CN109312271A - 洗涤剂组合物及其用途 - Google Patents

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CN109312271A CN201780026089.0A CN201780026089A CN109312271A CN 109312271 A CN109312271 A CN 109312271A CN 201780026089 A CN201780026089 A CN 201780026089A CN 109312271 A CN109312271 A CN 109312271A
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C.B.奥伦施拉格
D.R.塞古拉
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H.M.格尔茨-汉森
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J.萨洛蒙
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    • C12Y302/01052—Beta-N-acetylhexosaminidase (3.2.1.52)
    • C11D2111/12—

Abstract

本发明涉及具有氨基己糖苷酶活性的多肽和编码这些多肽的多核苷酸。本发明还涉及包含这些多核苷酸的核酸构建体、载体以及宿主细胞，连同产生和使用这些多肽的方法。

Description

洗涤剂组合物及其用途
序列表的引用
本申请含有处于计算机可读形式的序列表，将其通过引用并入本文。
发明背景
技术领域
本发明涉及具有氨基己糖苷酶活性的多肽，编码该多肽的多核苷酸和属于糖苷水解酶家族20的催化结构域(GH20，www.cazy.org)。本发明进一步涉及包含此类多肽的组合物，特别是清洁组合物、在清洁过程和/或深度清洁中具有氨基己糖苷酶活性的多肽的用途、用于深度清洁的方法。本发明进一步涉及包含这些多核苷酸的核酸构建体、载体以及宿主细胞连同生产和使用这些多肽和催化结构域的方法。
背景技术
具有氨基己糖苷酶活性的多肽包括分散蛋白(Dispersin)例如分散蛋白B(DspB)，其被描述为属于糖苷水解酶20家族的β-N-乙酰葡糖苷酶。WO 04061117 A2(凯恩生物技术公司(Kane Biotech INC))描述了包含DspB的组合物用于减少和防止由产生聚-N-乙酰葡糖胺的细菌引起的生物膜的用途，且Kane等人描述了包含分散蛋白的组合物用于减少医疗设备上的生物膜和用于伤口护理的用途。生物膜也可以存在于衣物物品上，例如织物，其他硬表面，例如餐具洗涤用具，餐具洗涤器和洗衣机，其中它们可能引起恶臭，即使在洗涤之后也难以去除。申请WO 9850512(宝洁公司(Procter and Gamble))披露了包含一种或多种氨基己糖苷酶的衣物洗涤或清洁产品。本发明提供了合适用于洗涤剂和用于深度清洁物品例如衣物洗涤和清洁过程的酶。
发明内容
本发明提供了属于来自糖苷水解酶20家族的氨基己糖苷酶的土地芽孢杆菌(Terribacillus)进化枝的多肽。该土地芽孢杆菌进化枝示出于图1和3。本发明的多肽具有氨基己糖苷酶活性。本发明进一步提供了包含具有氨基己糖苷酶活性的多肽的洗涤剂组合物，以及具有氨基己糖苷酶活性的多肽用于清洁过程中的用途。具有氨基己糖苷酶活性的本发明多肽具有有益的特性，例如在清洁过程中去除和/或减少生物膜相关组分例如EPS和/或PNAG。包括衣物洗涤和餐具洗涤。本发明的多肽属于土地芽孢杆菌进化枝，它们是糖苷水解酶20家族的特定进化枝的同源序列。因此，本发明涉及具有氨基己糖苷酶活性的多肽，这些多肽选自下组，该组由以下组成：
(a)与SEQ ID NO 2、4、6、13或15的成熟多肽具有至少80％序列同一性的多肽；
(b)SEQ ID NO 2、4、6、13或15的成熟多肽的变体，该变体在一个或多个(例如，若干个)位置处包含取代、缺失和/或插入；以及
(c)具有氨基己糖苷酶活性的(a)或(b)的多肽的片段。
本发明还涉及包含属于糖苷水解酶家族20(GH20，www.cazy.org)的催化结构域的多肽，且与SEQ ID NO 2的氨基酸1至324具有至少60％的序列同一性、与SEQ ID NO 4的氨基酸1至324具有至少60％的序列同一性、与SEQ ID NO 6的氨基酸1至324具有至少60％的序列同一性、与SEQ ID NO 13的氨基酸1至324具有至少60％的序列同一性或与SEQ ID NO15的氨基酸1至324具有至少60％的序列同一性。本发明还涉及使用本发明多肽的清洁方法和在清洁过程中的用途。本发明进一步涉及用于清洁或洗涤物品的方法，该方法包括以下步骤：
a.将物品暴露于包含具有氨基己糖苷酶活性的多肽或包含这些多肽的洗涤剂组合物的洗涤液，该多肽选自下组，该组由以下组成：SEQ ID NO 7、8、9、10和11的多肽或与其具有至少60％序列同一性的多肽；
b.完成至少一个洗涤循环；以及
c.任选地冲洗该物品，
其中该物品是纺织品。
另外，要求保护具有氨基己糖苷酶活性的多肽用于深度清洁物品的用途，该多肽选自下组，该组由以下组成：SEQ ID NO 7、8、9、10、11的多肽或具有至少60％序列同一性的多肽。
本发明进一步涉及包含至少0.001ppm具有氨基己糖苷酶活性的多肽和至少一种佐剂成分的组合物，其中该多肽选自下组，该组由以下组成：与SEQ ID NO 7、8、9、10和11所示的成熟多肽具有至少60％序列同一性的多肽。本发明进一步涉及本发明的组合物用于物品的深度清洁的用途，其中该物品是纺织品。
本发明进一步涉及用于洗涤物品的方法，该方法包括：a)将物品暴露于包含选自由SEQ ID NO 7、SEQ ID NO 8、SEQ ID NO 9、SEQ ID NO 10和SEQ ID NO 11所示的多肽组成的组的多肽的洗涤液，或与其具有至少60％序列同一性的多肽，或将物品暴露于根据本发明的洗涤剂组合物；b)完成至少一个洗涤循环；且任选地冲洗该物品，其中该物品是纺织品。
本发明进一步涉及本发明的多肽或组合物的用途，
(i)用于防止、减少或去除该物品的粘性；
(ii)用于预处理物品上的污渍；
(iii)用于在洗涤循环期间防止、减少或去除污垢的再沉积；
(iv)用于防止、减少或去除污垢在该物品上的附着；
(v)用于维持或改善该物品的白度；
(vi)用于防止、减少或去除该物品的恶臭，
其中该物品是纺织品。
附图说明
图1示出了土地芽孢杆菌进化枝的系统发育树。
图2是本发明多肽的比对
图3是本发明多肽的系统发育树
土地芽孢杆菌进化枝的序列综述
SEQ ID NO 1是编码来自嗜糖土地芽孢杆菌(Terribacillus saccharophilus)的全长多肽的DNA
SEQ ID NO 2是衍生自SEQ ID NO 1的多肽
SEQ ID NO 3是编码来自Terribacillus goriensis的全长多肽的DNA
SEQ ID NO 4是衍生自SEQ ID NO 3的多肽
SEQ ID NO 5是编码来自嗜糖土地芽孢杆菌的全长多肽的DNA
SEQ ID NO 6是衍生自SEQ ID NO 5的多肽
SEQ ID NO 7是SEQ ID NO 2的成熟多肽
SEQ ID NO 8是SEQ ID NO 4的成熟多肽
SEQ ID NO 9是SEQ ID NO 6的成熟多肽
SEQ ID NO 10是SEQ ID NO 13的成熟多肽
SEQ ID NO 11是SEQ ID NO 15的成熟多肽
SEQ ID NO 12是编码来自嗜糖土地芽孢杆菌的全长多肽的DNA
SEQ ID NO 13是衍生自SEQ ID NO 12的多肽
SEQ ID NO 14是编码来自嗜糖土地芽孢杆菌的全长多肽的DNA
SEQ ID NO 15是衍生自SEQ ID NO 14的多肽
SEQ ID NO 16是克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)分泌信号
SEQ ID NO 17是His-标签序列
SEQ ID NO 18是多肽基序GXDE
SEQ ID NO 19是多肽基序
[EQ][NRSHA][YVFL][AGSTC][IVLF][EAQYN][SN]
SEQ ID NO 20是多肽基序[VIM][LIV]G[GAV]DE[VI][PSA]
SEQ ID NO 21是多肽基序WND[SQR][IVL][TLVM]
SEQ ID NO 22是多肽基序QSTL
SEQ ID NO 23是多肽基序NKFFY
SEQ ID NO 24是多肽基序NLD[DR]S
定义
分散蛋白：术语“分散蛋白”和缩写“Dsp”意指例如在生物膜中发现的具有氨基己糖苷酶活性的多肽，EC 3.2.1.-，其催化N-乙酰基-葡糖胺聚合物(聚-N-乙酰葡糖胺)的β-1,6-糖苷键的水解。
氨基己糖苷酶：术语“氨基己糖苷酶”意指例如在生物膜中发现的具有氨基己糖苷酶活性(氨基己糖苷酶)的和包括EC 3.2.1例如催化N-乙酰基-D-氨基己糖或N-乙酰基-葡糖胺聚合物的水解的多肽。该术语包括分散蛋白，和包括具有N-乙酰葡糖苷酶活性和β-N-乙酰葡糖苷酶活性的多肽。术语“具有氨基己糖苷酶活性的多肽”可与术语氨基己糖苷酶可互换地使用，且类似的术语“具有β-N-乙酰葡糖苷酶(β-N-acetylglucosaminidase)活性的多肽”可与术语β-N-乙酰葡糖苷酶(β-N-acetylglucosamininidase)可互换地使用。出于本发明的目的，根据测定1或2中所描述的程序确定氨基己糖苷酶活性。在一个方面中，本发明的这些多肽具有SEQ ID NO 2的成熟多肽的至少20％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少100％的氨基己糖苷酶活性。在一个方面中，本发明的这些多肽具有SEQ ID NO 4的成熟多肽的至少20％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少100％的氨基己糖苷酶活性。在一个方面中，本发明的这些多肽具有SEQ ID NO 6的成熟多肽的至少20％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少100％的氨基己糖苷酶活性。在一个方面中，本发明的这些多肽具有SEQ ID NO 13的成熟多肽的至少20％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少100％的氨基己糖苷酶活性。在一个方面中，本发明的这些多肽具有SEQ ID NO 15的成熟多肽的至少20％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少100％的氨基己糖苷酶活性。
等位基因变体：术语“等位基因变体”意指占用同一染色体基因座的基因的两个或更多个替代形式中任一者。等位基因变异由突变天然产生，并且可以导致群体内多态性。基因突变可以是沉默的(在所编码的多肽中没有改变)或可编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位基因变体是由基因的等位基因变体编码的多肽。
生物膜：生物膜可以是由其中细胞彼此黏附在一起或黏附至表面(例如纺织品、餐具或硬表面)或另一种表面的任何群组的微生物产生的。这些黏附细胞经常包埋在细胞外高聚物(EPS)的自身产生的基质内。生物膜EPS是一般由细胞外的DNA、蛋白、和多糖组成的聚合物团块。生物膜可以形成在活的或非活的表面上。在生物膜中生长的微生物细胞与同一有机体的浮游细胞(相比之下，浮游细胞是可以在液体培养基中漂浮或浮游的单个细胞)在生理上是不同的。生活在生物膜中的细菌通常与同一物种的浮游细菌具有显著不同的特性，因为膜的密集并且受保护的环境允许它们以不同方式协作和相互作用。微生物的这一环境的一个益处是增加对洗涤剂和抗生素的抗性，因为，密集的细胞外基质和细胞的外层保护群落的内部。在衣物和硬表面上，会发现产生生物膜的细菌是在以下物种中：不动杆菌属物种、气微菌属物种、短波单胞菌属物种、微杆菌属物种、滕黄微球菌、假单胞菌属物种、链球菌属物种、和停乳链球菌停乳亚种、表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、寡养单胞菌属物种、肠杆菌属物种、黄单胞菌属物种、耶尔森菌属物种、克雷白氏菌属物种、伯克霍尔德菌属物种、寡养单胞菌属物种、贪食菌属物种、埃希氏菌属物种、罗尔斯通菌属物种、无色杆菌属菌种、藤黄色杆菌属(Luteibacter)物种、柠檬酸杆菌属物种、黄单胞菌科物种、盐单胞菌属物种、博代氏菌属物种、溶杆菌属物种、沙雷氏菌属物种、埃希氏菌属物种、凝聚杆菌属物种、单核细胞增生利斯特菌、艰难梭菌、分枝杆菌属菌种、淋病奈瑟氏球菌、流感嗜血杆菌、杜氏嗜血杆菌、幽门螺杆菌、空肠弯曲菌和粪肠球菌，连同真菌白色念珠菌、黄曲霉、腐皮镰孢、和新型隐球菌。在一个方面中，生物膜组分例如聚-N-乙酰葡糖胺包含菌株是短波单胞菌属物种。在一个方面中，生物膜组分例如聚-N-乙酰葡糖胺包含菌株是嗜碱性假单胞菌或荧光假单胞菌。在一个方面中，生物膜组分例如聚-N-乙酰葡糖胺包含菌株是金黄色葡萄球菌。
催化结构域：术语“催化结构域”意指酶的含有该酶的催化机构的区域。
cDNA：术语“cDNA”意指可以通过从获得自真核或原核细胞的成熟的、剪接的mRNA分子进行反转录而制备的DNA分子。cDNA缺少可以存在于相应基因组DNA中的内含子序列。早先的初始RNA转录物本是mRNA的前体，其在呈现为成熟的剪接的mRNA之前要经一系列步骤进行加工，包括剪接。
进化枝：基于追溯至共同祖先的同源性特征聚集在一起的一组多肽。多肽进化枝可以被看作是系统发育树，且进化枝是由共同祖先及其所有直系后裔组成的一组多肽(图1)。本发明的多肽(例如，所有属于土地芽孢杆菌进化枝的多肽)，在图1和3中被示为系统发育树。土地芽孢杆菌进化枝或土地芽孢杆菌的进化枝是一组酶，这组酶都与相同祖先相关并享有共同的特性。在系统发育树的进化枝(亚进化枝)内形成一组多肽也可以享有共同的特性，并且与进化枝中的其他多肽更密切相关。
编码序列：术语“编码序列”意指直接指定多肽的氨基酸序列的多核苷酸。编码序列的边界一般由可读框决定，该可读框以起始密码子(例如ATG、GTG或TTG)开始并且以终止密码子(例如TAA、TAG或TGA)结束。编码序列可为基因组DNA、cDNA、合成DNA或其组合。
控制序列：术语“控制序列”是指表达编码本发明的成熟多肽的多核苷酸所必需的核酸序列。每个控制序列对于编码该多肽的多核苷酸来说可以是天然的(即，来自相同基因)或外源的(即，来自不同基因)，或相对于彼此是天然的或外源的。此类控制序列包括但不限于前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列和转录终止子。最少，控制序列包括启动子、以及转录和翻译终止信号。出于引入有利于将这些控制序列与编码多肽的多核苷酸的编码区连接的特异性限制性酶切位点的目的，这些控制序列可以提供有多个接头。
深度清洁：术语“深度清洁”意指减少或去除生物膜的组分，例如EPS或其部分、多糖、PNAG(聚-N-乙酰葡糖胺)、蛋白质、DNA、污垢或生物膜中存在的其他组分。
洗涤剂佐剂成分：该洗涤剂佐剂成分不同于本发明的氨基己糖苷酶。这些额外佐剂组分的精确性质、其掺入水平将取决于组合物的物理形式和将在其中使用组合物的操作的性质。适合的佐剂材料包括，但不限于：以下描述的组分，如表面活性剂、助洗剂、絮凝助剂、螯合剂、染料转移抑制剂、酶、酶稳定剂、酶抑制剂、催化材料、漂白活化剂、过氧化氢、过氧化氢源、预形成的过酸、聚合剂、粘土去污剂/抗再沉淀剂、增白剂、抑泡剂、染料、香料、结构弹力剂、织物柔软剂、载体、助水溶物、助洗剂和共助洗剂、织物调色剂、防沫剂、分散剂、加工助剂、和/或颜料。
洗涤剂组合物：术语“洗涤剂组合物”是指用于从有待清洁的物品(如纺织品)去除不希望的化合物的组合物。该洗涤剂组合物可以用于例如清洁纺织品，用于家用清洁和工业清洁二者。这些术语涵盖选择用于希望的清洁组合物和产品的形式(例如，液体、凝胶、粉末、颗粒、糊状、或喷雾组合物)的任何材料/化合物，并且包括但不限于洗涤剂组合物(例如，液体和/或固体衣物洗涤剂和精细织物洗涤剂；织物清新剂；织物柔软剂；以及纺织品和衣物预去污剂/预处理)。除了含有本发明的多肽之外，该组合物还可以含有一种或多种另外的酶(例如蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、角质酶、纤维素酶、内切葡聚糖酶、木葡聚糖酶、果胶酶、果胶裂解酶、黄原胶酶、过氧化物酶、卤代过氧合酶、过氧化氢酶以及甘露聚糖酶、或其任何混合物)，和/或洗涤剂辅助剂成分，例如表面活性剂、助洗剂、螯合剂(chelator)或螯合试剂(chelating agent)、漂白系统或漂白组分、聚合物、织物调理剂、增泡剂、抑泡剂、染料、香料、晦暗抑制剂、光学增亮剂、杀细菌剂、杀真菌剂、污垢悬浮剂、防蚀剂、酶抑制剂或稳定剂、酶激活剂、一种或多种转移酶、水解酶、氧化还原酶、上蓝剂和荧光染料、抗氧化剂以及增溶剂。
酶洗涤益处：本文将术语“酶洗涤益处”定义为将一种酶添加至洗涤剂中与不具有该酶的相同洗涤剂相比的有利效果。可以由酶提供的重要洗涤益处是污渍去除伴随在洗涤和/或清洁之后无可见污垢或污垢非常少、防止或减少在洗涤过程中所释放的污垢再沉积(一种又称作抗再沉积的作用)、完全或部分地恢复纺织品的白度(一种又称作增白的作用)，这些纺织品最初是白色的，但是在反复使用和洗涤后获得淡灰或淡黄色外观。不直接与污垢的催化污渍去除或防止污垢再沉积的相关的纺织品护理益处对于酶洗涤益处而言也是重要的。此类纺织品护理益处的实例是防止或减少染料从一织物转移至另一织物或同一织物的另一部分(一种也被称作染料转移抑制或抗返染的作用)，从织物表面去除突出或断裂的纤维以减少起球倾向或去除已经存在的绒球或绒毛(一种也被称作抗起球的作用)，改进织物柔软性，织物的颜色澄清以及去除陷在织物或服装的纤维中的微粒状污垢。酶漂白是一种另外的酶洗涤益处，其中通常将催化活性用于催化漂白组分(如过氧化氢或其他过氧化物)的形成。
表达：术语“表达”包括涉及多肽产生的任何步骤，包括但不限于，转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰、以及分泌。
表达载体：术语“表达载体”意指直链或环状DNA分子，该DNA分子包含编码多肽的多核苷酸并且可操作地连接至提供用于其表达的控制序列。
片段：术语“片段”意指具有从成熟多肽或结构域的氨基和/或羧基端缺失的一个或多个(例如，若干个)氨基酸的多肽或催化结构域；其中该片段具有氨基己糖苷酶活性。在一方面中，片段含有至少300个氨基酸残基(例如，SEQ ID NO 2的氨基酸1至300)、至少305个氨基酸残基(例如，SEQ ID NO 2的氨基酸1至305)、至少310个氨基酸残基(例如，SEQ IDNO 2的氨基酸1至310)、至少315个氨基酸残基(例如，SEQ ID NO 2的氨基酸1至315)、或至少320个氨基酸残基(例如SEQ ID NO 2的氨基酸1至320)。在一方面中，片段含有至少300个氨基酸残基(例如，SEQ ID NO 4的氨基酸1至300)、至少305个氨基酸残基(例如，SEQ ID NO4的氨基酸1至305)、至少310个氨基酸残基(例如，SEQ ID NO 4的氨基酸1至310)、至少315个氨基酸残基(例如，SEQ ID NO 4的氨基酸1至315)、或至少320个氨基酸残基(例如SEQ IDNO 4的氨基酸1至320)。在一方面中，片段含有至少300个氨基酸残基(例如，SEQ ID NO 6的氨基酸1至300)、至少305个氨基酸残基(例如，SEQ ID NO 6的氨基酸1至305)、至少310个氨基酸残基(例如，SEQ ID NO 6的氨基酸1至310)、至少315个氨基酸残基(例如，SEQ ID NO 6的氨基酸1至315)、或至少320个氨基酸残基(例如SEQ ID NO 6的氨基酸1至320)。在一方面中，片段含有至少300个氨基酸残基(例如，SEQ ID NO 13的氨基酸1至300)、至少305个氨基酸残基(例如，SEQ ID NO 13的氨基酸1至305)、至少310个氨基酸残基(例如，SEQ ID NO 13的氨基酸1至310)、至少315个氨基酸残基(例如，SEQ ID NO 13的氨基酸1至315)、或至少320个氨基酸残基(例如SEQ ID NO 13的氨基酸1至320)。在一方面中，片段含有至少300个氨基酸残基(例如，SEQ ID NO 15的氨基酸1至300)、至少305个氨基酸残基(例如，SEQ IDNO 15的氨基酸1至305)、至少310个氨基酸残基(例如，SEQ ID NO 15的氨基酸1至310)、至少315个氨基酸残基(例如，SEQ ID NO 15的氨基酸1至315)、或至少320个氨基酸残基(例如SEQ ID NO 15的氨基酸1至320)。
宿主细胞：术语“宿主细胞”意指易于用包含本发明的多核苷酸的核酸构建体或表达载体进行转化、转染、转导等的任何细胞类型。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间发生的突变而与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。
分离的：术语“分离的”意指处于自然界中不存在的形式或环境中的一种物质。分离的物质的非限制性实例包括(1)任何非天然存在的物质，(2)包括但不限于任何酶、变体、核酸、蛋白质、肽或辅因子的任何物质，所述物质至少部分地从与其性质相关的一种或多种或所有天然存在的成分中去除；(3)相对于自然界中发现的物质通过人工修饰的任何物质；或(4)通过相对于与其天然相关的其他组分增加物质的量而修饰的任何物质(例如，宿主细胞中的重组产生；编码该物质的基因的多个拷贝；以及使用比与编码该物质的基因天然相关的启动子更强的启动子)。分离的物质可以存在于发酵液样品中；例如宿主细胞可以经遗传修饰以表达本发明的多肽。来自该宿主细胞的发酵液将包含分离的多肽。
改进的洗涤性能：本文将术语“改进的洗涤性能”定义为相对于没有酶的相同洗涤剂组合物的洗涤性能，展示出洗涤剂组合物中增加的洗涤性能的酶，例如，通过增加污渍去除或较少的再沉积。术语“改进的洗涤性能”包括在衣物中的洗涤性能。
洗涤：术语“洗涤”涉及家用洗涤和工业洗涤两者并且意指用一种含有本发明的清洁或洗涤剂组合物的溶液处理纺织品的过程。洗涤过程可以例如使用例如家用或工业洗衣机进行或可以手动进行。
恶臭：关于术语“恶臭”意指在清洁物品上不希望的气味。清洁的物品应气味清新并且干净，而没有附着在该物品上的恶臭。恶臭的一个实例是具有使人不愉快的气味的化合物，这些化合物可以是微生物产生的。另一个实例是令人不愉悦的气味可以是黏附至已经与人类或动物接触的物品的汗味或体味。恶臭的另一个实例可以是来自香料的气味，其粘附于物品，例如气味强烈的咖喱或其他异国香料。
成熟多肽：术语“成熟多肽”意指在翻译和任何翻译后修饰，例如N-末端加工、C-末端截短、糖基化作用、磷酸化作用等之后处于其最终形式的多肽。在一些方面中，该成熟多肽是SEQ ID NO 2的氨基酸1至324，并且SEQ ID NO 2的氨基酸-41至-1是信号肽。在一些方面中，该成熟多肽是具有SEQ ID NO 7的氨基酸序列。在一些方面中，该成熟多肽是SEQ IDNO 4的氨基酸1至324，并且SEQ ID NO 4的氨基酸-25至-1是信号肽。在一些方面中，该成熟多肽是具有SEQ ID NO 8的氨基酸序列。在一些方面中，该成熟多肽是SEQ ID NO 6的氨基酸1至324，并且SEQ ID NO 6的氨基酸-25至-1是信号肽。在一些方面中，该成熟多肽是具有SEQ ID NO 9的氨基酸序列。在一些方面中，该成熟多肽是SEQ ID NO 13的氨基酸1至324，并且SEQ ID NO 13的氨基酸-24至-1是信号肽。在一些方面中，该成熟多肽是具有SEQ IDNO 10的氨基酸序列。在一些方面中，该成熟多肽是SEQ ID NO 15的氨基酸1至324，并且SEQID NO 15的氨基酸-24至-1是信号肽。在一些方面中，该成熟多肽是具有SEQ ID NO 11的氨基酸序列。
本领域内已知，宿主细胞可以产生由相同多核苷酸表达的两种或更多种不同的成熟多肽(即，具有不同的C-末端和/或N-末端氨基酸)的混合物。本领域还已知，不同的宿主细胞不同地加工多肽，且因此一个表达多核苷酸的宿主细胞当与另一个表达相同多核苷酸的宿主细胞相比时可产生不同的成熟多肽(例如，具有不同的C-末端和/或N-末端氨基酸)。
成熟多肽编码序列：术语“成熟多肽编码序列”意指编码具有氨基己糖苷酶活性的成熟多肽的多核苷酸。在一个方面中，该成熟多肽编码序列是SEQ ID NO 1的核苷酸124至1095，并且SEQ ID NO 1的核苷酸1至123编码信号肽。在一个方面中，该成熟多肽编码序列是SEQ ID NO 3的核苷酸76至1047，并且SEQ ID NO 3的核苷酸1至75编码信号肽。在一个方面中，该成熟多肽编码序列是SEQ ID NO 5的核苷酸76至1047，并且SEQ ID NO5的核苷酸1至75编码信号肽。在一个方面中，该成熟多肽编码序列是SEQ ID NO 12的核苷酸73至1044，并且SEQ ID NO 12的核苷酸1至72编码信号肽。在一个方面中，该成熟多肽编码序列是SEQID NO 14的核苷酸73至1044，并且SEQ ID NO 14的核苷酸1至72编码信号肽。
核酸构建体：术语“核酸构建体”意指单-链或双链的核酸分子，所述核酸分子是从天然存在的基因中分离的，或以本来不存在于自然界中的方式被修饰成含有核酸的区段，或是合成的，所述核酸分子包含一个或多个控制序列。
可操作地连接：术语“可操作地连接”意思指这样一种配置，在该配置中，一个控制序列被放置在相对于多核苷酸的编码序列适当的位置处，这样使得该控制序列引导该编码序列的表达。
序列同一性：两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的关联度通过参数“序列同一性”来描述。
出于本发明的目的，使用如在EMBOSS软件包(EMBOSS：The European MolecularBiology Open Software Suite[欧洲分子生物学开放软件套件])，Rice等人，2000，TrendsGenet.[遗传学趋势]16:276-277)(优选5.0.0版本或更新版本)的Needle程序中所实施的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970，J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]48:443-453)来确定两个氨基酸序列之间的序列同一性。使用的参数是缺口开放罚分10、缺口扩展罚分0.5、以及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。使用Needle标记的“最长同一性”的输出(使用-nobrief选项获得)作为同一性百分比并且计算如下：
(一致的残基X 100)/(比对长度-比对中的空位总数)
严格条件：术语“非常低严格条件”意指对于至少100个核苷酸长度的探针，遵循标准DNA印迹程序，在42℃在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和25％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在45℃使用2X SSC、0.2％SDS将载体材料洗涤三次，每次15分钟。
术语“低严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和25％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在50℃使用2X SSC、0.2％SDS将载体材料洗涤三次，每次15分钟。
术语“中严格条件”是指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在55℃使用2X SSC、0.2％SDS将载体材料洗涤三次，每次15分钟。
术语“中高严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在60℃使用2X SSC、0.2％SDS将载体材料洗涤三次，每次15分钟。
术语“高严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃、在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/毫升剪切并变性的鲑鱼精子DNA和50％甲酰胺中预杂交和杂交12小时至24小时。最后在65℃使用2X SSC、0.2％SDS将载体材料洗涤三次，每次15分钟。
术语“非常高严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在70℃使用2X SSC、0.2％SDS将载体材料洗涤三次，每次15分钟。
变体：术语“变体”意指具有氨基己糖苷酶活性的、包含改变(即，在一个或多个(例如，若干个)位置处的取代、插入、和/或缺失)的多肽。取代意指用不同的氨基酸替代占用某一位置的氨基酸；缺失意指去除占用某一位置的氨基酸；并且插入意指在邻接并且紧随占用某一位置的氨基酸之后添加氨基酸。
命名
出于本发明的目的，命名[IV]或[I/V]意指在该位置处的氨基酸可以是异亮氨酸(Ile，I)或缬氨酸(Val，V)。同样，对于如本文所述的其他组合，命名[LVI]和[L/V/I]意指在该位置处的氨基酸可以是亮氨酸(Leu,L)、缬氨酸(Val，V)、或异亮氨酸(Ile，I)，并依次类推。除非进一步另有限制，氨基酸X被这样定义，使得它可以是20种天然氨基酸中的任一种。
具体实施方式
已经在衣物洗涤中使用了各种酶，其中许多酶涉及去除恶臭。WO2014/087011描述了脱氧核糖核酸酶(DNase)用于减少来自衣物和/或纺织品的恶臭的用途；WO 9909143描述了一种或多种氧化还原酶与介质组合用于减少恶臭的用途；并且WO 2012/112718描述了一种通过使用各种芽孢杆菌属菌株用于抑制由细菌引起的衣物恶臭的产生的方法。本发明涉及多肽和清洁例如包含来自具有氨基己糖苷酶活性的多肽的GH20家族的土地芽孢杆菌进化枝的多肽的洗涤剂组合物。还要求保护的是洗涤方法和具有氨基己糖苷酶活性的多肽的用途。来自具有氨基己糖苷酶活性的GH20家族的土地芽孢杆菌进化枝的多肽可用于减少和防止被洗涤物品的染色。诸位发明人惊讶地发现，具有氨基己糖苷酶活性的GH20家族的土地芽孢杆菌进化枝的多肽可用于减少衣物相关的有机物质，例如，EPS和/或PNAG。WO200406117描述了包含分散蛋白的组合物，例如，DspB。该组合物可包括洗涤剂，其可以是阴离子洗涤剂、阳离子洗涤剂或非离子洗涤剂。WO 9850512描述了具有氨基己糖苷酶活性的酶。本发明的多肽具有氨基己糖苷酶活性，但是这些多肽不属于DspB进化枝或与描述于WO9850512中的任何酶相关。本发明的多肽属于土地芽孢杆菌进化枝，并因此不同于DspB和来自于披露于WO 9850512中的那些。因此令人惊讶的是，本发明的多肽可用于防止、减少和/或去除有机物质，例如在硬表面连同在衣物洗涤中的生物膜组分，例如多糖，例如PNAG(聚-N-乙酰葡糖胺)。本领域未表明在清洁方法例如衣物洗涤或含有例如助洗剂和/或漂白剂的洗涤剂组合物中使用氨基己糖苷酶。为了在清洁过程中有用，酶需要在清洁过程例如衣物洗涤的条件下在洗涤剂中发挥其作用，其包括在洗涤剂组分例如表面活性剂、助洗剂和漂白组分存在下的稳定性。洗涤剂的组分可显著影响酶例如氨基己糖苷酶的性能。本申请令人惊讶地示出了属于土地芽孢杆菌进化枝的多肽表面活性剂在线性烷基苯磺酸盐(LAS)存在时是特别稳定的，LAS是洗涤剂中非常常见的表面活性剂。因此，属于土地芽孢杆菌的多肽特别适用于深度清洁，例如纺织品或洗衣机。
图1中提供了土地芽孢杆菌进化枝的综述。土地芽孢杆菌进化枝包含同源序列。本发明具有成熟氨基酸序列SEQ ID 7、8和9的具有氨基己糖苷酶活性的多肽可以使用Needleman-Wunsch算法成对比对(Needleman和Wunsch，1970，J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]48:443-453)。由这种比对导致的百分比同一性示出于下表1中。
表1
表1示出了本发明的多肽享有密切的序列相关性。包含SEQ ID NO 7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO 9、SEQ ID NO 10和SEQ ID NO 11的氨基酸序列的多肽属于分散蛋白进化枝的亚进化枝。与例如位于更远离的DspB多肽相比(未示出)，这些多肽享有超过90％的成对序列同一性并且彼此更密切相关。
本发明的一个方面涉及包含SEQ ID NO 7所示的氨基酸序列的多肽，或者是与其具有至少99.8％或100％序列同一性的多肽，其中该多肽具有氨基己糖苷酶活性。
本发明的一个方面涉及包含SEQ ID NO 8所示的氨基酸序列的多肽，或者是与其具有至少96％，例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％或100％序列同一性的多肽，其中该多肽具有氨基己糖苷酶活性。
本发明的一个方面涉及包含SEQ ID NO 9所示的氨基酸序列的多肽，或者是与其具有至少95％，例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％或100％序列同一性的多肽，其中该多肽具有氨基己糖苷酶活性。
本发明的一个方面涉及包含SEQ ID NO 10所示的氨基酸序列的多肽，或者是与其具有至少96％，例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％或100％序列同一性的多肽，其中该多肽具有氨基己糖苷酶活性。
本发明的一个方面涉及包含SEQ ID NO 11所示的氨基酸序列的多肽，或者是与其具有至少84％，例如至少85％、例如至少86％、例如至少87％、例如至少88％、例如至少89％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％或100％序列同一性的多肽，其中该多肽具有氨基己糖苷酶活性。
本发明的多肽均位于相同的进化枝内，土地芽孢杆菌进化枝，并且都具有共同的功能的特征，包括在洗涤剂存在下的深度清洁特性。诸位发明人惊讶地发现，包含具有SEQID NO 7、8、9、10、11的成熟多肽或其具有至少80％序列同一性的多肽的土地芽孢杆菌进化枝的多肽享有特异性的特性，更精确地，该进化枝所包含的多肽均具有良好的深度清洁效果，具有广泛的表面活性剂例如LAS，并因此特别适用于具有表面活性剂的洗涤剂，例如在包含阴离子、非离子、阳离子和/或两性表面活性剂的洗涤剂中。
如已经描述的，具有氨基己糖苷酶活性的本发明的多肽可以包含Glyco_hydro_20，例如GH20的结构域。包含GH20结构域的多肽可包含若干基序，一个实例是位于对应于嗜糖土地芽孢杆菌(SEQ ID NO 9)中的位置158至161的位置的GXDE(SEQ ID NO 18)。残基D和E是GH20的关键催化残基(SEQ ID NO 9中的位置160和161)。GH20多肽可以分成多个不同的子簇或进化枝，下面列出了特定的结构域的实例。鉴定了优选地由本发明的多肽共享的另外的结构域。该结构域之前未被描述，该结构域被称作IAS，且该结构域的多肽除了具有氨基己糖苷酶活性之外，例如PNAG活性，其特征在于包含某些基序，例如[EQ][NRSHA][YVFL][AGSTC][IVLF][EAQYN][SN](SEQ ID NO 19)中的一个或多个，对应于SEQ ID NO 9的位置44至50的ESYAIAS。鉴定了优选地由本发明的多肽共享的另一个的结构域。此结构域之前未描述过。该结构域被称作WND，且该结构域的多肽包含GH20结构域，是细菌来源的并且除了具有PNAG活性之外，其特征在于包含某些基序。结构域的多肽可包含基序[VIM][LIV]G[GAV]DE[VI][PSA](SEQ ID NO:20)，对应于SEQ ID NO 9的位置156至163，其中G(对应于SEQ ID NO 9中的位置158)在土地芽孢杆菌进化枝中是完全保守的，并且E是GH20的关键催化残基(SEQ ID NO 9中的位置160和161)。可以由本发明的多肽包含的另一个基序是WND[SQR][IVL][TLVM](SEQ ID NO:21)，在SEQ ID NO 9中的193至198，其中W(SEQ ID NO 9中的位置193)是活性位点口袋的一部分，并且推定涉及PNAG底物的N-乙酰基团的结合。土地芽孢杆菌进化枝的多肽可以进一步细分为称作QSTL的进化枝，其包含具有PNAG活性的细菌来源的WND结构域多肽。该进化枝的多肽包含基序实例QSTL(SEQ ID NO:22)，对应于SEQ IDNO 9的位置216至219，其中所有四个氨基在QSTL进化枝中是完全保守的并且推定涉及底物结合。可以由QSTL进化枝的多肽包含的另一个基序是NKFFY(SEQ ID NO:23)，SEQ ID NO 9中的273至277。可以由QSTL进化枝的多肽包含的另一个基序是NLD[DR]S(SEQ ID NO:24)，SEQ ID NO 9中的204至208。在一个方面中，本发明的多肽包含GXDE(SEQ ID NO 18)基序。在一个方面中，本发明的多肽包含[EQ][NRSHA][YVFL][AGSTC][IVLF][EAQYN][SN](SEQ IDNO 19)基序。在一个方面中，本发明的多肽包含基序[VIM][LIV]G[GAV]DE[VI][PSA](SEQID NO:20)。在一个方面中，本发明的多肽包含基序WND[SQR][IVL][TLVM](SEQ ID NO:21)。在一个方面中，本发明的多肽包含基序QSTL(SEQ ID NO 22)。在一个方面中，本发明的多肽包含基序NKFFY(SEQ ID NO:23)。在一个方面中，本发明的多肽包含基序NLD[DR]S(SEQ IDNO:24)。包含在QSTL进化枝中的本发明多肽的比对示出于图2中。
本发明的一些方面涉及包含基序GXDE(SEQ ID NO 18)或[EQ][NRSHA][YVFL][AGSTC][IVLF][EAQYN][SN](SEQ ID NO 19)中的一个或两个的多肽，其中该多肽包含选自SEQ ID NO 7、8、9、10和11所示的多肽的氨基酸序列或具有其至少80％序列同一性的多肽。
