polipéptido de MVK inferior puede ser de Methanosarcina mazei. En algunas realizaciones, el polipéptido de MVK inferior puede ser de M. burtonii. Se pueden encontrar ejemplos adicionales de polipéptidos de la ruta de MVA inferior en la publicación de solicitud de patente estadounidense 2010/0086978 a cuyo contenido se hace referencia expresamente, en especial con respecto a los polipéptidos de la ruta de MVK inferior y la variante de polipéptido de la ruta de MVK inferior.
Los polipéptidos de la ruta de MVA inferior incluyen polipéptidos, fragmentos de polipéptidos, péptidos y polipéptidos de fusión que tienen al menos una actividad de un polipéptido de la ruta de MVA inferior. Los ejemplos de ácidos nucleicos de la ruta de MVA inferior incluyen ácidos nucleicos que codifican para un polipéptido, fragmento de un polipéptido, péptido o polipéptido de fusión que tiene al menos una actividad de un polipéptido de la ruta de MVA inferior. Los ejemplos de polipéptidos y ácidos nucleicos de la ruta de MVA inferior incluyen polipéptidos y ácidos nucleicos que se producen de manera natural a partir de cualquiera de los organismos fuente descritos en el presente documento. Además, también pueden usarse variantes de polipéptidos de la ruta de MVA inferior que confieren el resultado de una mejor producción de isopreno.
En algunos aspectos, el polipéptido de la ruta de MVA inferior es un polipéptido de Saccharomyces cerevisiae, Enterococcus faecalis, o Methanosarcina mazei. En algunos aspectos, el polipéptido de MVK se selecciona del grupo que consiste en polipéptido de mevalonato cinasa de Lactobacillus, polipéptido de mevalonato cinasa de Lactobacillus sakei, polipéptido de mevalonato cinasa de levadura, polipéptido de mevalonato cinasa de Saccharomyces cerevisiae, polipéptido de mevalonato cinasa de Streptococcus, polipéptido de mevalonato cinasa de Streptococcus pneumoniae, polipéptido de mevalonato cinasa de Streptomyces, polipéptido de mevalonato cinasa de Streptomyces CL190, polipéptido de mevalonato cinasa de Methanosarcina mazei y polipéptido de mevalonato cinasa de M. Burtonii. Puede usarse cualquiera de los promotores descritos en el presente documento (por ejemplo, los promotores descritos en el presente documento e identificados en los ejemplos de la presente divulgación incluyendo promotores inducibles y promotores constitutivos) para dirigir la expresión de cualquiera de los polipéptidos de MVA descritos en el presente documento.
Cualquiera de las células descritas en el presente documento puede comprender uno o más ácidos nucleicos de IDI (por ejemplo, uno o más ácidos nucleicos endógenos o heterólogos que codifican para IDI). Los polipéptidos de isopentenil difosfato isomerasa (isopentenil-difosfato delta-isomerasa o IDI) catalizan la interconversión del isopentenil difosfato (IPP) y dimetilalil difosfato (DMAPP) (por ejemplo, convertir IPP en DMAPP y/o convertir DMAPP en IPP). Los ejemplos de polipéptidos de IDI incluyen polipéptidos, fragmentos de polipéptidos, péptidos y polipéptidos de fusión que tienen al menos una actividad de un polipéptido de IDI. Pueden usarse métodos convencionales (tales como los descritos en el presente documento) para determinar si un polipéptido tiene actividad de polipéptido de IDI midiendo la capacidad del polipéptido para interconvertir IPP y DMAPP in vitro en un extracto celular, o in vivo. Los ácidos nucleicos de IDI a modo de ejemplo incluyen ácidos nucleicos que codifican para un polipéptido, fragmento de un polipéptido, péptido o polipéptido de fusión que tiene al menos una actividad de un polipéptido de IDI. Los polipéptidos y ácidos nucleicos de IDI a modo de ejemplo incluyen polipéptidos y ácidos nucleicos que se producen de manera natural a partir de cualquiera de los organismos fuente descritos en el presente documento, así como polipéptidos y ácidos nucleicos mutantes derivados de cualquiera de los organismos fuente descritos en el presente documento.
Ácidos nucleicos que codifican para polipéptidos de isopreno sintasa
En algunos aspectos de la divulgación, las células descritas en cualquiera de las composiciones o los métodos descritos en el presente documento (incluidas las células huésped que se han modificado por ingeniería genética para aumentar el flujo de carbono a través de la ruta de la fosfocetolasa tal como se describe en el presente documento) comprenden además uno o más ácidos nucleicos que codifican para un polipéptido de isopreno sintasa o un polipéptido que tiene actividad isopreno sintasa. En algunos aspectos, el polipéptido de isopreno sintasa es un polipéptido endógeno. En algunos aspectos, el ácido nucleico endógeno que codifica para un polipéptido de isopreno sintasa está unido operativamente a un promotor constitutivo. En algunos aspectos, el ácido nucleico endógeno que codifica para un polipéptido de isopreno sintasa está unido operativamente a un promotor inducible. En algunos aspectos, el ácido nucleico endógeno que codifica para un polipéptido de isopreno sintasa está unido operativamente a un promotor fuerte. En un aspecto particular, las células se modifican por ingeniería genética para sobreexpresar el polipéptido de la ruta de la isopreno sintasa endógeno en relación con células de tipo natural. En algunos aspectos, el ácido nucleico endógeno que codifica para un polipéptido de isopreno sintasa está unido operativamente a un promotor débil. En algunos aspectos, el polipéptido de isopreno sintasa es un polipéptido de Pueraria o Populus o un híbrido tal como Populus alba x Populus trémula.
En algunos aspectos, el polipéptido de isopreno sintasa es un polipéptido heterólogo. En algunos aspectos, las células comprenden más de una copia de un ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido de isopreno sintasa. En algunos aspectos, el ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido de isopreno sintasa está unido operativamente a un promotor constitutivo. En algunos aspectos, el ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido de isopreno sintasa está unido operativamente a un promotor inducible. En algunos aspectos, el ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido de isopreno sintasa está unido operativamente a un promotor fuerte. En algunos aspectos, el ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido de isopreno sintasa está unido operativamente a un promotor débil.
Los ácidos nucleicos que codifican para un(os) polipéptido(s) de isopreno sintasa pueden integrarse en un genoma de las células huésped o pueden expresarse de manera estable en las células. Los ácidos nucleicos que codifican para un(os) polipéptido(s) de isopreno sintasa pueden estar adicionalmente en un vector.
Los ácidos nucleicos de isopreno sintasa a modo de ejemplo incluyen ácidos nucleicos que codifican para un polipéptido, fragmento de un polipéptido, péptido o polipéptido de fusión que tiene al menos una actividad de un polipéptido de isopreno sintasa. Los polipéptidos de isopreno sintasa convierten dimetilalil difosfato (DMAPP) en isopreno. Los polipéptidos de isopreno sintasa a modo de ejemplo incluyen polipéptidos, fragmentos de polipéptidos, péptidos y polipéptidos de fusión que tienen al menos una actividad de un polipéptido de isopreno sintasa. Los polipéptidos y ácidos nucleicos de isopreno sintasa a modo de ejemplo incluyen polipéptidos y ácidos nucleicos que se producen de manera natural a partir de cualquiera de los organismos fuente descritos en el presente documento. Además, las variantes de isopreno sintasa pueden presentar una actividad mejorada tal como una actividad enzimática mejorada. En algunos aspectos, una variante de isopreno sintasa tiene otras propiedades mejoradas, tales como estabilidad mejorada (por ejemplo, estabilidad térmica) y/o solubilidad mejorada.
Pueden usarse métodos convencionales para determinar si un polipéptido tiene actividad de polipéptido de isopreno sintasa midiendo la capacidad del polipéptido para convertir DMAPP en isopreno in vitro en un extracto celular, o in vivo. La actividad del polipéptido de isopreno sintasa en el extracto celular puede medirse, por ejemplo, tal como se describe en Silver et al., J. Biol. Chem. 270: 13010-13016, 1995. En un ensayo a modo de ejemplo, el DMAPP (Sigma) puede evaporarse hasta sequedad bajo una corriente de nitrógeno y rehidratarse hasta una concentración de 100 mM en tampón fosfato de potasio 100 mM, pH 8,2, y almacenarse a -20°C. Para realizar el ensayo, puede añadirse una disolución de 5 |il de MgCh 1 M, DMAPP 1 mM (250 |ig/ml), 65 |il de tampón de extracto de planta (PEB) (Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, MgCl220 mM, glicerol al 5% y DTT 2 mM) a 25 |il de extracto celular en un vial de espacio de cabeza de 20 ml con tapón de rosca metálico y septo de silicio recubierto de teflón (Agilent Technologies) y cultivarse a 37°C durante 15 minutos con agitación.. La reacción puede extinguirse añadiendo 200 |il de EDTA 250 mM y cuantificando mediante CG/EM.
En algunos aspectos, el polipéptido de isopreno sintasa es un polipéptido de isopreno sintasa de planta o una variante del mismo. En algunos aspectos, el polipéptido de isopreno sintasa es una isopreno sintasa de Pueraria o una variante del mismo. En algunos aspectos, el polipéptido de isopreno sintasa es una isopreno sintasa de Populus o una variante del mismo. En algunos aspectos, el polipéptido de isopreno sintasa es un polipéptido de isopreno sintasa de álamo o una variante del mismo. En algunos aspectos, el polipéptido de isopreno sintasa es un polipéptido de isopreno sintasa de kudzú o una variante del mismo. En algunos aspectos, el polipéptido de isopreno sintasa es un polipéptido de Pueraria o Populus o un híbrido, Populus alba x Populus trémula, o una variante de los mismos.
En algunos aspectos, el polipéptido o ácido nucleico de isopreno sintasa es de la familia Fabaceae, tal como la subfamilia Faboideae. En algunos aspectos, el polipéptido o ácido nucleico de isopreno sintasa es un polipéptido o ácido nucleico de Pueraria montana (kudzú) (Sharkey et al., Plant Physiology 137: 700-712, 2005), Pueraria lobata, álamo (por ejemplo, Populus alba, Populus nigra, Populus trichocarpa o Populus alba x tremula (CAC35696) (Miller et al., Plant 213: 483-487, 2001), álamo temblón (tal como, por ejemplo, Populus tremuloides) (Silver et al., JBC 270 (22): 13010-1316, 1995), roble común (Quercus robur) (Zimmer et al., documento WO 98/02550), o una variante de los mismos. En algunos aspectos, el polipéptido de isopreno sintasa es una isopreno sintasa de Pueraria montana, Pueraria lobata, Populus tremuloides, Populus alba, Populus nigra o Populus trichocarpa o una variante de la misma. En algunos aspectos, el polipéptido de isopreno sintasa es una isopreno sintasa de Populus alba o una variante de la misma. En algunos aspectos, el ácido nucleico que codifica para la isopreno sintasa (por ejemplo, isopreno sintasa de Populus alba o una variante la misma) presenta optimización de codones.
En algunos aspectos, el ácido nucleico o polipéptido de isopreno sintasa es un polipéptido o ácido nucleico que se produce de manera natural (por ejemplo, polipéptido o ácido nucleico que se produce de manera natural de Populus). En algunos aspectos, el ácido nucleico o polipéptido de isopreno sintasa no es un polipéptido o ácido nucleico de tipo natural o que se produce de manera natural. En algunos aspectos, el ácido nucleico o polipéptido de isopreno sintasa es una variante de un polipéptido o ácido nucleico natural que se produce de manera natural (por ejemplo, una variante de un polipéptido o ácido nucleico de tipo natural o que se produce de manera natural de Populus).
En algunos aspectos, el polipéptido de isopreno sintasa es una variante. En algunos aspectos, el polipéptido de isopreno sintasa es una variante de una isopreno sintasa de tipo natural o que se produce de manera natural. En algunos aspectos, la variante tiene una actividad mejorada tal como una actividad catalítica mejorada en comparación con la isopreno sintasa de tipo natural o que se produce de manera natural. El aumento de la actividad (por ejemplo, la actividad catalítica) puede ser de al menos aproximadamente el 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o el 95%. En algunos aspectos, el aumento de la actividad tal como la actividad catalítica, es de al menos aproximadamente 1 vez, 2 veces, 5 veces, 10 veces, 20 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces, 75 veces o 100 veces. En algunos aspectos, el aumento de la actividad tal como la actividad catalítica, es de aproximadamente el 10% a aproximadamente 100 veces (por ejemplo, de aproximadamente el 20% a aproximadamente 100 veces, de aproximadamente el 50% a aproximadamente 50 veces, de aproximadamente 1 vez a aproximadamente 25 veces, de aproximadamente 2 veces a aproximadamente 20 veces o de aproximadamente 5 veces a aproximadamente 20 veces). En algunos aspectos, la variante tiene una solubilidad mejorada en comparación con la isopreno sintasa de tipo natural o que se produce de manera natural. El aumento de la solubilidad puede ser de al menos aproximadamente el 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o el 95%. El aumento de la solubilidad puede ser de al menos aproximadamente cualquiera de 1 vez, 2 veces, 5 veces, 10 veces, 20 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces, 75 veces o 100 veces. En algunos aspectos, el aumento de la solubilidad es de aproximadamente el 10% a aproximadamente 100 veces (por ejemplo, de aproximadamente el 20% a aproximadamente 100 veces, de aproximadamente el 50% a aproximadamente 50 veces, de aproximadamente 1 vez a aproximadamente 25 veces, de aproximadamente 2 veces a aproximadamente 20 veces o de aproximadamente 5 veces a aproximadamente 20 veces). En algunos aspectos, el polipéptido de isopreno sintasa es una variante de la isopreno sintasa que se produce de manera natural y tiene una estabilidad mejorada (tal como estabilidad térmica) en comparación con la isopreno sintetasa que se produce de manera natural.
En algunos aspectos, la variante tiene al menos aproximadamente el 10%, al menos aproximadamente el 20%, al menos aproximadamente el 30%, al menos aproximadamente el 40%, al menos aproximadamente el 50%, al menos aproximadamente el 60%, al menos aproximadamente el 70%, al menos aproximadamente el 80%, al menos aproximadamente el 90%, al menos aproximadamente el 100%, al menos aproximadamente el 110%, al menos aproximadamente el 120%, al menos aproximadamente el 130%, al menos aproximadamente el 140%, al menos aproximadamente el 150%, al menos aproximadamente el 160%, al menos aproximadamente el 170%, al menos aproximadamente el 180%, al menos aproximadamente el 190%, al menos aproximadamente el 200% de la actividad de una isopreno sintasa de tipo natural o que se produce de manera natural. La variante puede compartir similitud de secuencia con una isopreno sintasa de tipo natural o que se produce de manera natural. En algunos aspectos, una variante de una isopreno sintasa de tipo natural o que se produce de manera natural puede tener una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente el 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% o el 99,9% que la isopreno sintasa de tipo natural o que se produce de manera natural. En algunos aspectos, una variante de una isopreno sintasa de tipo natural o que se produce de manera natural tiene una identidad de secuencia de aminoácidos de cualquiera de aproximadamente el 70% a aproximadamente el 99,9%, de aproximadamente el 75% a aproximadamente el 99%, de aproximadamente el 80% a aproximadamente el 98%, de aproximadamente el 85% a aproximadamente el 97%, o de aproximadamente el 90% a aproximadamente el 95% que la de la isopreno sintasa de tipo natural o que se produce de manera natural.
En algunos aspectos, la variante comprende una mutación en la isopreno sintasa de tipo natural o que se produce de manera natural. En algunos aspectos, la variante tiene al menos una sustitución de aminoácidos, al menos una inserción de aminoácidos y/o al menos una deleción de aminoácido. En algunos aspectos, la variante tiene al menos una sustitución de aminoácido. En algunos aspectos, el número de residuos de aminoácidos diferentes entre la variante y la isopreno sintasa de tipo natural o que se produce de manera natural puede ser uno o más, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50 o más residuos de aminoácidos. Las isopreno sintasas que se producen de manera natural pueden incluir cualquier isopreno sintasa de plantas, por ejemplo, isopreno sintasas de kudzú, isopreno sintasas de álamo, isopreno sintasas de roble común e isopreno sintasas de sauce. En algunos aspectos, la variante es una variante de la isopreno sintasa de Populus alba. En algunos aspectos, la variante de isopreno sintasa de Populus alba tiene al menos una sustitución de aminoácidos, al menos una inserción de aminoácidos y/o al menos una deleción de aminoácido. En algunos aspectos, la variante es una isopreno sintasa de Populus alba truncada. En algunos aspectos, la variante que codifica para el ácido nucleico (por ejemplo, variante de isopreno sintasa de Populus alba) presenta optimización de codones (por ejemplo, optimización de codones basándose en células huésped en las que se expresa la isopreno sintasa heteróloga).
El polipéptido de isopreno sintasa proporcionado en el presente documento puede ser cualquiera de las isopreno sintasas o variantes de isopreno sintasa descritas en los documentos WO 2009/132220, Wo 2010/124146 y la publicación de patente estadounidense n.°: 2010/0086978, a cuyo contenido se hace referencia expresamente con respecto a las isopreno sintasas y las variantes de isopreno sintasa.
Puede usarse uno cualquiera de los promotores descritos en el presente documento (por ejemplo, los promotores descritos en el presente documento e identificados en los ejemplos de la presente divulgación incluyendo promotores inducibles y promotores constitutivos) para dirigir la expresión de cualquiera de las isopreno sintasas descritas en el presente documento.
Las isopreno sintasas adecuadas incluyen, pero no se limitan a, las identificadas por los números de registro de Genbank AY341431, AY316691, AY279379, AJ457070 y AY182241. Los tipos de isopreno sintasas que pueden usarse en una cualquiera de las composiciones o los métodos incluyendo métodos de producción de células que codifican para las isopreno sintasas descritas en el presente documento también se describen en las publicaciones de solicitud de patente internacional n.os WO2009/076676, WO2010/003007, WO2009/132220, WO2010/031062, WO2010/031068, WO2010/031076, WO2010/013077, WO2010/031079, WO2010/148150, WO2010/124146, WO2010/078457, WO2010/148256, WO 2012/058494 y la patente estadounidense n.° 8,173,410.
Ruta de biosíntesis del isopreno.
El isopreno puede producirse a partir de dos alcoholes diferentes, 3-metil-2-buten-1-ol y 2-metil-3-buten-2-ol. Por ejemplo, en una ruta de biosíntesis de isopreno de dos etapas, el dimetilalil difosfato se convierte en 2-metil-3-buten-2-ol por una enzima tal como una sintasa (por ejemplo, una 2-metil-3-buten-2-ol sintasa), seguida de la conversión de 2-metil-3-buten-2-ol en isopreno por una 2-metil-3-buten-2-ol deshidratasa. Como otro ejemplo, en una ruta de biosíntesis de isopreno de tres etapas, el dimetilalil difosfato se convierte en 3-metil-2-buten-1-ol ya sea por una fosfatasa o una sintasa (por ejemplo, una geraniol sintasa o farnesol sintasa capaz de convertir el dimetilalil difosfato en 3-metil-2-buten-1-ol, el 3-metil-2-buten-1-ol se convierte en 2-metil-3-buten-2-ol por una 2-metil-3-buten-2-ol isomerasa, y el 2-metil-3-buten-2-ol se convierte en isopreno por una 2-metil-3-buten-2-ol deshidratasa. Véase por ejemplo, la publicación de solicitud de patente estadounidense n.°: US 20130309742 A1 y la publicación de solicitud de patente estadounidense n.°: US 20130309741 A1.
En algunos aspectos de la divulgación, las células descritas en cualquiera de las composiciones o los métodos descritos en el presente documento (incluidas las células huésped que se han modificado tal como se describe en el presente documento) comprenden además uno o más ácidos nucleicos que codifican para un polipéptido de una ruta de biosíntesis de isopreno seleccionado del grupo que consiste en 2-metil-3-buten-2-ol deshidratasa, 2-metil-3-buteno-2-ol isomerasa y 3-metil-2-buten-1-ol sintasa. En algunos aspectos, el polipéptido de una ruta de biosíntesis de isopreno es un polipéptido endógeno. En algunos aspectos, el ácido nucleico endógeno que codifica para un polipéptido de una ruta de biosíntesis de isopreno está unido operativamente a un promotor constitutivo. En algunos aspectos, el ácido nucleico endógeno que codifica para un polipéptido de una ruta de biosíntesis de isopreno está unido operativamente a un promotor inducible. En algunos aspectos, el ácido nucleico endógeno que codifica para un polipéptido de una ruta de biosíntesis de isopreno está unido operativamente a un promotor fuerte. En un aspecto particular, las células se modifican por ingeniería genética para sobreexpresar el polipéptido endógeno de una ruta de biosíntesis de isopreno en relación con las células de tipo natural. En algunos aspectos, el ácido nucleico endógeno que codifica para un polipéptido de una ruta de biosíntesis de isopreno está unido operativamente a un promotor débil.
En algunos aspectos, el polipéptido de una ruta de biosíntesis de isopreno es un polipéptido heterólogo. En algunos aspectos, las células comprenden más de una copia de un ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido de una ruta de biosíntesis de isopreno. En algunos aspectos, el ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido de una ruta de biosíntesis de isopreno está unido operativamente a un promotor constitutivo. En algunos aspectos, el ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido de una ruta de biosíntesis de isopreno está unido operativamente a un promotor inducible. En algunos aspectos, el ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido de una ruta de biosíntesis de isopreno está unido operativamente a un promotor fuerte. En algunos aspectos, el ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido de una ruta de biosíntesis de isopreno está unido operativamente a un promotor débil.
Los ácidos nucleicos que codifican para un(os) polipéptido(s) de una ruta de biosíntesis de isopreno pueden integrarse en un genoma de las células huésped o pueden expresarse de manera estable en las células. Los ácidos nucleicos que codifican para un(os) polipéptido(s) de una ruta de biosíntesis de isopreno pueden estar adicionalmente en un vector.
Los ácidos nucleicos a modo de ejemplo que codifican para un(os) polipéptido(s) de una ruta de biosíntesis de isopreno incluyen ácidos nucleicos que codifican para un polipéptido, fragmento de un polipéptido, péptido o polipéptido de fusión que tiene al menos una actividad de un polipéptido de una ruta de biosíntesis de isopreno, tal como polipéptido de 2-metil-3-buten-2-ol deshidratasa, polipéptido de 2-metil-3-buteno-2-ol isomerasa, y polipéptido de 3-metil-2-buten-1-ol sintasa. El/ los polipéptido(s) a modo de ejemplo de una ruta de biosíntesis de isopreno y ácidos nucleicos que codifican para polipéptido(s) de una ruta de biosíntesis de isopreno incluyen polipéptidos y ácidos nucleicos que se producen de manera natural a partir de cualquiera de los organismos fuente descritos en el presente documento. Además, las variantes de polipéptido(s) de una ruta de biosíntesis de isopreno (por ejemplo, un polipéptido de 2-metil-3-buten-2-ol deshidratasa, polipéptido de 2-metil-3-buteno-2-ol isomerasa y polipéptido de 3-metil-2-buten-1-ol sintasa) pueden presentar actividad mejorada tal como actividad enzimática mejorada.
En algunos aspectos, un polipéptido de una ruta de biosíntesis de isopreno es una fosfatasa. Las fosfatasas a modo de ejemplo incluyen una fosfatasa de Bacillus subtilis o Escherichia coli. En algunas realizaciones, la fosfatasa es un polipéptido de 3-metil-2-buten-1-ol sintasa o una variante del mismo. En algunos aspectos, un polipéptido de una ruta de biosíntesis de isopreno es una terpeno sintasa (por ejemplo, una geraniol sintasa, farnesol sintasa, linalool sintasa o nerolidol sintasa). Las terpeno sintasas a modo de ejemplo incluyen una terpeno sintasa de Ocimum basilicum, Perilla citriodora, Perilla frutescans, Cinnamomom tenuipile, Zea mays u Oryza sativa. Las terpeno sintasas a modo de ejemplo adicionales incluyen una terpeno sintasa de Clarkia breweri, Arabidopsis thaliana, Perilla setoyensis, Perilla frutescens, Actinidia arguta, Actinidia polygama, Artemesia annua, Ocimum basilicum, Mentha aquatica, Solanum lycopersicum, Medicago trunculata, Populus trichocarpa, Fragaria vesca o Fragraria ananassa. En algunas realizaciones, la terpeno sintasa es un polipéptido de 3-metil-2-buten-1-ol sintasa o una variante del mismo. Por ejemplo, una terpeno sintetasa descrita en el presente documento puede catalizar la conversión de dimetilalil difosfato en 3-metil-2-buten-1-ol (por ejemplo, una 3-metil-2-buten-1-ol sintasa). En algunos aspectos, una terpeno sintasa descrita en el presente documento puede catalizar la conversión de dimetilalil difosfato en 2-metil-3-buten-2-ol (por ejemplo, una 2-metil-3-buten-2-ol sintasa). En algunos aspectos, un polipéptido de una ruta de biosíntesis de isopreno es un polipéptido de 2-metil-3-buten-2-ol deshidratasa (por ejemplo, un polipéptido de 2-metil-3-buten-2-ol deshidratasa de Aquincola tertiaricarbonis) o variante de los mismos. En algunos aspectos, el polipéptido de 2-metil-3-buten-2-ol deshidratasa es un polipéptido de linalool deshidratasa-isomerasa (por ejemplo, un polipéptido de linalool deshidratasa-isomerasa de Castellaniella defragrans, número de registro de Genbank FR669447) o variante del mismo. En algunos aspectos, un polipéptido de una ruta de biosíntesis de isopreno es un polipéptido de isomerasa 2-metil-3-buten-2-ol o una variante del mismo. En algunos aspectos, el polipéptido de isomerasa 2-metil-3-buteno-2-ol es un polipéptido de linalool deshidratasa-isomerasa (por ejemplo, un polipéptido de linalool deshidratasa-isomerasa de Castellaniella defragrans, número de registro de Genbank FR669447) o variante del mismo.
Pueden usarse métodos convencionales para determinar si un polipéptido tiene la actividad enzimática de la ruta de biosíntesis del isopreno deseada (por ejemplo, una actividad 2-metil-3-buten-2-ol deshidratasa, actividad 2-metil-3-buten-2-ol isomerasa, y actividad 3-metil-2-buten-1-ol) midiendo la capacidad del polipéptido para convertir DMAPP en isopreno in vitro, en un extracto celular, o in vivo. Véase, por ejemplo, la publicación de solicitud de patente estadounidense n.°: US 20130309742 A1 y la publicación de solicitud de patente estadounidense n.°: US 20130309741 A1.
En algunos aspectos, el/los polipéptido(s) de una ruta de biosíntesis de isopreno (por ejemplo, un polipéptido de 2-metil-3-buten-2-ol deshidratasa, polipéptido de 2-metil-3-buteno-2-ol isomerasa y polipéptido de 3-metil-2-buten-1-ol sintasa) es una variante. En algunos aspectos, el/los polipéptido(s) de una ruta de biosíntesis de isopreno (por ejemplo, un polipéptido de 2-metil-3-buten-2-ol deshidratasa, polipéptido de 2-metil-3-buteno-2-ol isomerasa y polipéptido de 3-metil-2-buten-1-ol sintasa) es una variante de un(os) polipéptido(s) de tipo natural o que se produce(n) de manera natural de una ruta de biosíntesis de isopreno. En algunos aspectos, la variante tiene una actividad mejorada, tal como una actividad catalítica mejorada en comparación con el/los polipéptido(s) que se produce(n) de manera natural o de tipo natural de una ruta de biosíntesis de isopreno. El aumento de la actividad (por ejemplo, la actividad catalítica) puede ser de al menos aproximadamente el 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o el 95%. En algunos aspectos, el aumento de la actividad tal como la actividad catalítica, es de al menos aproximadamente 1 vez, 2 veces, 5 veces, 10 veces, 20 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces, 75 veces o 100 veces. En algunos aspectos, el aumento de la actividad tal como la actividad catalítica, es de aproximadamente el 10% a aproximadamente 100 veces (por ejemplo, de aproximadamente el 20% a aproximadamente 100 veces, de aproximadamente el 50% a aproximadamente 50 veces, de aproximadamente 1 vez a aproximadamente 25 veces, de aproximadamente 2 veces a aproximadamente 20 veces o de aproximadamente 5 veces a aproximadamente 20 veces). En algunos aspectos, la variante tiene una solubilidad mejorada en comparación con el/los polipéptidos de tipo natural o que se produce(n) de manera natural de una ruta de biosíntesis de isopreno. El aumento de la solubilidad puede ser de al menos aproximadamente el 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o el 95%. El aumento de la solubilidad puede ser de al menos aproximadamente cualquiera de 1 vez, 2 veces, 5 veces, 10 veces, 20 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces, 75 veces o 100 veces. En algunos aspectos, el aumento de la solubilidad es de aproximadamente el 10% a aproximadamente 100 veces (por ejemplo, de aproximadamente el 20% a aproximadamente 100 veces, de aproximadamente el 50% a aproximadamente 50 veces, de aproximadamente 1 vez a aproximadamente 25 veces, de aproximadamente 2 veces a aproximadamente 20 veces o de aproximadamente 5 veces a aproximadamente 20 veces). En algunos aspectos, el/los polipéptido(s) de una ruta de biosíntesis de isopreno es una variante del/los polipéptido(s) que se produce(n) de manera natural de una ruta de biosíntesis de isopreno y tiene una estabilidad mejorada (tal como termoestabilidad) en comparación con el/los polipéptido(s) que se produce(n) de manera natural de una ruta de biosíntesis de isopreno.
En algunos aspectos, la variante tiene al menos aproximadamente el 10%, al menos aproximadamente el 20%, al menos aproximadamente el 30%, al menos aproximadamente el 40%, al menos aproximadamente el 50%, al menos aproximadamente el 60%, al menos aproximadamente el 70%, al menos aproximadamente el 80%, al menos aproximadamente el 90%, al menos aproximadamente el 100%, al menos aproximadamente el 110%, al menos aproximadamente el 120%, al menos aproximadamente el 130%, al menos aproximadamente el 140%, al menos aproximadamente el 150%, al menos aproximadamente el 160%, al menos aproximadamente el 170%, al menos aproximadamente el 180%, al menos aproximadamente el 190%, al menos aproximadamente el 200% de la actividad de un(os) polipéptido(s) de tipo natural o que se produce(n) de manera natural de una ruta de biosíntesis de isopreno (por ejemplo, un polipéptido de 2-metil-3-buten-2-ol deshidratasa, polipéptido de 2-metil-3-buteno-2-ol isomerasa y polipéptido de 3-metil-2-buten-1-ol sintasa). La variante puede compartir la similitud de secuencia con un(os) polipéptido(s) de tipo natural o que se produce(n) de manera natural de una ruta de biosíntesis de isopreno. En algunos aspectos, una variante de un(os) polipéptido(s) de tipo natural o que se produce(n) de manera natural de una ruta de biosíntesis de isopreno puede tener una identidad de secuencia de al menos aproximadamente cualquiera del 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% o el 99,9% de aminoácidos como la del/los polipéptido(s) de tipo natural o que se produce(n) de manera natural de una ruta de biosíntesis de isopreno (por ejemplo, un polipéptido de 2-metil-3-buten-2-ol deshidratasa, polipéptido de 2-metil-3-buteno-2-ol isomerasa y polipéptido de 3-metil-2-buten-1-sintasa). En algunos aspectos, una variante de un(os) polipéptido(s) de tipo natural o que se produce(n) de manera natural de una ruta de biosíntesis de isopreno tiene una identidad de secuencia de aminoácidos de cualquiera de aproximadamente el 70% a aproximadamente el 99,9%, de aproximadamente el 75% a aproximadamente el 99%, de aproximadamente el 80% a aproximadamente el 98%, de aproximadamente el 85% a aproximadamente el 97% o de aproximadamente el 90% a aproximadamente el 95% como la del/los polipéptido(s) de tipo natural o que se produce(n) de manera natural de una ruta de biosíntesis de isopreno (por ejemplo, un polipéptido de 2-metil-3-buten-2-ol deshidratasa, polipéptido de 2-metil-3-buteno-2-ol isomerasa y polipéptido de 3-metil-2-buten-1-ol sintasa).
En algunos aspectos, la variante comprende una mutación en el/los polipéptido(s) de tipo natural o que se produce(n) de manera natural de una ruta de biosíntesis de isopreno (por ejemplo, un polipéptido de 2-metil-3-buten-2-ol deshidratasa, polipéptido de 2-metil-3-buteno-2-ol isomerasa y polipéptido de 3-metil-2-buten-1-ol sintasa). En algunos aspectos, la variante tiene al menos una sustitución de aminoácido, al menos una inserción de aminoácido y/o al menos una deleción de aminoácido. En algunos aspectos, la variante tiene al menos una sustitución de aminoácido. En algunos aspectos, el número de residuos de aminoácidos diferentes entre la variante y el/los polipéptido(s) de tipo natural o que se produce(n) de manera natural de una ruta de biosíntesis de isopreno puede ser uno o más, por ejemplo 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, o más residuos de aminoácidos. En algunos aspectos, el ácido nucleico que codifica para la variante (por ejemplo, un polipéptido de 2-metil-3-buten-2-ol deshidratasa, polipéptido de 2-metil-3-buteno-2-ol isomerasa, y polipéptido de 3-metil-2-buten-1-ol sintasa) es un codón optimizado (por ejemplo, codón optimizado basado en células huésped donde se expresa(n) el/los polipéptido(s) heterólogo(s) de una ruta de biosíntesis de isopreno).
Cualquiera de los promotores descritos en el presente documento (por ejemplo, los promotores descritos en el presente documento e identificados en los ejemplos de la presente divulgación que incluyen promotores inducibles y promotores constitutivos) puede usarse para dirigir la expresión de cualquiera de los polipéptidos de una ruta de biosíntesis de isopreno descrita en el presente documento.
Ácidos nucleicos que codifican para los polipéptidos de la ruta de DXP
En algunos aspectos de la divulgación, las células descritas en cualquiera de las composiciones o los métodos descritos en el presente documento (incluyendo células huésped que se han modificado por ingeniería genética para aumentar el flujo de carbono a través de la ruta de la fosfocetolasa tal como se describe en el presente documento) comprenden además uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican para un polipéptido de DXS u otros polipéptidos de la ruta de DXP. En algunos aspectos, las células comprenden además una copia cromosómica de un ácido nucleico endógeno que codifica para un polipéptido de DXS u otros polipéptidos de la ruta de DXP. En algunos aspectos, las células de E. coli comprenden además uno o más ácidos nucleicos que codifican para un polipéptido de IDI y un polipéptido de DXS u otros polipéptidos de la ruta de DXP. En algunos aspectos, un ácido nucleico codifica para el polipéptido de isopreno sintasa, el polipéptido de IDI y el polipéptido de dXs u otros polipéptidos de la ruta de DXP. En algunos aspectos, un plásmido codifica para el polipéptido de isopreno sintasa, el polipéptido de IDI y el polipéptido de DXS u otros polipéptidos de la ruta de DXP. En algunos aspectos, los plásmidos múltiples codifican para el polipéptido de isopreno sintasa, el polipéptido de IDI y el polipéptido de DXS u otros polipéptidos de la ruta de DXP.
Los ejemplos de polipéptidos de DXS incluyen polipéptidos, fragmentos de polipéptidos, péptidos y polipéptidos de fusión que tienen al menos una actividad de un polipéptido de DXS. Pueden usarse métodos convencionales (tales como los que se describen en el presente documento) para determinar si un polipéptido tiene actividad del polipéptido de DXS midiendo la capacidad del polipéptido para convertir el piruvato y el D-gliceraldehído 3-fosfato en 1-desoxi-D-xilulosa-5-fosfato in vitro en un extracto celular, o in vivo. Ejemplos de polipéptidos y ácidos nucleicos de DXS y métodos para medir la actividad de DXS se describen con más detalle en las publicaciones internacionales n.os Wo 2009/076676, WO 2010/003007, WO 2009/132220 y las publicaciones de patente estadounidense n.os US 2009/0203102, 2010/0003716 y 2010/0048964.
Los polipéptidos de las rutas de DXP a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, cualquiera de los siguientes polipéptidos: polipéptidos de DXS, polipéptidos de DXR, polipéptidos de MCT, polipéptidos de CMK, polipéptidos de MCS, polipéptidos de HDS, polipéptidos de HDR y polipéptidos (por ejemplo, polipéptidos de fusión) que tienen una actividad de uno, dos o más de los polipéptidos de la ruta de DXP. En particular, los polipéptidos de la ruta de DXP incluyen polipéptidos, fragmentos de polipéptidos, péptidos y polipéptidos de fusión que tienen al menos una actividad de un polipéptido de la ruta de DXP. Los ácidos nucleicos de la ruta de DXP a modo de ejemplo incluyen ácidos nucleicos que codifican para un polipéptido, fragmento de un polipéptido, péptido o polipéptido de fusión que tiene al menos una actividad de un polipéptido de la ruta de DXP. Los polipéptidos y ácidos nucleicos de la ruta de DXP a modo de ejemplo incluyen polipéptidos y ácidos nucleicos que se producen de manera natural a partir de cualquiera de los organismos fuente descritos en el presente documento, así como polipéptidos y ácidos nucleicos mutantes derivados de cualquiera de los organismos fuente descritos en el presente documento. Se describen polipéptidos y ácidos nucleicos de la ruta de DXP y métodos para medir la actividad del polipéptido de la ruta de DXP a modo de ejemplo con más detalle en la publicación internacional n.° WO 2010/148150.
Los polipéptidos de DXS a modo de ejemplo incluyen polipéptidos, fragmentos de polipéptidos, péptidos y polipéptidos de fusión que tienen al menos una actividad de un polipéptido de DXS. Pueden usarse métodos convencionales (tales como los que se describen en el presente documento) para determinar si un polipéptido tiene actividad del polipéptido de dXs midiendo la capacidad del polipéptido para convertir el piruvato y el D-gliceraldehído 3-fosfato en 1-desoxi-D-xilulosa-5-fosfato in vitro en un extracto celular, o in vivo. Se describen polipéptidos y ácidos nucleicos de DXS y métodos para medir la actividad de DXS a modo de ejemplo con más detalle en la publicación internacional n.° W o 2009/076676, WO 2010/003007, WO 2009/132220 y las publicaciones de patente estadounidense n.os US 2009/0203102, 2010/0003716 y 2010/0048964.
En particular, los polipéptidos de DXS convierten piruvato y D-gliceraldehído 3-fosfato en 1-desoxi-D-xilulosa-5-fosfato (DXP). Pueden usarse métodos convencionales para determinar si un polipéptido tiene actividad de polipéptido de DXS midiendo la capacidad del polipéptido para convertir piruvato y D-gliceraldehído 3-fosfato in vitro en un extracto celular, o in vivo.
Los polipéptidos de DXR convierten 1-desoxi-D-xilulosa 5-fosfato (DXP) en 2-C-metil-D-eritritol 4-fosfato (MEP). Pueden usarse métodos convencionales para determinar si un polipéptido tiene actividad de polipéptidos de DXR midiendo la capacidad del polipéptido para convertir DXP in vitro en un extracto celular, o in vivo.
Los polipéptidos de MCT convierten el 4-C-metil-D-eritritol 4-fosfato (MEP) en 4-(citidina 5'-difosfo)-2-metil-D-eritritol (CDP-ME). Pueden usarse métodos convencionales para determinar si un polipéptido tiene actividad de polipéptidos de MCT midiendo la capacidad del polipéptido para convertir MEP in vitro en un extracto celular, o in vivo.
Los polipéptidos de CMK convierten 4-(citidina 5'-difosfo)-2-C-metil-D-eritritol (CDP-ME) en 2-fosfo-4-(citidina 5'-difosfo)-2-C-metil-D-eritritol (CDP-MEP). Pueden usarse métodos convencionales para determinar si un polipéptido tiene actividad de polipéptidos de CMK midiendo la capacidad del polipéptido para convertir CDP-ME in vitro en un extracto celular, o in vivo.
Los polipéptidos de MCS convierten 2-fosfo-4-(citidina 5'-difosfo)-2-C-metil-D-eritritol (CDP-MEP) en 2-C-metil-D-eritritol 2,4-ciclodifosfato (ME-CPP o cMEPP). Pueden usarse métodos convencionales para determinar si un polipéptido tiene actividad de polipéptidos de MCS midiendo la capacidad del polipéptido para convertir CDP-MEP in vitro en un extracto celular, o in vivo.
Los polipéptidos de HDS convierten el 2-C-metil-D-eritritol 2,4-ciclodifosfato en difosfato de (E)-4-hidroxi-3-metilbut-2-en-1-ilo (HMBPP o HDMAPP). Pueden usarse métodos convencionales para determinar si un polipéptido tiene actividad de polipéptidos de HDS midiendo la capacidad del polipéptido para convertir ME-CPP in vitro en un extracto celular, o in vivo.
Los polipéptidos de HDR convierten el difosfato de (E)-4-hidroxi-3-metilbut-2-en-1-ilo en isopentenil difosfato (IPP) y dimetilalil difosfato (DMAPP). Pueden usarse métodos convencionales para determinar si un polipéptido tiene actividad de polipéptidos de HDR midiendo la capacidad del polipéptido para convertir HMBPP in vitro en un extracto celular, o in vivo.
Organismos fuente para la ruta de MVA inferior, isopreno sintasa, IDI y polipéptidos de la ruta de DXP
Pueden obtenerse ácidos nucleicos de la ruta de la isopreno sintasa, IDI, DXP y/o de la ruta de MVA inferior (y sus polipéptidos codificados) de cualquier organismo que contiene de manera natural ácidos nucleicos de la ruta de la isopreno sintasa, IDI, DXP y/o de la ruta de MVA inferior. El isopreno se forma de manera natural por una variedad de organismos, tales como bacterias, levaduras, plantas y animales. Algunos organismos contienen la ruta de MVA para producir isopreno. Pueden obtenerse ácidos nucleicos de isopreno sintasa, por ejemplo, de cualquier organismo que contenga una isopreno sintasa. Pueden obtenerse ácidos nucleicos de la ruta de MVA, por ejemplo, de cualquier organismo que contenga la ruta de MVA. Pueden obtenerse ácidos nucleicos de las rutas de IDI y DXP, por ejemplo, de cualquier organismo que contenga las rutas de IDI y DXP.
La secuencia de ácido nucleico de los ácidos nucleicos de la ruta de la isopreno sintasa, DXP, IDI y/o MVA puede aislarse de una bacteria, hongo, planta, alga o cianobacteria. Los organismos fuente a modo de ejemplo incluyen, por ejemplo, levaduras, tales como especies de Saccharomyces (por ejemplo, S. cerevisiae), bacterias, tales como especies de Escherichia (por ejemplo, E. coli), o especies de Methanosarcina (por ejemplo, Methanosarcina mazei), plantas, tales como kudzú o álamo (por ejemplo, Populus alba o Populus alba x tremula CAC35696) o álamo temblón (por ejemplo, Populus tremuloides). Las fuentes a modo de ejemplo para los polipéptidos de la ruta de las isopreno sintasas, IDI y/o MVA que pueden usarse también se describen en las publicaciones de solicitud de patente internacional n.os WO2009/076676, WO2010/003007, WO2009/132220, WO2010/031062, WO2010/031068, WO2010/031076, WO2010/013077, WO2010/031079, WO2010/148150, WO2010/078457 y WO2010/148256.
En algunos aspectos, el organismo fuente es una levadura, tal como Saccharomyces sp., Schizosaccharomyces sp., Pichia sp., o Candida sp.
En algunos aspectos, el organismo fuente es una bacteria, tal como las cepas de Bacillus tales como B. lichenformis o B. subtilis, cepas de Pantoea tales como P. citrea, cepas de Pseudomonas tales como P. alcaligenes, cepas de Streptomyces tales como S. lividans o S. rubiginosus, cepas de Escherichia tales como E. coli, cepas de Enterobacter, cepas de Streptococcus, o cepas de Archaea tales como Methanosarcina mazei.
Tal como se usa en el presente documento, “el género Bacillus” incluye todas las especies dentro del género “Bacillus”, tal como conocen los expertos en la técnica, incluyendo pero sin limitarse a B. subtilis, B. licheniformis, B. lentus, B. brevis, B. stearothermophilus, B. alkalophilus, B. amyloliquefaciens, B. clausii, B. halodurans, B. megaterium, B. coagulans, B. circulans, B. lautus, y B. thuringiensis. Se reconoce que el género Bacillus sigue sometiéndose a la reorganización taxonómica. Por tanto, se pretende que el género incluya especies que hayan sido reclasificadas, incluyendo, pero sin limitarse a, organismos tales como B. stearothermophilus, que ahora se denomina “Geobacillus stearothermophilus”. La producción de endosporas resistentes en presencia de oxígeno se considera la característica definitoria del género Bacillus, aunque esta característica también se aplica a los recién denominados Alicyclobacillus, Amphibacillus, Aneurinibacillus, Anoxybacillus, Brevibacillus, Filobacillus, Gracilibacillus, Halobacillus, Paenibacillus, Salibacillus, Thermobacillus, Ureibacillus y Virgibacillus.
En algunos aspectos, el organismo fuente es una bacteria gram-positiva. Los ejemplos no limitativos incluyen cepas de Streptomyces (por ejemplo, S. lividans, S. coelicolor o S. griseo) y Bacillus. En algunos aspectos, el organismo fuente es una bacteria gram-negativa, tal como E. coli o Pseudomonas sp.
En algunos aspectos, el organismo fuente es una planta, como una planta de la familia Fabaceae, tal como la subfamilia Faboideae. En algunos aspectos, el organismo fuente es kudzú, álamo (tal como Populus alba x tremula CAC35696), álamo temblón (tal como, por ejemplo, Populus tremuloides), o Quercus robur.
En algunos aspectos, el organismo fuente es un alga, tal como un alga verde, un alga roja, glaucofitas, cloraracniofitas, euglenoideos, cromista o dinoflagelados.
En algunos aspectos, el organismo fuente es una cianobacteria, tal como las cianobacterias clasificadas en cualquiera de los siguientes grupos según la morfología: Chroococcales, Pleurocapsales, Oscillatoriales, Nostocales o Stigonematales.
Células recombinantes capaces de aumentar la producción de isopreno.
Las células recombinantes descritas en el presente documento (incluyendo células huésped que se han modificado por ingeniería genética para aumentar el flujo de carbono a través de la ruta de la fosfocetolasa tal como se describe en el presente documento) tienen la capacidad de producir una concentración de isopreno mayor que la de las mismas células que carecen de una o más copias de un polipéptido de fosfocetolasa de ácido nucleico heterólogo, una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido de la ruta de MVA, y uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican para un polipéptido de isopreno sintasa cuando se cultivan en las mismas condiciones. Las células pueden comprender además uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican para un polipéptido de IDI. En determinadas realizaciones, el polipéptido de fosfocetolasa es de Burkholderia phytofirmans, Lactobacillus buchneri, Bifidobacterium gallicum, Bifidobacterium dentium, Bifidobacterium bifidum y/o Clostridium acetobutylicum. En otras realizaciones, el polipéptido de fosfocetolasa es de Mycobacterium gilvum, Shewanella baltica, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus crispatus, Bifidobacterium longum, Leuconostoc citreum, Bradyrhizobium sp., Enterococcus faecium, Brucella microti, Lactobacillus salivarius, Streptococcus agalactiae, Rhodococcus imtechensis, Burkholderia xenovorans, Mycobacterium intracelullare, Nitrosomonas sp., Schizosaccharomyces pombe, Leuconostoc mesenteroides, Streptomyces sp., Lactobacillus buchneri, Streptomyces ghanaensis, Cyanothece sp. y/o Neosartorya fischeri. En otras realizaciones, el polipéptido de fosfocetolasa es de Enterococcus faecium, Listeria grayi, Enterococcus gallinarum, Enterococcus saccharolyticus, Enterococcus casseliflavus, Mycoplasma alligatoris, Carnobacterium sp., Melissococcus plutonius, Tetragenococcus halophilus y/o Mycoplasma arthritidis. En otras realizaciones, el polipéptido de fosfocetolasa es de Streptococcus agalactiae, Mycoplasma agalactiae, Streptococcus gordonii, Kingella oralis, Mycoplasma fermentans, Granulicatella adiacens, Mycoplasma hominis, Mycoplasma crocodyli, Mycobacterium bovis, Neisseria sp., Streptococcus sp., Eremococcus coleocola, Granulicatella elegans, Streptococcus parasanguinis, Aerococcus urinae, Kingella kingae, Streptococcus australis, Streptococcus criceti y/o Mycoplasma columbinum. En algunas realizaciones, la célula recombinante es una Corynebacteria spp. (por ejemplo, C. glutamicum).
En una realización, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica para una fosfocetolasa aislada de Burkholderia phytofirmans. En otra realización, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica para una fosfocetolasa aislada de Lactobacillus buchneri. En todavía otra realización, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica para una fosfocetolasa aislada de Bifidobacterium gallicum. En todavía otra realización, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica para una fosfocetolasa aislada de Bifidobacterium dentium. En otra realización, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica para una fosfocetolasa aislada de Bifidobacterium bifidum. En todavía otra realización, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica para una fosfocetolasa aislada de Clostridium acetobutylicum. En otras realizaciones, las células recombinantes descritas en el presente documento comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica para una fosfocetolasa aislada de Mycobacterium gilvum, Shewanella baltica, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus crispatus, Bifidobacterium longum, Leuconostoc citreum, Bradyrhizobium sp., Enterococcus faecium, Brucella microti, Lactobacillus salivarius, Streptococcus agalactiae, Rhodococcus imtechensis, Burkholderia xenovorans, Mycobacterium intracellulare, Nitrosomonas sp., Schizosaccharomyces pombe, Leuconostoc mesenteroides, Streptomyces sp., Lactobacillus buchneri, Streptomyces ghanaensis, Cyanothece sp., y/o Neosartorya fischeri. En todavía otras realizaciones, las células recombinantes descritas en el presente documento comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica para una fosfocetolasa aislada de Enterococcus faecium, Listeria grayi, Enterococcus gallinarum, Enterococcus saccharolyticus, Enterococcus casseliflavus, Mycoplasma alligatoris, Carnobacterium sp., Melissococcus plutonius, Tetragenococcus halophilus y/o Mycoplasma arthritidis. En una realización, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica para una fosfocetolasa aislada de Streptococcus agalactiae, Mycoplasma agalactiae, Streptococcus gordonii, Kingella oralis, Mycoplasma fermentans, Granulicatella adiacens, Mycoplasma hominis, Mycoplasma crocodyli, Mycobacterium bovis, Neisseria sp., Streptococcus sp., Eremococcus coleocola, Granulicatella elegans, Streptococcus parasanguinis, Aerococcus urinae, Kingella kingae, Streptococcus australis, Streptococcus criceti y/o Mycoplasma columbinum.
En algunos aspectos, la una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica para fosfocetolasa, una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido de la ruta de MVA, y uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican para un polipéptido de isopreno sintasa son ácidos nucleicos heterólogos que se integran en la secuencia de nucleótidos cromosómicos de la célula huésped. En otros aspectos, el uno o más ácidos nucleicos heterólogos se integran en el plásmido. En aún otros aspectos, al menos uno de los uno o más ácidos nucleicos heterólogos se integra en la secuencia de nucleótidos cromosómica de la célula, mientras que al menos una de las una o más secuencias de ácido nucleico heterólogas se integra en un plásmido. Las células recombinantes pueden producir al menos un 5% de cantidades mayores de isopreno en comparación con células productoras de isopreno que no comprenden el polipéptido de fosfocetolasa. Alternativamente, las células recombinantes pueden producir más de aproximadamente el 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14% o el 15% de isopreno, inclusive, así como cualquier valor numérico entre estos números.
En un aspecto de la invención, se proporcionan en el presente documento células recombinantes según se reivindican que comprenden uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican para un polipéptido de fosfocetolasa tal como se describe en el presente documento, uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican para un(os) polipéptido(s) de la ruta de mevalonato (MVA), uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican para un(os) polipéptido(s) de la ruta de DXP, y uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican para un polipéptido de isopreno sintasa. Las células pueden comprender además uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican para un polipéptido de IDI. Cualquiera de los uno o más ácidos nucleicos heterólogos puede unirse operativamente a promotores constitutivos, puede unirse operativamente a promotores inducibles, o puede unirse operativamente a una combinación de promotores inducibles y constitutivos. El uno o más ácidos nucleicos heterólogos pueden unirse adicionalmente a promotores fuertes, promotores débiles y/o promotores de medios. Uno o más de los ácidos nucleicos heterólogos que codifican para fosfocetolasa, un(os) polipéptido(s) de la ruta mevalonato (MVA), un(os) polipéptido(s) de la ruta de DXP y un polipéptido de isopreno sintasa pueden integrarse en un genoma de las células huésped o pueden expresarse de manera estable en las células El uno o más ácidos nucleicos heterólogos pueden estar adicionalmente en un vector.
La producción de isopreno por las células según cualquiera de las composiciones o los métodos descritos en el presente documento puede mejorarse (por ejemplo, mejorarse mediante la expresión de uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican para un polipéptido de fosfocetolasa, un polipéptido de isopreno sintasa, polipéptido(s) de la ruta de MVA y/o un(os) polipéptido(s) de la ruta de DXP). Tal como se usa en el presente documento, la producción de isopreno “mejorada” se refiere a un índice de productividad celular aumentada (CPI) para el isopreno, un título aumentado de isopreno, un rendimiento másico aumentado de isopreno y/o una productividad específica aumentada de isopreno por las células descritas por cualquiera de las composiciones y métodos descritos en el presente documento en comparación con células que no tienen uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican para un péptido de fosfocetolasa. En determinadas realizaciones descritas en el presente documento, las células huésped se han modificado por ingeniería genética adicionalmente para aumentar el flujo de carbono a través de la ruta de la fosfocetolasa para la producción de E4P, GAP, Ac-P y/o acetil-CoA.
La producción de isopreno por las células recombinantes descritas en el presente documento puede mejorarse en aproximadamente un 5% a aproximadamente 1.000.000 de veces. En determinados aspectos, la producción de isopreno puede mejorarse en aproximadamente un 10% a aproximadamente 1.000.000 de veces (por ejemplo, de aproximadamente 1 a aproximadamente 500.000 veces, de aproximadamente 1 a aproximadamente 50.000 veces, de aproximadamente 1 a aproximadamente 5.000 veces, de aproximadamente 1 a aproximadamente 1.000 veces, de aproximadamente 1 a aproximadamente 500 veces, de aproximadamente 1 a aproximadamente 100 veces, de aproximadamente 1 a aproximadamente 50 veces, de aproximadamente 5 a aproximadamente 100.000 veces, de aproximadamente 5 a aproximadamente 10.000 veces, de aproximadamente 5 a aproximadamente 1.000 veces, de aproximadamente 5 a aproximadamente 500 veces, de aproximadamente 5 a aproximadamente 100 veces, de aproximadamente 10 a aproximadamente 50.000 veces, de aproximadamente 50 a aproximadamente 10.000 veces, de aproximadamente 100 a aproximadamente 5.000 veces, de aproximadamente 200 a aproximadamente 1.000 veces, de aproximadamente 50 a aproximadamente 500 veces o de aproximadamente 50 a aproximadamente 200 veces) en comparación con la producción de isopreno por las células que no expresan uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican para el péptido de fosfocetolasa. En determinadas realizaciones descritas en el presente documento, las células huésped se han modificado por ingeniería genética adicionalmente para aumentar el flujo de carbono a través de la ruta de la fosfocetolasa a la producción de MVA, proporcionando así una producción mejorada de isopreno en comparación con la producción de isopreno por las células que no expresan uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican para péptido de fosfocetolasa y que no se han modificado por ingeniería genética para aumentar el flujo de carbono a través de la ruta de la fosfocetolasa a la producción de mevalonato.
En otros aspectos, la producción de isopreno por las células recombinantes descritas en el presente documento también puede mejorarse al menos aproximadamente cualquiera del 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, el 90%, 1 vez, 2 veces, 5 veces, 10 veces, 20 veces, 50 veces, 100 veces, 200 veces, 500 veces, 1000 veces, 2000 veces, 5000 veces, 10.000 veces, 20.000 veces, 50.000 veces, 100.000 veces, 200.000 veces, 500.000 veces, o 1.000.000 veces en comparación con la producción de isopreno por células que no expresan uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican para el péptido de fosfocetolasa. En determinadas realizaciones descritas en el presente documento, las células huésped se han modificado por ingeniería genética adicionalmente para aumentar el flujo de carbono a través de la ruta de la fosfocetolasa a la producción de MVA, proporcionando así una producción mejorada de isopreno en comparación con la producción de isopreno por las células que no expresan uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican para fosfocetolasa péptido y que no se han modificado por ingeniería genética para aumentar el flujo de carbono a través de la ruta de la fosfocetolasa a la producción de mevalonato.
También se proporcionan en el presente documento células recombinantes productoras de isopreno capaces de aumentar el flujo de carbono a través de la ruta de la fosfocetolasa, en las que las células recombinantes comprenden: (i) una secuencia de ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa, en las que el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 65% con SEQ ID NO: 8, (ii) uno o más ácidos nucleicos que codifican para uno o más polipéptidos de la ruta de MVA completa, y (iii) uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican para un polipéptido de isopreno sintasa, en las que dicha célula recombinante que comprende dicho polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa de (i) tiene un valor de índice de rendimiento mayor de 1,0 en uno o más de los siguientes parámetros: (a) crecimiento celular en glucosa, (b) crecimiento celular en xilosa, (c) producción de acetil-fosfato intracelular o (d) crecimiento celular en glucosa-6-fosfato. En otras realizaciones, los parámetros de valor de índice de rendimiento incluyen además (e) solubilidad de proteínas de rendimiento de isopreno o (f) productividad específica de isopreno. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 23. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 24. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 25. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 26. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 27. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 28. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 29. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 30. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 31. En otras realizaciones, dicho valor de índice de rendimiento para cualquiera de dichos parámetros es cualquiera de tal como mayor de 1,1, tal como mayor de 1,2, mayor de 1,4, mayor de 1,6, mayor de 1,8, mayor de 2, mayor de 2,2, mayor de 2,4, mayor de 2,6, mayor de 2,8, mayor de 3, mayor de 3,2, mayor de 3,4, mayor de 3,6, mayor de 3,8, mayor de 4, mayor de 4,2, mayor de 4,4, mayor de 4,6, mayor de 4,8, mayor de 5, mayor de 5,2, mayor de 5,4, mayor de 5,6, mayor de 5,8, mayor de 6, mayor de 6,2, mayor de 6,4, mayor de 6,6, mayor de 6,8, mayor de 7, mayor de 7,2, mayor de 7,4, mayor de 7,6, mayor de 7,8, mayor de 8, mayor de 8,2, mayor de 8,4, mayor de 8,6, mayor de 8,8, 9, mayor de 9,2, mayor de 9,4, mayor de 9,6, mayor de 9,8 o mayor de 10 o más en comparación con un polipéptido parental que tiene actividad fosfocetolasa (por ejemplo, una fosfocetolasa de E. gallinarum). En otras realizaciones, el índice de rendimiento celular aumenta al menos aproximadamente 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 3, 4, 5 veces o más en comparación con una molécula parental. En otras realizaciones, el índice de rendimiento celular es mayor de cualquiera de aproximadamente 0,1 a 0,5, de aproximadamente 0,25 a 0,75, de aproximadamente 0,5 a 1, de aproximadamente 0,75 a 1,25, de aproximadamente 1 a 1,5, de aproximadamente 1,25 a 1,75, de aproximadamente 1,5 a 2, de aproximadamente 1,75 a 2,25, de aproximadamente 2 a 2,5, de aproximadamente 2,25 a 2,75, de aproximadamente 2,5 a 3, de aproximadamente 2,75 a 3,25, de aproximadamente 3 a 3,5, de aproximadamente 3,25 a 3,75, de aproximadamente 3,5 a 4, de aproximadamente 3,75 a 4,25, de aproximadamente 4 a 4,5, de aproximadamente 4,25 a 4,75, de aproximadamente 4,5 a 5, de aproximadamente 4,75 a 5,25, de aproximadamente 5 a 5,5, de aproximadamente 5,25 a 5,75, de aproximadamente 5,5 a 6, de aproximadamente 6.25 a 6,75, de aproximadamente 6,5 a 7, de aproximadamente 6,75 a 7,25, de aproximadamente 7 a 7,5, de aproximadamente 7,75 a 8,25, de aproximadamente 8 a 8,5, de aproximadamente 8,25 a 8,75, de aproximadamente 8,5 a 9, de aproximadamente 8,75 a 9,25, de aproximadamente 9 a 9,5, de aproximadamente 9,25 a 9,75 o de aproximadamente 9,5 a 10 o más en comparación con una molécula parental. En otras realizaciones, el índice de rendimiento celular es mayor de cualquiera de aproximadamente 0,1 a 2, aproximadamente 1-3, aproximadamente 2-4, aproximadamente 3-5, aproximadamente 4-6, aproximadamente 5-7, aproximadamente 6-8, aproximadamente 7-9 o aproximadamente 8-10 o más en comparación con una molécula parental. En algunas realizaciones, la molécula parental es una fosfocetolasa de E. gallinarum. En otras realizaciones, la actividad intracelular aumenta al menos aproximadamente 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 veces o más.
Adicionalmente, se proporciona en el presente documento células recombinantes productoras de isopreno capaces de aumentar el flujo de carbono a través de la ruta de la fosfocetolasa, en las que las células recombinantes comprenden: (i) una secuencia de ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa, en las que el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 65% para SEQ ID NO: 8, (ii) uno o más ácidos nucleicos que codifican para uno o más polipéptidos de la ruta de MVA completa, y (iii) uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican para un polipéptido de isopreno sintasa, en las que dicho polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa de (i) tiene un valor de índice de rendimiento mayor de 1,0 en uno o más de los siguientes parámetros: (a) solubilidad de proteínas, (b) expresión de proteínas o (c) actividad específica de fructosa-6-fosfato (F6P). En otras realizaciones, los parámetros de valor de índice de rendimiento incluyen además (d) solubilidad de proteínas de rendimiento de isopreno o (e) productividad específica de isopreno. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 23. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 24. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 25. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 26. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 27. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 28. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 29. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 30. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 31. En otras realizaciones, dicho valor de índice de rendimiento para cualquiera de dichos parámetros es cualquiera de tal como mayor de 1,1, tal como mayor de 1,2, mayor de 1,4, mayor de 1,6, mayor de 1,8, mayor de 2, mayor de 2,2, mayor de 2,4, mayor de 2,6, mayor de 2,8, mayor de 3, mayor de 3,2, mayor de 3,4, mayor de 3,6, mayor de 3,8, mayor de 4, mayor de 4,2, mayor de 4,4, mayor de 4,6, mayor de 4,8, mayor de 5, mayor de 5,2, mayor de 5,4, mayor de 5,6, mayor de 5,8, mayor de 6, mayor de 6,2, mayor de 6,4, mayor de 6,6, mayor de 6,8, mayor de 7, mayor de 7,2, mayor de 7,4, mayor de 7,6, mayor de 7,8, mayor de 8, mayor de 8,2, mayor de 8,4, mayor de 8,6, mayor de 8,8, 9, mayor de 9,2, mayor de 9,4, mayor de 9,6, mayor de 9,8 o mayor de 10 o más en comparación con un polipéptido parental que tiene actividad fosfocetolasa (por ejemplo, una fosfocetolasa de E. gallinarum). En otras realizaciones, el índice de rendimiento celular aumenta al menos aproximadamente 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 3, 4, 5 veces o más en comparación con una molécula parental. En otras realizaciones, el índice de rendimiento celular es mayor de cualquiera de aproximadamente 0,1 a 0,5, de aproximadamente 0,25 a 0,75, de aproximadamente 0,5 a 1, de aproximadamente 0,75 a 1,25, de aproximadamente 1 a 1,5, de aproximadamente 1.25 a 1,75, de aproximadamente 1,5 a 2, de aproximadamente 1,75 a 2,25, de aproximadamente 2 a 2,5, de aproximadamente 2,25 a 2,75, de aproximadamente 2,5 a 3, de aproximadamente 2,75 a 3,25, de aproximadamente 3 a 3,5, de aproximadamente 3,25 a 3,75, de aproximadamente 3,5 a 4, de aproximadamente 3,75 a 4,25, de aproximadamente 4 a 4,5, de aproximadamente 4,25 a 4,75, de aproximadamente 4,5 a 5, de aproximadamente 4,75 a 5,25, de aproximadamente 5 a 5,5, de aproximadamente 5,25 a 5,75, de aproximadamente 5,5 a 6, de aproximadamente 6,25 a 6,75, de aproximadamente 6,5 a 7, de aproximadamente 6,75 a 7,25, de aproximadamente 7 a 7,5, de aproximadamente 7,75 a 8,25, de aproximadamente 8 a 8,5, de aproximadamente 8,25 a 8,75, de aproximadamente 8,5 a 9, de aproximadamente 8,75 a 9,25, de aproximadamente 9 a 9,5, de aproximadamente 9.25 a 9,75 o de aproximadamente 9,5 a 10 o más en comparación con una molécula parental. En otras realizaciones, el índice de rendimiento celular es mayor de cualquiera de aproximadamente 0,1 a 2, aproximadamente 1-3, aproximadamente 2-4, aproximadamente 3-5, aproximadamente 4-6, aproximadamente 5-7, aproximadamente 6-8, aproximadamente 7-9 o aproximadamente 8-10 o más en comparación con una molécula parental. En algunas realizaciones, la molécula parental es una fosfocetolasa de E. gallinarum. En otras realizaciones, la actividad intracelular aumenta al menos aproximadamente 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 veces o más.
Además, se proporcionan en el presente documento células recombinantes productoras de isopreno capaces de aumentar el flujo de carbono a través de la ruta de la fosfocetolasa, en las que las células recombinantes comprenden: (i) una secuencia de ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa, en las que el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 65% con SEQ ID NO: 11, (ii) uno o más ácidos nucleicos que codifican para uno o más polipéptidos de la ruta de MVA completa, y (iii) uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican para un polipéptido de isopreno sintasa, en las que dicha célula recombinante que comprende dicho polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa de (i) tiene un valor de índice de rendimiento mayor de 1,0 en uno o más de los siguientes parámetros: (a) crecimiento celular en glucosa, (b) crecimiento celular en xilosa, (c) producción de acetil-fosfato intracelular o (d) crecimiento celular en glucosa-6-fosfato. En otras realizaciones, los parámetros de valor de índice de rendimiento incluyen además (e) solubilidad de proteínas de rendimiento de isopreno o (f) productividad específica de isopreno. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 32. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 33. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 34. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 35. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 36. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 37. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 38. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 39. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 40. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 41. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 42. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 43. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 44. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 45. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 46. En otras realizaciones, dicho valor de índice de rendimiento para cualquiera de dichos parámetros es cualquiera de tal como mayor de 1,1, tal como mayor de 1,2, mayor de 1,4, mayor de 1,6, mayor de 1,8, mayor de 2, mayor de 2,2, mayor de 2,4, mayor de 2,6, mayor de 2,8, mayor de 3, mayor de 3,2, mayor de 3,4, mayor de 3,6, mayor de 3,8, mayor de 4, mayor de 4,2, mayor de 4,4, mayor de 4,6, mayor de 4,8, mayor de 5, mayor de 5,2, mayor de 5,4, mayor de 5,6, mayor de 5,8, mayor de 6, mayor de 6,2, mayor de 6,4, mayor de 6,6, mayor de 6,8, mayor de 7, mayor de 7,2, mayor de 7,4, mayor de 7,6, mayor de 7,8, mayor de 8, mayor de 8,2, mayor de 8,4, mayor de 8,6, mayor de 8,8, 9, mayor de 9,2, mayor de 9,4, mayor de 9,6, mayor de 9,8 o mayor de 10 o más en comparación con un polipéptido parental que tiene actividad fosfocetolasa (por ejemplo, una fosfocetolasa de E. gallinarum). En otras realizaciones, el índice de rendimiento celular aumenta al menos aproximadamente 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 3, 4, 5 veces o más en comparación con una molécula parental. En otras realizaciones, el índice de rendimiento celular es mayor de cualquiera de aproximadamente 0,1 a 0,5, de aproximadamente 0,25 a 0,75, de aproximadamente 0,5 a 1, de aproximadamente 0,75 a 1,25, de aproximadamente 1 a 1,5, de aproximadamente 1,25 a 1,75, de aproximadamente 1,5 a 2, de aproximadamente 1,75 a 2,25, de aproximadamente 2 a 2,5, de aproximadamente 2,25 a 2,75, de aproximadamente 2,5 a 3, de aproximadamente 2,75 a 3,25, de aproximadamente 3 a 3,5, de aproximadamente 3,25 a 3,75, de aproximadamente 3,5 a 4, de aproximadamente 3,75 a 4,25, de aproximadamente 4 a 4,5, de aproximadamente 4,25 a 4,75, de aproximadamente 4,5 a 5, de aproximadamente 4,75 a 5,25, de aproximadamente 5 a 5,5, de aproximadamente 5,25 a 5,75, de aproximadamente 5,5 a 6, de aproximadamente 6,25 a 6,75, de aproximadamente 6,5 a 7, de aproximadamente 6,75 a 7,25, de aproximadamente 7 a 7,5, de aproximadamente 7,75 a 8,25, de aproximadamente 8 a 8,5, de aproximadamente 8,25 a 8,75, de aproximadamente 8,5 a 9, de aproximadamente 8,75 a 9,25, de aproximadamente 9 a 9,5, de aproximadamente 9,25 a 9,75 o de aproximadamente 9,5 a 10 o más en comparación con una molécula parental. En otras realizaciones, el índice de rendimiento celular es mayor de cualquiera de aproximadamente 0,1 a 2, aproximadamente 1-3, aproximadamente 2-4, aproximadamente 3-5, aproximadamente 4­ 6, aproximadamente 5-7, aproximadamente 6-8, aproximadamente 7-9 o aproximadamente 8-10 o más en comparación con una molécula parental. En algunas realizaciones, la molécula parental es una fosfocetolasa de E. gallinarum. En otras realizaciones, la actividad intracelular aumenta al menos aproximadamente 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 veces o más.
