MX2011000073A - Composiciones y metodos para producir isopreno libre de hidrocarburos de c5 bajo condicion de desacoplamiento y/o intervalos de operacion seguros. - Google Patents

Composiciones y metodos para producir isopreno libre de hidrocarburos de c5 bajo condicion de desacoplamiento y/o intervalos de operacion seguros.

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Abstract

La invención se refiere a métodos para producir isopreno a partir de células cultivadas, en donde las células están en la fase estacionaria. La invención también provee composiciones que incluyen estas células cultivadas y/o cantidad incrementada de isopreno. La invención también provee sistemas que incluyen una concentración no inflamable de isopreno en la fase de gas. Además, la invención provee composiciones de isopreno, tales como composiciones con cantidad incrementada de isopreno o pureza incrementada.

Description

COMPOSICIONES Y METODOS PARA PRODUCIR ISOPRENO LIBRE DE HIDROCARBUROS DE C5 BAJO CONDICION DE DESACOPLAMIENTO Y/O INTERVALOS DE OPERACION SEGUROS Antecedentes de la Invención El isopreno (2-metil-l, 3-butadieno) es el material de partida crítico para una variedad de polímeros sintéticos, muy notablemente hules sintéticos. El isopreno es producido naturalmente por una variedad de especies microbianas, vegetales y animales. En particular, se han identificado dos vías para la biosíntesis de isopreno: la vía de mevalonato (MVA) y la vía que no es de mevalonato (DXP) (figura 19) . Sin embargo, el rendimiento de isopreno a partir de organismos que ocurren naturalmente es comercialmente inatractivo. Aproximadamente 800,000 toneladas por año de cis-poliisopreno son producidas a partir de la polimerización de isopreno; la mayor parte de este poliisopreno se usa en la industria de llantas y hule. El isopreno es también copolimerizado para usarse como un elastómero sintético en otros productos tales como calzado, productos mecánicos, productos médicos, artículos deportivos y látex.
Actualmente, la industria de llantas y hule se basa en el uso de hule natural y sintético. El hule natural se obtiene del jugo lechoso de árboles o plantas de hule encontradas en las selvas lluviosas de África. El hule Ref. 216629 sintético se basa principalmente en polímeros de butadieno. Para estos polímeros, el butadieno se obtiene como un co-producto de la fabricación de etileno y propileno.
Aunque el isopreno se puede obtener por fraccionamiento del petróleo, la purificación de este material es costosa y consume tiempo. El fraccionamiento del petróleo de la corriente de hidrocarburos de C5 produce sólo aproximadamente 15% de isopreno. Por lo tanto, son necesarios métodos más económicos para producir isopreno. En particular, los métodos que producen isopreno a tasas, títulos y pureza que son suficientes para satisfacer las demandas de un procedimiento comercial robusto son deseables. También se desean sistemas para producir isopreno a partir de materiales de partida de bajo costo.
Sumario de la Invención En un aspecto, la invención se refiere a células en cultivo que producen isopreno. En algunas modalidades, la invención provee células en cultivo que producen mayores que aproximadamente 400 nmoles de isopreno/gramo de células para el peso húmedo de las células/hora (nmol/gwcm/hr) de isopreno. En algunas modalidades, las células tienen un ácido nucleico heterólogo que (i) codifica un polipéptido de isopreno sintasa y (ii) está operablemente enlazado a un promotor. En algunas modalidades, las células son cultivadas en un medio de cultivo que incluye una fuente de carbono, tal como, pero sin limitarse a, un carbohidrato, glicerol, glicerina, dihidroxiacetona, fuente de un carbono, aceite, grasa animal, aceite animal, ácido graso, lípido, fosfolípido, glicerolípido, monoglicérido, diglicérido, triglicérido, fuente de carbono renovable, polipéptido (v.gr., una proteína o péptido microbiano o vegetal) , extracto de levadura, componente de un extracto de levadura, o cualquier combinación de dos o más de los anteriores. En algunas modalidades, las células son cultivadas bajo condiciones de glucosa limitadas.
En algunas modalidades, la invención provee células en cultivo que convierten más de aproximadamente 0.002% del carbono en un medio de cultivo de células a isopreno. En algunas modalidades, las células tienen un ácido nucleico heterólogo que (i) codifica un polipéptido de isopreno sintasa y (ii) está operablemente enlazado a un promotor. En algunas modalidades, las células son cultivadas en un medio de cultivo que incluye una fuente de carbono, tal como, pero sin limitarse a, un carbohidrato, glicerol, glicerina, dihidroxiacetona, fuente de un carbono, aceite, grasa animal, aceite animal, ácido graso, lípido, fosfolípido, glicerolípido, monoglicérido, diglicérido, triglicérido, fuente de carbono renovable, polipéptido (v.gr., una proteína o péptido microbiano o vegetal) , extracto de levadura, componente de a extracto de levadura, o cualquier combinación de dos o más de los anteriores. En algunas modalidades, las células son cultivadas bajo condiciones de glucosa limitadas.
En algunas modalidades, la invención provee células en cultivo que comprenden un ácido nucleico heterólogo que codifica un polipéptido de isopreno sintasa. En algunas modalidades, las células tienen un ácido nucleico heterólogo que (i) codifica un polipéptido de isopreno sintasa y (ii) está operablemente enlazado a un promotor. En algunas modalidades, las células son cultivadas en un medio de cultivo que incluye una fuente de carbono, tal como, pero sin limitarse a, un carbohidrato, glicerol, glicerina, dihidroxiacetona , fuente de un carbono, aceite, grasa animal, aceite animal, ácido graso, lípido, fosfolípido, glicerolípido, monoglicérido, diglicérido, triglicérido , fuente de carbono renovable, polipéptido (v.gr., una proteína o péptido microbiano o vegetal) , extracto de levadura, componente de un extracto de levadura, o cualquier combinación de dos o más de los anteriores. En algunas modalidades, las células son cultivadas bajo condiciones de glucosa limitadas.
En un aspecto, la invención se refiere a métodos de producción de isopreno, tales como métodos para usar cualquiera de las células descritas aquí para producir isopreno. En algunas modalidades, el método implica cultivar células bajo condiciones suficientes para producir más que aproximadamente 400 nmol/gwcm/hr de isopreno. En algunas modalidades, el método también incluye recuperar isopreno producido por las células. En algunas modalidades, el método incluye purificar isopreno producido por las células. En algunas modalidades, el método incluye polimerizar el isopreno. En algunas modalidades, las células tienen un ácido nucleico heterólogo que (i) codifica un polipéptido de isopreno sintasa y (ii) está operablemente enlazado a un promotor. En algunas modalidades, las células son cultivadas en un medio de cultivo que incluye una fuente de carbono, tal como, pero sin limitarse a, un carbohidrato, glicerol, glicerina, dihidroxiacetona , fuente de un carbono, aceite, grasa animal, aceite animal, ácido graso, lípido, fosfolípido, glicerolípido, monogli.cérido, diglicérido, triglicérido, fuente de carbono renovable, polipéptido (v.gr. , una proteína o péptido microbiano o vegetal) , extracto de levadura, componente de a extracto de levadura, o cualquier combinación de dos o más de los anteriores. En algunas modalidades, las células son cultivadas bajo condiciones de glucosa limitadas. En varias modalidades, la cantidad de isopreno producido (tal como la cantidad total de isopreno producido o la cantidad de isopreno producido por litro de caldo por hora por OD0oo) durante la fase estacionaria es mayor que o aproximadamente 2 o más veces la cantidad de isopreno producido durante la fase de crecimiento-para la misma longitud de tiempo. En algunas modalidades, la fase gaseosa comprende más de, o aproximadamente, 9.5% (volumen) de oxígeno, y . la concentración de isopreno en la fase gaseosa es menor que el límite de inflamabilidad inferior o más del límite de inflamabilidad superior. En modalidades particulares, (i) la concentración de isopreno en la fase gaseosa es menor que el límite de inflamabilidad inferior o más del límite de inflamabilidad superior, y (ii) las células producen más de aproximadamente 400 nmoles/gWCm/hr de isopreno.
En algunas modalidades, el método incluye cultivar células bajo condiciones suficientes para convertir más de aproximadamente 0.002% del carbono (mol/mol) en un medio de cultivo de células a isopreno. En algunas modalidades, el método también incluye recuperar isopreno producido por las células. En algunas modalidades, el método incluye purificar isopreno producido por las células. En algunas modalidades, el método incluye polimerizar el isopreno. En algunas modalidades, las células tienen un ácido nucleico heterólogo que (i) codifica un polipéptido de isopreno sintasa y (ii) está operablemente enlazado a un promotor. En algunas modalidades, las células son cultivadas en un medio de cultivo que incluye una fuente de carbono, tal como, pero sin limitarse a, un carbohidrato, glicerol, glicerina, dihidroxiacetona, fuente de un carbono, aceite, grasa animal, aceite animal, ácido graso, lípido, fosfolípido, glicerolípido, monoglicérido , diglicérido, triglicérido, fuente de carbono renovable, polipéptido (v.gr., una proteína o péptido microbiano o vegetal) , extracto de levadura, componente de a extracto de levadura, o cualquier combinación de dos o más de los anteriores. En algunas modalidades, las células son cultivadas bajo condiciones de glucosa limitadas.
En algunas modalidades, isopreno es únicamente producido en fase estacionaria. En algunas modalidades, el isopreno es producido tanto en la fase de crecimiento como en la fase estacionaria. En varias modalidades, la cantidad de isopreno producido (tal como la cantidad total de isopreno producido o la cantidad de isopreno producido por litro de caldo por hora por OD0oo) durante la fase estacionaria es mayor que o aproximadamente 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, o más veces la cantidad de isopreno producido durante la fase de crecimiento para la misma longitud de tiempo.
En un aspecto, la invención presenta composiciones y sistemas que comprende isopreno. En algunas modalidades, la composición comprende más de, o aproximadamente, 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 ó 1000 mg de isopreno. En algunas modalidades, la composición comprende más de, o aproximadamente, 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 g de isopreno (p/p) de la fracción orgánica volátil de la composición es isopreno.
En algunas modalidades, la composición comprende más de, o aproximadamente, 99.90, 99.92, 99.94, 99.96, 99.98, o 100% de isopreno en peso comparado con el peso total de todos los hidrocarburos de C5 en la composición. En algunas modalidades, la composición comprende menos de o aproximadamente 0.12, 0.10, 0.08, 0.06, 0.04, 0.02, 0.01, 0.005, 0.001, 0.0005, 0.0001, 0.00005 o 0.00001% de hidrocarburos de C5 distintos del isopreno (tal como 1,3-ciclopentadieno, cis-1, 3 -pentadieno, trans-1, 3-pentadieno, 1-pentino, 2-pentino, 1-penteno, 2-metil-l-buteno, 3-metil-l-butino, tans-piperileno, cis-piperileno, pent-4-eno-l-ino, trans-pent-3-eno-l-ino o cis-pent-3-eno-l-ino) en peso comparado con el peso total de todos los hidrocarburos de C5 en la composición. En algunas modalidades, la composición tiene menos de o aproximadamente 0.12, 0.10, 0.08, 0.06, 0.04, 0.02, 0.01, 0.005, 0.001, 0.0005, 0.0001, 0.00005 ó 0.00001% para 1 , 3 -ciclopentadieno, cis-1 , 3 -pentadieno, trans-1 , 3 -pentadieno , 1-pentino, 2-pentino, 1-penteno, 2-metil-l-buteno, 3 -metil-l-butino, trans-piperileno, cis-piperileno, pent-4 -eno-l-ino, trans-pent-3-eno-l-ino o cis-pent-3-eno-l-ino en peso comparado con el peso total de todos los hidrocarburos de C5 en la composición. En modalidades particulares, la composición tiene más de aproximadamente 2 mg de isopreno y tiene más de, o aproximadamente, 99.90, 99.92, 99.94, 99.96, 99.98 ó 100% de isopreno en peso comparado con el peso total de todos los hidrocarburos de C5 en la composición.
En algunas modalidades, la composición tiene menos de o aproximadamente 50, 40, 30, 20, 10, 5, 1, 0.5, 0.1, 0.05, 0.01, o 0.005 ug/L de un compuesto que inhibe la polimerización de isopreno para cualquier compuesto en la composición que inhibe la polimerización de isopreno. En modalidades particulares, la composición también tiene más de aproximadamente 2 mg de isopreno.
En algunas modalidades, la composición tiene uno o más compuestos seleccionados del grupo que consiste de etanol, acetona, alcoholes prenílieos de C5, y compuestos de isoprenoide con 10 o más átomos de carbono. En algunas modalidades, la composición tiene más de, o aproximadamente, 0.005, 0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1, 5, 10, 20, 30, 40, 60, 80, 100 ó 120 ug/L de etanol, acetona, un alcohol prenílico de C5 (tal como 3-metil-3-buten-l-ol o 3-metil-2-buten-l-ol) , o cualesquiera dos o más de los anteriores. En modalidades particulares, la composición tiene más de aproximadamente 2 mg de isopreno y tiene uno o más compuestos seleccionados del grupo que consiste de etanol, acetona, alcoholes prenílicos de C5, y compuestos de isoprenoide con 10 o más átomos de carbono .
En algunas modalidades, la composición incluye isopreno y uno o más segundos compuestos seleccionados del grupo que consiste de 2-heptanona, 6-metil-5-hepten-2-ona, 2, 4, 5-trimetilpiridina, 2 , 3 , 5 -trimetilpirazina , citronelal, acetaldehído, metanotiol, acetato de metilo, 1-propanol, diacetilo, 2-butanona, 2-metil-3-buten-2-ol, acetato de etilo, 2-metil-l-propanol , 3 -metil-l-butanal , 3-metil-2-butanona, 1-butanol, 2-pentanona, 3-metil-l-butanol , isobutirato de etilo, 3-metil-2-butenal, acetato de butilo, 3 -metilacetato de butilo, acetato de 3-metil-3-but-l-enilo, acetato de 3-metil-2-but-l-enilo, (E) -3 , 7-dimetil-l, 3 , 6-octatrieno, (Z) -3 , 7-dimetil -1 , 3 , 6 -octatrieno y 2,3-cicloheptenolpiridina . En varias modalidades, la cantidad de uno de estos segundos componentes relativos a la cantidad de isopreno en unidades de por ciento en peso (es decir, peso del componente dividido entre el peso de isopreno por 100) es a más de, o aproximadamente, 0.01, 0.02, 0.05, 0.1, 0.5, 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 ó 110% (p/p) .
En algunas modalidades, la composición comprende (i) una fase gaseosa que comprende isopreno y (ii) células en cultivo que produce más de aproximadamente 400 nmoles/gwcm/hr de isopreno. En algunas modalidades, la composición comprende un sistema cerrado, y la fase gaseosa comprende más de, o aproximadamente, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 ug/L de isopreno cuando se normaliza a 1 mL de 1 OD6oo cultivado durante 1 hora. En algunas modalidades, la composición comprende un sistema abierto, y la fase gaseosa comprende más de, o aproximadamente, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 ug/L de isopreno cuando es rociada a una velocidad de 1 wm. En algunas modalidades, la fracción orgánica volátil de la fase gaseosa comprende más de, o aproximadamente, 99.90, 99.92, 99.94, 99.96, 99.98 ó 100% de isopreno en peso comparado con el peso total de todos los hidrocarburos de C5 en la fracción orgánica volátil . En algunas modalidades, la fracción orgánica volátil de la fase gaseosa comprende menos de o aproximadamente 0.12, 0.10, 0.08, 0.06, 0.04, 0.02, 0.01, 0.005, 0.001, 0.0005, 0.0001, 0.00005 ó 0.00001% de hidrocarburos de C5 distintos del isopreno (tales como 1 , 3 -ciclopentadieno, cis-1, 3 -pentadieno, trans-l, 3 -pentadieno, 1-pentino, 2-pentino, 1-penteno, 2-metil-l-buteno, 3 -metil-l-butino, trans-piperileno, cis-piperileno, pent-4-eno-l-ino, trans-pent-3-eno-l-ino o cis-pent-3-eno-l-ino) en peso comparado con el peso total de todos los hidrocarburos de C5 en la fracción orgánica volátil. En algunas modalidades, la fracción orgánica volátil de la fase gaseosa has menos de o aproximadamente 0.12, 0.10, 0.08, 0.06, 0.04, 0.02, 0.01, 0.005, 0.001, 0.0005, 0.0001, 0.00005 ó 0.00001% para 1 , 3 -ciclopentadieno, cis-1, 3-pentadieno, trans-1 , 3 -pentadieno, 1-pentino, 2-pentino, 1-penteno, 2-metil-l-buteno, 3-metil-l-butino, trans-piperileno, cis-piperileno, pent-4 -eno- 1- ino, trans-pent-3 -eno-1-??? o cis-pent-3-eno-l-ino en peso comparado con el peso total de todos los hidrocarburos de C5 en la fracción orgánica volátil. En modalidades particulares, la fracción orgánica volátil de la fase gaseosa tiene más de aproximadamente 2 mg de isopreno y tiene más de, o aproximadamente, 99.90, 99.92, 99.94, 99.96, 99.98 ó 100% de isopreno en peso comparado con el peso total de todos los hidrocarburos de C5 en la fracción orgánica volátil.
En algunas modalidades, la fracción orgánica volátil de la fase gaseosa tiene menos de o aproximadamente 50, 40, 30, 20, 10, 5, 1, 0.5, 0.1, 0.05, 0.01 ó 0.005 ug/L de un compuesto que inhibe la polimerización de isopreno para cualquier compuesto en la fracción orgánica volátil de la fase gaseosa que inhibe la polimerización de isopreno. En modalidades particulares, la fracción orgánica volátil de la fase gaseosa también tiene más de aproximadamente 2 mg de isopreno .
En algunas modalidades, la fracción orgánica volátil de la fase gaseosa has uno o más compuestos seleccionados del grupo que consiste de etanol, acetona, alcoholes prenílicos de C5 , y compuestos de isoprenoide con 10 o más átomos de carbono. En algunas modalidades, la fracción orgánica volátil de la fase gaseosa tiene más de, o aproximadamente, 0.005, 0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1, 5, 10, 20, 30, 40, 60, 80, 100 ó 120 ug/L de etanol, acetona, a alcohol prenílico de C5 (tal como 3-metil-3-buten-l-ol o 3-metil-2-buten-l-ol) , o cualesquiera dos o más de los anteriores. En modalidades particulares, la fracción orgánica volátil de la fase gaseosa tiene más de aproximadamente 2 mg de isopreno y tiene uno o más compuestos seleccionados del grupo que consiste de etanol, acetona, alcoholes prenílicos de C5 , y compuestos de isoprenoide con 10 o más átomos de carbono.
En algunas modalidades, la fracción orgánica volátil de la fase gaseosa incluye isopreno y uno o más segundos compuestos seleccionados del grupo que consisten de 2-heptanona, 6-metil-5-hepten-2-ona, 2 , 4 , 5-trimetilpiridina, 2 , 3 , 5-trimetilpirazina, citronelal, acetaldehído, metanotiol, acetato de metilo, 1-propanol, diacetilo, 2-butanona, 2-metil-3-buten-2-ol, acetato de etilo, 2-metil- 1-propanol, 3 -metil-l-butanal , 3-metil-2-butanona, 1-butanol, 2-pentanona, 3-metil-l-butanol , isobutirato de etilo, 3 -metil -2 -butenal , acetato de butilo, 3 -metilacetato de butilo, acetato de 3-metil-3-but-l-enilo, acetato de 3-metil-2-but-l-enilo, (E) -3 , 7-dimetil-l , 3 , 6 -octatrieno, (Z) -3 , 7-dimetil-l , 3,6-octatrieno, y 2 , 3-cicloheptenolpiridina . En varias modalidades, la cantidad de uno de estos segundos componentes relativos a la cantidad de isopreno en unidades de por' ciento en peso (es decir, peso del componente dividido entre el peso de isopreno por 100) es a más de, o aproximadamente, 0.01, 0.02, 0.05, 0.1, 0.5, 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 ó 110% (p/p) en la fracción orgánica volátil de la fase gaseosa.
En algunas modalidades de cualquiera de las composiciones de la invención, por lo menos una porción del isopreno está en una fase gaseosa. En algunas modalidades, por lo menos una porción del isopreno está en una fase líquida (tal como un condensado) . En algunas modalidades, por lo menos una porción del isopreno está en una fase sólida. En algunas modalidades, por lo menos una porción del isopreno es adsorbido a un soporte sólido, tal como un soporte que incluye sílice y/o carbón activado. En algunas modalidades, la composición incluye etanol . En algunas modalidades, la composición incluye de aproximadamente 75 a aproximadamente 90% en peso de etanol, tal como de, aproximadamente 75 a aproximadamente 80%, aproximadamente 80 a aproximadamente 85%, o aproximadamente 85 a aproximadamente 90% en peso de etanol. En algunas modalidades, la composición incluye de aproximadamente 4 a aproximadamente 15% en peso de isopreno, tal como de aproximadamente 4 a aproximadamente 8%, aproximadamente 8 a aproximadamente 12%, o aproximadamente 12 a aproximadamente 15% en peso de isopreno.
En algunas modalidades, la invención también se refiere a sistemas que incluyen cualquiera de las células y/o composiciones descritas aquí. En algunas modalidades, el sistema incluye un reactor cuya cámara comprende células en cultivo que producen más de aproximadamente 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1,000, 1,250, 1,500, 1,750, 2,000, 2,500, 3,000, 4,000, 5,000 o más nmoles/gwcm/hr de isopreno. En algunas modalidades, el sistema no es un sistema cerrado. En algunas modalidades, por lo menos una porción del isopreno es removido del sistema. En algunas modalidades, el sistema incluye una fase gaseosa que comprende isopreno. En varias modalidades, la fase gaseosa comprende cualquiera de las composiciones descritas aquí.
En un aspecto, la invención provee una llanta que comprende poliisopreno . En algunas modalidades, el poliisopreno es producido por (i) polimerización de isopreno en cualquiera de las composiciones descritas aquí o (ii) polimerización de isopreno recuperado de cualquiera de las composiciones descritas aquí. En algunas modalidades, el poliisopreno comprende cis- 1 , 4 -poliisopreno .
En algunas modalidades de cualquiera de las composiciones, sistemas, y métodos de la invención, una concentración de isopreno no inflamable en la fase gaseosa es producida. En algunas modalidades, la fase gaseosa comprende menos de aproximadamente 9.5% (volumen) de oxígeno. En algunas modalidades, la fase gaseosa comprende más de, o aproximadamente, 9.5% (volumen) de oxígeno, y la concentración de isopreno en la fase gaseosa es menor que el límite de inflamabilidad inferior o más del límite de inflamabilidad superior. En algunas modalidades, la porción de la fase gaseosa distinta del isopreno . comprende de aproximadamente 0% a aproximadamente 100% (volumen) de oxígeno, tal como de aproximadamente 10% a aproximadamente 100% (volumen) de oxígeno. En algunas modalidades, la porción de la fase gaseosa distinta del isopreno comprende de aproximadamente 0% a aproximadamente 99% (volumen) de nitrógeno. En algunas modalidades, la porción de la fase gaseosa distintos del isopreno comprende de aproximadamente 1% a aproximadamente 50% (volumen) de C02.
En algunas modalidades de cualquiera de los aspectos de la invención, las células en cultivo producen isopreno a más de, o aproximadamente, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1,000, 1,250, 1,500, 1,750, 2,000, 2,500, 3,000, 4,000, 5,000, o más nmoles/gwcm/hr de isopreno. En algunas modalidades de cualquiera de los aspectos de la invención, las células en cultivo convierten más de, o aproximadamente, 0.002, 0.005, 0.01, 0.02, 0.05, 0.1, 0.12, 0.14, 0.16, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.2, 1.4, 1.6%, o más del carbono en el medio de ? ????? de células a isopreno. En algunas modalidades de cualquiera de los aspectos de la invención, las células en cultivo produce isopreno a más de, o aproximadamente, 1, 10, 25, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1,000, 1,250, 1,500, 1,750, 2,000, 2,500, 3,000, 4,000, 5,000, 10,000, 100,000, o más, ng de isopreno/gramo de células para el peso húmedo de las células/hr (ng/gwcm/hr) . En algunas modalidades de cualquiera de los aspectos de la invención, las células en cultivo producen un título acumulativo (cantidad total) de isopreno a más de, o aproximadamente, 1, 10, 25, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1,000, 1,250, 1,500, 1,750, 2,000, 2,500, 3,000, 4,000, 5,000, 10,000, 50,000, 100,000 o más mg de isopreno/L de caldo (mg/Lcaido, en donde el volumen de caldo incluye el volumen de las células y el medio de las células) . Otras velocidades ilustrativas de producción de isopreno y cantidades totales de producción de isopreno se describen en la presente.
En algunas modalidades de cualquiera de los aspectos de la invención, las células además comprenden un ácido nucleico heterólogo que codifica un polipéptido IDI . En algunas modalidades de cualquiera de los aspectos de la invención, las células además comprenden una inserción de una copia de un ácido nucleico endógeno que codifica un polipéptido IDI. En algunas modalidades de cualquiera de los aspectos de la invención, las células además comprenden un ácido nucleico heterólogo que codifica un polipéptido DXS . En algunas modalidades de cualquiera de los aspectos de la invención, las células además comprenden una inserción de una copia de un ácido nucleico endógeno que codifica un polipéptido DXS. En algunas modalidades de cualquiera de los aspectos de la invención, las células además comprenden uno o más ácidos nucleicos que codifican un polipéptido IDI y un polipéptido DXS . En algunas modalidades de cualquiera de los aspectos de la invención, un ácido nucleico codifica el polipéptido de isopreno sintasa, polipéptido IDI, y polipéptido DXS. En algunas modalidades de cualquiera de los aspectos de la invención, un vector que codifica el polipéptido de isopreno sintasa, polipéptido IDI, y polipéptido DXS. En algunas modalidades, el vector comprende un marcador selectivo, tal como un ácido nucleico de resistencia a antibióticos.
En algunas modalidades de cualquiera de los aspectos de la invención, el ácido nucleico de isopreno sintasa heterólogo está operablemente enlazado a un promotor T7 , tal como un promotor T7 contenido en un plásmido de copia media o alta. En algunas modalidades de cualquiera de los aspectos de la invención, el ácido nucleico de isopreno sintasa heterólogo está operablemente enlazado a un promotor Trc, tal como un promotor Trc contenido en un plásmido de copia media o alta. En algunas modalidades de cualquiera de los aspectos de la invención, el ácido nucleico de isopreno sintasa heterólogo está operablemente enlazado a un promotor Lac, tal como un promotor Lac contenido en un plásmido de copia baja. En algunas modalidades de cualquiera de los aspectos de la invención, el ácido nucleico de isopreno sintasa heterólogo está operablemente enlazado a un promotor endógeno, tal como un promotor de serina proteasa alcalina endógeno. En algunas modalidades, el ácido nucleico de isopreno sintasa heterólogo se integra en un cromosoma de las células sin un marcador selectivo.
En algunas modalidades, uno o más ácidos nucleicos de la vía de MVA, IDI, DXP o isopreno sintasa son puestos bajo el control de un promotor o factor que es más activo en la fase estacionaria que en la fase de crecimiento. Por ejemplo, uno o más ácidos nucleicos de la vía de MVA, IDI, DXP o isopreno sintasa pueden ser puestos bajo control de un factor sigma de fase estacionaria, tal como RpoS . En algunas modalidades, uno o más ácidos nucleicos de la vía de MVA, IDI, DXP o isopreno sintasa son puestos bajo control de un promotor inducible en fase estacionaria, tal como un promotor inducible por un activo regulador de respuesta en fase estacionaria .
En algunas modalidades de cualquiera de los aspectos de la invención, por lo menos una porción de las células mantiene el ácido nucleico de isopreno sintasa heterólogo para por lo menos o aproximadamente 5, 10, 20, 40, 50, 60, 65, o más divisiones celulares en un cultivo continuo (tal como un cultivo continuo sin dilución) . En algunas modalidades de cualquiera de los aspectos de la invención, el ácido nucleico que comprende el ácido nucleico de isopreno sintasa, IDI o DXS también comprende un marcador selectivo, tal como un ácido nucleico de resistencia a antibióticos.
En algunas modalidades de cualquiera de los aspectos de la invención, las células además comprenden un ácido nucleico heterólogo que codifica un polipéptido de la vía de MVA (tal como un polipéptido de la vía de MVA de Saecharomyees cerevisiae o Enterococcus faecalis) . En algunas modalidades de cualquiera de los aspectos de la invención, las células además comprenden una inserción de una copia de un ácido nucleico endógeno que codifica un polipéptido de la vía de MVA (tal como un polipéptido de la vía de MVA de Saccharomyces cerevisiae o Enterococcus faecalis) . En algunas modalidades de cualquiera de los aspectos de la invención, las células comprenden un ácido nucleico de isopreno sintasa, DXS y vía de MVA. En algunas modalidades de cualquiera de los aspectos de la invención, las células comprenden un ácido nucleico de isopreno sintasa, un ácido nucleico de DXS, un ácido nucleico de IDI y un ácido nucleico de la vía de MVA (además del ácido nucleico de IDI) .
En algunas modalidades de cualquiera de los aspectos de la invención, el polipéptido de isopreno sintasa es un polipéptido que ocurre naturalmente de una planta tal como Pueraria (v.gr., Pueraria montana o Pueraria lobata) .
En algunas modalidades de cualquiera ¦ de los aspectos de la invención, las células son células bacterianas, tales como células bacterianas gram-positivas (v.gr., células de Bacillus tales como células de Bacillus subtilis o células de Streptomyces tales como células de Streptomyces lividans, Streptomyces coelicolor, o Streptomyces griseus) . En algunas modalidades de cualquiera de los aspectos de la invención, las células son células bacterianas gram-negativas (v.gr., células de . Escherichia tales como células de Escherichia coli o células de Pantoeá tales como células de Pantoea citrea) . En algunas modalidades de cualquiera de los aspectos de la invención, las células son células de hongos tales como células de hongos filamentosos (v.gr., células de Trichoderma tales como células de Trichoderma reesei o células de Aspergillüs tales como Aspergillüs oryzae y Aspergillüs niger) o células de levadura (v.gr., células de Yarrowia tales como células de Yarrowia lypolitica) .
En algunas modalidades de cualquiera de los aspectos de la invención, la fuente de carbono de polipéptido microbiano incluye uno o más polipéptidos de levadura o bacterias. En algunas modalidades de cualquiera de los aspectos de la invención, la fuente de carbono de polipéptido vegetal incluye uno o más polipéptidos de soya, maíz, cañóla, jatrofa, palmera, cacahuate, girasol, coco, mostaza, semilla de colza, semilla de algodón, semilla de palmera, olivo, cártamo, ajonjolí o semilla de linaza. ' En un aspecto, la invención se refiere a un producto producido por cualquiera de las composiciones o métodos de la invención.
Breve Descripción de las Figuras La figura 1 es la secuencia de nucleótidos de un gen de isopreno sintasa de kudzu optimizado en codón para expresión en E. coli (SEQ ID N0:1) . El codón de inicio de atg está en cursivas, el codón de detención está en negrillas y el sitio de Pstl añadido está subrayado.
La figura 2 es un mapa de pTrcKudzu.
Las figuras 3A a 3C son la secuencia de nucleótidos de pTrcKudzu (SEQ ID NO: 2) . El RBS está subrayado, el codón de inicio de isopreno sintasa de kudzu está en mayúsculas negrillas y el codón de detención está en negrillas, mayúsculas, cursivas. El esqueleto del vector es pTrcHis2B.
La figura 4 es un mapa de pETNHisKudzu .
Las figuras 5A a 5C son la secuencia de nucleótidos de pETNHisKudzu (SEQ ID NO: 5) .
La figura 6 es un mapa de pCL-lac-Kudzu.
Las figuras 7A a 7C son la secuencia de nucleótidos de pCL-lac-Kudzu (SEQ ID NO: 7) .
La figura 8A es una gráfica que muestra la producción de isopreno en células de E. coli BL21 sin vector.
La figura 8B es una gráfica que muestra la producción de isopreno en células de E. coli BL21 con pCL-lac-Kudzu La figura 8C es una gráfica que muestra la producción de isopreno en células de E. coli BL21 con pTrcKudzu .
Laa figura 8D es una gráfica que muestra la producción de isopreno en células de E. coli BL21 con pETN-HisKudzu.
La figura 9A es una gráfica que muestra OD sobre el tiempo de fermentación de E. coli BL21/pTrcKudzu en una fermentación de lote de alimentación de 14 litros.
La figura 9B es una gráfica que muestra la producción de isopreno sobre el tiempo de fermentación de E. coli BL21/pTrcKudzu en una fermentación de lote de alimentación de 14 litros.
La figura 10A es una gráfica que muestra la producción de isopreno en Panteoa citrea. Las células de control isopreno sintasa de sin kudzu recombinante . Los diamantes grises representan síntesis de isopreno, los cuadros negros representan OD60o- La figura 10B es una gráfica que muestra la producción de isopreno en Panteoa citrea que expresan pCL-lac Kudzu. Los diamantes grises representan síntesis de isopreno, los cuadros negros representan OD60o- La figura 10C es una gráfica que muestra la producción de isopreno en Panteoa citrea que expresa pTrcKudzu. Los diamantes grises representan síntesis de isopreno, los cuadros negros representan OD60o- La figura 11 es una gráfica que muestra la producción de isopreno en Bacillus subtilis que expresa isopreno sintasa recombinante . BG3594comK es una cepa de B. subtilis sin plásmido (producción de isopreno nativo) . CF443-BG3594comK es unba cepa de B. subtilis con pBSKudzu (producción de isopreno recombinante) . IS en el eje Y indica isopreno.
Las figuras 12A a 12C son la secuencia de nucleótidos de pBS Kudzu #2 (SEQ ID NO: 57) .
La figura 13 es la secuencia de nucleótidos de isopreno sintasa de kudzu optimizada en codón para expresión en Yarrowia (SEQ ID NO: 8) .
La figura 14 es un mapa de pTrex3g que comprende un gen de isopreno sintasa de kudzu optimizado en codón para expresión en Yarrowia .
Las figuras 15A a 15C son la secuencia de nucleótidos del vector pSPZl (MAP29Spb) (SEQ ID NO: 11) .
La figura 16 es la secuencia de nucleótidos del gen de isopreno de kudzu sintético {Pueraria montana) optimizado en codón para expresión en Yarrowia (SEQ ID NO: 12) .
La figura 17 es la secuencia de nucleótidos del gen de isopreno sintasa de álamo blanco híbrido sintético (Populus alba x Populus trémula) (SEQ ID NO : 13) . El codón de inicio de ATG está en negrillas 'y el codón de detención está subrayado .
La figura 18A muestra una construcción delineadora esquemática de los vectores pYLA 1, pYLl y pYL2.
La figura 18B muestra una construcción delineadora esquemática del vector pYLA(POPl) .
La figura 18C muestra una construcción delineadora esquemática del vector pYLA(KZl) .
La figura 18D muestra una construcción delineadora esquemática del vector pYLl (KZ1) .
La figura 18E muestra una construcción delineadora esquemática del vector pYLl (MAP29 ) .
La figura 18F muestra una construcción delineadora esquemática del vector pYLA(MAP29) .
La figura 19 muestra las vías metabólicas de MVA y DXP para isopreno (basado en F. Bouvier et al., Progress in Lipid Res. 44: 357-429, 2005). La siguiente descripción incluye nombres alternativos para cada polipéptido en las vías y una referencia que describe una prueba para medir la actividad del polipéptido indicado (cada una de estas referencias son incorporadas cada una por referencia en su totalidad, particularmente con respecto a pruebas para actividad de polipéptido para polipéptidos en las vías de MVA y DXP) . Vía de Mevalonato : AACT; Acetil-CoA acetiltransferasa, MvaE, EC 2.3.1.9. Assay: J. Bacteriol . , 184: 2116-2122, 2002; HMGS ; Hidroximetilglutaril-CoA sintasa, MvaS, EC 2.3.3.10. Assay: J. Bacteriol., 184: 4065-4070, 2002; HMGR; 3-Hidroxi-3-metilglutaril-CoA reductasa, MvaE, EC 1.1.1.34. Assay: J. Bacteriol., 184: 2116-2122, 2002; VK; Mevalonato cinasa, ERG12, EC 2.7.1.36. Assay: Curr Genet 19:9-14, 1991. PMK; Fosfomevalonato cinasa, ERG8 , EC 2.7.4.2, Assay: Mol Cell Biol, 11:620-631, 1991; DPMDC; Difosfomevalonato descarboxilasa, MVDl, EC 4.1.1.33. Assay: Biochemistry, 33:13355-13362, 1994; IDI ; Isopentenil-difosfate delta- isomerasa, IDIl, EC 5.3.3.2. Assay: J. Biol. Chem. 264:19169-19175, 1989. DXP Pathway. DXS ; 1-Desoxixilulosa-5-fosfato sintasa, dxs, EC 2.2.1.7. Assay: PNAS, 94:12857-62, 1997; DXR; 1-Deoxi-D-xilulosa 5-fosfato reductoisomerasa, dxr, EC 2.2.1.7. Assay: Eur. J. Biochem. 269:4446-4457, 2002; MCT; 4-DifosfOCÍtÍdil-2C-metÍl-D-eritritol sintasa, IspD, EC 2.7.7.60. Assay: PNAS, 97: 6451-6456, 2000; CMK; 4 -Difosfocitidil -2 -C-metil-D-eritritol cinasa, IspE, EC 2.7.1.148. Assay: PNAS, 97:1062-1067, 2000; MCS; 2 , 4 -ciclodifosfato de 2C-Metil -D-eritritol sintasa, IspF, EC 4.6.1.12. Assay: PNAS, 96:11758-11763, 1999; HDS ; 4-difosfato de l-Hidroxi-2-metil-2- (E) -butenilo sintasa, ispG, EC 1.17.4.3. Assay: J. Org. Chem., 70:9168 -9174, 2005; HDR; 4-difosfato de 1 -Hidroxi -2 -metil -2 - (E) -butenilo reductasa, IspH, EC 1.17.1.2. Assay: JACS, 126:12847-12855, 2004.
Las figuras 20A a 20B muestran gráficas que representan resultados del análisis de GC-MS de producción de isopreno por cepas de Y. lypolitica recombinantes sin (figura 20A) o con (figura 20B) un gen de isopreno sintasa de kudzu. Las flechas indican el tiempo de elución del estándar de isopreno auténtico.
La figura 21 es un mapa de pTrcKudzu yIDI DXS Kan. Las figuras 22A a 22D son la secuencia de nucleótidos de pTrcKudzu yIDI DXS Kan (SEQ ID NO: 20) .
La figura 23A es una gráfica que muestra la producción de isopreno de glucosa en BL21/pTrcKudzukan. El tiempo 0 es el tiempo de inducción con IPTG (400 µp\?1) . El eje x es el tiempo después de la inducción; el eje y es OD60o y el eje y2 es la productividad total de isopreno (ug/L de espacio superior o productividad específica (]ig/l¡ de espacio superior/OD) . Los diamantes representan OD6oo/ los círculos representan productividad total de isopreno (pg/L) y los cuadros representan productividad específica de isopreno (ug/L/OD) .
La figura 23B es una gráfica que muestra la producción de isopreno de glucosa en BL2l/pTrcKudzu yIDI kan. El tiempo 0 es el tiempo de inducción con IPTG (400 ymol) . El eje x es el tiempo después de inducción; el eje y es OD6oo y el eje y2 es productividad total de isopreno ( g/L de espacio superior o productividad específica ( g/L de espacio superior/OD) . Los diamantes representan OD60o/ los círculos representan productividad total de isopreno ( g/L) y los cuadros representan productividad específica de isopreno (pg/L/OD) .
La figura 23C es una gráfica que muestra la producción de isopreno a partir de glucosa en BL2l/pTrcKudzu DXS kan. El tiempo 0 es el tiempo de inducción con IPTG (400 mol) . El eje x es el tiempo después de inducción; el eje y es OD6oo y el eje y2 es productividad total de isopreno (yg/L de espacio superior o productividad específica ( g/L de espacio superior/OD) . Los diamantes representan OD6oo( los círculos representan productividad total de isopreno (pg/L) y los cuadros representan productividad específica de isopreno (Ug/L/OD) .
La figura 23D es una gráfica que muestra la producción de isopreno a partir de glucosa en BL21/pTrcKudzu yIDI DXS kan. El tiempo 0 es el tiempo de inducción con IPTG (400 µt???) . El eje x es el tiempo después de inducción; el eje y es OD600 y el eje y2 es productividad total de isopreno ( g/L de espacio superior o productividad específica (pg/L de espacio superior/OD) . Los diamantes representan OD600, los círculos representan productividad total de isopreno ( g/L) y los cuadros representan productividad específica de isopreno (ug/L/OD) .
La figura 23E es una gráfica que muestra la producción de isopreno a partir de glucosa en BL21/pCL PtrcKudzu. El tiempo 0 es el tiempo de inducción con IPTG (400 pmol) . El eje x es el tiempo después de inducción; el eje y es OD60Q y el eje y2 es productividad total de isopreno (pg/L de espacio superior o productividad específica (pg/L de espacio superior/OD) . Los diamantes representan OD6oo, los círculos representan productividad total de isopreno (pg/L) y los cuadros representan productividad específica de isopreno (pg/L/OD) .
La figura 23F es una gráfica que muestra la producción de isopreno a partir de glucosa en BL21/pCL PtrcKudzu yIDI . El tiempo 0 es el tiempo de inducción con IPTG (400 pmol) . El eje x es el tiempo después de inducción; el eje y es OD6oo y el eje y2 es productividad total de isopreno (pg/L de espacio superior o productividad específica (pg/L de espacio superior/OD) . Los diamantes representan OD600 / los círculos representan productividad total de isopreno (pg/L) y los cuadros representan productividad específica de isopreno (pg/L/OD) .
La figura 23G es una gráfica que muestra la producción de isopreno a partir de glucosa en BL21/pCL PtrcKudzu DXS . El tiempo 0 es el tiempo de inducción con IPTG (400 mol) . El eje x es el tiempo después de inducción; el eje y es OD60o y el eje y2 es productividad total de isopreno (pg/L de espacio superior o productividad específica (pg/L de espacio superior/OD) . Los diamantes representan OD60o/ los círculos representan productividad total de isopreno (pg/L) y los cuadros representan productividad específica de isopreno (pg/L/OD) .
La figura 23H es una gráfica que muestra la producción de isopreno a partir de glucosa en BL2l/pTrcKudzuIDIDXSkan. La flecha indica el tiempo de inducción con IPTG (400 ymol) . El eje x es el tiempo después de inducción; el eje y es OD600 y el eje y2 es productividad total de isopreno (pg/L de espacio superior o productividad específica (pg/L de espacio superior/OD) . Los diamantes negros representan OD600 , los triángulos negros representan productividad de isopreno (pg/L) y los cuadros blancos representan productividad específica de isopreno (pg/L/OD) .
La figura 24 es un mapa de pTrcKKDylklS kan.
Las figuras 25A a 25D son una secuencia de nucleótidos de pTrcKKDylklS kan (SEQ ID NO-.33).
La figura 26 es un mapa de pCL PtrcUpperPathway.
La figuras 27A-27D son una secuencia de nucleótidos de pCL PtrcUpperPathway (SEQ ID NO: 46) .
La figura 28 muestra un mapa del cásete que contiene la vía de MVA inferior y idi de levadura para integración en el cromosoma de B. subtilis en el locus nprE. nprE en dirección 5 '/en dirección 3' indica 1 kb cada una de secuencia del locus nprE para integración. El promotor aprE j (promotor de serina proteasa alcalina) indica el promotor (-35, -10, +1 sitio de inicio de transcripción, RBS) del gen aprE. MVKl indica el gen de mevalonato cinasa de levadura. RBS-P K indica el gen de fosfomevalonto cinasa de levadura con un RBS de Bacillus en dirección 5' del sitio de inicio. RBS-MPD indica el gen de difosfomevalonato descarboxilasa de levadura con un RBS de Bacillus en dirección 5' del sitio de inicio. RBS-IDI indica el gen idi de levadura con un RBS de Bacillus en dirección 5' del sitio de inicio. El terminador indica el terminador de transcripción de serina proteasa alcalina de B. amyliquefaciens. SpecR indica el marcador de resistencia a espectinomicina . "nprE en dirección 5' se repite para amp" indica una repetición directa de la región en dirección 5' usada para amplificación.
Las figuras 29A a 29D son una secuencia de nucleótidos de cásete que contiene la vía de MVA más baja y idi de levadura para integración en el cromosoma de B. subtilis en el locus nprE (SEQ ID NO:47) .
La figura 30 es un mapa de p9796 -poplar .
Las figuras 31A a 31B son una secuencia de nucleótidos de p9796-poplar (SEQ ID NO:48) .
La figura 32 es un mapa de pTrcPoplar.
Las figuras 33A a 33C son una secuencia de nucleótidos de pTrcPoplar (SEQ ID NO: 49) .
La figura 34 es un mapa de pTrcKudzu yIDI Kan.
Las figuras 35A a 35C son una secuencia de nucleótidos de pTrcKudzu yIDI Kan (SEQ ID NO: 50) .
La figura 36 es un mapa de pTrcKudzuDXS Kan.
Las figuras 37A a 37C son una secuencia de nucleótidos de pTrcKudzuDXS Kan (SEQ ID NO: 51) .
La figura 38 es un mapa de pCL PtrcKudzu.
Las figuras 39A a 39C son una secuencia de nucleótidos de pCL PtrcKudzu (SEQ ID NO:52).
La figura 40 es un mapa de pCL PtrcKudzu A3.
Las figuras 41A a 41C son una secuencia de nucleótidos de pCL PtrcKudzu A3 (SEQ ID NO:53).
La figura 42 es un mapa de pCL PtrcKudzu yIDI.
Las figuras 43A a 43C son una secuencia de nucleótidos de pCL PtrcKudzu yIDI (SEQ ID NO:54).
La figura 44 es un mapa de pCL PtrcKudzu DXS.
Las figuras 45A a 45D son una secuencia de nucleótidos de pCL PtrcKudzu DXS (SEQ ID NO: 55) .
Las figuras 46A a 46E muestran gráficas que representan producción de isopreno a partir de materiales de alimentación de biomasa. La figura 46A muestra la producción de isopreno a partir de rastrojo de maíz, la figura 46B muestra la producción de isopreno a partir de bagazo, la figura 46C muestra la producción de isopreno a partir de pulpa de madera, la figura 46D muestra la producción de isopreno a partir de glucosa, y el panel E muestra la producción de isopreno a partir de células sin material de alimentación adicional. Los cuadros grises representan mediciones de OD60o de los cultivos en los tiempos indicados después de la inoculación y los triángulos negros representan la producción de isopreno en los tiempos indicados después de la inoculación.
La figura 47A muestra una gráfica que representa la producción de isopreno por BL21 (ADE3) pTrcKudzu yIDI DXS (kan) en un cultivo sin glucosa añadida. Los cuadros representan OD60o/ y los triángulos representan isopreno producido ( g/ml) .
La figura 47B muestra una gráfica que representa producción de isopreno a partir de 1% de azúcar invertido de material de alimentación de glucosa por BL21 (XDE3) pTrcKudzu yIDI DXS (kan) . Los cuadros representan OD60o/ y los triángulos representan isopreno producido (pg/ml) .
La figura 47C muestra una gráfica que representa producción de isopreno a partir de 1% de material de alimentación de azúcar invertido por BL21 (ADE3) pTrcKudzu yIDI DXS (kan) . Los cuadros representan OD6oo, y los triángulos representan isopreno producido ( g/ml) .
La figura 47D muestra una gráfica que representa producción de isopreno a partir de 1% de material de alimentación derastrojo de maíz AFEX por BL21 (ADE3) pTrcKudzu yIDI DXS (kan) . Los cuadros representan OD6oo, y los triángulos representan isopreno producido (pg/ml) .
Las figuras 48A a 48C muestran gráficas que demuestran el efecto de extracto de levadura de producción de isopreno. La figura 48A muestra el curso de tiempo de densidad óptica dentro de los fermentadores alimentados con cantidades variables de extracto de levadura. La figura 48B muestra el curso de tiempo de título de isopreno dentro de los termentadores alimentados con cantidades variables de extracto de levadura. El título se define como la cantidad de isopreno producido por litro de caldo de fermentación. La figura 48C muestra el efecto del extracto de levadura sobre la producción de isopreno en E. coli que crece en cultivo de lotes alimentados.
Las figuras 49A a 49C muestran gráficas que demuestran la producción de isopreno a partir de un biorreactor de 500 L con células de E. coli que contiene el plásmido pTrcKudzu + yIDI + DXS . La figura 49A muestra el curso de tiempo de densidad óptica dentro del biorreactor de 500 L alimentado con glucosa y extracto de levadura. La figura 49B muestra el curso de tiempo de título de isopreno dentro del biorreactor de 500 L alimentado con glucosa y extracto de levadura. El título se define como la cantidad de isopreno producido por litro de caldo de fermentación. La figura 49C muestra el curso de tiempo de total isopreno producido a partir del biorreactor de 500 L alimentado con glucosa y extracto de levadura.
La figura 50 es un mapa de pJMupperpathway2.
Las figuras 51A a 51C son la secuencia de nucleótidos de pJ upperpathway2 (SEQ ID NO: 56) .
La figura 52· es un mapa de pBS Kudzu #2.
La figura 53A es una gráfica que muestra crecimiento durante el tiempo de fermentación de Bacillus que expresan isopreno sintasa de kudzu recombinante en fermentación en lote de alimentación de 14 L. Los diamantes negros representan una cepa de control (BG3594comK) sin isopreno sintasa recombinante (producción de isopreno nativo) y los triángulos grises representan Bacillus con pBSKudzu (producción de isopreno recombinante) .
La figura 53B es una gráfica que müestra la producción de isopreno durante el tiempo de fermentación de Bacillus que expresa isopreno sintasa de kudzu recombinante en fermentación en lote de alimentación de 14 L. Los diamantes negros representan una cepa de control (BG3594comK) sin isopreno sintasa recombinante (producción de isopreno nativo) y los triángulos grises representan Bacillus con pBSKudzu (producción de isopreno recombinante) .
La figura 54 es un curso de tiempo de densidad óptica dentro del biorreactor de 15 L alimentado con glucosa.
La figura 55 es un curso de tiempo de título de isopreno dentro del biorreactor de 15 L alimentado con glucosa. El título se define como la cantidad de isopreno producido por litro de caldo de fermentación.
La figura 56 es un curso de tiempo de total isopreno producido a partir del biorreactor de 15 L alimentado con glucosa.
La figura 57 es un curso de tiempo de densidad óptica dentro del biorreactor de 15 L alimentado con glicerol .
La figura 58 es un curso de tiempo de título de isopreno dentro del biorreactor de 15 L 'alimentado con glicerol. El título se define como la cantidad de isopreno producido por litro de caldo de fermentación.
La figura 59 es un curso de tiempo de total isopreno producido a partir del- biorreactor de 15 L alimentado con glicerol.
Las figuras 60A-60C son los cursos de tiempo de densidad óptica, título de ácido mevalónico, y productividad específica dentro del biorreactor de 150 L alimentado con glucosa.
Las figuras 61A-61C son los cursos de tiempo de densidad óptica, título de ácido mevalónico, y productividad específica dentro del biorreactor de 15 L alimentado con glucosa .
Las figuras 62A-62C son los cursos de tiempo de densidad óptica, título de ácido mevalónico, y productividad específica dentro del biorreactor de 15 L alimentado con glucosa .
Las figuras 63A-63C son los cursos de tiempo de densidad óptica, título de isopreno, y productividad específica dentro del biorreactor de 15 L alimentado con glucosa .
Las figuras 64A-64C son los cursos de tiempo de densidad óptica, título de isopreno, y productividad específica dentro del biorreactor de 15 L alimentado con glucosa .
Las figuras 65A-65C son los cursos de tiempo de densidad óptica, título de isopreno, y productividad específica dentro del biorreactor de 15 L alimentado con glucosa .
Las figuras 66A-66C son los cursos de tiempo de densidad óptica, título de isopreno, y productividad específica dentro del biorreactor de 15 L alimentado con glucosa .
Las figuras 67A-67C son los cursos de tiempo de densidad óptica, título de isopreno, y productividad específica dentro del biorreactor de 15 L alimentado con glucosa .
La figura 68 es una gráfica de las temperaturas de llama adiabática calculadas para la serie A como una función de concentración de combustible para varios niveles de oxígeno. Las leyendas de figura listan las curves en el orden en el que aparecen en la gráfica. Por ejemplo, la primera entrada en las leyendas de figura (isopreno en aire a 40°C) corresponde a la curva más alta en la gráfica.
La figura 69 es una gráfica de las temperaturas de llama adiabática calculadas para la serie B como una función de concentración de combustible para varios niveles de oxígeno con 4% de agua. Las leyendas de figura listan las curvas en el orden en el que aparecen en la gráfica.
La figura 70 es una gráfica de las temperaturas de llama adiabática calculadas para la serie C como una función de concentración de combustible para varios niveles de oxígeno con 5% de C02. Las leyendas de figura listan las curvas en el orden en el que aparecen en la gráfica.
La figura 71 es una gráfica de las temperaturas de llama adiabática calculadas para la serie D como una función de concentración de combustible para varios niveles de oxígeno con 10% de C02. Las leyendas de figura listan las curvas en el orden en el que aparecen en la gráfica.
La figura 72 es una gráfica de las temperaturas de llama adiabática calculadas para la serie E como una función de concentración de combustible para varios niveles de oxígeno con 15% de C02. Las leyendas de figura listan las curvas en el orden en el que aparecen en la gráfica.
La figura 73 es una gráfica de las temperaturas de llama adiabática calculadas para la serie F como una función de concentración de combustible para varios niveles de oxígeno con 20% de C02. Las leyendas de figura listan las curvas en el orden en el que aparecen en la gráfica.
La figura 74 es una gráfica de las temperaturas de llama adiabática calculadas para la serie G como una función de concentración de combustible para varios niveles de oxígeno con 30% de CO2. Las leyendas de figura listan las curvas en el orden en el que aparecen en la gráfica.
La figura 75A es una mesa de la conversión de los resultados de modelo resultados del modelo CAFT a partir del por ciento en peso a por ciento en volumen para la serie A.
La figura 75B es una gráfica de los resultados de inflamabilidad del modelo resultados del modelo CAFT para la serie A en la figura 68 graficada como por ciento en volumen.
La figura 76A es una tabla de conversión del resultados del modelo de CAFT del por ciento en peso a por ciento en volumen para la serie B.
La figura 76B es una gráfica de los resultados de inflamabilidad a partir de los resultados del modelo CAFT para la serie B en la figura 69 graficadas como por ciento en volumen .
La figura 77 es una figura del recipiente de prueba de inflamabilidad.
La figura 78A es una gráfica de la curva de inflamabilidad para la serie de prueba 1: 0% de vapor, 0 de psig, y 40°C.
La figura 78B es una tabla que resume los puntos de datos de explosión y no explosión para la serie de prueba 1.
La figura 78C es una gráfica de la curva de inflamabilidad para la serie de prueba 1 comparada con los resultados del modelo de CAFT.
La figura 79A es una gráfica de la curva de inflamabilidad para la serie de prueba 2: 4% de vapor, 0 kg/cm2 manométricos , y 40°C.
La figura 79B es una tabla que resume los puntos de datos de explosión y no explosión para la serie de prueba 2.
La figura 79C es una gráfica de la curva de inflamabilidad para la serie de prueba 2 comparada con los resultados del modelo de CAFT.
Las figuras 80A y 80B son una tabla de las condiciones experimentales detalladas y resultados para la serie de prueba 1.
La figura 81 es una tabla de las condiciones experimentales detalladas y resultados para la serie de prueba 2.
La figura 82 es una gráfica de la temperatura de llama adiabática calculada graficada como una función de concentración de combustible para varias relaciones de nitrógeno/oxígeno a 3 atmósferas de presión.
La figura 83 es una gráfica de la temperatura de llama adiabática calculada graficada como una función de concentración de combustible para varias relaciones de nitrógeno/oxígeno a 1 atmósfera de presión.