本发明的一些方面涉及包含基序[VIM][LIV]G[GAV]DE[VI][PSA](SEQ ID NO 20)或WND[SQR][IVL][TLVM](SEQ ID NO 21)中的一个或两个的多肽，其中该多肽包含选自SEQID NO 7、8、9、10和11所示的多肽的氨基酸序列或具有其至少80％序列同一性的多肽。
本发明的一些方面涉及包含基序QSTL(SEQ ID NO 22)、NKFFY(SEQ ID NO:23)或NLD[DR]S(SEQ ID NO:24)中的一个或多个的多肽，其中该多肽包含选自SEQ ID NO 7、8、9、10和11所示的多肽的氨基酸序列或具有其至少80％序列同一性的多肽。
本发明的一个方面涉及包含基序[VIM][LIV]G[GAV]DE[VI][PSA](SEQ ID NO 20)或WND[SQR][IVL][TLVM](SEQ ID NO 21)中的一个或两个的多肽，其中该多肽包含SEQ IDNO 7所示的氨基酸序列的多肽，或者是与其具有至少84％，例如至少85％、例如至少86％、例如至少87％、例如至少88％、例如至少89％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％或100％序列同一性的多肽，其中该多肽具有氨基己糖苷酶活性。
本发明的一个方面涉及包含基序[VIM][LIV]G[GAV]DE[VI][PSA](SEQ ID NO 20)或WND[SQR][IVL][TLVM](SEQ ID NO 21)中的一个或两个的多肽，其中该多肽包含SEQ IDNO 8所示的氨基酸序列的多肽，或者是与其具有至少84％，例如至少85％、例如至少86％、例如至少87％、例如至少88％、例如至少89％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％或100％序列同一性的多肽，其中该多肽具有氨基己糖苷酶活性。
本发明的一个方面涉及包含基序[VIM][LIV]G[GAV]DE[VI][PSA](SEQ ID NO 20)或WND[SQR][IVL][TLVM](SEQ ID NO 21)中的一个或两个的多肽，其中该多肽包含SEQ IDNO 9所示的氨基酸序列的多肽，或者是与其具有至少84％，例如至少85％、例如至少86％、例如至少87％、例如至少88％、例如至少89％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％或100％序列同一性的多肽，其中该多肽具有氨基己糖苷酶活性。
本发明的一个方面涉及包含基序[VIM][LIV]G[GAV]DE[VI][PSA](SEQ ID NO 20)或WND[SQR][IVL][TLVM](SEQ ID NO 21)中的一个或两个的多肽，其中该多肽包含SEQ IDNO 10所示的氨基酸序列的多肽，或者是与其具有至少84％，例如至少85％、例如至少86％、例如至少87％、例如至少88％、例如至少89％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％或100％序列同一性的多肽，其中该多肽具有氨基己糖苷酶活性。
本发明的一个方面涉及包含基序[VIM][LIV]G[GAV]DE[VI][PSA](SEQ ID NO 20)或WND[SQR][IVL][TLVM](SEQ ID NO 21)中的一个或两个的多肽，其中该多肽包含SEQ IDNO 11所示的氨基酸序列的多肽，或者是与其具有至少84％，例如至少85％、例如至少86％、例如至少87％、例如至少88％、例如至少89％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％或100％序列同一性的多肽，其中该多肽具有氨基己糖苷酶活性。
本发明的一个方面涉及包含基序QSTL(SEQ ID NO 22)、NKFFY(SEQ ID NO:23)或NLD[DR]S(SEQ ID NO:24)中的一个或多个的多肽，其中该多肽包含SEQ ID NO 7所示的氨基酸序列的多肽，或者是与其具有至少84％，例如至少85％、例如至少86％、例如至少87％、例如至少88％、例如至少89％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％或100％序列同一性的多肽，其中该多肽具有氨基己糖苷酶活性。
本发明的一个方面涉及包含基序QSTL(SEQ ID NO 22)、NKFFY(SEQ ID NO:23)或NLD[DR]S(SEQ ID NO:24)中的一个或多个的多肽，其中该多肽包含SEQ ID NO 8所示的氨基酸序列的多肽，或者是与其具有至少84％，例如至少85％、例如至少86％、例如至少87％、例如至少88％、例如至少89％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％或100％序列同一性的多肽，其中该多肽具有氨基己糖苷酶活性。
本发明的一个方面涉及包含基序QSTL(SEQ ID NO 22)、NKFFY(SEQ ID NO:23)或NLD[DR]S(SEQ ID NO:24)中的一个或多个的多肽，其中该多肽包含SEQ ID NO 9所示的氨基酸序列的多肽，或者是与其具有至少84％，例如至少85％、例如至少86％、例如至少87％、例如至少88％、例如至少89％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％或100％序列同一性的多肽，其中该多肽具有氨基己糖苷酶活性。
本发明的一个方面涉及包含基序QSTL(SEQ ID NO 22)、NKFFY(SEQ ID NO:23)或NLD[DR]S(SEQ ID NO:24)中的一个或多个的多肽，其中该多肽包含SEQ ID NO 10所示的氨基酸序列的多肽，或者是与其具有至少84％，例如至少85％、例如至少86％、例如至少87％、例如至少88％、例如至少89％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％或100％序列同一性的多肽，其中该多肽具有氨基己糖苷酶活性。
本发明的一个方面涉及包含基序QSTL(SEQ ID NO 22)、NKFFY(SEQ ID NO:23)或NLD[DR]S(SEQ ID NO:24)中的一个或多个的多肽，其中该多肽包含SEQ ID NO 11所示的氨基酸序列的多肽，或者是与其具有至少84％，例如至少85％、例如至少86％、例如至少87％、例如至少88％、例如至少89％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％或100％序列同一性的多肽，其中该多肽具有氨基己糖苷酶活性。
一个方面，涉及在清洁过程中包含SEQ ID NO 7、SEQ ID NO 8、SEQ ID NO 9、SEQID NO 10、SEQ ID NO 11所示的氨基酸序列的多肽，或者是与其具有至少84％，例如至少85％、例如至少86％、例如至少87％、例如至少88％、例如至少89％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％或100％序列同一性的多肽的用途，其中该多肽具有氨基己糖苷酶活性。本发明的一些方面涉及清洁例如洗涤剂组合物，该组合物包含a)一个或多个选自下组的多肽，该组由以下组成：SEQ ID NO 7、SEQ ID NO 8、SEQ ID NO 9、SEQID NO 10和SEQ ID NO 11，其中该多肽具有氨基己糖苷酶活性，和b)至少一种表面活性剂，优选地至少一种选自下组的表面活性剂，该组由以下组成：阴离子、非离子和/或阳离子表面活性剂。
本发明的一个方面涉及包含至少0.001ppm具有氨基己糖苷酶活性的多肽和至少一种佐剂成分的组合物，其中该多肽选自下组，该组由以下组成：与SEQ ID NO 7、8、9、10和11所示的成熟多肽具有至少60％序列同一性的多肽。
多肽的量可以在0.00004-100ppm的范围内，例如在0.00008-50ppm的范围内、在0.00001-20的范围内、在0.0002-20ppm的范围内、在0.0001-50ppm的范围内、在0.0002-50的范围内、在0.0004-50的范围内、在0.0008-50的范围内、在0.001-50ppm的范围内、0.01-50ppm、优选地0.0001-50ppm、更优选地0.0002-20ppm、更优选地0.0002-10ppm、更优选地0.001-10ppm、并且最优选地0.002-10ppm。本发明的氨基己糖苷酶的量可以对应于至少0.00001ppm，例如至少0.00002ppm、至少0.0001ppm、至少0.0002ppm、至少0.0005ppm、至少0.001ppm、至少0.002mg ppm、至少0.005ppm、至少0.01ppm或至少0.02ppm。该组合物可以包含至少0.00008％、优选地至少0.0000.1％、0.00002％、0.000.1％、0.0002％、0.001％、0.002％、0.003％、0.004％、0.005％、0.006％、0.008％、0.01％、0.02％、0.03％、0.05％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％或1.0％氨基己糖苷酶。
优选地，该多肽具有N-乙酰葡糖苷酶活性和/或β-N-乙酰葡糖苷酶活性，例如，对PNAG的活性。在一个方面中，该多肽包含基序GXDE(SEQ ID NO18)、[EQ][NRSHA][YVFL][AGSTC][IVLF][EAQYN][SN](SEQ ID NO 19)、[VIM][LIV]G[GAV]DE[VI][PSA](SEQ ID NO:20)、WND[SQR][IVL][TLVM](SEQ ID NO:21)、QSTL(SEQ ID NO 22)、NKFFY(SEQ ID NO:23)、NLD[DR]S(SEQ ID NO:24)中的一个或多个。在一个方面中，该多肽具有N-乙酰葡糖苷酶活性和/或β-N-乙酰葡糖苷酶活性，例如，对PNAG的活性，并且包含基序GXDE(SEQ ID NO 18)、[EQ][NRSHA][YVFL][AGSTC][IVLF][EAQYN][SN](SEQ ID NO 19)、[VIM][LIV]G[GAV]DE[VI][PSA](SEQ ID NO:20)、WND[SQR][IVL][TLVM](SEQ ID NO:21)、QSTL(SEQ ID NO 22)、NKFFY(SEQ ID NO:23)、NLD[DR]S(SEQ ID NO:24)中的一个或多个。在一个方面中，该多肽与SEQ ID NO 7、SEQ ID NO 8、SEQ ID NO 9、SEQ ID NO 10和SEQ ID NO 11所示的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性。
在一个方面中，该多肽具有N-乙酰葡糖苷酶活性和/或β-N-乙酰葡糖苷酶活性，例如，对PNAG的活性，并且包含基序GXDE(SEQ ID NO 18)、[EQ][NRSHA][YVFL][AGSTC][IVLF][EAQYN][SN](SEQ ID NO 19)、[VIM][LIV]G[GAV]DE[VI][PSA](SEQ ID NO:20)、WND[SQR][IVL][TLVM](SEQ ID NO:21)、QSTL(SEQ ID NO 22)、NKFFY(SEQ ID NO:23)、NLD[DR]S(SEQID NO:24)中的一个或多个，其中该多肽与SEQ ID NO 7、SEQ ID NO 8、SEQ ID NO 9、SEQID NO 10和SEQ ID NO 11所示的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性。
在一个方面中，该多肽包含或由SEQ ID NO 7或SEQ ID NO 2的成熟多肽组成、包含或由SEQ ID NO 8或SEQ ID NO 4的成熟多肽组成、包含或由SEQ ID NO 9或SEQ ID NO 6的成熟多肽组成、包含或由SEQ ID NO 10或SEQ ID NO 13的成熟多肽组成、或包含或由SEQID NO 11或SEQ ID NO 15的成熟多肽组成。
该组合物优选地是清洁组合物，优选地衣物洗涤或餐具洗涤组合物。本发明的一些方面涉及包含本发明多肽和佐剂成分的组合物，其中该佐剂成分选自，
a)至少一种助洗剂，
b)至少一种表面活性剂，和
至少一种漂白组分。
本发明的一些方面涉及清洁组合物例如洗涤剂组合物，该组合物包含a)一个或多个选自下组的多肽或与其具有至少80％序列同一性的多肽，该组由以下组成：SEQ ID NO7、SEQ ID NO 8、SEQ ID NO 9、SEQ ID NO 10和SEQ ID NO 11，其中该多肽具有氨基己糖苷酶活性，和b)至少一种表面活性剂，优选地至少一种选自下组的表面活性剂，该组由以下组成：阴离子、非离子和/或阳离子表面活性剂。
本发明的一些方面涉及洗涤剂组合物，该洗涤剂组合物包含：
a)至少0.01ppm的活性酶多肽，其中该酶多肽选自下组或与其具有至少80％序列同一性的多肽，该组由以下组成：SEQ ID NO 7、SEQ ID NO 8或SEQ ID NO 9，其中该多肽具有氨基己糖苷酶活性，和
b)从约2wt％至约60wt％的表面活性剂，或从约5wt％至约60wt％的表面活性剂。
本发明的一些方面涉及洗涤剂组合物，该洗涤剂组合物包含：
a)至少0.0001ppm的活性酶多肽，其中该酶多肽选自下组或与其具有至少80％序列同一性的多肽，该组由以下组成：SEQ ID NO 7、SEQ ID NO 8、SEQ ID NO 9、SEQ ID NO10和SEQ ID NO 11，其中该多肽具有氨基己糖苷酶活性，和
b)从约2wt％至约60wt％的表面活性剂、或从约5wt％至约60wt％的表面活性剂、从约5wt％至约60wt％的表面活性剂。
该组合物优选地包含从约2wt％至约60wt％、从约5wt％至约50wt％、从约5wt％至约40wt％、从约5wt％至约30wt％、从约5wt％至约20wt％、从约5wt％至约10wt％的阴离子表面活性剂和/或非离子表面活性剂。该表面活性剂可以是在如上描述的非离子、阴离子和/或两性离子型表面活性剂中选择的，优选地阴离子或非离子型表面活性剂也可以使用两性离子型表面活性剂。通常，优选是漂白剂稳定的表面活性剂。优选的阴离子型表面活性剂是硫酸盐表面活性剂并且具体地烷基醚硫酸盐，特别是C9-C15醇醚硫酸盐、C12-15伯醇乙氧基化物、C8-C16酯硫酸盐和C10-C14酯硫酸盐，例如单十二烷基酯硫酸盐。阴离子型表面活性剂的非限制性实例包括硫酸盐和磺酸盐，具体地是直链烷基苯磺酸盐(LAS)、LAS的异构体、支链烷基苯磺酸盐(BABS)、苯基链烷磺酸盐、α-烯烃磺酸盐(AOS)、烯烃磺酸盐、链烯烃磺酸盐、链烷-2,3-二基双(硫酸盐)、羟基链烷磺酸盐以及二磺酸盐、烷基硫酸盐(AS)(如十二烷基硫酸钠(SDS))、脂肪醇硫酸盐(FAS)、伯醇硫酸盐(PAS)、醇醚硫酸盐(AES或AEOS或FES，也被称为醇乙氧基硫酸盐或脂肪醇醚硫酸盐)、仲链烷磺酸盐(SAS)、石蜡烃磺酸盐(PS)、酯磺酸盐、磺化的脂肪酸甘油酯、α-磺酸基脂肪酸甲酯(α-SFMe或SES)(包括甲酯磺酸盐(MES))、烷基琥珀酸或烯基琥珀酸、十二烯基/十四烯基琥珀酸(DTSA)、氨基酸的脂肪酸衍生物、磺酸基琥珀酸的二酯和单酯或脂肪酸的盐(皂)、及其组合。阴离子型表面活性剂优选地以盐的形式添加至洗涤剂中。在这些盐中的合适的阳离子为碱金属离子，例如钠、钾和锂以及铵盐，例如(2-羟基乙基)铵、二(2-羟基乙基)铵和三(2-羟基乙基)铵盐。非离子型表面活性剂的非限制性实例包括醇乙氧基化物(AE或AEO)、醇丙氧基化物、丙氧基化的脂肪醇(PFA)、烷氧基化的脂肪酸烷基酯(例如乙氧基化的和/或丙氧基化的脂肪酸烷基酯)、烷基酚乙氧基化物(APE)、壬基酚乙氧基化物(NPE)、烷基多糖苷(APG)、烷氧基化的胺、脂肪酸单乙醇酰胺(FAM)、脂肪酸二乙醇酰胺(FADA)、乙氧基化的脂肪酸单乙醇酰胺(EFAM)、丙氧基化的脂肪酸单乙醇酰胺(PFAM)、多羟基烷基脂肪酸酰胺、或葡糖胺的N-酰基N-烷基衍生物(葡糖酰胺(GA)、或脂肪酸葡糖酰胺(FAGA))、连同在SPAN和TWEEN商品名下可获得的产品、及其组合。可商购的非离子型表面活性剂包括来自BASF公司的PlurafacTM、LutensolTM和PluronicTM类、来自科宁公司(Cognis)的DehyponTM系列和来自科莱恩特公司(Clariant)的GenapolTM系列。
在本发明的一些方面中，本发明的洗涤剂组合物包含：
a)至少0.01ppm的活性酶多肽，其中该酶多肽属于土地芽孢杆菌进化枝并且选自下组或与其具有至少60％序列同一性的多肽，该组由以下组成：SEQ ID NO 7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO 9、SEQ ID NO 10和SEQ ID NO 11，其中该多肽具有氨基己糖苷酶活性，
b)从约2wt％至约60wt％的至少一种表面活性剂
在本发明的一个优选的方面，阴离子/非离子表面活性剂的比率高于1，即阴离子表面活性剂的含量高于非离子表面活性剂的量。因此，本发明的一个方面涉及洗涤剂组合物，该洗涤剂组合物包含：
a)至少0.01ppm的活性酶多肽，其中该酶多肽属于土地芽孢杆菌进化枝并且选自下组或与其具有至少60％序列同一性的多肽，该组由以下组成：SEQ ID NO 7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO 9、SEQ ID NO 10和SEQ ID NO 11，其中该多肽具有氨基己糖苷酶活性，
b)从约5wt％至约50wt％的阴离子表面活性剂，和
c)从约1wt％至约8wt％的非离子表面活性剂。
本发明的多肽也可以配制成组合物例如，任选地包含助洗剂的液体衣物洗涤组合物，该组合物包含：
a)至少0.0001ppm，例如0.01ppm的活性酶多肽，其中该酶多肽属于土地芽孢杆菌进化枝并且选自下组或与其具有至少60％序列同一性的多肽，该组由以下组成：SEQ ID NO7、SEQ ID NO 8、SEQ ID NO 9、SEQ ID NO 10和SEQ ID NO 11，其中该多肽具有氨基己糖苷酶活性，
b)从约2wt％至约60wt％的至少一种表面活性剂，和任选地
c)从约5wt％至约50wt％的至少一种助洗剂，例如碳酸盐、沸石、磷酸盐助洗剂、钙螯合剂助洗剂或络合剂。
该组合物包含至少一种助洗剂，其中该助洗剂的添加量为从约0至约65％wt％、从约40wt％至约65wt％、从约20wt％至约65wt％、从约10wt％至约50wt％或从约5wt％至约50wt％的重量，其中该助洗剂选自磷酸盐、柠檬酸钠助洗剂、碳酸钠、硅酸钠、钠和沸石。
本发明的一个方面涉及一种清洁组合物，该组合物包含：
a)至少0.0001ppm的多肽，其中该多肽属于土地芽孢杆菌进化枝，包含基序[VIM][LIV]G[GAV]DE[VI][PSA](SEQ ID NO 20)或WND[SQR][IVL][TLVM](SEQ ID NO 21)中的一个或两个，其中该多肽选自下组和与其具有至少80％序列同一性的多肽，该组由以下组成：SEQ ID NO 7、SEQ ID NO 8、SEQ ID NO 9、SEQ ID NO 10和SEQ ID NO 11，其中该多肽具有氨基己糖苷酶活性，和任选地
b)从约2wt％至约60wt％的至少一种表面活性剂，和任选地
c)从约5wt％至约50wt％的至少一种助洗剂，和任选地
d)从约1wt％至约15wt％的至少一种漂白组分。
该表面活性剂可以是上文描述的那些中的任一个。
优选地，助洗剂选自磷酸盐、柠檬酸钠助洗剂、碳酸钠、硅酸钠、铝硅酸钠(沸石)。合适的助洗剂是碱金属或磷酸铵、聚磷酸盐、磷酸盐、聚磷酸盐、碳酸盐、碳酸氢盐、硼酸盐、柠檬酸盐和聚羧酸盐。柠檬酸盐助洗剂，例如柠檬酸及其可溶性盐(特别是钠盐)是聚羧酸盐助洗剂。柠檬酸盐可以与沸石、硅酸盐如BRITESIL类型、和/或层状硅酸盐助洗剂组合使用。助洗剂优选以按重量计约0-65％(例如按重量计约5％至约50％)的量添加。在组合物中，助洗剂的水平典型地为按重量计约40％-65％、特别地是按重量计约50％-65％、特别地是按重量计从20％-50％。助洗剂和/或共助洗剂可以特别地是与Ca和Mg形成水溶性络合物的螯合试剂。可以利用本领域中已知的、在清洁洗涤剂中使用的任何助洗剂和/或共助洗剂。助洗剂的非限制性实例包括沸石、二磷酸盐(焦磷酸盐)、三磷酸盐例如三磷酸钠(STP或STPP)、碳酸盐例如碳酸钠、可溶性硅酸盐例如偏硅酸钠、层状硅酸盐(例如来自赫斯特公司(Hoechst)的SKS-6)和(羧甲基)菊粉(CMI)及其组合。助洗剂的进一步的非限制性实例包括柠檬酸盐；螯合剂，例如氨基羧酸盐、氨基聚羧酸盐和磷酸盐；以及烷基琥珀酸或烯基琥珀酸。另外的具体实例包括2,2',2”-次氮基三乙酸(NTA)、乙二胺四乙酸(EDTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、亚氨基二琥珀酸(IDS)、乙二胺-N,N'-二琥珀酸(EDDS)、甲基甘氨酸-N,N-二乙酸(MGDA)、谷氨酸-N,N-二乙酸(GLDA)、1-羟基乙烷-1,1-二膦酸、N-(2-羟基乙基)亚氨基二乙酸(EDG)、天冬氨酸-N-单乙酸(ASMA)、天冬氨酸-N,N-二乙酸(ASDA)、天冬氨酸-N-单丙酸(ASMP)、亚氨基二琥珀酸(IDA)、N-(磺甲基)天冬氨酸(SMAS)、N-(2-磺乙基)-天冬氨酸(SEAS)、N-(磺甲基谷氨酸(SMGL)、N-(2-磺乙基)-谷氨酸(SEGL)、N-甲基亚氨基二乙酸(MIDA)、丝氨酸-N,N-二乙酸(SEDA)、异丝氨酸-N,N-二乙酸(ISDA)、苯丙氨酸-N,N-二乙酸(PHDA)、邻氨基苯甲酸-N,N-二乙酸(ANDA)、磺胺酸-N,N-二乙酸(SLDA)、牛磺酸-N,N-二乙酸(TUDA)以及N'-(2-羟基乙基)-亚乙基二胺-N,N,N'-三乙酸(HEDTA)、二乙醇甘氨酸(DEG)、及其组合和盐。
合适本文使用的磷酸盐包括1-羟基乙烷-1,1-二膦酸(HEDP)、乙二胺四(亚甲基膦酸)(EDTMPA)、二亚乙基三胺五(亚甲基膦酸)(DTMPA或DTPMPA或DTPMP)、次氮基三(亚甲基膦酸)(ATMP或NTMP)、2-膦酰基丁烷-1,2,4-三羧酸(PBTC)、六亚甲基二胺四(亚甲基膦酸)(HDTMP)。
该组合物还可以含有按重量计0-50％，如约5％至约30％的洗涤剂共助洗剂。
该组合物可以只包括共助洗剂，或与助洗剂，例如沸石助洗剂结合。共助洗剂的非限制性实例包括聚丙烯酸酯的均聚物或其共聚物，例如聚(丙烯酸)(PAA)或共聚(丙烯酸/马来酸)(PAA/PMA)或聚天冬氨酸。
另外的示例性助洗剂和/或共助洗剂描述于例如WO 09/102854、US5977053中。
在一个优选的实施例中，该助洗剂是基于非磷的助洗剂，例如柠檬酸和/或甲基甘氨酸-N,N-二乙酸(MGDA)和/或谷氨酸-N,N-二乙酸(GLDA)和/或其盐。
本发明的一些方面涉及组合物，该组合物包含至少一种酶多肽，其中该酶选自具有下组的多肽或与其具有至少60％序列同一性的多肽，该组由以下组成：SEQ ID NO 7、SEQID NO 8、SEQ ID NO 9、SEQ ID NO 10和SEQ ID NO 11，其中该多肽具有氨基己糖苷酶活性和选自柠檬酸，甲基甘氨酸-N,N-二乙酸(MGDA)和/或谷氨酸-N,N-二乙酸(GLDA)及其混合物的非磷酸盐助洗剂。
在一个方面中，该组合物是洗涤剂组合物，例如衣物洗涤组合物，自动餐具洗涤组合物(ADW)，该组合物包含：
a)至少0.0001ppm，例如0.01ppm的活性酶多肽，其中该酶多肽选自下组或与其具有至少60％序列同一性的多肽，该组由以下组成：SEQ ID NO7、SEQ ID NO 8、SEQ ID NO 9、SEQ ID NO 10和SEQ ID NO 11，其中该多肽具有氨基己糖苷酶活性，和
b)10wt％-50wt％的助洗剂，该助洗剂选自柠檬酸、甲基甘氨酸-N,N-二乙酸(MGDA)和/或谷氨酸-N,N-二乙酸(GLDA)及其混合物，以及任选地
c)至少一种漂白组分。
该组合物可以含有按重量计0-30％，例如约1％至约20％、例如约1％至约10％、例如约1％至约5％、例如约10％至约30％、例如约5％至约10％或按漂白系统重量计例如约10％至约20％。可以利用包含本领域已知的用于清洁洗涤剂中的组分的任何漂白系统。适合的漂白系统组分包括过氧化氢源；过酸源；和漂白催化剂或增效剂。
过氧化氢源
合适的过氧化氢的来源是无机过酸盐，包括碱金属盐例如过碳酸钠和过硼酸钠(通常是一水合物或四水合物)，以及过氧化氢―尿素(1/1)。
过酸源
过酸可以是(a)直接作为预成型过酸掺入，或(b)从过氧化氢和漂白活化剂(过水解)在洗液中原位形成，或(c)从过氧化氢和过氧化氢酶和后者合适的底物(例如酯)在洗液中原位形成。
a)合适的预成型过酸包括但不限于：过氧羧酸例如过氧苯甲酸及其环取代的衍生物、过氧基-α-萘甲酸、过氧邻苯二甲酸、过氧月桂酸、过氧硬脂酸、ε-邻苯二甲酰亚氨基过氧羊油酸[邻苯二甲酰亚氨基过氧己酸(PAP)]、和邻-羧基苯甲酰胺基过氧羊油酸；脂肪族和芳香族二过氧二羧酸例如二过氧十二烷二酸、二过氧壬二酸、二过氧癸二酸、二过氧十三烷二酸、2-癸基二过氧丁二酸、以及二过氧邻苯二甲酸、二过氧间苯二甲酸和二过氧对苯二甲酸、过亚氨酸、过氧单硫酸、过氧二硫酸、过氧磷酸、过氧硅酸、以及所述化合物的混合物。应当理解的是，在有些情况下，所提到的过酸可能最好是作为适合的盐的添加，例如碱金属盐(例如)或碱土金属盐。
b)合适的漂白活化剂包括属于酯、酰胺、酰亚胺、腈类或酸酐类别的那些，以及适用时，其盐。合适的实例是四乙酰基乙二胺(TAED)、4-[(3,5,5-三甲基己酰基)氧基]苯-1-磺酸钠(ISONOBS)、4-(十二酰基氧基)苯-1-磺酸钠(LOBS)、4-(癸酰基氧基)苯-1-磺酸钠、4-(癸酰基氧基)苯甲酸(DOBA)、4-(壬酰基氧基)苯-1-磺酸钠(NOBS)和/或披露于WO 98/17767中的那些。感兴趣的漂白活化剂的家族披露于EP624154中并且在那个家族中特别地优选的是乙酰柠檬酸三乙酯(ATC)。ATC或短链甘油三酸酯(像三醋精)具有它们是环境友好的优点。此外，乙酰柠檬酸三乙酯和三醋精在存储时在产品中具有良好的水解稳定性，并且是有效的漂白活化剂。最后，ATC是多功能的，因为在过水解反应中释放的柠檬酸盐可以作为助洗剂起作用。
漂白催化剂和增效剂
该漂白系统还可以包括漂白催化剂或增效剂。
可用于本发明组合物中的漂白催化剂的一些非限制性实例包括草酸锰、乙酸锰、锰胶原、钴-胺催化剂和锰三氮杂环壬烷(MnTACN)催化剂；特别优选锰与1,4,7-三甲基-1,4,7-三氮杂环壬烷(Me3-TACN)或1,2,4,7-四甲基-1,4,7-三氮杂环壬烷(Me4-TACN)的络合物，具体地是Me3-TACN，如双核锰络合物[(Me3-TACN)Mn(O)3Mn(Me3-TACN)](PF6)2、和[2,2',2”-次氮基三(乙烷-1,2-二基氮烷基亚基-κN-甲基亚基)三酚并-κ3O]锰(III)。这些漂白催化剂也可以是其他金属化合物，如铁或钴络合物。
在其中过酸的来源包括在内的一些实施例中，可以使用具有下式之一的有机漂白催化剂或漂白增效剂：
(iii)及其混合物；其中每个R1独立地是含有从9到24个碳的支链烷基或含有从11到24个碳的直链烷基，优选地每个R1独立地是含有从9到18个碳的支链烷基或含有从11到18个碳的直链烷基，更优选地每个R1独立地选自下组，该组由以下组成：2-丙基庚基、2-丁基辛基、2-戊基壬基、2-己基癸基、十二烷基、十四烷基、十六烷基、十八烷基、异壬基、异癸基、异十三烷基以及异十五烷基。其他示例性漂白系统描述于例如WO 2007/087258、WO2007/087244、WO 2007/087259、EP 1867708(维生素K)以及WO 2007/087242中。适合的光漂白剂可以例如是磺化的酞菁锌或酞菁铝。
本发明涉及具有氨基己糖苷酶活性的土地芽孢杆菌进化枝的多肽，组合物例如，包含该多肽的洗涤剂组合物，以及包含本发明多肽的洗涤剂组合物用于深度清洁物品例如纺织品的用途。
因此，本发明的一些方面涉及清洁组合物，例如，洗涤剂组合物，该组合物包含：
a)土地芽孢杆菌进化枝的至少0.0001ppm，例如0.001ppm多肽，任选地包含选自下组的基序中的一个或多个，该组由以下组成：GXDE(SEQ ID NO 18)、[EQ][NRSHA][YVFL][AGSTC][IVLF][EAQYN][SN](SEQ ID NO19)、[VIM][LIV]G[GAV]DE[VI][PSA](SEQ ID NO:20)、WND[SQR][IVL][TLVM](SEQ ID NO:21)、QSTL(SEQ ID NO 22)、NKFFY(SEQ ID NO:23)、NLD[DR]S(SEQ ID NO:24)，其中该酶多肽选自下组和与其具有至少60％(例如至少70％、例如至少80％、或例如至少90％)序列同一性的多肽，该组由以下组成：SEQ ID NO 7、SEQ IDNO 8、SEQ ID NO 9、SEQ ID NO 10和SEQ ID NO 11，其中该多肽具有氨基己糖苷酶活性，和任选地
b)从约10wt％至约50wt％的助洗剂，优选地选自柠檬酸、甲基甘氨酸-N,N-二乙酸(MGDA)和/或谷氨酸-N,N-二乙酸(GLDA)及其混合物，和任选地
c)从约5wt％至约50wt％的表面活性剂，优选地选自阴离子表面活性剂，例如LAS、AOS、AEOS和/或非离子表面活性剂例如AE或AEO，和任选地
d)至少一种漂白组分，优选地选自过碳酸盐、过硫酸盐和过酸。
因此，本发明的一些方面涉及洗涤剂组合物，该组合物包含：
a)土地芽孢杆菌进化枝的至少0.0001ppm，例如0.001ppm多肽，任选地包含选自下组的基序中的一个或多个，该组由以下组成：GXDE(SEQ ID NO 18)、[EQ][NRSHA][YVFL][AGSTC][IVLF][EAQYN][SN](SEQ ID NO 19)、[VIM][LIV]G[GAV]DE[VI][PSA](SEQ ID NO:20)、WND[SQR][IVL][TLVM](SEQ ID NO:21)、QSTL(SEQ ID NO 22)、NKFFY(SEQ ID NO:23)、NLD[DR]S(SEQ ID NO:24)，其中该酶多肽选自下组和与其具有至少60％(例如至少70％、例如至少80％、或例如至少90％)序列同一性的多肽，该组由以下组成：SEQ ID NO 7、SEQ IDNO 8、SEQ ID NO 9、SEQ ID NO 10和SEQ ID NO 11，其中该多肽具有氨基己糖苷酶活性，和任选地
b)从约10wt％至约50wt％的助洗剂，优选地选自柠檬酸、甲基甘氨酸-N,N-二乙酸(MGDA)和/或谷氨酸-N,N-二乙酸(GLDA)及其混合物，和任选地
c)从约5wt％至约50wt％的表面活性剂，优选地选自阴离子表面活性剂，例如LAS、AOS、AEOS和/或非离子表面活性剂例如AE或AEO，和任选地
d)至少一种漂白组分，优选地选自过碳酸盐、过硫酸盐和过酸。
因此，本发明的一些方面涉及洗涤剂组合物，该组合物包含：
a)土地芽孢杆菌进化枝的至少0.0001ppm，例如0.001ppm的多肽，任选地包含选自下组的基序中的一个或多个，该组由以下组成：GXDE(SEQ ID NO 18)、[EQ][NRSHA][YVFL][AGSTC][IVLF][EAQYN][SN](SEQ ID NO19)、[VIM][LIV]G[GAV]DE[VI][PSA](SEQ ID NO:20)、WND[SQR][IVL][TLVM](SEQ ID NO:21)、QSTL(SEQ ID NO 22)、NKFFY(SEQ ID NO:23)、NLD[DR]S(SEQ ID NO:24)，其中该酶多肽选自下组和与其具有至少60％(例如至少70％、例如至少80％、或例如至少90％)序列同一性的多肽，该组由以下组成：SEQ ID NO 7、SEQ IDNO 8、SEQ ID NO 9、SEQ ID NO 10和SEQ ID NO 11，其中该多肽具有氨基己糖苷酶活性，和任选地
b)从约10wt％至约50wt％的助洗剂，优选地选自柠檬酸、甲基甘氨酸-N,N-二乙酸(MGDA)和/或谷氨酸-N,N-二乙酸(GLDA)及其混合物，和任选地
c)从约5wt％至约50wt％的表面活性剂，优选地选自阴离子表面活性剂，例如LAS、AOS、AEOS和/或非离子表面活性剂例如AE或AEO，和任选地
d)至少一种漂白组分，其中该漂白剂是过氧化物，且漂白催化剂是锰化合物，其中，氧漂白剂优选地是过碳酸盐，且锰催化剂优选地是1,4,7-三甲基-1,4,7-三氮杂环壬烷或乙酸锰(III)四水合物(MnTACN)。
一个方面涉及如上所述的组合物用于深度清洁物品，例如纺织品的用途。
具有氨基己糖苷酶活性的本发明多肽可以用于深度清洁例如硬表面、纺织品和/或织物的物品。在本发明的一些方面中，本发明的多肽例如该多肽与SEQ ID NO 2、SEQ IDNO 4、SEQ ID NO 6、SEQ ID NO 13和SEQ ID NO 15的成熟多肽或与SEQ ID NO 7、SEQ IDNO 8、SEQ ID NO 9、SEQ ID NO 10和SEQ ID NO 11的成熟多肽具有至少60％，例如至少70％，例如至少80％或例如至少90％的序列同一性，具有β-N-乙酰葡糖苷酶活性，并且在一些方面中该氨基己糖苷酶活性是β-N-乙酰葡糖苷酶活性且本发明的多肽是β-N-乙酰葡糖苷酶。
本发明的一个方面涉及土地芽孢杆菌进化枝的多肽在清洁过程(例如衣物洗涤和/或餐具洗涤)中的用途，其中该多肽具有氨基己糖苷酶活性，优选地N-乙酰葡糖苷酶活性和/或β-N-乙酰葡糖苷酶活性。
本发明的一个方面涉及包含基序GXDE(SEQ ID NO 18)、[EQ][NRSHA][YVFL][AGSTC][IVLF][EAQYN][SN](SEQ ID NO 19)、[VIM][LIV]G[GAV]DE[VI][PSA](SEQ ID NO:20)、WND[SQR][IVL][TLVM](SEQ ID NO:21)、QSTL(SEQ ID NO 22)、NKFFY(SEQ ID NO:23)、NLD[DR]S(SEQ ID NO:24)中的一个或多个的多肽的用途。
本发明的一个方面涉及土地芽孢杆菌进化枝的多肽在清洁过程(例如衣物洗涤和/或餐具洗涤)中的用途，其中该多肽具有氨基己糖苷酶活性，优选地N-乙酰葡糖苷酶活性和/或β-N-乙酰葡糖苷酶活性，其中该多肽包含基序GXDE(SEQ ID NO 18)、[EQ][NRSHA][YVFL][AGSTC][IVLF][EAQYN][SN](SEQ ID NO 19)、[VIM][LIV]G[GAV]DE[VI][PSA](SEQID NO:20)、WND[SQR][IVL][TLVM](SEQ ID NO:21)、QSTL(SEQ ID NO 22)、NKFFY(SEQ IDNO:23)、NLD[DR]S(SEQ ID NO:24)中的一个或多个。
本发明的一个方面涉及土地芽孢杆菌进化枝的多肽用于深度清洁物品的用途，该多肽例如包含基序GXDE(SEQ ID NO 18)、[EQ][NRSHA][YVFL][AGSTC][IVLF][EAQYN][SN](SEQ ID NO 19)、[VIM][LIV]G[GAV]DE[VI][PSA](SEQ ID NO:20)、WND[SQR][IVL][TLVM](SEQ ID NO:21)、QSTL(SEQ ID NO 22)、NKFFY(SEQ ID NO:23)、NLD[DR]S(SEQ ID NO:24)中的一个或多个，其中该多肽具有氨基己糖苷酶活性且其中该多肽是与SEQ ID NO 7、SEQID NO 8、SEQ ID NO 9、SEQ ID NO 10或SEQ ID NO 11所示的成熟多肽具有至少60％，例如80％、85％、90％或95％序列同一性的多肽，其中该物品是纺织品。在本发明的一个方面中，具有氨基己糖苷酶活性的土地芽孢杆菌进化枝的多肽用于防止、减少或去除物品的粘性。在本发明的一个方面中，具有氨基己糖苷酶活性的土地芽孢杆菌进化枝的多肽可进一步被使用用于预处理纺织品，例如纺织品上的污渍。
本发明的一个方面涉及具有氨基己糖苷酶活性的土地芽孢杆菌进化枝的多肽用于在洗涤循环期间防止、减少或去除污垢的再沉积的用途。
此外，本发明的一个方面涉及具有氨基己糖苷酶活性的土地芽孢杆菌进化枝的多肽用于防止、减少或去除污垢对物品的附着的用途。在一个实施例中，该物品是纺织品。当该污垢没有附着于该物品时，该物品显得更干净。因此，本发明进一步涉及具有氨基己糖苷酶活性的土地芽孢杆菌进化枝的多肽用于维持或改善该物品白度的用途。
当使用物品(像T恤或运动衣)时，物品被暴露于来自使用者的身体和来自物品处于的使用环境中的其余部分的细菌。即使在洗涤该物品后，这能够引起物品上的恶臭。因此，本发明还涉及纺织品上的恶臭的去除或减少。该恶臭可能由产生具有令人不愉快气味的化合物的细菌引起。此类具有令人不愉快气味的化合物的一个实例是E-2-壬烯醛。该恶臭可以存在于新洗的仍是湿的纺织品上。或者该恶臭可以存在于新洗的基本上已经干了的纺织品上。该恶臭还可以存在于纺织品上，该纺织品在洗涤后储存了一段时间。本发明涉及减少或去除湿的或干的纺织品的恶臭例如E-2-壬烯醛。
本发明的一个方面涉及土地芽孢杆菌进化枝的多肽(例如包含基序GXDE(SEQ IDNO 18)、[EQ][NRSHA][YVFL][AGSTC][IVLF][EAQYN][SN](SEQ ID NO 19)、[VIM][LIV]G[GAV]DE[VI][PSA](SEQ ID NO:20)、WND[SQR][IVL][TLVM](SEQ ID NO:21)、QSTL(SEQ IDNO 22)、NKFFY(SEQ ID NO:23)、NLD[DR]S(SEQ ID NO:24)中的一个或多个)的以下用途，其中该多肽具有氨基己糖苷酶活性，优选地N-乙酰葡糖苷酶活性和/或β-N-乙酰葡糖苷酶活性，并且其中该多肽是与SEQ ID NO 7、SEQ ID NO 8、SEQ ID NO 9、SEQ ID NO 10和SEQ IDNO 11所示的成熟多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的多肽，
(i)用于防止、减少或去除该物品的粘性；
(ii)用于预处理物品上的污渍；