Se proporcionan en el presente documento células recombinantes productoras de isopreno capaces de aumentar el flujo de carbono a través de la ruta de la fosfocetolasa, en las que las células recombinantes comprenden: (i) una secuencia de ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa, en las que el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 65% SEQ ID NO: 11, (ii) uno o más ácidos nucleicos que codifican para uno o más polipéptidos de la ruta de MVA completa, y (iii) uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican para un polipéptido de isopreno sintasa, en las que dicho polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa de (i) tiene un valor de índice de rendimiento mayor de 1,0 en uno o más de los siguientes parámetros: (a) solubilidad de proteínas, (b) expresión de proteínas o (c) actividad específica de fructosa-6-fosfato (F6P). En otras realizaciones, los parámetros de valor de índice de rendimiento incluyen además (d) solubilidad de proteínas de rendimiento de isopreno o (e) productividad específica de isopreno. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 32. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 33. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 34. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 35. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 36. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 37. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 38. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 39. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 40. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 41. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 42. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 43. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 44. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 45. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 46. En otras realizaciones, dicho valor de índice de rendimiento para cualquiera de dichos parámetros es cualquiera de tal como mayor de 1,1, tal como mayor de 1,2, mayor de 1,4, mayor de 1,6, mayor de 1,8, mayor de 2, mayor de 2,2, mayor de 2,4, mayor de 2,6, mayor de 2,8, mayor de 3, mayor de 3,2, mayor de 3,4, mayor de 3,6, mayor de 3,8, mayor de 4, mayor de 4,2, mayor de 4,4, mayor de 4,6, mayor de 4,8, mayor de 5, mayor de 5,2, mayor de 5,4, mayor de 5,6, mayor de 5,8, mayor de 6, mayor de 6,2, mayor de 6,4, mayor de 6,6, mayor de 6,8, mayor de 7, mayor de 7,2, mayor de 7,4, mayor de 7,6, mayor de 7,8, mayor de 8, mayor de 8,2, mayor de 8,4, mayor de 8,6, mayor de 8,8, 9, mayor de 9,2, mayor de 9,4, mayor de 9,6, mayor de 9,8 o mayor de 10 o más en comparación con un polipéptido parental que tiene actividad fosfocetolasa (por ejemplo, una fosfocetolasa de E. gallinarum). En otras realizaciones, el índice de rendimiento celular aumenta al menos aproximadamente 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 3, 4, 5 veces o más en comparación con una molécula parental. En otras realizaciones, el índice de rendimiento celular es mayor de cualquiera de aproximadamente 0,1 a 0,5, de aproximadamente 0,25 a 0,75, de aproximadamente 0,5 a 1, de aproximadamente 0,75 a 1,25, de aproximadamente 1 a 1,5, de aproximadamente 1,25 a 1,75, de aproximadamente 1,5 a 2, de aproximadamente 1,75 a 2,25, de aproximadamente 2 a 2,5, de aproximadamente 2,25 a 2,75, de aproximadamente 2,5 a 3, de aproximadamente 2,75 a 3,25, de aproximadamente 3 a 3,5, de aproximadamente 3,25 a 3,75, de aproximadamente 3,5 a 4, de aproximadamente 3,75 a 4,25, de aproximadamente 4 a 4,5, de aproximadamente 4,25 a 4,75, de aproximadamente 4,5 a 5, de aproximadamente 4,75 a 5,25, de aproximadamente 5 a 5,5, de aproximadamente 5,25 a 5,75, de aproximadamente 5,5 a 6, de aproximadamente 6,25 a 6,75, de aproximadamente 6,5 a 7, de aproximadamente 6,75 a 7,25, de aproximadamente 7 a 7,5, de aproximadamente 7,75 a 8,25, de aproximadamente 8 a 8,5, de aproximadamente 8,25 a 8,75, de aproximadamente 8,5 a 9, de aproximadamente 8,75 a 9,25, de aproximadamente 9 a 9,5, de aproximadamente 9,25 a 9,75 o de aproximadamente 9,5 a 10 o más en comparación con una molécula parental. En otras realizaciones, el índice de rendimiento celular es mayor de cualquiera de aproximadamente 0,1 a 2, aproximadamente 1-3, aproximadamente 2-4, aproximadamente 3-5, aproximadamente 4-6, aproximadamente 5-7, aproximadamente 6-8, aproximadamente 7-9 o aproximadamente 8-10 o más en comparación con una molécula parental. En algunas realizaciones, la molécula parental es una fosfocetolasa de E. gallinarum. En otras realizaciones, la actividad intracelular aumenta al menos aproximadamente 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 veces o más.
Métodos de uso de células recombinantes para producir isopreno.
También se proporcionan en el presente documento métodos para producir isopreno que comprenden cultivar cualquiera de las células recombinantes descritas en el presente documento. En un aspecto, el isopreno puede producirse cultivando células recombinantes que comprenden uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican para cualquier polipéptido de fosfocetolasa tal como se describe en el presente documento, uno o más polipéptidos de la ruta de MVA y un polipéptido de isopreno sintasa. En determinadas realizaciones, las células recombinantes descritas en el presente documento comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica para una fosfocetolasa aislada de Burkholderia phytofirmans, Lactobacillus buchneri, Bifidobacterium gallicum, Bifidobacterium dentium, Bifidobacterium bifidum y/o Clostridium acetobutylicum. En otras realizaciones, las células recombinantes descritas en el presente documento comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica para una fosfocetolasa aislada de Mycobacterium gilvum, Shewanella baltica, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus crispatus, Bifidobacterium longum, Leuconostoc citreum, Bradyrhizobium sp Enterococcus faecium, Brucella microti, Lactobacillus salivarius, Streptococcus agalactiae, Rhodococcus imtechensis, Burkholderia xenovorans, Mycobacterium intracellulare, Nitrosomonas sp., Schizosaccharomyces pombe, Leuconostoc mesenteroides, Streptomyces sp., Lactobacillus buchneri, Streptomyces ghanaensis, Cyanothece sp., y/o Neosartorya fischeri. En todavía otras realizaciones, las células recombinantes descritas en el presente documento comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica para una fosfocetolasa aislada de Enterococcus faecium, Listeria grayi, Enterococcus gallinarum, Enterococcus saccharolyticus, Enterococcus casseliflavus, Mycoplasma alligatoris, Carnobacterium sp., Melissococcus plutonius, Tetragenococcus halophilusy/o Mycoplasma arthritidis. En una realización, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica para una fosfocetolasa aislada de Streptococcus agalactiae, Mycoplasma agalactiae, Streptococcus gordonii, Kingella oralis, Mycoplasma fermentans, Granulicatella adiacens, Mycoplasma hominis, Mycoplasma crocodyli, Mycobacterium bovis, Neisseria sp., Streptococcus sp., Eremococcus coleocola, Granulicatella elegans, Streptococcus parasanguinis, Aerococcus urinae, Kingella kingae, Streptococcus australis, Streptococcus criceti y/o Mycoplasma columbinum.
En otro aspecto, el isopreno puede producirse cultivando células recombinantes que comprenden la modulación en cualquiera de las rutas enzimáticas descritas en el presente documento y uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican para un péptido de fosfocetolasa, un polipéptido de la ruta de MVA y un polipéptido de isopreno sintasa. En determinadas realizaciones, las células recombinantes descritas en el presente documento comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica para una fosfocetolasa aislada de Burkholderia phytofirmans, Lactobacillus buchneri, Bifidobacterium gallicum, Bifidobacterium dentium, Bifidobacterium bifidum y/o Clostridium acetobutylicum. En otras realizaciones, las células recombinantes descritas en el presente documento comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica para una fosfocetolasa aislada de Mycobacterium gilvum, Shewanella baltica, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus crispatus, Bifidobacterium longum, Leuconostoc citreum, Bradyrhizobium sp., Enterococcus faecium, Brucella microti, Lactobacillus salivarius, Streptococcus agalactiae, Rhodococcus imtechensis, Burkholderia xenovorans, Mycobacterium intracellulare, Nitrosomonas sp., Schizosaccharomyces pombe, Leuconostoc mesenteroides, Streptomyces sp., Lactobacillus buchneri, Streptomyces ghanaensis, Cyanothece sp., y/o Neosartorya fischeri. En todavía otras realizaciones, las células recombinantes descritas en el presente documento comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica para una fosfocetolasa aislada de Enterococcus faecium, Listeria grayi, Enterococcus gallinarum, Enterococcus saccharolyticus, Enterococcus casseliflavus, Mycoplasma alligatoris, Carnobacterium sp., Melissococcus plutonius, Tetragenococcus halophilus y/o Mycoplasma arthritidis. En una realización, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica para una fosfocetolasa aislada de Streptococcus agalactiae, Mycoplasma agalactiae, Streptococcus gordonii, Kingella oralis, Mycoplasma fermentans, Granulicatella adiacens, Mycoplasma hominis, Mycoplasma crocodyli, Mycobacterium bovis, Neisseria sp., Streptococcus sp., Eremococcus coleocola, Granulicatella elegans, Streptococcus parasanguinis, Aerococcus urinae, Kingella kingae, Streptococcus australis, Streptococcus criceti y/o Mycoplasma columbinum. El isopreno puede producirse a partir de cualquiera de las células descritas en el presente documento y según cualquiera de los métodos descritos en el presente documento. Cualquiera de las células puede usarse con el propósito de producir isopreno a partir de hidratos de carbono, incluyendo, pero sin limitarse a, azúcares de seis carbonos, tales como glucosa y/o azúcares de cinco carbonos, tales como xilosa.
Por tanto, se proporcionan en el presente documento métodos para producir isopreno que comprenden cultivar células que comprenden uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican para un polipéptido de fosfocetolasa y una isopreno sintasa en una condición adecuada para producir isopreno y (b) producir isopreno. En determinadas realizaciones, las células recombinantes descritas en el presente documento comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica para una fosfocetolasa aislada de Burkholderia phytofirmans, Lactobacillus buchneri, Bifidobacterium gallicum, Bifidobacterium dentium, Bifidobacterium bifidum y/o Clostridium acetobutylicumi. En otras realizaciones, las células recombinantes descritas en el presente documento comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica para una fosfocetolasa aislada de Mycobacterium gilvum, Shewanella baltica, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus crispatus, Bifidobacterium longum, Leuconostoc citreum, Bradyrhizobium sp., Enterococcus faecium, Brucella microti, Lactobacillus salivarius, Streptococcus agalactiae, Rhodococcus imtechensis, Burkholderia xenovorans, Mycobacterium intracellulare, Nitrosomonas sp., Schizosaccharomyces pombe, Leuconostoc mesenteroides, Streptomyces sp., Lactobacillus buchneri, Streptomyces ghanaensis, Cyanothece sp., y/o Neosartorya fischeri. En todavía otras realizaciones, las células recombinantes descritas en el presente documento comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica para una fosfocetolasa aislada de Enterococcus faecium, Listeria grayi, Enterococcus gallinarum, Enterococcus saccharolyticus, Enterococcus casseliflavus, Mycoplasma alligatoris, Carnobacterium sp., Melissococcus plutonius, Tetragenococcus halophilus y/o Mycoplasma arthritidis. En una realización, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica para una fosfocetolasa aislada de Streptococcus agalactiae, Mycoplasma agalactiae, Streptococcus gordonii, Kingella oralis, Mycoplasma fermentans, Granulicatella adiacens, Mycoplasma hominis, Mycoplasma crocodyli, Mycobacterium bovis, Neisseria sp., Streptococcus sp., Eremococcus coleocola, Granulicatella elegans, Streptococcus parasanguinis, Aerococcus urinae, Kingella kingae, Streptococcus australis, Streptococcus criceti y/o Mycoplasma columbinum.
Las células pueden comprender además una o más moléculas de ácido nucleico que codifican para el o los polipéptidos de la ruta de MVA descritos anteriormente (por ejemplo, la ruta de MVA completa) y cualquiera de los polipéptidos de isopreno sintasa descritos anteriormente (por ejemplo, isopreno sintasa de Pueraria). En algunos aspectos, las células recombinantes pueden ser una de las células descritas en el presente documento. Cualquiera de las isopreno sintasas o variantes de las mismas descritas en el presente documento, cualquiera de las cepas de células huésped descritas en el presente documento, cualquiera de los promotores descritos en el presente documento y/o cualquiera de los vectores descritos en el presente documento también pueden usarse para producir isopreno usando cualquiera de las fuentes de energía (por ejemplo, glucosa o xilosa) descritas en el presente documento puede usarse en los métodos descritos en el presente documento. En algunos aspectos, el método para producir isopreno comprende además una etapa de recuperación del isopreno. En otras realizaciones, el polipéptido de fosfocetolasa es de Burkholderia phytofirmans, Lactobacillus buchneri, Bifidobacterium gallicum, Bifidobacterium dentium, Bifidobacterium bifidum, Clostridium acetobutylicum, Mycobacterium gilvum, Shewanella baltica, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus crispatus, Bifidobacterium longum, Leuconostoc citreum, Bradyrhizobium sp., Enterococcus faecium, Brucella microti, Lactobacillus salivarius, Streptococcus agalactiae, Rhodococcus imtechensis, Burkholderia xenovorans, Mycobacterium intracellulare, Nitrosomonas sp., Schizosaccharomyces pombe, Leuconostoc mesenteroides, Streptomyces sp., Lactobacillus buchneri, Streptomyces ghanaensis, Cyanothece sp., Neosartorya fischeri, Enterococcus faecium, Listeria grayi, Enterococcus gallinarum, Enterococcus saccharolyticus, Enterococcus casseliflavus, Mycoplasma alligatoris, Carnobacterium sp., Melissococcus plutonius, Tetragenococcus halophilus, Mycoplasma arthritidis, Streptococcus agalactiae, Mycoplasma agalactiae, Streptococcus gordonii, Kingella oralis, Mycoplasma fermentans, Granulicatella adiacens, Mycoplasma hominis, Mycoplasma crocodyli, Mycobacterium bovis, Neisseria sp., Streptococcus sp., Eremococcus coleocola, Granulicatella elegans, Streptococcus parasanguinis, Aerococcus urinae, Kingella kingae, Streptococcus australis, Streptococcus criceti y/o Mycoplasma columbinum.
En determinados aspectos, se proporcionan en el presente documento métodos para fabricar isopreno que comprenden cultivar células recombinantes que comprenden uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican para un polipéptido de fosfocetolasa de Burkholderia phytofirmans, Lactobacillus buchneri, Bifidobacterium gallicum, Bifidobacterium dentium, Bifidobacterium bifidum, Clostridium acetobutylicum, Mycobacterium gilvum, Shewanella baltica, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus crispatus, Bifidobacterium longum, Leuconostoc citreum, Bradyrhizobium sp., Enterococcus faecium, Brucella microti, Lactobacillus salivarius, Streptococcus agalactiae, Rhodococcus imtechensis, Burkholderia xenovorans, Mycobacterium intracellulare, Nitrosomonas sp., Schizosaccharomyces pombe, Leuconostoc mesenteroides, Streptomyces sp., Lactobacillus buchneri, Streptomyces ghanaensis, Cyanothece sp., Neosartorya fischeri, Enterococcus faecium, Listeria grayi, Enterococcus gallinarum, Enterococcus saccharolyticus, Enterococcus casseliflavus, Mycoplasma alligatoris, Carnobacterium sp., Mycoplasma fermentans, Granulicatella adiacens, Mycoplasma hominis, Mycoplasma crocodyli, Mycobacterium bovis, Neisseria sp., Streptococcus sp., Eremococcus coleocola, Granulicatella elegans, Streptococcus parasanguinis, Aerococcus urinae, Kingella kingae, Streptococcus australis, Streptococcus criceti y/o Mycoplasma columbinum, un polipéptido de mvaS y mvaE de L. grayi, E. faecium, E. gallinarum, E. casseliflavus y/o E. faecalis, en una condición adecuada para producir isopreno y (b) producir isopreno. Las células pueden comprender además una o más moléculas de ácido nucleico que codifican para el/los polipéptido(s) de la ruta de MVA descrito(s) anteriormente (por ejemplo, MVK, PMK, MVD y/o IDI) y cualquiera de los polipéptidos de isopreno sintasa descritos anteriormente. En algunos aspectos, las células recombinantes pueden ser cualquiera de las células descritas en el presente documento.
En determinados aspectos, se proporcionan en el presente documento métodos para fabricar isopreno que comprenden cultivar células recombinantes que comprenden uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican para un polipéptido de fosfocetolasa de Burkholderia phytofirmans, Lactobacillus buchneri, Bifidobacterium gallicum, Bifidobacterium dentium, Bifidobacterium bifidum, Clostridium acetobutylicum, Mycobacterium gilvum, Shewanella baltica, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus crispatus, Bifidobacterium longum, Leuconostoc citreum, Bradyrhizobium sp., Enterococcus faecium, Brucella microti, Lactobacillus salivarius, Streptococcus agalactiae, Rhodococcus imtechensis, Burkholderia xonovorans, Mycobacterium intracellulare, Nitrosomonas sp., Schizosaccharomyces pombe, Leuconostoc mesenteroides, Streptomyces sp., Lactobacillus buchneri, Streptomyces ghanaensis, Cyanothece sp., Neosartorya fischeri, Enterococcus faecium, Listeria grayi, Enterococcus gallinarum, Enterococcus saccharolyticus, Enterococcus casseliflavus, Mycoplasma alligatoris, Carnobacterium sp., Melissococcus plutonius, Tetragenococcus halophilus, Mycoplasma arthritidis, Streptococcus agalactiae, Mycoplasma agalactiae, Streptococcus gordonii, Kingella oralis, Mycoplasma fermentans, Granulicatella adiacens, Mycoplasma hominis, Mycoplasma crocodyli, Mycobacterium bovis, Neisseria sp., Streptococcus sp., Eremococcus coleocola, Granulicatella elegans, Streptococcus parasanguinis, Aerococcus urinae, Kingella kingae, Streptococcus australis, Streptococcus criceti y/o Mycoplasma columbinum, en una condición adecuada para producir isopreno y (b) producir isopreno. Las células pueden comprender además una o más moléculas de ácido nucleico que codifican para el/los polipéptido(s) de la ruta de MVA inferior descrito(s) anteriormente (por ejemplo, MVK, PMK, MVD y/o IDI) y cualquiera de los polipéptidos de isopreno sintasa descritos anteriormente. En algunos aspectos, las células recombinantes pueden ser cualquiera de las células descritas en el presente documento.
Las células recombinantes descritas en el presente documento que tienen diversas rutas enzimáticas manipuladas para aumentar el flujo de carbono a través de la ruta de la fosfocetolasa a la producción de mevalonato pueden usarse para producir isopreno. En algunos aspectos, las células recombinantes pueden modificarse por ingeniería genética adicionalmente para aumentar la actividad de uno o más de los siguientes genes seleccionados del grupo que consiste en la ribosa 5-fosfato isomerasa (rpiA y/o rpiB), D-ribulosa-5-fosfato 3-epimerasa (rpe), transcetolasa (tktA y/o tktB), transaldolasa B (tal B), fosfato acetiltransferasa (pta y/o eutD). En otra realización, estas células recombinantes pueden modificarse por ingeniería genética adicionalmente para disminuir la actividad de uno o más genes de los siguientes genes, incluyendo glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (zwf), 6-fosfofructocinasa-1 (pfkA y/o pfkB), fructosa bisfosfato aldolasa (fba, fbaA, fbaBy/o fbaC), gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (gapA y/o gapB), acetato cinasa (ackA), citrato sintasa (gltA), EI (ptsI), EIICBGlc (ptsG), EIIAGlc (crr) y/o HPr (ptsH).
En algunos aspectos, la cantidad de isopreno producido se mide en el punto máximo de tiempo de productividad absoluta. En algunos aspectos, la productividad absoluta máxima para las células es aproximadamente cualquiera de las cantidades de isopreno divulgadas en el presente documento. En algunos aspectos, la cantidad de isopreno producido se mide en el punto de tiempo de productividad específica del pico. En algunos aspectos, el pico de productividad específica para las células es aproximadamente cualquiera de las cantidades de isopreno por célula descritas en el presente documento. En algunos aspectos, se mide la cantidad total acumulada de isopreno producido. En algunos aspectos, la productividad total acumulada para las células es aproximadamente cualquiera de las cantidades de isopreno descritas en el presente documento.
En algunos aspectos, cualquiera de las células descritas en el presente documento (por ejemplo, las células en cultivo) producen isopreno en más de aproximadamente cualquiera de o aproximadamente 1, 10, 25, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 400 500, 600, 700, 800, 900, 1.000, 1.250, 1.500, 1.750, 2.000, 2.500, 3.000, 4.000, 5.000 o más nmoles de isopreno/gramo de células para el peso húmedo de las células/h (nmoles/g)wcm/h). En algunos aspectos, la cantidad de isopreno está entre de aproximadamente 2 a aproximadamente 5.000 nmoles/gwcm/h, tal como entre de aproximadamente 2 a aproximadamente 100 nmoles/gwcm/h, de aproximadamente 100 a aproximadamente 500 nmoles/gwcm/h, de aproximadamente 150 a aproximadamente 500 nmoles/gwcm/h, de aproximadamente 500 a aproximadamente 1.000 nmoles/gwcm/h, de aproximadamente 1.000 a aproximadamente 2.000 nmoles/gwcm/h o de aproximadamente 2.000 a aproximadamente 5.000 nmoles/gwcm/h. En algunos aspectos, la cantidad de isopreno está entre de aproximadamente 20 a aproximadamente 5.000 nmoles/gwcm/h, de aproximadamente 100 a aproximadamente 5.000 nmoles/gwcm/h, de aproximadamente 200 a aproximadamente 2.000 nmoles/gwcm/h, de aproximadamente 200 a aproximadamente 1.000 nmoles/gwcm/h, de aproximadamente 300 a aproximadamente 1.000 nmoles/gwcm/h o de aproximadamente 400 a aproximadamente 1.000 nmoles/gwcm/h.
En algunos aspectos, las células en cultivo producen isopreno a más o aproximadamente 1, 10, 25, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 700, 800, 900, 1.000, 1.250, 1.500, 1.750, 2.000, 2.500, 3.000, 4.000, 5.000, 10.000, 100.000 o más ng de isopreno/gramo de células para el peso húmedo de las células/h (ng/g)wcm/h). En algunos aspectos, la cantidad de isopreno está entre de aproximadamente 2 a aproximadamente 5.000 ng/gwcm/h, tal como entre de aproximadamente 2 a aproximadamente 100 ng/gwcm/h, de aproximadamente 100 a aproximadamente 500 ng/gwcm/h, de aproximadamente 500 a aproximadamente 1.000 ng/gwcm/h, de aproximadamente 1.000 a aproximadamente 2.000 ng/gwcm/h o de aproximadamente 2.000 a aproximadamente 5.000 ng/gwcm/h. En algunos aspectos, la cantidad de isopreno está entre de aproximadamente 20 a aproximadamente 5.000 ng/gwcm/h, de aproximadamente 100 a aproximadamente 5.000 ng/gwcm/h, de aproximadamente 200 a aproximadamente 2.000 ng/gwcm/h, de aproximadamente 200 a aproximadamente 1.000 ng/gwcm/h, de aproximadamente 300 a aproximadamente 1.000 ng/gwcm/h o de aproximadamente 400 a aproximadamente 1.000 ng/gwcm/h.
En algunos aspectos, las células en cultivo producen un título acumulativo (cantidad total) de isopreno en más de aproximadamente 1, 10, 25, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1.000, 1.250, 1.500, 1.750, 2.000, 2.500, 3.000, 4.000, 5.000, 10.000, 50.000, 100.000 o más mg de isopreno/l de caldo (mg/l)caldo, en la que el volumen de caldo incluye el volumen de las células y el medio celular). En algunos aspectos, la cantidad de isopreno está entre de aproximadamente 2 a aproximadamente 5.000 mg/lcaldo, tal como entre de aproximadamente 2 a aproximadamente 100 mg/lcaldo, de aproximadamente 100 a aproximadamente 500 mg/lcaldo, de aproximadamente 500 a aproximadamente 1.000 mg/lcaldo, de aproximadamente 1.000 a aproximadamente 2.000 mg/lcaldo o de aproximadamente 2.000 a aproximadamente 5.000 mg/lcaldo. En algunos aspectos, la cantidad de isopreno está entre de aproximadamente 20 a aproximadamente 5.000 mg/lcaldo, de aproximadamente 100 a aproximadamente 5.000 mg/lcaldo, de aproximadamente 200 a aproximadamente 2.000 mg/lcaldo, de aproximadamente 200 a aproximadamente 1.000 mg/lcaldo, de aproximadamente 300 a aproximadamente 1.000 mg/lcaldo o de aproximadamente 400 a aproximadamente 1.000 mg/lcaldo.
En algunos aspectos, el isopreno producido por las células en cultivo comprende al menos aproximadamente el 1, 2, 5, 10, 15, 20 o el 25% en volumen del gas residual de fermentación. En algunos aspectos, el isopreno comprende entre de aproximadamente el 1 a aproximadamente el 25% en volumen del gas residual, tal como entre de aproximadamente el 5 a aproximadamente el 15%, de aproximadamente el 15 a aproximadamente el 25%, de aproximadamente el 10 a aproximadamente el 20% o de aproximadamente el 1 a aproximadamente el 10%.
En determinadas realizaciones, los métodos de producción de isopreno pueden comprender las etapas de:
(a) cultivar células recombinantes (incluyendo, pero sin limitarse a, células de E. coli) que no expresan de manera endógena un polipéptido de fosfocetolasa, en los que las células expresan de manera heteróloga una o más copias de un gen que codifica para un polipéptido de fosfocetolasa junto con (i) uno o más ácidos nucleicos que expresan uno o más péptidos de la ruta de mVa y (ii) una isopreno sintasa y
(b) producir isopreno, en los que las células recombinantes muestran una tasa de absorción de oxígeno disminuida (OUR) en comparación con la de las mismas células que carecen de una o más copias heterólogas de un gen que codifica para un polipéptido de fosfocetolasa. En determinadas realizaciones, las células recombinantes que expresan una o más copias heterólogas de un gen que codifica para un polipéptido de fosfocetolasa muestran una disminución de hasta 1 vez, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 6 veces o 7 veces de la OUR en comparación con células recombinantes que no expresan una fosfocetolasa.
También se proporcionan en el presente documento métodos para la producción de células que comprenden isopreno que tienen capacidades mejoradas de producción de isopreno. La producción de isopreno por las células descritas en el presente documento puede mejorarse mediante la expresión de uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican para un polipéptido de fosfocetolasa, una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica para uno o más polipéptidos del polipéptido de la ruta de MVA completa, y una o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican para un polipéptido de isopreno sintasa. En determinadas realizaciones, el polipéptido de fosfocetolasa es de Burkholderia phytofirmans, Lactobacillus buchneri, Bifidobacterium gallicum, Bifidobacterium dentium, Bifidobacterium bifidum y/o Clostridium acetobutylicum. En algunas realizaciones, el polipéptido de fosfocetolasa es de Mycobacterium gilvum, Shewanella baltica, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus crispatus, Bifidobacterium longum, Leuconostoc citreum, Bradyrhizobium sp., Enterococcus faecium, Brucella microti, Lactobacillus salivarius, Streptococcus agalactiae, Rhodococcus imtechensis, Burkholderia xenovorans, Mycobacterium intracellulare, Nitrosomonas sp., Schizosaccharomyces pombe, Leuconostoc mesenteroides, Streptomyces sp., Lactobacillus buchneri, Streptomyces ghanaensis, Cyanothece sp., y/o Neosartorya fischeri. En todavía otras realizaciones, la fosfocetolasa es de Enterococcus faecium, Listeria grayi, Enterococcus gallinarum, Enterococcus saccharolyticus, Enterococcus casseliflavus, Mycoplasma alligatoris, Carnobacterium sp., Melissococcus plutonius, Tetragenococcus halophilus y/o Mycoplasma arthritidis. En todavía otras realizaciones, la fosfocetolasa es de Streptococcus agalactiae, Mycoplasma agalactiae, Streptococcus gordonii, Kingella oralis, Mycoplasma fermentans, Granulicatella adiacens, Mycoplasma hominis, Mycoplasma crocodyli, Mycobacterium bovis, Neisseria sp., Streptococcus sp., Eremococcus coleocola, Granulicatella elegans, Streptococcus parasanguinis, Aerococcus urinae, Kingella kingae, Streptococcus australis, Streptococcus criceti y/o Mycoplasma columbinum. Tal como se usa en el presente documento, la producción de isopreno “mejorada” se refiere a un índice de productividad celular aumentada (CPI) para el isopreno, un título aumentado de isopreno, un rendimiento másico aumentado de isopreno y/o una productividad específica aumentada de isopreno por las células descritas por cualquiera de las composiciones y métodos descritos en el presente documento en comparación con células que no tienen uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican para un polipéptido de fosfocetolasa, un(os) polipéptido(s) de la ruta de MVA y un polipéptido de isopreno sintasa. La producción de isopreno puede mejorarse en aproximadamente un 5% a aproximadamente 1.000.000 de veces. La producción de isopreno puede mejorarse en aproximadamente un 10% a aproximadamente 1.000.000 de veces (por ejemplo, de aproximadamente el 50% a aproximadamente 1.000.000 veces, de aproximadamente 1 a aproximadamente 500.000 veces, de aproximadamente 1 a aproximadamente 50.000 veces, de aproximadamente 1 a aproximadamente 5.000 veces, de aproximadamente 1 a aproximadamente 1.000 veces, de aproximadamente 1 a aproximadamente 500 veces, de aproximadamente 1 a aproximadamente 100 veces, de aproximadamente 1 a aproximadamente 50 veces, de aproximadamente 5 a aproximadamente 100.000 veces, de aproximadamente 5 a aproximadamente 10.000 veces, de aproximadamente 5 a aproximadamente 1.000 veces, de aproximadamente 5 a aproximadamente 500 veces, de aproximadamente 5 a aproximadamente 100 veces, de aproximadamente 10 a aproximadamente 50.000 veces, de aproximadamente 50 a aproximadamente 10.000 veces, de aproximadamente 100 a aproximadamente 5.000 veces, de aproximadamente 200 a aproximadamente 1.000 veces, de aproximadamente 50 a aproximadamente 500 veces o de aproximadamente 50 a aproximadamente 200 veces) en comparación con la producción de isopreno por las células productoras de isopreno que no expresan de manera endógena la enzima fosfocetolasa. En determinadas realizaciones descritas en el presente documento, los métodos descritos en el presente documento comprenden que las células huésped se han modificado por ingeniería genética adicionalmente para aumentar el flujo de carbono a través de la ruta de la fosfocetolasa a la producción de MVA, proporcionando así una producción mejorada de isopreno en comparación con la producción de isopreno por células productoras de isopreno que no expresan uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican para el péptido de fosfocetolasa y que no se han modificado por ingeniería genética para aumentar el flujo de carbono a través de la ruta de la fosfocetolasa a la producción de mevalonato.
En otros aspectos, los métodos descritos en el presente documento se dirigen a la producción mejorada de isopreno por las células descritas en el presente documento (por ejemplo, mejoradas por la expresión de uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican para un polipéptido de fosfocetolasa). En determinadas realizaciones, el polipéptido de fosfocetolasa es de Burkholderia phytofirmans, Lactobacillus buchneri, Bifidobacterium gallicum, Bifidobacterium dentium, Bifidobacterium bifidum y/o Clostridium acetobutylicum. En algunas realizaciones, el polipéptido de fosfocetolasa es de Mycobacterium gilvum, Shewanella baltica, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus crispatus, Bifidobacterium longum, Leuconostoc citreum, Bradyrhizobium sp., Enterococcus faecium, Brucella microti, Lactobacillus salivarius, Streptococcus agalactiae, Rhodococcus imtechensis, Burkholderia xenovorans, Mycobacterium intracellulare, Nitrosomonas sp., Schizosaccharomyces pombe, Leuconostoc mesenteroides, Streptomyces sp., Lactobacillus buchneri, Streptomyces ghanaensis, Cyanothece sp., y/o Neosartorya fischeri. En todavía otras realizaciones, la fosfocetolasa es de Enterococcus faecium, Listeria grayi, Enterococcus gallinarum, Enterococcus saccharolyticus, Enterococcus casseliflavus, Mycoplasma alligatoris, Carnobacterium sp., Melissococcus plutonius, Tetragenococcus halophilus y/o Mycoplasma arthritidis. En todavía otras realizaciones, la fosfocetolasa es de Streptococcus agalactiae, Mycoplasma agalactiae, Streptococcus gordonii, Kingella oralis, Mycoplasma fermentans, Granulicatella adiacens, Mycoplasma hominis, Mycoplasma crocodyli, Mycobacterium bovis, Neisseria sp., Streptococcus sp., Eremococcus coleocola, Granulicatella elegans, Streptococcus parasanguinis, Aerococcus urinae, Kingella kingae, Streptococcus australis, Streptococcus criceti y/o Mycoplasma columbinum. La producción de isopreno puede mejorarse en aproximadamente un 5% a aproximadamente 1.000.000 de veces. La producción de isopreno puede mejorarse en aproximadamente un 10% a aproximadamente 1.000.000 de veces (por ejemplo, de aproximadamente el 50% a aproximadamente 1.000.000 veces, de aproximadamente 1 a aproximadamente 500.000 veces, de aproximadamente 1 a aproximadamente 50.000 veces, de aproximadamente 1 a aproximadamente 5.000 veces, de aproximadamente 1 a aproximadamente 1.000 veces, de aproximadamente 1 a aproximadamente 500 veces, de aproximadamente 1 a aproximadamente 100 veces, de aproximadamente 1 a aproximadamente 50 veces, de aproximadamente 5 a aproximadamente 100.000 veces, de aproximadamente 5 a aproximadamente 10.000 veces, de aproximadamente 5 a aproximadamente 1.000 veces, de aproximadamente 5 a aproximadamente 500 veces, de aproximadamente 5 a aproximadamente 100 veces, de aproximadamente 10 a aproximadamente 50.000 veces, de aproximadamente 50 a aproximadamente 10.000 veces, de aproximadamente 100 a aproximadamente 5.000 veces, de aproximadamente 200 a aproximadamente 1.000 veces, de aproximadamente 50 a aproximadamente 500 veces o de aproximadamente 50 a aproximadamente 200 veces) en comparación con la producción de isopreno por una célula productora de isopreno sin la expresión de uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican para un polipéptido de fosfocetolasa. La producción de isopreno también puede mejorarse en al menos aproximadamente el 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, el 90%, 1 vez, 2 veces, 5 veces, 10 veces, 20 veces, 50 veces, 100 veces, 200 veces, 500 veces, 1000 veces, 2000 veces, 5000 veces, 10.000 veces, 20.000 veces, 50.000 veces, 100.000 veces, 200.000 veces, 500.000 veces, o 1.000.000 veces en comparación con la producción de isopreno por células productoras de isopreno sin la expresión de uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican para fosfocetolasa. En determinadas realizaciones descritas en el presente documento, los métodos descritos en el presente documento comprenden que las células huésped se han modificado por ingeniería genética adicionalmente para aumentar el flujo de carbono a la producción de MVA, proporcionando así una producción mejorada de isopreno en comparación con la producción de isopreno por las células que no expresan uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican para péptido de fosfocetolasa y que no se han modificado por ingeniería genética para aumentar el flujo de carbono a la producción de mevalonato.
Además, pueden usarse condiciones de cultivo celular más específicas para cultivar las células en los métodos descritos en el presente documento. Por ejemplo, en algunos aspectos, el método para la producción de isopreno comprende las etapas de (a) cultivar células recombinantes (incluyendo, pero sin limitarse a, células de E. coli) que no tienen de manera endógena un gen de la fosfocetolasa en medio mínimo a 34°C, en el que las células recombinantes expresan de manera heteróloga (i) una o más copias de un gen heterólogo que codifica para un polipéptido de fosfocetolasa en un plásmido de bajo y medio número de copias y bajo el control de un promotor fuerte, (ii) una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica para uno o más polipéptidos del polipéptido de la ruta de MVA (ruta de MVA superior y ruta de MVA inferior) y (iii) uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican para un polipéptido de isopreno sintasa; y (b) producir isopreno. En determinadas realizaciones, el polipéptido de fosfocetolasa es de Burkholderia phytofirmans, Lactobacillus buchneri, Bifidobacterium gallicum, Bifidobacterium dentium, Bifidobacterium bifidum y/o Clostridium acetobutylicum. En algunas realizaciones, el polipéptido de fosfocetolasa es de Mycobacterium gilvum, Shewanella baltica, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus crispatus, Bifidobacterium longum, Leuconostoc citreum, Bradyrhizobium sp., Enterococcus faecium, Brucella microti, Lactobacillus salivarius, Streptococcus agalactiae, Rhodococcus imtechensis, Burkholderia xenovorans, Mycobacterium intracellulare, Nitrosomonas sp., Schizosaccharomyces pombe, Leuconostoc mesenteroides, Streptomyces sp., Lactobacillus buchneri, Streptomyces ghanaensis, Cyanothece sp., y/o Neosartorya fischeri. En todavía otras realizaciones, la fosfocetolasa es de Enterococcus faecium, Listeria grayi, Enterococcus gallinarum, Enterococcus saccharolyticus, Enterococcus casseliflavus, Mycoplasma alligatoris, Carnobacterium sp., Melissococcus plutonius, Tetragenococcus halophilus y/o Mycoplasma arthritidis. En todavía otras realizaciones, la fosfocetolasa es de Streptococcus agalactiae, Mycoplasma agalactiae, Streptococcus gordonii, Kingella oralis, Mycoplasma fermentans, Granulicatella adiacens, Mycoplasma hominis, Mycoplasma crocodyli, Mycobacterium bovis, Neisseria sp., Streptococcus sp., Eremococcus coleocola, Granulicatella elegans, Streptococcus parasanguinis, Aerococcus urinae, Kingella kingae, Streptococcus australis, Streptococcus criceti y/o Mycoplasma columbinum. En algunos aspectos, el método para producir isopreno comprende además una etapa de recuperación del isopreno.
También se proporcionan en el presente documento métodos de producción de isopreno que comprenden cultivar células recombinantes capaces de aumentar el flujo de carbono a través de la ruta de la fosfocetolasa, en los que las células recombinantes comprenden: (i) una secuencia de ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa, en los que el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 65% con SEQ ID NO: 8, (ii) uno o más ácidos nucleicos que codifican para uno o más polipéptidos de la ruta de MVA completa, y (iii) uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican para un polipéptido de isopreno sintasa, en los que dicha célula recombinante comprende dicho polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa de (i) tiene un valor de índice de rendimiento mayor de 1,0 en uno o más de los siguientes parámetros: (a) crecimiento celular en glucosa, (b) crecimiento celular en xilosa, (c) producción de acetil-fosfato intracelular o (d) crecimiento celular en glucosa-6-fosfato y producir dicho isopreno. En otras realizaciones, los parámetros de valor de índice de rendimiento incluyen además (e) solubilidad de proteínas de rendimiento de isopreno o (f) productividad específica de isopreno. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 23. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 24. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 25. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 26. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 27. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 28. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 29. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 30. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 31. En otras realizaciones, dicho valor de índice de rendimiento para cualquiera de dichos parámetros es cualquiera de tal como mayor de 1,1, tal como mayor de 1,2, mayor de 1,4, mayor de 1,6, mayor de 1,8, mayor de 2, mayor de 2,2, mayor de 2,4, mayor de 2,6, mayor de 2,8, mayor de 3, mayor de 3,2, mayor de 3,4, mayor de 3,6, mayor de 3,8, mayor de 4, mayor de 4,2, mayor de 4,4, mayor de 4,6, mayor de 4,8, mayor de 5, mayor de 5,2, mayor de 5,4, mayor de 5,6, mayor de 5,8, mayor de 6, mayor de 6,2, mayor de 6,4, mayor de 6,6, mayor de 6,8, mayor de 7, mayor de 7,2, mayor de 7,4, mayor de 7,6, mayor de 7,8, mayor de 8, mayor de 8,2, mayor de 8,4, mayor de 8,6, mayor de 8,8, 9, mayor de 9,2, mayor de 9,4, mayor de 9,6, mayor de 9,8 o mayor de 10 o más en comparación con un polipéptido parental que tiene actividad fosfocetolasa (por ejemplo, una fosfocetolasa de E. gallinarum). En otras realizaciones, el índice de rendimiento celular aumenta al menos aproximadamente 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 3, 4, 5 veces o más en comparación con una molécula parental. En otras realizaciones, el índice de rendimiento celular es mayor de cualquiera de aproximadamente 0,1 a 0,5, de aproximadamente 0,25 a 0,75, de aproximadamente 0,5 a 1, de aproximadamente 0,75 a 1,25, de aproximadamente 1 a 1,5, de aproximadamente 1,25 a 1,75, de aproximadamente 1,5 a 2, de aproximadamente 1,75 a 2,25, de aproximadamente 2 a 2,5, de aproximadamente 2.25 a 2,75, de aproximadamente 2,5 a 3, de aproximadamente 2,75 a 3,25, de aproximadamente 3 a 3,5, de aproximadamente 3,25 a 3,75, de aproximadamente 3,5 a 4, de aproximadamente 3,75 a 4,25, de aproximadamente 4 a 4,5, de aproximadamente 4,25 a 4,75, de aproximadamente 4,5 a 5, de aproximadamente 4,75 a 5,25, de aproximadamente 5 a 5,5, de aproximadamente 5,25 a 5,75, de aproximadamente 5,5 a 6, de aproximadamente 6.25 a 6,75, de aproximadamente 6,5 a 7, de aproximadamente 6,75 a 7,25, de aproximadamente 7 a 7,5, de aproximadamente 7,75 a 8,25, de aproximadamente 8 a 8,5, de aproximadamente 8,25 a 8,75, de aproximadamente 8,5 a 9, de aproximadamente 8,75 a 9,25, de aproximadamente 9 a 9,5, de aproximadamente 9,25 a 9,75 o de aproximadamente 9,5 a 10 o más en comparación con una molécula parental. En otras realizaciones, el índice de rendimiento celular es mayor de cualquiera de aproximadamente 0,1 a 2, aproximadamente 1-3, aproximadamente 2-4, aproximadamente 3-5, aproximadamente 4-6, aproximadamente 5-7, aproximadamente 6-8, aproximadamente 7-9 o aproximadamente 8-10 o más en comparación con una molécula parental. En algunas realizaciones, la molécula parental es una fosfocetolasa de E. gallinarum. En otras realizaciones, la actividad intracelular aumenta al menos aproximadamente 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 veces o más.
Adicionalmente, se proporcionan en el presente documento métodos para producir isopreno que comprenden cultivar células recombinantes capaces de aumentar el flujo de carbono a través de la ruta de la fosfocetolasa, en los que las células recombinantes comprenden: (i) una secuencia de ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa, en los que el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 65% con SEQ ID NO: 8 y, (ii) uno o más ácidos nucleicos que codifican para uno o más polipéptidos de la ruta de MVA completa, y (iii) uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican para un polipéptido de isopreno sintasa, en los que dicho polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa de (i) tiene un valor de índice de rendimiento mayor de 1,0 en uno o más de los siguientes parámetros: (a) solubilidad de proteínas, (b) expresión de proteínas o (c) actividad específica de fructosa-6-fosfato (F6P) y producir dicho isopreno. En otras realizaciones, los parámetros de valor de índice de rendimiento incluyen además (d) solubilidad de proteínas de rendimiento de isopreno o (e) productividad específica de isopreno. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 23. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 24. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 25. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 26. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 27. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 28. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 29. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 30. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 31. En otras realizaciones, dicho valor de índice de rendimiento para cualquiera de dichos parámetros es cualquiera de tal como mayor de 1,1, tal como mayor de 1,2, mayor de 1,4, mayor de 1,6, mayor de 1,8, mayor de 2, mayor de 2,2, mayor de 2,4, mayor de 2,6, mayor de 2,8, mayor de 3, mayor de 3,2, mayor de 3,4, mayor de 3,6, mayor de 3,8, mayor de 4, mayor de 4,2, mayor de 4,4, mayor de 4,6, mayor de 4,8, mayor de 5, mayor de 5,2, mayor de 5,4, mayor de 5,6, mayor de 5,8, mayor de 6, mayor de 6,2, mayor de 6,4, mayor de 6,6, mayor de 6,8, mayor de 7, mayor de 7,2, mayor de 7,4, mayor de 7,6, mayor de 7,8, mayor de 8, mayor de 8,2, mayor de 8,4, mayor de 8,6, mayor de 8,8, 9, mayor de 9,2, mayor de 9,4, mayor de 9,6, mayor de 9,8 o mayor de 10 o más en comparación con un polipéptido parental que tiene actividad fosfocetolasa (por ejemplo, una fosfocetolasa de E. gallinarum). En otras realizaciones, el índice de rendimiento celular aumenta al menos aproximadamente 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 3, 4, 5 veces o más en comparación con una molécula parental. En otras realizaciones, el índice de rendimiento celular es mayor de cualquiera de aproximadamente 0,1 a 0,5, de aproximadamente 0,25 a 0,75, de aproximadamente 0,5 a 1, de aproximadamente 0,75 a 1,25, de aproximadamente 1 a 1,5, de aproximadamente 1,25 a 1,75, de aproximadamente 1,5 a 2, de aproximadamente 1,75 a 2,25, de aproximadamente 2 a 2,5, de aproximadamente 2.25 a 2,75, de aproximadamente 2,5 a 3, de aproximadamente 2,75 a 3,25, de aproximadamente 3 a 3,5, de aproximadamente 3,25 a 3,75, de aproximadamente 3,5 a 4, de aproximadamente 3,75 a 4,25, de aproximadamente 4 a 4,5, de aproximadamente 4,25 a 4,75, de aproximadamente 4,5 a 5, de aproximadamente 4,75 a 5,25, de aproximadamente 5 a 5,5, de aproximadamente 5,25 a 5,75, de aproximadamente 5,5 a 6, de aproximadamente 6.25 a 6,75, de aproximadamente 6,5 a 7, de aproximadamente 6,75 a 7,25, de aproximadamente 7 a 7,5, de aproximadamente 7,75 a 8,25, de aproximadamente 8 a 8,5, de aproximadamente 8,25 a 8,75, de aproximadamente 8,5 a 9, de aproximadamente 8,75 a 9,25, de aproximadamente 9 a 9,5, de aproximadamente 9,25 a 9,75 o de aproximadamente 9,5 a 10 o más en comparación con una molécula parental. En otras realizaciones, el índice de rendimiento celular es mayor de cualquiera de aproximadamente 0,1 a 2, aproximadamente 1-3, aproximadamente 2-4, aproximadamente 3-5, aproximadamente 4-6, aproximadamente 5-7, aproximadamente 6-8, aproximadamente 7-9 o aproximadamente 8-10 o más en comparación con una molécula parental. En algunas realizaciones, la molécula parental es una fosfocetolasa de E. gallinarum. En otras realizaciones, la actividad intracelular aumenta al menos aproximadamente 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 veces o más.
Además, se proporcionan en el presente documento métodos para producir isopreno que comprenden cultivar células recombinantes capaces de aumentar el flujo de carbono a través de la ruta de la fosfocetolasa, en la que la célula recombinante comprende: (i) una secuencia de ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa, en los que el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 65% con SEQ ID NO: 11, (ii) uno o más ácidos nucleicos que codifican para uno o más polipéptidos de la ruta de MVA completa, y (iii) uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican para un polipéptido de isopreno sintasa, en los que dicha célula recombinante comprende dicho polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa de (i) tiene un valor de índice de rendimiento mayor de 1,0 en uno o más de los siguientes parámetros: (a) crecimiento celular en glucosa, (b) crecimiento celular en xilosa, (c) producción de acetil-fosfato intracelular o (d) crecimiento celular en glucosa-6-fosfato y producir dicho isopreno. En otras realizaciones, los parámetros de valor de índice de rendimiento incluyen además (e) solubilidad de proteínas de rendimiento de isopreno o (f) productividad específica de isopreno. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 32. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 33. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 34. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 35. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 36. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 37. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 38. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 39. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 40. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 41. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 42. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 43. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 44. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 45. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 46. En otras realizaciones, dicho valor de índice de rendimiento para cualquiera de dichos parámetros es cualquiera de tal como mayor de 1,1, tal como mayor de 1,2, mayor de 1,4, mayor de 1,6, mayor de 1,8, mayor de 2, mayor de 2,2, mayor de 2,4, mayor de 2,6, mayor de 2,8, mayor de 3, mayor de 3,2, mayor de 3,4, mayor de 3,6, mayor de 3,8, mayor de 4, mayor de 4,2, mayor de 4,4, mayor de 4,6, mayor de 4,8, mayor de 5, mayor de 5,2, mayor de 5,4, mayor de 5,6, mayor de 5,8, mayor de 6, mayor de 6,2, mayor de 6,4, mayor de 6,6, mayor de 6,8, mayor de 7, mayor de 7,2, mayor de 7,4, mayor de 7,6, mayor de 7,8, mayor de 8, mayor de 8,2, mayor de 8,4, mayor de 8,6, mayor de 8,8, 9, mayor de 9,2, mayor de 9,4, mayor de 9,6, mayor de 9,8 o mayor de 10 o más en comparación con un polipéptido parental que tiene actividad fosfocetolasa (por ejemplo, una fosfocetolasa de E. gallinarum). En otras realizaciones, el índice de rendimiento celular aumenta al menos aproximadamente 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 3, 4, 5 veces o más en comparación con una molécula parental. En otras realizaciones, el índice de rendimiento celular es mayor de cualquiera de aproximadamente 0,1 a 0,5, de aproximadamente 0,25 a 0,75, de aproximadamente 0,5 a 1, de aproximadamente 0,75 a 1,25, de aproximadamente 1 a 1,5, de aproximadamente 1.25 a 1,75, de aproximadamente 1,5 a 2, de aproximadamente 1,75 a 2,25, de aproximadamente 2 a 2,5, de aproximadamente 2,25 a 2,75, de aproximadamente 2,5 a 3, de aproximadamente 2,75 a 3,25, de aproximadamente 3 a 3,5, de aproximadamente 3,25 a 3,75, de aproximadamente 3,5 a 4, de aproximadamente 3,75 a 4,25, de aproximadamente 4 a 4,5, de aproximadamente 4,25 a 4,75, de aproximadamente 4,5 a 5, de aproximadamente 4,75 a 5,25, de aproximadamente 5 a 5,5, de aproximadamente 5,25 a 5,75, de aproximadamente 5,5 a 6, de aproximadamente 6,25 a 6,75, de aproximadamente 6,5 a 7, de aproximadamente 6,75 a 7,25, de aproximadamente 7 a 7,5, de aproximadamente 7,75 a 8,25, de aproximadamente 8 a 8,5, de aproximadamente 8,25 a 8,75, de aproximadamente 8,5 a 9, de aproximadamente 8,75 a 9,25, de aproximadamente 9 a 9,5, de aproximadamente 9.25 a 9,75 o de aproximadamente 9,5 a 10 o más en comparación con una molécula parental. En otras realizaciones, el índice de rendimiento celular es mayor de cualquiera de aproximadamente 0,1 a 2, aproximadamente 1-3, aproximadamente 2-4, aproximadamente 3-5, aproximadamente 4-6, aproximadamente 5-7, aproximadamente 6-8, aproximadamente 7-9 o aproximadamente 8-10 o más en comparación con una molécula parental. En algunas realizaciones, la molécula parental es una fosfocetolasa de E. gallinarum. En otras realizaciones, la actividad intracelular aumenta al menos aproximadamente 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 veces o más.
En el presente documento se proporcionan métodos de producción de isopreno que comprenden cultivar células recombinantes capaces de aumentar el flujo de carbono a través de la ruta de la fosfocetolasa, en los que las células recombinantes comprenden: (i) una secuencia de ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa, en los que el polipéptido comprende al menos el 65% identidad de secuencia con SEQ ID NO: 11, (ii) uno o más ácidos nucleicos que codifican para uno o más polipéptidos de la ruta de MVA completa, y (iii) uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican para un polipéptido de isopreno sintasa, en los que dicho polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa de (i) tiene un valor de índice de rendimiento mayor de 1,0 en uno o más de los siguientes parámetros: (a) solubilidad de proteínas, (b) expresión de proteínas o (c) actividad específica de fructosa-6-fosfato (F6P) y producir dicho isopreno En otras realizaciones, los parámetros de valor de índice de rendimiento incluyen además (d) solubilidad de proteínas de rendimiento de isopreno o (e) productividad específica de isopreno. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con s Eq ID NO: 32. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 33. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 34. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 35. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 36. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 37. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 38. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 39. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 40. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 41. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 42. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 43. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 44. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 45. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 46. En otras realizaciones, dicho valor de índice de rendimiento para cualquiera de dichos parámetros es cualquiera de tal como mayor de 1,1, tal como mayor de 1,2, mayor de 1,4, mayor de 1,6, mayor de 1,8, mayor de 2, mayor de 2,2, mayor de 2,4, mayor de 2,6, mayor de 2,8, mayor de 3, mayor de 3,2, mayor de 3,4, mayor de 3,6, mayor de 3,8, mayor de 4, mayor de 4,2, mayor de 4,4, mayor de 4,6, mayor de 4,8, mayor de 5, mayor de 5,2, mayor de 5,4, mayor de 5,6, mayor de 5,8, mayor de 6, mayor de 6,2, mayor de 6,4, mayor de 6,6, mayor de 6,8, mayor de 7, mayor de 7,2, mayor de 7,4, mayor de 7,6, mayor de 7,8, mayor de 8, mayor de 8,2, mayor de 8,4, mayor de 8,6, mayor de 8,8, 9, mayor de 9,2, mayor de 9,4, mayor de 9,6, mayor de 9,8 o mayor de 10 o más en comparación con un polipéptido parental que tiene actividad fosfocetolasa (por ejemplo, una fosfocetolasa de E. gallinarum). En otras realizaciones, el índice de rendimiento celular aumenta al menos aproximadamente 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 3, 4, 5 veces o más en comparación con una molécula parental. En otras realizaciones, el índice de rendimiento celular es mayor de cualquiera de aproximadamente 0,1 a 0,5, de aproximadamente 0,25 a 0,75, de aproximadamente 0,5 a 1, de aproximadamente 0,75 a 1,25, de aproximadamente 1 a 1,5, de aproximadamente 1,25 a 1,75, de aproximadamente 1,5 a 2, de aproximadamente 1,75 a 2,25, de aproximadamente 2 a 2,5, de aproximadamente 2.25 a 2,75, de aproximadamente 2,5 a 3, de aproximadamente 2,75 a 3,25, de aproximadamente 3 a 3,5, de aproximadamente 3,25 a 3,75, de aproximadamente 3,5 a 4, de aproximadamente 3,75 a 4,25, de aproximadamente 4 a 4,5, de aproximadamente 4,25 a 4,75, de aproximadamente 4,5 a 5, de aproximadamente 4,75 a 5,25, de aproximadamente 5 a 5,5, de aproximadamente 5,25 a 5,75, de aproximadamente 5,5 a 6, de aproximadamente 6.25 a 6,75, de aproximadamente 6,5 a 7, de aproximadamente 6,75 a 7,25, de aproximadamente 7 a 7,5, de aproximadamente 7,75 a 8,25, de aproximadamente 8 a 8,5, de aproximadamente 8,25 a 8,75, de aproximadamente 8,5 a 9, de aproximadamente 8,75 a 9,25, de aproximadamente 9 a 9,5, de aproximadamente 9,25 a 9,75 o de aproximadamente 9,5 a 10 o más en comparación con una molécula parental. En otras realizaciones, el índice de rendimiento celular es mayor de cualquiera de aproximadamente 0,1 a 2, aproximadamente 1-3, aproximadamente 2-4, aproximadamente 3-5, aproximadamente 4-6, aproximadamente 5-7, aproximadamente 6-8, aproximadamente 7-9 o aproximadamente 8-10 o más en comparación con una molécula parental. En algunas realizaciones, la molécula parental es una fosfocetolasa de E. gallinarum. En otras realizaciones, la actividad intracelular aumenta al menos aproximadamente 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 veces o más.
Células recombinantes capaces de aumentar la producción de precursores de isoprenoides y/o isoprenoides
Los isoprenoides pueden producirse en muchos organismos a partir de la síntesis de las moléculas precursoras de isoprenoides, que son los productos finales de la ruta de MVA. Tal como se indicó anteriormente, los isoprenoides representan una clase importante de compuestos e incluyen, por ejemplo, complementos de alimentos y piensos, compuestos de sabor y olor, y compuestos anticancerígenos, antimaláricos, antifúngicos y antibacterianos.
Como una clase de moléculas, los isoprenoides se clasifican según el número de unidades de isopreno comprendidas en el compuesto. Los monoterpenos comprenden diez carbonos o dos unidades de isopreno, los sesquiterpenos comprenden 15 carbonos o tres unidades de isopreno, los diterpenos comprenden 20 carbonos o cuatro unidades de isopreno, los sesterterpenos comprenden 25 carbonos o cinco unidades de isopreno, y así sucesivamente. Los esteroides (que generalmente comprenden alrededor de 27 carbonos) son productos de isoprenoides escindidos o reordenados.
Los isoprenoides pueden producirse a partir de las moléculas precursoras de isoprenoides IPP y DMAPP. Estos diversos compuestos derivan de estos precursores universales bastante simples y se sintetizan por grupos de poliprenil pirofosfato sintasas conservadas (Hsieh et al., Plant Physiol. Marzo de 2011; 155 (3): 1079-90). Las diversas longitudes de cadena de estos prenil pirofosfatos lineales, que reflejan sus funciones fisiológicas distintivas, en general están determinadas por los sitios activos altamente desarrollados de las poliprenil pirofosfato sintasas a través de reacciones de condensación de sustratos alílicos (dimetilalil difosfato (Cs-DMa Pp ), geranil pirofosfato (C10-GPP), farnesil pirofosfato (C15-FPP), geranilgeranil pirofosfato (C20-GGPP)) con el número correspondiente de isopentenil pirofosfatos (C5-IPP) (Hsieh et al., Plant Physiol. Marzo de 2011; 155 (3): 1079-90).
La producción de precursores de isoprenoides y/o isoprenoides puede realizarse usando cualquiera de las células huésped recombinantes que comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica para una fosfocetolasa para aumentar la producción de precursores de isoprenoides y/o isoprenoides. En algunos aspectos, estas células comprenden además uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican para polipéptidos de la ruta de MVA, IDI y/o la ruta de DXP, tal como se describió anteriormente, y un ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido de poliprenil pirofosfato sintasa. Sin querer restringirse a la teoría, se piensa que el aumento de la producción celular de mevalonato en células recombinantes por cualquiera de las composiciones y métodos descritos anteriormente dará como resultado de manera similar la producción de cantidades más altas de moléculas precursoras de isoprenoides y/o isoprenoides. El aumento del rendimiento molar de la producción de mevalonato a partir de la glucosa se traduce en rendimientos molares mayores de moléculas precursoras de isoprenoides y/o isoprenoides, incluyendo isopreno, producido a partir de la glucosa cuando se combina con los niveles de actividad enzimática apropiados de mevalonato cinasa, fosfomevalonato cinasa, difosfomevalonato descarboxilasa, isopentil difosfato isomerasa y otras enzimas apropiadas para la producción de isopreno e isoprenoides. Las células recombinantes descritas en el presente documento que tienen diversas rutas enzimáticas manipuladas para aumentar el flujo de carbono a la producción de mevalonato pueden usarse para producir precursores de isoprenoides y/o isoprenoides. En algunos aspectos, las células recombinantes pueden modificarse por ingeniería genética adicionalmente para aumentar la actividad de uno o más de los siguientes genes seleccionados del grupo que consiste en rpiA, rpe, tktA, tal B, pta y/o eutD. En otro aspecto, estas cepas pueden modificarse por ingeniería genética adicionalmente para reducir la actividad de uno o más genes de los siguientes genes, incluyendo zwf, pfkA, fba, gapA, ackA, gltA y/o pts.
Tipos de isoprenoides
Las células recombinantes de la presente invención son capaces de aumentar la producción de isoprenoides y las moléculas precursoras de isoprenoides DMAPP e IPP. Los ejemplos de isoprenoides incluyen, sin limitación, hemiterpenoides, monoterpenoides, sesquiterpenoides, diterpenoides, sesterterpenoides, triterpenoides, tetraterpenoides y politerpenoides superiores. En algunos aspectos, el hemiterpenoide es prenol (es decir, 3-metil-2-buten-1-ol), isoprenol (es decir, 3-metil-3-buten-1-ol), 2-metil-3-buten-2-ol, o ácido isovalérico. En algunos aspectos, el monoterpenoide puede ser, sin limitación, geranil pirofosfato, eucaliptol, limoneno o pineno. En algunos aspectos, el sesquiterpenoide es farnesil pirofosfato, artemisinina o bisabolol. En algunos aspectos, el diterpenoide puede ser, sin limitación, geranilgeranil pirofosfato, retinol, retinal, fitol, taxol, forskolina o afidicolina. En algunos aspectos, el triterpenoide puede ser, sin limitación, escualeno o lanosterol. El isoprenoide también puede seleccionarse del grupo que consiste en abietadieno, amorfadieno, careno, a-farneseno, p-farneseno, farnesol, geraniol, geranilgeraniol, linalool, limoneno, mirceno, nerolidol, ocimeno, pachulol, p-pineno, sabineno, y-terpineno, terpindeno y valenceno.
En algunos aspectos, el tetraterpenoide es licopeno o caroteno (un carotenoide). Tal como se usa en el presente documento, el término “carotenoide” se refiere a un grupo de pigmentos orgánicos que se producen de manera natural producidos en los cloroplastos y cromoplastos de las plantas, de algunos otros organismos fotosintéticos, tales como algas, en algunos tipos de hongos y en algunas bacterias. Los carotenoides incluyen las xantofilas que contienen oxígeno y los carotenos que no contienen oxígeno. En algunos aspectos, los carotenoides se seleccionan del grupo que consiste en xantofilas y carotenos. En algunos aspectos, la xantofila es luteína o zeaxantina. En algunos aspectos, el carotenoide es a-caroteno, p-caroteno, y-caroteno, p-criptoxantina o licopeno.
En otras realizaciones, el isoprenoide puede ser una forma de vitamina A, tal como, sin limitación, retinol, palmitato de retinilo, ácido retinoico, alfa-caroteno, betacaroteno, gamma-caroteno o beta-criptoxantina de xantofila. En todavía otras realizaciones, el isoprenoide puede ser una forma de vitamina E, tal como, sin limitación, un tocoferol (por ejemplo, alfa-tocoferol, beta-tocoferol, gamma-tocoferol o delta-tocoferol) o un tocotrienol (por ejemplo, alfa tocotrienol, beta-tocotrienol, gamma-tocotrienol o delta-tocotrienol).
Ácidos nucleicos heterólogos que codifican para polipéptidos de poliprenil pirofosfato sintasas
En algunos aspectos de la divulgación, las células divulgadas en cualquiera de las composiciones o métodos en el presente documento comprenden además uno o más ácidos nucleicos que codifican para un polipéptido de fosfocetolasa, tal como se describió anteriormente, así como uno o más ácidos nucleicos que codifican para polipéptido(s) de poliprenil pirofosfato sintasa. El polipéptido de poliprenil pirofosfato sintasa puede ser un polipéptido endógeno. El ácido nucleico endógeno que codifica para un polipéptido de poliprenil pirofosfato sintasa puede unirse operativamente a un promotor constitutivo o puede unirse operativamente de manera similar a un promotor inducible. El ácido nucleico endógeno que codifica para un polipéptido de poliprenil pirofosfato sintasa puede además unirse operativamente a un promotor fuerte. Alternativamente, el ácido nucleico endógeno que codifica para un polipéptido de poliprenil pirofosfato sintasa puede unirse operativamente a un promotor débil. En particular, las células pueden modificarse por ingeniería genética para sobreexpresar el polipéptido de la poliprenil pirofosfato sintasa endógeno en relación con las células de tipo natural.
En algunos aspectos, el polipéptido de poliprenil pirofosfato sintasa es un polipéptido heterólogo. Las células de la presente invención pueden comprender más de una copia de un ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido de poliprenil pirofosfato de sintasa. En algunos aspectos, el ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido de poliprenil pirofosfato sintasa está unido operativamente a un promotor constitutivo. En algunos aspectos, el ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido de poliprenil pirofosfato sintasa está unido operativamente a un promotor inducible. En algunos aspectos, el ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido de poliprenil pirofosfato sintasa está unido operativamente a un promotor fuerte. En algunos aspectos, el ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido de poliprenil pirofosfato sintasa está unido operativamente a un promotor débil.
Los ácidos nucleicos que codifican para un(os) polipéptido(s) de poliprenil pirofosfato sintasa pueden integrarse en un genoma de las células huésped o pueden expresarse de manera estable en las células. Los ácidos nucleicos que codifican para un(os) polipéptido(s) de poliprenil pirofosfato sintasa pueden estar adicionalmente en un vector.
Los ácidos nucleicos de poliprenil pirofosfato sintasa a modo de ejemplo incluyen ácidos nucleicos que codifican para un polipéptido, un fragmento de un polipéptido, un péptido o un polipéptido de fusión que tiene al menos una actividad de una poliprenil pirofosfato. Los polipéptidos de la poliprenil pirofosfato sintasa convierten las moléculas precursoras de isoprenoides en compuestos isoprenoides más complejos. Los polipéptidos de poliprenil pirofosfato sintasa a modo de ejemplo incluyen polipéptidos, fragmentos de polipéptidos, péptidos y polipéptidos de fusión que tienen al menos una actividad de un polipéptido de isopreno sintasa. Los polipéptidos y ácidos nucleicos de poliprenil pirofosfato sintasa a modo de ejemplo incluyen polipéptidos y ácidos nucleicos que se producen de manera natural a partir de cualquiera de los organismos fuente descritos en el presente documento. Además, las variantes de la poliprenil pirofosfato sintetasa pueden presentar una actividad mejorada tal como una actividad enzimática mejorada. En algunos aspectos, una variante de poliprenil pirofosfato sintasa tiene otras propiedades mejoradas, tales como estabilidad mejorada (por ejemplo, estabilidad térmica) y/o solubilidad mejorada. Los ejemplos de ácidos nucleicos de poliprenil pirofosfato sintasa pueden incluir ácidos nucleicos que codifican para polipéptidos de poliprenil pirofosfato sintasa, tales como, sin limitación, geranil difosfato (GPP) sintasa, farnesil pirofosfato (FPP) sintasa y geranilgeranil pirofosfato (GGPP) sintasa, o cualquier otro polipéptido de poliprenil pirofosfato sintasa.
En algunos aspectos de la divulgación, las células divulgadas en cualquiera de las composiciones o métodos en el presente documento comprenden además uno o más ácidos nucleicos que codifican para una farnesil pirofosfato (FPP) sintasa. El polipéptido de FPP sintasa puede ser un polipéptido endógeno codificado por un gen endógeno. En algunos aspectos, el polipéptido de FPP sintasa está codificado por un gen ispA endógeno en E. coli. El ácido nucleico endógeno que codifica para un polipéptido de FPP sintasa puede estar unido operativamente a un promotor constitutivo o puede estar unido de manera similar a un promotor inducible. El ácido nucleico endógeno que codifica para un polipéptido de FPP sintasa puede además unirse operativamente a un promotor fuerte. En particular, las células pueden modificarse por ingeniería genética para sobreexpresar el polipéptido de FPP sintasa endógena en relación con las células de tipo natural.
En algunos aspectos, el polipéptido de FPP sintasa es un polipéptido heterólogo. Las células de la presente invención pueden comprender más de una copia de un ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido de FPP sintasa. En algunos aspectos, el ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido de FPP sintasa está unido operativamente a un promotor constitutivo. En algunos aspectos, el ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido de FPP sintasa está unido operativamente a un promotor inducible. En algunos aspectos, el ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido de poliprenil pirofosfato sintasa está unido operativamente a un promotor fuerte.
Los ácidos nucleicos que codifican para un polipéptido de FPP sintasa pueden integrarse en un genoma de las células huésped o pueden expresarse de manera estable en las células. Los ácidos nucleicos que codifican para una FPP sintasa también pueden estar en un vector.
Pueden usarse métodos convencionales para determinar si un polipéptido tiene actividad de polipéptido de poliprenil pirofosfato sintasa midiendo la capacidad del polipéptido para convertir IPP en isoprenoides de orden superior in vitro en un extracto celular, o in vivo. Estos métodos se conocen bien en la técnica y se describen, por ejemplo, en la patente estadounidense n.°: 7.915.026; Hsieh et al., Plant Physiol. Marzo de 2011; 155 (3): 1079-90; Danner et al., Phytochemistry. 12 de abril de 2011 [Epub antes de la impresión]; Jones et al., J. Biol Chem. 24 de marzo de 2011 [Epub antes de la impresión]; Keeling et al., BMC Plant Biol. 7 de marzo de 2011 y 11:43; Martin et al., BMC Plant Biol. 21 de octubre de 2010; 10:226; Kumeta & Ito, Plant Physiol. Diciembre de 2010; 154 (4): 1998-2007; y Kollner & Boland, J Org Chem. 20 de agosto de 2010; 75 (16): 5590-600.
Células recombinantes capaces de aumentar la producción de precursores de isoprenoides y/o isoprenoides
Las células recombinantes (por ejemplo, células bacterianas recombinantes) descritas en el presente documento (incluyendo células huésped que se han modificado por ingeniería genética para aumentar el flujo de carbono a través de la ruta de la fosfocetolasa tal como se describe en el presente documento) tienen la capacidad de producir precursores de isoprenoides y/o isoprenoides en una cantidad y/o concentración mayor que la de las mismas células que carecen de una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica para fosfocetolasa, una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido de la ruta de MVA, y uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican para un polipéptido de poliprenil pirofosfato sintasa cuando se cultivan bajo las mismas condiciones. En determinadas realizaciones, el polipéptido de fosfocetolasa es de Burkholderia phytofirmans, Lactobacillus buchneri, Bifidobacterium gallicum, Bifidobacterium dentium, Bifidobacterium bifidum y/o Clostridium acetobutylicum. En otras realizaciones, el polipéptido de fosfocetolasa es de Mycobacterium gilvum, Shewanella baltica, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus crispatus, Bifidobacterium longum, Leuconostoc citreum, Bradyrhizobium sp., Enterococcus faecium, Brucella microti, Lactobacillus salivarius, Streptococcus agalactiae, Rhodococcus imtechensis, Burkholderia xenovorans, Mycobacterium intracellulare, Nitrosomonas sp., Schizosaccharomyces pombe, Leuconostoc mesenteroides, Streptomyces sp., Lactobacillus buchneri, Streptomyces ghanaensis, Cyanothece sp. y/o Neosartorya fischeri. En otras realizaciones, el polipéptido de fosfocetolasa es de Enterococcus faecium, Listeria grayi, Enterococcus gallinarum, Enterococcus saccharolyticus, Enterococcus casseliflavus, Mycoplasma alligatoris, Carnobacterium sp., Melissococcus plutonius, Tetragenococcus halophilus y/o Mycoplasma arthritidis. En otras realizaciones, el polipéptido de fosfocetolasa es de Streptococcus agalactiae, Mycoplasma agalactiae, Streptococcus gordonii, Kingella oralis, Mycoplasma fermentans, Granulicatella adiacens, Mycoplasma hominis, Mycoplasma crocodyli, Mycobacterium bovis, Neisseria sp., Streptococcus sp., Eremococcus coleocola, Granulicatella elegans, Streptococcus parasanguinis, Aerococcus urinae, Kingella kingae, Streptococcus australis, Streptococcus criceti y/o Mycoplasma columbinum.