La figura 84 es una gráfica de la envoltura de inflamabilidad construida al usar datos de la figura 82 y que sigue la metodología descrita en el ejemplo 13. Los puntos de datos experimentales (círculos) son de las pruebas descritas aquí que se condujeron a una presión del sistema inicial de 1 atmósfera.
La figura 85 es una gráfica de la envoltura de inflamabilidad construida al usar datos de la figura 83 y al seguir la metodología descrita en el ejemplo 13. Los puntos de datos experimentales (círculos) son de las pruebas descritas aquí que se condujeron a una presión del sistema inicial de 1 atmósfera.
La figura 86A es un cromatograma de GC/MS de gas desprendido de la fermentación.
La figura 86B es una expansión de la figura 86A para mostrar compuestos volátiles menores presentes en el gas desprendido de la fermentación.
La figura 87A es un cromatograma de GC/MS de compuestos volátiles traza presentes en gas desprendido después de crio-atrapamiento a -78°C.
La figura 87B es un cromatograma de GC/MS de compuestos volátiles traza presentes en gas de desprendimiento después de crio-atrapamiento a -196°C.
La figura 87C es una expansión de la figura 87B. La figura 87D es una expansión de la figura 87C. Las figuras 88A y 88B son cromatograma de GC/MS que compara hidrocarburos de C5 a partir de isopreno derivado del petróleo (figura 88A) e isopreno biológicamente producido (figura 88B) . El estándar contiene tres impurezas de hidrocarburo de C5 que eluye alrededor del pico de isopreno principal (figura 88A) . Por el contrario, isopreno biológicamente producido que contiene cantidades de etanol y acetona (tiempo de corrimiento de 3.41 minutos) (figura 88A) .
La figura 89 es una gráfica del análisis de gas de desprendimiento de la fermentación de una cepa BL21 (DE3) pTrcIS de E. coli que expresa una isopreno sintasa de Kudzu y glucosa alimentada con 3 g/L de extracto de levadura.
La figura 90 muestra las estructuras de varias impurezas que son estructuralmente similares a isopreno y también pueden actuar como venenos catalizadores de polimerización.
La figura 91 es un mapa de pTrcHis2AUpperPathway (también llamado pTrcUpperMVA) .
Las figuras 92A-92C son la secuencia de nucleótidos de pTrcHis2AUpperPathway (también llamado pTrcUpperMVA) (SEQ ID NO: 86) .
La figura 93 es un curso de tiempo de densidad óptica dentro del biorreactór de 15 L alimentado con glucosa.
La figura 94 es un curso de tiempo de título de isopreno dentro del biorreactor de 15 L alimentado con glucosa. El título se define como la cantidad de isopreno producido por litro de caldo de fermentación.
La figura 95 es un curso de tiempo de total isopreno producido a partir del biorreactor de 15 L alimentado con glucosa.
La figura 96 es un curso de tiempo de densidad óptica dentro del biorreactor de 15 L alimentado con azúcar invertido .
La figura 97 es un curso de tiempo de título de isopreno dentro del biorreactor de 15 L alimentado con azúcar invertido. El título se define como la cantidad de isopreno producido por litro de caldo de fermentación.
La figura 98 es un curso de tiempo de total isopreno producido a partir del biorreactor de 15 L alimentado con azúcar invertido.
La figura 99 es un curso de tiempo de densidad óptica dentro del biorreactor de 15 L alimentado con glucosa.
La figura 100 es un curso de tiempo de título de isopreno dentro del biorreactor de 15 L alimentado con glucosa. El título se define como la cantidad de isopreno producido por litro de caldo de fermentación.
La figura 101 es un curso de tiempo de actividad específica de isopreno a partir del biorreactor de 15 L alimentado con glucosa.
La figura 102 es un mapa de pCLPtrcUpperPathwayHGS2.
Las figuras 103A-103C son la secuencia de nucleótidos de pCLPtrcUpperPathwayHGS2 (SEQ ID NO: 87) .
La figura 104 es un curso de tiempo de densidad óptica dentro del biorreactor de 15 L alimentado con glucosa.
La figura 105 es un curso de tiempo de título de isopreno dentro del biorreactor de 15 L alimentado con glucosa. El título se define como la cantidad de isopreno producido por litro de caldo de fermentación.
La figura 106 es un curso de tiempo de total isopreno producido a partir del biorreactor de 15 L alimentado con glucosa.
La figura 107 es un mapa de plásmido MCM330.
Las figuras 108A-108C son la secuencia de nucleótidos de plásmido MCM330 (SEQ ID NO: 90) .
La figura 109 es un mapa de pET24D-Kudzu .
Las figuras 110A y 110B son la secuencia de nucleótidos de pET24D-Kudzu (SEQ ID NO:101).
La figura 111A es un curso de tiempo de densidad óptica dentro del biorreactor de 15 L alimentado con glucosa.
La figura 111B es un curso de tiempo de título de isopreno dentro del biorreactor de 15 L alimentado con glucosa. El título se define como la cantidad de isopreno prpducido por litro de caldo de fermentación.
La figura 111C es un curso de tiempo de productividad específica de isopreno en el biorreactor de 15 L alimentado con glucosa.
Descripción Detallada de la Invención En un aspecto, la invención se refiere a composiciones y métodos para la producción de isopreno en cantidades y/o pureza incrementadas. Como se usa en la presente, el término "isopreno" o "2 -metil- 1 , 3 -butadieno" (CAS# 78-79-5) se refiere al producto de hidrocarburo de C5 volátil directo y final a partir de la eliminación de pirofosfato a partir de pirofosfato de 3 , 3 -dimetilalilo (DMAPP) , y no implica el enlace o polimerización de una o más moléculas de difosfato de isopentenilo (IPP) a una o más moléculas de DMAPP.
La vasta mayoría de isopreno se deriva de fuentes petroquímicas como una fracción de hidrocarburo de C5 impura que requiere purificación extensiva antes de que el material sea adecuado para la polimerización. Varias impurezas son particularmente problemáticas dada su similitud estructural a isopreno y el hecho de que pueden actuar como venenos catalizadores de polimerización. Dichos compuestos incluyen 1, 3-ciclopentadieno, cis- y trans-1, 3-pentadieno, 1-pentino, 2-pentino, 3-metil-l-butino, trans-piperileno, cis-piperileno, pent-4-eno-l-ino, trans-pent - 3 -eno-l-ino, y cis-pent-3-eno-l-ino (figura 90) . En algunas modalidades, la composición de isopreno de la invención es sustancialmente libre de cualesquiera hidrocarburos de C5 insaturados contaminantes. Como se describe además en el ejemplo 10, una cantidad no detectable de hidrocarburos de C5 insaturados distintos del isopreno (tales como 1,3-ciclopentadieno, cis- 1 , 3 -pentadieno, trans- 1 , 3 -pentadieno , 1-pentino, 2-pentino, 1-penteno, 2-metil-l-buteno, 3-metil-l-butino, trans-piperileno , cis- piperileno, pent-4-eno-l-ino, trans-pent-3-eno-l-ino, o cis-pent-3-eno-l^ino) se encontró en composiciones de isopreno producidas al usar los métodos descritos aquí. Algunas composiciones de isopreno producidas mediante el uso de los métodos descritos aquí contienen etanol, acetona y alcoholes prenílicos de C5 como se determinó por análisis de GC/MS. Todos estos componentes son más fácilmente removidos a partir de la corriente de isopreno que las fracciones de hidrocarburo de C5 isoméricas que están presentes en las composiciones de isopreno derivadas de fuentes petroquímicas. Por consiguiente, en algunas modalidades, las composiciones de isopreno de la invención requieren tratamiento mínimo para ser de grado de polimerización.
En un aspecto, composiciones y métodos de la invención incrementan ta tasa de producción de isopreno e incrementan la cantidad total de isopreno que es producido. Por ejemplo, los sistemas de cultivo de células que generan 4.8 x 104 nmoles/gwcm/hr de isopreno han sido producidas (tabla 1) . La eficiencia de estos sistemas es demostrada por la conversión de aproximadamente 2.2% del carbono que las células consumen de un medio de cultivo de células a isopreno. Como se muestra en los ejemplos y la tabla 2, aproximadamente 3 g de isopreno por litro de caldo se generó. Si se desea, cantidades aún mayores de isopreno se pueden obtener mediante el uso de otras condiciones, tales como las que aquí se describen. En algunas modalidades, una fuente de carbono renovable se usa para la producción de isopreno. En algunas modalidades, la producción de isopreno es desacoplada del crecimiento de las células. En algunas modalidades, las concentraciones de isopreno y cualesquiera oxidantes están dentro de los intervalos no inflamables para reducir o eliminar el riesgo de que pueda ocurrir un incendio durante la producción o recuperación de isopreno. Las composiciones y métodos de la presente invención son deseables porque permiten el alto rendimiento de isopreno por células, alto rendimiento de carbono, alta pureza de isopreno, alta productividad, uso de energía bajo, costo de producción e inversión bajos, y reacciones colaterales mínimas. Este proceso biosintético eficiente, de gran escala, para la producción de isopreno provee una fuente de isopreno para hule a base de isopreno sintético y provee una alternativa de bajo costo, deseable, para usar hule natural.
Como se describe más adelante, la cantidad de isopreno producido por células puede ser incrementado en gran medida al introducir un ácido nucleico heterólogo que codifica un pol.ipéptido de isopreno sintasa (v.gr. , un polipéptido de isopreno sintasa vegetal) en las células. Los polipéptido de isopreno sintasa convierten difosfato de dimetilalilo (DMAPP) a isopreno. Como se muestra en los ejemplos, un polipéptido de isopreno sintasa heterólogo de Pueraria Montana (kudzu) se expresó en una variedad de células hospederas, tales como Escherichia coli, Panteoa citrea, Bacillus subtilis , Yarrowia lypolitica y Trichoderma reesei . Todas estas células produjeron más isopreno que las células correspondientes sin el polipéptido de isopreno sintasa heterólogo. Como se ilustra en las tablas 1 y 2, grandes cantidades de isopreno se producen mediante el uso de los métodos descritos aquí. Por ejemplo, células de B. subtilis con un ácido nucleico de isopreno sintasa heterólogo produjo aproximadamente 10 veces más isopreno en un termentador de 14 litros que las células de B. subtilis de control correspondientes sin el ácido nucleico heterólogo (tabla 2) . La producción de 300 mg de isopreno por litro de caldo (mg/L, en donde el volumen de caldo incluye tanto el volumen del medio de las células y el volumen de las células) por E. coli y 30 mg/L por B. subtilis en termentadores indica que se pueden generar cantidades significativas de isopreno (tabla 2) . Si se desea, el isopreno se puede producir a una escala aún más grande u otras condiciones descritas aquí se pueden usar para incrementar adic ionalmente la cantidad de isopreno. Los vectores listados en las tablas 1 y 2 y. las condiciones experimentales se describen con detalle adicional más adelante y en la sección de ejemplos.
Tabla 1 Rendimientos ilustrativos de isopreno de un matraz de agitación que usa los cultivos de células y métodos de la invención La prueba para medir la producción de isopreno se describe en el ejemplo I, parte II. Para esta prueba, una muestra fue removida en uno o más puntos de tiempo del matraz de agitación y cultivada durante 30 minutos. La cantidad de isopreno producido en esta muestra fue después medida. La concentración de espacio superior y velocidad de producción específica de isopreno se listan en la tabla 1 y se describe adicionalmente aquí.
?Normalizado a 1 mL de 1 OD6oo, cultivado durante 1 hora en un tubo de espacio superior sellado con un líquido a una relación de espacio superior-volumen de 1:19.
Tabla 2 Rendimientos ilustrativos de isopreno en un fermentador mediante el uso de los cultivos de células y métodos de la invención La prueba para medir la producción de isopreno se describe en el ejemplo I, parte II. Para esta prueba, una muestra del gas desprendido del fermentador se tomó y analizó para la cantidad de isopreno. La concentración de espacio superior pico (que es la concentración de espacio superior más alta durante la fermentación) , título (que es la cantidad total acumulativa de isopreno producido por litro de caldo) , y tasa de producción específica pico de isopreno (que es la tasa específica más alta durante la fermentación) se listan en la tabla 2 y se describen además aquí .
E. colÍ/MCM127 con 992.5 IS de Kudzu y vía 3815 3044 (1.46 x 104) de MVA entera E. coli BL2l/pCLPtrc vía 1248 2418 1640 superior gil.2 vía (1.83 X 104) inferior integrada E. coli BL2l/pCLPtrc vía 1088 3500 3300 superior HGS2- (1.60 x 104) pTrcKKDylklS Bacillus subtilis 0.8 1.5 2.5 de tipo silvestre (11.7) IS de Bacillus pBS 30 5 Kudzu 16.6 (durante (73.4) 100 hr) Bacillus Marburg 24.5 6051 [Wagner y 2.04 0.61 (359.8) Fall (1999)] Bacillus Marburg 6.8 6051 Fall US 0.7 0.15 (100) 5849970 ** Normalizado a una velocidad de flujo de gas de desprendimiento de 1 vvm (1 volumen de gas desprendido por 1 Lcaido por minuto) .
Además, la producción de isopreno por células que contienen un ácido nucleico de isopreno sintasa heterologo se puede incrementar al .incrementar la cantidad de un polipéptido de l-desoxi-D-xilulosa-5-fosfato sintasa (DXS) y/o un polipéptido de difosfato de isopentenilo isomerasa (IDI) expresado por las células. Por ejemplo, un ácido nucleico de DXS y/o un ácido nucleico de IDI pueden ser introducidos en las células. El ácido nucleico de DXS puede ser un ácido nucleico heterologo o una copia duplicada de un ácido nucleico endógeno. De manera similar, el ácido nucleico de IDI puede ser un ácido nucleico heterólogo o una copia duplicada de un ácido nucleico endógeno. En algunas modalidades, la cantidad de DXS y/o polipéptido IDI se incrementa al reemplazar los promotores DXS y/o IDI endógenos o regiones reguladoras con otros promotores y/o regiones reguladoras que dan por resultado mayor transcripción de los ácidos nucleicos DXS y/o IDI. En algunas modalidades, las células contienen tanto un ácido nucleico heterólogo que codifica un polipéptido de isopreno sintasa (v.gr., un ácido nucleico de isopreno sintasa vegetal) como una copia duplicada de un ácido nucleico endógeno que codifica un polipéptido de isopreno sintasa.
Los polipéptidos DXS y IDI codificados son parte de la vía de DXP para la biosíntesis de isopreno (figura 19) . Los polipéptidos DXS convierten piruvato y D-glicefaldehído-3-fosfato a l-desoxi -D-xilulosa-5-fosfato . Aunque no se pretende estar limitado por ninguna teoría en particular, se cree que al incrementar la cantidad de polipéptido DXS se incrementa el flujo de carbono a través de la vía de DXP, lo que conduce a mayor producción de isopreno. Los polipéptidos IDI catalizan la interconversión de difosfato de isopentenilo (IPP) y difosfato de dimetilalilo (DMAPP) . Aunque no se pretende estar limitado por ninguna teoría en particular, se cree que al incrementar la cantidad de polipéptido IDI en células se incrementa la cantidad (y tasa de conversión) de IPP que es convertida a DMAPP, que a su vez es convertida a isopreno.
Por ejemplo, la fermentación de células de E. coli con una isopreno sintasa de kudzu, IDI de S. cerevisiae, y ácidos nucleicos de DXS de E. coli se usó para producir isopreno. Los niveles de isopreno variaron de 50 a 300 g/L durante un período de 15 horas (ejemplo 7, parte VII) .
En algunas modalidades, la presencia de ácidos nucleicos heterologos o extra-endógenos de isopreno sintasa, IDI, y DXS causa que las células crezcan más reproducibilidad o permanezcan viables por más tiempo comparado con la célula correspondiente con sólo uno o dos de estos ácidos nucleicos endógenos heterologos o extra. Por ejemplo, las células que contienen ácidos nucleicos isopreno sintasa, IDI, y DXS heterologos crecieron mejor que las células sólo con ácidos nucleicos de isopreno sintasa y DXS heterologos o sólo con un ácido nucleico de isopreno sintasa heterólogo. También, los ácidos nucleicos de isopreno sintasa, IDI, y DXS heterologos fueron operablemente enlazados con éxito a un promotor fuerte en un plásmido de copia alta que fue mantenido por células de E. coli, lo que sugiere que grandes cantidades de estos polipéptidos podrían ser expresadas en las células sin causar una cantidad excesiva de toxicidad a las células. Aunque no se pretende estar limitado por ninguna teoría en particular, se cree que la presencia de ácidos nucleicos de isopreno sintasa e IDI heterólogos o extra-endógenos puede reducir la cantidad de uno o más intermediarios potencialmente tóxicos que de otra manera se acumularían si sólo un ácido nucleico de DXS heterólogo o extra-endógeno estuviera presente en las células.
En algunas modalidades, la producción de isopreno por células que contienen un ácido nucleico de isopreno sintasa heterólogo es aumentada al incrementar la cantidad de un polipéptido MVA expresado por las células (figura 19) . Los polipéptidos de las vías de MVA ilustrativos incluyen cualquiera de los siguientes polipéptidos: polipéptidos de acetil-CoA acetiltransferasa (AA-CoA tiolasa) , polipéptidos de 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA sintasa (HMG-CoA sintasa) , polipéptidos de 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA reductasa (HMG-CoA reductasa) , mevalonato cinasa (MVK) polipéptidos, polipéptidos de fosfomevalonato cinasa (PMK) , polipéptidos de difosfomevalonto descarboxilasa (MVD) , polipéptidos IDI, y polipéptidos (v.gr., polipéptidos de fusión) que tienen una actividad de dos o más polipéptidos de la vía de MVA. Por ejemplo, uno o más ácidos nucleicos de la vía de MVA pueden ser introducidos en las células. En algunas modalidades, las células contienen la vía de MVA superior, que incluye ácidos nucleicos de AA-CoA tiolasa, HMG-CoA sintasa, y HMG-CoA reductasa. En algunas modalidades, las células contienen de la vía de MVA inferior, que incluye los ácidos nucleicos de MVK, PMK, MVD, y IDI . En algunas modalidades, las células contienen la vía de MVA entera, que incluye ácidos nucleicos de AA-CoA tiolasa, HMG-CoA sintasa, HMG-CoA reductasa, MVK, PMK, MVD, y IDI. Los ácidos nucleicos de la vía de MVA pueden ser ácido nucleico heterólogos o copias duplicadas de ácidos nucleicos endógenos. En algunas modalidades, la cantidad de uno o más polipéptidos de la vía de MVA es incrementada al reemplazar los promotores endógenos o regiones reguladoras para los ácidos nucleicos de la vía de MVA con otros promotores y/o regiones reguladoras que dan por resultado transcripción mayor de los ácidos nucleicos de la vía de MVA. En algunas modalidades, las células contienen tanto un ácido nucleico heterólogo que codifica un polipéptido de isopreno sintasa (v.gr., un ácido nucleico de isopreno sintasa vegetal) como una copia duplicada de un ácido nucleico endógeno que codifica un polipéptido de isopreno sintasa.
Por ejemplo, células de E. coli que contienen un ácido nucleico que codifica un polipéptido de isopreno sintasa de kudzu y ácidos nucleicos que codifican polipéptidos de MVK, PMK, MVD e IDI de Saccharomyces cerevisiae que generan isopreno a una velocidad de 6.67 x 10~4 mol/Lbroth/OD6oo/hr (véase ejemplo 8) . Además, una fermentación de 14 litros de células de E. coli con ácidos nucleicos que codifican polipéptidos de AA-CoA tiolasa, HMG-CoA sintasa, y H G-CoA reductasa de Enterococcus faecalis produjeron 22 gramos de ácido mevalónico (un intermediario de la vía de MVA) . Un matraz de agitación de estas células produjo 2-4 gramos de ácido mevalónico por litro. Estos resultados indican que los ácidos nucleicos de vías de MVA heterólogos son activos en E. coli. Células de E. coli que contienen ácidos nucleicos tanto para la vía de MVA superior como la vía de MVA inferior así como una isopreno sintasa de kudzu (cepa MCM 127) produjo significativamente más isopreno (874 ug/L) comparado con células E. coli con ácidos nucleicos sólo para la vía de MVA inferior y la isopreno sintasa de kudzu (cepa MCM 131) (véase tabla 3 y ejemplo 8, parte VIII) .
En algunas modalidades, por lo menos una porción de las células mantienen el ácido nucleico de isopreno sintasa, DXS, IDI, y/o la vía de MVA heterólogo para por lo menos aproximadamente 5, 10, 20, 50, 75, 100, 200, 300, o más divisiones celulares en un cultivo continuo (tal como un cultivo continuo sin dilución) . En algunas modalidades de cualquiera de los aspectos de la invención, el ácido nucleico que comprende el ácido nucleico de isopreno sintasa, DXS, IDI y/o la vía de MVA heterólogo o copia duplicada de un endógeno también comprende un marcador selectivo, tal como un ácido nucleico de resistencia a antibióticos kanamicina, ampicilina, carbenicilina, gentamicina, higromicina, fleomicina, bleomicina, neomicina o cloranfenicol .
Como se indica en el ejemplo 7, parte VI, la cantidad de isopreno producido puede ser incrementada además al añadir extracto de levadura al medio de cultivo de células. En este ejemplo, la cantidad de isopreno producido fue linealmente proporcional a la cantidad de extracto de levadura en el medio de las células para las concentraciones probadas (figura 48C) . Además, aproximadamente 0.11 gramos de isopreno por litro de caldo fueron producidos a partir de un medio de células con extracto de levadura y glucosa (ejemplo 7, parte VIII). Estos dos experimentos usaron células de E. coli con ácidos nucleicos isopreno sintasa de kudzu, IDI de S. cerevisiae, y DXS de E. coli para producir isopreno. Al incrementar la cantidad de extracto de levadura en presencia de glucosa se produjo más isopreno que al incrementar la cantidad de glucosa en presencia de extracto de levadura. También, el incremento en la cantidad de extracto de levadura permitió que las células produjeran un alto nivel de isopreno durante un tiempo más largo y mejoraran la salud de las células .
La producción de isopreno también se demostró mediante el uso de tres tipos de biomasa hidrolizada (bagazo, rastrojo de maíz, y pulpa de madera suave) como la fuente de carbono (figuras 46A-46C) . Las células de E. coli con ácidos nucleicos de isopreno sintasa de kudzu, IDI de S. cerevisiae, y DXS de E. coli produjeron tanto isopreno a partir de fuentes de carbonos de biomasa hidrolizada suelta como a partir de la cantidad equivalente de glucosa (v.gr., 1% de glucosa, p/v) . Si se desea, cualquier otra fuente de carbono de biomasa se puede usar en las composiciones y métodos de la invención. Las fuentes de carbono de biomasa son deseables debido a que son más baratas que muchos medios de células convencionales, lo que facilita la producción económica de isopreno.
Además, se mostró azúcar invertido funciona como una fuente de carbono para la generación de isopreno (figuras 47C y 96-98). Por ejemplo, 2.4 g/L de isopreno fue producido a partir de células que expresan polipéptidos de la vía de MVA y una isopreno sintasa de Kudzu (ejemplo 8, parte XV) . El glicerol también se usó como una fuente de carbono para la generación de 2.2 mg/L de isopreno a partir de células que expresan una isopreno sintasa de Kudzu (ejemplo 8, parte XIV) . La expresión de un ácido nucleico de DXS, un ácido nucleico de IDI, y/o uno o más ácidos nucleicos de la vía de MVA (tales como ácidos nucleicos que codifican la vía de MVA entera) además de un ácido nucleico de isopreno sintasa puede incrementar la producción de isopreno a partir de glicerol.
En algunas modalidades, un aceite se incluye en el medio de las células. Por ejemplo, células de B. subtilis que contienen un ácido nucleico de isopreno sintasa de kudzu produjo isopreno cuando se cultivó en un medio de células que contenía un aceite y una fuente de glucosa (ejemplo 4, parte III) . En algunas modalidades, más de un aceite (tal como 2, 3, 4, 5, o más aceites) se incluye en el medio de las células. Aunque no se pretende estar limitado por ninguna teoría en particular, se cree que (i) el aceite puede incrementar la cantidad de carbón en las células que está disponible para conversión a isopreno, (ii) el aceite puede incrementar la cantidad de acetil-CoA en las células, al incrementar así el flujo de carbono a través de la vía de MVA, y/o (ii) el aceite puede proveer nutrientes adicionales a las células, que es deseable ya que mucho del carbono en las células es convertido a isopreno más que otros productos. En algunas modalidades, las células que son cultivadas en un medio de células que contiene aceite naturalmente usan la vía de MVA para producir isopreno o son genéticamente modificadas para contener ácidos nucleicos para la vía de MVA entera. En algunas modalidades, el aceite es parcialmente o completamente hidrolizado antes de añadirse al medio de cultivo de células para- facilitar el uso del aceite por las células hospederas.
Uno de los principales obstáculos a la producción comercial de moléculas pequeñas tal como isopreno en células (v.gr., bacterias) es el desacoplamiento de producción de la molécula del crecimiento de las células . En algunas modalidades para la producción de isopreno comercialmente viable, una cantidad significativa del carbono del material de alimentación es convertida a isopreno, más que para el crecimiento y mantenimiento de las células ("eficiencia de carbono") . En varias modalidades, las células convierten más de, o aproximadamente, 0.0015, 0.002, 0.005, 0.01, 0.02, 0.05, 0.1, 0.12, 0.14, 0.16, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.2, 1.4, 1.6, 1.8, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 5.0, 6.0, 7.0 ó 8.0% del carbono en el medio de cultivo de células en isopreno. En modalidades particulares, una porción significativa del carbono a partir del material de alimentación que es convertido a productos en dirección 3' es convertida a isopreno. Como se describe ádemás en el ejemplo 11, células de E. coli que expresan los ácidos nucleicos de la vía de MVA e isopreno sintasa de kudzu mostraron desacoplamiento de la producción de isopreno o el intermediario ácido mevalónico del crecimiento, y se obtuvo alta eficiencia de carbono. En particular, el ácido mevalónico se formó a partir de células que expresaron la vía de MVA superior de Enterococcus faecalis. El isopreno se formó a partir de células que expresaron la vía de MVA superior de Enterococcus faecalis, la vía de MVA inferior de Saccharomyces cerevisiae, y la isopreno sintasa de Pueraria montana (Kudzu) . Este desacoplamiento de producción de isopreno o ácido mevalónico a partir del crecimiento se demostró en cuatro cepas diferentes de E. coli: BL21(LDE3), BL21 (LDE3 ) Tuner, FM5, y MG1655. Las primeras dos cepas de E. coli son cepas B, y las últimas dos son cepas K12. El desacoplamiento de producción de crecimiento también se demostró en una variante de MG 1655 con genes ack y pta deletados. Esta variante también demostró menos producción de acetato.
Polipéptidos y ácidos nucleicos ilustrativos Varios polipéptidos y ácidos nucleicos de isopreno sintasa, DXS, IDI y/o la vía de MVA se pueden usar en las composiciones y métodos de la invención.
Como se usa en la presente, los "polipéptidos" incluyen polipéptidos, proteínas, péptidos, fragmentos de polipéptidos y polipéptidos de fusión. En algunas modalidades, el polipéptido de fusión incluye parte o todo un primer polipéptido (v.gr., un polipéptido de isopreno sintasa, DXS, IDI, o la vía de MVA o fragmento catalíticamente activo del mismo) y opcionalmente puede incluir parte o todo un segundo polipéptido (v.gr., un péptido que facilita la purificación o detección del polipéptido de fusión, tal como His-Tag) . En algunas modalidades, el polipéptido de fusión tiene una actividad de dos o más polipéptidos de vía MVA (tales como polipéptidos de AA-CoA tiolasa y HMG-CoA reductasa) . En algunas modalidades, el polipéptido es un polipéptido que ocurre naturalmente (tal como el polipéptido codificado por un ácido nucleico de mvaE de Enterococcus faecalis) que tiene una actividad de dos o más polipéptidos de vía MVA.
En varias modalidades, un polipéptido tiene por lo menos o aproximadamente 50, 100, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, o más aminoácidos. En algunas modalidades, el fragmento de polipéptido contiene por lo menos o aproximadamente 25, 50, 75, 100, 150, 200, 300, o más aminoácidos contiguos de un polipéptido de longitud completa y tiene por lo menos o aproximadamente 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o 100% de una actividad de un polipéptido de longitud completa correspondiente. En modalidades particulares, el polipéptido incluye un segmento de o la secuencia de aminoácidos entera de cualquier polipéptido de isopreno sintasa, DXS, IDI o la vía de MVA que ocurre naturalmente. En algunas modalidades, el polipéptido tiene una o más mutaciones comparado con la secuencia de un polipéptido de isopreno sintasa, DXS, IDI, o la vía de MVA de tipo silvestre (es decir, una secuencia que ocurre en la naturaleza) .
En algunas modalidades, el polipéptido es un polipéptido aislado. Como se usa en la presente, un "polipéptido aislado" no es parte de una biblioteca de polipéptidos, tal como una biblioteca de 2 , 5, 10, 20, 50 o más polipéptidos diferentes y se separa de por lo menos un componente con el cual ocurre en la naturaleza. Un polipéptido aislado se puede obtener, por ejemplo, por expresión de un ácido nucleico recombinante que codifica el polipéptido.
En algunas modalidades, el polipéptido es un polipéptido heterólogo. Por "polipéptido heterólogo" se entiende un polipéptido cuya secuencia de aminoácidos no es idéntica a la de otro polipéptido naturalmente expresado en la misma célula hospedera. En particular, un polipéptido heterólogo no es idéntico a un ácido nucleico de tipo silvestre que se encuentra en la misma célula hospedera en la naturaleza .
Como se usa en la presente, un "ácido nucleico" se refiere a dos o más desoxirribonucleótidos y/o ribonucleótidos ya sea en una forma de cadena sencilla o de doble cadena. En algunas modalidades, el ácido nucleico es un ácido nucleico recombinante. Por "ácido nucleico recombinante" se entiende un ácido nucleico de interés que es libre de uno o más ácidos nucleicos (v.gr., genes) que, en el genoma que ocurre en la naturaleza del organismo del cual el ácido nucleico de interés se deriva, flanquea el ácido nucleico de interés. El término por lo tanto incluye, por ejemplo, un ADN recombinante que se incorpora en un vector, en un plásmido o virus que se replica autónomamente, o en el ADN genómico de un procariota o eucariota, o que existe como una molécula separada (v.gr., a ADNc, un fragmento de ADN genómico, o un fragmento de ADNc producido por PCR o digestión por endonucleasa de restricción) independiente de otras secuencias. En varias modalidades, un ácido nucleico es un ácido nucleico recombinante. En algunas modalidades, un ácido nucleico de isopreno sintasa, DXS, IDI o la vía de MVA está operablemente enlazado a otro ácido nucleico que codifica todo o una porción de otro polipéptido de tal manera que el ácido nucleico recombinante codifica un polipéptido de fusión que incluye un polipéptido de isopreno sintasa, DXS, IDI, o . la vía de MVA y todo o parte de otro polipéptido (v.gr. , un péptido que facilita la purificación o detección del polipéptido de fusión, tal como His-tag) . En algunas modalidades, parte o todo un ácido nucleico recombinante es químicamente sintetizado.
En algunas modalidades, el ácido nucleico es un ácido nucleico heterólogo. Por "ácido nucleico heterólogo" se entiende un ácido nucleico cuya secuencia de ácido nucleico no es idéntica a la de otro ácido nucleico naturalmente encontrado en la misma célula hospedera.
En modalidades particulares, el ácido nucleico incluye un segmento de o la secuencia de ácido nucleico entera de cualquier ácido nucleico de isopreno sintasa, DXS, IDI, o la vía de MVA que ocurre naturalmente. En algunas modalidades, el ácido nucleico incluye por lo menos o aproximadamente 50, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, o más nucleótidos contiguos de un ácido nucleico de isopreno sintasa DXS, IDI, o la vía de MVA que ocurre naturalmente. En algunas modalidades, el ácido nucleico tiene una o más mutaciones comparado con la secuencia de un ácido nucleico de isopreno sintasa, DXS, IDI ,\ o la vía de MVA de tipo silvestre (es decir, una secuencia que ocurre en la naturaleza). En algunas modalidades, el ácido nucleico tiene una o más mutaciones (v.gr. , una mutación silenciosa) que incrementa la transcripción o traducción de ácido nucleico de isopreno sintasa, DXS, IDI o la vía de MVA. En algunas modalidades, el ácido nucleico es una variante degenerada de cualquier ácido nucleico que codifica un péptido de isopreno sintasa, DXS, IDI o la vía de MVA.
"Degeneración de codón" se refiere a divergencia en el código genético que permite variación de la secuencia de nucleótidos sin afectar la secuencia de aminoácidos de un polipéptido codificado. El experto en la técnica está muy consciente de la "derivación de codón" mostrada por una célula hospedera específica en el uso de codones de nucleótido para especificar un aminoácido dado. Por lo tanto, cuando se sintetiza un ácido nucleico para expresión mejorada en una célula hospedera, es deseable en algunas modalidades diseñar el ácido nucleico de tal manera que su frecuencia de uso de codón se aproxima a la frecuencia de uso de codón preferido de la célula hospedera.
Los números de acceso de polipéptidos y ácidos nucleicos de isopreno sintasa, DXS, IDI y/o la vía de MVA ilustrativos se listan en el apéndice 1 (los números de acceso del apéndice 1 y sus secuencias correspondientes se incorporan aquí por referencia en su totalidad, particularmente con respecto a las secuencias de aminoácidos y ácidos nucleicos de péptidos y ácidos nucleicos de isopreno sintasa, DXS, IDI y/o la vía de MVA) . La base de datos Kegg también contiene las secuencias de aminoácidos y ácidos nucleicos de numerosos péptidos y ácidos nucleicos de isopreno sintasa, DXS, IDI y/o la vía de MVA ilustrativos (véase, por ejemplo, la red a nivel mundial (www) en "genome.jp/kegg/pathway/map/map00100.html" y las secuencias en la misma, que son incorporadas cada una aquí por referencia en su totalidad, particularmente con respecto a las secuencias de aminoácidos y ácidos nucleicos de péptidos y ácidos nucleicos de isopreno sintasa, DXS, IDI y/o la vía de MVA) . En algunas modalidades, uno o más de los polipéptidos y/o ácidos nucleicos de isopreno sintasa, DXS, IDI y/o la vía de MVA tienen una secuencia idéntica a una secuencia publicamente disponible el 12 de diciembre de 2007, tal como cualquiera de las secuencias que corresponden a cualquiera de los números de acceso en el apéndice 1 o cualquiera de las secuencias presentes en la base de datos Kegg. Péptidos y ácidos nucleicos de isopreno sintasa, DXS, IDI y/o la vía de MVA ilustrativos adicionales se describen más adelante.
Polipéptidos y ácidos nucleicos de isopreno sintasa ilustrativos Como se indicó antes, los polipéptidos de isopreno sintasa convierten difosfato de dimetilalilo (DMAPP) a isopreno. Polipéptidos ilustrativos de isopreno sintasa incluyen polipéptidos, fragmentos de polipéptidos, péptidos, y polipéptidos de fusión que tienen por lo menos una actividad de un polipéptido de isopreno sintasa. Métodos estándares se pueden usar para determinar si un polipéptido tiene actividad de polipéptido de isopreno sintasa al medir la capacidad del polipéptido para convertir DMAPP a isopreno in vi ro, en un extracto de células, o in vivo. En una prueba ilustrativa, los extractos de células se preparan al hacer crecer una cepa (v.gr., la cepa E. coli/pTrcKudzu aquí descrita) en el método de matras de agitación como se describe en el ejemplo 1. Después de que la inducción está completa, aproximadamente 10 mL de células son comprimidas mediante centrifugación a 7000 x g durante 10 minutos y resuspendidas en 5 mi de PEB sin glicerol. Las células son lisadas mediante el uso de una célula French Pressure con el uso de procedimientos estándares. Alternativamente, las células son tratadas con lisozima (solución de lisozima Ready-Lyse; EpiCentre) después de congelamiento/descongelamiento a -80°C.
La actividad de polipéptido isopreno sintasa en el extracto de células se puede medir, por ejemplo, como se describe en Silver et al., J. Biol . Chem. 270:13010-13016, 1995 y referencias en la misma, que son cada una incorporada aquí por referencia en su totalidad, particularmente con respecto a pruebas para actividad de polipéptido de isopreno sintasa. DMAPP (Sigma) es evaporado a sequedad bajo una corriente de nitrógeno y rehidratada a una concentración de 100 mM en 100 mM de regulador de pH de fosfato de potasio, pH 8.2 y almacenado a -20°C. Para realizar la prueba, una solución de 5 pL de IM MgCl2, 1 mM (250 ug/ml) de DMAPP, 65 pL de regulador de pH de extracto vegetal (PEB) (50 mM de Tris-HCl, pH 8.0, 20 mM de MgCl2, 5% de glicerol, y 2 mM de DTT) se añade a 25 pL de extracto de células en un tubo de espacio de cabeza de 20 mi con una tapa de tornillo de metal y septo de silicón revestido con teflón (Agilent Technologies) y cultivado a 37°C durante 15 minutos con agitación. La reacción se extingue mediante la adición de 200 µ?? de 250 mM de EDTA y se cuantifica por GC/MS como se describe en el ejemplo 1, parte II.
Los ácidos nucleicos de isopreno sintasa ilustrativos incluyen ácidos nucleicos que codifican un polipéptido, fragmento de un polipéptido, péptido o polipéptido de fusión que tiene por lo menos una actividad de un polipéptido de isopreno sintasa. Los polipéptidos y ácidos nucleicos de isopreno sintasa ilustrativos incluyen polipéptidos y ácidos nucleicos que ocurren naturalmente de cualquiera de los organismos de fuente aquí descritos así como polipéptidos y ácidos nucleicos mutantes derivados de cualquiera de los organismos fuente aquí descritos.
En algunas modalidades, el polipéptido o ácido nucleico de isopreno sintasa es a partir de lo familia Fabaceae, tal como la subfamilia Faboideae. En algunas modalidades, el polipéptido de isopreno sintasa o ácido nucleico es un polipéptido o ácido nucleico que ocurre naturalmente de Pueraria montana (kudzu) (Sharkey et al., Plant Physiology 137: 700-712, 2005), Pueraria lobata, álamo blanco (tal como Populus alba x trémula CAC35696) Miller et al., Planta 213: 483-487, 2001), álamo temblón (tal como Populus tremuloides) , Silver et al, JBC 270(22): 13010-1316, 1995), o roble inglés (Quercus rohur) (Zimmer et al., O 98/02550) , que son incorporadas cada una aquí por referencia en su totalidad, particularmente con respecto a ácidos nucleicos de isopreno sintasa y la expresión de polipéptidos de isopreno sintasa. Las isopreno sintasas adecuadas incluyen, pero no se limitan a, aquellas identificadas por acceso a Genbank Nos. AY341431, AY316691, AY279379, AJ457070, , y AYl 82241, que son incorporadas cada una aquí por referencia en su totalidad, particularmente con respecto a secuencias de ácidos nucleicos y polipéptidos de isopreno sintasa. En algunas modalidades, . el polipéptido o el ácido nucleico de isopreno sintasa no es un polipéptido o ácido nucleico que ocurre naturalmente de Quercus robur (es decir, el polipéptido de isopreno sintasa o ácido nucleico es un polipéptido o ácido nucleico de isopreno sintasa distinto de un polipéptido o ácido nucleico que ocurre naturalmente de Quercus robur) . En algunas modalidades, el ácido nucleico o polipéptido de isopreno sintasa no es un polipéptido o ácido nucleico que ocurre naturalmente de álamo blanco (tal como Populus alba x trémula CAC35696) .
Polipéptidos y ácidos nucleicos de DXS ilustrativos Como se indicó antes, los polipéptidos de 1-desoxi- D-xilulosa-5-fosfato sintasa (DXS) convierten piruvato y D- gliceraldehído-3-fosfato a l-desoxi-D-xilulosa-5-fosfato . Los polipéptido ilustrativos DXSs incluyen polipéptidos, fragmentos de polipéptidos, péptidos y polipéptidos de fusión que tienen por lo menos una actividad de un polipéptido DXS. Métodos estándares (tales como los que aquí se describen) se pueden usar para determinar si un polipéptido tiene actividad de polipéptido DXS al medir la capacidad del polipéptido para convertir piruvato y D-gliceraldehído-3 -fosfato a 1-desoxi-D-xilulosa-5-fosfato in vitro, en un extracto de células, o in vivo. Los ácidos nucleicos de DXS ilustrativos incluyen ácidos nucleicos que codifican un polipéptido, fragmento de un polipéptido, péptido o polipéptido de fusión que tiene por lo menos una actividad de un polipéptido de DXS. Polipéptido de DXS ilustrativos y ácidos nucleicos incluyen polipéptidos y ácidos nucleicos que ocurren naturalmente de cualquiera de los organismos fuente aquí descritos así como polipéptidos y ácidos nucleicos mutantes derivados de cualquiera de los organismos fuente aquí descritos.
Polipéptidos y ácidos nucleicos de IDI ilustrativos Los polipéptidos de isopentenil difosfato isomerasa ( isopentenil-difosfato delta- isomerase o IDI) cataliza la interconversión de difosfato de isopentenilo (IPP) y difosfato de dimetilalilo (DMAPP) (v.gr., que convierte IPP a DMAPP y/o que convierte DMAPP a IPP) . Los polipéptidos de IDI ilustrativos incluyen polipéptidos, fragmentos de polipéptidos, péptidos y polipéptidos de fusión que tienen por lo menos una actividad de un polipéptido de IDI. Los métodos estándares (tales como las que aquí se describen) se pueden usar para determinar si un polipéptido tiene actividad de polipéptido de IDI al medir la capacidad del polipéptido para interconvertir IPP y DMAPP in vitro, en un extracto de células, o in vivo. Los ácidos nucleicos de IDI ilustrativos incluyen ácidos nucleicos que codifican un polipéptido, fragmento de un polipéptido, péptido o polipéptido de fusión que tiene por lo menos una actividad de un polipéptido de IDI. Los polipéptidos y ácidos nucleicos de IDI ilustrativos incluyen polipéptidos y ácidos nucleicos que ocurren naturalmente de cualquiera de los organismos fuente aquí descritos así como polipéptidos y ácidos nucleicos mutantes derivados de cualquiera de los organismos fuente aquí descritos .
Polipéptidos y ácidos nucleicos de la vía de MVA ilustrativos Polipéptidos de la vía de MVA ilustrativos incluyen polipéptidos de acetil-CoA acetiltransferasa (AA-CoA tiolasa) , polipéptidos de 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA sintasa (HMG-CoA sintasa) , polipéptidos de 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA reductasa (HMG-CoA reductasa) , polipéptidos de mevalonato cinasa (MVK) , polipéptidos de fosfomevalonato cinasa (PMK) , polipéptidos de difosfomevalonato descarboxilasa (MVD) , polipéptidos IDI, y polipéptidos (v.gr., fusión polipéptidos) que tienen una actividad de dos o más polipéptidos de la vía de MVA. En particular, los polipéptidos de la vía de MVA incluyen polipéptidos, fragmentos de polipéptidos, péptidos, y polipéptidos de fusión que tienen por lo menos- una actividad de un polipéptido de la vía de MVA. Los ácidos nucleicos de la vía de MVA ilustrativos incluyen ácidos nucleicos que codifican un polipéptido, fragmento de un polipéptido, péptido o polipéptido de fusión que tiene por lo menos una actividad de un polipéptido de la vía de MVA. Los polipéptidos y ácidos nucleicos de la vía de MVA ilustrativos incluyen polipéptidos y ácidos nucleicos que ocurren' naturalmente de cualquiera de los organismos fuente aquí descritos así como polipéptidos y ácidos nucleicos mutantes derivados de cualquiera de los organismos fuente aquí descritos.
En particular, los polipéptidos de acetil-CoA acetiltransferasa (AA-CoA tiolasa o AACT) convierten dos moléculas de acetil-CoA a acetoacetil-CoA. Se pueden usar métodos estándares (tales como los que aquí se describen) para determinar si un polipéptido tiene actividad de polipéptido de AA-CoA tiolasa al medir la capacidad del polipéptido para convertir dos moléculas de acetil-CoA a acetoacetil-CoA in vitro, en un extracto de células, o in vivo.
Los polipéptidos de 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA sintasa (HMG-CoA sintasa o HMGS) convierten acetoacetil-CoA a 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA. Se pueden usar métodos estándares (tales como los que aquí se describen) para determinar si un polipéptido tiene actividad de polipéptido de HMG-CoA sintasa al medir la capacidad del polipéptido para convertir acetoacetil-CoA a 3 -hidroxi -3 -metilglutaril-CoA in vitro, en un extracto de células, o in vivo.
Los polipéptidos de 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA reductasa (HMG-CoA reductasa o HMGR) convierten 3 -hidroxi -3-metilglutaril-CoA a mevalonato. Se pueden usar métodos estándares (tales como los que aquí se describen) para determinar si un polipeptido tiene actividad de polipéptido de HMG-CoA reductasa al medir la capacidad del polipéptido para convertir 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA a mevalonato in vitro, en un extracto de células, o in vivo.
Los polipéptidos de mevalonato cinasa (MVK) fosforilan el mevalonato para formar mevalonato- 5 -fosfato. Se pueden usar métodos estándares (tales como los que aquí se describen) para determinar si un polipéptido tiene actividad de polipéptido de MVK al medir la capacidad del polipéptido para convertir mevalonato a mevalonato-5- fosfato in vitro, en un extracto de células, o in vivo.
Los polipéptidos de fosfomevalonato cinasa (PMK) fosforilan mevalonato-5-fosfato para formar mevalonato-5-difosfato. Se pueden usar métodos estándares (tales como los que aquí se describen) para determinar si un polipéptido tiene actividad de polipéptido de PMK al medir la capacidad del polipéptido para convertir mevalonato-5 -fosfato a mevalonato-5-difosfato in vitro, en un extracto de células, o in vivo.
Los polipéptidos de difosfomevalonato descarboxilasa (MVD o DPMDC) convierten mevalonato-5-difosfato a isopentenil difosfato polipéptidos (IPP) . Se pueden usar métodos estándares (tales como los que aquí se describen) para determinar si un polipéptido tiene actividad de polipéptido de MVD al medir la capacidad del polipéptido para convertir mevalonato-5-difosfato a IPP in vitro, en un extracto de células, o in vivo.
Los polipéptidos y ácidos nucleicos IDI ilustrativos se describieron anteriormente.
Métodos ilustrativos para aislar ácidos nucleicos Los ácidos nucleicos de isopreno sintasa, DXS, IDI, y/o la vía de MVA se pueden aislar mediante el uso de métodos estándares. Los métodos para obtener ácidos nucleicos deseados de un organismo fuente de interpes (tal como un genoma bacteriano) son comunes y bien conocidos en la técnica de biología molecular (véase, por ejemplo, O 2004/033646 y referencias citadas en la misma, que son incorporadas cada una aquí por referencia en su totalidad, particularmente con respecto al aislamiento de ácidos nucleicos de interés) . Por ejemplo, si la secuencia del ácido nucleico es conocida (tal como cualquiera de los ácidos nucleicos conocidos aquí descritos) , se pueden crear bibliotecas genómicas adecuadas por digestión con endonucleasa de restricción y se pueden determinar selectivamente con sondas complementarias a la secuencia de ácido nucleico deseada. Una vez que la secuencia es aislada, el ADN puede ser amplificado mediante el uso de métodos de amplificación dirigidos para cebador estándar tales como reacción en cadena de polimerasa (PCR) (Patente de E.U.A. No. 4,683,202, que es incorporada aquí por referencia en su totalidad, particularmente con respecto a métodos de PCR) para obtener cantidades de ADN adecuadas para transformación mediante el uso de vectores apropiados.
Alternativamente, los ácidos nucleicos de isopreno sintasa, DXS, IDI, y/o la vía de MVA (tales como cualesquiera ácidos nucleicos de isopreno sintasa, DXS, IDI, y/o la vía de MVA con una secuencia de ácido nucleico conocida) se pueden sintetizar químicamente mediante el uso de métodos estándares.
Polipéptidos y ácidos nucleicos de isopreno sintasa, DXS, IDI o la vía de MVAs adicionales que pueden ser adecuados para usarse en las composiciones y métodos aquí descritos pueden ser identificados mediante el uso de métodos estándares. Por ejemplo, bibliotecas de cósmidos del ADN cromosómico de organismos que se sabe que producen isopreno naturalmente pueden ser construidos en organismos tales como E. coli, y después determinados selectivamente para la producción de isopreno. En particular, se pueden crear bibliotecas de cósmidos en donde segmentos grandes de ADN genómico (35-45 kb) son empacados en vectores y usados para transformar hospederos apropiados. Los vectores de cósmidos son únicos para poder acomodar grandes cantidades de ADN. Generalmente, los vectores de cósmidos tienen por lo menos una copia de la secuencia de eos ADN que es necesaria para empaque y subsecuente circularización del ADN heterólogo. Además de la secuencia de eos, estos vectores también contienen un origen de replicación tal como ColEI y marcadores de resistencia a fármacos tales como un ácido nucleico resistente a ampicilina o neomicina. Los métodos de uso de vectores ' de cósmidos para la transformación de hospederos bacterianos adecuados se describen bien en Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed., Cold Spring Harbor, 1989, que es incorporada aquí por referencia en su totalidad, particularmente con respecto a métodos de transformación.
Típicamente para clonar cósmidos, el ADN heterólogo es aislado mediante el uso de las endonucleasas de restricción adecuadas y ligadas adyacentes a la región eos del vector de cósmido mediante el uso de las ligasas apropiadas. Los vectores de cósmido que contienen el ADN heterólogo linealizado después se hacen reaccionar con un vehículo de empaque de ADN tal como bacteriófago. Durante el proceso de empaque, los sitios eos son digeridos y el ADN heterólogo es empacado en la porción de cabeza de la partícula viral bacteriana. Estas partículas se usan después para transfectar células hospederas adecuadas tales como E. coli. Una vez inyectadas en la célula, el ADN heterólogo circula bajo la influencia de los extremos pegajosos eos. De esta manera, grandes segmentos de ADN heterólogo se pueden introducir y expresar en células hospederas.
Métodos adicionales para obtener ácidos nucleicos de isopreno sintasa, DXS, IDI, y/o la vía de MVA incluyen determinar selectivamente una biblioteca metagenómica mediante prueba (tal como la prueba de espacio superior aquí descrita) o por PCR mediante el uso de cebadores dirigidos contra nucleótidos que codifican una longitud de aminoácidos conservados (por ejemplo, por lo menos 3 aminoácidos conservados) . Los aminoácidos conservados pueden ser identificados al alinear las secuencias de aminoácidos de polipéptidos de isopreno sintasa, DXS, IDI, y/o de la vía de MVA conocidos. Los aminoácidos conservados para polipéptidos de isopreno sintasa pueden ser identificados con base en secuencias alineadas de polipéptidos de isopreno sintasa conocidos. Un organismo que se encuentra que produce isopreno naturalmente puede ser sometido a métodos de purificación de proteína estándares (que son bien conocidos en la técnica) y el polipéptido purificado resultante puede ser secuenciado mediante el uso de métodos estándares . Otros métodos se encuentran en la literatura (véase, por ejemplo, Julsing et al, Applied. Microbiol. Biotechnol . 75: 1377-84, 2007; Withers et al., Appl Environ Microbiol. 73 (19) : 6277-83 , 2007, que son incorporadas cada una aquí por referencia en su totalidad, particularmente con respecto a identificación de ácidos nucleicos implicados en la síntesis de isopreno) .
Además, la alineación de secuencia estándar y/o programas de predicción de estructura se pueden usar para identificar polipéptidos y ácidos nucleicos de DXS, IDI, o de la vía de MVA adicionales basados en la similitud de su estructura primaria y/o secundaria de polipéptido predicha con la de polipéptidos y ácidos nucleicos de DXS, IDI, o de la vía de MVA conocidos. Las bases de datos estándares tales como la base de datos swissprot-trembl (www en "expasy.org", Swiss Institute of Bioinformatics Swiss-Prot group CMU - 1 rué Michel Servet CH-1211 Geneva 4, Suiza) también se pueden usar para identificar polipéptidos y ácidos nucleicos de isopreno sintasa, DXS, IDI o la vía de MVA. La estructura secundaria y/o terciaria de un péptido de isopreno sintasa, DXS, IDI o la vía de MVA se puede predecir mediante el uso de los valores por omisión de los programas de predicción de estructura estándares, tales como PredictProtein (630 West, 168 Street, BB217, New York, N.Y. 10032, E.U.A.). Alternativamente, la estructura secundaria y/o terciaria real de un péptido de isopreno sintasa, DXS, IDI o la vía de MVA se puede determinar mediante el uso de métodos estándares.
Los ácidos nucleicos de isopreno sintasa, DXS, IDI, o la vía de MVA adicionales también pueden ser identificados por hibridación a sondas generadas, a partir de ácidos nucleicos de isopreno sintasa, DXS, IDI, o la vía de MVA conocidos.
Promotores y vectores ilustrativos Cualquiera del ácido nucleico de isopreno sintasa, DXS, IDI o la vía de MVA aquí descrito puede ser incluido en uno o más vectores. Por consiguiente, la invención también se refiere a vectores con uno o más ácidos nucleicos que codifican cualquiera de los polipéptidos de isopreno sintasa, DXS, IDI o la vía de MVA que aquí se describen. Como se usa en la presente, un "vector" significa un constructo que es capaz de suministrar, y deseablemente expresar uno o más ácidos nucleicos de interés en una célula hospedera. Ejemplos de los vectores incluyen, pero no se limitan a, plásmidos, vectores virales, vectores de expresión de ADN o RNA, vectores de cósmidos y fagos. En algunas modalidades, el vector contiene un ácido nucleico bajo el control de una secuencia de control de expresión.
Como se usa en la presente, una "secuencia de control de expresión" significa una secuencia de ácido nucleico que dirige la transcripción de un ácido nucleico de interés. Una secuencia de control de expresión puede ser un promotor, tal como un promotor constitutivo o un promotor inducible, o un incrementador . Un "promotor inducible" es un promotor que es activo bajo regulación ambiental y de desarrollo. La secuencia de control de expresión es operablemente enlazada al segmento de ácido nucleico que ha de ser transcrito.
En algunas modalidades, el vector contiene un marcador selectivo. El término "marcador selectivo" se refiere a un ácido nucleico capaz de expresarse en una célula hospedera que permite facilidad de selección de aquellas células hospederas que contienen un ácido nucleico o vector introducido. Ejemplos de marcadores seleccionables incluyen, pero no se limitan a, ácidos nucleicos de resistencia a antibióticos (v.gr., kanamicina, ampicilina, carbenicilina, gentamicina, higromicina, fleomicina, bleomicina, neomicina, o cloranfenicol ) y/o ácidos nucleicos que confieren una ventaja metabólica, tal como una ventaja nutricional sobre la célula hospedera. Marcadores selectivos nutricionales ilustrativos incluyen aquellos marcadores conocidos en la técnica como amdS, argB, y pyr4. Los marcadores útiles en sistemas de vectores para transformación de Trichoderma son conocidos en la técnica (véase, v.gr., Finkelstein, capítulo 6 en Biotechnology of Filamentous Fungí, Finkelstein et al, Eds . Butterworth-Heinemann, Boston, MA, Capítulo 6., 1992; y Kinghorn et al., Applied Molecular Genetics of Filamentous Fungí, Blackie Academic y Professional , Chapman y Hall, Londres, 1992, que son incorporadas cada una aquí por referencia en su totalidad, particularmente con respecto a marcadores selectivos) . En algunas modalidades, el marcador selectivo es el ácido nucleico de amdS, que codifica la enzima acetamidasa, que permite que células transformadas crezcan en acetamida como una fuente de nitrógeno. El uso de un ácido nucleico de amdS de A. nidulans como un marcador selectivo se describe en Kelley et al, EMBO J. 4:475-479, 1985 y Penttila et al, Gene 61:155-164, 1987 (que son incorporadas cada una aquí por referencia en su totalidad, particularménte con respecto a marcadores selectivos) . En algunas modalidades, un ácido nucleico de isopreno sintasa, DXS, IDI o la vía de MVA se integra en un cromosoma de las células sin un marcador selectivo.