(iii)用于在洗涤循环期间防止、减少或去除污垢的再沉积；
(iv)用于防止、减少或去除污垢在该物品上的附着；
(v)用于维持或改善该物品的白度；
(vi)用于防止、减少或去除该物品的恶臭，
其中该物品是纺织品。
清洁，例如根据本发明的洗涤剂组合物可包含至少一种佐剂成分，例如该佐剂成分可以是表面活性剂和助洗剂和/或螯合剂，例如上述那些。佐剂成分也可以是以下任何一种絮凝助剂，染料转移抑制剂、酶、酶稳定剂、酶抑制剂、催化材料、漂白活化剂、过氧化氢、过氧化氢源、预形成的过酸、聚合的分散剂、粘土去污剂/抗再沉淀剂、增白剂、抑泡剂、染料、香料、结构弹力剂、织物柔软剂、载体、助水溶物、助洗剂和共助洗剂、织物调色剂、防沫剂、分散剂、加工助剂、和/或色素。
在一个实施例中，该洗涤剂佐剂成分是助洗剂或粘土去污剂/抗再沉淀剂。
在一个实施例中，洗涤剂佐剂成分是酶。该一种或多种酶可以选自下组，该组由以下组成：蛋白酶、脂肪酶、角质酶、淀粉酶、糖酶、纤维素酶、果胶酶、甘露聚糖酶、阿拉伯糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶和氧化酶。
除了具有氨基己糖苷酶活性的多肽外，还包含SEQ ID NO 7、SEQ ID NO 8、SEQ IDNO 9、SEQ ID NO 10、SEQ ID NO 11的多肽或具有氨基己糖苷酶活性并且具有其至少60％的序列同一性的多肽，本发明的清洁组合物可以进一步包含纤维素酶。合适的纤维素酶包括细菌来源或真菌来源的那些。包括化学修饰的突变体或蛋白质工程化的突变体。合适的纤维素酶包括来自芽孢杆菌属、假单胞菌属、腐质霉属、镰孢属、梭孢壳属、支顶孢属的纤维素酶，例如披露于US 4,435,307、US 5,648,263、US 5,691,178、US 5,776,757以及WO 89/09259中的由特异腐质霉、嗜热毁丝霉和尖孢镰孢产生的真菌纤维素酶。尤其适合的纤维素酶是具有颜色护理益处的碱性或中性纤维素酶。这类纤维素酶的实例是描述于EP 0 495257、EP 0 531 372、WO 96/11262、WO 96/29397、WO 98/08940中的纤维素酶。其他实例为纤维素酶多肽，例如描述于WO 94/07998、EP 0 531 315、US 5,457,046、US 5,686,593、US 5,763,254、WO 95/24471、WO 98/12307以及PCT/DK 98/00299中的那些。展现内切-β-1,4-葡聚糖酶活性的纤维素酶的实例(EC 3.2.1.4)是已经描述于WO 02/099091中的那些。纤维素酶的其他实例包括描述于WO 96/29397中的家族45纤维素酶，并且特别是在对应于WO 02/099091的SEQ ID NO 8中的以下位置的一个或多个位置处具有取代、插入和/或缺失的其多肽：2、4、7、8、10、13、15、19、20、21、25、26、29、32、33、34、35、37、40、42、42a、43、44、48、53、54、55、58、59、63、64、65、66、67、70、72、76、79、80、82、84、86、88、90、91、93、95、95d、95h、95j、97、100、101、102、103、113、114、117、119、121、133、136、137、138、139、140a、141、143a、145、146、147、150e、150j、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160c、160e、160k、161、162、164、165、168、170、171、172、173、175、176、178、181、183、184、185、186、188、191、192、195、196、200、和/或20，优选地选自P19A、G20K、Q44K、N48E、Q119H或Q146R。可商购的纤维素酶包括CelluzymeTM、Celluclean和CarezymeTM(诺维信公司(Novozymes A/S))、ClazinaseTM、和Puradax HATM(杰能科国际有限公司(Genencor International Inc.))、以及KAC-500(B)TM(花王株式会社(Kao Corporation))。
除了具有氨基己糖苷酶活性的多肽外，还包含SEQ ID NO 7、SEQ ID NO 8、SEQ IDNO 9、SEQ ID NO 10、SEQ ID NO 11或具有氨基己糖苷酶活性并且具有其至少60％的序列同一性的多肽，本发明的清洁组合物可以进一步包含纤维素酶。适合的蛋白酶包括细菌、真菌、植物、病毒或动物来源的那些，例如植物或微生物来源。优选的是微生物来源。包括化学修饰的突变体或蛋白质工程化的突变体。它可以是碱性蛋白酶，例如丝氨酸蛋白酶或金属蛋白酶。丝氨酸蛋白酶可以例如是S1家族(如胰蛋白酶)或S8家族(如枯草杆菌蛋白酶)。金属蛋白酶可以例如是来自例如M4家族的嗜热菌蛋白酶或其他金属蛋白酶，例如来自M5、M7或M8家族的那些。术语“枯草杆菌蛋白酶”是指根据Siezen等人，ProteinEngng.[蛋白质工程]4(1991)719-737和Siezen等人，Protein Science[蛋白质科学]6(1997)501-523的丝氨酸蛋白酶亚组。丝氨酸蛋白酶是通过在活性位点具有与底物形成共价加合物的丝氨酸来表征的蛋白酶的一个亚组。枯草杆菌蛋白酶(subtilase)可以划分为6个亚部，即，枯草杆菌蛋白酶家族、嗜热蛋白酶(Thermitase)家族、蛋白酶K家族、羊毛硫氨酸抗生素肽酶(Lantibiotic peptidase)家族、Kexin家族和Pyrolysin家族。枯草杆菌酶的实例是来源于芽孢杆菌属的那些，例如描述于US 7262042和WO 09/021867中的迟缓芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短小芽孢杆菌和吉氏芽孢杆菌；和描述于WO 89/06279中的枯草杆菌蛋白酶lentus、枯草杆菌蛋白酶Novo、枯草杆菌蛋白酶Carlsberg、地衣芽孢杆菌、枯草杆菌蛋白酶BPN’、枯草杆菌蛋白酶309、枯草杆菌蛋白酶147和枯草杆菌蛋白酶168以及描述于(WO 93/18140)中的蛋白酶PD138。其他有用的蛋白酶可以是描述于WO92/175177、WO 01/016285、WO 02/026024以及WO 02/016547中的那些。胰蛋白酶样蛋白酶的实例是胰蛋白酶(例如猪或牛来源的)和镰孢属蛋白酶(描述于WO89/06270、WO94/25583和WO 05/040372中)，以及源自纤维单胞菌(Cellumonas)的胰凝乳蛋白酶(描述于WO05/052161和WO05/052146中)。进一步优选的蛋白酶是来自迟缓芽孢杆菌DSM 5483的碱性蛋白酶(如描述于例如WO 95/23221中)、及其变体(描述于WO 92/21760、WO 95/23221、EP1921147以及EP 1921148中)。金属蛋白酶的实例是如描述于WO07/044993(杰能科国际公司(Genencor Int.))中的中性金属蛋白酶，例如衍生自解淀粉芽孢杆菌的那些。
有用的蛋白酶的实例是描述于以下中的变体：WO 92/19729、WO 96/034946、WO98/20115、WO 98/20116、WO 99/011768、WO 01/44452、WO 03/006602、WO 04/03186、WO 04/041979、WO 07/006305、WO 11/036263、WO 11/036264，尤其是在以下位置中的一个或多个处与WO 2016/001449的SEQ ID NO 1相比具有取代的变体：3、4、9、15、24、27、42、55、59、60、66、74、85、96、97、98、99、100、101、102、104、116、118、121、126、127、128、154、156、157、158、161、164、176、179、182、185、188、189、193、198、199、200、203、206、211、212、216、218、226、229、230、239、246、255、256、268以及269，其中这些位置对应于WO2016/001449的SEQ ID NO1所示的迟缓芽孢杆菌蛋白酶的位置。更优选的枯草杆菌酶变体可以包含以下突变的任何一种：S3T、V4I、S9R、S9E、A15T、S24G、S24R、K27R、N42R、S55P、G59E、G59D、N60D、N60E、V66A、N74D、N85S、N85R、G96S、G96A、S97G、S97D、S97A、S97SD、S99E、S99D、S99G、S99M、S99N、S99R、S99H、S101A、V102I、V102Y、V102N、S104A、G116V、G116R、H118D、H118N、N120S、S126L、P127Q、S128A、S154D、A156E、G157D、G157P、S158E、Y161A、R164S、Q176E、N179E、S182E、Q185N、A188P、G189E、V193M、N198D、V199I、Y203W、S206G、L211Q、L211D、N212D、N212S、M216S、A226V、K229L、Q230H、Q239R、N246K、N255W、N255D、N255E、L256E、L256D、T268A或R269H。这些蛋白酶变体优选地是在WO 2016/001449的SEQ ID NO 1所示的迟缓芽孢杆菌蛋白酶的变体、或者在WO 2016/001449的SEQ ID NO 2所示的解淀粉芽孢杆菌蛋白酶(BPN')的变体。这些蛋白酶变体与WO 2016/001449的SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2优选地具有至少80％序列同一性。
在以下一个或多个位置包含取代的蛋白酶变体,该位置对应于WO 2004/067737的SEQ ID NO 1的位置171、173、175、179或180，其中所述蛋白酶变体与WO 2004/067737的SEQID NO 1具有至少75％但少于100％的序列同一性。
适合的可商购蛋白酶包括以下列商标名出售的那些：DuralaseTm、DurazymTm、Ultra、Ultra、Ultra、Ultra、Blzae100T、Blaze125T、Blaze150T、和(诺维信公司(Novozymes A/S))，在以下商标名下出售的那些： PurafectPurafect Excellenz P1000TM、Excellenz P1250TM、Preferenz P100TM、PurafectPreferenz P110TM、Effectenz P1000TM、Effectenz P1050TM、PurafectEffectenz P2000TM、和(丹斯尼克公司(Danisco)/杜邦公司(DuPont))、AxapemTM(吉斯特布罗卡德斯公司(Gist-Brocases N.V.))、BLAP(在US 5352604的图29中示出的序列)及其变体(汉高公司(HenkelAG))和来自花王株式会社(Kao)的KAP(嗜碱芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶(Bacillusalkalophilus))。
除了具有氨基己糖苷酶活性的多肽外，还包含SEQ ID NO 7、SEQ ID NO 8、SEQ IDNO 9、SEQ ID NO 10、SEQ ID NO 11的多肽或具有氨基己糖苷酶活性并且具有其至少60％的序列同一性的多肽，本发明的清洁组合物可以进一步包含脂肪酶和角质酶，其包括细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰的或蛋白质工程化的突变体酶。实例包括例如描述于EP258068和EP 305216中的来自嗜热丝孢菌属(Thermomyces)(例如来自疏绵状嗜热丝孢菌(T.lanuginosus)(之前命名为疏棉状腐质霉(Humicola lanuginosa))的脂肪酶、来自腐质霉属(Humicola)(例如特异腐质霉(H.insolens)(WO 96/13580))的角质酶、来自假单胞菌属(Pseudomonas)菌株(这些假单胞菌属菌株中的一些现在重命名为伯克氏菌属(Burkholderia))(例如，产碱假单胞菌(P.alcaligenes)或类产碱假单胞菌(P.pseudoalcaligenes)(EP 218272))、洋葱假单胞菌(P.cepacia)(EP 331376)、假单胞菌属物种菌株SD705(WO 95/06720&WO 96/27002)、威斯康星假单胞菌(P.wisconsinensis)(WO 96/12012)、GDSL型链霉菌属脂肪酶(Streptomyces)(WO 10/065455)的脂肪酶、来自稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)(WO 10/107560)的角质酶、来自门多萨假多胞菌(Pseudomonas mendocina)(US 5,389,536)的角质酶、来自嗜热裂孢菌(Thermobifidafusca)(WO 11/084412)的脂肪酶、嗜热脂肪土芽孢杆菌(Geobacillusstearothermophilus)脂肪酶(WO 11/084417)、来自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)(WO 11/084599)的脂肪酶、以及来自灰色链霉菌(Streptomyces griseus)(WO 11/150157)和始旋链霉菌(S.pristinaespiralis)(WO 12/137147)的脂肪酶。其他实例是脂肪酶多肽，例如描述于EP 407225、WO 92/05249、WO 94/01541、WO 94/25578、WO 95/14783、WO 95/30744、WO 95/35381、WO 95/22615、WO 96/00292、WO 97/04079、WO 97/07202、WO 00/34450、WO 00/60063、WO 01/92502、WO 07/87508以及WO 09/109500中的那些。优选的商业化脂肪酶产品包括LipolaseTM、LipexTM；LipolexTM和LipocleanTM(诺维信公司)，Lumafast(来自杰能科公司(Genencor))以及Lipomax(来自吉斯特布罗卡德斯公司(Gist-Brocades))。还其他实例是有时称为酰基转移酶或过水解酶的脂肪酶，例如与南极假丝酵母(Candida antarctica)脂肪酶A具有同源性的酰基转移酶(WO 10/111143)、来自耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)的酰基转移酶(WO 05/56782)、来自CE 7家族的过水解酶(WO 09/67279)以及耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)过水解酶的多肽(特别是来自亨斯迈纺织品染化有限公司(Huntsman Textile Effects Pte Ltd)的商业产品Gentle PowerBleach中所用的S54V变体)(WO 10/100028)。
除了具有氨基己糖苷酶活性的多肽外，还包含SEQ ID NO 7、SEQ ID NO 8、SEQ IDNO 9、SEQ ID NO 10、SEQ ID NO 11或具有氨基己糖苷酶活性并且具有其至少60％的序列同一性的多肽，本发明的清洁组合物可以进一步包含淀粉酶，其可与本发明的多肽共同使用。该淀粉酶可以是α-淀粉酶或葡糖淀粉酶并且可以是细菌或真菌来源的。包括化学修饰的突变体或蛋白质工程化的突变体。淀粉酶包括例如从芽孢杆菌属，例如地衣芽孢杆菌的特定菌株(更详细地描述于GB 1,296,839中)获得的α-淀粉酶。合适的淀粉酶包括具有在WO95/10603中的SEQ ID NO 3的淀粉酶或其与SEQ ID NO 3具有90％序列同一性的多肽。优选的多肽描述于WO 94/02597、WO 94/18314、WO 97/43424以及WO 99/019467的SEQ ID NO 4中，例如在以下位置中的一个或多个中具有取代的多肽：15、23、105、106、124、128、133、154、156、178、179、181、188、190、197、201、202、207、208、209、211、243、264、304、305、391、408以及444。不同的合适的淀粉酶包括具有WO 02/010355中的SEQ ID NO 6的淀粉酶或其与SEQ ID NO 6具有90％序列同一性的多肽。SEQ ID NO 6的优选的多肽是在位置181和182中具有缺失并且在位置193中具有取代的那些。其他合适的淀粉酶是包括WO 2006/066594的SEQ ID NO 6所示的衍生自解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶的残基1至33和WO 2006/066594的SEQ ID NO 4所示的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的残基36至483的杂合α-淀粉酶或其具有90％序列同一性的多肽。这种杂合α-淀粉酶的优选的多肽是在以下位置中的一个或多个中具有取代、缺失或插入的那些：G48、T49、G107、H156、A181、N190、M197、I201、A209以及Q264。包括WO 2006/066594的SEQ ID NO 6所示的衍生自解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶的残基1至33和SEQ ID NO 4的残基36至483的杂合α-淀粉酶的最优选的多肽是具有以下取代的那些：
M197T；
H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S；或
G48A+T49I+G107A+H156Y+A181T+N190F+I201F+A209V+Q264S。
另外的合适的淀粉酶是具有在WO 99/019467中的SEQ ID NO 6的淀粉酶或其与SEQ ID NO 6具有90％序列同一性的多肽。SEQ ID NO 6的优选的多肽是在以下位置中的一个或多个中具有取代、缺失或插入的那些：R181、G182、H183、G184、N195、I206、E212、E216以及K269。特别优选的淀粉酶是在位置R181和G182或位置H183和G184中具有缺失的那些。可以使用的另外的淀粉酶是具有WO 96/023873的SEQ ID NO 1、SEQ ID NO 3、SEQ ID NO 2或SSEQ ID NO 7的那些或其与SEQ ID NO 1、SEQ ID NO 2、SEQ ID NO 3或SEQ ID NO 7具有90％序列同一性的多肽。SEQ ID NO 1、SEQ ID NO 2、SEQ ID NO 3或SEQ ID NO 7的优选的多肽是在以下位置中的一个或多个中具有取代、缺失或插入的那些：140、181、182、183、184、195、206、212、243、260、269、304以及476。更优选的多肽是在位置181和182或位置183和184中具有缺失的那些。SEQ ID NO 1、SEQ ID NO 2或SEQ ID NO 7的最优选的淀粉酶多肽是在位置183和184中具有缺失并在位置140、195、206、243、260、304和476中的一个或多个中具有取代的那些。其他可以使用的淀粉酶是具有WO 08/153815的SEQ ID NO 2、WO 01/66712中的SEQ ID NO 10的淀粉酶或其与WO 08/153815的SEQ ID NO 2具有90％序列同一性或与WO 01/66712的SEQ ID NO 10具有90％序列同一性的多肽。在WO 01/66712中的SEQID NO 10的优选的多肽是在以下位置中的一个或多个中具有取代、缺失或插入的那些：176、177、178、179、190、201、207、211以及264。
进一步的合适的淀粉酶是具有WO 09/061380的SEQ ID NO 2的淀粉酶或其与SEQID NO 2具有90％序列同一性的多肽。SEQ ID NO 2的优选的多肽是在以下位置中的一个或多个中具有C-末端截短和/或取代、缺失或插入的那些：Q87、Q98、S125、N128、T131、T165、K178、R180、S181、T182、G183、M201、F202、N225、S243、N272、N282、Y305、R309、D319、Q320、Q359、K444以及G475。SEQ ID NO:2的更优选的多肽是在以下位置中的一个或多个处具有取代的那些：Q87E,R、Q98R、S125A、N128C、T131I、T165I、K178L、T182G、M201L、F202Y、N225E,R、N272E,R、S243Q,A,E,D、Y305R、R309A、Q320R、Q359E、K444E以及G475K，和/或在位置R180和/或S181或T182和/或G183处具有缺失的那些。SEQ ID NO 2的最优选的淀粉酶多肽是具有以下取代的那些：
N128C+K178L+T182G+Y305R+G475K；
N128C+K178L+T182G+F202Y+Y305R+D319T+G475K；
S125A+N128C+K178L+T182G+Y305R+G475K；或
S125A+N128C+T131I+T165I+K178L+T182G+Y305R+G475K，其中这些多肽是C末端截断的并且任选地进一步包含在位置243的取代和/或在位置180和/或位置181的缺失。
其他合适的淀粉酶是具有WO 01/66712中的SEQ ID NO 12的α-淀粉酶或与SEQ IDNO 12具有至少90％序列同一性的变体。优选的淀粉酶多肽是在WO 01/66712中的SEQ IDNO 12的一个或多个以下位置中具有取代、缺失或插入的那些：R28、R118、N174；R181、G182、D183、G184、G186、W189、N195、M202、Y298、N299、K302、S303、N306、R310、N314；R320、H324、E345、Y396、R400、W439、R444、N445、K446、Q449、R458、N471、N484。特别优选的淀粉酶包括具有D183和G184的缺失并且具有取代R118K、N195F、R320K和R458K的多肽，并且另外在一个或多个选自下组的位置处具有取代的变体：M9、G149、G182、G186、M202、T257、Y295、N299、M323、E345以及A339，最优选的是另外在所有这些位置处具有取代的变体。
其他的实例是淀粉酶多肽，例如在WO 2011/098531、WO 2013/001078和WO 2013/001087中描述的那些。
可商购的淀粉酶是DuramylTM、TermamylTM、FungamylTM、Stainzyme TM、StainzymePlusTM、NatalaseTM、Liquozyme X及BANTM(来自诺维信公司)，以及RapidaseTM、PurastarTM/EffectenzTM、Powerase及Preferenz S100(来自杰能科国际有限公司/杜邦公司(GenencorInternational Inc./DuPont))。
除了具有氨基己糖苷酶活性的多肽外，还包含SEQ ID NO 7、SEQ ID NO 8、SEQ IDNO 9的多肽或具有氨基己糖苷酶活性并且具有其至少60％的序列同一性的多肽，本发明的清洁组合物可以进一步包含过氧化物酶/氧化酶，其包括植物、细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰的突变体或蛋白质工程化的突变体。有用的过氧化物酶的实例包括来自鬼伞属(Coprinus)，例如来自灰盖鬼伞(C.cinereus)的过氧化物酶、及其多肽，如在WO 93/24618、WO 95/10602、以及WO 98/15257中描述的那些。可商购的过氧化物酶包括GuardzymeTM(诺维信公司(Novozymes A/S))。
该一种或多种清洁组合物可以通过添加含有一种或多种酶的单独的添加剂，或通过添加包含所有这些酶的组合添加剂而被包括于例如，洗涤剂组合物中。本发明的洗涤剂添加剂，即单独的或组合的添加剂，可以配制成例如颗粒、液体、浆液等。优选的洗涤剂添加剂配制品为颗粒，特别是非尘颗粒；液体，特别是稳定化液体；或者浆液。
非尘颗粒可以例如如在US 4,106,991和4,661,452中所披露而产生，并且可以任选地通过本领域已知的方法进行涂覆。蜡状包衣材料的实例是具有平均分子量为1000至20000的聚(环氧乙烷)产品(聚乙二醇，PEG)；具有从16个到50个环氧乙烷单位的乙氧基化壬基酚；具有从12个碳原子至20个碳原子并且存在15个至80个环氧乙烷单元的乙氧基化脂肪醇；脂肪醇；脂肪酸；以及脂肪酸的甘油单酯、和甘油二酯、和甘油三酯。适用于通过流化床技术应用的成膜包衣材料的实例在GB 1483591中给出。液体酶制剂可以例如通过根据已确立的方法添加多元醇(例如丙二醇)、糖或糖醇、乳酸或硼酸而稳定化。受保护的酶可以根据EP 238,216中披露的方法来制备。
本发明的洗涤剂组合物还可以含有按重量计0-10％，例如0.5％-5％、2％-5％、0.5％-2％或0.2％-1％的聚合物。可以利用本领域中已知的在洗涤剂中使用的任何聚合物。该聚合物可以作为如上文提到的共助洗剂起作用，或可以提供抗再沉积、纤维保护、污垢释放、染料转移抑制、油污清洁和/或抑泡特性。一些聚合物可以具有多于一种的上文提到的特性和/或多于一种的下文提到的基序。示例性聚合物包括(羧甲基)纤维素(CMC)、聚(乙烯醇)(PVA)、聚(乙烯吡咯烷酮)(PVP)、聚(乙二醇)或聚(环氧乙烷)(PEG)、乙氧基化的聚(亚乙基亚胺)、(羧甲基)菊粉(CMI)、和聚羧化物(例如PAA、PAA/PMA)、聚天冬氨酸、和月桂基甲基丙烯酸/丙烯酸共聚物、疏水修饰的CMC(HM-CMC)和硅酮、对苯二甲酸和低聚乙二醇的共聚物、聚(乙烯对苯二酸酯)和聚(氧乙烯对苯二酸酯)的共聚物(PET-POET)、PVP、聚(乙烯基咪唑)(PVI)、聚(乙烯基吡啶-N-氧化物)(PVPO或PVPNO)以及聚乙烯吡咯烷酮-乙烯基咪唑(PVPVI)。进一步的示例性聚合物包括磺化的聚羧酸酯、聚环氧乙烷和聚环氧丙烷(PEO-PPO)以及乙氧基磺酸二季铵盐。其他示例性聚合物披露于例如WO 2006/130575中。还考虑了以上提到的聚合物的盐。
本发明的清洁组合物还可以包括织物调色剂，如染料或色素，当配制在洗涤剂组合物中时，当所述织物与洗涤液接触时织物调色剂可以沉积在织物上，该洗涤液包含所述洗涤剂组合物，并且因此通过可见光的吸收/反射改变所述织物的色彩。如果经受紫外光照射，荧光增白剂发出至少一些可见光。相比之下，当织物调色剂吸收至少部分可见光谱时，它们改变表面的色彩。适合的织物调色剂包括染料和染料-粘土轭合物，并且还可以包括色素。适合的染料包括小分子染料和聚合物染料。合适的小分子染料包括选自下组的小分子染料，该组由落入颜色索引(Colour Index)(C.I.)分类的以下染料组成：直接蓝、直接红、直接紫、酸性蓝、酸性红、酸性紫、碱性蓝、碱性紫和碱性红或其混合物，例如如描述于WO2005/03274、WO 2005/03275、WO 2005/03276和EP 1876226(通过引用并入本文)中。洗涤剂组合物优选地包含从约0.00003wt％至约0.2wt％、从约0.00008wt％至约0.05wt％、或甚至从约0.0001wt％至约0.04wt％的织物调色剂。该组合物可以包含从0.0001wt％至0.2wt％的织物调色剂，当该组合物处于单位剂量袋的形式时，这可以是特别优选的。适合的调色剂还披露于例如WO 2007/087257和WO 2007/087243中。
该自何物可以进一步含有按重量计0-10％，例如按重量计0-5％，例如约0.5％至约5％、或约3％至约5％的助水溶剂。可以利用本领域中已知的用于在洗涤剂中使用的任何水溶助剂。水溶助剂的非限制性实例包括苯磺酸钠、对甲苯磺酸钠(STS)、二甲苯磺酸钠(SXS)、枯烯磺酸钠(SCS)、伞花烃磺酸钠、氧化胺、醇和聚乙二醇醚、羟基萘甲酸钠、羟基萘磺酸钠、乙基己基磺酸钠及其组合。
本发明的清洁组合物还可以包含分散剂。具体而言，粉状洗涤剂可以包含分散剂。合适的水溶性有机材料包括均聚合或共聚合的酸或其盐，其中聚羧酸包含被不多于两个碳原子彼此分开的至少两个羧基。合适的分散剂例如描述于Powdered Detergents[粉末洗涤剂]，Surfactant Science Series[表面活性剂科学系列]，第71卷，马塞尔德克尔公司(Marcel Dekker,Inc)中。
该清洁组合物还可以包括一种或多种染料转移抑制剂。适合的聚合物染料转移抑制剂包括但不限于聚乙烯吡咯烷酮聚合物、多胺N-氧化物聚合物、N-乙烯吡咯烷酮和N-乙烯基咪唑的共聚物、聚乙烯噁唑烷酮和聚乙烯咪唑或其混合物。当在主题组合物中存在时，染料转移抑制剂可以按该组合物的重量计以从约0.0001％至约10％、从约0.01％至约5％或甚至从约0.1％至约3％的水平存在。
优选地，清洁组合物还可以含有另外的组分，这些组分可以给正在清洁的物品着色，例如荧光增白剂或光学增亮剂。当存在时，该增亮剂优选地以约0.01％至约0.5％的水平存在。在衣物组合物中可以使用合适在衣物洗涤剂组合物中使用的任何荧光增白剂。最常用的荧光增白剂是属于以下类别的那些：二氨基芪-磺酸衍生物、二芳基吡唑啉衍生物和二苯基-联苯乙烯衍生物。荧光增白剂的二氨芪-磺酸衍生物型的实例包括以下各项的钠盐：4,4'-双[(4-苯胺基-6-二乙醇氨基-s-三嗪-2-基)氨基]芪-2,2'-二磺酸盐、4,4'-双[(4,6-二苯胺基-s-三嗪-2-基)氨基]芪-2,2'-二磺酸盐、4,4'-双{4-苯胺基-6-[甲基(2-羟基乙基)氨基]-s-三嗪-2-基氨基}芪-2,2'-二磺酸盐、4,4'-双(4-苯基-1,2,3-三唑-2-基)芪-2,2'-二磺酸盐以及5-(2H-萘并[1,2-d][1,2,3]三唑-2-基)-2-[(E)-2-苯基乙烯基]苯磺酸钠。优选的荧光增白剂是可从BASF公司获得的天来宝(Tinopal)DMS和天来宝CBS。天来宝DMS是4,4'-双[(4-苯胺基-6-吗啉代-s-三嗪-2-基)氨基]芪-2,2'-二磺酸盐的二钠盐。天来宝CBS是2,2'-[二苯基-4,4'-二(2,1-乙烯二基)]二苄醚-1-磺酸盐的二钠盐。还优选的是可商购的Parawhite KX，由印度孟买的派拉蒙矿物与化学品公司(ParamountMinerals and Chemicals)供应。合适使用的其他荧光剂包括1-3-二芳基吡唑啉和7-烷氨基香豆素。
合适的荧光增白剂水平包括从约0.01wt％、从0.05wt％、从约0.1wt％或甚至从约0.2wt％的较低水平至0.5wt％或甚至0.75wt％的较高水平。
该清洁组合物还可以包括一种或多种污垢释放聚合物，这些聚合物帮助从织物(例如棉和聚酯基的织物)去除污垢，特别是从聚酯基的织物去除疏水性污垢。污垢释放聚合物可以例如是基于非离子型或阴离子型对苯二甲酸的聚合物、聚乙烯基己内酰胺和相关共聚物、乙烯基接枝共聚物、或聚酯聚酰胺，参见例如Powdered Detergents[粉末洗涤剂]，Surfactant science series[表面活性剂科学系列]第71卷第7章，马塞尔·德克尔公司(Marcel Dekker，Inc.)。另一种类型的污垢释放聚合物是包含核心结构和附接至该核心结构的多个烷氧基化基团的两亲性烷氧基化油污清洁聚合物。核心结构可以包含聚烷基亚胺结构或聚烷醇胺结构，例如详细描述于WO 2009/087523中的(通过引用并入本文)。此外，随机接合共聚物是合适的污垢释放聚合物。合适的接合共聚物更详细地描述于WO 2007/138054、WO 2006/108856和WO 2006/113314中(通过引用并入本文)。其他污垢释放聚合物是经取代的多糖结构，尤其是经取代的纤维素结构，例如改性的纤维素衍生物，例如描述于EP 1867808或WO 2003/040279中的那些(将这二者都通过引用特此结合)。合适的纤维素聚合物包括纤维素、纤维素醚、纤维素酯、纤维素酰胺以及其混合物。适合的纤维素聚合物包括阴离子修饰的纤维素、非离子修饰的纤维素、阳离子修饰的纤维素、兼性离子修饰的纤维素及其混合物。
该清洁组合物还可以包括一种或多种抗再沉积剂，例如(羧甲基)纤维素(CMC)、聚(乙烯醇)(PVA)、丙烯酸的均聚物、丙烯酸与马来酸的共聚物、以及乙氧基化的聚乙烯亚胺。上文在污垢释放聚合物下描述的基于纤维素的聚合物还可以作为抗再沉积剂起作用。
清洁组合物还可以含有一种或多种辅料。适合的辅助材料包括但不限于防缩剂、抗皱剂、杀细菌剂、粘合剂、载体、染料、酶稳定剂、织物软化剂、填充剂、泡沫调节剂、助水溶剂、香料、色素、抑泡剂、溶剂、以及用于液体洗涤剂的结构剂和/或结构弹性剂。
该清洁组合物可以处于任何常规形式，例如条、均匀的片剂、具有两个或更多个层的片剂、具有一个或多个室的袋、规则的或压缩的粉末、颗粒、膏、凝胶、或规则的、压缩的或浓缩的液体。
袋可以被配置为单一隔室或多隔室。它可以具有适合容持该组合物的任何形式、形状和材料，例如在与水接触之前，不允许该组合物从袋中释放出来。该袋由水溶性膜制成，它包含了一个内部体积。可以将所述内部体积分成袋的室。优选的膜是高分子材料，优选地形成膜或薄片的聚合物。优选的聚合物、共聚物或其衍生物选自聚丙烯酸酯、和水溶性丙烯酸酯共聚物、甲基纤维素、羧甲基纤维素、糊精钠、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、麦芽糊精、聚甲基丙烯酸酯，最优选地是聚乙烯醇共聚物以及羟丙基甲基纤维素(HPMC)。优选地，聚合物在膜例如PVA中的水平是至少约60％。优选的平均分子量将典型地是约20,000至约150,000。膜还可以是共混组合物，包含可水解降解并且水可溶的聚合物共混物，例如聚乳酸和聚乙烯醇(已知在贸易参考号M8630下，如由美国印第安纳州的MonoSol有限责任公司出售)加增塑剂，像甘油、乙二醇、丙二醇、山梨醇及其混合物。袋可以包含固体衣物洗涤清洁组合物或部分组分以及/或者液体清洁组合物或由水溶性膜分开的部分组分。用于液体组分的室在构成上可以与包含固体的室不同：US 2009/0011970A1。
可以由水可溶袋中的或片剂的不同层中的室来将洗涤剂成分彼此物理分离。因此，可以避免组分间的不良的储存相互作用。在清洗溶液中，每个室的不同溶解曲线还可以引起选择的组分的延迟溶解。
非单位剂量的液体或凝胶洗涤剂可以是水性的，典型地包含按重量计至少20％并且最高达95％的水，例如高达约70％的水、高达约65％的水、高达约55％的水、高达约45％的水、高达约35％的水。包括但不限于链烷醇、胺、二醇、醚以及多元醇的其他类型的液体可以被包括在水性液体或凝胶中。含水液体或凝胶洗涤剂可以含有从0-30％的有机溶剂。
本发明还针对根据本发明的多肽或其组合物在纺织品和织物洗涤中的使用方法，如家用衣物洗涤和工业衣物洗涤。
本发明的一个方面进一步涉及用于洗涤物品的方法，该方法包括：
a)将物品暴露于包含选自由SEQ ID NO 7、SEQ ID NO 8、SEQ ID NO 9、SEQ ID NO10和SEQ ID NO 11所示的多肽组成的组的多肽的洗涤液，或将物品暴露于根据权利要求1至14中任一项所述的洗涤剂组合物；
b)完成至少一个洗涤循环；以及
任选地冲洗该物品，其中该物品是纺织品。
本发明还针对在清洁硬表面例如地板、桌子、墙壁、屋顶等，连同硬物体的表面，例如汽车(汽车洗涤)和餐具(餐具洗涤)中使用根据本发明的多肽或其组合物的方法。
可以将本发明的多肽添加至洗涤剂组合物中并且因此使其变成清洁组合物的组分。本发明的一个方面涉及具有氨基己糖苷酶活性的多肽在清洁过程(例如衣物洗涤和/或硬表面清洁)中的用途，该多肽任选地包含选自下组的基序中的一个或多个，该组由以下组成：GXDE(SEQ ID NO 18)、[EQ][NRSHA][YVFL][AGSTC][IVLF][EAQYN][SN](SEQ ID NO19)、[VIM][LIV]G[GAV]DE[VI][PSA](SEQ ID NO:20)、WND[SQR][IVL][TLVM](SEQ ID NO:21)、QSTL(SEQ ID NO 22)、NKFFY(SEQ ID NO:23)、NLD[DR]S(SEQ ID NO:24)，其中具有氨基己糖苷酶活性的多肽选自下组，该组由以下组成：SEQ ID NO 7、SEQ ID NO 8、SEQ ID NO9、SEQ ID NO 10、SEQ ID NO 11和与其具有至少60％序列同一性的多肽。
因此，本发明的一个方面涉及具有氨基己糖苷酶活性的多肽在清洁过程(例如衣物洗涤和/或硬表面清洁)中的用途，该多肽任选地包含选自下组的基序中的一个或多个，该组由以下组成：GXDE(SEQ ID NO 18)、[EQ][NRSHA][YVFL][AGSTC][IVLF][EAQYN][SN](SEQ ID NO 19)、[VIM][LIV]G[GAV]DE[VI][PSA](SEQ ID NO:20)、WND[SQR][IVL][TLVM](SEQ ID NO:21)、QSTL(SEQ ID NO 22)、NKFFY(SEQ ID NO:23)、NLD[DR]S(SEQ ID NO:24)，其中该多肽选自下组，该组由以下组成：SEQ ID NO 7、SEQ ID NO 8、SEQ ID NO 9、SEQ IDNO 10、SEQ ID NO 11和与其具有至少60％序列同一性的多肽，并且其中该多肽相对于参考酶具有改进的深度清洁特性。
该清洁过程或纺织品护理过程可以例如是衣物洗涤过程、餐具洗涤过程或硬表面(例如浴室瓷砖、地板、桌面、排水管、水槽以及脸盆)清洁。衣物洗涤过程可以例如是家用衣物洗涤，但是它也可以是工业衣物洗涤。此外，本发明涉及用于洗涤织物和/或衣物的方法，其中该方法包括用含有清洁组合物和至少一种本发明的多肽的洗涤溶液处理织物。例如，可以在机器清洁过程中或者在手动洗涤过程中进行清洁过程或纺织品保养过程。洗涤溶液可以例如是包含洗涤剂组合物的水洗溶液。
因此，包含在土地芽孢杆菌进化枝中的多肽特别适用于包含表面活性剂例如洗涤剂组合物的组合物，并且本发明的多肽可优选地用于清洁过程，例如衣物洗涤和餐具洗涤。