En una realización, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica para una fosfocetolasa aislada de Burkholderia phytofirmans. En otra realización, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica para una fosfocetolasa aislada de Lactobacillus buchneri. En todavía otra realización, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica para una fosfocetolasa aislada de Bifidobacterium gallicum. En todavía otra realización, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica para una fosfocetolasa aislada de Bifidobacterium dentium. En otra realización, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica para una fosfocetolasa aislada de Bifidobacterium bifidum. En todavía otra realización, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica para una fosfocetolasa aislada de Clostridium acetobutylicum. En otras realizaciones, las células recombinantes descritas en el presente documento comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica para una fosfocetolasa aislada de Mycobacterium gilvum, Shewanella baltica, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus crispatus, Bifidobacterium longum, Leuconostoc citreum, Bradyrhizobium sp., Enterococcus faecium, Brucella microti, Lactobacillus salivarius, Streptococcus agalactiae, Rhodococcus imtechensis, Burkholderia xenovorans, Mycobacterium intracellulare, Nitrosomonas sp., Schizosaccharomyces pombe, Leuconostoc mesenteroides, Streptomyces sp., Lactobacillus buchneri, Streptomyces ghanaensis, Cyanothece sp. y/o Neosartorya fischeri. En todavía otras realizaciones, las células recombinantes descritas en el presente documento comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica para una fosfocetolasa aislada de Enterococcus faecium, Listeria grayi, Enterococcus gallinarum, Enterococcus saccharolyticus, Enterococcus casseliflavus, Mycoplasma alligatoris, Carnobacterium sp., Melissococcus plutonius, Tetragenococcus halophilus y/o Mycoplasma arthritidis. En una realización, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica para una fosfocetolasa aislada de Streptococcus agalactiae, Mycoplasma agalactiae, Streptococcus gordonii, Kingella oralis, Mycoplasma fermentans, Granulicatella adiacens, Mycoplasma hominis, Mycoplasma crocodyli, Mycobacterium bovis, Neisseria sp., Streptococcus sp., Eremococcus coleocola, Granulicatella elegans, Streptococcus parasanguinis, Aerococcus urinae, Kingella kingae, Streptococcus australis, Streptococcus criceti y/o Mycoplasma columbinum. En otra realización, la célula recombinante es una Corynebacteria spp. (por ejemplo, C. glutamicum).
En algunos aspectos, la una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica para fosfocetolasa, una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido de la ruta de MVA, y uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican para un polipéptido de poliprenil pirofosfato sintasa son ácidos nucleicos heterólogos que se integran en la secuencia de nucleótidos cromosómicos de la célula huésped. En otros aspectos, el uno o más ácidos nucleicos heterólogos se integran en el plásmido. En aún otros aspectos, al menos uno de los uno o más ácidos nucleicos heterólogos se integra en la secuencia de nucleótidos cromosómica de la célula, mientras que al menos una de las una o más secuencias de ácido nucleico heterólogos se integra en un plásmido. Las células recombinantes pueden producir al menos un 5% de cantidades mayores de precursores de isoprenoides y/o isoprenoides en comparación con células precursoras de isoprenoides y/o productoras de isoprenoides que no comprenden el polipéptido de fosfocetolasa. Alternativamente, las células recombinantes pueden producir más de aproximadamente el 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14% el o 15% de los precursores de isoprenoides y/o isoprenoides, inclusive, así como cualquier valor numérico entre estos números.
En un aspecto de la invención, se proporcionan en el presente documento células recombinantes según se reivindican que comprenden uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican para un polipéptido de fosfocetolasa tal como se describe en el presente documento, uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican para un(os) polipéptido(s) de la ruta de mevalonato (MVA), uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican para un(os) polipéptido(s) de la ruta de DXP, y uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican para un polipéptido de poliprenil pirofosfato sintasa. Las células pueden comprender además uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican para un polipéptido de IDI. Cualquiera de los uno o más ácidos nucleicos heterólogos puede unirse operativamente a promotores constitutivos, puede unirse operativamente a promotores inducibles, o puede unirse operativamente a una combinación de promotores inducibles y constitutivos. El uno o más ácidos nucleicos heterólogos pueden unirse adicionalmente a promotores fuertes, promotores débiles y/o promotores de medios. Uno o más de los ácidos nucleicos heterólogos que codifican para fosfocetolasa, un(os) polipéptido(s) de la ruta mevalonato (MVA), un(os) polipéptido(s) de la ruta de DXP y un polipéptido de poliprenil pirofosfato sintasa pueden integrarse en un genoma de las células huésped o pueden ser estables expresado en las células. El uno o más ácidos nucleicos heterólogos pueden estar adicionalmente en un vector.
La producción de isoprenoides y/o precursores de isoprenoides por células según cualquiera de las composiciones o los métodos descritos en el presente documento puede mejorarse (por ejemplo, mejorarse por la expresión de uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican para un polipéptido de fosfocetolasa, un polipéptido de poliprenil pirofosfato sintasa, polipéptido(s) de la ruta de MVA y/o un(os) polipéptido(s) de la ruta de dXp ). Tal como se usa en el presente documento, producción de precursores de isoprenoides y/o isoprenoides “mejorada” se refiere a un índice de productividad celular aumentada (CPI) para los precursores de isoprenoides y/o isoprenoides, un título aumentado de los precursores de isoprenoides y/o isoprenoides, un mayor rendimiento másico de los precursores de isoprenoides y/o isoprenoides y/o una productividad específica aumentada de los precursores de isoprenoides y/o isoprenoides por las células descritas por cualquiera de las composiciones y métodos descritos en el presente documento en comparación con células que no tienen uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican para un péptido de fosfocetolasa. En determinadas realizaciones descritas en el presente documento, las células huésped se han modificado por ingeniería genética adicionalmente para aumentar el flujo de carbono a través de la ruta de la fosfocetolasa para la producción de E4P, GAP, Ac-P y/o acetil-CoA.
La producción de precursores de isoprenoides y/o isoprenoides por las células recombinantes descritas en el presente documento puede mejorarse en aproximadamente un 5% a aproximadamente 1.000.000 de veces. En determinados aspectos, la producción de precursores de isoprenoides y/o isoprenoides puede mejorarse en aproximadamente un 10% a aproximadamente 1.000.000 veces (por ejemplo, de aproximadamente 1 a aproximadamente 500.000 veces, de aproximadamente 1 a aproximadamente 50.000 veces, de aproximadamente 1 a aproximadamente 5.000 veces, de aproximadamente 1 a aproximadamente 1.000 veces, de aproximadamente 1 a aproximadamente 500 veces, de aproximadamente 1 a aproximadamente 100 veces, de aproximadamente 1 a aproximadamente 50 veces, de aproximadamente 5 a aproximadamente 100.000 veces, de aproximadamente 5 a aproximadamente 10.000 veces, de aproximadamente 5 a aproximadamente 1.000 veces, de aproximadamente 5 a aproximadamente 500 veces, de aproximadamente 5 a aproximadamente 100 veces, de aproximadamente 10 a aproximadamente 50.000 veces, de aproximadamente 50 a aproximadamente 10.000 veces, de aproximadamente 100 a aproximadamente 5.000 veces, de aproximadamente 200 a aproximadamente 1.000 veces, de aproximadamente 50 a aproximadamente 500 veces o de aproximadamente 50 a aproximadamente 200 veces) en comparación con la producción de precursores de isoprenoides y/o isoprenoides por células que no expresan uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican para el péptido de fosfocetolasa. En determinadas realizaciones descritas en el presente documento, las células huésped se han modificado por ingeniería genética adicionalmente para aumentar el flujo de carbono a través de la ruta de la fosfocetolasa a la producción de MVA, proporcionando así una producción mejorada de precursores de isoprenoides y/o isoprenoides en comparación con la producción de precursores de isoprenoides y/o isoprenoides por células que no expresan uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican para el péptido de fosfocetolasa y que no se han diseñado para aumentar el flujo de carbono a través de la ruta de la fosfocetolasa a la producción de mevalonato.
En otros aspectos, la producción de precursores de isoprenoides y/o isoprenoides por las células recombinantes descritas en el presente documento también puede aumentarse en al menos aproximadamente el 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%. 70%, 80%, el 90%, 1 vez, 2 veces, 5 veces, 10 veces, 20 veces, 50 veces, 100 veces, 200 veces, 500 veces, 1000 veces, 2000 veces, 5000 veces, 10.000 veces, 20.000 veces, 50.000 veces, 100.000 veces, 200.000 veces, 500.000 veces, o 1.000.000 veces en comparación con la producción de precursores de isoprenoides y/o isoprenoides por células que no expresan uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican para el péptido de fosfocetolasa. En determinadas realizaciones descritas en el presente documento, las células huésped se han modificado por ingeniería genética adicionalmente para aumentar el flujo de carbono a través de la ruta de la fosfocetolasa a la producción de MVA, proporcionando así una producción mejorada de precursores de isoprenoides y/o isoprenoides en comparación con la producción de precursores de isoprenoides y/o isoprenoides por células no expresan uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican para el péptido de fosfocetolasa y que no se han modificado por ingeniería genética para aumentar el flujo de carbono a través de la ruta de la fosfocetolasa a la producción de mevalonato.
En un aspecto de la invención, se proporcionan células recombinantes según se reivindican que comprenden uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican para un polipéptido de fosfocetolasa, uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican para uno o más polipéptidos de la ruta de MVA completa (es decir, la ruta de MVA superior y la ruta de MVA inferior), uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican para la poliprenil pirofosfato sintasa y/o uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican para un(os) polipéptido(s) de la ruta de DXP. Las células pueden comprender además uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican para un polipéptido de IDI. Además, el polipéptido de la poliprenil pirofosfato sintasa puede ser un polipéptido de FPP sintasa. En determinadas realizaciones, el polipéptido de fosfocetolasa es de Burkholderia phytofirmans, Lactobacillus buchneri, Bifidobacterium gallicum, Bifidobacterium dentium, Bifidobacterium bifidum y/o Clostridium acetobutylicum. En otras realizaciones, el polipéptido de fosfocetolasa es de Mycobacterium gilvum, Shewanella baltica, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus crispatus, Bifidobacterium longum, Leuconostoc citreum, Bradyrhizobium sp., Enterococcus faecium, Brucella microti, Lactobacillus salivarius, Streptococcus agalactiae, Rhodococcus imtechensis, Burkholderia xenovorans, Mycobacterium intracellulare, Nitrosomonas sp., Schizosaccharomyces pombe, Leuconostoc mesenteroides, Streptomyces sp., Lactobacillus buchneri, Streptomyces ghanaensis, Cyanothece sp. y/o Neosartorya fischeri. En otras realizaciones, el polipéptido de fosfocetolasa es de Enterococcus faecium, Listeria grayi, Enterococcus gallinarum, Enterococcus saccharolyticus, Enterococcus casseliflavus, Mycoplasma alligatoris, Carnobacterium sp., Melissococcus plutonius, Tetragenococcus halophilus y/o Mycoplasma arthritidis. En otras realizaciones, el polipéptido de fosfocetolasa es de Streptococcus agalactiae, Mycoplasma agalactiae, Streptococcus gordonii, Kingella oralis, Mycoplasma fermentans, Granulicatella adiacens, Mycoplasma hominis, Mycoplasma crocodyli, Mycobacterium bovis, Neisseria sp., Streptococcus sp., Eremococcus coleocola, Granulicatella elegans, Streptococcus parasanguinis, Aerococcus urinae, Kingella kingae, Streptococcus australis, Streptococcus criceti y/o Mycoplasma columbinum. En una realización, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica para una fosfocetolasa aislada de Burkholderia phytofirmans. En otra realización, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica para una fosfocetolasa aislada de Lactobacillus buchneri. En todavía otra realización, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica para una fosfocetolasa aislada de Bifidobacterium gallicum. En todavía otra realización, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica para una fosfocetolasa aislada de Bifidobacterium dentium. En otra realización, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica para una fosfocetolasa aislada de Bifidobacterium bifidum. En todavía otra realización, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica para una fosfocetolasa aislada de Clostridium acetobutylicum. En otras realizaciones, las células recombinantes descritas en el presente documento comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica para una fosfocetolasa aislada de Mycobacterium gilvum, Shewanella baltica, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus crispatus, Bifidobacterium longum, Leuconostoc citreum, Bradyrhizobium sp., Enterococcus faecium, Brucella microti, Lactobacillus salivarius, Streptococcus agalactiae, Rhodococcus imtechensis, Burkholderia xenovorans, Mycobacterium intracellulare, Nitrosomonas sp., Schizosaccharomyces pombe, Leuconostoc mesenteroides, Streptomyces sp., Lactobacillus buchneri, Streptomyces ghanaensis, Cyanothece sp. y/o Neosartorya fischeri. En todavía otras realizaciones, las células recombinantes descritas en el presente documento comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica para una fosfocetolasa aislada de Enterococcus faecium, Listeria grayi, Enterococcus gallinarum, Enterococcus saccharolyticus, Enterococcus casseliflavus, Mycoplasma alligatoris, Carnobacterium sp., Melissococcus plutonius, Tetragenococcus halophilus y/o Mycoplasma arthritidis. En una realización, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica para una fosfocetolasa aislada de Streptococcus agalactiae, Mycoplasma agalactiae, Streptococcus gordonii, Kingella oralis, Mycoplasma fermentans, Granulicatella adiacens, Mycoplasma hominis, Mycoplasma crocodyli, Mycobacterium bovis, Neisseria sp., Streptococcus sp., Eremococcus coleocola, Granulicatella elegans, Streptococcus parasanguinis, Aerococcus urinae, Kingella kingae, Streptococcus australis, Streptococcus criceti y/o Mycoplasma columbinum. En otra realización, la célula recombinante es una Corynebacteria spp. (por ejemplo, C. glutamicum). El uno o más ácidos nucleicos heterólogos pueden estar adicionalmente en uno o más vectores.
Se proporcionan en el presente documento células recombinantes que pueden proporcionar producción de precursores de isoprenoides y/o isoprenoides mejorada. La producción de precursores de isoprenoides y/o isoprenoides por células puede mejorarse mediante la expresión de uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican para un polipéptido de fosfocetolasa, uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican para uno o más polipéptidos de la ruta de MVA completa (es decir, la ruta de MVA superior y la ruta de MVA inferior) y uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican para un polipéptido de poliprenil pirofosfato sintasa. En determinadas realizaciones, el polipéptido de fosfocetolasa es de Burkholderia phytofirmans, Lactobacillus buchneri, Bifidobacterium gallicum, Bifidobacterium dentium, Bifidobacterium bifidum y/o Clostridium acetobutylicum. En otras realizaciones, el polipéptido de fosfocetolasa es de Mycobacterium gilvum, Shewanella baltica, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus crispatus, Bifidobacterium longum, Leuconostoc citreum, Bradyrhizobium sp., Enterococcus faecium, Brucella microti, Lactobacillus salivarius, Streptococcus agalactiae, Rhodococcus imtechensis, Burkholderia xenovorans, Mycobacterium intracellulare, Nitrosomonas sp., Schizosaccharomyces pombe, Leuconostoc mesenteroides, Streptomyces sp., Lactobacillus buchneri, Streptomyces ghanaensis, Cyanothece sp. y/o Neosartorya fischeri. En otras realizaciones, el polipéptido de fosfocetolasa es de Enterococcus faecium, Listeria grayi, Enterococcus gallinarum, Enterococcus saccharolyticus, Enterococcus casseliflavus, Mycoplasma alligatoris, Carnobacterium sp., Melissococcus plutonius, Tetragenococcus halophilus y/o Mycoplasma arthritidis. En otras realizaciones, el polipéptido de fosfocetolasa es de Streptococcus agalactiae, Mycoplasma agalactiae, Streptococcus gordonii, Kingella oralis, Mycoplasma fermentans, Granulicatella adiacens, Mycoplasma hominis, Mycoplasma crocodyli, Mycobacterium bovis, Neisseria sp., Streptococcus sp., Eremococcus coleocola, Granulicatella elegans, Streptococcus parasanguinis, Aerococcus urinae, Kingella kingae, Streptococcus australis, Streptococcus criceti y/o Mycoplasma columbinum. En una realización, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica para una fosfocetolasa aislada de Burkholderia phytofirmans. En otra realización, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica para una fosfocetolasa aislada de Lactobacillus buchneri. En todavía otra realización, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica para una fosfocetolasa aislada de Bifidobacterium gallicum. En todavía otra realización, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica para una fosfocetolasa aislada de Bifidobacterium dentium. En otra realización, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica para una fosfocetolasa aislada de Bifidobacterium bifidum. En todavía otra realización, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica para una fosfocetolasa aislada de Clostridium acetobutylicum. En otras realizaciones, las células recombinantes descritas en el presente documento comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica para una fosfocetolasa aislada de Mycobacterium gilvum, Shewanella baltica, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus crispatus, Bifidobacterium longum, Leuconostoc citreum, Bradyrhizobium sp., Enterococcus faecium, Brucella microti, Lactobacillus salivarius, Streptococcus agalactiae, Rhodococcus imtechensis, Burkholderia xenovorans, Mycobacterium intracellulare, Nitrosomonas sp., Schizosaccharomyces pombe, Leuconostoc mesenteroides, Streptomyces sp., Lactobacillus buchneri, Streptomyces ghanaensis, Cyanothece sp. y/o Neosartorya fischeri. En todavía otras realizaciones, las células recombinantes descritas en el presente documento comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica para una fosfocetolasa aislada de Enterococcus faecium, Listeria grayi, Enterococcus gallinarum, Enterococcus saccharolyticus, Enterococcus casseliflavus, Mycoplasma alligatoris, Carnobacterium sp., Melissococcus plutonius, Tetragenococcus halophilus y/o Mycoplasma arthritidis. En una realización, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica para una fosfocetolasa aislada de Streptococcus agalactiae, Mycoplasma agalactiae, Streptococcus gordonii, Kingella oralis, Mycoplasma fermentans, Granulicatella adiacens, Mycoplasma hominis, Mycoplasma crocodyli, Mycobacterium bovis, Neisseria sp., Streptococcus sp., Eremococcus coleocola, Granulicatella elegans, Streptococcus parasanguinis, Aerococcus urinae, Kingella kingae, Streptococcus australis, Streptococcus criceti y/o Mycoplasma columbinum. En otra realización, la célula recombinante es una Corynebacteria spp. (por ejemplo, C. glutamicum). Tal como se usa en el presente documento, producción de precursores de isoprenoides y/o isoprenoides “mejorada” se refiere a un índice de productividad celular aumentada (CPI) para la producción de precursores de isoprenoides y/o isoprenoides, un título aumentado de precursores de isoprenoides y/o isoprenoides, un rendimiento en masa aumentado de precursores de isoprenoides y/o isoprenoides y/o una productividad específica aumentada de los precursores de isoprenoides y/o isoprenoides por las células descritas por cualquiera de las composiciones y métodos descritos en el presente documento en comparación con células que no tienen uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican para una fosfocetolasa, uno o más polipéptidos de la ruta de MVA completa, y un polipéptido de poliprenil pirofosfato sintasa. La producción de precursores de isoprenoides y/o isoprenoides puede mejorarse en aproximadamente un 5% a aproximadamente 1.000.000 de veces. La producción de precursores de isoprenoides y/o isoprenoides puede mejorarse en aproximadamente un 10% a aproximadamente 1.000.000 veces (por ejemplo, de aproximadamente 1 a aproximadamente 500.000 veces, de aproximadamente 1 a aproximadamente 50.000 veces, de aproximadamente 1 a aproximadamente 5.000 veces, de aproximadamente 1 a aproximadamente 1.000 veces, de aproximadamente 1 a aproximadamente 500 veces, de aproximadamente 1 a aproximadamente 100 veces, de aproximadamente 1 a aproximadamente 50 veces, de aproximadamente 5 a aproximadamente 100.000 veces, de aproximadamente 5 a aproximadamente 10.000 veces, de aproximadamente 5 a aproximadamente 1.000 veces, de aproximadamente 5 a aproximadamente 500 veces, de aproximadamente 5 a aproximadamente 100 veces, de aproximadamente 10 a aproximadamente 50.000 veces, de aproximadamente 50 a aproximadamente 10.000 veces, de aproximadamente 100 a aproximadamente 5.000 veces, de aproximadamente 200 a aproximadamente 1.000 veces, de aproximadamente 50 a aproximadamente 500 veces o de aproximadamente 50 a aproximadamente 200 veces) en comparación con la producción de precursores de isoprenoides y/o isoprenoides por las células sin la expresión de uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican para una fosfocetolasa. En determinadas realizaciones descritas en el presente documento, las células huésped recombinantes se han modificado por ingeniería genética además para aumentar el flujo de carbono a la producción de MVA, proporcionando así una producción de isoprenoides y/o precursores de isoprenoides mejorada en comparación con la producción de isoprenoides y/o precursores de isoprenoides mediante isoprenoides y/o células productoras de precursores de isoprenoides que no expresan uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican para el polipéptido de fosfocetolasa y que no se han modificado por ingeniería genética para aumentar el flujo de carbono a la producción de mevalonato.
La producción de precursores de isoprenoides y/o isoprenoides por las células descritas en el presente documento puede mejorarse (por ejemplo, mejorarse por la expresión de uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican para los polipéptidos de fosfocetolasa de Burkholderia phytofirmans, Lactobacillus buchneri, Bifidobacterium gallicum, Bifidobacterium dentium, Bifidobacterium bifidum, Clostridium acetobutylicum, Mycobacterium gilvum, Shewanella baltica, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus crispatus, Bifidobacterium longum, Leuconostoc citreum, Bradyrhizobium sp., Enterococcus faecium, Brucella microti, Lactobacillus salivarius, Streptococcus agalactiae, Rhodococcus imtechensis, Burkholderia xenovorans, Mycobacterium intracellulare, Nitrosomonas sp., Schizosaccharomyces pombe, Leuconostoc mesenteroides, Streptomyces sp., Lactobacillus buchneri, Streptomyces ghanaensis, Cyanothece sp., Neosartorya fischeri, Enterococcus faecium, Listeria grayi, Enterococcus gallinarum, Enterococcus saccharolyticus, Enterococcus casseliflavus, Mycoplasma alligatoris, Carnobacterium sp., Melissococcus plutonius, Tetragenococcus halophilus, Mycoplasma arthritidis, Streptococcus agalactiae, Mycoplasma agalactiae, Streptococcus gordonii, Kingella oralis, Mycoplasma fermentans, Granulicatella adiacens, Mycoplasma hominis, Mycoplasma crocodyli, Mycobacterium bovis, Neisseria sp., Streptococcus sp., Eremococcus coleocola y/o Mycoplasma columbinum, uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican para un polipéptido de la ruta de mVa inferior, y uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican para un polipéptido de poliprenil pirofosfato sintasa). La producción de precursores de isoprenoides y/o isoprenoides puede mejorarse en aproximadamente un 5% a aproximadamente 1.000.000 de veces. La producción de precursores de isoprenoides y/o isoprenoides puede mejorarse en aproximadamente un 10% a aproximadamente 1.000.000 veces (por ejemplo, de aproximadamente 1 a aproximadamente 500.000 veces, de aproximadamente 1 a aproximadamente 50.000 veces, de aproximadamente 1 a aproximadamente 5.000 veces, de aproximadamente 1 a aproximadamente 1.000 veces, de aproximadamente 1 a aproximadamente 500 veces, de aproximadamente 1 a aproximadamente 100 veces, de aproximadamente 1 a aproximadamente 50 veces, de aproximadamente 5 a aproximadamente 100.000 veces, de aproximadamente 5 a aproximadamente 10.000 veces, de aproximadamente 5 a aproximadamente 1.000 veces, de aproximadamente 5 a aproximadamente 500 veces, de aproximadamente 5 a aproximadamente 100 veces, de aproximadamente 10 a aproximadamente 50.000 veces, de aproximadamente 50 a aproximadamente 10.000 veces, de aproximadamente 100 a aproximadamente 5.000 veces, de aproximadamente 200 a aproximadamente 1.000 veces, de aproximadamente 50 a aproximadamente 500 veces o de aproximadamente 50 a aproximadamente 200 veces) en comparación con la producción de precursores de isoprenoides y/o isoprenoides por células que se producen de manera natural (por ejemplo, células sin la expresión de uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican para polipéptido de fosfocetolasa de Burkholderia phytofirmans, Lactobacillus buchneri, Bifidobacterium gallicum, Bifidobacterium dentium, Bifidobacterium bifidum, Clostridium acetobutylicum, Mycobacterium gilvum, Shewanella baltica, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus crispatus, Bifidobacterium longum, Leuconostoc citreum, Bradyrhizobium sp., Enterococcus faecium, Brucella microti, Lactobacillus salivarius, Streptococcus agalactiae, Rhodococcus imtechensis, Burkholderia xenovorans, Mycobacterium intracellulare, Nitrosomonas sp., Schizosaccharomyces pombe, Leuconostoc mesenteroides, Streptomyces sp., Lactobacillus buchneri, Streptomyces ghanaensis, Cyanothece sp., Neosartorya fischeri, Enterococcus faecium, Listeria grayi, Enterococcus gallinarum, Enterococcus saccharolyticus, Enterococcus casseliflavus, Mycoplasma alligatoris, Carnobacterium sp., Melissococcus plutonius, Tetragenococcus halophilus, Mycoplasma arthritidis, Streptococcus agalactiae, Mycoplasma agalactiae, Streptococcus gordonii, Kingella oralis, Mycoplasma fermentans, Granulicatella adiacens, Mycoplasma hominis, Mycoplasma crocodyli, Mycobacterium bovis, Neisseria sp., Streptococcus sp., Eremococcus coleocola y/o Mycoplasma columbinum junto con uno o más ácidos nucleicos heterólogos que expresan uno o más péptidos de la ruta de MVA y que no se han modificado por ingeniería genética para aumentar la producción de flujo de carbono a mevalonato.
En otras realizaciones, las células recombinantes descritas en el presente documento pueden proporcionar la producción de precursores de isoprenoides y/o isoprenoides también pueden mejorarse al menos aproximadamente entre el 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%. 70%, 80%, el 90%, 1 vez, 2 veces, 5 veces, 10 veces, 20 veces, 50 veces, 100 veces, 200 veces, 500 veces, 1000 veces, 2000 veces, 5000 veces, 10.000 veces, 20.000 veces, 50.000 veces, 100.000 veces, 200.000 veces, 500.000 veces o 1.000.000 veces en comparación con la producción de precursores de isoprenoides y/o isoprenoides por precursores de isoprenoides y/o isoprenoides que producen células recombinantes que no expresan uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican para un polipéptido de fosfocetolasa.
También se proporcionan en el presente documento células recombinantes productoras de precursores de isoprenoides y/o isoprenoides capaces de aumentar el flujo de carbono a través de la ruta de la fosfocetolasa, en las que las células recombinantes comprenden: (i) una secuencia de ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa, en las que el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 65% con SEQ ID NO: 8, (ii) uno o más ácidos nucleicos que codifican para uno o más polipéptidos de la ruta de MVA completa, y (iii) uno o más ácidos nucleicos que codifican para un polipéptido de poliprenil pirofosfato sintasa, en las que dicha célula recombinante que comprende dicho polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa de (i) tiene un valor de índice de rendimiento mayor de 1,0 en uno o más de los siguientes parámetros: (a) crecimiento celular en glucosa, (b) crecimiento celular en xilosa, (c) producción de acetil-fosfato intracelular o (d) crecimiento celular en glucosa-6-fosfato. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 23. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 24. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 25. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 26. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 27. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 28. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 29. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 30. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 31. En otras realizaciones, dicho valor de índice de rendimiento para cualquiera de dichos parámetros es cualquiera de tal como mayor de 1,1, tal como mayor de 1,2, mayor de 1,4, mayor de 1,6, mayor de 1,8, mayor de 2, mayor de 2,2, mayor de 2,4, mayor de 2,6, mayor de 2,8, mayor de 3, mayor de 3,2, mayor de 3,4, mayor de 3,6, mayor de 3.8, mayor de 4, mayor de 4,2, mayor de 4,4, mayor de 4,6, mayor de 4,8, mayor de 5, mayor de 5,2, mayor de 5,4, mayor de 5,6, mayor de 5,8, mayor de 6, mayor de 6,2, mayor de 6,4, mayor de 6,6, mayor de 6,8, mayor de 7, mayor de 7,2, mayor de 7,4, mayor de 7,6, mayor de 7,8, mayor de 8, mayor de 8,2, mayor de 8,4, mayor de 8,6, mayor de 8,8, 9, mayor de 9,2, mayor de 9,4, mayor de 9,6, mayor de 9,8 o mayor de 10 o más en comparación con un polipéptido parental que tiene actividad fosfocetolasa (por ejemplo, una fosfocetolasa de E. gallinarum). En otras realizaciones, el índice de rendimiento celular aumenta al menos aproximadamente 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 3, 4, 5 veces o más en comparación con una molécula parental. En otras realizaciones, el índice de rendimiento celular es mayor de cualquiera de aproximadamente 0,1 a 0,5, de aproximadamente 0,25 a 0,75, de aproximadamente 0,5 a 1, de aproximadamente 0,75 a 1,25, de aproximadamente 1 a 1,5, de aproximadamente 1,25 a 1,75, de aproximadamente 1,5 a 2, de aproximadamente 1,75 a 2,25, de aproximadamente 2 a 2,5, de aproximadamente 2,25 a 2,75, de aproximadamente 2,5 a 3, de aproximadamente 2,75 a 3,25, de aproximadamente 3 a 3,5, de aproximadamente 3,25 a 3,75, de aproximadamente 3,5 a 4, de aproximadamente 3,75 a 4,25, de aproximadamente 4 a 4,5, de aproximadamente 4,25 a 4,75, de aproximadamente 4,5 a 5, de aproximadamente 4,75 a 5,25, de aproximadamente 5 a 5,5, de aproximadamente 5.25 a 5,75, de aproximadamente 5,5 a 6, de aproximadamente 6,25 a 6,75, de aproximadamente 6,5 a 7, de aproximadamente 6,75 a 7,25, de aproximadamente 7 a 7,5, de aproximadamente 7,75 a 8,25, de aproximadamente 8 a 8,5, de aproximadamente 8,25 a 8,75, de aproximadamente 8,5 a 9, de aproximadamente 8,75 a 9,25, de aproximadamente 9 a 9,5, de aproximadamente 9,25 a 9,75 o de aproximadamente 9,5 a 10 o más en comparación con una molécula parental. En otras realizaciones, el índice de rendimiento celular es mayor de cualquiera de aproximadamente 0,1 a 2, aproximadamente 1-3, aproximadamente 2-4, aproximadamente 3-5, aproximadamente 4­ 6, aproximadamente 5-7, aproximadamente 6-8, aproximadamente 7-9 o aproximadamente 8-10 o más en comparación con una molécula parental. En algunas realizaciones, la molécula parental es una fosfocetolasa de E. gallinarum. En otras realizaciones, la actividad intracelular aumenta al menos aproximadamente 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 veces o más.
Además, se proporcionan en el presente documento células recombinantes productoras de precursores de isoprenoides y/o isoprenoides capaces de aumentar el flujo de carbono a través de la ruta de la fosfocetolasa, en las que las células recombinantes comprenden: (i) una secuencia de ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa, en las que el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 65% con SEQ ID NO: 8, (ii) uno o más ácidos nucleicos que codifican para uno o más polipéptidos de la ruta de MVA completa, y (iii) uno o más ácidos nucleicos que codifican para un polipéptido de poliprenil pirofosfato sintasa, en las que dicho polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa de (i) tiene un valor de índice de rendimiento mayor de 1,0 en uno o más de los siguientes parámetros: (a) solubilidad de proteínas, (b) expresión de proteínas o (c) actividad específica de fructosa-6-fosfato (F6P). En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 23. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 24. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 25. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 26. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 27. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 28. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 29. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 30. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 31. En otras realizaciones, dicho valor de índice de rendimiento para cualquiera de dichos parámetros es cualquiera de tal como mayor de 1,1, tal como mayor de 1,2, mayor de 1,4, mayor de 1,6, mayor de 1.8, mayor de 2, mayor de 2,2, mayor de 2,4, mayor de 2,6, mayor de 2,8, mayor de 3, mayor de 3,2, mayor de 3,4, mayor de 3,6, mayor de 3,8, mayor de 4, mayor de 4,2, mayor de 4,4, mayor de 4,6, mayor de 4,8, mayor de 5, mayor de 5,2, mayor de 5,4, mayor de 5,6, mayor de 5,8, mayor de 6, mayor de 6,2, mayor de 6,4, mayor de 6,6, mayor de 6,8, mayor de 7, mayor de 7,2, mayor de 7,4, mayor de 7,6, mayor de 7,8, mayor de 8, mayor de 8,2, mayor de 8,4, mayor de 8,6, mayor de 8,8, 9, mayor de 9,2, mayor de 9,4, mayor de 9,6, mayor de 9,8 o mayor de 10 o más en comparación con un polipéptido parental que tiene actividad fosfocetolasa (por ejemplo, una fosfocetolasa de E. gallinarum). En otras realizaciones, el índice de rendimiento celular aumenta al menos aproximadamente 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 3, 4, 5 veces o más en comparación con una molécula parental. En otras realizaciones, el índice de rendimiento celular es mayor de cualquiera de aproximadamente 0,1 a 0,5, de aproximadamente 0,25 a 0,75, de aproximadamente 0,5 a 1, de aproximadamente 0,75 a 1,25, de aproximadamente 1 a 1,5, de aproximadamente 1,25 a 1,75, de aproximadamente 1,5 a 2, de aproximadamente 1,75 a 2,25, de aproximadamente 2 a 2,5, de aproximadamente 2.25 a 2,75, de aproximadamente 2,5 a 3, de aproximadamente 2,75 a 3,25, de aproximadamente 3 a 3,5, de aproximadamente 3,25 a 3,75, de aproximadamente 3,5 a 4, de aproximadamente 3,75 a 4,25, de aproximadamente 4 a 4,5, de aproximadamente 4,25 a 4,75, de aproximadamente 4,5 a 5, de aproximadamente 4,75 a 5,25, de aproximadamente 5 a 5,5, de aproximadamente 5,25 a 5,75, de aproximadamente 5,5 a 6, de aproximadamente 6.25 a 6,75, de aproximadamente 6,5 a 7, de aproximadamente 6,75 a 7,25, de aproximadamente 7 a 7,5, de aproximadamente 7,75 a 8,25, de aproximadamente 8 a 8,5, de aproximadamente 8,25 a 8,75, de aproximadamente 8.5 a 9, de aproximadamente 8,75 a 9,25, de aproximadamente 9 a 9,5, de aproximadamente 9,25 a 9,75 o de aproximadamente 9,5 a 10 o más en comparación con una molécula parental. En otras realizaciones, el índice de rendimiento celular es mayor de cualquiera de aproximadamente 0,1 a 2, aproximadamente 1-3, aproximadamente 2-4, aproximadamente 3-5, aproximadamente 4-6, aproximadamente 5-7, aproximadamente 6-8, aproximadamente 7-9 o aproximadamente 8-10 o más en comparación con una molécula parental. En algunas realizaciones, la molécula parental es una fosfocetolasa de E. gallinarum. En otras realizaciones, la actividad intracelular aumenta al menos aproximadamente 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 veces o más.
Además, se proporcionan en el presente documento células recombinantes productoras de precursores de isoprenoides y/o isoprenoides capaces de aumentar el flujo de carbono a través de la ruta de la fosfocetolasa, en las que las células recombinantes comprenden: (i) una secuencia de ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa, en las que el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 65% con SEQ ID NO: 11, (ii) uno o más ácidos nucleicos que codifican para uno o más polipéptidos de la ruta de MVA completa, y (iii) uno o más ácidos nucleicos que codifican para un polipéptido de poliprenil pirofosfato sintasa, en las que dicha célula recombinante que comprende dicho polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa de (i) tiene un valor de índice de rendimiento mayor de 1,0 en uno o más de los siguientes parámetros: (a) crecimiento celular en glucosa, (b) crecimiento celular en xilosa, (c) producción de acetil-fosfato intracelular o (d) crecimiento celular en glucosa-6-fosfato. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 32. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 33. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 34. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 35. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 36. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 37. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 38. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 39. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 40. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 41. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 42. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 43. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 44. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 45. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 46. En otras realizaciones, dicho valor de índice de rendimiento para cualquiera de dichos parámetros es cualquiera de tal como mayor de 1,1, tal como mayor de 1,2, mayor de 1,4, mayor de 1,6, mayor de 1,8, mayor de 2, mayor de 2,2, mayor de 2,4, mayor de 2,6, mayor de 2,8, mayor de 3, mayor de 3,2, mayor de 3,4, mayor de 3,6, mayor de 3,8, mayor de 4, mayor de 4,2, mayor de 4,4, mayor de 4,6, mayor de 4,8, mayor de 5, mayor de 5,2, mayor de 5,4, mayor de 5,6, mayor de 5,8, mayor de 6, mayor de 6,2, mayor de 6,4, mayor de 6,6, mayor de 6,8, mayor de 7, mayor de 7,2, mayor de 7,4, mayor de 7,6, mayor de 7,8, mayor de 8, mayor de 8,2, mayor de 8,4, mayor de 8,6, mayor de 8,8, 9, mayor de 9,2, mayor de 9,4, mayor de 9,6, mayor de 9,8 o mayor de 10 o más en comparación con un polipéptido parental que tiene actividad fosfocetolasa (por ejemplo, una fosfocetolasa de E. gallinarum). En otras realizaciones, el índice de rendimiento celular aumenta al menos aproximadamente 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 3, 4, 5 veces o más en comparación con una molécula parental. En otras realizaciones, el índice de rendimiento celular es mayor de cualquiera de aproximadamente 0,1 a 0,5, de aproximadamente 0,25 a 0,75, de aproximadamente 0,5 a 1, de aproximadamente 0,75 a 1,25, de aproximadamente 1 a 1,5, de aproximadamente 1,25 a 1,75, de aproximadamente 1,5 a 2, de aproximadamente 1,75 a 2,25, de aproximadamente 2 a 2,5, de aproximadamente 2.25 a 2,75, de aproximadamente 2,5 a 3, de aproximadamente 2,75 a 3,25, de aproximadamente 3 a 3,5, de aproximadamente 3,25 a 3,75, de aproximadamente 3,5 a 4, de aproximadamente 3,75 a 4,25, de aproximadamente 4 a 4,5, de aproximadamente 4,25 a 4,75, de aproximadamente 4,5 a 5, de aproximadamente 4,75 a 5,25, de aproximadamente 5 a 5,5, de aproximadamente 5,25 a 5,75, de aproximadamente 5,5 a 6, de aproximadamente 6.25 a 6,75, de aproximadamente 6,5 a 7, de aproximadamente 6,75 a 7,25, de aproximadamente 7 a 7,5, de aproximadamente 7,75 a 8,25, de aproximadamente 8 a 8,5, de aproximadamente 8,25 a 8,75, de aproximadamente 8.5 a 9, de aproximadamente 8,75 a 9,25, de aproximadamente 9 a 9,5, de aproximadamente 9,25 a 9,75 o de aproximadamente 9,5 a 10 o más en comparación con una molécula parental. En otras realizaciones, el índice de rendimiento celular es mayor de cualquiera de aproximadamente 0,1 a 2, aproximadamente 1-3, aproximadamente 2-4, aproximadamente 3-5, aproximadamente 4-6, aproximadamente 5-7, aproximadamente 6-8, aproximadamente 7-9 o aproximadamente 8-10 o más en comparación con una molécula parental. En algunas realizaciones, la molécula parental es una fosfocetolasa de E. gallinarum. En otras realizaciones, la actividad intracelular aumenta al menos aproximadamente 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 veces o más.
Se proporcionan en el presente documento células precursoras isoprenoides y/o recombinantes productoras de isoprenoides capaces de aumentar el flujo de carbono a través de la ruta de la fosfocetolasa, en las que las células recombinantes comprenden: (i) una secuencia de ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa, en las que el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 65% con SEQ ID NO: 11, (ii) uno o más ácidos nucleicos que codifican para uno o más polipéptidos de la ruta de MVA completa, y (iii) uno o más ácidos nucleicos que codifican para un polipéptido de poliprenil pirofosfato sintasa, en las que dicho polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa de (i) tiene un valor de índice de rendimiento mayor de 1,0 en uno o más de los siguientes parámetros: (a) solubilidad de proteínas, (b) expresión de proteínas o (c) actividad específica de fructosa-6-fosfato (F6P). En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 32. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 33. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 34. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 35. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 36. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 37. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 38. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 39. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 40. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 41. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 42. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 43. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 44. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 45. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 46. En otras realizaciones, dicho valor de índice de rendimiento para cualquiera de dichos parámetros es cualquiera de tal como mayor de 1,1, tal como mayor de 1,2, mayor de 1,4, mayor de 1,6, mayor de 1,8, mayor de 2, mayor de 2,2, mayor de 2,4, mayor de 2,6, mayor de 2,8, mayor de 3, mayor de 3,2, mayor de 3,4, mayor de 3,6, mayor de 3,8, mayor de 4, mayor de 4,2, mayor de 4,4, mayor de 4,6, mayor de 4,8, mayor de 5, mayor de 5,2, mayor de 5,4, mayor de 5,6, mayor de 5,8, mayor de 6, mayor de 6,2, mayor de 6,4, mayor de 6,6, mayor de 6,8, mayor de 7, mayor de 7,2, mayor de 7,4, mayor de 7,6, mayor de 7,8, mayor de 8, mayor de 8,2, mayor de 8,4, mayor de 8,6, mayor de 8,8, 9, mayor de 9,2, mayor de 9,4, mayor de 9,6, mayor de 9,8 o mayor de 10 o más en comparación con un polipéptido parental que tiene actividad fosfocetolasa (por ejemplo, una fosfocetolasa de E. gallinarum). En otras realizaciones, el índice de rendimiento celular aumenta al menos aproximadamente 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 3, 4, 5 veces o más en comparación con una molécula parental. En otras realizaciones, el índice de rendimiento celular es mayor de cualquiera de aproximadamente 0,1 a 0,5, de aproximadamente 0,25 a 0,75, de aproximadamente 0,5 a 1, de aproximadamente 0,75 a 1,25, de aproximadamente 1 a 1,5, de aproximadamente 1.25 a 1,75, de aproximadamente 1,5 a 2, de aproximadamente 1,75 a 2,25, de aproximadamente 2 a 2,5, de aproximadamente 2,25 a 2,75, de aproximadamente 2,5 a 3, de aproximadamente 2,75 a 3,25, de aproximadamente 3 a 3,5, de aproximadamente 3,25 a 3,75, de aproximadamente 3,5 a 4, de aproximadamente 3,75 a 4,25, de aproximadamente 4 a 4,5, de aproximadamente 4,25 a 4,75, de aproximadamente 4,5 a 5, de aproximadamente 4,75 a 5,25, de aproximadamente 5 a 5,5, de aproximadamente 5,25 a 5,75, de aproximadamente 5,5 a 6, de aproximadamente 6,25 a 6,75, de aproximadamente 6,5 a 7, de aproximadamente 6,75 a 7,25, de aproximadamente 7 a 7,5, de aproximadamente 7,75 a 8,25, de aproximadamente 8 a 8,5, de aproximadamente 8,25 a 8,75, de aproximadamente 8,5 a 9, de aproximadamente 8,75 a 9,25, de aproximadamente 9 a 9,5, de aproximadamente 9.25 a 9,75 o de aproximadamente 9,5 a 10 o más en comparación con una molécula parental. En otras realizaciones, el índice de rendimiento celular es mayor de cualquiera de aproximadamente 0,1 a 2, aproximadamente 1-3, aproximadamente 2-4, aproximadamente 3-5, aproximadamente 4-6, aproximadamente 5-7, aproximadamente 6-8, aproximadamente 7-9 o aproximadamente 8-10 o más en comparación con una molécula parental. En algunas realizaciones, la molécula parental es una fosfocetolasa de E. gallinarum. En otras realizaciones, la actividad intracelular aumenta al menos aproximadamente 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 veces o más.
Métodos de uso de las células recombinantes para producir isoprenoides y/o moléculas precursoras de isoprenoides
También se proporcionan en el presente documento métodos de producción de moléculas precursoras de isoprenoides y/o isoprenoides que comprenden cultivar células recombinantes (por ejemplo, células bacterianas recombinantes) que comprenden uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican para una fosfocetolasa y un polipéptido de poliprenil pirofosfato sintasa. En determinadas realizaciones, las células recombinantes comprenden además uno o más uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican para un polipéptido de la ruta de MVA superior y un polipéptido de la ruta de MVA inferior. Las moléculas precursoras de isoprenoides y/o los isoprenoides pueden producirse a partir de cualquiera de las células descritas en el presente documento y según cualquiera de los métodos descritos en el presente documento. Cualquiera de las células puede usarse con el propósito de producir moléculas precursoras de isoprenoides y/o isoprenoides a partir de hidratos de carbono, incluyendo azúcares de seis carbonos, tales como glucosa.
En determinados aspectos, se proporcionan en el presente documento métodos para producir moléculas precursoras de isoprenoides y/o isoprenoides que comprenden cultivar células recombinantes que comprenden uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican para un polipéptido de fosfocetolasa de Burkholderia phytofirmans, Lactobacillus buchneri, Bifidobacterium gallicum, Bifidobacterium dentium, Bifidobacterium bifidum, Clostridium acetobutylicum, Mycobacterium gilvum, Shewanella baltica, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus crispatus, Bifidobacterium longum, Leuconostoc citreum, Bradyrhizobium sp., Enterococcus faecium, Brucella microti, Lactobacillus salivarius, Streptococcus agalactiae, Rhodococcus imtechensis, Burkholderia xenovorans, Mycobacterium intracellulare, Nitrosomonas sp., Schizosaccharomyces pombe, Leuconostoc mesenteroides, Streptomyces sp., Lactobacillus buchneri, Streptomyces ghanaensis, Cyanothece sp., Neosartorya fischeri, Enterococcus faecium, Listeria grayi, Enterococcus gallinarum, Enterococcus saccharolyticus, Enterococcus casseliflavus, Mycoplasma alligatoris, Carnobacterium sp., Melissococcus plutonius, Tetragenococcus halophilus, Mycoplasma arthritidis, Streptococcus agalactiae, Mycoplasma agalactiae, Streptococcus gordonii, Kingella oralis, Mycoplasma fermentans, Granulicatella adiacens, Mycoplasma hominis, Mycoplasma crocodyli, Mycobacterium bovis, Neisseria sp., Streptococcus sp., Eremococcus coleocola y/o Mycoplasma columbinum, un polipéptido de mvaS y mvaE de L. grayi, E. faecium, E. gallinarum, E. casseliflavus y/o E. faecalis, en una condición adecuada para producir moléculas precursoras de isoprenoides y/o isoprenoides, y (b) producir moléculas precursoras de isoprenoides y/o isoprenoides. Las células pueden comprender además una o más moléculas de ácido nucleico que codifican para el/los polipéptido(s) de la ruta de MVA inferior descrito(s) anteriormente (por ejemplo, MVK, PMK, MVD y/o IDI) y cualquiera de los polipéptidos de poliprenil pirofosfato sintasa descritos anteriormente. En algunos aspectos, las células recombinantes pueden ser cualquiera de las células descritas en el presente documento. Cualquiera de la poliprenil pirofosfato sintasa o sus variantes descritas en el presente documento, cualquiera de las cepas de células huésped descritas en el presente documento, cualquiera de los promotores descritos en el presente documento y/o cualquiera de los vectores descritos en el presente documento también pueden usarse para producir moléculas precursoras de isoprenoides y/o isoprenoides usando cualquiera de las fuentes de energía (por ejemplo, glucosa o cualquier otro azúcar de seis carbonos) descritas en el presente documento. En algunos aspectos, el método para producir moléculas precursoras de isoprenoides y/o isoprenoides comprende además una etapa de recuperación de las moléculas de precursores de isoprenoides y/o isoprenoides.
En determinados aspectos, se proporcionan en el presente documento métodos para producir moléculas precursoras de isoprenoides y/o isoprenoides que comprenden cultivar células recombinantes que comprenden uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican para un polipéptido de fosfocetolasa de Burkholderia phytofirmans, Lactobacillus buchneri, Bifidobacterium gallicum, Bifidobacterium dentium, Bifidobacterium bifidum, Clostridium acetobutylicum, Mycobacterium gilvum, Shewanella baltica, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus crispatus, Bifidobacterium longum, Leuconostoc citreum, Bradyrhizobium sp., Enterococcus faecium, Brucella microti, Lactobacillus salivarius, Streptococcus agalactiae, Rhodococcus imtechensis, Burkholderia xenovorans, Mycobacterium intracellulare, Nitrosomonas sp., Schizosaccharomyces pombe, Leuconostoc mesenteroides, Streptomyces sp., Lactobacillus buchneri, Streptomyces ghanaensis, Cyanothece sp., Neosartorya fischeri, Enterococcus faecium, Listeria grayi, Enterococcus gallinarum, Enterococcus saccharolyticus, Enterococcus casseliflavus, Mycoplasma alligatoris, Carnobacterium sp., Melissococcus plutonius, Tetragenococcus halophilus, Mycoplasma arthritidis, Streptococcus agalactiae, Mycoplasma agalactiae, Streptococcus gordonii, Kingella oralis, Mycoplasma fermentans, Granulicatella adiacens, Mycoplasma hominis, Mycoplasma crocodyli, Mycobacterium bovis, Neisseria sp., Streptococcus sp., Eremococcus coleocola y/o Mycoplasma columbinum, un polipéptido de mvaS y mvaE de L. grayi, E. faecium, E. gallinarum, E. casseliflavus y/o E. faecalis, en una condición adecuada para producir moléculas precursoras de isoprenoides y/o isoprenoides, y (b) producir moléculas precursoras de isoprenoides y/o isoprenoides. Las células pueden comprender además una o más moléculas de ácido nucleico que codifican para el/los polipéptido(s) de la ruta de MVA inferior descrito(s) anteriormente (por ejemplo, MVK, p Mk , MVD y/o IDI) y cualquiera de los polipéptidos de poliprenil pirofosfato sintasa descritos anteriormente. En algunos aspectos, las células recombinantes pueden ser cualquiera de las células descritas en el presente documento. Cualquiera de la poliprenil pirofosfato sintasa o sus variantes descritas en el presente documento, cualquiera de las cepas de células huésped descritas en el presente documento, cualquiera de los promotores descritos en el presente documento y/o cualquiera de los vectores descritos en el presente documento también pueden usarse para producir moléculas precursoras de isoprenoides y/o isoprenoides usando cualquiera de las fuentes de energía (por ejemplo, glucosa o cualquier otro azúcar de seis carbonos) descritas en el presente documento. En algunos aspectos, el método para producir moléculas precursoras de isoprenoides y/o isoprenoides comprende además una etapa de recuperación de las moléculas de precursores de isoprenoides y/o isoprenoides.
El método para producir moléculas precursoras de isoprenoides y/o isoprenoides puede comprender de manera similar las etapas de: (a) cultivar células recombinantes (incluyendo, pero sin limitarse a, células de E. coli) que no tienen una fosfocetolasa en forma endógena, en el que las células recombinantes expresan de manera heteróloga una o más copias de un gen que codifica para un polipéptido de fosfocetolasa; y (b) producir moléculas precursoras de isoprenoides y/o isoprenoides, en el que las células recombinantes producen cantidades aumentadas de precursores de isoprenoides y/o isoprenoides cuando se comparan con isoprenoides y/o células productoras de precursores de isoprenoides que no comprenden el polipéptido de fosfocetolasa.
Los métodos actuales para la producción de moléculas precursoras de isoprenoides y/o isoprenoides pueden producir al menos un 5% de cantidades mayores de precursores de isoprenoides y/o isoprenoides cuando se comparan con células recombinantes productoras de precursores de isoprenoides y/o isoprenoides que no comprenden un polipéptido de fosfocetolasa. Alternativamente, las células recombinantes pueden producir más de aproximadamente el 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14% o el 15% de los precursores de isoprenoides y/o isoprenoides, inclusive. En algunos aspectos, el método para producir moléculas precursoras de isoprenoides y/o isoprenoides comprende además una etapa de recuperación de las moléculas de precursores de isoprenoides y/o isoprenoides.
Se proporcionan en el presente documento métodos para usar cualquiera de las células descritas anteriormente para la producción mejorada de moléculas precursoras de isoprenoides y/o isoprenoides. La producción de moléculas precursoras de isoprenoides y/o isoprenoides por células puede mejorarse mediante la expresión de uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican para fosfocetolasa y/o los polipéptidos de mvaE y mvaS de L. grayi, E. faecium, E. gallinarum, E. casseliflavus y/o E. faecalis, uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican para un polipéptido de la ruta de MVA inferior, y uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican para un polipéptido de poliprenil pirofosfato sintasa. Tal como se usa en el presente documento, producción de precursores de isoprenoides y/o isoprenoides “mejorada” se refiere a un índice de productividad celular aumentada (CPI) para la producción de precursores de isoprenoides y/o isoprenoides, un título aumentado de precursores de isoprenoides y/o isoprenoides, un rendimiento en masa aumentado de precursores de isoprenoides y/o isoprenoides y/o una productividad específica aumentada de los precursores de isoprenoides y/o isoprenoides por las células descritas por cualquiera de las composiciones y métodos descritos en el presente documento en comparación con células que no tienen uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican para una fosfocetolasa, un polipéptido de poliprenil pirofosfato sintasa, un(os) polipéptido(s) de la ruta de MVA inferior, los polipéptidos de mvaE y mvaS de L. grayi, E. faecium, E. gallinarum, E. casseliflavus. La producción de moléculas precursoras de isoprenoides y/o isoprenoides puede aumentarse en aproximadamente un 5% a aproximadamente 1.000.000 de veces. La producción de moléculas precursoras de isoprenoides y/o isoprenoides puede mejorarse en aproximadamente un 10% a aproximadamente 1.000.000 de veces (por ejemplo, aproximadamente 1 a aproximadamente 500.000 veces, de aproximadamente 1 a aproximadamente 50.000 veces, de aproximadamente 1 a aproximadamente 5.000 veces, de aproximadamente 1 a aproximadamente 1.000 veces, de aproximadamente 1 a aproximadamente 500 veces, de aproximadamente 1 a aproximadamente 100 veces, de aproximadamente 1 a aproximadamente 50 veces, de aproximadamente 5 a aproximadamente 100.000 veces, de aproximadamente 5 a aproximadamente 10.000 veces, de aproximadamente 5 a aproximadamente 1.000 veces, de aproximadamente 5 a aproximadamente 500 veces, de aproximadamente 5 a aproximadamente 100 veces, de aproximadamente 10 a aproximadamente 50.000 veces, de aproximadamente 50 a aproximadamente 10.000 veces, de aproximadamente 100 a aproximadamente 5.000 veces, de aproximadamente 200 a aproximadamente 1.000 veces, de aproximadamente 50 a aproximadamente 500 veces o de aproximadamente 50 a aproximadamente 200 veces) en comparación con la producción de moléculas precursoras de isoprenoides y/o isoprenoides por células sin la expresión de uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican para un polipéptido de fosfocetolasa. En determinadas realizaciones descritas en el presente documento, los métodos comprenden células huésped recombinantes que se han modificado por ingeniería genética adicionalmente para aumentar el flujo de carbono a la producción de MVA, proporcionando así una producción de isoprenoides y/o precursores de isoprenoides mejorada en comparación con la producción de isoprenoides y/o precursores de isoprenoides mediante isoprenoides y/o células productoras de precursores de isoprenoides que no expresan uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican para el péptido de fosfocetolasa y que no se han modificado por ingeniería genética para aumentar el flujo de carbono a la producción de mevalonato.
La producción de moléculas precursoras de isoprenoides y/o isoprenoides también puede mejorarse mediante los métodos descritos en el presente documento en al menos aproximadamente el 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, el 90%, 1 vez, 2 veces, 5 veces, 10 veces, 20 veces, 50 veces, 100 veces, 200 veces, 500 veces, 1000 veces, 2000 veces, 5000 veces, 10.000 veces, 20.000 veces, 50.000 veces, 100.000 veces, 200.000 veces, 500.000 veces, o 1.000.000 veces en comparación con la producción de moléculas precursoras de isoprenoides y/o isoprenoides por precursores de isoprenoides y/o células productoras de isoprenoides sin la expresión de uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican para un polipéptido de fosfocetolasa. En determinadas realizaciones descritas en el presente documento, los métodos comprenden células huésped recombinantes que se han modificado por ingeniería genética adicionalmente para aumentar el flujo de carbono a la producción de MVA, proporcionando así una producción de isoprenoides y/o precursores de isoprenoides mejorada en comparación con la producción de isoprenoides y/o precursores de isoprenoides mediante isoprenoides y/o células productoras de precursores de isoprenoides que no expresan uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican para el péptido de fosfocetolasa y que no se han modificado por ingeniería genética para aumentar el flujo de carbono a la producción de mevalonato.
Además, pueden usarse condiciones de cultivo celular más específicas para cultivar las células en los métodos descritos en el presente documento. Por ejemplo, en algunos aspectos, el método para la producción de moléculas precursoras de isoprenoides y/o isoprenoides comprende las etapas de (a) cultivar células recombinantes (incluyendo, pero sin limitarse a, células de E. coli) que comprenden un ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido de fosfocetolasa y que no tienen de manera endógena un gen mvaE y un gen mvaS de L. grayi, E. faecium, E. gallinarum, E. casseliflavus y/o E. faecalis en medio mínimo a 34°C, en el que las células recombinantes expresan de manera heteróloga una o más copias de un gen que codifica para un polipéptido de fosfocetolasa de Burkholderia phytofirmans, Lactobacillus buchneri, Bifidobacterium gallicum, Bifidobacterium dentium, Bifidobacterium bifidum, Clostridium acetobutylicum, Mycobacterium gilvum, Shewanella baltica, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus crispatus, Bifidobacterium longum, Leuconostoc citreum, Bradyrhizobium sp., Enterococcus faecium, Brucella microti, Lactobacillus salivarius, Streptococcus agalactiae, Rhodococcus imtechensis, Burkholderia xenovorans, Mycobacterium intracellulare, Nitrosomonas sp., Schizosaccharomyces pombe, Leuconostoc mesenteroides, Streptomyces sp., Lactobacillus buchneri, Streptomyces ghanaensis, Cyanothece sp., Neosartorya fischeri, Enterococcus faecium, Listeria grayi, Enterococcus gallinarum, Enterococcus saccharolyticus, Enterococcus casseliflavus, Mycoplasma alligatoris, Carnobacterium sp., Melissococcus plutonius, Tetragenococcus halophilus, Mycoplasma arthritidis, Streptococcus agalactiae, Mycoplasma agalactiae, Streptococcus gordonii, Kingella oralis, Mycoplasma fermentans, Granulicatella adiacens, Mycoplasma hominis, Mycoplasma crocodyli, Mycobacterium bovis, Neisseria sp., Streptococcus sp., Eremococcus coleocola y/o Mycoplasma columbinum en un plásmido de número de copias bajo a medio y bajo el control de un promotor fuerte; y (b) producir moléculas precursoras de isoprenoides y/o isoprenoides. En algunos aspectos, los métodos comprenden además una etapa de recuperación de las moléculas precursoras de isoprenoides y/o isoprenoides.
También se proporcionan en el presente documento métodos de producción de precursores de isoprenoides y/o isoprenoides que comprenden cultivar células recombinantes capaces de aumentar el flujo de carbono a través de la ruta de la fosfocetolasa, en los que las células recombinantes comprenden: (i) una secuencia de ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa, en los que el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 65% con SEQ ID NO: 8, (ii) uno o más ácidos nucleicos que codifican para uno o más polipéptidos de la ruta de MVA completa, y (iii) uno o más ácidos nucleicos que codifican para un polipéptido de poliprenil pirofosfato sintasa, en los que dicha célula recombinante que comprende dicho polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa de (i) tiene un valor de índice de rendimiento mayor de 1,0 en uno o más de los siguientes parámetros: (a) crecimiento celular en glucosa, (b) crecimiento celular en xilosa, (c) producción de acetilfosfato intracelular o (d) crecimiento celular en glucosa-6-fosfato y producción de precursores de isoprenoides y/o isoprenoides. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 23. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 24. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 25. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 26. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 27. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 28. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 29. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 30. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 31. En otras realizaciones, dicho valor de índice de rendimiento para cualquiera de dichos parámetros es cualquiera de tal como mayor de 1,1, tal como mayor de 1,2, mayor de 1,4, mayor de 1,6, mayor de 1,8, mayor de 2, mayor de 2,2, mayor de 2,4, mayor de 2,6, mayor de 2,8, mayor de 3, mayor de 3,2, mayor de 3,4, mayor de 3,6, mayor de 3,8, mayor de 4, mayor de 4,2, mayor de 4,4, mayor de 4,6, mayor de 4,8, mayor de 5, mayor de 5,2, mayor de 5,4, mayor de 5,6, mayor de 5,8, mayor de 6, mayor de 6,2, mayor de 6,4, mayor de 6,6, mayor de 6,8, mayor de 7, mayor de 7,2, mayor de 7,4, mayor de 7,6, mayor de 7,8, mayor de 8, mayor de 8,2, mayor de 8,4, mayor de 8,6, mayor de 8,8, 9, mayor de 9,2, mayor de 9,4, mayor de 9,6, mayor de 9,8 o mayor de 10 o más en comparación con un polipéptido parental que tiene actividad fosfocetolasa (por ejemplo, una fosfocetolasa de E. gallinarum). En otras realizaciones, el índice de rendimiento celular aumenta al menos aproximadamente 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 3, 4, 5 veces o más en comparación con una molécula parental. En otras realizaciones, el índice de rendimiento celular es mayor de cualquiera de aproximadamente 0,1 a 0,5, de aproximadamente 0,25 a 0,75, de aproximadamente 0,5 a 1, de aproximadamente 0,75 a 1,25, de aproximadamente 1 a 1,5, de aproximadamente 1,25 a 1,75, de aproximadamente 1,5 a 2, de aproximadamente 1,75 a 2,25, de aproximadamente 2 a 2,5, de aproximadamente 2,25 a 2,75, de aproximadamente 2,5 a 3, de aproximadamente 2,75 a 3,25, de aproximadamente 3 a 3,5, de aproximadamente 3,25 a 3,75, de aproximadamente 3,5 a 4, de aproximadamente 3,75 a 4,25, de aproximadamente 4 a 4,5, de aproximadamente 4,25 a 4,75, de aproximadamente 4,5 a 5, de aproximadamente 4,75 a 5,25, de aproximadamente 5 a 5,5, de aproximadamente 5,25 a 5,75, de aproximadamente 5,5 a 6, de aproximadamente 6,25 a 6,75, de aproximadamente 6,5 a 7, de aproximadamente 6,75 a 7,25, de aproximadamente 7 a 7,5, de aproximadamente 7,75 a 8,25, de aproximadamente 8 a 8,5, de aproximadamente 8,25 a 8,75, de aproximadamente 8,5 a 9, de aproximadamente 8,75 a 9,25, de aproximadamente 9 a 9,5, de aproximadamente 9,25 a 9,75 o de aproximadamente 9,5 a 10 o más en comparación con una molécula parental. En otras realizaciones, el índice de rendimiento celular es mayor de cualquiera de aproximadamente 0,1 a 2, aproximadamente 1-3, aproximadamente 2-4, aproximadamente 3-5, aproximadamente 4-6, aproximadamente 5-7, aproximadamente 6-8, aproximadamente 7-9 o aproximadamente 8-10 o más en comparación con una molécula parental. En algunas realizaciones, la molécula parental es una fosfocetolasa de E. gallinarum. En otras realizaciones, la actividad intracelular aumenta al menos aproximadamente 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 veces o más.
Adicionalmente, se proporcionan en el presente documento métodos para producir precursores de isoprenoides y/o isoprenoides que comprenden cultivar células recombinantes capaces de aumentar el flujo de carbono a través de la ruta de la fosfocetolasa, en los que las células recombinantes comprenden: (i) una secuencia de ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa, en los que el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 65% con SEQ ID NO: 8, (ii) uno o más ácidos nucleicos que codifican para uno o más polipéptidos de la ruta de MVA completa, y (iii) uno o más ácidos nucleicos que codifican para un polipéptido de poliprenil pirofosfato sintasa, en los que dicho polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa de (i) tiene un valor de índice de rendimiento mayor de 1,0 en uno o más de los siguientes parámetros: (a) solubilidad de proteínas, (b) expresión de proteínas, o (c) actividad específica de fructosa-6-fosfato (F6P) y producción de precursores de isoprenoides y/o isoprenoides. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 23. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 24. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 25. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 26. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 27. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 28. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 29. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 30. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 31. En otras realizaciones, dicho valor de índice de rendimiento para cualquiera de dichos parámetros es cualquiera de tal como mayor de 1,1, tal como mayor de 1,2, mayor de 1,4, mayor de 1,6, mayor de 1,8, mayor de 2, mayor de 2,2, mayor de 2,4, mayor de 2,6, mayor de 2,8, mayor de 3, mayor de 3,2, mayor de 3,4, mayor de 3,6, mayor de 3,8, mayor de 4, mayor de 4,2, mayor de 4,4, mayor de 4,6, mayor de 4,8, mayor de 5, mayor de 5,2, mayor de 5,4, mayor de 5,6, mayor de 5,8, mayor de 6, mayor de 6,2, mayor de 6,4, mayor de 6,6, mayor de 6,8, mayor de 7, mayor de 7,2, mayor de 7,4, mayor de 7,6, mayor de 7,8, mayor de 8, mayor de 8,2, mayor de 8,4, mayor de 8,6, mayor de 8,8, 9, mayor de 9,2, mayor de 9,4, mayor de 9,6, mayor de 9,8 o mayor de 10 o más en comparación con un polipéptido parental que tiene actividad fosfocetolasa (por ejemplo, una fosfocetolasa de E. gallinarum). En otras realizaciones, el índice de rendimiento celular aumenta al menos aproximadamente 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 3, 4, 5 veces o más en comparación con una molécula parental. En otras realizaciones, el índice de rendimiento celular es mayor de cualquiera de aproximadamente 0,1 a 0,5, de aproximadamente 0,25 a 0,75, de aproximadamente 0,5 a 1, de aproximadamente 0,75 a 1,25, de aproximadamente 1 a 1,5, de aproximadamente 1,25 a 1,75, de aproximadamente 1,5 a 2, de aproximadamente 1,75 a 2,25, de aproximadamente 2 a 2,5, de aproximadamente 2,25 a 2,75, de aproximadamente 2.5 a 3, de aproximadamente 2,75 a 3,25, de aproximadamente 3 a 3,5, de aproximadamente 3,25 a 3,75, de aproximadamente 3,5 a 4, de aproximadamente 3,75 a 4,25, de aproximadamente 4 a 4,5, de aproximadamente 4,25 a 4,75, de aproximadamente 4,5 a 5, de aproximadamente 4,75 a 5,25, de aproximadamente 5 a 5,5, de aproximadamente 5,25 a 5,75, de aproximadamente 5,5 a 6, de aproximadamente 6,25 a 6,75, de aproximadamente 6.5 a 7, de aproximadamente 6,75 a 7,25, de aproximadamente 7 a 7,5, de aproximadamente 7,75 a 8,25, de aproximadamente 8 a 8,5, de aproximadamente 8,25 a 8,75, de aproximadamente 8,5 a 9, de aproximadamente 8,75 a 9,25, de aproximadamente 9 a 9,5, de aproximadamente 9,25 a 9,75 o de aproximadamente 9,5 a 10 o más en comparación con una molécula parental. En otras realizaciones, el índice de rendimiento celular es mayor de cualquiera de aproximadamente 0,1 a 2, aproximadamente 1-3, aproximadamente 2-4, aproximadamente 3-5, aproximadamente 4-6, aproximadamente 5-7, aproximadamente 6-8, aproximadamente 7-9 o aproximadamente 8­ 10 o más en comparación con una molécula parental. En algunas realizaciones, la molécula parental es una fosfocetolasa de E. gallinarum. En otras realizaciones, la actividad intracelular aumenta al menos aproximadamente 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 veces o más.
Además, se proporcionan en el presente documento métodos para producir precursores de isoprenoides y/o isoprenoides que comprenden cultivar células recombinantes capaces de aumentar el flujo de carbono a través de la ruta de la fosfocetolasa, en los que las células recombinantes comprenden: (i) una secuencia de ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa, en los que el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 65% con SEQ ID NO: 11, (ii) uno o más ácidos nucleicos que codifican para uno o más polipéptidos de la ruta de MVA completa, y (iii) uno o más ácidos nucleicos que codifican para un polipéptido de poliprenil pirofosfato sintasa, en los que dicha célula recombinante que comprende dicho polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa de (i) tiene un valor de índice de rendimiento mayor de 1,0 en uno o más de los siguientes parámetros: (a) crecimiento celular en glucosa, (b) crecimiento celular en xilosa, (c) producción de acetilfosfato intracelular o (d) crecimiento celular en glucosa-6-fosfato y producción de precursores de isoprenoides y/o isoprenoides. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 32. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 33. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 34. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 35. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 36. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 37. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 38. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 39. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 40. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 41. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 42. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 43. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 44. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 45. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 46. En otras realizaciones, dicho valor de índice de rendimiento para cualquiera de dichos parámetros es cualquiera de tal como mayor de 1,1, tal como mayor de 1,2, mayor de 1,4, mayor de 1,6, mayor de 1,8, mayor de 2, mayor de 2,2, mayor de 2,4, mayor de 2,6, mayor de 2,8, mayor de 3, mayor de 3,2, mayor de 3,4, mayor de 3,6, mayor de 3,8, mayor de 4, mayor de 4,2, mayor de 4,4, mayor de 4,6, mayor de 4,8, mayor de 5, mayor de 5,2, mayor de 5,4, mayor de 5,6, mayor de 5,8, mayor de 6, mayor de 6,2, mayor de 6,4, mayor de 6,6, mayor de 6,8, mayor de 7, mayor de 7,2, mayor de 7,4, mayor de 7,6, mayor de 7,8, mayor de 8, mayor de 8,2, mayor de 8,4, mayor de 8,6, mayor de 8,8, 9, mayor de 9,2, mayor de 9,4, mayor de 9,6, mayor de 9,8 o mayor de 10 o más en comparación con un polipéptido parental que tiene actividad fosfocetolasa (por ejemplo, una fosfocetolasa de E. gallinarum). En otras realizaciones, el índice de rendimiento celular aumenta al menos aproximadamente 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 3, 4, 5 veces o más en comparación con una molécula parental. En otras realizaciones, el índice de rendimiento celular es mayor de cualquiera de aproximadamente 0,1 a 0,5, de aproximadamente 0,25 a 0,75, de aproximadamente 0,5 a 1, de aproximadamente 0,75 a 1,25, de aproximadamente 1 a 1,5, de aproximadamente 1,25 a 1,75, de aproximadamente 1,5 a 2, de aproximadamente 1,75 a 2,25, de aproximadamente 2 a 2,5, de aproximadamente 2.25 a 2,75, de aproximadamente 2,5 a 3, de aproximadamente 2,75 a 3,25, de aproximadamente 3 a 3,5, de aproximadamente 3,25 a 3,75, de aproximadamente 3,5 a 4, de aproximadamente 3,75 a 4,25, de aproximadamente 4 a 4,5, de aproximadamente 4,25 a 4,75, de aproximadamente 4,5 a 5, de aproximadamente 4,75 a 5,25, de aproximadamente 5 a 5,5, de aproximadamente 5,25 a 5,75, de aproximadamente 5,5 a 6, de aproximadamente 6.25 a 6,75, de aproximadamente 6,5 a 7, de aproximadamente 6,75 a 7,25, de aproximadamente 7 a 7,5, de aproximadamente 7,75 a 8,25, de aproximadamente 8 a 8,5, de aproximadamente 8,25 a 8,75, de aproximadamente 8,5 a 9, de aproximadamente 8,75 a 9,25, de aproximadamente 9 a 9,5, de aproximadamente 9,25 a 9,75 o de aproximadamente 9,5 a 10 o más en comparación con una molécula parental. En otras realizaciones, el índice de rendimiento celular es mayor de cualquiera de aproximadamente 0,1 a 2, aproximadamente 1-3, aproximadamente 2-4, aproximadamente 3-5, aproximadamente 4-6, aproximadamente 5-7, aproximadamente 6-8, aproximadamente 7-9 o aproximadamente 8-10 o más en comparación con una molécula parental. En algunas realizaciones, la molécula parental es una fosfocetolasa de E. gallinarum. En otras realizaciones, la actividad intracelular aumenta al menos aproximadamente 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 veces o más.