Los vectores adecuados son aquellos que son compatibles con la célula hospedera utilizada. Los vectores adecuados se pueden derivar, por ejemplo, de una bacteria, un virus (tal como bacteriófago T7 o un fago derivado de M-13) , un cósmido, una levadura, o una planta. Los protocolos para obtener y usar esos vectores son conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed. , Cold Spring Harbor, 1989, que se incorpora aquí por referencia en su totalidad, particularmente con respecto al uso de los vectores) .
Los promotores son bien conocidos en la técnica.
Cualquier promotor que funcione en la célula hospedera se puede usar para la expresión de un ácido nucleico de isopreno sintasa, DXS, IDI o la vía de MVA en la célula hospedera. Las regiones de control de inicio o promotores, que son útiles para impulsar la expresión de ácidos nucleicos de isopreno sintasa, DXS, IDI, o la vía de MVA en varias células hospederas son numerosas y familiares para los expertos en la técnica (véase, por ejemplo, . WO 2004/033646 y referencias citadas en ésta, que son cada una incorporada' aquí por referencia en su totalidad, particularmente con respecto a vectores para la expresión de ácidos nucleicos de interés) . Virtualmente cualquier promotor capaz de impulsar estos ácidos nucleicos es adecuado para la presente invención incluyendo, pero sin limitarse a, CYC1, HIS3, GAL1, GALIO, ADH1, PGK, PH05 , GAPDH, ADCI , TRP1, URA3 , LEU2 , ENO, y TPI (útil para expresión en Saccharomyces) ; A0X1 (útil para expresión en Pichia) ; y lac, trp, APL, APR, T7, tac, y trc (útil para expresión en E. coli) .
En algunas modalidades, se usa un promotor de glucosa isomerasa (véase, por ejemplo, patente de E.U.A. No. 7,132,527 y referencias citadas en ésta, que son cada un a incorporadas aquí por referencia en su totalidad, particularmente con respecto a sistemas de promotores y plásmidos para expresar polipéptidos de interés) . Los mutantes de promotor de glucosa isomerasa reportados se pueden usar para variar el nivel de expresión del polipéptido codificado por un ácido nucleico operablemente enlazado al promotor de glucosa isomerasa (Patente de E.U.A. No. 7,132,527). En varias modalidades, el promotor de glucosa isomerasa está contenido en un plásmido de copia baja, media o alta (Patente de E.U.A. No. 7,132,527).
En varias modalidades, un ácido nucleico de isopreno sintasa, DXS, IDI , y/o la vía de MVA está contenido en un plásmido de copia baja (v.gr., un plásmido que es mantenido a aproximadamente 1 a aproximadamente 4 copias por célula), plásmido de copia media (v.gr., un plásmido que es mantenido a aproximadamente 10 a aproximadamente 15 copias por célula) , o plásmido de copia alta (v.gr. , un plásmido que es mantenido a aproximadamente 50 o más copias por célula) . En algunas modalidades, el ácido nucleico de isopreno sintasa, DXS, IDI o la vía de MVA heterólogo o extra-endógeno está operablemente enlazado a un promotor T7. En algunas modalidades, el ácido nucleico de isopreno sintasa, DXS, IDI o la vía de MVA heterólogo o extra-endógeno operablemente enlazado a un promotor T7 está contenido en un plásmido de copia media o alta. En algunas modalidades, el ácido nucleico de isopreno sintasa, DXS, IDI o la vía de MVA heterólogo o extra-endógeno está operablemente enlazado a un promotor Trc. En algunas modalidades, el ácido nucleico de isopreno sintasa, DXS, IDI o la vía de MVA heterólogo o extra-endógeno operablemente enlazado a un promotor Trc está contenido en un plásmido de copia media o alta. En algunas modalidades, el ácido nucleico de isopreno sintasa, DXS, IDI o la vía de MVA heterólogo o extra-endógeno está operablemente enlazado a un promotor Lac . En algunas modalidades, el ácido nucleico de isopreno sintasa, DXS, IDI o la vía de MVA heterólogo o extra-endógeno operablemente enlazado a un promotor Lac está contenido en un plásmido de copia baja. En algunas modalidades, el ácido nucleico de isopreno sintasa, DXS, IDI o la vía de MVA heterólogo o extra-endógeno está operablemente enlazado a un promotor endógeno, tal como un promotor endógeno de Escherichia, Panteoa, Bacillus, Yarrowia, Streptomyces, o Trichoderma o un promotor de serina proteasa alcalina, isopreno sintasa, DXS, IDI, o vía de MVA endógeno. En algunas modalidades, el ácido nucleico de isopreno sintasa, DXS, IDI o la vía de MVA heterólogo o ext a-endógeno operablemente enlazado a un promotor endógeno está contenido en un plásmido de copia alta. En algunas modalidades, el vector es una plásmido replicante que no se integra a un cromosoma en las células. En algunas modalidades, parte o todo el vector se integra en un cromosoma en las células .
En algunas modalidades, el vector es cualquier vector que cuando se introduce en una célula hospedera fúngica es integrado al genoma de la célula hospedera y es replicado. Se hace referencia al Fungal Genetics Stock Center Catalogue of Strains (Catálogo de Cepas del Centro de Material Genético de Hongos) (FGSC, por sus siglas en inglés, la red a nivel mundial en "fgsc.net" y las referencias citadas en ésta, qué son incorporadas cada una aquí por referencia en su totalidad, particularmente con respecto a vectores) para una lista de los vectores. Ejemplos adicionales de vectores de expresión y/o integración adecuados se proveen en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed. , Cold Spring Harbor, 1989, Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel et al. (eds) 1987, Supplement 30, sección 7.7.18) ; van den Hondel et al. in Bennett y Lasure (Eds.) More Gene Manipulaciones in Fungi, Academic Press pp. 396-428, 1991; y patente de E.U.A. No. 5,874,276, que son incorporadas cada una aquí por referencia en su totalidad, particularmente con respecto a vectores. Vectores particularmente útiles incluyen pFB6, pB 322, PUC18, pUClOO, y pENTR/D.
En algunas modalidades, an ácido nucleico de isopreno sintasa, DXS, IDI o la vía de MVA está operablemente enlazado a un promotor adecuado que muestra actividad transcripcional en una célula hospedera fúngica. El promotor puede ser derivado de uno o más ácidos nucleicos que codifican un polipéptido que es ya sea. endógeno o heterólogo a la célula hospedera. En algunas modalidades, el promotor es útil en un hospedero Tric oderma . Ejemplos no limitantes adecuados de promotores incluyen cJbhl , cbh2 , egll , egl2 , pepA, hfbl, hfb2, xynl, y amy. En algunas modalidades, el promotor es uno que es nativo a la célula hospedera. Por ejemplo, en algunas modalidades cuando T. reesei es el hospedero, el promotor es un promotor de T. reesei nativo. En algunas modalidades, el promotor es cbhl de T. reesei, que es un promotor inducible y ha sido depositado en GenBank bajo el acceso No. D86235, que es incorporado aquí por referencia en su totalidad, particularmente con respecto a promotores. En algunas modalidades, el promotor es uno que es heterólogo a la célula hospedera fúngica. Otros ejemplos de promotores útiles incluyen promotores a partir de los genes de glucoamilasa de A. awamori y A niger (glaA) (Nunberg et al., Mol. Cell Biol. 4:2306-2315, 1984 y Boel et al., EMBO J. 3:1581-1585, 1984, que son incorporadas cada una aquí por referencia en su totalidad, particularmente con respecto a promotores) ; alfa-amilasas de Aspergillus niger, amilasa TAKA de Aspergillus oryzae, xlnl de T. reesei, y la celobiohidrolosa 1 de T. reesei (EP 137280, que es incorporada aquí por referencia en su totalidad, particularmente con respecto a promotores) .
En algunas modalidades, el vector de expresión también incluye una secuencia de terminación. Las regiones de control de terminación también se pueden derivar de varios genes nativos a la célula hospedera.
En algunas modalidades, la secuencia de terminación y la secuencia de promotor se derivan de la misma fuente. En otra modalidad, la secuencia de terminación es endógena a la célula hospedera. Una secuencia de terminación particularmente adecuada es cb l derivada de una cepa de Trichoderma (tal como T. reesei) . Otros terminadores fúngicos útiles incluyen el terminador de un ácido nucleico de glucoamilasa de A. niger o A. awa ori (Nunberg et al, Mol. Cell Biol. 4:2306-2315, 1984 y Boel et al, EMBO J. 3:1581-1585, 1984; que son incorporadas cada una aquí por referencia en su totalidad, particularmente con respecto a terminadores fúngales). Opcionalmente , un sitio de terminación puede estar incluido. Para expresión efectiva de los polipéptidos , los ADN que codifica el polipéptido son enlazados operablemente a través de codones de inicio a regiones de control de expresión seleccionadas de tal manera que la expresión da por resultado la formación del ARN mensajero apropiado.
En algunas modalidades, el promotor, región codificante y terminador se originan todos del ácido nucleico de isopreno sintasa, DXS, IDI o la vía de MVA que ha de ser expresada". En algunas modalidades, la región codificante para un ácido nucleico de isopreno sintasa, DXS, IDI o la vía de MVA es insertado en un vector de expresión de propósitos generales de tal manera que está bajo el control transcripcional de las secuencias de promotor y terminador de constructo de expresión. En algunas modalidades, genes o parte de los mismos son insertados en dirección 3' del promotor cb l f erte .
Un ácido nucleico de isopreno sintasa, DXS, IDI o la vía de VA puede ser incorporado en un vector, tal como un vector de expresión, mediante el uso de técnicas estándares (Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, 1982, que es incorporada aquí por referencia en su totalidad, particularmente con respecto a la determinación selectiva de secuencias de ADN apropiadas y la construcción de los vectores) . Los métodos usados para ligar el constructo de ADN que comprende un ácido nucleico de interés (tal como un ácido nucleico de isopreno sintasa, DXS, IDI o la vía de MVA) , un promotor, un terminador, y otras secuencias y para insertarlas en un vector adecuado son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, las enzimas de restricción se pueden usar para digerir el ácido nucleico de isopreno sintasa, DXS, IDI o la vía de MVA y el vector. Después, los extremos compatibles del ácido nucleico de isopreno sintasa, DXS, IDI o la vía de MVA digerido y el vector digerido pueden ser ligados. El enlace generalmente se logra por ligación en sitios de restricción convenientes. Si esos sitios no existen, los enlazadores de oligonucleótido sintéticos se usan de conformidad con la práctica convencional (véase, Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed. , Cold Spring Harbor, 1989, y Bennett y Lasure, More Gene Manipulaciones in Fungi, Academic Press, San Diego, pp 70-76, 1991, que son incorporadas cada una aquí por referencia en su totalidad, particularmente con respecto a enlazadores de oligonucleótido) . Además, los vectores se pueden construir mediante el uso de técnicas de recombinación conocidas (v.gr. , Invitrogen Life Technologies, Gateway Technology) .
En algunas modalidades, puede ser deseable sobre-expresar ácidos nucleicos de isopreno sintasa, DXS, IDI, o la-vía de MVA a niveles muy por arriba de los encontrados actualmente en células que ocurren naturalmente. Este resultado se puede lograr por la clonación selectiva de los ácidos nucleicos que codifican esos polipéptidos en plásmidos de copias múltiples o al colocar esos ácidos nucleicos bajo un promotor inducible o constitutivo fuerte. Los métodos para sobre-expresar polipéptidos deseados son comunes y bien conocidos en la técnica de biología molecular y ejemplos se pueden encontrar en Sambrook et at, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed. , Cold Spring Harbor, 1989, que es incorporada aquí por referencia en su totalidad, particularmente con respecto a técnicas de clonación.
Los siguientes recursos incluyen descripciones de metodología general adicional útil de conformidad con la invención: Kreigler, Gene Transfer y Expression; A Laboratory Manual, 1990 y Ausubel et al., Eds . Current Protocols in Molecular Biology, 1994, que son incorporadas cada una aquí por referencia en su totalidad, particularmente con respecto a técnicas de biología molecular y clonación.
Organismos fuente ilustrativos Los ácidos nucleicos de isopreno sintasa, DXS, IDI, o la vía de MVA (y sus polipéptidos codificados) se pueden obtener de cualquier organismo que contenga naturalmente ácidos nucleicos de isopreno sintasa, DXS, IDI, y/o la vía de MVA. Como se indicó antes, el isopreno es formado naturalmente por una variedad de organismos, tales como bacterias, levaduras, plantas y animales. Los organismos contienen la vía de MVA, vía de DXP, o tanto la vía de MVA como de DXP para producir isopreno (figura 19) . Por lo tanto, los ácidos nucleicos de DXS se pueden obtener, v.gr. , de cualquier organismo que contenga la vía de DXP o que contenga tanto la vía de MVA como de DXP. Los ácidos nucleicos de IDI e isopreno sintasa se pueden obtener, v.gr., de cualquier organismo que contenga la vía de MVA, vía de DXP, o tanto la vía de MVA como de DXP. Los ácidos nucleicos de la vía de MVA se pueden obtener, v.gr., de cualquier organismo que contenga la vía de MVA o que contenga tanto la vía de MVA como de DXP .
En algunas modalidades, la secuencia de ácido nucleico de ácido nucleico de isopreno sintasa, DXS, IDI, o la vía de MVA es idéntica a la secuencia de un ácido nucleico que es producida por cualquiera de los siguientes organismos en la naturaleza. En algunas modalidades, la secuencia de aminoácidos del péptido de isopreno sintasa, DXS, IDI o la vía de MVA es idéntica a la secuencia de un polipéptido que es producido por cualquiera de los siguientes organismos en la naturaleza. En algunas modalidades, el ácido nucleico o polipéptido de isopreno sintasa, DXS, IDI o la vía de MVA es un ácido nucleico o polipéptido mutante derivado de cualquiera de los organismos aquí descritos. Como se usa en la presente, "derivado de" se refiere a la fuente del ácido nucleico o polipéptido en el cual una o más mutaciones es introducida. Por ejemplo, un polipéptido que es "derivado de un polipéptido vegetal" se refiere a polipéptido de interés que resulta de introducir una o más mutaciones en la secuencia de un polipéptido vegetal de tipo silvestre (es decir, una secuencia que ocurre en la naturaleza) .
En algunas modalidades, el organismo fuente es un hongo, ejemplos del cual son especies de Aspergillus tales como A oryzae y A niger, especies de Saccharomyces tales como S. cerevisiae, especies de Schizosaccharomyces tales como S. pombe, y especies de Trichoderma tales como T. reesei . En algunas modalidades, el organismo fuente es una célula' de hongo filamentoso. El término "hongo filamentoso" se refiere a todas las formas filamentosas de la subdivisión Eumycotina (véase, Alexopoulos, C. J. (1962) , Introductory Mycology, Wiley, New York) . Estos hongos se caracterizan por un micelio vegetativo con una pared celular compuesta de quitina, celulosa, y otros polisacáridos complejos. Los hongos filamentosos son morfológicamente, fisiológicamente, y genéticamente distintos de las levaduras. El crecimiento vegetativo por los hongos filamentosos es por alargamiento de hifas y el catabolismo del carbono es aeróbico obligatorio. La célula progenitora de hongo filamentoso puede ser una célula de una especie de, pero sin limitarse a, Trichoderma, (v.gr., Trichoderma reesei, la forma asexual de ypocrea jecorina, previamente clasificada como T. longibrachiatum, Trichoderma viride, Trichoderma koningii , Trichoderma harzianum) (Sheir-Neirs et al, Ap l . Microbiol . Biotechnol 20: 46-53, 1984; ATCC No. 56765 y ATCC No. 26921); Penicillium sp. , Humicola sp. (v.gr., H. insolens, H. lanuginose, o H. grísea); Chrysosporium sp. (v.gr., C. lucknowense) , Gliocladium sp . , Aspergillus sp . (v.gr., A. oryzae, A. niger, A sojae, A. japonicus, A. nidulans, o A. awamori) (Ward et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 39: 7380743, 1993 y Goedegebuur et al, Genet 41: 89-98, 2002), Fusarium sp. , (v.gr., F. roseum, F. gra inum F. cerealis, F. oxysporuim, o F. venenatum) , Neurospora sp., (v.gr., N. crassa) , Hypocrea sp., Mucor sp . , (v.gr., M. miehei) , Rhizopus sp. y Emericella sp. (véase también, Innis et al . , Sci. 228: 21-26, 1985). El término " Trichoder a" o "Trichoderma sp." o "Trichoderma spp." Se refiere a cualquier género de hongo previamente o actualmente clasificado como Trichoderma.
En algunas modalidades, el hongo es A. nidulans, A. awamori, A. oryzae, A. aculeatus, A. niger, A. japonicus, T. reesei, T. viride, F. oxysporum, o F. solani . Las cepas de Aspergillus se describen en Ward et al., Appl . Microbiol . Biotechnol . 39:738-743, 1993 y Goedegebuur et al., Curr Gene 41:89-98, 2002, que son incorporadas cada una aquí por referencia en su totalidad, particularmente con respecto a hongos. En modalidades particulares, el hongo es una cepa de Trichoderma, tal como una cepa de T. reesei. Las cepas de T. reesei son ejemplos conocidos y no conocidos e incluyen ATCC No. 13631, ATCC No. 26921, ATCC No. 56764, ATCC No. 56765, ATCC No. 56767, y NRRL 15709, que son cada una incorporadas aquí por . referencia en su totalidad, particularmente con respecto a cepas de T. reesei. En algunas modalidades, la cepa hospedera es un derivado de RL-P37. RL-P37 se describe en Sheir-Neiss et al., Ap l. Microbiol. Biotechnology 20:46-53, 1984, que es incorporada aquí por referencia en su totalidad, particularmente con respecto a cepas de T. reesei.
En algunas modalidades, el organismo fuente es una levadura, tal como Saccharomyces sp. , Schizosaccharomyces sp., Pichia sp., o Candida sp.
En algunas modalidades, el organismo fuente .es una bacteria, tal como cepas de Bacillus tales como B. lichenformis o B . subtilis, cepas de Pantoea tales como P. citrea, cepas de Pseudomonas tales como P. alcaligenes, cepas de Streptomyces tales como S. lividans o S. rubiginosus, o cepas de Escherichia tales como E. coli.
Como se usa en la presente, "el género Bacillus" incluye todas las especies dentro del género "Bacillus" como lo conocen los expertos en la técnica, que incluyen pero sin limitarse a B. subtilis, B. licheniformis, B. lentus, B. brevis, B. stearothermophilus, B. alkalophilus, B. amyloliquefaciens, B. clausii, B. halodurans, B. megaterium, B. coagulans, B. circulans, B. lautus, y B. thuringiensis . Se reconoce que el género Bacillus aún pasa por reorganización taxonómica. Por lo tanto, se pretende que el género incluya especies que han sido reclasificadas , las cuales incluyen pero sin limitarse a organismos tales como B. stearothermophilus, que ahora se llama " Geobacillus stearothermophilus" . La producción de endosporas resistentes en presencia de oxígeno se considera la característica definitoria del género Bacillus, aunque esta característica también se aplica al recientemente nombrado Aliciclobacillus, Amphibacillus, Aneurinibacillus, Anoxybacillus, Brevibacillus, Filobacillus, Gracilibacillus, Halobacillus, Paenibacillus, Salibacillus, Thermobacillus, Ureibacillus y Virgibacillus .
En algunas modalidades, el organismo fuente es una bacteria gram-positiva . Ejemplos no limitantes incluyen cepas de Streptomyces (v.gr., S. livídans, S. coelicolor, o S. griseus) y Bacillus . En algunas modalidades, el organismo fuente es una bacteria gram-negativa, tal como E. coli o Pseudomonas sp.
En algunas modalidades, el organismo fuente es una planta, tal como una planta de la familia Fabaceae, tal como la subfamilia Faboideae. En algunas modalidades, el organismo fuente es kudzu, álamo blanco (tal como Populus alba x trémula CAC35696) , álamo temblón (tal como Populus tremuloides) , o Quercus robur.
En algunas modalidades, el organismo fuente es un alga, tal como un alga verde, alga roja, glaucofitos, cloraracniofitos , euglenidos, cromista, o dinoflagelados .
En algunas modalidades, el organismo fuente es una cianobacteria, tal como cianobacterias clasificadas en cualquiera de los siguientes grupos basados en morfología: Chroococcales , Pleurocapsales , Oscillatoriales , Nostocales, o Stigonematales .
Células hospederas ilustrativas Una variedad de células hospederas se pueden para expresar isopreno sintasa, DXS, IDI, y/o polipéptidos de la vía de MVA y para producir isopreno en los métodos de la invención reivindicada. Las células hospederas ilustrativas incluyen células de cualquiera de los organismos listados en la sección anterior bajo el encabezado "Exemplary Source Organisms". La célula hospedera puede ser una célula que produce naturalmente isopreno o una célula que no produce naturalmente isopreno. En algunas modalidades, la célula hospedera produce naturalmente isopreno mediante el uso de la vía de DXP, y un ácido nucleico de isopreno sintasa, DXS, y/o de IDI se añade para incrementar la producción de isopreno mediante el uso de esta vía. En algunas modalidades, la célula hospedera produce naturalmente isopreno mediante el uso de la vía de MVA, y un ácido nucleico de isopreno sintasa y/o uno o más ácidos nucleicos de vía de MVA se añaden para incrementar la producción de isoprenó mediante el uso de esta vía. En algunas modalidades, la célula hospedera produce naturalmente isopreno mediante el uso de la vía de DXP y uno o más ácidos nucleicos de la vía de MVA se añaden para producir isopreno mediante el uso de parte o toda la vía de MVA así como la vía de DXP. En algunas modalidades, la célula hospedera produce naturalmente isopreno mediante el uso tanto de la vía de DXP como de MVAs y uno o más ácidos nucleicos de isopreno sintasa, DXS, IDI, o la vía de MVA se añaden para incrementar la producción de isopreno por una o ambas de estas vías .
Métodos de transformación ilustrativos Los ácidos nucleicos de isopreno sintasa, DXS, IDI , y/o la vía de MVA o vectores que los contienen pueden ser insertados en una célula hospedera (v.gr., una célula vegetal, una célula de hongo, una célula de levadura, o una célula bacteriana aquí descrita) mediante el uso de técnicas estándares para la expresión del polipéptido de isopreno sintasa, DXS, IDI, y/o la vía de MVA codificado. La introducción de un constructo o vector de ADN en una célula hospedera se puede llevar a cabo mediante el uso de técnicas tales como transformación, electroporación, microinyección nuclear, transducción, transfección (v.gr. , lipofección mediada o transfección mediada por DEAE-Dextrin o transfección mediante el uso de un virus de fago recombinante) , incubación con precipitado de ADN de fosfato de calcio, bombardeo a alta velocidad con microproyectiles revestidos con ADN, y fusión de protoplastos. Las técnicas de transformación generales son conocidas en la técnica (véase, v.gr., Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel et al. (eds) capítulo 9, 1987; Sambrook et al, -Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed. , Cold Spring Harbor, 1989; y Campbell et al, Curr. Genet. 16:53-56, 1989, que son incorporadas cada una aquí por referencia en su totalidad, particularmente con respecto a métodos de transformación) . La expresión de polipéptido heterólogo en Trichoderma se describe en la patente de E.U.A. No. 6,022,725; patente de E.U.A. No. 6,268,328; patente de E.U.A. No. 7,262,041; O 2005/001036; Harkki et al; Enzyme Microb. Technol . 13:227-233, 1991; Harkki et al., Bio Technol. 7:596-603, 1989; EP 244,234; EP 215,594; y Nevalainen et al., "The Molecular Biology of Trichoderma y its Application to the Expression of Both Homologous y Heterologous Genes", en Molecular Industrial Mycology, Eds . Leong y Berka, Marcel Dekker Inc., NY pp. 129-148, 1992, que son incorporadas cada una aquí por referencia en su totalidad, particularmente con respecto a transformación y expresión métodos) . También se hace referencia a Cao et al., {Sci. 9:991-1001, 2000; EP 238023; y Yelton et al, Proceedings . Nati. Acad. Sci. USA 81:1470-1474, 1984 (que son incorporadas cada una aquí por referencia en su totalidad, particularmente con respecto a métodos de transformación) para transformación de cepas de Aspergillus . Los ácidos nucleicos introducidos pueden ser integrados en ADN cromosómico o mantenidos como secuencias de replicación extracromosómicas .
Cualquier método conocido en la técnica se puede usar para seleccionar transformantes. En un ejemplo no limitante, los transformantes estables que incluyen un marcador de amdS se distinguen de los transformantes inestables por su tasa de crecimiento más rápida y la formación de colonias circulares con un contorno liso, más que rugoso en medio de cultivo sólido que contiene acetamida. Además, en algunos casos una prueba adicional de estabilidad es conducida al hacer crecer los transformantes en un medio sólido no selectivo (v.gr., un medio que carece de acetamida) , al cosechar las esporas de este medio de cultivo, y al determinar el por ciento de estas esporas que subsecuentemente germinan y crecen en medio selectivo que contiene acetamida.
En algunas modalidades, las células de hongos son transformadas por un proceso que implica formación de protoplastos y transformación de los protoplastos seguida por regeneración de la pared celular de una manera conocida. En una modalidad específica, la preparación de Trichoderma sp. para transformación implica la preparación de protoplastos de micelios de hongos (véase, Campbell et al., Curr. Genet. 16:53-56, 1989, que es incorporada aquí por referencia en su totalidad, particularmente con respecto a métodos de transformación) . En . algunas modalidades, los micelios se obtienen de esporas vegetativas germinadas. Los micelios son tratados con una enzima que digiere la pared celular lo que da por resultado protoplastos. Los protoplastos después son protegidos por la presencia de un estabilizador osmótico en el medio de suspensión. Estos estabilizadores incluyen sorbitol, manitol, cloruro de potasio, sulfato de magnesio, y similares. Usualmente, la concentración de estos estabilizadores varía entre 0.8 M y 1.2 M. Es deseable usar aproximadamente una solución 1.2 M de sorbitol en el medio de suspensión.
La absorción de ADN en la cepa hospedera Trichoderma sp . depende de las concentración de iones de calcio. Generalmente, de aproximadamente 10 mM de CaCl2 y 50 mM de CaCl2 se usa en una solución de absorción. Además del ion de calcio en la solución de absorción, otros compuestos generalmente incluidos son un sistema regulador de pH tal como regulador de pH de TE (10 Mm de Tris, pH 7.4; 1 mM de EDTA) o 10 mM de MOPS, pH 6.0 regulador de pH (ácido morfolinopropansulfónico) y polietilenglicol (PEG) . Aunque no se. pretende estar ligado a ninguna teoría en particular, se cree que el polietilenglicol actúa para fusionar las membranas celulares, lo que permite que los contenidos del medio sean suministrados al citoplasma de la cepa de Trichoderma sp. y el ADN del plásmido sea transferido al núcleo. Esta fusión frecuentemente deja múltiples copias del ADN del plásmido integradas al cromosoma del hospedero.
Usualmente una suspensión que contiene los protoplastos o células de Trichoderma sp. que han sido sometidos a un tratamiento de permeabilidad a una densidad de io5 a 107/mL (tal como 2 x 106/mL) se usan en la transformación. Un volumen de 100 µ??? de estos protoplastos o células en una solución apropiada (v.gr., 1.2 M de sorbitol y 50 mM de CaCl2) se mezclan con el ADN deseado. Generalmente, una concentración alta de PEG se añade la solución de absorción. De 0.1 a 1 volumen de PEG 4000 al 25% se pueden añadir a la suspensión de protoplasto. En algunas modalidades, aproximadamente 0.25 volúmenes se añaden a la suspensión de protoplasto. Aditivos tales como sulfóxido de dimetilo, heparina, espermidina, cloruro de potasio, y similares también se pueden añadir a la solución de absorción y ayudan en la transformación-. Procedimientos similares están disponibles para otras células hospederas de hongos (véase, v.gr., Patente de E.U.A. Nos. 6,022,725 y 6,268,328, que son incorporadas cada una aquí por referencia en su totalidad, particularmente con respecto a métodos de transformación) .
Generalmente, la mezcla es después cultivada a aproximadamente 0°C durante un período de entre 10 y 30 minutos. Después se añade PEG adicional a la mezcla para incrementar adicionalmente la absorción de la secuencia de ácido nucleico deseada. El PEG 4000 al 25% generalmente se añade en volúmenes de 5 a 15 veces el volumen de la mezcla de transformación; sin embargo, volúmenes mayores o menores pueden ser adecuados. El PEG 4000 al 25% es deseablemente aproximadamente 10 veces el volumen de la mezcla de transformación. Después de que se añade el PEG, la mezcla de transformación es entonces cultivada ya sea a temperatura ambiente o sobre hielo antes de la adición de una solución de sorbitol y solución de CaCl2. La suspensión de protoplasto se añade después a alícuota fundida de un medio de crecimiento. Cuando el medio de crecimiento incluye una selección de crecimiento (v.gr., acetamida o un antibiótico) permite el crecimiento de transformantes únicamente.
La transformación de células bacterianas se puede llevar a cabo de conformidad con métodos convencionales, v.gr., como se describe en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, 1982, que es incorporada aquí por referencia en su totalidad, particularmente con respecto a métodos de transformación.
Medios de cultivo de células ilustrativos La invención también incluye una célula o una población de células en cultivo que producen isopreno. Por "células en cultivo" se entiende dos o más células en una solución (v.gr., un medio de células) que permite que las células sufran una o más divisiones celulares. "Células en cultivo" no incluye células vegetales que son parte de una planta multicelular viva que contiene células que se han diferenciado en tejidos vegetales. En varias modalidades, el cultivo de células incluye por lo menos o aproximadamente 10, 20, 50, 100, 200, 500, 1,000, 5,000, 10,000 o más células.
Cualquier fuente de carbono se puede usar para cultivar las células hospederas. El término "fuente de carbono" se refiere a uno o más compuestos que contienen carbono, capaces de ser metabolizados por una célula u organismo hospedero. Por ejemplo, el medio de las células usado para cultivar las células hospederas puede incluir cualquier fuente de carbono adecuada para mantener la viabilidad o crecimiento de las células hospederas.
En algunas modalidades, la fuente de carbono es un carbohidrato (tal como monosacárido, disacárido, oligosacárido o polisacáridos) , azúcar invertido (v.gr. , jarabe de sacarosa enzimáticamente tratado), glicerol, glicerina (v.gr., un subproducto de glicerina de un biodiesel o proceso de fabricación de jabón), dihidroxiacetona , fuente de un carbono, aceite (v.gr. , un aceite de planta o vegetal tal como aceite de maíz, palma, o soya) , grasa animal, aceite animal, ácido graso (v.gr., un ácido graso saturado, un ácido graso insaturado, o ácido graso poliinsaturado) , lípido, fosfolípido, glicerolípido, monoglicérido, diglicérido, triglicérido, polipéptido (v.gr., una proteína o péptido microbiano o vegetal), fuente de carbono renovable (v.gr., una fuente de carbono de biomasa tal .como una fuente de carbono de biomasa hidrolizado) , extracto de levadura, componente de un extracto de levadura, polímero, ácido, alcohol, aldehido, cetona, aminoácido, succinato, lactato, acetato, etanol o cualquier combinación de dos o más de los anteriores. En algunas modalidades, la fuente de carbono es un producto de fotosíntesis, que incluye, pero sin limitarse a, glucosa.
Los monosacáridos ilustrativos incluyen glucosa y fructosa; oligosacáridos ilustrativos incluyen lactosa y sacarosa, y polisacáridos ilustrativos incluyen almidón y celulosa. Los carbohidratos ilustrativos incluyen azúcares de C6 (v.gr., fructosa, mañosa, galactosa o glucosa) y azúcares de C5 (v.gr., xilosa o arabinosa) . En algunas modalidades, el medio de las células incluye un carbohidrato así como una fuente de carbono distinta de un carbohidrato (v.gr., glicerol, glicerina, dihidroxiacetona, fuente de un carbono, aceite, grasa animal, aceite animal, ácido graso, lípido, fosfolípido, glicerolípido, monoglicérido, diglicérido, triglicérido, fuente de carbono renovable, o un componente de un extracto de levadura) . En algunas modalidades, el medio dé las células incluye un carbohidrato así como un polipéptido (v.gr., una proteína o péptido microbiano o vegetal) . En algunas modalidades, el polipéptido microbiano es un polipéptido de levadura o bacterias. En algunas modalidades, el polipéptido vegetal es un polipéptido de soya, maíz, cañóla, jatrofa, palmera, cacahuate, girasol, coco, mostaza, semilla de colza, semilla de algodón, semilla de palmera, olivo, cártamo, ajonjolí o semilla de linaza.
En algunas modalidades, la concentración del carbohidrato es por lo menos o aproximadamente 5 gramos por litro de caldo (g/L, en donde el volumen de caldo incluye tanto el volumen del medio de las células como el volumen de las células), tal como por lo menos o aproximadamente 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 80, 100, 150, 200, 300, 400, o más g/L. En algunas modalidades, la concentración de los carbohidratos es de aproximadamente 50 y aproximadamente 400 g/L, tal como de aproximadamente 100 y aproximadamente 360 g/L, de aproximadamente 120 y aproximadamente 360 g/L, o de aproximadamente 200 y aproximadamente 300 g/L. En algunas modalidades, esta concentración de carbohidrato incluye la cantidad total de carbohidrato que se añade antes y/o durante el cultivo de las células hospederas.
En algunas modalidades, las células son cultivadas bajo condiciones de glucosa limitadas. Por "condiciones de glucosa limitada" se entiende que la cantidad de glucosa que se añade es menor que o aproximadamente 105% (tal como aproximadamente 100%) de la cantidad de glucosa que es consumida por las células. En modalidades particulares, la cantidad de glucosa que se añade al medio de cultivo es aproximadamente la misma que la cantidad de glucosa que es consumida por las células durante un período específico. En algunas modalidades, la tasa de crecimiento celular es controlada al limitar la cantidad de glucosa añadida de tal manera que las células que crecen a la tasa que puede ser soportada por la cantidad de glucosa en el medio de las células. En algunas modalidades, la glucosa no se acumula durante el tiempo que las células son cultivadas. En varias modalidades, las células son cultivadas bajo condiciones de glucosa limitadas durante más de, o aproximadamente, 1, 2, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60 ó 70 horas. En varias modalidades, las células son cultivadas bajo condiciones de glucosa limitadas para más de, o aproximadamente, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95 ó 100% de la longitud total de tiempo que las células son cultivadas. Aunque no se pretende estar limitado por alguna teoría en particular, se cree que las condiciones de glucosa limitadas pueden permitir regulación más favorable de las células.
En algunas modalidades, las células son cultivadas en presencia de un exceso de glucosa. En modalidades particulares, la cantidad de glucosa que se añade es mayor que aproximadamente 105% (tal como aproximadamente o más de 110, 120, 150, 175, 200, 250, 300, 400 ó 500%) o más de la cantidad de glucosa que es consumido por las células durante un período específico. En algunas modalidades, la glucosa se acumula durante el tiempo que las células son cultivadas.
Los lípidos ilustrativos son cualquier sustancia que contiene uno o más ácido grasos que son ácidos grasos de C4 y mayores que son saturados, insaturados o ramificados.
Los aceites ilustrativos son lípidos que son líquidos a temperatura ambiente. En algunas modalidades, el lípido contiene uno o más ácidos grasos de C4 o mayores (v.gr., contienen uno o más ácido graso saturado, insaturado, o ramificado con cuatro o más carbonos) . En algunas modalidades, el aceite se obtiene de soya, maíz, cañóla, jatrofa, palmera, cacahuate, girasol, coco, mostaza, semilla de colza, semilla de algodón, semilla de palmera, olivo, cártamo, ajonjolí, semilla de linaza, células microbianas oleaginosas, cebo chino o cualquier combinación de dos o más de los anteriores .
Los ácidos grasos ilustrativos incluyen compuestos de la fórmula RCOOH, en donde "R" es un hidrocarburo. Los ácidos grasos insaturados ilustrativos incluyen compuestos en donde "R" incluye por lo menos un doble enlace carbono-carbono. Los ácido grasos insaturados ilustrativos incluyen, pero no se limitan a, ácido oleico, ácido vaccénico, ácido linoleico, ácido palmitolaídico, y ácido araquidónico . Los ácidos grasos poliinsaturados ilustrativos incluyen compuestos en donde "R" incluye una pluralidad de dobles enlaces carbono-carbono . Los ácidos grasos saturados ilustrativos incluyen compuestos en donde "R" es un grupo alifático saturado. En algunas modalidades, la fuente de carbono incluye uno o más ácido grasos de C12-C22 , tales como un ácido grasos saturado de Ci2, un ácido grasos saturado de C14, un ácido grasos saturado de C16, un ácido grasos saturado de Cíe, un ácido grasos saturado de C2o, o un ácido grasos saturado de C22- En una modalidad ilustrativa, el ácido graso es ácido palmítico. En algunas modalidades, la fuente de carbono es una sal de un ácido graso (v.gr. , un ácido graso insaturado) , un derivado de un ácido graso (v.gr., un ácido graso insaturado) , o una sal de un derivado de ácido graso (v.gr., un ácido graso insaturado). Las sales adecuadas incluyen, pero no se limitan a, sales de litio, sales de potasio, sales de sodio, y similares. Los di- y trigliceroles son ésteres de ácido graso de glicerol.
En algunas modalidades, la concentración del lípido, aceite, grasa, ácido graso, monoglicérido, diglicérido o triglicérido es por lo menos o aproximadamente i gramo por litro de caldo (g/L, en donde el volumen de caldo incluye tanto el volumen del medio de las células como el volumen de las células) , tal como por lo menos o aproximadamente 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 80, 100, 150, 200, 300, 400 o más g/L. En algunas modalidades, la concentración del lípido, aceite, grasa, ácido graso, monoglicérido, diglicérido o triglicérido es de aproximadamente 10 a aproximadamente 400 g/L, tal como de aproximadamente 25 a aproximadamente 300 g/L, de aproximadamente 60 a aproximadamente 180 g/L, o de aproximadamente 75 a aproximadamente 150 g/L. En algunas modalidades, la concentración incluye la cantidad total del lípido, aceite, grasa, ácido graso, monoglicérido, diglicérido o triglicérido que se añade antes y/o durante el cultivo de las células hospederas. En algunas modalidades, la fuente de carbono incluye tanto (i) un lípido, aceite, grasa, ácido graso, monoglicérido, diglicérido o triglicérido como (ii) un carbohidrato, tal como glucosa. En algunas modalidades,, la relación del lípido, aceite, grasa, ácido graso, monoglicérido, diglicérido o triglicérido al carbohidrato es aproximadamente 1:1 sobre una base de carbono (es decir, un carbono en el lípido, aceite, grasa, ácido graso, monoglicérido, diglicérido o triglicérido por carbono de carbohidrato) . En modalidades particulares, la cantidad del lípido, aceite, grasa, ácido graso, monoglicérido, diglicérido o triglicérido es de aproximadamente 60 y 180 g/L, y la cantidad del carbohidrato es de aproximadamente 120 y 360 g/L.
Las fuentes de carbono de polipéptido microbiano ilustrativas incluyen uno o más polipéptidos de levaduras o bacterias. Las fuentes de carbono de polipéptido vegetales ilustrativas incluyen uno o más polipéptidos de soya, maíz, cañóla, jatrofa, palmera, cacahuate, girasol, coco, mostaza, semilla de colza, semilla de algodón, semilla de palmera, olivo, cártamo, ajonjolí o semilla de linaza.
Las fuentes de carbono renovables ilustrativas incluyen permeado de suero de queso, macerado de maíz, melaza de remolacha azucarera, malta de cebada, y componentes de cualquiera de los anteriores. Fuente de carbono renovables ilustrativas también incluyen glucosa, hexosa, pentosa y xilosa presentes en la biomasa, tal como maíz, pasto aguja, caña de azúcar, desechos celulares de procesos de fermentación, y subproducto de proteína a partir de la molienda de soya, maíz o trigo. En algunas modalidades, la fuente de carbono de biomasa es un material lignocelulósico, hemicelulósico o celulósico tal como, pero no limitado a, un pasto, trigo, paja de trigo, bagazo, bagazo de caña de azúcar, pulpa de madera suave, maíz, mazorca o cáscara de maíz, semilla de maíz, fibra de semillas de maíz, rastrojo de maíz, pasto aguja, producto de cáscara de arroz, o un subproducto de molienda húmeda o seca de granos (v.gr., maíz, sorgo, centeno, triticale, cebada, trigo, y/o grans de destilerías) . Materiales celulósicos ilustrativos incluyen madera, papel y desechos de pulpa, plantas herbáceas, y pulpa de fruta. En algunas modalidades, la fuente de carbono incluye cualquier parte de la planta, tal como tallos, granos, raíces o tubérculos. En algunas modalidades, toda o parte de cualquiera de las siguientes plantas se usan como una fuente de carbono: maíz, trigo, centeno, sorgo, triticale, arroz, mijo, cebada, mandioca, leguminosas, tales como frijoles y guisantes, papas, camotes, plátanos, caña de azúcar y/o tapioca. En algunas modalidades, la fuente de carbono es un hidrolizado de biomasa, tal como un hidrolizado de biomasa que incluye tanto xilosa como glucosa o que incluye tanto sacarosa como glucosa.
En algunas modalidades, la fuente de carbono renovable (tal como biomasa) es pretratada antes de añadirla al medio de cultivo de células. En algunas modalidades, el pretratamiento incluye pretratamiento enzimático, pretratamiento químico o una combinación tanto de pretratamiento enzimático como químico (véase, por ejemplo, Farzaneh et al, Bioresource Technology 96 (18) : 2014-2018, 2005; patente de E.U.A. No. 6,176,176; patente de E.U.A. No. 6,106,888; que son incorporadas cada una aquí por referencia» en su totalidad, particularmente con respecto al pretratamiento de fuentes de carbono renovables) . En algunas modalidades, la fuente de carbono renovable es parcialmente o completamente hidrolizada antes de añadirla al medio de cultivo de células.
En algunas modalidades, la fuente de carbono renovable (tal como rastrojo de maíz) sufre pretratamiento de expansión de fibra de amonio (AFEX) antes añadirla al medio de cultivo de células (véase, por ejemplo, Farzaneh et al., Bioresource Technology 96 (18) : 2014-2018, 2005) . Durante el pretratamiento de AFEX, una fuente de carbono renovable es tratada con amoniaco anhidro líquido a temperaturas moderadas (tales como aproximadamente 60 a aproximadamente 100°C) y presión alta (tal como aproximadamente 17.57 a aproximadamente 21.09 kg/cm2) durante aproximadamente 5 minutos. Después, la presión es rápidamente liberada. En este proceso, los efectos químicos y físicos combinados de solubilización de lignina, hidrólisis de hemicelulosa , descristalización de celulosa, y área de superficie incrementada permite conversión enzimática casi completa de celulosa y hemicelulosa a azúcares fermentables . El pretratamiento de AFEX tiene la ventaja de que casi todo el amoniaco puede ser recuperado y reutilizado, mientras el resto sirve como fuente de nitrógeno para microbios en procesos corriente abajo. También, una corriente de lavado no es requerida para pretratamiento de AFEX. Por lo tanto, la recuperación de materia seca después del tratamiento de AFEX es esencialmente 100%. AFEX es básicamente un proceso seco a seco. La fuente de carbono renovable tratada es estable durante períodos largos y se puede alimentar a cargas de sólido muy altas en procesos de hidrólisis enzimática o fermentación. La celulosa y hemicelulosa son bien conservadas en el proceso de AFEX, con poca o ninguna degradación. No hay necesidad de neutralización antes de la hidrólisis enzimática de una fuente de carbono renovable que ha sufrido pretratamiento de AFEX. La hidrólisis enzimática de fuentes de carbono tratadas con AFEX produce corrientes de azúcar limpias para subsecuente uso en fermentación.
En algunas modalidades, la concentración de la fuente de carbono (v.gr. , una fuente de carbono renovable) es equivalente a por lo menos o aproximadamente 0.1, 0.5, 1, 1.5 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 40 ó 50% de glucosa (p/v) . La cantidad equivalente de glucosa se puede determinar mediante el uso de métodos de HPLC estándares con glucosa como una referencia para medir la cantidad de glucosa generada a partir de la fuente de carbono. En algunas modalidades, la concentración de la fuente de carbono (v.gr., una fuente de carbono renovable) es equivalente a de aproximadamente 0.1 y aproximadamente 20% de glucosa, tal como de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 10% de glucosa, de aproximadamente 0.5 a aproximadamente 10% de glucosa, de aproximadamente 1 a aproximadamente 10% de glucosa, de aproximadamente 1 a aproximadamente 5% de glucosa, o de aproximadamente 1 a aproximadamente 2% de glucosa.
En algunas modalidades, la fuente de carbono incluye extracto de levadura o uno o más componentes de extracto de levadura. En algunas modalidades, la concentración de extracto de levadura es por lo menos 1 gramo de extracto de levadura por litro de caldo (g/L, en donde el volumen de caldo incluye tanto el volumen del medio de las células como el volumen de las células) , tal como por lo menos o aproximadamente 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 80, 100, 150, 200, 300, o más g/L. En algunas modalidades, la concentración de extracto de levadura es dé aproximadamente 1 a aproximadamente 300 g/L, tal como de aproximadamente 1 a aproximadamente 200 g/L, de aproximadamente 5 a aproximadamente 200 g/L, de aproximadamente 5 a aproximadamente 100 g/L, o de aproximadamente 5 a aproximadamente 60 g/L. En algunas modalidades, la concentración incluye la cantidad total de extracto de levadura que se añade antes y/o durante el cultivo de las células hospederas. En algunas modalidades, la fuente de carbono incluye tanto extracto de levadura (o uno o más componentes del mismo) como otra fuente de carbono, tal como glucosa. En algunas modalidades, la relación de extracto de levadura a la otra fuente de carbono es aproximadamente 1:5, aproximadamente 1:10, o aproximadamente 1:20 (p/p) - Además, la fuente de carbono también puede ser sustratos de un carbono tal como dióxido de carbono o metanol . La producción de glicerol a partir de fuentes de un solo carbono (v.gr. , metanol, formaldehído o formiato) se ha reportado en levaduras metilotróficas (Yamada et al., Agrie. Biol . Chem. , 53(2) 541-543, 1989, que es incorporada aquí por referencia en su totalidad, particularmente con respecto a fuentes de carbono) y en bacterias (Hunter et . al, Biochemistry, 24, 4148-4155, 1985, que es incorporada aquí por referencia en su totalidad, particularmente con respecto a fuentes de carbono) . Estos organismos pueden asimilar compuestos de un solo carbono, que varían en estado de oxidación de metano a formiato, y producen glicerol. La vía de asimilación de carbono puede ser a través de monofosfato de ribulosa, a través de serina o a través de momofosfato de xilulosa (Gottschalk, Bacterial Metabolism, Segunda Edición, Springer-Verlag : New York, 1986, que es incorporada aquí por referencia en su totalidad, particularmente con respecto a fuentes de carbono) . La vía de monofosfato de ribulosa implica la condensación de formiato con ribulose-5-fosfate para formar un azúcar de seis carbonos que se vuelve fructosa y finalmente el producto de tres carbonos gliceraldehído-3 -fosfato. Asimismo, la vía de serina asimila el compuesto de un carbono en la vía glicolítica mediante tetrahidrofolato de metileno.
Además de sustratos de de uno y dos carbonos, los organismos metilotróficos también se sabe que utilizan un número de otro carbono que contiene compuestos tales como metilamina, glucosamina y una variedad de aminoácidos para actividad metabólica. Por ejemplo, la levadura metilotrófica se sabe que utiliza el carbono de metilamina para formar trehalosa o glicerol (Bellion et al, Microb . Growth Cl Compd. , [Int. Sym . ] , 7a ed. , 415-32. Editores: Murrell et al, Publisher: Intercept, Andover, R.U. , 1993, que es incorporadas aquí por referencia en su totalidad, particularmente con respecto a fuentes de carbono) . De manera similar, varias especies de Candida metabolizan alanina o ácido oleico (Suiter et al, Arch. Microbiol . 153(5), 485-9, 1990, que es incorporada aquí por referencia en su totalidad, particularmente con respecto a fuentes de carbono) .
En algunas modalidades, las células son cultivadas en un medio estándar que contiene sales fisiológicas y nutrientes (véase, v.gr., Pourquie, J. et al., Biochewistry and Genetics of Cellulose Degradation, eds . Aubert et al., Academic Press, pp . 71-86, 1988 e limen et al., Appl . Environ. Microbiol. 63:1298-1306, 1997, que son incorporadas cada una aquí por referencia en su totalidad, particularmente con respecto a medios de células) . Medios de crecimiento ilustrativos son medios comercialmente preparados comunes tales como caldo de Luria Bertani (LB) , caldo Sabouraud Dextrosé (SD) , o caldo de medio de levadura (YM) . Otros medios de crecimiento definidos o sintéticos también se pueden usar, y el medio apropiado para crecimiento de células hospederas particulares son conocidos por los expertos en la técnica de microbiología o ciencia de fermentación.
Además de una fuente de carbono apropiada, el medio de las células deseablemente contiene minerales, sales, cofactores, reguladores de pH, y otros componentes adecuados conocidos por los expertos en la técnica adecuados para el crecimiento de los cultivos o el incremento de la producción de isopreno (véase, por ejemplo, WO 2004/033646 y referencias citadas en ésta y WO 96/35796 y referencias citadas en ésta, que son incorporadas cada una aquí por referencia en su totalidad, particularmente con respecto a medios de células y condiciones de cultivo de células) . En algunas modalidades en donde un ácido nucleico de isopreno sintasa, DXS, IDI , y/o la vía de MVA está bajo el control de un promotor inducible, el agente inductor (v.gr., un azúcar, sal de metal o antimicrobiano) , es deseablemente añadido al medio a una concentración efectiva para inducir expresión de un polipéptido de isopreno sintasa, DXS, IDI, y/o la vía de MVA. En algunas modalidades, el medio de células tiene un antibiótico (tal como kanamicina) que corresponde al ácido nucleico de resistencia a antibióticos (tal como un ácido nucleico de resistencia a kanamicina) sobre un vector que tiene uno o más ácidos nucleicos de DXS, IDI, o la vía de MVA.
Condiciones de cultivo de células ilustrativo Materiales y métodos adecuados para el mantenimiento y crecimiento de cultivos bacterianos son bien conocidos en la técnica. Técnicas ilustrativas se pueden encontrar en Manual of Methods for General Bacteriology Gerhardt et al., eds) , American Society for Microbiology, Washington, D. C. (1994) o Brock en Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology, Segunda Edición (1989) Sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA, que son incorporadas cada una aquí por referencia en su totalidad, particularmente con respecto a técnicas de cultivo de células. En algunas modalidades, las células son cultivadas en un medio de cultivo bajo condiciones que permiten la expresión de uno o más polipéptidos de isopreno sintasa, DXS, IDI o la vía de MVA codificados por un ácido nucleico insertado en las células hospederas.
Las condiciones de cultivo de células estándares se pueden usar para cultivar las células (véase, por ejemplo, O 2004/033646 y referencias citadas en ésta, que son incorporadas cada una aquí por referencia en su totalidad, particularmente con respecto a condiciones de cultivo de células y fermentación) . Las células se hacen crecer y se mantienen a una temperatura apropiada, mezcla de gases, y pH (tal como a aproximadamente 20 a aproximadamente 37°C, a aproximadamente 6% a aproximadamente 84% de C02 , y a un pH de aproximadamente 5 a aproximadamente 9) . En algunas modalidades, las células se hacen crecer a 35°C en un medio de cultivo de células. En algunas modalidades, v.gr., los cultivos son cultivados a aproximadamente 28°C en un medio apropiado en cultivos de agitación o fermentadores hasta que se logra la cantidad deseada de producción de isopreno. En algunas modalidades, los intervalos de pH para fermentación son de aproximadamente pH 5.0 a aproximadamente pH 9.0 (tal como aproximadamente pH 6.0 a aproximadamente pH 8.0 o aproximadamente 6.5 a aproximadamente 7.0). Las reacciones se pueden llevar a cabo bajo condiciones aeróbicas, anóxicas o anaeróbicas basadas en los requerimientos de las células hospederas. Las condiciones de cultivo ilustrativas para un hongo filamentoso dado son conocidas en la técnica y se pueden encontrar en la literatura científica y/o a partir de las fuentes de los hongos tal como el American Type Culture Collection and Fungal Genetics Stock Center.
En varias modalidades, las células se hacen crecer mediante el uso de cualquier modo de fermentación conocido, tal como procedimientos intermitente, intermitente con alimentación, o continuos. En algunas modalidades, se usa un método de fermentación intermitente. La fermentación intermitente clásica es un sistema cerrado en donde la composición de los medios se fija al principio de la fermentación y no es sometida a alteraciones artificiales durante la fermentación. Por lo tanto, al principio de la fermentación el medio de las células es inoculado con las células hospederas deseadas y se deja que ocurra la fermentación sin añadir nada al sistema. Típicamente, sin embargo, fermentación "intermitente" es intermitente con respecto a la adición de fuente de carbono y a menudo se hacen intentos para controlar factores tales como pH y concentración de oxígeno. En sistemas intermitentes, las composiciones de metabolito y biomasa del sistema cambian constantemente hasta el tiempo en que la fermentación se detiene. Dentro de los cultivos intermitentes, las células moderan a través de una fase de demora estática a una fase logarítmica de crecimiento alta y finalmente a una fase estacionaria en donde la tasa de crecimiento es disminuida o detenida. En algunas modalidades, las células en la fase logarítmica son responsables del volumen de producción de isopreno. En algunas modalidades, las células en la fase estacionaria producen isopreno.
En algunas modalidades, se usa una variación en el sistema intermitente estándar, tal como el sistema intermitente con alimentación. Los procesos de fermentación intermitente con alimentación comprenden un sistema intermitente típico con la excepción de que la fuente de carbono se añade en incrementos a medida que la fermentación progresa. Los sistemas de fermentación intermitente con alimentación son útiles cuando la represión de catabolitos es apta para inhibir el metabolismo de las células y en donde es deseable tener cantidades limitadas de fuente de carbono en el medio de células. Las fermentaciones intermitentes con alimentación se pueden llevar a cabo con la fuente de carbono (v.gr., glucosa) en una cantidad limitada o en exceso. La medición de esta concentración de fuente de carbono real en sistemas intermitentes con alimentación es difícil y por lo tanto se estima sobre la base de los cambios de factores medibles tales como pH, oxígeno disuelto, y la presión parcial de gases de desecho tales como C02. Las fermentaciones intermitente e intermitente con alimentación son comunes y bien conocidas en la técnica y ejemplos se pueden encontrar en Brock, Biotechnology : A Textbook of Industrial Microbiology, Segunda Edición (1989) Sinauer Associates, Inc., que es incorporada aquí por referencia en su totalidad, particularmente con respecto a condiciones de cultivo de células y fermentación.
En algunas modalidades, se usan métodos de fermentación continuos. La fermentación continua es un sistema abierto en donde un medio de fermentación definido se añade continuamente a un biorreactor y una cantidad igual al medio acondicionado es removido simultáneamente para procesamiento. La fermentación continua generalmente mantiene los cultivos a una densidad alta constante en donde las células están principalmente en crecimiento de fase logarítmica.
La fermentación continua permite la modulación de un factor o cualquier número de factores que afectan el crecimiento celular o producción de isopreno. Por ejemplo, un método mantiene un nutriente limitante tal como el nivel de fuente de carbono o nitrógeno a una tasa fija y permite que todos los demás parámetros se moderen. En otros sistemas, un número de factores que afectan el crecimiento pueden ser alterados continuamente mientras la concentración de células (v.gr., la concentración medida por turbidez del medio) se mantiene constante. Los sistemas continuos luchan por mantener condiciones de crecimiento de estado constante. Por lo tanto, la pérdida de células debido a la extracción de medio es equilibrada contra la tasa de crecimiento de células en la fermentación. Los métodos de modulación de nutrientes y factores de crecimiento para procedimientos de fermentación continuos así como técnicas para aumentar al máximo la tasa de formación de producto son bien conocidos en la técnica de microbiología industrial y una variedad de métodos son detallados por Brock, Biotechnology : A Textbook of Industrial Microbiology, Segunda Edición (1989) Sinauer Associates, Inc., que es incorporada aquí por referencia en su totalidad, particularmente con respecto a condiciones de cultivo de células y fermentación.