在一些方面中，本发明涉及土地芽孢杆菌的进化枝的多肽，该多肽与SEQ ID NO 2的成熟多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性，这些多肽具有氨基己糖苷酶活性。在一个方面中，这些多肽与SEQ ID NO 7所示的成熟多肽相差多达10个(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、或10个)氨基酸。
在一些方面中，本发明涉及土地芽孢杆菌的进化枝的多肽，该多肽与SEQ ID NO 4的成熟多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性，这些多肽具有氨基己糖苷酶活性。在一个方面中，这些多肽与SEQ ID NO 8所示的成熟多肽相差多达10个(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、或10个)氨基酸。
在一些方面中，本发明涉及土地芽孢杆菌的进化枝的多肽，该多肽与SEQ ID NO 6的成熟多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性，这些多肽具有氨基己糖苷酶活性。在一个方面中，这些多肽与SEQ ID NO 9所示的成熟多肽相差多达10个(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、或10个)氨基酸。
在一些方面中，本发明涉及土地芽孢杆菌的进化枝的多肽，该多肽与SEQ ID NO13的成熟多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性，这些多肽具有氨基己糖苷酶活性。在一个方面中，这些多肽与SEQ ID NO 10所示的成熟多肽相差多达10个(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、或10个)氨基酸。
在一些方面中，本发明涉及土地芽孢杆菌的进化枝的多肽，该多肽与SEQ ID NO14的成熟多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性，这些多肽具有氨基己糖苷酶活性。在一个方面中，这些多肽与SEQ ID NO 11所示的成熟多肽相差多达10个(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、或10个)氨基酸。
在一个实施例中，该多肽已经被分离。本发明的多肽优选地包含SEQ ID NO 7的氨基酸序列或其等位基因变体或由其组成；或为具有氨基己糖苷酶活性的其片段。在另一方面中，该多肽包含SEQ ID NO 2的成熟多肽或由其组成。在另一方面中，该多肽包含SEQ IDNO 2的氨基酸1至324或由其组成。
在一个实施例中，该多肽已经被分离。本发明的多肽优选地包含SEQ ID NO 8的氨基酸序列或其等位基因变体或由其组成；或为具有氨基己糖苷酶活性的其片段。在另一方面中，该多肽包含SEQ ID NO 4的成熟多肽或由其组成。在另一方面中，该多肽包含SEQ IDNO 4的氨基酸1至324或由其组成。
在一个实施例中，该多肽已经被分离。本发明的多肽优选地包含SEQ ID NO 9的氨基酸序列或其等位基因变体或由其组成；或为具有氨基己糖苷酶活性的其片段。在另一方面中，该多肽包含SEQ ID NO 6的成熟多肽或由其组成。在另一方面中，该多肽包含SEQ IDNO 6的氨基酸1至324或由其组成。
在一个实施例中，该多肽已经被分离。本发明的多肽优选地包含SEQ ID NO 10的氨基酸序列或其等位基因变体或由其组成；或为具有氨基己糖苷酶活性的其片段。在另一方面中，该多肽包含SEQ ID NO 13的成熟多肽或由其组成。在另一方面中，该多肽包含SEQID NO 13的氨基酸1至324或由其组成。
在一个实施例中，该多肽已经被分离。本发明的多肽优选地包含SEQ ID NO 11的氨基酸序列或其等位基因变体或由其组成；或为具有氨基己糖苷酶活性的其片段。在另一方面中，该多肽包含SEQ ID NO 15的成熟多肽或由其组成。在另一方面中，该多肽包含SEQID NO 15的氨基酸1至324或由其组成。
在另一个实施例中，本发明涉及由以下多核苷酸编码的具有氨基己糖苷酶活性的多肽，该多核苷酸在非常低严格条件、低严格条件、中严格条件、中-高严格条件、高严格条件、或非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQ ID NO 1、3、5、12或14的成熟多肽编码序列，或(ii)(i)的全长互补体(Sambrook等人，1989，Molecular Cloning,A Laboratory Manual[分子克隆实验指南]，第二版，冷泉港，纽约)。在一个实施例中，该多肽已经被分离。
可以使用SEQ ID NO 1、SEQ ID NO 3、SEQ ID NO 5、SEQ ID NO 12或SEQ ID NO14的多肽或其子序列，连同SEQ ID NO 2、SEQ ID NO 4、SEQ ID NO 6、SEQ ID NO 13、SEQID NO 15的多肽或其片段来设计核酸探针以根据本领域熟知的方法鉴定和克隆编码来自不同属或物种的菌株的具有氨基己糖苷酶活性的多肽的DNA。可以遵循标准DNA印迹程序，使用此类探针来与感兴趣的细胞的基因组DNA或cDNA杂交，以便鉴定和分离其中的相应基因。此类探针可明显短于完整序列，但是长度应为至少15，例如至少25、至少35、或至少70个核苷酸。优选地，该核酸探针长度为至少100个核苷酸，例如长度为至少200个核苷酸、至少300个核苷酸、至少400个核苷酸、至少500个核苷酸、至少600个核苷酸、至少700个核苷酸、至少800个核苷酸、或至少900个核苷酸。DNA和RNA探针两者都可使用。典型地将探针进行标记(例如，用32P、3H、35S、生物素、或抗生物素蛋白)，用于检测相应的基因。此类探针涵盖于本发明中。
可以筛选由此类其他菌株制备的基因组DNA或cDNA文库的与上述探针杂交并编码具有氨基己糖苷酶活性的多肽的DNA。来自此类其他菌株的基因组DNA或其他DNA可通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳或其他分离技术来分离。可将来自文库的DNA或分离的DNA转移到并固定在硝化纤维素或其他适合的载体材料上。为了鉴定与SEQ ID NO 1、3、5、12或14或其子序列杂交的克隆或DNA，将载体材料用于DNA印迹中。
出于本发明的目的，杂交指示该多核苷酸在非常低到非常高严谨度条件下与对应于以下各项的经过标记的核酸探针杂交：(i)SEQ ID NO 1、SEQ ID NO 3、SEQ ID NO 5、SEQID NO 12或SEQ ID NO 14；(ii)SEQ ID NO 1、SEQ ID NO 3、SEQ ID NO 5、SEQ ID NO 12或SEQ ID NO 14的成熟多肽编码序列；(iii)其全长互补体；或(iv)其子序列；杂交是在非常低的至非常高的严格条件下进行。可以使用例如X-射线胶片或本领域已知的任何其他检测手段来检测在这些条件下核酸探针杂交的分子。
在另一个实施例中，本发明涉及具有氨基己糖苷酶活性的多肽，该多肽由与SEQID NO 1的成熟多肽编码序列具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性的多核苷酸编码。在一个另外的实施例中，该多肽已经被分离。
在另一个实施例中，本发明涉及具有氨基己糖苷酶活性的多肽，该多肽由与SEQID NO 3的成熟多肽编码序列具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性的多核苷酸编码。在一个另外的实施例中，该多肽已经被分离。
在另一个实施例中，本发明涉及具有氨基己糖苷酶活性的多肽，该多肽由与SEQID NO 5的成熟多肽编码序列具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性的多核苷酸编码。在一个另外的实施例中，该多肽已经被分离。
在另一个实施例中，本发明涉及具有氨基己糖苷酶活性的多肽，该多肽由与SEQID NO 12的成熟多肽编码序列具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性的多核苷酸编码。在一个另外的实施例中，该多肽已经被分离。
在另一个实施例中，本发明涉及具有氨基己糖苷酶活性的多肽，该多肽由与SEQID NO 14的成熟多肽编码序列具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性的多核苷酸编码。在一个另外的实施例中，该多肽已经被分离。
在另一个实施例中，本发明涉及SEQ ID NO 2、SEQ ID NO 4、SEQ ID NO 6、SEQ IDNO 13或SEQ ID NO 15的成熟多肽的变体，这些变体在一个或多个(例如若干个)位置处包括取代、缺失和/或插入。在一个实施例中，引入SEQ ID NO 7、SEQ ID NO 8、SEQ ID NO 9、SEQ ID NO 10或SEQ ID NO 11的成熟多肽中的氨基酸取代、缺失和/或插入的数目多达10个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个。这些氨基酸改变可以具有微小性质，即，不会显著地影响蛋白的折叠和/或活性的保守氨基酸取代或插入；典型地为1至30个氨基酸的小缺失；小的氨基-末端或羧基末端延伸，例如氨基末端的甲硫氨酸残基；多至20至25个残基的小接头肽；或小的延伸，其通过改变净电荷或另一功能(例如聚组氨酸段、抗原表位或结合结构域)来促进纯化。保守取代的实例是在下组之内：碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸及组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸及缬氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸及酪氨酸)及小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸及甲硫氨酸)。一般不会改变比活性的氨基酸取代是本领域已知的并且例如由H.Neurath和R.L.Hill,1979,于The Proteins[蛋白质],Academic Press[学术出版社],纽约中描述。常见取代为Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly。
可替代地，这些氨基酸改变具有这样一种性质使得多肽的物理化学性质发生改变。例如，氨基酸改变可以提高多肽的热稳定性、改变底物特异性、改变最适pH等。可以根据本领域中已知的程序，例如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(Cunningham和Wells,1989,Science[科学]244:1081-1085)来鉴定多肽中的必需氨基酸。在后一项技术中，在该分子中的每个残基处引入单个丙氨酸突变，并且测试所得分子的氨基己糖苷酶活性以鉴定对于该分子的活性关键的氨基酸残基。还参见，Hilton等人，1996，J.Biol.Chem.[生物化学杂志]271:4699-4708。酶或其他生物学相互作用的活性位点还可以通过对结构的物理分析来确定，如通过这样的技术确定：如核磁共振、晶体学、电子衍射或光亲和标记，连同对推定的接触位点氨基酸进行突变。参见，例如，de Vos等人，1992，Science[科学]255:306-312；Smith等人，1992，J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]224:899-904；Wlodaver等人，1992，FEBS Lett.[欧洲生化学会联合会快报]309:59-64。还可以从与相关多肽的比对来推断必需氨基酸的身份。本发明的多肽是氨基己糖苷酶，例如属于土地芽孢杆菌进化枝的分散蛋白。土地芽孢杆菌分散蛋白是β-氨基己糖苷酶，其特异性水解N-乙酰葡糖胺聚合物的β-1,6-糖苷键，其可以例如被发现于生物膜中。分散蛋白B属于与本发明的多肽(氨基己糖苷酶)不同的进化枝，含有三个高度保守的酸性残基：残基183(D183)的天冬氨酸、残基184的谷氨酸(E184)、和残基332(E332)的谷氨酸。可以做出单个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入并且使用已知的诱变、重组和/或改组方法进行测试，随后进行有关筛选程序，例如由Reidhaar-Olson和Sauer,1988,Science[科学]241:53-57；Bowie和Sauer,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]86:2152-2156；WO 95/17413；或WO 95/22625所披露的那些。可以使用的其他方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如，Lowman等人,1991,Biochemistry[生物化学]30:10832-10837；美国专利号5,223,409；WO 92/06204)和区域定向诱变(Derbyshire等人,1986,Gene[基因]46:145；Ner等人，1988，DNA 7:127)。诱变/改组方法可以与高通量自动化筛选方法组合以检测由宿主细胞表达的克隆的诱变多肽的活性(Ness等人，1999，Nature Biotechnology[自然生物技术]17:893-896)。可从宿主细胞回收编码活性多肽的诱变的DNA分子，并使用本领域的标准方法快速测序。这些方法允许迅速确定多肽中个体氨基酸残基的重要性。该多肽可为杂合多肽，其中一个多肽的区域在另一个多肽的区域的N-末端或C-末端处融合。
该多肽可为融合多肽或可切割的融合多肽，其中另一个多肽在本发明多肽的N-末端或C-末端处融合。通过将编码另一个多肽的多核苷酸与本发明多核苷酸融合而产生融合多肽。用于产生融合多肽的技术是本领域已知的，且包括连接编码多肽的编码序列使得它们符合读框，而且融合多肽的表达处于相同的启动子和终止子的控制之下。还可使用内含肽技术构建融合多肽，其中在翻译后产生融合多肽(Cooper等人，1993，EMBO J.[欧洲分子生物学学会杂志]12:2575-2583；Dawson等人，1994，Science[科学]266:776-779)。融合多肽可进一步包含两种多肽之间的切割位点。在融合蛋白分泌之时，该位点被切割而释放这两个多肽。切割位点的实例包括但不限于在以下文献中披露的位点：Martin等人，2003，J.Ind.Microbiol.Biotechnol.[工业微生物生物技术杂志]3:568-576；Svetina等人，2000，J.Biotechnol.[生物技术杂志]76:245-251；Rasmussen-Wilson等人，1997，Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学]63:3488-3493；Ward等人，1995，Biotechnology[生物技术]13:498-503；和Contreras等人，1991，Biotechnology[生物技术]9:378-381；Eaton等人，1986,Biochemistry[生物化学]25:505-512；Collins-Racie等人，1995，Biotechnology[生物技术]13:982-987；Carter等人，1989,Proteins[蛋白质]；Structure,Function,and Genetics[结构、功能以及遗传学]6:240-248；以及Stevens，2003，Drug Discovery World[世界药物发现]4:35-48。
具有氨基己糖苷酶活性的多肽的来源
本发明的具有氨基己糖苷酶活性的多肽可从任何属的微生物获得。出于本发明的目的，如在此结合给定来源使用的术语“从……获得”应当意指由多核苷酸编码的多肽是由该来源或由已经插入了来自该来源的多核苷酸的菌株产生的。在一个方面中，获得自给定来源的多肽被分泌到细胞外。
在另一方面中，该多肽是土地芽孢杆菌多肽，例如，从嗜糖土地芽孢杆菌获得的多肽。在一个优选的方面中，该多肽是与SEQ ID NO 7具有至少80％序列同一性的多肽，并且从土地芽孢杆菌获得，优选地嗜糖土地芽孢杆菌。
在另一方面中，该多肽是土地芽孢杆菌多肽，例如，从Terribacillus goriensis获得的多肽。在一个优选的方面中，该多肽是与SEQ ID NO 8具有至少80％序列同一性的多肽，并且从土地芽孢杆菌获得，优选地Terribacillus goriensis。
在另一方面中，该多肽是土地芽孢杆菌多肽，例如，从嗜糖土地芽孢杆菌获得的多肽。在一个优选的方面中，该多肽是与SEQ ID NO 9具有至少80％序列同一性的多肽，并且从土地芽孢杆菌获得，优选地嗜糖土地芽孢杆菌。
在另一方面中，该多肽是土地芽孢杆菌多肽，例如，从嗜糖土地芽孢杆菌获得的多肽。在一个优选的方面中，该多肽是与SEQ ID NO 10具有至少80％序列同一性的多肽，并且从土地芽孢杆菌获得，优选地嗜糖土地芽孢杆菌。
在另一方面中，该多肽是土地芽孢杆菌多肽，例如，从嗜糖土地芽孢杆菌获得的多肽。在一个优选的方面中，该多肽是与SEQ ID NO 11具有至少80％序列同一性的多肽，并且从土地芽孢杆菌获得，优选地嗜糖土地芽孢杆菌。
应理解的是对于前述物种，本发明涵盖完全和不完全阶段(perfect andimperfect states)，和其他分类学的等效物(equivalent)，例如，无性型(anamorph)，而与它们已知的种名无关。本领域的技术人员将容易地识别适当等效物的身份。
这些物种的菌株可容易地在许多培养物保藏中心为公众所获得，例如美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)、德国微生物和细胞培养物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，DSMZ)、荷兰菌种保藏中心(Centraalbureau Voor Schimmelcultures，CBS)以及美国农业研究服务专利培养物保藏中心北方地区研究中心(Agricultural Research Service Patent CultureCollection,Northern Regional Research Center,NRRL)。
可以使用以上提到的探针从其他来源，包括从自然界(例如，土壤、堆肥、水等)分离的微生物或直接从天然材料(例如，土壤、堆肥、水等)获得的DNA样品鉴定和获得该多肽。用于从天然生境中直接分离微生物和DNA的技术是本领域已知的。然后可通过类似地筛选另一微生物的基因组DNA或cDNA文库或混合的DNA样品来获得编码该多肽的多核苷酸。一旦已经用一种或多种探针检测到编码多肽的多核苷酸，则可通过利用本领域普通技术人员所知的技术(参见，例如Sambrook等人，1989，见上文)分离或克隆多核苷酸。
核酸构建体
本发明还涉及核酸构建体，这些核酸构建体包含可操作地连接至一个或多个控制序列的本发明的多核苷酸，在与控制序列相容的条件下，这个或这些控制序列指导编码序列在适合的宿主细胞中的表达。
可用许多方式操作所述多核苷酸以提供多肽的表达。取决于表达载体，在多核苷酸插入载体之前对其进行操作可为合意的或必需的。用于利用重组DNA方法修饰多核苷酸的技术是本领域已知的。
该控制序列可为启动子，即，被宿主细胞识别用于表达编码本发明多肽的多核苷酸的多核苷酸。该启动子包含转录控制序列，其介导该多肽的表达。该启动子可以是在宿主细胞中显示出转录活性的任何多核苷酸，包括变体、截短型及杂合型启动子，并且可以从编码与该宿主细胞同源或异源的细胞外或细胞内多肽的基因获得。
用于在细菌宿主细胞中指导本发明核酸构建体的转录的合适启动子的实例是从以下基因中获得的启动子：解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、嗜热脂肪芽孢杆菌产麦芽糖淀粉酶基因(amyM)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因、苏云金芽孢杆菌cryIIIA基因(Agaisse和Lereclus，1994，Molecular Microbiology[分子微生物学]13:97-107)、大肠杆菌lac操纵子、大肠杆菌trc启动子(Egon等人，1988，Gene[基因]69:301-315)、天蓝链霉菌琼脂水解酶基因(dagA)和原核β-内酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等人，1978，Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]75:3727-3731)以及tac启动子(DeBoer等人，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]80:21-25)。其他启动子描述在Gilbert等人，1980，Scientific American[科学美国人]242:74-94的“Usefulproteins from recombinant bacteria[来自重组细菌的有用蛋白质]”；和在Sambrook等人，1989，见上文中。串联启动子的实例披露于WO 99/43835中。
在丝状真菌宿主细胞中，用于指导本发明的核酸构建体的转录的合适启动子的实例是获得自以下酶的基因的启动子：构巢曲霉(Aspergillus nidulans)乙酰胺酶、黑曲霉(Aspergillus niger)中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉(Aspergillus awamori)葡萄糖淀粉酶(glaA)、米曲霉(Aspergillus oryzae)TAKA淀粉酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、尖孢镰孢(Fusarium oxysporum)胰蛋白酶-样蛋白酶(WO 96/00787)、镶片镰孢(Fusarium venenatum)淀粉葡糖苷酶(WO 00/56900)、镶片镰孢Daria(WO 00/56900)、镶片镰孢Quinn(WO 00/56900)、米黑根毛霉(Rhizomucormiehei)脂肪酶、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉(Trichoderma reesei)β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉木聚糖酶III、里氏木霉β-木糖苷酶，以及里氏木霉翻译延长因子，以及NA2-tpi启动子(来自曲霉属中性α-淀粉酶基因的经修饰的启动子，其中未翻译的前导序列已经用来自曲霉属丙糖磷酸异构酶基因的未翻译的前导序列替换；非限制性实例包括来自黑曲霉中性α-淀粉酶的基因的经修饰的启动子，其中未翻译的前导序列已经用来自构巢曲霉或米曲霉丙糖磷酸异构酶基因的未翻译的前导序列替换)；及其变体、截短的及杂合的启动子。其他启动子在美国专利号6,011,147中描述。
在酵母宿主中，从以下酶的基因获得有用的启动子：酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母乙醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH1，ADH2/GAP)、酿酒酵母磷酸丙糖异构酶(TPI)、酿酒酵母金属硫蛋白(CUP1)、和酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。Romanos等人，1992，Yeast[酵母]8:423-488描述了酵母宿主细胞的其他有用的启动子。
控制序列也可为由宿主细胞识别以终止转录的转录终止子。该终止子可操作地连接到编码该多肽的多核苷酸的3'-末端。在宿主细胞中有功能的任何终止子可用于本发明中。
细菌宿主细胞的优选终止子从针对以下的基因获得：克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprH)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(amyL)、和大肠杆菌核糖体RNA(rrnB)。
用于丝状真菌宿主细胞的优选终止子从以下酶的基因获得：构巢曲霉乙酰胺酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶、尖孢镰孢胰蛋白酶-样蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉木聚糖酶III、里氏木霉β-木糖苷酶以及里氏木霉翻译延长因子。用于酵母宿主细胞的优选的终止子从以下酶的基因获得：酿酒酵母烯醇化酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)、以及酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶。由Romanos等人，1992(见上文)描述了酵母宿主细胞的其他有用终止子。该控制序列还可以是在启动子下游并且在基因编码序列上游的mRNA稳定子区域，它增加该基因的表达。合适的mRNA稳定子区域的实例是从以下获得的：苏云金芽孢杆菌cryIIIA基因(WO 94/25612)和枯草芽孢杆菌SP82基因(Hue等人，1995，Journal ofBacteriology[细菌学杂志]177:3465-3471)。所述控制序列也可以是前导子，即对宿主细胞翻译很重要的mRNA的非翻译区域。该前导子可操作地连接至编码该多肽的多核苷酸的5'-末端。可以使用在宿主细胞中有功能的任何前导序列。用于丝状真菌宿主细胞的优选前导序列是从米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶的基因获得的。对于酵母宿主细胞合适的前导序列从以下酶的基因获得：酿酒酵母烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α因子、和酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)。控制序列也可以是多聚腺苷化序列，一种与多核苷酸3’-末端可操作地连接并在转录时由宿主细胞识别为向转录的mRNA添加聚腺苷酸残基的信号序列。可以使用在宿主细胞中起作用的任何聚腺苷酸化序列。用于丝状真菌宿主细胞的优选聚腺苷酸化序列是从以下的基因获得：构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶以及尖孢镰孢胰蛋白酶样蛋白酶。对于酵母宿主细胞有用的多聚腺苷酸化序列由Guo和Sherman，1995，Mol.Cellular Biol.[分子细胞生物学]15:5983-5990描述。
控制序列也可为编码与多肽的N-末端连接的信号肽并指导多肽进入细胞的分泌途径的信号肽编码区。多核苷酸的编码序列的5'-端可固有地含有在翻译阅读框中与编码多肽的编码序列的区段天然地连接的信号肽编码序列。可替代地，编码序列的5'-端可含有对于编码序列为外来的信号肽编码序列。在编码序列天然地不含有信号肽编码序列的情况下，可能需要外源信号肽编码序列。可替代地，外源信号肽编码序列可以单纯地替代天然信号肽编码序列以便增强多肽的分泌。然而，可以使用指导已表达多肽进入宿主细胞的分泌途径的任何信号肽编码序列。
用于细菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是从芽孢杆菌NCIB 11837生麦芽糖淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶、地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT、nprS、nprM)和枯草杆菌prsA的基因获得的信号肽编码序列。另外的信号肽由Simonen和Palva,1993,Microbiological Reviews[微生物评论]57:109-137描述。用于丝状真菌宿主细胞的有效的信号肽编码序列是从以下酶的基因获得的信号肽编码序列：黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶、特异腐质霉纤维素酶、特异腐质霉内切葡聚糖酶V、疏棉状腐质霉脂肪酶和米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶。用于酵母宿主细胞的有用的信号肽从酿酒酵母α-因子和酿酒酵母转化酶的基因获得。其他的有用的信号肽编码序列由Romanos等人，1992，见上文描述。
控制序列也可以是编码位于多肽N-末端处的前肽的前肽编码序列。生成的多肽被称为前体酶(proenzyme)或多肽原(或在一些情况下被称为酶原(zymogen))。多肽原通常是无活性的并且可通过催化切割或自身催化切割来自多肽原的前肽而转化为活性多肽。可以从枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、嗜热毁丝霉漆酶(Myceliophthora thermophila laccase)(WO 95/33836)、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶(Rhizomucor miehei aspartic proteinase)和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)α-因子的基因获得前肽编码序列。
在信号肽序列和前肽序列二者都存在的情况下，该前肽序列位于紧邻多肽的N-末端且该信号肽序列位于紧邻该前肽序列的N-末端。
也可为希望的是添加调节序列，所述调节序列调节宿主细胞生长相关的多肽的表达。调节序列的实例是引起基因表达以响应于化学或物理刺激(包括调节化合物的存在)而开启或关闭的那些。原核系统中的调节序列包括lac、tac以及trp操纵子系统。在酵母中，可以使用ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中，可以使用黑曲霉葡糖淀粉酶启动子、米曲霉TAKAα-淀粉酶启动子和米曲霉葡糖淀粉酶启动子、里氏木霉纤维二糖水解酶I启动子以及里氏木霉纤维二糖水解酶II启动子。调控序列的其他实例是那些允许基因扩增的那些序列。在真核系统中，这些调节序列包括在甲氨蝶呤存在下扩增的二氢叶酸还原酶基因以及用重金属扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况中，编码多肽的多核苷酸会与调控序列可操作地连接。
表达载体
本发明还涉及包含本发明的多核苷酸、启动子、以及转录和翻译终止信号的重组表达载体。多个核苷酸和控制序列可连接在一起以产生重组表达载体，其可包括一个或多个便利的限制位点以允许编码该多肽的多核苷酸在这些位点处的插入或取代。可替代地，多核苷酸可通过将该多核苷酸或包含该多核苷酸的核酸构建体插入用于表达的适当载体中来表达。在产生该表达载体时，该编码序列位于该载体中使得该编码序列与该用于表达的适当控制序列可操作地连接。
重组表达载体可以是可方便地经受重组DNA程序并且可引起多核苷酸表达的任何载体(例如，质粒或病毒)。载体的选择将典型地取决于载体与待引入载体的宿主细胞的相容性。载体可以是线状或闭合的环状质粒。
载体可以是自主复制载体，即作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如质粒、染色体外元件、微染色体或人工染色体。载体可以含有用于确保自我复制的任何装置。可替代地，载体可以是这样的载体，当它引入宿主细胞中时整合入基因组中并与其中已整合了它的一个或多个染色体一起复制。此外，可以使用单独的载体或质粒或两个或更多个载体或质粒，其共同含有待引入宿主细胞基因组的总DNA，或可以使用转座子。
载体优选地含有允许方便地选择转化细胞、转染细胞、转导细胞等细胞的一个或多个选择性标记。选择性标志物是一种基因，其产物提供了杀生物剂抗性或病毒抗性、对重金属抗性、对营养缺陷型的原养性等。
细菌选择性标志物的实例是地衣芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌dal基因、或赋予抗生素抗性(如氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素、新霉素、大观霉素、或四环素抗性)的标志物。用于酵母宿主细胞的适合的标志物包括但不限于：ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。用于丝状真菌宿主细胞中的选择性标记包括但不限于：adeA(磷酸核糖酰氨基咪唑-琥珀酸甲酰胺合酶)、adeB(磷酸核糖酰-氨基咪唑合酶)、amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草丁膦乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)、pyrG(乳清酸核苷-5'-磷酸脱羧酶)、sC(硫酸腺苷酰基转移酶)、以及trpC(邻氨基苯甲酸合酶)、以及其等效物。优选地用于曲霉细胞中的是构巢曲霉或米曲霉amdS和pyrG基因以及吸水链霉菌bar基因。在木霉属细胞中优选使用的是adeA、adeB、amdS、hph以及pyrG基因。
选择性标志物可以是如描述于WO 2010/039889中的双选择性标志物系统。在一个方面中，双选择性标记是hph-tk双选择性标记系统。
载体优选含有允许载体整合到宿主细胞的基因组中或载体在细胞中独立于基因组自主复制的一个或多个元件。
对于整合到该宿主细胞基因组中，该载体可以依靠编码该多肽的多核苷酸序列或用于通过同源或非同源重组整合到该基因组中的该载体的任何其他元件。可替代地，该载体可含有用于指导通过同源重组而整合入宿主细胞基因组中的一个或多个染色体中的一个或多个精确位置处的另外的多核苷酸。为了增加在精确位置整合的可能性，整合的元件应包含足够数量的核酸，如100至10,000个碱基对、400至10,000个碱基对、以及800至10,000个碱基对，其与相应的靶序列具有高度的序列同一性以增强同源重组的可能性。整合元件可以是与宿主细胞基因组内的靶序列同源的任何序列。此外，整合元件可以是非编码多核苷酸或编码多核苷酸。另一个方面，载体可以通过非同源重组整合入宿主细胞的基因组中。
对于自主复制，载体可以进一步包含使载体能够在所讨论的宿主细胞中自主地进行复制的复制起点。复制起点可为在细胞中有功能的介导自主复制的任何质粒复制子。术语“复制起点”或“质粒复制子”意指使质粒或载体能够在体内复制的多核苷酸。
细菌复制起点的实例是容许在大肠杆菌中复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177和pACYC184的复制起点，以及容许在芽孢杆菌属中复制的质粒pUB110、pE194、pTA1060和pAMβ1。
用于酵母宿主细胞中的复制起点的实例是2微米复制起点、ARS1、ARS4、ARS1与CEN3的组合、及ARS4与CEN6的组合。
用于丝状真菌细胞中的复制起点的实例是AMA1和ANS1(Gems等人，1991，Gene[基因]98:61-67；Cullen等人，1987，Nucleic Acids Res[核酸研究]15:9163-9175；WO 00/24883)。可根据WO 00/24883中披露的方法完成AMA1基因的分离和包含该基因的质粒或载体的构建。
可将本发明多核苷酸的多于一个拷贝插入宿主细胞以增加多肽的产生。通过将序列的至少一个另外的拷贝整合到宿主细胞基因组中或者通过包括与该多核苷酸一起的可扩增的选择性标志基因可以获得多核苷酸的增加的拷贝数目，其中通过在适当的选择性试剂的存在下培养细胞可以选择含有选择性标志基因的经扩增的拷贝的细胞、以及由此该多核苷酸的另外的拷贝。
用于连接以上所描述的元件以构建本发明的重组表达载体的方法是本领域的技术人员熟知的(参见，例如，Sambrook等人，1989，见上文)。
宿主细胞
本发明还涉及重组宿主细胞，这些宿主细胞包含可操作地连接至一个或多个控制序列的本发明的多核苷酸，这个或这些控制序列指导本发明的多肽的产生。将包含多核苷酸的构建体或载体引入宿主细胞中，这样使得该构建体或载体作为染色体整合体或作为自主复制的染色体外载体维持，如较早前所述。术语“宿主细胞”涵盖由于复制过程中发生的突变而与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。宿主细胞的选择会在很大程度上取决于编码该多肽的基因及其来源。
宿主细胞可为在本发明的多肽的重组产生中有用的任何细胞，例如原核细胞或真核细胞。
原核宿主细胞可为任何革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。革兰氏阳性细菌包括但不限于：芽孢杆菌属、梭菌属、肠球菌属、土芽孢杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、海洋芽孢杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属、和链霉菌属。革兰氏阴性细菌包括但不限于：弯曲杆菌属、大肠杆菌、黄杆菌属、梭杆菌属、螺杆菌属、泥杆菌属、奈瑟氏菌属、假单胞菌属、沙门氏菌属、以及脲原体属。
细菌宿主细胞可以是任何芽孢杆菌属细胞，包括但不限于：嗜碱芽孢杆菌、高地芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、植物解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens plantarum)亚种、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚硬芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、甲基营养型芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、沙福芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌以及苏云金芽孢杆菌细胞。