Se proporcionan en el presente documento métodos para producir precursores de isoprenoides y/o isoprenoides que comprenden cultivar células recombinantes capaces de aumentar el flujo de carbono a través de la ruta de la fosfocetolasa, en los que las células recombinantes comprenden: (i) una secuencia de ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa, en los que el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 65% con SEQ ID NO: 11, (ii) uno o más ácidos nucleicos que codifican para uno o más polipéptidos de la ruta de MVA completa, y (iii) uno o más ácidos nucleicos que codifican para un polipéptido de poliprenil pirofosfato sintasa, en los que dicho polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa de (i) tiene un valor de índice de rendimiento mayor de 1,0 en uno o más de los siguientes parámetros: (a) solubilidad de proteínas, (b) expresión de proteínas o (c) actividad específica de fructosa-6-fosfato (F6P) y producción de precursores de isoprenoides y/o isoprenoides. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 32. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 33. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 34. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 35. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 36. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 37. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 38. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 39. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 40. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 41. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 42. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 43. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 44. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 45. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 46. En otras realizaciones, dicho valor de índice de rendimiento para cualquiera de dichos parámetros es cualquiera de tal como mayor de 1,1, tal como mayor de 1,2, mayor de 1,4, mayor de 1,6, mayor de 1,8, mayor de 2, mayor de 2,2, mayor de 2,4, mayor de 2,6, mayor de 2,8, mayor de 3, mayor de 3,2, mayor de 3,4, mayor de 3,6, mayor de 3,8, mayor de 4, mayor de 4,2, mayor de 4,4, mayor de 4,6, mayor de 4,8, mayor de 5, mayor de 5,2, mayor de 5,4, mayor de 5,6, mayor de 5,8, mayor de 6, mayor de 6,2, mayor de 6,4, mayor de 6,6, mayor de 6,8, mayor de 7, mayor de 7,2, mayor de 7,4, mayor de 7,6, mayor de 7,8, mayor de 8, mayor de 8,2, mayor de 8,4, mayor de 8,6, mayor de 8,8, 9, mayor de 9,2, mayor de 9,4, mayor de 9,6, mayor de 9,8 o mayor de 10 o más en comparación con un polipéptido parental que tiene actividad fosfocetolasa (por ejemplo, una fosfocetolasa de E. gallinarum). En otras realizaciones, el índice de rendimiento celular aumenta al menos aproximadamente 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 3, 4, 5 veces o más en comparación con una molécula parental. En otras realizaciones, el índice de rendimiento celular es mayor de cualquiera de aproximadamente 0,1 a 0,5, de aproximadamente 0,25 a 0,75, de aproximadamente 0,5 a 1, de aproximadamente 0,75 a 1,25, de aproximadamente 1 a 1,5, de aproximadamente 1,25 a 1,75, de aproximadamente 1,5 a 2, de aproximadamente 1,75 a 2,25, de aproximadamente 2 a 2,5, de aproximadamente 2.25 a 2,75, de aproximadamente 2,5 a 3, de aproximadamente 2,75 a 3,25, de aproximadamente 3 a 3,5, de aproximadamente 3,25 a 3,75, de aproximadamente 3,5 a 4, de aproximadamente 3,75 a 4,25, de aproximadamente 4 a 4,5, de aproximadamente 4,25 a 4,75, de aproximadamente 4,5 a 5, de aproximadamente 4,75 a 5,25, de aproximadamente 5 a 5,5, de aproximadamente 5,25 a 5,75, de aproximadamente 5,5 a 6, de aproximadamente 6.25 a 6,75, de aproximadamente 6,5 a 7, de aproximadamente 6,75 a 7,25, de aproximadamente 7 a 7,5, de aproximadamente 7,75 a 8,25, de aproximadamente 8 a 8,5, de aproximadamente 8,25 a 8,75, de aproximadamente 8,5 a 9, de aproximadamente 8,75 a 9,25, de aproximadamente 9 a 9,5, de aproximadamente 9,25 a 9,75 o de aproximadamente 9,5 a 10 o más en comparación con una molécula parental. En otras realizaciones, el índice de rendimiento celular es mayor de cualquiera de aproximadamente 0,1 a 2, aproximadamente 1-3, aproximadamente 2-4, aproximadamente 3-5, aproximadamente 4-6, aproximadamente 5-7, aproximadamente 6-8, aproximadamente 7-9 o aproximadamente 8-10 o más en comparación con una molécula parental. En algunas realizaciones, la molécula parental es una fosfocetolasa de E. gallinarum. En otras realizaciones, la actividad intracelular aumenta al menos aproximadamente 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 veces o más.
Vectores
Pueden usarse vectores adecuados para cualquiera de las composiciones y métodos descritos en el presente documento. Por ejemplo, pueden usarse vectores adecuados para optimizar la expresión de una o más copias de un gen que codifica para una fosfocetolasa, un polipéptido de la ruta de MVA superior que incluye, pero no se limita a, un polipéptido de mvaS y mvaE, un polipéptido de la ruta de MVA inferior, una isopreno sintasa, o una poliprenil pirofosfato sintasa en una célula huésped particular (por ejemplo, E. coli). En algunos aspectos, el vector contiene un marcador selectivo. Los ejemplos de marcadores seleccionables incluyen, pero no se limitan a, ácidos nucleicos de resistencia a antibióticos (por ejemplo, kanamicina, ampicilina, carbenicilina, gentamicina, higromicina, fleomicina, bleomicina, neomicina o cloranfenicol) y/o ácidos nucleicos que confieren una ventaja metabólica, tal como una ventaja nutricional en la célula huésped. En algunos aspectos, una o más copias de una fosfocetolasa, un polipéptido de la ruta de MVA superior que incluye, pero no se limita a, un polipéptido de mvaS y mvaE, un polipéptido de la ruta de MVA inferior, un ácido nucleico de mvaS y mvaE de L. grayi, E. faecium, E. gallinarum, E. casseliflavus y/o E. faecalis, una isopreno sintasa o un(os) ácido(s) nucleico(s) de poliprenil pirofosfato sintasa que se integran en el genoma de las células huésped sin un marcador selectivo.
En la presente invención puede usarse cualquiera de los vectores caracterizados en el presente documento o usados en los ejemplos de la presente divulgación.
Métodos de transformación
Los ácidos nucleicos que codifican para una o más copias de una fosfocetolasa, un polipéptido de la ruta de MVA superior que incluye, pero no se limita a, un polipéptido de mvaS y mvaE, un polipéptido de la ruta de MVA inferior y/o polipéptidos de la ruta de MVA inferior pueden insertarse en una célula usando técnicas adecuadas. Además, los ácidos nucleicos o vectores que los contienen de isopreno sintasa, IDI, DXP y/o poliprenil pirofosfato sintasa pueden insertarse en una célula huésped (por ejemplo, una célula vegetal, una célula fúngica, una célula de levadura o una célula bacteriana descritas en el presente documento) usando técnicas convencionales para la introducción de un vector o constructo de ADN en una célula huésped, tal como transformación, electroporación, microinyección nuclear, transducción, transfección (por ejemplo, transfección mediada por lipofección o mediada por DEAE-dextrina o transfección usando un virus de fago recombinante), incubación con precipitado de ADN de fosfato de calcio, bombardeo de alta velocidad con microproyectiles recubiertos de ADN y fusión de protoplastos. En la técnica se conocen técnicas de transformación general (véase, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel et al. (eds.) capítulo 9, 1987; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed., Cold Spring Harbor, 1989; y Campbell et al., Curr. Gineta. 16: 53-56, 1989). Los ácidos nucleicos introducidos pueden integrarse en el ADN cromosómico o mantenerse tal como secuencias de replicación extracromosómicas. Los transformantes pueden seleccionarse por cualquier método conocido en la técnica. Los métodos adecuados para seleccionar los transformantes se describen en la publicación internacional n.° WO 2009/076676, publicación de patente estadounidense n.° 2009/0203102, Wo 2010/003007, publicación estadounidense n.° 2010/0048964, WO 2009/132220y publicación estadounidense n.° 2010/0003716.
Células huésped a modo de ejemplo
Un experto en la técnica reconocerá que los vectores de expresión están diseñados para contener determinados componentes que optimizan la expresión génica para determinadas cepas huésped. Tales componentes de optimización incluyen, pero no se limitan a, origen de replicación, promotores y potenciadores. Los vectores y componentes a los que se hace referencia en el presente documento se describen con fines a modo de ejemplo y no pretenden limitar el alcance de la invención.
Puede usarse cualquier célula o progenie de la misma que pueda usarse para expresar de forma heteróloga genes para expresar una o más de una fosfocetolasa. En determinadas realizaciones, las células (por ejemplo, células recombinantes) comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica para una fosfocetolasa aislada de Burkholderia phytofirmans, Lactobacillus buchneri, Bifidobacterium gallicum, Bifidobacterium dentium, Bifidobacterium bifidum y/o Clostridium acetobutylicum. En algunas realizaciones, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica para una fosfocetolasa aislada de Mycobacterium gilvum, Shewanella baltica, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus crispatus, Bifidobacterium longum, Leuconostoc citreum, Bradyrhizobium sp., Enterococcus faecium, Brucella microti, Lactobacillus salivarius, Streptococcus agalactiae, Rhodococcus imtechensis, Burkholderia xenovorans, Mycobacterium intracellulare, Nitrosomonas sp., Schizosaccharomyces pombe, Leuconostoc mesenteroides, Streptomyces sp., Lactobacillus buchneri, Streptomyces ghanaensis, Cyanothece sp. y/o Neosartorya fischeri. En algunas realizaciones, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica para una fosfocetolasa aislada de Enterococcus faecium, Listeria grayi, Enterococcus gallinarum, Enterococcus saccharolyticus, Enterococcus casseliflavus, Mycoplasma alligatoris, Carnobacterium sp., Melissococcus plutonius, Tetragenococcus halophilus y/o Mycoplasma arthritidis. En algunas realizaciones, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica para una fosfocetolasa aislada de Streptococcus agalactiae, Mycoplasma agalactiae, Streptococcus gordonii, Kingella oralis, Mycoplasma fermentans, Granulicatella adiacens, Mycoplasma hominis, Mycoplasma crocodyli, Mycobacterium bovis, Neisseria sp., Streptococcus sp., Eremococcus coleocola, Granulicatella elegans, Streptococcus parasanguinis, Aerococcus urinae, Kingella kingae, Streptococcus australis, Streptococcus criceti y/o Mycoplasma columbinum. En algunas realizaciones, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica para una fosfocetolasa aislada de un organismo enumerado en la tabla 1, la tabla 2 y/o las figuras 3-24.
Las células (por ejemplo, células recombinantes) con ácido nucleico heterólogo que codifica para una fosfocetolasa tal como se describió anteriormente y en el presente documento también pueden modificarse por ingeniería genética con uno o más ácidos nucleicos heterólogos que expresan uno o más péptidos de la ruta de MVA, polipéptido(s) de la ruta de DXP, IDI, isopreno sintasa y/o polipéptidos de poliprenil pirofosfato sintasa. En algunas realizaciones, la célula huésped es una bacteria gram-positiva. Los ejemplos no limitativos incluyen cepas de Corynebacteria (por ejemplo C. glutamicum), Streptomyces (por ejemplo, S. lividans, S. coelicolor o S. griseus), Bacillus, Listeria (por ejemplo, L. monocytogenes) o Lactobacillus (por ejemplo, L. spp). En algunas realizaciones, el organismo fuente es una bacteria gram-negativa, tal como E. coli, Pseudomonas sp. o H. pylori.
Las células bacterianas, incluyendo bacterias gram-positivas o gram-negativas, pueden usarse para expresar cualquiera de los genes heterólogos descritos anteriormente. En particular, los genes mvaE y mvaS pueden expresarse en una cualquiera de células de P. citrea, B. subtilis, B. licheniformis, B. lentus, B. brevis, B. stearothermophilus, B. alkalophilus, B. amyloliquefaciens, B. clausii, B. halodurans, B. megaterium, B. coagulans, B. circulans, B. lautus, B. thuringiensis, S. albus, S. lividans, S. coelicolor, S. griseus, Pseudomonas sp. y P. alcaligenes.
Existen numerosos tipos de células anaerobias que pueden usarse como células huésped en las composiciones y métodos de la presente invención. En un aspecto de la invención, las células descritas en cualquiera de las composiciones o los métodos descritos en el presente documento son células anaerobias obligadas y progenie de las mismas. Los anaerobios obligados normalmente no crecen bien, si es que lo hacen, en condiciones donde el oxígeno está presente. Debe entenderse que puede estar presente una pequeña cantidad de oxígeno, es decir, hay algún nivel de tolerancia que los anaerobios obligados tienen para un nivel bajo de oxígeno. En un aspecto, los anaerobios obligados modificados por ingeniería genética para producir mevalonato, precursores de isoprenoides, isopreno e isoprenoides pueden servir como células huésped para cualquiera de los métodos y/o composiciones descritas en el presente documento y se hacen crecer en condiciones sustancialmente libres de oxígeno, en las que la cantidad de oxígeno presente no es perjudicial para el crecimiento, mantenimiento y/o fermentación de los anaerobios.
En otro aspecto de la invención, las células huésped descritas y/o usadas en cualquiera de las composiciones o los métodos descritos en el presente documento son células anaerobias facultativas y progenie de las mismas. Los anaerobios facultativos pueden generar ATP celular mediante la respiración aerobia (por ejemplo, el uso del ciclo de TCA) si hay oxígeno presente. Sin embargo, los anaerobios facultativos también pueden crecer en ausencia de oxígeno. Esto contrasta con los anaerobios obligados que mueren o crecen escasamente en presencia de cantidades aumentadas de oxígeno. Por tanto, en un aspecto, los anaerobios facultativos pueden servir como células huésped para cualquiera de las composiciones y/o métodos proporcionados en el presente documento y pueden modificarse por ingeniería genética para producir mevalonato, precursores de isoprenoides, isopreno e isoprenoides. Las células huésped anaerobias facultativas pueden cultivarse en condiciones sustancialmente libres de oxígeno, en las que la cantidad de oxígeno presente no es perjudicial para el crecimiento, mantenimiento y/o fermentación de los anaerobios, o pueden cultivarse alternativamente en presencia de cantidades aumentadas de oxígeno.
La célula huésped puede ser adicionalmente una célula fúngica filamentosa y progenie de las mismas. (Véase, por ejemplo, Berka y Barnett, Biotechnology Advances, (1989), 7 (2): 127-154). En algunos aspectos, la célula fúngica filamentosa puede ser cualquiera de Trichoderma longibrachiatum, T. viride, T. koningii, T. harzianum, Penicillium sp. Humicola insolens, H. lanuginose, H. grisea, Chrysosporium sp., C. lucknowense, Gliocladium sp., Aspergillus sp., tales como A. oryzae, A. niger, A sojae, A. japonicus, A. nidulans, o A. awamori, Fusarium sp., tal como F. roseum, F. graminum, F. cerealis, F. oxysporuim o F. venenatum, Neurospora sp., tal como N. crassa, Hypocrea sp., Mucor sp., tal como M. miehei, Rhizopus sp. o Emericella sp. En algunos aspectos, el hongo es A. nidulans, A. awamori, A. oryzae, A. aculeatus, A. niger, A. japonicus, T. reesei, T. viride, F. oxysporum, o F. solani. En determinadas realizaciones, los plásmidos o componentes de plásmidos para su uso en el presente documento incluyen los descritos en la publicación de patente de estadounidense n.° US 2011/0045563.
La célula huésped también puede ser una levadura, tal como Saccharomyces sp., Schizosaccharomyces sp., Pichia sp. o Candida sp. En algunos aspectos, la Saccharomyces sp. es Saccharomyces cerevisiae (véase, por ejemplo, Romanos et al., Yeast, (1992), 8 (6): 423-488.). En determinadas realizaciones, los plásmidos o componentes de plásmidos para su uso en el presente documento incluyen los descritos en la patente estadounidense n.° 7.659.097 y la publicación de patente estadounidense n.° US 2011/0045563.
La célula huésped también puede ser una especie de algas, tales como algas verdes, algas rojas, glaucofitos, cloraracniofitos, euglenoides, cromistas o dinoflagelados. (Véase, por ejemplo, Saunders & Warmbrodt, “Expresión génica en algas y hongos, incluida la levadura” (1993), National Agricultural Library, Beltsville, MD). En determinadas realizaciones, los plásmidos o componentes de plásmidos para su uso en el presente documento incluyen los descritos en la publicación de patente de estadounidense n.° US 2011/0045563. En algunos aspectos, la célula huésped es una cianobacteria, como la cianobacteria clasificada en cualquiera de los siguientes grupos según la morfología: Chlorococcales, Pleurocapsales, Oscillatoriales, Nostocales, o Stigonematales (Véase, por ejemplo, Lindberg et al., Metab. Eng., (2010) 12 (1): 70-79). En determinadas realizaciones, los plásmidos o componentes de plásmidos para su uso en el presente documento incluyen los descritos en la publicación de patente de estadounidense n.° US 2010/0297749; US 2009/0282545 y la solicitud de patente internacional n.° WO 2011/034863.
Pueden usarse células huésped de E. coli para expresar una o más enzimas fosfocetolasa de cualquier número de organismos. En determinadas realizaciones, las células (por ejemplo, células recombinantes) comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica para una fosfocetolasa aislada de Burkholderia phytofirmans, Lactobacillus buchneri, Bifidobacterium gallicum, Bifidobacterium dentium, Bifidobacterium bifidum y/o Clostridium acetobutylicum. En algunas realizaciones, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica para una fosfocetolasa aislada de Mycobacterium gilvum, Shewanella baltica, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus crispatus, Bifidobacterium longum, Leuconostoc citreum, Bradyrhizobium sp., Enterococcus faecium, Brucella microti, Lactobacillus salivarius, Streptococcus agalactiae, Rhodococcus imtechensis, Burkholderia xenovorans, Mycobacterium intracellulare, Nitrosomonas sp., Schizosaccharomyces pombe, Leuconostoc mesenteroides, Streptomyces sp., Lactobacillus buchneri, Streptomyces ghanaensis, Cyanothece sp. y/o Neosartorya fischeri. En algunas realizaciones, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica para una fosfocetolasa aislada de Enterococcus faecium, Listeria grayi, Enterococcus gallinarum, Enterococcus saccharolyticus, Enterococcus casseliflavus, Mycoplasma alligatoris, Carnobacterium sp., Melissococcus plutonius, Tetragenococcus halophilus y/o Mycoplasma arthritidis. En algunas realizaciones, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica para una fosfocetolasa aislada de Streptococcus agalactiae, Mycoplasma agalactiae, Streptococcus gordonii, Kingella oralis, Mycoplasma fermentans, Granulicatella adiacens, Mycoplasma hominis, Mycoplasma crocodyli, Mycobacterium bovis, Neisseria sp., Streptococcus sp., Eremococcus coleocola, Granulicatella elegans, Streptococcus parasanguinis, Aerococcus urinae, Kingella kingae, Streptococcus australis, Streptococcus criceti y/o Mycoplasma columbinum. En algunas realizaciones, las células recombinantes comprenden una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que codifica para una fosfocetolasa aislada de un organismo enumerado en la tabla 1, la tabla 2 y/o las figuras 3-24.
Estas células también pueden manipularse con uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican para uno o más polipéptidos de la ruta de MVA, polipéptidos de la ruta de DXP, IDI, isopreno sintasa y/o polipéptidos de poliprenil pirofosfato sintasa. En un aspecto, la célula huésped es una célula recombinante de una cepa de Escherichia coli (E. coli), o progenie de la misma, capaz de producir mevalonato que expresa uno o más ácidos nucleicos que codifican para la fosfocetolasa descrita anteriormente y en el presente documento junto con uno o más ácidos nucleicos heterólogos que expresan uno o más péptidos de la ruta de MVA. Las células huésped de E. coli pueden producir mevalonato en cantidades, títulos máximos y productividades celulares mayores que las de las mismas células que carecen de uno o más ácidos nucleicos expresados de forma heteróloga que codifican para los polipéptidos de fosfocetolasa descritos anteriormente y en el presente documento junto con uno o más ácidos nucleicos heterólogos que expresan uno o más péptidos de la ruta de MVA. Además, el uno o más ácidos nucleicos expresados de manera heteróloga que codifican para el polipéptido de fosfocetolasa descrito anteriormente y en el presente documento junto con uno o más ácidos nucleicos heterólogos que expresan uno o más péptidos de la ruta de MVA en E. coli pueden ser copias cromosómicas (por ejemplo, integradas en el cromosoma de E. coli). En otros aspectos, las células de E. coli están en cultivo. En algunos aspectos, la una o más enzimas fosfocetolasa son de Clostridium acetobutylicum, Bifidobacterium longum y/o Enterococcus gallinarum. En cualquier aspecto, la una o más enzimas fosfocetolasa son cualquier enzima fosfocetolasa tal como se divulga en el presente documento.
Modificaciones a modo de ejemplo de la célula huésped
Ruta de la citrato sintasa
La citrato sintasa cataliza la condensación de oxaloacetato y acetil-CoA para formar citrato, un metabolito del ciclo del ácido tricarboxílico (TCA) (Ner, S. et al. 1983. Biochemistry, 22: 5243-5249.; Bhayana, V. y Duckworth, H. 1984. Biochemistry 23: 2900-2905). En E. coli, esta enzima, codificada por gltA se comporta como un trímero de subunidades diméricas. La forma hexamérica permite que la enzima se regule de manera alostérica mediante NADH. Esta enzima se ha estudiado ampliamente (Wiegand, G., y Remington, S. 1986. Annual Rev. Biophysics Biophys. Chem.15: 97-117; Duckworth et al. 1987. Biochem Soc Symp. 54: 83-92; Stockell, D. et al. 2003. J. Biol. Chem. 278: 35435-43; Maurus, R. et al. 2003. Biochemistry. 42: 5555-5565). Para evitar la inhibición alostérica por NADH, se ha considerado el reemplazo por o complementación con la citrato sintasa insensible a NADH de Bacillus subtilis (Underwood et al. 2002. Appl. Environ. Microbiol. 68: 1071-1081; Sanchez et al. 2005. Met. Ing. 7: 229-239).
La reacción catalizada por la citrato sintasa está compitiendo directamente con la tiolasa que cataliza la primera etapa de la ruta del mevalonato, ya que ambas tienen acetil-CoA como sustrato (Hedl et al. 2002. J. Bact. 184: 2116­ 2122). Por tanto, un experto en la técnica puede modular la expresión de citrato sintasa (por ejemplo, disminuir la actividad enzimática) para permitir que más carbono fluya hacia la ruta del mevalonato, aumentando así la producción final de mevalonato, isopreno e isoprenoides. La disminución de la actividad citrato sintasa puede ser cualquier cantidad de reducción de la actividad específica o actividad total en comparación con cuando no se ha efectuado ninguna manipulación. En algunos casos, la disminución de la actividad enzimática se reduce en al menos aproximadamente el 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96 %, 97%, 98%, 99% o el 100%. En algunos aspectos, la actividad citrato sintasa se modula al disminuir la actividad de un gen de la citrato sintasa endógena. Esto puede lograrse mediante la sustitución cromosómica de un gen de la citrato sintasa endógena con un transgén que codifica para una citrato sintasa insensible a NADH o mediante el uso de un transgén que codifica para una citrato sintasa insensible a NADH que deriva de Bacillus subtilis. La actividad citrato sintasa también puede modularse (por ejemplo, disminuirse) reemplazando el promotor de gen de la citrato sintasa endógena con un promotor sintético de expresión constitutivamente baja. El gen que codifica para la citrato sintasa también puede delecionarse. La disminución de la actividad citrato sintasa puede dar como resultado un mayor flujo de carbono hacia la ruta de biosíntesis dependiente de mevalonato en comparación con células que no tienen una expresión reducida de la citrato sintasa. En cualquier aspecto de la invención, se proporcionan en el presente documento células recombinantes según se reivindican que comprenden uno o más ácidos nucleicos expresados de forma heteróloga que codifican para polipéptidos de fosfocetolasa tal como se divulga en el presente documento y se modifican por ingeniería genética adicionalmente para disminuir la actividad citrato sintasa (gltA). La modulación de la actividad (por ejemplo, disminución) de isozimas de citrato sintasa también se contempla en el presente documento. En cualquier aspecto de la invención, se proporcionan en el presente documento células recombinantes según se reivindican que comprenden uno o más ácidos nucleicos expresados de forma heteróloga que codifican para polipéptidos de fosfocetolasa tal como se divulga en el presente documento y se modifican por ingeniería genética adicionalmente para disminuir la actividad de una isozima citrato sintasa.
Rutas que implican la fosfotransacetilasa y/o acetato cinasa
La fosfotransacetilasa ((codificada en E. coli por (i) pta (Shimizu et al. 1969. Biochim. Biofis Acta 191: 550-558 o (ii) eutD (Bolonia et al. 2010. J of Microbiology. 48: 629-636) cataliza la conversión reversible entre acetil-CoA y acetilfosfato (acetil-P), mientras que la acetato cinasa (codificada en E. coli por ackA) (Kakuda, H. et al. 1994. J. Biochem.
11: 916-922) usa acetil-P para formar acetato. Estos genes pueden transcribirse como un operón en E. coli. Juntos, catalizan la disimilación del acetato, con la liberación de ATP. Por tanto, es posible aumentar la cantidad de acetil-P que se dirige hacia la acetil-CoA mejorando la actividad fosfotransacetilasa. En determinadas realizaciones, la mejora se logra colocando un promotor regulado por incremento hacia 5' del gen en el cromosoma, o colocando una copia del gen detrás de un promotor adecuado en un plásmido. Con el fin de disminuir la cantidad de acetil-coA que se dirige hacia el acetato, la actividad del gen de la acetato cinasa (por ejemplo, el gen de la acetato cinasa endógena) puede disminuir o atenuarse. En determinadas realizaciones, la atenuación se logra delecionando la acetato cinasa (ackA). Esto se hace reemplazando el gen con un casete de cloranfenicol seguido por sobresalir en bucle del casete. En algunos aspectos, la actividad acetato cinasa se modula disminuyendo la actividad de una acetato cinasa endógena. Esto puede lograrse reemplazando el promotor del gen de la acetato cinasa endógena con un promotor sintético de expresión constitutivamente baja. En determinadas realizaciones, si la atenuación del gen de la acetato cinasa debe hacerse interrumpiendo la expresión del gen de la fosfotransacetilasa (pta), se produce acetato por E. coli por muchas razones (Wolfe, A. 2005. Microb, Mol. Biol. Rev. 69: 12-50). Sin pretender limitarse a ninguna teoría, la deleción de ackA podría dar como resultado carbono disminuido que se desvía hacia la producción de acetato (ya que ackA usa acetil-CoA) y, por tanto, aumenta el rendimiento de mevalonato, precursores de isoprenoides, isopreno y/o isoprenoides.
En algunos aspectos, las células recombinantes descritas en el presente documento producen cantidades reducidas de acetato en comparación con células que no tienen la expresión del gen de la acetato cinasa endógena atenuada o la fosfotransacetilasa mejorada. La disminución de la cantidad de acetato producido puede medirse mediante ensayos de rutina conocidos por un experto en la técnica. La cantidad de reducción de acetato es de al menos aproximadamente el 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98 % o el 99% en comparación cuando no se realizan manipulaciones moleculares a la expresión del gen de la acetato cinasa endógena o la expresión del gen de la fosfotransacetilasa.
La actividad fosfotransacetilasa (pta y/o eutD) puede aumentarse por otras manipulaciones moleculares de las enzimas. El aumento de la actividad enzimática puede ser un aumento de cualquier cantidad de actividad específica o actividad total en comparación con cuando no se ha efectuado ninguna manipulación. En algunos casos, el aumento de la actividad enzimática aumenta en al menos aproximadamente el 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96 %, 97%, 98% o el 99%. En una realización, la actividad de pta se aumenta alterando el promotor y/o rbs en el cromosoma, o expresándolo a partir de un plásmido. En cualquier aspecto de la invención, se proporcionan en el presente documento células recombinantes según se reivindican que comprenden uno o más ácidos nucleicos expresados de forma heteróloga que codifican para polipéptidos de fosfocetolasa tal como se divulga en el presente documento y se modifican por ingeniería genética adicionalmente para aumentar la actividad fosfotransacetilasa (pta y/o eutD). La modulación de la actividad (por ejemplo, un aumento) de las isozimas de fosfotransacetilasa también se contempla en el presente documento. En cualquier aspecto de la invención, se proporcionan en el presente documento células recombinantes según se reivindican que comprenden uno o más ácidos nucleicos expresados de manera heteróloga que codifican para polipéptidos de fosfocetolasa tal como se divulga en el presente documento y se modifican por ingeniería genética adicionalmente para incrementar la actividad de una isozima de fosfotransacetilasa (pta y/o eutD).
La actividad acetato cinasa (ackA) también puede disminuir por otras manipulaciones moleculares de las enzimas. La disminución de la actividad enzimática puede ser cualquier cantidad de reducción de la actividad específica o actividad total en comparación con cuando no se ha efectuado ninguna manipulación. En algunos casos, la actividad enzimática disminuye al menos aproximadamente el 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25 %, 30%, 35%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99%. En cualquier aspecto de la invención, se proporcionan en el presente documento células recombinantes según se reivindican que comprenden uno o más ácidos nucleicos expresados de forma heteróloga que codifican para polipéptidos de fosfocetolasa tal como se divulga en el presente documento y se modifican por ingeniería genética adicionalmente para disminuir la actividad acetato cinasa (ackA). La modulación de la actividad (por ejemplo, disminuida) de isozimas acetato cinasa también se contempla en el presente documento. En cualquier aspecto de la invención, se proporcionan en el presente documento células recombinantes según se reivindican que comprenden uno o más ácidos nucleicos expresados de forma heteróloga que codifican para polipéptidos de fosfocetolasa tal como se divulga en el presente documento y se modifican por ingeniería genética adicionalmente para disminuir la actividad de una isozima acetato cinasa.
En algunos casos, la atenuación de la actividad del gen de la acetato cinasa endógena da como resultado un mayor flujo de carbono hacia la ruta de biosíntesis dependiente de mevalonato en comparación con células que no tienen una expresión atenuada del gen de la acetato endógeno.
Rutas que implican la lactato deshidrogenasa
En E. coli, D-lactato se produce a partir del piruvato a través de la enzima lactato deshidrogenasa (codificada por IdhA - figura 1) (Bunch, P. et al. 1997. Microbiol. 143: 187-195). La producción de lactato se acompaña de la oxidación de NADH, por tanto, el lactato se produce cuando el oxígeno es limitado y no puede acomodar todos los equivalentes reductores. Por tanto, la producción de lactato podría ser una fuente de consumo de carbono. Como tal, para mejorar el flujo de carbono a través de la producción de mevalonato (y el isopreno, el precursor de isoprenoides y la producción de isoprenoides, si se desea), un experto en la técnica puede modular la actividad lactato deshidrogenasa, tal como disminuyendo la actividad enzimática.
Por consiguiente, en un aspecto, la actividad lactato deshidrogenasa puede modularse atenuando la actividad de un gen de la lactato deshidrogenasa endógena. Dicha atenuación puede lograrse mediante la eliminación del gen de la lactato deshidrogenasa endógena. También pueden usarse otras formas de atenuar la actividad del gen de la lactato deshidrogenasa que conoce un experto en la técnica. Al manipular la ruta que implica la lactato deshidrogenasa, la célula recombinante produce cantidades reducidas de lactato en comparación con células que no tienen expresión atenuada del gen de la lactato deshidrogenasa endógena. La disminución de la cantidad de lactato producido puede medirse mediante ensayos de rutina conocidos por un experto en la técnica. La cantidad de reducción de lactato es de al menos aproximadamente el 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o el 99% en comparación cuando no se realizan manipulaciones moleculares.
La actividad lactato deshidrogenasa también puede disminuir por otras manipulaciones moleculares de la enzima. La disminución de la actividad enzimática puede ser cualquier cantidad de reducción de la actividad específica o actividad total en comparación con cuando no se ha efectuado ninguna manipulación. En algunos casos, la actividad enzimática disminuye al menos aproximadamente el 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25 %, 30%, 35%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o el 99%.
Por consiguiente, en algunos casos, la atenuación de la actividad del gen de la lactato deshidrogenasa endógena da como resultado un mayor flujo de carbono hacia la ruta de biosíntesis dependiente de mevalonato en comparación con células que no tienen expresión atenuada del gen de la lactato deshidrogenasa endógena.
Rutas que implican gliceraldehído 3-fosfato
La gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (gapA y/o gapB) es una enzima crucial de la glicólisis que cataliza la conversión de gliceraldehído 3-fosfato en 1,3-bifosfo-D-glicerato (Branlant G. y Branlant C. 1985. Eur. J. Biochem.
150: 61-66).
Con el fin de dirigir el carbono hacia la enzima fosfocetolasa, la expresión de gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa puede modularse (por ejemplo, disminuir la actividad enzimática) para permitir que fluya más carbono hacia la fructosa 6-fosfato y la xilulosa 5-fosfato, aumentando así la producción eventual de mevalonato, isopreno e isoprenoides. La disminución de la actividad gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa puede ser cualquier reducción de la actividad específica o de la actividad total en comparación con cuando no se ha efectuado ninguna manipulación. En algunos casos, la disminución de la actividad enzimática se reduce en al menos aproximadamente el 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96 %, 97%, 98%, 99% o el 100%. En algunos aspectos, la actividad gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa se modula disminuyendo la actividad de una gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa endógena. Esto puede lograrse reemplazando el promotor del gen de la gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa endógena con un promotor sintético de expresión constitutivamente baja. El gen que codifica para la gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa también se puede delecionarse. El gen que codifica para la gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa también puede reemplazarse por una enzima de Bacillus que cataliza la misma reacción pero produce NADPH en lugar de NADH. La disminución de la actividad gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa puede dar como resultado un mayor flujo de carbono hacia la ruta de biosíntesis dependiente de mevalonato en comparación con células que no tienen una expresión reducida de la gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa. En cualquier aspecto de la invención, se proporcionan en el presente documento células recombinantes según se reivindican que comprenden uno o más ácidos nucleicos expresados de manera heteróloga que codifican para polipéptidos de fosfocetolasa tal como se describe en el presente documento y se modifican por ingeniería genética adicionalmente para reducir la actividad gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (gapA y/o gapB). La modulación de la actividad (por ejemplo, disminuida) de las isozimas gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa también se contempla en el presente documento. En cualquier aspecto de la invención, se proporcionan en el presente documento células recombinantes según se reivindican que comprenden uno o más ácidos nucleicos expresados de forma heteróloga que codifican para polipéptidos de fosfocetolasa tal como se describe en el presente documento se modifican por ingeniería genética para disminuir la actividad de una isozima gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (gapA y/o gapB).
Rutas que implican la ruta de Entner-Doudoroff
La ruta de Entner-Doudoroff (ED) es una alternativa a la ruta de Emden-Meyerhoff-Parnass (EMP -glicólisis). Algunos organismos, tales como E. coli, albergan tanto las rutas de ED como de EMP, mientras que otros solo tienen una o la otra. Bacillus subtilis sólo tiene la ruta de EMP, mientras que Zymomonas mobilis sólo tiene la ruta de ED (Peekhaus y Conway. 1998. J. Bact. 180: 3495-3502; Stulke y Hillen. 2000. Annu. Rev. Microbiol. 54, 849-880; Dawes et al. 1966. Biochem. J. 98: 795-803). La fructosa bifosfato aldolasa (fba, fbaA, fbaB y/o fbaC) interactúa con la ruta de Entner-Doudoroff y cataliza reversiblemente la conversión de la fructosa 1,6-bisfosfato en fosfato de dihidroxiacetona (DHAP) y gliceraldehído 3-fosfato (GAP) (Baldwin S.A., et al., Biochem J. (1978) 169 (3): 633-41).
La fosfogluconato deshidratasa (edd) elimina una molécula de H2O de 6-fosfo-D-gluconato para formar 2-deshidro-3-desoxi-D-gluconato 6-fosfato, mientras que 2-ceto-3-desoxigluconato 6-fosfato aldolasa (eda) cataliza una escisión aldólica (Egan et al. 1992. J. Bact. 174: 4638-4646). Los dos genes están en un operón.
Los metabolitos que pueden dirigirse hacia la ruta de la fosfocetolasa también pueden desviarse hacia la ruta de ED. Para evitar la pérdida de metabolitos en la ruta de ED, la actividad del gen de la fosfogluconato deshidratasa (por ejemplo, el gen de la fosfogluconato deshidratasa endógena) y/o un gen de la 2-ceto-3-desoxigluconato 6-fosfato aldolasa (por ejemplo, el gen de la 2-ceto-3-desoxigluconato 6-fosfato aldolasa endógena) se atenúa. Una forma de lograr la atenuación es mediante la deleción de fosfogluconato deshidratasa (edd) y/o 2-ceto-3-desoxigluconato 6-fosfato aldolasa (eda). Esto puede lograrse reemplazando uno o ambos genes con un casete de cloranfenicol o kanamicina seguido por sobresalir en bucle del casete. Sin estas actividades enzimáticas, más carbono puede fluir a través de la enzima fosfocetolasa, aumentando así el rendimiento de mevalonato, isopreno o isoprenoides.
La actividad de fosfogluconato deshidratasa (edd) y/o 2-ceto-3-desoxigluconato 6-fosfato aldolasa (eda) también puede disminuir por otras manipulaciones moleculares de las enzimas. La disminución de la actividad enzimática puede ser cualquier cantidad de reducción de la actividad específica o actividad total en comparación con cuando no se ha efectuado ninguna manipulación. En algunos casos, la disminución de la actividad enzimática se reduce en al menos aproximadamente el 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96 %, 97%, 98% o el 99%.
En algunos casos, la atenuación de la actividad del gen de la fosfogluconato deshidratasa endógena y/o el gen de la 2-ceto-3-desoxigluconato-6-fosfato aldolasa endógena da como resultado un mayor flujo de carbono hacia la ruta de biosíntesis dependiente de mevalonato en comparación con células que no tienen expresión atenuada del gen de la fosfogluconato deshidratasa endógena y/o gen de la acetato cinasa 2-ceto-3-desoxigluconato 6-fosfato aldolasa endógena.
Los metabolitos que pueden dirigirse hacia la ruta de la fosfocetolasa también pueden desviarse hacia la ruta de ED o la ruta de EMP. Para evitar la pérdida de metabolitos y aumentar la concentración de fructosa-6-fosfato (F6P), se atenúa la actividad fructosa bifosfato aldolasa (por ejemplo, la fructosa bifosfato aldolasa endógena). En algunos casos, la atenuación de la actividad del gen de la fructosa bisfosfato aldolasa endógena (fba, fbaA, fbaB y/o fbaC) da como resultado un mayor flujo de carbono hacia la ruta de biosíntesis dependiente de mevalonato en comparación con células que no tienen expresión atenuada del gen de la fructosa bisfosfato aldolasa endógena (fba, fbaA, fbaB y/o fbaC). En algunos aspectos, la atenuación se logra delecionando la fructosa bisfosfato aldolasa (fba, fbaA, fbaB y/o fbaC). La deleción puede lograrse reemplazando el gen con un casete de cloranfenicol o kanamicina seguido por sobresalir en bucle del casete. En algunos aspectos, la actividad fructosa bisfosfato aldolasa se modula al disminuir la actividad de una fructosa bisfosfato aldolasa endógena. Esto puede lograrse reemplazando el promotor del gen de la fructosa bisfosfato aldolasa endógena con un promotor sintético de expresión constitutivamente baja. Sin estas actividades enzimáticas, más carbono puede fluir a través de la enzima fosfocetolasa, aumentando así el rendimiento de mevalonato, isopreno o isoprenoides. La actividad fructosa bisfosfato aldolasa también puede disminuir por otras manipulaciones moleculares de la enzima. La disminución de la actividad enzimática puede ser cualquier cantidad de reducción de la actividad específica o actividad total en comparación con cuando no se ha efectuado ninguna manipulación. En algunos casos, la disminución de la actividad enzimática se reduce en al menos aproximadamente el 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o el 99%. En cualquier aspecto de la invención, se proporcionan en el presente documento células recombinantes según se reivindican que comprenden uno o más ácidos nucleicos expresados de forma heteróloga que codifican para polipéptidos de fosfocetolasa tal como se divulga en el presente documento y se modifican por ingeniería genética adicionalmente para disminuir la actividad fructosa bisfosfato aldolasa (fba, fbaA, fbaB y/o fbaC). En el presente documento también se contempla la modulación de la actividad (por ejemplo, disminución) de isozimas fructosa bisfosfato aldolasa. En cualquier aspecto de la invención, se proporcionan en el presente documento células recombinantes según se reivindican que comprenden uno o más ácidos nucleicos expresados de manera heteróloga que codifican para polipéptidos de fosfocetolasa tal como se divulga en el presente documento y se modifican por ingeniería genética adicionalmente para disminuir la actividad de una isozima fructosa bisfosfato aldolasa.
Rutas que implican la rama oxidativa de la ruta de geniosa fosfato
E. coli usa la ruta de pentosa fosfato para descomponer las hexosas y pentosas y para proporcionar células con productos intermedios para diversas rutas anabólicas. También es un importante productor de NADPH. La ruta de pentosa fosfato se compone de una rama oxidativa (con enzimas tales como glucosa 6-fosfato 1-deshidrogenasa (zwf), 6-fosfogluconolactonasa (pgl) o 6-fosfogluconato deshidrogenasa (gnd)) y una rama no oxidativa (con enzimas tales como transcetolasa (tktA y/o tktB), transaldolasa (talA o talB), ribulosa-5-fosfato epimerasa y (o) ribosa 5-fosfato epimerasa, ribosa 5-fosfato isomerasa (rpiA y/o rpiB) y/o ribulosa-5-fosfato 3-epimerasa (rpe)) (Sprenger.
1995. Arch. Microbiol. 164: 324-330).
Con el fin de dirigir el carbono hacia la enzima fosfocetolasa, la rama no oxidativa de la expresión de la ruta de pentosa fosfato (transcetolasa, transaldolasa, ribulosa-5-fosfato-epimerasa y (o) ribosa-5-fosfato epimerasa, ribosa-5-fosfato isomerasa A, ribosa-5-fosfato isomerasa B y/o ribulosa-5-fosfato 3-epimerasa) puede modularse (por ejemplo, aumentar la actividad enzimática) para permitir que fluya más carbono hacia la fructosa 6-fosfato y la xilulosa 5-fosfato, aumentando así la eventual producción de mevalonato, isopreno e isoprenoides. El aumento de la actividad transcetolasa, transaldolasa, ribulosa-5-fosfato-epimerasa y (o) ribosa-5-fosfato epimerasa puede ser cualquier cantidad de aumento de la actividad específica o actividad total en comparación con cuando no se ha efectuado ninguna manipulación. En algunos casos, la actividad enzimática se aumenta en al menos aproximadamente el 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25 %, 30%, 35%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o el 100%. En algunos aspectos, la actividad transcetolasa, transaldolasa, ribulosa-5-fosfato-epimerasa y (o) ribosa-5-fosfato epimerasa se modula aumentando la actividad de una transcetolasa, transaldolasa, ribulosa-5-fosfato-epimerasa y o) ribosa-5-fosfato epimerasa endógenas. Esto puede lograrse reemplazando el promotor del gen de transcetolasa, transaldolasa, ribulosa-5-fosfato-epimerasa y (o) ribosa-5-fosfato epimerasa endógenas con un promotor sintético de expresión constitutivamente alta. Los genes que codifican para la transcetolasa, transaldolasa, ribulosa-5-fosfato-epimerasa y (o) ribosa-5-fosfato epimerasa también pueden clonarse en un plásmido detrás de un promotor apropiado. El aumento de la actividad transcetolasa, transaldolasa, ribulosa-5-fosfato-epimerasa y (o) ribosa-5-fosfato epimerasa puede dar como resultado un mayor flujo de carbono hacia la ruta de biosíntesis dependiente de mevalonato en comparación con células que no tienen una mayor expresión de transcetolasa, transaldolasa, ribulosa-5-fosfato epimerasa y (o) ribosa 5-fosfato epimerasa.
En cualquier aspecto de la invención, se proporcionan en el presente documento células recombinantes según se reivindican que comprenden uno o más ácidos nucleicos expresados de forma heteróloga que codifican para polipéptidos de fosfocetolasa tal como se divulga en el presente documento y se modifican por ingeniería genética adicionalmente para aumentar la actividad transcetolasa (tktA y/o tktB). En cualquier aspecto de la invención, se proporcionan en el presente documento células recombinantes según se reivindican que comprenden uno o más ácidos nucleicos expresados de manera heteróloga que codifican para polipéptidos de fosfocetolasa tal como se divulga en el presente documento y se modifican por ingeniería genética adicionalmente para disminuir la actividad transcetolasa (tktA y/o tktB). En cualquier aspecto de la invención, se proporcionan en el presente documento células recombinantes según se reivindican que comprenden uno o más ácidos nucleicos expresados de forma heteróloga que codifican para polipéptidos de fosfocetolasa tal como se divulga en el presente documento y se modifican por ingeniería genética adicionalmente para aumentar la actividad transaldolasa (talA o talB). En cualquier aspecto de la invención, se proporcionan en el presente documento células recombinantes según se reivindican que comprenden uno o más ácidos nucleicos expresados de manera heteróloga que codifican para polipéptidos de fosfocetolasa tal como se divulga en el presente documento y se modifican por ingeniería genética adicionalmente para aumentar la actividad ribosa-5-fosfato isomerasa (rpiA y/o rpiB). En cualquier aspecto de la invención, se proporcionan en el presente documento células recombinantes según se reivindican que comprenden uno o más ácidos nucleicos expresados de forma heteróloga que codifican para polipéptidos de fosfocetolasa tal como se divulga en el presente documento y se modifican por ingeniería genética adicionalmente para aumentar la actividad ribulosa-5-fosfato 3-epimerasa (rpe). La modulación de la actividad (por ejemplo, disminuida o aumentada) de isozimas glucosa 6-fosfato 1-deshidrogenasa (zwf), 6-fosfogluconolactonasa (pgl), 6-fosfogluconato deshidrogenasa (gnd), transcetolasa (tktA y/o tktB), transaldolasa (talA o talB), ribulosa-5-fosfato epimerasa, ribosa 5-fosfato epimerasa, ribosa 5-fosfato isomerasa (rpiA y/o rpiB) y/o ribulosa-5-fosfato 3-epimerasa (rpe) también se contempla en el presente documento. En cualquier aspecto de la invención, se proporcionan en el presente documento células recombinantes según se reivindican que comprenden uno o más ácidos nucleicos expresados de forma heteróloga que codifican para polipéptidos de fosfocetolasa tal como se divulga en el presente documento y se modifican por ingeniería genética adicionalmente para aumentar la actividad de una isozima glucosa 6-fosfato 1-deshidrogenasa (zwf). En cualquier aspecto de la invención, se proporcionan en el presente documento células recombinantes según se reivindican que comprenden uno o más ácidos nucleicos expresados de manera heteróloga que codifican para polipéptidos de fosfocetolasa tal como se divulga en el presente documento y se modifican por ingeniería genética adicionalmente para aumentar la actividad de una isozima transcetolasa (tktA y/o tktB). En cualquier aspecto de la invención, se proporcionan en el presente documento células recombinantes según se reivindican que comprenden uno o más ácidos nucleicos expresados de forma heteróloga que codifican para polipéptidos de fosfocetolasa tal como se divulga en el presente documento y se modifican por ingeniería genética adicionalmente para disminuir la actividad de una isozima transcetolasa (tktA y/o tktB). En cualquier aspecto de la invención, se proporcionan en el presente documento células recombinantes según se reivindican que comprenden uno o más ácidos nucleicos expresados de forma heteróloga que codifican para polipéptidos de fosfocetolasa tal como se divulga en el presente documento y se modifican por ingeniería genética adicionalmente para aumentar la actividad de una isozima transaldolasa (talA o talB). En cualquier aspecto de la invención, se proporcionan en el presente documento células recombinantes según se reivindican que comprenden uno o más ácidos nucleicos expresados de forma heteróloga que codifican para polipéptidos de fosfocetolasa tal como se divulga en el presente documento y se modifican por ingeniería genética adicionalmente para aumentar la actividad de una isozima ribosa-5-fosfato isomerasa (rpiA y/o rpiB). En cualquier aspecto de la invención, se proporcionan en el presente documento células recombinantes según se reivindican que comprenden uno o más ácidos nucleicos expresados de manera más heteróloga que codifican para polipéptidos de fosfocetolasa tal como se divulga en el presente documento y se modifican por ingeniería genética adicionalmente para aumentar la actividad de una isozima ribulosa-5-fosfato 3-epimerasa (rpe).
Con el fin de dirigir el carbono hacia la enzima fosfocetolasa, la glucosa 6-fosfato 1-deshidrogenasa puede modularse (por ejemplo, disminuir la actividad enzimática). En algunos aspectos, la actividad glucosa 6-fosfato 1-deshidrogenasa (zwf) (por ejemplo, el gen de la glucosa 6-fosfato 1-deshidrogenasa endógena) puede disminuirse o atenuarse. En determinadas realizaciones, la atenuación se logra delecionando la glucosa 6-fosfato 1-deshidrogenasa. En algunos aspectos, la actividad glucosa 6-fosfato 1-deshidrogenasa se modula disminuyendo la actividad de una glucosa 6-fosfato 1-deshidrogenasa endógena. Esto puede lograrse reemplazando el promotor del gen de la glucosa 6-fosfato 1-deshidrogenasa endógena con un promotor sintético de expresión constitutivamente baja. En cualquier aspecto de la invención, se proporcionan en el presente documento células recombinantes según se reivindican que comprenden uno o más ácidos nucleicos expresados de forma heteróloga que codifican para polipéptidos de fosfocetolasa tal como se divulga en el presente documento y se modifican por ingeniería genética adicionalmente para disminuir la actividad glucosa 6-fosfato 1-deshidrogenasa (zwf). En el presente documento también se contempla la modulación de la actividad (por ejemplo, disminución) de isozimas glucosa 6-fosfato 1-deshidrogenasa. En cualquier aspecto de la invención, se proporcionan en el presente documento células recombinantes según se reivindican que comprenden uno o más ácidos nucleicos expresados de forma heteróloga que codifican para polipéptidos de fosfocetolasa tal como se divulga en el presente documento y se modifican por ingeniería genética adicionalmente para disminuir la actividad de una isozima glucosa 6-fosfato 1-deshidrogenasa.
Rutas que implican la fosfofructocinasa
La fosfofructocinasa es una enzima crucial de la glicólisis que cataliza la fosforilación de la fructosa 6-fosfato. E. coli tiene dos isozimas codificadas por pfkA y pfkB. La mayor parte de la actividad fosfofructocinasa en la célula se debe a pfkA (Kotlarz et al. 1975 Biochim. Biofis Acta 381: 257-268).
Con el fin de dirigir el carbono hacia la enzima fosfocetolasa, la expresión de la fosfofructocinasa puede modularse (por ejemplo, disminuir la actividad enzimática) para permitir que fluya más carbono hacia la fructosa 6-fosfato y la xilulosa 5-fosfato, aumentando así la producción final de mevalonato, isopreno e isoprenoides. La disminución de la actividad fosfofructocinasa puede ser cualquier cantidad de reducción de la actividad específica o actividad total en comparación con cuando no se ha efectuado ninguna manipulación. En algunos casos, la disminución de la actividad enzimática se reduce en al menos aproximadamente el 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96 %, 97%, 98%, 99% o el 100%. En algunos aspectos, la actividad fosfofructocinasa se modula disminuyendo la actividad de una fosfofructocinasa endógena. Esto puede lograrse reemplazando el promotor del gen de la fosfofructocinasa endógena con un promotor sintético de expresión constitutivamente baja. El gen que codifica para la fosfofructocinasa también puede delecionarse. La disminución de la actividad fosfofructocinasa puede dar como resultado un mayor flujo de carbono hacia la ruta de biosíntesis dependiente de mevalonato en comparación con células que no tienen una expresión reducida de la fosfofructocinasa.
En cualquier aspecto de la invención, se proporcionan en el presente documento células recombinantes según se reivindican que comprenden uno o más ácidos nucleicos expresados de forma heteróloga que codifican para polipéptidos de fosfocetolasa tal como se divulga en el presente documento y se modifican por ingeniería genética adicionalmente para disminuir la actividad fructosa 6-fosfato (pfkA y/o pfkB). La modulación de la actividad (por ejemplo, disminución) de las isozimas fructosa 6-fosfato también se contempla en el presente documento. En cualquier aspecto de la invención, se proporcionan en el presente documento células recombinantes que comprenden uno o más ácidos nucleicos expresados de manera heteróloga que codifican para polipéptidos de fosfocetolasa tal como se divulga en el presente documento y se modifican por ingeniería genética adicionalmente para disminuir la actividad de una isozima fructosa 6-fosfato.
Rutas que implican el complejo de piruvato deshidrogenasa
El complejo de piruvato deshidrogenasa, que cataliza la descarboxilación del piruvato en acetil-CoA, se compone de las proteínas codificadas por los genes aceE, aceF e lpdA. La transcripción de esos genes está regulada por varios reguladores. Por tanto, un experto en la técnica puede aumentar la acetil-CoA modulando la actividad del complejo de piruvato deshidrogenasa. La modulación puede ser aumentar la actividad y/o la expresión (por ejemplo, la expresión constante) del complejo de piruvato deshidrogenasa. Esto puede realizarse de diferentes maneras, por ejemplo, colocando un promotor constitutivo fuerte, como PL.6 (aattcatataaaaaacatacagataaccatctgcggtgataaattatctctggcggtgttgacataaataccactggcggtgatactgagcac atcagcaggacgcactgaccaccatgaaggtg - promotor lambda, GenBank NC_001416), delante del operón o usando uno o más promotores sintéticos de expresión constitutiva.
Por consiguiente, en un aspecto, la actividad piruvato deshidrogenasa se modula aumentando la actividad de una o más enzimas del complejo de piruvato deshidrogenasa que consiste en (a) piruvato deshidrogenasa (E1), (b) dihidrolipoil transacetilasa y (c) dihidrolipoil deshidrogenasa. Se entiende que uno, dos o tres de los genes que codifican para estas enzimas pueden manipularse para aumentar la actividad piruvato deshidrogenasa. En otro aspecto, la actividad del complejo de piruvato deshidrogenasa puede modularse atenuando la actividad de un represor endógeno de complejo de piruvato deshidrogenasa, detallado más adelante. La actividad de un represor de complejo de piruvato deshidrogenasa endógena puede atenuarse mediante la deleción del gen represor de complejo de piruvato deshidrogenasa endógena.
En algunos casos, uno o más genes que codifican para el complejo de piruvato deshidrogenasa son genes endógenos. Otra forma de aumentar la actividad del complejo de piruvato deshidrogenasa es mediante la introducción en la célula de uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican para uno o más polipéptidos del grupo que consiste en (a) piruvato deshidrogenasa (E1), (b) dihidrolipoil transacetilasa y c) dihidrolipoil deshidrogenasa.
Al usar cualquiera de estos métodos, las células recombinantes pueden producir cantidades aumentadas de acetil-Co-A en comparación con células en las que la actividad piruvato deshidrogenasa no está modulada. La modulación de la actividad piruvato deshidrogenasa puede dar como resultado un mayor flujo de carbono hacia la ruta de biosíntesis dependiente de mevalonato en comparación con células que no tienen la expresión de piruvato deshidrogenasa modulada.
Rutas que implican el sistema de fosfotransferasa
El sistema de fosfotransferasa dependiente de fosfoenolpiruvato (PTS) es un sistema multicomponente que transporta y fosforila simultáneamente sus sustratos de hidratos de carbono a través de una membrana en un proceso que depende de la energía proporcionada por el fosfoenolpiruvato intermedio glicolítico (PEP). Los genes que regulan el PTS están en su mayoría agrupados en operones. Por ejemplo, el operón pts (ptsHIcrr) de Escherichia coli se compone de los genes ptsH, ptsI y crr que codifican para tres proteínas centrales para el sistema de fosfotransferasa dependiente de fosfoenolpiruvato (PTS), la HPr (ptsH), la enzima I (ptsI) y proteínas EIIIGlc (crr). Estos tres genes están organizados en un operón complejo en el que la mayor parte de la expresión del gen distal, err, se inicia desde una región promotora dentro de ptsI. Además de los genes del operón pts, ptsG codifica para el transportador específico de glucosa del sistema de fosfotransferasa, la transcripción ptsG de esta región promotora está bajo el control positivo de la proteína activadora de catabolitos (CAP)- AMP cíclico (AMPc) y se mejora durante el crecimiento en presencia de glucosa (un sustrato de PTS). Además, el gen ppsA codifica para la fosfoenolpiruvato sintetasa para la producción de fosfoenolpiruvato (PEP) que se requiere para la actividad del sistema de fosfotransferasa (PTS). El flujo de carbono lo dirige la fosfoenolpiruvato sintetasa a través de la ruta de la piruvato deshidrogenasa o la ruta de la STP. Véase Postma, P.W., et al., Microbiol Rev. (1993), 57 (3): 543-94).
En determinadas realizaciones descritas en el presente documento, la regulación por disminución (por ejemplo, atenuación) del operón pts puede mejorar el uso de acetato por células huésped. La regulación por disminución de la actividad del operón PTS puede ser cualquier cantidad de reducción de la actividad específica o actividad total en comparación con cuando no se ha efectuado ninguna manipulación. En algunos casos, la disminución de la actividad del complejo se reduce en al menos aproximadamente el 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o el 99%. En determinadas realizaciones, la atenuación se logra delecionando el operón pts. En algunos aspectos, la actividad del sistema PTS se modula disminuyendo la actividad de un operón pts endógeno. Esto puede lograrse reemplazando el/los promotor(es) endógeno(s) dentro del operón pts con promotor(es) de expresión constitutivamente baja sintético(s). En cualquier aspecto de la invención, se proporcionan en el presente documento células recombinantes según se reivindican que comprenden uno o más ácidos nucleicos expresados de manera heteróloga que codifican para polipéptidos de fosfocetolasa tal como se divulga en el presente documento y se modifican por ingeniería genética adicionalmente para disminuir la actividad del operón pts. En cualquier aspecto de la invención, se proporcionan en el presente documento células recombinantes según se reivindican que comprenden uno o más ácidos nucleicos expresados de manera heteróloga que codifican para polipéptidos de fosfocetolasa tal como se divulga en el presente documento y se modifican por ingeniería genética adicionalmente para disminuir la actividad de EI (ptsI). En cualquier aspecto de la invención, se proporcionan en el presente documento células recombinantes según se reivindican que comprenden uno o más ácidos nucleicos expresados de forma heteróloga que codifican para polipéptidos de fosfocetolasa tal como se divulga en el presente documento y se modifican por ingeniería genética adicionalmente para disminuir la actividad de EIICBGlc (ptsG). En cualquier aspecto de la invención, se proporcionan en el presente documento células recombinantes según se reivindican que comprenden uno o más ácidos nucleicos expresados de forma heteróloga que codifican para polipéptidos de fosfocetolasa tal como se divulga en el presente documento y se modifican por ingeniería genética adicionalmente para disminuir la actividad de EIIAGlc (crr). En cualquier aspecto de la invención, se proporcionan en el presente documento células recombinantes según se reivindican que comprenden uno o más ácidos nucleicos expresados de manera heteróloga que codifican para polipéptidos de fosfocetolasa tal como se divulga en el presente documento y se modifican por ingeniería genética adicionalmente para disminuir la actividad de HPr (ptsH). Para disminuir la pérdida de carbono a través de la piruvato deshidrogenasa al mismo tiempo que se aumenta el conjunto de PEP para la captación de glucosa, la actividad de fosfoenolpiruvato sintetasa (ppsA) puede aumentarse. En cualquier aspecto de la invención, se proporcionan en el presente documento células recombinantes según se reivindican que comprenden uno o más ácidos nucleicos expresados de manera heteróloga que codifican para polipéptidos de fosfocetolasa tal como se divulga en el presente documento y se modifican por ingeniería genética adicionalmente para aumentar la actividad de fosfoenolpiruvato sintetasa (ppsA). En cualquier aspecto adicional de la invención, el PTS está regulado por disminución y la ruta de transporte de glucosa está regulada por incremento. Una ruta de transporte de glucosa incluye, pero no se limita a, galactosa (galP) y glucocinasa (glk). En algunas realizaciones, el operón pts está regulado por disminución, el gen de galactosa (galP) está regulado por incremento y el gen de glucocinasa (glk) está regulado por incremento. La modulación de la actividad (por ejemplo, disminución) de las isozimas del PTS también se contempla en el presente documento. En cualquier aspecto de la invención, se proporcionan en el presente documento células recombinantes según se reivindican que comprenden uno o más ácidos nucleicos expresados de forma heteróloga que codifican para polipéptidos de fosfocetolasa tal como se divulga en el presente documento y se modifican por ingeniería genética adicionalmente para disminuir la actividad de las isozimas de PTS.
Rutas que implican el uso de xilosa
En determinadas realizaciones descritas en el presente documento, el uso de xilosa es deseable para convertir el azúcar derivado de la biomasa vegetal en productos deseados, tales como mevalonato, tales como precursores de isoprenoides, isopreno y/o isoprenoides. En algunos organismos, el uso de xilosa requiere el uso de la ruta de pentosa fosfato para la conversión en fructosa-6-fosfato para el metabolismo. Los organismos pueden modificarse por ingeniería genética para uso de xilosa mejorado, o bien desactivando la represión del catabolito por la glucosa, o bien por la expresión heteróloga de genes del operón de xilosa que se encuentra en otros organismos. La ruta de la xilulosa puede modificarse por ingeniería genética tal como se describe a continuación para mejorar la producción de mevalonato, precursores de isoprenoides, isopreno y/o isoprenoides a través de la ruta de la fosfocetolasa.
Sería beneficioso el aumento de la captación de xilosa y la conversión en xilulosa-5-fosfato seguida de una entrada directa en la ruta de la fosfocetolasa. Sin pretender limitarse a ninguna teoría, esto permite que el flujo de carbono eluya la ruta de la pentosa fosfato (aunque algunos gliceraldehído-3-fosfato pueden ciclarse a p Pp según sea necesario). La expresión mejorada de xilocinasa puede usarse para aumentar la producción total de xilulosa-5-fosfato. La optimización de la expresión y la actividad xilocinasa puede usarse para mejorar el uso de la xilosa en una cepa con una ruta de la fosfocetolasa. La xilocinasa deseada puede ser o bien la enzima del huésped endógeno, o bien cualquier xilocinasa heteróloga compatible con el huésped. En una realización, otros componentes del operón de xilosa pueden sobreexpresarse para aumentar el beneficio (por ejemplo, xilosa isomerasa). En otra realización, otras enzimas de la ruta de xilosa (por ejemplo, xilosa reductasa) pueden necesitar atenuación (por ejemplo, actividad reducida o eliminada).
Por consiguiente, las células huésped modificadas por ingeniería genética para tener enzimas fosfocetolasa tal como se describe en el presente documento pueden modificarse por ingeniería genética adicionalmente para expresar xilulosa isomerasa y/o xilocinasa, o bien las formas endógenas o bien formas heterólogas, para mejorar el rendimiento general y la productividad de mevalonato, precursores de isoprenoides, isopreno y/o isoprenoides.
Rutas que implican las enzimas transaldolasa y transcetolasa de la ruta de pentosa fosfato
Algunos microorganismos capaces de crecimiento anaerobio o heterofermentativo incorporan una ruta de la fosfocetolasa en lugar de o además de una ruta glicolítica. Esta ruta depende de la actividad de las enzimas de la ruta de pentosa fosfato transaldolasa y transcetolasa. Por consiguiente, las células huésped modificadas por ingeniería genética para tener enzimas fosfocetolasa tal como se describe en el presente documento pueden modificarse por ingeniería genética adicionalmente para sobreexpresar una transcetolasa y transaldolasa, o bien las formas endógenas o bien formas heterólogas, para mejorar el flujo de la ruta, disminuir los niveles de productos intermedios potencialmente tóxicos, reducir la desviación de productos intermedios a rutas no productivas, y mejorar el rendimiento general y la productividad de mevalonato, precursores de isoprenoides, isopreno y/o isoprenoides.
Combinaciones de mutaciones
Se entiende que para cualquiera de las enzimas y/o rutas enzimáticas descritas en el presente documento, manipulaciones moleculares que modulan cualquier combinación (dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece o catorce) de las enzimas y/o rutas de enzimas descritas en el presente documento se contempla expresamente. Para facilitar la recitación de las combinaciones, la citrato sintasa (gltA) se designa como A, la fosfotransacetilasa (pta) se designa como B, la acetato cinasa (ackA) se designa como C, la lactato deshidrogenasa (ldhA) se designa como D, la gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (gap) se designa como E, y la piruvato descarboxilasa (aceE, aceF y/o lpdA) se designa como F, la fosfogluconato deshidratasa (edd) se designa como G, la 2-ceto-3-desoxigluconato 6-fosfato aldolasa (eda) se designa como H, la fosfofructocinasa se designa como I, la transaldolasa se designa como J, la transcetolasa se designa como K, la ribulosa-5-fosfato-epimerasa se designa como L, la ribosa-5-fosfato epimerasa se designa como M, la xilocinasa se designa como N, la xilosa isomerasa se designa como O, y la xilitol reductasa se designa como P, la ribosa-5-fosfato isomerasa (rpi) se designa como Q, la D-ribulosa-5-fosfato 3-epimerasa (rpe) se designa como R, la fosfoenolpiruvato sintetasa (pps) se designa como S, la fructosa bisfosfato aldolasa (fba) se designa como T, EI (ptsI) se designa como U, EIICBGlc (ptsG) se designa como V, EIIAGlc (crr) se designa como W, HPr (ptsH) se designa como X, la galactosa (galP) se designa como Y, la glucocinasa (glk) se designa como Z, la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (zwf) se designa como AA. Tal como se discutió anteriormente, las enzimas aceE, aceF y/o lpdA del complejo de piruvato descarboxilasa pueden usarse individualmente, o dos de tres enzimas, o tres de tres enzimas para aumentar la actividad piruvato descarboxilasa. Por tanto, todas y cada una de las combinaciones de enzimas designadas como A-M en el presente documento se contemplan expresamente, así como todas y cada una de las combinaciones de enzimas designadas como A-AA. Además, cualquier combinación descrita anteriormente puede usarse en combinación con cualquiera de las enzimas y/o rutas enzimáticas descritas en el presente documento (por ejemplo, fosfocetolasa, polipéptidos de la ruta de MVA, isopreno sintasa, polipéptidos de la ruta de DXP).
Otros reguladores y factores para aumentar la producción
Pueden usarse otras manipulaciones moleculares para aumentar el flujo de carbono hacia la producción de mevalonato. Un método es reducir, disminuir o eliminar los efectos de los reguladores negativos para las rutas que se alimentan en la ruta del mevalonato. Por ejemplo, en algunos casos, los genes aceEF-lpdA están en un operón, con un cuarto gen hacia 5' pdhR. El gen pdhR es un regulador negativo de la transcripción de su operón. En ausencia de piruvato, se une a su promotor diana y reprime la transcripción. También regula ndh y cyoABCD de la misma manera (Ogasawara, H. et al. 2007. J. Bact. 189: 5534-5541). En un aspecto, la deleción del regulador pdhR puede mejorar el suministro de piruvato y, por tanto, la producción de mevalonato, precursores de isoprenoides, isopreno e isoprenoides.
En otras realizaciones, cualquiera de las cepas resultantes descritas anteriormente puede modificarse por ingeniería genética adicionalmente para modular la actividad de la ruta de Entner-Doudoroff. El gen que codifica para la fosfogluconato deshidratasa o la aldolasa puede atenuarse o delecionarse. En otras realizaciones, cualquiera de las cepas resultantes descritas anteriormente también puede modificarse por ingeniería genética para disminuir o eliminar la actividad acetato cinasa o citrato sintasa. En otras realizaciones, cualquiera de las cepas, la cepa resultante también puede modificarse por ingeniería genética para disminuir o eliminar la actividad fosfofructocinasa. En otras realizaciones, cualquiera de las cepas resultantes descritas anteriormente también puede modificarse por ingeniería genética para modular la actividad gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa. La actividad gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa puede modularse disminuyendo su actividad. En otras realizaciones, las enzimas de la rama no oxidativa de la ruta de pentosa fosfato, tales como transcetolasa, transaldolasa, ribulosa-5-fosfato-epimerasa y (o) ribosa-5-fosfato de epimerasa pueden sobreexpresarse.
En otros aspectos, las células huésped pueden modificarse por ingeniería genética adicionalmente para aumentar las concentraciones intracelulares de acetil-fosfato mediante la introducción de ácidos nucleicos heterólogos que codifican para sedoheptulosa-1,7-bisfosfatasa/fructosa-1,6-bisfosfato aldolasa y sedoheptulosa-1,7-bisfosfatasa/fructosa-1,6-bisfosfato fosfatasa. En determinadas realizaciones, las células huésped que tienen estas manipulaciones moleculares pueden combinarse con genes de transaldolasa (talB) y fosfofructocinasa (pfkA y/o pfkB) atenuados o delecionados, permitiendo así una conversión más rápida de eritrosa 4-fosfato, dihidroxiacetona fosfato y gliceraldehído 3-fosfato en sedoheptulosa 7-fosfato y fructosa 1-fosfato (véase la figura 5).
En otros aspectos, la introducción de la 6 -fosfogluconolactonasa (PGL) en las células (como diversas cepas de E. coli) que carecen de PGL pueden usarse para mejorar la producción de mevalonato, precursores de isoprenoides, isopreno e isoprenoides. El PGL puede introducirse mediante la introducción del gen codificador usando integración cromosómica o vehículos extracromosómicos, tales como plásmidos.