En algunas modalidades, las células son inmovilizadas en un sustrato como catalizadores de células enteros y sometidos a condiciones de fermentación para la producción de isopreno.
En algunas modalidades, botellas de cultivo líquido se colocan sobre agitadores a fin de introducir oxígeno al líquido y mantener la uniformidad del cultivo. En algunas modalidades, una incubadora se usa para controlar la temperatura, humedad, velocidad de agitación y/o otras condiciones en las cuales se hace crecer un cultivo. Las incubadoras más sencillas son cajas aisladas con un calentador ajustable, que típicamente llega hasta -65 °C. Incubadoras más elaboradas también pueden incluir la capacidad para bajar la temperatura (por refrigeración) , o la capacidad para controlar la humedad o los niveles de C02. La mayoría de las incubadoras incluyen un regulador de tiempo; algunas también pueden ser programadas para ciclar a través, de diferentes temperaturas, niveles de humedad, etc. Las incubadoras pueden variar en tamaño desde las de mesa hasta unidades del tamaño de un cuarto pequeño.
Si se desea, una porción o todo el medio de las células se puede cambiar para rellenar nutrientes y/o evitar la acumulación de subproductos metabólicos potencialmente nocivos y células muertas. En el caso de cultivos de suspensión, las células puede ser separadas a partir de los medios por centrifugación o filtración del cultivo en suspensión y después resuspensión de las células en un medio fresco. En el caso de cultivos adherentes, los medios pueden ser removidos directamente por aspiración y reemplazados. En algunas modalidades, el medio de las células permite por lo menos que una porción de las células se divida por lo menos o aproximadamente 5, 10, 20, 40, 50, 60, 65, o más divisiones celulares en un cultivo continuo (tal como un cultivo continuo sin dilución) .
En algunas modalidades, un promotor constitutivo o de fuga (tal como un promotor Trc) se usa y un compuesto (tal como IPTG) no se añade para inducir expresión del ácido nucleico de isopreno sintasa, DXS, IDI o la vía de MVA(s) operablemente enlazado al promotor. En algunas modalidades, un compuesto (tal como IPTG) se añade para inducir la expresión del ácido nucleico de isopreno sintasa, DXS, IDI o la vía de MVA(s) operablemente enlazado al promotor.
Métodos ilustrativos para desacoplar la producción de isopreno del crecimiento de células Deseablemente, el carbono del material de alimentación es convertido a isopreno más que al crecimiento y mantenimiento de las células. En algunas modalidades, las células se hacen crecer a una OD600 media o baja, después la producción de isopreno es iniciada o incrementada. Esta estrategia permite que una porción del carbono grande sea convertida a isopreno.
En algunas modalidades, las células alcanzan una densidad óptica tal que ya no se dividen o se dividen en forma extremadamente lenta, pero aún producen isopreno por varias horas (tal como aproximadamente 2, 4, 6, 8, 10, 15, 20, 25, 30, o más horas). Por ejemplo, las figuras 60A-67C ilustran que las células aún pueden producir una cantidad sustancial de ácido mevalónico o isopreno después de que las células alcanzan una densidad óptica tal que ya no se dividen o se dividen en forma extremadamente lenta. En algunos casos, la densidad óptica a 550 nm disminuye con el tiempo (tal como una disminución en la densidad óptica después de que las células ya no están en una fase de crecimiento exponencial debido a lisis celular, cese del crecimiento, falta de nutrientes u otros factores que conducen a falta de crecimiento celular) , y las células aún producen una cantidad sustancial de ácido mevalónico o isopreno. En algunas modalidades, la densidad óptica a 550 nm de las células incrementa por menos de o aproximadamente 50% (tal como por menos de o aproximadamente 40, 30, 20, 10, 5 ó 0%) durante un cierto período (tal como más de, o aproximadamente, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50 ó 60 horas), y las células producen isopreno a más de, o aproximadamente, 1, 10, 25, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1,000; 1,250; 1,500; 1,750; 2,000; 2,500; 3,000; 4,000; 5,000; 10,000; 20,000; 30,000; 40,000; 50,000; 100,000; 200,000; 300,000; 400,000; 500,000; 600,000; 700,000; 800,000; 900,000; 1,000,000 o más nmoles de isopreno/gramo de células paira el peso húmedo de las células/hora (nmoles/gwcm/hr) durante este período. En algunas modalidades, la cantidad de isopreno es de aproximadamente 2 a aproximadamente 5,000 nmoles/gwcm/hr, tal como de aproximadamente 2 a aproximadamente 100 nmoles/gwcm/hr, aproximadamente 100 a aproximadamente 500 nmoles/gwcm/hr, aproximadamente 150 a aproximadamente 500 nmoles/gwcra /hr, aproximadamente 500 a aproximadamente 1,000 nmoles/gwcm/hr, aproximadamente 1,000 a aproximadamente 2,000 nmoles/gwcm/hr, o aproximadamente 2,000 a aproximadamente 5,000 nmoles/gwcm/h . En algunas modalidades, la cantidad de isopreno es de aproximadamente 20 a aproximadamente 5,000 nmoles/g„cm/hr, aproximadamente 100 a aproximadamente 5,000 nmoles/gwcm/hr, aproximadamente 200 a aproximadamente 2,000 nmoles/gwcm/hr, aproximadamente 200 a aproximadamente 1,000 nmoles/gwcra/hr, aproximadamente 300 a aproximadamente 1,000 nmoles/gwcm/hr, o aproximadamente 400 a aproximadamente 1,000 nmoles/gwcm/hr .
En algunas modalidades, la densidad óptica a 550 nm de las células incrementa por menos de o aproximadamente 50% (tal como por menos de o aproximadamente 40, 30, 20, 10, 5 ó 0%) durante un cierto período (tal como más de, o aproximadamente, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50 ó 60 horas), y las células producen un título acumulativo (cantidad total) de isopreno a más de, o aproximadamente, 1, 10, 25, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1,000, 1,250, 1,500, 1,750, 2,000, 2,500, 3,000, 4,000, 5,000, 10,000, 50,000, 100,000, o más mg de isopreno/L de caldo (mg/Lcaldo, en donde el volumen de caldo incluye el volumen de las células y el medio de las células) durante este período. En algunas modalidades, la cantidad de isopreno es de aproximadamente 2 a aproximadamente 5,000 mg/Lcaido/ tal como de aproximadamente 2 a aproximadamente 100 mg/Lcaido, aproximadamente 100 a aproximadamente 500 ntg/Lcaido, aproximadamente 500 a aproximadamente 1,000 mg/Lcaido, aproximadamente 1, 000 a aproximadamente 2,000 mg/Lcaido, o aproximadamente 2, 000 a aproximadamente 5,000 mg/Lcaido. En algunas modalidades, la cantidad de isopreno es de aproximadamente 20 a aproximadamente 5,000 mg/Lcaido, aproximadamente 100 a aproximadamente 5,000 mg/Lcaido, aproximadamente 200 a aproximadamente 2,000 mg/LCaido, aproximadamente 200 a aproximadamente 1,000 mg/Lcaido, aproximadamente 300 a aproximadamente 1,000 mg/Lcaido/ o aproximadamente 400 a aproximadamente 1,000 mg/Lcaido- En algunas modalidades, la densidad óptica a 550 nm de las células incrementa por menos de o aproximadamente 50% (tal como por menos de o aproximadamente 40, 30, 20, 10, 5 ó 0%) durante un cierto período (tal como más de, o aproximadamente, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50 ó 60 horas), y las células convierten más de, o aproximadamente, 0.0015, 0.002, 0.005, 0.01, 0.02, 0.05, 0.1, 0.12, 0.14, 0.16, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.2, 1.4, 1.6, 1.8, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 5.0, 6.0, 7.0 ó 8.0% del carbono en el medio de cultivo de células a isopreno durante este período. En algunas modalidades, el por ciento de conversión de carbono a isopreno es de aproximadamente 0.002 a aproximadamente 4.0%, aproximadamente 0.002 a aproximadamente 3.0%, aproximadamente 0.002 a aproximadamente 2.0%, aproximadamente 0.002 a aproximadamente 1.6%, aproximadamente 0.002 a aproximadamente 0.005%, aproximadamente 0.005 a aproximadamente 0.01%, aproximadamente 0.01 a aproximadamente 0.05%, aproximadamente 0.05 a aproximadamente 0.15%, 0.15 a aproximadamente 0.2%, aproximadamente 0.2 a aproximadamente 0.3%, aproximadamente 0.3 a aproximadamente 0.5%, aproximadamente 0.5 a aproximadamente 0.8%, aproximadamente 0.8 a aproximadamente 1.0%, o aproximadamente 1.0 a aproximadamente 1.6%. En algunas modalidades, el por ciento de conversión de carbono a isopreno es de aproximadamente 0.002 a aproximadamente 0.4%, 0.002 a aproximadamente 0.16%, 0.04 a aproximadamente 0.16%, aproximadamente 0.005 a aproximadamente 0.3%, aproximadamente 0.01 a aproximadamente 0.3%, o aproximadamente 0.05 a aproximadamente 0.3%.
En algunas modalidades, el isopreno es únicamente producido en la fase estacionaria. En algunas modalidades, el isopreno es producido tanto en la fase de crecimiento como en la fase estacionaria. En varias modalidades, la cantidad de isopreno producido (tal como la cantidad total de isopreno producido o la cantidad de isopreno producido por litro de caldo por hora por OD60o) durante la fase estacionaria es mayor que o aproximadamente 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, o más veces la cantidad de isopreno producido durante la fase de crecimiento para la misma longitud de tiempo. En varias modalidades, más de, o aproximadamente, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 99% o más de la cantidad total de isopreno que es producido (tal como la producción de isopreno durante una fermentación durante una cierta cantidad de tiempo, tal como 20 horas) es producido mientras las células están en fase estacionaria. En varias modalidades, más de, o aproximadámente, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 99% o más de la cantidad total de isopreno que es producido (tal como la producción de isopreno durante una fermentación durante una cierta cantidad de tiempo, tal como 20 horas) es producido mientras las células se dividen lentamente o no se dividen en absoluto de tal manera que la densidad óptica a •550 nm de las células incrementa por menos de o aproximadamente 50% (tal como por menos de o aproximadamente 40, 30, 20, 10, 5 ó 0%) . En algunas modalidades, el isopreno es únicamente producido en la fase de crecimiento.
En algunas modalidades, uno o más ácidos nucleicos de la vía de VA, IDI, DXP o isopreno sintasa son puestos bajo el control de un promotor o factor que es más activo en la fase estacionaria que en la fase de crecimiento. Por ejemplo, ' uno o más ácidos nucleicos de la vía de MVA, IDI, DXP o isopreno sintasa pueden ser puestos bajo control de un factor sigma de fase estacionaria, tal como RpoS . En algunas modalidades, uno o más ácidos nucleicos de la vía de MVA, . IDI, DXP o isopreno sintasa son puestos bajo control de un promotor inducible en fase estacionaria, tal como un promotor inducible por un activo regulador de respuesta en fase estacionaria .
Producción de isopreno dentro de intevalos de operación seguros La producción de isopreno dentro de los niveles de operación seguros de conformidad con sus características de inflamabilidad simplifica el diseño y construcción de instalaciones comerciales, mejora en forma vasta la capacidad para operar con seguridad, y. limita el potencial de que ocurran incendios. En particular, los intervalos óptimos para la producción de isopreno están dentro de la zona segura, es decir, el intervalo no inflamable de concentraciones de isopreno. En tal aspecto, la invención se refiere a un método para la producción de isopreno dentro del intervalo no inflamable de concentraciones de isopreno (fuera de la envoltura de inflamabilidad del isopreno) .
Por lo tanto, el modelado por computadora y las pruebas experimentales se usaron para determinar los límites de inflamabilidad del isopreno (tal como isopreno en presencia de 02, N2, C02, o cualquier combinación de dos o más de los gases anteriores) a fin de asegurar seguridad del proceso. La envoltura de inflamabilidad se caracteriza por el límite de inflamabilidad inferior (LFL) , el límite de inflamabilidad superior (UFL) , . la concentración de oxígeno limitante (LOC) , y la temperatura limitante. Para que un sistema sea inflamable, una cantidad mínima de combustible (tal como isopreno) debe estar en presencia de una cantidad mínima de oxidante, típicamente oxígeno. El LFL es la cantidad mínima de isopreno que .debe estar presente para resistir quemadura, mientras que el UFL es la cantidad máxima de isopreno que puede estar presente. Por arriba de este límite, la mezcla es rica en combustible y la fracción de oxígeno es demasiado baja para tener una mezcla inflamable. La LOC indica la fracción mínima de oxígeno que también debe estar presente para tener una mezcla inflamable. La temperatura limitante se basa en el punto de inflamabilidad de isopreno y es aquella temperatura más baja a la cual la combustión de isopreno se puede propagar. Estos límites son específicos para la concentración de isopreno, tipo y concentración de oxidante, inertes presentes en el sistema, temperatura y presión del sistema. Las composiciones que caen dentro de los límites de la envoltura de inflamabilidad propagan la combustión y requieren precauciones de seguridad adicionales tanto en el diseño como operación de equipo de proceso.
Las siguientes condiciones se probaron mediante el uso de simulación por computadora y análisis matemático y pruebas experimentales. Si se desea, otras condiciones (tales como otra temperatura, presión y composiciones de gas permanentes) se pueden probar mediante el uso de los métodos aquí descritos para determinar las concentraciones de LFL, UFL y LOC. (1) Simulación por computadora y análisis matemático Serie de prueba 1 : isopreno: 0% en peso - 14% en peso 02 : 6% en peso - 21% en peso N2 : 79% en peso - 94% en peso Serie de prueba 2 : isopreno: 0% en peso - 14% en peso 02 : 6% en peso - 21% en peso N2 : 79% en peso - 94% en peso saturado con H20 Serie de prueba 3 : isopreno: 0% en peso - 14% en peso 02 : 6% en peso - 21% en peso N2: 79% en peso - 94% en peso de C02 : 5% en peso - (2) Pruebas experimentales para determinación final de límites de inflamabilidad Serie de prueba 1 : isopreno: 0% en peso - 14% en peso 02: 6% en peso - 21% en peso N2 : 79% en peso - 94% en peso Serie de prueba 2 : isopreno: 0% en peso - 14% en peso 02 : 6% en peso - 21% en peso N2 : 79% en peso - 94% en peso Saturado con H20 Se usó software de simulación para dar un estimado de las características de inflamabilidad del sistema para varias condiciones de prueba diferentes. C02 no mostró afecto significativo sobre los límites de inflamabilidad del sistema. Las series de prueba 1 y 2 fueron confirmadas por pruebas experimentales. Los resultados de modelado estaban en línea con los resultados de prueba experimentales. Sólo se encontraron ligeras variaciones con la adición de agua.
Se determinó que la LOC era 9.5% en volumen para una mezcla de isopreno, 02, N2( y C02 a 40°C y 1 atmósfera. La adición de hasta 30% de C02 no afectó significativamente las características de inflamabilidad de una mezcla de isopreno, o2 , y N2. Sólo características de variaciones ligeras en inflamabilidad se mostraron entre un sistema de isopreno, 02, y N2 seco y con agua. La temperatura limitante es aproximadamente -54°C. Temperaturas por abajo de aproximadamente -54°C son demasiado bajas para propagar la combustión de isopreno.
En algunas modalidades, el LFL de isopreno varía de aproximadamente 1.5% en volumen a aproximadamente 2.0% en volumen, y el UFL de isopreno varía de aproximadamente 2.0% en volumen a aproximadamente 12.0% en volumen, según la cantidad de oxígeno en el sistema. En algunas modalidades, la LOC es aproximadamente 9.5% en volumen de oxígeno. En algunas modalidades, el LFL de isopreno es de aproximadamente 1.5% en volumen a aproximadamente 2.0% en volumen, el UFL de isopreno es de aproximadamente 2.0% en volumen a aproximadamente 12.0% en volumen, y el LOC es aproximadamente 9.5% en volumen de oxígeno cuando la temperatura es de aproximadamente 25 °C a aproximadamente 55°C (tal como aproximadamente 40°C) y la presión es de aproximadamente 1 atmósfera y 3 atmósferas.
En algunas ' modalidades , el isopreno es producido en presencia de menos de aproximadamente 9.5% en volumen de oxígeno (es decir, por debajo de la LOC requerida para tener una mezcla inflamable de isopreno) . En algunas modalidades en las cuales el isopreno es producido en presencia de más de, o aproximadamente, 9.5% en volumen de oxígeno, la concentración de isopreno está por abajo del LFL (tal como por abajo de aproximadamente 1.5% en volumen). Por ejemplo, la cantidad de isopreno se puede mantener por abajo del LFL al diluir la composición de isopreno con un gas inerte (v.gr., al añadir continuamente o periódicamente un gas inerte tal como nitrógeno para mantener la composición de isopreno por abajo del LFL) . En algunas modalidades en las cuales el isopreno es producido en presencia de más de, o aproximadamente, 9.5% en volumen de oxígeno, la concentración de isopreno está por arriba del UFL (tal como antes aproximadamente 12% en volumen) . Por ejemplo, la cantidad de isopreno se puede mantener por arriba del UFL mediante el uso de a sistema (tal como cualquiera de los sistemas de cultivo de células aquí descritos) que produce isopreno a una concentración por arriba del UFL. Si se desea, se puede usar un nivel relativamente bajo de oxígeno, por lo que el UFL también es relativamente bajo. En este caso, una concentración de isopreno más baja es necesaria para permanecer por arriba del UFL.
En algunas modalidades en las cuales el isopreno es producido en presencia de más de, o aproximadamente, 9.5% en volumen de oxígeno, la concentración de isopreno está dentro de la envoltura de inflamabilidad (tal como entre el LFL y el UFL) . En algunas modalidades, cuando la concentración de isopreno puede caer dentro de la envoltura de inflamabilidad, se lleva a cabo uno o más pasos para reducir la probabilidad de un incendio o explosión. Por ejemplo, una o más fuentes de ignición (tales como cualesquiera materiales que puedan generar una chispa) se pueden evitar. En algunas modalidades, se lleva a cabo uno o más pasos para reducir la cantidad de tiempo que la concentración de isopreno permanece dentro de la envoltura de inflamabilidad. En algunas modalidades, se usa un sensor para detectar cuando la concentración de isopreno está cerca o dentro de la envoltura de inflamabilidad. Si se desea, la concentración de isopreno se puede medir en uno o más puntos de tiempo durante el cultivo de células, y las condiciones de cultivo de células y/o la cantidad de gas inerte se puede ajustar mediante el uso de métodos estándares si la concentración de isopreno está cerca o dentro de la envoltura de inflamabilidad. En modalidades particulares, las condiciones de cultivo de células (tales como condiciones de fermentación) se ajustan ya sea para disminuir la concentración de isopreno por abajo del LFL o incrementar la concentración de isopreno por arriba del UFL. En algunas modalidades, la cantidad de isopreno se mantiene por abajo del LFL al diluir la composición de isopreno con un gas inerte (tal como al añadir continuamente o periódicamente un gas inerte para mantener la composición de isopreno por abajo del LFL) .
En algunas modalidades, la cantidad de volátiles inflamables distintos del isopreno (tales como uno o más azúcares) es por lo menos aproximadamente 2, 5, 10, 50, 75 ó 100 veces menos de la cantidad de isopreno producido. En algunas modalidades, la porción de la fase gaseosa distinta del isopreno gaseoso comprende de aproximadamente 0% a aproximadamente 100% (volumen) de oxígeno, tal como de aproximadamente 0% a aproximadamente 10%, aproximadamente 10% a aproximadamente 20%, aproximadamente 20% a aproximadamente 30%, aproximadamente 30% a aproximadamente 40%, aproximadamente 40% a aproximadamente 50%, aproximadamente 50% a aproximadamente 60%, aproximadamente 60% a aproximadamente 70%, aproximadamente 70% a aproximadamente 80%, aproximadamente 90% a aproximadamente 90%, o aproximadamente 90% a aproximadamente 100% (volumen) de oxígeno. En algunas modalidades, la porción de la fase gaseosa distintos del isopreno gaseoso comprende de aproximadamente 0% a aproximadamente 99% (volumen) de "nitrógeno, tal como de aproximadamente 0% a aproximadamente 10%, aproximadamente 10% a aproximadamente 20%, aproximadamente 20% a aproximadamente 30%, aproximadamente 30% a aproximadamente 40%, aproximadamente 40% a aproximadamente 50%, aproximadamente 50% a aproximadamente 60%, aproximadamente 60% a aproximadamente 70%, aproximadamente 70% a aproximadamente 80%, aproximadamente 90% a aproximadamente 90%, o aproximadamente 90% a aproximadamente 99% (volumen) de nitrógeno.
En algunas modalidades, la porción de la fase gaseosa distinta del isopreno gaseoso comprende de aproximadamente 1% a aproximadamente 50% (volumen) de C02, tal como de aproximadamente 1% a aproximadamente 10%, aproximadamente 10% a aproximadamente 20%, aproximadamente 20% a aproximadamente 30%, aproximadamente 30% a aproximadamente 40%, o aproximadamente 40% a aproximadamente 50% (volumen) de C02.
En algunas modalidades, una composición de isopreno también contiene etanol. Por ejemplo, el etanol se puede usar para destilación extractiva de isopreno, que da por resultado composiciones (tales como corrientes de producto intermediario) que incluyen tanto etanol como isopreno. Deseablemente, la cantidad de etanol está fuera de la envoltura de inflamabilidad para etanol. El LOC de etanol es aproximadamente 8.7% en volumen, y el LFL para etanol es aproximadamente 3.3% en volumen en¦ condiciones estándares, tales como aproximadamente 1 atmósfera y aproximadamente 15.5°C (NFPA 69 Standard on Explotion Prevention Systems, 2008 edición, que es incorporada aquí por referencia en su totalidad, particularmente con respecto a valores de LOC, LFL, y UFL) . En algunas modalidades, las composiciones que incluyen isopreno y etanol son producidas en presencia de menos del LOC requerido para tener una mezcla inflamable de etanol (tal como menos de aproximadamente 8.7% en volumen) .
En algunas modalidades en las cuales las composiciones que incluyen isopreno y etanol son producidas en presencia de más de, o aproximadamente, el LOC requerido para tener una mezcla inflamable de etanol, la concentración de etanol está por abajo del LFL (tal como menos de aproximadamente 3.3% en volumen) .
En varias modalidades, la cantidad de oxidante (tal como oxígeno) está por abajo del LOC de cualquier combustible en el sistema (tal como isopreno o etanol) . En varias modalidades, la cantidad de oxidante (tal como oxígeno) es menor que aproximadamente 60, 40, 30, 20, 10 ó 5% del LOC de isopreno o etanol. En varias modalidades, la cantidad de oxidante (tal como oxígeno) es menor que el LOC de isopreno o etanol por lo menos por 2, 4, 5 o más puntos porcentuales absolutos (% en volumen). En modalidades particulares, la cantidad de oxígeno es por lo menos 2 puntos porcentuales absolutos (% en volumen) menos del LOC de isopreno o etanol (tal como una concentración de oxígeno de menos de 7.5% en volumen cuando el LOC de isopreno es 9.5% en volumen) . En varias modalidades, la cantidad de combustible (tal como isopreno o etanol) es menor que o aproximadamente 25, 20, 15, 10 ó 5% del LFL para ese combustible.
Producción de isopreno ilustrativa En algunas modalidades, las células son cultivadas en un medio de cultivo bajo condiciones que permiten la producción de isopreno por las células. Por "productividad absoluta pico" se entiende la cantidad absoluta máxima de isopreno en el gas desprendido durante el cultivo de células por un período particular (v.gr., el cultivo de células durante una operación de fermentación particular) . Por "punto de tiempo de productividad absoluta pico" se entiende el punto de tiempo durante una operación de fermentación cuando la cantidad absoluta de isopreno en el gas desprendido está a un máximo durante el cultivo de células durante un período particular (v.gr., el cultivo de células durante una operación de fermentación particular) . En algunas modalidades, la cantidad de isopreno se mide en el punto de tiempo de productividad absoluta pico. En algunas modalidades, la productividad absoluta pico para las células es aproximadamente cualquiera de las cantidades de isopreno descritas aquí .
Por "productividad específica pico" se entiende la cantidad máxima de isopreno producido por célula durante el cultivo de células por un período particular (v.gr., el cultivo de células durante una operación de fermentación particular) . Por "punto de tiempo de productividad específica pico" se entiende el punto de tiempo durante el cultivo de células por un período particular (v.gr., el cultivo de células durante una operación de fermentación particular) cuando la cantidad de isopreno producido por célula está a un máximo. La productividad específica se determina al dividir la productividad total por la cantidad de células, como se determina por la densidad óptica a 600nm (OD6oo) · En algunas modalidades, la cantidad de isopreno se mide en el punto de tiempo de productividad específica. En algunas modalidades, la productividad específica pico para las células es aproximadamente cualquiera de las cantidades de isopreno por célula descritas aquí.
Por "productividad acumulativa total" se entiende la cantidad acumulativa total de isopreno producido durante el cultivo de células por un período particular (v.gr. , el cultivo de células durante una operación de fermentación particular) . En algunas modalidades, se mide la cantidad acumulativa total de isopreno. En algunas modalidades, la productividad acumulativa total para las células es aproximadamente cualquiera de las cantidades de isopreno descritas aquí .
Por "respuesta del detector relativa" se refiere a la relación entre la respuesta del detector (tal como el área de GC/MS) para un compuesto (tal como isopreno) a la respuesta del detector (tal como el área de GC/MS) de uno o más compuestos (tales como todos los hidrocarburos de C5) . La respuesta del detector se puede medir como se describe aquí, tal como el análisis de GC/MS realizado con un sistema Agilent 6890 GC/MS equipado con una columna Agilent HP-5MS GC/MS (30 m x 250 µt?; 0.25 pm de espesor de película) . Si se desea, la respuesta del detector relativa puede ser convertida a un por ciento en peso mediante el uso de los factores de respuesta para cada uno de los compuestos. Este factor de respuesta es una medida de qué tanta señal es generada para una cantidad dada de un compuesto particular (es decir, qué tan sensible es el detector a un compuesto particular) . Este factor de respuesta se puede usar como un factor de corrección para convertir la respuesta del detector relativa a un por ciento en peso cuando el detector tiene diferentes sensibilidades a los compuestos que son comparados. Alternativamente, el por ciento en peso puede ser aproximado al suponer que los factores de respuesta son los mismos para los compuestos que son comparados. Por lo tanto, se puede suponer que el por ciento en peso es aproximadamente el mismo que la respuesta del detector relativa.
En algunas modalidades, las células en cultivo producen isopreno a más de, o aproximadamente, 1, 10, 25, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1,000, 1,250, 1,500, 1,750, 2,000, 2,500, 3,000, 4,000, 5,000, o más nmoles de isopreno/gramo de células para el peso húmedo de las células/hora (nmoles/gwcm/hr) . En algunas modalidades, la cantidad de isopreno es de aproximadamente 2 a aproximadamente 5,000 nmoles/gwcm/hr , tal como de aproximadamente 2 a aproximadamente 100 nmoles/gwcm/hr, aproximadamente 100 a aproximadamente 500 nmoles/gwcm/hr, aproximadamente 150 a aproximadamente 500 nmoles/gwcm /hr, aproximadamente 500 a aproximadamente 1,000 nmoles/gwcm/hr, aproximadamente 1,000 a aproximadamente 2,000 nmoles/gwcm/hr, o aproximadamente 2,000 a aproximadamente 5,000 nmoles/gwcm/hr. En algunas modalidades, la cantidad de isopreno es de aproximadamente 20 a aproximadamente 5,000 nmoles/gwcm/hr, aproximadamente 100 a aproximadamente 5,000 nmoles/gwcm/hr, aproximadamente 200 a aproximadamente 2,000 nmoles/gwcm/hr, aproximadamente 200 a aproximadamente 1,000 nmoles/gwcm/hr, aproximadamente 300 a aproximadamente 1,000 nmoles/gwcm/hr, o aproximadamente 400 a aproximadamente 1,000 nmoles/gwcm/hr .
La cantidad de isopreno en unidades de nmoles/gwcm/hr se puede medir como se describe en la patente de E.U.A. No. 5,849,970, que es incorporada aquí por referencia en su totalidad, particularmente con respecto a la medición de producción de isopreno. Por ejemplo, dos mL de espacio superior (v.gr., espacio superior de un cultivo tal como 2 mL de cultivo cultivado en tubos sellados a 32 °C con agitación a 200 rpm por aproximadamente 3 horas) son analizados para isopreno mediante el uso de un sistema de cromatografía de gases estándar, tal como un sistema operado isotérmicamente (85°C) con una columna n-octano/porasil C (Alltech Associates, Inc., Deerfield, 111.) y acoplado a un detector de gas de reducción de óxido mercúrico RGD2 (Trace Analytical, Menlo Park, CA) (véase, por ejemplo, Greenberg et al, Atmos. Environ. 21 A: 2689-2692, 1993; Silver et al, Plant Physiol. 97:1588-1591, 1991, que son incorporadas cada una aquí por referencia en su totalidad, particularmente con respecto a la medición de producción de isopreno) . Las unidades de área de cromatografía de gases son convertidas a nmol de isopreno por una curva de calibración de concentración de isopreno estándar. En algunas modalidades, el valor para los gramos de células para el peso húmedo de las células se calcula al obtener el valor de A60o para una muestra del cultivo de células, y después convertir el valor de ASoo a gramos de células basadas en una curva de calibración de pesos húmedos para cultivos de células con un valor de A6oo conocido. En algunas modalidades, los gramos de las células se estima al suponer que un litro de caldo (que incluye medio de células y células) con un valor de A600 de 1 tiene un peso húmedo de células de 1 gramo. El valor también es dividido entre el número de horas que el cultivo ha sido incubado durante tres horas .
En algunas modalidades, las células en cultivo producen isopreno a más de, o aproximadamente, 1, 10, 25, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1,000, 1,250, 1,500, 1,750, 2,000, 2,500, 3,000, 4,000, 5,000, 10,000, 100,000, o más ng de isopreno/gramo de células para el peso húmedo de las células/hr (ng/gWCm/hr) . En algunas modalidades, la cantidad de isopreno es de aproximadamente 2 a aproximadamente 5,000 ng/gwcm/hr, tal como de aproximadamente 2 a aproximadamente 100 ng/gwcm/hr, aproximadamente 100 a aproximadamente 500 ng/gwcm/hr, aproximadamente 500 a aproximadamente 1,000 ng/gwcm/hr, aproximadamente 1,000 a aproximadamente 2,000 ng/gwcm/hr, o aproximadamente 2,000 a aproximadamente 5,000 ng/gwcm/h. En algunas modalidades, la cantidad de isopreno es de aproximadamente 20 a aproximadamente 5,000 ng/g„cm/hr, aproximadamente 100 a aproximadamente 5,000 ng/g„cra/hr, aproximadamente 200 a aproximadamente 2,000 ng/gwcm/hr, aproximadamente 200 a aproximadamente 1,000 ng/g„cm/hr, aproximadamente 300 a aproximadamente 1 , 000 ng/gwcm/hr, o aproximadamente 400 a aproximadamente 1, 000 ng/gwcm/h. La cantidad de isopreno en ng/gwcm/hr se puede calcular al multiplicar el valor para la producción de isopreno en las unidades de nmoles/gwcra/hr descritas anteriormente por 68.1 (como se describe en la ecuación 5 siguiente) .
En algunas modalidades, las células en cultivo producen un título acumulativo (cantidad total) de isopreno a más de, o aproximadamente, 1, 10, 25, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1,000, 1,250, 1,500, 1,750, 2,000, 2,500, 3,000, 4,000, 5,000, 10,000, 50,000, 100,000, o más mg de isopreno/L de caldo (mg/Lcaid0( en donde el volumen de caldo incluye el volumen de las células y el medio de las células) . En algunas modalidades,' la cantidad de isopreno es de aproximadamente 2 a aproximadamente 5,000 mg/Lcaido, tal como de aproximadamente 2 a aproximadamente 100 rog/Lcaido, aproximadamente 100 a aproximadamente 500 mg/Lcaido, aproximadamente 500 a aproximadamente 1,000 mg/Lcaido, aproximadamente 1,000 a aproximadamente 2,000 mg/Lcaido, ° aproximadamente 2,000 a aproximadamente 5,000 mg/Lcaido- En algunas modalidades, la cantidad de isopreno es de aproximadamente 20 a aproximadamente 5,000 mg/Lcaido/ aproximadamente 100 a aproximadamente 5,000 g/Lgaido aproximadamente 200 a aproximadamente 2,000 mg/Lcaido/ aproximadamente 200 a aproximadamente 1,000 mg/Lcaid0f aproximadamente 300 a aproximadamente 1,000 mg/Lcaido, o aproximadamente 400 a aproximadamente 1,000 mg/Lcaid0.
La productividad específica de isopreno en mg de isopreno/L de espacio superior de matraz de agitación o cultivos similares se puede medir al tomar una muestra de 1 mi a partir de los el cultivo de células a un valor de OD600 de aproximadamente 1.0, al ponerlo en un tubo de 20 mL, al incubar durante 30 minutos, y después al medir la cantidad de isopreno en el espacio superior (como se describe, por ejemplo, en el ejemplo I, parte II) . Si el valor de OD60o no es 1.0, entonces la medición puede ser normalizada a un valor de OD60o de 1.0 al dividir entre el valor de OD60o- El valor de mg de isopreno/L de espacio superior puede ser convertido a mg/Lcaido/h /OID6oo de caldo de cultivo al multiplicar por un factor de 38. El valor en unidades de mg/Lcaido/hr/OD60o se puede multiplicar por el número de horas y el valor de OD6oo para obtener el título acumulativo en unidades de mg de isopreno/L de caldo.
La tasa de producción instantánea de isopreno en mg/LCaido/hr en un termentador se puede medir al tomar una muestra del gas desprendido del termentador, al analizarlo para la cantidad de isopreno (en unidades tales como mg de isopreno por Lgas) como se describe, por ejemplo, en el ejemplo I, parte II y al multiplicar este valor por la tasa a la cual el gas desprendido se hace pasar a través de cada litro de caldo (v.gr. , a 1 wm (volumen de aire/volumen de caldo/minuto) éste es 60 Lgas por hora) . Por lo tanto, un nivel de gas desprendido de 1 mg/Lgas corresponde a una tasa de producción instantánea de 60 mg/Lcaido/hr a flujo de aire de 1 wm. Si se desea, el valor en las unidades de mg/Lcaido/hr se puede dividir entre el valor de OD60o para obtener la tasa específica en unidades de mg/Lcaido/hr/0D . El valor promedio de mg de isopreno/Lgas puede ser convertido a la productividad total del producto (gramos de isopreno por litro de caldo de fermentación, mg/Lcaido) al multiplicar esta concentración de gas desprendido promedio de isopreno por la cantidad total de gas desprendido salpicado por litro de caldo de fermentación durante la fermentación. Por lo tanto, una concentración de gas desprendido promedio de isopreno de 0.5 mg/Lcaid0/hr durante 10 horas a 1 wm corresponde a una concentración de producto total de 300 mg de isopreno/Lcaido .
En algunas modalidades, las células en cultivo convierten más de, o aproximadamente, 0.0015, 0.002, 0.005, 0.01, 0.02, 0.05, 0.1, 0.12, 0.14, 0.16, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.2, 1.4, 1.6, 1.8, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 5.0, 6.0, 7.0 ó 8.0% del carbono en el medio de cultivo de células en isopreno. En algunas modalidades, el por ciento de conversión de carbono a isopreno es de aproximadamente 0.002 a aproximadamente 4.0%, aproximadamente 0.002 a aproximadamente 3.0%, aproximadamente 0.002 a aproximadamente 2.0%, aproximadamente 0.002 a aproximadamente 1.6%, aproximadamente 0.002 a aproximadamente 0.005%, aproximadamente 0.005 a aproximadamente 0.01%, aproximadamente 0.01 a aproximadamente 0.05%, aproximadamente 0.05 a aproximadamente 0.15%, 0.15. a aproximadamente 0.2%, aproximadamente 0.2 a aproximadamente 0.3%, aproximadamente 0.3 a aproximadamente 0.5%, aproximadamente 0.5 a aproximadamente 0.8%, aproximadamente 0.8 a aproximadamente 1.0%, o aproximadamente 1.0 a aproximadamente 1.6%. En algunas modalidades, el por ciento de conversión de carbono a isopreno es de aproximadamente 0.002 a aproximadamente 0.4%, 0.002 a aproximadamente 0.16%, 0.04 a aproximadamente 0.16%, aproximadamente 0.005 a aproximadamente 0.3%, aproximadamente 0.01 a aproximadamente 0.3%, o aproximadamente 0.05 a aproximadamente 0,3%.
El por ciento de conversión de carbono a isopreno (también referido como "% de rendimiento de carbono") se puede medir al dividir los moles de carbono en el isopreno producido por los moles de carbono en la fuente de carbono (tal como los moles de carbono en glucosa intermitente y alimentada y extracto de levadura) . Este número es multiplicado por 100% para dar un valor de por ciento (como se indica en la ecuación 1) .
Ecuación 1 % de rendimiento de carbono = (moles de carbono en isopreno producido) / (moles de carbón en fuente de carbono) * 100 Para este cálculo, se puede suponer que el extracto de levadura contiene 50% p/p de carbono. Como un ejemplo, para los 500 litros descritos en el ejemplo 7, parte VIII, el por ciento de conversión de carbono a isopreno se puede calcular como se muestra en la ecuación 2.
Ecuación 2 % de rendimiento de carbono = (39.1 g de isopreno * 1/68.1 mol/g * 5 C/mol )/[ (181221 g de glucosa * 1/180 mol/g * 6 C/mol) + (17780 g de extracto de levadura * 0.5 * 1/12 mol/g)] * 100 = 0.042% Para las dos fermentaciones de 500 litros aquí descritas (ejemplo 7, partes VII y VIII) , el por ciento de conversión de carbono a isopreno fue entre 0.04-0.06%. Un rendimiento de carbono de 0.11- 0.16% se ha logrado mediante el uso de sistemas de 14 litros como se describe aquí. El ejemplo 11, parte V describe el 1.53% de conversión de carbono a isopreno mediante el uso del métodos aquí descritos.
Un experto en la técnica puede convertir fácilmente las tazas de producción de isopreno o cantidad de isopreno producido en cualesquiera otras unidades. Ecuaciones ilustrativas se listan más adelante para interconvertir entre unidades .
Unidades para tasa de producción de isopreno (total y específica) Ecuación 3 1 g de isopreno/Lcaido/hr = 14.7 mmol de isopreno/Lcaldo/hr (tasa volumétrica total) Ecuación 4 1 nmol de isopreno/gwcm/hr = 1 nmol de isopreno/Lcaldo/hr/OD6oo (Esta conversión supone que un litro de caldo con un valor de OD600 de 1 tiene un peso de células húmedo de 1 gramo) .
Ecuación 5 1 nmol de isopreno/gwcm/hr = 68.1 ng de isopreno/gwcm/hr (dado el peso molecular de isopreno) Ecuación 6 1 nmol de isopreno/Lgag 02/hr = 90 nmol de isopreno/Lcaido/hr (a una velocidad de flujo de 02 de 90 L/hr por L de caldo de cultivo) Ecuación 7 1 ug de isopreno/Lgas isopreno en gas desprendido = 60 ug de isopreno/LCaido/hr a una velocidad de flujo de 60 Lgas por Lcaido ( 1 wm) Unidades para título (total y específica) Ecuación 8 1 nmol de isopreno/mg de proteína celular = 150 nmol de isopreno/Lcaido/OD6oo (Esta conversión supone que un litro de caldo con un valor de ODSOo de 1 tiene una proteína celular total de aproximadamente 150 mg) (productividad específica) .
Ecuación 9 1 g isopreno/Lcaido = 14.7 mmol isopreno/Lcaido (título total) Si se desea, la ecuación 10 se puede usar para convertir cualquiera de las unidades que incluyen el peso húmedo de las células en las unidades correspondientes que incluyen el peso seco de las células.
Ecuación 10 Peso seco de las células = (peso húmedo de las células) /3.3 Si se desea, la ecuación 11 se puede usar para convertir entre unidades de ppm y ug/L. En particular, "ppm" significa partes por millón definidas en términos de ug/g (p/p) o uL/L (vol/vol) .
La conversión de ug/L a ppm (v.gr., ug de analito por g de gas) se puede llevar a cabo al determinar la masa por L de gas desprendido (es decir, la densidad del gas) . Por ejemplo, un litro de aire a STP tiene una densidad de aproximadamente 1.2 g/L. Por lo tanto, una concentración de 1 ppm (ug/g) es igual a 0.83 ug/L. a STP (ecuación 11) . La conversión de ppm (ug/g) a ug/L es una función de presión, temperatura y composición global del gas desprendido.
Ecuación 11 1 ppm (ug/g) es igual a 0.83 ug/L a temperatura y presión estándares (STP; 101.3 kPa (1 bar) y 273.15 ).
La conversión de ug/L a ppmv (v.gr., uL de analito por L de gas) se puede llevar a cabo mediante el uso de la Ley Universal de los Gases (ecuación 12) . Por ejemplo, una concentración de gas desprendido de 1000 ug/Lgas corresponde a 14.7 umol/Lgas. La constante universal de los gases es 0.082057 L.atm K^mol"1, por lo que el uso de la ecuación 12, el volumen ocupado por 14.7 umol de HG a STP es igual a 0.329 mL. Por lo tanto, la concentración de 1000 ug/L HG es igual a 329 ppmv o 0.0329% (v/v) a STP.
Ecuación 12 PV = nRT, en donde " P" es presión, "V" es volumen, "n" es moles de gas, "R" es la constante Universal de los gases, y "T" es la temperatura en Kelvin.
La cantidad de impurezas en composiciones de isopreno son típicamente medidas aquí sobre una base de peso por volumen (p/v) en unidades tales como ug/L. Si se desea, las mediciones en unidades de ug/L pueden ser convertidas a unidades de mg/m3 al usar la ecuación 13.
Ecuación 13 1 ug/L = 1 mg/m3 En algunas modalidades abarcadas por la invención, una célula que comprende un ácido nucleico heterólogo que codifica un polipéptido de isopreno sintasa produce una cantidad de isopreno que es por lo menos o aproximadamente 2 veces, 3 veces, 5 veces, 10 veces, 25 veces, 50 veces, 100 veces, 150 veces, 200 veces, 400 veces, o más de la cantidad de isopreno producido de una célula correspondiente que crece esencialmente bajo las mismas condiciones sin el ácido nucleico heterólogo que codifica el polipéptido de isopreno sintasa .
En algunas modalidades abarcadas por la invención, una célula que comprende un ácido nucleico heterólogo que codifica un polipéptido de isopreno sintasa y uno o más ácidos nucleicos heterologos que codifican un polipéptido de DXS, IDI, y/o la vía de MVA produce una cantidad de isopreno que es por lo menos o aproximadamente 2 veces, 3 veces, 5 veces, 10 veces, 25 veces, 50 veces, 100 veces, 150 veces, 200 veces, 400 veces, o más de la cantidad de isopreno producido de una célula correspondiente que crece esencialmente bajo las mismas condiciones sin el ácido nucleico heterologos.
En algunas modalidades, la composición de isopreno comprende más de, o aproximadamente, 99.90, 99.92, 99.94, 99.96, 99.98 ó 100% de isopreno en peso comparado con el p'eso total de todos los hidrocarburos de C5 en la composición. En algunas modalidades, la composición tiene una respuesta del detector relativa de más de, o aproximadamente, 99.90, 99.91, 99.92, 99.93, 99.94, 99.95, 99.96, 99.97, 99.98, 99.99 ó 100% para isopreno comparado con la respuesta del detector para todos los hidrocarburos de C5 en la composición. En algunas modalidades, la composición de isopreno comprende de aproximadamente 99. .90 a aproximadamente 99. 92, aproximadamente 99. .92 a aproximadamente 99. 94, aproximadamente 99. .94 a aproximadamente 99. .96, aproximadamente 99. .96 a aproximadamente 99. .98, aproximadamente 99.98 a 100% de isopreno en peso comparado con el peso total de todos los hidrocarburos de C5 en la composición.
En algunas modalidades, la composición de isopreno comprende menos de o aproximadamente 0.12, 0.10, 0.08, 0.06, 0.04, 0.02, 0.01, 0.005, 0.001, 0.0005, 0.0001, 0.00005 ó 0.00001% de hidrocarburos de C5 distintos del isopreno (el 1, 3-ciclopentadieno, cis-1 , 3-pentadieno, trans-1,3-pentadieno, 1-pentino, 2-pentino, 1-penteno, 2-metil-l-buteno, 3-metil-l-butino, trans-piperileno , cis-piperileno, pent-4-eno-l-ino, fcrans-pent-3-eno-l-ino o cis-pent-3-eno-l-ino) en peso comparado con el peso total de todos los hidrocarburos de C5 en la composición. En algunas modalidades, la composición tiene una respuesta del detector relativa de menos de o aproximadamente 0.12, 0.10, 0.08, 0.06, 0.04, 0.02, 0.01, 0.005, 0.001, 0.0005, 0.0001, 0.00005 ó 0.00001% para hidrocarburos de C5 distintos del isopreno comparado con la respuesta del detector para todos los hidrocarburos de C5 en la composición. En algunas modalidades, la composición tiene una respuesta del detector relativa de menos de o aproximadamente 0.12, 0.10, 0.08, 0.06, 0.04, 0.02, 0.01, 0.005, 0.001, 0.0005, 0.0001, 0.00005 ó 0.00001% para 1 , 3 -ciclopentadieno, cis-1 , 3 -pentadieno, trans-1, 3 -pentadieno, 1-pentino, 2-péntino, 1-penteno, 2-metil-l-buteno, 3 -metil-l-butino, t_rans-piperileno, cis-piperileno, pent-4-eno-l-ino, trans-pent-3 -eno- 1- ino ó cis-pent-3-eno-l-ino comparado con la respuesta del detector para todos los hidrocarburos de C5 en la composición. En algunas modalidades, la composición de isopreno comprende de aproximadamente 0.02 a aproximadamente 0.04%, aproximadamente 0.04 a aproximadamente 0.06%, aproximadamente 0.06 a 0.08%, aproximadamente 0.08 a 0.10%, o aproximadamente 0.10 a aproximadamente 0.12% de hidrocarburos de C5 distintos del isopreno (el 1 , 3 -ciclopentadieno, cis-1, 3-pentadieno, trans-1 , 3-pentadieno, 1-pentino, 2-pentino, 1-penteno, 2-metil-l-buteno, 3 -metil-l-butino, trans-piperileno, cis-piperileno, pent-4-eno-l-ino, trans-pent-3-eno-l-ino o cis-pent-3-ene-l- ino) en peso comparado con el peso total de todos los hidrocarburos de C5 en la composición.
En algunas modalidades, la composición de isopreno comprende menos de o aproximadamente 50, 40, 30, 20, 10, 5, 1, 0.5, 0.1, 0.05, 0.01 ó 0.005 ug/L de un compuesto que inhibe la polimerización de isopreno para cualquier compuesto en la composición que inhibe la polimerización de isopreno. En algunas modalidades, la composición de isopreno comprende de aproximadamente 0.005 a aproximadamente 50, tal como aproximadamente 0.01 a aproximadamente 10, aproximadamente 0.01 a aproximadamente 5, aproximadamente 0.01 a aproximadamente 1, aproximadamente 0.01 a aproximadamente 0.5, o aproximadamente 0.01 a aproximadamente 0.005 ug/L de un compuesto que inhibe la polimerización de isopreno para cualquier compuesto en la composición que inhibe la polimerización de isopreno. En algunas modalidades, la composición de isopreno comprende menos de o aproximadamente 50, 40, 30, 20, 10, 5, 1, 0.5, 0.1, 0.05, 0.01 ó 0.005 ug/L de un hidrocarburo distinto del isopreno (tal como 1,3-ciclopentadieno, cis-1 , 3 -pentadieno, trans- 1 , 3 -pentadieno, 1-pentino, 2-pentino, 1-penteno, 2-metil-l-buteno, 3-metil-l-butino, trans-piperileno, cis-piperileno, pent-4-eno-l-ino, trans-pent-3-eno-l-ino ó cis-pent-3-eno-l-ino) . En algunas modalidades, la composición de isopreno comprende de aproximadamente 0.005 a aproximadamente 50, tal como aproximadamente 0.01 a aproximadamente 10, aproximadamente 0.01 a aproximadamente 5, aproximadamente 0.01 a aproximadamente 1, . aproximadamente 0.01 a aproximadamente 0.5, o aproximadamente 0.01 a aproximadamente 0.005 ug/L de un hidrocarburo distintos del isopreno. En algunas modalidades, la composición de isopreno comprende menos de o aproximadamente 50, 40, 30, 20, 10, 5, 1, 0.5, 0.1, 0.05, 0.01 ó 0.005 ug/L de una proteína o ácido graso (tal como una proteína o ácido graso que está naturalmente asociado con natural hule) .
En algunas modalidades, la composición de isopreno comprende menos de o aproximadamente 10, 5, 1, 0.8, 0.5, 0.1, 0.05, 0.01 ó 0.005 ??t? de alfa acetilenos, piperilenos, acetonitrilo ó 1 , 3 -ciclopentadieno . En algunas modalidades, la composición de isopreno comprende menos de o aproximadamente 5, 1, 0.5, 0.1, 0.05, 0.01 ó 0.005 ppm de azufre o alenos . En algunas modalidades, la composición de isopreno comprende menos de o aproximadamente 30, 20, 15, 10, 5, 1, 0.5, 0.1, 0.05, 0.01 ó 0.005 ppm de todos los acetilenos (tal como pentino-1, butino-2, 2MBl-3ino, y 1-pentino-4ino) . En algunas modalidades, la composición de isopreno comprende menos de o aproximadamente 2000, 1000, 500, 200, 100, 50, 40, 30, 20, 10, 5, 1, 0.5, 0.1, 0.05, 0.01 ó 0.005 ppm de dímeros de isopreno, tales como dímeros de isopreno cíclicos (v.gr., compuestos de CIO cíclicos derivados de la dimerización de dos unidades de isopreno) .
En algunas modalidades, la composición de isopreno incluye etanol, acetona, un alcohol prenílico de C5 (tal como 3-metil-3-buten-l-ol o 3-metil-2-buten-l-ol) , o cualesquiera dos o más de los anteriores. En modalidades particulares, la composición de isopreno comprende más de, o aproximadamente, 0.005, 0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1, 5, 10, 20, 30, 40, 60, 80, 100 ó 120 ug/L de etanol, acetona, un alcohol prenílico de C5 (tal como 3 -metil-3-buten-l-ol o 3-metil-2-buten-l-ol) , o cualesquiera dos o más de los anteriores. En algunas modalidades, la composición de isopreno comprende de aproximadamente 0.005 a aproximadamente 120, tal como aproximadamente 0.01 a aproximadamente 80, aproximadamente 0.01 a aproximadamente 60, aproximadamente 0.01 a aproximadamente 40, aproximadamente 0.01 a aproximadamente 30, aproximadamente 0.01 a aproximadamente 20, aproximadamente 0.01 a aproximadamente 10, aproximadamente 0.1 a aproximadamente 80, aproximadamente 0.1 a aproximadamente 60, aproximadamente 0.1 a aproximadamente 40, aproximadamente 5 a aproximadamente 80, aproximadamente 5 a aproximadamente 60, o aproximadamente 5 a aproximadamente 40 ug/L de etanol, acetona, un alcohol prenílico de C5 , o cualesquiera dos o más de los anteriores.
En algunas modalidades, la composición de isopreno incluye uno o más de los siguientes componentes: 2-heptanona, 6-metil-5-hepten-2-ona, 2 , 4 , 5-trimetilpiridina, 2,3,5-trimetilpirazina, citronelal, acetaldehído, metanotiol, acetato de metilo, 1-propanol, diacetilo, 2-butanona, 2-metil-3-buten-2-ol, acetato de etilo, 2-metil- 1-propanol, 3-metil-1- butanal , 3 -metil-2-butanona, 1-butanol, 2-pentanona, 3 -metil- 1-butanol , isobutirato de etilo, 3-metil-2-butenal, acetato de butilo, 3-metilacetato de butilo, acetato de 3-metil-3-but-l-enilo, acétate de 3-metil-2-but-l-enilo, (E) -3 , 7-dimetil-l, 3 , 6-octatrieno, (Z) -3 , 7-dimetil-l, 3,6-octatrieno, 2 , 3 -cicloheptenolpiridina o un polímero de isopreno lineal (tal como un dímero de isopreno lineal o un trímero de isopreno lineal derivado de la polimerización de unidades de isopreno múltiples) . En varias modalidades, la cantidad de uno de estos componentes relativos a la cantidad de isopreno en unidades de por ciento en peso (es decir, peso del componente dividido entre el peso de isopreno por 100) es mayor que o aproximadamente 0.01, 0.02, 0.05, 0.1, 0.5, 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 6, 110% (p/p) . En algunas modalidades, la respuesta del detector relativa para el segundo compuesto comparado con la respuesta del detector para isopreno es mayor que o aproximadamente 0.01, 0.02, 0.05, 0.1, 0.5, 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 ó 110%. En varias modalidades, la cantidad de uno de estos componentes relativos a la cantidad de isopreno en unidades de por ciento en peso (es decir, peso del componente dividido entre el peso de isopreno por 100) es de aproximadamente 0.01 a aproximadamente 105% (p/p), tal como aproximadamente 0.01 a aproximadamente 90, aproximadamente 0.01 a aproximadamente 80, aproximadamente 0.01 a aproximadamente 50, aproximadamente 0.01 a aproximadamente 20, aproximadamente 0.01 a aproximadamente 10, aproximadamente 0.02 a aproximadamente 50, aproximadamente 0.05 a aproximadamente 50, aproximadamente 0.1 a aproximadamente 50 ó 0.1 a aproximadamente 20% (p/p) .
En algunas modalidades, la composición de isopreno incluye uno o más de los siguientes: un alcohol, un aldehido o una cetona (tal como cualquiera de los alcoholes, aldehidos o cetonas aquí descritas) . En algunas modalidades, la composición de isopreno incluye (i) un alcohol y un aldehido, (ii) un- alcohol y una cetona, (iii) un aldehido y una cetona o (iv) un alcohol, un aldehido, y una cetona.
En algunas modalidades, la composición de isopreno contiene uno o más de los siguientes: metanol, acetaldehído, etanol, metanotiol, 1-butanol, 3-metil-l-propanol, acetona, ácido acético, 2-butanona, 2-metil-l-butanol o indol . En algunas modalidades, la composición de isopreno contiene 1 ppm o más de uno o más de los siguientes: metanol, acetaldehído, etanol, metanotiol, 1-butanol, 3-metil-l-propanol, acetona, ácido acético, 2- butanona, 2-metil-l-butanol ó indol. En algunas modalidades, la concentración de más de uno o más de los siguientes: metanol, acetaldehído, etanol, metanotiol, 1-butanol , 3-metil-l-propanol , acetona, ácido acético, 2-butanona, 2-metil-l-butanol ó indol, es de aproximadamente 1 a aproximadamente 10,000 ppm en una composición de isopreno (tal como gas desprendido antes de que sea purificado) . En algunas modalidades, la composición de isopreno (tal como gas desprendido después de que ha pasado por uno o más pasos de purificación) incluye uno o más de los siguientes: metanol, acetaldehído, etanol, metanotiol, 1-butanol, 3-metil-l-propanol , acetona, ácido acético, 2-butanona, 2 -metil-l-butanol ó indol, a una concentración de aproximadamente 1 a aproximadamente 100 ppm, tal como aproximadamente 1 a aproximadamente 10 ppm, aproximadamente 10 a aproximadamente 20 ppm, aproximadamente 20 a aproximadamente 30 ppm, aproximadamente 30 a aproximadamente 40 ppm, aproximadamente 40 a aproximadamente 50 ppm, aproximadamente 50 a aproximadamente 60 ppm, aproximadamente 60 a aproximadamente 70 ppm, aproximadamente 70 a aproximadamente 80 ppm, aproximadamente 80 a aproximadamente 90 ppm, o aproximadamente 90 a aproximadamente 100 ppm. compuestos orgánicos volátiles de cultivos de células (tales como compuestos orgánicos volátiles en el espacio superior de cultivos de células) pueden ser analizados mediante el uso de métodos estándares tales como las que aquí se describen u otros métodos estándares tales como espectrometría de masa-reacción de transferencia de protones (véase, por ejemplo, Bunge et ah, Applied y Environmental Microbiology, 74 (7) :2179-2186 , 2008 que es incorporada aquí por referencia en su totalidad, particular con respecto al análisis de compuestos orgánicos volátiles) .