细菌宿主细胞还可以是任何链球菌属细胞，包括但不限于：类马链球菌、化脓性链球菌、乳房链球菌以及马链球菌兽疫亚种细胞。
细菌宿主细胞还可以是任何链霉菌属细胞，包括但不限于：不产色链霉菌、除虫链霉菌、天蓝链霉菌、灰色链霉菌以及浅青紫链霉菌细胞。
将DNA引入芽孢杆菌属细胞中可以通过以下来实现：原生质体转化(参见例如，Chang和Cohen,1979,Mol.Gen.Genet.[分子遗传学与基因组学]168:111-115)、感受态细胞转化(参见例如，Young和Spizizen,1961,J.Bacteriol.[细菌学杂志]81:823-829，或Dubnau和Davidoff-Abelson,1971,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]56:209-221)、电穿孔(参见例如，Shigekawa和Dower,1988,Biotechniques[生物技术]6:742-751)或接合(参见例如，Koehler和Thorne,1987,J.Bacteriol.[细菌学杂志]169:5271-5278)。将DNA引入大肠杆菌细胞中可以通过以下来实现：原生质体转化(参见例如，Hanahan,1983,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]166:557-580)或电穿孔(参见例如，Dower等人,1988,Nucleic AcidsRes.[核酸研究]16:6127-6145)。将DNA引入链霉菌属细胞中可以通过以下来实现：原生质体转化、电穿孔(参见例如，Gong等人，2004，Folia Microbiol.(Praha)[叶线形微生物学(布拉格)]49:399-405)、接合(参见例如，Mazodier等人，1989，J.Bacteriol.[细菌学杂志]171:3583-3585)或转导(参见例如，Burke等人，2001，Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]98:6289-6294)。将DNA引入假单孢菌属细胞中可以通过以下来实现：电穿孔(参见例如，Choi等人,2006,J.Microbiol.Methods[微生物学方法杂志]64:391-397)或接合(参见例如，Pinedo和Smets,2005,Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学]71:51-57)。可通过如下方法实现将DNA引入到链球菌属细胞：例如天然感受态(naturalcompetence)(参见，例如，Perry和Kuramitsu,1981,Infect.Immun.[感染与免疫]32:1295-1297)、原生质体转化(参见，例如，Catt和Jollick，1991，Microbios[微生物学]68:189-207)、电穿孔(参见，例如，Buckley等人，1999，Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学]65:3800-3804)、或接合(参见，例如，Clewell，1981，Microbiol.Rev.[微生物学评论]45:409-436)。然而，可以使用本领域已知的将DNA引入宿主细胞中的任何方法。
宿主细胞还可以是真核生物，如哺乳动物、昆虫、植物或真菌细胞。
宿主细胞可以是真菌细胞。如在此使用的“真菌”包括子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)和接合菌门(Zygomycota)以及卵菌门(Oomycota)和所有有丝分裂孢子真菌(如由Hawksworth等人，所定义的，在：Ainsworth andBisby's Dictionary of The Fungi[Ainsworth和Bisby的真菌大词典]，第8版，1995，国际CAB，大学出版社，剑桥，英国)。
真菌宿主细胞可为酵母细胞。如本申请中使用的“酵母”包括产子嚢酵母(内孢霉目)、产担子酵母和属于半知菌类(芽孢纲)的酵母。由于酵母的分类可能在将来变化，出于本发明的目的，酵母应当如酵母的生物学与活性(Skinner、Passmore和Davenport编辑，Soc.App.Bacteriol.Symposium Series No.9[应用细菌学学会专题论文集系列9]，1980)所描述那样定义。
酵母宿主细胞可为假丝酵母属、汉逊酵母属、克鲁弗酵母属、毕赤酵母属、酵母属、裂殖酵母属、或耶氏酵母属细胞，例如乳酸克鲁弗酵母(Kluyveromyces lactis)、卡尔酵母、酿酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母、克鲁弗酵母、诺地酵母、卵形酵母或解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)细胞。
真菌宿主细胞可为丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌门(Eumycota)和卵菌门(Oomycota)的亚门的所有丝状形式(如由Hawksworth等人，1995，见上文)。丝状真菌通常的特征在于由几丁质、纤维素、葡聚糖、壳多糖、甘露聚糖、以及其他复杂多糖构成的菌丝体壁。营养生长是通过菌丝延长，而碳分解代谢是专性需氧的。相反，酵母(例如酿酒酵母)的营养生长是通过单细胞菌体的出芽(budding)，而碳分解代谢可以是发酵性的。
丝状真菌宿主细胞可以是枝顶孢霉属、曲霉属、短梗霉属、烟管霉属(Bjerkandera)、拟腊菌属、金孢子菌属、鬼伞属、革盖菌属(Coriolus)、隐球菌属、线黑粉菌科(Filibasidium)、镰孢属、腐质霉属、梨孢菌属、毛霉属、毁丝霉属、新美鞭菌属、链孢菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌属、射脉菌属(Phlebia)、梨囊鞭菌属、侧耳属(Pleurotus)、裂褶菌属、篮状菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、栓菌属(Trametes)或木霉属细胞。
例如，丝状真菌宿主细胞可以是泡盛曲霉、臭曲霉、烟曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、黑刺烟管菌(Bjerkandera adusta)、干拟蜡菌(Ceriporiopsisaneirina)、卡内基拟蜡菌(Ceriporiopsis caregiea)、浅黄拟蜡孔菌(Ceriporiopsisgilvescens)、潘诺希塔拟蜡菌(Ceriporiopsis pannocinta)、环带拟蜡菌(Ceriporiopsisrivulosa)、微红拟蜡菌(Ceriporiopsis subrufa)、虫拟蜡菌(Ceriporiopsissubvermispora)、狭边金孢子菌(Chrysosporium inops)、嗜角质金孢子菌、卢克诺文思金孢子菌(Chrysosporium lucknowense)、粪状金孢子菌(Chrysosporium merdarium)、租金孢子菌、女王杜香金孢子菌(Chrysosporium queenslandicum)、热带金孢子菌、褐薄金孢子菌(Chrysosporium zonatum)、灰盖鬼伞(Coprinus cinereus)、毛革盖菌(Coriolushirsutus)、杆孢状镰孢、谷类镰孢、库威镰孢、大刀镰孢、禾谷镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖孢镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰孢、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰孢、镶片镰孢、特异腐质霉、柔毛腐质霉、米黑毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙脉孢菌、产紫青霉、黄孢原毛平革菌、射脉菌(Phlebia radiata)、刺芹侧耳(Pleurotuseryngii)、土生梭孢壳霉、长域毛栓菌(Trametes villosa)、变色栓菌(Trametesversicolor)、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉、或绿色木霉细胞。
真菌细胞可以通过下述过程转化，该过程涉及原生质体形成、原生质体的转化、以及以本身已知的方式的细胞壁的再生。用于转化曲霉属和木霉属宿主细胞的适合程序描述于以下文献中：EP 238023，Yelton等人，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]81:1470-1474以及Christensen等人，1988，Bio/Technology[生物/技术]6:1419-1422。用于转化镰孢属物种的适合方法在Malardier等人，1989，Gene[基因]78:147-156和WO 96/00787中描述。可使用由如以下文献描述的程序转化酵母：Becker和Guarente，于Abelson，J.N.和Simon，M.I.编，Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology[酵母遗传学与分子生物学指南]，Methods in Enzymology[酶学方法]，第194卷，第182-187页，学术出版社有限公司(Academic Press,Inc.)，纽约；Ito等人，1983，J.Bacteriol.[细菌学杂志]153:163；以及Hinnen等人，1978，Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院刊]75:1920。
产生方法
本发明还涉及产生本发明的多肽的方法，这些方法包括(a)在有益于产生该多肽的条件下培养一种细胞，该细胞以其野生型形式产生该多肽；并且可任选地(b)回收该多肽。在个一方面中，该细胞是土地芽孢杆菌细胞。在另一个方面中，该细胞是嗜糖土地芽孢杆菌细胞。在个一方面中，该细胞是土地芽孢杆菌细胞。在另一个方面中，该细胞是Terribacillus goriensis细胞。
本发明还涉及产生本发明的多肽的方法，包含(a)在有益于产生该多肽的条件下培养本发明的重组宿主细胞；和任选地(b)回收该多肽。
这些宿主细胞是在合适于使用本领域中已知的方法产生这些多肽的营养介质中培养的。例如，可通过摇瓶培养、或在实验室或工业发酵器中小规模或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批或固态发酵)培养细胞，所述培养在合适的介质中并且在允许表达和/或分离多肽的条件下进行。使用本领域中已知的程序，培养发生在包含碳和氮来源及无机盐的适合的营养介质中。适合的培养基可从商业供应商获得或可以根据公开的组成(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)制备。如果多肽被分泌到该营养培养基中，那么可以直接从该培养基中回收多肽。如果多肽不进行分泌，那么其可以从细胞裂解液中进行回收。
可以使用特异性针对具有氨基己糖苷酶活性的多肽的本领域已知的方法来检测该多肽。这些检测方法包括但不限于：特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。例如，可以使用酶测定来确定多肽的活性。
可使用本领域已知的方法来回收多肽。例如，可通过常规方法，包括但不限于，收集、离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀，从营养介质回收多肽。在一个方面中，回收包含多肽的发酵液。
可通过本领域已知的多种方法纯化多肽以获得基本上纯的多肽，所述方法包括但不限于层析(例如，离子交换、亲和、疏水、层析聚焦和大小排阻)、电泳方法(例如，制备型等电聚焦)、差示溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE或提取(参见，例如，ProteinPurification[蛋白质纯化]，Janson和Ryden编辑，VCH Publishers[VCH出版公司]，纽约，1989)。
在一个替代性方面，不回收多肽，而是将表达该多肽的本发明的宿主细胞用作多肽的来源。
洗涤剂产品的配制品
该清洁组合物可以处于任何常规形式，例如条、均匀的片剂、具有两个或更多个层的片剂、具有一个或多个室的袋、规则的或压缩的粉末、颗粒、膏、凝胶、或规则的、压缩的或浓缩的液体。袋可以被配置为单一隔室或多隔室。它可以具有适合容持该组合物的任何形式、形状和材料，例如在与水接触之前，不允许该组合物从袋中释放出来。该袋由水溶性膜制成，它包含了一个内部体积。可以将所述内部体积分成袋的室。优选的膜是高分子材料，优选地形成膜或薄片的聚合物。优选的聚合物、共聚物或其衍生物选自聚丙烯酸酯、和水溶性丙烯酸酯共聚物、甲基纤维素、羧甲基纤维素、糊精钠、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、麦芽糊精、聚甲基丙烯酸酯，最优选地是聚乙烯醇共聚物以及羟丙基甲基纤维素(HPMC)。优选地，聚合物在膜例如PVA中的水平是至少约60％。优选的平均分子量将典型地是约20,000至约150,000。膜还可以是共混组合物，包含可水解降解并且水可溶的聚合物共混物，例如聚乳酸和聚乙烯醇(已知在贸易参考号M8630下，如由美国印第安纳州的MonoSol有限责任公司出售)加增塑剂，像甘油、乙二醇、丙二醇、山梨醇及其混合物。这些袋可以包含固体衣物清洁组合物或部分组分和/或液体清洁组合物或由水溶性膜分开的部分组分。用于液体组分的室在构成上可以与包含固体的室不同：US 2009/0011970A1。
可以由水可溶袋中的或片剂的不同层中的室来将洗涤剂成分彼此物理分离。因此，可以避免组分间的不良的储存相互作用。在清洗溶液中，每个室的不同溶解曲线还可以引起选择的组分的延迟溶解。
非单位剂量的液体或凝胶洗涤剂可以是水性的，典型地包含按重量计至少20％并且最高达95％的水，例如高达约70％的水、高达约65％的水、高达约55％的水、高达约45％的水、高达约35％的水。包括但不限于链烷醇、胺、二醇、醚以及多元醇的其他类型的液体可以被包括在水性液体或凝胶中。含水液体或凝胶洗涤剂可以含有从0-30％的有机溶剂。
液体或凝胶洗涤剂可以是非水性的。
洗衣皂条
本发明的多肽可以被添加至洗衣皂条中并且用于手洗洗衣、织物和/或纺织品。术语洗衣皂条包括洗衣条、皂条、组合条(combo bar)、合成洗涤剂条以及洗涤剂条。条的类型通常区别在于它们含有的表面活性剂的类型，并且术语洗衣皂条包括含有来自脂肪酸的皂和/或合成皂的那些。洗衣皂条具有在室温下为固体而非液体、凝胶或粉末的物理形式。术语固体被定义为不随时间显著变化的物理形式，即如果固体物体(例如洗衣皂条)被放置在容器里，该固体物体不会为了填充其被放置的容器而发生改变。该条是固体时典型地是条的形式但也可能是其他的固体形状如圆形或椭圆。该洗衣皂条可以含有一个或多个另外的酶、蛋白酶抑制剂如肽醛类(或次硫酸盐加合物或半缩醛加合物)、硼酸、硼酸盐、硼砂和/或苯基硼酸衍生物如4-甲酸基本硼酸、一个或多个皂或合成的表面活性剂、多元醇如甘油、pH控制化合物如脂肪酸、柠檬酸、乙酸和/或甲酸、和/或一价阳离子和有机阴离子的盐，其中该一价阳离子可以是例如Na+、K+或NH4 +并且该有机阴离子可以是例如甲酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐或乳酸盐，这样使得该一价阳离子和有机阴离子的盐可以是例如甲酸钠。洗衣皂条还可以含有络合剂像EDTA和HEDP、香料和/或不同类型的填充剂、表面活性剂例如阴离子型合成表面活性剂、助洗剂、聚合的污垢释放剂、洗涤剂螯合剂、稳定试剂、填充剂、染料、着色剂、染料转移抑制剂、烷氧基化的聚碳酸酯、抑泡剂、结构剂、黏合剂、浸出剂、漂白活化剂、黏土去污剂、抗再沉积剂、聚合分散剂、增亮剂、织物柔软剂、香料和/或本领域已知的其他化合物。洗衣皂条可以在常规的洗衣皂条制造设备中进行加工，例如但不限于：混合器、压条机例如双级真空压条机、挤出机、切割机、标识压模机(logo-stamper)、冷却隧道以及包装机。本发明不局限于通过任何单一方法制备衣物皂条。可以在工艺的不同阶段向肥皂中添加预混料。例如，可以制备包含皂、氨基己糖苷酶、任选地一种或多种另外的酶、蛋白酶抑制剂以及一价阳离子和有机阴离子的盐的预混料并且然后将该混合物压条。可以同时添加作为例如处于液态的蛋白酶抑制剂的氨基己糖苷酶以及任选的另外的酶。除了混合步骤和压条步骤以外，该过程还可以进一步包含研磨、挤出、切割、压模、冷却和/或包装的步骤。
共颗粒中酶的配制品
本发明的多肽可以被配制为颗粒，例如，配制为结合一种或多种酶的共颗粒。然后，每种酶将存在于多种颗粒中，这些颗粒确保酶在洗涤剂中的分布更均匀。这还减少了由于不同的粒度，不同酶的物理隔离。用于生产针对洗涤剂工业的多酶共颗粒的方法披露于IP.com公开内容IPCOM000200739D中。使用共颗粒的酶的配制品的另一个实例披露于WO2013/188331中，其涉及包含以下的洗涤剂组合物：(a)多酶共颗粒；(b)少于10wt沸石(无水基底)；和(c)少于10wt磷酸盐(无水基底)，其中所述酶共颗粒包含从10wt％至98wt％的水分汇组分，并且该组合物另外还包含从20wt％至80wt％的洗涤剂水分汇组分。
该多酶共颗粒可以包含氨基己糖苷酶和一种或多种选自下组的酶，该组由以下组成：脂肪酶、纤维素酶、木葡聚糖酶、过水解酶、过氧化物酶、脂氧合酶、漆酶、半纤维素酶、蛋白酶、纤维二糖脱氢酶、木聚糖酶、磷脂酶、酯酶、角质酶、果胶酶、甘露聚糖酶、果胶酸裂解酶、角蛋白酶、还原酶、氧化酶、酚氧化酶、木质素酶、支链淀粉酶、鞣酸酶、戊聚糖酶、地衣多糖酶、葡聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、透明质酸酶、软骨素酶、淀粉酶及其混合物。
在以下各段落中进一步概述本发明：
1.具有氨基己糖苷酶活性的多肽用于深度清洁物品的用途，该多肽优选地包含基序GXDE(SEQ ID NO 18)、[EQ][NRSHA][YVFL][AGSTC][IVLF][EAQYN][SN](SEQ ID NO 19)、[VIM][LIV]G[GAV]DE[VI][PSA](SEQ ID NO:20)、WND[SQR][IVL][TLVM](SEQ ID NO:21)、QSTL(SEQ ID NO 22)、NKFFY(SEQ ID NO:23)或NLD[DR]S(SEQ ID NO:24)中的一种或多种，其中该物品是纺织品。
2.根据段落1所述的用途，用于防止、减少或去除物品的粘性。
3.根据段落1或2中任一项所述的用途，用于预处理该物品上的污渍。
4.根据段落1-3中任一项所述的用途，用于防止、减少或去除洗涤循环过程中污垢的再沉积。
5.根据段落1-4中任一项所述的用途，用于防止、减少或去除污垢在物品上的附着。
6.根据以上段落中任一项所述的用途，用于维持或改善该物品的白度。
7.根据以上段落中任一项所述的用途，其中从该物品减少或去除恶臭。
8.根据以上组合物段落中任一项所述的用途，其中该表面是纺织品表面。
9.根据以上组合物段落中任一项所述的用途，其中该纺织品由棉、棉/聚酯、聚酯、聚酰胺、聚丙烯和/或丝绸制成。
10.根据以上段落中任一项所述的用途，其中该多肽是如段落47-61所述的多肽。
11.一种组合物，包含具有氨基己糖苷酶活性的多肽，优选地包含基序GXDE(SEQID NO 18)、[EQ][NRSHA][YVFL][AGSTC][IVLF][EAQYN][SN](SEQ ID NO 19)、[VIM][LIV]G[GAV]DE[VI][PSA](SEQ ID NO:20)、WND[SQR][IVL][TLVM](SEQ ID NO:21)、QSTL(SEQ IDNO 22)、NKFFY(SEQ ID NO:23)或NLD[DR]S(SEQ ID NO:24)中的一种或多种以及佐剂成分。
12.根据段落11所述的组合物，其中该多肽是如段落47-61所述的多肽。
13.根据以上组合物段落中任一项所述的组合物，其中该洗涤剂佐剂成分选自下组，该组由以下组成：表面活性剂、助洗剂、絮凝助剂、螯合剂、染料转移抑制剂、酶、酶稳定剂、酶抑制剂、催化材料、漂白活化剂、过氧化氢、过氧化氢源、预形成的过酸、聚合的分散剂、粘土去污剂/抗再沉淀剂、增白剂、抑泡剂、染料、香料、结构弹力剂、织物柔软剂、载体、助水溶物、助洗剂和共助洗剂、织物调色剂、防沫剂、分散剂、加工助剂、和/或颜料。
14.根据前述组合物段落中任一项所述的组合物，其中该组合物包含从约5wt％至约50wt％、从约5wt％至约40wt％、从约5wt％至约30wt％、从约5wt％至约20wt％、从约5wt％至约10wt％的阴离子表面活性剂，优选地选自直链烷基苯磺酸盐(LAS)、LAS的异构体、支链烷基苯磺酸盐(BABS)、苯基链烷磺酸盐、α-烯烃磺酸盐(AOS)、烯烃磺酸盐、链烯烃磺酸盐、链烷-2,3-二基双(硫酸盐)、羟基链烷磺酸盐以及二磺酸盐、烷基硫酸盐(AS)(例如十二烷基硫酸钠(SDS))、脂肪醇硫酸盐(FAS)、伯醇硫酸盐(PAS)、醇醚硫酸盐(AES或AEOS或FES)、仲链烷磺酸盐(SAS)、石蜡烃磺酸盐(PS)、酯磺酸盐、磺化的脂肪酸甘油酯、α-磺酸基脂肪酸甲酯(α-SFMe或SES)(包括甲酯磺酸盐(MES))、烷基琥珀酸或烯基琥珀酸、十二烯基/十四烯基琥珀酸(DTSA)、氨基酸的脂肪酸衍生物、磺酸基琥珀酸或脂肪酸盐(皂)的二酯和单酯及其组合。
15.根据前述组合物段落中任一项所述的组合物，其中该组合物包含从约10wt％至约50wt％的至少一种助洗剂，优选地选自柠檬酸、甲基甘氨酸-N,N-二乙酸(MGDA)和/或谷氨酸-N,N-二乙酸(GLDA)及其混合物。
16.根据前述组合物段落中任一项所述的组合物，其中具有氨基己糖苷酶活性的多肽选自下组，该组由以下组成：具有SEQ ID NO 7、SEQ ID NO 8、SEQ ID NO 9、SEQ ID NO10、SEQ ID NO 11的氨基酸序列的多肽以及与其具有至少60％，例如80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性的多肽。
17.根据前述组合物段落中任一项所述的组合物，其中该多肽具有氨基己糖苷酶活性，是SEQ ID NO 7的氨基酸序列或与其具有至少60％，例如80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性的多肽。
18.根据段落11-16中任一项所述的组合物，其中该多肽具有氨基己糖苷酶活性，是SEQ ID NO 8的氨基酸序列或与其具有至少60％，例如80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性的多肽。
19.根据段落11-16中任一项所述的组合物，其中该多肽具有氨基己糖苷酶活性，是SEQ ID NO 9的氨基酸序列或与其具有至少60％，例如80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性的多肽。
20.根据段落11-16中任一项所述的组合物，其中该多肽具有氨基己糖苷酶活性，是SEQ ID NO 10的氨基酸序列或与其具有至少60％，例如80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性的多肽。
21.根据段落11-16中任一项所述的组合物，其中该多肽具有氨基己糖苷酶活性，是SEQ ID NO 11的氨基酸序列或与其具有至少60％，例如80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性的多肽。
22.根据前述段落中任一项所述的组合物，包含从约5wt％至约40wt％的非离子表面活性剂、和从约0wt％至约5wt％的阴离子表面活性剂。
23.根据段落22所述的组合物，其中该非离子表面活性剂选自：醇乙氧基化物(AE或AEO)、醇丙氧基化物、丙氧基化的脂肪醇(PFA)、烷氧基化的脂肪酸烷基酯(例如乙氧基化的和/或丙氧基化的脂肪酸烷基酯)、烷基酚乙氧基化物(APE)、壬基酚乙氧基化物(NPE)、烷基多糖苷(APG)、烷氧基化胺、脂肪酸单乙醇酰胺(FAM)、脂肪酸二乙醇酰胺(FADA)、乙氧基化的脂肪酸单乙醇酰胺(EFAM)、丙氧基化的脂肪酸单乙醇酰胺(PFAM)、多羟基烷基脂肪酸酰胺、或葡糖胺的N-酰基N-烷基衍生物(葡糖酰胺(GA)、或脂肪酸葡糖酰胺(FAGA))及其组合。
24.根据前述组合物段落中任一项所述的组合物，其中该组合物进一步包括选自下组的一种或多种酶，该组由以下组成：蛋白酶、脂肪酶、角质酶、淀粉酶、糖酶、纤维素酶、果胶酶、甘露聚糖酶、阿拉伯糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶和氧化酶。
25.根据以上组合物段落中任一项所述的组合物，其中该酶是动物、植物或微生物来源的蛋白酶。
26.根据以上组合物段落中任一项所述的组合物，其中该蛋白酶是化学修饰的蛋白酶或蛋白质工程的蛋白酶。
27.根据以上组合物段落中任一项所述的组合物，其中蛋白酶是丝氨酸蛋白酶或金属蛋白酶，优选地碱性微生物蛋白酶或胰蛋白酶样蛋白酶。
28.根据以上组合物段落中任一项所述的组合物，其中该蛋白酶选自下组，该组由以下组成：芽孢杆菌属，例如，枯草杆菌蛋白酶诺和、枯草杆菌蛋白酶嘉士伯、枯草杆菌蛋白酶309、枯草杆菌蛋白酶147、枯草杆菌蛋白酶168、牛源胰蛋白酶、猪源的胰蛋白酶和镰孢属蛋白酶。
29.根据以上组合物段落中任一项所述的组合物，其中该组合物能够减少选自下组的细菌的EPS黏附至表面，该组由以下组成：不动杆菌属物种、气微菌属物种、短波单胞菌属物种、微杆菌属物种、滕黄微球菌、假单胞菌属物种、表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌以及寡养单胞菌属物种，或能够使细菌从它们黏附至其上的表面释放。
30.根据前述组合物段落中任一项所述的组合物，其中该组合物是条，均匀的片剂，具有两个或更多个层的片剂，具有一个或多个室的袋，规则的或压缩的粉末，颗粒，膏，凝胶，或规则的、压缩的或浓缩的液体。
31.根据前述组合物段落中任一项所述的组合物，其中该组合物是选自液体洗涤剂，粉末洗涤剂和颗粒洗涤剂组合物的清洁组合物。
32.一种用于洗涤物品的方法，该方法包括以下步骤：
a.将一种物品暴露于一种洗涤液，该洗涤液包含如段落46-56所述的多肽或根据段落11-31中任一项所述的组合物；
b.完成至少一个洗涤循环；以及
c.任选地冲洗该物品，
其中该物品是纺织品。
33.一种深度清洁物品的方法，其中该物品优选地为纺织品，所述方法包括：将物品暴露于包含多肽的洗涤液中，该多肽优选地包含基序GXDE(SEQ ID NO 18)、[EQ][NRSHA][YVFL][AGSTC][IVLF][EAQYN][SN](SEQ ID NO 19)、[VIM][LIV]G[GAV]DE[VI][PSA](SEQID NO:20)、WND[SQR][IVL][TLVM](SEQ ID NO:21)、QSTL(SEQ ID NO 22)、NKFFY(SEQ IDNO:23)或NLD[DR]S(SEQ ID NO:24)中的一种或多种，其中该多肽选自与示出于下组的多肽具有至少60％，例如80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％的序列同一性，该组由以下组成：SEQ ID NO 7、SEQ ID NO 8、SEQ ID NO 9、SEQ ID NO 10和SEQ ID NO 11。
34.根据段落32或33所述的方法，其中该洗涤液的pH在1至11的范围内。
35.根据以上方法段落中任一项所述的方法，其中该洗涤液的pH在5.5至11的范围内，如在7至9的范围内，在7至8的范围内或在7至8.5的范围内。
36.根据以上方法段落中任一项所述的方法，其中该洗涤液的温度在5℃至95℃的范围内、或在10℃至80℃的范围内、在10℃至70℃的范围内、在10℃至60℃的范围内、在10℃至50℃的范围内、在15℃至40℃的范围内、在20℃至40℃的范围内、在15℃至30℃的范围内或在20℃至30℃的范围内。
37.根据以上方法段落中任一项所述的方法，其中该洗涤液的温度是从约20℃至约40℃。
38.根据以上方法段落中任一项所述的方法，其中该洗涤液的温度是约15℃至约30℃。
39.根据以上方法段落中任一项所述的方法，其中将物品上存在的污渍用如段落46-60所述的多肽或根据段落11-31中任一项所述的洗涤剂组合物进行预处理。
40.根据以上方法段落中任一项所述的方法，其中该物品的粘性被减少。
41.根据以上方法段落中任一项所述的方法，其中污垢再沉积被减少。
42.根据以上方法段落中任一项所述的方法，其中污垢在物品上的附着被减少或去除。
43.根据以上方法段落中任一项所述的方法，其中该物品的白度得到维持或改善。
44.根据以上方法段落中任一项所述的方法，其中从该物品减少或去除恶臭。
45.根据以上方法段落中任一项所述的方法，其中在洗涤液中具有氨基己糖苷酶活性的多肽的浓度为每升洗涤液中至少0.001mg多肽，例如至少0.05mg的蛋白、或至少1.0mg的蛋白、或至少1.5mg的蛋白，任选地洗涤液中该多肽的浓度是每升洗涤液中在0.0002mg/L至2mg/L，例如0.002mg/L至2mg/L、例如0.2mg/L至2mg/L、或在0.00001mg/L至10mg/L的范围内、或在0.0001mg/L至10mg/L的范围内、或在0.001mg/L至10mg/L的范围内、或在0.01mg/L至10mg/L的范围内，任选地本发明多肽的浓度为在总洗涤剂浓度中0.00001％至2wt％，例如0.0001至0.1wt％、例如0.0005至0.1wt％、例如0.001至0.1wt％、例如0.001至0.5wt％、例如0.002至0.5wt％或0.0002至0.09wt％。
46.一种具有氨基己糖苷酶活性的多肽，该多肽选自下组，该组由以下组成：
a.与SEQ ID NO 7、8、9、10或11所示的成熟多肽具有至少60％，例如80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％序列同一性的多肽；
b.由如下多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸在低严格条件下与以下杂交：
i.SEQ ID NO 1、3、5、12或14的成熟多肽编码序列，
ii.其cDNA序列，或
iii.(i)或(ii)的全长互补体；
c.由与SEQ ID NO 1、3、5、12或14的成熟多肽编码序列或其cDNA序列具有至少60％，例如80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％序列同一性的多肽；
d.SEQ ID NO 7、SEQ ID NO 8、SEQ ID NO 9、SEQ ID NO 10或SEQ ID NO 11的成熟多肽的变体，该变体在一个或多个位置处包含取代、缺失、和/或插入；以及
e.(a)、(b)、(c)或(d)的多肽的片段，该片段具有氨基己糖苷酶活性；以及
f.多肽，其包含基序GXDE(SEQ ID NO 18)、[EQ][NRSHA][YVFL][AGSTC][IVLF][EAQYN][SN](SEQ ID NO 19)、[VIM][LIV]G[GAV]DE[VI][PSA](SEQ ID NO:20)、WND[SQR][IVL][TLVM](SEQ ID NO:21)、QSTL(SEQ ID NO 22)、NKFFY(SEQ ID NO:23)、NLD[DR]S(SEQID NO:24)中的一个或多个。
47.如段落46所述的多肽，与SEQ ID NO 2、SEQ ID NO 4、SEQ ID NO 6、SEQ ID NO13或SEQ ID NO 15的成熟多肽或与SEQ ID NO 7、SEQ ID NO 8、SEQ ID NO 9、SEQ ID NO10或SEQ ID NO 11所示的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性。
48.如段落46或47中所述的多肽，该多肽与SEQ ID NO 2的成熟多肽或与SEQ IDNO 7所示的成熟多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性。
49.如段落46或47中所述的多肽，该多肽与SEQ ID NO 4的成熟多肽或与SEQ IDNO 8所示的成熟多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性。
50.如段落46或47中所述的多肽，该多肽与SEQ ID NO 6的成熟多肽或与SEQ IDNO 9所示的成熟多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性。
51.如段落46或47中所述的多肽，该多肽与SEQ ID NO 13的成熟多肽或与SEQ IDNO 10所示的成熟多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性。
52.如段落46或47中所述的多肽，该多肽与SEQ ID NO 15的成熟多肽或与SEQ IDNO 11所示的成熟多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性。
53.根据段落46至52中所述的多肽，该多肽由以下多核苷酸编码，该多核苷酸在低严格条件、低-中严格条件、中严格条件、中-高严格条件、高严格条件、或非常高严格条件下与以下杂交：
i.SEQ ID NO 1、3、5、12或14的成熟多肽编码序列，
ii.其cDNA序列，或
iii.(i)或(ii)的全长互补体。
54.根据段落46-53中任一项所述的多肽，该多肽由以下多核苷酸编码，该多核苷酸与SEQ ID NO 1、3、5、12、14的成熟多肽编码序列或其cDNA序列具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性。
55.根据段落46至54中任一项所述的多肽，包含SEQ ID NO 7、SEQ ID NO 8、SEQID NO 9、SEQ ID NO 10或SEQ ID NO 11所示的氨基酸序列或SEQ ID NO 2、SEQ ID NO 4、SEQ ID NO 6、SEQ ID NO 13或SEQ ID NO 15的成熟多肽或由其组成。
56.根据段落46至55中任一项所述的多肽，该多肽是SEQ ID NO 7、SEQ ID NO 8、SEQ ID NO 9、SEQ ID NO 10或SEQ ID NO 11的变体，该变体在一个或多个位置处包含取代、缺失、和/或插入。
57.一种多核苷酸，该多核苷酸编码根据段落46-56中任一项所述的多肽。
58.一种核酸构建体或表达载体，该核酸构建体或表达载体包含如段落57所述的多核苷酸，该多核苷酸可操作地连接至指导该多肽在表达宿主内产生的一个或多个控制序列。
59.一种重组宿主细胞，该重组宿主细胞包含如段落57所述的多核苷酸，该多核苷酸可操作地连接至指导该多肽产生的一个或多个控制序列。
60.一种产生如段落46-56中任一项所述的多肽的方法，该方法包括：在有益于产生该多肽的条件下培养细胞，该细胞以其野生型形式产生该多肽。
61.如段落60所述的方法，其进一步包括回收该多肽。
62.一种产生根据段落46-56中任一项所述的多肽的方法，该方法包括：在有益于产生该多肽的条件下培养如段落59所述的宿主细胞。
63.如段落62所述的方法，其进一步包括回收该多肽。
64.一种核酸构建体或表达载体，该核酸构建体或表达载体包括编码蛋白质的可操作地连接至如段落57所述的多核苷酸的基因，其中该基因对于编码该信号肽的多核苷酸而言是外源的。
65.一种重组宿主细胞，该重组宿主细胞包括编码蛋白质的可操作地连接至如段落57所述的多核苷酸的基因，其中该基因对于编码该信号肽的多核苷酸而言是外源的。
66.一种产生蛋白质的方法，该方法包括：在有益于产生该蛋白质的条件下培养重组宿主细胞，该重组宿主细胞包括编码蛋白质的可操作地连接至如段落62所述的多核苷酸上的基因，其中该基因对于编码该信号肽的多核苷酸而言是外源的。
67.如段落66所述的方法，该方法进一步包括回收该蛋白质。
68.如段落65所述的重组宿主细胞，进一步包含编码感兴趣的第二多肽的多核苷酸；优选感兴趣的酶；更优选感兴趣的分泌的酶，甚至更优选水解酶、异构酶、连接酶、裂解酶、氧化还原酶、或转移酶；并且最优选该分泌的酶是α-半乳糖苷酶、α-葡糖苷酶、氨肽酶、淀粉酶、天冬酰胺酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、β-木糖苷酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、内切葡聚糖酶、酯酶、绿色荧光蛋白、葡聚糖转移酶、葡糖淀粉酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、变聚糖酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、或木聚糖酶。
69.如段落65的重组宿主细胞，其中该感兴趣的第二多肽是与宿主细胞异源的或同源的。