Además de las mutaciones de la célula huésped (por ejemplo, célula huésped bacteriana) para modular diversas rutas enzimáticas descritas en el presente documento que aumentan el flujo de carbono hacia la producción de mevalonato, las células huésped descritas en el presente documento comprenden genes que codifican para el polipéptido de fosfocetolasa, así como otras enzimas de la ruta de MVA superior e inferior, que incluye pero no se limita a, productos de genes mvaE y mvaS. Los ejemplos no limitativos de polipéptidos de la ruta de MVA incluyen polipéptidos de acetil-CoA acetiltransferasa (AA-CoA tiolasa), polipéptidos de 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA (HMG-CoA sintasa), polipéptidos de 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA reductasa (HMG-CoA reductasa), polipéptidos de mevalonato cinasa (MVK), polipéptidos de fosfomevalonato cinasa (PMK), polipéptidos difosfomevalonato descarboxilasa (MVD), polipéptidos de fosfomevalonato descarboxilasa (PMDC), polipéptidos de isopentenil fosfato cinasa (IPK), polipéptidos de IDI y polipéptidos (por ejemplo, polipéptidos de fusión) que tienen una actividad de dos o más polipéptidos de la ruta de MVa . Los polipéptidos de la ruta de MVA pueden incluir polipéptidos, fragmentos de polipéptidos, péptidos y polipéptidos de fusión que tienen al menos una actividad de un polipéptido de la ruta de MVA. Los ácidos nucleicos de la ruta de MVA a modo de ejemplo incluyen ácidos nucleicos que codifican para un polipéptido, fragmento de un polipéptido, péptido o polipéptido de fusión que tiene al menos una actividad de un polipéptido de la ruta de MVA. Los polipéptidos y ácidos nucleicos de la ruta de MVA a modo de ejemplo incluyen polipéptidos y ácidos nucleicos que se producen de manera natural a partir de cualquiera de los organismos fuente descritos en el presente documento.
Los ejemplos no limitativos de polipéptidos de la ruta de MVA que pueden usarse se describen en la publicación de solicitud de patente internacional n°. WO2009/076676; W02010/003007 y WO2010/148150.
Medios de cultivo celular a modo de ejemplo
Tal como se usa en el presente documento, los términos “medio mínimo” o “medios mínimo” se refieren a medios de crecimiento que contienen los nutrientes mínimos posibles para el crecimiento celular, en general, pero no siempre, sin la presencia de uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8 , 9, 10 o más aminoácidos). El medio mínimo contiene normalmente: (1 ) una fuente de carbono para el crecimiento bacteriano; (2 ) diversas sales, que pueden variar entre especies bacterianas y condiciones de crecimiento; y (3) agua. La fuente de carbono puede variar significativamente, desde azúcares simples tales como glucosa hasta hidrolizados más complejos de otra biomasa, tal como extracto de levadura, tal como se explica con más detalle a continuación. Las sales proporcionan generalmente elementos esenciales tales como magnesio, nitrógeno, fósforo y azufre para permitir que las células puedan sintetizar proteínas y ácidos nucleicos. El medio mínimo también puede complementarse con agentes selectivos, tales como antibióticos, para seleccionar el mantenimiento de determinados plásmidos y similares. Por ejemplo, si un microorganismo es resistente a un determinado antibiótico, tal como ampicilina o tetraciclina, entonces ese antibiótico puede añadirse al medio para evitar que crezcan las células que carecen de la resistencia. El medio puede complementarse con otros compuestos según sea necesario para seleccionar características fisiológicas o bioquímicas deseadas, tales como aminoácidos particulares y similares.
Puede usarse cualquier formulación de medio mínimo para cultivar las células huésped. Las formulaciones de medio mínimo a modo de ejemplo incluyen, por ejemplo, medio mínimo M9 y medio mínimo TM3. Cada litro de medio mínimo M9 contiene (1) 200 ml de sales m9 estériles (64 g de Na2HPO4-7H2O, 15 g de KH2PO4 , 2,5 g de NaCl y 5,0 g de NH4Cl por litro); (2) 2 ml de MgSO4 1 M (estéril); (3) 20 ml de glucosa al 20% (p/v) (u otra fuente de carbono); y (4) 100 pl de CaCb 1 M (estéril). Cada litro de medio mínimo de TM3 contiene (1) 13,6 g de K2HPO4 ; (2) 13,6 g de KH2PO4 ; (3) 2 g de MgSO4* 7 H2O; (4) 2 g de ácido cítrico monohidratado; (5) 0,3 g de citrato de amonio férrico; (6) 3,2 g de (NH4)2SO4; (7) 0,2 g de extracto de levadura; y (8) 1 ml de disolución de elementos traza 1000X; se ajusta el pH a ~6,8 y la disolución se esteriliza por filtración. Cada litro de disolución de elementos traza 1000X contiene: (1) 40 g de ácido cítrico monohidratado; (2) 30 g de MnSO4* H2O; (3) 10 g de NaCl; (4) 1 g de FeSO4* 7 H2O; (4) 1 g de COCb* 6 H2O; (5) 1 g de ZnSO4* 7 H2O; (6) 100 mg de CuSO4* 5 H2O; (7) 100 mg H3BO3; y (8) 100 mg de NaMoO4* 2 H2O; se ajusta el pH a ~3,0.
Un medio mínimo a modo de ejemplo adicional incluye (1) fosfato de potasio K2HPO4 , (2) sulfato de magnesio MgSO4 * 7 H2O, (3) ácido cítrico monohidratado C6H8O7* H2O, (4) citrato de amonio férrico NH4FeC6HsO7, (5) extracto de levadura (de Biospringer), (6) disolución de metal traza modificada 1000X, (7) ácido sulfúrico al 50% p/v, (8) foamblast 882 (Emerald Performance Materials) y (9) disolución de sales de macro 3,36 ml. Todos los componentes se añaden juntos y se disuelven en H2O desionizada y luego se esterilizan con calor. Después de enfriar a temperatura ambiente, se ajusta el pH a 7,0 con hidróxido de amonio (28%) y c.s.p. enrasar. Se añaden disolución de vitaminas y espectinomicina después de la esterilización y el ajuste del pH.
Puede usarse cualquier fuente de carbono para cultivar las células huésped. El término “fuente de carbono” se refiere a uno o más compuestos que contienen carbono que pueden metabolizarse por una célula u organismo huésped. Por ejemplo, el medio celular usado para cultivar las células huésped puede incluir cualquier fuente de carbono adecuada para mantener la viabilidad o hacer crecer las células huésped. En algunos aspectos, la fuente de carbono es un hidrato de carbono (tal como monosacárido, disacárido, oligosacárido o polisacáridos) o azúcar invertido (por ejemplo, jarabe de sacarosa tratado enzimáticamente).
En algunos aspectos, la fuente de carbono incluye extracto de levadura o uno o más componentes del extracto de levadura. En algunos aspectos, la concentración de extracto de levadura es del 0,1% (p/v), 0,09% (p/v), 0,08% (p/v), 0,07% (p/v), 0,06% (p/v), 0,05% (p/v), 0,04% (p/v), 0,03% (p/v), 0,02% (p/v) o el 0,01% (p/v) de extracto de levadura. En algunos aspectos, la fuente de carbono incluye tanto extracto de levadura (o uno o más componentes del mismo) como otra fuente de carbono, tal como glucosa.
Los monosacáridos a modo de ejemplo incluyen glucosa y fructosa; los oligosacáridos a modo de ejemplo incluyen lactosa y sacarosa, y los polisacáridos a modo de ejemplo incluyen almidón y celulosa. Los hidratos de carbono a modo de ejemplo incluyen azúcares C6 (por ejemplo, fructosa, manosa, galactosa o glucosa) y azúcares C5 (por ejemplo, xilosa o arabinosa).
Condiciones de cultivo celular a modo de ejemplo
Se describen materiales y métodos adecuados para el mantenimiento y crecimiento de las células recombinantes de la invención a continuación, por ejemplo, en la sección de ejemplos. Otros materiales y métodos adecuados para el mantenimiento y crecimiento de cultivos bacterianos se conocen bien en la técnica. Pueden encontrarse técnicas a modo de ejemplo en la publicación internacional n.° WO 2009/076676, publicación de patente estadounidense n.° 2009/0203102, WO 2010/003007, publicación estadounidense n.° 2010/0048964, WO 2009/132220, publicación estadounidense n.° 2010/0003716, Manual of Methods for General Bacteriology Gerhardt et al., eds), Sociedad Americana de Microbiología, Washington, DC (1994) o Brock en Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology, segunda edición (1989) Sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA. En algunos aspectos, las células se cultivan en un medio de cultivo en condiciones que permiten la expresión del polipéptido de fosfocetolasa, así como otras enzimas de la ruta de MVA superior e inferior, incluyendo, pero sin limitarse a, los productos de genes mvaE y mvaS, isopreno sintasa, ruta de DXP (por ejemplo, DXS), IDI, o polipéptidos PGL codificados por un ácido nucleico insertado en las células huésped.
Pueden usarse condiciones de cultivo celular convencionales para cultivar las células (véase, por ejemplo, el documento WO 2004/033646 y las referencias citadas en el mismo). En algunos aspectos, las células se hacen crecer y se mantienen a una temperatura, mezcla de gases y pH adecuados (tal como a de aproximadamente 20°C hasta aproximadamente 37°C, a de aproximadamente el 6% hasta aproximadamente el 84% de CO2 , y a un pH entre de aproximadamente 5 hasta aproximadamente 9). En algunos aspectos, las células se hacen crecer a 35°C en un medio celular apropiado. En algunos aspectos, los intervalos de pH para la fermentación están entre de aproximadamente pH 5,0 hasta aproximadamente pH 9,0 (tal como de aproximadamente pH 6,0 hasta aproximadamente pH 8,0 o de aproximadamente 6,5 hasta aproximadamente 7,0). Las células pueden hacerse crecer en condiciones aerobias, anóxicas o anaerobias según los requisitos de las células huésped. Además, pueden usarse condiciones de cultivo celular más específicas para cultivar las células. Por ejemplo, en algunas realizaciones, las células recombinantes (tales como células de E. coli) comprenden uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican para un polipéptido de fosfocetolasa, así como enzimas de la parte superior, incluyendo, pero sin limitarse a, los productos de genes mvaE y mvaS y los polipéptidos de mvaE y mvaS de L. grayi, E. faecium, E. gallinarum, E. casseliflavus y/o E. faecalis bajo el control de un promotor fuerte en un plásmido de número de copias bajo a medio y se cultivan a 34°C.
Las condiciones de cultivo convencionales y los modos de fermentación, tales como fermentación discontinua, semicontinua o continua que pueden usarse se describen en la publicación internacional n° WO 2009/076676, publicación de patente estadounidense n.° 2009/0203102, WO 2010/003007, publicación estadounidense n.° 2010/0048964, Wo 2009/132220, publicación estadounidense n.° 2010/0003716. Las fermentaciones discontinuas y semicontinuas son comunes y se conocen bien en la técnica y pueden encontrarse ejemplos en Brock, Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology, segunda edición (1989) Sinauer Associates, Inc.
En algunos aspectos, las células se cultivan en condiciones de glucosa limitada. Por “condiciones de glucosa limitada” se entiende que la cantidad de glucosa que se añade es menor o aproximadamente del 105% (tal como de aproximadamente el 100%, 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20% o el 10%) de la cantidad de glucosa que consumen las células. En aspectos particulares, la cantidad de glucosa que se añade al medio de cultivo es aproximadamente la misma que la cantidad de glucosa que consumen las células durante un periodo específico de tiempo. En algunos aspectos, la tasa de crecimiento celular se controla al limitar la cantidad de glucosa añadida, de modo que las células crezcan a la tasa que puede soportar la cantidad de glucosa en el medio celular. En algunos aspectos, la glucosa no se acumula durante el tiempo en que se cultivan las células. En diversos aspectos, las células se cultivan en condiciones de glucosa limitada durante más de o aproximadamente 1, 2, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60 o 70 horas. En diversos aspectos, las células se cultivan en condiciones de glucosa limitada durante más de o aproximadamente el 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95 o el 100% de la longitud de tiempo total de cultivo de las células. Sin pretender limitarse a ninguna teoría en particular, se cree que las condiciones de glucosa limitada pueden permitir una regulación más favorable de las células.
En algunos aspectos, las células recombinantes se hacen crecer en cultivo discontinuo. Las células recombinantes también pueden crecer en cultivo semicontinuo o en cultivo continuo. Además, las células recombinantes pueden cultivarse en medio mínimo, que incluye, pero no se limita a, cualquiera de los medios mínimos descritos anteriormente. El medio mínimo puede complementarse adicionalmente con glucosa al 1,0% (p/v), o cualquier otro azúcar de seis carbonos, o menos. Específicamente, el medio mínimo puede complementarse con glucosa al 1% (p/v), 0,9% (p/v), 0,8% (p/v), 0,7% (p/v), 0,6% (p/v), 0,5 % (p/v), 0,4% (p/v), 0,3% (p/v), 0,2% (p/v) o al 0,1% (p/v). Además, el medio mínimo puede complementarse con extracto de levadura al 0 ,1 % (p/v) o menos. Específicamente, el medio mínimo puede complementarse con extracto de levadura al 0,1% (p/v), 0,09% (p/v), 0,08% (p/v), 0,07% (p/v), 0,06% (p/v), 0,05 % (p/v), 0,04% (p/v), 0,03% (p/v), 0,02% (p/v) o al 0,01% (p/v). Alternativamente, el medio mínimo puede complementarse con glucosa al 1% (p/v), 0,9% (p/v), 0,8% (p/v), 0,7% (p/v), 0,6% (p/v), 0,5 % (p/v), 0,4% (p/v), 0,3% (p/v), 0,2% (p/v) o al 0,1% (p/v) y con extracto de levadura al 0,1% (p/v), 0,09% (p/v), 0,08% (p/v), 0,07% (p/v), 0,06% (p/v), 0,05% (p/v), 0,04% (p/v), 0,03% (p/v), 0,02% (p/v) o al 0,01% (p/v).
Métodos de purificación a modo de ejemplo
En algunos aspectos, cualquiera de los métodos descritos en el presente documento incluye además una etapa de recuperación de los compuestos producidos. En algunos aspectos, cualquiera de los métodos descritos en el presente documento incluye además una etapa de recuperación del isopreno. En algunos aspectos, el isopreno se recupera por absorción-desorción (véase, por ejemplo, la publicación estadounidense n.° 2011/0178261). En algunos aspectos, cualquiera de los métodos descritos en el presente documento incluye además una etapa de recuperación del polipéptido heterólogo. En algunos aspectos, cualquiera de los métodos descritos en el presente documento incluye además una etapa de recuperación del terpenoide o carotenoide.
Los métodos de purificación adecuados se describen con más detalle en la publicación de solicitud de patente estadounidense US2010/0196977 A1.
La invención puede entenderse mejor haciendo referencia a los siguientes ejemplos, que se proporcionan a modo de ilustración y no pretenden ser limitativos.
Ejemplos
Ejemplo 1: Identificación de fosfocetolasas
Para identificar las fosfocetolasas que podrían usarse para mejorar la producción de metabolitos derivados de acetilcoenzima A (derivados de acetil-CoA), isopreno, precursores isoprenoides e isoprenoides en células recombinantes, se usó el programa CDART dentro del sitio web del NCBI para identificar seleccionar todos los productos genéticos. que eran consistentes con la arquitectura de dominio de fosfocetolasa conocida (Geer L et al. (2002), “CDART: protein homology by domain architecture.”, Genome Res.12 (10) 1619-23). Las secuencias se refinaron aún más seleccionando las secuencias refseq de la búsqueda de la arquitectura del dominio original. A continuación, las secuencias se agruparon en 22 grupos distintos según la similitud de secuencia (Clustering by Passing Messages Between Data Points. Brendan J. Frey y Delbert Dueck, University of Toronto Science 315, 972-976, febrero de 2007). Brevemente, las secuencias de aminoácidos se alinearon de forma múltiple usando ClustalW. Se calcularon las identidades porcentuales por pares (PID). Esto se definió operativamente y, en este caso, fue el número de residuos que eran idénticos sobre los residuos que se alinearon. Los PID se convirtieron a distancias mediante la fórmula K = -Ln (1 - D -(D.D)/5) (Kimura, M. The neutral Theory of Molecular Evolution, Camb.Univ.Press, 1983, página 75). Las distancias negativas se usaron como puntuación de similitud en el algoritmo anterior. Se usaron similitudes medias como preferencias para cada punto de datos. Se definieron 22 agrupaciones usando este método (figuras 3-24). El ADN que codifica para la secuencia de aminoácidos de la secuencia representativa central de cada agrupación se sintetizó (figura 2 y tabla 1). En los casos en los que se determinó que el representante central de una agrupación no es probable que represente una fosfocetolasa activa debido a la ausencia de dominios completos de fosfocetolasa, se seleccionó una fosfocetolasa alternativa de esa agrupación para la síntesis de ADN (tabla 1).
Tabla 1. Secuencia representativa central.
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N/D indica que no está hecho
* Reemplazó al representante central Aspergillus fumigatus Af293 (número NCBI 70999652)
Los ADN que codifican para las secuencias de proteínas que eran menos del 90% idénticas entre sí por alineación por pares usando ClustalW dentro de la agrupación 8 , que contenía la fosfocetolasa de Enterococcus gallinarum y de la agrupación 1 1 , que compartían la mayor homología con la agrupación 8 , se diseñaron para la síntesis de proteínas (tabla 2 ).
Tabla 2. Secuencias de la agrupación 8 y la agrupación 11
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Tabla 3. Secuencias de la agrupación 8 -identidad de secuencias de aminoácidos en porcentaje
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Tabla 4: Secuencias de la identidad de secuencias de aminoácidos en porcentaje de la agrupación 11
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Ejemplo 2: Identificación de fosfocetolasas en genomas bacterianos que carecen de fosfofructocinasa
Se realizó una búsqueda de genomas bacterianos que tenían una fosfocetolasa (PKL) anotada, pero no tenían una fosfofructocinasa anotada (PFK), una enzima crítica para el flujo de carbono a través de la glicólisis. Se eligieron varios organismos que se ajustan a estos criterios, y de esta lista cinco PKL, específicamente PKL de Burkholderia phytofirmans PsJN (SEQ ID NO: 47), Lactobacillus buchneri NRRL B-30929 (SEQ ID NO: 48), Bifidobacterium gallicum DSM 20093 (SEQ ID NO: 49), Bifidobacterium dentium Bd1 (SEQ ID NO: 50) y Bifidobacterium bifidum IPLA 20015 (SEQ ID NO: 51), para la investigación de alta actividad y aumento del rendimiento de isopreno a partir de glucosa. Dado que la mayoría de las PKL de la lista completa de organismos no se han caracterizado, las cinco PKL que se eligieron se basaron en la diversidad de secuencias y la mejor evidencia circunstancial de alta actividad que podría obtenerse en la bibliografía. la PKL de Bifidobacterium dentium muestra un pH óptimo de 7 (Sgorbati B., et al., Antonie van Leeuwenhoek 1976 (42), 49-57), mientras que el pH óptimo para otras PKL es generalmente alrededor de 6 (Heath EC., et al., J Bio Chem 1957, 1009-1029). Lactobacillus buchneri se aisló como un contaminante de una planta de etanol combustible, y se demostró que crece tanto en glucosa como en xilosa, presumiblemente mediante la actividad PKL o bien en F6 P o bien en X5P para la masa celular y la energía (Liu S., et al., J Ind Microbiol Biotechnol 2008 (35), 75-81). Las PKL de Bifidobacterium bifidum y Bifidobacterium gallicum se eligieron porque estas cepas podían crecer o bien en glucosa o bien en xilosa como única fuente de carbono (Palframan rJ., et al., Curr Issues Intest Microbiol 2003 (4), 71-75).
Ejemplo 3: Clonación de enzimas fosfocetolasa identificadas
Se sometieron a ensayo cada una de las PKL obtenidas de Bifidobacterium longum subsp. infantis, Enterococcus gallinarum, y Clostridium acetobutylicum para determinar la actividad enzimática. Se encontró que la PKL de Bifidobacterium longum subsp. infantis PKL tenía una Km de 5,7 ± 1,16 mM, una kcat de 4,56 ± 0,2 seg.-1, y una kcat/Km de 0,79 ± 0,2 mM’ 1 segundo’1, la PKL de Enterococcus gallinarum tenía una Km de 10,4 ± 1,03 mM, un kcat de 1,35 ± 0,04 seg.-1, y una kcat/Km de 0,13 ± 0,1 mM-1 segundo-1y la PKL de Clostridium acetobutylicum tiene una Km de 10,3 ± 0,67 mM, una kcat de 2,18 ± 0,05 seg.-1, y una kcat/Km de 0 , 21 ± 0,06 mM-1segundo-1, Se usó una construcción que codifica para el Bifidobacterium longum subsp. infantis, Enterococcus gallinarum o Clostridium acetobutylicum como control para examinar las enzimas PKL candidatas para su actividad in vitro e in vivo.
La secuencia de aminoácidos de la PKL de Enterococcus gallinarum (SEQ ID NO: 93) se obtuvo de GenBank y se procesó en el software de optimización de GeneArt para una expresión optimizada en E. coli. Se añadieron dos pares de bases frente al gen PKL para formar un sitio BspHI y se insertó un sitio SacI justo después del codón de parada. El gen PKL sintetizado se clonó en el plásmido de clonación resistente a kanamicina de GeneArt. El gen de la PKL de E. gallinarum se subclonó luego en un vector pTrcHis2B digerido con NcoI/SacI (Life Technologies, Carlsbad, CA) para formar el plásmido pCMP1321 (tabla 5, figura 25).
Se obtuvo ADN cromosómico de la cepa ATCC15697, Bifidobacterium longum subsp. infantis de ATCC (Manassas, VA). El gen que codifica para la PKL de B. longum se amplificó mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) a partir del ADN cromosómico usando los cebadores CMP283: 5'-ctgtatTCATGAcgagtcctgttattggcacc-3' y CMP284: 5'-ctctatGAATTCTCACTCGTTGTCGCCAGCG-3' y la polimerasa Herculasa según el protocolo del fabricante (Life Technologies, Carlsbad, CA). El producto de la PCR se digirió con enzimas de restricción EcoRI y BspHI antes de la purificación. Después de la purificación, el fragmento de aproximadamente 2500 pb se montó en pTrcHis2B (Invitrogen, Carlsbad, CA) digerido con EcoRI/NcoI usando el kit de clonación GENEART Seamless (Invitrogen, Carlsbad, CA) para formar el plásmido pCMP1090 (tabla 5).
Para la construcción del plásmido de control que codifica para una PKL de Clostridium acetobutylicum, el ADN cromosómico de la cepa ATCC BAA-98 se obtuvo de ATCC (Manassas, VA). El gen que codifica para la PKL de Clostridium acetobutylicum se amplificó mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) a partir del ADN cromosómico usando los cebadores CacetpTrcHisBF: 5'-taaggaggaataaaccatgcaaagtataataggaaaacataaggatgaagg-3' y CacetpTrcHisBR: 5'-ttctagaaagcttcgttatacatgccactgccaattagttatttc-3', y la polimerasa Herculasa de acuerdo con el protocolo del fabricante (Life Technologies, Carlsbad, CA).. El producto de la PCR se purificó y se montó en pTrcHis2B (Invitrogen, Carlsbad, CA) digerido con EcoRI/NcoI usando el kit de clonación GENEART Seamless (Invitrogen, Carlsbad, CA) para formar el plásmido pCMP1364 (tabla 3).
Las secuencias de ácido nucleico que codifican para una proteína PKL derivada de cada uno de Bifidobacterium dentium, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium gallicum, Lactobacillus buchneri, Burkholderia phytofirmans y Clostridium acetobutylicum (SEQ ID NO: 94) eran codones optimizados para la expresión en E. coli y sintetizados por Gene Oracle (Mountain View, CA). Estos genes de PKL optimizados por codón se amplificaron por PCR y se subclonaron en el plásmido de expresión pTrcHis2B usando el kit de clonación GeneArt Seamless (Life Technologies), según el protocolo recomendado por el fabricante. La tabla 5 a continuación enumera los cebadores usados para la construcción de plásmidos pMCS530 a pMCS535. Las enzimas PKL se clonaron corriente abajo del promotor pTrc para permitir la expresión inducible de los genes de fosfocetolasa mediante IPTG (tabla 6 , figuras 26­ 31).
Tabla 5. Cebadores usados para la construcción de plásmidos.
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Tabla 6. Plásmidos que codifican para PKL
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pMCS535 pTrcHis2B de PKL de C. acetobutylicum, Carb
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Carb indica carbenicilina
Las secuencias de ácido nucleico que codifican para una proteína PKL derivada de cada uno de los organismos enumerados en la tabla 1, la tabla 2, y las agrupaciones 1-22 (véanse las figuras 3-24) están optimizadas por codones para la expresión en E. coli y sintetizadas. Estos genes de PKL con codones optimizados se subclonan en el plásmido de expresión pTrcHis2B en sentido descendente del promotor pTrc para permitir la expresión inducible del gen de la fosfocetolasa por IPTG.
Ejemplo 4: construcción de cepas que expresan PKL identificadas para estudios in vitro
Las cepas que expresaban PKL se construyeron transformando la cepa CMP1133 (BL21, Apg1 PL.2mKKDyl, GI1.2gltA, yhfSFRTPyddVIspAyhfS, thiFRTtruncIspA) con los plásmidos enumerados en la tabla 5 y seleccionando las colonias en placas Luria-Bertani que contenían 20 pg/ml de kanamicina. El marcador de kanamicina se eliminó usando el protocolo recomendado por el fabricante (Gene Bridges, Heidelberg, Alemania) para formar las cepas indicadas (tabla 7).
Tabla 7: Descripción de cepas de E. coli
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Se construyen cepas que expresan PKL, cada una expresando una PKL identificada, transformando la cepa CMP1133 (BL21, Apgl PL.2mKKDyl, GI1.2gltA, yhfSFRTPyddVIspAyhfS, thiFRTtruncIspA) con un plásmido que codifica para una PKL enumerado en la tabla 1, tabla 2 y agrupaciones 1-22 (véanse las figuras 3-24) y se selecciona para colonias en placas de Luria-Bertani que contienen 20 pg/ml de kanamicina. El marcador de kanamicina se elimina usando el protocolo recomendado por el fabricante (Gene Bridges, Heidelberg, Alemania).
Ejemplo 5: Comparación de la expresión y la solubilidad de las PKL identificadas
Se hicieron crecer cepas que expresan pTrcHis2B B. longum (cepa CMP1183), pTrcHis2B E. gallinarum (cepa CMP1328), pTrcHis2B C. acetobutylicum (cepa CMP1366), pTrcHis2B PKL de B. dentium (cepa MCS545), pTrcHis2B B. bifidum (cepa MCS546), pTrcHis2B PKL de B. gallicum (cepa MCS547), pTrcHis2B p Kl de L. buchneri (cepa MCS548), pTrcHis2B PKL de B. phytofirmans (cepa MCS549), o pTrcHis2B PKL de C. acetobutylicum optimizada (cepa MCS550) en medios LB, se indujeron a DO600 ~ 0,5 con IPTG 200 pM, y se indujeron durante 4 horas a una temperatura de 30°C o 34°C. Se recogieron las células mediante centrifugación de 4 ml de caldo de cultivo a 3000 rpm durante 10 minutos. Se resuspendieron los sedimentos celulares en 2 ml de MES 50 mM, NaCl 50 mM, pH 6,0 con ADNasal al 0,1% y AEBSF 0,5 mM. Se lisó la suspensión celular usando una célula de presión francesa a 14.000 psi (American Instrument Company). Luego se centrifugó el lisado a 15.000 rpm durante 10 minutos a 4°C en una centrífuga Eppendorf 5804r . Se separaron el sobrenadante y el sedimento. Se resuspendieron los sedimentos en el tampón de lisis MES 50 mM, NaCl 50 mM pH 6,0. Se analizaron las muestras de sobrenadante y de sedimento mediante electroforesis en gel con SDS-PAGE al 4-12%. Se evaluó la solubilidad mediante la comparación de las fracciones de fosfocetolasa soluble frente a sedimento (insoluble).
Los resultados mostraron que PKL de C. acetobutylicum optimizada (figura 32A, carril 9) se expresó a un nivel mayor en comparación con PKL de C. acetobutylicum sin codones optimizados (figura 32A, carril 3). Todas las PKL de B. dentium (figura 32A, carril 4), B. bifidium (figura 32A, carril 5) y B. gallicum (figura 32A, carril 6) a un nivel similar a PKL de C. acetobutylicum (figura 32A, carril 3) y eran en su mayoría solubles (figura 32B). En comparación, L. buchneri (carril 7) y B. phytofirmans (carril 8) eran casi completamente insolubles (figura 32B).
Se hacen crecer cepas que expresan una PKL enumerada en la tabla 1, la tabla 2 y las agrupaciones 1-22 (véanse las figuras 3-24) en medios LB, se inducen a DO600 ~ 0,5 con IPTG 200 pM y se inducen durante 4 horas a una temperatura de 30°C o 34°C. Se recogen las células mediante centrifugación de 4 ml de caldo de cultivo a 3000 rpm durante 10 minutos. Se resuspenden los sedimentos celulares en 2 ml de MES 50 mM, NaCl 50 mM, pH 6,0 con ADNasa al 0,1% y AEBSF 0,5 mM. Se lisa la suspensión celular usando una célula de presión francesa a 14.000 psi (American Instrument Company). Luego se centrifuga el lisado a 15.000 rpm durante 10 minutos a 4°C en una centrífuga Eppendorf 5804R. Se separan el sobrenadante y el sedimento. Se resuspenden los sedimentos en el tampón de lisis (MES 50 mM, NaCl 50 mM pH 6,0). Se analizan las muestras de sobrenadante y de sedimento mediante electroforesis en gel SDS-PAGE al 4-12%. Se evalúa la solubilidad mediante la comparación de las fracciones de fosfocetolasa soluble frente a sedimento (insoluble).
Ejemplo 6: Examen in vitro para determinar la actividad fosfocetolasa en cepas que expresan PKL identificadas
Se hicieron crecer cepas que expresan pTrcHis2B B. longum (cepa CMP1183), pTrcHis2B E. gallinarum (cepa CMP1328), pTrcHis2B C. acetobutylicum (cepa CMP1366), pTrcHis2B PKL de B. dentium (cepa MCS545), pTrcHis2B B. bifidum (cepa MCS546), pTrcHis2B PKL de B. gallicum (cepa MCS547), pTrcHis2B p Kl de L. buchneri (cepa MCS548), pTrcHis2B PKL de B. phytofirmans (cepa MCS549), o pTrcHis2B PKL de C. acetobutylicum optimizada (cepa MCS550) en medio LB con 50 pg/ml de carbenicilina a 37°C antes de la inducción. Después de la inducción con IPTG 10 pM, 25 pM, 50 pM o 100 pM, se transfirieron los cultivos a un agitador a 34°C durante 30 minutos. Se recogieron las células mediante centrifugación a 10.000 rpm durante 10 minutos a 4°C. Se almacenaron los sedimentos celulares a -80°C antes de la purificación. Para la purificación, se resuspendieron sedimentos celulares de PKL en MES 50 mM, pH 6,0, NaCl 50 mM, AEBSF 0,5 mM, 0,1 mg/ml de ADNasal. Se lisaron las células mediante paso repetido por medio de una prensa francesa y se clarificaron mediante ultracentrifugación a 50.000 rpm durante 60 min. Se cargó lisado clarificado que contiene la PKL de B. longum, E. gallinarum, C. acetobutylicum, B. dentium, B. bifidum, B. gallicum, L. buchneri, B. phytofirmans o C. acetobutylicum en una columna DEAE HiTrap FF equilibrada en MES 50 mM, NaCl 50 mM, pH 6 y se eluyó con un gradiente hasta MES 50 mM, NaCl 1 M, pH 6. Se analizaron las fracciones resultantes mediante SDS-PAGE. Se agruparon las fracciones que contienen PKL y se desalaron usando una columna de desalación G25 en MES 50 mM, NaCl 50 mM, pH 6,0. Se logró purificación adicional usando una columna MonoQ 10/100 GL equilibrada en MES 50 mM, NaCl 50 mM, pH 6 con un gradiente de sal hasta NaCl 1 M. Se midió la cantidad de AcP formado por cada PKL usando una versión reducida del ensayo de hidroxamato descrito en L. Meile et. al., Bacteriol., 2001, 183: 2929-2936 y Frey et. al., Bioorganic Chem., 2008, 36: 121-127. Se realizaron los ensayos en un formato de placa de 96 pocillos (catálogo Costar n° 9017), a 37°C. Cada 300 pl de reacción contenía TPP 1 mM, fosfato de potasio 10 mM, pH 6,0, MES 50 mM, pH 6, MgCh 10 mM, F6P 5 mM y PKL a una concentración de 250 nM. Se tomaron puntos de tiempo a diversos intervalos. Para detener la reacción, se mezclaron 60 pl de la mezcla de reacción con 60 pl de hidroxilamina 2 M a pH 6,5, se incubaron durante 10 minutos a temperatura ambiente. Se usó adición de 40 pl de TCA al 15%, 40 pl de HCl 4 M y 40 pl de FeCb al 5% en HCl 0,1 M para precipitar la proteína y permitir la detección de AcP. Luego, se centrifugaron las muestras a 3000 rpm durante 10 min. Se transfirió una muestra de 200 pl de sobrenadante a una placa de microtitulación y un lector de placa, y se monitorizaron cambios de absorbancia asociados con la cantidad de AcP formado a 505 nm.
Los resultados mostraron que PKL de C. acetobutylicum optimizada tenía actividad de F6P y produjo cantidades mayores de AcP en comparación con PKL de C. acetobutylicum sin codones optimizados (figura 33). B. dentium tenía una actividad de F6P de PKL similar a la PKL de C. acetobutylicum sin codones optimizados. Las PKL de B. dentium y B. gallicum tenían una actividad de F6P significativa y eran comparables a la actividad de F6P de PKL de E. gallinarum. En comparación, PKL de L. buchneri (figura 33) y PKL de B. phytofirmans no demostró la actividad de F6P que se apoya en el descubrimiento de que estas PKL son casi completamente insolubles.
Se cultivan las cepas que expresan una PKL identificada en la tabla 1, la tabla 2 y las agrupaciones 1-22 (véanse las figuras 3-24) en medio LB con 50 pg/ml de carbenicilina a 37°C antes de la inducción. Después de la inducción con IPTG 10 pM, 25 pM, 50 pM o 100 pM, los cultivos se transfieren a un agitador a 34°C durante 30 minutos. Se recogen las células mediante centrifugación a 10.000 rpm durante 10 minutos a 4°C. Para la purificación, se resuspenden los sedimentos celulares de PKL en MES 50 mM, pH 6,0, NaCl 50 mM, AEBSF 0,5 mM, 0,1 mg/ml de ADNasal. Se lisan las células mediante paso repetido por medio de una prensa francesa y se clarifican mediante ultracentrifugación a 50.000 rpm durante 60 min. Se carga el lisado clarificado que contiene las PKL en una columna DEAE HiTrap FF equilibrada en MES 50 mM, NaCl 50 mM, pH 6 y se eluye con un gradiente hasta MES 50 mM, NaCl 1 M, pH 6. Se analizan las fracciones resultantes mediante SDS-PAGE. Se agrupan fracciones que contienen PKL y se desalan usando una columna de desalación G25 en MES 50 mM, NaCI 50 mM pH 6,0. Se logra purificación adicional usando una columna MonoQ 10/100 GL equilibrada en MES 50 mM, NaCl 50 mM, pH 6 con un gradiente de sal hasta NaCl 1 M. Se mide la cantidad de AcP formado por cada PKL usando una versión reducida del ensayo de hidroxamato descrito en L. Meile et. al., Bacteriol., 2001, 183: 2929-2936 y Frey et. al., Bioorganic Chem., 2008, 36: 121-127. Se realizan los ensayos en un formato de placa de 96 pocillos (n.° de catálogo Costar 9017), a 37°C. Cada reacción de 300 pl contiene TPP 1 mM, fosfato de potasio 10 mM, pH 6,0, MES 50 mM, pH 6 , MgCl2 10 mM, F6 P y PKL 5 mM a una concentración de 250 nM. Se toman puntos de tiempo a diversos intervalos. Para detener la reacción, se mezclan 60 pl de la mezcla de reacción con 60 pl de hidroxilamina 2 M a pH 6,5, se incuban durante 10 minutos a temperatura ambiente. Se usa adición de 40 pl de TCA al 15%, 40 pl de HCl 4 M y 40 pl de FeCl3 al 5% en HCl 0,1 M para precipitar la proteína y permitir la detección de AcP. Luego se centrifugan las muestras a 3000 rpm durante 10 min. Se transfiere una muestra de 200 pl de sobrenadante a una placa de microtitulación y un lector de placa, y se monitorizan los cambios de absorbancia asociados con la cantidad de AcP formado a 505 nm.
Ejemplo 7: Examen in vivo de la actividad fosfocetolasa en cepas que expresan fosfocetolasas identificadas (PKL)
Se evaluaron las actividades in vivo de las enzimas fosfocetolasa (PKL) en una cepa mutante que no tiene actividad transcetolasa (tkt). La transcetolasa es responsable de la producción de eritrosa-4-fosfato (E4P), el sustrato para todas las vitaminas aromáticas y aminoácidos en E. coli. El crecimiento de E. coli en medio mínimo con glucosa como fuente de carbono en ausencia de actividad transcetolasa, por tanto no es posible debido a la auxotrofia aromática (Zhao y Winkler 1994). La transcetolasa también está implicada en la interconversión de xilulosa-5-fosfato (X5P) con sedoheptulosa-7-fosfato (S7P) y gliceraldehído-3-fosfato (GAP) y el crecimiento de un mutante de tkt en medio mínimo con xilosa como fuente de carbono tampoco es posible, ya que la actividad de tkt es la única salida a la glicólisis de la ruta de pentosa fosfato. Dado que la fosfocetolasa produce E4P a partir de F6 P, y GAP a partir de X5P, las enzimas funcionales pueden rescatar los defectos de crecimiento de un mutante de tkt cuando se cultivan en glucosa (lo que indica la actividad de F6 P) o xilosa (lo que indica tanto actividad de X5P como actividad de F6 P). Por tanto, puede usarse crecimiento de mutantes complementados para someter a prueba las diferentes actividades in vivo de las enzimas fosfocetolasa.
Construcción de cepas
Se usaron técnicas de biología molecular convencionales para amplificar mutaciones de la colección Keio mediante PCR, realizar transducción de P1, realizar inserciones de GeneBridges (protocolo del fabricante), amplificación por PCR (Pfu Turbo o Herculase, protocolo del fabricante), transformar plásmidos y cultivar y propagar cepas. Brevemente, ya que hay dos enzimas transcetolasa en el genoma de E. coli, ambas tuvieron que desactivarse para generar un mutante nulo de transcetolasa. Se amplificó el inserto de kanamicina en tktB por PCR de la colección Keio y se introdujo mediante recombinación en BL21. Se confirmó el casete de resistencia a antibióticos en tktB mediante PCR y luego sobresalió en bucle usando el plásmido pCP20 (tabla 5). Luego se introdujo la mutación de tktA en BL21 por el mismo método y posteriormente se introdujo en el mutante de tktB por transducción de P1 para generar una cepa mutante nula de transcetolasa (tabla 6 ). Esta cepa, DW809, sólo creció en medio mínimo de glucosa M9 con casaminoácidos que no contribuyeron sustancialmente al suministro de aminoácidos aromáticos y un complemento adicional de todos los compuestos aromáticos, incluyendo tirosina, fenilalanina, triptófano, paminobenzoato, 2-3-dihidroxibenzoato, p-hidroxibenzoato y piridoxina (tal como se indica en Zhao y Winkler, 1994). Esta combinación de seis compuestos aromáticos y piridoxina se denomina posteriormente “complemento aromático”. Luego se transformaron plásmidos que albergan diferentes enzimas fosfocetolasa en la cepa mutante de la transcetolasa y se seleccionaron para el crecimiento en casaminoácidos de glucosa M9 con el complemento aromático y la carbenicilina (tabla 6 ). Luego se sometieron a ensayo las cepas para determinar el crecimiento en un Enzyscreen Growth Profiler (Enzyscreen, BV) o bien en glucosa M9 o bien en xilosa sin el complemento aromático y se compararon con la cepa de control que no expresaba una enzima fosfocetolasa. Se indujeron enzimas fosfocetolasa en el mutante nulo de transcetolasa a dos concentraciones diferentes de IPTG, 20 pM y 60 pM.
Se transforma la cepa mutante nula de transcetolasa con una PKL identificada enumerada en la tabla 1, la tabla 2 o las agrupaciones 1-22 (véanse las figuras 3-24) y se selecciona para determinar el crecimiento en casaminoácidos de glucosa M9 con el complemento aromático y la carbenicilina. Luego se sometieron a ensayo las cepas se para determinar el crecimiento en un Enzyscreen Growth Profiler (Enzyscreen, BV) o bien en glucosa M9 o bien en xilosa sin el complemento aromático y se comparan con la cepa de control que no expresaba una enzima fosfocetolasa. En el mutante nulo de la transcetolasa se inducen enzimas fosfocetolasa a dos concentraciones diferentes de IPTG, 20 pM y 60 pM.
Tabla 8. Cebadores para someter a prueba la presencia de mutaciones de tktA y tktB
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Tabla 9. Cepas modificadas por ingeniería genética que expresan PKL
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Resultados
En este ensayo, el mutante de la transcetolasa creció en glucosa sólo con complemento (figura 34) y no creció en xilosa con o sin complemento (figura 36). El crecimiento del mutante nulo de la transcetolasa que expresa diferentes fosfocetolasas destacó el comportamiento diferencial in vivo de estas enzimas. PKL de E. gallinarum mostró el mejor rendimiento tanto en glucosa como en xilosa, lo que indica una actividad suficiente de F6P y X5P para mantener el crecimiento del mutante de la transcetolasa en ausencia de complemento (véanse las figuras 35 y 37). La PKL de C. acetobutylicum también permitió el crecimiento del mutante de la transcetolasa en ausencia de un complemento aromático sobre la glucosa y la xilosa (figura 35 y 37), pero pareció tener un efecto perjudicial sobre el crecimiento celular a la concentración de IPTG 60 pM cuando creció en glucosa (figura 35).
Ejemplo 8: Medición de acetil-fosfato intracelular en cepas que expresan PKL
Se construyen cepas de E. coli productoras de isopreno para expresar una fosfocetolasa de Burkholderia phytofirmans PsJN, Lactobacillus buchneri NRRL B-30929, Bifidobacterium gallicum DSM 20093, Bifidobacterium dentium Bd1, o Bifidobacterium bifidum IPLA 20015, o una PKL de la tabla 1, la tabla 2 o las agrupaciones 1-22 (véanse las figuras 3-24). Se usan como controles cepas que no expresaron una fosfocetolasa.
(i) Materiales
Receta de medios TM3 (por litro de medio de fermentación):
K2HPO4 13,6 g, KH2PO4 13,6 g, MgSO4* 7 H2O 2 g, ácido cítrico monohidratado 2 g, citrato de amonio férrico 0,3 g, (NH4)2SO43,2 g, extracto de levadura 0,2 g, disolución de metales traza 1000X 1 ml. Todos los componentes se añaden juntos y se disuelven en diH2O. Se ajusta el pH a 6,8 con hidróxido de amonio (30%) y se enrasa. Se esterilizan los medios por filtración con un filtro de 0,22 micrómetros. Se añaden 10,0 g de glucosa y antibióticos después del ajuste del pH y la esterilización.
Disolución de metales traza 1000X (por litro de medio de fermentación)
Ácido cítrico * H2O 40 g, MnSO4* H2O 30 g, NaCl 10 g, FeSO4* 7 H2O 1 g, CoCh* 6 H2O 1 g, ZnSO4* 7 H2O 1 g, CuSO4* 5 H2O 100 mg, H3BO3 100 mg, NaMoO4* 2 H2O 100 mg. Se disuelve cada componente uno a la vez en diH2O. Se ajusta el pH a 3,0 con HCl/NaOH, y luego se enrasa la disolución y se esteriliza por filtración con un filtro de 0,22 micrómetros.
(ii) Procedimiento experimental
Se hacen crecer células que expresan la ruta de MVA completa y una PKL de Burkholderia phytofirmans PsJN, Lactobacillus buchneri n Rr L B-30929, Bifidobacterium gallicum DSM 20093, Bifidobacterium dentium Bd1, o Bifidobacterium bifidum IPLA 20015, o una PKL de la tabla 1, la tabla 2 o las agrupaciones 1-22 (véanse las figuras 3-24) durante la noche en caldo Luria-Bertani antibióticos. Al día siguiente, se diluyen hasta una DO600 de 0,05 en 20 ml de medio TM3 que contiene 50 pg/ml de carbenicilina (en un matraz Erlenmeyer con deflectores de 250 ml) y se incuban a 34°C y 200 rpm. Después de 2 h de crecimiento, se mide la DO600 y se añade IPTG 20 uM. Después de 3,5 horas más, se centrifugaron 1,5 ml de muestra, se desechó el sobrenadante y se resuspendió el sedimento en 100 ul de metanol enfriado en hielo seco.
(iii) Determinación de acetil-fosfato intracelular.
Para extraer acetil-fosfato, se centrifugan 1,5 ml de células de E. coli crecidas hasta DO 0,57-2,26 mediante centrifugación y se añaden a los sedimentos 100 pl de metanol enfriado en hielo seco. Se almacenan las muestras enfriadas con metanol a -20°C durante varios días. El procesamiento adicional de la muestra incluye una resuspensión celular suave, una centrifugación de 5 minutos a -9°C y la aspiración del sobrenadante en viales limpios. Se vuelve a extraer el sedimento dos veces con 75 pl de agua que contiene ácido acético al 2%. Después de cada extracción, los se sedimentan los residuos celulares mediante centrifugación a -9°C, se agrupan juntos los sobrenadantes de las tres extracciones y se añaden con 1 pl de tributilamina. Se lleva a cabo análisis espectrométrico de masas de acetil-fosfato mediante CLEM usando un sistema Thermo Finnigan TSQ (Thermo Electron Corporation, San Jose, CA). Se realizan control del sistema, adquisición de datos y evaluaciones de datos espectrales usando el software XCalibur y LCQuan (Thermo Electron Corp). Se aplica un gradiente de fase móvil a una columna de HPLC Synergi MAX-RP 5 pM (150 x 2 mm, Phenomenex) a un velocidad de flujo de 0,4 ml/min. El perfil de gradiente aplicado es el 99% de A y el 1% de B en t = 0-1 min; el 80% de A y el 20% de B en t = 11 min; el 75% de B y el 25% de C a t = 12-14 min; el 99% de A y el 1% de B a t = 15-16 min, donde el disolvente A es tributilamina 15 mM/ácido acético 10 mM en agua, el disolvente B es metanol y el disolvente C es agua. Se lleva a cabo la detección másica de acetil-fosfato mediante ionización por electrospray (ESI-EM/EM) en modo negativo (voltaje de pulverización ESI de 2,5-3,0 kV, temperatura del tubo de transferencia iónica 390°C) con valor m/z para el ión precursor de 138,9. Se determina la concentración de acetil-fosfato según la intensidad integrada del pico generado por el ión de producto de PO3-(m/z = 79,0, energía de colisión 20 V, presión de gas de colisión 1,7 mTorr, Rt= 13,2 min). Se usa una curva de calibración obtenida por inyección de patrón de acetil-fosfato (Sigma-Aldrich) para calcular la concentración del metabolito en extractos celulares. Se determina la concentración de acetil-fosfato intracelular basándose en el supuesto de que en 1 ml del cultivo a DO = 200, el volumen integrado de todas las células es de 50 Ml. Se evalúa el acetil-fosfato producido en cepas que expresan una PKL en comparación con la cepa de control que no expresa fosfocetolasa.
Ejemplo 9: Producción de isopreno en células huésped recombinantes que expresan fosfocetolasa a pequeña escala
Se construyen cepas de E. coli productoras de isopreno para expresar una fosfocetolasa de Burkholderia phytofirmans PsJN, Lactobacillus buchneri NRRL B-30929, Bifidobacterium gallicum DSM 20093, Bifidobacterium dentium Bd1 o Bifidobacterium bifidum IPLA 20015, o una PKL de la tabla 1, la tabla 2 o las agrupaciones 1-22 (véanse las figuras 3-24), la ruta de MVA completa y una isopreno sintasa. Se usan como controles cepas productoras de isopreno que no expresaron una fosfocetolasa.
Receta de medios TM3 (por litro de medio de fermentación):
K2HPO4 13,6 g, KH2PO4 13,6 g, MgSO4* 7 H2O 2 g, ácido cítrico monohidratado 2 g, citrato de amonio férrico 0,3 g, (NH4)2SO43,2 g, extracto de levadura 0,2 g, disolución de metales traza 1000X 1 ml. Todos los componentes se añaden juntos y se disuelven en diH2O. Se ajusta el pH a 6,8 con hidróxido de amonio (30%) y se enrasa. Se esterilizan los medios por filtración con un filtro de 0,22 micrómetros. Se añaden glucosa 10,0 g y antibióticos después del ajuste del pH y la esterilización.
Disolución de metales traza 1000X (por litro de medio de fermentación)
Ácido cítrico * H2O 40 g, MnSO4* H2O 30 g, NaCl 10 g, FeSO4* 7 H2O 1 g, CoCb* 6 H2O 1 g, ZnSO4* 7 H2O 1 g, CuSO4* 5 H2O 100 mg, H3BO3 100 mg, NaMoO4* 2 H2O 100 mg. Se disuelve cada componente uno a la vez en diH2O. Se ajusta el pH a 3,0 con HCl/NaOH, y luego se enrasa la disolución y se esteriliza por filtración con un filtro de 0,22 micrómetros.
(ii) Procedimiento experimental
Se hacen crecer células durante la noche en caldo Luria-Bertani antibióticos. Al día siguiente, se diluyeron a una DO600 de 0,1 en 20 ml de medio TM3 que contenía 50 ug/ml de espectinomicina, 25 ug/ml de cloranfenicol y 50 ug/ml de carbenicilina (en un matraz Erlenmeyer con deflectores de 250 ml) y se incubaron a 34°C y 200 rpm. Después de 2 h de crecimiento, se mide la DO600 y se añade IPTG 20 uM. Se toman muestras regularmente durante el curso de la fermentación. En cada punto de tiempo, se mide la DO600. Además, se realiza análisis de gases residuales de isopreno usando un cromatógrafo de gases-espectrómetro de masas (CG-EM) (Agilent) en el ensayo del espacio de cabeza. Se coloca una muestra de 100 pl de caldo completo en un bloque de vidrio de 96 pocilios. Se sella el bloque de vidrio con papel de aluminio y se incuba a 34°C mientras se agita a 450 rpm, durante
30 minutos con un aparato Thermomixer. Después de 30 minutos, se mantiene el bloque en un baño de agua a 70°C durante 2 minutos y se determinan los niveles de isopreno en la medición del espacio de cabeza mediante cromatografía de gases-espectrometría de masas. La productividad específica notificada es la cantidad de isopreno en ug/l leída por el CG dividida entre el tiempo de incubación (30 min) y la DO600 medida.
Ejemplo 10: Producción de isopreno en células huésped recombinantes que expresan fosfocetolasa a una escala de
15 l
Se construyen las cepas de E. coli productoras de isopreno para expresar una fosfocetolasa de Burkholderia phytofirmans PsJN, Lactobacillus buchneri NRRL B-30929, Bifidobacterium gallicum DSM 20093, Bifidobacterium dentium Bd1 o Bifidobacterium bifidum IPLA 20015, o una PKL de la tabla 1, la tabla 2 o las agrupaciones 1-22 (véanse las figuras 3-24), la ruta de MVA completa y una isopreno sintasa. Se usan como controles cepas productoras de isopreno que no expresaron una fosfocetolasa en un experimento a escala de 15 litros para la producción de isopreno.
(i) Materiales
Receta del medio (por litro de medio de fermentación):
K2HPO4 7,5 g, MgSO4 * 7 H2O 2 g, ácido cítrico monohidratado 2 g, citrato de amonio férrico 0,3 g, extracto de levadura 0,5 g, ácido sulfúrico al 50% 1,6 ml, disolución de metal traza modificada 1000X 1 ml. Todos los componentes se añaden juntos y se disuelven en diH2O. Se esteriliza esta disolución con calor (123°C durante
20 minutos). Se ajusta el pH a 7,0 con hidróxido de amonio (28%) y c.s.p. enrasar. Después de la esterilización y el ajuste del pH, se añaden 10 g de glucosa, disolución de vitaminas 8 ml y antibióticos.
disolución de metales traza modificada 1000X (por litro):
Ácidos cítricos * H2O 40 g, MnSO4 * H2O 30 g, NaCl 10 g, FeSO4 * 7 H2O 1 g, CoCb * 6 H2O 1 g, ZnSO * 7 H2O 1 g, CuSO4 * 5 H2O 100 mg, H3BO3 100 mg, NaMoO4 * 2 H2O 100 mg. Se disolvió cada componente uno a la vez en diH2O, se ajustó el pH a 3,0 con HCl/NaOH, y luego se enrasó la disolución y se esterilizó por filtración con un filtro de 0,22 micrómetros.
Disolución de vitaminas (por litro):
Clorhidrato de tiamina 1,0 g, D-(+)-biotina 1,0 g, ácido nicotínico 1,0 g, clorhidrato de piridoxina 4,0 g. Se disolvió cada componente uno a la vez en diH2O, se ajustó el pH a 3,0 con HCl/NaOH, y luego se enrasó la disolución y se esterilizó por filtración con filtro de 0,22 micrómetros.
Disolución de sal macro (por litro):
MgSO4 * 7 H2O 296 g, ácido cítrico monohidratado 296 g, citrato de amonio férrico 49,6 g. Todos los componentes se disolvieron en agua, c.s.p. enrasar y se esterilizaron por filtración con filtro de 0,22 micrómetros.
Disolución de alimentación (por kilogramo):
Glucosa 0,590 kg, diH2O 0,393 kg, K2HPO47,4 g y Foamblast882 100% 8,9 g. Se mezclaron todos los componentes juntos y se sometieron a autoclave. Después de someter a autoclave la disolución de alimentación, se añaden complementos de nutrientes a la botella de alimentación en una campana estéril. Las adiciones posteriores a la esterilización al alimento son (por kilogramo de disolución de alimento), disolución de sal macro 5,54 ml, disolución de vitaminas 6,55 ml, disolución de metales traza modificada 1000X 0,82 ml.
(ii) Análisis
Se determinan los niveles de isopreno, oxígeno, nitrógeno y dióxido de carbono en el gas residual de forma independiente mediante dos espectrómetros de masas, un espectrómetro de masas iSCAN (Hamilton Sundstrand) y uno Hiden HPR20 (Hiden Analytical). Se mide el oxígeno disuelto en el caldo de fermentación mediante sonda sanitaria, esterilizable con un sensor óptico proporcionado por Hamilton Company. Se determinan las concentraciones de citrato, glucosa, acetato y mevalonato en el caldo del fermentador en muestras de caldo tomadas a intervalos de 4 horas mediante un análisis de HPLC. Se determina la concentración en muestras de caldo mediante la comparación de la respuesta del índice de refracción frente a una curva de calibración generada previamente usando el patrón de una concentración conocida.
Ejemplo 11: Producción de amorfadieno o farneseno en cepas que expresan una fosfocetolasa identificada
Se construyen cepas de E. coli productoras de isoprenoides para expresar una fosfocetolasa de Burkholderia phytofirmans PsJN, Lactobacillus buchneri NRRL B-30929, Bifidobacterium gallicum DSM 20093, Bifidobacterium dentium Bd1 o Bifidobacterium bifidum IPLA 20015, o una PKL de la tabla 1, la tabla 2 o las agrupaciones 1-22 (véanse las figuras 3-24), la ruta de MVA completa y un gen con codones optimizados que codifica para la farneseno sintasa o la amorfadieno sintasa. Las cepas productoras de isoprenoides que no expresaron una fosfocetolasa se usan como controles en un experimento para la producción de amorfadina o farneseno.
(i) Materiales
Receta de medios TM3 (por litro de medio de fermentación):
K2HPO4 13,6 g, KH2PO4 13,6 g, MgSO4* 7 H2O 2 g, ácido cítrico monohidratado 2 g, citrato de amonio férrico 0,3 g, (NH4)2SO43,2 g, extracto de levadura 0,2 g, disolución de metales traza 1000X 1 ml. Todos los componentes se añaden juntos y se disuelven en diH2O. Se ajusta el pH a 6,8 con hidróxido de amonio (30%) y se enrasa. Se esterilizan los medios por filtración con un filtro de 0,22 micrómetros. Se añaden 10,0 g de glucosa y antibióticos después de la esterilización y el ajuste del pH.
Disolución de metales traza 1000X (por litro de medio de fermentación):
Ácido cítrico * H2O 40 g, MnSO4* H2O 30 g, NaCl 10 g, FeSO4* 7 H2O 1 g, CoCl2* 6 H2O 1 g, ZnSO4* 7 H2O 1 g, CuSO4* 5 H2O 100 mg, H3BO3 100 mg, NaMoO4* 2 H2O 100 mg. Se disuelve cada componente uno a la vez en diH2O. Se ajusta el pH a 3,0 con HCl/NaOH, y luego se enrasa la disolución y se esteriliza por filtración con un filtro de 0,22 micrómetros.
(ii) Procedimiento experimental
Se hacen crecer células durante la noche en caldo Luria-Bertani antibióticos. Al día siguiente, se diluyen a una DO600 de 0,05 en 20 ml de medio TM3 que contiene 50 pg/ml de espectinomicina, 25 pg/ml de cloranfenicol y 50 pg/ml de carbenicilina (en un matraz Erlenmeyer con deflectores de 250 ml) y se incuban a 34°C y 200 rpm. Antes de la inoculación, se añade una capa de dodecano (Sigma-Aldrich) al 20% (v/v) a cada matraz de cultivo para atrapar el producto de sesquiterpeno volátil tal como se describió anteriormente (Newman et al., 2006).
Después de 2 h de crecimiento, se mide la DO600 y se añade isopropil p-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) 0,05­ 0,40 mM. Se toman muestras regularmente durante el curso de la fermentación. En cada punto de tiempo, se mide la DO600. Además, la concentración de amorfadieno o farneseno en la fase orgánica se somete a ensayo diluyendo la fase de dodecano en acetato de etilo. Se analizan los extractos de dodecano/acetato de etilo mediante métodos de CG-EM tal como se describió anteriormente (Martin et al., Nat. Biotechnol 2003, 21: 96-802) monitorizando el ión molecular (204 m/z) y el ión de fragmento 189 m/z para el amorfadieno o el ión molecular (204 m/z) para el farneseno. Se inyectan muestras de amorfadieno o farneseno de concentración conocida para producir curvas patrón para amorfadieno o farneseno, respectivamente. La cantidad de amorfadieno o farneseno en las muestras se calcula usando las curvas patrón de amorfadieno o farneseno, respectivamente.
Ejemplo 12: Construcción de cepas que expresan fosfocetolasa que albergan mutaciones del huésped para producir isopreno.
Las cepas productoras de isopreno que comprenden una PKL de Burkholderia phytofirmans PsJN, Lactobacillus buchneri NRRL B-30929, Bifidobacterium gallicum DSM 20093, Bifidobacterium dentium Bd1, o Bifidobacterium bifidum IPLA 20015, o una PKL de la tabla 1, la tabla 2 o las agrupaciones 1-22 (véanse las figuras 3-24) pueden modificarse por ingeniería genética adicionalmente para aumentar la actividad de uno o más de los siguientes genes, incluyendo ribosa-5-fosfato isomerasa (rpiA y/o rpiB), D-ribulosa-5-fosfato 3-epimerasa (rpe), transcetolasa (tktA y/o tktB), transaldolasa B (tal B), fosfoenolpiruvato sintetasa (ppsA), fosfato acetiltransferasa (pta y/o eutD) para mejorar el flujo de carbono a través de la ruta de la fosfocetolasa (figura 38). En determinados aspectos, la actividad de los siguientes genes rpiA, rpiB, rpe, tktA, tktB, tal B, ppsA, eutD y/o pta puede aumentarse alterando el promotor y/o rbs en el cromosoma, o expresándolo a partir de un plásmido. En una realización, la actividad ribosa-5-fosfato isomerasa (rpiA y/o rpiB) se aumenta alterando el promotor y/o rbs en el cromosoma, o expresándolo a partir de un plásmido. En otra realización, la actividad de D-ribulosa-5-fosfato 3-epimerasa (rpe) se aumenta alterando el promotor y/o rbs en el cromosoma, o expresándolo a partir de un plásmido. En otra realización la actividad transcetolasa (tktA y/o tktB) se aumenta alterando el promotor y/o rbs en el cromosoma, o expresándolo a partir de un plásmido. En todavía otra realización la actividad de transaldolasa B (tal B) se aumenta alterando el promotor y/o rbs en el cromosoma, o expresándolo a partir de un plásmido. En otra realización, la actividad de fosfoenolpiruvato sintetasa (ppsA) se aumenta alterando el promotor y/o rbs en el cromosoma, o expresándolo a partir de un plásmido. En todavía otras realizaciones, la actividad de fosfatascetiltransferasa (pta y/o eutD) se aumenta alterando el promotor y/o rbs en el cromosoma, o expresándolo a partir de un plásmido. En determinados aspectos, las isozimas de los siguientes genes rpiA, rpiB, rpe, tktA, tktB, tal B, ppsA, eutD y/o pta pueden aumentarse alterando el promotor y/o rbs en el cromosoma, o expresándolo a partir de un plásmido.
Estas cepas pueden modificarse por ingeniería genética adicionalmente para disminuir la actividad de uno o más de los siguientes genes, incluyendo glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (zwf), 6-fosfofructocinasa-1 (pfkA y/o pfkB), fructosa bisfosfato aldolasa (fba, fbaA, fbaB y/o fbaC), gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (gapA y/o gapB), acetato cinasa (ackA), citrato sintasa (gltA), transcetolasa (tktA y/o tktB), IE (ptsI), EIICBGlc (ptsG),EIIAGlc (crr) y/o HPr (ptsH) para aumentar el flujo de carbono hacia la ruta de la fosfocetolasa (figura 39). En una realización, un gen zwf que codifica para la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa está regulado por disminución. En otra realización, un gen pfkA que codifica para la 6-fosfofructocinasa-1A está regulado por disminución. En otra realización, un gen gapA que codifica para la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa A está regulado por disminución. En otra realización, un gen fba que codifica para la fructosa bisfosfato aldolasa está regulado por disminución. En todavía otra realización, un gen gltA que codifica para la citrato sintasa está regulado por disminución. En una realización, un gen ackA que codifica para la acetato cinasa está regulado por disminución. En otra realización, un gen ptsI que codifica para EI está regulado por disminución. En una realización, un gen ptsH que codifica para HPr está regulado por disminución. En otra realización, un gen ptsG que codifica para EIICBGlc está regulado por disminución. En todavía otra realización, un gen crr que codifica para EIIAGlc está regulado por disminución. El operón pts codifica para los genes del sistema de fosfotransferasa. En algunas realizaciones, las cepas pueden modificarse por ingeniería genética para disminuir la actividad del sistema de fosfotransferasa (PTS) para aumentar el flujo de carbono hacia la ruta de la fosfocetolasa. En algunas realizaciones, el PTS está regulado por disminución por la regulación por disminución del operón pts. En determinados aspectos, el PTS está regulado por disminución y la ruta de transporte de glucosa está regulada por incremento. Una ruta de transporte de glucosa incluye, pero no se limita a, genes de galactosa (galP) y glucocinasa (glk). En algunas realizaciones, el operón pts está regulado por disminución, el gen de galactosa (galP) está regulado por incremento, y el gen de glucocinasa (glk) está regulado por incremento. En determinados aspectos, las isozimas de proteínas codificadas por los siguientes genes zwf, pfkA, fba, gapA, ackA, gltA, tktA, ptsG, ptsH, ptsI y/o crr pueden regularse por disminución para aumentar el flujo de carbono hacia la ruta de la fosfocetolasa. En algunas realizaciones, el gen pfkB está regulado por disminución. En algunas realizaciones, el gen de la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa B (gapB) está regulado por disminución. En algunas realizaciones, el gen de la transcetolasa B (tktB) está regulado por disminución.
Ejemplo 13: Producción de isopreno por cepas que expresan fosfocetolasa que albergan mutaciones del huésped a pequeña escala
Las cepas productoras de isopreno descritas en el ejemplo 12 se evalúan para determinar la producción de isopreno a pequeña escala.
(i) Materiales
Receta de medios TM3 (por litro de medio de fermentación):
K2HPO4 13,6 g, KH2PO4 13,6 g, MgSO4* 7 H2O 2 g, ácido cítrico monohidratado 2 g, citrato de amonio férrico 0,3 g, (NH4)2SO43,2 g, extracto de levadura 0,2 g, disolución de metales traza 1000X 1 ml. Todos los componentes se añaden juntos y se disuelven en diH2O. Se ajusta el pH a 6,8 con hidróxido de amonio (30%) y se enrasa. Se esterilizan los medios por filtración con un filtro de 0,22 micrómetros. Se añaden glucosa 10,0 g y antibióticos después del ajuste del pH y la esterilización.
Disolución de metales traza 1000X (por litro de medio de fermentación)
Ácido cítrico * H2O 40 g, MnSO4* H2O 30 g, NaCl 10 g, FeSO4* 7 H2O 1 g, CoCb* 6 H2O 1 g, ZnSO4* 7 H2O 1 g, CuSO4* 5 H2O 100 mg, H3BO3 100 mg, NaMoO4* 2 H2O 100 mg. Se disuelve cada componente uno a la vez en diH2O. Se ajusta el pH a 3,0 con HCl/NaOH, y luego se enrasa la disolución y se esteriliza por filtración con un filtro de 0,22 micrómetros.
(ii) Procedimiento experimental
Se hacen crecer células durante la noche en caldo Luria-Bertani antibióticos. Al día siguiente, se diluyeron a una DO600 de 0,1 en 20 ml de medio TM3 que contenía 50 |ig/ml de espectinomicina, 25 |ig/ml de cloranfenicol y 50 |ig/ml de carbenicilina (en un matraz Erlenmeyer con deflectores de 250 ml) y se incubaron a 34°C y 200 rpm. Después de 2 h de crecimiento, se mide la DO600 y se añade IPTG 20 uM. Se toman muestras regularmente durante el curso de la fermentación. En cada punto de tiempo, se mide la DO600. Además, se realiza análisis de gases residuales de isopreno usando un ensayo de espacio de cabeza con cromatógrafo de gases-espectrómetro de masas (CG-EM) (Agilent). Se colocan cien microlitros de caldo completo en un vial sellado de CG y se incuban a 34°C y 200 rpm durante un tiempo fijo de 30 minutos. Después de una etapa termoinactivación, que consiste en una incubación a 70°C durante 7 minutos, la muestra se carga en el CG. La productividad específica notificada es la cantidad de isopreno en ug/l leída por el CG dividida entre el tiempo de incubación (30 min) y la DO600 medida.
Ejemplo 14: Producción de isopreno por cepas que expresan fosfocetolasa que albergan mutaciones del huésped a una escala de 15 l
Las cepas productoras de isopreno descritas en el ejemplo 12 se evalúan para determinar la producción de isopreno a una escala de 15 l.
(i) Materiales
Receta del medio (por litro de medio de fermentación):
K2HPO4 7,5 g, MgSÜ4 * 7 H2O 2 g, ácido cítrico monohidratado 2 g, citrato de amonio férrico 0,3 g, extracto de levadura 0,5 g, ácido sulfúrico al 50% 1,6 ml, disolución de metal traza modificada 1000X 1 ml. Todos los componentes se añadieron juntos y se disolvieron en diH2O. Esta disolución se esterilizó por calor (123°C durante 20 minutos). Se ajustó el pH a 7,0 con hidróxido de amonio (28%) y c.s.p. enrasar. Se añadieron glucosa 10 g, disolución de vitaminas 8 ml y antibióticos después de la esterilización y el ajuste del pH.
Disolución de metales traza modificada 1000X (por litro):
Ácidos cítricos * H2O 40 g, MnSO4 * H2O 30 g, NaCl 10 g, FeSO4 * 7 H2O 1 g, CoCb * 6 H2O 1 g, ZnSO * 7 H2O 1 g, CuSO4 * 5 H2O 100 mg, H3BO3 100 mg, NaMoO4 * 2 H2O 100 mg. Se disolvió cada componente uno a la vez en diH2O, se ajustó el pH a 3,0 con HCl/NaOH, y luego se enrasó la disolución y se esterilizó por filtración con un filtro de 0,22 micrómetros.
Disolución de vitaminas (por litro):
Clorhidrato de tiamina 1,0 g, D-(+)-biotina 1,0 g, ácido nicotínico 1,0 g, clorhidrato de piridoxina 4,0 g. Se disolvió cada componente uno a la vez en diH2O, se ajustó el pH a 3,0 con HCl/NaOH, y luego se enrasó la disolución y se esterilizó por filtración con filtro de 0,22 micrómetros.
Disolución de sal macro (por litro):
MgSO4 * 7 H2O 296 g, ácido cítrico monohidratado 296 g, citrato de amonio férrico 49,6 g. Todos los componentes se disolvieron en agua, c.s.p. enrasar y se esterilizó por filtración con filtro de 0,22 micrómetros.
Disolución de alimentación (por kilogramo):
Glucosa 0,590 kg, diH2O 0,393 kg, K2HPO47,4 g y Foamblast882 100% 8,9 g. Se mezclaron todos los componentes juntos y se sometieron a autoclave. Después de someter a autoclave la disolución de alimentación, se añaden complementos de nutrientes a la botella de alimentación en una campana estéril. Las adiciones posteriores a la esterilización a la alimentación son (por kilogramo de disolución de alimentación), disolución de sal macro 5,54 ml, disolución de vitaminas 6,55 ml, disolución de metales traza modificada 1000X 0,82 ml.
(ii) Análisis
Se determinan los niveles de isopreno, oxígeno, nitrógeno y dióxido de carbono en el gas residual independientemente por dos espectrómetros de masas, un espectrómetro iSCAN (Hamilton Sundstrand) y uno Hiden HPR20 (Hiden Analytical). Se mide el oxígeno disuelto en el caldo de fermentación mediante una sonda sanitaria esterilizable con un sensor óptico proporcionado por Hamilton Company. Las concentraciones de citrato, glucosa, acetato y mevalonato en el caldo del fermentador se determinan en muestras de caldo tomadas a intervalos de 4 horas mediante un análisis de HPLC. La concentración en muestras de caldo se determina mediante la comparación de la respuesta del índice de refracción frente a una curva de calibración generada previamente usando el patrón de una concentración conocida.
Ejemplo 15: Cepas usadas para la evaluación a pequeña escala de fosfocetolasas
Se generaron cepas que expresan fosfocetolasa usando técnicas convencionales de biología molecular en las que la PKL especificada se transformó en MD-891 (BL2 GI1.2gltA yhfSFRTPyddVIspAyhfS thiFRTtruncIspA pgl ML FRT-PL.2-3cis-RBS10000-mvk (burtonii)) junto con MCM-1225 (pMCM1225 - pCL Ptrc-E gallinarumMVA superior)). Las cepas se enumeran en la tabla 10.
Tabla 10. Cepas usadas para la evaluación a pequeña escala de fosfocetolasas
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Ejemplo 16: Examen in vivo para determinar la actividad fosfocetolasa en la expresión de fosfocetolasas identificadas (PKL)
Se realizó el siguiente examen in vivo para determinar la actividad fosfocetolasa tal como se expuso anteriormente en el ejemplo 7. El fondo de la célula huésped es DW-809 con los plásmidos pMCS811-pMCS852 que contienen distintas fosfocetolasas.