En algunas modalidades, la composición comprende más de aproximadamente 2 mg de isopreno, tal como más de, o aproximadamente, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 ó 1000 mg de isopreno. En algunas modalidades, la composición comprende más de, o aproximadamente, 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 g de isopreno. En algunas modalidades, la cantidad de isopreno en la composición es de aproximadamente 2 a aproximadamente 5,000 mg, tal como de aproximadamente 2 a aproximadamente 100 mg, aproximadamente 100 a aproximadamente 500 mg, aproximadamente 500 a aproximadamente 1,000 mg, aproximadamente 1, 000 a aproximadamente 2,000 mg, o aproximadamente 2,000 a aproximadamente 5,000 mg. En algunas modalidades, la cantidad de isopreno en la composición es de aproximadamente 20 a aproximadamente 5,000 mg, aproximadamente 100 a aproximadamente 5, 000 mg, aproximadamente 200 a aproximadamente 2, 000 mg, aproximadamente 200 a aproximadamente 1, 000 mg, aproximadamente 300 a aproximadamente 1,000 mg, o aproximadamente 400 a aproximadamente 1,000 mg. En algunas modalidades, más de, o aproximadamente, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ó 95% en peso de la fracción orgánica volátil de la composición es isopreno.
En algunas modalidades, la composición incluye etanol . En algunas modalidades, la composición incluye de aproximadamente 75 a aproximadamente 90% en peso de etanol, tal como de aproximadamente 75 a aproximadamente 80%, aproximadamente 80 a aproximadamente 85%, o aproximadamente 85 a aproximadamente 90% en peso de etanol . En algunas modalidades en las cuales la composición incluye etanol, la composición también incluye de aproximadamente 4 a aproximadamente 15% en peso de isopreno, tal como de aproximadamente 4 a aproximadamente 8%, aproximadamente 8 a aproximadamente 12%, o aproximadamente 12 a aproximadamente 15% en peso de isopreno.
En algunas modalidades abarcadas por la invención, una célula que comprende uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican un polipéptido de isopreno sintasa, polipéptido DXS, polipéptido IDI, y/o polipéptido de la vía de MVA produce una cantidad de un compuesto isoprenoide (tal como un compuesto con 10 o más átomos de carbono que es formado a partir de la reacción de una o más moléculas de IPP con una o más moléculas de DMAPP) que es mayor que o aproximadamente 2 veces, 3 veces, 5 veces, 10 veces, 25 veces, 50 veces, 100 veces, 150 veces, 200 veces, 400 veces, o más de la cantidad del compuesto isoprenoide producido a parir de una célula correspondiente que crece esencialmente bajo las mismas condiciones sin uno o más ácidos nucleicos heterólogos. En algunas modalidades abarcadas por la invención, una célula que comprende uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican un polipéptido de isopreno sintasa, polipéptido DXS, polipéptido IDI , y/o polipéptido de la vía de MVA produce una cantidad de un alcohol prenílico de C5 (tal como 3 -metil-3 -buten-l-ol o 3-metil-2-buten-l-ol) que es mayor que o aproximadamente 2 veces, 3 veces, 5 veces, 10 veces, 25 veces, 50 veces, 100 veces, 150 veces, 200 veces, 400 veces, o más de la cantidad del alcohol prenílico de C5 producido a partir de una célula correspondiente que crece esencialmente bajo las mismas condiciones sin uno o más ácidos nucleicos heterologos.
Métodos de purificación de isopreno ilustrativos En algunas modalidades, cualquiera de los métodos aquí descritos incluye además la recuperación del isopreno. Por ejemplo, el isopreno producido mediante el uso de las composiciones y métodos de la invención puede ser recuperado mediante el uso de técnicas estándares, tales como separación de gases, separación incrementada por membrana, fraccionamiento, adsorpción/desorción, perevaporación, deserción térmica o por vacío de isopreno de una fase sólida o extracción de isopreno inmovilizado o absorbido a una fase sólida con un solvente (véase, por ejemplo, las patentes de E.U.A. Nos. 4,703,007 y 4,570,029, que son incorporadas cada una aquí por referencia en su totalidad, particularmente con respecto a métodos de recuperación y purificación de isopreno) . En particular, modalidades, destilación extractiva con un alcohol (tal como etanol, metanol, propanol ó a combinación del mismo) se usa para recuperar el isopreno. En algunas modalidades, la recuperación de isopreno implica el aislamiento de isopreno en una forma líquida (tal como una solución neta de isopreno o una solución de isopreno en un solvente) . La separación de gases implica la remoción de vapor de isopreno a partir de la corriente de gas de fermentación desprendido de una manera continua. Esa remoción se puede lograr en varias formas diferentes que incluyen, pero sin limitarse a, adsorción a una fase sólida, partición en una fase líquida o condensación directa (tal como condensación debida a exposición a una bobina de condensación o debido a un incremento en presión) . En algunas modalidades, el enriquecimiento con membrana de una corriente de vapor de isopreno diluida por arriba del punto de rocío del vapor resültante en la condensación de isopreno líquido. En algunas modalidades, el isopreno es comprimido y condensado.
La recuperación de isopreno puede implicar un paso o múltiples pasos. En algunas modalidades, la remoción de vapor de isopreno a partir del gas desprendido de la fermentación y la conversión de isopreno a una fase líquida se llevan a cabo simultáneamente. Por ejemplo, el isopreno puede ser directamente condensado a partir de la corriente de gas desprendido para formar un líquido. En algunas modalidades, la remoción de vapor de isopreno a partir del gas desprendido de la fermentación y la conversión de isopreno a una fase líquida se llevan a cabo secuencialmente . Por ejemplo, el isopreno puede ser adsorbido a una fase sólida y después extraído de la fase sólida con un solvente.
En algunas modalidades, cualquiera de los métodos aquí descritos además incluye purificar el isopreno. Por ejemplo, el isopreno producido mediante el uso de las composiciones y métodos de la invención puede ser purificado mediante el uso de técnicas estándares. La purificación se refiere a un proceso a través del cual el isopreno es separado de uno o más componentes que están presentes cuando el isopreno es producido. En algunas modalidades, el isopreno se obtiene como un líquido sustancialmente puro. Ejemplos de métodos de purificación incluyen (i) destilación de una solución en un extractante líquido y (ii) cromatografía. Como se usa en la presente, "isopreno purificado" significa isopreno que ha sido separado de uno o más componentes que están presentes cuando el isopreno es producido. En algunas modalidades, el isopreno es por lo menos aproximadamente 20%, en peso, libre de otros componentes que están presentes cuando el isopreno es producido. En varias modalidades, el isopreno es por lo menos o aproximadamente 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95% ó 99%, en peso, puro. La pureza se puede probar por cualquier método apropiado, v.gr., or cromatografía en columna, análisis de HPLC ó análisis de GC-MS.
En algunas modalidades, por lo menos una porción de la fase gaseosa que queda después de -uno o más pasos de recuperación para la remoción de isopreno es reciclada al introducir la fase gaseosa en un sistema de cultivo de células (tal como un termentador) para la producción de isopreno.
En algunas modalidades, cualquiera de los métodos aquí descritos además incluye polimerizar el isopreno. Por ejemplo, se puede usar métodos estándares para polimerizar el isopreno purificado para formar cis-poliisopreno u otros productos corriente abajo mediante el uso de métodos estándares. Por consiguiente, la invención también se refiere a llantas que comprenden poliisopreno, tal como cis-1,4-poliisopreno y/o trans-1 , 4 -poliisopreno hechos de cualquiera de las composiciones de isopreno descritas aquí.
Ej emplos Los ejemplos, que están diseñados para ser puramente ilustrativos de la invención y por lo tanto no deben ser considerados para limitar la invención en ninguna forma, también describen y detallan aspectos y modalidades de la invención descritos anteriormente. A menos que se indique otra cosa, la temperatura es en grados centígrados y la presión es en o cerca de la atmosférica. Los ejemplos anteriores y la descripción detallada se ofrecen a manera de ilustración y no a manera de limitación. Todas las publicaciones, solicitudes de patente y patentes citadas en esta especificación se incorporan aquí por referencia como si cada publicación, solicitud de patente o patente individuales fueran específicamente e individualmente indicadas para ser incorporadas por referencia. En particular, todas las publicaciones citadas aquí son expresamente incorporadas aquí por referencia para el propósito de describir y desglosar las composiciones y metodologías que pudieran ser usadas en conexión con la invención. Aunque la invención anterior se ha descrito con algún detalle a manera de ilustración y ejemplo para propósitos de claridad de entendimiento, será fácilmente evidente para los expertos en la técnica a la luz de las enseñanzas de esta invención que se pueden hacer ciertos cambios y modificaciones a la misma sin apartarse de la esencia o alcance de las reivindicaciones anexas.
Ejemplo 1 Producción de isopreno en E. coli que expresa isopreno sintasa de kudzu recombinante I . Construcción de los vectores para la expresión de la isopreno sintasa de kudzu en E. coli La secuencia de proteína para el gen de isopreno sintasa de kudzu (Pueraria montana) (IspS) se obtuvo de GenBank (AAQ84170) . Un gen de isopreno sintasa de kudzu, optimizado para uso de codón de E. coli, se compró de DNA2.0 (SEQ ID NO: 1) . El gen de isopreno sintasa fue removido del plásmido suministrado por digestión con enzima de restricción con BspLUlll/PstI , purificado en gel, y ligado a pTrcHis2B (Invitrogen) que había sido digerido con Ncol/PstI. El constructo se diseñó para el codón de detención en el gen de isopreno sintasa 5' al sitio PstI . Como resultado, cuando el constructo fue expresado, la His-Tag no se unió a la proteína isopreno sintasa. El plásmido resultante, pTrcKudzu, fue verificado por secuenciación (figuras 2 y 3).
El gen de isopreno sintasa también se clonó en pET16b (Novagen) . En este caso, el gen de isopreno sintasa se insertó en pET16b de tal manera que la proteína isopreno sintasa recombinante contenía la His-tag N-terminal. El gen de isopreno sintasa fue amplificado a partir de pTrcKudzu por PCR mediante el uso del conjunto de cebador pET-His-Kudzu-2F : 5 ' -CGTGAGATCATATGTGTGCGACCTCTTCTCAATTTAC (SEQ ID NO: 3) y pET-His-Kudzu-R: 5 ' -CGGTCGACGGATCCCTGCAGTTAGACATACATCAGCTG (SEQ ID N0:4). Estos cebadores añadieron un sitio Ndel en el extremo 5 ' y un sitio BamHl en el extremo 3 ' del gen respectivamente. El plásmido pTrcKudzu, descrito anteriormente, se usó como ADN de plantilla, la polimeraasa Herculase (Stratagene) se usó de conformidad con las instrucciones de fabricación, y los cebadores se añadieron a una concentración de 10 pMoles . La PCR se llevó a cabo en un volumen total de 25 µ? . El producto de PCR fue digerido con Ndel/BamHl y se clonó en ????ß? digerido con las mismas enzimas. La mezcla de ligación fue transformada a ToplO de E. coli (Invitrogen) y el clon correcto fue seleccionado por secuenciación. El plásmido resultante, en el cual el gen de isopreno sintasa de kudzu se expresó a partir del promotor T7, fue designado pETNHisKudzu (figuras 4 y 5) .
El gen de isopreno sintasa de kudzu también se clonó en plásmido de número de copias bajo pCL1920. Los cebadores se usaron para amplificar el gen de isopreno sintasa de kudzu de pTrcKudzu descrito antes. El cebador hacia adelante añadió un sitio de HindIII y un RBS de consenso de E. coli al extremo 5'. El sitio de clonación de PstI ya estaba presente en pTrcKudzu apenas 3 ' del codón de detención por lo que el cebador de reversa fue construido de tal manera que el producto de PCR final incluye el sitio de PstI . Las secuencias de los cebadores fueron: HindlII-rbs-Kudzu F: 5 ' -CATATGAAAGCTTGTATCGATTAAATAAGGAGGAATAAACC (SEQ ID NO: 6) y BamHl-Kudzu R: 5'- CGGTCGACGGATCCCTGCAGTTAGACATACATCAGCTG (SEQ ID NO : 4 ) . El producto de PCR fue amplificado mediante el uso de la polimerasa Herculase con cebadores a una concentración de 10 pmoles y con 1 ng de ADN de plantilla (pTrcKudzu) . El protocolo de amplificación incluyó 30 ciclos de (95°C durante 1 minuto, 60°C durante 1 minuto, 72°C durante 2 minutos) . El producto fue digerido con HindIII y PstI y ligado en pCL1920 que también había sido digerido con HindIII y PstI. La mezcla de ligación fue transformada a ToplO de E. coli. Varios transformantes fueron verificados por secuenciación. El plásmido resultante fue designado pCL-lac-Kudzu (figuras 6 y 7) .
II. Determinación de producción de isopreno Para los cultivos en matraz de agitación, un mi de un cultivo fue transferido de matraces de agitación a tubos de espacio superior CTC de 20 mi (Agilent vial cat# 5188 2753; cap cat# 5188 2759) . La tapa se enroscó apretadamente y los tubos se incubaron a la temperatura equivalente con agitación a 250 rpm. Después de 30 minutos los tubos fueron removidos de la incubadora y analizados como se describe más adelante (véase tabla 1 para algunos valores experimentales de esta prueba) .
En casos en donde la producción de isopreno en termentadores se determinó, se tomaron muestras de los gases desprendidos del termentador y se analizaron directamente como se describe más adelante (véase tabla 2 para algunos valores experimentales de esta prueba) .
El análisis se llevó a cabo mediante el uso de un sistema de GC/ S Agilent 6890 en interfaz con un automuestreador CTC Analytics (Suiza) CombiPAL que operaba en el modo de espacio superior. Una columna GC/MS de Agilent HP-5MS (30 m x 0.25 mm; 0.25 m de espesor de película) se usó para separación de analitos. El muestreador se preparó para inyectar 500 de gas de espacio superior. El método de GC/MS utilizó helio como el gas portador a un flujo de 1 ml/min. El puerto de inyección se mantuvo a 250°C con una relación de separación de 50:1. La temperatura de horno se mantuvo a 37 °C durante los 2 minutos de duración del análisis. El detector selectivo de masa Agilent 5793N se llevó a cabo en modo de monitoreo de ion individual (SIM) en m/z 67. El detector se cambió de 1.4 a 1.7 minutos para permitir la elución de gases permanentes. Bajo estas condiciones, se observó que el isopreno (2 -metil-1 , 3 -butadieno) eluía a 1.78 minutos. Se usó una tabla de calibración para cuantificar la cantidad absoluta de isopreno y se encontró que era lineal de 1 pg/L a 2000 ug/L. Se estimó que el límite de detección era 50 a 100 ng/L mediante' el uso de este método.
III. Producción de isopreno en matraces de agitación que contiene células de E. coli que expresan isopreno sintasa recombinante Los vectores descritos antes fueron introducidos a la cepa BL21 de E. coli (Novagen) para producir las cepas BL2l/ptrcKudzu, BL21/pCL-lac-Kudzu y BL2l/pETHisKudzu . Las cepas se diseminaron para aislamiento sobre LA (agar Luria) + carbenicilina (50 µg/ml) y se incubaron durante la noche a 37°C. Colonias individuales fueron inoculadas en matraces de agitación de 250 mi con división que contenían 20 mi de caldo Luria Bertani (LB) y carbenicilina (100 pg/ml) . Los cultivos se hicieron crecer durante la noche a 20°C con agitación a 200 rpm. La OD6oo de los cultivos durante la noche se midió y los cultivos se diluyeron en un matraz de agitación de 250 mi con división que contenían 30 mi de MagicMedia (Invitrogen) + carbenicilina (100 yg/ml) a una OD600 -0.05. El cultivo se incubó a 30°C con agitación a 200 rpm. Cuando la OD60o -0.5-0.8, 400 µ? de IPTG se añadió y las células se incubaron durante 6 horas adicionales a 30°C con agitación a 200 rpm. A 0, 2, 4 y 6 horas después de la inducción con IPTG, alícuotas de 1 mi de los cultivos se recolectaron, la OD60o se determinó y la cantidad de isopreno producido se midió como se describió antes. Los resultados se muestran en las figuras 8A a 8D.
IV. Producción de isopreno de BL21/ptrcKudzu en fermentación de 14 litros La producción a gran escala de isopreno a partir de E. coli que contiene el gen de isopreno sintasa de kudzu recombinante se determinó a partir de un cultivo intermitente con- alimentación. La receta para el medio de fermentación (TM2) por litro de medio de fermentación fue la siguiente: K2HP04 13.6 g, KH2PO4 13.6 g, MgS04 * 7H20 2 g, ácido cítrico monohidratado 2 g, citrato de amonio férrico 0.3 g, (NH )2S04 3.2 g, extracto de levadura 5 g, solución de metal traza modificado 1000X 1 mi. Todos los componentes se añadieron juntos y se disolvieron en diH20. El pH se ajustó a 6.8 con hidróxido de potasio (KOH) y c.b.p. volumen. El producto final se esterilizó mediante filtro con 0.22 µ (solo, no se sometió a autoclave) . La receta para solución de metal traza modificado 1000X fue la siguiente: ácidos cítricos * H20 40 g, MnS04 * H20 30 g, NaCl 10 g, FeS04 * 7H20 1 g, CoCl2 * 6H20 1 g, ZnSO * 7H20 1 g, CuS04 * 5H20 100 mg, H3B03 100 mg, NaMo04 * 2H20 100 mg. Cada componente se disolvió uno a la vez en diH20, pH a 3.0 con HCl/NaOH, después c.b.p. volumen y se esterilizó mediante filtro con un filtro de 0.22 µ.
Este experimento se llevó a cabo en 14 L biorreactor para monitorear la formación de isopreno a partir de glucosa a la fermentación deseada, pH 6.7 y temperatura 34 °C. Un inoculo de cepa BL21/ptrcKudzu de E. coli tomada de un tubo congelado se preparó en un medio de soytone-extracto de levadura-glucosa. Después de que el inoculo creció a OD550 = 0.6, dos matraces de 600 mi se centrif garon y el contenido se resuspendió en 70 mi de sobrenadante para transferir la pastilla de células (70 mi de OD 3.1 de material) al biorreactor. En varios tiempos después de la inoculación, las muestras se removieron y la cantidad de isopreno producido se determinó como se describió antes. Los resultados se muestran en las figuras 9A a 9B.
Ejemplo 2 Producción de isopreno en E. coli que expresa isopreno sintasa de álamo blanco recombinante La secuencia de proteína para la isopreno sintasa de álamo blanco (Populus alba x Populus trémula) (Schnitzler, J-P, et al. (2005) Planta 222:777-786) se obtuvo de GenBank (CAC35696) . Un gen, codón optimizado para E. coli, se compró de DNA2.0 (p9796-poplar, figuras 30 y 31). El gen de isopreno sintasa fue removido del plásmido suministrado por digestión con enzima de restricción con BspLUlII/ sti , purificado en gel, y ligado en pTrcHis2B que había sido digerido con Ncol/PstI. El constructo se clonó de tal manera que el codón de detención en el inserto es antes del sitio Petl , que da por resultado un constructo en el cual el His-Tag no es unido a la proteína isopreno sintasa. El plásmido. resultante pTrcPoplar (figuras 32 y 33) , fue verificado por secuenciación.
Ejemplo 3 Producción de isopreno en Panteoa citrea que expresa isopreno sintasa de kudzu recombinante Los plásmidos pTrcKudzu y pCL-lac de Kudzu descritos en el ejemplo 1 se sometieron a electroporacion en P. citrea (patente de E.U.A. No. 7,241,587). Se seleccionaron transformantes en LA que contenía carbenicilina (200 pg/ml) o espectinomicina (50 ug/ml) respectivamente. La producción de isopreno de matraces de agitación y la determinación de la cantidad de isopreno producido se llevó a cabo como se describe en el ejemplo 1 para cepas de E. coli que expresaban isopreno sintasa de kudzu recombinante . Los resultados se muestran en las figura 10A a 10C.
Ejemplo 4 La producción de isopreno en Bacillus subtilis que expresa isopreno sintasa de kudzu recombinante I. Construcción de un plásmido replicante de B. subtilis para la expresión de isopreno sintasa de kudzu El gen de isopreno sintasa de kudzu fue expresado en cepa aprEnprE - Pxyl-comK de Bacillus subtilis (BG3594comK) mediante el uso de un plásmido replicante (pBS19 con un cásete de resistencia a cloranfenicol ) bajo control del promotor aprE. El gen de isopreno sintasa, el promotor aprE y el terminador de transcripción fueron amplificados por separado y fusionados mediante el uso de PCR. El constructo después fue clonado a pBS19 y transformado a B . subtilis. a) Amplificación del promotor aprE El promotor aprE fue amplificado de ADN cromosómico de Bacillus subtilis mediante el uso de los siguientes cebadores : CF 797 (+) Inicio de los siguientes cebadores Mfel 5»- GACATCAATTGCTCCATTTTCTTCTGCTATC (SEQ ID NO: 58) CF 07-43 (-) Fusión del promotor aprE a ispS de Kudzu 51 -ATTGAGAAGAGGTCGCACACACTCTTTACCCTCTCCTTTTA (SEQ ID NO: 59) b) Amplificación del gen de isopreno sintasa El gen de isopreno sintasa de kudzu fue amplificado de plásmido pTrcKudzu (SEQ ID NO: 2) . El gen había sido optimizado en codón para E. coli y sintetizado por DNA 2.0. Se usaron los siguientes cebadores: CF 07-42 (+) Fusión del promotor aprE al gen de isopreno sintasa de kudzu (codón de inicio de GTG) 5 ' -TAAAAGGAGAGGGTAAAGAGTGTGTGCGACCTCTTCTCAAT (SEQ ID NO: 60) CF 07-45 (-) Fusión del extremo 3' del gen de isopreno sintasa de kudzu al termiñador 5 ' -CCAAGGCCGGTTTTTTTTAGACATACATCAGCTGGTTAATC (SEQ ID NO: 61) c) Amplificación del termiñador de transcripción El termiñador de la serina proteasa alcalina de Bacillus amyliquefaciens fue amplificado a partir de un plásmido pJHPms382 secuenciado mediante el uso de los siguientes cebadores: CF 07-44 (+) Fusión del extremo 3' de isopreno sintasa de kudzu al terminador 5'- GATTAACCAGCTGATGTATGTCTAAAAAAAACCGGCCTTGG (SEQ ID NO: 62) CF 07-46 (-) Terminación del terminador de B . amyliquefaciens (BamHI) 5 ' -GACATGACGGATCCGATTACGAATGCCGTCTC (SEQ ID NO: 63) El fratmento de kudzu fue fusionado al fragment del terminador mediante el uso de PCR con los siguientes cebadores : CF 07-42 (+) Fusión del promotor aprE al gen de isopreno sintasa de kudzu (codón de inicio de GTG) 5 ' -TAAAAGGAGAGGGTAAAGAGTGTGTGCGACCTCTTCTCAAT (SEQ ID NO: 61) CF 07-46 (-) Terminación del terminador de B. amyliquefaciens (BamHI) 5'- GACATGACGGATCCGATTACGAATGCCGTCTC (SEQ ID NO: 63) El fragmento de terminador de kudzu fue fusionado al fragmento de promotor mediante el uso de PCR con los siguientes cebadores: CF 797 (+) Inicio del promotor de aprE Miel 5'- GACATCAATTGCTCCATTTTCTTCTGCTATC (SEQ ID NO: 64) CF 07-46 (-) Terminación del terminador de B. amyliquefaciens (BamHI) 5'- GACATGACGGATCCGATTACGAATGCCGTCTC (SEQ ID NO: 63) El fragmento de PCR de fusión fue purificado mediante el uso de un Qiagen kit y digerido con las enzimas de restricción Mfel y BamHI. Este fragmento de ADN digerido fue purificado en gel mediante el uso de un Qiagen kit y ligado a un vector conocido como pBS19, que había sido digerido con EcoRI y BamHI y purificado en gel.
La mezcla de ligación fue transformada a ToplO de células de E. coli y las colonias se seleccionaron sobre placas de carbenicilina con LA+50. Un total de seis colonias se escogieron y se hicieron crecer durante la noche en carbenicilina LB+50 y después los plásmidos se aislaron mediante el uso de un Qiagen kit. Los plásmidos fueron digeridos con EcoRI y BamHI para verificar insertos y tres de los plásmidos correctos fueron enviados para secuenciación con los siguientes cebadores: CF 149 (+) EcoRI inicio de promotor aprE 5*- GACATGAATTCCTCCATTTTCTTCTGC (SEQ ID NO: 65) CF 847 (+) Secuenciación en pXX 049 (terminación del promotor aprE) 5 ' -AGGAGAGGGTAAAGAGTGAG (SEQ ID NO: 66) CF 07-45 (-) Fusión del extremo 3' de isopreno sintasa de kudzu al terminador 5'- CCAAGGCCGGTTTTTTTTAGACATACATCAGCTGGTTAATC (SEQ ID NO: 61) CF 07-48 (+) Secuenciación del cebador para isopreno sintasa de kudzu 5'- CTTTTCCATCACCCACCTGAAG (SEQ ID NO: 67) CF 07-49 (+) Secuenciación en isopreno sintasa de kudzu 5'- GGCGAAATGGTCCAACAACAAAATTATC (SEQ ID NO: 68) El plásmido designado pBS Kudzu #2 (figuras 52 y 12) fue corregido por secuenciación y fue transformado a BG 3594 comK, una cepa hospedera de Bacillus subtilis . La selección se hizo en placas de LA + 5 cloranfenicol . Un transformante se escogió y se agregó a colonias individuales sobre LA + 5 cloranfenicol , después se hizo crecer en LB+5 cloranfenicol hasta alcanzar una OD600 de 1.5. Se almacenó bajo congelamiento en un tubo a -80°C en presencia de glicerol. La cepa resultante fue designada CF 443.
II . Producción de isopreno en matraces de agitación que contiene células de B. subtilis que expresan isopreno sintasa recombinante Los cultivos que se dejó durante la noche fueron inoculados con una colonia individual de CF 443 a partir de un LA + cloranfenicol (Cm, 25 pg/ml) . Los cultivos se hicieron crecer en LB + Cm a 37°C con agitación a 200 rpm. Estos cultivos que se dejaron durante la noche (1 mi) se usaron para inocular matraces de agitación de 250 mi con división que contenían 25 mi de medio Grants II y cloranfenicol a una concentración final de 25 g/ml. La receta de medio Grants II fue 10 g de soytone, 3 mi de K2HP04 1M, 75 g de glucosa, 3.6 g de urea, 100 mi de 10X MOPS, c.b.p. 1 L con H20, pH 7.2; la receta para 10X MOPS fue 83.72 g de MOPS, 7.17 g de tricina, 12 g de comprimidos de KOH, 10 mi de solución 0.276M de K2S04, 10 mi de solución 0.528M de ¦ MgCl2, 29.22 g de NaCl, 100 mi de 100X micronutrientes , c.b.p. 1 L con H20; y La receta para micronutrientes 100X fue 1.47 g de CaCl2*2H20, 0.4 g de FeSO4*7H20, 0.1 g de MnSO4*H20, 0.1 g de ZnS04*H20, 0.05 g de CuCl2*2H20, 0.1 g de CoCl2*6H20, 0.1 g de Na2Mo04*2H20, c.b.p. 1 L con H20. Los matraces de agitación se incubaron a 37°C y se tomaron muestras a 18, 24, y 44 horas. A 18 horas los espacios superiores de CF443 y la cepa de control se muestrearon. Esto representó 18 horas de acumulación de isopreno. La cantidad de isopreno como se determina por cromatografía de gases como se describe en el ejemplo 1. La producción de isopreno se incrementó significativamente al expresar isopreno sintasa recombinante (figura 11) .
III. Producción de isopreno por CF443 en fermentación de 14 L La producción a gran escala de isopreno de B. subtilis que contenía el gen de isopreno sintasa de kudzu recombinante sobre un plásmido de replicación se determinó a partir de un cultivo intermitente con alimentación. Cepa CF 443 de Bacillus, que expresa un gen de isopreno sintasa de kudzu o cepa de control que no expresa un gen de isopreno sintasa de kudzu fueron cultivadas por fermentación intermitente en alimentación convencional en un medio de nutrientes que contenía harina de soya (Cargill) , fosfato de sodio y potasio, sulfato de magnesio y una solución de ácido cítrico, cloruro férrico y cloruro de manganeso. Antes de la fermentación, el medio es macerado durante 90 minutos mediante el uso de una mezcla de enzimas que incluye celulasas, hemicelulasas y pectinasas (véase, W095/04134). Fermentaciones intermitentes de 14 L son alimentadas con 60% p/p de glucosa (Cargill DE99 dextrosa, ADM Versadex greens o azúcar invertido de Danisco) y 99% p/p de aceite (aceite de soya Western Family, en donde el 99% p/p es la concentración de aceite antes de añadirse al medio de cultivo de células) . La alimentación se inició cuando la glucosa en el lote no fue detectable. La velocidad de alimentación disminuyó en varias horas y se ajustó para añadir aceite sobre una base igual de carbono. El pH fue controlado a 6.8-7.4 mediante el uso de 28% p/v de hidróxido de amonio. En caso de espumación, se añadí agente anti -espumación al medio. La temperatura de fermentación fue controlada a 37°C y el cultivo de fermentación se agitó a 750 rpm. Varios otros parámetros tales como pH, %DO, flujo de aire y presión fueron monitoreados a lo largo de todo el proceso. El %DO se mantuvo por arriba de 20. Se tomaron muestras durante el curso de tiempo de 36 horas y se analizaron para crecimiento celular (OD550) y producción de isopreno. Los resultados de estos experimentos se presentan en las figuras 53A y 53B.
IV. Integración de la isopreno sintasa de kudzu (ispS) en 23. subtilis .
El gen de isopreno sintasa de kudzu' se clonó en un plásmido integrador (p JHlOl-cmpR) bajo el control del promotor aprE. Bajo las condiciones probadas, no se detectó isopreno.
Ejemplo 5 Producción de isopreno en Trichoderma I. Construcción de los vectores para expresión del isopreno sintasa de kudzu en Trichoderma reesei El gen de kudzu . IS optimizado por codón para Yarrowia lypolitica fue sintetizado por DNA 2.0 (SEQ ID NO: 8) (figura 13) . Este plásmido sirvió como la plantilla para la siguiente reacción de amplificación por PCR: 1 µ? de plantilla de plásmido (20 ng/ul) , 1 µ? de Primer EL-945 (10 uM) 51 -GCTTATGGATCCTCTAGACTATTACACGTACATCAATTGG (SEQ ID NO: 9), 1 µ? de Primer EL-965 (10 uM) 5'-CACCATGTGTGCAACCTCCTCCCAGTTTAC (SEQ ID NO: 10), 1 µ? de dNTP (10 mM) , 5 µ? de ADN polimerasa lOx PfuUltra II Fusión HS, 1 µ? de ADN polimerasa PfuUltra II Fusión HS, 40 µ? de agua en un volumen de reacción total de 50 µ? . El cebador hacia adelante contenía 4 nucleótidos adicionales en el extremo 5' que no correspondió al gen de isopreno sintasa de kudzu optimizado por codón para Y. lypolitica, pero fue requerido para clonarse en el vector pENTR/D-TOPO . El cebador de reversa contenía 21 nucleótidos adicionales en el extremo 5' que no correspondían al gen de isopreno sintasa de kudzu optimizado por codón para Y. lypolitica, pero fueron insertados para clonarse en otros esqueletos de vector. Al usar el MJ Research PTC-200 Thermociclor, la reacción de PCR se llevó a cabo como sigue: 95°C durante 2 minutos (primer ciclo únicamente) , 95°C durante 30 segundos, 55°C durante 30 segundos, 72 °C durante 30 segundos (se repite durante 27 ciclos) , 72°C durante 1 minuto después del último ciclo. El producto de PCR se analizó en un E-gel al 1.2% para confirmar amplificación exitosa del gen de isopreno sintasa de kudzu optimizado por codón para Y. lypolitica .
El producto de PCR se clonó después mediante el uso del TOPO pENTR/D-TOPO Cloning Kit según el protocolo del fabricante: 1 µ? de reacción de PCR, 1 µ? de solución de sal, 1 µ? de vector TOPO pENTR/D-TOPO y 3 µ? de agua en un volumen de reacción total de 6 µ? . La reacción se incubó a temperatura ambiente durante 5 minutos. Un microlitro de reacción TOPO fue transformada a células de E. coli químicamente competentes con TOP10. Los transformantes fueron seleccionados en placas con LA + 50 de kanamicina. Varias colonias fueron recogidas y cada una fue inoculada en un tubo de 5 mi que contenía LB + 50 yg/ml de kanamicina y los cultivos crecieron durante la noche a 37 °C con agitación a 200 rpm. Los plásmidos se aislaron a partir de los tubos que se dejó durante la noche mediante el uso de QIAprep Spin Miniprep Kit, según el protocolo del fabricante. Varios plásmidos fueron secuenciados para verificar, que la secuencia de ADN era correcta.
Un plásmido de pENTR/D-TOPO individual, que codifica un gen de isopreno sintasa de kudzu optimizado por codón para Y. lypolitica, se usó para clonación Gateway en un vector pTrex3g personalizado. La construcción de pTrex3g se describe en WO 2005/001036 A2. La reacción se llevó a cabo según el protocolo del fabricante para el Gateway LR Clonase II Enzyme Mix Kit (Invitrogen) : 1 µ? de gen de isopreno sintasa de kudzu optimizado por codón para Y. lypolitica, vector donador de pENTR/D-TOPO, 1 µ? de vector de destino pTrex3g, 6 µ? de regulador de pH TE, pH 8.0 en un volumen de reacción total de 8 µ?. La reacción se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora y después 1 µ? de solución de proteinasa K se añadió y la incubación continuó a 37 °C durante 10 minutos. Después, 1 µ? de reacción se transformó a células de E. coli químicamente competentes con TOP10. Los transformantes fueron seleccionados en LA + 50 pg/ml de placas de carbenicilina . Varias colonias se recogieron y cada una fue inoculada en un tubo de 5 mi que contiene LB + 50 ylg/ml de carbenicilina y los cultivos se hicieron crecer durante la noche a 37°C con agitación a 200 rpm. Los plásmidos se aislaron a partir de los tubos que se dejó durante la noche mediante el uso de QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen, Inc.), según el protocolo del fabricante. Varios plásmidos fueron secuenciados para verificar que la secuencia de ADN fuera correcta.
La transformación biolística de plásmido pTrex3g de isopreno sintasa de kudzu optimizada por codón de Y". lypolitica (figura 14) en una cepa cepa de Trichoderma reesei quad-deletada se llevó a cabo mediante el uso del Biolistic PDS-1000/?? Particle Delivery System (see WO 2005/001036 A2) . El aislamiento de transformantes estables y evaluación del matraz de agitación se llevó a cabo mediante el uso del protocolo listado en el ejemplo 11 de la publicación de patente WO 2005/001036 A2.
II. La producción de isopreno en cepas recombinantes de T. reesei Un mi de cultivos de transformantes de isopreno sintasa de 15 y 36 horas descritos anteriormente fue transferido a tubos de espacio superior. Los tubos se sellaron y se incubaron durante 5 horas a 30°C. El gas del espacio superior se midió y el isopreno se identificó por el método descrito en el ejemplo 1. Dos de los transformantes mostraron trazas de isopreno. La cantidad de isopreno se pudo incrementar por una incubación de 14 horas. Las dos muestras positivas mostraron isopreno a niveles de aproximadamente 0.5 pg/L para la incubación de 14 horas . El control no transformado no mostró niveles detectables de isopreno. Este experimento muestra que T. reesei es capaz de producir isopreno de precursor endógeno cuando se suministra con una isopreno sintasa exógena .
Ejemplo 6 Producción de isopreno en Yarrowia I . Construcción de los vectores para expresión de la isopreno sintasa de kudzu en Yarrowia lypolitica .
El punto de inicio para la construcción de los vectores para la expresión del gen de isopreno sintasa de kudzu en Yarrowia lypolitica fue el vector pSPZl (MAP29Spb) . La secuencia completa de este vector (SEQ ID No: 11) se muestra en las figuras 15A a 15C.
Los siguientes fragmentos fueron amplificados por PCR mediante el uso de ADN cromosómico cié una cepa GICC 120285 de Y. lypolitica como la plantilla: una forma sin promotor del gen URA3 , un fragmento de gen de ARN ribosomal de 18S, un terminador de transcripción del gen XPR2 de Y. lypolitica y dos fragmentos de ADN que contienen los promotores de genes XPR2 y ICL1. Se usaron los siguientes cebadores de PCR: ICLl 3 51 -GGTGAATTCAGTCTACTGGGGATTCCCAAATCTATATATACTGCAGGTGAC (SEQ ID NO: 69) ICLl 5 51 -GCAGGTGGGAAACTATGCACTCC (SEQ ID NO: 70) XPR 3 5 * -CCTGAATTCTGTTGGATTGGAGGATTGGATAGTGGG (SEQ ID NO: 71) XPR 5 5 ' -GGTGTCGACGTACGGTCGAGCTTATTGACC (SEQ ID NO: 72) XPRT3 5 ' -GGTGGGCCCGCATTTTGCCACCTACAAGCCAG (SEQ ID NO: 73) XPRT 5 5 ' -GGTGAATTCTAGAGGATCCCAACGCTGTTGCCTACAACGG (SEQ ID NO: 74) Y18S3 5 ' -GGTGCGGCCGCTGTCTGGACCTGGTGAGTTTCCCCG (SEQ ID NO: 75) Y18S5 5 ' -GGTGGGCCCATTAAATCAGTTATCGTTTATTTGATAG (SEQ ID NO: 76) YURA3 5 ' -GGTGACCAGCAAGTCCATGGGTGGTTTGATCATGG (SEQ ID NO: 77) YURA 50 51 -GGTGCGGCCGCCTTTGGAGTACGACTCCAACTATG (SEQ ID NO: 78) YURA 51 5 ' -GCGGCCGCAGACTAAATTTATTTCAGTCTCC (SEQ ID NO:79) Para amplificación por PCR la polimerasa PfuUltralI (Stratagene) , regulador de pH provisto por el proveedor y dNTPs , cebadores de 2.5 µ? y el ADN de plantilla indicado se usaron según las instrucciones del fabricante. La amplificación se hizo mediante el uso del siguiente ciclo: 95°C durante 1 min; 34x (95°C durante 30 seg; 55°C durante 30 seg; 72°C durante 3 min) y 10 min a 72°C seguido por una incubación a 4°C.
Las moléculas de ADN sintéticas que codifican el gen de isopreno sintasa de kudzu, optimizado por codón para expresión en Yarrowia, se obtuvo de DNA 2.0 (figura 16; SEQ ID NO: 12) . Detalle completo de los esquemas de construcción de los plásmidos pYLA(KZl) y pYLI (KZ1) que portan el gen sintético de isopreno sintasa de kudzu bajo control de los promotores XPR2 y ICL1 respectivamente se presenta en las figuras 18A a 18F. Los plásmidos de control en los cuales un gen de factor de acoplamiento (MAP29) es insertado en lugar de un gen de isopreno sintasa también fueron construidos (figuras 18E y 18F) .
Un procedimiento de clonación similar se puede usar para expresar un gen de isopreno sintasa de álamo blanco (Populus alba x Populus trémula) . La secuencia del isopreno sintasa de álamo blanco se describe en Miller B. et al. (2001) Planta 213, 483-487 y se muestra en la figura 17 (SEQ ID NO: 13) . Un esquema de construcción para la generación de los plásmidos pYLA(POPl) y pYLI(POPl) que portan el gen de isopreno sintasa de álamo blanco sintético bajo control de los promotores XPR2 y ICLl respectivamente se presenta en las figura 18A y 18B.
II. Producción de isopreno por cepas de Y. lypolitica recombinantes .
Los vectores pYLA(KZl) , pYLI(KZl), pYLA(MAP29) y pYLI(MAP29) fueron digeridos con SacII y usados para transformar la cepa CLIB 122 de Y. lypolitica por un procedimiento de acetato de litio/polietilenglicol estándar a prototrofia de uridina. En breve, las células de levadura que crecieron en YEPD (1% de extracto de levadura, 2% de peptona, 2% de glucosa) durante la noche, fueron recolectadas por centrifugación (4000 rpm, 10 min) , lavadas una vez con agua estéril y se suspendió en 0.1 M de acetato de litio, pH 6.0. Alícuotas de doscientos µ? de la suspensión de células se mezclaron con solución de ADN de plásmido linealizado (10-20 µg) , se incubaron durante 10 minutos a temperatura ambiente y se mezclaron con 1 mi de 50% PEG 4000 en el mismo regulador de pH. Las suspensiones se incubaron adicionalmente durante 1 hora a temperatura ambiente seguido por un impacto término durante 2 minutos a 42°C. Las células después se colocaron sobre placas de SC his leu (0.67% de base de nitrógeno de levadura, 2% de glucosa, 100 mg/L de cada una de leucina e histidina) . Los transformantes aparecieron después de 3-4 días de incubación a 30°C.
Tres aislados a partir de la transformación de pYLA(KZl), tres aislados a partir de la transformación de pYLI(KZl), dos aislados a partir de la transformación de pYLA(MAP29) y dos aislados a partir de la transformación de pYLI(MAP29) se hicieron crecer durante 24 horas en medio YEP7 (1% de extracto de levadura, 2% de peptona, pH 7.0) a 30°C con agitación. Células de 10 mi de cultivo se recolectaron por centrifugación, se resuspendieron en 3 mi de YEP7 fresco y se colocaron en 15 mi de tubos con tapa roscada. Los tubos se incubaron durante la noche a temperatura ambiente con agitación suave (60 rpm) . El contenido de isopreno en el espacio superior de estos tubos se analizó por cromatografía de gases mediante el uso de detector espectrométrico de gases como se describe en el ejemplo 1. Todos los transformantes obtenidos con pYLA(KZl) y pYLI(KZl) produjeron cantidades fácilmente detectables de isopreno (0.5 ug/L a 1 g/L, figuras 20A a 20B) . No se detectó isopreno en el espacio superior de las cepas de control que portaban gen de fitasa en lugar de un gen de isopreno sintasa .
Ejemplo 7 La producción de isopreno en E. coli que expresa isopreno sintasa de kudzu y idi ó dxs ó idi y dxs I. Construcción de los vectores que codifican isopreno sintasa de kudzu y idi ó dxs ó idi y dxs para la producción de isopreno en E. coli i) Construcción de pTrcKudzuKan El gen bla de pTrc Kudzu (descrito en el ejemplo 1) fue reemplazado por el gen que confiere resistencia a kanamicina. Para remover el gen bla, pTrcKudzu fue digerido con BspUl, tratado con fosfatasa alcalina de camarón (SAP) , aniquilado con calor a 65°C, después fue llenado en los extremos con fragmento Klenow y dNTPs . El fragmento grande de 5 kbp fue purificado de un gel de agarosa y ligado al gen kanr que ha sido amplificado con PCR de pCR-Blunt - I I - TOPO mediante el uso de cebadores MCM22 51 -GATCAAGCTTAACCGGAATTGCCAGCTG (SEQ ID NO : 14) y MCM23 5 ' -GATCCGATCGTCAGAAGAACTCGTCAAGAAGGC (SEQ ID NO: 15) , fue digerido con HindIII y Pvul, y llenado en los extremos. Un transformante que portaba un plásmido que confería resistencia a la kanamicina (pTrcKudzuKan) se seleccionó en LA que contenía kanamicina 50 µg/ml . ii) Construcción de pTrcKudzu yIDI Kan pTrcKudzuKan fue digerido con PstI, tratado con SAP, aniquilado con calor y. urificado en gel . Fue ligado a un producto de PCR que codificaba idi de S. cerevisiae con un RBS sintético. Los cebadores para PCR fueron Nsil-YIDIl F 5'-CATCAATGCATCGCCCTTAGGAGGTAAAAAAAAATGAC (SEQ ID NO: 16) y PstI- YIDI 1 R 5 ' -CCTTCTGCAGGACGCGTTGTTATAGC (SEQ ID NO: 17); y la plantilla fue ADN genómico S. cerevisiae . El producto de PCR fue digerido con Nsil y PstI y purificado en gel antes de la ligación. La mezcla de ligación fue transformada a células TOP10 químicamente competentes y seleccionadas en LA que contienen 50 µg/ l de kanamicina. Varios transformantes se aislaron y secuenciados y el plásmido resultante se llamó pTrcKudzu-yIDI (kan) (figuras 34 y 35). iii) Construcción de pTrcKudzu DXS Kan El plásmido pTrcKudzuKan fue digerido con PstI, tratado con SAP, aniquilado con calor y purificado en gel. Fue ligado a un producto de PCR que codificaba dxs de E. coli con un RBS sintético. Los cebadores para PCR fueron MCM 13 5 ' -GATCATGCATTCGCCCTTAGGAGGTAAAAAAACATGAGTTTTGATATTGCCAAAT ACCCG (SEQ ID NO: 18) y MCM14 5'- CATGCTGCAGTTATGCCAGCCAGGCCTTGAT (SEQ ID NO: 19); y la plantilla fue ADN genómico de E. coli. El producto de PCR fue digerido con Nsil y PstI y purificado en gel antes de la ligación. La reacción de transformación resultante fue transformada a células TOP10 y seleccionadas en LA con kanamicina 50 µg/ml . Varios transformantes se aislaron y secuenciaron y el plásmido resultante se llamó pTrcKudzu-DXS(kan) (figuras 36 y 37). iv) Construcción de pTrcKudzu-yIDI -dxs (kan) pTrcKudzu-yIDI (kan) fue digerido con PstI, tratado con SAP, aniquilado con calor y purificado en gel . Fue ligado a un producto de PCR que codificaba dxs de E. coli con un RBS sintético (cebadores MCM13 5'-GATCATGCATTCGCCCTTAGGAGGTAAAAAAACATGAGTTTTGATATTGCCAAATACCC G (SEQ ID NO: 18) y MCM14 5'- CATGCTGCAGTTATGCCAGCCAGGCCTTGAT (SEQ ID NO: 19); células TOP10 de plantilla) que había sido digerido con Nsil y PstI y purificado en gel. El plásmido final se llamó pTrcKudzu-ylDI-dxs (kan) (figuras 21 y 22) . v) Construcción de pCL PtrcKudzu Un fragmento de ADN que contenía el promotor, gen estructural y terminador del ejemplo 1 anterior fue digerido de pTrcKudzu mediante el uso de SspI y purificado en gel. Fue ligado a pCL1920 que había sido digerido con PvwII, tratado con SAP y aniquilado con calor. La mezcla de ligación resultante fue transformada a células TOP10 y seleccionada en LA que contenía espect inomicina 50 g/ml. Varios clones . se aislaron y secuenciaron y dos fueron seleccionados. pCL PtrcKudzu y pCL PtrcKudzu (A3) tienen el inserto en orientaciones opuestas (figuras 38-41) . vi) Construcción de pCL PtrcKudzu yIDI El amplicón de IDI PCR, digerido por iVsil-Pstl, purificado en gel, de (ii) anterior fue ligado en pCL PtrcKudzu que había sido digerido con PstI, tratado con SAP, y aniquilado con calor. La mezcla de ligación fue transformada a células TOP10 y seleccionada en LA que contenía espectinomicina 50 yg/ml. Varios clones se aislaron y secuenciaron y el plásmido resultante se llama pCL PtrcKudzu yIDI (figuras 42 y 43) . vii) Construcción de pCL PtrcKudzu DXS El amplicón de DXS PCR, digerido por Nsil-PstI , purificado en gel, de (iii) anterior fue ligado en pCL PtrcKudzu (A3) que había sido digerido con PstI, tratado con SAP, y aniquilado con calor. La mezcla de ligación fue transformada a células TOP10 y seleccionada en LA que contenía espect inomicina 50 µg/ml. Varios clones se aislaron y secuenciaron y el plásmido resultante se llama pcL PtrcKudzu DXS (figuras 44 y 45) .
II. Medición de isopreno en espacio superior de cultivos que expresan isopreno sintasa de kudzu, idi, y/o dxs a diferentes números de copia Los cultivos de E. coli BL21(ADE3) previamente transformados con plásmidos pTrcKudz (kan) (A), pTrcKudzu-ylDI kan (B) , pTrcKudzu-DXS kan (C) , pTrcKudzu-ylDI -DXS kan (D) se hicieron crecer en LB kanamicina 50 pg/mL . Cultivos de pCL PtrcKudzu (E) , pCL PtrcKudzu, pCL PtrcKudzu-yIDI (F) y pCL PtrcKudzu-DXS (G) se hicieron crecer en LB espectinomicina 50 Los cultivos fueron inducidos con 400 µ? de IPTG en el tiempo 0 (OD500 aproximadamente 0.5) y se tomaron muestras para medición de espacio superior de isopreno (véase ejemplo 1) . Los resultados se muestran en la figura 23A-23G.
El plásmido pTrcKudzu-ylDI -dxs (kan) fue introducido en la cepa BL21 de E. coli por transformación. La cepa resultante BL2l/pTrc Kudzu IDI DXS se hizo crecer durante la noche en LB que contenía kanamicina (50 pg/ml) a 20°C y se usó para inocular matraces de agitación de TM3 (13.6 g de K2P04, 13.6 g de KH2P04, 2.0 g de MgS04*7H20) , 2.0 g de ácido cítrico monohidratado, 0.3 g de citrato de amonio férrico, 3.2 g de (NH4)2S04, 0.2 g de extracto de levadura, 1.0 mi de solución de metal traza modificada lOOOx, ajustado a pH 6.8 y c.b.p. para H20, y se esterilizó mediante filtro) que contenía 1% de glucosa. Los matraces fueron incubados a 30°C hasta que se alcanzó una OD60o de 0.8, y después fueron inducidos con 400 µ? de IPTG. Se tomaron muestras en varios tiempos después de la inducción y la cantidad de isopreno en el espacio superior se midió como se describe en el ejemplo 1. Los resultados se muestran en la figura 23H.
III. Producción de isopreno a partir de biomasa en E. coli/pTrc Kudzu yIDI DXS La cepa, BL21 pTrcKudzuIDIDXS se probó para la capacidad para generar isopreno de tres tipos de biomasa; bagazo, rastrojo de maíz y pulpa de madera suave con glucosa como un control. Los hidrolizados de la biomasa se prepararon por hidrólisis enzimática (Brown, L y Torget, R. , 1996, NREL standard assay method Lap-009 "Enzymatic Saccharification of Lignocellulosic Biomass") y se usaron a una dilución basada en equivalentes de glucosa. En este ejemplo, equivalentes de glucosa fueron iguales a 1% de glucosa. Una sola colonia de células de BL21 (DE3) pTrc Kudzu yIDI DXS (kan) recién transformadas en una placa se usó para inocular 5 mi de LB más kanamicina (50 µg/ml) . El cultivo se incubó durante la noche a 25°C con agitación. El día siguiente, el cultivo que se dejó durante la noche fue diluido a una OD60o de 0.05 en 25 mi de TM3 + 0.2% YE + 1% de material de alimentación. El material de alimentación fue rastrojo de maíz, bagazo o pulpa de madera suave. La glucosa se usó como un control positivo y no se usó glucosa como un control negativo. Los cultivos se incubaron a 30°C con agitación a 180 rpm. El cultivo fue monitoreado para OD60o y cuando alcanzó una OD60o de -0.8, los cultivos se analizaron a 1 y 3 horas para la producción de isopreno como se describe en el ejemplo 1. Los cultivos no fueron inducidos. Todos los cultivos que contenían material de alimentación añadido producen isopreno equivalente a - los del control positivo de glucosa. Se llevaron a cabo experimentos por duplicado y se muestran en las figuras 46A a 46E.
IV. Producción de isopreno a partir de azúcar invertido en E. coli/pTrcKudzuIDIDXS Una colonia individual de células BL21 (XDE3 ) /pTrcKudzu yIDI DXS (kan) recién transformadas en placa se usó para inocular 5 mL de LB + kanamicina (50 pg/ml) . El cultivo se incubó durante la noche a 25°C con agitación. El día siguiente el cultivo que se dejó durante la noche fue diluido a una OD600 de 0.05 en 25 mi de TM3 + 0.2% YE + 1% de material de' alimentación. El material de alimentación fue glucosa, glucosa invertida o rastrojo de maíz. El material de alimentación de azúcar invertido (Danisco Invert Sugar) se preparó por tratamiento enzimático de jarabe de sacarosa. Rastrojo de maíz AFEX se preparó como se describe más adelante (Parte V) . Las células se hicieron crecer a 30°C y la primera muestra se midió cuando los cultivos alcanzaron una OD60o -0.8-1.0 (0 hora). Los cultivos fueron analizados para crecimiento como se mide por OD6oo y para la producción de isopreno como en el ejemplo 1 a 0, 1 y 3 horas. Los resultados se muestran en las figuras 47A a 47D.
V. Preparación de hidrolizado der rastrojo de maíz pretratado con AFEX Rastrojo de maíz pretratado con AFEX se obtuvo de Michigan Biotechnology Institute. Las condiciones de pretratamiento fueron 60% de humedad, 1:1 de carga de amoniaco, y 90°C durante 30 minutos, desp,ués se secó con aire. El contenido de humedad en el rastrojo de maíz pretratado con AFEX fue 21.27%. El contenido de glucano' y xilano en el rastrojo de maíz pretratado con AFEX fueron 31.7% y 19.1% (base seca), respectivamente. El proceso de sacarificación fue el siguiente; 20 g de rastrojo de maíz pretratado con AFEX se añadió a un matraz de 500 mi con 5 mi de regulador de pH de citrato de sodio 1 M, pH 4.8, 2.25 mi de Accellerase 1000, 0.1 mi de Grindamyl H121 (producto de xilanase de Danisco de Aspergillus niger para la industria de elaboración de pan) , y 72.65 mi de agua DI. El matraz se puso en un agitador orbital y se incubó a 50°C durante 96 horas. se tomó una muestra del agitador y se analizó mediante el uso de HPLC . El hidrol i zado contenía 38.5 g/l de glucosa, 21.8 g/l de xilosa, y 10.3 g/l de oligómeros de glucosa y/o xilosa VI . El efecto de extracto de levadura sobre la producción de isopreno en E. coli que crece en cultivo intermitente con alimentación La fermentación se llevó a cabo a la escala de 14 L como se describió anteriormente con células de E. coli que contenían el plásmido pTrcKudzu yIDI DXS descrito anteriormente. Extracto de levadura (Bio Springer, Montreal, Quebec, Canadá) se alimentó a una velocidad exponencial. La cantidad total de extracto de levadura suministrado al termentador fue variado entre 70-830 g durante la fermentación de 40 horas. La densidad óprica del caldo de fermentación se midió a una longitud de onda de 550 nm . La densidad óptica final dentro de los termentadores fue proporcional a la cantidad de extracto de levadura añadida (figura 48A) . El nivel de isopreno en el gas desprendido a partir del termentador se determinó como se describió anteriormente. El título de isopreno incrementó durante el curso de la fermentación (figura 48B) . La cantidad de isopreno producido fue linealmente proporcional a la cantidad de extracto de levadura alimentado (figura 48C) .