70.如段落65或68所述的重组宿主细胞，该重组宿主细胞是真菌宿主细胞；优选丝状真菌宿主细胞；更优选地枝顶孢霉属、曲霉属、短梗霉属、烟管霉属(Bjerkandera)、拟腊菌属、金孢子菌属、鬼伞属、革盖菌属(Coriolus)、隐球菌属、线黑粉菌科(Filibasidium)、镰孢属、腐质霉属、梨孢菌属、毛霉属、毁丝霉属、新美鞭菌属、链孢菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌属、射脉菌属(Phlebia)、瘤胃壶菌属、侧耳属(Pleurotus)、裂褶菌属、篮状菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、栓菌属(Trametes)或木霉属细胞；最优选泡盛曲霉、臭曲霉、烟曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、黑刺烟管菌(Bjerkandera adusta)、干拟蜡菌(Ceriporiopsis aneirina)、卡内基拟蜡菌(Ceriporiopsis caregiea)、浅黄拟蜡孔菌(Ceriporiopsis gilvescens)、潘诺希塔拟蜡菌(Ceriporiopsis pannocinta)、环带拟蜡菌(Ceriporiopsis rivulosa)、微红拟蜡菌(Ceriporiopsis subrufa)、虫拟蜡菌(Ceriporiopsis subvermispora)、狭边金孢子菌(Chrysosporium inops)、嗜角质金孢子菌、卢克诺文思金孢子菌(Chrysosporium lucknowense)、粪状金孢子菌(Chrysosporiummerdarium)、租金孢子菌、昆士兰金孢子菌(Chrysosporium queenslandicum)、热带金孢子菌、褐薄金孢子菌(Chrysosporium zonatum)、灰盖鬼伞(Coprinus cinereus)、毛革盖菌(Coriolus hirsutus)、杆孢状镰孢、谷类镰孢、库威镰孢、大刀镰孢、禾谷镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖孢镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰孢、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰孢、镶片镰孢、特异腐质霉、疏棉状腐质霉、米黑毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙链孢菌、产紫青霉、黄孢平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、射脉菌(Phlebia radiata)、刺芹侧耳(Pleurotus eryngii)、土生梭孢壳霉、长域毛栓菌(Trametes villosa)、变色栓菌(Trametes versicolor)、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉、或绿色木霉细胞。
71.如段落65或68中所述的重组宿主细胞，该重组宿主细胞是细菌宿主细胞；优选地原核生物宿主细胞；更优选革兰氏阳性宿主细胞；甚至更优选地芽孢杆菌属、梭状芽孢杆菌、肠球菌属、土芽孢杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、海洋芽孢杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属、或链霉菌属宿主细胞；和最优选地嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、和苏云金芽孢杆菌宿主细胞。
72.根据段落32-45中任一项所述的方法洗涤的物品。
在以下各段落中概述一些优选的实施例：
1.一种组合物，其包含每克组合物至少0.01mg的活性酶和至少一种佐剂成分，其中具有氨基己糖苷酶活性的该多肽选自与SEQ ID NO:2、4和6的成熟多肽具有至少60％序列同一性的多肽。
2.如段落1所述的组合物，其中该多肽与SEQ ID NO:2、4和6的成熟多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性。
3.如段落1或2中任一项所述的组合物，包含SEQ ID NO:7，或SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:8的成熟多肽，或SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:9的成熟多肽，或SEQ ID NO:6的成熟多肽或由其组成。
4.根据段落1至3中任一项所述的组合物，其中该组合物是清洁组合物，例如衣物或餐具洗涤组合物。
5.根据段落4所述的组合物，其中该佐剂成分选自，
a.至少一种助洗剂，
b.至少一种表面活性剂，和
c.至少一种漂白组分。
6.根据段落5所述的组合物，其中该组合物包含至少一种助洗剂，其中该助洗剂的添加量为按重量计约0-65％、优选地按重量计约40％-65％、特别地按重量计约20％-65％、特别地按重量计从10％至50％，且其中该助洗剂选自磷酸盐、柠檬酸钠助洗剂、碳酸钠、硅酸钠、钠和沸石。
7.根据段落6所述的组合物，其中该助洗剂选自柠檬酸、甘氨酸-N,N-二乙酸甲酯(MGDA)和/或谷氨酸-N,N-二乙酸(GLDA)及其混合物。
8.根据前述段落中任一项的组合物，包含1wt％-40wt％，优选地从0.5wt％-30wt％的至少一种漂白组分，其中该漂白组分包括过碳酸盐和漂白催化剂，优选地锰化合物。
9.根据段落8所述的组合物，其中至少一种漂白组分是过氧化物，优选地过碳酸盐和催化剂，优选地含有金属的漂白催化剂例如1,4,7-三甲基-1,4,7-三氮杂环壬烷或乙酸锰(II)四水合物(MnTACN)。
10.根据前述段落中任一项所述的组合物，其中该组合物包含至少一种表面活性剂，其中该表面活性剂是阴离子表面活性剂和/或非离子表面活性剂。
11.根据段落10所述的组合物，其中该组合物包含从约5wt％至约50wt％、从约5wt％至约40wt％、从约5wt％至约30wt％、从约5wt％至约20wt％、从约5wt％至约10wt％的阴离子表面活性剂。
12.根据段落10或11中任一项所述的组合物，其中该组合物包含从约5wt％至约50wt％、从约5wt％至约40wt％、从约5wt％至约30wt％、从约5wt％至约20wt％、从约5wt％至约10wt％的非离子表面活性剂。
13.根据段落10至12中任一项所述的组合物，其中该阴离子表面活性剂选自LAS的直链烷基苯磺酸(LAS)异构体、醇醚硫酸盐(AEO、AEOS)和月桂基醚硫酸钠和月桂醇聚醚硫酸钠(SLES)。
14.根据段落10至13中任一项所述的组合物，其中该非离子表面活性剂选自：醇乙氧基化物(AE或AEO)、醇丙氧基化物、醇丙氧基化物、丙氧基化的脂肪醇(PFA)、烷氧基化的脂肪酸烷基酯(例如乙氧基化的和/或丙氧基化的脂肪酸烷基酯)、烷基酚乙氧基化物(APE)、壬基酚乙氧基化物(NPE)、烷基多糖苷(APG)、烷氧基化胺、脂肪酸单乙醇酰胺(FAM)、脂肪酸二乙醇酰胺(FADA)、乙氧基化的脂肪酸单乙醇酰胺(EFAM)、丙氧基化的脂肪酸单乙醇酰胺(PFAM)、多羟基烷基脂肪酸酰胺、葡糖胺的N-酰基N-烷基衍生物(葡糖酰胺(GA)、或脂肪酸葡糖酰胺(FAGA))及其组合。
15.根据段落1至14中任一项所述的组合物用于深度清洁物品的用途，其中该物品是纺织品。
16.一种用于洗涤物品的洗涤方法，该方法包括以下步骤：
将物品暴露于洗涤液，该洗涤液包含选自下组的多肽，该组由以下组成：与SEQ IDNO:2、4和6的成熟多肽具有至少60％序列同一性的多肽或根据段落1至14中任一项的洗涤剂组合物；
完成至少一个洗涤循环；以及
任选地冲洗该物品，
其中该物品是纺织品。
17.土地芽孢杆菌进化枝的多肽在清洁过程中，例如衣物洗涤和/或餐具洗涤中的用途，其中该多肽具有氨基己糖苷酶活性。
18.土地芽孢杆菌进化枝的多肽用于深度清洁物品的用途，其中该多肽具有氨基己糖苷酶活性，其中该物品是纺织品。
19.根据段落17所述的用途，用于防止、减少或去除物品的粘性。
20.根据段落17或18中任一项所述的用途，用于防止、减少或去除洗涤循环过程中污垢的再沉积。
21.根据前述段落中任一项所述的用途，其中该多肽选自下组，该组由以下组成：与SEQ ID NO:2、4和6的成熟多肽具有至少60％序列同一性的多肽和至少一种佐剂成分。
22.如段落21所述的用途，其中该多肽与SEQ ID NO:2、4和6的成熟多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性。
应当理解的是贯穿本说明书给出的每一最大数值限度包括每一较低的数值限度，如同此类较低数值限度在此被明确写出。贯穿本说明书给出的每一最小数值限度将包括每一较高的数值限度，如同此类较高数值限度在此被明确写出。本说明书中所给出的每个数值范围将包括落入在这样更宽泛数值范围内的每一狭小的范围，好像这样狭小的数值范围都在这里被书面表达了。
测定和洗涤剂组合物
洗涤剂组合物
可以将以下提及的洗涤剂组合物结合本发明的酶一起使用。
Biotex黑(液体)
5％-15％的阴离子型表面活性剂、<5％非离子型表面活性剂、香料、酶、DMDM和乙内酰脲。
碧浪灵敏性白色与彩色衣物洗涤剂组合物、液体洗涤剂组合物
水、酒精乙氧基硫酸盐、醇乙氧基化物、氨基氧化物、柠檬酸、C12-18拔顶棕榈仁脂肪酸、蛋白酶、糖苷酶、淀粉酶、乙醇、1,2丙二醇、甲酸钠、氯化钙、氢氧化钠、有机硅乳液、跨硫酸EHDQ(这些成分以递减次序列出)。
WFK IEC-A标准洗涤剂的组合物(粉末)
成分：直链烷基苯磺酸钠8.8％、乙氧基化的脂肪醇C12-18(7EO)4.7％、钠皂3.2％、消泡剂DC2-4248S 3.9％、硅酸铝钠沸石4A 28.3％、碳酸钠11.6％、丙烯酸和马来酸的共聚物的钠盐(Sokalan CP5)2.4％、硅酸钠3.0％、羧甲基纤维素1.2％、Dequest 20662.8％，光学增白剂0.2％、硫酸钠6.5％、蛋白酶0.4％。
标准洗涤剂A组合物(液体)
成分：12％LAS、11％AEO Biosoft N25-7(NI)、5％AEOS(SLES)、6％MPG(丙二醇)、3％乙醇、3％TEA、2.75％可可皂、2.75％大豆皂、2％甘油、2％氢氧化钠、2％柠檬酸钠、1％甲酸钠、0.2％DTMPA和0.2％PCA(所有的百分数都是w/w)。
标准洗涤剂NA组合物(液体)
成分：NaOH 0.87％、MPG(丙二醇)6％、甘油2％、皂-大豆2.75％、皂-可可2.75％、PCA(Sokalon CP-5)0.2％、AEO Biosoft N25-7(NI)16％、甲酸钠1％、甲酸钠2％、DTMPA0.2％、乙醇(96％)3％、用NaOH或柠檬酸调节pH值添加水至100％(所有百分比均为w/w(重量体积))。
宝莹通用凝胶的组合物
成分：15％-30％阴离子表面活性剂、5％-15％非离子表面活性剂、<5％磷酸盐、皂、戊基肉桂醛、丁苯基甲基丙醛、柠檬烯、香叶醇、光学增亮剂、酶。
碧浪Actilift组合物(液体)
成分：5％-15％阴离子表面活性剂；<5％非离子型表面活性剂、磷酸盐、皂；酶、光学增亮剂、苯并异噻唑啉酮、甲基异噻唑啉酮、香料、α-异甲基紫罗兰酮、香茅醇、香叶醇、芳樟醇。
碧浪Actilift彩色&风格组合物(液体)
成分：5％-15％阴离子表面活性剂；<5％非离子型表面活性剂、磷酸盐、皂；酶、香料、苯并异噻唑啉酮、甲基异噻唑啉酮、α-异甲基紫罗兰酮、丁苯基甲基丙醛、香茅醇、香叶醇、芳樟醇。
宝莹小&强大洗涤剂组合物(液体)
成分：15％-30％阴离子表面活性剂、非离子型表面活性剂、5％-15％皂、<5％聚羧酸盐、香料、磷酸盐、光学增亮剂
宝莹2合1与舒适西番莲粉末
硫酸钠、碳酸钠、十二烷基苯磺酸钠、膨润土、碳酸钠过氧化物、硅酸钠、沸石、水、柠檬酸、TAED、C12-15Pareth-7、硬脂酸、香精、丙烯酸钠/MA共聚物、纤维素胶、所修饰的玉米淀粉、氯化钠、羟乙磷酸四钠、EDTMP钙钠、苯胺吗啉三嗪基-氨基苯磺酸二钠、碳酸氢钠、苯丙基乙基聚甲基硅氧烷、丁苯基甲基丙醛、甘油硬脂酸酯、碳酸钙、聚丙烯酸钠、α-异甲基紫罗兰酮、二苯乙烯基联苯基二磺酸二钠、纤维素、蛋白酶、柠檬烯、PEG-75、二氧化钛、糊精、蔗糖、聚芳基磺酸钠、CI 12490、CI 45100、CI 42090、硫代硫酸钠、CI 61585。
宝莹生物粉末
蔗糖、山梨醇、硅酸铝、聚甲醛三聚氰胺、聚芳基磺酸钠、CI 61585、CI 45100、脂肪酶、淀粉酶、黄胞胶、羟丙基甲基纤维素、CI 12490、二苯乙烯基联苯基二磺酸二钠、硫代硫酸钠、CI 42090、甘露聚糖酶、CI 11680、羟乙磷酸、EDTA四钠。
宝莹生物片剂
碳酸钠、碳酸钠过氧化物、碳酸氢钠、沸石、水、硅酸钠、月桂基硫酸钠、纤维素、TAED、十二烷基苯磺酸钠、半纤维素、木质素、月桂基葡糖苷、丙烯酸钠/MA共聚物、膨润土、氯化钠、香精、羟乙磷酸四钠、硫酸钠、聚丙烯酸钠、二甲硅油、苯胺基吗啉代三嗪基氨基芪磺酸二钠盐、十二烷基苯磺酸、三甲基硅氧基硅酸盐、碳酸钙、纤维素、PEG-75、二氧化钛、糊精、蛋白酶、所修饰的玉米淀粉、蔗糖、CI 12490、聚芳基磺酸钠、硫代硫酸钠、淀粉酶、高岭土。
宝莹色彩护理生物粉末
枯草杆菌蛋白酶、咪唑啉酮、己基肉桂醛、蔗糖、山梨醇、硅酸铝、聚甲醛三聚氰胺、CI 61585、CI 45100、脂肪酶、淀粉酶、黄胞胶、羟丙基甲基纤维素、CI 12490、二苯乙烯基联苯基二磺酸二钠、硫代硫酸钠、CI 42090、甘露聚糖酶、CI 11680、羟乙磷酸、EDTA四钠。
宝莹色彩护理生物片剂
碳酸氢钠、碳酸钠、沸石、水、硅酸钠、十二烷基硫酸钠、纤维素胶、十二烷基苯磺酸钠、月桂基葡糖苷、氯化钠、丙烯酸钠/MA共聚物、香精、硫代乙酸钠、PVP、硫酸钠、羟乙磷酸四钠、聚丙烯酸钠、二甲硅油、膨润土、十二烷基苯磺酸、三甲基硅氧基硅酸盐、碳酸钙、纤维素、PEG-75、二氧化钛、糊精、蛋白酶、所修饰的玉米淀粉、蔗糖、硫代硫酸钠、淀粉酶、CI74160、高岭土。
宝莹双效胶囊生物制品
MEA-十二烷基苯磺酸、MEA-氢化椰油酸、C12-15Pareth-7、二丙二醇、水、羟乙磷酸四钠、聚乙烯醇、甘油、氮丙啶、乙氧基化的均聚物、丙二醇、香精、二亚乙基三胺五亚甲基磷酸钠、山梨醇、MEA-硫酸、乙醇胺、枯草杆菌蛋白酶、乙二醇、丁苯基甲基丙醛、硼酸、(4-甲酰苯基)、己基肉桂醛、柠檬烯、芳樟醇、二苯乙烯基联苯基二磺酸二钠、α-异甲基紫罗兰酮、香叶醇、淀粉酶、聚合的蓝色着色剂、聚合的黄色着色剂、滑石粉、氯化钠、苯并异噻唑啉酮、甘露聚糖酶、苯酸苄铵酰胺。
宝莹2合1与舒适晴天粉末
硫酸钠、碳酸钠、十二烷基苯磺酸钠、膨润土、碳酸钠过氧化物、硅酸钠、沸石、水、柠檬酸、TAED、C12-15Pareth-7、香精、硬脂酸、丙烯酸钠/MA共聚物、纤维素胶、所修饰的玉米淀粉、氯化钠、羟乙磷酸四钠、EDTMP钙钠、苯胺吗啉三嗪基-氨基苯磺酸二钠、碳酸氢钠、苯丙基乙基聚甲基硅氧烷、丁苯基甲基丙醛、甘油硬脂酸酯、碳酸钙、聚丙烯酸钠、香叶醇、二苯乙烯基联苯基二磺酸二钠、纤维素、蛋白酶、PEG-75、二氧化钛、糊精、蔗糖、聚芳基磺酸钠、CI 12490、CI 45100、CI 42090、硫代硫酸钠、CI 61585。
宝莹小&强大2合1与舒适晴天
水、C12-15Pareth-7、十二烷基苯磺酸钠、丙二醇、氢化椰油酸钠、三乙醇胺、甘油、TEA-氢化椰油酸酯、香精、氯化钠、聚季铵盐-10、PVP、聚合的粉色着色剂、硫酸钠、二苯乙烯基联苯基二磺酸二钠、丁苯基甲基丙醛、苯乙烯/丙烯酸酯共聚物、己基肉桂醛、香茅醇、丁子香酚、聚乙烯醇、乙酸钠、异丙醇、聚合的黄色着色剂、十二烷基硫酸钠。
宝莹小&强大生物制品
水、MEA-十二烷基苯磺酸、丙二醇、月桂醇醚硫酸钠、C12-15Pareth-7、TEA-氢化椰油酸酯、MEA-柠檬酸、氮丙啶、乙氧基化的均聚物、MEA-羟乙磷酸、三乙醇胺、香精、丙烯酸酯共聚物、山梨醇、MEA-硫酸、亚硫酸钠、二苯乙烯基联苯基二磺酸二钠、丁苯基甲基丙醛、苯乙烯/丙烯酸酯共聚物、香茅醇、硫酸钠、肽、盐、来自发酵(过程)的糖、枯草杆菌蛋白酶、甘油、硼酸、(4-甲酰苯基)、香叶醇、果胶裂解酶、淀粉酶、十二烷基硫酸钠、甘露聚糖酶、CI42051。
宝莹小&强大胶囊生物制品
MEA-十二烷基苯磺酸、MEA-氢化椰油酸、C12-15Pareth-7、二丙二醇、水、甘油、聚乙烯醇、香精、氮丙啶、乙氧基化的均聚物、二亚乙基三胺五亚甲基磷酸钠、丙二醇、山梨醇、MEA-硫酸、乙醇胺、枯草杆菌蛋白酶、乙二醇、丁苯基甲基丙醛、己基肉桂醛、淀粉、硼酸、(4-甲酰苯基)、柠檬烯、芳樟醇、二苯乙烯基联苯基二磺酸二钠、α-异甲基紫罗兰酮、香叶醇、淀粉酶、滑石粉、聚合的蓝色着色剂、氯化钠、苯并异噻唑啉酮、苯酸苄铵酰胺、聚合的黄色着色剂、甘露聚糖酶。
宝莹小&强大胶囊色彩护理
MEA-十二烷基苯磺酸、MEA-氢化椰油酸、C12-15Pareth-7、二丙二醇、水、甘油、聚乙烯醇、香精、氮丙啶、乙氧基化的均聚物、二亚乙基三胺五亚甲基磷酸钠、丙二醇、MEA-硫酸、乙醇胺、PVP、山梨醇、丁苯基甲基丙醛、枯草杆菌蛋白酶、己基肉桂醛、淀粉、柠檬烯、芳樟醇、硼酸、(4-甲酰苯基)、α-异甲基紫罗兰酮、香叶醇、滑石粉、聚合的蓝色着色剂、苯酸苄铵酰胺、聚合的黄色着色剂。
宝莹小&强大色彩护理
水、MEA-十二烷基苯磺酸、丙二醇、月桂醇醚硫酸钠、C12-15Pareth-7、TEA-氢化椰油酸酯、MEA-柠檬酸、氮丙啶、乙氧基化的均聚物、MEA-羟乙磷酸、三乙醇胺、香精、丙烯酸酯共聚物、山梨醇、MEA-硫酸、亚硫酸钠、甘油、丁苯基甲基丙醛、香茅醇、硫酸钠、肽、盐、来自发酵(过程)的糖,苯乙烯/丙烯酸酯共聚物、枯草杆菌蛋白酶、硼酸、(4-甲酰苯基)、香叶醇、果胶裂解酶、淀粉酶、十二烷基硫酸钠、甘露聚糖酶、CI 61585、CI 45100。
Fairy非生物制品组合物(液体)
成分：15％-30％阴离子表面活性剂、5％-15％非离子表面活性剂、皂、苯并异噻唑啉酮、甲基异噻唑啉酮、香料
标准洗涤剂T组合物(粉末)
成分：11％LAS、2％AS/AEOS、2％皂、3％AEO、15.15％碳酸钠、3％硅酸钠、18.75％沸石、0.15％螯合剂、2％柠檬酸钠、1.65％AA/MA共聚物、2.5％CMC和0.5％SRP(所有的百分数都是w/w)。
标准洗涤剂X组合物(粉末)
成分：16.5％LAS、15％沸石、12％二硅酸钠、20％碳酸钠、1％sokalan、35.5％硫酸钠(所有的百分数都是w/w)。
碧浪Actilift彩色&风格组合物(粉末)
成分：15％-30％阴离子表面活性剂、<5％非离子表面活性剂、磷酸盐、聚羧酸盐、沸石；酶、香料、己基肉桂醛。
碧浪Actilif组合物(粉末)
成分：5％-15％阴离子表面活性剂、基于氧的漂白剂、<5％非离子表面活性剂、磷酸盐、聚羧酸盐、沸石、光学增亮剂、酶、香料、丁苯基甲基丙醛、香豆素、己基肉桂醛
宝莹Megaperls组合物(粉末)
成分：以下的15％-30％：阴离子表面活性剂、基于氧的漂白剂和沸石，以下的少于5％：非离子表面活性剂、磷酸盐、聚羧酸盐、皂、另外的成分：香料、己基肉桂醛、水杨酸苄酯、芳樟醇、光学增亮剂、酶和香茅醇。
嘉盛液体，原版：
成分：水、醇乙氧基硫酸盐、二乙二醇、醇乙氧化物、乙醇胺、直链烷基苯磺酸盐、脂肪酸钠、聚乙烯亚胺乙氧基化物、柠檬酸、硼砂、枯烯磺酸钠、丙二醇、DTPA、二氨基二苯乙烯二磺酸钠、二丙乙基四氨、氢氧化钠、甲酸钠、甲酸钙、二甲硅油、淀粉酶、蛋白酶、LiquitintTM、氢化蓖麻油、香料。
汰渍液体，原版：
成分：直链烷基苯磺酸酯、丙二醇、柠檬酸、氢氧化钠、硼砂、乙醇胺、乙醇、醇硫酸盐、聚乙烯亚胺乙氧基化物、脂肪酸钠、乙氧基硫酸二季铵盐、蛋白酶、二乙二醇、月桂醇聚醚-9、烷基二甲胺氧化物、香料、淀粉酶、二氨基二苯乙烯二磺酸钠、DTPA、甲酸钠、甲酸钙、聚乙二醇4000、甘露聚糖酶、LiquitintTM蓝、二甲硅油。
液体汰渍，自由和温和型：
水、醇乙氧基硫酸钠、丙二醇、硼砂、乙醇、线形烷基苯磺酸钠、盐、聚乙烯亚胺乙氧基化物、二乙二醇、反式硫酸化和乙氧基化的六亚甲基二胺、醇乙氧化物、线形烷基苯磺酸酯、MEA盐、甲酸钠、烷基硫酸钠、DTPA、氧化胺、甲酸钙、二氨基二苯乙烯二钠、二磺酸盐、淀粉酶、蛋白酶、二甲硅油、苯并异噻唑啉酮
汰渍冷水液体，清香型：
水、醇乙氧基硫酸酯、直链烷基苯磺酸酯、二乙二醇、丙二醇、乙醇胺、柠檬酸、硼砂、醇硫酸盐、氢氧化钠、聚乙烯亚胺、乙氧基化物、脂肪酸钠、乙醇、蛋白酶、月桂醇聚醚-9、乙氧基硫酸二季铵盐、月桂基胺氧化物、异丙苯钠、磺酸盐、香味、DTPA、淀粉酶、二钠、二氨基二苯乙烯、二磺酸盐、甲酸钠、二苯乙烯基联苯基二磺酸二钠、甲酸钙、聚乙二醇4000、甘露聚糖酶、果胶酶、LiquitintTM蓝、二甲硅油
汰渍TOTALCARETM液体，冷棉：
水、醇乙氧基硫酸酯、丙二醇、脂肪酸钠、月桂基三甲基氯化铵、乙醇、氢氧化钠、异丙基苯磺酸钠、柠檬酸、乙醇胺、二甘醇、聚醚硅氧烷、硼砂、香味、聚乙烯亚胺、乙氧基化物、蛋白酶、月桂醇聚醚-9、DTPA、聚丙烯酰胺季铵盐氯化物、二氨基二苯乙烯二磺酸钠、甲酸钠、LiquitintTM橙、二丙基乙四胺、二甲硅油、纤维素酶，
液体汰渍加漂白剂AlternativeTM，生动白与鲜艳、原版以及清洁微风：
水、醇乙氧基硫酸钠、烷基硫酸钠、MEA柠檬酸、线形烷基苯磺酸酯、MEA盐、丙二醇、二乙二醇、聚乙烯亚胺乙氧基化物、乙醇、脂肪酸钠、乙醇胺、月桂基胺氧化物、硼砂、月桂醇聚醚-9、DTPA、枯烯磺酸钠、甲酸钠、甲酸钙、线形烷基苯磺酸酯、钠盐、醇硫酸盐、氢氧化钠、乙氧基硫酸二季铵盐、香料、淀粉酶、蛋白酶、甘露聚糖酶、果胶酶、二氨基二苯乙烯二磺酸钠、苯并异噻唑啉酮、LiquitintTM蓝、二甲硅油、二丙基乙四胺。
液体汰渍HE，原味：
水、醇乙氧基硫酸钠、MEA柠檬酸、烷基硫酸钠、醇乙氧化物、线形烷基苯磺酸酯、MEA盐、脂肪酸钠、聚乙烯亚胺乙氧基化物、二乙二醇、丙二醇、乙氧基硫酸二季铵盐、硼砂、聚乙烯亚胺、乙氧基化物丙氧基化物、乙醇、枯烯磺酸钠、香味、DTPA、二氨基二苯乙烯二磺酸钠、甘露聚糖酶、纤维素酶、淀粉酶、甲酸钠、甲酸钙、月桂基胺氧化物、LiquitintTM蓝、二甲硅油/聚二甲基硅酮。
汰渍TOTALCARE HE液体，新生雨润(renewing Rain)：
水、醇乙氧基硫酸酯、线形烷基苯磺酸酯、醇乙氧化物、柠檬酸、乙醇胺、脂肪酸钠、二乙二醇、丙二醇、氢氧化钠、硼砂、聚乙烯亚胺乙氧基化物、聚醚硅氧烷、乙醇、蛋白酶、枯烯磺酸钠、乙氧基硫酸二季铵盐、月桂醇聚醚-9、香味、淀粉酶、DTPA、二氨基二苯乙烯二磺酸钠、二苯乙烯基联苯基二磺酸二钠、甲酸钠、甲酸钙、甘露聚糖酶、LiquitintTM橙、二甲硅油、聚丙烯酰胺季铵盐氯化物、纤维素酶、二丙基乙四胺。
汰渍液体HE自由：
水、醇乙氧基硫酸酯、二乙二醇、单乙醇胺柠檬酸、甲酸钠、丙二醇、线形烷基苯磺酸酯、乙醇胺、乙醇、聚乙烯亚胺乙氧基化物、淀粉酶、苯并异噻唑啉、硼砂、甲酸钙、柠檬酸、乙二烯三胺五乙酸钠、二甲硅油、乙氧基硫酸二季铵盐、二氨基二苯乙烯二磺酸钠、月桂醇聚醚-9、甘露聚糖酶、蛋白酶、枯烯磺酸钠、脂肪酸钠。
汰渍冷水HE液体，清香型：
水、醇乙氧基硫酸酯、MEA柠檬酸、醇硫酸盐、醇乙氧化物、线形烷基苯磺酸酯MEA、脂肪酸钠、聚乙烯亚胺乙氧基化物、二乙二醇、丙二醇、乙氧基硫酸二季铵盐、硼砂、聚乙烯亚胺乙氧基化物丙氧基化物、乙醇、枯烯磺酸钠、香料、DTPA、二氨基二苯乙烯二磺酸钠、蛋白酶、甘露聚糖酶、纤维素酶、淀粉酶、甲酸钠、甲酸钙、月桂基胺氧化物、LiquitintTM蓝、二甲硅油。
汰渍冷水HE自由液体：
水、醇乙氧基硫酸钠、MEA柠檬酸、线形烷基苯磺酸酯：钠盐、醇乙氧化物、线形烷基苯磺酸酯：MEA盐、脂肪酸钠、聚乙烯亚胺乙氧基化物、二乙二醇、丙二醇、乙氧基硫酸二季铵盐、硼砂、蛋白酶、聚乙烯亚胺乙氧基化物丙氧基化物、乙醇、枯烯磺酸钠、淀粉酶、柠檬酸、DTPA、二氨基二苯乙烯二磺酸钠、甲酸钠、甲酸钙、二甲硅油。
汰渍简单洁净与清新：
水、醇乙氧化物硫酸盐、直链烷基苯磺酸钠/Mea盐、丙二醇、二乙二醇、甲酸钠、乙醇、硼砂、脂肪酸钠、香料、月桂基胺氧化物、DTPA、聚乙烯胺乙氧基化物、甲酸钙、二氨基二苯乙烯二磺酸钠、二甲硅油、四胺、LiquitintTM蓝。
汰渍舱，海雾，神秘森林，春天牧场：
线形烷基苯磺酸酯、C12-16Pareth-9、丙二醇、醇乙氧基硫酸酯、水、聚乙烯亚胺乙氧基化物、甘油、脂肪酸盐、PEG-136聚乙酸乙烯酯、乙二胺琥珀酸盐、单乙醇胺柠檬酸、亚硫酸氢钠、乙二烯三胺五乙酸钠、二苯乙烯基联苯基二磺酸二钠、甲酸钙、甘露聚糖酶、木葡聚糖酶、甲酸钠、氢化蓖麻油、natalase、染料、termamyl、枯草杆菌蛋白酶、苯并异噻唑啉、香料。
汰渍去污笔(Tide to Go)：
去离子水、二丙二醇丁基醚、烷基硫酸钠、过氧化氢、乙醇、硫酸镁、烷基二甲基氧化胺、柠檬酸、氢氧化钠、三甲氧基苯甲酸、香料。
汰渍污渍释放液体：
水、烷基乙氧基化物、直链烷基苯磺酸盐、过氧化氢、乙氧基硫酸二季铵盐、乙醇胺、二苯乙烯基联苯基二磺酸二钠、四丁基乙叉基双酚、F&DC黄3、香味。
汰渍污渍释放粉末：
过碳酸钠、硫酸钠、碳酸钠、铝硅酸钠、壬酰氧基苯磺酸盐、聚丙烯酸钠、水、烷基苯磺酸钠、DTPA、聚乙二醇、棕榈酸钠、淀粉酶、蛋白酶、修饰的淀粉、FD&C蓝1、香味。
汰渍污渍释放，预处理器喷雾：
水、烷基乙氧基化物、MEA硼酸盐、直链烷基苯磺酸盐、丙二醇、乙氧基硫酸二季铵盐、氯化钙酶、蛋白酶、乙醇胺、苯并异噻唑啉酮、淀粉酶、柠檬酸钠、氢氧化钠、香料。
汰渍去污渍橡皮擦：
水、烷基氧化胺、二丙二醇苯基醚、过氧化氢、柠檬酸、乙二胺二琥珀酸钠盐、烷基硫酸钠、香味。
汰渍氧化加强：
碳酸氢钠、碳酸钠、过碳酸钠、醇乙氧化物、氯化钠、马来酸/丙烯酸共聚物、壬酰氧基苯磺酸盐、硫酸钠、着色剂、乙二烯三胺五乙酸钠盐、水合硅铝酸盐(沸石)、聚乙二醇、烷基苯磺酸钠、棕榈酸钠、淀粉、水、香料。
汰渍污渍释放加强双重Pac：
聚乙烯醇袋膜，其中有被包装的液体部分和粉末部分：
液体成分：二丙二醇、乙氧基硫酸二季铵盐、水、甘油、LiquitintTM橙，粉末成分：过碳酸钠、壬酰氧基苯磺酸盐、碳酸钠、硫酸钠、铝硅酸钠、聚丙烯酸钠、烷基苯磺酸钠、马来酸/丙烯酸共聚物、水、淀粉酶、聚乙二醇、棕榈酸钠、修饰的淀粉、蛋白酶、甘油、DTPA、香料。
汰渍超级污渍释放：
水、醇乙氧基硫酸钠、直链烷基苯磺酸盐、钠/MEA盐、MEA柠檬酸、丙二醇、聚乙烯亚胺乙氧基化物、乙醇、二乙二醇、聚乙烯亚胺丙氧基乙氧基化物、脂肪酸钠、蛋白酶、硼砂、枯烯磺酸钠、DTPA、香味、淀粉酶、二氨基二苯乙烯二磺酸钠、甲酸钙、甲酸钠、葡聚糖酶、二甲硅油、LiquitintTM蓝、甘露聚糖酶。
具有少许粉状洗涤剂的超级汰渍，四月清新/清洁微风/四月精华：
碳酸钠、铝硅酸钠、硫酸钠、线形烷基苯磺酸酯、膨润土、水、过碳酸钠、聚丙烯酸钠、硅酸盐、烷基硫酸盐、壬酰氧基苯酚酯磺酸、DTPA、聚乙二醇4000、硅胶、乙氧基化物、香味、聚氧化乙烯、棕榈酸、二氨基二苯乙烯二磺酸钠、蛋白酶、LiquitintTM红、FD&C蓝1、纤维素酶。
具有少许Downy清洁微风的超级汰渍：
水、醇乙氧基硫酸钠、MEA柠檬酸、直链烷基苯磺酸盐：钠/MEA盐、丙二醇、聚乙烯亚胺乙氧基化物、乙醇、二乙二醇、聚乙烯亚胺、丙氧基乙氧基化物、乙氧基硫酸二季铵盐、醇硫酸盐、二甲硅油、香料、硼砂、脂肪酸钠、DTPA、蛋白酶、亚硫酸氢钠、二氨基二苯乙烯二磺酸钠、淀粉酶、葡聚糖酶、蓖麻油、甲酸钙、MEA、苯乙烯丙烯酯共聚物、甲酸钠、LiquitintTM蓝。
具有Downy阳花的超级汰渍：
水、醇乙氧基硫酸钠、MEA柠檬酸、直链烷基苯磺酸盐：钠/MEA盐、丙二醇、乙醇、二乙二醇、聚乙烯亚胺丙氧基乙氧基化物、聚乙烯亚胺乙氧基化物、醇硫酸盐、二甲硅油、香料、硼砂、脂肪酸钠、DTPA、蛋白酶、亚硫酸氢钠、二氨基二苯乙烯二磺酸钠、淀粉酶、蓖麻油、甲酸钙、MEA、苯乙烯丙烯酯共聚物、丙铵丙酰胺、葡聚糖酶、甲酸钠、LiquitintTM蓝。
具有Downy四月清新/甜蜜梦境的超级汰渍：
水、醇乙氧基硫酸钠、MEA柠檬酸、直链烷基苯磺酸盐：钠/MEA盐、丙二醇、聚乙烯亚胺乙氧基化物、乙醇、二乙二醇、聚亚乙基亚胺丙氧基乙氧基化物、乙氧基硫酸二季铵盐、醇硫酸盐、二甲硅油、香料、硼砂、脂肪酸钠、DTPA、蛋白酶、亚硫酸氢钠、二氨基二苯乙烯二磺酸钠、淀粉酶、葡聚糖酶、蓖麻油、甲酸钙、MEA、苯乙烯丙烯酯共聚物、丙铵丙酰胺、甲酸钠、LiquitintTM蓝。
超级汰渍自由粉状洗涤剂：
碳酸钠、铝硅酸钠、烷基硫酸盐、硫酸钠、直链烷基苯磺酸酯、水、聚丙烯酸钠、硅酸盐、乙氧基化物、过碳酸钠、聚乙二醇4000、蛋白酶、二氨基二苯乙烯二磺酸钠、硅胶、纤维素酶。
超级汰渍粉状洗涤剂，清洁微风/春日薰衣草/森林泉：
碳酸钠、铝硅酸钠、硫酸钠、线形烷基苯磺酸酯、烷基硫酸盐、过碳酸钠、水、聚丙烯酸钠、硅酸盐、壬酰氧基苯酚酯磺酸、乙氧基化物、聚乙二醇4000、香味、DTPA、二氨基二苯乙烯二磺酸钠、棕榈酸、蛋白酶、硅胶、纤维素酶。
超级汰渍HE(高效率)粉状洗涤剂，清洁微风：
碳酸钠、铝硅酸钠、硫酸钠、线形烷基苯磺酸酯、水、壬酰氧基苯酚酯磺酸、烷基硫酸盐、聚丙烯酸钠、硅酸盐、过碳酸钠、乙氧基化物、聚乙二醇4000、香味、DTPA、棕榈酸、二氨基二苯乙烯二磺酸钠、蛋白酶、硅胶、纤维素酶。
超级汰渍冷水粉状洗涤剂，清香型：
碳酸钠、铝硅酸钠、硫酸钠、过碳酸钠、烷基硫酸盐、线形烷基苯磺酸酯、水、壬酰氧基苯酚酯磺酸、聚丙烯酸钠、硅酸盐、乙氧基化物、聚乙二醇4000、DTPA、香味、Natalase、棕榈酸、蛋白酶、二钠、二氨基二苯乙烯二磺酸盐、FD&C蓝1、硅胶、纤维素酶、烷基醚硫酸盐。
具有漂白剂粉状洗涤剂的超级汰渍，清洁微风：
碳酸钠、铝硅酸钠、硫酸钠、线形烷基苯磺酸酯、过碳酸钠、壬酰氧基苯酚酯磺酸、烷基硫酸盐、水、硅酸盐、聚丙烯酸钠乙氧基化物、聚乙二醇4000、香味、DTPA、棕榈酸、蛋白酶、二氨基二苯乙烯二磺酸钠、硅胶、FD&C蓝1、纤维素酶、烷基醚硫酸盐。
具有Febreeze FreshnessTM粉状洗涤剂的超级汰渍，春日新生：
碳酸钠、铝硅酸钠、硫酸钠、线形烷基苯磺酸酯、过碳酸钠、烷基硫酸盐、水、聚丙烯酸钠、硅酸盐、壬酰氧基苯酚酯磺酸、乙氧基化物、聚乙二醇4000、DTPA、香味、纤维素酶、蛋白酶、二氨基二苯乙烯二磺酸钠、硅胶、FD&C蓝1。
具有Febreeze Freshness的液体汰渍加-运动HE活跃新鲜：
水、醇乙氧基硫酸钠、MEA柠檬酸、线形烷基苯磺酸酯、钠盐、线形烷基苯磺酸酯：MEA盐、醇乙氧化物、脂肪酸钠、丙二醇、二乙二醇、聚乙烯亚胺乙氧基化物丙氧基化物、乙氧基硫酸二季铵盐、
乙醇、枯烯磺酸钠、硼砂、香料、DTPA、硫酸氢钠、二氨基二苯乙烯二磺酸钠、甘露聚糖酶、纤维素酶、淀粉酶、甲酸钠、甲酸钙、月桂基胺氧化物、LiquitintTM蓝、二甲硅油/聚二甲基硅酮。
汰渍加Febreeze Freshness春日新生：
水、醇乙氧基硫酸钠、直链烷基苯磺酸盐：钠/MEA盐、MEA柠檬酸、丙二醇、聚乙烯亚胺乙氧基化物、香料、乙醇、二乙二醇、聚乙烯亚胺丙氧基乙氧基化物、蛋白酶、醇硫酸盐、硼砂、脂肪酸钠、DTPA、二氨基二苯乙烯二磺酸钠、MEA、甘露聚糖酶、葡聚糖酶、甲酸钠、二甲硅油、LiquitintTM蓝、四胺。
具有Febreeze Freshness的液体汰渍加，运动HE胜利新鲜：
水、醇乙氧基硫酸钠、MEA柠檬酸、线形烷基苯磺酸酯、钠盐、线形烷基苯磺酸酯：MEA盐、醇乙氧化物、脂肪酸钠、丙二醇、二乙二醇、聚乙烯亚胺乙氧基化物丙氧基化物、乙氧基硫酸二季铵盐、乙醇、枯烯磺酸钠、硼砂、香料、DTPA、硫酸氢钠、二氨基二苯乙烯二磺酸钠、甘露聚糖酶、纤维素酶、淀粉酶、甲酸钠、甲酸钙、月桂基胺氧化物、LiquitintTM蓝、二甲硅油/聚二甲基硅酮。
汰渍生动白+鲜艳，原版：
碳酸钠、铝硅酸钠、硫酸钠、线形烷基苯磺酸酯、过碳酸钠、壬酰氧基苯酚酯磺酸、烷基硫酸盐、水、硅酸盐、聚丙烯酸钠乙氧基化物、聚乙二醇4000、香料、DTPA、棕榈酸、蛋白酶、二氨基二苯乙烯二磺酸钠、硅胶、FD&C蓝1、纤维素酶、烷基醚硫酸盐。
洗涤测定
迷你Launder-O-Meter(迷你LOM)模式洗涤系统
MiniLOM是一个迷你洗涤系统，其中洗涤是在置于斯图尔特(Stuart)旋转器中的50ml试管中进行的。每个试管模拟一个小的洗涤机并且在一次实验过程中，每个试管将包含一种具有特定的有待测试的洗涤剂/酶系统连同在关于其进行测试的弄脏的和未弄脏的织物。经由旋转(典型地20rpm)获得机械应力，并且通过将旋转器放置在加热柜/室中来控制温度。
Terg-O-toMeter(TOM)洗涤测定
Terg-O-toMeter(TOM)是一种中等规模标准洗涤系统，它可以应用于同时测试12种不同的洗涤条件。TOM基本上是大型的具有多达12个开放金属烧杯淹没至其中的温度受控的水浴。每个烧杯构成一个小的顶部加载型洗涤机器并且在实验期间，它们中的每一者将含有特定洗涤剂/酶系统的溶液并且对弄脏的和未弄脏的织物测试其性能。通过旋转搅拌臂获得机械应力，该旋转搅拌臂搅拌在每个烧杯内的液体。因为TOM杯子不含盖子，所以有可能在TOM实验期间收回样品并且在洗涤期间在线分析信息。
TOM标准洗涤系统主要用于清洁剂和酶的中等规模测试，在例如US或LA/AP洗涤条件下。在一个TOM实验中，因素例如压载物与污垢的比率和织物与洗涤液的比率可以变化。因此，TOM提供了在小规模实验(如AMSA和微型洗涤)与在顶部加载型洗涤机中的更费时的全规模实验之间的联系。设备：水浴具有12个钢制烧杯并且每个烧杯1个旋转臂，每个烧杯的容量是500mL或1200mL的洗涤剂溶液。温度范围是从5℃至80℃。水浴必须充满去离子水。转速可以设定到高达70至120rpm/min。设定Terg-O-toMeter中的温度并且开始在水浴中旋转。等待温度调整(公差是+/-0,5℃)。应该对所有烧杯进行清洁并且不含微量先前测试物质。在一个桶中制备具有所希望的量的洗涤剂、温度和水硬度的洗涤溶液。允许将该洗涤剂在磁搅拌10min期间进行溶解。洗涤溶液应该在制备之后30至60min之内使用。将800ml洗液添加到TOM烧杯中。将洗涤液在120rpm下进行搅拌，并且任选地将一种或多种酶添加到该烧杯中。将小块布样撒到烧杯中并且然后是压载加载物。当小块布样和压载物添加到烧杯中时开始时间测量。将小块布样洗涤20分钟，此后，停止搅拌。随后，将洗涤加载物从TOM烧杯转移到筛，并且用冷自来水冲洗。将固体小块布样从压载加载物中分离。在流动的水下，将污垢小块布样转移到含冷自来水的5L烧杯，持续5分钟。针对即将到来的灭活，分开存放压载加载物。用手轻轻压出小块布样中的水，并且置于铺有纸的托盘上。将另一张纸置于小块布样的顶部。在经受分析之前，允许小块布样干燥过夜，例如，如在此描述的使用Color Eye测量颜色强度。
通过以下实例进一步描述本发明，该实例不应理解为对本发明的范围进行限制。
测定
测定1：氨基己糖苷酶活性
使用4-硝基苯基N-乙酰基-β-D-氨基葡糖苷(西格玛奥瑞奇(Sigma-Aldrich))作为底物确定具有SEQ ID NO 7、SEQ ID NO 8、和SEQ ID NO 9的成熟多肽的氨基己糖苷酶活性。酶促反应在96孔平底聚苯乙烯微量滴定板(赛默科技公司(Thermo Scientific))中一式三份进行，条件如下：在100μl总反应体积中50mM 2-(N-吗啉代)乙磺酸pH 6缓冲液、1.5mg/ml 4-硝基苯基N-乙酰基-β-D-氨基葡糖苷和20μg/ml纯化的酶样品。没有酶的空白样品平行运行。反应在37℃在Thermomixer comfort(艾本德公司(Eppendorf))中进行。孵育10分钟后，向每个反应混合物中添加5μl 1M NaOH以停止酶促反应。使用POLARstarOmega读板数仪(BMG LABTECH)在405nm处读取吸光度，以估计由于4-硝基苯基N-乙酰基-β-D-氨基葡糖苷底物的酶促水解而释放的4-硝基苯酚离子的形成。结果在下表中概述。该表示出了在一式三份中进行的每个反应在405nm处测量的平均吸光度。可以看出，与没有酶的空白相比，用SEQ ID NO 7、SEQ ID NO 8、SEQ ID NO 9进行的反应的吸光度更高，这证明了SEQ ID NO 7、SEQ ID NO 8、SEQ ID NO 9展示了氨基己糖苷酶活性。
表2.SEQ ID NO 7、SEQ ID NO 8和SEQ ID NO 9的氨基己糖苷酶活性。
测定2：氨基己糖苷酶活性
使用4-甲基伞形酮N-乙酰基-β-D-氨基葡糖苷(西格玛奥瑞奇(Sigma-Aldrich))作为底物确定具有SEQ ID NO 7、SEQ ID NO 8、SEQ ID NO 9和SEQ ID NO 10的成熟多肽的氨基己糖苷酶活性。酶促反应在96孔平底聚苯乙烯微量滴定板(赛默科技公司(ThermoScientific))中一式三份进行，条件如下：在200μl总反应体积中20mM 3-吗啉基丙烷-1-磺酸pH 7缓冲液、5mM 4-甲基伞形酮N-乙酰基-β-D-氨基葡糖苷和20nM纯化的酶样品。没有酶的空白样品平行运行。反应在环境温度20℃-25℃进行。在使用SpectraMax M2e读板数仪混合酶和底物后立即跟踪反应动力学。激发波长设定为368nm，荧光发射读数在448nm下完成。以60秒的间隔跟踪反应持续30min。荧光信号的增加用于估计由于4-甲基伞形酮N-乙酰基-β-D-氨基葡糖苷底物的酶法水解而释放的4-甲基伞形酮离子的形成。结果在下表中概述。该表示出了在368nm下使用激发测量的相对荧光单位每分钟(RFU/min)的平均初始反应速率和在一式三份中进行的每个反应的448nm的荧光发射。可以看出，与没有酶的空白相比，用SEQ ID NO 7、SEQ ID NO 8、SEQ ID NO 9、和SEQ ID NO 10进行的反应的初始反应速率更高，这证明了SEQ ID NO 7、SEQ ID NO 8、SEQ ID NO 9、和SEQ ID NO 10展示了氨基己糖苷酶活性。
表3.SEQ ID NO 7、SEQ ID NO 8、SEQ ID NO 9和SEQ ID NO 10的氨基己糖苷酶活性。Δ初始反应速率(RFU/min)＝(初始反应速率样品-初始反应速率空白)
实例
实例1氨基己糖苷酶的表达和克隆
编码氨基己糖苷酶的DNA具有包含于SEQ ID NO 2的多肽是在1969年从ATCC获得的嗜糖土地芽孢杆菌菌株(ATCC12327)中分离的。编码氨基己糖苷酶的DNA具有包含于SEQID NO 4和6的多肽是从美国收集的环境土壤样品中分离的，分别分离自Terribacillusgoriensis和嗜糖土地芽孢杆菌细菌菌株。编码氨基己糖苷酶的DNA具有包含于SEQ ID NO13和15的多肽是随后从两个从美国收集的环境样品中分离的嗜糖土地芽孢杆菌菌株中分离的。通过QIAamp DNA血液迷你试剂盒(凯捷公司(Qiagen)，希尔登(Hilden)，德国)分离来自四个嗜热芽孢杆菌菌株和Terribacillus goriensis菌株的染色体DNA，并使用Illumina技术进行全基因组测序。针对具有糖基水解酶结构域的蛋白质序列分析基因组序列(GH20，www.cazy.org)。从嗜糖土地芽孢杆菌和Terribacillus goriensis菌株中鉴定出三种GH20基因和相应的序列SEQ ID NO:1、3、5、12和14。编码氨基己糖苷酶的成熟肽序列的密码子优化的合成DNA订购自Geneart公司。该成熟多肽示出于SEQ ID NO 7、8、9、10和11。