Para la evaluación del crecimiento in vivo de este conjunto de enzimas fosfocetolasa (PKL), la cepa DW809, la cepa mutante doble de la transcetolasa tal como se describe en el ejemplo 7, se transformó con plásmidos que expresan tanto la PKL como la isopreno sintasa de un promotor inducible por IPTG (véase la tabla 11 para una lista completa). Los transformantes individuales se identificaron mediante el crecimiento en placas de medio mínimo de glucosa M9 con el complemento aromático, se hicieron crecer durante la noche y luego se sometieron a ensayo en el Enzyscreen Growth Profiler para determinar el rendimiento de crecimiento o bien en glucosa o bien xilosa sin el complemento aromático, tal como se describe en el ejemplo 7. El intervalo de concentraciones de IPTG usadas para la inducción fue 0, 20, 40, 60, 80, 100, 200 y 400 |iM. Para calcular el índice de rendimiento (PI) para el crecimiento en glucosa o xilosa, la DO de cada cepa experimental se normalizó a la DO del control en un punto de tiempo específico en la curva de crecimiento (normalmente entre 30 y 40 horas). Las cepas experimentales que mostraron los mayores PI para el crecimiento expresaron las enzimas p Kl con la actividad in vivo más preferida, mientras que las cepas con bajos PI expresaron PKL que también se realizaron en este ensayo. Se calcularon los PI a 0, 100 y 400 |iM, y fueron representativos del rendimiento de crecimiento global a diferentes niveles de inducción. Estos se ilustran en la tabla 1 1.
Tabla 11. Índices de rendimiento (PI) para el crecimiento en glucosa o xilosa
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Ejemplo 17: Evaluación a pequeña escala del rendimiento de isopreno y la productividad específica del isopreno en cepas que expresan fosfocetolasa
Las cepas productoras de isopreno descritas en el ejemplo 15 se evaluaron para determinar la producción de isopreno a pequeña escala.
(i) Materiales y métodos
Se adquirieron extracto de levadura, MgSO4 , glucosa, IPTG, espectinomicina y carbenicilina de Sigma. El sello de papel de aluminio, el bloque de 5 ml estéril de 48 pocillos, la membrana de sellado Breathe Easier, las placas de microtitulación de 96 pocillos y las placas de fondo cónico de 96 pocillos se adquirieron de VWR. Se adquirieron bloques de vidrio de 96 pocillos de Zinsser Analytic. Equipo: Agilent 6890 CG equipado con un espectrómetro de masas 5973N, centrífuga Eppendorf 5417R, Sorval legend RT.
Medición de la tasa de crecimiento:
Se inocularon tubos de agitación que contenían 3 ml de medio LB, con antibióticos apropiados, con reservas de cultivo de glicerol. Se incubaron los cultivos durante aproximadamente 15 horas a 30°C, 220 rpm.
Se prepararon medios TM3 complementados combinando medios TM3 (sin MgSO4 y extracto de levadura), glucosa al 1%, MgSO4 8 mM, extracto de levadura al 0,02% y antibióticos apropiados. Se inocularon 2 ml de TM3 complementado con cultivos durante la noche en cada pocillo de un bloque estéril de 48 pocillos hasta una DO600 final de 0,2. Se sellaron los bloques con membranas Breathe Easier y se incubaron durante 2 horas a 34°C a 600 rpm. Después de 2 horas de crecimiento, se midió la DO600 en la placa de microtitulación y las células se indujeron con diversas concentraciones de IPTG. Se tomaron lecturas de DO600 cada hora después de la inducción de IPTG durante 4 horas. Se determinaron mediciones de DO600 usando un SpectraMax Plus190 (Molecular Devices).
Ensayo de rendimiento de isopreno:
Se prepararon medios TM3 complementados combinando medios TM3 (sin MgSO4 y extracto de levadura), glucosa al 1%, MgSO4 8 mM, extracto de levadura al 0,02% y antibióticos apropiados. Se inocularon 2 ml de medio TM3 complementado en cada pocilio de un bloque estéril de 48 pocilios hasta una DO600 final de 0,2. Se transfirieron 10 pl de los cultivos inoculados a 90 pl de medio TM3 sin glucosa o extracto de levadura y se sellaron con una papel de aluminio en un bloque de vidrio de 96 pocillos (Zinsser) y se incubaron a 34°C y 450 rpm durante 24 horas. Después de 24 horas, se midió la cantidad de isopreno en el espacio de cabeza mediante CG/EM y la cantidad de glucosa que queda en los medios para calcular el rendimiento de isopreno.
Medición de la productividad específica del isopreno:
Se recogieron 100 pl de cultivo en un bloque de vidrio de 96 pocillos. Se selló el bloque de vidrio con un sello de papel de aluminio y se incubó a 34°C mientras se agitaba a 450 rpm durante 30 minutos usando un aparato Thermomixer (Eppendorf). Después de 30 minutos, se incubó el bloque a 70°C en un baño de agua durante 2 minutos. Se dejó enfriar el bloque de vidrio a temperatura ambiente y luego se midió el isopreno en el espacio de cabeza de los pocillos mediante CG/EM.
Medición de glucosa:
Se recogieron muestras de glucosa mediante centrifugación de 300 pl de cultivo celular en la placa de fondo cónico de 96 pocillos durante 10 minutos a 4°C, 3000 rpm. Se diluyó el sobrenadante 10 veces en agua desionizada y se midió la concentración de glucosa usando el ensayo de glucosa oxidasa descrito.
Ensayo de glucosa oxidasa:
Se solubilizó ABTS en acetato de sodio 50 mM, pH 5. Se añadieron glucosa oxidasa (GOX) y peroxidasa de rábano picante (HRP) a la siguiente concentración: 2,74 mg/ml de ABTS (polvo), 0,1 U/ml de HRP, 1 U/ml de GOX. Se envolvió el contenedor en papel de aluminio para protegerlo de la luz y se almacenó hasta 7 días a 4°C. Se preparó patrón de glucosa disolviendo glucosa en agua MilliQ en el intervalo de concentración deseado (es decir, dilución en serie 2x a partir de 1 mg/ml). Se añadieron 10 pl de muestra de prueba (sobrenadante de reacción diluida) y/o patrón de glucosa a un pocillo de una placa de microtitulación. Se añadieron 90 pl del reactivo ABTS y se mezclaron rápidamente en un mezclador de placas. Se transfirió la placa de ensayo al lector de placas y se monitorizó la absorbancia a 420 nm durante 3-5 minutos. Se exportó el archivo de datos a Excel. Se usó la curva de calibración de glucosa para calcular la cantidad de glucosa en cada pocillo.
Tabla 12. Parámetros para la detección de isopreno mediante CG/EM
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(ii) Resultados
Para calcular el índice de rendimiento (PI) para cada uno de: (i) productividad específica de isopreno a las 2 horas; (ii) productividad específica de isopreno a las 4 horas; (iii) tasa de crecimiento; y (iv) rendimiento de isopreno, cada cepa experimental se normalizó al parámetro específico del control en un punto de tiempo específico en la curva de crecimiento (normalmente entre 15-24 horas). Las cepas experimentales que mostraron valores de PI mayores de 1,0 para estos parámetros evaluados indicaron un mejor rendimiento de la PKL evaluada en este ensayo de producción de isopreno.
Tabla 13. PI para cada uno de: (i) productividad específica de isopreno a las 2 horas; (ii) productividad específica de isopreno a las 4 horas; (iii) tasa de crecimiento; y (iv) rendimiento de isopreno.
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Ejemplo 18: Medición de metabolitos intracelulares en cepas que expresan PKL
(i) Materiales y métodos
Extracción de metabolitos:
Las cepas usadas para el análisis de metabolitos fueron las mismas cepas descritas en el ejemplo 17. Por tanto, estas cepas se hicieron crecer en las condiciones de crecimiento establecidas en el ejemplo 17 y se tomaron muestras después de 4 horas de crecimiento para determinar las concentraciones relativas de metabolitos celulares seleccionados. Se recogieron 500 ul de los cultivos celulares mediante centrifugación, se descartó el sobrenadante, se añadieron 1 0 0 ul de metanol frío en hielo seco a los sedimentos y los tubos con los sedimentos se congelaron inmediatamente en hielo seco y se colocaron en un refrigerador a -80°C para su almacenamiento. Para extraer los metabolitos, los sedimentos celulares cubiertos con metanol se resuspendieron usando varillas de vidrio, los tubos se centrifugaron en microcentrífuga durante 5 minutos y se retiraron los sobrenadantes resultantes y se colocaron en tubos limpios. Los sedimentos celulares obtenidos después de la primera etapa de extracción se resuspendieron en 40 ul de mezcla de metanol al 50%/acetato de amonio 10 mM, se centrifugaron los residuos celulares y los sobrenadantes se recogieron y se agruparon junto con los sobrenadantes obtenidos después de la primera extracción. Este procedimiento de extracción se repitió una vez más para asegurar una eliminación más completa de los metabolitos de los residuos celulares.
Durante la extracción-centrifugación, las muestras con células se mantuvieron por debajo de 4°C para minimizar la degradación de los metabolitos. Los extractos agrupados finales se mezclaron y luego se aclararon mediante centrifugación.
Mediciones de metabolitos:
Se realizó análisis de los metabolitos mediante CL-EM en un instrumento de cuadrupolo triple TSQ Quantim (Thermo Scientific). Se realizaron monitorización del sistema, adquisición de datos y análisis de datos con el software XCalibur y LCQuan (Thermo Scientific). Se aplicaron muestras de 10 ul a una columna de HPLC C18 Synergi MAX-RP (150x2 mm, 4 uM, 80A, Phenomenex) equipada con el cartucho de protección recomendado por el fabricante. Se eluyó la columna con un gradiente de ácido acético 15 mM tributilamina 10 mM en agua de calidad para MilliQ (disolvente A) y metanol de calidad parar CL-EM de Honeywell, Burdick & Jackson (disolvente B). El gradiente de 22,5 min fue el siguiente: t = 0 min, 5% de B; t = 2 min, 5% de B; t = 6 min, 1 0 % de B; t= 12 min, 20% de B; t = 18 min, 67% de B; t = 19 min, 99% de B; t= 21 min, 99% de B; ; t = 21,5 min, 5% de B; t= 22,5 min, 5% de B, velocidad de flujo 0,4 ml/min, temperatura de la columna 35°C. La detección de masas se llevó a cabo usando ionización por electropulverización en modo negativo a un voltaje de pulverización ESI de 3,0-3,5 kV y una temperatura del tubo de transferencia de iones de 350°C. Las siguientes transiciones SRM se seleccionaron para los metabolitos de interés: 259 ^ 79 glucosa-6 -fosfato (G6 P), 339 ^ 79 para fructosa 1,6-bisfosfato, 167 ^ 79 para fosfoenolpiruvato, 275 ^ 79 para 6 -fosfoglicerato, 259 ^ 79 eV para ribosa-5-fosfato, 139 ^ 79 para acetil-fosfato y 199 ^ 79 para eritrosa 4-fosfato. El tiempo de barrido para cada transición SRM fue de 0,1 s con un ancho de barrido establecido a 0,7 m/z. Se usó argón como gas de colisión a 1,7 mTorr, y las energías de colisión se optimizaron para obtener las intensidades de señal máximas usando los patrones correspondientes adquiridos de Sigma-Aldrich. Se usaron los mismos patrones para verificar los tiempos de retención de los metabolitos medidos. Los picos con las transiciones SRM 369 ^ 79 se atribuyeron a los heptosa-bisfosfatos. Las concentraciones de metabolitos medidos se expresaron como intensidades de señal normalizadas a las densidades ópticas de los cultivos durante el muestreo.
(ii) Resultados
Para calcular el índice de rendimiento (PI) para la producción de acetil-fosfato (AcP), la cantidad de cada metabolito de la cepa experimental respectiva se normalizó al parámetro específico del control en un momento específico en la curva de crecimiento (normalmente entre 30 y 40 horas). Las cepas experimentales que mostraron valores de PI mayores de 1,0 para estos parámetros evaluados indicaron un mejor desempeño de la PKL evaluada en este ensayo.
Tabla 14. PI para la producción de: (i) acetil-fosfato (AcP)
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Ejemplo 19: Determinación de la expresión de proteínas y solubilidad de las fosfocetolasas
(i) Materiales y métodos
Las cepas usadas para determinar la expresión de proteínas y la solubilidad de las fosfocetolasas evaluadas fueron las mismas cepas descritas en el ejemplo 17. Las cepas se hicieron crecer en caldo LB durante la noche a 34°C con los antibióticos apropiados. Al día siguiente, se añadieron 100 ul del cultivo durante la noche a 5 ml de LB con antibióticos apropiados y se hicieron crecer a 34°C hasta una DO (600) de -0,5, Luego se indujeron los cultivos con IPTG 200 uM y se incubaron durante 6 horas adicionales a 34°C. Se recogieron las células mediante centrifugación y se almacenaron los sedimentos a -80°C.
Al día siguiente, los sedimentos se dejaron descongelar y se resuspendieron a una DO (600) de 4 en Tris 100 mM, NaCl 100 mM pH 7,6 con 0,2 mg/ml de ADNasal y AEBSF 0,5 mM. A continuación, se lisaron las células individualmente por medio de una prensa francesa, y se retiraron los residuos celulares mediante centrifugación. La concentración de proteína total promedio de la fracción soluble fue de 0,56 ± 0,22 mg/ml según lo determinado por el ensayo de Bradford convencional. El sedimento de la centrifugación se resuspendió en Tris 100 mM, NaCl 100 mM pH 7,6 y se guardó para determinar el porcentaje de solubilidad de cada fosfocetolasa.
El lisado se usó luego para determinar la cantidad de actividad fosfocetolasa (PKL) en fructosa 6 -fosfato (F6 P) por unidad de proteína total (pmol/min/mg). La actividad PKL en F6 P se determinó siguiendo la cantidad de acetil-fosfato (AcP) generada. La mezcla de reacción (200 ul) contenía MgCh 10 mM, fosfato de potasio 10 mM (pH 7,6), difosfato de tiamina 1 mM, F6 P 10 mM, NaF 20 mM, yodoacetomida 8 mM, ditiotreitol 1 mM en Tris 100 mM, NaCl 100 mM pH 7,6 con 100 ul de lisado. Estos se incubaron durante 30 minutos a 34°C y se extinguieron mediante la adición de 60 ul de la mezcla de reacción a 60 ul de hidroxilamina 2 M, pH 6,5. Esta mezcla extinguida se incubó a temperatura ambiente durante 10 minutos y luego se añadieron 40 ul de TcA al 15%, 40 ul de HCl 4 M y 40 ul de FeCb al 5% en HCl 0,1 M. Esta mezcla final se centrifugó luego a 3000 rpm durante 5 min. Se retiró el sobrenadante (200 ul) y se midió la absorbancia a 505 nm. Se usó una curva de calibración de AcP para calcular la cantidad de AcP que se produjo.
La expresión relativa y la solubilidad de cada variante de PKL, en relación con el control de E. gallinarum MCS908, se determinó por densitometría. Los lisados solubles de cada muestra se mezclaron 1:1 con colorante de carga de gel y se ejecutaron en geles de SDS-PAGE. Cada sedimento, obtenido a partir de la centrifugación de la muestra después de la lisis por medio de la prensa francesa (véase anteriormente), se diluyó 1 : 1 con colorante de carga de gel y se cargó en geles de SDS-PAGE. Se incluyó una muestra de lisado soluble de E. gallinarum MCS908 en cada gel como control. Se desarrollaron los geles usando tinción con azul brillante de Coomassie y se analizaron usando el software de densitometría ImageQuantTL v2005 (GE Health Sciences). El porcentaje de proteína soluble expresada y el porcentaje de soluble a insoluble se determinaron en relación con la cepa de control (E. gallinarum MCS908).
(ii) Resultados
Para calcular el índice de rendimiento (Pl) para cada uno de: (i) actividad específica de (F6 P) por unidad de proteína total (pmol/min/mg); (ii) nivel de expresión; y (iii) solubilidad de cada cepa experimental se normalizó al parámetro específico del control. El Pl para la actividad específica de F6 P (nivel de actividad/expresión) se determinó dividiendo los valores de PI para (i) entre el valor de PI para (ii). Las cepas experimentales que mostraron un PI mayor de 1,0 para estos parámetros evaluados indicaron un mejor desempeño de la PKL evaluada en este ensayo.
Tabla 15. Solubilidad y expresión de cada PKL
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Ejemplo 20: Actividad fosfocetolasa en fructosa 6 -fosfato y xilulosa 5-fosfato
Este ejemplo determinó la actividad PKL cuando las cepas se hacen crecer en fructosa 6 -fosfato (F6 P) o xilulosa 5-fosfato (X5P).
(i) Materiales y métodos
Se hicieron crecer cepas en caldo LB durante la noche a 34°C con antibióticos apropiados. Al día siguiente, se añadieron 200 ul del cultivo durante la noche a 5 ml de TM3 con antibióticos apropiados y se cultivaron a 34°C durante 2,5 horas. Luego se indujeron los cultivos con IPTG 200 uM y se incubaron durante 4 horas adicionales a 34°C. Se recogieron las células mediante centrifugación y se almacenaron los sedimentos a -80°C.
Al día siguiente, los sedimentos se dejaron descongelar y se resuspendieron en 2 ml de HEPES 100 mM, pH 7,8, con 0,2 mg/ml de ADNasal y AEBSF 0,5 mM. A continuación, se lisaron las células individualmente por medio de una prensa francesa, y se retiraron los residuos celulares mediante centrifugación.
Preparación del lisado y determinación de la actividad enzimática:
Luego se usó el lisado para determinar la cantidad de actividad fosfocetolasa (PKL) en fructosa 6 -fosfato (F6 P) y xilulosa 5-fosfato (X5P). La actividad PKL en F6 P y X5P se determinó siguiendo la cantidad de acetil-fosfato (AcP) generada. La mezcla de reacción de F6 P (200 ul) contenía MgCb 10 mM, fosfato de potasio 10 mM (pH 7,6), difosfato de tiamina 1 mM, F6 P 10 mM, NaF 20 mM, yodoacetomida 8 mM, ditiotreitol 1 mM en HEPES 100 mM pH 7,8 con y 100 ul de lisado. Estos se incubaron durante 30 minutos a 34°C y se extinguieron mediante la adición de 60 ul de la mezcla de reacción a 60 ul de hidroxilamina 2 M, pH 6,5. Esta mezcla extinguida se incubó a temperatura ambiente durante 10 minutos y luego se añadieron 40 ul de TcA al 15%, 40 ul de HCl 4 M y 40 ul de FeCb al 5% en HCl 0,1 M. Esta mezcla final se centrifugó luego a 3000 rpm durante 5 min. Se retiró el sobrenadante (200 ul) y se midió la absorbancia a 505 nm. Se usó una curva de calibración de AcP para calcular la cantidad de AcP que se produjo. Se midió la actividad de X5P con un método similar. La mezcla de reacción de X5P (200 ul) contenía MgCb 10 mM, fosfato de potasio 10 mM (pH 7,6), difosfato de tiamina 1 mM, ribosa 5-fosfato 10 mM, 60 ug/ml de ribulosa-5-fosfato 3-epimerasa, 200 ug/ml de ribosa-5-fosfato isomerasa A, NaF 20 mM, yodoacetomida 8 mM, ditiotreitol 1 mM en HEPES 100 mM, pH 7,8 con y 20 ul de lisado. Debido a la amplia gama de actividades en X5P, las actividades se midieron a dos concentraciones de lisado: sin diluir y diluidas cinco veces en HEPES 100 mM, pH 7,8.
Tabla 16. Actividad PKL en F6P o X5P
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Ejemplo 21: Evaluación de 14 l de la producción de isopreno en cepas que expresan fosfocetolasa
Este experimento se realizó para evaluar el efecto de la expresión de varias enzimas fosfocetolasa en la producción de isopreno. Todas las cepas en este experimento usaron un huésped de E. coli modificado (el huésped de producción derivado de BL21, MD891) que expresa los genes introducidos de la ruta del mevalonato, la isopreno sintasa y la fosfocetolasa (PKL), para los detalles de la cepa, véase la tabla 17. Todas estas cepas productoras de isopreno se hicieron crecer en un cultivo semicontinuo a una escala de 15 l.
Las métricas de rendimiento relevantes son el rendimiento acumulativo de isopreno en la glucosa y el título de isopreno. Las métricas de productividad se encuentran resumidas en la tabla 18.
Tabla 17. Lista de cepas
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(i) Materiales y métodos
Receta del medio (por litro de medio de fermentación):
K2HPO4 7,5 g, MgSÜ4 * 7 H2O 2 g, ácido cítrico monohidratado 2 g, citrato de amonio férrico 0,3 g, extracto de levadura 0,5 g, ácido sulfúrico al 50% 1,6 ml, disolución de metal traza modificada 1000X 1 ml. Todos los componentes se añadieron juntos y se disolvieron en diH2O. Esta disolución se esterilizó por calor (123°C durante 20 minutos). Se ajustó el pH a 7,0 con hidróxido de amonio (28%) y c.s.p. enrasar. Se añadieron 10 g de glucosa, 8 ml de disolución de vitamina y antibióticos (espectinomicina y carbenicilina) después de la esterilización y el ajuste del pH a una concentración objetivo de 50 mg/l.
Disolución de metales traza modificada 1000X (por litro):
Ácidos cítricos * H2O 40 g, MnSO4 * H2O 30 g, NaCl 10 g, FeSO4 * 7 H2O 1 g, CoCh * 6 H2O 1 g, ZnSO * 7 H2O 1 g, CuSO4 * 5 H2O 100 mg, H3BO3 100 mg, NaMoO4 * 2 H2O 100 mg. Se disolvió cada componente uno a la vez en diH2O, se ajustó el pH a 3,0 con HCl/NaOH, y luego se enrasó la disolución y se esterilizó por filtración con un filtro de 0,22 micrómetros.
Disolución de vitaminas (por litro):
Clorhidrato de tiamina 1,0 g, D-(+)-biotina 1,0 g, ácido nicotínico 1,0 g, clorhidrato de piridoxina 4,0 g. Se disolvió cada componente uno a la vez en diH2O, se ajustó el pH a 3,0 con HCl/NaOH, y luego se enrasó la disolución y se esterilizó por filtración con filtro de 0,22 micrómetros.
Disolución de sal macro (por litro):
MgSO4 * 7 H2O 296 g, ácido cítrico monohidratado 296 g, citrato de amonio férrico 49,6 g. Todos los componentes se disolvieron en agua, c.s.p. enrasar y se esterilizaron por filtración con filtro de 0,22 micrómetros.
Disolución de alimentación (por kilogramo):
Glucosa 0,590 kg, diH2O 0,393 kg, K2HPO4 7,4 g y Foamblast882 al 100% 8,9 g. Se mezclaron todos los componentes juntos y se sometieron a autoclave. Después de someter a autoclave la disolución de alimentación, se añaden complementos de nutrientes a la botella de alimentación en una campana estéril. Las adiciones posteriores a la esterilización a la alimentación son (por kilogramo de disolución de alimento), disolución de sal macro 5,54 ml, disolución de vitaminas 6,55 ml, disolución de metales traza modificada 1000X 0,82 ml. Para un objetivo de IPTG 100 |iM: se añaden 1,87 ml de una disolución estéril de 10 mg/ml por kilogramo de alimentación.
Este experimento se llevó a cabo para monitorizar la producción de isopreno a partir de la glucosa al pH de fermentación (7,0) y la temperatura (34°C) deseado. Para comenzar cada experimento, se descongeló el vial congelado apropiado de la cepa de producción de E. coli y se inoculó en un matraz con medio de extracto de triptona-levadura (LB) y los antibióticos apropiados. Después de que el inóculo creciera hasta una densidad óptica de aproximadamente 1,0, se midió a 550 nm (DO550). Se usaron 500 ml para inocular un biorreactor de 15 l y llevar el volumen inicial del tanque a 5 l.
Las instalaciones internas proporcionaron el gas de entrada que se usa para mantener la contrapresión del biorreactor a 0,7 bar manométricos y para proporcionar oxígeno a los organismos de producción que diluyen el gas de entrada a una concentración conocida (del 7,3 al 8,3% en volumen de oxígeno).
Los medios en lotes tenían glucosa en lotes a 9,7 g/l. La inducción se logró mediante la adición de isopropil-beta-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG). Se añadió una jeringa que contenía una disolución estéril de IPTG para llevar la concentración de IPTG a 100 |iM cuando las células estaban a una DO550 de 6, Una vez se consumió la glucosa por el cultivo, tal como se señala por una elevación del pH, se alimentó la disolución de alimentación de glucosa para satisfacer las demandas metabólicas a tasas menores o iguales a 10 g/min. En un tiempo fijo después de que se estableciera la limitación de oxígeno disuelto, se elevó la temperatura desde 34°C hasta 37°C en el transcurso de una hora. La fermentación se ejecutó durante el tiempo suficiente para determinar el rendimiento másico de isopreno acumulativo máximo en glucosa, normalmente un total de 64 horas de tiempo de fermentación (EFT).
(ii) Resultados y análisis
Se determinaron los niveles de isopreno, oxígeno, nitrógeno y dióxido de carbono en el gas residual de forma independiente mediante un espectrómetro de masas Hiden HPR20 (Hiden Analytical).
Se mide el oxígeno disuelto en el caldo de fermentación mediante una sonda sanitaria esterilizable con un sensor óptico proporcionado por Hamilton Company.
Se determinaron las concentraciones de citrato, glucosa, acetato y mevalonato en el caldo del fermentador en muestras de caldo tomadas a intervalos de 4 horas mediante un análisis de HPLC. Se determinó la concentración en muestras de caldo mediante la comparación de la respuesta del índice de refracción frente a una curva de calibración generada previamente usando el patrón de una concentración conocida.
INFORMACIÓN DE HPLC
Sistema: Waters Alliance 2695
Columna: BioRad - Aminex HPX-87H Columna de exclusión de iones 300 mm x 7,8 mm n.° de catálogo 125-0140
Temperatura de la columna: 50°C
Columna de protección: BioRad - Recambio de Microguard Cation H 30 mm x 4,6 mm n.° de catálogo 125-0129
Tampón de ejecución: H2SO40,01 N
Velocidad de flujo de tampón de ejecución: 0,6 ml/min
Presión de ejecución aproximada: ~1100-1200 psi
Volumen de inyección: 20 microlitros.
Detector: Índice de refracción (Knauer K-2301)
Tiempo de ejecución: 26 minutos
El rendimiento acumulado de isopreno en la glucosa es igual al peso total de isopreno (t)/[(Peso de alimentación (0)-Peso de alimentación (t) 83,5)*0,5826)], donde 0,5826 es el % en peso de glucosa en la disolución de alimentación de glucosa y 83,5 son los gramos de esta alimentación en lotes en el fermentador en t = 0, Las unidades son gisopreno/gglucosa * 100, expresados en porcentajes.
IspER es la tasa de evolución de isopreno en (mmol/l/h).
Productividad específica (mg/l/h/DO) = IspER*68,117 g/mol/DO.
DO = densidad óptica = Absorbancia a 550 nm * factor de dilución en agua.
Productividad específica suavizada (mg/l/h/DO) = pendiente de miligramos de isopreno producido por hora (promediado a lo largo de un intervalo de 8 horas)/volumen de caldo * DO.
Título de isopreno (gisopreno/lcaldo promedio) es el isopreno evolucionado total por volumen de caldo promedio. Se calcula integrando la IspER y convirtiendo la unidad de isopreno de mmol a gramos.
Los resultados se representan gráficamente en las figuras 40 y 41 y se ilustran en la tabla 15.
Tabla 18. Métricas de productividad de isopreno
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Ejemplo 22: Evaluación in vivo del crecimiento en cepas que expresan PKL bloqueadas para las rutas de pentosa fosfato y glicólisis
Para el análisis de la actividad de la enzima PKL en una cepa bloqueada para las rutas de pentosa fosfato y glicólisis, se transformó un subconjunto de plásmidos de expresión en la cepa MD1041 (HMB GI1.2gltA yhfSFRTPyddVIspAyhfS thiFRTtruncIspA pgl ML, FRT-PL.2-2cis-RBS10000-MVK(burtonii)), t zwf::FRT, t pfkA::Frt t ackA::FRT, t pfkB::Frt) usando técnicas convencionales de biología molecular. Los transformantes individuales se hicieron crecer durante la noche en LB, se diluyeron en medio TM3 con glucosa-6-fosfato al 1% (Sigma) como fuente de carbono, y se indujeron con IPTG 0, 20, 40, 60, 80, 100, 200 o 400 pM. Las cepas se sometieron a ensayo para determinar el rendimiento del crecimiento en Enzyscreen Growth Profiler en comparación con las cepas de control MD1041 que no expresaron ninguna PKL (y, por tanto, no crecieron), expresaron la enzima PKL de E. gallinarum (y fueron representativas del rendimiento inicial), o cepas de tipo natural que no tuvieron bloqueo metabólico en para las rutas de pentosa fosfato y glicólisis (como control para el crecimiento óptimo).
Para calcular el índice de rendimiento (PI) para el crecimiento, se compararon cepas derivadas de MD1041 que expresaban enzimas PKL experimentales con MCS1148, una cepa que expresaba la PKL de E. gallinarum (véase la tabla 1 para la lista de cepas). Se eligieron el punto de tiempo de 35 horas y el nivel de inducción de IPTG 100 pM como representativos del rendimiento general en toda la curva de crecimiento. Para normalizar los valores entre las placas de ensayo, se aplicó un factor de corrección, basado en la diferencia entre los valores máximos de DO de las cepas de tipo natural, de 1,279 a todos los valores en la placa que no contenían la cepa de control que expresaba PKL de E. gallinarum. Luego se calculó PI dividiendo el valor de DO experimental corregido entre el valor de DO de MCS1148 en el punto de tiempo de 35 horas. El PI de MCS1148 fue, por tanto, 1,0, y cualquier valor mayor de este indicó una mejora de X veces en el crecimiento en este ensayo. Los valores de PI se muestran en la tabla 19.
Tabla 19: Valores de PI en cepas que expresan PKL bloqueadas para las rutas de pentosa fosfato y glicólisis
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Secuencias
Secuencia de aminoácidos para una enzima fosfocetolasa de Mycobacterium gilvum Spyr1 5 MTTATTAERRPLSDQDVDRLDRWWRAANYLSVGQIYLLDNPLLRTPLTREDVKPRLLG HWGTTPGLNFLYAHLNRAIAQRQQSTIYVTGPGHGGPGLVANAYLDGTYSEIYSDITQD DEGLRRLFRQFSFPGGIPSHVAPETPGSIHEGGELGYALSHAYGAAFDNPDLLVAAVVG DGEAETGPLATSWHSNKFVNAAKDGAVLPILHLNGYKIANPTLLARIPTDELRALMVG YGHHPYFFEVPDDEGGPGVDHADAHRRFARLLDDVLDEIADIKTRAREGDESRPAWPM IVFRTPKGWTGPDYIDGKKTTGSWRAHQVPLSNARDTKEHLAVLSDWLSSYRPDELFD ADGRLLPEIAELAPSGQLRMSDNAHANGGLLLKDLRLPDFREYAVDVPAPGATVAEAT RVLGQWLTEVIRLNPDNFRIFGPDETASNRLQAVYDATDKQWNAEFFGAEVDEHLARA GRVVEMLSEHQCQGWLEGYLLTGRHGLFNCYEAHHIVDSMLNQHAKWLKVTNHIPW RRPIASI.NYI.ESSHVWRQDHNGFSHQDPGFIDHVVNKSAKVVRVYI.PPDANTELSTYD HCLRSRQYVNVVVSGKQPSPNFLTMEQAVAHCTRGLGIWEWAGSEELGTDPDVVLAS AGDIPTLEALAAADILRQHLPDLKVRFVNVVDLMRLQDSTEHPHGLPDRDFDMIFTTDR PI1EAYHGYPWL1HRLTYRRAGHDNLHVRGYKEEGTTITPFDMVMLNDLDRYHLVMD VIDRVPSLGSTCAALRQQMADKRIAAREYTRAHGEDIPEVKOWVWPAARESGFGTAGA DGASSTGGDNE (SEQ ID N O :l)
Secuencia de aminoácidos para una enzima fosfocetolasa de Shewanella baltica OS185
MTQIHEINALKKYVRATNFLATSQIYLKQNVLHKRPLAHTDIKPRLLGHWGTCPGINFV YANINRLIVKHNRSFIYLVGPGHGFPAVQANLFMEGSLSHFYPETIPYNETGIEDICKKFS AAYGYPSHANPEAPGQILEGGELGYSLSVGWGAVLDNPDLIATVLIGDGEAETGPLAAS WYANREVSPATSCiAVEPIVHINGYKISGPTRMGRMSHEELDEEFRGEGYFPIIVDNELEE DIYVQMTNAMDTAYAMINDIQRRARSGEDVVKPKWPVILMRTAKGWTGVSEYKGKK LEGNCESHQVIVNKCATDKGHLDALDNWLASYHFQELYQMNDKGELIFDADICSLIPPK QLACGRQHLTYGGEVVRALTNPDLEKLSYGPEVPRGHRGYSMLKMGEWMRDAFKLN RDQRNLRIFSPDETYSNQLQAVFEETDRAWQWPIESWDEDMSREGRVIELLSENLLFGM LHGYTVTGRHGMFPTYESFSQVISSMADQYCKYVYASQGVHFRKPLPSCNVVLSSLLER QDHNGYSHQNPSFLGAMLEKHPKIISAYLPADANSTLVYTERAYADRDKLNILVAGKK ELPOWLSLEEARKQAKDGVMVWDFASDENPDIVLAGCGDYVTQECMASLVLIRELLPR VKIRFVSVTELSSDGLGSRKFKEKPWLMDEIFTQDKGVVFNYHGYPNTIKKLIFDYKGS RRFRIKGYEEEGSTTTPFDMGVRNGTSRYHLVIDMAYKLFQQGVIDETMHVSITTDMLQ
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Secuencia de aminoácidos para una enzima fosfocetolasa de Lactobacillus rhamnosus LMS2-1
MSMDTKVKTVDYSSKEYFDKMTAYWRAANYVSVGQLYLKDNPLLERPLKSEDVKPH PIGHWGTIAGQNFIYTHLNRVINKYDLNMFYIEGPGHGGQVMVSNSYLDGSYSEIYPRV SQDKEGMKNLFTQFSWPGGVASHASAQTPGSIHEGGELGYALSHATGAILDNPDVIAA WTGDGETETGPLAASWFSNTFINPISDGAILPIVHMNC.FKISNPTILSRKSDEDLTKYFE GMGWKPYFVEGDDPTKLNPEMAKVMDAAIEEIKAIQKHARETGDTTMPHWPVIIFRSP KGWTGPKSWNGEPIEGSFRAHOIPIPVDAEDMEHADSLAGWLKSYHPEELFDENGKUP ELAALPPKGDKRMAANPITNGGLDPKPLVLPDYRKYALDNKEHGKQIKQDMIVWSDY LRDLIKLNPHNFRIFGPDETMSNRLYSLFEVTNROWLEPIKEPADQYLAPAC.RIIDSQLSE HQSEGFNEGYTI.TGRHGLFTSYEAFLRVVDSMLTQHFKWTRKAHEEPWHKAYPSI.NVV STSTSFQQDHNGYTHQDPGILTHMAEKKAEYIREYLPADANSLLAISPKLFSSQNTVNVL ITSKQPRPQFYSIDEATVLANAGLKRIDWASNDDGVEPDVVIAAAGTEPNMESLAAINLL HDAFPDLKIRFINVLDLLKLRSPEIDPRGLSDAEFNSYFTTDKPILFAYHGFEGLIRDIFFTR QNRNVLIHGYREEGDITTPFDMRVLNELDRFHLAKDVIQHVPAYAEKAAAFVQKMDDT
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S e c u e n c ia de a m in o á c id o s para una e n z im a fo s fo c e to la s a de Lactobacillus crispatus ST1
MAVDYDSKDYLKSVDAYWRAANYLSVGQLFLMKNPLLKTPLVAEDVKPKPIGHWGTI APQNFIYAHLNRVLKKYDLNMFYIEGSGHGGQVMVSNSYLDGSYTERYPEITQDEKGM AKLFKRFSFPGGVASHAAPETPGSIHEGGELGYSLSHGTGAVLDNPDVIAAVEIGDGEAE TGPLAASWFSDKFINPIKDGAVLPILQINGFKISNPTIVSRMSDQELTEYFRGMGWDPHF VSVFKGGRFDGEKDPMQVHEEMAKTMDEVIEEIKAIQKHARENNDATLPHWPMIIFQC PKGWTGPKKDLDGNPIENSFRAHQIPIPVAQGDMEHADMLTDWLESYKPEELFNEDGSP KEIVTENTAKGDHRMAMNPITNGGIDPKRLNLPDYRKFALKFDKPGSVEAQDMVEWA KYLDEVAKLNPTTFRGFGPDESKSNRLFQLLDDQKRQWEPEVHEPNDENLAPSGRVIDS QLSEHQDEGFLEGYVLTGRHGFFATYEAFGRVVDSMLTQHMKWLRKAKEQYWRHDY PSLNFVATSTVFQQDHNGYTHQDPGILTHLYEKNRPDLVHEYLPSDTNTLLAVGDKAL QDRECINVLVTSKQPRPQWFSIEEAKKLVDKGLGYIDWASTDKGAKPDVVFASTETEPT IETLAAIDILHKKFPDLKlRYINVVDVMKLMDPKDNKÍs'GLSTEEFDRLFPKDVPVIFAWH GYKSMMESIWFARKRYNVHIHCYEENGDITTPFDMRVLNHLDRFDLAKDAVESIDKLK GKNADFISHMDDLLEKHHQYIRDNGKDMPEVTEWQWSGLK (SEQ ID NO:4)
Secuencia de aminoácidos para una enzima fosfocetolasa de Bifidobacterium longum subsp. longum jdm301
MTSPVIGTPWKKI.NAPVSEEAEEGVDKYWRVANYESIGQIYI.RSNPEMKEPFTREDVK HRLVGHWGTTPGLNFLIGHINRFIADHGQNTVIIMGPGHGGPAGTSQSYLDGTYTETFPK
it k d e a g l o k f f r q f s y p g g ip s h f a p e t p g s ih e g g e l g y a l s h a y g a im d n p s l f v p a i VGDGEAETGPLATGWQSNKLVNPRTDG1VLPILHLNGYK1ANPT1LSRISDEELHEFFHG MGYEPYEFVAGFDDEDHMSIHRRFAEEWETIWDEICDIKAAAQTDNVHRPFYPMEIFRT PKGWTCPKYIDGKKTEGSWRAHQVPLASARDTEAHFEVLKNWLESYKPEELFDANGA
v k d d v l a f m p k g e l r ig a n p n a n g g v ir d d l k l p n l e d y e v k e v a e y g h g v v g o l e a t RRLGVYTRDIIKNNPRDFRIFGPDETASNRLQASYEVTNKQWDAGYISDEVDEHMHVSG QVVEQESEHQMEGH.EAYEETGRHGIWSSYESFVHVIDSMENOHAKWEEATVREIPWR KPIASMNLLVSSHVWRQDHNGFSHQDPGVTSVLLNKCFHNDHVIGIYFATDANMLLAI AEKCYKSTNKINAIIAGKQPAATWLTLDEARAELEKGAAAWDWASTAKNNDEAEVVL AAAGDVPTQEIMAASDKLKELGVKFKVVNVADLLSLQSAKENDEALTDEEFADIFTAD KPVLFAYHSYAHDVRGLIYDRPNHDNFNVHGYEEEGSTTTPYDMVRVNRIDRYELTAE ALRMID ADKY ADKIDELEKFRDEAFQFAVDKGYDHPDYTDWV Y SGVNTDKKG AVT AT AATAGDNE (SEQ ID NO:5)
Secuencia de aminoácidos para una enzima fosfocetolasa de Leuconostoc citreum KM20
MADFDSKEYLELVDKWWRATNYLSAGMIFLKSNPLFSVTNTPIQAEDVKVKPIGHWGT ISGQTFLY AH ANRLIN KY DLNMF YIGGPGHGGQVM VTN A Y LDGEYTED YPE1FQDLEG MSRLFKRFSFPGGIGSHMTAQTPGSLHEC.CiELCiYSLSHAFGAVLDNPDQIAFAVVGDGE AETGPS.MTSWHSTKFLNAKNDGAVLPILDLNGFKISNPTIFSRMSDEEITKFFEGLGYSPR FIENDDIHDYAAYHELAAKVLDQAIEDIQAIQKDARENGKYEDGTIPAWPVIIARLPKG WGGPTIIDEDGNPIENSFRAIIQVPLPLAQNKLETLSQFEDWMNSYKPEELFNADGSLKD ELKAIAPKGDKRMSANPIANGGRRRGEEATDLTLPDWRQFTNDITNENRGHELPKVTQ NMDMTTLSNYLEEVAKLNPTSFRVFGPDETMSNRLWSLFNTTNRQWMEEVKEPNDQY VGPEGRIIDSQLSEHQAEGWLEGYTLTGRVGIFASYESFLRVVDTMVTQHFKWLRHASE QAWRNDYPSLNLIATSTAFQQDHNGYTHQDPGMLTHLAEKKSNFIREYLPADGNSLLA VQDRAFSERHKVNLIIASKQPRQQWFTADEADELANEGLKIIDWASTAPSGDVDITFASS GTEPTIETLAALWLINQAFPEVKFRYVNVVELLRLQKKSESHMNDERELSDAEFNKFFQ ADKPVIFGFHAYEDLIESFFFERKFKGDVYVHGYREDGDITTTYDMRVYSKLDRFHQAK EAAEILSANSTIDQAAADTFIEKMDATLAKHFEVTRNEGRDIEEFTDWNWSALK (SEQ
ID NO:6)
S e c u e n c ia de a m in o á c id o s para una e n z im a fo s fo c e to la s a de Bradyrhizobium sp. S23321
MNNQQQSALSRSDLDLLDRYWRAANYLSVGQIYLLDNPLLREPLRPEHIKPRLLGHWG TTPGLNFIYAHLNRVIRALDLSVLYVCGPGNGGPGMVANTYLEGSYSEIYPNIARDTDG LRKLFRQFSFPGGIPSHAAPETPGSIHEGGELGYALVHAYGAAFDNPDLIVACVVGDGE AETGPLAASWHSNKFLNPVHDGAVLP1LHLNGYKIANPTVLGRMRDEE1RDLFRGFGHE PLFVEGDDPTLMHQAMADAFDVAFARIRSIQQHARDGRKEIERPRWPMIVLRSPKGWT GPKEVDGLKVEGFWRAHQVPVAGCRENPAHLKILEDWMRSYEPEKLFDASGALIPELQ ALAPEGNRRMGANPHANGGLLKKELKLPDFRSFALEVPOPGGVTGEATRELGKFLRDV IRLNAAERNFRIMGPDETASNRLDAVFEETERVWMEPIEPYDVHLAQDGRVMEVLSEH LCQGWLEGYLLTGRHGFFSCYEAFIHIVDSMFNQHAKWLKVTRHLPWRRPIASLNYLL TSHVWRQDHNGFSHQDPGFVDLVANKKADIVRIYFPPDANTLLWIADHCLRTYNRINVI
v a g k q p a p q w l s m q d a a t h c d a g ig iw s w a g n e d a t g e p h v v m a c a g d v p t l e t l a AVDLLRKALPDLKIRVVNVVDLMTLQPKEQHPHGLSDRDFDSLFTSDKPV1FAYHGYPH LIHRLTYNRTNHAGEHVRGFIEEGTTTTPFDMVVLNELDRYHLAIEAIERVPGLAARAA AVKQQFRDALIEHSHYIREHGEDMPEIRDWVWPGKTG (SEQ ID NO:7)
Secuencia de aminoácidos para una enzima fosfocetolasa de Enterococcus faecium E1039
MDYSSKEYFDKMTAWWRAANYLSVGQLYLKDNPLLRRTLKPEDVKKHPIGHWGTIPC. QNFIYVHLNRVINKYDLNMFYIEGPGHGGQVMVSNAYLDGSYTEIYPEVTEDETGMQK LFKRFSFPGGIASHAAPETPGSIHEGGELGYSLSHAVGAVLDNPEVISAVVIGDGEAETGP
I.ACiSWFSNVFINPVIDGAVI.PII.HI.NGAKIANPT[I.ARKSDGF.I.ANYFNGEGWEPFFIEG NDPEKLNPVMAEKMDQAIEKIKSIQKEARLKTATDVVMPKWPVLIVRTPKGWTGEPIE
g t f r a h q v p ip v d q e h m d h a d a l l r w l k s y e p e k l f d a q g r il e e ir e ia p t g d q r m a k NPITNGGIDPKPL1MPDWKKYTLQFEKPGSIKAEDMTELGK.FVREIIEKNPENFRIFGPDE TKSNRLNOVFKTTNRQWMEKIEPENDEWLSPSGRVIDSQESEIIQDI Gl EI'GYVI.TGRII GFFASYESFLRVVDSMI.TOHFKWMRKSHDESWRNDYPSI.NUASSTVFQODHNGYSHO DPG1LTHLAEKKAEFIREYLPADANTLLAVMDKAFRSSEKINLIISSKHPRAOFYSAEEAA VLVNEGLKIIDWASTAKEEEPELVIAAAGTESNLEALAAVTLLLEEFPKLKIRFINVVDLL KLRHPSQDPRGESDEEFDQYFTKDKPILFAFHGYETEVRTIFFDRHNHHLMIHGYKENG
D1TTPFDMRVVNELDRYHLAKDAALK1KGSQAEDFAERMDQRLQEHQNY1RENG1DLP EVLDWKWKNLDQ (SEQ ID NO:8)
Secuencia de aminoácidos para una enzima fosfocetolasa de Brucella microti CCM 4915
MPAKGPLTPQQLSLINRYWRAANYLSVGQIYLMKNPLLREPLQPEHIKPRLLGHWGTTP GLNFIYAHLNRIIQQRNANVIYICGPGHGGPGMVANTYLEGTYSEIYPAISEDEAGMERL FRQFSFPGGIPSHAAPETPGSIHEGGELGYALVHAYGAAFDNPDLVVACVVGDGEAETG ALATSWHSNKFLNPARDGAVLPILHLNGYKIANPTVLARLSDDDLDNLFRGYGYEPFFV EGSEPADMHQKMAATLDTIFQRIQDIKKNADVHSPERPRWPMIILRSPKGWTGPKTVDG LVVENYWRAHQVPVANCRENDAHRKILEDWMKSYDPSDLFDEKGALKPELRALAPKG EARMGANPHANGGLLRKELHMPDFRQYAVNVTEPGAIEAQSTKILGDFLRDVMKLNET EKNFRIFGPDETASNRLGSVLEATNRVWMAETLDMDDHLAADGRVMEVLSEHLCQGW LEGYLLSGRHGFFSCYEAFIHIIDSMFNQHAKWLQVARELEWRKPISSLNYLLTSHVWR QDHNGFSHQDPGFVDLVANKSADIVRVYFPPDANTLLWVGDHCLKTWNRVNVIVAGK QPEPQWLTMAEAEKHCEAGLGIWEWAGTEDGLEPDIVMACAGDVPTMETLAAVDLLR QSLPHLRIRVVNVVDLMVLQSPHQHPHGISDEEFDRMFTTNRPVIFAYHGYPYLIHRLV YKRTNHSNFHVRGFIEQGTTTTPFDMTVLNELDRFHLAMEAVERLPLGESVAKPUDNF TEKLALHKDYIRQHGEDMPEIRDWKWTWPR (SEQ ID NO:9)
S e c u e n c ia de a m in o á c id o s para una e n z im a fo s fo c e to la s a de Lactobacillus salivarius ATCC 11741
MTDYSSQEYLDKLDAYWRAANYVSVGQLYLKDNPLLRRPLKAEDVKVKPIGHWGTIA GQNFIYAHLNRVINKYDLNMFYVEGPGHGGQVMVSNSYLDGSYSEIYPEISQDEQGMK RLFKRFSFPGGVASHAAPETPGS1HEGGELGYSISHSVGAVLDNPDLIVAAVVGDGEAET GPLAASWQSNKFINPIHDGAVLPILDLNGFKISNPTILSRESDETLTKYFEGMGWHPIFVE GDDPKLMHPAMAKAMDEAIEEIKAIQKNARENNDPSLPAWPVIIFRAPKGWTGPKEWD GEPIEKSFRAHQIPIPVDQNDMQHADALVDVVLESYKPEELFDENGKLKAEIAEITPKGDK RMAANPHTNPGKLIREVIKPDFRDFAVDTSVPGKEVAQDMTVLGKYLEKVLSDNRHNY RVFGPDETMSNRLAPIFDVTKRQWLAEIKEPNDQYEAPSGQVIDSQLSEHQAEGFLEGY VLTGRHGFFASYESFLRVVDSMLTQHFKWLRKATEQPWRTSIPSLNVIATSTVFQQDHN GYTHQDPGILGHLADKKPEYIREYLPADANSLLAVFDKTINDRDKINLIVASKHPRQQFY SAAEAKELVDKGLKIIDWASTDKNAEPDVVIAAAGTEPNLEALAAISILHEKLPDLKiRFI NVVDIEKERSPKVDPRGI.SDDFFDAYFTKDKPVIFAFHGYFGI.I.RDIFYYRHNHNVAFH GYRENGDITTPFDMRVLSQMDRFDLVKSVALSLPDADKYGQLVAEMDAKVAKHHQYI RDEGTDLPEVENWEWKPLD (SEQ ID NO: 10)
Secuencia de aminoácidos para una enzima fosfocetolasa de Streptococcus agalactiae COH1
MSEFDTKSYLEKLDAWWRAANYISAAQMYLKDNPLLRRELVENDLKVHPIGHWGTVP GQNFIYAHLNRAINKYDLDMFYIEGPGHGGQVMVSNSYLDGSYTELNPNIEQTEDGFK QLCKIFSFPGGIASHAAPETPGSIHEGGELGYALSHATGA1LDNPDVIAATVIGDGEGETG PLMAGWLSNTF1NPVNDGAVLPIFYLNGGKIHNPTIFERKTDEELSQFFEGLGWKPIFAD VVELSEDHAAAHALFAEKLDQA1QEIKT1QSEARQKPAEEAIQAKFPVLVAR1PKGWTGP KAWEGTPIEGGFRAHQVPIPVDAHHMEHVDSLLSWLQSYRPEELFDENGKIVDEIAAISP KGDRRMSMNPITNAGIVKAMDTADWKKFALDINVPGQIMAQDMIEFGKYAADLVDAN PDNFRIFGPDETKSNRLQEVFTRTSRQWLGRRKPDYDEALSPAGRVIDSQLSEHQAEGFL EGYVLTGRHGFFASYESFLRVVDSMVTQHFKWLRKSKTHTTWRKNYPALNLIAASTVF QQDHNGYTHQDPGILTHLAEKTPEYIREYLPADTNSLLAVMDKAFKAEDKINLIVTSKH PRPQFYSIAEAEELVAEGYKVIDWASNVSLNQEPDVVFAAAGTEPNLEALAAISILIIKAF PELKIRFVNVLDILKLRHPSQDARGLSDEEFNKVFTTDKPVIFAFHGYEDM1RDIFFSRHN IINLIITIIGYRENGDITTPFDMRVMSELDRFIILAQDAALASLGIKI1 (SEQ ID N O :ll)
Secuencia de aminoácidos para una enzima fosfocetolasa de Rhodococcus imtechensis RKJ300
MTDGRQVGSQDSDGHYSDSDLDLDLRWWAAANYLTVAQIYLQDNALLRAPLRPEHIK PRLLGHWGTSPGLSMIYALLNRLIRRTDTDCLYVTGPGHGGPALVAATYLEGTYSEVYP GVSRDAAGIHRLCRQFSTPGGIPSHVSVQTPGSIHEGGELGYALAHAAGAAFDHPNLLV ACVIGDGEAETGPLSGSWKLPAFLNPERDGAVLPILHVNGAKIAGPTVYGRSSDADVEA FLGGQGWAPTVVSGDDPRHVFPALHRALTDAHAAISDLQREARAGRRSAAKWPAIVLR TPKGWTGPRTVDGVLVEGTHRAHQVPLSGVRTDEAHLRQLEEWMRSYGPGELFDSSG a l v p d l e r l a p q g d k r m g s s p y a n g g r l r a d l p v p p l e k y a l a ie k p g t t l h e t t r v l g ELLRDLYAATATPDGGGYFRLFCPDETASNRLGAVFEVTDRCWOLPVTDYDDGLSARG RVMEVLSEHLCEGWLEGYLLSGRHGLFASYEAFAMVSVSMLVQHTKWLQHAVDLPW RAPVASLNVLLTSTCWRNDHNGFSHQGPGMIDAVIPLAPDVVRIWLPPDSNTLLSIADH CLRSTDHVNLIVVDKQPHLQYLTLAEAHAHCAAGASVWEWAGTEGAVGADPDVVLA AAGDVPTQEILAAAQLLREHTPDLVTRVVNVVDLMGLLTPTEHPHGFDARMFLDLFTA DTDVVFAFHGYSRAVHELIUGRPAPDRFIIVRGFSEQGTTTTPFDMVVLNRMSRYULVL EALRRTRREPAGAGELADFCLRQLERHGEYVVAHLEDMPEVRDWTVVS (SEQ ID
NO:12)
S e c u e n c ia de a m in o á c id o s para una e n z im a fo s fo c e to la s a de Burkholderia xenovorans LB400
MAEASSRPTPPQVLDADTLRNMDRYWRACNYLSAGMIYLRDNPLLREPLKPEHIKNRL LGHWGSDPGQSFLLVHLNRLIRKLDLNVIYVAGPGHGAPATLAHCYLEGHYSEIYPDRS EDEAGMQRFFRQFSFPGGIGSHCTPETPGSIHEGGELGYSLSHGYGAAFDNPDLIVTVMI GDGEAETCiPLATSWHSNKFLNPVRDGAVEPVLHLNGYKIANPTILARIPREELEALLTG YGHKPYFVEGDDPAVMHQQMAATLEQCIGEIRAIQQHARANNDATRPRWPMIVLRSPK GWTGPKEVDGHKVEGSWRAHQVPVLDPVTNGKSLKLVENWMRSYEPESLFDEAGRL VEELRELAPKGARRISANPHANGGLLCKTLDMPAFGDYAVAVKKPGGTYTSPTEVLGK FI.CDVMRRNMTNFRVFGPDETASNKETAIYEASEKTWI.AQTEPSDADGGDEAVDGRV MEMLSEHTLEGWFEGYVLTGRHGLFATYEAFVHVIDSMFNQHAKWLEKAKRDLGWR QPVPSINLLITSLVWRQDHNGFTHQDPGFLDVVTNKSPDVVRIYLPPDANCLLSVADHC LRSRDYVNVIVADKQPHLQYLDMDAAVIHCTKGIGIWDWASTDQGVEPDVVIASAGDI ATMEAEAAVQII.KERFADI.KIRFVNVVDEFRI.MPEHAHPHGESNRDFDSEFTATKPVIF NFHSYASLVHKLTYNRTNHDNLHVHGYHEKGNINTPLELAIINQVDRFSLAIDVIDRVPK LRGVGDHAKEWLRGQVIEHLAYAHAEGIDREEIRNWTWKG (SEQ ID NO: 13)
Secuencia de aminoácidos para una enzima fosfocetolasa de Mycobacterium intracellulare ATCC 13950
MTHATALSDDELALIDKYWRAANYLSVGQIYLLDNPLLTEPLTIDHVKPRLLGHWGTTP GLNLVYAHLNRVIRHRDADVIYVTGPGHGGPGLVANAYLEGTYSEVYTGIEEDTEGLR KLFRQFSFPGGIPSHVAAQTPGSIHEGGELGYALVHAYGAALDNPYLVVACVVGDGEA ETGPLAASWHSNKFLNPVTDGAVLPILALNGYKIANPTVLARIPHAELESLLRGYGYRPI TVAGDDPADVHRQLAAALDDAFDDIAAIQSAARGGNGVERPVWPMIVLRTPKGWTGP KMVDGKKVEGTWRSHQVPLAATRDNPEHRAQLEEWLRSYGPGELFDENGRLRPELRA LAPSGDRRMSANPHANGGLLLHDLDLPDFRDYAVAVERPAAVTHEATRVLGGFLRDVI ARNKDRFRLMGPDETASNRLDAVYGSTDKVWLSEIEPDDEHLAPDGRVMEVLSEHLCQ GWLEGYLLTGRIIGLFNCYE AFVIIIVDSMLNQIIAKWL ATSRELPWRRPIASLN YLLSSII VWRQDHNGASHQDPGFIDLVANKRPELTRVYLPPDGNTLLSVADHCLRSRDYINVIVA GKQPALAYLDMDEAVAHCTRGLGIWEWASTATDDPDVVLACAGDIPTLETLAAADILR SELPELAVRVVNVVDLMRLQPDTEHPHGLPDREFDALFTPDRPVIFAYHGYPWLIHRLT YSRTNHAHMHVRGFKERGTTTTPFDMVMLNDLDRFHLVMDVIDRVDGLASRAAMLR QRMVDARLAARMYTREHGEDDPKISGWTWGPSD (SEQ ID NO: 14)
Secuencia de aminoácidos para una enzima fosfocetolasa de Nitrosomonas sp. Is79A3
MKKNTKLLSPELLHKMDAYVVRAANYLSVGQIYLYDNPLLKQPLKLAHIKPRLLGHWG TTPGLNFIYVHLNRIIKEHDLNVIYITGPGHGGPGLVANTYLEGTYSEVYPNISQDEDGM QRLFKQFSFPGGIPSHVAPETPGSIHEGGELGYSLSHAFGAAFDNPGLLVACVVGDGEAE TGPLATSWIISNKFLNPVIIDGAVLPILHLNGYKIAGPTVLARIPCDELEALFRGYGYTPYF IEGDDPLEMHQRMAATLDAVIANIQSIQRDARTHGFTKRPHWPMIILRSPKGWTGPKVV DGKPTEGTFRSHQVPMGDMSQPGHVKILEKWLKSYRPQELFDETGKLLAELAELAPQG ARRMGANPHANGGMLLRDLRLPDFRDYAVKVANPGTVSAEATRTOGEFIRDVVKLNA TNFRVFSPDETASNRWGAVFEVTNRCSTAEIVPGDDHVAPDGRVMEMLSEHQCEGWLE GYLLTGRHGFFSCYEAFIHIIDSMFNQHAKWLKVANEIPWRRPIASLNYLLSSHVWRQD HNGFSHQDPGFIDHVINKKAEIIRIYLPPDANTLLSVTDHCLRSRNYVNVIVAGKQPQPQ WLDMDAAIKHCTAGIGIWEWASNDQGEEPDVVMACAGDAPTIETLAAVELLWKHFPE LKlRVINVVDLMSLQPQSEHPHGLSDKDFDGLFTKDKPlIFAYHGYPWLIHRLTYRRrNH DNLHVRGYKEEGTTSTPFDMVVMNDLDRFHLVADVIDRVPQLGSRAAYVKQAIRDKLI EHKQYINQYGEDMPEIRNWKWKGSSV (SEQ ID NO:15)
Secuencia de aminoácidos para una enzima fosfocetolasa de Schizosaccharomyces pombe 972h MATQNDIPNSTPEDLAKQVEIAEKHPDPPAMPSRLPDSLKTLEAKIDTSKITDEEVANVH RFQRACDYLAASLIFLSNGLYTGGDLEEKDIKTRLLGHWGTCPGLSIVYSHCNRIINKYD LNMLFVVGPGHÜAPAILSALFLEDSLGPFYPRYQFTKEGLNNLINTFSLPGGFPSHVNAE VPGAIHEGGEEGYALSVSYGAVFDRPDUVTCVVGDGEAETGPTATSWHAHKFLDPAE SGAVIPVLELNGYKISERTIYGCMDDSELLSLFSGFGYEVAIVNDTPDQNRVMAATMDW AVERIHDIQHRARVNREEIKPRWPMIILRTPKGKGCPKYLNGKFLEGTFRAHQVPLKLA RTDTNQRNLLKDWLNSYNCQDFLDEHGLPTKGITEHLPPREKRMGQRHETYNSYLPLK VPDWKKYGVKKGETTSATSVVGQYLDELLVTNDSTLRIFSPDELESNKLDGALKHSYR TMQTDPELMAKRGRVTEVLSEHLCQGFMQGYTLTGRTAIFPSYEAFMTIVVSMLVQYS KFLKMGLETGWHGKFGSLNYVTSSTWARQEHNGFSHQSPRFITTMLSLKPGVSRVYFPP DANCFLATVARCMKSENTINLMVSSKNPQPAYLSVEEAEHHCKAGASVWKFASTDNG ENPDVVIAGVGNEIMFEVVKAAEMLQNDIPELRVRVINVTDLMVLSSLHPHGMNPAEF DSLFTKDRHVHFNYHGYVMDLKALLFDRIQGTRVTMEGYREEGTTTTPFNMMMCNNT SR YH V ARM ALQH ALHNPTV AVNCNMLC AKY AWKLEEIENYIMENKDDPPEIY A APVF KNKTSTL (SEQ ID NO: 16)
Secuencia de aminoácidos para una enzima fosfocetolasa de Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides J18
MNIDSTDYLNNLDAYWR ATNYLSVGQLYLLDNPLLKEKLT AEQVKIIIPIGIIWGTIPSQ NFIYAHLNRAINKFNLNMFYIEGPGHGGQVMISNAYLDGSYTEAFPEITQDEAGMQKMF KRFSFPGGVASHADPKVPGSIHEGGALGYSILHGAGAVLDNPDLIAAVVVGDGEAETAP LATSWHVNKFLNPKNDGTVLPILNLNGFKIANPTVLSRESDETLTEYFHSLGWHPYFVSS FDKP1MQVHEEMAKTMDTVFTEIKDIREKAVQQTNEEITRPLWPM1VLRSPKGWTGPKT WDDNPIENSFRAUQ1P1PADQNHPEY1PQLVDWLQSYKPDELFDENGQLTQS1QEVLPKK ELRMANNSVTNAGKIKPLILPDIDNYLVENNQPGNNLAODAILLGDYLRDIIKLNPTNFR GFGPDETASNRFQDIFETTNRQWLLPIKEPNDQFMAPEGRIIDSMLSEHYDEGMLEAYTL TGRUGFFASYEVFIREVDDMIVQIIFKWLNI1SHDVSWRKDVPALNIIADSTVFQQDHNG YSHQDPGVTTMLYEKQPDFIREFFPADANSLVATFEHAAQATQQINYIVASKHPRLQWF SPTEAKQLVTQGLRVIDWASTDKGEKPDIIISSAGSEPTTESLAAIQILHEHIPSLKIRYINV LDLFKLRADASYGLSDDEFDAYFTTDTPVLFAFIIGYEPMIESIFFKRHNMIILAVHGYRE VGDITTPFDMRVI.NKIDRFNLVKAAINLEPENIRTKOAAI VQF.MTDKI DFHVAYTRSKG TDLPEVEDWRWQPLK (SEQ ID NO:17)
Secuencia de aminoácidos para una enzima fosfocetolasa deStreptomvces sp. SA3 actG