VII. La producción de isopreno en fermentación de 500 L de pTrcKudzu DXS yIDI Una fermentación de 500 litros de células de E. coli con ácidos nucleicos de isopreno sintasa de kudzu, IDI de S. cerevisiae, y DXS de E. coli (BL21 de E. coli (ADE3) pTrc Kudzu dxs yidi) se usó para producir isopreno. Los niveles de isopreno varían de 50 a 300 g/L durante un período de 15 horas. Sobre la base de las concentraciones de isopreno promedio, el flujo promedio a través del dispositivo y el grado de rompimiento de isopreno, la cantidad de isopreno recolectado se calculó que era de aproximadamente 17 g- VIII. Producción de isopreno en fermentación de 500 L de E. coli que crecía en cultivo intermitente con alimentación Receta del medio (por litro medio de fermentación) : K2HP04 7.5 g, MgS04 * 7H20 2 g, ácido cítrico monohidratado 2 g, citrato de amonio férrico 0.3 g, extracto de levadura 0.5 g, solución de metal traza modificado 1000X 1 mi. Todos los componentes se añadieron juntos y se disolvieron en diH20. Esta solución se sometió a autoclave. El pH se ajustó a 7.0 con amonio gaseoso (NH3) y c.b.p. volumen. Glucosa 10 g, tiamina * HC1 0.1 g, y antibiótico se añadieron después de la esterilización y ajuste de pH.
Solución de metal traza modificado 1000X: Acidos cítricos * H20 40 g, MnS04 * H20 30 g, NaCl 10 g, FeS04 * 7H20 1 g, CoGl2 * 6H20 1 g, ZnSO * 7H20 1 g, CuS04 * 5H20 100 mg, H3B03 100 mg, NaMo04 * 2H20 100 mg. Cada componente se disuelve uno a la vez en DI H20, pH a 3.0 con HCl/NaOH, después c.b.p. volumen y se esterilizó mediante filtro con filtro de 0.22 mieras.
La fermentación se llevó a cabo en un biorreactor de 500 L con células de E. coli que contenían el plásmido pTrcKudzu yIDI DXS . Este experimento se llevó a cabo para monitorear la formación de isopreno a partir de glucosa y extracto de levadura a la fermentación deseada pH 7.0 y temperatura 30°C. Un inoculo de cepa de E. coli tomada de un tubo congelado se preparó en medio de soytone-extracto de levadura-glucosa. Después de que el inoculo creció a OD 0.15, medida a 550 nm, se usó 20 mi para inocular un biorreactor que contenía 2.5 L de medio de soytone-extracto de levadura-glucosa. El biorreactor de 2.5 L se hizo crecer a 30°C a OD 1.0 y 2.0 L fue transferido al biorreactor de 500 L.
Extracto de levadura (Bio Springer, Mont eal, Quebec, Canadá) y glucosa se alimentaron a velocidades exponenciales. La cantidad total de glucosa y extracto de levadura suministrada al biorreactor durante fermentación de 50 horas fue 181.2 kg y 17.6 kg, respectivamente. La densidad óptica dentro del biorreactor con el tiempo se muestra en la figura 49A. El nivel de isopreno en el gas desprendido a partir del biorreactor se determinó como se describió anteriormente. El título de isopreno incrementó durante el curso de la fermentación (figura 49B) . La cantidad total de isopreno producido durante fermentación de 50 horas fue 55.1 g y el curso de tiempo de producción se muestra en la figura 49C.
Ejemplo 8 Producción de isopreno en E. coli que expresa genes de isopreno sintasa de kudzu y vía de ácido mevalónico recombinante I. Clonación de la vía de MVA más baja La estrategia para clonar la vía de ácido mevalónico más baja fue la siguiente. Cuatro genes de la vía de biosíntesis de ácido mevalónico; genes de mevalonato cinasa (MVK) , fosfomevalonato cinasa (PMK) , difosfomevalonte descarboxilasa (MVD) y isopentenil difosfato isomerasa fueron amplificados por PCR de ADN cromosómico S. cerevisiae y fueron clonados individualmente en el plásmido pCR BluntlI TOPO (Invitrogen) . En algunos casos, el gen idi fue amplificado de ADN cromosómico de E. coli. Los cebadores se diseñaron de tal manera que un RBS de consenso de E. coli (AGGAGGT (SEQ ID NO:80) o AAGGAGG (SEQ ID NO: 81))' se insertó en el extremo 5', 8 pb en dirección 5' del codón de inicio y un sitio PstI se añadió en el extremo 3' . Los genes después se clonaron uno a uno en el vector pTrcHis2B hasta que se ensambló toda la vía.
El ADN cromosómico de S. cerevisiae S288C se obtuvo de ATCC (ATCC 204508D) . El gen MVK fue amplificado a partir de los cromosomas de S. cerevisiae mediante el uso de cebadores MVKF (51 -AGGAGGTAAAAAAACATGTCATTACCGTTCTTAACTTCTGC, SEQ ID NO: 21) y MVK-PstI-R (5'- ATGGCTGCAGGCCTATCGCAAATTAGCTTATGAAGTCCATGGTAAATTCGTG, SEQ ID NO: 22) mediante el uso de PfuTurbo según las instrucciones del fabricante. El producto de PCR de tamaño correcto (1370 pb) fue identificado por electroforesis a través de un E-gel al 1.2% (Invitrogen) y clonado en pZeroBLUNT TOPO. El plásmido resultante fue designado pMVKl . El plásmido pMVKl fue digerido con endonucleasas de restricción SacI y Tagl y el fragmento fue purificado en gel y ligado en pTrcHis2B digerido con SacI y BstBI . El plásmido resultante se denominó pTrcMVKl .
El segundo gen en la vía de biosíntesis de mevalónico, PMK, fue amplificado por PCR mediante el uso de cebadores: PstI-PMKl R (5 ' -GAATTCGCCCTTCTGCAGCTACC, SEQ ID NO:23) y BsiHKA I-PMK1 F (5'- CGACTGGTGCACCCTTAAGGAGGAAAAAAACATGTCAG, SEQ ID NO: 24). La reacción de PCR se llevó a cabo mediante el uso de Pfu Turbo polimerasa (Stratagene) según las instrucciones del fabricante. El producto de tamaño correcto (1387 pb) fue digerido con PstI y BsiHKI y ligado en pTrcMVKl digerido con PstI. El plásmido resultante se llamó pTrcKK. Los genes MVD e idi se clonaron de la misma manera. Se llevó a cabo PCR mediante el uso de los pares de cebador PstI-MVD 1 R (5'- GTGCTGGAATTCGCCCTTCTGCAGC, SEQ ID NO : 25 ) y Nsil-MVD 1 F (51 -GTAGATGCATGCAGAATTCGCCCTTAAGGAGG , SEQ ID NO:26) para amplificar el gen MVD y PstI- YIDI 1 R (5'-CCTTCTGCAGGACGCGTTGTTATAGC, SEQ ID NO: 27) y Nsil-YIDI 1 F (51 -CATCAATGCATCGCCCTTAGGAGGTAAAAAAAAATGAC , SEQ ID NO:28) para amplificar el gen yIDI . En algunos casos, se, usó el gen de IPP isomerasa, idi de E. coli. Para amplificar idi a partir de ADN cromosómico de E. coli, se usó la siguiente serie de cebador: PstI-CIDI 1 R (51 -GTGTGATGGATATCTGCAGAATTCG, SEQ ID NO: 29) y Nsil-CIDI 1 F (5 ' - CATCAATGCATCGCCCTTAGGAGGTAAAAAAACATG , SEQ ID NO-.30). El ADN de plantilla fue ADN cromosómico aislado por métodos estándares de FM5 de E. coli (WO 96/35796 y WO 2004/033646, que son incorporadas cada una aquí por referencia en su totalidad, particularmente con respecto a aislamiento de ácidos nucleicos). Los plásmidos finales se llamaron pKKDIy para el constructo que codifica el gen de idi de levadura o pKKDIc para el constructo que codifica el gen de idi de E. coli. Los plásmidos fueron transformados en hospederos BL21 de E. coli para análisis subsecuente. En algunos casos, la isopreno sintasa de kudzu se clonó en' pKKDIy para dar plásmido pKKDIyIS.
La vía de MVA más baja también se clonó en pTrc que contenía un marcador de resistencia a antiniótico kanamicina. El plásmido pTrc KKDIy fue digerido con endonucleasas de restricción Apal y PstI, el fragmento de 5930 pb fue separado en un E-gel de azarosa al 1.2% y purificado mediante el uso del Qiagen Gel Purification kit de conformidad con las instrucciones del fabricante. El plásmido pTrcKudzuKan , descrito en el ejemplo 7, fue digerido con endonucleasas de restricción Apal y PstI, y el fragmento de 3338 pb que contenía el vector fue purificado a partir de un E-gel al 1.2% mediante el uso del Qiagen Gel Purification kit. El fragmento de vector de 3338 pb y el fragmento de la vía de MVA más bajo de 5930 pb se ligaron mediante el uso del Roche Quick Ligation kit. La mezcla de ligación fue transformada a células de E. coli TOP10 y los tranformantes se hicieron crecer a 37°C durante la noche con selección en LA que contenía kanamicina (50 pg/ml) . Los transformantes fueron verificados por digestión con restricción enzima y uno se congeló como un material de abastecimiento. El plásmido fue designado pTrcKanKKDIy .
II . Clonación de un gen de isopreno sintasa de kudzu en pTrcKanKKDIy El gen de isopreno sintasa de kudzu fue amplificado por PCR de pTrc Kudzu, descrito en el ejemplo 1, mediante el uso de cebadores MCM50 5'- GATCATGCATTCGCCCTTAGGAGGTAAAAAAACATGTGTGCGACCTCTTCTCAAT TTACT (SEQ ID NO: 31) y MCM53 5'- CGGTCGACGGATCCCTGCAGTTAGACATACATCAGCTG (SEQ ID NO: 32). El fragmento de PCR resultante fue clonado en pCR2.1 y fue transformado a E. coli TOP10. Este fragmento contenía la secuencia codificante para isopreno sintasa de kudzu y una región en dirección 5' que contenía un RBS de E. coli. Los transformantes se incubaron durante la noche a 37°C con selección en LA que contenía carbenicilina (50 pg/ml) . La inserción correcta del fragmento fue verificado por secuenciación y esta cepa fue designada MCM93.
El plásmido de la cepa MCM93 fue digerido con endonucleasas de restricción iVsil y PstI para liberar un insertro de 1724 pb que contenía el RBS e isopreno sintasa de kudzu. El fragmento de 1724 pb se separó en un gel de agarosa E-gel al 1.2% y se purificó mediante el uso del Qiagen Gel Purificación kit de conformidad con las instrucciones del fabricante. El plásmido pTrcKanKKDIy fue digerido con la endonucleasa de restricción PstI, tratado con SAP durante 30 minutos a 37° C y purificado mediante el uso del Qiagen PCR cleanup kit. El plásmido e isopreno sintasa de kudzu que codifica fragmento de ADN fueron ligados mediante el uso del Roche Quick Ligación kit. La mezcla de ligación fue transformada a células de E. coli TOP10 y los transformantes se hicieron crecer durante la noche a 37°C con selección en LA que contenía Kanamiciha a 50 g/ml. El transformante correcto fue verificado por digestión de restricción y el plásmido fue designado pTrcKKDylklSKan (figuras 24 y 25) . Este plásmido fue transformado a células BL21(ADE3) (Invitrogen) .
III. Producción de isopreno a partir de mevalonato en E. cóli que expresa la vía de mevalonato inferior recombinante y la isopreno sintasa de kudzu La cepa BL21/pTrcKKDyIkISKan fue cultivada en un medio MOPS (Neidhardt et al., (1974) J. Bacteriology 119:736-747) ajustada a pH 7.1 y complementada con 0.5% de glucosa y 0.5% de ácido mevalónico. Un cultivo de control también se preparó mediante el uso de condiciones idénticas pero sin la adición de 0.5% de ácido mevalónico. El cultivo se inició a partir de un cultivo de semillas dejado durante la noche en un inoculo al 1% y fue inducido con 500 µ? de IPTG cuando el cultivo había alcanzado una ODS00 de 0.3 a 0.5. Los cultivos se hicieron crecer a 30°C con agitación a 250 rpm. La producción de isopreno se analizó 3 horas después de la inducción mediante el uso de la prueba de espacio superior descrita en el ejemplo 1. La producción máxima de isopreno fue 6.67 x 10"4 moles/Lcaido/OD60o/hr en donde Lcaido es el volumen de caldo e incluye tanto el volumen del medio de las células como el volumen de las células. El cultivo de control no complementado con ácido mevalónico no produjo isopreno medible.
IV. Clonación de la vía de MVA más alta La vía de mevalonato biosintético más alta, que comprendía dos genes que codificaban tres actividades enzimáticas, se clonó de Enterococcus faecalis . El gen mvaE codifica una proteína con las actividades enzimáticas tanto de acetil-CoA acetiltransferasa como de 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA (HMG-CoA) reductasa, la primera y tercera proteínas en la vía, y el gen mvaS codifican la segunda enzima en la vía, HMG-CoA sint.asa. El gen mvaE fue amplificado del ADN genómico de E. faecalis (ATCC 700802D-5) con un sitio de unión a ribosoma de E. coli y un separador en frente mediante el uso de los siguientes cebadores: CF 07-60 (+) Inicio de mvaE con RBS + codón de inicio de ATG SacI 5 ' -GAGACATGAGCTCAGGAGGTAAAAAAACATGAAAACAGTAGTTATTATTG (SEQ ID NO: 34) CF 07-62 (-) Fusión de mvaE á mvaS con RBS entre los mismos 5 ' -TTTATCAATCCCAATTGTCATGTTTTTTTACCTCCTTTATTGTTTTCTTAAATC (SEQ ID NO: 35) El gen mvaS fue amplificado de ADN genómico de E. faecalis (ATCC 700802D-5) con un RBS y separador de E. coli en frente mediante el uso de los siguientes cebadores: CF 07-61 (+) Fusión de mvaE a mvaS con RBS entre los mismos 51 -GATTTAAGAAAACAATAAAGGAGGTAAAAAAACATGACAATTGGGATTGATAAA (SEQ ID NO:36) CF 07-102 (-) Fin del gen mvaS BglII 5 ' -GACATGACATAGATCTTTAGTTTCGATAAGAACGAACGGT (SEQ ID NO: 37) Los fragmentos de PCR fueron fusionados junto con PCR mediante el uso de los siguientes cebadores: CF 07-60 (+ ) Inicio de mvaE w/ RBS + codón de inicio de ATG SacI 5 ' -GAGACATGAGCTCAGGAGGTAAAAAAACATGAAAACAGTAGTTATTATTG· (SEQ ID NO:34) CF 07-102 (-) Fin del gen mvaS BglII 5 ' -GACATGACATAGATCTTTAGTTTCGATAAGAACGAACGGT (SEQ ID NO: 37) El fragmento de PCR de fusión fue purificado mediante el uso de un Qiagen kit y digerido con las enzimas de restricción SacI y BglII. Este fragmento de ADN digerido fue purificado en gel mediante el uso de un Qiagen kit y ligado en el vector comercialmente disponible pTrcHis2A, que había sido digerido con SacI y BglII y purificado en gel.
La mezcla de ligación fue transformada a ToplO de células de E. coli y las colonias fueron seleccionadas en placas con LA+50 g/ml de carbenicilina . Un total de seis colonias se escogieron y se hicieron creer durante la noche en LB+50 yg/ml de carbenicilina y los plásmidos se aislaron mediante el uso de un Qiagen kit. Los plásmidos fueron digeridos con SacI y BglII para verificar insertos y un plásmido correcto fue secuenciado con los siguientes cebadores : CF 07-58 (+) Inicio de gen mvaE 5 ' -ATGAAAACAGTAGTTATTATTGATGC (SEQ ID NO: 38) CF 07-59 (-) Fin de gen mvaE 51 -ATGTTATTGTTTTCTTAAATCATTTAAAATAGC (SEQ ID NO: 39) CF 07-82 (+) Inicio de gen mvaS 5 ' -ATGACAATTGGGATTGATAAAATTAG (SEQ ID NO: 40) CF 07-83 (-) Fin de gen mvaS 5 ' - TAGTTTCGATAAGAACGAACGGT (SEQ ID NO : 41) CF 07-86 (+) Secuencia en mvaE 5 ' -GAAATAGCCCCATTAGAAGTATC (SEQ ID NO : 42 ) CF 07-87 (+) Secuencia en mvaE 51 -TTGCCAATCATATGATTGAAAATC (SEQ ID NO: 43) CF 07-88 (+ ) Secuencia en mvaE 51 -GCTATGCTTCATTAGATCCTTATCG (SEQ ID NO : 44 ) CF 07-89 (+) Secuencia en mvaS 51 -GAAACCTACATCCAATCTTTTGCCC (SEQ ID NO: 45) El plásmido llamado pTrcHis2AUpperPathway#l fue corregido por secuenciación y fue transformado a la cepa de E. coli BL21 comercialmente disponible. La selección se hizo sobre LA+ 50 µg/ml de carbenicilina. Dos transformantes se escogieron y se hicieron crecer en LB+ 50 yg/ml de carbenicilina hasta que alcanzaron una OD600 de 1.5. Ambas cepas se congelaron en un tubo a -80° C en presencia de glicerol. Las cepas fueron designadas CF 449 para pTrcHis2AUpperPathway#l en BL21, aislado #1 y CF 450 para pTrcHis2AUpperPathway#l en BL21, aislado #2. Se encontró que ambos clones se comportaron de manera idéntica cuando se analizaron.
V. Clonación de la vía de UpperMVA en pCL 1920 El plásmido pTrcHis2AUpperPathway fue digerido con la endonucleasa de restricción SspI para liberar un fragmento que contenía pTrc-mvaE-mvaS- (His-tag) -terminador . En este fragmento, la his-tag no fue traducida. Este extremo de extremo romo de 4.5 kbp fue purificado a partir de un E-gel al 1.2% mediante el uso del Qiagen Gel Purificación kit. Un fragmento de extremo romo desfosforilado de 4.2 kbp de pCL1920 se preparó al digerir el vector con la endonucleasa de restricción PvwII, al tratar con SAP y purificar en gel a, partir de un E-gel al 1.2% mediante el uso del Qiagen Gel Purificación kit. Los dos fragmentos fueron ligados mediante el uso del Roche Quick Ligation Kit y transformado a células químicamente competentes con TOP10. Se seleccionaron transformantes en LA que contenía espectinomicina (50 yg/ml) . Una colonia correcta fue identificada al determinar selectivamente la presencia del inserto por PCR. El plásmido fue designado pCL PtrcUpperPathway (figuras 26 y 27A-27D) .
VI. Cepas que expresan las vías de ácido mevalónico superor e inferior combinadas Para obtener una cepa con una vía de ácido mevalónico completa más isopreno sintasa de kudzu, los plásmidos pTrcKKDylklSkan y pCLpTrcUpperPathway fueron ambos transformados a células competentes BL21(XDE3) (Invitrogen) y los transformantes fueron seleccionados en LA que contenía kanamicina (50 yg/ml) y espectinomicina (50 yg/ml) . Los transformantes fueron verificados por preparación de plásmido para asegurarse que ambos plásmidos fueran retenidos en el hospedero. La cepa fue designada MCM 127.
VII. Producción de ácido mevalónico a partir de glucosa en E. coli/pUpperpathway Colonias individuales de BL21/pTrcHis2A-mvaE/mvaS o FM5/p pTrcHis2A-mvaE/mvaS se inoculan en LB + carbenicilina (100 pg/ml) y se hacen crecer durante la noche a 37°C con agitación a 200 rpm. Estos cultivos se diluyeron en un medio de 50 mi en 250 mi de matraces con división para una ODe0o de 0.1. El medio fue TM3 + 1 ó 2% de glucosa + carbenicilina (100 ug/ml) o TM3 + 1% de glucosa + aceite de soya hidrolizado + carbenicilina (100 ug/ml) o TM3 + biomasa (bagazo, rastrojo de maíz o pasto aguja preparado) . Los cultivos se hicieron crecer a 30°C con agitación a 200 rpm durante aproximadamente 2-3 horas hasta que se alcanzó una OD6oo de 0.4. En este punto la expresión de los constructor mvaE mvaS fue inducido por la adición de IPTG (400 µ?) . Los cultivos fueron incubados durante 20 ó 40 horas adicionales con muestras tomadas a intervalos de 2 horas a 6 horas después de la inducción y después a 24, 36 y 48 horas según sea necesario. El muestreo se hizo al remover 1 mi de cultivo, al medir la OD600 , al comprimir las células en una microcentrífuga, al remover el sobrenadante y analizarlo para ácido mevalónico.
Una fermentación de 14 litros de células de E. coli con ácidos nucleicos que codifican péptidos AA-CoA tiolasa, HMG-CoA sintasa y HMG-CoA reductasa de Enterococcus faecalis produjeron 22 gramos de ácido mevalónico con medio TM3 y 2% de glucosa como el medio de las células . Un matraz de agitación de estas células produjo 2-4 gramos de ácido mevalónico por litro con medio LB y 1% de glucosa como el medio de cultivo de células. La producción de ácido mevalónico en estas cepas indicó que la vía de MVA fue funcional en E. coli.
VIII. Producción de isopreno de E. coli BL21 que contenía la vía de MVA superior e inferior más isopreno sintasa de kudzu Las siguientes cepas se crearon al transformar en varias combinaciones de plásmidos que contenían la vía de MVA superior e inferior y el gen de isopreno sintasa de kudzu como se describió antes y los plásmidos que contenían los genes de idi, dxs, y dxr e isopreno sintasa descritos en el ejemplo 7. Las células hospederas usadas fueron BL21(XDE3) químicamente competentes y las transformaciones se hicieron por los métodos estándares. Se seleccionaron transformantes en L agar que contenía kanamicina (50 µg/ml) o kanamicina más espectinomicina (ambas a una concentración de 50 g/ml) . Las placas se hicieron crecer a 37°C. Las cepas resultantes ¦ fueron designadas como sigue: Aquellas que crecieron en Kanamicina más espectinomicina (50 µg/ml cada una) MCM127 - pCL MVA superior + pTrcKKDyIkIS (kan) en BL21 (ADE3 ) MCM131 - pCL1920 + pTrcKKDyIkIS (kan) en BL21 (ADE3 ) MCM125 - pCL MVA superior + pTrcHis2B (kan) en BL21(XDE3) Aquellas que crecieron en Kanamicina (50 µ9/p?1) MCM64 - pTrcKudzu yIDI DXS (kan) en BL21(XDE3) MCM50 - pTrcKudzu (kan) en BL21 (ADE3) MCM123 - pTrcKudzu yIDI DXS DXR (kan) en BL21(XDE3) Las cepas anteriores se sembraron por veteado de abastecimientos de congelador a LA + antibiótico apropiado y se hicieron crecer durante la noche a 37 °C. Una colonia individual de cada placa se usó para inocular matraces de agitación (25 mi LB + al antibiótico apropiado) . Los matraces se incubaron a 22 °C durante la noche con agitación a 200 rpm. A la mañana siguiente los matraces fueron transferidos a una incubadora a 37°C y se hicieron crecer durante 4.5 horas adicionales con agitación a 200 rpm. Los cultivos de 25 mi se centrifugaron para comprimir las células y las células fueron resuspendidas en 5 mi de LB + el antibiótico apropiado. Los cultivos se diluyeron después en 25 mi de LB+ 1% de glucosa + el antibiótico apropiado a una OD60o de 0.1. Dos matraces para cada cepa se prepararon, una serie para inducción con IPTG (800 µ?) la segunda serie no fue inducida. Los cultivos se incubaron a 37 °C con agitación a 250 rpm. Una serie de los cultivos fue inducida después de 1.50 horas (inmediatamente después del punto 1 del tiempo de muestreo) . En cada punto del tiempo de muestreo, la OD60o se midió y la cantidad de isopreno se determinó como se describe en el ejemplo 1. Los resultados se presentan en la Tabla 3. La cantidad de isopreno hecho se presenta como la cantidad a la producción pico para la cepa particular. t Tabla 3 Producción de isopreno en cepas de E. Coli ND : no detectado Traza: pico presente pero no integrable IX. Análisis de ácido mevalónico Mevalonolactona (1.0 g, 7.7 mmoles) (CAS# 503-48-0) fue suministrada por Sigma-Aldrich (WI, E.U.A.) como un jarabe que se disolvió en agua (7.7 mL) y se trató con hidróxido de potasio (7.7 mmol) a fin de generar la sal de potasio de ácido mevalónico. La conversión a ácido mevalónico fue confirmada por análisis de NMR. Muestras para análisis de HPLC se prepararon por centrifugación a 14,000 rpm durante 5 minutos para remover las células, seguido por la adición de una alícuota de 300 µ? de sobrenadante a 900 µ? de H20. Acido perclórtico (36 µ? de una solución al 70%) se añadió después seguido por mezclado y enfriamiento sobre hielo durante 5 minutos. Las muestras después se centrifugaron nuevamente (14,000 rpm durante 5 min) y el sobrenadante se transfirieron a HPLC. Estándares de ácido mevalónico (20, 10, 5, 1 y 0.5 g/L) se prepararon de la misma manera. El análisis de ácido mevalónico (volumen de inyección de 20 uL) se llevó a cabo por HPLC mediante el uso de una columna BioRad Aminex 87-H+ (300 mm por 7.0 mra) eluido con 5 mM de ácido sulfúrico a 0.6 niL/min¦ con detección de índice de refracción (IR) . Bajo estas condiciones, ácido mevalónico eluido como la lactona se forma en 18.5 minutos.
X. Producción de isopreno de E. coli BL21 que contenía la vía de MVA superior más isopreno sintasá de kudzu Una fermentación a escala de 15 L de E. coli que expresa polipéptidos de la vía de ácido mevalónico e isopreno sintasa de Kudzu se usó para producir isopreno de células en cultivo intermitente con alimentación. Este experimento demuestra que el crecimiento de células bajo condiciones limitantes de glucosa dio por resultado la producción de 2.2 g/L de isopreno.
Receta del medio (por litro medio de fermentación) : El medio fue generado mediante el uso de los siguientes componentes por litro de medio de fermentación: K2HP04 7.5 g, MgS04 * 7H20 2 g, ácido cítrico monohidratado 2 g, citrato de amonio férrico 0.3 g, extracto de levadura 0.5 g, y solución de metal traza modificado 1000X 1 mi. Todos los componentes se añadieron juntos y se disolvieron en diH20. Esta solución se sometió a autoclave. El pH se ajustó a 7.0 con hidróxido de amonio (30%) y c.b.p. volumen. Glucosa 10 g, tiamina * HCl 0.1 g, y antibióticos se añadieron después de la esterilización y ajuste de pH.
Solución de metal traza modificado 1000X: La solución de metal traza modificado 1000X fue generada mediante el uso de los siguientes componentes: ácido cítricos * H20 40 g, MnS04 * H20 30 g, NaCl 10 g, FeS04 * 7H20 1 g, CoCl2 * 6H20 1 g, ZnSO * 7H20 1 g, CuS04 * 5H20 100 mg, H3BO3 100 mg, y NaMo04 * 2H20 100 mg. Cada componente se disolvió uno a la vez en diH20, pH a 3.0 con HCl/NaOH, después c.b.p. volumen, y se esterilizó mediante filtro con un filtro de 0.22 mieras.
La fermentación se llevó a cabo en un biorreactor de 15 L con células de E. coli BL21 (DE3) que contenían los plásmidos pCL PtrcUpperPathway (figura 26) y pTrcKKDylklS . Este experimento se llevó a cabo para monitorear la formación de isopreno a partir de glucosa a la fermentación deseada pH 7.0 y temperatura 30°C. Un inoculo de cepa de E. coli tomada de un tubo congelado se sembró por veteado en una placa de agar con caldo LB (con antibióticos) y se incubó a 37°C. Una colonia individual fue inoculada en un medio de soytone-extracto de levadura -glucosa . Después de que el inoculo creció a OD 1.0 cuando se midió a 550 nm, 500 mL se usó para inocular un biorreactor de 5 L.
La glucosa fue alimentada a una velocidad exponencial hasta que las células alcanzaron la fase estacionaria. Después de este tiempo, la alimentación de glucosa se disminuyó para satisfacer las demandas metabólicas. La cantidad total de glucosa suministrada al biorreactor durante la fermentación de 54 horas fue 3.7 kg . La inducción se logró al añadir isopropil -beta-D- 1 -tiogalacto iranosido (IPTG) . La concentración de IPTG se llevó a 25 uM cuando la densidad óptica a 550 nm (OD550) alcanzó un valor de 10. La concentración de IPTG se elevó a 50 uM cuando la OD550 alcanzó 190. La concentración de IPTG se elevó a 100 uM a 38 horas de fermentación. El perfil de OD550 dentro del biorreactor con el tiempo se muestra en la figura 54. El nivel de isopreno en el gas desprendido a partir del biorreactor se determinó se describe aquí. El título de isopreno se incrementó durante el curso de la fermentación a un valor final de 2.2 g/L (figura 55) . La cantidad total de isopreno producido durante la fermentación de 54 horas fue 15.9 g, y el curso de tiempo de producción se muestra en la figura 56.
XL Fermentación de isopreno de E. colí que expresa genes a partir de la vía de ácido mevalónico y que crece en cultivo intermitente con alimentación a la escala de 15 L Una fermentación a escala de 15 L de E. coli que expresa polipéptidos de la vía de ácido mevalónico e isopreno sintasa de Kudzu se usó para producir isopreno de células en cultivo intermitente con alimentación. Este experimento demuestra que el crecimiento de células bajo condiciones limitantes de glucosa dio por resultado la producción de 3.0 g/L de isopreno.
Receta del medio (por litro medio de fermentación) : El medio fue generado mediante el uso de los siguientes componentes por litro de medio de fermentación: K2HP04 7.5 g, MgS04 * 7H20 2 g, ácido cítrico monohidratado 2 g, citrato de amonio férrico 0.3 g, extracto de levadura 0.5 g, y solución de metal traza modificado 1000X 1 mi. Todos los componentes se añadieron juntos y se disolvieron en diH20.
Esta solución se sometió a autoclave. El pH se ajustó a 7.0 con hidróxido de amonio (30%) y c.b.p. volumen. Glucosa 10 g, tiamina * HCl 0.1 g, y antibióticos se añadieron después de la esterilización y ajuste de pH.
Solución de metal traza modificado 1000X: La solución de metal traza modificado 1000X fue generada mediante el uso de los siguientes componentes: ácido cítricos * H20 40 g, MnS04 * H20 30 g, NaCl 10 g, FeS04 * 7H20 1 g, CoCl2 * 6H20 1 g, ZnSO * 7H20 1 g, CuS04 * 5H20 100 mg, H3BO3 100 mg, y NaMo04 * 2H20 100 mg. Cada componente se disolvió uno a la vez en diH20, pH a 3.0 con HCl/NaOH, después c.b.p. volumen, y se esterilizó mediante filtro con un filtro de 0.22 mieras.
La fermentación se llevó a cabo en un biorreactor de 15 L con células de E. coli BL21 (DE3) que contenían los plásmidos pCL PtrcUpperMVA y pTrc KKDylklS. Este experimento se llevó a cabo para monitorear la formación de isopreno a partir de glucosa a la fermentación deseada pH 7.0 y temperatura 30°C. Un inoculo de cepa de E. coli tomada de un tubo congelado se sembró por veteado en una placa de agar con caldo LB (con antibióticos) y se incubó a 37°C. Una colonia individual fue inoculada en un medio de triptona-extracto de levadura. Después de que el inoculo creció a OD 1.0, medida a 550 nm, 500 mL se usó para inocular un biorreactor de 5 L .
La glucosa fue alimentada a una velocidad exponencial hasta que las células alcanzaron la fase estacionaria. Después de este tiempo, la alimentación de glucosa se disminuyó para satisfacer las demandas metabólicas. La cantidad total de glucosa suministrada al biorreactor durante la fermentación de 59 horas fue 2.2 kg. La inducción se logró al añadir IPTG. La concentración de IPTG se llevó a 25 u cuando la densidad óptica a 550 nm (OD550) alcanzó un valor de 10. La concentración de IPTG se elevó a 50 uM cuando la OD550 alcanzó 190. La concentración de IPTG se elevó a 50 uM cuando OD550 alcanzó 190. El perfil de OD550 dentro del biorreactor con el tiempo se muestra en la figura 93. El nivel de isopreno en el gas desprendido del biorreactor se determinó como se describe aquí. El título de isopreno se incrementó durante el curso de la fermentación a un valor final de 3.0 g/L (figura 94) . La cantidad total de isopreno producido durante la fermentación de 59 horas fue 22.8 g, y el curso de tiempo de producción se muestra en la figura 95. El rendimiento molar de carbono utilizado que contribuyó a la producción de isopreno durante fermentación fue 2.2%. El por ciento en peso de rendimiento de isopreno a partir de glucosa fue 1.0%.
XII. Fermentación de isopreno de E. coli que expresa genes a partir de la vía de ácido mevalónico y que crece en cultivo intermitente con alimentación a la escala de 15 L Una fermentación a escala de 15 L de E. coli que expresa polipéptidos de la vía de ácido mevalónico, isopreno sintasa de Pueraria lobata, e isopreno sintasa de Kudzu se usó para producir isopreno de células en cultivo intermitente con alimentación. Este experimento demuestra que el crecimiento de células bajo condiciones limitantes de glucosa dio por resultado la producción de 3.3 g/L de isopreno. i) Construcción de pCLPtrcUpperPathwayHGS2 El gen que codifica isopreno sintasa de Pueraria lobata fue amplificado por PCR mediante el uso de cebadores Nsil-RBS-HGS F (CTTGATGCATCCTGCATTCGCCCTTAGGAGG, SEQ ID NO: 88) y pTrcR (CCAGGCAAATTCTGTTTTATCAG, SEQ ID NO: 89), y pTrc KKDyIkIS como una plantilla. El producto de PCR así obtained fue digerido por restricción con Nsil y PstI y purificado en gel . El plásmido pCL PtrcUpperPathway fue digerido por restricción con PstI y desfosforilado mediante el uso de fosfatasa alcalina de rAPid (Roche) de conformidad con las instrucciones del fabricante.
Estos fragmentos de ADN fueron ligados juntos y la reacción de ligación fue transformada a células químicamente competentes con ToplO de E. coli (Invitrogen) , colocada en agar L que contenía espectinomicina (50 ug/ml) e incubada durante la noche a 37°C. El ADN del plásmido se preparó a partir de 6 clones mediante el uso del Qiaquick Spin Mini-prep kit. El ADN del plásmido fue digerido con enzimas de restricción EcoRV y MIuI para identificar un clon en el cual el inserto tenía la orientación correcta (es decir, el gen orientado en la misma dirección que el promotor Trc) .
El plásmido correcto resultante fue designado pCLPtrcUpperPathwayHGS2. Este plásmido se probó mediante el uso de la prueba de espacio superior aquí descrita y se encontró que producía isopreno en ToplO de E. coli, lo que valida la funcionalidad del gen. El plásmido fue transformado a BL21 (LDE3) que contenía pTrcKKDylklS para dar la cepa BL21/pCLPtrcUpperPathwayHGS2-pTrcKKDyIkIS. Esta cepa tenía una copia adicional de la isopreno sintasa en comparación con la cepa BL2l/pCL PtrcUpperMVA y pTrc KKDylklS (ejemplo 8, parte XI) . Esta cepa también tenía expresión y actividad incrementadas de HMGS en comparación con la cepa BL21/pCL PtrcUpperMVA y pTrc KKDylklS usada en el ejemplo 8, parte XL. ii) Fermentación de isopreno de E. coli que expresa pCLPtrcUpperPathwayHGS2-pTrc KKDylklS y que crece en cultivo intermitente con alimentación a la escala de 15 L Receta del medio (por litro medio de fermentación) : El medio fue generado mediante el uso de los siguientes componentes por litro medio de fermentación: K2HP04 7.5 g, MgS04 * 7H20 2 g, ácido cítrico monohidratado 2 g, citrato de amonio férrico 0.3 g, extracto de levadura 0.5 g, y y solución de metal traza modificado 1000X 1 mi. Todos los componentes se añadieron juntos y se disolvieron en diH20. Esta solución se sometió a autoclave. El pH se ajustó a 7.0 con hidróxido de amonio (30%) y c.b.p. volumen. Glucosa 10 g, tiamina * HC1 0.1 g, y antibióticos se añadieron después de la esterilización y ajuste de pH.
Solución de metal traza modificado 1000X: La solución de metal traza modificado 1000X fue generada mediante el uso de los siguientes componentes: ácido cítricos. * H20 40 g, MnS04 * H20 30 g, NaCl 10 g, FeS04 * 7H20 1 g, CoCl2 * 6H20 1 g, ZnSO * 7H20 1 g, CuS04 * 5H20 100 mg, H3BO3 100 mg, y NaMo04 * 2H20 100 mg. Cada componente se disolvió uno a la vez en Di H20, pH a 3.0 con HCl/NaOH, después c.b.p. volumen y se esterilizó mediante filtro con filtro de 0.22 mieras.
La fermentación se llevó a cabo en un biorreactor de 15 L con células de E. coli BL21 (DE3) que contenían los plásmidos pCLPtrcUpperPathwayHGS2 y pTrc KKDyIkIS. Este experimento se llevó a cabo para monitorear la formación de isopreno a partir de glucosa a la fermentación deseada pH 7.0 y temperatura 30°C. Un inoculo de cepa de E. coli tomada de un tubo congelado se sembró por veteado en una placa de agar con caldo LB (con antibióticos) y se incubó a 37°C. Una colonia individual fue inoculada en un medio de triptona-extracto de levadura. Después de que el inoculo creció a OD 1.0, medida a 550 nm, 500 mL se usó para inocular un biorreactor de 5 L.
La glucosa fue alimentada a una velocidad exponencial hasta que las células alcanzaron la fase estacionaria. Después de este tiempo, la alimentación de glucosa se disminuyó para satisfacer las demandas metabólicas. La cantidad total de glucosa suministrada al biorreactor durante la fermentación de 58 horas fue 2.1 kg . La inducción se logró al añadir IPTG. La concentración de IPTG se llevó a 25 uM cuando la densidad óptica a 550 nm (OD550) alcanzó un valor de 9. La concentración de IPTG se elevó a 50 uM cuando la OD550 alcanzó 170. El perfil de OD550 dentro del biorreactor con el tiempo se muestra en la figura 104. El nivel de isopreno en el gas desprendido a partir del biorreactor se determinó como se describe aquí. El título de isopreno se incrementó durante el curso de la fermentación a un valor final de 3.3 g/L (figura 105) . La cantidad total de isopreno producido durante la fermentación de 58 horas fue 24.5 g y el curso de tiempo de producción se muestra en la figura 106. El rendimiento molar de carbono utilizado que contribuyó a la producción de isopreno durante fermentación fue 2.5%. El por ciento en peso de rendimiento de isopreno a partir de glucosa fue 1.2%. El análisis mostró que la actividad de la isopreno sintasa fue incrementada por aproximadamente 3-4 veces aquella comparada con BL21 que expresa plásmidos CL PtrcUpperMVA y pTrc KKDyIkIS (no se muestran datos) .
XIII. Ilntegración cromosómica de la vía de mevalonato inferior en E. coli.
Un operón sintético que contenía mevalonato cinasa, mevalonato fosfato cinasa, mevalonato pirofosfato descarboxilasa, y la IPP isomerasa fue integrado al cromosoma de E. coli. Si se desea, la expresión puede ser alterada al integrar diferentes promotores 5' del operón.
La tabla 9 lista cebadores usados para este experimento .
Tabla 9 Cebadores MCM78 attTn7 en dirección 5' gcatgctcgagcggccgcTTTTAATCAAACATCCTGC en reversa para CAACTC (SEO ID NO: 91) constructo de integración MCM79 attTn7 en dirección 3' gatcgaagggcgatcgTGTCACAGTCTGGCGAAACC en reversa para (SEO ID NO: 92) constructo de integración MCM88 attTn7 en dirección 5' ctgaattctgcagatatcTGTTTTTCCACTCTTCGTTCA hacia adelante para CTTT (SEO ID NO: 93) constructo de integración MCM89 attTn7 en dirección 3' tctagagggcccAAGAAAAATGCCCCGCTTACG hacia adelante para (SEO ID NO: 94) constructo de integración MCM104 promotor Gil.2 - MVK Gatcgcggccgcgcccttgacgatgccacatcctgagcaaataat tcaaccactaat gtgagcggataacacaaggagg9aaacagctat qtcattaccgttcttaacttc (SEQ ID NO: 95) CM105 terminador aspA - ylDI Gatcgggccccaagaaaaaaggcacgtcatctgacgtgcctttttt atttgtagacgcgttgttatagcattcta (SEO ID NO: 96) MCM120 Hacia adelante de aaagtagccgaagatgacggtttgtcacatggagttggcaggatgt attTn7 : homología de ttgattaaaagcAATTAACCCTCACTAAAGGGCGG attTn7, homología de (SEO ID NO: 97) de marcador GB MCM127 En reversa complemento AGAGTGTTCACCAAAAATAATAACCTTTCCCG de 1.2 GI : homología GTGCAgaagttaagaacggtaatgacatagctgtttcctccttgt de marcador GB (extra gttatccgctcacaattagtggttgaattatttgctcaggatgtggcatc largo) , promotor, RBS, gtcaagggcTAATACGACTCACTATAGGGCTCG ATG (SEO ID NO: 98) i) Construcción de vector objetivo El sitio attTn7 fue seleccionado para integración. Las regiones de homología en dirección 5' (attTn7 ascendente) (cebadores MCM78 y MCM79) y en dirección 3' (attTn7 descendente) (cebadores MCM88 y MCM89) fueron amplificados por PCR de células MG1655. Una reacción de 50 uL con 1 uL de cebadores lOuM, 3 uL de ddH20, 45 uL de Invitrogen Platinum PCR Supermix High Fidelity, y una colonia raspada de G1655 fue desnaturalizada por 2:00 a 94°C, ciclada 25 veces (2:00 a 94°C, 0:30 a 50°C, y 1:00 a 68°C) , extendida por 7:00 a 72°C, y enfriada a 4°C. Este ADN resultante se clonó en pCR2.1 (Invitrogen) de conformidad con las instrucciones del fabricante, lo que dio por resultado plásmidos MCM278 (attTn7 ascencente) y MCM252 (attTn7 descendente) . El fragmento Apal-Pvul de 832 pb digerido y purificado en gel de MCM252 se clonó en Apal-Pvul digerido y purificado en plásmido pR6K en gel, lo que creó el plásmido MCM276. El fragmento PstI-Notl de 825 pb digerido y purificado en gel de MC 278 se clonó en PstI-Notl digerido y purificado en gel MCM276, lo que creó el plásmido MCM281. ii) Clonación de la vía inferior y promotor Los genes MVK-PMK-MVD-IDI fueron amplificados de pTrcKKDylklS con los cebadores MCM 104 y MCM 105 mediante el uso de Roche Expand Long PCR System de conformidad con las instrucciones del fabricante. Este producto fue digerido con Notl y Apal y clonado en MCM281 que había sido digerido con iVotl y Apal y purificado en gel . Los cebadores MCM 120 y MCM127 se usaron para amplificar el cásete de CMR a partir del ADN de plantilla de GeneBridges FRT-gb2 -Cm-FRT mediante el uso de Stratagene Pfu Ultra II. Un programa de PCR de desnaturalización a 95°C por 4:00, 5 ciclos de 95°C por 0:20, 55°C por 0:20, 72°C por 2:00, 25 ciclos de 95°C por 0:20, 58°C por 0:20, 72°C por 2:00, 72°C por 10:00, y después enfriamiento a 4°C se usó con cuatro reacciones de PCR de 50 uL que contenían 1 uL~10 ng/uL de plantilla, 1 uL cada cebador, 1.25 uL de d TPs 10 mM, 5uL de regulador de pH lOx, 1 uL de enzima, y 39.75 uL de ddH20. Las reacciones se pusieron en acervo, se purificaron en una columna de limpieza por PCR Qiagen, y se usaron para electroporar células Pirl lavadas con agua que contenían plásmido MCM296. La electroporación se llevó a cabo en tuvos de 2 mM a 2.5 V y 200 ohms. Las reacciones de electroporación fueron recuperadas en LB durante 3 hr a 30°C. El transformante MCM330 se seleccionó en LA con CMP5, Kan50 (figuras 107 y 108A-108C) . iii) Integración en cromosomas de E. coli ADN minipreparado (Qiaquick Spin kit) de MCM330 fue digerido con SnaBI y usado para electroporar BL21(DE3) (Novagen) o MG 1655 que contenía plásmido pRedET Carb de GeneBridges . Las células se hicieron crecer a 30°C a -0D1 después fueron inducidas con 0.4% L-arabinosa a 37°C durante 1.5 horas. Estas células se lavaron tres veces en 4°C ddH20 antes de la electropbración con 2 uL de ADN. Los integrantes fueron seleccionados en agar L que contenía cloranfenicol (5 ug/ml) y subsecuentemente se confirmó que no crecía en agar L + Kanamicina (50 ug/ml) . El integrante de BL21 MCM331 y el integrante de MG 1655 MCM333 se congelaron. iv) Construcción de pET24D-Kudzu que codifica isopreno sintasa de Kudzu El gen de isopreno sintasa de kudzu fue subclonado en el vector pET24d (Novagen) a partir del vector pCR2.1 (Invitrogen) . En particúlar, el gen de isopreno sintasa de kudzu fue amplificado a partir del ADN de plantilla de pTrcKudzu mediante el uso de cebadores MCM50 5 ' -GATCATGCAT TCGCCCTTAG GAGGTAAAAA AACATGTGTG CGACCTCTTC TCAATTTACT (SEQ ID NO: 99) y MCM53 51 -CGGTCGACGG ATCCCTGCAG TTAGACATAC ATCAGCTG (SEQ ID NO: 100) . Las reacciones de PCR se llevaron a cabo mediante el uso de Taq DNA Polymerase (ADN polimerasa Taq) (Invitrogen) , y el producto de PCR resultante se clonó en vector de clonación pCR2.1-TOPO TA (Invitrogen), y se transformó a células químicamente competentes con ToplO de E. coli (Invitrogen) . Los transformantes se colocaron en agar L que contenía carbenicilina (50 µ9/p?1) y se incubaron durante la noche a 37 °C. Cinco mi de cultivos en caldo de Luria que contenían carbenicilina 50 g/ml fueron inoculados con transformantes individuales y que crecieron ' durante la noche a 37 °C. Cinco colonias se determinaron selectivamente para el inserto correcto por secuenciación de ADN del plásmido aislado de 1 mi de cultivo líquido (caldo de Luria) y purificado mediante el uso del QIAprep Spin Mini-prep Kit (Qiagen) . El plásmido resultante, designado MCM93, contenía la secuencia codificante de isopreno sintasa de kudzu en un esqueleto de pCR2.1.
La secuencia codificante de kudzu fue removida por digestión por enzima de restricción con Pcil y SamHl (Roche) y purificada en gel mediante el uso del QIAquick Gel Extracción kit (Qiagen) . El ADN de vector pET24d fue digerido con Ncol y BamHI (Roche) , tratado con fosfatasa alcalina de camarón (Roche) , y purificado mediante el uso del QIAprep Spin Mini-prep Kit (Qiagen) . El fragmento de isopreno sintasa de kudzu fue ligado al pET24d digerido por Ncol/BamHI mediante el uso del Rapid ADN Ligation Kit (Roche) en una relación de fragmento de a vector de 5:1 en un volumen total de 20 µ? . Una porción de la mezcla de ligación (5 µ?) fue transformada a células químicamente competentes con ToplO de E. coli y colocadas en agar L que contenía kanamicina (50 g/ml) . El transformante correcto fue confirmado por secuenciación y transformado a células BL21 (ADE3 ) LysS químicamente competentes (Novagen) . Una colonia individual fue seleccionada después de crecimiento durante la noche a 37°C en agar L que contenía kanamicina (50 g/ml) . Un mapa del plásmido resultante designado como pET24D-Kudzu se muestra en la figura 109. La secuencia de pET24D-Kudzu (SEQ ID NO: 101) se muestra en las figuras 110A y 110B. La actividad de isopreno sintasa fue confirmada mediante el uso de una prueba de espacio superior. v) Cepas de producción Las cepas MCM331 y MCM333 fueron cotransformadas con plásmidos pCLPtrcupperpathway y ya sea pTrcKudzu o pETKudzu, lo que dio por resultado las cepas mostradas en la tabla 10.
Tabla 10 Cepas de producción vi) Fermentación de isopreno de E. coli que expresa genes de la vía de ácido mevalónico y que crece en cultivo intermitente con alimentación a la escala de 15 -L Receta del medio (por litro medio de fermentación) : El medio fue generado mediante el uso de los siguientes componentes por litro de medio de fermentación: K2HP04 7.5 g, MgS04 * 7H20 2 g, ácido cítrico monohidratado 2 g, citrato de amonio férrico 0.3 g, extracto de levadura 0.5 g, y solución de metal traza modificado 1000X 1 mi. Todos los componentes se añadieron juntos y se disolvieron en diH20. Esta solución se sometió a autoclave. El pH se ajustó a 7.0 con hidróxido de amonio (30%) y c.b.p. volumen. Glucosa 10 g, tiamina * HCl 0.1 g, y antibióticos se añadieron después de la esterilización y ajuste de pH.
Solución de metal traza modificado 1000X: La solución de metal traza modificado 1000X fue generada mediante el uso de los siguientes componentes: ácido cítricos * H20 40 g, MnS04 * H20 30 g, NaCl 10 g, FeS04 * 7H20 1 g, CoCl2 * 6H20 1 g, ZnSO * 7H20 1 g, CuS04 * 5H20 100 mg, H3BO3 100 mg, y NaMo04 * 2H20 100 mg. Cada componente se disolvió uno a la vez en diH20, pH a 3.0 con HCl/NaOH, después c.b.p. volumen, y se esterilizó mediante filtro con un filtro de 0.22 mieras.
La fermentación se llevó a cabo en un biorreactor de 15 L con células de E. coli BL21 (DE3) que contenían la vía de MVA inferior integrada a gil.2 descrita anteriormente y los plásmidos pCL PtrcUpperMVA y pTrcKudzu. Este experimento se llevó a cabo para monitorear la formación de isopreno a partir de glucosa a la fermentación deseada pH 7.0 y temperatura 30°C. Un inoculo de cepa de E. coli tomada de un tubo congelado se sembró por veteado en una placa de agar con caldo LB (con antibióticos) y se incubó a 37°C. Una colonia individual fue inoculada en un medio de triptona-extracto de levadura. Después de que el inoculo creció a OD 1.0, medida a 550 niti, 500 mL se usó para inocular un biorreactor de 5 L.
La glucosa fue alimentada a una velocidad exponencial hasta que las células alcanzaron la fase estacionaria. Después de este tiempo, la alimentación de glucosa se disminuyó para satisfacer las demandas metabólicas. La cantidad total de glucosa suministrada al biorreactor durante la fermentación de 57 horas fue 3.9 kg. La inducción se logró al añadir IPTG. La concentración de IPTG se llevó a 100 uM cuando la velocidad de evolución de dióxido de carbono alcanzó 100 mmol/L/hr. El perfil de OD55o dentro del biorreactor con el tiempo se muestra en la figura 111A. El nivel de isopreno en el gas desprendido del biorreactor se determinó como se describe aquí. El título de isopreno se incrementó durante el curso de la fermentación a un valor final de 1.6 g/L (figura 111B) . La productividad específica de isopreno durante el curso de la fermentación se muestra en la figura 111C y alcanzó un pico a 1.2 mg/OD/hr. La cantidad total de isopreno producido durante la fermentación de 57 horas fue 16.2 g. El rendimiento molar de carbono utilizado que contribuyó a la producción de isopreno durante fermentación fue 0.9%. El por ciento en peso de rendimiento de isopreno a partir de glucosa fue 0.4%.
XIV. Producción de isopreno de E. coli BL21 que contenía la isopreno sintasa de kudzu mediante el uso de glicerol como una fuente de carbono Una fermentación a escala de 15 L de E. coli que expresa isopreno sintasa de Kudzu se usó para producir isopreno a partir de células alimentadas con glicerol en cultivo intermitente con alimentación. Este experimento demuestra que el crecimiento de células en presencia de glicerol (sin glucosa) dio por resultado la producción de 2.2 mg/L de isopreno.
Receta del medio (por litro medio de fermentación) : El medio fue generado mediante el uso de los siguientes componentes por litro de medio de fermentación: K2HP04 7.5 g, MgS0 * 7H20 2 g, ácido cítrico monohidratado 2 g, citrato de amonio férrico 0.3 g, y solución de metal traza modificado 1000X 1 mi. Todos los componentes se añadieron juntos y se disolvieron en diH20. Esta solución se sometió a autoclave. El pH se ajustó a 7.0 con hidróxido de amonio (30%) y c.b.p. volumen. Glicerol 5.1 g, tiamina * HC1 0.1 g, y antibióticos se añadieron después de la esterilización y ajuste de pH.
Solución de metal traza modificado 1000X: El medio fue generado mediante el uso de los following componentes por litro medio de fermentación: ácido cítricos * H20 40 g, MnS04 * H20 30 g, NaCl 10 g, FeS04 * 7H20 1 g, CoCl2 * 6H20 1 g, ZnSO * 7H20 1 g, CuS04 * 5H20 100 mg, H3BO3 100 mg, y NaMo0 * 2H20 100 mg. Cada componente se disolvió uno a la vez en diH20, pH a 3.0 con HCl/NaOH, después c.b.p. volumen y se esterilizó mediante filtro con un filtro de 0.22 mieras.
La fermentación se llevó a cabo en un biorreactor de 15 L con células de E. coli BL21 (DE3) que contenían el plásmido pTrcKudzu. Este experimento se llevó a cabo para monitorear la formación de isopreno a partir de glicerol a la fermentación deseada pH 7.0 y temperatura 35 °C. Un inoculo de cepa de E. coli tomada de un tubo congelado se sembró por veteado en una placa de agar con caldo LB (con antibióticos) y se incubó a 37 °C. Una colonia individual fue inoculada en un medio de soytone-extracto de levadura-glucosa y se hizo crecer a 35 °C. Después de que el inoculo creció a OD 1.0, medida a 550 nm, 600 mL se usó para inocular un biorreactor de 7.5 L.
El glicerol fue alimentado a una velocidad exponencial hasta que las células alcanzaron una densidad óptica a 550 nm (OD550) de 153. La cantidad total de glicerol suministrado al biorreactor durante la fermentación de 36 hora fue 1.7 kg. Otro distinto de la glucosa en el inoculo, no se añadió glucosa al biorreactor. La inducción se logró al añadir IPTG. La concentración de IPTG se llevó a 20 uM cuando la OD550 alcanzó un valor de 50. El perfil de OD550 dentro del biorreactor con el tiempo se muestra en la figura 57. El nivel de isopreno en el gas desprendido del biorreactor se determinó como se describe aquí. El título de isopreno se incrementó durante el curso de la fermentación a un valor final de 2.2 mg/L (figura 58). La cantidad total de isopreno producido durante la fermentación de 54 horas fue 20.9 mg, y el curso de tiempo de producción se muestra en la figura 59.
XV. Fermentación de isopreno a partir de E. colí que expresa genes de la vía de ácido mevalónico y que crecen en cultivo intermitente con alimentación a la escala de 15 L mediante el uso de azúcar invertido como una fuente de carbono Una fermentación a escala de 15 L de E. coli que expresa polipéptidos de la vía de ácido mevalónico e isopreno sintasa de Kudzu se usó para producir isopreno a partir de células alimentadas con azúcar invertido en cultivo intermitente con alimentación. Este experimento demuestra que el crecimiento de células en presencia de azúcar invertido dio por resultado la producción de 2.4 g/L de isopreno.