表4
酶 供体
SEQ ID NO 7 嗜糖土地芽孢杆菌
SEQ ID NO 8 Terribacillus goriensis
SEQ ID NO 9 嗜糖土地芽孢杆菌
SEQ ID NO 10 嗜糖土地芽孢杆菌
SEQ ID NO 11 嗜糖土地芽孢杆菌
实例2：氨基己糖苷酶的克隆和表达
编码氨基己糖苷酶的成熟肽序列或具有氨基己糖苷酶活性的多肽的密码子优化的合成基因示出于SEQ ID NO 7、8、9、10和11中。如WO 12/025577中所述，将序列插入到芽孢杆菌表达载体中。简言之，将编码氨基己糖苷酶基因的成熟肽的DNA框内克隆到克劳氏芽孢杆菌分泌信号(BcSP；具有以下氨基酸序列：MKKPLGKIVASTALLISVAFSSSIASA(SEQ ID NO16))中。BcSP替代了该基因中的天然分泌信号。在BcSP序列的下游，引入亲和标签序列以便于纯化过程(His-标签；具有以下氨基酸序列：HHHHHHPR(SEQ ID NO 17)因此，被表达的基因包含BcSP序列，其后是His-标签序列，随后是成熟的野生型GH20序列，即与SEQ ID NO 7、SEQ ID NO 8、SEQ ID NO 9、SEQ ID NO 10和SEQ ID NO 11的多肽。将最终表达质粒(BcSP-His-标签-GH20)转化到枯草芽孢杆菌表达宿主中。在转化时将GH20BcSP融合基因通过同源重组整合至枯草芽孢杆菌宿主细胞基因组中。
在三联启动子系统的控制下表达该基因构建体(如描述于WO 99/43835中)。将编码氯霉素乙酰转移酶的基因用作标记物(如描述于(Diderichsen等人，1993，Plasmid[质粒]30:312-315)中)。在每ml补充有6毫克氯霉素的LB培养基琼脂上选择转化体。选择一个含有GH20表达构建体的重组枯草芽孢杆菌克隆，并且在旋转摇床上在500mL带挡板的锥形瓶中进行培养，每个锥形瓶含有100ml基于酵母提取物的培养基。在30℃至37℃的3-5天的培养时间后，通过离心收获含有酶的上清液并通过His-标签纯化对这些酶进行纯化。
实例3：His标签纯化方法
在5mL HisTrap Excel柱(通用电气医疗集团生命科学部(GE Healthcare LifeSciences))上，使用Ni2+作为金属离子，通过固定化金属层析(IMAC)纯化所有His-标签的GH20氨基己糖苷酶。该纯化发生在pH 7下，并用咪唑对结合蛋白进行洗脱。通过SDS-PAGE检查纯化的酶的纯度，并且在50mM HEPES、100mM NaCl pH 7.0中缓冲液交换后通过280nm的吸光度确定酶的浓度。
实例4：生物膜测定
金黄色葡萄球菌由Lasa(Valle等人,Mol Microbiol.[分子微生物学]2003五月；48(4):1075-87)友情提供。菌株在胰蛋白酶解酪蛋白大豆琼脂(TSA)上于37℃生长过夜。第二天，将单个菌落转移至15ml胰蛋白酶解酪蛋白大豆肉汤(TSB)中并在37℃振荡孵育5小时。将培养物在TSB+1％葡萄糖中以1:100稀释，并将100μL细菌悬浮液转移至96孔微量滴定板(赛默科技公司(Thermo Scientific)，Nunclon Delta Surface，目录号167008)的每个孔中，并在37℃不摇晃孵育24小时。吸出上清液，用100μL 0.9％氯化钠洗涤孔，并用100μL硬水或3.3g/L标准洗涤剂A填充，该标准洗涤剂A含有0(对照)或20、10、5、2.5、1.25、0.62、0.31、0.16、0.08、0.04、0.02和0.01μg/mL的酶(该成熟多肽具有SEQ ID NO 7、SEQ IDNO 8、SEQ ID NO 9、SEQ ID NO 10和SEQ ID NO 11)。在37℃孵育1小时后，用水洗涤孔并用100μL的0.095％结晶紫溶液(SIGMA V5265)染色15min。然后用100μL水冲洗孔两次，干燥并扫描平板。
在存在和不存在洗涤剂的情况下，确定在孵育1小时后可以减少金黄色葡萄球菌生物膜的可见形成的每种酶的最低浓度(参见表5)。每个重复测定所有酶，得到类似的结果。
表5.在硬水或标准洗涤剂A中孵育1小时后，可以减少金黄色葡萄球菌可见形成的最低浓度的酶。
实例5：在液体标准洗涤剂中氨基己糖苷酶的深度清洁
金黄色葡萄球菌15981(由Lasa(Valle等人,Mol Microbiol.[分子微生物学]2003五月；48(4):1075-87)友情馈赠)在本实例中用作标准微生物。将金黄色葡萄球菌在胰胨大豆琼脂(TSA)(pH 7.3)(CM0131；Oxoid有限公司，贝辛斯托克，英国)上再划线，并在37℃孵育1天。将单个菌落接种到10mL TSB中，并将培养物在37℃振荡(200rpm)孵育16小时。繁殖后，将金黄色葡萄球菌培养物在新鲜的TSB+1％葡萄糖(24563；Roquette Freres)中稀释(1:100)，并将2mL等分试样添加到12孔聚苯乙烯平-底微板(3512；Costar康宁公司(Corning Incorporated)，康宁，纽约，美国))的孔中，其中放置了无菌聚酯(WFK30A)的圆形小块布样(直径2cm)。向对照孔中添加无菌TSB+1％葡萄糖。在37℃，48h(静态孵育)后，用15°dH水冲洗小块布样两次。将五个冲洗的小块布样(无菌或有金黄色葡萄球菌)置于50mL试管和10mL洗涤液(15°dH水和0.2g/L氧化铁(III)纳米粉末(544884；西格玛奥瑞奇(Sigma-Aldrich))中，含3.33g/L液体标准A洗涤剂)和0.2ppm酶(具有SEQ ID NO 7、8和9的成熟多肽)添加至每个管中。没有酶的洗涤被包括作为对照。将试管置于斯图尔特(Stuart)旋转器中并在37℃以20rpm孵育1小时。然后去除洗涤液，并且将小块布样用15°dH水冲洗两次并且在滤纸上干燥过夜。
使用Handheld Minolta CR-300测量色差(L)值，并展示在表6中。还指示了Δ值(L(用酶洗涤的小块布样)-L(没有用酶洗涤的小块布样))。
表6.氨基己糖苷酶在标准洗涤剂A中的深度清洁效果
酶 酶浓度(ppm) L值 ΔL(L有酶-L没有酶)
没有酶 0 102.9
SEQ ID NO 7 0.2 115.1 12.3
SEQ ID NO 8 0.2 115.5 12.7
SEQ ID NO 9 0.2 115.2 12.3
结果示出，氨基己糖苷酶在标准洗涤剂A中展示出深度清洁特性。
实例6：在液体标准洗涤剂中氨基己糖苷酶的深度清洁效果
如实例5中所述，金黄色葡萄球菌生物膜在纺织品小块布样(wfk30A)上生长。用无菌培养基孵育的小块布样被包括作为对照。为了测试氨基己糖苷酶的深度清洁特性，将五个冲洗的小块布样(无菌或有金黄色葡萄球菌)置于50mL锥形离心管和10mL洗涤液中(15°dH水和0.2g/L氧化铁(III)纳米粉末(544884；西格玛奥瑞奇(Sigma-Aldrich))中，含3.33g/L液体标准A洗涤剂)和0.2ppm(或2ppm)酶添加至每个管中。没有酶添加到对照中。将试管置于斯图尔特(Stuart)旋转器山并在37℃以20rpm孵育1小时。然后去除洗涤液，并且将小块布样用15°dH水冲洗两次并且在滤纸上干燥过夜。
使用Handheld Minolta CR-300测量色差(L)值，并计算相对洗涤效率((L有酶-L无酶)/(L无菌小块布样-L无酶)*100)并指示于表7中。
表7.金黄色葡萄球菌生物膜小块布样中液体标准洗涤剂的洗涤效率百分比
小块布样 酶 酶浓度(ppm) ％洗涤效率
金黄色葡萄球菌生物膜 0 0.0
金黄色葡萄球菌生物膜 SEQ ID NO 9 0.2 83.7
金黄色葡萄球菌生物膜 SEQ ID NO 10 0.2 82.1
金黄色葡萄球菌生物膜 SEQ ID NO 11 0.2 62.5
金黄色葡萄球菌生物膜 SEQ ID NO 11 2 89.1
结合之前的实例，结果示出，与不含酶的样品相比，本发明的所有多肽都具有深度清洁特性。
实例7：氨基己糖苷酶对荧光假单胞菌生物膜小块布样的深度清洗效果
分离自冰岛的荧光假单胞菌在本实例中用作标准微生物。将荧光假单胞菌在胰胨大豆琼脂(TSA)(pH 7.3)(CM0131；Oxoid有限公司，贝辛斯托克，英国)上再划线，并在环境温度孵育3天。将单个菌落接种到10mL TSB中，并将培养物在环境温度振荡(Tetramax1000，460rpm)孵育16小时。繁殖后，将培养物在新鲜的TSB中稀释(1:100)，并将1.65mL等分试样添加到12孔聚苯乙烯平-底微板(3512；Costar康宁公司(Corning Incorporated)，康宁，纽约，美国))的孔中，其中放置了无菌聚酯(WFK20A)的圆形小块布样(直径2cm)。向对照孔中添加无菌TSB。在环境温度(静态)孵育48小时后，用0.9％(w/v)NaCl冲洗小块布样两次。将五个冲洗的小块布样(无菌或有荧光假单胞菌生物膜)置于50mL试管和10mL洗涤液(15°dH水和0.2g/L氧化铁(III)纳米粉末(544884；西格玛奥瑞奇(Sigma-Aldrich))中，含3.33g/L液体标准A洗涤剂)和0.2ppm或2ppm酶添加至每个管中。没有酶的洗涤被包括作为对照。将试管置于斯图尔特(Stuart)旋转器中并在30℃以20rpm孵育1小时。然后去除洗涤液，并且将小块布样用15°dH水冲洗两次并且在滤纸上干燥过夜。
使用配备有Nikon D90数码相机的DigiEYE颜色测量和成像系统(VeriVide)测量三色刺激光强度(Y)值，并展示在表8中。还指示了Δ值(Y(用酶洗涤的小块布样)-Y(没有用酶洗涤的小块布样))。
表8.氨基己糖苷酶对纺织品上荧光假单胞菌生物膜的深层清洁效果
实例8氨基己糖苷酶在液体标准洗涤剂中对来自不同微生物的EPS的深度清洁效果
生物膜胞外高聚物(EPS)的粗提取物由金黄色葡萄球菌15981(由Lasa(Valle,J.,A.Toledo-Arana,C.Berasain,J.M.Ghigo,B.Amorena,J.R.Penades,和I.Lasa.2003,Mol.Microbiol.[分子微生物学]48:1075-1087)友情馈赠)、科氏葡萄球菌(纺织品分离株，丹麦，O437F4)、荧光假单胞菌(分离自冰岛)和洛菲氏不动杆菌(分离自丹麦的纺织品)。对于金黄色葡萄球菌，该提取物如下制备：该菌株在胰胨大豆琼脂(TSA)(pH7.3)(CM0131；Oxoid有限公司，贝辛斯托克，英国)上再划线，并在37℃孵育3天。然后接种500mL的TSB+1％葡萄糖(24563；Roquette Freres)，等分到50ml锥形离心管(339652；赛默科技公司Nunc)(每次33ml)中，并在37℃下振荡(200rpm)孵育24小时。随后通过离心(10min，6000g，25℃)沉淀细胞，汇集并重悬于总的5ml 3M NaCl中。将悬浮液剧烈涡旋并在环境温度下孵育15min以提取该表面相关的EPS。然后将细胞重新沉淀(10mi，5000g，25℃)并回收含有EPS的上清液。将上清液无菌过滤两次(0.45μm，然后0.2μm)，测试无菌性并储存在-20℃直至进一步使用。
将科氏葡萄球菌分离株在TSA上再划线，在37℃孵育3天，并用于接种过夜培养物(10ml TSB+1％葡萄糖，在37℃，200rpm孵育)。然后将该培养物稀释(1:100)到具有VentCap(产品号3293)的225cm2角度颈细胞培养瓶中的250ml新鲜培养基(TSB+1％葡萄糖)中，并将烧瓶在37℃孵育2天。通过离心(10min，8000g，25℃)沉淀生物膜培养物，重悬于2.5ml 3M NaCl中并在室温下孵育30min。然后将细胞重新沉淀(10min，5000g，25℃)，回收含有EPS的上清液，无菌过滤(0,20μm，16534-K，Minisart，赛多利斯斯泰迪公司(Sartorius Stedim))并储存于-20℃直到使用。
将荧光假单胞菌在TSA上再划线并在20℃孵育1天。将菌株接种到10mL TSB中，并将培养物在20℃静态孵育16小时。繁殖后，将培养物在400ml M63补充培养基中稀释(1:100)(15mM(NH4)2SO4、100mM KH2PO4、1.8μM FeSO4、1mM MgSO4.7H2O、0.4％(w/v)甘油、0.2％(w/v)酪蛋氨基酸和0.0001％(w/v)硫胺素)，添加至具有Vent Cap的 225cm2角度颈细胞培养瓶并在20℃静态孵育3天。随后通过离心(10min，8000g，25℃)沉淀生物膜培养物，并将细胞重悬于4ml 3M NaCl中并在30℃孵育30min以提取表面相关的EPS。然后将离心(10min，5000g，25℃)后获得的含有EPS的上清液无菌过滤并在-20℃下储存直至进一步。
如下制备来自洛菲氏不动杆菌的粗EPS提取物：将菌株在TSA平板上再划线并在30℃孵育3天。然后用单菌落接种10ml LB培养基(L3152，Fluka)，并在30℃，200rpm孵育48h。将培养物在300ml新鲜LB中稀释(1:100)，添加到具有Vent Cap的225cm2角度颈细胞培养瓶中，并在30℃静态孵育4天。随后通过离心(10min，8000g，25℃)沉淀生物膜培养物，并将该沉淀重悬于总的3ml 3M NaCl中并在室温下孵育30min。离心(10min，5000g，25℃)后获得的含有EPS的上清液进行无菌过滤(0,20μm，16534-K，Minisart，赛多利斯斯泰迪公司(Sartorius Stedim))并储存于-20℃直到使用。
对于洗涤性能测试，将50μl等分试样的不同粗EPS提取物点在无菌纺织品小块布样(WFK20A)上，并在环境温度下孵育15min。将小块布样(无菌或有EPS)置于50mL试管和10mL洗涤液(15°dH水和0.2g/L氧化铁(III)纳米粉末(544884；西格玛奥瑞奇(Sigma-Aldrich))中，含3.33g/L液体标准A洗涤剂)和0.2μg/ml或2μg/ml酶添加至每个管中。没有酶的洗涤被包括作为对照。将试管置于斯图尔特(Stuart)旋转器中并在37℃以20rpm孵育1小时。然后去除洗涤液，并且将小块布样用15°dH水冲洗两次并且在滤纸上干燥过夜。使用配备有Nikon D90数码相机的DigiEYE颜色测量和成像系统(VeriVide)测量三色刺激光强度(Y)值，并展示在表9中。
也指示了Δ值(Y(用酶洗涤的小块布样)-Y(没有用酶洗涤的小块布样))和相对洗涤效率值((L有酶-L无酶)/(L无菌小块布样-L无酶)*100))。
表9.示出于SEQ ID NO 9中的氨基己糖苷酶在液体标准洗涤剂中对来自不同微生物的EPS的深度清洁效果
该数据清楚地示出，氨基己糖苷酶示出了对来自各种微生物的生物膜EPS的深度清洁特性，包括革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌。
实例9：在液体标准洗涤剂中氨基己糖苷酶的减少恶臭
如描述于例如实例8中纯化EPS。纯化后，50μL等分试样的EPS添加到12孔聚苯乙烯平-底微板(3512；Costar，康宁公司(Corning Incorporated)，康宁，纽约，美国))的孔中，其中放置了无菌聚酯(WFK30A)的圆形小块布样(直径2cm)。在进行之前将小块布样孵育15min(静态孵育)。将六个冲洗的小块布样置于50mL试管和10mL洗涤液(15°dH水，含3.33g/L液体标准A洗涤剂)和0.2ppm、2.0ppm或20.0ppm酶(SEQ ID NO 9)添加至每个管中。没有酶的洗涤被包括作为对照。将试管置于斯图尔特(Stuart)旋转器中并在37℃以20rpm孵育1小时。然后去除洗涤液，并且将小块布样用20mL 15°dH水冲洗两次并且在滤纸上干燥过夜。
使用电子鼻设置和分析纺织品上的挥发物的气味室
为了测试气态挥发物的结合，将所有干燥的小块布样随机分布在方形塑料盒(30.7cm x 21.9cm x 6.0cm-内部测量)中。在中心位置的10mL玻璃烧杯中添加5mL各种醛类的混合物(戊醛160mM、己醛40mM、庚醛80mM、(E)-2-庚醛20mM、辛醛30mM、壬醛10mM、癸醛8mM、(E)-2-癸烯醛10mM和(E,E)-2-癸二烯醛12mM-所有化学品购自西格玛奥瑞奇(Sigma-Aldrich))。用盖子关闭气味室并用包裹。将小块布样在室温孵育16h，然后单独置于20mL GC-MS小瓶(Mikrolab奥尔胡斯公司，奥尔胡斯，丹麦)的底部，并用硅胶螺口盖封盖(Mikrolab奥尔胡斯公司，奥尔胡斯，丹麦)。从每个样品中分析5mL顶部空间：
·在40℃孵育20分钟后，来自法国阿尔法M.O.S.(Alpha M.O.S.)的Heracles II电子鼻(具有2个FID的双柱气相色谱仪，柱1：Restek MXT-5 10m x 0.18mm x 0.2μm并且柱2：Restek MXT-1701 10m x 0.18mm x 0.2μm)。样品以随机顺序运行。
表10.在A型标准洗涤剂中通过氨基己糖苷酶去除恶臭。
结果示出氨基己糖苷酶在标准洗涤剂A中展示出恶臭减少特性。
实例10：深度清洁不同洗涤剂中的氨基己糖苷酶
如实例8中所述，从荧光假单胞菌(分离自冰岛)制备粗EPS(胞外高聚物)提取物。对于洗涤性能测试，将50μl等分试样的该提取物点在无菌纺织品小块布样(WFK20A)上，并在环境温度浸泡15min。将小块布样(无菌或有EPS)置于50mL锥形离心管并添加10mL洗涤液(15°dH水和0.2g/L氧化铁(III)纳米粉末(544884；西格玛奥瑞奇(Sigma-Aldrich))中，和含3.33g/L液体标准A洗涤剂、2.0g/L标准N或4.6g/L宝莹通用)。添加酶至终浓度为0.2μg/ml。没有酶的试管被包括作为对照。将试管置于斯图尔特(Stuart)旋转器中并在37℃以20rpm孵育1小时。然后去除洗涤液，并且将小块布样用15°dH水冲洗两次并且在滤纸上干燥过夜。使用配备有Nikon D90数码相机的DigiEYE颜色测量和成像系统(VeriVide)测量三色刺激光强度(Y)值，并展示在表11中。
还指示了Δ值(Y(用酶洗涤的小块布样)-Y(没有用酶洗涤的小块布样))。
表11.荧光假单孢菌EPS小块布样上不同洗涤剂中氨基己糖苷酶的深度清洁
实例11：TOM中的洗涤性能
如实例8中所述，从荧光假单胞菌(分离自冰岛)制备粗EPS提取物。在使用前将提取物无菌过滤，并将100μl等分试样点在纺织品小块布样(wfk20A(聚酯/棉混合(65％/35％))，50mm x 50mm)上，并在室温下孵育10min。Terg-o-tometer洗涤如下进行；称取0.4g/L氧化铁(III)纳米粉末(544884；西格玛奥瑞奇(Sigma-Aldrich))，和3.33g/L液体标准洗涤剂A，并且在洗涤前浸泡1h。然后将脏的洗涤剂添加到TOM烧杯中的1000ml预热水硬度(15°dH)中，并允许其溶解10min(最大搅拌)。然后将搅拌水平减少至90rpm，并添加纺织品小块布样(两个EPS小块布样连同压载物材料(wfk10A，wfk30A)以达到总的10g纺织品/烧杯)并在30℃洗涤35min(0.2ppm)(有或没有酶)。洗涤后，将所有小块布样在自来水中冲洗两次并在滤纸上干燥过夜。使用Macbeth Color-Eye 7000(CE7000)测量反射(REM460nm)值，并展示于表12中。
还指示了Δ值(REM460nm (用酶洗涤的小块布样)-REM460nm (没有用酶洗涤的小块布样))。
表12：EPS小块布样上氨基己糖苷酶的深度清洁特性，在TOM中洗涤
实例12：全规模洗涤的洗涤性能
如实例8中所述，从荧光假单胞菌(分离自冰岛)制备粗EPS提取物。将提取物(200μl等分试样)点在中间切割的预洗涤的T恤(Anvil可持续的(50％聚酯/50％棉))上，并将斑点在洗涤之前在室温干燥30min。T恤的两半在Miele洗衣机(Miele Softtronic，W2245)中使用自来水和在3.33g/L液体标准A洗涤剂中的0.16g/L氧化铁(III)纳米粉末(544884；西格玛奥瑞奇(Sigma-Aldrich))独立地洗涤。使用40℃颜色程序(运行时间1h，26min)。洗涤后，将T恤的两半在室温悬挂干燥过夜。使用Macbeth Color-Eye 7000(CE7000)测量反射(REM460nm)值，并展示于表13中。还指示了Δ值(REM460nm (用酶洗涤的小块布样)-REM460nm (没有用酶洗涤的小块布样))。
表13.在全规模洗衣机中氨基己糖苷酶的深度清洁
实例13：使用荧光WGA-Alexafluor488测定进行EPS水解测量
从冰岛分离的荧光假单胞菌菌株在本实例中用作标准微生物。将荧光假单胞菌菌株在胰胨大豆琼脂(TSA)(pH 7.3)(CM0131；Oxoid有限公司，贝辛斯托克，英国)上再划线，并在23℃孵育1天。将菌株接种到10mL TSB中，并将培养物在23℃振荡孵育16小时。将过夜培养物在200ml M63补充培养基中稀释(1:100)，将(15mM(NH4)2SO4、100mM KH2PO4、1.8μMFeSO4、1mM MgSO4.7H2O、0.4％(w/v)甘油、0.2％(w/v)酪蛋氨基酸和0.0001％(w/v)硫胺素)添加到具有Vent Cap(产品号3293)的 225cm2角度颈细胞培养瓶中，并在23℃静态孵育5天。随后将每种生物膜培养物转移到四个50ml falcon管(Corning#430820)中并通过离心沉淀(10min，8000g，25℃)，并将上清液完全丢弃。将来自四个falcon中的每一个的剩余颗粒重悬于0.450ml 3M NaCl中以提取表面相关的EPS(胞外高聚物)并汇集在一个试管(5ml，Eppendorf号0030119401)中。将悬浮液在25℃以5000g离心10min，并将1.8ml上清液作为EPS级分转移至新的试管中并在-20℃储存直至进一步使用(称作粗EPS)。将150μL等分试样的粗EPS分配到三个Eppendorf管中，并与150μl的含有80ppm的SEQ ID NO 9或单独的50mM Hepes 100mM NaCl缓冲液的酶溶液混合，并在室温孵育1hr。从每个管中回收50μL等分试样，并且然后向孔中添加nunc Maxisorp黑色微量滴定板(赛默科技公司(ThermoScientific号437111)，其中放置了无菌预洗涤小块布样的圆形小块布样(wfk 20A，聚酯/棉65％/35％)。将该平板在室温下孵育15分钟。然后从每个孔中去除上清液，并用100μl水洗涤小块布样。接下来，向每个孔中添加50μl WGA-Alexafluor488染料(10μg/ml；激发/反射最大值约495/519nm；赛默飞世尔科技公司(ThermoFischer Scientific)，号W11261)。488WGA与唾液酸和N-乙酰葡糖胺基残基结合。将该平板在室温下孵育15min。最后用100μl水洗涤样品并在SpectraMax M3仪器中测量。将对应于与酶溶液和缓冲液对照混合的粗EPS的三个样品中的每一个在置于8个孔中的8个小块布样上测试。获得的测量值包括标准差，列于下表14中。
表14.用来自用缓冲液或SEQ ID NO 9处理的荧光假单胞菌菌株的粗EPS的WGA-Alexa Fluor488染料进行荧光测量。
样品 平均测量值
缓冲液对照 416
SEQ ID NO 9 121
荧光测量的结果示出提取自荧光假单胞菌菌株的EPS用WGA-Alexa Fluor488标记，表明EPS含有N-乙酰葡糖胺基残基并且对氨基己糖苷酶(SEQ ID NO 9)水解敏感。
实例14：麦胚凝集素(WGA)-洗涤的EPS小块布样的污渍
从金黄色葡萄球菌15981制备粗EPS提取物(由Lasa(Valle,J.,A.Toledo-Arana,C.Berasain,J.M.Ghigo,B.Amorena,J.R.Penades,和I.Lasa.2003,Mol.Microbiol.[分子微生物学]48:1075-1087)友情馈赠)如实例8中所述(作了微小的修改)：在EPS提取之前，将培养物在37℃在TSB+1％葡萄糖中孵育24h。用于洗涤，将100μl等分试样的EPS点在无菌纺织品小块布样上(预洗涤的wfk20A织物，65％聚酯/35％棉)并在环境温度下孵育20min。将小块布样(无菌或有EPS)置于50mL试管和10mL洗涤液(15°dH水，含3.33g/L液体标准A洗涤剂)和20μg/ml酶添加至每个管中。没有酶的洗涤被包括作为对照。将试管置于斯图尔特(Stuart)旋转器中并在37℃以20rpm孵育1小时。然后取出该洗涤液，并用15°dH水冲洗小块布样两次，并置于12孔聚苯乙烯平-底微板(3512；Costar，康宁公司(CorningIncorporated)，康宁，纽约，美国)。然后将小块布样用Alexa 488麦胚凝集素(WGA)(在1X PBS中10μg/ml)在室温下染色30min，用1X PBS冲洗两次并通过在BMG CLARIOstar酶标仪中的良好扫描进行测量(在488nm处激发，在525nm处发射)。荧光强度值示出于表15中。
还示出了与对照(FIU有酶-FIU没有酶)相比的相对底物去除。
表15.麦胚凝集素(WGA)-有或没有氨基己糖苷酶洗涤的EPS小块布样(SEQ ID NO9)。
当WGA凝集素对N-乙酰葡糖胺基残基具有亲和力时，结果示出，氨基己糖苷酶处理改进了洗涤期间从纺织品中去除底物。
实例15：进化枝和系统发育树的构建
Glyco_hydro_20结构域包括本发明的具有氨基己糖苷酶例如PNAG活性的多肽并且包含WND结构域连同例如进化枝的簇。
如PFAM(PF00728，Pfam版本31.0，Finn(2016).Nucleic Acids Research[核酸研究],数据库问题(Database Issue)44:D279-D285)中所定义的，构建含有Glyco_hydro_20结构域的多肽序列的系统发育树。系统发育树由含有至少一个Glyco_hydro_20结构域的成熟多肽序列的多重比对构建。使用MUSCLE算法版本3.8.31(Edgar,2004.Nucleic AcidsResearch[核酸研究]32(5):1792-1797)对序列进行比对，并且使用FastTree版本2.1.8(Price等人,2010,PloS one[公共科学图书馆·综合]5(3))构建树并使用iTOL(Letunic&Bork,2007.Bioinformatics[生物信息学]23(1):127-128)对树进行可视化。含有Glyco_hydro_20结构域的多肽序列包含若干个基序；一个实例是GXDE(SEQ ID NO 18)，位于嗜糖土地芽孢杆菌的位置158至161(SEQ ID NO 9)。残基D和E是Glyco_hydro_20酶的关键催化残基(SEQ ID NO 9中的位置160至161)。
Glyco_hydro_20中的多肽可以分成多个如下列出的不同的子簇或进化枝。下面详细描述每个进化枝的不同基序。
IAS结构域的生成
鉴定了优选地由本发明的多肽共享的一个结构域。此结构域之前未描述过。该结构域被称作IES，且该结构域的多肽包含Glyco_hydro_20结构域多肽，是细菌来源的并且除了具有PNAG活性之外，其特征在于包含某些基序。该结构域的多肽包含基序实例[EQ][NRSHA][YVFL][AGSTC][IVLF][EAQYN][SN](SEQ ID NO 19)，对应于SEQ ID NO 9的位置44至50的ESYAIAS。
WND结构域的生成
鉴定了优选地由本发明的多肽共享的一个结构域。此结构域之前未描述过。该结构域被称作WND，且该结构域的多肽包含Glyco_hydro_20结构域多肽，是细菌来源的并且除了具有PNAG活性之外，其特征在于包含某些基序。结构域的多肽包含基序实例[VIM][LIV]G[GAV]DE[VI][PSA](SEQ ID NO 20)，对应于SEQ ID NO 9的位置156至163，其中G和DE(对应于SEQ ID NO 9的位置158和160-161)在DSP3进化枝和部分活性位点中是完全保守的。残基D和E是Glyco_hydro_20酶的关键催化残基(SEQ ID NO 9中的位置160至161)。可以由WND结构域的多肽包含的另一个基序是WND[SQR][IVL][TLVM](SEQ ID NO 21)，在SEQ ID NO 9中的193至198，其中W(SEQ ID NO 9中的位置193)是活性位点口袋的一部分，并且推定涉及PNAG底物的N-乙酰基团的结合。
QSTL进化枝的生成
QSTL进化枝包含细菌来源的WND结构域多肽，具有氨基己糖苷酶，例如PNAG活性。该进化枝的多肽包含基序实例QSTL(SEQ ID NO 22)，对应于SEQ ID NO 9的位置216至219，其中所有四个氨基在QSTL进化枝中是完全保守的。该基序是酶的TIM桶结构的推定“盖子”的一部分，并且推定涉及底物结合。可以由QSTL进化枝的多肽包含的另一个基序是NKFFY(SEQ ID NO 23)，SEQ ID NO 9中的273至277。可以由QSTL进化枝的多肽包含的另一个基序是NLD[DR]S(SEQ ID NO 24)，对应于SEQ ID NO 9中的氨基酸204至208。
本发明多肽的比对示出于图2中。本发明多肽的系统发育树示出于图3中。
序列表
<110> 诺维信公司（Novozymes A/S）
<120> 洗涤剂组合物及其用途
<130> 14181-WO-PCT
<160> 24
<170> PatentIn 版本 3.5
<210> 1
<211> 1095
<212> DNA
<213> 嗜糖土地芽孢杆菌
<220>
<221> 信号肽
<222> (1)..(123)
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1095)
<220>
<221> 成熟肽
<222> (124)..(1095)
<400> 1
atg gta tct cgc acg atg ctt ttc atc aag cgc gag aag ggc aag acg 48
Met Val Ser Arg Thr Met Leu Phe Ile Lys Arg Glu Lys Gly Lys Thr
-40 -35 -30
gtt ctt atc aag ttc ctt tct atc acg aca gta tct atc ctt ctt ttc 96
Val Leu Ile Lys Phe Leu Ser Ile Thr Thr Val Ser Ile Leu Leu Phe
-25 -20 -15 -10
ctt acg atg gcg aac act gcg caa gcg caa gac caa gag aag ggc atc 144
Leu Thr Met Ala Asn Thr Ala Gln Ala Gln Asp Gln Glu Lys Gly Ile
-5 -1 1 5
aca atc gac atc tct cgc aag tac tac agc atc aag acg ctt aag gcg 192
Thr Ile Asp Ile Ser Arg Lys Tyr Tyr Ser Ile Lys Thr Leu Lys Ala
10 15 20
atc gtt gac gag atc tca gcg aat ggt ggc gac tac ctt caa ctt cac 240
Ile Val Asp Glu Ile Ser Ala Asn Gly Gly Asp Tyr Leu Gln Leu His
25 30 35
ttc tct gac aac gag agc tac gcg atc gcg tct gag ttc ctt ggc caa 288
Phe Ser Asp Asn Glu Ser Tyr Ala Ile Ala Ser Glu Phe Leu Gly Gln
40 45 50 55
aac tct gag aac cca aac tct gcg tac ctt aca aag aag gag ctt ctt 336
Asn Ser Glu Asn Pro Asn Ser Ala Tyr Leu Thr Lys Lys Glu Leu Leu
60 65 70
tca ctt atc gcg tac tct aac gac cgc aac atc atg gtt atc ccg gac 384
Ser Leu Ile Ala Tyr Ser Asn Asp Arg Asn Ile Met Val Ile Pro Asp
75 80 85
atc gac ctt cct gcg cac tca aag ggc tgg ctt aac atc atg aag gag 432
Ile Asp Leu Pro Ala His Ser Lys Gly Trp Leu Asn Ile Met Lys Glu
90 95 100
aag gac tct ggc ctt tac aca gac atc gta act gac tac tca gaa gac 480
Lys Asp Ser Gly Leu Tyr Thr Asp Ile Val Thr Asp Tyr Ser Glu Asp
105 110 115
act ctt gac tac cac aac aac gcg gtt gcg ctt tac acg gcg aac caa 528
Thr Leu Asp Tyr His Asn Asn Ala Val Ala Leu Tyr Thr Ala Asn Gln
120 125 130 135
ctt ctt gac gag gtt ctt gac ctt ttc tac caa cct aag ttt gct ggc 576
Leu Leu Asp Glu Val Leu Asp Leu Phe Tyr Gln Pro Lys Phe Ala Gly
140 145 150
aag caa cgc atc gtt ctt ggt ggc gac gag gtt cct ggc tct ggt gcg 624
Lys Gln Arg Ile Val Leu Gly Gly Asp Glu Val Pro Gly Ser Gly Ala
155 160 165
cac caa act gac ttc atc cgc ttc atg aac cag atc gcg aag aca gcg 672
His Gln Thr Asp Phe Ile Arg Phe Met Asn Gln Ile Ala Lys Thr Ala
170 175 180
aag gcg tct aac tac gag cca caa atg tgg aac gac agc atc act cct 720
Lys Ala Ser Asn Tyr Glu Pro Gln Met Trp Asn Asp Ser Ile Thr Pro
185 190 195
gag ggc atc caa aac ctt gac cgc tct ttc tct atc ctt tac tgg aag 768
Glu Gly Ile Gln Asn Leu Asp Arg Ser Phe Ser Ile Leu Tyr Trp Lys
200 205 210 215
caa tca acg ctt tca aat ggt gcg caa tct ctt gac gta caa gac ttc 816
Gln Ser Thr Leu Ser Asn Gly Ala Gln Ser Leu Asp Val Gln Asp Phe
220 225 230
gag gag aac ggc ctt tca gtt tac aac tac aac gct tac agc ctt tac 864
Glu Glu Asn Gly Leu Ser Val Tyr Asn Tyr Asn Ala Tyr Ser Leu Tyr
235 240 245
ttc ctt cct agc act cgc ttc acg caa gag gac atc acg gag caa atc 912
Phe Leu Pro Ser Thr Arg Phe Thr Gln Glu Asp Ile Thr Glu Gln Ile
250 255 260
gac tac atg aag tgg gcg tat gcg tac aac aag ttc ttc tac atc tct 960
Asp Tyr Met Lys Trp Ala Tyr Ala Tyr Asn Lys Phe Phe Tyr Ile Ser
265 270 275
gac tac tac aag caa gta gac aca cca aac gta aag ggc tca tct ctt 1008
Asp Tyr Tyr Lys Gln Val Asp Thr Pro Asn Val Lys Gly Ser Ser Leu
280 285 290 295
gta ttc tgg ggt gag cac gcg aac gac ctt tct caa gag ggc ctt ctt 1056
Val Phe Trp Gly Glu His Ala Asn Asp Leu Ser Gln Glu Gly Leu Leu
300 305 310
aag caa gag aag cca ctt atc caa aac ttc ctt ggc ctt 1095
Lys Gln Glu Lys Pro Leu Ile Gln Asn Phe Leu Gly Leu
315 320
<210> 2
<211> 365
<212> PRT
<213> 嗜糖土地芽孢杆菌
<400> 2
Met Val Ser Arg Thr Met Leu Phe Ile Lys Arg Glu Lys Gly Lys Thr
-40 -35 -30
Val Leu Ile Lys Phe Leu Ser Ile Thr Thr Val Ser Ile Leu Leu Phe
-25 -20 -15 -10
Leu Thr Met Ala Asn Thr Ala Gln Ala Gln Asp Gln Glu Lys Gly Ile
-5 -1 1 5
Thr Ile Asp Ile Ser Arg Lys Tyr Tyr Ser Ile Lys Thr Leu Lys Ala
10 15 20
Ile Val Asp Glu Ile Ser Ala Asn Gly Gly Asp Tyr Leu Gln Leu His
25 30 35
Phe Ser Asp Asn Glu Ser Tyr Ala Ile Ala Ser Glu Phe Leu Gly Gln
40 45 50 55