MSDASVSAVADALDYLCLAQLYLRENPLLARPLTSAHVKWRPAGHWGVCPPVNRML AALGPVQASVPDGYELRVLHGAGHAGPSALAHAYLTGRLGRVYPDLIQSPAGLLELVS GFPRPETGGEITPMIPGHLHTGGQLGAALAIGQGTVLDAPRRLTVALLGDGECETGTTA ASWLASRALRGTGDHGTVLPVVLLNGMRMGGPSVLSTLSRDELTAYFTGLGHQPVYS DGLDIAQLRQAIAEAVADARPLGVPGPSSVLVLTLEKGYGAPAGLAATPAVHKTPLHDP ASVPSEFDLLSEWLASYRPAQLLTPGGRPRPHLLPALPRPRPEPGGLSAPRGCIAASTQV ADHASGRAFAQVVPDVLRARAAQGPFRVFSPDELASNR1DLTDGQGRTVPWAVEVLSE ELCHAWAQGYTETGRHALVATYEAFAPITLSLVQQQLKHRSARRHAGLAPLPSLVYLL TSLGWHNTFTHQNPSLATALLAGGDPSVHVLTPADPARAAAALTFALRKLDRCTLVIA DKHATVQHPLETLDEELRHGMAIWPHLSAPGPEEPDLILASAGDLPAEVLTTLARRLRD DRRELRLRYVHIHDLTALAEEDTRSLALGPAAFTHHFGTTAPLVLATSGHPAD1HALFG RRHPGPRI.TVIXj YRDPGRPVSQTHI.RQIXXjLDDTSLWHLATTLIDASKEIPAP (SEQ ID
NO: 18)
S e c u e n c ia de a m in o á c id o s para una e n z im a fo s fo c e to la s a de Lactobacillus buchneri ATCC 11577
MTVDYDSKEYLDLLDKYWRAANYLSVGQLYLRDNPLLKRPLKSDDVKIKPIGHWGTIV s q n f iy a q l n r a in k y d l n m f y ie g s g h g g q v m v s n s y l d g s y s d iy p n is q d e k g m q KLFKQFSFPGGVASHAAPETPGSIHEGGELGYSLSHGTGAILDNPDVIAAVEIGDGESET GPLAASWFSDKFINPITDGAVLPIINMNGFKISNPTILSRMSDADETDYFKGMGWEAHFV EATADTDHAKVEAEFAKTLDTVIEKIKSIQKNARENETPDNVKLPVWPMIIFRSPKGWT GPKKDLDGNPIEGSFRAHQVPIPVDANDMEHADELVDWLKSYKPEELFDENGTLKPEL RALAPKGEQRMSVNPITNGGIKPEPLKLPNVRDFEVKFDKRGTEQKQDMIEWSKWLDA VAKLNPTTFRGFGPDETKSNRLYSLLDDGKRQWMEDIHEPYDEDLANHGRVIDSQLSE HQAEGWLEGYVLTGRHGFFATYESFGRVVDSMLTQHFKWLRKASEQYWRKQYPSLNF VDTSTVFQQDHNGYTHQDPGLLTHLAEKKPEFIREYLPADANELLAVGDSAFRTYEKIN LIVTSKHPRRQWYSY1DEAQNLVKNGLGYIDWASTDQGQEPDVVFAAAGSEPNLEALA AISILNKEFPELKIRFINVVDILKLNSPKKDPRGLSDEEFDNLFTTDKPVIFAWHGFEDMIK DIFFDRHNHNLYVHGYRENGDITTPFDMRVLNELDRFHLAADAIRHIPAYAVKGGYFIQ RMNNIVDKHNRYIREVGTDLPEVTSWNWEPLNK (SEQ ID NO: 19)
Secuencia de aminoácidos para una enzima fosfocetolasa de Streptomyces ghanaensis ATCC 14672
MPEAPDTRTVLSDEELRTLDAHWRAANYLAAGQIYLLANPLLTEPLRPEHIKPRLLGHW GTSPGLNLVYTHLNRVIAGRGLDALCIWGPGHGGPSVLANSWLEGSYGETYPDVGRDA AGMERLFRQFSFPGGVPSHVAPEVPGSVHEGGELGYSLAHAYGAALDHPGLLVACVIG DGEAETGPLAASWHSNKFLDPVHDGAVLPILHLNGYKIANPTVLARLPEDELDSLLRGY GHEPIHVSGDDPAAVHRAMAHAMDTALDRIAEVQRAAREDGVTERARTPVIVLRTPKG WTGPAEVDGKPVEGTWRAFIQVPLAGVRDNPEFILRQLEAWLRSYRPEELFDDAGRPVA DVLACLPEGDRRLGSTPYANGGLLVRELPMPALDDFAVPVDKPGTTLHEPTRILGGLLE RIMRDTADRRDFRLVGPDETASNRLEAVYDASGKAWQAGTLDVDEHLDRHGRVMEV LSEHLCQGWLEGYLLTGRHGLFSCYEAFVHIVDSMVNQHIKWLKTSRELPWRAPIASLN y l l t s h v w r q d h n g f s f iq d p g f v d h v l n k s p e v v r v y l p p d a n t l l s v a d h a l r s r d YVNVVVAGKQPCFDWLS1DEARVHCARGAGIWEWAGTENGGAPDVVLACAGDVPTQ EVLAAAQLLRRHLPELAVRVVNVVDIARLMPREEHPHGMTDFEYDGLFTADKPVIFAY HGYPWLIHRLAYRRNGHPNLHVRGYKESGTTTTPFDMVVRNDLDRYRLVMDVIDRVP GLAVRAAAVRQRMADARTRHHAWIREHGTDLPEVAEWSWNA (SEQ ID NO:20)
Secuencia de aminoácidos para una enzima fosfocetolasa de Cyanothece sp. PCC 8802
MVATPERPTLEQTPLSAEELRQIQAYWRACNYLAVGMIYLRDNPLLKDPLTEDHVKNR LLGHWGSSPGLSF1YIHLNRLIKKYGLDVIYMAGPGHGAPG1LGPVYLEGTYSETYPDKS EDEEGMKKFFKQFSFPGGIGSHCTPETPGSIHEGGELGYSLSHAYGAALDNPDLIVAAVV GDGEAETGPLATAWHSNKFINPIRDGAVLPILHLNGYKIANPTILARISHEELEYLFKGYG YKPYFVEGSDPEVMHQKMAATLETAIAEIKHIQQEARTSGVAKRP1WPMIVLRSPKGWT GPASVDGKKrEDFWRSHQVPLSGMHGNPAHIKVLEDWLKSYTPEELFDENGTLIPELKE I^APTGFIHRMSANPHANGGLLRKDI.KMPDFRNYGVEVAKPGTVEVGNTALIGtNFERDV MANNMTNFRVFGPDETASNRLNAIYEISKKVWMGEILPEDADGTEITTDGRVMEMLSE HTLQGWLEGYLLTGRHGFFHTYEAFAHVVDSMFNQHAKWLDICKNEVPWRASVSSLN ILLSSTVWRQDHNGFSHQDPGYVDLVTNKSADVVRVYFPPDANCLLSVANHCLKSTDY VNVIVSDKQIHI.QYENMDQAIKHCTKGIGIWDWASNDDCGTEPDHPDVIMASCGDVAT KEALAATAILREEFPDLKVRFINVVDLFKLQSEIEHPHGLSDRDFDNLFTKDKPIIFNFHG YPWLIHKLTYRRTNHHNLHVRGYKEKGNINTPLELAINNQIDRFNLVIDVINRVPKLGSA AAYVYERMKNAIIEHRAYAYEHG1DKPEINNWKWPH (SEQ ID NO:21)
S e c u e n c ia de a m in o á c id o s para una e n z im a fo s fo c e to la s a de Neosartorya fischeri NRRL 181
m t s k g e ie s l s a y g v a r s t iq g t p l s q d e l r k m d a y f r a s m y l c l g m l y l r d n p l l k e p LKVEHLKARLLGHWCiSDAGQSFTWIHMNRLIKKYDLDVLFISGPGHGAPGILSQSYLEG VYTEVYPEKTQDEKGLQRFFKQFSFPGGIGSHATPETPGSIHEGGELGYSISHAFGTVFD HPNLITLTMVGDGEAETGPLATSWHSNKFLNPITDGAVLPVLHLNGYKINNPTILARISH EELEMLLKGYGWIPYFVEGSDRESMHQAMAATLEHCVLE1KKIQKQARESNKAFRPL WPMIVLRSPKGWSAPREIDGKYLEGFWRAHQIPITDVQSKPEHLKVLENWMKAYKPEE VFDKNGTLIPELKELAPTGTSRMSANPVGNGGLLRRPMDLPDFRDYALTDIEPGVTIRPS MSNMSKYLRDVVARNMTTFRVFGPDETESNKLAEIYKAGKKVWMAEYFKEDEDGGN LDMQGRVMEILSEHTCEGWLEGYILSGRHGMLNSYEPFIHVIDSMVNQHCKWIEKCLA VEWRAKVSSLNILLTATVWRQDHNGFTHQDPGFLDVVANKSPEVVRIYLPPDGNTLLS TMNHCFRSVNYVNV1VADKQEHVQFLNMEEAIEHCTKGVGIWDWASNDQGCEPDVV MASCGDVATHEALAATALLREHLPQLKVRFVNVVDLFRLISDINHPHGMPDRQWGAIF TTDKPIIFNFUSYPWLIIIRLTYKRPGQIINLIIVRGYKEKGNIDTPFELAVRNQTDRYSLAI DAIDRIPSLGNTASGVRERL1NLQLAAKNKAFDDGIDPDYIRNWTWDYPRKKC (SEQ ID
Secuencia de aminoácidos para una enzima fosfocetolasa de Enterococcus faecium TX1330
MDYSSKEYFDKMTAWWRAANYLSVGQIYLKDNPLLRRTLKPEDVKKHPIGHWGTIPG QNFIYVHLNRVINKYDLNMFYIEGPGHGGQVMVSNAYLDGSYTEIYPEVTEDETGMQK LFKRFSFPGGIASHAAPETPGSIHEGGELGYSLSHGVGAVLDNPEVISAVVIGDGEAETGP LAGSWFSNVFINPVTDGAVLPILHLNGAKIANPTILARKSDGELANYFNGLGWEPFFIEG NDPEKLNPVMAEKMDQAIEKIKSIQKEARLKTAADAMMPKWPVLIVRTPKGWTGPEE WDGEPIEGTFRAHQVPIPVDQEHMDHADALLRWLKSYEPEKLFDAQGRILEEIREIAPTG DHRMAKNPITNGGMDPKPLIMPDWKRYTLQFEKPGSVTAEDMTELGKFVREIIEKNPEN FRIFGPDETKSNRLNQVFKTTNRQWMEKIEPENDEWLSPSGRVIDSQLSEHQDEGFLEG YVLTGRHGFFASYESFLRVVDSMLTQHFKWMRKSRDLSWRNNYPSLNLIASSTVFQQD HNGYSHQDPGILTHLAEKKAEFIREYLPADANTLLAVMDKAFRSSEKINLIISSKHPRAQ FYSAEEAAVLVNEGLKIIDWASTAKEEEPELVIAAAGTESNLEALAAVTLLLEEFPKLKI RFINVVDLLKLRHPSQDPRGLSDEEFDKYFTKDKPILFAFHGYETLIRTIFFDRHNHHLMI HGYKENGDITTPFDMRVVNELDRYHLAKDAALKIKGSQAEDFAKKMDQKLQEHQNYI RENGIDLPEVLDWKWKNLDQ (SEQ ID NO:23)
Secuencia de aminoácidos para una enzima fosfocetolasa de Listeria grayi DSM 20601
MTDYSSPNYLAKVDAWWRAADFISVGQLYLKGNPLLRRPLEKEDLKVHPIGHWGTISG QNFIYAFILNRVINKYDLNMFYIEGPGHGGQVMVSNSYLDGSYTDTYPTITQDEVGLTKL YKQFSFPGGIASHAAPETPGSEHF.GGELGYAESHATGSIEDNPDVIAATVIGDGEAETGP LSAGWFSNTFINPVNDGAVLPILYLNGAKISNPTILSRKTDKELTSFFQGLGWDPIFVEGE DPAKVHPLMAEKLDQAIEKIKAIQTEARKEAADKATMPTWPVILFRTPKGWTGPKEWN NEP1EGSFRAHQVPIPVDQHHFDHVDALENWLQSYRPEELFTEEGSLKEEIKSLAPKNRM ATNPITNGGIDPQPERLPSWKDYAVETANKDVITQDMIELGGFVRDIVKENPDNFRIFGP DETKSNRLNKVFEVTNRQWMSKAEFPRDEWLAPAGRIIDGQLSEHQAEGFLEGYVLTG RHGFFASYESFLRVVDSMLTQHFKWLRKAKEQTWRNSYPSLNVIATSTVFQQDHNGYT HQDPGVLTHLAEKKPEFIREYLPADTNSLLAVMNEAFRSEELINLIVSSKHPRPQFYSAEE AEII.VKDGEKIIDWASTVSF.AFFPDVVIASAGTFPNEFAEAAVTI.LNFAFPSI.KIRFINIVD ILKLRHPDIDPRGLTDEEFDRYFTTDKPIIFAFHSYEGMVRDIFFNRHNHNLFIHGYRENG DITTPFDMRVLSEMDRFHLAKDAAEAVYGEIATSFAAEMDAVLSKHHHFIRENGEDLPE VENWKWQALKTDLLEV (SEQ ID NO:24)
S e c u e n c ia de a m in o á c id o s para una e n z im a fo s fo c e to la s a de Enterococcus casseliflavus EC30
MKTTYDTPEYYQKMNAWWRAANYLSVGQIYLKDNPLLRRPIEEKDLKVNPIGHWGTI AGQNFIYTHLNRVINKYDLNMFYIEGPGHGGQVMVANAYLDGSYSEIYPKATQDEAG MKHLFKTFSFPGGIASHAAPETPGSIHEGGELGYSIAHATGAILDNPDVIAAVVVGDGEA ETGPLAGSWFSNTFINPVNDGAILPILHLNGAKIANPTILARKSDQDLTKYFEGMGWTPY FVEGDDPEAVHPQLAQKMDQAIEQIHAIQAEARKGSAEEAAMPHWPVLIVRTPKGWTG PKVWDGEPIEGGFRAHQVPIPVNAKHMEHVDALTDWLQSYRPEELFDENGRIKAEIQEL APKGEQRMAVNPITNGGIDPQPLRLPDWQAHAIAIETPGETTAQDMMVFGKFARDIIKE NPDNFRIFGPDEAKSNRLNHVFEVTDRQWLEPKHPDYDEWLSSVGRVIDSQLSEHQAEG FLEGYVLTGRIIGFFASYESFLRVVDSMITQHFKWLRKAI1DLDWRNPYPSLNLIASSTVF OQDHNGYTHQDPGIMTHIAEKKADFVRVYLPADANSLMAVMAETLASEEKINLVVSSK HPRPQFYSADEAKVLVKDGLKVIDWASTDEGQEPDIVIAAAGTEPNLEALAAVSLLIEA FPELKVRFINVVDLLKLRRPEVDPRGLSDEAFEAYFTKDKPIVFAFHGYEGLIRDIFFGRR NQQLHIHGYRENGDITTPFDMRILSELDRFHLAKDAAEWVYGEKATDFAQKMADTVA YHHDFIRENGYDIAEVEEWEWKPLR (SEQ ID NO:25)
Secuencia de aminoácidos para una enzima fosfocetolasa de Mycoplasma alligatoris A21JP2
MKKNTFDTQDYLDKVDAWFRAANYLSVGQMYLRNNPLLRSKITSDDVKVYPIGHWGT IPGQNFAYAHLNRVINKYNLNMFYIEGPGHGGQVMTSNSYLDGSYTELFPHVTQDVAG MKHLFKYFSFPGGTASHAAPETPGSIHEGGELGYSLSHATGAILDNPNVIAATIVGDGEA ETGPLAASWFSNSFINPVNDGAVLPILHLNGGKISNPTILCRKSNKELTDYFAGMGWEA VFVEGSDEKEMHKVMAQKLDYVIEKIQSIQNEARKKPANQATRPIWPMMVLRTPKGW TGPDSWNKDKIVGSFRAHQVPIPVNSANMEHIDALLDWLKSYKVDNLFDKNGKLVDEI AQIAPKGDQRMGMNPITNGGLNPKKLVMPRWQDFALKFSKPGELVNQDMVELGTYFA KMMELNKDNFRLFGPDETKSNRLYNVFKVTK.RQWLEPISPILDEALSPEGRVIDSQLSEH QAEGFLEGYVLTGRHGVFASYESFLRVVDSMLTQHLKWLKKAKDVHWRNDYPSLNVI ATSTAFQQDHNGYTHQDPGLIGHLADKTPEIIRQYLPADTNTLLAVMDKSLKERNVINH IIASKQPREQFYSEQEAAELVEKGLKVIDWASTTKGNEEPELVVVAAGTEPNLEALAAV riLNKEYPSLKIRFVNVVDLMKLRHPSLDPRGLSDKEFDAlFTSNKPIVFAFHGYEGILRD MFFKRNNHNLITHGYRENGDITTSFDIRQLSHMDRFHISASAAKAVYGNKAQEFEDKMI QTIDFHTKYIREYGTDIPEVKEWKWADLTRK (SEQ ID NO:26)
Secuencia de aminoácidos para una enzima fosfocetolasa de Carnobacterium sp. 17-4
MKNYDSKDYLKKVDAFWRAANYLSVGQLYLRDNPLLQRPLKSTDVKAHPIGHWGTIS GQNFIYAHLNRVINKYDLNMFYIEGPGHGGQVMISNAYLDGSYTEIYPDITENKEGMKK LFKQFSSPGGVASHAAPETPGSIHEGGELGYSLSHATGAlLDNPDVlAArVlGDGEAETG PLAACiWFSNNFINPVNDGAVLPIEYENGGKISNPTIEARKSNFDEKKYFEGMGWKPYFV EGTDPEKVHPVMANTLDVVIEEIRSIQNEARKGKAEDVEMPHWPVMIIRTPKGVVTGPKE WDNKKIEGTFRAHQVPIPVDAEHMEYVNKLVDWLKSYRPEELFTENGKLIDDLKELTP KGNKRMATNPlTNGGlNAKALlIPNWKQHAIDrnPGAVlAQDMDVFGEQARDLlVKNP NNFRIFGPDETKSNREDKIFEVTNRQWLESKEETDEWQSSAGRVIDGQESEHQAEGFEE GYVLTGRHGFFASYESFLRVVDSMLTQHFKWLRKATDQKWRNNYPSLNVIATSTVFQQ DHNGYTHQDPGILTHLAEKKPEFIREYLPADANSLMAVMDKTLQEEQLINLIISSKHPRP QFYSVEEAEILVKDGLKIIDWASTDNDSEPDLVIAAAGTEPNLEALAAMSILHKAFPELKI RFINIVDILKLRHPDIDSRGLTDEKFDSYFTKEQPIIFAFHGFEGLIRDIFFNRHNHNLRIHG YRENGDITTPFDMRVLNEMDRFHLAKDAAKAVYGLKANKFMQEMENTVNFHHQYIRE NGIDIPEVINWKWEK1 (SEQ ID NO:27)
Secuencia de aminoácidos para una enzima fosfocetolasa de Melissococcus plutonius ATCC 35311
MEKDKYSSTEYLDKIDKWWRAANYLSIGQLYLKDNPLLKRKIRSEDVKYHPIGHWGTI AGQNFIYAHLNRIINKYDLNMFYIEGPGHGGQVMVSNSYLDGSYTEIYPAVTEDEAGM QKLFKRFSFPGGVSSIIAAPETPGSIHEGGELGYSLSHGVGAILDNPEVISAVVIGDGESET GPLATSWFSNTFINPVTDGAVLPILHLNGAKIANPTILGRKSDKELEQYFRGMGWIPYFV EGNDPNQMHPLMAKTLDQVIEKIHSIQETARKQTAETASIQKWPLIVLRTPKGWTGPKE WDGKPIEVTFRAHQVPIPIDQDHMEHVDQLVNWLKSYKPEELFDETGRLNSEIRAIAPM NDKRMAMNPITNGGINPKPLQMPDWREFDLHISKPGELVAQDMLEFGKMVAAIIKKNP QNFLIFGPDETKSNLLNDAFSVTSRQWLEPIYEPQDEWLAPSGRIIDSQLSEHQDEGILEG YVLTGRHGFFASYEAFIR1VDSMIAQHIKWMRKAMDLPWRNGYSSLNLIASSTAFQQDH NGYTHQDPGILSHLAEKEADFIHEYVPADTNSLLAVMDKVLKSQGKVNLVISSKHPRPQ FYSPEEAQELVNRGLMEIDWASTVAENGTPEIV1VAAGTEPNMEALAAINLINQSFPKLQ FRFINVVDLLKLRHPAVDSRGISEVEYNHLFTVDSPIIFVCQGYSSLIRSLFYDRKNRPVSI HSYQENGAITTPFDMRVLNKIDRYHLAKDIALTAYGSRGEDFARAMDTILEKHNQYIRE TGKDLPEVLNWKWAPLHIYNENIEQD (SEQ ID NO:28)
Secuencia de aminoácidos para una enzima fosfocetolasa de Tetragenococcus halophilus NBRC 12172
MSVNIDSKEYLERMNAWWRAANYISVAQIFLRDNPLLRRPLEKEDIKINPIGHWGTISG QNFIYVHLNRVINKYGLNMFYIEGPGHGGQVMVSNSYIDGSYSEIYPDVTQDEAGLKKL FKQFSFPGGMGSHAAPETPGSIHEGGELGYSMSHAVGAVLDNPDVIAATVIGDGEAETG PLAASWMSNNFINPVNDGAVLPILNLNGAKIANPTVLARKSDKDLQKYFEGLGWKPYF VEGDNPEKMHPLMAETLDAVINEIQSIQKEARKGSAEDVTMPHWPVIVFRTPKGWEGP EKWDNEQIAGTFRAHQVPIPIDASHMEYANDLAKWLKSYRPEELFDENGTIIDAIKELSP KGDNRMSVNPITNGGLDPKALNMPDWHTHAVDTSKRGTDKAQDMSVLGGFIADIMEN NPKNFRIFGPDETKSNRLNKVFDVTNRQWVEPRELSDEWQSAVGRVIDGQLSEHQAEG FLEGYTLTGRHGFFASYEAFLRIVDSMLTQHFKWIRKANEKSWRKKYPSLNVISSSTAF QQDHNGYTHQDPGVITHLAEKKPEYIREYFPADANSLMAVMDKALKDENVINLITSSK
h p r p q f y s v e e a q e l v d y g v k k id w a s n d q d s e p d iv f a a a g s e p n l e a l a a is il h e q f PEMKIRFINVVDLLKLRHPDVDPRGLSDEAFDELFTFÜKPVIFNFHGYEGLIRDIFFTRHN RNESIHGYREDGDITTPFDMRVKNEFDRFHI.AKDAANTIYAEKAADFIQEMDKTFQYH HDYIRENGDDISEVQNWEWKDLK (SEQ ID NO:29)
Secuencia de aminoácidos para una enzima fosfocetolasa de Melissococcus plutonius DAT561
MTKYDSKEYLAKVDAFWRAANYISVGQLYLKDNPLLDRPIETTDVKVHPIGHWGTISG QNFIYAHLNRVINKYDLNMFYVEGPGHGGQVMVSNSYLDGSYTEIYPEITEDKEGLKKL FKQFSFPGGIASHAAPETPGSIHEGGELGYSISHATGAILDNPDVIAATVVGDGEAETGPL SAGWFANTFINPVNDGAIEPIEYENGGKISNPTII.ERKSDEELTKYFEGMGWKPYFVEGT VPDKVHPLMAKILDHIIEEIKDIQKEARKDKAENAKMPHWPVLIMRTPKGWTGPKIWD DEKIEGTFRAHQVPIPVDAEHMEHIDALVDWLKSYHPEELFDKNGTLKPELKELVPKGD RRMAKNPITNGGLDPKPLKMNGWEQHAIDTSTPGMVTAQDMIVFGNYVEDLIKANPTN FRIFGPDETKSNRLNKVFDSTDRQWMEPISNADEWQSSVGRVIDGQLSEHQAEGFLEGY ILTGRHGFFASYESFLRVVDSMLTQHFKWLRKAKEQSWRKEYPALNIIATSTVFQQDHN GYTHQDPGILTHLAEKKAEYIREYLPADANCLMAVMDKAFQENEVINLIVSSKHPRPQF YSVTEAKELVDKGVKVIDWASNDEGQTPDIVIAASGTEPNLEALAAITLLNKEFIDLKIR FVNVVDILKLRHPSIDPRGLTDEEFDAIFTKDKPIVFAFHGFEGLIRDIFFSRSNHQLFVHG YREKGDITTPFDMRVLSEMDRFHLAKDVADKVYNEQAADFMNRMDEILAFHHQYIRK NGIDIPEVVNWKWEDLRKKTICFN (SEQ ID NO:30)
Secuencia de aminoácidos para una enzima fosfocetolasa de Mycoplasma arthritidis 158L3-1
MKKTNYDSNEYFNLIDKWFRAANYLSVGQIYLRNNPLLKTKLVADDVKIYPIGHWGTI PGQNFIYAHLNRVINKYDLEMFYIEGPGHGGQVMISNSYLDGSYTEIYPEITEDEAGLKT MFKRFSFPGGTASHAAPETPGSIHEGGELGYALSHATGAILDNPNVIAATVIGDGEAETG PLAAGWFSNSFINPVNDGAVLPIIHLNGAKISNPTILSRKSNQELENYFSGLGWEPLFVEG DDPKLMHPLMAKKLDEAIEKIQMIQASARKHKASEATRPVWPMLIVRTPKGWTGPKD WNGEVVEGSFRAHQVPIPVNALNMTHIDKLEAWLTSYHPEELFDKNGKILEEIRALAPK GLKRMAVHPITNGGINPRTLKLSSWEKFATKFETPGQIKGQDMIELGKYFAEIITLNKDN FRIFGPDETKSNRMNAVFNVTKRQWLEKIAPTYDEWMSPEGRVIDSQLSEHQAEGFLEG YVITGRHGVFASYEAFLRVVDSMETQHMKWMKKSLELPWRKDFPSENVIATSTAFQQD HNGYTHQDPGLLGHLADKRPELIREYLPADTNCLLATVIEKALKDRNVINLIVASKQPRE QFYSVEEASELVQKGYKIINWASNVSKNEEPDVVFAAAGVEPNLEALAA1SILNKEFPNL KIRFVNVLDLLKLKSPKHDPRGISDEEFDQIFTKNKPIIFAFHGYEGLLRDIFFDRHNHNLI THGYRENGDITTSFDIRQLSHMDRFHIAKDAAIAALGKDGEMFAKKMDSKLQEHTSYV REYGYDLPEVVNWKWTNLKPIK (SEQ ID NO:31)
S e c u e n c ia de a m in o á c id o s para una e n z im a fo s fo c e to la s a de Streptococcus agalactiae NEM316
MSEFDTKSYLEKLDAWWRAANYISAAQMYLKDNPLLRRELVENDLKVHPIGHWGTVP GQNFIYAHLNRA1NKYDLDMFYIEGPGHGGQVMVSNSYLDGSYTELNPNIEQTEDGFK QLCK1FSFPGG1ASHAAPETPGSIHEGGELGYALSHATGAILDNPDVIAATV1GDGEGETG PLMAGWLSNTFINPVNDGAVLPIFYLNGGKIHNPTIFERKTDEELSQFFEGLGWKPIFAD VVELSEDHAAAHALFAEKLDQAIQEIKTIQSEARQKPAEEAIQAKFPVLVARIPKGWTGP KAWEGTPIEGGFRAHQVPIPVDAHHMEHVDSLLSWLQSYRPEELFDESGKIVDEIAAISP KGDRRMSMNPITNAGIVKAMDTADWKKFALD1NVPGQIMAQDMIEFGKYAADLVDAN PDNFRIFGPDETKSNREQEVFTRTSRQWEGRRKPDYDEAI.SPAGRVIDSQI.SEHQAEGFL EGYVLTGRHGFFASYESFLRVVDSMVTQHFKWLRKSKTHTTWRKNYPALNLIAASTVF QQDHNGYTHQDPGILTHLAEKTPEYIREYLPADTNSLLAVMDKAFKAEDKINLIVTSKH PRPQFYS1AEAEELVAEGYKVIDWASNVSLNQEPDVVFAAAGTEPNLEALAAISILHK.AF PEI.KIRFVNVLDIEKERHPSQDARGESDEEFDKVFTTDKPVIFAFHSYEDMIRDIFFSRHN HNLHTHGYRENGDITTPFDMRVMSELDRFHLAQDAALASLGNEAQAFSDEMNQMVAY HKDYIREHGDDIPEVQNWKWENIK (SEQ ID NO:32)
Secuencia de aminoácidos para una enzima fosfocetolasa de Mycoplasma agalactiae PG2
MKKSHDFDSKEYLNLVDAWWRAANYLSVGQMYLRNNPLLKIPLTSNDVKIYPIGHWG TVPGQNFIYAHLNRIINKYDLNMFFISGPGHGGQVIASNTYLDGSYTELFPHVTKDIKGM THLFKYFSFPGGTASHAAPECPGSIHEGGELGYSLSHAAGAVLDNPDVIAATVIGDGESE TGPLSAGWFINSFINPANDGAVLPILHVNGGKISNPTIWSRRSNEELVSYFTGAGWKPFIV EGNEPEYMHHEMAKALDASVELIKQYQAEARKNGANKAKRPQWPMIVLKSPKGWTG PKEWNHEAIEGSFRAHQVPVPVSAEKMQH1DALENWLRSYRPEELFDENAQLKPEIAAI APKGDRRMGKNPIANGGINPRAINVGDWTKFALDIKQPGKVINQDMVTLGSYLGELSL LNKDNFRVWGPDEHKSNRLYEMFKVTDRQWLDRIDEKYDEFLSSVGRIIDSQLSEHQA EGMLEGYVLTGRHGVFASYESFLRVVDSMLTQHMKWVKKALDIPWRNDYPSLNVIAT SNAFQQDHNGYTHQDPGLIGHLADKRPEL1REYLPADTNTLLATMAKALQDRNV1NLIIS SKQPRHQFFSFEEATELVEKGIKIIDWASNIKPNEEPDLVVAASGTESTIESLATITYLRAH FPELKIRFVNVLDLLKLRHPSIDPRGLSDSEFDSIFTKDKPILFAFHGYEAILRDIFFLRSNH NIITHGYRENGDITTAFDIRLLSEMDRFHMTANVAKKLAPVVGESKANELVKLMEDKIK EHRAYIKEYGTDLPEVKEWEWTPYK (SEQ ID NO:33)
Secuencia de aminoácidos para una enzima fosfocetolasa de Streptococcus gordonii cepa Challis subcepa CH1
MTTDYNSKAYLEKVDAWWRAANYISAAQMYLKDNPLLKRDVVANDLKAHPIGHWG TVPGQNFIYAHLNRTINKYDLDMFYIEGPGHGGQVMVSNSYLDGSYTELNPNIPQNEEG FKHLCKIFSFPGGIASHAAPETPGSIHEGGELGYALSHAAGAILDNPDVIAATVIGDGEGE TGPLMAGWLSNTFINPVNDGAILPIFYLNGGKIUNPTIFERKTDEELTLFFEGLGWKPIFA DVTAISENHEAAHALFAAKLDEAIEEIKKVQAEARKGSAEEATQAIFPVLVARIPKGWT GPKSWEGTPIEGGFRAHQVPIPVDAHHMEHVDALLNWLKSYRPEELFDESGKVLPEIAA IGPKGDRRMAMNPITNAGVIKPMDTADWKKHALKFGTPGEIVAQDMIEFGKYATDLVD ANPDNFRIFGPDETKSNRLQEVFTRTSRQWLGRMRPEYDEALSPAGRVIDSQLSEHQAE GMLEGYVLTGRHGFFASYESFLRVVDSMVTQHFKWLRKCKTHTTWRKNYPALNLIAT STVFQQDHNGYTHQDPGILTHLAEKTPEFIREYLPADTNSLLAVMDKAFKAEDKVNLIV TSKHPRPQFYSAEEAEELVREGYKVIDWASTVSNNEEPDVVFAAAGTEPNLEALAAVSI LHKAFPELKIRFVNVVDILKLRHPSVDARGLSDEEFDQVFTTDKPV1FAFHGYEGMIRDIF FNRHNHNLRVHGYRENGDITTPFDMRVMSELDRFHLAQDAANAALGEDAAVFSAKMD ETVAYHNAYIRENGDDIPEVQNWKWENINK (SEQ ID NO:34)
S e c u e n c ia de a m in o á c id o s para una e n z im a fo s fo c e to la s a de Kingella oralis ATCC 51147
MQNTQFDTPEYLAKVDAWWRAANYISAAQMYLKDNPLLKKPLTANDVKAHPIGHWG TVPGQNFIYAHLNRAINKYDVDMFYIEGPGHGGQVMVSNSYLDHSYTDIYPEITQDEAG LKKLCKIFSFPGG1ASHAAPETPGSIHEGGELGYALSHAFGAVLDNPM1AAAVIGDGEAE TGPLCAGWFGNTFINPVNDGAVEPILYLNGGKIHNPTILARKTDAELTQYFNGMGWEPI FVEVSDPAHSHAIMAQKLDEAVERILAIWQDARSRSANDATMPRWPVLVARIPKGWTG PKTWNGEPIEGGFRAHQVPIPTNSHDMSTADALEAWLRSYRPEELFDDNGRFLDKWREI SPKGAKRMSVHPITNGGVAPKALVMPDWTKHALKiGTPGSQDAQDMIECGRLMADVIT ANPDNFRIFGPDETKSNRENEVFKVTNRQWEGVRDAAYDEWIAPVGRVTDSQESFHQA EGFLEGYVLTGRHGFFASYESFLRVVDSMITQHFKWLRKCKTHAPWRKDYPSLNLIATS TVFQQDHNGYTHQDPGLLTHLAEKKPEFVREYLPADANTLLAVMSEALTSRDRINLIVS SKHLRPQFYSADEAKELVREGYKIIEWASTCHDGEPDVVIAAAGTEPNMEALAAINVLH KHYPEMKIRFINVVDII.KI.RHPSIDPRGI-SDEAFDAEFTRDKPVVFCFHGYENMVRDIFF PRHNRNVRIHGYRENGDITTPFDMRVLSEMDRFHVAKDAAQAVYGEKAADFANKMDE TIQFHRSYIREHGKDIPEVAEWKWQPLAK (SEQ ID NO:35)
Secuencia de aminoácidos para una enzima fosfocetolasa de Mycoplasma fermentans M64
MNKKEFDSKEYLEKVDAWWRAANYLSVGQIYLRNNPLLKHPLTSDDVKVYPIGHWGT ISGQNFAYAHLNRVINKYDLNMFYIEGPGHGGQVMTSNSYLDGSYTELFPHVTQDEAG MQIILFKYFSFPGGTASHAAPETPGSIIIEGGELGYSISHATGAILDNPDVIAATIVGDGEA ETGPLATSWFSNSFINPVNDGAVLPILHLNGGKISNPTILSRKSNEELQQYFRGMGWEPH FVEGDKPEVMHELMAKTLDSVIEEIQSIQTKARKKPADKAKRPVWPVIIVLRTPK.GWTG PKS WN KE AIEG SFR AHQ VPLPIN AENMEH AD ALEKW LRS Y RPEELFDKKG KL V KEIA AI APKGKRRMGMNPITNGGINPKVMKLGDWRKFALHFDRPGSVVAQDMVELGTYFADL VK.RNPENFRIFGPDETKSNRLYNLFK.VTNRQWMERIDSK.LDEALSPVGRIIDSQLSEHQA QGFLEGYVLTGRHGIFASYESFLRVVDSMVTQHMKVVLRKAKEINWRKDYPSLNIMATS TAFQQDHNGYTIIQDPGIIGUMADKRPELIREYLPADTNTLLAVMDKArTERNVINLIVS SKQPRHQFYSVEEAETLVEKGLDIIDWASTCSRNETPDLVVVASGTEPNLEALATISILN KEYPSMKIRFVNVVDLLKLRHPKIDPRGLSDEEFDEIFTKDKPVLFAFHGFEGILRDIFFD RHNHNLIAHGYRENGDITTSFDIRQLSHMDRFHMASDAAAAVFGSSKAKEFMDKMEET IQFHNKYIREVGTDIPEVKNWKWEGLIK (SEQ ID NO:36)
Secuencia de aminoácidos para una enzima fosfocetolasa de Granulicatella adiacens ATCC 49175
MTQFDTPEYLAKVDAWWRAANYISVAQMYLKDNPLLRRPIQKEDVKLHPIGHWGTIA GQNFIYAHLNRAINKYDLDMFYIEGPGHGGQVMVSNSYLDGSYTELYPQITQDEAGFK QLCKIFSFPGGIASHAAPETPGSIHEGGELGYSLSHATGAVLDNPNVIAAAVIGDGEAET GPLAAGWFSNTFINPVNDGAVLPILYLNGGKIHNPTILARRTDEELTQFFNGLGWDPIFV EGTDPEKVHPLMAAKLDEAIEKIQAIQKEARAKSAEEATMPHWPVLVVRTPKGWTGPK EWNHEPIEGGFRAHQVPIPVSGEAMEHVDALVDWLKSYRPEELFDENGKLVEEIAAISP KGPRRMSMNPITNAGVVKPMEITDWTKHAIDTSKPGAIQKQDMIEFGKFAADLVKANP DNFRIFGPDETKSNRLNEVFKATNRQWVGRRDESYDEWISPVGRVIDSQLSEHQAEGFL EGYVLTGRHGFFASYESFLRVVDSMITQHFKWLRKAKTHAPWRKNYPSLNLIATSTVF QQDHNGYTHQDPGLLTHLAEKKPEFVREYLPADTNSLMAVMAEALSSEDKINLIVSSK HPRPQFYSVEEAKELVSEGYKVIDWASTVKEGEEPDVVIAAAGTEPNLEALAGISILHKQ FPELKIRFINVVDILKLRSPKVDPRGLSDEEFDKLFTTDKPVVFCFHGYEGMIRDLFFDRN NHNVHIHGYRENGDm’PFDMRVLSEMDRFHVAKDAAVAVYGEKASEFAAKMDETVE FHHSYIRF.HGEDIPEVVSWQWENVNK (SEQ II) NO:37)
S e c u e n c ia de a m in o á c id o s para una e n z im a fo s fo c e to la s a de Mycoplasma hominis ATCC 23114
MISKTYDDKKYI.FKMDKWFRAANYUj VCQMYFRDNPFFKKPFTSNDIKFYPIGFIWGT VPGQNFIYTHLNRVIKKYDLNMFYIEGPGHGGQVM1SNSYLDGSYSEIYPEISQDEAGLA KMFKRFSFPGGTASHAAPETPGSIHEGGELGYSISHGTGAILDNPDVICAAVVGDGEAET GPLATSWFSNAFINPVNDGALLPILHLNGGKISNPTLLSRKPKEEIK.K.YFEGLGWNP1FVE WSEDKSNI.DMHEEMAKSEDKAIESIKEIQAFARKKPAEEATRPTWPMIVI.RTPKGWTG PKQWNNEAIEGSFRAHQVPIPVSAFKMEKIADLEKWLKSYKPEELFDENGTIIKEIRDLA PEGLKRMAVNPITNGGIDSKPLKLQDWKKYALKIDYPGEIKAQDMAEMAKFAADIMK DNPSSFRVFGPDETKSNRMFALFNVTNRQWLEPVSKKYDEWISPAGRIIDSQLSEHQCE GFLEGYVFTGRHGFFASYFAFFRVVDSMFTQHMKWIKKASEFSWRKTYPSFNIIATSNA FQQDHNGYTHQDPGLLGHLADKRPEIIREYLPADTNSLLAVMNKALTERNVINLIVASK QPREQFFTVEDAEELLEKGYKVVPWASNISENEEPDIVFASSGVEPNIESLAAISLINQEY PHLKIRYVYVLDLLKLRSRKIDPRGISDEEFDKVFTKNKPIIFAFHGFEGLLRDIFFTRSNH NLIAHGYRENGDITTSFDIRQFSEMDRYHIAKDAAEAVYGKDAKAFMNKFDQKLEYHR NYIDEYGYDMPEVVEWKWKNINKEN (SEQ ID NO:38)
Secuencia de aminoácidos para una enzima fosfocetolasa de Mycoplasma crocodyli MP145
MKKTVYDTELYIEKLDAWFRAANYLSVGQMYLRNNPLLRNKITKDDVKVYPIGHWGT IPGONFAYAHLNRVINKYDLNMFYIEGPGHGGQVMTSNSYLDGSYTELFPHVTQDLDG MKHLFKYFSFPGGTASHAAPETPGSIHEGGELGYSLSHATGAILDNPNVIAATIVGDGES ETGPLAAGWFSNSFINPVNDGAVLPILHLNGGKISNPTILCRKSNEELTNYFLGMGWEAI FVEGEDVQKMHKLMATKLDYAIERILSIQKEARKGKAEEATRPLWPMIVLRTPKGWTG PQKWNSDQIVGSFRAHQVPIPVNSENMTHIDALVDWLKSYNVDNLFDKKGKLVPEIAEI APVGDRRMGMNPVTNGGLNPRNLALPNWQDFALNLEKPGAKIAQDMVELGSYFAKV MEMNKDNFRLFGPDETKSNRLFNVFKVTSRQWLEPINPLFDEALSPAGRVIDSQLSEHQ AEGFLEGYVLTGRHGVFASYESFLRVVDSMLTQHMKWLKKANDVSWRNDYPSLNVIA TSTAFQQDHNGYTHQDPGLIGHLADKTPELIRQYLPADTNTLLAVMDKSLTERNVINHII ASKQPREQFYSAKEAAELVEKGLKVIKWASTVEGNDEPDLVVAAAGTEPNLEALAAITI LNKEFPKLKIRFVNVVDLMKLRHPSIDPRGITDKEFDKIFTKDKPVLFAFHGYEGILRDIF FKRNNHNLIAHGYRENGDITTSFDIRQLSHMDRFHMAASAAVAALGKKANAFETKMLE TIDFHTKYIREYGTDIPEVKEWKWNPLVRK (SEQ ID NO:39)
Secuencia de aminoácidos para una enzima fosfocetolasa de Neisseria sp. taxón oral 014 cepa F0314
MSAQYDSADYLNKVDAWWRAANYISVAQMYLKDNPLLMRPIQASDVKAHPIGHWGT IAGQNFIYAHLNRAINKYDLNMFYIEGPGHGGQVMVSNSYLDGSYSEIYPNITQDEAGL KQLCKIFSFPGGIASHAAPETPGSIHEGGELGYALSHAVGAVLDNPDVIAATVIGDGEAE TGPLSAGWFSNVFINPVNDGAVLPILYLNGGKIHNPTILARKSDESLRLYFEGLGWDPIF VEATDYATTHKVMAQKLDEAIEKIK.AIQTKARAGKAEEAVMPKWPVLVARLPKÜWTG PKVWNGEPIEGGFRAHQVPIPASSHDMATVDSLVEWLKSYRPEELFDANGTFKAELREI SPKGDRRMSTNPITNGGINPRPLNTADWKKFALDNSDRGSIMAQDMIEFGKYAAELVK ANPDNFRIFGPDETKSNRMNEVFKVTNRQWLEPIDKAYDEWMSPAGRVIDSQLSEHQA EGFLEGYVLTGRHGFFASYESFLRVVDSMATQHFKWLRKCKTF1APWRKSYPSLNLIAT STVFQQDHNGYTHQDPGMLTHLAEKKPEHREYLPADANSLLAVMSEVLSSKDKVNLI VSSKHPRPQFYSAAEAEELVREGYKVIDWASTDKGGEPDVVIAAAATEPNLEALAAITIL NKQFPELKIRnNVVDILKLRHPKVDPRGLTDEQFDALFTKDKPVIFCFHGYEGMVRDIF FDRHNHNLR1HGYRENGDI1TPFDMRVLSEMDRFHVAKDAALAVYGDKAQDFAKKMD DTLAFHHSYIRENGEDIPFVRNWKWFALK (SEQ ID NO:40)
Secuencia de aminoácidos para una enzima fosfocetolasa de Eremococcus coleocola ACS-139-V-Col8
MTVDYNSKEYLTLVDKWWRAANYLSVGQMFLRDNPLLQEEVTADHVKLNPIGHWGT
ig g q n f l y a h l n r iin k y n v n m f y ie g p g h g g q v m v t n s y l d g s y t e r y p e f t q d ia g MKKLFKTFSFPGGIGSHAAPETPGSMHEGGELGYALSHATGAILDNPDVIAATVVGDGE AETGPEAAGWFSNVFINPVSDGAVEPIEYI/NGGKIANPTIEARKSNEDETKYFEGMGWK PYIVEGTDPEQVHPIMAKVLDEVIEEIQAIQAEARKGKAEDAKMPHWPMILYRTPKGWT GPEEVEGKTIQGSFRAHQVPIPVSGRNMEDIDLLINWLKSYGPEELFTENGELVDELKEF APKGDHRMAMNPLTNGGNPKPLNMPNWKDYALEIGTPGSKDAQDMIEFGGFARDIVK ENPENFRIFGPDETKSNRLNKVFEVTNRQWLEPISEKFDENMSASGRVIDSQLSEIIQNQG FLEAYVLTGRHGFFASYESFFRTVDSMITQHFKWIRKSAKHSWRKPYQSLNLISASTVFQ QDHNGYTHQDPGLLTHIGEKHGEYMRAYLPADTNSLLAVMDKAFRSENVINYVVTSK HPRPQFFTADEAEELVNEGLKVIDWASTVKDNEEPDVVIAAAGTEPNFEAIAA1SYLVK AFPELKIRFVNVVDLFRLRSPEIDPRGLSDDEFDAIFTKDKPVFFAFHSYEGMLKDIFFTR HNHNLYAHGYRENGEITTPFDMRVLNELDRFHLSAHVADVVYGDKARDYVAEMKGK VQEHRDYVEEYGADMPEVEDWKWEDIK (SEQ ID NO:41)
Secuencia de aminoácidos para una enzima fosfocetolasa de Aerococcus urinae ACS-120-V-Col10a
MTDFDSKAYLDKVDAWWRAANYLSVGQMYLRDNPLLDREVTADDIKITPIGHWGTIA GQNFVYAHLNRVINKYDLNMFY1EGPGHGGQVMQANAYLDGTWTEHYPEYPQNKEG MQKFFKYFSFPGGTGSHATAEIPGSIHEGGELGYSLSHATGAILDNPDVIAATVIGDGESE
t g p l a a s w l s n s f in p v t d g a v l p il y l n g g k ia n p t il e r k s n e d l ik y f q g l g w d p m v v e g n d p e k v h p l m a k t l d q a ie k ik s iq g e a r k g s a d e a t m g h w p m il y r t p k g w t g p k a w e g n d ie g s f r a h q v p ip v n a e n m e h v d a l id w l k s y r p e e l f t e e g q l r p e ia e ia p k g d q r m a s n p it d g g id p k p l d l p d w r d y a l d f e t p g e r d a q d m ie m g g y a a g v ie k n PDNFRIFGPDETKSNRENKVFNVTKRQWLEPIKDNYDEWMSPSGRVIDSQLSEHQMEGF LEAYTLTGRHGFFASYEAFIRTVDSMITQHFKWMREASEYKWHKPYQSLNLISSSTAFQ QDHNGYTHQDPGLLTHLAEKKGEFVRAYLPADTNSLLAVMDKALSSENVINYIVTSKH PRPQFFSVEEAEEFVDKGYKVIDWASTVEEGEEPDVVIAASGTEPTVETIATISYLHEAFP ELKIRYVNVVDLYRLRHPNIDPRGLSDEEFDAVFTKDKPVFFGFHSFEGLLKDIFFDRHN HNLYPHGYREEGAITTPFDMRVLNELDRFHFAAHVAEVVYGDKAQDFIDQMNAKVEE HRAYIVEYGTDMPEVKEWKWQPLEK (SEQ ID NO:42)
Secuencia de aminoácidos para una enzima fosfocetolasa de Kingella kngae ATCC 23330
MTNKTQFDTPEYLGKVDAWWRAANYISVAQMYLKDNPLLKTPLVANDVKAHPIGHW GTVPGQNFIYAHLNRAINKYDVDMFY1EGPGHGGQVMVSNSYLDGSYTE1YPDITQDTA GLKKLCKIFSFPGGIASHAAPETPGSIHEGGELGYALSHAFGAVLDNPNVIAAAVIGDGE AETGPLCAGWFGNTFINPVNDGAVLPILYLNGGKIHNPTILARKTDEELKQYFNGMGWE
p if v d v n n v d n y h e im s q k v d e a v e h il s iw q t a r t q k a e d a t m p h w p v l v a r ip k g w TGPKTWHGEPIEGGFRAHQVPIPASSHDMETAGELEKWLRSYRPEELFDDNGCFLDKW RDISPKGAKRMSVHPITNGGINPKAEVMPDWTQHALEIGVPGSQDAQDMVECGREMA DVVTANPNNFRIFGPDETKSNRLNQVFQVTKRQWLGRRDEAYDEWIAPVGRVIDSQLS EHQAEGFLEGYVLTGRHGFFASYESFFRVVDSMITQHFKWLRKCKTHAAWRNDYPSLN LIATSTVFQQDHNGYTHQDPGLLTHLAEKKPEFVREYLPADSNTLMAVMSEALTSRDR1 NEIVSSKHERPQFFNAEEAKEEVREGYKVIDWASTCHDGEPDVVIAAAGTEPNMEAEA AISILHKQFPELKIRFINVVD1LKLRHPSIDPRGLSDEQFDALFTQEKPVVFCFHGYEGMIR DLFFPRANHNVRIHGYRENGDITTPFDMRVLSEMDRFHVAKDAAQAVYGDKASEFAK KMGETVAFHRSYIREHGTDIPEVAEWKWQPLAK (SEQ ID NO:43)
S e c u e n c ia de a m in o á c id o s para una e n z im a fo s fo c e to la s a de Streptococcus criceti HS-6
MNTNFDSSDYLNKVDAWWRAANYISAAQMYLKDNPLLRREVAAEDLKSHPIGHWGT VPGQNFIYAHLLRSINKYDEDMFYIEGPGHGGQVMVSNSYI.DGSYTEI.NPQISQTEEGL KQLCKIFSFPGGIASHAAPETPGSIHEGGELGYALSHATGAVLDNPDVIAATVIGDGESET GPLMAGWLSNTFINPVNDGAVLPIHFLNGGKIHNPTIFERKSDDELKAFFTGLGWKPIFA DVTAFASDHAAAHKLFAAKLDEAIEEIRN1QAKARKGSADEATMPAWPV1VARIPKGW TGPKSWKGTPIEGGWRAUQVPIPVDSHHMEHVDALLDWLKSYQPEELFDAEGHLKSEV AALSPKGNRRMSMNPITNAGVIKPMDTADWKKRAFDIQTPGEIVAQDMIEFGKYAADL VEANPDNFRIFGPDESKSNRLNEVFTKTNRQWMGRRDPSYDEWLSPAGRVIDSQLSEHO AEGFLEGYVLTGRHGFFASYESFLRVVDTMITQHFKWLRKSKTHTTWRKNYPSLNLIAT STVFQQDHNGYTHQDPGVLTHLSEKTPEYIREYLPADTNSLLAVMDKAFKDEDKINLIV TSKHPRPQFYSVEEASELVEKGYKVIDWASTVQANEEPDVVFAAAGTEPNLEALAA1SIL HKTFPSLKIRFVNVVDILKLRHPDLDPRGLSDEEFDKVFTKDKPVIFAFHAYEGMIRDIFF RRI INI INLIIVIIG YRENGDITTPFDMRVMSELDRFI1L AQD A ALTTLGEKAQ AFS AKMDC ■ i
Secuencia de aminoácidos para una enzima fosfocetolasa de Streptococcus criceti HS-6
MTEFDSKDYLAKVDAWWRAANYISVAQMYLKDNPLLRREVSKEDVKVHPIGHWGTIA GQNFIYAHLNRV1NKFDLNMFYIEGPGHGGQVMVSNSYIDGSYTERYPNITQDEDGLKQ LCKIFSFPGGIASHAAPETPGSIHEGGELGYALSHATGAILDNPDVIAATVIGDGEAETGP LNAGWFSNTFINPVNDGAVLPILYLNGGKIFINPTILSRKTDEELTHLFQGLGWEPYFVEG NDPEVIHSQMAETLDKVIEKIKTIQTQARQKPAEEAQQAQWPVLIVRTPKGWTGPKEW NGEPIEGGFRAHQVPIPVEAGHMEHIDALTDWLKSYRPEELFDEKGYVKEEIRVISPKGN RRMSMNPITNAGIVKKLDLADWRKHAIDTSKPGSIMKQDMIEFGKYAADLVKANPDNF RIFGPDETKSNRLNNVFTATNRQWLAPRDKSYDEWISPVGRVIDSQLSEHQAEGFLEGY VLTGRHGFFASYESFLRVVDSMITQHFKWLRKSKTHTDWRKNYPSLNLIATSTVFQQD HNGYTHQDPGLLTHLAEKTPEYVREYLPADSNSLFAVMEYALADEDKVNVIVTSKHPR PQFYSVAEAQELVKEGYKVIDWASNDHDGEPDIVFAAAGTEPNLEVLAGISLLHKAFPE VK.1RFINVVD1LKLRSPKVDPRGLSDEAFNKLFTTDKPIVFAYHGYEGQIRDLFFNRDNH KVYIHGYRENGDITTPFDMRVMSEMDRFHIAKEAAQAVLGDKAQGFAQEMADKLAYH TAYIREHGDDIPEVQNWQWETID (SEQ ID NO:45)
Secuencia de aminoácidos para una enzima fosfocetolasa de Mycoplasma columbinum SF7
MSKTNFDSKKYLDKIHAWWRAANYLSVGQMYLKNNPLLQEPLKDEDIKIYPIGHWGTI
p g q n l iy a h l n r v in k y d l n m f y ie g p g h g g q v m is n s y l d g s y t e l f p e it q d l a g l n KMFKRFSFPGGTASHAAPETPGS1F1EGGELGYALSHATGA1LDNPDVIAATV1GDGEAET GPLMAGWYSSSFINPVNDGTVLPILHINGGKISNPTILARKTDKEIKQLLAGFGWEAIFVE ADVFRPEAIHLSMAKAFDKAIEKIQRIQREARANSANHAKRPIWPALVVRTPKGWTCPH KIDDKVYEGSFRSHQVPLAVSSENTTKKVDLVNWLESYKPRELFNQDGSFKAHYAEIAP KGNKRMAMNP1TNGG1NPKNLDLPNWEQFA1DFDKPGAIKAQDMVSAGTWFADV1KR NPTNFRIFGPDETKSNREFDVEKTTNRQWI.ERVDYDEDENIGPAGRVIDSQESEHQAECi FLEGYVLTGRHGMFASYESFLRVVDSMLTQHMKWVAKAKKVHWRNDYPSLNVIATST AFQQDHNGYTHQDPGILGHLADKKPELIREYLPADSNTLLAVLDKAFKERDVINLIVAS KQPREQWFSPREANILVKNGLKVISWASTCTLEEEPDLVVAAAGTEPTLEALAAISYLNE KFPTEKIRFVNVVDLEKERHPSIDPRGESNYEFDSIFTKDKPIEFAFHGYEAEIRDIFFLRN NHNLHIHGYRENGDITTSFDIRLMSEMDRFHMAQTAAKAVLGYDKAKSFVDKMQDKI DQHNAYIKEHGIDMDEVRYWTWKGLNK (SEQ ID NO:46)
S e c u e n c ia de a m in o á c id o s para una e n z im a fo s fo c e to la s a de Burkholderia phytofirmans PsJN
MAEATAHPTPPQTLDADTLRNMDRYWRACNYLSAGMIYLRDNPLLREPLKPEHIKNRL LGHWGSDPGQSFLLVHLNRLIKKLDLNVIYVAGPGHGAPATLANCYLEGHYSEIYPDRS QDVAGMERFFRQFSFPGGIGSIICTPETPGSIIIEGGELGYSLSIIGYGAAFDNPDLIVAVMI GDGEAETGPLATSWHSNKFLNPIRDGAVLPVLHLNGYKIANPTILARIPREELEALLTGY GHKPYFVEGEDPAVMHQQMAATLEQCIGEIRAIQQHARESNDASRPRWPMIVLRSPKG WTGPKEVDGHKVEGSWRAHQVPVLDPATNSKSLKLVENWLRSYEPETLFDEAGRLVK ELRELAPEGARRISANPHANGGVLCKTLAMPPFRDYAVAVKKPAGSYTSPTEVLGKFLR DVMRNNMTNFRVFGPDETSSNKLTAIYEASEKTWLAQTVPSDADGGELAVDGRVMEM LSEHTLEGWFEGYVLTGRHGLFATYEAFVHVIDSMFNQHAKWLEKAKRDLGWRQPVP SINLLITSLVWRQDUNGmiQDPGFLDVVTNKSPDVVRIYLPPDANCLLSVADHCLRSR DYVNVIVADKQPHLQYLDMDAAVTHCTKGIGIWDWASTDQGVEPDVVMACAGDIPT MEALAAVQILKEQFADLKIRFVNVVDLFRLMPEHAHPHGLSSRDFDSLFTTDKPVIFNFH SYASLVHKLTYNRTNHDNLHVHGYHEKGNINTPLELAIINQVDRFSLAIDVIDRVPRLRG
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Secuencia de aminoácidos para una enzima fosfocetolasa de Lactobacillus buchneri NRRL B-30929
MTVDYDSKEYLELVDKYWRAANYLSVGQLFLRDNPLLKRPLEAKDVKVKPIGHWGTI VSQNLIYAELNRVINKYDLNMFYIEGSGHGGQVMVSNSYLDGSYSDIYPNISQDEKGMA KLFKQFSFPGGVASHAAPETPGSIHEGGELGYSLSHGTGAILDNPDVIAAVEIGDGESET GPLAASWFSDKFINPITDGAVLPIINMNGFKISNPTILSRMSDEDLTSYFKGMGWDPYFV EATADTDHAKVEEEFAKTLDHVIEEIKSIQKNARENETPDNVKLPNWPMIIFRSPKGWT GPKKDLDGNPIEGSFRAHQVPIPVAAGSMEHKDLLNDWLKSYKPEELFDENGTVKPEIR AVAPKGDKRMSVNPITNGGIKPEPLKLPDVRNFEVKFDRGVTQKQDMIEWSNWLEKVA ELNPTSFRGFGPDETKSNRLYSLLDDSKRQWMEDIHEPFDEDLSNHGRVIDSQLSEHQA EGWLEGYVLTGRHGFFATYESFGRVVDSMLTQHFKWLRKASEQYWRKQYPSLNFVDT STVFQQDHNGYTHQDPGMLTHLAEKKPEFIREYLPADANELLAVGDVAFRTYEKINLIV TSKHPRRQWYTMDEAQNLVKNGLGYIDWASTDQGQEPDVVFAAAGSEPNLEALAAISI LNKEFPEMK.IRFINVVDLLKLRSPKVDPRGLSDEEFDNLFTTDKPV1FAFHGFEDLIKD1FF DRHNHNLHVHGYRENGDITTPFDMRVLNQLDRFnLAKEAVQDIPAYTVKGGYFIQRM NDMVDKHNAYIRQEGTDLPEVVDWKWEGLKK (SEQ ID NO:48)
Secuencia de aminoácidos para una enzima fosfocetolasa de Bifidobacterium gallicum DSM 20093
MTSPVIGTPWQKLNRPVSEEAIEGMDKYWRASNYMSIGQIYLRSNPLMKEPFTRDDVK y r l v g h w g t t p g l n f l l a h in r l ia d h q q n t v f im g p g h g g p a g t a q s y l d g t y t e y y PNITKDEEGLQKFFRQFSYPGGIPSHFAPETPGSIHEGGELGYALSHAYGAVMNNPSLFV PCIVGDGEAETGPLATGWQSNKEVNPRTDGIVEPIEHLNGYKIANPTIEARVSDEEEFIDF FRGLGYHPYEFVAGFDNEDHLSIHRRFAELFETIFDEICDIKAAANTDDMTRPFYPMLIFR TPKGWTCPKFIDGKKTEGSWRAHQVPLASARDTEAHFEVLKNWMASYKPEELFDDKG AIKDDVVDFMPKGDLRIGANPNANGGVIREELDLPALENYEVKEVKEFGHGWGQLEAT RKFGEYTRDIIKNNPDSFRIFGPDETASNREQASYFVTNKQWDNGYLSKDLVDEHMAV TGQVTEQLSEHQCEGFLEAYLLTGRHGIWSSYESFVHVIDSMLNQHAKWLEATVRE1P WRKPISSMNLLVSSHVWRODHNGFSHQDPGVTSVLLNKTFNNDHVIGLYFATDANVLL AIAEKCYKSTNMINAIVAGKQPAATWTTLDEARELVAKGAGEFEWASNVKTNDEAEIV LASAGDVPTQELMAAADRLNKLGVKFKVVNVVDLIKLQSAKENDQALSDAEFAELFTE DKPVLFAYHSYAHDVRGLIFDRPNHDNFNVVGYKEQGSTTTPYDMVRVNDIDRYELTA TALRMIDADKYADEIKKLEDFRIEAYQFAVDNGYDIPDYTDWVWPGVKTDLPGAVSAT AATAGDNE (SEQ ID NO:49)
Secuencia de aminoácidos para una enzima fosfocetolasa de Bifidobacterium dentium Bd1
MTSPVIGTPWKKLNAPVSEEAIEGVDKYWRAANYLSIGQIYLRSNPLMKEPFTREDVKH RLVGHWGTTPGLNFLIGHINRLIADHQQNTVIIMGPGHGGPAGTAQSYLDGTYTEYFPNI TKDEAGLQKFFRQFSYPGGIPSHYAPETPGSIHEGGELGYALSHAYGAVMNNPSLFVPAI VGDGEAETGPLATGWQSNKLVNPRTDGIVLP1LHLNGYKIANPTILSRISDEELHEFFHG MGYEPYEFVAGFDNEDIILSniRRFAELFETVFDEICDIKAAAQTDDMTRPFYPMIIFRTP KGWTCPKFIDGKKTEGSWRSHQVPLASARDTEAHFEVLKNWLESYKPEELFDANGAV KPEVTAFMPTGELRIGENPNANGGRIREELNLPALEDYEVKEVAEYGHGWGQLEATRR LGVYTRDIIKNNPDSFRIFGPDETASNRLQAAYDVTNKQWDAGYLSAQVDEHMAVTGQ VTEQLSEFFQVÍEGFLEAYLLTGRFIGIWSSYESFVHVIDSMLNQHAKWLEATVRETPWRK PISSMNLLVSSHVWRQDHNGFSHQDPGVTSVLLNKCFNNDHVIGIYFPVDSNMLLAVAE KCYKSTDMINAIIAGKQPAATWLTLDEARAELEKGAAEVVEWASTAKSNDEAQIVLASA GDVPAQEIMAAADKLDAMGIKFKVVNVVDLVKLQSTKENDEAISDADFADLFTEDKPV LFAYHSYARDVRGLIYDRPNHDNFNVHGYEEQGSTTTPYDMVRVNNIDRYELVAEALR MIDADKYADKIDELEAFRKEAFQFAVDNGYDHPDYTDWVYSGVNTNKQGAVSATAAT AGDNE (SEQ ID NO:50)
Secuencia de aminoácidos para una enzima fosfocetolasa de Bifidobacterium bifidum IPLA 20015
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Secuencia de ácido nucleico que codifica para una enzima fosfocetolasa de Mycobacterium gilvum Spyr1
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S e c u e n c ia de ác id o nu c le ico qu e co d ifica para una e n z im a fo s fo c e to la s a de Shewanella baltica OS185
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Secuencia de ácido nucleico que codifica para una enzima fosfocetolasa de Lactobacillus rhamnosus LMS2-1
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S e c u e n c ia de ác id o nu c le ico qu e co d ifica para una e n z im a fo s fo c e to la s a de Lactobacillus crispatus ST1
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Secuencia de ácido nucleico que codifica para una enzima fosfocetolasa de Leuconostoc citreum KM20
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S e c u e n c ia de ác id o nu c le ico qu e co d ifica para una e n z im a fo s fo c e to la s a de Bradyrhizobium sp. S23321
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Secuencia de ácido nucleico que codifica para una enzima fosfocetolasa de Brucella microti CCM 4915
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S e c u e n c ia de ác id o nu c le ico qu e co d ifica para una e n z im a fo s fo c e to la s a de Lactobacillus salivarius ATCC 11741
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Secuencia de ácido nucleico que codifica para una enzima fosfocetolasa de Rhodococcus imtechensis RKJ300
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S e c u e n c ia de ác id o nu c le ico qu e co d ifica para una e n z im a fo s fo c e to la s a de Burkholderia xenovorans LB400
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Secuencia de ácido nucleico que codifica para una enzima fosfocetolasa de Mycobacterium intracellulare ATCC 13950
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S e c u e n c ia de ác id o nu c le ico qu e co d ifica para una e n z im a fo s fo c e to la s a de Nitrosomonas sp. Is79A3
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Secuencia de ácido nucleico que codifica para una enzima fosfocetolasa de Schizosaccharomyces pombe 972h-
atggccacccagaatgatattccgaatagcacaccggaagatctggcaaaacaggttgaaattgcagaaaaacatccggatccgcctgca atgccgagccgtctgccggatagcctgaaaaccctggaagcaaaaattgataccagcaaaattaccgatgaagaggttgcaaatgtgcatc gttttcagcgtgcatgtgattatctggcagcaagcctgatttttctgagcaatggtctgtataccggtggtgatctggaagagaaagatatcaaa acccgtctgctgggtcattggggcacctgtccgggtctgagcattgtttatagccattgcaatcgcatcatcaacaaatacgatctgaacatgc tgtttgttgttggtcctggtcatggtgcaccggcaattctgagcgcactgttcctggaagatagtctgggtccgttttatccgcgttatcagtttac caaagaaggcctgaataacctgattaacacctttagcctgcctggtggttttccgagccatgttaatgccgaagttccgggtgcaattcatgaa ggtggcgaactgggttatgcactgagcgttagctatggtgcagttctggatcgtccggatctgattgttacctgtgttgtgggtgatggtgaag cagaaaccggtccgaccgcaaccagctggcatgcacataaatttcttgatccggcagaaagcggtgccgttattccggttctggaactgaat ggttacaaaattagcgaacgcaccatttatggttgcatggatgatagcgaactgctgagcctgtttagcggttttggttatgaagttgccattgt gaatgatacaccggatcagaatcgtgttatggcagccaccatggattgggcagttgaacgtattcatgatatccagcatcgtgcacgtgttaa tcgcgaagaaatlaaaccgcgttggccgatgattattctgcgtaccccgaaaggtaaaggttgtccgaaatatctgaatggcaaatttctgga aggcacctttcgtgcacatcaggttccgctgaaactggcacgtaccgataccaatcagcgtaatctgctgaaagattggctgaatagctataa ctgtcaggattttctggatgaacatggtctgccgaccaaaggtattaccgaacatctgcctccgcgtgaaaaacgtatgggtcagcgtcatga aacctataatagttatctgccactgaaagtgccggactggaagaaatatggtgttaaaaaaggtgaaaccaccagtgcgaccagcgtggttg gccagtatctggacgagctgctggttaccaatgatagcaccctgcgcatttttagtccggatgaactggaaagcaataaactggatggtgcc ctgaaacatagctatcgtaccatgcagaccgatccggaactgatggccaaacgtggtcgtgrtaccgaagtgctgagtgaacacctgtgtca gggttttatgcagggttataccctgaccggtcgtaccgccatttttccgtcatatgaagcatttatgaccatcgttgttagcatgctggttcagtat agcaaattcctgaaaatgggtctggaaacgggttggcatggtaaatttggtagtctgaattatgttaccagcagcacctgggcacgtcaaga acataatggttttagccatcagagtccgcgttttattaccaccatgctgagtctgaaaccgggtgttagccgtgtttattttccgcctgatgcaaa ttgttttctggcaaccgttgcacgttgtatgaaaagcgaaaacaccattaatctgatggtcagcagtaaaaatccgcagcctgcatatctgagc gtggaagaagcggaacatcattgtaaagccggtgcaagcgtttggaaatttgcaagcaccgataatggtgaaaatccggatgttgttattgc cggtgttggcaatgaaatcatgtttgaagttgttaaagcagccgaaatgctgcagaacgatatccctgaactgcgtgttcgtgtgattaatgtg accgacctgatggtgctgagcagtctgcatccgcatggtatgaatcctgcagaatttgattcactgtttacgaaagatcgccacgtgcacttta actatcatggttatgttatggatctgaaggcactgctgttcgatcgtattcagggcacccgtgtgaccatggaaggttatcgtgaagaaggtac aaccaccaccccgtttaatatgatgatgtgtaataataccagccgctatcatgttgcccgtatggcactgcagcatgccctgcataatccgacc gttgcggttaattgtaatatgctgtgtgcaaaatatgcctggaaacttgaagagatcgagaactacatcatggaaaacaaagatgatcctccg gaaatttatgccgcaccggtgtttaaaaacaaaaccagtaccctg (SEQ ID NO:64)
S e c u e n c ia de ác id o nu c le ico qu e co d ifica para una e n z im a fo s fo c e to la s a de Lactobacillus buchneri ATCC 11577
atgaccgtggaltacgatageaaagagtatctggatctgctggataaalaetggcgtgcagcaaattatctgagcgttggtcagctgtatctgc gtgataatccgctgctgaaacgtccgetgaaaagtgatgatgttaaaatcaaaecgattggtcattggggcaccattgttagccagaattttat ctatgcacagctgaatcgtgccatcaacaaatatgatctgaatatgttctatattgaaggcagcggtcatggtggtcaggttatggttagcaata gclatctggacggtagctatagcgatatttatccgaaiattagccaggacgaaaaaggcatgcagaaactgttcaaacagtttagctttccgg gtggtgttgcaagccatgcagcaccggaaacaccgggtagcattcatgaaggtggtgaactgggttatagcctgagccatggcaccggtg caattctggataacccggatgttattgcagcagttgaaattggtgatggtgaaagcgaaaccggtccgctggeagcaagctggtttagcgat aaattcattaatccgattaccgatggtgcagtfctgccgatlattaacatgaacggtttcaaaaltagcaalccgaccattctgagccgtatgagt gatgcagatcigacggattatltcaaaggiatgggttgggaagcccattttgltgaagcaaccgcagataccgatcatgcaaaagttgaagcc gaatttgcaaaaaccctggataccgtgattgagaaaattaagagcatccagaaaaacgcacgcgaaaatgaaactccggataatgttaaact gecggtttggccgatgattatctttcgtagcccgaaaggttggacaggtccgaaauaagatctggatggtaacccgattgaaggtagctttcg tgcacatcaggttccgattccggttgatgcaaatgatatggaacatgcagatgaactggttgactggctgaaatcatataaaccggaagaact gtttgatgaaaacggcaccctgaaacctgaactgcgtgcactggcaccgaaaggcgaacagegtatgagcgtgaatccgatcacaaatgg tggtattaaaccagaacctctgaaactgcctaatgtgcgtgattttgaagtgaaatttgataaacgtgggaccgagcagaaacaggatatgatt gagtggtcaaaatggctggatgcagltgcaaaactgaacccgaccacctttcgtggtutggtccggalgaaaccaaaagcaatcgtctgiat tcactgctggacgatggtaaacgtcagtggatggaagatatccatgaaccgtatgatgaggatctggcaaatcatggtcgtgttattgatagc cagctgagcgaacatcaggcagaaggttggciggaaggiialgttclgaccggtcglcatggutttilgcaacciaigaaagctltggicgcg ttgtggatagcatgctgacccagcattttaagtggctgcgtaaagcaagcgaacagtattggcgtaaacagtatccgagcctgaacttigttg ataccagcaccgtttttcagcaggatcataatggttatacccatcaggatccgggtctgctgacacatctggcggaaaaaaagccggaattta ttcglgaatatctgcctgcagatgccaatgaaclgclggcagttggtgatagcgcatttcgtacatatgaaaagattaacclgatcgtgaccag caaacatccgcgtcgccagtggtatagtatggatgaagcacagaarctggtgaaaaatggtctgggeiaratcgattgggcaagcaccgat cagggtcaagaaccggatgtggtttttgcagccgcaggtagceaaccgaatctggaagccciggcagccattagtattctgaataaagaatt cccggaactgaagatccgctttattaacgtggttgatatcctgaagctgaacagccctaaaaaggatccgcgtggtctgtcagatgaagaatt cgataacctgtttaccaccgacaaaccggtgattutgcatggcatggcUlgaggacaigatcaaagacatcttttttgatcgccataaccaca accigtalglgcalggtialcgtgaaaaiggcgaiattaccaccccgutgatatgcgigilcigaacgaaciggatcgttttcalciggcagcg gatgccaitcgtcatattccggcatatgcagttaaaggtggctattttatccagcgcatgaacaacatcgtggataaacataatcgctatattcg
. . • .. . . (SEQ ID NO:65)
Secuencia de ácido nucleico que codifica para una enzima fosfocetolasa de Streptomyces ghanaensis ATCC 14672
atgccggaagcaccggatacccgtaccgttctgagtgatgaagaactgcgtaccctggatgcacattggcgtgcagcaaattatctggcag caggtcagatttatctgctggcaaatccgctgctgacegaaccgctgcgtccggaacacattaaaccgcgtctgctgggtcattggggcac cagtccgggtctgaatctggtttotacccalctgaatcgtgttattgcaggtcgtggtctggatgccctgtgtatttggggtcctggtcatggtg glccgagcgttctggccaatagctggctggaaggtagctatggtgaaacclatccggatgllggtcgtgalgcagccgglatggaacgtctg titcgtcagtitagctilccgggtggtgtgccgagccatgitgcaccggaagttccgggiagcgticalgaaggtggtgaactgggttaiagcc tggcacatgcatatggtgcagcactggatcatccgggactgctggttgcatgcgttattggtgatggigaagcagaaaccggtccgctggc agccagctggcatagcaacaaarttctggatccggttcatgatggcgcagrtctgccgatfctgcatctgaacggctataaaatcgccaafcc gaccgtgctggcacgtctgcctgaagatgaactggaiagcctgctgcgtggitatggtcatgaaccgattcatgttagcggtgatgatccgg cagcagttcatcgtgcaatggcccatgcaatggatactgccctggatcgtattgccgaagttcagcgtgccgcacgtgaagatggtgttacc gaacgtgcacgtacaccggttattgttctgcgcaccccgaaaggttggaccggtcctgcggaagttgatggtaaaccggttgaaggcacct ggcgtgcccatcaggttcctctggcaggcgticgtgataacccggaacatctgcgtcagctggaagcatggctgcgtagctatcgtcctga ggaactgtttgatgatgccggtcgtccggttgcagatgttctggcgtgtctgccagaaggtgatcgtcgtctgggtagcaccccgtatgcaaa tggtggcctgctggtgcgcgaactgccgatgcctgcgctggatgattttgcagttccggttgataaaccgggtacaaccctgcaigaaccta cccgtattctgggtggtctgttagaacgtattatgcgtgataccgcagatcgtcgcgattttcgtctggttggtccggalgaaaccgcaagcaa tcgtctggaagccgtttatgatgcaagcggtaaagcgtggcaggcaggtacactggatgttgatgagcatctggatcgccatggtcgtgtga tggaagttctgagcgaacacctgtgtcagggttggitagaaggttatttactgacaggtcgtcatggcctgtttagctgttatgaagcatttgtg catatcgtggatagcatggttaaccagcatatcaaatggctgaaaaccagccgtgaactgccatggcgtgctccgattgcaagcctgaatta cctgctgacaagccatgtgrggcgtcaggatcaiaatggttttagccatcaggatccgggttttgttgatcatgttctgaataaaagtccggaa glggttcgtgtgiatctgcctccggatgcaaataccctgctgtcagttgccgatcatgcactgcgtagtcgtgattatgttaatgttgttgttgcc ggtaaacagccgtgttttgattggctgagcattgatgaagcacgtgttcattgtgcacglggtgcaggcaUtgggaatgggcaggcaccga aaatggcggtgcaccigatgtggtictggcatglgcgggtgatgitccgacccaagaagiactggcagcggcacagctgttacgtcgtcatc tgccggaactggcagttcgtgttgtgaatgttgtggatattgcccgtctgatgcctcgtgaagaacatccgcatggtatgacagattttgaatat gatggactgttcaccgcagacaaaccggtgatuttgcctatcatggtiatccgtggctgattcaccgtctggcctatcgtcgtaatggicatcc gaatctgcaigucgtggttacaaagaaagcggtacgaccaccaccccgtttgatatggttgttcgtaatgatctggaccgttatcgcctggta atggatgttattgatcgtgttcctggtctggccgttcgcgcagcagccgttcgtcagcgtatggcagatgcccgtacccgtcatcatgcatgg attcgtgaacatggcaccgatttacctgaagttgcagaatggtcttggaatgca (SEQ ID NO:66)
S e c u e n c ia de ác id o nu c le ico qu e co d ifica para una e n z im a fo s fo c e to la s a de Cyanothece sp. PCC 8802
atggttgcâ accggMcgtccg^cctggaacagíicaccgctgagcgcagaagaactgcgtcagaUcaggcatattggcgtgcatgt aattatctggcagtgggtatgatttatctgcgtgataatccgctgctgaaagatccgctgaccgaagatcatgttaaaaatcgtctgctgggtca ttggggtagcagtccgggtctgagctttatctatattcatctgaatcgcctgatcaaaaaatacggcctggatgtgatttatatggcaggtcctg gtcatggtgcaccgggtattctgggtccggtttatctggaaggcacctatagcgaaacctatccggataaaagcgaagatgaagagggcat gaaaaaattcttcaaacagtttagctttccgggtggtattggtagccattgtactccggaaacaccgggttcaattcatgaaggtggtgaactg ggttatagcctgagccatgcatatggtgcagcactggataacccggatctgattgttgcagcagttgttggtgatggtgaagcagaaaccgg tccgctggcaaccgcatggcatagcaataaattcattaatccgattcgtgatggcgcagttctgccgattctgcatctgaacggctataaaatc gcaaatccgaccattctggcacgtattagccatgaggaactggaatacctgtttaaaggttatggctacaaaccgtattttgtcgaaggtagcg atccggaagttatgcatcagaaaatggcagcaacactggaaaccgcaattgccgaaattaaacatattcagcaagaggcacgtaccagcg gtgttgcaaaacgtcctatttggccgatgattgttctgcgtagcccgaaaggttggacaggtccggcaagcgttgatggcaaaaaaacgga agatttttggcgtagccatcaggttccgctgagtggtatgcatggtaatccggcacatattaaagttctggaagattggctgaaaagctatacc cctgaagaactttttgatgaaaacggcaccctgattccggaactgaaagaactggcaccgaccggtcatcatcgtatgagcgccaatccgc atgccaatggtggtctgctgcgtaaagatctgaaaatgccggattttcgtaattatggtgttgaagttgccaaaccgggtacagttgaagtggg taataccgcactgctgggcaattttctgcgggatgttatggccaataatatgaccaattttcgtgtgtttggtccggatgaaaccgccagcaac cgtctgaatgcaatttatgaaatcagcaaaaaagtgtggatgggcgaaattctgccggaagatgcagatggtacagaaatcaccaccgatg gtcgtgttatggaaatgctgagcgaacataccctgcagggctggctggaaggttatctgctgaccggtcgccatggtttttttcatacctatga agcatttgcccatgtggtggatagcatgtttaatcagcatgcaaaatggctggacatctgcaaaaatgaagttccgtggcgtgccagcgttag cagcctgaatattctgctgagcagcaccgtttggcgtcaggatcataatggttttagtcatcaggatcctggttatgttgatctggttaccaataa atcagcggatgttgtgcgtgtttattttcctccggatgcgaattgtctgctgtcagttgcaaatcattgtctgaaatcaaccgattacgtgaacgtt attgttagcgataagcagatccatctgcagtatctgaatatggatcaggccatcaaacattgcaccaaaggtattggcatttgggattgggcaa gcaatgatgattgcggtacggaaccggatcatcctgatgttattatggcaagctgtggtgatgttgcaaccaaagaagcactggcagccacc gccattctgcgcgaagaatttccggatttaaaagtgcgttttatcaacgtggttgacctgttcaaactgcagagtgaaattgaacatcctcatgg tctgagtgatcgcgattttgataaccttttcaccaaagacaaaccgatcatctttaactttcatggttatccgtggctgatccacaaactgacctat cgtcgtaccaatcatcacaatctgcatgttcgtggttataaagagaaaggcaatattaacactccgctggaactggccattaacaatcagattg atcgttttaacctggtgatcgatgttatcaatcgtgttccgaaactgggtagcgcagcagcatatgtttatgaacgtatgaaaaacgccatcatc g ..a..a..c.a..t.c..g..t.g..c.a..t.a..t.g..c..c.t.a..t.g..a..a..c.a..t.g .g .ta .t .tg .a .taagcccgagattaacaactggaaatggcctcat (SEQ ID NO:67)
Secuencia de ácido nucleico que codifica para una enzima fosfocetolasa de Neosartorya fischeri NRRL 181
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S e c u e n c ia de ác id o nu c le ico qu e co d ifica para una e n z im a fo s fo c e to la s a de Enterococcus faecium TX1330
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Secuencia de ácido nucleico que codifica para una enzima fosfocetolasa de Listeria grayi DSM 20601
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S e c u e n c ia de ác id o nu c le ico qu e co d ifica para una e n z im a fo s fo c e to la s a de Enterococcus casseliflavus EC30
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Secuencia de ácido nucleico que codifica para una enzima fosfocetolasa de Mycoplasma alligatoris A21JP2
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S e c u e n c ia de ác id o nu c le ico qu e co d ifica para una e n z im a fo s fo c e to la s a de Carnobacterium sp. 17-4
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Secuencia de ácido nucleico que codifica para una enzima fosfocetolasa de Melissococcus plutonius ATCC 35311
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Secuencia de ácido nucleico que codifica para una enzima fosfocetolasa de Tetragenococcus halophilus NBRC 12172
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Secuencia de ácido nucleico que codifica para una enzima fosfocetolasa de Melissococcus plutonius DAT561