Receta del medio (por litro medio de fermentación) : El medio fue generado mediante el uso de los siguientes componentes por litro de medio de fermentación: K2HP04 7.5 g, MgS0 * 7H20 2 g, ácido cítrico monohidratado 2 g, citrato de amonio férrico 0.3 g, extracto de levadura 0.5 g, y solución de metal traza modificado 1000X 1 mi. Todos los componentes se añadieron juntos y se disolvieron en diH20. Esta solución se sometió a autoclave. El pH se ajustó a 7.0 con hidróxido de amonio (30%) y c.b.p. volumen. Azúcar invertido 10 g, tiamina * HC1 0.1 g, y antibióticos se añadieron después de la esterilización y ajuste de pH.
Solución de metal traza modificado 1000X: La solución de metal traza modificado 1000X fue generada mediante el uso de los siguientes componentes: ácido cítricos * H20 40 g, MnS04 * H20 30 g, NaCl 10 g, FeS04 * 7H20 1 g, C0CI2 * 6H20 1 g, ZnSO * 7H20 1 g, CuS04 * 5H20 100 mg, H3BO3 100 mg, y NaMo04 * 2H20 100 mg. Cada componente se disolvió uno a la vez en Di H20, pH a 3.0 con HCl/NaOH, después c.b.p. volumen y se esterilizó mediante filtro con filtro de 0.22 mieras.
La fermentación se llevó a cabo en un biorreactor de 15 L con células BL21 (DE3) de E. coli que contenían los plásmidos pCL PtrcUpperMVA y pTrc KKDyIkIS. Este experimento se llevó a cabo para monitorear la formación de isopreno a partir de azúcar invertido a la fermentación deseada pH 7.0 y temperatura 30°C. Un inoculo de cepa de E. coli tomada de un tubo congelado se, sembró por veteado en una placa de agar con caldo LB (con antibióticos) y se incubó a 37°C. Una colonia individual fue inoculada en un medio de triptona-extracto de levadura. Después de que el inoculo creció a OD 1.0, medida a 550 nm, 500 mL se usó para inocular un biorreactor de 5 L .
El azúcar invertido fue alimentado a una velocidad exponencial hasta que las células alcanzaron la fase estacionaria. Después de este tiempo, la alimentación de azúcar invertido se disminuyó para satisfacer las demandas metabólicas. La cantidad total de azúcar invertido suministrado al biorreactor durante la fermentación de 44 hora fermentación fue 2.4 kg. La inducción se logró al añadir IPTG. La concentración de IPTG se llevó a 25 uM cuando la densidad óptica a 550 nm (OD550) alcanzó un valor de 9. La concentración de IPTG se elevó a 50 uM cuando la OD55o alcanzó 200. El perfil de OD550 dentro del biorreactor con el tiempo se muestra en la figura 96. El nivel de isopreno en el gas desprendido del biorreactor se determinó como se describe aquí. El título de isopreno se incrementó durante el curso de la fermentación a un valor final de 2.4 g/L (figura 97) . La cantidad total de isopreno producido durante la fermentación de 44 horas fue 18.4 g y el curso de tiempo de producción se muestra en la figura 98. El rendimiento molar de carbono utilizado que contribuyó a la producción de isopreno durante fermentación fue 1.7%. El por ciento en peso de rendimiento de isopreno a partir de glucosa fue 0.8%.
Ejemplo 9 Construcción de la vía de MVA superior e inferior para integración a Bacillue subtilis I . Construcción de la vía de MVA superior en Bacillus subtilis La vía superior de Enterococcus faecalis es integrada a B. subtilis bajo control del promotor aprE. La vía superior consiste de dos genes; mvaE, que codifica para AACT y HMGR, y mvaS, que codifica para HMGS . Los dos genes se fusionan entre sí con un codón de detención entre los mismos, un sitio de RBS en frente de mvaS, y están bajo el control del promotor aprE. Un terminador está situado después del gen mvaE. El marcador de resistencia a cloranfenicol es clonado después del gen mvaE y el constructo es integrado en el locus aprE por doble cruzamiento mediante el uso de regiones de flanqueo de homología.
Cuatro fragmentos de ADN son amplificados por PCR de tal manera que contienen colgantes que les permitirán ser fusionados entre sí por una reacción de PCR. Amplificaciones por4 PCR se llevan a cabo mediante el uso de polimerasa Herculase de conformidad con las instrucciones del fabricante . 1. PaprE CF 07-134 (+) Inicio de promotor aprE PstI 5'- GACATCTGCAGCTCCATTTTCTTCTGC (SEQ ID NO : 82) CF 07-94 (-) Fusión de PaprE a mvaE 5'- CAATAATAACTACTGTTTTCACTCTTTACCCTCTCCTTTTAA (SEQ ID NO: 83) Plantilla: ADN cromosómico de Bacillus subtilis 2. mvaE CF 07-93 (+) fusión de mvaE al promotor aprE (codón de inicio de GTG) 5 ' -TTAAAAGGAGAGGGTAAAGAGTGAAAACAGTAGTTATTATTG (SEQ ID NO: 84) CF 07-62 (-) Fusión de mvaE a mvaS con RBS entre los mismos 5 ' -TTTATCAATCCCAATTGTCATGTTTTTTTACCTCCTTTATTGTTTTCTTAAATC (SEQ ID NO:35) Plantilla: ADN cromosómico de Enterococcus faecalis (de ATCC) 3. mvaS CF 07-61 (+) Fusión de mvaE a mvaS con RBS entre los mismos 5 ' -GATTTAAGAAAACAATAAAGGAGGTAAAAAAACATGACAATTGGGATTGATAAA (SEQ ID NO: 36) CF 07-124 (-) Fusión del extremo de mvaS al terminador 5 ' -CGGGGCCAAGGCCGGTTTTTTTTAGTTTCGATAAGAACGAACGGT (SEQ ID NO: 85) Plantilla: ADN cromosómico de Enterococcus faecalis 4. Terminador de serina proteasa alcalina de B. amyliquefaciens CF 07-123 (+) Fusión del extremo de mvaS al terminador 5 ' -ACCGTTCGTTCTTATCGAAACTAAAAAAAACCGGCCTTGGCCCCG (SEQ ID NO:86) CF 07-46 (-) Fin del terminador de B . amyliquefaciens BamHI 5 ' -GACATGACGGATCCGATTACGAATGCCGTCTC (SEQ ID NO: 63) Plantilla: ADN cromosómico de Bacillus amyliquefaciens Reacciones de Fusión por PCR 5. Fusión de mvaE a mvaS CF 07-93 (+) fusión de mvaE al promotor aprE (codón de inicio de GTG) 5 ' -TTAAAAGGAGAGGGTAAAGAGTGAAAACAGTAGTTATTATTG (SEQ ID NO: 84) CF 07-124 (-) Fusión del extremo de mvaS al terminador 5 ' -CGGGGCCAAGGCCGGTTTTTTTTAGTTTCGATAAGAACGAACGGT (SEQ ID NO: 85) Plantilla: #2 y 3 anteriores 6. Fusión de mvaE-mvaS al promotor aprE CF 07-134 (+) Inicio de promotor aprE PstI 51 -GACATCTGCAGCTCCATTTTCTTCTGC (SEQ ID NO: 82) CF 07-124 (-) Fusión del extremo de mvaS al terminador 5 ' -CGGGGCCAAGGCCGGTTTTTTTTAGTTTCGATAAGAACGAACGGT (SEQ ID NO:85) Las plantillas #1 y #4 anteriores 7. Fusión de PaprE-mvaE-mvaS al terminador CF 07-134 (+) Inicio de promotor aprE PstI 5 ' -GACATCTGCAGCTCCATTTTCTTCTGC (SEQ ID NO: 82) CF 07-46 (-) Fin de terminador de B . amyliquefaciens BamHI 5 ' -GACATGACGGATCCGATTACGAATGCCGTCTC (SEQ ID NO: 63) Plantilla: #4 y #6 El producto es digerido con endonucleasas de restricción Pstl/BamHI y ligado a pJM102 (Perego, M. 1993. Integrat ional vectors for genetic manipulation in Bacillus subtilis, p. 615-624. En A . L. Sonenshein, J. A . Hoch, y R. Losick (ed. ) , Bacillus subtilis and other gram-pos i t ive bacteria: biochemistry , physiology, and molecular genetics. American Society for Microbiology , Washington , D . C . ) que es digerido con Pstl/BamRI. La ligación es transformada a células químicamente competentes con E.coli TOP 10 y los transformantes son seleccionados sobre LA que contiene carbenic i 1 ina (50 yg/ml) . El plásmido correcto es identificado por secuenciación y es designado pJMUpperpathway2 (figuras 50 y 51) . El ADN de plásmido purificado es transformado a Bacillus subtilis aprEnprE Pxyl-comK y los transformantes son seleccionados sobre agar L que contiene cloranf enicol (5 µg/ml) . Una colonia correcta es seleccionada y es colocada secuenc ialmente sobre agar L que contiene c loranfeni col 10, 15 y 25 yg/ml para amplificar el número de copias del cásete que contiene la vía superior .
La cepa resultante se prueba para producción de ácido mevalónico al crecer en LB que contiene 1% de glucosa y 1%. Los cultivos son analizados por GC para la producción de ácido mevalónico.
Esta cepa se usa subsecuentemente como un hospedero para la integración de la vía de ácido mevalónico inferior.
Los siguientes cebadores se usan para secuenciar los diversos constructos anteriores.
Cebadores secuenciadores : CF 07-134 (+) Inicio de promotor aprE PstI 5 ' -GACATCTGCAGCTCCATTTTCTTCTGC (SEQ ID NO: 82) CF 07-58 (+) Inicio del gen mvaE 5 ' -ATGAAAACAGTAGTTATTATTGATGC (SEQ ID NO : 38 ) CF 07-59 (-) Fin del gen mvaE 5 ' -ATGTTATTGTTTTCTTAAATCATTTAAAATAGC (SEQ ID NO : 39 ) CF 07-82 (+) Inicio del gen mvaS 51 -ATGACAATTGGGATTGATAAAATTAG (SEQ ID NO : 40 ) CF 07-83 (-) Fin del gen mvaS 5 ' - TTAGTTTCGATAAGAACGAACGGT (SEQ ID NO: 41) CF 07-86 (+) Secuencia en mvaE 5 ' -GAAATAGCCCCATTAGAAGTATC (SEQ ID NO : 42 ) CF 07-87 (+) Secuencia en mvaE 5 ' - TTGCCAATCATATGATTGAAAATC (SEQ ID NO: 43) CF 07-88 (+) Secuencia en mvaE 5 ' - GCTATGCTTCATTAGATCCTTATCG (SEQ ID NO: 44) CF 07-89 (+) Secuencia en mvaS 5 ' -GAAACCTACATCCAATCTTTTGCCC (SEQ ID NO : 45 ) Los transformantes se seleccionan sobre LA que contiene cloranfenicol a una concentración de 5 g/ml. Una. colonia se confirma que tiene la integración correcta por secuenc iac ión y es colocada en LA que contiene . concentraciones cada vez mayores de cloranf enicol durante varios vías, a un nivel final de 25 yg/ml . Esto da por resultado la amplificación del cásete que contiene los genes de interés. La cepa resultante es designada CF 455: JMupperpathway# 1 X Baci 1 lus subt i 1 i s aprEnprE Pxyl coraK (amplificada para crecer en LA que contiene cloranf enicol 25 yg/ml) .
II. Construcción de la vía de MVA inferior en Bacillus subtilis La vía de MVA inferior, que consiste de los genes mvkl , pmk, mpd e idi se combinan en un cásete que consiste de flanquear regiones de ADN de la región nprE del cromosoma de B. subtilis (sitio de integración) , el promotor aprE y el marcador de resistencia a e spect inomi c ina (véase figuras 28 y 29) . Este c sete es sintetizado por ADN2.0 y es integrado en el cromosoma de B. subtilis que contiene la vía de MVA superior integrada en el locus de aprE. El gen de isopreno sintasa de kudzu es expresado a partir del plásmido replicador descrito en el ejemplo 4 y es transformado en la cepa con las vías superior e inferior integradas .
Ejemplo 10 Composiciones ilustrativas de isopreno y métodos para hacerlas I. Análisis composicional de gas de fermentación desprendido que contiene isopreno Una fermentación a escala de 14 L se llevó a cabo con una cepa de E. coli BL21 (DE3) recombinante que contenía dos plásmidos (p,CL upperMev; pTrcKKDylklS que codifica la vía de mevalonato completa para biosíntesis de precursor de isoprenoide, una isoprenil pirofosfato isomerasa de levadura, y una isopreno sintasa de Kudzu. El gas desprendido de fermentación del tanque de 14 L fue recolectado en tubos de espacio superior de 20 mL alrededor del tiempo de peak productividad de isopreno (tiempo de fermentación transcurrido de 27.9 horas, "EFT") y analizado por GC/MS de espacio superior para componentes volátiles.
El análisis de espacio superior se llevó a cabo con un sistema de GC/MS Agilent 6890 equipado con una columna Agilent HP-5MS GC/MS (30 m x 250 ym; 0.25 µt? de espesor de película) . Un autoinyector combiPAL se usó para muestrear alícuotas de 500 uL de 20 mL de tubos de espacio superior. El método de GC/MS utilizó helio com el gas portador a un flujo de 1 mL/min. El puerto de inyección se mantuvo a 250°C con una relación de separación de 50:1. La temperatura del horno se mantuvo a 37 °C durante un período inicial de 2 minutos, seguido por un incremento a 237°C a una velocidad de 25°C/min para un tiempo de método total de 10 minutos. El detector selectivo de masa Agilent 5793N escudriñó de m/z 29 a m/z 300. El límite de detección de este sistema es aproximadamente 0.1 ug/Lgas o aproximadamente 0.1 ppm. Si se desea, se puede usar equipo más sensible con un límite de detección inferior.
El gas desprendido consistió de 99.925% (v/v) de gases permanentes (N2, C02 y 02) , aproximadamente 0.075% de isopreno (2-metil-l, 3-butadieno) (-750 ppmv, 2100 g/L) y cantidades menores (<50 ppmv) de etanol, acetona, y dos alcoholes prenílicos de C5. La cantidad de vapor de agua no se determinó pero se estimó que era igual a la presión de vapor de equilibrio a 0°C. La composición de la fracción orgánica volátil como se determina por integración del área bajo los picos en el cromatograma de GC/MS (figuras. 86A y 86B) y se lista en la tabla 6. Las curvas de calibración para estándares de etanol y acetona permitieron la conversión del área de GC a concentración de fase gaseosa en unidades de ug/L mediante el uso de métodos estándares.
Tabla 6 Composición de componentes orgánicos volátiles en gas desprendido de fermentación El gas desprendido analizado en el punto de tiempo de 27.9 horas de una fermentación mediante el uso de una cepa de E. coli BL21 (DE3) que expresa una vía de mevalonato heterólogo, una isoprenil pirofosfato isomerasa de levadura, y una isopreno sintasa de Kudzu.
II. Medición de componentes orgánicos volátiles traza (VOCs) co - produc idos con isopreno durante la fermentación de una cepa de E. coli recombinante Una fermentación a escala de 14 L se llevó a cabo con una cepa de E. coli BL21 (DE3) recombinante que contenía dos plásmidos (pCL upperMev; pTrc.KKDylkl S ) que codifica la vía de mevalonato completa para biosíntesis de precursor de isoprenoide, una isoprenil pirofosfato isomerasa de levadura, y una isopreno sintasa de Kudzu.
El gas desprendido de fermentación se hizo pasar a través de los tubos de espacio superior enfriados a fin de concentrar e identificar los componentes orgánicos volátiles traza. El gas desprendido de esta fermentación se muestreó a una velocidad de 1 L/min durante 10 minutos a través de un tubo de espacio superior de 20 mL empacado con lana de cuarzo (2g) y se enfrió a -78°C con hielo seco. El tubo se volvió a tapar con una tapa de tubo nueva y se analizó por GC/MS de espacio superior para VOCs atrapados mediante el uso de las condiciones descritas en el ejemplo 10, parte I. Las relaciones de compuestos observadas en las figuras 87A-87D son una combinación del nivel global en el gas desprendido de fermentación, la presión de vapor relativa a -78°C, y la respuesta del detector del espectrómetro de masa. Por ejemplo, el nivel bajo de isopreno en relación con compuestos volátiles oxigenados (v.gr., acetona y etanol) es una función de la alta volatilidad de este material, de tal manera que no se acumula en el tubo del espacio superior a -78°C.
La presencia de muchos de estos compuestos es única para composiciones de isopreno derivadas de fuentes biológicas. Los resultados se ilustran en las figuras 87A-87D y se resumen en las tablas 7A y 7B.
Tabla 7A Compuestos volátiles traza presentes en gas desprendido producido por E. coli BL21 (DE3) (pCL upperMev; pTrcKKDylklS) después de crio-atrapamiento a -78°C Compuesto TR Area % de Relación (min) de GC1 área %3 Acetaldehído 1. 542 4019861 4. 841 40.14 Etanol 1. 634 10553620 12 .708 105.39 Acetona 1. 727 7236323 8. 714 72.26 2-metil-l , 3 -butadieno 1. 777 10013714 12 .058 100.00 1-propanol 1. 987 163574 0. 197 1.63 Diacetilo 2. .156 221078 0. 266 2.21 2-metil-3-buten-2-ol 2. 316 902735 1. 087 9.01 2 -metil - 1-propanol 2. 451 446387 0. 538 4.46 3 -metil - 1-butanal 2 .7 165162 0. 199 1.65 1-butanol 2. 791 231738 0. 279 2.31 3 -metil -3 -buten-l-ol 3. 514 14851860 17 .884 148.32 3 -metil -1-butanol 3. 557 8458483 10 .185 84.47 3 -metil-2-buten- l-ol 4. 042 18201341 21 .917 181.76 3 -metil -2 -butenal 4. 153 1837273 2. 212 18.35 Acetato de 3-metilbutilo 5. 197 196136 0. 236 1.96 Acetato de 3-metil-3-but-l- 5. 284 652132 0. 785 6.51 enilo 2-heptanona 5. 348 67224 0 081 0.67 2 , 5-dimetilpirazina 5. 591 58029 0 070 0.58 Acetato de 3-metil-2-but-l- 5. 676 1686507 2 031 16.84 enilo 6 -metil- 5 -hepten-2 -ona 6. 307 101797 0 123 1.02 2,4, 5-trimetilpiridina 6 .39 68477 0 082 0.68 ¦ 2,3, 5-trimetilpirazina 6 485 30420 0 037 0.30 (E) -3 , 7-dimetil-l, 3,6- 6 766 848928 1 022 8.48 octatrieno (Z) -3, 7-dimetil-l, 3, 6- 6 864 448810 0 540 4.48 octatrieno Butirato de 3-metil-2-but-l- 7 294 105356 0 127 1.05 enilo Citronelal 7 756 208092 0 251 2.08 2 , 3 -cicloheptenolpiridina 8 .98 1119947 1 349 11.18 ¦"?? área ' de GC es el área no corregida bajo el pico correspondiente al compuesto listado. 2E1 % del área es el área pico expresada como un % relativo al área pico total de todos los compuestos. 3E1 % de relación es el área pico expresada como un % relativo al área pico de 2-metil-l , 3-butadieno.
Tabla 7B Compuestos volátiles traza presentes en gas desprendido producido por E. coli BL21 (DE3) (pCL upperMev; pTrcKKDylklS) después de crio-atrapamiento a -196°C 1E1 área de GC es el área no corregida bajo el pico correspondiente al compuesto listado. 2E1 % del área es el área pico expresada como un % relativo al área pico total de todos los compuestos. 3E1 % de relación es el área pico expresada como un % relativo al área pico de 2-metil-l , 3-butadieno.
III. Ausencia de isómeros de hidrocarburo de C5 en isopreno derivado de fermentación El crio-atrapamiento de isopreno presente en gas desprendido de fermentación se llevó a cabo mediante el uso de un tubo de espacio superior de 2 mL enfriado en nitrógeno líquido. El gas desprendido (1 L/min) primero se hizo pasar a través de un tubo de 20 mL que contenía comprimidos de hidróxido de sodio para reducir al mínimo la acumulación de hielo y C02 sólido en el tubo de 2 mL (-196°C) . Aproximadamente 10 L de gas desprendido se hizo pasar a través del tubo, después de lo cual se dejó calentar a -78°C con ventilación, seguido por resellado con una tapa de tubo, nueva y análisis por GC/MS.
El análisis de espacio superior por GC/MS se llevó a cabo con un sistema de GC/MS Agilent 6890 mediante el uso de una jeringa hermética a gas de 100 uL en modo de espacio superior. Una columna Zebron ZB-624 GC/MS (30 m x 250 µp\; con espesor de película de 1.40 µp?) se usó para la separación de anal itos. El autoinyector de GC fue equipado con una jeringa hermética a gas de 100 uL, y la altura de la aguja se ajustó para permitir la inyección de una muestra de espacio superior de 50 uL de un tubo de GC de 2 mL. El método de GC/MS utilizó helio como el gas portador a un flujo de 1 mL/min. El puerto de inyección se mantuvo a 200°C con una relación de separación de 20:1. La temperatura del horno se mantuvo a 37°C por los 5 minutos de duración del análisis. El detector selectivo de masa Agilent 5793N se puso en operación en un modo de monitoreo de iones individual (SIM) en m/z 55, 66, 67 y 70. Bajo estas condiciones, se observó que el isopreno se eluía a 2.966 minutos (figura 88B) . Un estándar de isopreno derivado del petróleo (Sigma-Aldrich) también se analizó mediante el uso de este método y se encontró que contenía isómeros de hidrocarburo de C5 adicionales, que se eluyeron poco antes o después del pico principal y fueron cuantificados con base en el área de GC corregida (figura 88A) .
Tabla 8A Análisis de isopreno derivado del petróleo por GC/MS Tabla 8B Análisis de isopreno derivado de fermentación por GC/MS (¾ del total de hidrocarburos de C5) En un experimento separado, una mezcla estándar de hidrocarburos de C5 se analizó para determinar si la respuesta del detector era la misma para cada uno de los compuestos. Los compuestos fueron 2 -met i 1 - 1 - buteno , 2 -met i 1 - 1 , 3 -butadieno , (E)- 2-penteno, ( Z ) - 2 -penteno y (E) - 1 , 3 -pentadieno . En este caso, el análisis se llevó a cabo en una columna Agilent DB-Petró (100 m x 0.25 mm , con espesor de película de 0.50 um) mantenida a 50°C durante 15 minutos. El método de GC/MS utilizó helio como el gas portador a un flujo de 1 mL/min. El puerto de inyección se mantuvo a 200°C con una relación de separación de 50:1. El detector selectivo de masa Agilent 5793N se puso en operación en un modo de escudriñamiento completo de m/z 19 a m/z 250. Bajo estas condiciones, una concentración de 100 ug/L de cada estándar produjo la misma respuesta del detector dentro del error experimental.
IV. Composiciones que comprenden isopreno adsorbido a una fase sólida.
Isopreno biológicamente producido fue adsorbido a carbón activado lo que dio por resultado una fase sólida que contenía 50 a 99.9% de carbono, 0.1% a 50% de isopreno, 0.01% a 5% de agua, y cantidades menores (<0.1%) de otros componentes orgánicos volátiles.
El gas desprendido de fermentación se puso en operación a través de una bobina de condensación de cobre mantenida a 0°C, seguido por un filtro desecante de sílice granulada a fin de remover vapor de agua. El gas desprendido deshumidi ficado entonces se llevó a cabo a través del carbono que contenía filtros (Koby Jr, Koby Filters, MA) al punto en el cual el rompimiento de isopreno se detectó en el escape del filtro por GC/MS . La cantidad de isopreno adsorbida al cartucho se puede determinar indirectamente al calcular la concentración en el gas desprendido, la velocidad de flujo global y el por ciento de rompimiento durante el período de recolección. Alternativamente, el isopreno adsorbido se puede recuperar a partir de los filtros por desorción térmica, bajo vacío o mediada por solvente.
V. Recolección y análisis de isopreno condensado El gas desprendido de fermentación es deshumidif icado, y el C02 removido por filtración a través de un adsorbente adecuado (v.gr. , ascarita) . La corriente de gas desprendido resultante es después llevada a través de un condensador enfriado con nitrógeno líquido a fin de condensar los VOCs en la corriente. El recipiente de recolección contiene t-butilcatecol para inhibir el isopreno condensado resultante. El condensado es analizado por GC/MS y NMR para determinar la pureza mediante el uso de métodos estándares, tales como las que aquí se describen.
VI. Producción de alcoholes prenílicos por fermentación El análisis de gas desprendido de una cepa de E. coli BL21 (DE3) que expresa una isopreno sintasa de Kudzu reveló la presencia tanto de isopreno como de 3-metil-3-buten-l-ol (isoprenol). Los niveles de los dos compuestos en el gas desprendido de fermentación durante la fermentación se muestran en la figura 89 como se determina por GC/MS de espacio superior. Los niveles de isoprenol ( 3 -metil - 3 -buten- 1 -ol , 3-MBA) logrados fueron de casi 10 ug/Lgas des rendido en este experimento. Experimentos adicionales produjeron niveles de aproximadamente 20 ug/ Lgag des rendido en el gas desprendido de fermentación.
Ejemplo 11 El desacoplamiento de crecimiento y producción de isopreno en E. coli que expresa genes de la vía de ácido mevalónico y fermentado en un cultivo intermitente con alimentación El ejemplo 11 ilustra el desacoplamiento del crecimiento celular de ácido mevalónico y producción de isopreno .
I . Condiciones de fermentación Receta del medio (por litro medio de fermentación) : El medio fue generado mediante el uso de los siguientes componentes por litro de medio de fermentación: K2HP0 7.5 g, MgS04 * 7H20 2 g, ácido cítrico monohidratado 2 g, citrato de amonio férrico 0.3 g, extracto de levadura 0.5 g, y solución de metal traza modificado 1000X 1 mi. Todos los componentes se añadieron juntos y se disolvieron en diH20. Esta solución se sometió a autoclave. El pH se ajustó a 7.0 con hidróxido de . amonio (30%) y c.b.p. volumen. Glucosa 10 g, tiamina * HCl 0.1 g, y antibióticos se añadieron después de la esterilización y ajuste de pH.
Solución de metal traza modificado 1000X: La solución de metal traza modificado 1000X fue generada mediante el uso de los siguientes componentes: ácidos cítricos * H20 40 g, MnS04 * H20 30 g, NaCl 10 g, FeS04 * 7H20 1 g, CoC12 * 6H20 1 g, ZnSO * 7H20 1 g, CuS04 * 5H20 100 mg, H3BO3 100 mg, y NaMo04 * 2H20 100 mg. Cada componente se disolvió uno a la vez en Di H20, pH a 3.0 con HCl/NaOH, después c.b.p. volumen, y se esterilizó mediante filtro con un filtro de 0.22 mieras.
La fermentación se llevó a cabo con células de E. coli que contenían el plásmido pTrcHis2AUpperPathway (también llamado pTrcUpperMVA, figuras 91 y 92A-92C) (50 ug/ml de carbenicilina) o el plásmido pCL PtrcUpperMVA (también llamado pCL PtrcUpperPathway (figura 26) ) (50 g/ml espectinomicina) . Para experimentos en los cuales se produjo isopreno, las células de E. coli también contenían el plásmido pTrc KKDyIkIS (50 g/ml kanamicina) . Estos experimentos se llevaron a cabo para monitorear formación de ácido mevalónico o isopreno a partir de glucosa a la fermentación deseada pH 7.0 y temperatura de 30°C. Un inoculo de una cepa de E. coli tomada de un tubo congelado se sembró por veteado en una placa de agar con caldo LA (con antibióticos) y se incubó a 37°C. Una colonia individual fue inoculada en un medio de triptona-extracto de levadura. Después de que el inoculo creció a densidad óptica 1.0 cuando medida a 550 nm, se usó para inocular el biorreactor.
La glucosa fue alimentada a una velocidad exponencial hasta que las células alcanzaron la fase estacionaria. Después de este tiempo, la alimentación de glucosa se disminuyó para satisfacer las demandas metabólicas. La inducción se logró al añadir IPTG. La concentración de ácido mevalónico en caldo de fermentación como se determina al aplicar muestras (0.3 M incubadas a 4°C durante 5 minutos) tratadas con ácido perclórico (Sigma-Aldrich # 244252) a una columna de HPLC de ácidos orgánicos (BioRad # 125-0140) . La concentración como se determina por comparar el tamaño pico de ácido mevalónico del caldo a una curva de calibración generada a partir de mevalonolacetona (Sigma-Aldrich # M4667) tratada con ácido perclórico para formar D, L-mevalonato . El nivel de isopreno en el gas desprendido del biorreactor se determinó como se describe aquí. El título de isopreno se define como la cantidad de isopreno producido por litro de. caldo de fermentación.
II. Producción de ácido mevalónico a partir de células de E. coli BL21 (DE3) que expresan el plásmido pTrcUpperMVA a una escala de 150 L Células BL21 (DE3) que se hicieron crecer sobre una placa como se explicó antes en el ejemplo 11, parte I fueron inoculadas en un matraz que contenía 45 mL de medio de triptona-extracto de levadura y se incubaron a 30°C con agitación a 170 rpm durante 5 horas. Esta solución fue transferida a un biorreactor de 5 L de medio de triptona-extracto de levadura, y las células se hicieron crecer a 30°C y 27.5 rpm hasta que el cultivo alcanzó una ODS5o de 1.0. Los 5 L de inoculo se sembraron en un biorreactor de 150 L que contenía 45-kg de medio. La concentración de IPTG se llevó a 1.1 mM cuando la OD550 alcanzó un valor de 10. El perfil de OD550 dentro del biorreactor con el tiempo se muestra en la figura 60A. El título de ácido mevalónico se incrementó durante el curso de la fermentación a un valor final de 61.3 g/L (figura 60B) . El perfil de productividad específica a través de la fermentación se muestra en la figura 60C y una comparación con la figura 60A ilustra el desacoplamiento de crecimiento y producción de ácido mevalónico. La cantidad total de ácido mevalónico producido durante la fermentación de 52.5 horas fue 4.0 kg a partir de 14.1 kg de glucosa utilizada. El rendimiento molar de carbono utilizado que contribuyó a la producción de ácido mevalónico durante fermentación fue 34.2%.
III. Producción de ácido mevalónico a partir de células de E. coli BL21 (DE3) que expresan el plásmido pTrcUpperMVA a una escala de 15 L Células BL21 (DE3) que se hicieron crecer sobre una placa como se explicó antes en el ejemplo 11, parte I fueron inoculadas en un matraz que contenía 500 mL de medio de triptona-extracto de levadura y que crece a 30°C a 160 rpm a OD550 de 1.0. Este material se sembró en un biorreactor de 15 L que contenía 4.5 kg de medio. La concentración de IPTG se llevó a 1.0 mM cuando la OD550 alcanzó un valor de 10. El perfil de OD550 dentro del biorreactor con el tiempo se muestra en la figura 61A. El título de ácido mevalónico se incrementó durante el curso de la fermentación a un valor final de 53.9 g/L (figura 61B) . El perfil de productividad específica a lo largo de la fermentación se muestra en la figura 61C y una comparación con la figura 61A que ilustra el desacoplamiento de crecimiento y producción de ácido mevalónico. La cantidad total de ácido mevalónico producido durante la fermentación de 46.6 horas fue 491 g a partir de 2.1 kg de glucosa utilizada. El rendimiento molar de carbono utilizado que contribuyó a la producción de ácido mevalónico durante fermentación fue 28.8%.
IV. Producción de ácido mevalónico a partir de células de E. coli FM5 que expresan el plásmido pTrcUpperMVA a una escala de 15 L Células FM5 que se hicieron crecer sobre una placa como se explicó antes en el ejemplo 11, parte I fueron inoculadas en un matraz que contenía 500 mL de medio de triptona-extracto de levadura y crecieron a 30 °C a 160 rpm a OD550 de 1.0. Este material se sembró en un biorreactor de 15 L que contenía 4.5 kg de medio. La concentración de IPTG se llevó a 1.0 mM cuando la OD5So alcanzó un valor de 30. El perfil de OD550 dentro del biorreactor con el tiempo se muestra en la figura 62A. El título de ácido mevalónico se incrementó durante el curso de la fermentación a un valor final de 23.7 g/L (figura 62B) . El perfil de productividad específica a lo largo de la fermentación se muestra en la figura 62C y una comparación con la figura 62A ilustra el desacoplamiento de crecimiento y producción de ácido mevalónico. La cantidad total de ácido mevalónico producido durante la fermentación de 51.2 horas fue 140 g a partir de 1.1 kg de glucosa utilizada. El rendimiento molar de carbono utilizado que contribuyó a la producción de ácido mevalónico durante fermentación fue 15.2%.
V. Producción de isopreno a partir de células de E. coli BL21 (DE3) que expresan los plásmidos pCL PtrcUpperMVA y pTrc KKDyIkIS a una escala de 15 L Células BL21 (DE3) que expresan los plásmidos pCL PtrcUpperMVA y pTrc KKDyIkIS que se hicieron crecer sobre una placa como se explicó antes en el ejemplo 11, parte I fueron inoculadas en un matraz que contenía 500 mL de medio de triptona-extracto de levadura y crecieron a 30°C a 160 rpm a OD550 de 1.0. Este material se sembró en un biorreactor de 15 L que contenía 4.'5 kg de medio. La concentración de IPTG se llevó a 25 µ? cuando la OD550 alcanzó un valor de 10. La concentración de IPTG se elevó a 50 uM cuando la OD550 alcanzó 190. La concentración de IPTG se elevó a 100 uM a 38 horas de fermentación. El perfil de OD550 dentro del biorreactor con el tiempo se muestra en la figura 63A. El título de isopreno se incrementó durante el curso de la fermentación a un valor final de 2.2 g/L de caldo (figura 63B) . El perfil de productividad específica a lo largo de la fermentación se muestra en la figura 63C y una comparación con la figura 63A ilustra el desacoplamiento de crecimiento y producción de isopreno. La cantidad total de isopreno producido durante la fermentación de 54.4 horas fue 15.9 g a partir de 2.3 kg de glucosa utilizada. El rendimiento molar de carbono utilizado que contribuyó a ¦ la producción de isopreno durante fermentación fue 1.53%.
VI. Producción de isopreno a partir de células afinadoras de E. coli BL21 (DE3) que expresan los plásmidos pCL PtrcUpperMVA y pTrc KKDyIkIS a una escala de 15 L Células afinadoras BL21 (DE3) que expresan los plásmidos pCL PtrcUpperMVA y pTrc KKDyIkIS que se hicieron crecer sobre una placa como se explicó antes en el ejemplo 11, parte I fueron inoculadas en un matraz que contenía 500 mL de medio de triptona-extracto de levadura y crecieron a 30°C a 160 rpm a OD550 de 1.0. Este material se sembró en un biorreactor de 15 L que contenía 4.5 kg de medio. La concentración de IPTG se llevó a 26 µ? cuando la OD550 alcanzó un valor de 10. La concentración de IPTG se elevó a 50 uM cuando la OD550 alcanzó 175. El perfil de OD550 dentro del biorreactor con el tiempo se muestra en la figura 64A. El título de isopreno se incrementó durante el curso de la fermentación a un valor final de 1.3 g/L de caldo (figura 64B) . El perfil de productividad específica a lo largo de la fermentación se muestra en la figura 64C y una comparación con la figura 64A ilustra el desacoplamiento de crecimiento y producción de isopreno. La cantidad total de isopreno producido durante la fermentación de 48.6 horas fue 9.9 g a partir de 1.6 kg de glucosa utilizada. El rendimiento molar de carbono utilizado que contribuyó a la producción de isopreno durante fermentación fue 1.34%.
VII. Producción de isopreno a partir de células de E. coli MG 1655 células que expresan los plásmidos pCL PtrcUpperMVA y pTrc KKDyIkIS a una escala de 15 L Células MG1655 que expresan los plásmidos pCL PtrcUpperMVA y pTrc KKDyIkIS que se hicieron crecer sobre una placa como se explicó antes en el ejemplo 11, parte I fueron inoculadas en un matraz que contenía 500 mL de medio de triptona-extracto de levadura y crecieron a 30°C a 160 rpm a OD550 de 1.0. Este material se sembró en un biorreactor de 15 L que contenía 4.5 kg de medio. La concentración de IPTG se llevó a 24 µ? cuando la OD550 alcanzó un valor de 45. El perfil de OD550 dentro del biorreactor con el tiempo se muestra en la figura 65A. El título de isopreno se incrementó durante el curso de la fermentación a un valor final de 393 mg/L de caldo (figura 65B) . El perfil de productividad específica a lo largo de la fermentación se muestra en la figura 65C y una comparación con la figura 65A ilustra el desacoplamiento de crecimiento y producción de isopreno. La cantidad total de isopreno producido durante la fermentación de 67.4 horas fue 2.2 g a partir de 520 g de glucosa utilizada. El rendimiento molar de carbono utilizado que contribuyó a la producción de isopreno durante fermentación fue 0.92%.
VIII. Producción de isopreno a partir de células de E. coli MG1655ack-pta que expresan los plásmidos pCL PtrcUpperMVA y pTrc KKDyIkIS a una escala de 15 L Células MG 1655ack-pta que expresan los plásmidos pCL PtrcUpperMVA y pTrc KKDyIkIS que se hicieron crecer sobre una placa como se explicó antes en el ejemplo 11, parte I fueron inoculadas en un matraz que contenía 500 mL de medio de triptona-extracto de levadura y crecieron a 30 °C a 160 rpm a OD550 de 1.0. Este material se sembró en un biorreactor de 15 L que contenía 4.5 kg de medio. La concentración de IPTG se llevó a 30 µ? cuando la OD550 alcanzó un valor de 10. El perfil de OD550 dentro del biorreactor con el tiempo se muestra en la figura 66A. El título de isopreno se incrementó durante el curso de la fermentación a un valor final de 368 mg/L de caldo (figura 66B) . El perfil de productividad específica a lo largo de la fermentación se muestra en la figura 66C y una comparación con la figura 66A ilustra el desacoplamiento de crecimiento y producción de isopreno. La cantidad total de isopreno producido durante la fermentación de 56.7 horas fue 1.8 g a partir de 531 g de glucosa utilizada. El rendimiento molar de carbono utilizado que contribuyó a la producción de isopreno durante fermentación fue 0.73%.
IX. Producción de isopreno a partir de células de E. coli F 5 que expresan los plásmidos pCL PtrcUpperMVA y pTrc KKDyIkIS a una escala de 15 L Células FM5 que expresan los plásmidos pGL PtrcUpperMVA y pTrc KKDyIkIS que se hicieron crecer sobre una placa como se explicó antes en el ejemplo 11, parte I fueron inoculadas en un matraz que contenía 500 mL de medio de triptona-extracto de levadura y crecieron a 30°C a 160 rpm a OD550 de 1.0. Este material se sembró en un biorreactor de 15 L que contenía 4.5 kg de medio. La concentración de IPTG se llevó a 27 µ? cuando la OD550 alcanzó un valor de 15. El perfil de OD550 dentro del biorreactor con el tiempo se muestra en la figura 67A. El título de isopreno se incrementó durante el curso de la fermentación a un valor final de 235 mg/L de caldo (figura 67B) . El perfil de productividad específica a lo largo de la fermentación se muestra en la figura 67C y una comparación con la figura 67A ilustra el desacoplamiento de crecimiento y producción de isopreno. La cantidad total de isopreno producido durante la fermentación de 52.3 horas fue 1.4 g a partir de 948 g de glucosa utilizada. El rendimiento molar de carbono utilizado que contribuyó a la producción de isopreno durante fermentación fue 0.32%.
Ejemplo 12 La producción de isopreno durante la fase de crecimiento exponencial de E. coli que expresa genes a partir de la vía de ácido mevalónico y fermentado en un cultivo intermitente con alimentación El ejemplo 12 ilustra la producción de isopreno durante la fase de crecimiento exponencial de las células.
Receta del medio (por litro medio de fermentación) : El medio fue generado mediante el uso de los siguientes componentes por litro de medio de fermentación: K2HP04 7.5 g, MgS0 * 7H20 2 g, ácido cítrico monohidratado 2 g, citrato de amonio férrico 0.3 g, extracto de levadura 0.5 g, y solución de metal traza modificado 1000X 1 mi. Todos los componentes se añadieron juntos y se disolvieron en diH20.
Esta solución se sometió a autoclave. El pH se ajustó a 7.0 con hidróxido de amonio (30%) y c.b.p. volumen. Glucosa 10 g, tiamina * HC1 0.1 g, y antibióticos se añadieron después de la esterilización y ajuste de pH.
Solución de metal traza modificado 1000X: La solución de metal traza modificado 1000X fue generada mediante el uso de los siguientes componentes: ácido cítricos * H20 40 g, MnS04 * H20 30 g, NaCl 10 g, FeS04 * 7H20 1 g, CoC12 * 6H20 1 g, ZnSO * 7H20 1 g, CuS04 * 5H20 100 mg, H3B03 100 mg, y NaMo04 * 2H20 100 mg . Cada componente se disolvió uno a la vez en Di H20, pH a 3.0 con HCl/NaOH, después c.b.p. volumen, y se esterilizó mediante filtro con un filtro de 0.22 mieras.
La fermentación se llevó a cabo en un biorreactor de 15 L con células de E. coli ATCCl 1303 que contenían los plásmidos pCL PtrcUpperMVA y pTrc KKDyIkIS. Este experimento se llevó a cabo para monitorear la formación de isopreno a partir de glucosa a la fermentación deseada pH 7.0 y temperatura de 30°C. Un inoculo de una cepa de E. coli tomada de un tubo congelado se sembró por veteado en una placa de agar con caldo LB (con antibióticos) y se incubó a 37°C. Una colonia individual fue inoculada en un medio de triptona-extracto de levadura. Después de que el inoculo creció a densidad óptica 1.0 cuando medida a 550 nm, se usó para inocular un biorreactor de 5-L.
La glucosa fue alimentada a una velocidad exponencial hasta que las células alcanzaron la fase estacionaria. Después de este tiempo, la alimentación de glucosa se disminuyó para satisfacer las demandas metabólicas. La cantidad total de glucosa suministrada al biorreactor durante fermentación de 50 horas fue de 2.0 kg . La inducción se logró al añadir IPTG. La concentración IPTG se llevó a 25 uM cuando la densidad óptica a 550 nm (OD550 ) alcanzó un avlor de 10. La concentración de IPTG se elevó a 50 uM cuando la OD550 alcanzó 190. El perfil de OD550 dentro del biorreactor con el tiempo se muestra en la figura 99. El nivel de isopreno en el gas desprendido del biorreactor se determinó como se describe aquí. El título de isopreno se incrementó durante el curso de la fermentación a un valor final de 1.4 g/L (figura 100) . La cantidad total de isopreno producido durante fermentación de 50 horas fue 10.0 g. El pefil de productividad específica de isopreno con el tiempo dentro del biorreactor se muestra en la figura 101. El rendimiento molar de carbono utilizado que contribuyó a la producción de isopreno durante fermentación fue 1.1%. El por ciento en peso de rendimiento de isopreno a partir de glucosa fue 0.5%..
Ej emplo 13 Modelado de inlamabilidad y prueba de isopreno I. Resumen de modelado de inlamabilidad y prueba de isopreno Modelado y experimentos de inlamabilidad se llevaron a cabo para varias mezclas de hidrocarburo/ oxígeno/nitrógeno/agua/dióxido de carbono. Este modelado y prueba experimental estuvo destinada a definir curvas de inflamabilidad de isopreno y oxígeno/nitrógeno bajo vapor y concentraciones de monóxido de carbono especificadas a una presión y temperatura fijas. Una matriz de las condiciones del modelo se muestra en la tabla 4, y una matriz de los experimentos realizados se muestra en la tabla 5.
Tabla 4 Resumen de inflamabilidad de isopreno modelada Tabla 5 Resumen de pruebas de inflamabilidad de isopreno II. Descripción del modelo de temperatura de llama adiabática calculada (resultados del modelo de CAFT) Las temperaturas de llama adiabática calculadas (resultados del modelo de CAFT) junto con una temperatura de llama límite seleccionada para propagación de combustión se usaron para determinar la envoltura de inflamabilidad para isopreno. El programa de computadora usado en este estudio para calcular las temperaturas de llama es el software CEA (equilibrio químico con aplicaciones) del Glenn Research Center de la NASA.
Hay cinco pasos implicados en la determinación de la envoltura de inflamabilidad mediante el uso de un modelo de temperatura de llama adiabática para un mecanismo de combustión homogéneo (en donde tanto el combustible como el oxidante están en estado gaseoso) : selección de los reactivos deseados, selección de la condición de prueba, selección de la temperatura de llama límite, modificación de los reactivos, y construcción de una envoltura de inflamabilidad a partir de los cálculos.
En este primer paso, la selección de los reactivos deseados, se debe tomar una decisión en cuanto a la especie de reactivo que estará presente en el sistema y las cantidades de cada uno. En muchos casos, los programas de computadora usados para los cálculos tienen una lista de especies de reactivo y producto. Si cualquiera de los datos para la especie que ha de ser estudiada no se encuentran en el programa, se pueden obtener de otras fuentes tales como las tablas de JANAF o de la Internet. En este modelo actual, los datos para agua, nitrógeno, oxígeno y dióxido de carbono estaban presentes en la base de datos del programa. La base de datos del programa no tenía isopreno como una especie; por lo tanto, las propiedades termodinámicas fueron incorporadas manualmente.
El siguiente paso es decidir en qué condiciones iniciales de presión y temperatura tiene lugar el proceso de combustión. En este modelo, la presión fue 1 atmósfera (absoluta) y la temperatura fue 40°C, el punto de ebullición de isopreno.
La temperatura de llama límite para la combustión puede ser ya sea seleccionada con base en principios teóricos o determinada experimentalmente . Cada método tiene sus propias limitaciones.
Con base en estudios previos, las temperaturas de llama límite de hidrocarburos caen en el intervalo de 1000 K a 1500 K. Para este modelo, el valor de 1500 K se seleccionó. Esta es la temperatura a la cual la reacción de monóxido de carbono a dióxido de carbono (una reacción altamente exotérmica y constituye una proporción significativa de la energía de la llama) se vuelve autosustentable.
Una vez que se ha decidido por la temperatura de llama límite, los cálculos del modelo se llevan a cabo sobre la mezcla de reactivos dada (concentraciones de especie) y la temperatura de llama adiabática se determina. La propagación de la llama se considera que ha ocurrido únicamente si la temperatura es mayor que la temperatura de llama límite. La composición de la mezcla de reactivos es entonces modificad para crear conjuntos de datos para las mezclas de propagación y no propagación.
Este tipo de modelo muestra buen acuerdo con los límites de inflamabilidad experimentalmente determinados . Las regiones fuera de la envoltura derivada son no inflamables y las regiones dentro de ella son inflamables. La forma de la envoltura forma una nariz. La nariz de la envoltura está relacionada con la concentración de oxígeno limitante (LOC) para combustibles gaseosos.
III. Resultados de modelo de temperatura de llama adiabática calculada (resultados del modelo de CAFT) En las figuras 68 a 74 se grafican los resultados del modelo de CAFT para las series A a G, respectivamente. Las figuras grafican la temperatura de llama adiabática calculada (mediante el uso del programa CEA de la NASA) como una función de concentración de combustible (en peso) para varias relaciones (en peso) de oxígeno/nitrógeno. Las partes de la curva que están por arriba de 1500 K, la temperatura de llama límite seleccionada, contienen niveles de combustible suficientes para de propagación de llama. Los resultados pueden ser difíciles de interpretar en la forma presentada en las figuras 68 a 74. Además, la forma actual no conduce a comparación con los datos experimentales que generalmente se presentan en términos de por ciento en volumen.
El uso de la serie A como un ejemplo, los data n la figura 68 se pueden graficar en forma de una envoltura de inflamabilidad tradicional. Con el uso de la figura 68 y la lectura a través de la línea de temperatura de 1500 K en las ' ordenadas se puede determinar la concentración de combustible para esta temperatura de llama límite al dejar caer una tangente a la abscisa para cada curva (relación de oxígeno a nitrógeno) que interseca. Estos valores entonces pueden ser tabulados como por ciento en peso de combustible para un por ciento en peso dado de oxidante (figura 75A) . Después, al conocer la composición del combustible (100 % en peso de isopreno) y la composición del oxidante (contenido relativo de agua, oxígeno y nitrógeno) , se pueden establecer las cantidades molares.
De estas cantidades molares se puede calcular las concentraciones en por ciento en volumen. Las concentraciones en términos de por ciento en volumen se pueden graficar para generar la envoltura de inflamabilidad (figura 75B) . El área delimitada por la envoltura es el intervalo de explosividad y el área excluida es el intervalo de no explosividad. La "nariz" de la envoltura es la concentración de oxígeno limitante. Las figuras 76A y 76B contienen las concentraciones en volumen calculadas para la envoltura de inflamabilidad para la serie B generada a partir de los datos presentados en la figura 69. Un enfoque similar se puede usar sobre los datos presentados en las figuras 70-74.
IV. Equipo y procedimiento experimental de prueba de inflamabilidad La prueba de inflamabilidad fue conducida en un recipiente de alta presión de cuatro litros. El recipiente era de forma cilindrica con un diámetro interno de 15.24 cm y una altura interna de 21.90 cm. La temperatura del recipiente (y los gases internos) se mantuvo mediante el uso de calentadores externos que fueron controlados por un controlador PID. Para prevenir pérdidas de calor, se colocó lana de cerámica y aislamiento reflectivo alrededor del recipiente de presión. Termopares de tipo K se usaron para medir la temperatura del espacio de gas así como la temperatura del recipiente mismo. La figura 77 ilustra el recipiente de prueba.
Antes de ejecutar la prueba, el recipiente fue evacuado y purgado con nitrógeno para asegurarse que cualesquiera gases de pruebas previas fueran removidos. Después se produjo un vacío en el recipiente. La presión después de que se había hecho esto fue típicamente de alrededor de 0.06 ba (a) . Debido a la purga de nitrógeno, el gas responsable de esta presión inicial se supuso que era nitrógeno. Al usar presiones parciales, después se añadió agua, isopreno, nitrógeno y oxígeno en las cantidades apropiadas para lograr las condiciones de prueba en cuestión. Un ventilador de mezclado impulsado magnéticamente dentro del. recipiente aseguró el mezclado del contenido gaseoso. Se dejó mezclar los gases durante aproximadamente 2 minutos con el ventilador apagado aproximadamente 1 minuto antes del encendido .
El encendido estaba compuesto de una bobina de nicromo de 1.5 ohms y una fuente de voltaje de AC en un circuito regulador de tiempo. Con el uso de un osciloscopio , se determinó que 34.4 VAC fueron suministrados al encendido durante 3.2 segundos. Una corriente máxima de 3.8 amps ocurrió aproximadamente a la mitad hacia el ciclo de encendido. Por lo tanto, la potencia máxima fue 131 W y la energía total provista durante el ciclo de encendido fue aproximadamente 210 J.
Los datos de deflagración se adquirieron mediante el uso de un transductor de presión Validino DP215 de reluctancia variable conectado a un sistema de adquisición de datos. Una mezcla de gases se consideró que había deflagrado si el aumento de presión era más de o igual a 5%.
V. Resultados de la prueba de inflamabilidad La primera serie experimental (Serie 1) se llevó a cabo a 40°C y 0 kg/cm2 manométricos sin vapor. La ejecución de las pruebas a concentraciones variables de isopreno y oxígeno produjo la curva de inflamabilidad mostrada en la figura 78A. Los puntos de datos mostrados en esta curva son únicamente aquellos que delimitan la curva. Una lista detallada de todos los puntos de datos para esta serie se muestran en las figuras 80A y 80B.
La figura 78B resume los datos de explosibilidad mostrados en la figura 78A. La figura 78C es una comparación de los datos experimentales con los resultados de la envoltura de inflamabilidad predicha por el modelo de CAFT. El modelo concuerda muy bien con los datos experimentales .
Las discrepancias se pueden deber a la naturaleza no adiabática de la cámara de prueba y limitaciones del modelo. El modelo mira a un horizonte de tiempo infinito para la reacción de oxidación y no toma en consideración alguna limitación de cinética de reacción.
Además, el modelo es limitado por el número de especies químicas en equilibrio que están en tu base de datos y por lo tanto puede no predecir apropiadamente las especies pirolíticas. También, la envoltura de inflamabilidad desarrollada por el modelo usa un valor para una temperatura de llama límite (1500K) . La temperatura de llama límite puede estar en el intervalo de valores de ?,???? a 1,500K de acuerdo con la especie química de reacción. La naturaleza compleja de la especie química pirolítica formada a concentraciones de combustible por arriba del nivel estequiométrico de combustible/oxidante es una razón por la cual el modelo puede no predecir con exactitud el límite inflamable superior para este sistema.
La segunda serie experimental (Serie 2) se llevó a cabo a 40°C y 0 kg/cm2 manométricos con una concentración de vapor fija de 4%. Las pruebas ejecutadas a concentraciones variables de isopreno y oxígeno produjeron la curva de inflamabilidad mostrada en la figura 79A. Los puntos de datos mostrados en esta curva son únicamente aquellos que delimitan la curva. Una lista detallada de todos los puntos de datos para esta serie se muestran en la figura 81. Debido a la similitud entre los datos en la serie 1 únicamente los puntos clave del límite inflamable inferior, concentración de oxígeno limitante, y los límites inflamables superiores se probaron. La adición de 4% de vapor a la mezcla de prueba no cambió significativamente los límites clave de la envoltura de inflamabilidad. Cabe notar que concentraciones más altas de vapor/agua y/u otros inertantes pueden influir en la envoltura de inflamabilidad.
La figura 79B resume los puntos de datos de explosividad mostrados en la figura 79A. La figura 79C es una comparasion de los datos experimentales con los resultados de la envoltura de inflamabilidad predicha por el modelo de CAFT. El modelo concuerda muy bien con los datos experimentales. Las discrepancias se pueden deber a los mismos factores descritos en la serie 1.
V. Cálculo de límites de inflamabilidad de isopreno en aire a 3 atmósferas de presión Los métodos descritos en el ejemplo 13, partes I a IV también se usaron para calcular los límites de inflamabilidad de isopreno a una presión del sistema absoluta de 3 atmósferas y 40°C. Estos resultados se compararon con los del ejemplo 13, partes I a IV a una presión del sistema absoluta de 1 atmósfera y 40°C. Esta presión más alta se probó porque la envoltura de inflamabilidad se expande o crece más a medida que la presión del sistema se incrementa'. El límite de inflamabilidad superior es afectado es el más afectado, seguido por la composición de oxígeno limitante. El límite de inflamabilidad inferior es el menos afectado (véase, por ejemplo, "Boletín 627 - Flammability Characteristics of Combustible Gases and Vapors" escrito por Michael G. Zabetakis y publicado por la anterior US Bureau of Mines (1965) , que es incorporada aquí por referencia en su totalidad, en particular con respecto al cálculo de límites de inflamabilidad) .
En la figura 82, la temperatura de llama adiabática calculada es graficada como una función de concentración de isopreno (combustible) , expresada en por ciento en peso del combustible/nitrógeno/oxígeno total, en donde la presión del sistema fue inicialmente de 3 atmósferas. Las temperaturas de llama calculadas son muy similares a aquellas determinadas inicialmente en el sistema de 1 atmósfera (figura 83) . Como resultado, cuando las envolturas de inflamabilidad son generadas mediante el uso de los datos de inflamabilidad adiabática calculada, las curvas son muy similares (véase figuras 84 y 85) . Por lo tanto, con base en estos cálculos teóricos, un incremento de presión del sistema de 1 atmósfera a 3 atmósferas no da por resultado un incremento/ampliación de la envoltura de inflamabilidad significativo. Si se desea, estos resultados del modelo pueden ser validados mediante el uso de pruebas expe imentales (tales como la prueba experimental aquí descrita a una presión de 1 atmósfera) .
VII. Resumen de estudios de inflamabilidad Un modelo de temperatura adiabática calculada fue desarrollado para la envoltura de inflamabilidad del sistema de isopreno/oxígeno/nitrógeno/agua/dióxido de carbono a 40 ° C y 0 kg/cm2 manométricos Los resultados del modelo de CAFT que se desarrolló concordaron bien con los datos experimentales generados por las pruebas conducidas en este trabajo. Los resultados experimentales de las series 1 y 2 validaron los resultados del modelo de las series A y B .