Asn Ser Glu Asn Pro Asn Ser Ala Tyr Leu Thr Lys Lys Glu Leu Leu
60 65 70
Ser Leu Ile Ala Tyr Ser Asn Asp Arg Asn Ile Met Val Ile Pro Asp
75 80 85
Ile Asp Leu Pro Ala His Ser Lys Gly Trp Leu Asn Ile Met Lys Glu
90 95 100
Lys Asp Ser Gly Leu Tyr Thr Asp Ile Val Thr Asp Tyr Ser Glu Asp
105 110 115
Thr Leu Asp Tyr His Asn Asn Ala Val Ala Leu Tyr Thr Ala Asn Gln
120 125 130 135
Leu Leu Asp Glu Val Leu Asp Leu Phe Tyr Gln Pro Lys Phe Ala Gly
140 145 150
Lys Gln Arg Ile Val Leu Gly Gly Asp Glu Val Pro Gly Ser Gly Ala
155 160 165
His Gln Thr Asp Phe Ile Arg Phe Met Asn Gln Ile Ala Lys Thr Ala
170 175 180
Lys Ala Ser Asn Tyr Glu Pro Gln Met Trp Asn Asp Ser Ile Thr Pro
185 190 195
Glu Gly Ile Gln Asn Leu Asp Arg Ser Phe Ser Ile Leu Tyr Trp Lys
200 205 210 215
Gln Ser Thr Leu Ser Asn Gly Ala Gln Ser Leu Asp Val Gln Asp Phe
220 225 230
Glu Glu Asn Gly Leu Ser Val Tyr Asn Tyr Asn Ala Tyr Ser Leu Tyr
235 240 245
Phe Leu Pro Ser Thr Arg Phe Thr Gln Glu Asp Ile Thr Glu Gln Ile
250 255 260
Asp Tyr Met Lys Trp Ala Tyr Ala Tyr Asn Lys Phe Phe Tyr Ile Ser
265 270 275
Asp Tyr Tyr Lys Gln Val Asp Thr Pro Asn Val Lys Gly Ser Ser Leu
280 285 290 295
Val Phe Trp Gly Glu His Ala Asn Asp Leu Ser Gln Glu Gly Leu Leu
300 305 310
Lys Gln Glu Lys Pro Leu Ile Gln Asn Phe Leu Gly Leu
315 320
<210> 3
<211> 1047
<212> DNA
<213> Terribacillus goriensis
<220>
<221> 信号肽
<222> (1)..(75)
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1047)
<220>
<221> 成熟肽
<222> (76)..(1047)
<400> 3
atg ctt atc aag ttc ctt tct atc acg aca gtt tca atc ctt ctt ttc 48
Met Leu Ile Lys Phe Leu Ser Ile Thr Thr Val Ser Ile Leu Leu Phe
-25 -20 -15 -10
ctt acg atg tct aac act gcg caa gcg caa gac caa gag aag ggc atc 96
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aca atc gac atc tct cgc aag tac tac tct atc gag aca ctt aag tct 144
Thr Ile Asp Ile Ser Arg Lys Tyr Tyr Ser Ile Glu Thr Leu Lys Ser
10 15 20
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Thr Met Ser Asn Thr Val Gln Ala Gln Asp Gln Glu Lys Gly Ile Thr
-5 -1 1 5
atc gat att tcg agg aaa cac tat act gtt gaa aca ctg aaa agc ctt 144
Ile Asp Ile Ser Arg Lys His Tyr Thr Val Glu Thr Leu Lys Ser Leu
10 15 20
gta gat gaa ata agc tat aat ggc ggg aac tac gta cag ctg cat ttt 192
Val Asp Glu Ile Ser Tyr Asn Gly Gly Asn Tyr Val Gln Leu His Phe
25 30 35 40
tcc gat aat gag aat tat gct ata gct tct gaa tat ctt ggt cag agc 240
Ser Asp Asn Glu Asn Tyr Ala Ile Ala Ser Glu Tyr Leu Gly Gln Ser
45 50 55
agt gag aat acc aat aat aca tat ttg acg aaa aat gaa ctt cta tca 288
Ser Glu Asn Thr Asn Asn Thr Tyr Leu Thr Lys Asn Glu Leu Leu Ser
60 65 70
tta ata gca tat agt aat gat aaa gat ata ctg gtc att cct gat att 336
Leu Ile Ala Tyr Ser Asn Asp Lys Asp Ile Leu Val Ile Pro Asp Ile
75 80 85
gat ctg ccg gcg cac tcc aag ggg tgg ctg gaa tta atc aaa aag aaa 384
Asp Leu Pro Ala His Ser Lys Gly Trp Leu Glu Leu Ile Lys Lys Lys
90 95 100
gat gtg aag tta tat aat gac atc gta acg gat tac agc gaa gag aca 432
Asp Val Lys Leu Tyr Asn Asp Ile Val Thr Asp Tyr Ser Glu Glu Thr
105 110 115 120
ctg gat tat tat gat aat aga gtc gca ttg gat act gtg aat cag ctg 480
Leu Asp Tyr Tyr Asp Asn Arg Val Ala Leu Asp Thr Val Asn Gln Leu
125 130 135
ttg gat gaa gtg ctt gat ttg ttt tat cag cca aaa ttc gaa gga aaa 528
Leu Asp Glu Val Leu Asp Leu Phe Tyr Gln Pro Lys Phe Glu Gly Lys
140 145 150
caa aga ata gtg ctt ggc ggg gat gaa gta tcg gga agt gaa gtg cat 576
Gln Arg Ile Val Leu Gly Gly Asp Glu Val Ser Gly Ser Glu Val His
155 160 165
cag ttg gat ttt att gat ttt atg aat cag att gcc agt aca gtc aaa 624
Gln Leu Asp Phe Ile Asp Phe Met Asn Gln Ile Ala Ser Thr Val Lys
170 175 180
gaa agc aaa tat gaa ccg caa atg tgg aat gac agc atc acg tca gaa 672
Glu Ser Lys Tyr Glu Pro Gln Met Trp Asn Asp Ser Ile Thr Ser Glu
185 190 195 200
gga ata gcg aac ttg gac gat agc ttt tcc atc ctc tat tgg cag caa 720
Gly Ile Ala Asn Leu Asp Asp Ser Phe Ser Ile Leu Tyr Trp Gln Gln
205 210 215
agt aca ctt tcc agc gga gaa gaa agc ttg aat gtg gag gac ttt gaa 768
Ser Thr Leu Ser Ser Gly Glu Glu Ser Leu Asn Val Glu Asp Phe Glu
220 225 230
aac tgg ggt ttc tcc gta tat aac tat aat gca tat tct ttg tac ttc 816
Asn Trp Gly Phe Ser Val Tyr Asn Tyr Asn Ala Tyr Ser Leu Tyr Phe
235 240 245
tta cca tca aac ggg ttt aca cag gaa gat atc aat gag cag atg gat 864
Leu Pro Ser Asn Gly Phe Thr Gln Glu Asp Ile Asn Glu Gln Met Asp
250 255 260
tat atg aat tgg gct tat gcg cat aat aaa ttt ttc tat att tca gat 912
Tyr Met Asn Trp Ala Tyr Ala His Asn Lys Phe Phe Tyr Ile Ser Asp
265 270 275 280
tac tat cat gcg gtg gaa act tct aat gta aaa ggt tca agt ctg acc 960
Tyr Tyr His Ala Val Glu Thr Ser Asn Val Lys Gly Ser Ser Leu Thr
285 290 295
ttt tgg ggc gaa cat gca act gac ttg agc caa aag aaa tta tta aag 1008
Phe Trp Gly Glu His Ala Thr Asp Leu Ser Gln Lys Lys Leu Leu Lys
300 305 310
caa gag ctg cct ttg ata aga cat tat ctg aac ttg taa 1047
Gln Glu Leu Pro Leu Ile Arg His Tyr Leu Asn Leu
315 320
<210> 13
<211> 348
<212> PRT
<213> 嗜糖土地芽孢杆菌
<400> 13
Leu Phe Lys Ile Leu Ser Ile Thr Ala Leu Gly Met Ile Leu Phe Leu
-20 -15 -10
Thr Met Ser Asn Thr Val Gln Ala Gln Asp Gln Glu Lys Gly Ile Thr
-5 -1 1 5
Ile Asp Ile Ser Arg Lys His Tyr Thr Val Glu Thr Leu Lys Ser Leu
10 15 20
Val Asp Glu Ile Ser Tyr Asn Gly Gly Asn Tyr Val Gln Leu His Phe
25 30 35 40
Ser Asp Asn Glu Asn Tyr Ala Ile Ala Ser Glu Tyr Leu Gly Gln Ser
45 50 55
Ser Glu Asn Thr Asn Asn Thr Tyr Leu Thr Lys Asn Glu Leu Leu Ser
60 65 70
Leu Ile Ala Tyr Ser Asn Asp Lys Asp Ile Leu Val Ile Pro Asp Ile
75 80 85
Asp Leu Pro Ala His Ser Lys Gly Trp Leu Glu Leu Ile Lys Lys Lys
90 95 100
Asp Val Lys Leu Tyr Asn Asp Ile Val Thr Asp Tyr Ser Glu Glu Thr
105 110 115 120
Leu Asp Tyr Tyr Asp Asn Arg Val Ala Leu Asp Thr Val Asn Gln Leu
125 130 135
Leu Asp Glu Val Leu Asp Leu Phe Tyr Gln Pro Lys Phe Glu Gly Lys
140 145 150
Gln Arg Ile Val Leu Gly Gly Asp Glu Val Ser Gly Ser Glu Val His
155 160 165
Gln Leu Asp Phe Ile Asp Phe Met Asn Gln Ile Ala Ser Thr Val Lys
170 175 180
Glu Ser Lys Tyr Glu Pro Gln Met Trp Asn Asp Ser Ile Thr Ser Glu
185 190 195 200
Gly Ile Ala Asn Leu Asp Asp Ser Phe Ser Ile Leu Tyr Trp Gln Gln
205 210 215
Ser Thr Leu Ser Ser Gly Glu Glu Ser Leu Asn Val Glu Asp Phe Glu
220 225 230
Asn Trp Gly Phe Ser Val Tyr Asn Tyr Asn Ala Tyr Ser Leu Tyr Phe
235 240 245
Leu Pro Ser Asn Gly Phe Thr Gln Glu Asp Ile Asn Glu Gln Met Asp
250 255 260
Tyr Met Asn Trp Ala Tyr Ala His Asn Lys Phe Phe Tyr Ile Ser Asp
265 270 275 280
Tyr Tyr His Ala Val Glu Thr Ser Asn Val Lys Gly Ser Ser Leu Thr
285 290 295
Phe Trp Gly Glu His Ala Thr Asp Leu Ser Gln Lys Lys Leu Leu Lys
300 305 310
Gln Glu Leu Pro Leu Ile Arg His Tyr Leu Asn Leu
315 320
<210> 14
<211> 1047
<212> DNA
<213> 嗜糖土地芽孢杆菌
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1044)
<220>
<221> 信号肽
<222> (1)..(72)
<220>
<221> 成熟肽
<222> (73)..(1044)
<400> 14
ttg att aaa ttt ctt tct att aca aca gtt agt ata ctc tta ttt cta 48
Leu Ile Lys Phe Leu Ser Ile Thr Thr Val Ser Ile Leu Leu Phe Leu
-20 -15 -10
act atg gcg aat aca gta cat gca aag gat caa gag aaa ggg att tca 96
Thr Met Ala Asn Thr Val His Ala Lys Asp Gln Glu Lys Gly Ile Ser
-5 -1 1 5
atc gat att tcg aga aaa tat tat tct atc gga aca tta aaa gca att 144
Ile Asp Ile Ser Arg Lys Tyr Tyr Ser Ile Gly Thr Leu Lys Ala Ile
10 15 20
ata gat gaa ata agt gca aat ggc gga gac tac tta cag ctg cat ttt 192
Ile Asp Glu Ile Ser Ala Asn Gly Gly Asp Tyr Leu Gln Leu His Phe
25 30 35 40
tca gat aat gag agc tat gca att gct tct gac tat ctt ggt cag atc 240
Ser Asp Asn Glu Ser Tyr Ala Ile Ala Ser Asp Tyr Leu Gly Gln Ile
45 50 55
agt gat act cct aac aat aca tac tta acg aaa aat gat ctt tta tca 288
Ser Asp Thr Pro Asn Asn Thr Tyr Leu Thr Lys Asn Asp Leu Leu Ser
60 65 70
ctt ata gca tat agc aat gat aga aat ata ctg atc att ccc gat atg 336
Leu Ile Ala Tyr Ser Asn Asp Arg Asn Ile Leu Ile Ile Pro Asp Met
75 80 85
gat cta cct gcg cat tcc aga ggc tgg ttg gag tta atg aaa gtg aaa 384
Asp Leu Pro Ala His Ser Arg Gly Trp Leu Glu Leu Met Lys Val Lys
90 95 100
gat aga gaa tta tat act gac att gta acg gat tac agt aac gag aca 432
Asp Arg Glu Leu Tyr Thr Asp Ile Val Thr Asp Tyr Ser Asn Glu Thr
105 110 115 120
ctt gat tat cat aat aat aca gat gct cta aat act gcg aat cag ctg 480
Leu Asp Tyr His Asn Asn Thr Asp Ala Leu Asn Thr Ala Asn Gln Leu
125 130 135
tta aat gaa ata ctt gaa cta ttt tat cag cca aag ttt gcg ggg aag 528
Leu Asn Glu Ile Leu Glu Leu Phe Tyr Gln Pro Lys Phe Ala Gly Lys
140 145 150
cag agg ata gta ctt ggc gga gat gaa gtg cca ggg agt gag att cat 576
Gln Arg Ile Val Leu Gly Gly Asp Glu Val Pro Gly Ser Glu Ile His
155 160 165
cag ttg gat ttc att cgt ttt att aat caa atc gcc tcc act gct aaa 624
Gln Leu Asp Phe Ile Arg Phe Ile Asn Gln Ile Ala Ser Thr Ala Lys
170 175 180
gct agc aac tat gca cca cag atg tgg aat gat agc att act gca gaa 672
Ala Ser Asn Tyr Ala Pro Gln Met Trp Asn Asp Ser Ile Thr Ala Glu
185 190 195 200
gga att cag aat ctg gat aaa agc ttc tct att ctt tat tgg aag caa 720
Gly Ile Gln Asn Leu Asp Lys Ser Phe Ser Ile Leu Tyr Trp Lys Gln
205 210 215
agt acg ctt tca aac ggt gca caa agt cta gaa gta caa gac ttt gaa 768
Ser Thr Leu Ser Asn Gly Ala Gln Ser Leu Glu Val Gln Asp Phe Glu
220 225 230
gac tgg gat ttt ccc gta tat aac tat aat gca tat tct tta tat ttc 816
Asp Trp Asp Phe Pro Val Tyr Asn Tyr Asn Ala Tyr Ser Leu Tyr Phe
235 240 245
tta cct tcc atc cgt ttt acc gat gaa gat ata aca gag cag atg aac 864
Leu Pro Ser Ile Arg Phe Thr Asp Glu Asp Ile Thr Glu Gln Met Asn
250 255 260
tat atg aaa tgg gct tat gca tat aat aaa ttt ttc tat att tca gat 912
Tyr Met Lys Trp Ala Tyr Ala Tyr Asn Lys Phe Phe Tyr Ile Ser Asp
265 270 275 280
tac tat aag tcg gtg gac gca tct aac gta aaa ggg tct agc ttg acc 960
Tyr Tyr Lys Ser Val Asp Ala Ser Asn Val Lys Gly Ser Ser Leu Thr
285 290 295
ttt tgg ggt gaa cac gca act gac tta agc caa gag gaa ttg ctt gag 1008
Phe Trp Gly Glu His Ala Thr Asp Leu Ser Gln Glu Glu Leu Leu Glu
300 305 310
caa gaa ctg cct tta ata aaa aaa ttc tta agc tta taa 1047
Gln Glu Leu Pro Leu Ile Lys Lys Phe Leu Ser Leu
315 320
<210> 15
<211> 348
<212> PRT
<213> 嗜糖土地芽孢杆菌
<400> 15
Leu Ile Lys Phe Leu Ser Ile Thr Thr Val Ser Ile Leu Leu Phe Leu
-20 -15 -10
Thr Met Ala Asn Thr Val His Ala Lys Asp Gln Glu Lys Gly Ile Ser
-5 -1 1 5
Ile Asp Ile Ser Arg Lys Tyr Tyr Ser Ile Gly Thr Leu Lys Ala Ile
10 15 20
Ile Asp Glu Ile Ser Ala Asn Gly Gly Asp Tyr Leu Gln Leu His Phe
25 30 35 40
Ser Asp Asn Glu Ser Tyr Ala Ile Ala Ser Asp Tyr Leu Gly Gln Ile
45 50 55
Ser Asp Thr Pro Asn Asn Thr Tyr Leu Thr Lys Asn Asp Leu Leu Ser
60 65 70
Leu Ile Ala Tyr Ser Asn Asp Arg Asn Ile Leu Ile Ile Pro Asp Met
75 80 85
Asp Leu Pro Ala His Ser Arg Gly Trp Leu Glu Leu Met Lys Val Lys
90 95 100
Asp Arg Glu Leu Tyr Thr Asp Ile Val Thr Asp Tyr Ser Asn Glu Thr
105 110 115 120
Leu Asp Tyr His Asn Asn Thr Asp Ala Leu Asn Thr Ala Asn Gln Leu
125 130 135
Leu Asn Glu Ile Leu Glu Leu Phe Tyr Gln Pro Lys Phe Ala Gly Lys
140 145 150
Gln Arg Ile Val Leu Gly Gly Asp Glu Val Pro Gly Ser Glu Ile His
155 160 165
Gln Leu Asp Phe Ile Arg Phe Ile Asn Gln Ile Ala Ser Thr Ala Lys
170 175 180
Ala Ser Asn Tyr Ala Pro Gln Met Trp Asn Asp Ser Ile Thr Ala Glu
185 190 195 200
Gly Ile Gln Asn Leu Asp Lys Ser Phe Ser Ile Leu Tyr Trp Lys Gln
205 210 215
Ser Thr Leu Ser Asn Gly Ala Gln Ser Leu Glu Val Gln Asp Phe Glu
220 225 230
Asp Trp Asp Phe Pro Val Tyr Asn Tyr Asn Ala Tyr Ser Leu Tyr Phe
235 240 245
Leu Pro Ser Ile Arg Phe Thr Asp Glu Asp Ile Thr Glu Gln Met Asn
250 255 260
Tyr Met Lys Trp Ala Tyr Ala Tyr Asn Lys Phe Phe Tyr Ile Ser Asp
265 270 275 280
Tyr Tyr Lys Ser Val Asp Ala Ser Asn Val Lys Gly Ser Ser Leu Thr
285 290 295
Phe Trp Gly Glu His Ala Thr Asp Leu Ser Gln Glu Glu Leu Leu Glu
300 305 310
Gln Glu Leu Pro Leu Ile Lys Lys Phe Leu Ser Leu
315 320
<210> 16
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 克劳氏芽孢杆菌信号肽
<400> 16
Met Lys Lys Pro Leu Gly Lys Ile Val Ala Ser Thr Ala Leu Leu Ile
1 5 10 15
Ser Val Ala Phe Ser Ser Ser Ile Ala Ser Ala
20 25
<210> 17
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> His-标签
<400> 17
His His His His His His Pro Arg
1 5
<210> 18
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 基序
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (2)..(2)
<223> Xaa = 任何天然氨基酸
<400> 18
Gly Xaa Asp Glu
1
<210> 19
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 基序
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(1)
<223> Xaa = E（Glu）或Q（Gln）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (2)..(2)
<223> Xaa = N（Asn）或 R（Arg）或S（Ser）或H（His）或A（Ala）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (3)..(3)
<223> Xaa = Y（Tyr）或V（Val）或F（Phe）或L（Leu）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (4)..(4)
<223> Xaa = A（Ala）或G（Gly）或S（Ser）或T（Thr）或C（Cys）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (5)..(5)
<223> Xaa = I (Ile) 或 V (Val) 或 L (Leu) 或 F (Phe)
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (6)..(6)
<223> Xaa = E（Glu）或A（Ala）或Q（Gln）或Y（Tyr）或N（Asn）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (7)..(7)
<223> Xaa = S（Ser）或N（Asn）
<400> 19
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5
<210> 20
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 基序
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(1)
<223> Xaa = V（Val）或I（Ile）或M（Met）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (2)..(2)
<223> Xaa = L（Leu）或I（Ile）或V（Val）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (4)..(4)
<223> Xaa = G（Gly）或A（Ala）或V（Val）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (7)..(7)
<223> Xaa = V（Val）或I（Ile）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (8)..(8)
<223> Xaa = P（Pro）或S（Ser）或A（Ala）
<400> 20
Xaa Xaa Gly Xaa Asp Glu Xaa Xaa
1 5
<210> 21
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 基序
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (4)..(4)
<223> Xaa = S（Ser）或Q（Gln）或R（Arg）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (5)..(5)
<223> Xaa = I（Ile）或 V（Val）或L（Leu）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (6)..(6)
<223> Xaa = T（Thr）或L（Leu）或V（Val）或M（Met）
<400> 21
Trp Asn Asp Xaa Xaa Xaa
1 5
<210> 22
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 基序
<400> 22
Gln Ser Thr Leu
1
<210> 23
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 基序
<400> 23
Asn Lys Phe Phe Tyr
1 5
<210> 24
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 基序
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (4)..(4)
<223> Xaa = D（Asp）或R（Arg）
<400> 24
Asn Leu Asp Xaa Ser
1 5

Claims (17)

1.一种组合物，该组合物包含至少0.001ppm具有氨基己糖苷酶活性的多肽，其中该多肽选自下组，该组由以下组成：与SEQ ID NO 7、8、9、10和11所示的成熟多肽具有至少60％序列同一性的多肽；和至少一种佐剂成分。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中该多肽具有N-乙酰葡糖苷酶活性和/或β-N-乙酰葡糖苷酶活性。
3.根据权利要求1或2所述的组合物，其中该多肽包含基序GXDE(SEQ ID NO 18)、[EQ][NRSHA][YVFL][AGSTC][IVLF][EAQYN][SN](SEQ ID NO 19)、[VIM][LIV]G[GAV]DE[VI][PSA](SEQ ID NO:20)、WND[SQR][IVL][TLVM](SEQ ID NO:21)、QSTL(SEQ ID NO 22)、NKFFY(SEQ ID NO:23)、NLD[DR]S(SEQ ID NO:24)中的一个或多个。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的组合物，其中该多肽与SEQ ID NO 7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO 9、SEQ ID NO 10和SEQ ID NO 11所示的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的组合物，其中该多肽包含或由SEQ ID NO 7或SEQID NO 2的成熟多肽组成、包含或由SEQ ID NO 8或SEQ ID NO 4的成熟多肽组成、包含或由SEQ ID NO 9或SEQ ID NO 6的成熟多肽组成、包含或由SEQ ID NO 10或SEQ ID NO 13的成熟多肽组成、或包含或由SEQ ID NO 11或SEQ ID NO 15的成熟多肽组成。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的组合物，其中该组合物是清洁组合物，优选地衣物或餐具洗涤组合物。
7.根据权利要求6所述的组合物，其中该佐剂成分选自，
a)至少一种助洗剂，
b)至少一种表面活性剂，和
至少一种漂白组分。
8.根据权利要求7所述的组合物，其中该组合物包含至少一种助洗剂，其中该助洗剂的添加量为从约0至约65％wt％、从约40wt％至约65wt％、从约20wt％至约65wt％、从约10wt％至约50wt％或从约5wt％至约50wt％的重量，其中该助洗剂选自磷酸盐、柠檬酸钠助洗剂、碳酸钠、硅酸钠、钠和沸石。
9.根据权利要求7所述的组合物，其中该组合物包含从约1wt％至约40wt％，优选地从约0.5wt％至约30wt％的至少一种漂白组分，其中该漂白组分包括过碳酸盐和漂白催化剂，优选地锰化合物。
10.根据权利要求7所述的组合物，其中该组合物包含从约2wt％至约60wt％、从约5wt％至约50wt％、从约5wt％至约40wt％、从约5wt％至约30wt％、从约5wt％至约20wt％、从约5wt％至约10wt％的阴离子表面活性剂和/或非离子表面活性剂。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的组合物用于深度清洁物品的用途，其中该物品是纺织品。
12.一种用于洗涤物品的方法，该方法包括：
a)将物品暴露于包含选自由SEQ ID NO 7、SEQ ID NO 8、SEQ ID NO 9、SEQ ID NO 10和SEQ ID NO 11所示的多肽组成的组的多肽的洗涤液，或将物品暴露于根据权利要求1至14中任一项所述的洗涤剂组合物；
b)完成至少一个洗涤循环；以及
c)任选地冲洗该物品，其中该物品是纺织品。
13.土地芽孢杆菌进化枝的多肽在清洁过程中，例如衣物和/或餐具洗涤中的用途，其中该多肽具有氨基己糖苷酶活性，优选地N-乙酰葡糖苷酶活性和/或β-N-乙酰葡糖苷酶活性。
14.根据权利要求13所述的用途，其中该多肽包含基序GXDE(SEQ ID NO 18)、[EQ][NRSHA][YVFL][AGSTC][IVLF][EAQYN][SN](SEQ ID NO 19)、[VIM][LIV]G[GAV]DE[VI][PSA](SEQ ID NO:20)、WND[SQR][IVL][TLVM](SEQ ID NO:21)、QSTL(SEQ ID NO 22)、NKFFY(SEQ ID NO:23)、NLD[DR]S(SEQ ID NO:24)中的一个或多个。
15.根据权利要求13或14中任一项所述的用途，该用途用于深度清洁物品，其中该物品是纺织品。
16.根据权利要求13至15中任一项所述的用途，该用途
(i)用于防止、减少或去除该物品的粘性；
(ii)用于预处理该物品上的污渍；
(iii)用于在洗涤循环期间防止、减少或去除污垢的再沉积；
(iv)用于防止、减少或去除污垢在该物品上的附着；
(v)用于维持或改善该物品的白度；
(vi)用于防止、减少或去除该物品的恶臭，
其中该物品是纺织品。
17.根据权利要求13至16中任一项所述的用途，其中该多肽与SEQ ID NO 7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO 9、SEQ ID NO 10和SEQ ID NO 11所示的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性。
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