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S e c u e n c ia de ác id o nu c le ico qu e co d ifica para una e n z im a fo s fo c e to la s a de Mycoplasma arthritidis 158L3-1
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Secuencia de ácido nucleico que codifica para una enzima fosfocetolasa de Streptococcus agalactiae NEM316
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Secuencia de ácido nucleico que codifica para una enzima fosfocetolasa de Mycoplasma agalactiae PG2 atgaaaaaaagccatgatrttgatagcaaagaatatctgaatctggttgatgcatggtggcgtgcagcaaattatctgagcgtlggtcagatgt atctgcgtaaiaatccgctgctgaaaattccgctgaccagcaaigatgtiaaaatctatccgattggtcattggggcaccgttccgggtcagaa ttttatctatgcacatctgaaccgcattatcaacaaatacgatctgaatatgttttttatcagcggtcctggtcatggtggtcaggttattgcaagc aatacctatctggatgglagctataccgaactgtttccgcatgttaccaaagatattaaaggtatgacccacctgUcaaatactttagctilccg ggtggcaccgcaagccatgcagcaccggaatgtccgggtagcattcatgaaggiggtgaactgggttatagcctgagtcatseagccggt gcagttctggataatccggatgttattgccgcaaccgttattggtgatggtgaaagcgaaaccggtccgctgagcgeaggttggtttattaac agetttatcaatccggeaaatgatggtgccgttctgccgattctgcatgttaatggtegtaaaattagcaacecgaccatttggagccgtcgta gcantgaagaactggttagctatftlaccggtgccggtrggaaaccgtttattgttgaaggtaatgagccggaatatatgcatcatganatggc aaaagcactggatgcaagcg»gaactgattaaacaglatcaggccgaagcacglaaaaatggtgcaaataaagcaaaacgtccgcagtg gccgatgattgttctgaaaagcccgaaaggttggacaggtccgaaagaatggaatcatgaagcaattgaaggttcctttcgtgcacalcagg ticcggttccagtiagcgcagaaaaaatgcagcatattgatgcactggaaaattggctgcgtagciaicgtccggaagaactttttgaigaaaa tgcccagctgaaaccggaaattgcagcaattgcaccgaaaggcgatcgtcgtatgggtaaaaacccgattgcaaatggtggcattaatccg cgtgcaattaatgrtggtgattggaccaaatttgccctggatatcaaacagcctggcaaagttattaatcaggatatggttaccctgggcagct atctgggcgaactgagcctgctgaataaagataattttcgtgmggggtccggatgaacataaaagcaatcgtcigtatgagatgttcaaagt taccgatcgtcagtggctggatcgtatcgatgaaaaatatgatgaatttctgagcagcgtsggtcgcattattgatagccagctgagcgaaca tcaggcagaaggtatgctggaaggttatgttctgaccggtcgccatggtgtttttgcaagctutgaaagctttctgcgtgttgtggatagcatgc tgacccaacaiatgaagtgggtlaaaaaagcgctggacattccgtggcgtaatgatiatccgagcctgaatgtgattgcaaccagiaatgcat ttcagcagpatcataatggttatacccatcaggatcctggtctgattggccatctggcagataaacgtccagaactgatccgtgaatatttacc ggcagataccaataccctgctggcaaccatggccaaagccctgcaggatcgtaacgtgattaatctgattatcagcagtaaacagccacgc catcagttttttagiattgaagaagcaaccgagctggtcgaaaaaggcattaaaatcattgattgggccagcaacattaagccgaacgaaga uceggatclggtggUgcagceagcggtaeagaaagcaccaltgaaagcctggceaceaUacetaeclgcgtgcccutiltccggauctg aaaatccgttttgttaatgtgctggatctgctgaagctgcgtcatccgagtattgatcctcgtggtctgagcgatagcgaatttgatagtatcttc acgaaagacaaaccgatcctgtttgcctttcatggttatgaagccattctgcgcgatatctttttcctgcgttcaaaccataacattatcacccat ggctatcgtgaaaatggcgalaUaccaccgcatttgatatícgtctgctgagtgaaatggatcgctttcatatgaccgcaaatgttgcaaaaaa actggcaccggttgttggcgaaagcaaagcaaatgaactggtgaaactgatggaagataaaatcaaagaacaccgtgcctatatcaaaga gtatggcaccgatctgccggaagttaaagaatgggaatggaccccgtataaa (SEQ ID NO:79)
Secuencia de ácido nucleico que codifica para una enzima fosfocetolasa de Streptococcus gordonii cepa Challis subcepa CH1
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S e c u e n c ia de ác id o nu c le ico qu e co d ifica para una e n z im a fo s fo c e to la s a de Kingella oralis ATCC 51147
atgcagaacacccagtilgacacaccggyatatclggcaaaagttgutgcatggtggcglgcagcaaactatatlagcgcugcacagatgt atctgaaagataatccgctgctgaaaaaaccgctgaccgcaaatgatgttaaagcacatccgattggtcattggggcaccgttccgggtcag aattttatctatgcacatctgaatcgtgccatcaacaaatatgatgtggacatgttttatatcgaaggtcctggtcatggtggtcaggttatggtta gcaatagctatctggatcatagctataccgatatctatccggaaattacccaggatgaagcaggtctgaaaaagctgtgtaaaatctttagcttt ccgggtggtaugcaagccatgcagcaccggaaacaccgggtagcattcatgaaggtggtgaactgggttatgcactgagccaigcctttg gtgcagttctggataaccceaacattattgcagcagcagttattggtgatggtgaagcagaaaccggtccgctgtgtgcaggttggtttggta atacctttattaacccggttaatgatggtgccgtgctgccgattctgtacctgaatggtggtaaaattcataatccgaccattctggcacgtaaa accgatgccgaaclgacccagtattttaacggtatgggtlgggaaccgatttttgttgaagttagcgalccggcacatagccatgcgattatgg cacagaaactggatgaggcagttgaacgtattctggccatttggcaggatgcacgtagccgtagcgccaatgatgcaaccatgcctcgtlg gcclgttctggttgcccgtattccgaaaggttggacaggtccgaaaacctggaatggcgaaccgatcgaaggcggttttcgtgcacatcag gttccgattccgaccaalagtcatgatatgagcaccgcagatgcactggaagcatggclgcgtagctatcgtccggaagaactgtttgatgat aatggtcgtttcctggataaatggcgtgaaattagcccgaaaggcgcaaaacgtatgagcgttcatccgatcaccaatggcggtgttgcacc gaaagcactggttatgccggattggaccaaacatgccctgaaaattggcacccctggtagccaggatgcccaggatatgattgaatgtggt cgtctgatggcagatgttaUaccgccaatccggataactttcglatltttgglccggatgaaaccaaaagcaatcgtctgaatgaagtgUcaa agigaccaatcgtcagtggctgggtgttcgtgatgcagcctatgatgaatggattgcaccggttggtcgtgttattgatagccagclgagcga acaicaggcagaaggttttctggaaggttatgitctgaccggtcgtcatgglttttiigcaagctatgaaagctttctgcgtgügtggaiagcat gattacacagcactttaagtggctgcgcaaatgcaaaacccatgcaccgtggcgtaaagattatccgagcctgaatctgattgcaaccagea ccgttlttcagcaggatcalaatggttalacccutcaggatccgggtctgctgacccatctggcagaaaaaaaacctgaatttgtgcgcgaat atttaccggcagalgccaataccctgctggcagttatgagcgaagcactgaccagccgtgatcgtattaacctgattgttagcagtaaacatc tgcgtccgcagitttatagcgcagatgaagccaaagaactggticgtgaaggctataaaatcaitgaatgggcaagcaectgicatgacggt gaaccggatgttgtgatcgcagcggcaggcaccgaaccgaatatggaagccctggcagcaattaatgttctgcacaaacattacccggaa atgaaaatccgctttatcaacgtggtggatattctgaaactgcgtcatccgagcattgatccgcgtggtctgagtgatgaagcgtttgatgccc tgutacccgtgataaaccggttgutittgctttcatggctatgagaatatggigcgcgatatctttttlccgcgtcataatcgtaatglgcgcatcc atggliaicgtgaaaatgglgalatiaccaccccgiugalalgcgtgttctgtcagaaatggaicgttltcatgttgcaaaagatgccgcacag gcagtttatggtgagaaagcagcagattttgccaacaaaatggacgaaaccattcagtttcatcgtagctacaitcgcgaacatggtaaagat . ■ ■ ■ ' ■ ■ ■ ■ ■ .. '•'I !l > Ni I-Sl
Secuencia de ácido nucleico que codifica para una enzima fosfocetolasa de Mycoplasma fermentans M64
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S e c u e n c ia de ác id o nu c le ico qu e co d ifica para una e n z im a fo s fo c e to la s a de Granulicatella adiacens ATCC 49175
atgacccagtttgacacaccggaatatctggcaaaagttgatgcatggtggcgtgcagcaaactatattagcgttgcacagatgtatctgaaa gataatccgctgctgcgtcgtccgattcagaaagaagatgttaaactgcatccgattggtcattggggcaccattgcaggtcagaattttatct atgcacatctgaatcgtgccatcaacaaatatgatctggacatgttttatatcgaaggtccgggtcatggtggtcaggttatggttagcaatagc tatctggatggtagctataccgaactgtatccgcagattacccaggatgaagcaggttttaaacagctgtgcaaaatctttagctttccgggtg gtattgcaagccatgcagcaccggaaacaccgggtagcattcatgaaggtggtgaactgggttatagcctgagccatgccaccggtgcag ttctggataacccgaatgttattgcagcagcagttattggtgatggtgaagcagaaaccggtccgctggcagcaggttggtttagtaatacctt tattaacccggttaatgatggtgccgttctgccgattctgtacctgaatggcggtaaaattcataatccgaccattctggcacgtcgtaccgatg aagaactgacacagttttttaacggtctgggttgggatccgatttttgttgaaggcaccgatccggaaaaagttcatccgctgatggcagcaa aactggatgaggcaattgaaaaaattcaggccatccagaaagaggcacgcgcaaaatcagccgaagaggcaaccatgccgcattggcct gttctggttgttcgtaccccgaaaggttggacaggtccgaaagaatggaatcatgaaccgattgaaggcggttttcgtgcacatcaggttccg attccggttagcggtgaagccatggaacatgttgatgccctggttgattggctgaaaagctatcgtccggaagaactttttgatgaaaatggc aaactggtggaagaaattgcagccattagccctaaaggtccgcgtcgtatgagtatgaatccgattaccaatgccggtgttgttaaaccgatg gaaattaccgattggaccaaacatgcaatcgataccagcaaaccgggtgcaattcaaaaacaggatatgatcgaattcggcaaatttgcag ccgatctggttaaagcaaatccggataattttcgcattttcggtccggatgaaaccaaaagtaatcgtctgaacgaagtgtttaaagccaccaa tcgtcagtgggttggtcgtcgtgatgaaagctatgatgaatggattagtccggtgggtcgtgttattgatagccagctgagcgaacatcaggc agaaggttttctggaaggttatgttctgaccggtcgtcatggtttttttgccagctatgaaagttttctgcgtgttgtggatagcatgattacacag cactttaaatggctgcgtaaagccaaaacccatgcaccgtggcgtaaaaactatccgagcctgaatctgattgcaaccagcaccgtttttcag caggatcataatggttatacccatcaggatccgggtctgctgacccatctggcagaaaaaaaaccggaatttgtgcgtgaatatttaccggca gataccaatagtctgatggccgttatggcagaagcactgagcagcgaagataaaatcaacctgattgtgagcagtaaacatccgcgtccgc agttttatagcgttgaagaagcaaaagaactggtcagcgaaggctataaagtgattgattgggcaagcaccgtgaaagaaggtgaagaac cggacgttgtgatcgcagcagccggtacagaaccgaatctggaagccctggcaggtattagcattctgcacaaacagtttccggaactgaa aatccgttttatcaacgtggtggatattctgaaactgcgttcaccgaaagtggatccgcgtggtctgagcgacgaagaatttgataaactgttta ccaccgataaaccggtggtgttttgttttcatggttatgaaggtatgatccgcgacctgttttttgatcgcaataaccataacgtgcatatccatg gctatcgcgaaaatggtgatattaccaccccgtttgatatgcgtgttctgagtgaaatggatcgctttcatgttgcaaaagatgcagccgttgca gtgtatggtgaaaaagcaagcgaatttgccgctaaaatggacgaaaccgttgaatttcatcacagctatattcgtgaacatggtgaggatattc cggaagttgttagctggcagtgggaaaatgtgaacaaa (SEQ ID NO:83)
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Secuencia de ácido nucleico que codifica para una enzima fosfocetolasa de Mycoplasma hominis ATCC 23114
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S e c u e n c ia de ác id o nu c le ico qu e co d ifica para una e n z im a fo s fo c e to la s a de Mycoplasma crocodyli MP145
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Secuencia de ácido nucleico que codifica para una enzima fosfocetolasa de Neisseria sp. taxón oral 014 cepa F0314
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Secuencia de ácido nucleico que codifica para una enzima fosfocetolasa de Eremococcus coleocola ACS-139-V-Col8
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• M-(.) 11 > M >:S- :
Secuencia de ácido nucleico que codifica para una enzima fosfocetolasa de Aerococcus urinae ACS-120-V-Col10a
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S e c u e n c ia de ác id o nu c le ico qu e co d ifica para una e n z im a fo s fo c e to la s a de Kinsella kingae ATCC 23330
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Secuencia de ácido nucleico que codifica para una enzima fosfocetolasa de Streptococcus criceti HS-6
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S e c u e n c ia de ác id o nu c le ico qu e co d ifica para una e n z im a fo s fo c e to la s a de Streptococcus criceti HS-6
atgaccgagttcgacagcaaagattatctggcaaaagttgatgcatggtggcgtgcagcaaactatattagcgttgcacagatgtatctgaaa gataatccgctgctgcgtcgtgaagttagcaaagaagatgttaaagttcatccgattggtcattggggcaccattgcaggtcagaattttatcta tgcacatctgaatcgcgtgatcaacaaattcgatctgaacatgttttatatcgaaggtccgggtcatggtggtcaggttatggttagcaatagct atattgatggcagctataccgaacgctatccgaatattacccaggatgaagatggtctgaaacagctgtgtaaaatctttagctttccgggtgg tattgcaagccatgcagcaccggaaacaccgggtagcattcatgaaggtggtgaactgggttatgcactgagccatgccaccggtgcaatt ctggataacccggatgttattgcagcaaccgttattggtgatggtgaagcagaaaccggtccgctgaatgcaggttggtttagtaataccttta ttaacccggttaatgatggtgcagttctgccgattctgtacctgaatggcggtaaaattcataatccgaccattctgagccgtaaaaccgatga agaactgacccacctgtttcagggtctgggttgggaaccgtattttgttgaaggtaatgatccggaagttatccatagccagatggccgaaac cctggataaagttatcgaaaaaatcaagaccattcagacccaggcacgtcagaaacctgcagaagaggcacagcaggcacagtggcctg ttctgattgttcgtaccccgaaaggttggacaggtccgaaagaatggaatggtgaaccgattgaaggcggttttcgtgcacatcaggttccga ttccggttgaagcaggtcatatggaacatatcgatgccctgaccgattggctgaaaagctatcgtccggaagaactttttgatgagaaaggct atgtgaaagaagagattcgcgttatttcaccgaaaggcaatcgtcgtatgagcatgaatccgattaccaatgccggtattgtgaaaaaactgg atctggcagattggcgtaaacatgcaattgataccagcaaaccgggttccattatgaaacaggatatgalcgaattcggcaaatatgcagca gatctggttaaagcaaatccggataactttcgtattttcggtccggatgaaaccaaaagcaatcgcctgaataatgtttttaccgcaaccaatcg tcagtggctggcaccgcgtgataaaagttatgatgaatggattagtccggtgggtcgtgttattgatagtcagctgagcgaacatcaggcag aaggttttctggaaggttatgttctgaccggtcgtcatggtttttttgcaagctatgaaagctttctgcgtgttgtggatagcatgattacacagca ctttaaatggctgcgtaaaagcaaaacccatacggattggcgcaaaaactatccgagcctgaatctgattgcaaccagcaccgtttttcagca ggatcataatggttatacccatcaggatccgggtctgctgacccatctggcggaaaaaaccccagaatatgttcgtgaatatctgcctgcaga ttccaatagcctgtttgcagttatggaatatgccctggcagacgaagataaagtgaatgtgattgtgaccagtaaacatccgcgtccgcagttt tatagcgtggcagaagcacaagaactggtaaaagaaggctacaaagtaattgattgggccagcaatgatcatgatggcgaaccggatattg tttttgcagccgcaggcaccgaaccgaatctggaagttctggcaggtattagcctgctgcacaaagcatttccagaagtgaaaattcgctttat caacgtggtggatattctgaaactgcgcagcccgaaagtggatccgcgtggtctgagtgatgaagcatttaacaaactgttcaccaccgata aaccgatcgtttttgcctatcatggttatgaaggtcagattcgtgacctgttttttaaccgcgataaccacaaagtgtatatccatggctatcgcg aaaatggtgatattaccaccccgtttgatatgcgtgttatgagcgaaatggatcgctttcatattgcaaaagaagcagcacaggccgttctgg gtgataaagcacagggttttgcccaagaaatggcagataaactggcatatcataccgcctatattcgtgaacatggtgatgatatcccggaa gtgcagaattggcagtgggaaaccattgat (SEQ ID NO:91)
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Secuencia de ácido nucleico que codifica para una enzima fosfocetolasa de Mvcoplasma columbinum SF7
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S e c u e n c ia de a m in o á c id o s de P K L de Enterococcus gallinarum
METTFDTQF.YFDKMNAWWRAANYIJ5VGQIYLKDNPLLRRPIKE1KDLKVNPIGHWGTIA GQNFIYTHLNRVINKYDLNMFYIEGPGllGGQVMVSNAYI.DGSYTEIYPnVTQDEAGMQ HLFK1FSFPGGIASHAAPETPGS1HEGGELGYSIAHGTGAVKDNPDVIAAVVVGDGEAET GPLAGSWFSNTFINPVNDGAVLPILHLNGAKISNPTILARKSDEDLTKYFEGMGWTPYFV
e g d d p a t v iip q m a r a l d r a v e q ik a iq t k a r q g k a d e a v m p h w p v u v r t p k g w t g p KIWEGEPII.GGIRAIIQV pipv N AIKJ MI: H V O ALIOWLXS YKPEELPDESdUKAElQELAP KGQQRMAMNPITNGGmPQPLKITDWRQHAiniGVK>STTAQDMMFFGKFARDLIVENP
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Secuencia de aminoácidos de PKL de Clostridium acetobutylicum codificada por secuencia con codones optimizados
MQSIIGKHKDEGKITPEYLKK1DAYWRAANFISVGQLYLLDNPLLREPLKPEHLKRKVV GHWGT1PGQNF1YAHLNRV1KKYDLDM1YVSGPGHGGQVMVSNSYLDGTYSEVYPNVS RDLNGLKKLCKQFSFPGGISSHMAPETPGSINEGGELGYSLAHSFGAVFDNPDL1TACVV GDGEAETGPLATSWQANKFLNPVTDGAVLPILHLNGYKISNPTVLSRIPKDELEKFFEGN GWKPYFVEGEDPETMHKLMAETLDIVTEEILNIQKNARENNDCSRPKWPMIVLRTPKG WTGPKFVDGVPNEGSFRAHQVPLAVDRYHTENLDQLEEWLKSYKPEELFDENYRLIPE
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Secuencia de ácido nucleico de mvaE de L. grayi
ATGGTT A A AG AC ATTGT A AT A ATTG ATGCCCTCCGT ACTCCC ATCGGT A AGT ACCGC GGTCAGCTCTCAAAGATGACGGCGGTGGAATTGGGAACCGCAGTTACAAAGGCTCT GTTCG AG A AG A ACO ACC AGGTC A A AG ACC ATGT AG A AC A AGTC ATTTTTGGC A ACO TTTTACAGGCAGGGAACGGCCAGAATCCCGCCCGTCAGATCGCCCTTAATTCTGGCC TGTCCGCAGAGATACCGGCTTCGACTATTAACCAGGTGTGTGGTTCTGGCCTGAAAG CA AT A AGC ATGGCGCGCC A AC AG ATCCT ACTCGG AG A AGCGG A AGT A AT AGT AGC A GGAGGTATCGAATCCATGACGAATGCGCCGAGTATTACATATTATAATAAAGAAGA AGACACCCTCTCAAAGCCTGTTCCTACGATGACCTTCGATGGTCTGACCGACGCGTT TAGCGGAAAGATTATGGGTTTAACAGCCGAAAATGTTGCCGAACAGTACGGCGTAT CACGTGAGGCCCAGGACGCCTTTGCGTATGGATCGCAGATGAAAGCAGCAAAGGCC CAAGAACAGGGCATTTTCGCAGCTGAAATACTGCCTCTTGAAATAGGGGACGAAGT TATTACTCAGGACGAGGGGGTTCGTCAAGAGACCACCCTCGAAAAATTAAGTCTGC TTCGG ACC ATTTTT A A AG A AG ATGGT ACTGTT AC AGCGGGC A ACGCCTC A ACG ATC AATGATGGCGCCTCAGCCGTGATCATTGCATCAAAGGAGTTTGCTGAGACAAACCA GATTCCCT ACCTTGCGATCGT AC ATG AT ATT AC AG AG AT AGGC ATTG ATCC ATC A AT AATGGGCATTGCTCCCGTGAGTGCGATCAATAAACTGATCGATCGTAACCAAATTA GCATGGAAGAAATCGATCTCTTTGAAATTAATGAGGCATTTGCAGCATCCTCGGTGG TAGTTCAAAAAGAGTTAAGCATTCCCGATGAAAAGATCAATATTGGCGGTTCCGGT ATTGC ACT AGGCC ATCCTCTTGGCGCC AC AGG AGCGCGC ATTGT A ACCACCCT AGCG CACCAGTTGAAACGTACACACGGACGCTATGGTATTGCCTCCCTGTGCATTGGCGGT GGCCTTGGCCTAGCAATATTAATAGAAGTGCCTCAGGAAGATCAGCCGGTTAAAAA ATTTTATCAATTGGCCCGTGAGGACCGTCTGGCTAGACTTCAGGAGCAAGCCGTGAT CAGCCCAGCTACAAAACATGTACTGGCAGAAATGACACTTCCTGAAGATATTGCCG ACAATCTGATCGAAAATCAAATATCTGAAATGGAAATCCCTCTTGGTGTGGCTTTGA ATCTG AGGGTC A ATG AT A AG AGTT AT ACC ATCCC ACT AGC AACTGAGGAACCGAGT GTAATCGCTGCCTGTAATAATGGTGCAAAAATGGCAAACCACCTGGGCGG'ITTTCA GTCAGAATTAAAAGATGGTTTCCTGCGTGGGCAAATTGTACTTATGAACGTCAAAG AACCCGCAACTATCGAGCATACGATCACGGCAGAGAAAGCGGCAATTTTTCGTGCC GCAGCGCAGTCACATCCATCGATTGTGAAACGAGGTGGGGGTCTAAAAGAGATAGT AGTGCGT ACGTTCG ATG ATG ATCCG ACGTTCCTGTCT ATTG ATCTG AT AGTTG AT AC TA A AGACGCA ATGGGCGCT AACATCATT AACACCATTCTCGAGGGTGT AGCCGGCT TTCTGAGGGAAATCCTTACCGAAGAAATTCTGTTCTCTATTTTATCTAATTACGCAA CCGAATCAATTGTGACCGCCAGCTGTCGCATACCTTACGAAGCACTGAGTAAAAAA GGTGATGGTAAACGAATCGCTGAAAAAGTGGCTGCTGCATCTAAATTTGCCCAGTT AG ATCCTTATCG AGCTGC A ACCC AC A AC A A AGGT ATT ATG A ATGGT ATTG AGGCCG TCGTTTTGGCCTCAGGAAATGACACACGGGCGGTCGCGGCAGCCGCACATGCGTAT GCTTCACGCGATCAGCACTATCGGGGCTTAAGCCAGTGGCAGGTTGCAGAAGGCGC GTTACACGGGGAGATCAGTCTACCACTTGCACTCGGCAGCGTTGGCGGTGCAATTG AGGTCTTGCCT A A AGCG A AGGCGGC ATTCG A A ATC ATGGGG ATC AC AC> AGGCG A AG GAGCTGGCAGAAGTCACAGCTGCGGTAGGGCTGGCGCAAAACCTGGCGGCGTTAAG AGCGCTTGTTAGTGAAGGAATACAGCAAGGTCACATGTCGCTCCAGGCTCGCTCTCT TGCATTATCGGTAGGTGCTACAGGCAAGGAAGTTGAAATCCTGGCCGAAAAATTAC AGGGCTCTCGTATG A ATC AGGCG A ACGCTC AG ACC AT ACTCGC AG AG ATC AG ATCG CAAAAAGTTGAATTGTGA (SEQ ID NO:95)
Secuencia de ácido nucleico de mvaE de E. faecium
ATGAAAGAAGTGGTTATGATTGATGCGGCTCGCACACCCATTGGGAAATACAGAGCi TAGTCTTAGTCCTTTTACAGCGGTGGAGCTGGGGACACTGGTCACGAAAGGGCTGCT GGATAAAACAAAGCTTAAGAAAGACAAGATAGACCAAGTGATATTCGGCAATGTG CTTCAGGCAGGAAACGGACAAAACGTTGCAAGACAAATAGCCCTGAACAGTGGCTT ACCAGTTGACGTGCCGGCGATGACTATTAACGAAC.TTTGCGGGTCCGGAATGAAAG GGGGGTACGGAGTCAATGTCACAAGCACCCATGCTGAAACCTTACCAGTCAGAGAC C A ACG A AT ACGG AGAGCCG AT ATC ATC A ATGGTT A ATG ACGGGCTG ACGG ATGCGT TTTCCAATGCTCACATGGGTCTTACTGCCGAAAAGGTGGCGACCCAGTTTTCAGTGT CGCGCGAGGAACAAGACCGGTACGCATTGTCCAGCCAATTGAAAGCAGCGCACGCG GTTGAAGCCGGGGTGTTCTCAGAAGAGATTATTCCGGTTAAGATTAGCGACGAGGA TGTCTTGAGTGAAGACGAGGCAGTAAGAGGCAACAGCACTTTGGAAAAACTGGGCA CCTTGCGGACGGTGTTTTCTGAAGAGGGCACGGTTACCGCTGGCAATGCTTCACCGC TGAATGACGGCGCTAGTGTCGTGATTCTTGCATCAAAAGAATACGCGGAAAACAAT AATCTGCCTTACCTGGCGACGATAAAGGAGGTTGCGGAAGTTGGTATCGATCCTTCT ATCATGGGTATTGCCCCAATAAAGGCCATTCAAAAGTTAACAGATCGGTCGGGCAT GAACCTGTCCACGATTGATCTGTTCGAAATTAATGAAGCATTCGCGGCATCTAGCAT TGTTGTTTCTCAAGAGCTGCAATTGGACGAAGAAAAAGTGAATATCTATGGCGGGG CG AT AGCTTT AGGCC ATCC A ATCGGCGC A AGCGG AGCCCGG AT ACTG AC A ACCTT A GC AT ACGGCCTCCTGCGTG AGC A A A AGCGTT ATGGT ATTGCGTC ATT ATGT ATCGGC GGTGGTCTTGGTCTGGCCGTGCTGTTAGAAGCTAATATGGAGCAGACCCACAAAGA CGTTCAGAAGAAAAAGTTTTACCAGCTTACCCCCTCCGAGCGGAGATCGCAGCTTAT CGAGAAGAACGTTCTGACTCAAGAAACGGCACTTATTTTCCAGGAGCAGACGTTGT CCGAAGAACTGTCCGATCACATGATTGAGAATCAGGTCTCCGAAGTGGAAATTCCA ATGGG A ATTGC ACA A A ATTTTCAG ATT A ATGGC A AG A A A A A ATGG ATTCCT ATGGC GACTGAAGAACCTTCAGTAATAGCGGCAGCATCGAACGGCGCCAAAATCTGCGGGA ACATTTGCGCGGAAACGCCTCAGCGGCTTATGCGCGGGCAGATTGTCCTGTCTGGCA AATCAGAATATCAAGCCGTGATAAATGCCGTGAATCATCGCAAAGAAGAACTGATT CTTTGCGCAAACGAGTCGTACCCGAGTATTGTTAAACGCGGGGC.AGGTGTTCAGGA T ATTTCT ACGCGGG AGTTT ATGGGTTCTTTTCACGCGT ATTT ATCA ATCG ACTTTCTG GTGGACGTCAAGGACGCAATGGGGGCAAACATGATCAACTCTATTCTCGAAAGCGT TGCAAATAAACTGCGTGAATGGTTCCCGGAAGAGGAAATACTGTTCTCCATCCTGTC A A ACTTCGCT ACGG AGTCCCTGGC ATCTGC ATGTTGCCi AG ATTCCTTTTG A A AG ACT TGGTCGTAACAAAGAAATTGGTGAACAGATCGCCAAGAAAATTCAACAGGCAGGG GAATATGCTAAGCTTGACCCTTACCGCGCGGCAACCCATAACAAGGGGATTATGAA CGGTATCGAAGCCGTCGTTGCCGCAACGGGAAACGACACACGGGCTGTTTCCGCTT CT ATTC ACGC AT ACGCCGCCCGT A ATGGCTTGT ACC A AGGTTTA ACGG ATTGGC AG A TCAAGGGCGATAAACTGGTTGGTAAATTAACAGTCCCACTGGCTGTGGCGACTGTC GGTGGCGCGTCGAACATATTACCAAAAGCCAAAGCTTCCCTCGCCATGCTGGATATT GATTCCGCAAAAGAACTGGCCCAAGTGATCGCCGCGGTAGGTTTAGCACAGAATCT GGCGGCGTTACGTGCATTAGTGACAGAAGGCATTCAGAAAGGACACATGGGCTTGC AAGCACGTTCTTTAGCGATTTCGATAGGTGCCATCGGTGAGGAGATAGAGCAAGTC GCGAAAAAACTGCGTGAAGCTGAAAAAATGAATCAGCAAACGGCAATACAGATTTT AGAAAAAATTCGCGAGAAATGA (SEQ ID NO:96)
Secuencia de ácido nucleico de mvaE de E. gallinarum
ATGGAAGAAGTGGTAATTATAGATGCACGTCGGACTCCGATTGGTAAATATCACGG GTCGTTGAAGAAGTTTTCAGCGGTGGCGCTGGGGACGGCCGTGGCTAAAGACATGT TCGAACGCAACCAGAAAATCAAAGAGGAGATCGCGCAGGTCATAATTGGTAATGTC TTGCAGGCAGGAAATGGCCAGAACCCCGCGCGGCAAGTTGCTCTTCAATCAGGGTT GTCCGTTGACATTCCCGCTTCTACAATTAACGAGGTTTGTGGGTCTGGTTTGAAAGC TATCTTGATGGGCATGGAACAAATCCAACTCGGCAAAGCGCAAGTAGTGCTGGCAG GCGGCATTGAATCAATGACAAATGCGCCAAGCCTGTCCCACTATAACAAGGCGGAG TCT AGT A A ACCT ATGGG ATT A AC AGCGG A A A ACGTCGC AC AGCGCT ACGGT ATCTC CCGTGAGGCGCAAGATCAATTCGCATATCAATCTCAGATGAAAGCAGCAAAAGCGC AGGCAGAAAACAAATTCGCTAAGGAAATTGTGCCACTGGCGGGTGAAACTAAAACC ATCACAGCTGACGAAGGGATCAGATCCCAAACAACGATGGAGAAACTGGCAAGTCT CAAACCTGTTTTTAAAACCGATGGCACTGTAACCGCAGGGAATGCTAGCACCATTA ATGACGGGGCCGCCCTTGTGCTGCTTGCTAGCAAAACTTACTGCGAAACTAATGAC AT ACCGT ACCTT GCGACAATCAA AG A A ATTGTTG A AGTTGG A ATCG ATCCGG AG AT TATGGGCATCTCTCCGATAAAAGCGATACAAACATTGTTACAAAATCAAAAAGTTA GCCTCG A AG AT ATTGG AGTTTTTG A A AT A A ATG A AGCCTTTGCCGC A AGT AGC AT A GTGGTTGAATCTGAGTTGGGATTAGATCCGGCTAAAGTTAACCGTTATGGGGGTGGT AT ATCCTT AGGTC ATGC A ATTGGGGC A ACCGGCGCTCGCCTGGCC ACTTC ACTGGTG TATCAAATGCAGGAGATACAAGCACGTTATGGTATTGCGAGCCTGTGCGTTGGTGG TGGACTTGGACTGGCAATGCTTTTAGAACGTCCAACTATTGAGAAGGCTAAACCGA CAGACAAAAAGTTCTATGAATTGTCACCAGCTGAACGGTTGCAAGAGCTGGAAAAT CAACAGAAAATCAGTTCTGAA ACTA AACAGCAGTTATCTC AGATGATGCTTGCCGA GGACACTGCAAACCATTTGATAGAAAATCAAATATCAGAGATTGAACTCCCAATGG GCGTCGGG ATG AACCTG AAGGTTG ATGGG AAAGCCTATGTTGTGCCAATGGCGACG GAAGAGCCGTCCGTCATCGCGGCCATGTCTAATGGTGCCAAAATGGCCGGCGAAAT TCACACTCAGTCGAAAGAACGGCTGCTCAGAGGTCAGATTGTTTTCAGCGCGAAGA ATCCGAATGAAATCGAACAGAGAATAGCTGAGAACCAAGCTTTGATTTTCGAACGT GCCGAACAGTCCTATCCTTCCATTGTGAAAAGAGAGGGAGGTCTCCGCCGCATTGC ACTTCGTCATTTTCCTGCCGATTCTCAGCAGGAGTCTGCGGACCAGTCCACATTTTTA TCAGTGGACCTTTTTGTAGATGTGAAAGACGCGATGGGGGCAAATATCATAAATGC AATACTTGAGGGCGTCGCAGCCCTGTTTCGCGAATGGTTCCCCAATGAGGAAATTCT TTTTTCT ATTCTCTCG A ACTTGGCT ACGG AG AGCTT AGTC ACGGCTGTTTGTG AAGTC CCATTTAGTGCACTTAGCAAGAGAGGTGGTGCAACGGTGGCCCAGAAAATTGTGCA GGCGTCGCTCTTCGCAAAGACAGACCCATACCGCGCAGTGACCCACAACAAAGGGA TTATGAACGGTGTAGAGGCTGTTATGCTTGCCACAGGCAACGACACGCGCGCAGTC TCAGCCGCTTGTCATGG AT ACGC AGCGCGC ACCGGT AGCT ATC AGGGTCTG ACT AA CTGGACGATTGAGTCGGATCGCCTGGTAGGCGAGATAACACTGCCGCTGGCCATCG CT AC AGTTGG AGGCGCT ACC A A AGTGTTGCCC A A AGCTC A AGCGGC ACTGG AG ATT AGTGATGTTCACTCTTCTCAAGAGCTTGCAGCCTTAGCGGCGTCAGTAGGTTTAGTA CAAAATCTCGCGGCCCTGCGCGCACTGGTTTCCGAAGGTATACAAAAAGGGCACAT GTCC ATGC A AGCCCGGTCTCTCGC A ATCGCGGTCGGTGCTG A A A A AGCCG AG ATCG AGCAGGTCGCCGAAAAGTTGCCiCiCACiAACCCGCCAATGAATCAGCAGCAGGCGCTC CGTTTTCTT GGCG AG ATCCGCG A AC A ATG A (SEQ ID NO:97)
Secuencia de ácido nucleico de mvaE de E. casseliflavus
ATGGAAGAAGTTGTCATCATTGACGCACTGCGTACTCCAATAGGAAAGTACCACGG TTCGCTGAAAGATTACACAGCTGTTGAACTGGGGACAGTAGCAGCAAAGGCGTTGC TGGCACGAAATCAGCAAGCAAAAGAACACATAGCGCAAGTTATTATTGGCAACGTC CTGCAAGCCGGAAGTGGGCAGAATCCAGGCCGACAAGTCAGTTTACAGTCAGGATT GTCTTCTG AT ATCCCCGCT AGC ACG ATC A ATG A AGTGTGTGGCTCGGGT ATG A A AGC GATTCTGATGGGTATGGAGCAAATTCAGCTGAACAAAGCCTCTGTGGTCTTAACAG GCGGAATTGAAAGCATGACCAACGCGCCGCTGTTTAGTTATTACAACAAGGCTGAG GATCAATATTCGGCGCCGGTTAGCACAATGATGCACGATGGTCTAACAGATGCTTTC AGTTCCAAACCAATGGGCTTAACCC.CAGAGACCGTCGCTGAGAGATATCjGAATTAC í i í ' ÍU'A \C,G \ \C \ \G Y I G \ V H T G r n YI ( 'ACI (" I CAA Y I G \ \( ií K 'í íCií ’í ' A \ UK'CC AGGCGGCGAAAAAGTTTGATCAGGAAATTGTACCCCTGACGGAAAAATCCGGAACG GTTCTCCAGGACGAAGGCATCAGAGCCGCGACAACAGTCGAGAAGCTAGCTGAGCT TAAAACGGTGTTCAAAAAAGACGGAACAGTTACAGCGGGTAACGCCTCTACGATAA ATG ATGGCGCTGCT ATGGT ATT A AT AGC ATC A A A ATCTT ATTGCG A AG A AC ACC AG ATTCCTTATCTGGCCGTT AT AAAGG AG ATCGTTG AGGTGGGTTTTGCCCCCG AAAT A ATGGGTATTTCCCCCATTAAGGCTATAGACACCCTGCTGAAAAATCAAGCACTGACC ATAGAGGATATAGGAATATTTGAGATTAATGAAGCCTTTGCTGCGAGTTCGATTGTG GT AG A ACGCG AGTTGGGCCTGG ACCCC A A A A A AGTT A ATCGCT ATGGCGGTGGT AT ATCACTCGGCCACGCAATTGGGGCGACGGGAGCTCGCATTGCGACGACCGTTGCTT ATCAGCTGAAAGATACCCAGGAGCGCTACGGTATAGCTTCCTTATGCGTTGGTGGG GGTCTTGGATTGGCGATGCTTCTGGAAAACCCATCGGCCACTGCCTCACAAACTAAT TTTGATGAGGAATCTGCTTCCGAAAAAACTGAGAAGAAGAAGTTTTATGCGCTAGC TCCT A ACG A ACGCTT AGCGTTTTTGG A AGCCC A AGGCGCT ATT ACCGCTGCTG A A AC CCTGGTCTTCCAGGAGATGACCTTAAACAAAGAGACAGCCAATCACTTAATCGAAA ACCAAATCAGCGAAGTTGAAATTCCTTTAGGCGTGGGCCTGAACTTACAGGTGAAT GGG A A AGCGT ATA ATGTTCCTCTGGCC ACGG AGG A ACCGTCCGTT ATCGCTGCG AT GTCGAATGGCGCCAAAATGGCTGGTCCTATTACAACAACAAGTCAGGAGAGGCTGT TACGGGGTC AG ATTGTCTTC ATGG ACGT AC AGG ACCC AG A AGC A AT ATT AGCG A A A GTTGAATCCGAGCAAGCTACCATTTTCGCGGTGGCAAATGAAACATACCCGTCTATC GTGAAAAGAGGAGGAGGTCTGCGTAGAGTCATTGGCAGGAATTTCAGTCCGGCCGA A AGTG ACTT AGCC ACGGCGT ATGT ATCAATTGACCTG ATGGT AG ATGTT A AGG ATG CA ATGGGTGCT A ATATC ATC A ATAGTATCCT AG A AGGTGTTGCGG A ATTGTTT AGA A AATGGTTCCCAGAAGAAGAAATCCTGTTCTCAATTCTCTCCAATCTCGCGACAGAAA GTCTGGTAACGGCGACGTGCTCAGTTCCGTTTGATAAATTGTCCAAAACTGGGAATG GTCGACAAGTAGCTGGTAAAATAGTGCACGCGGCGGACTTTGCTAAGATAGATCCA TACAGAGCTGCCACACACAATAAAGGTATTATGAATGGCGTTGAAGCGTTAATCTT AGCCACCGGTAATGACACCCGTGCGGTGTCGGCTGCATGCCACGGTTACGCGGCAC GCAATGGGCGAATGCAAGGGCTTACCTCTTGGACGATTATCGAAGATCGGCTGATA GGCTCTATCACATTACCTTTGGCTATTGCG ACAGTGGGGGGTGCCACAAAAATCTTG CCAAAAGCACAGGCCGCCCI'GGCGC IAAC IG C C G n GAGACGGCG I'CGGAAC IGGC CACiCCTGGCGGCGAGTGTGGGATTAGTTCAAAATTTGGCCGCTTTACGACiCACTAGT GAGCGAGGGCATTCAGCAAGGGCACATGAGTATGCAAGCTAGATCCCTGGCCATTA GCGT AGGTGCG A A AGGT ACTG A A AT AG AGCA ACT AGCTGCG A AGCTG AGGGC AGC GACGCAAATGAATCAGGAGCAGGCTCGTAAATTTCTGACCGAAATAAGAAATTAA
(SEQ ID NO:98)
Secuencia de ácido nucleico de mvaS de L. grayi
ATGACCATGAACGTTGGAATCGATAAAATGTCATTCTTTGTTCCACCTTACTTTGTG GACATGACTGATCTGGCAGTAGCACGGGATGTCGATCCCAATAAGTTTCTGATTGGT ATTGGCCAGGACCAGATGGCAGTTAATCCGAAAACGCAGGATATTGTGACATTTGC C AC A A ATGCTGCC A A A A AC AT ACTGTC AGCTG AGG ACCTTGAT A A A ATTG AT ATGG TCATAGTCGGCACCGAGAGTGGAATCGATGAATCCAAAGCGAGTGCCGTAGTGCTT CACAGGTTGCTCGGTATCCAGAAGTTTGCTCGCTCCTTTGAAATCAAAGAAGCCTGT TATGGGGGTACCGCGGCTTTACAGTTCGCTGTAAACCACATTAGGAATCATCCTGAA TCAAAGGTTCTTGTAGTTGCATCAGATATCGCGAAATACGGCCTGGCTTCTGGAGGT GAACCAACGCAAGGTGCAGGCGCTGTGGCTATGCTCGTCTCAACTGACCCTAAGAT C ATTGCTTTC A ACG ACG AT AGCCTCCiCGCTT AC AC A AG AT ATCT ATG ACTTCTGGCG ACCAGTTGGACATGACTATCCTATGGTCGACGGGCCTCTTAGTACAGAGACCTACAT CCAGTCATTTCAGACCGTATGGCAGGAATACACAAAACGGTCGCAGCATGCACTGG C AG ACTTTGCTGCCCTT AGCTTTC AT ATCCCGT AT ACT A A A ATGGGC A A A A AGGCGC TGCTTGCAATCCTTGAAGGCGAATCAGAGGAGGCTCAGAACCGTATACTAGCAAAA TATGAAAAGAGTATAGCCTACTCCAGAAAGGCGGGTAACCTGTATACCGGTAGCCT GTATCTAGGACTTATTTCACTTCTGGAAAATGCAGAAGACCTTAAAGCTGGTGATTT AATAGGCCTCTTTTCTTACGGTTCCGGTGCTGTTGCGGAGTTTTTCTCAGGAAGGCT GGTTGAGGACTATCAGGAACAGCTACTTAAAACAAAACATGCCGAACAGCTGGCCC ATAGAAAGCAACTGACAATCGAGGAGTACGAAACGATGTTCTCCGATCGCTTGGAC GTGGACAAAGACGCCGAATACGAAGACACATTAGCTTATAGCATTTCGTCAGTCCG AAACACCGTACGTGAGTACAGGAGTTGA (SEQ ID Nü:99)
S e c u e n c ia de ác id o nu c le ico de mvaS de E. faecium
ATGAAAATCGGTATTGACCGTCTGTCCTTCTTCATCCCGAATTTGTATTTGGACATG ACTGAGCTGGCAGAATCACGCGGGGATGATCCAGCTAAATATCATATTGGAATCGG ACAAGATCAGATGGCAGTGAATCGCGCAAACGAGGACATCATAACACTGGGTGCA AACGCTGCGAGTAAGATCGTGACAGAGAAAGACCGCGAGTTGATTGATATGGTAAT CGTTGGCACGGAATCAGGAATTGACCACTCCAAAGCAAGCGCCGTGATTATTCACC ATCTCCTTAAAATTCAGTCGTTCGCCCGTTCTTTCGAGGTAAAAGAAGCTTGCTATG GCGG A ACTGCTGCCCTGC AC ATGGCG A AGG AGT ATGTC A A A A ATC ATCCGG AGCGT A AGGTCTTGGT A ATTGCGTC AG AC ATCGCGCGTT ATGGTTTGGCCAGCGG AGG AG A AGTTACTCAAGGCGTGGGGGCCGTAGCCATGATGATTACACAAAACCCCCGGATTC TTTCGATTGA AG ACG AT AGTGTTTTTCTCACAG AGG AT ATCTATG ATTTCTGGCGGC CTGATT ACTCCG AGTTCCCTGT AGTGGACGGGCCCCTTTCA A ACTC A ACGTAT AT AG AGAGTTTTCAGAAAGTTTGGAACCGGCACAAGGAATTGTCCGGAAGAGGGCTGGAA GATT ATCA AGCT ATTGCTTTTCACAT ACCCTAT ACG A AG ATGGGT A AG A A AGCGCTC CAGAGTGTTTTAGACCAAACCGATGAAGATAACCAGGAGCGCTTAATGGCT AGATA TGAGGAGTCT ATTCGCT AT AGCCGGAGA ATTGGT AACCTGT AC ACAGGCAGCTTGT ACCTTGGTCTTACAAGCTTGTTGGAAAACTCTAAAAGTTTACAACCGGGAGATCGG ATCGGCCTCTTTTCCT ATGGC AGTGGTGCGGTGTCCG AGTTCTTT ACCGGGT ATTT AG AAG A A A ATT ACC A AG AGT ACCTGTTCGCTC A A AGCCATC A AG A A ATGCTGG AT AGC CGG ACTCGG ATTACGGTCG ATG A AT ACG AG ACC ATCTTTTC AG AG ACTCTGCC AG A AC ATGGTG A ATGCGCCG AAT AT ACG AGCG ACGTCCCCTTTTCT AT AACC AAG ATTG A GAACGACATTCGTTATTATAAAATCTGA (SEQ ID NOrlOO)
Secuencia de ácido nucleico de mvaS de E. gallinarum
ATGAACGTCGGCATTGACAAAATTAATTTTTTCGTTCCACCGTATTATCTGGATATG GTCGACCTGGCCCACGCACGCGAAGTGGACCCGAACAAATTTACAATTGGAATTGG ACAGGATCAGATGGCTGTGAGCAAAAAGACGCACGATATCGTAACATTCGCGGCTA GTGCCCiCCiAAGGAAATTTTAGAACCTGACiGACTTGCAAGCTATAGACATGGTTATA GTTGGTACCGAATCGGGCATTGACGAGAGCAAAGCATCCGCGGTCGTTTTACATCG TTTGTTGGGCGTACAACCTTTCGCTCGCAGTTTTGAAATTAAAGAAGCCTGTTACGG GGC A ACCGC AGGC ATTCAGTTTGCC A AG ACTCAT AT AC A AGCG A ACCCGG AG AGCA AGGTCCTGGT A ATTGC A AGCG AT AT AGCTCGGT ATGGTCTTCGGTC ACiGTGG AG AG CCCACACAAGGCGCAGGGGCAGTTGCTATGCTTCTCACGGCAAATCCCAGAATCCT GACCTTCGAAAACGACAATCTGATGTTAACGCAGGATATTTATGACTTCTGGAGACC ACTTGGTCACGCTTACCCTATGGTAGATGGCCACCTTTCCAATCAAGTCTATATTGA C AGTTTT AAG A AGGTCTGGC A AGC AC ATTGCG A ACGC A ATC A AGCTTCT AT ATCCG ACT ATGCCGCG ATT AGTTTTC AT ATTCCGT AT ACA A A A ATGGGT A AG A A AGCCCTGC TCGCTGTTTTTGCAGATGAAGTGGAAACTGAACAGGAACGCGTTATGGCACGGTAT GAAGAGTCTATCGTATATTCACGCCGGATCGGCAACTTGTATACGGGATCATTGTAC CTGGGGCTGATATCCTTATTGGAAAACAGTTCTCACCTGTCGGCGGGCGACCGGATA GGATTGTTT AGTT ATGGG AGTGGCGCTGTC AGCG AATTTTTCTCCGGTCGTTT AGTG GCAGGCTATGAAAATCAATTGAACAAAGAGGCGCATACCCAGCTCCTGGATCAGCG TCAGAAGCTTTCCATCGAAGAGTATGAGGCGATTTTTACAGATTCCTTAGAAATTGA TCAGGATGCAGCGTTCTCGGATGACCTGCCATATTCCATCCGCGAGATAAAAAACA CG ATTCGGT ACT AT A AGG AG AGCTG A (SEQ ID 1SO:101)
S e c u e n c ia de ác id o nu c le ico de mvaS de E. casseliflavus
ATGAACGTTGGAATTGATAAAATCAATTTTTTCGTTCCGCCCTATTTCATTGATATGG TGGATCTCGCTCATGCAAGAGAAGTTGACCCCAACAAGTTCACTATAGGAATAGGC CAAGATCAGATGGCAGTAAACAAGAAAACGCAAGATATCGTAACGTTCGCGATGCA CGCCGCGAAGGATATTCTGACTAAGGAAGATTTACAGGCCATAGATATGGTAATAG TGGGGACTGAGTCTGGGATCGACGAGAGCAAGGCAAGTGCTGTCGTATTGCATCGG CTTTTAGGTATTCAGCCTTTTGCGCGCTCCTTTGAAATTAAGGAGGCATGCTATGGG GCCACTGCCGGCCTTCAGTTTGCAAAAGCTCATGTGCAGGCTAATCCCCAGAGCAA GGTCCTGGTGGTAGCTTCCGATATAGCACGCTACGGACTGGCATCCGGAGGAGAAC CGACTCAAGGTGTAGGTGCTGTGGCAATGTTGATTTCCGCTGATCCAGCTATCTTGC AGTTAGAAAATGATAATCTCATGTTGACCCAAGATATATACGATTTTTGGCGCCCGG TCGGGC ATC A AT ATCCT ATGGT AG ACGGCC ATCTGTCTA ATGCCGTCT AT AT AG AC A GCTTTAAACAAGTCTGGCAAGCACA'ITGCGAGAAAAACCAACGGACTGCTAAAGAT T ATGCTGC ATTGTCGTTCC AT ATTCCGT AC ACG A A A ATGGGT A AG A A AGCTCTGTT A GCGGTTTTTGCGGAGGAAGATGAGACAGAACAAAAGCGGTTAATGGCACGTTATGA AGAATCAATTGTATACAGTCGTCGGACTGGAAATCTGTATACTGGCTCACTCTATCT GGGCCTG ATTTCCTT ACTGG AG A ATAGT AGCAGTTT AC AGGCG A ACG ATCGC AT AG GTCTGTTT AGCT ATGGTTC AGGGGCCGTTGCGG A ATTTTTCAGTGGCCTCTTGGT AC CGGGTTACGAGAAACAATTAGCGCAAGCTGCCCATCAAGCTCTTCTGGACGACCGG CAAAAACTGACTATCGCAGAGTACGAAGCCATGTTTAATGAAACCATTGATATTGA TCAGGACCAGTCATTTGAGGATGACTTACTGTACTCCATCAGAGAGATCAAAAACA CT ATTCGCT ACT AT A ACG AGG AG A ATGA ATA A (SEQ ID NO: 102)
Secuencia de aminoácidos de la acetoacetil-CoA sintasa
MTDVRFRIIGTGAYVPERIVSNDEVGAPAGVDDDWITRKTGIRQRRWAADDQATSDLA TAAGRAALKAAGITPEQETVIAVATSTPDRPQPPTAAYVQHHI.GATGTAAFDVNAVCS GTVFALSSVAGTLVYRGGYALVIGADLYSRILNPADRKTVVLFGDGAGAMVLGPTSTG
t g p iv r r v a l h t f g g l t d l ir v p a g g s r o p l d t d g l d a g l q y f a m d g r e v r r f v t e h l p QLIKGFLHEAGVDAADISHFVPHQANGVMLDEVFGELHLPRATMHRTVETYGNTGAAS IPITMDAAVRAGSFRPGELVLLAGFGGGMAASFALIEW (SEQ ID NO: 103)
Secuencia de ácido nucleico de PKL de L. lactis
atgaccgagtataacagcgaggcctatctgaaaaaactggataaatggtggcgtgcagcaacctatctgggtgcaggtatgatttttctgaaa gaaaatccgctgtttagcgttaccggcaccccgattaaagcagaaaatctgaaagccaatccgattggtcattggggcaccgttagcggtca gacctttctgtatgcacatgcaaatcgtctgatcaacaaatatgatcagaaaatgttttatatgggtggtccgggtcatggtggtcaggcaatg gttgttccgagctatctggatggtagctataccgaagcatatccggaaattacccaggatctggaaggtatgagccgtctgtttaaacgtttta gctttccgggtggtattggtagccatatgaccgcacagacaccgggtagcctgcatgaaggtggtgaactgggttatgttctgagccatgca accggtgcaattctggatcagccggaacaaattgcatttgcagttgltggtgatggtgaagccgaaaccggtccgctgatgaccagctggc atagcatcaaatttatcaacccgaaaaacgatggtgccattctgccgatcctggatctgaatggctttaaaatcagcaatccgaccctgtttgc acgtaccagtgatgttgatattcgcaaatttttcgaaggcctgggctatagtccgcgttatattgaaaatgatgatattcacgactatatggccta ccataaactggcagcagaagtttttgataaagccatcgaagatatccatcagatccagaaagatgcccgtgaagataatcgttatcagaatg gtgaaattccggcatggccgattgttattgcacgtctgccgaaaggttggggtggccctcgttataatgattggagcggtccgaaatttgatg gtaaaggtatgccgattgaacatagctttcgtgcacatcaggttccgctgccgctgagcagcaaaaatatgggcaccctgccggaatttgtta aatggatgacctcatatcagcctgaaacactgtttaatgcagatggttcactgaaagaggaactgcgcgattttgcaccgaaaggcgaaatg cgtatggcaagtaatccggttaccaatggtggtgttgatagcagcaatctggttctgccggattggcaagaatttgcaaacccgattagcgaa aataatcgtggtaaactgctgccggacaccaatgataatatggatatgaatgtgctgagcaagtattttgccgaaatcgttaaactgaatccga cacgttttcgcctgtttggtccggatgaaaccatgagcaatcgtttttgggaaatgttcaaagtgaccaatcgtcagtggatgcaggttatcaaa aatccgaacgatgaattcattagtccggaaggtcgtattattgatagccagctgagcgaacatcaggcagaaggttggctggaaggctatac cctgaccggtcgtaccggtgcctttgcaagctatgaaagctttctgcgtgttgtggatagcatgctgacccagcatttcaaatggattcgtcag gcagccgaccagaaatggcgtcatgattatccgagcctgaatgttattagcaccagcaccgtttttcagcaggatcataatggttatacccatc aggatccgggtatgctgacacatctggcagagaaaaaaagcgattttatccgtcagtatctgcctgccgatggtaataccctgctggcagtgt ttgatcgtgcatttcaggatcgtagcaaaatcaatcatattgtggcaagcaaacagcctcgtcagcagtggtttaccaaagaagaagccgag aaactggccaccgatggcattgcaaccattgattgggcgagcaccgcaaaagatggcgaagcagttgatctggtttttgcaagtgccggtg cagaaccgaccattgaaaccctggcagccctgcatctggttaatgaagtgtttccgcaggcaaaatttcgctatgttaatgttgttgagctggg tcgtctgcagaaaaagaaaggtgcactgaatcaagaacgtgaactgtccgatgaagaattcgagaaatatttcggtccgagcggtacaccg gttatttttggttttcatggttatgaggatctgattgaaagcatcttttatcagcgtggtcatgatggcctgatcgttcatggctatcgcgaagatgg tgatattaccaccacctatgatatgcgtgtttatagcgaactggatcgttttcatcaggccattgatgcaatgcaggtactgtatgtgaatcgcaa agttaatcagggtctggccaaagcatttatcgatcgtatgaaacgtaccctggtgaaacattttgaagtgacccgtaatgaaggcgtggatatt ccggattttaccgaatgggtttggagcgatctgaagaaa (SEQ ID NO: 104)
Secuencia de aminoácidos de PKL de L. lactis
MTEYNSEAYL KKLDKWWRAA TYLGAGMIFL KENPLFSVTG TPIKAENLK.A NPIGHWGTVS GQTFLYAHAN REINKYDQKM FYMGGPGHGG QAMVVPSYED GSYTEAYPEITQDLEGMSRL FKRFSFPGGI GSHMTAQTPG SLHEGGELGY VLSHATGAIL DQPEQIAFAV VGDGEAETGP LMTSWHS1KFINPKNDGAIL P1LDLNGFK1 SNPTLFARTS DVD1RKFFEG LGYSPRY1EN DD1HDYMAYH KLAAEVFDKA IEDIHQIQKD AREDNRYQNG EIPAWPIVIA RLPKGWGGPR YNDWSGPKFD GKGMPIEHSF RAHQVPLPLS SKNMGTLPEF VKWMTSYQPE TLFNADGSLK EELRDFAPKG EMRMASNPVT NGGVDSSNLV LPDWQEFANP ISENNRGKLL PDTNDNMDMN VLSKYFAEIV KENPTRFRLF GPDETMSNRF WF.MFKVTNRQ WMQVIKNPNO EFISPEGRIIDSQLSEHQAE GWLEGYTLTG RTGAFASYES FLRVVDSMLT QHFKWIRQAA DQKWRHDYPS LNVISTSTVF QQDHNGYTHQ DPGMLTHLAE KKSDFIRQYL PADGNTLLAV FDRAFQDRSK INHIVASKQP RQQWFTKEEA EKLATDGIAT IDWASTAKDG EAVDLVFASA GAEPTIETLA ALHLVNEVFP QAKFRYVNVV ELGRLQKKKG ALNQERELSD EEFEKYFGPS GTPVIFGFHG YEDLIESIFY QRGHDGLIVH GYREDGDITT TYDMRVYSEL DRFHQAIDAM QVLYVNRKVN QGLAKAFIDR MKRTLVKHFE VTRNEGVDIP DFTEWVWSDL KK (SEQ ID NO: 105)

Claims (1)

  1. REIVINDICACIONES
    Célula recombinante capaz de aumentar el flujo de carbono a través de la ruta de la fosfocetolasa, en la que la célula recombinante comprende
    (A)
    (i) una secuencia de ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa, en la que el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 65% con SEQ ID NO: 8 y
    (ii) uno o más ácidos nucleicos que codifican para uno o más polipéptidos de la ruta de MVA completa, en la que dicha célula recombinante que comprende dicho polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa de (i) tiene un valor de índice de rendimiento mayor de 1,0 en uno o más de los siguientes parámetros: (a) crecimiento celular en glucosa, (b) crecimiento celular en xilosa, (c) producción de acetil-fosfato intracelular o (d) crecimiento celular en glucosa-6-fosfato; o
    (B)
    (i) una secuencia de ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa, en la que el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 65% con SEQ ID NO: 8 y
    (ii) uno o más ácidos nucleicos que codifican para uno o más polipéptidos de la ruta de MVA completa, en la que dicho polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa de (i) tiene un valor de índice de rendimiento mayor de 1,0 en el siguiente parámetro: actividad específica de fructosa-6-fosfato (F6P);
    en la que el valor de índice de rendimiento es la actividad calculada por unidad en relación con la fosfocetolasa de E. gallinarum de SEQ ID NO: 93.
    Célula recombinante según la reivindicación 1, en la que el polipéptido comprende
    (i) una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 23; o
    (ii) una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 24; o
    (iii) una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 25; o
    (iv) una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 26; o
    (v) una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 27; o
    (vi) una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 28; o
    (vii) una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 29; o
    (viii) una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 30; o
    (ix) una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 31.
    Célula recombinante capaz de aumentar el flujo de carbono a través de la ruta de la fosfocetolasa, en la que la célula recombinante comprende
    (A)
    (i) una secuencia de ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa, en la que el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 65% con SEQ ID NO: 11 y
    (ii) uno o más ácidos nucleicos que codifican para uno o más polipéptidos de la ruta de MVA completa, en la que dicha célula recombinante que comprende dicho polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa de (i) tiene un valor de índice de rendimiento mayor de 1,0 en uno o más de los siguientes parámetros: (a) crecimiento celular en glucosa, (b) crecimiento celular en xilosa, (c) producción de acetil-fosfato intracelular o (d) crecimiento celular en glucosa-6-fosfato; o
    (B)
    (i) una secuencia de ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa, en la que el polipéptido comprende una identidad de secuencia de al menos el 65% con SEQ ID NO: 11 y
    (ii) uno o más ácidos nucleicos que codifican para uno o más polipéptidos de la ruta de MVA completa, en la que dicho polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa de (i) tiene un valor de índice de rendimiento mayor de 1,0 en el siguiente parámetro: actividad específica de fructosa-6-fosfato (F6P);
    en la que el valor de índice de rendimiento es la actividad calculada por unidad en relación con la fosfocetolasa de E. gallinarum de SEQ ID NO: 93.
    Célula recombinante según la reivindicación 3, en la que el polipéptido comprende
    (i) una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 32; o
    (ii) una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 33; o
    (iii) una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 34; o
    (iv) una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 35; o
    (v) una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 36; o
    (vi) una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 37; o
    (vii) una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 38; o
    (viii) una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 39; o
    (ix) una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 40; o
    (x) una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 41; o
    (xi) una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 42; o
    (xii) una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 43; o
    (xiii) una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 44; o
    (xiv) una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 45; o
    (xv) una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 46.
    Célula recombinante según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en la que
    (i) el cultivo de la célula recombinante en un medio adecuado aumenta uno o más de una cantidad intracelular de eritrosa 4-fosfato, una cantidad intracelular de gliceraldehído 3-fosfato o una cantidad intracelular de fosfato; o
    (ii) el polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa es capaz de sintetizar gliceraldehído 3-fosfato y acetilfosfato a partir de xilulosa 5-fosfato; o
    (iii) el polipéptido que tiene actividad fosfocetolasa es capaz de sintetizar eritrosa 4-fosfato y acetil-fosfato a partir de fructosa 6-fosfato.
    Célula recombinante según una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en la que el uno o más polipéptidos de la ruta de MVA completa se selecciona de (a) una enzima que condensa dos moléculas de acetil-CoA para formar acetoacetil-CoA; (b) una enzima que condensa acetoacetil-CoA con acetil-CoA para formar HMG-CoA (por ejemplo, HMG sintasa); (c) una enzima que convierte HMG-CoA en mevalonato; (d) una enzima que fosforila mevalonato a mevalonato 5-fosfato; (e) una enzima que convierte mevalonato 5-fosfato en mevalonato 5-pirofosfato; y (f) una enzima que convierte mevalonato 5-pirofosfato en isopentenil pirofosfato.
    Célula recombinante capaz de producir isopreno, en la que la célula recombinante según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4 comprende además un ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido de isopreno sintasa, en la que el cultivo de la célula recombinante en un medio adecuado proporciona la producción de isopreno con un valor de índice de rendimiento mayor de 1,0 en uno o más de los siguientes parámetros: (a) rendimiento de isopreno o (b) productividad específica de isopreno.
    8. Célula recombinante según la reivindicación 7, en la que
    (i) el ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido de isopreno sintasa codifica para un polipéptido de isopreno sintasa de planta, en la que opcionalmente el polipéptido de isopreno sintasa de planta es un polipéptido de Pueraria o Populus o un híbrido, Populus alba x Populus trémula, o en la que opcionalmente el polipéptido de isopreno sintasa es de Pueraria montana, Pueraria lobata, Populus tremuloides, Populus alba, Populus nigra o Populus trichocarpa; o
    (ii) las células recombinantes comprenden además uno o más ácidos nucleicos que codifican para uno o más polipéptidos de la ruta de 1-desoxi-D-xilulosa 5-fosfato (DXP).
    9. Célula recombinante capaz de producir:
    (A) precursores de isoprenoides, en la que la célula recombinante según una cualquiera de las reivindicaciones 1-6 se cultiva en un medio adecuado y produce dichos precursores de isoprenoides; o (B) isoprenoides, en la que la célula recombinante según una cualquiera de las reivindicaciones 1-6 comprende además un ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido de poliprenil pirofosfato sintasa, en la que el cultivo de la célula recombinante en un medio adecuado proporciona la producción de isoprenoides; o
    (C) un metabolito derivado de acetil-CoA, en la que el cultivo de la célula recombinante según una cualquiera de las reivindicaciones 1-6 en un medio adecuado proporciona la producción del metabolito derivado de acetil-CoA.
    10. Célula recombinante según una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en la que
    (i) el ácido nucleico se coloca bajo un promotor inducible o un promotor constitutivo; o
    (ii) el ácido nucleico se clona en uno o más plásmidos multicopia; o
    (iii) el ácido nucleico se integra en un cromosoma de las células; o
    (iv) las células recombinantes son células bacterianas gram-positivas, células bacterianas gram-negativas, células fúngicas, células fúngicas filamentosas, células de algas o células de levadura; o
    (v) las células recombinantes se seleccionan del grupo que consiste en Corynebacteria, Bacillus subtilis, Streptomyces lividans, Streptomyces coelicolor, Streptomyces griseus, Escherichia coli, Pantoea citrea, Trichoderma reesei, Aspergillus oryzae, Aspergillus niger, Saccharomyces cerevisiae y Yarrowia lipolytica.
    11. Célula recombinante según la reivindicación 9(B), en la que el isoprenoide
    (i) se selecciona de un grupo que consiste en monoterpenos, diterpenos, triterpenos, tetraterpenos, sesquiterpeno y politerpeno; o
    (ii) es un sesquiterpeno; o
    (iii) se selecciona del grupo que consiste en abietadieno, amorfadieno, careno, a-farneseno, p-farneseno, farnesol, geraniol, geranilgeraniol, linalool, limoneno, mirceno, nerolidol, ocimeno, pachulol, p-pineno, sabineno, y-terpineno, terpindeno y valenceno.
    12. Célula recombinante según la reivindicación 9(C), en la que
    (i) el metabolito derivado de acetil-CoA se selecciona del grupo que consiste en policétidos, polihidroxibutirato, alcoholes grasos y ácidos grasos; o
    (ii) el metabolito derivado de acetil-CoA se selecciona del grupo que consiste en ácido glutámico, glutamina, aspartato, asparagina, prolina, arginina, metionina, treonina, cisteína, succinato, lisina, leucina e isoleucina; o
    (iii) el metabolito derivado de acetil-CoA se selecciona del grupo que consiste en acetona, isopropanol, isobuteno y propeno.
    13. Método para producir isopreno que comprende: (a) cultivar la célula recombinante según la reivindicación 7 en condiciones adecuadas para producir isopreno y (b) producir isopreno.
    14. Método de producción de un precursor de isoprenoides que comprende: (a) cultivar la célula recombinante según la reivindicación 9(A) en condiciones adecuadas para producir un precursor de isoprenoides y (b) producir un precursor de isoprenoides.
    15. Método de producción de un isoprenoide que comprende: (a) cultivar la célula recombinante según la reivindicación 9(B) en condiciones adecuadas para producir un isoprenoide y (b) producir un isoprenoide.
    16. Método de producción de un metabolito derivado de acetil-CoA que comprende: (a) cultivar la célula recombinante según la reivindicación 9(C) en condiciones adecuadas para producir un metabolito derivado de acetil-CoA y (b) producir un metabolito derivado de acetil-CoA.
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