A menos que se defina de otra manera, los significados de todos los términos técnicos y científicos usados aquí son aquellos comúnmente entendidos por un experto en la técnica al cual está dirigida esta invención. Singleton, et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, 2a. ed. , John iley y Sons, New York (1994), y Hale y Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology, Harper Perennial, N.Y. (1991) proveen a un experto un diccionario general de muchos de los términos usados en esta invención. Cabe entender que esta invención no se limita a la metodología, protocolos y reactivos particulares descritos, ya que éstos pueden variar. Un experto en la técnica también apreciará que cualesquiera métodos y materiales similares o equivalentes a los que aquí se describen también se pueden usar par poner en práctica o probar la invención.
Los encabezados provistos aquí no son limitaciones de los diversos aspectos o modalidades de la invención que se pueden tener por referencia a la especificación como un todo.
Para usarse aquí, a menos que se indique claramente de otra manera, el uso de los términos "un", "una" y similares se refiere a uno o más.
La referencia a "aproximadamente" un valor o parámetro aquí incluye (y describe) modalidades que son dirigidas a ese valor o parámetro como tales. Por ejemplo, descripción referente a "aproximadamente X" incluye descripción de "X." Intervalos numéricos son inclusivos de los números que definen el intervalo.
Cabe entender que los aspectos y modalidades de la invención aquí descrita incluyen "que comprende", "que consiste" y "que consiste esencialmente de" aspectos y modalidades.
Apéndice 1 Acidos nucleicos y polipéptidos de 1-desoxi-D-xilulosa-5-fosfato sintasa ilustrativos ATH: AT3G21500 (DXPSl) AT4G15560 (CLA1) AT5G11380 (DXPS3 ) OSA: 4338768 4340090 4342614 CME: CMF089C PFA: MAL13P1.186 TAN: TA20470 TPV: TP01_0516 ECO: b0420(dxs) ECJ: J 0410(dxs) ECE: Z0523(dxs) ECS: ECS0474 ECC: c0531(dxs) ECI: UTI89_C0443 (dxs) ECP: ECP_0479 ECV: APECOl_1590 (dxs) ECW: EcE24377A_0451 (dxs) ECX: EcHS_A0491 STY: STY0461(dxs) STT: t2441(dxs) SPT: SPA2301(dxs) SEC: SC0463(dxs) STM: STM0422(dxs) YPE: YP03177 (dxs) YPK: yl008(dxs) ???: YP_0754(dxs) ???: ???_2671 ???: ???_0911 ???: YPDSF_2812 YPS: ????0939 (dxs) ??? : YpsIP31758_3112 (dxs) SFL: SF0357(dxs) SFX: S0365(dxs) SFV: SFV_0385 (dxs) SSN: SSON_0397 (dxs) SBO: SBO_0314 (dxs) SDY : SDY_0310 (dxs) ECA: ECA1131(dxs) PLU: plu3887(dxs) BUC: BU 64(dxs) BAS: BUsg448(dxs) WBR: GLpl44(dxs) SGL: SG0656 KPN: KPN_00372 (dxs) BFL: Bfl238(dxs) BPN: BPEN_244 (dxs) HIN: HI1439(dxs) HIT: NTHI1691 (dxs) HIP: CGSHiEE 04795 HIQ: CGSHiGG_01080 HDU: HD0441(dxs) HSO: HS_0905 (dxs) PMU: PM0532(dxs) SU: MS1059 (dxs) APL: APL_0207 (dxs) XFA: XF2249 XFT: PD1293(dxs) XCC: XCC2434(dxs) XCB: XC_1678 XCV: XCV2764 (dxs) XAC: XAC2565(dxs) XOO: XOO2017(dxs) XOM: XOO_1900 (XOO1900) VCH: VC088.9 WU: W10_0315 WY: W0868 VPA: VP0686 VFI: VF0711 PPR: PBPRA0805 PAE: PA4044(dxs) PAU: PA14_11550 (dxs) PAP: PSPA7_1057 (dxs-) PPU: PP_0527(dxs) PST: PSPTO 0698 (dxs) PSB: Psyr_0604 PSP: PSPPH_0599 (dxs) PFL: PFL_5510 (dxs) PFO: Pfl_5007 PEN: PSEEN0600 (dxs) PMY: Pmen_3844 PAR: Psyc_0221 (dxs) PCR: Pcryo_0245 ACI: ACIAD3247 (dxs) SON: SO_1525(dxs) SDN: Sden_2571 SFR: Sfri_2790 SAZ: Sama_2436 SBL: Sbal_1357 SLO: Shew_2771 SHE: Shewmr4_2731 SHM : Shewmr7_2804 SH : Shewana3_2901 SHW: Sputw3181_2831 ILO: IL2138(dxs) CPS: CPS_1088 (dxs) PHA: PSHAa2366 (dxs) PAT: Patl_1319 SDE : Sde_3381 PIN: Pinq 2240 MAQ: Maqu_2438 MCA: MCA0817(dxs) FTU: FTT1018C (dxs) FTF: FTF1018C (dxs) FTW: FTW_0925 (dxs) FTL: FTL_1072 FTH : FTH_1047 (dxs) FTA: FTA_1131 (dxs) FTN: FTN_0896 (dxs) NOC: Noc_1743 AEH: Mlg_1381 HCH: HCH_05866 (dxs) CSA: Csal_0099 ABO: AB0_2166 (dxs) AHA: AHA_3321 (dxs) BCI: BCI_0275 (dxs) RMA: Rmag_0386 VOK: COSY_0360 (dxs) NME: NMB1867 NMA: NMA0589(dxs) NMC: MMC0352(dxs) NGO: NGO0036 CVI: CV_2692(dxs) RSO: RSc2221(dxs) REU: Reut A0882 REH: H16_A2732 (dxs) RME: Rmet_2615 BMA: BMAA0330 (dxs) BMV: BMASAVP1_1512 (dxs) BML: BMA10299_1706 (dxs) BMN: BMA10247_A0364 (dxs) BXE: Bxe_B2827 BUR : Bcepl8194_B2211 BCN: Bcen_4486 BCH: Bcen2424_3879 BAM : Bamb_3250 BPS: BPSS1762 (dxs) BPM : BURPS1710b_A0842 (dxs) BPL: BURPS1106A_A2392 (dxs) BPD: BURPS668_A2534 (dxs) BTE: BTH_I 10614 (dxs) BPE: BP2798(dxs) BPA: BPP2464(dxs) BBR: BB1912(dxs) RFR : Rfer_2875 POL: Bpro_1747 PNA: Pnap_1501 AJS: Ajs_1038 MPT: pe_A2631 HAR: HEAR0279 (dxs) MMS: mma_0331 NEU: NE1161(dxs) NET: Neut_1501 NMU: Nmul_A0236 EBA: ebA4439(dxs) AZO: azoll98(dxs) DAR: Daro_3061 TBD: Tbd_0879 MFA: Mfla_2133 HPY: HP0354(dxs) HPJ: jhp0328(dxs) HPA: HPAG1_0349 HHE: HH0608(dxs) HAC: Hac_0968 (dxs) WSU: WS1996 TDN: Tmden_0475 CJE: Cj0321(dxs) CJR: CJE0366(dxs) CJJ: CJJ81176_0343 (dxs) CJU: C8J_0298 (dxs) CJD: JJD26997_1642 (dxs) CFF: CFF8240_0264 (dxs) CCV: CCV52592_1671 (dxs) CCV52592_1722 CHA: CHAB381_1297 (dxs) CCO: CCC13826 1594 (dxs) ABU: Abu_2139 (dxs) NIS: NIS_0391 (dxs) SUN: SUN_2055 (dxs) GSU: GSU0686 (dxs-1) GSU1764 (dxs-2 ) GME: Gmet_193 Gmet_2822 PCA: Pcar_1667 ¦ PPD: Ppro_1191 Ppro_2403 DVU: DVU1350(dxs) DVL: Dvul_1718 DDE: Dde_2200 LIP: LI0408(dsx) DPS: DP2700 ADE: Adeh_1097 MXA: MXAN_4643 (dxs) SAT: SY _02456 SFU: Sfum_1418 PUB: SAR11_0611 (dxs) MLO: mlr7474 MES: Meso_0735 SME: SMC00972 (dxs) ATU: Atu0745(dxs) ATC: AGR_C_1351 RET: RHE_CH00913 (dxs) RLE: RL0973 (dxs) BME: BMEI1498 BMF: BAB1_0462 (dxs) BMS: BR0436(dxs) BMB: BruAbl_0458 (dxs) BOV: BOV_0443 (dxs) BJA: bll2651(dxs) BRA: BRAD02161 (dxs) BBT: BBta_2479 (dxs) RPA: RPA0952(dxs) RPB: RPB_4460 RPC: RPC_1149 RPD: RPD_4305 RPE: RPE_1067 N I: Nwi_0633 NHA: Nham_0778 BHE: BH04350(dxs) BQU: BQ03540(dxs) BBK: BARBAKC583_0400 (dxs) CCR: CC_2068 SIL : SPO0247(dxs) SIT: TM1040_2920 RSP: RSP_0254 (dxsA) RSP_1134 (dxs) JAN: Jann_0088 Jann_0170 RDE: RD1_0101 (dxs) RD1_0548 (dxs) MMR: Mmarl0_0849 HNE: HNE 1838 (dxs) ZMO: ZM01234(dxs) ZM01598(dxs) NAR: Saro_0161 SAL: Sala_2354 ELI: ELI_12520 GOX: GOX0252 GBE: GbCGDNIHl_0221 GbCGDNIHl_24 RRU: Rru_A0054 Rru_A2619 MAG: amb2904 MGM : Mmcl_1048 SUS: Acid_1783 BSU: BG11715(dxs) BHA: BH2779 BAN: BA4400(dxs) BAR: GBAA4400 (dxs) BAA: BA_4853 BAT: BAS4081 BCE: BC4176(dxs) BCA: BCE_4249 (dxs) BCZ: BCZK3930 (dxs) BTK: BT9727_3919 (dxs) BTL : BALH_3785 (dxs) BLI: BL01523(dxs) BLD: B1Í02598 (dxs) BCL: ABC2462(dxs) BAY: RBAM 022600 BPU: BPUM_2159 GKA: GK2392 GTN: GTNG_2322 LMO: lmol365 (tktB) LMF: LMOf2365_1382 (dxs) LIN: linl402 (tktB) LWE: lwel380 (tktB) LLA: L108911 (dxsA) L123365 (dxsB) LLC: LACR_1572 LACR_1843 LLM: llmg_0749 (dxsB) SAK: SAK_0263 LPL: lp_26.10 (dxs) LJO: LJ0406 LAC: LBA0356 LSL: LSL_0209 (dxs) LGA: LGAS_0350 STH: STH1842 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A4255 Bxe B0377 Bxe_B0739 Bxe_C0332 Bxe_C0574 Bxe_C0915 .
BVI: Bcepl808_0519 Bcepl808_1717 Bcepl808_2877 Bcepl808_3594 Bcepl808_4015 Bcepl808_5507 Bcepl808_5644 BUR: Bcepl8194_A3629 Bcepl8194_A5080 Bcepl8194_A5091 Bcepl8194_A6102 Beepl8194_B0263 Bcepl8194_B1439 Bcepl8194_C6652 Bcepl8194_C6802- Bcepl8194_C6874 Bcepl8194_C7118 Bcepl8194_C7151 Bcepl8194_C7332 BCN: Bcen_1553 Bcen_1599 Bcen_2158 Bcen_2563 Bcen_2998 Bcen_6289 BCH: Bcen2424_0542 Bcen2424_1790 Bcen2424_2772 Bcen2424_5368 Bcen2424_6232 Bcen2424_6276 BAM: Bamb_0447 Bamb_1728 Bamb_2824 Bamb_4717 Bamb_5771 Bamb_5969 BPS: BPSL1426 BPSL1535 (phbA) BPSL1540 BPM: BURPS1710b_2325 (bktB) BURPS 1710b_2330 (phbA) BURPS1710b_2453 (atoB-2) BPL: BURPS1106A_2197 (bktB) BURPS1106A_2202 (phbA) BPD: BURPS668_2160 (bktB) BURPS668_2165 (phbA) BTE: BTH_I2144 BTH_I2256 BTH_I2261 PNU: Pnuc_0927 BPE: BP0447 BP0668 BP2059 BPA: BPP0608 BPP1744 BPP3805 BPP4216 BPP4361 BBR: BB0614 BB3364 BB4250 BB4804 BB4947 RFR: Rfer_0272 Rfer_1000 Rfer_1871 Rfer_2273 Rfer_2561 Rfer 2594 Rfer 3839 POL: Bpro_1577 Bpro_2140 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Smal450 SMc03879 (phbA) SMD: Smed_0499 Smed_3117 Smed_5094 Smed_5096 ATU: Atu2769 (atoB) Atu3475 ATC: AGR_C_5022 ( hbA) AGR_L_2713 RET: RHE_CH04018 (phbAch) RHE_PC00068 (ypc00040) RHE_ PF00014 (phbAf) RLE: RL4621 (phaA)' pRL100301 pRL120369 BME: BMEI0274 BMEII0817 BMF: BAB1_1783 (phbA-1) BAB2_0790 (phbA-2) BMS: BR1772 (phbA-1) BRA0 48 (phbA-2 ) BMB: BruAbl_1756 (phbA-1) BruAb2_0774 (phbA-2) BOV: BOV 1707(phbA-l) OAN: Oant_1130 Oant_3107 Oant_3718 Oant_4020 BJA: bll0226 (atoB) bll3949 bll7400 bll7819 blr3724 (phbA) BRA: BRADO0562 (phbA) BRADO0983 (pimB) BRADO3110 BRAD03134 (atoB) BBT: BBta_3558 BBta_3575 (atoB) BBta_5147 (pimB) BBta_7072 (pimB) BBta_7614 (phbA) RPA: RPA0513 (pcaF) RPA0531 RPA3715 (pimB) RPB: RPB_0509 RPB_0525 RPB_1748 RPC: RPC_0504 RPC_0636 RPC_06 1 RPC_0832 RPC_1050 RPC_2005 RPC_2194 RPC_2228 RPD: RPD_0306 RPD_0320 RPD_3105 RPD_3306 RPE : RPE_0168 RPE_0248 RPE_3827 NWI: Nwi_3060 XAU: Xaut_3108 Xaut_4665 CCR: CC_0510 CC_0894 CC_3462 SIL: SP00142 (bktB) SPO0326 (phbA) 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Clos_0084 Clos_0258 CHY: CHY_1288 CHY_1355 (atoB) CHY_1604 CHY_1738 DSY: DSY0632 DSY0639 DSY1567 DSY1710 DSY2402 DSY3302 DRM: Dred_0400 Dred_1491 Dred_1784 Dred_1892 S O: Swol_0308 Swol_0675 Swol_0789- Swol_1486 Swol_1934 Swol_2051 TTE: TTE0549 (paaJ) MTA: Moth_1260 MTU: Rvll35A Rvl323 (fadA4) Rv3546 (fadA5) MTC: T1365 (phbA) MBO: Mbll67 Mbl358 ( fadA4 ) Mb3576 (fadA5) Mb3586c (fadA6) BB: BCG_1197 BCG_1385 ( fadA4 ) BCG_3610 (fadA5) BCG_3620c (fadA6) LE: ML1158 (fadA4) MPA: MAP2407C (fadA3) MAP2436c ( fadA4 ) MAV: MAV_1544 MAV_1573 MAV_1863 MAV_5081 MSM: MS EG_2224 MSMEG_4920 MUL: MUL_0357 MVA: Mvan_1976 Mvan_1988 Mvan_4305 Mvan_4677 van_4891 MGI: Mflv_1347 Mflv_1484 Mflv_2040 Mflv_2340 Mflv_4356 Mflv_4368 MMC: Mmcs_1758 Mmcs_1769 Mmcs_3796 Mmcs_3864 MKM: Mkms_0251 Mkms_1540 Mkms_1805 Mkms_1816 Mkms_2836 Mkms_3159 Mkms_3286 Mkms_3869 Mkms_3938 Mkms_4227 Mkms_4411 Mkms_4580 Mkms_4724 Mkms_4764 Mkms_4776 MJL: Mjls_0231 Mjls_1739 Mjls_1750 Mjls_2819 Mjls_3119 Mjls_3235 Mjls_3800 Mjls_3850 Mjls_4110 Mjls_4383 Mjls_4705 Mjls_4876 Mjls_5018 Mjls_5063 Mjls_5075 CGL: NCgl2309 (cgl2392) CGB: cg2625 (pcaF) CEF: CE0731 CE2295 CJK: jkl543 (fadA3) NFA: nfal0750 (fadA4) RHA: RHAl_ro01455 RHAl_ro01623 RHAl_ro01876 RHAl_ro02517 (catF) RHAl_ro03022 RHAl_ro03024 RHAl_ro03391 RHA_ro03892 RHAl_ro04599 RHAl_ro05257 RHAl_ro08871 SCO: SC05399 (SC8F4.03) SMA: SAV1384 (fadA5) SAV2856 (fadAl) ART: Arth_1160 Arth_2986 Arth_3268 Arth_4073 NCA: Noca_1371 Noca_1797 Noca_1828 Noca_2764 Noca_4142 TFU: Tfu_1520 Tfu_2394 FRA: Francci3_3687 FRE: Franeanl_1044 Franeanl_2711 Franeanl_2726 Franeanl_3929 Franeanl_4037 Franeanl_4577 FAL: FRAAL2514 FRAAL2618 FRAAL5910 (atoB) ACE : Acel_0626 Acel_0672 SE : SACE_1192 (mmgA) SACE_2736 (fadA6) SACE_4011 (catF) SACE_6236 (fadA4) STP: Strop_3610 SAQ: Sare_1316 Sare_3991 RXY: Rxyl_1582 Rxyl_1842 Rxyl_2389 Rxyl_2530 FNU: FN0495 BGA: BGOllO(fadA) BAF : BAPKO_0110 ( fadA) LIL: LA0457 (thiLl) LA0828 (thiL2 ) LA4139(fadA) LIC: LIC10396 (phbA) LBJ: LBJ_2862 (paaJ-4) LBL: LBL_0209 (paaJ-4) SYN: slrl993 (phaA) SRU: SRU_1211 (atoB) SRU_1547 CHU: CHU_1910 (atoB) GFO: GFO_1507 (atoB) FJO: Fjoh_4612 FPS: FP0770 FP1586 FP1725 RRS: RoseRS_3911 RoseRS_4348 RCA: Rcas_0702 Rcas_3206 HAU: Haur_0522 DRA: DR_1072 DR_1428 DR_1960 DR_2480 DR_A0053 DGE: Dgeo_0755 Dgeo_1305 Dgeo_1441 Dgeo_1883 TTH : TTC0191 TTC0330 TTJ: TTHA0559 TME: Tmel_1134 FNO: Fnod_0 14 PMO: Pmob_0515 HMA: rrnAC0896 (acaB3) rrnAC2815 (aca2 ) rrnAC3497 (yqeF) rrnB0240 (acal) rrnB0242 (acaB2 ) rrnB0309 (acaBl) TAC: Ta0582 TVO: TV 0649 PTO: PTO1505 APE: APE_2108 SSO: SS02377 (acaB-4) STO: ST0514 SAI: Saci_0963 Saci_1361 (acaBl) MSE: Msed_0656 PAI: PAE1220 PIS: Pisl_0029 Pisl_1301 PCL: Pcal_0781 PAS: Pars_0309 Pars_1071 CMA: Cmaq_1941 Acidos nucleicos y polipéptidos de HMG-CoA sintasa ilustrativos HSA: 3157(HMGCS1) 3158(HMGCS2) PTR: 457169 (HMGCS2) 461892 (HMGCS1) MCC: 702553 (HMGCS1) 713541 (HMGCS2 ) MMU: 15360 (Hmgcs2) 208715 (Hmgcsl) RNO: 24450 (Hmgcs2) 29637 (Hmgcsl) CFA: 479344 (HMGCS1) 607923 (HMGCS2) BTA: 407767 (HMGCS1) SSC: 397673 (CH242-38B5.1) GGA: 396379 (HMGCS1) XLA: 380091 (hmgcsl) 447204 (MGC80816) DRE: 394060 (hmgcsl) SPU: 578259 (LOC578259) DME: Dmel_CG4311 (Hmgs) CEL: F25B4.6 ATH: AT4G11820 (BAP1) OSA: 4331418 4347614 CME : CMM189C SCE: YML126C (ERG13) AGO : AGOS_ADL356C PIC: PICST_83020 CAL: Ca019_7312 (Ca019.7312) CGR : CAGL0H04081g SPO: SPAC4F8.14c (hcs) MGR: GG_01026 A I: A 4923.2 AFM: AFUA_3G10660 AFUA_8G07210 AOR: AO090003000611 AO090010000487 CNE: CNC05080 CNG02670 U A : UM05362.1 ECU: ECU10_0510 DDI: DDBDRAFT_0217522 DDB_0219924 (hgsA) TET: TTHERM_00691190 TBR: Tb927.8.6110 YPE: YP01457 YPK: y2712(pksG) YPM: YP_1349 (pksG) YPA: YPA_0750 YPN: YPN_2521 YPP: YPDSF_1517 YPS: YPTB1475 CBD: COXBU7E912_1931 TCX: Tcr_1719 DNO: DNO_0799 BMA: BMAA1212 BPS: BPSS1002 BPM: BURPS1710b_A2613 BPL: BURPS1106A_A1384 BPD : BURPS668_A1470 BTE: BTH_I 11670 MXA: MXAN_3948 (tac) MXA _4267 (mvaS) BSU: BG10926 (pksG) OIH: OB2248 SAU: SA2334 (mvaS) SAV: SAV2546 (mvaS) SAM: MW2467(mvaS) SAR : SAR2626 (mvaS) SAS: SAS2432 SAC: SACOL2561 SAB: SAB2420 (mvaS) SAA: SAUSA300_2484 SAO: SAOUHSC_02860 SAJ: SaurJH9_2569 SAH: SaurJHl_2622 SEP: SE2110 SER: SERP2122 SHA: SH0508 (mvaS) SSP: SSP0324 LMO: lmol415 LMF: LMOf2365_1434 (mvaS) LIN: linl454 LWE: lwel432 (mvaS) LLA: L13187 (hmcM) LLC: LACR_1666 LLM: llmg_0929 (hmcM) SPY: SPy_0881 (mvaS.2) SPZ: M5005_Spy_0687 (mvaS.1) SPM: spyM18_0942 (mvaS2) SPG: SpyM3_0600 (mvaS.2) SPS : SPsl253 SPH: MGAS10270_Spy0745 (mvaSl) SPI : MGAS10750_Spy0779 (mvaSl) SPJ: MGAS2096_Spy0759 (mvaSl) SPK: MGAS9429_Spy0743 (mvaSl) SPF: SpyM51121 (mvaS) SPA: M6_Spy0704 SPB: M28_Spy0667 (mvaS .1) SPN: SP_1727 SPR: sprl571 (mvaS) SPD: SPD_1537 (mvaS) SAG: SAG1316 SAN: gbsl386 SAK: SAK_1347 SMU: SMU.943C STC: str0577 (mvaS) STL: stu0577 (mvaS) STE: STER_0621 SSA: SSA_0338 (mvaS) SSU: SSU05_1641 SSV: SSU98_1652 SGO: SGO_0244 LPL: lp_2067 (mvaS) LJO: LJ1607 LAC: LBA0628 (hmcS) LSA: LSA1484 (mvaS) LSL: LSL_0526 LDB : Ldb0881 (mvaS) LBU: LBUL_0806 LBR: LVIS_1363 LCA: LSEI_1785 LGA: LGAS_1372 LRE: Lreu_0676 PPE: PEPE_0868 EFA: EF1363 OOE: OEOE_0968 LME : LEUM 1184 NFA: nfa22120 SEN: SACE_4570 (pksG) BBU: BB0683 BGA: BG0706 BAF : BAPKO_0727 FJO: Fjoh_0678 HAL: VNG1615G(mvaB) HMA: rrnAC1740 (mvaS) H A: HQ2868A(mvaB) NPH: NP2608A(mvaB_l) NP4836A (mvaB_2 ) Acidos nucleicos ?_ polipépt idos de hidroximetilglutaril-CoA reductasa ilustrativos HSA: 3156 (HMGCR) PTR: 471516 (HMGCR) MCC: 705479 (HMGCR) MMU: 15357 (Hmgcr) RNO: 25675 (Hmgcr) CFA : 479182 (HMGCR) BTA: 407159 (HMGCR) GGA: 395145 (RCJMB04_14m24) SPU: 373355 (LOC373355) DME : Dmel_CG10367 (Hmgcr) CEL: F08F8.2 OSA: 4347443 SCE: YLR450W(HMG2) YML075C (HMG1) AGO: AGOS_AER152W CGR: CAGL0L11506g SPO: SPCC162.09c (hmgl) ANI: AN3817.2 AF : AFUA_1G11230 AFUA_2G03700 AOR: AO090103000311 AO090120000217 CNE: CNF04830 UMA: U 03014.1 ECU: ECU10_1720 DDI: DDB_0191125 (hmgA) DDB_0215357 (hmgB) TBR: Tb927.6.4540 TCR: 506831.40 509167.20 LMA: LmjF30.3190 VCH: VCA0723 VCO: VC0395_0662 WU: W2_0117 WY: WA0625 VPA: VPA0968 VFI: VFA0841 PAT: Patl_0427 CBU: CBU_0030 CBU_0610 .
CBD: COXBU7E912_0151 COXBU7E912_0622 (hmgA) TCX: Tcr_1717 DNO: DNO 0797 CVI : CV_1806 SUS: Acid_5728 Acid_6132 SAU: SA2333 (mvaA) SAV: SAV2545 (mvaA) SAM : MW2466 (mvaA) SAB: SAB2419C (mvaA) SEP : SE2109 LWE: lwe0819 (mvaA) LLA: L10433 (mvaA) LLC: LACR_1664 LLM: llmg_0931 (mvaA) SPY: SPy_0880 (mvaS.1) SPM: spyM18_0941 (mvaSl) SPG: SpyM3_0599 (mvaS .1 ) SPS : SPS1254 SPH: MGAS10270_Spy0744 SPI : MGAS10750_Spy0778 SPJ: MGAS2096_Spy0758 SPK: MGAS9429_Spy0742 SPA: M6_Spy0703 SPN: SP_1726 SAG: SAG1317 SAN: gbsl387 STC: str0576 (mvaA) STL: stu0576 (mvaA) STE: STER_0620 SSA: SSA_0337 (mvaA) LPL: lp_0447 (mvaA) LJO: LJ1608 LSL: LSL_0224 LBR: LVIS_0450 LGA: LGAS_1373 EFA: EF1364 NFA: nfa22110 BGA: BG0708(mvaA) SRU: SRU_2422 FPS: FP2341 MMP: MMP0087 (hmgA) MMQ: MmarC5_1589 MAC: MA3073(hmgA) MBA: Mbar_A1972 MMA: MM_0335 MBU: Mbur_1098 MHU: Mhun_3004 MEM: Memar_2365 MBN: Mboo_0137 MTH: MTH562 MST: Msp_0584 (hmgA) MSI: Msm_0227 MKA: MK0355(HMG1) AFU: AF1736(mvaA) HAL: VNG1875G(mvaA) HMA: rrnAC3412 (mvaA) H A: HQ3215A (hmgR) NPH: NP0368A(mvaA_2) NP2422A(mvaA_l) TAC: Ta0406m TVO: TV 1168 PTO: PT01143 PAB: PAB2106 (mvaA) PFU: PF1848 TKO: TK0914 RCI: RCIX1027 (hmgA) RCIX376 (hmgA) APE: APE_1869 IHO: Igni_0476 HBU: Hbut_1531 SSO: SSO0531 STO: ST1352 SAI: Saci_1359 PAI: PAE2182 PIS: Pisl_0814 PCL: Pcal_1085 PAS: Pars 0796 Acidos nucleicos y polipéptidos de mevalonato cinasa ilustrativos HSA: 4598 (MVK) MCC: 707645 (MVK) MMU: 17855 (Mvk) R O: 81727 (Mvk) CFA: 486309 (MVK) BTA: 505792 (MVK) GGA: 768555 (MVK) DRE: 492477 (zgc: 103473) SPU: 585785 (LOC585785) DME: Dmel_CG33671 OSA: 4348331 SCE: YMR208 (ERG12) AGO: AGOS_AER335W PIC: PICST_40742 (ERG12) CGR: CAGL0F03861g SPO: SPAC13G6.11C MGR: MGG_06946 A I: A 3869.2 AFM: AFUA_4G07780 AOR: AO090023000793 CNE: CNK01740 ECU: ECU09_1780 DDI : DDBDRAFT 0168621 TET: TTHERM_00637680 TBR: Tb927. .4070 TCR: 436521.9 509237.10 LMA: LmjF31.0560 CBU: CBU_0608 CBU_0609 CBD: COXBU7E912_0620 (mvk) LPN: lpg2039 LPF : lpl2017 LPP: lpp2022 BBA: Bdl027(lmbP) Bdl630 (mvk) MXA: MXA _5019 (mvk) OIH: OB0225 SAU: SA0547 (ravaKl) SAV : SAVO590 (mvaKl ) SAM: MW0545 (mvaKl) SAR: SAR0596 (mvaKl) SAS: SAS0549 SAC: SACOL0636 (mvk) SAB: SAB0540 (mvaKl) SAA: SAUSA300_0572 (mvk) SAO: SAOUHSC_00577 SEP: SE0361 SER: SERP0238 (mvk) SHA: SH2402 (mvaKl) SSP: SSP2122 LMO: lmoOOlO LMF: LMOf2365_0011 LIN: linOOlO L E: lweOOll (mvk) LLA: L7866 (yeaG) LLC: LACR_0454 LL : llmg_0425 (mvk) SPY: SPy_0876 (mvaKl) SPZ: M5005_Spy_0682 (mvaKl) SPM: spyM18_0937 (mvaKl) SPG: SpyM3_0595 (mvaKl) SPS : SPs 1258 SPH: MGAS10270_Spy0740 (mvaKl) SPI : MGAS10750_Spy0774 (mvaKl) SPJ: MGAS2096_Spy0753 (mvaKl) SPK: MGAS9429_Spy0737 (mvaKl) SPF: SpyM51126 (mvaKl) SPA: M6_Spy0699 SPB: M28_Spy0662 (mvaKl) SPN: SP_0381 SPR: spr0338 (mvk) SPD: SPD_0346 (mvk) SAG: SAG1326 SAN: gbsl396 SAK: SAK 1357 (mvk) SMU: SMU.181 STC: str0559 (mvaKl) STL: stu0559 (mvaKl) STE: STER_0598 SSA: SSA_0333 (mvaKl] SSU: SSU05_0289 SSV: SSU98_0285 SGO: SGO_0239 (mvk) LPL: lp_1735 (mvaKl) LJO: LJ1205 LAC: 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YMR220W(ERG8) AGO: AG0S_AER354 PIC: PICST_52257 (ERG8) CGR: CAGL0F03993g SPO: SPAC343.01C MGR: MGG_05812 A I: AN2311.2 AFM: AFUA_5G10680 AOR: AO090010000471 CNE: CNM00100 UMA: U 00760.1 DDI : DDBDRAFT_184512 TBR: Tb09.160.3690 TCR: 507913.20 508277.140 LMA: LmjF15.1460 MXA: MXA _5017 OIH: OB0227 SAU: SA0549 (mvaK2) SAV: SAV0592 (mvaK2) SAM: MW0547 (mvaK2) SAR : SARO598 (mvaK2 ) ¦ SAS: SAS0551 SAC: SACOL0638 SAB: SAB0542 (mvaK2) SAA: SAUSA300_0574 SAO: SAOUHSC_00579 SAJ: SaurJH9_0615 SEP: SE0363 SER: SERP0240 SHA: SH2400 (mvaK2 ) SSP: SSP2120 LMO: lmo0012 LMF: L Of2365_0013 LIN: lin0012 L E: lwe0013 LLA: L10014 (yebA) LLC: LACR_0456 LLM: llmg_0427 SPY: SPy_0878 (mvaK2) SPZ: M5005_Spy_0684 (mvaK2) SPM: spyM18_0939 SPG: SpyM3_0597 (mvaK2) SPS : SPS1256 SPH: MGAS10270_Spy0742 (mvaK2 ) SPI : MGAS10750_Spy0776 (mvaK2) SPJ: MGAS2096_Spy0755 (mvaK2) SPK: MGAS9429_Spy0739 (mvaK2) SPF: SpyM51124 (mvaK2) SPA: M6_Spy0701 SPB: M28_Spy0664 (mvaK2) SPN: SP_0383 SPR: spr0340 (mvaK2) SPD: SPD_0348 (mvaK2) SAG: SAG 1324 SAN: gbsl394 SAK: SAK_1355 SMU: SMU.938 STC: str0561 (mvaK2) STL: stu0561 (mvaK2) STE: STER_0600 SSA: SSA_0335 (mvaK2) SSU: SSU05_0291 SSV: SSU98_0287 SGO: SGO_0241 LPL: lp_1733 (mvaK2) LJO: LJ1207 LAC: LBA1169 LSA: LSA0906 (mvaK2) LSL : LSL_0683 LDB : Ldb0997 (mvaK) LBU: LBUL_0904 LBR : LVIS_0860 LCA: LSEI_1092 LGA: LGAS_1035 LRE: Lreu_0913 PPE: PEPE_0925 EFA: EF0902 NFA: nfa22090 BGA: BG0710 BAF: BAPKO 0731 NPH: NP2852A SSO: SS02988 STO: ST0978 SAI : Saci 1244 Acidos nucleicos polipéptidos de difosfomevalonato descarboxilasa ilustrativos HSA: 4597 (MVD) PTR: 468069 (MVD) MCC: 696865 (MVD) MMU: 192156 (Mvd) R O: 81726 (Mvd) CFA: 489663 (MVD) GGA: 425359 (MVD) DME: Dmel_CG8239 SCE: YNR043 (MVD1) AGO: AGOS_AGL232C PIC: PICST_90752 CGR: CAGL0C03630g SPO: SPAC24C9.03 MGR: MGG_09750 ANI: AN4414.2 AFM: AFUA_4G07130 AOR: AO090023000862 CNE: CNL04950 UMA: UM05179.1 DDI : DDBDRAFT_0218058 TET: TTHERM_00849200 TBR: TblO.05.0010 Tbl0.61.2745 TCR: 507993.330 511281.40 LMA: Lmj.F18.0020 CBU: CBU_0607 (mvaD) CBD: COXBU7E912_0619 (mvaD) LPN: lpg2040 LPF: lpl2018 LPP: lpp2023 TCX: Tcr_1734 DNO : DNO_0504 (mvaD) BBA: Bdl629 MXA: MXA _5018 (mvaD) OIH: OB0226 SAU: SA0548(mvaD) SAV: SAV0591 (mvaD) SAM: M 0546 (mvaD) SAR: SAR0597 (mvaD) SAS: SAS0550 SAC: SACOL0637 (mvaD) SAB: SAB0541 (mvaD) SAA : SAUSA300_0573 (mvaD) SAO: SAOUHSC 00578 SAJ: SaurJH9_0614 SAH: SaurJHl_0629 SEP: SE0362 SER: SERP0239 (mvaD) SHA: SH2401(mvaD) SSP: SSP2121 LMO: lmoOOll L F: LMOf2365_0012 (mvaD) LIN: linOOll LWE: lwe0012 (mvaD) LLA: L9089(yeaH) LLC: LACR_0455 LLM: llmg_0426 (mvaD) SPY: SPy_0877 (mvaD) SPZ: M5005_Spy_0683 (mvaD) SPM: spyM18_0938 (mvd) SPG: SpyM3_0596 (mvaD) SPS: SPS1257 SPH: MGAS10270_Spy0741 (mvaD) SPI: MGAS10750_Spy0775 (mvaD) SPJ: MGAS2096_Spy0754 (mvaD) SPK: MGAS9429_Spy0738 (mvaD) SPF: SpyM51125 (mvaD) SPA: M6_Spy0700 SPB: M28_Spy0663 (mvaD) SPN: SP_0382 SPR: spr0339 (mvdl) SPD: SPD_0347 (mvaD) SAG : SAG1325 (mvaD) SAN: gbsl395 SAK: SAK_1356 (mvaD) SMU: SMU.937 STC: str0560 (mvaD) STL: stu0560 (mvaD) STE: STER_0599 SSA: SSA_0334 (mvaD) SSU: SSU05_0290 SSV: SSU98_0286 SGO: SGO_0240 (mvaD) LPL: lp_1734 (mvaD) LJO: LJ1206 LAC: LBA1168 (mvaD) LSA: LSA0907 (mvaD) LSL: LSL_0684 LDB: Ldb0998 (mvaD) LBU: LBUL_0905 LBR: LVIS_0859 LCA: LSEI_1492 LGA: LGAS_1034 LRE: Lreu 0914 PPE: PEPE_0926 EFA: EF0903(mvaD) LME: LEUM_1386 NFA: nfa22080 BBU: BB0686 BGA: BG0709 BAF: BAPKO_0730 GFO: GFO_3632 FPS: FP0310 (mvaD) HAU: Haur_1612 HAL : VNG0593G(dmd) HMA: rrnAC1489 (dmd) HWA: HQ1525A(mvaD) NPH: NP1580A(mvaD) PTO: PTO0478 PT01356 SSO: SS02989 STO: ST0977 SAI: Saci_1245 (mvd) MSE : Msed 1576 Acidos nucleicos y polipéptidos de isopentenil-difosfato Delta-isomerasa (IDI) ilustrativos HSA: 3422 (IDI1) 91734 (IDI2) PTR : 450262 (IDI2) 450263 (IDI1) MCC: 710052 (LOC710052) 721730 (LOC721730) MMU: 319554 (Idil) R O: 89784 (Idil) GGA: 420459 (IDI1) XLA: 494671 (LOC494671) XTR: 496783 (idi2) SPU: 586184 (LOC586184) CEL: K06H7.9 (idi-1) ATH: AT3G02780 (IPP2) OSA: 4338791 4343523 CME: CMB062C SCE: YPL117C (IDI1) AGO: AGOS_ADL268C PIC: PICST_68990(IDI1) CGR: CAGL0J06952g SPO: SPBC106.15 (idil) A I: A 0579.2 AFM : AFUA_6G11160 AOR: AO090023000500 CNE: CNA02550 UMA: UM04838.1 ECU: ECU02_0230 DDI: DDB_191342 (ipi) TET: TTHERM_00237280 TTHERM_00438860 TBR: Tb09.211.0700 TCR: 408799.19 510431.10 LMA: LmjF35.5330 EHI: 46.t00025 ECO: b2889(idi) ECJ: JW2857(idi) ECE: Z4227 ECS: ECS3761 ECC: C3467 ECI: UTI89_C3274 ECP: ECP_2882 ECV: APEC01_3638 ECW: EcE24377A_3215 (idi) ECX: EcHS_A3048 STY : STY3195 STT: t2957 SPT: SPA2907(idi) SEC: SC2979(idi) STM: STM3039(idi) SFL: SF2875(idi) SFX: S3074 SFV: SFV_2937 SSN: SSON_3042 SSON_3489 (yhfK) SBO: SBO_3103 SDY: SDY_3193 ECA: ECA2789 PLU: plu3987 ENT: Ent638_3307 SPE: Spro_2201 VPA: VPA0278 VFI: VF0403 PPR: PBPRA0469 (mvaD) PEN: PSEEN4850 CBU: CBU_0607 (mvaD) CBD: COXBU7E912_0619 (mvaD) LPN: lpg2051 LPF: lpl2029 LPP: lpp2034 TCX: Tcr_1718 HHA: Hhal_1623 DNO: DNO_0798 EBA: ebA5678 p2A143 DVU: DVU1679(idi) DDE: Dde_1991 LIP: LI1134 BBA: Bdl626 AFW: Anael09_4082 MXA: MXAN_5021 (fni) RPR: RP452 RTY: RT0439(idi) RCO: RC0744 RFE: RF 0785 (fni) RBE: RBE_0731 (fni) RAK: A1C_04190 RBO: A1I_04755 RCM: A1E_02555 RRI: A1G_04195 MLO: mlr6371 RET: RHE_PD00245 (ypd00046) XAU: Xaut_4134 SIL: SPO0131 SIT: TM1040_3442 RSP: RSP_0276 RSH: Rsphl7029_1919 RSQ: Rsphl7025_1019 JAN: Jann_0168 RDE: RD1_0147 (idi) DSH : Dshi_3527 BSU: BG11440 (ypgA) BAN: BA1520 BAR: GBAA1520 BAA: BA_2041 BAT: BAS1409 BCE: BC1499 BCA: BCE_1626 BCZ: BCZK1380 (fni) BCY: Bcer98 1222 BTK: BT9727_1381 (fni) BTL: BALH_1354 BLI: BL02217(fni) BLD: B1Í02426 BAY: RBAM_021020 (fni) BPU: BPUM_2020 (fni) OIH: OB0537 SAU: SA2136(fni) SAV: SAV2346(fni) SAM: MW2267(fni) SAR: SAR2431(fni) SAS: SAS2237 SAC: SACOL2341 (fni) SAB: SAB2225C (fni) SAA: SAUSA300_2292 (fni SAO: SAOUHSC_02623 SEP: SE1925 SER: SERP1937 (fni-2) SHA: SH0712(fn ) SSP: SSP0556 LMO: lmol383 LMF: LMOf2365_1402 (fni LIN: linl420 L E: lwel399 (fni) LLA: L11083 (yebB) LLC: LACR_0457 LLM: llmg_0428 (fni) SPY: SPy_0879 SPZ: M5005_Spy_0685 SPM: spyM18_0940 SPG: SpyM3_0598 SPS: SPS1255 SPH: MGAS10270_Spy0743 SPI : MGAS10750_Spy0777 SPJ: MGAS2096_Spy0756 SPK: MGAS9429_Spy0740 SPF: SpyM51123 (fni) SPA: M6_Spy0702 SPB: M28_Spy0665 SPN: SP_0384 SP : spr0341 (fni) SPD: SPD_0349 (fni) SAG: SAG1323 SAN: gbsl393 SAK: SAK_1354 (fni) SMU: SMU.939 STC: str0562 (idi) STL: stu0562 (idi) STE : STER_0601 SSA: SSA_0336 SGO: SGO_0242 LPL: lp_1732 (idil) LJO: LJ1208 LAC: LBA1171 LSA: LSA0905(idi) LSL : LSL_0682 LDB: Ldb0996(fni) LBU: LBUL_0903 LBR: LVIS_0861 LCA: LSEI_1493 LGA: LGAS_1036 LRE: Lreu_0912 EFA: EF0901 OOE: OEOE_1103 STH: STH1674 CBE: Cbei_3081 DRM: Dred_0474 SWO: Swol_1341 MTA: Moth_1328 MTU : Rvl745c(idi) MTC: MT1787(idi) MBO : Mbl774c (idi) MBB: BCG_1784c (idi) MPA: MAP3079C MAV: MAV 3894 (fni) MSM: MSMEG_1057 (fni) MSMEG_2337 ( fni ) MUL: MUL_0380 (idi2) MVA: Mvan_1582 Mvan_2176 MGI: Mflv_1842 Mflv_4187 MMC: Mmcs_1954 MKM: Mkms_2000 MJL: Mjls_1934 CGL: NCgl2223 (cgl2305) CGB: cg2531(idi) CEF: CE2207 CDI: DIP1730(idi) NFA: nfal9790 nfa22100 RHA: RHAl_ro00239 SCO: SCO6750 (SC5F2A.33c) SMA: SAV1663(idi) LXX: Lxx23810 (idi) CMI : CMM_2889 (idiA) AAU: AAur_0321 (idi) PAC: PPA2115 FRA: Francci3_4188 FRE: Franeanl_5570 FAL: FRAAL6504 (idi) KRA: rad_3991 SEN: SACE_2627 (idiB_2) SACE_5210 (idi) STP: Strop_4438 SAQ: Sare_4564 Sare_4928 RXY: Rxyl_0400 BBU: BB0684 BGA: BG0707 SYN: S111556 SYC: syc2161_c SYF: Synpcc7942_1933 CYA: CYA_2395 (fni) CYB: CYB_2691 (fni) TEL: tlll403 ANA: all4591 AVA: Ava_2461 Ava_B0346 TER: Tery_1589 SRU: SRU_1900 (idi) CHU: CHU_0674 (idi) GFO: GFO_2363 (idi) FJO: Fjoh_0269 FPS: FP1792(idi) CTE: CT0257 CCH: Cag_1445 CPH: Cpha266_0385 PVI: Cvib_1545 PLT: Plut_1764 RRS: RoseRS_2437 RCA: Rcas 2215 HAU: Haur_4687 DRA: DR_1087 DGE: Dgeo_1381 TTH: TT_P0067 TTJ: TTHB110 MJA: MJ0862 MMP: MMP0043 MMQ: MmarC5_1637 MMX: MmarC6_0906 MMZ: MmarC7_1040 MAE: Maeo_1184 MV : Mevan_1058 MAC: MA0604(idi) MBA: Mbar_A1419 MMA: MM_1764 MBU: Mbur_2397 MTP: Mthe_0474 MHU: Mhun_2888 MLA: Mlab_1665 MEM: emar_1814 MBN: Mboo_2211 MTH: MTH48 MST: sp_0856 (fni MSI: Msm_1441 MKA: MK0776 (lldD) AFU: AF2287 HAL: V G1818G(idi) VNG6081G ( crt_l ) V G6445G (crt_2 ) VNG7060 V G7149 HMA: rrnAC3484 (idi) HWA: HQ2772A ( idiA) HQ2847A ( idiB) NPH: NP0360A(idiB_l) NP4826A ( idiA) NP5124A ( idiB_2 ) TAC: Ta0102 TVO: TVN0179 PTO: PTO0496 PHO: PH1202 PAB: PAB1662 PFU: PF0856 TKO: TK1470 RCI: LRC397(fni) APE: APE_1765.1 SMR: Smar_0822 IHO: Igni_0804 HBU: Hbut_0539 SSO: SSO0063 STO: ST2059 SAI: Saci_0091 MSE: Msed_2136 PAI: PAE0801 PIS: Pisl_1093 pcL: Peal 0017 PAS: Pars_0051 TPE: Tpen_0272 Acidos nucleicos y polipéptidos de isopreno sintasa ilustrativos Nos. de acceso al Genbank AY341431 AY316691 AY279379 AJ457070 AY 182241 Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (31)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:
1. Células en cultivo capaces de producir isopreno caracterizadas porque las células están en fase estacionaria y en donde la producción de isopreno es mayor que o aproximadamente 2 veces mayor de la cantidad de isopreno producido durante la fase de crecimiento para la misma longitud de tiempo.
2. Las células de conformidad con la reivindicación 1, caracterizadas porque el isopreno es producido en la fase gaseosa y (a) en donde la fase gaseosa comprende más de, o aproximadamente, 9.5% (volumen) de oxígeno, y la concentración de isopreno en la fase gaseosa es menor que el límite de inflamabilidad inferior o mayor del límite de inflamabilidad superior o (b) la concentración de isopreno en la fase gaseosa es menor que el límite de inflamabilidad inferior o mayor del límite de inflamabilidad superior, y las células producen más de aproximadamente 400 nmoles/gWCm/hr de isopreno.
3. Células en cultivo que producen más de aproximadamente 400 nmoles/gwcm/hr de isopreno, caracterizadas porque las células se hacen crecer bajo condiciones que desacoplan la producción de isopreno del crecimiento celular.
4. Células en cultivo que tienen una productividad volumétrica promedio de isopreno de más de aproximadamente 0.1 mg/Lcaido/hr, caracterizadas porque las células- se hacen crecer bajo condiciones que desacoplan la producción de isopreno del crecimiento celular.
5. Células en cultivo que convierten más de aproximadamente 0.002 por ciento molar del carbono que las células consumen de un medio de cultivo de células en isopreno, caracterizadas porque las células se hacen crecer bajo condiciones que desacoplan la producción de isopreno del crecimiento celular.
6. Las células de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, caracterizadas porque las células se hacen crecer bajo condiciones de glucosa limitadas.
7. Las células de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, caracterizadas porque la cantidad de isopreno producido durante la fase estacionaria es mayor que o aproximadamente 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, o más veces la cantidad de isopreno producido durante la fase de crecimiento para la misma longitud de tiempo.
8. Las células de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, caracterizadas porque comprenden un ácido nucleico heterólogo que codifica un polipéptido de isopreno sintasa.
9. Una composición caracterizada porque comprende más de aproximadamente 2 mg de isopreno producido por las células de conformidad con la reivindicación 1 y que comprende más de, o aproximadamente, 99.94% de isopreno en peso comparado con el peso total de todos los hidrocarburos de C5 en la composición.
10. Una composición caracterizada porque comprende más de, o aproximadamente, 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 ó 1000 mg de isopreno producido por las células de conformidad con la reivindicación 1.
11. Una composición caracterizada porque comprende más de, o aproximadamente, 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 g de isopreno (p/p) de la fracción orgánica volátil de las células de conformidad con la reivindicación 1.
12. Una composición caracterizada porque comprende más de aproximadamente 2 mg de isopreno producido por las células de conformidad con la reivindicación 1 y que comprende menos de o aproximadamente 0.5 ug/L por compuesto para cualquier compuesto en la composición que inhibe la polimerización de isopreno.
13. La composición de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada porque la composición que inhibe la polimerización de isopreno comprende menos de o aproximadamente 0.12, 0.10, 0.08, 0.06, 0.04, 0.02, 0.01, 0.005, 0.001, 0.0005, 0.0001, 0.00005 ó 0.00001% de uno o más hidrocarburos de C5 seleccionados del grupo que consiste de: 1 , 3-ciclopentadieno, cis-1, 3 -pentadieno, trans-1,3-pentadieno, 1-pentino, 2-pentino, 1-penteno, 2-metil-l-buteno, 3 -metil-l-butino, trans-piperileno, cis-piperileno, pent-4-eno-l-ino, trans-pent-3-eno-l-ino, y cis-pent-3-eno-l-ino en peso comparado con el peso total de todos los hidrocarburos de C5 en la composición.
14. La composición de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada porque la composición que inhibe la polimerización de isopreno tiene menos de o aproximadamente 0.12, 0.10, 0.08, 0.06, 0.04, 0.02, 0.01, 0.005, 0.001, 0.0005, 0.0001, 0.00005 ó 0.00001% de 1,3-ciclopentadieno, cis-1 , 3 -pentadieno, trans-1, 3 -pentadieno, 1-pentino, 2-pentino, 1-penteno, 2-metil-l-buteno, 3-metil-l-butino, trans-piperileno, cis-piperileno, pent-4-eno-l-ino, trans-pent-3-eno-l-ino o . cis-pent-3-eno-l-ino en peso comparado con el peso total de todos los hidrocarburos de C5 en la composición.
15. Una composición caracterizada porque comprende más de aproximadamente 2 mg de isopreno producido por las células de conformidad con la reivindicación 1 y tiene más de, o aproximadamente, 99.90, 99.92, 99.94, 99.96, 99.98 ó 100% de isopreno en peso comparado con el peso total de todos los hidrocarburos de C5 en la composición.
16. La composición de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada porque el isopreno es recuperado de una porción de gas desprendido.
17. Una composición caracterizada porque comprende más de aproximadamente 2 mg de isopreno producido por las células de conformidad con la reivindicación 1 y que comprende uno o más compuestos seleccionados del grupo que consiste de etanol, acetona, alcoholes prenílicos de C5 , y compuestos de isoprenoide con 10 o más átomos de carbono.
18. Una composición caracterizada porque comprende más de aproximadamente 2 mg de isopreno producido por las células de conformidad con la reivindicación 1 y que comprende uno o más segundos compuestos seleccionados del grupo que consiste de 2-heptanona, 6-metil-5-hepten-2-ona, 2 , , 5-trimetilpiridina, 2 , 3 , 5-trimetilpirazina, citronelal, acetaldehído, metanotiol, acetato de metilo, 1-propanol, diacetilo, 2-butanona, 2-metil-3-buten-2-ol , acetato de etilo, 2-metil-l-propanol, 3 -metil-l-butanal , 3-metil-2-butanona, 1-butanol, 2-pentanona, 3 -metil- 1-butanol , isobutirato de etilo, 3 -metil-2 -butenal , acetato de butilo, 3 -metilacetato de butilo, acetato de 3-metil-3-but-l-enilo, acetato de 3-metil-2-but-l-enilo, (E) -3 , 7-dimetil-l , 3 , 6-octatrieno, (Z) -3 , 7 -dimetil-1 , 3 , 6- octatrieno, y 2,3-cicloheptenolpiridina; en donde la cantidad del segundo compuesto en relación con la cantidad del isopreno es mayor que o aproximadamente 0.01% (p/p) .
19. Una composición caracterizada porque comprende (i) una fase gaseosa que comprende isopreno y (ii) células en cultivo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-8.
20. La composición de conformidad con la reivindicación 19, caracterizada porque la composición comprende un sistema cerrado, y la fase gaseosa comprende más de, o aproximadamente, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ó 100 ug/L de isopreno cuando se normaliza a 1 mL de 1 OD6oo cultivado durante 1 hora.
21. La composición de conformidad con la reivindicación 19, caracterizada porque la composición comprende un sistema abierto, y la fase gaseosa comprende más de, o aproximadamente, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ó 100 ug/L de isopreno cuando es rociada a una velocidad de 1 wm .
22. La composición de conformidad con la reivindicación 19, caracterizada porque la composición comprende una fracción orgánica volátil de la fase gaseosa que comprende más de, o aproximadamente, 99.90, 99.92, 99.94, 99.96, 99.98 ó 100% de isopreno en peso comparado con el peso total de todos los hidrocarburos de C5 en la fracción orgánica volátil.
23. Un método de producción de isopreno, caracterizado porque comprende (a) cultivar células de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-8 bajo condiciones de cultivo adecuadas para la producción de isopreno; en donde la cantidad de isopreno producido durante la fase estacionaria es mayor que o aproximadamente 2 veces más de la cantidad de isopreno producido durante la fase de crecimiento durante la misma longitud de tiempo, y (b) producr isopreno.
24. El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque las células son cultivadas bajo condiciones de glucosa limitadas.
25. El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque el isopreno es recuperado de una porción de gas desprendido del cultivo de células.
26. Un sistema caracterizado porque comprende una concentración no inflamable de isopreno en la fase gaseosa en donde la fase gaseosa comprende menos de aproximadamente 9.5% (volumen) de oxígeno o más de, o aproximadamente, 9.5% (volumen) de oxígeno, y la concentración de isopreno en la fase gaseosa es menor que el límite de inflamabilidad inferior o más del límite de inflamabilidad superior.
27. El sistema de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque la porción de la fase gaseosa distinta del isopreno comprende de aproximadamente 10% a aproximadamente 100% (volumen) de oxígeno.
28. El sistema de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque la porción de la fase gaseosa distinta del isopreno comprende de aproximadamente 0% a aproximadamente 99% (volumen) de nitrógeno.
29. El sistema de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque la porción de la fase gaseosa distinta del isopreno comprende de aproximadamente 1% a aproximadamente 50% (volumen) de C02.
30. Un método de producción de isopreno, caracterizado porque comprende: (a) cultivar células bajo condiciones de cultivo adecuadas para la producción de isopreno, en donde la fase gaseosa comprende más de, o aproximadamente, 9.5% (volumen) de oxígeno, y (b) producir isopreno, en donde la concentración de isopreno en la fase gaseosa es menor que el límite de inflamabilidad inferior o mayor del límite de inflamabilidad superior, y en donde las células producen más de aproximadamente 400 nmoles/gwcm/hr de isopreno.
31. Un método de producción de isopreno, caracterizado porque comprende (a) cultivar células bajo condiciones de cultivo adecuadas para la producción de isopreno, en donde la fase gaseosa comprende menos de, o aproximadamente, 9.5% (volumen) de oxígeno, y (b) producir isopreno, en donde las células producen más de aproximadamente 400 nmoles/gwcm/hr de isopreno .
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