ES2136409T5 - Metodo para mejorar las propiedades de una pasta de harina. - Google Patents
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Abstract
UN METODO DE MEJORA DE LAS PROPIEDADES REOLOGICAS DE UNA MASA DE HARINA Y LA CALIDAD DEL PRODUCTO FINAL REALIZADO A PARTIR DE DICHA MASA, QUE SE BASA EN LA ADICION DE UNA CANTIDAD EFECTIVA DE UNA OXIDORREDUCTASA CAPAZ DE OXIDAR LA MALTOSA, EN PARTICULAR UNA HEXOSA OXIDASA, AISLADA DE UNA DETERMINADA ESPECIE DE ALGAS COMO IRIDOPHYCUS FLACCIDUM, CHONDRUS CRISPUS O EUTHORA CRISTATA Y UNA MEJORA DE LA COMPOSICION DE LA MASA QUE CONTIENE LA OXIDORREDUCTASA.
Description
Método para mejorar las propiedades de una pasta
de harina.
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La presente invención se refiere a la provisión
de pastas de harinas que tienen propiedades reológicas mejoradas y a
productos alimenticios harinosos que tienen características de
calidad mejoradas, y proporciona una composición que contiene una
óxido-reductasa que oxida a la maltosa, capaz de
conferir tales propiedades mejoradas a las pastas y a los productos
alimenticios acabados fabricados a partir de esta memoria cuando se
añade como componente a las pastas, y a un método para preparar
pastas y productos alimenticios harinosos mejorados.
En particular, la invención se refiere a un
método para proporcionar pastas de harinas que tienen propiedades
reológicas mejoradas y para proporcionar productos acabados secados
u horneados fabricados a partir de tales pastas, que tienen
características dimensionales, de calidad alimenticia y de textura,
mejoradas.
Con respecto a esto, la "fortaleza" o
"debilidad" de las pastas es un aspecto importante para
fabricar productos acabados harinosos a partir de pastas, incluyendo
la fabricación de pan. La "fortaleza" o "debilidad" de una
pasta se determina primariamente por su contenido de proteínas y, en
particular, el contenido y la calidad de la proteína gluten es un
factor importante a este respecto. Generalmente, las harinas con un
bajo contenido de proteínas se caracterizan como "débiles".
Así, la masa cauchoide, extensible y cohesiva que se forma mezclando
agua y harina débil será usualmente altamente extensible cuando se
somete a tensión, pero no volverá a sus dimensiones originales
cuando se elimine la tensión.
Generalmente, las harinas con un alto contenido
de proteínas se caracterizan como harinas "fuertes", y la masa
formada mezclando dichas harinas y agua será menos extensible que la
masa formada a partir de una harina débil, y la tensión que se
aplica durante el mezclado se restaurará sin ruptura en una
extensión mayor que la del caso con una masa de harina formada a
partir de una harina débil.
Generalmente, se prefiere una harina fuerte en
la mayoría de los casos de fabricación de pan debido a las
superiores propiedades reológicas y de manipulación de la pasta y a
la superior calidad de forma y textura de los productos secados u
horneados acabados fabricados a partir de la pasta de harina
fuerte.
Generalmente, las pastas fabricadas de harinas
fuertes son más estables. La estabilidad de una pasta es una de las
características más importantes de las pastas de harinas. Según la
"American Association of Cereal Chemists (AACC)", método
36-01A, el término "estabilidad" se puede
definir como "el intervalo de tiempo de la pasta sobre el que se
obtiene una respuesta positiva y la propiedad de una pasta
redondeada mediante la que resiste el aplastamiento bajo su propio
peso durante el curso del tiempo". Según el mismo método, el
término "respuesta" se define como "la reacción de una pasta
a un estímulo, sustancia o serie de condiciones, específico y
desconocido, determinado usualmente cociéndolo en comparación con un
testigo".
Dentro de las industrias de la panadería y
molinería se sabe usar "acondicionantes" de la pasta para
fortalecer la pasta. Normalmente, tales acondicionantes de la pasta
son agentes oxidantes no específicos tales como, por ejemplo,
yodatos, peróxidos, ácido ascórbico, bromato de potasio o
azo-dicarbonamida, y se añaden a la pasta con el fin
de mejorar la eficiencia del horneado de la harina para lograr una
pasta con estirabilidad mejorada y tener, así, una resistencia y
estabilidad deseables. El mecanismo detrás de este efecto de los
agentes oxidantes es que las proteínas de la harina, en particular
el gluten que contiene grupos tiol que, cuando llegan a oxidarse,
forman enlaces disulfuro mediante los que la proteína forma una
matriz más estable dando lugar a una mejor calidad de la pasta y a
mejoras del volumen y la estructura de migas de los productos
horneados.
Además de la utilidad anterior del ácido
ascórbico/ascorbato como acondicionante de pastas debido a su
capacidad oxidante, estos compuestos también pueden actuar como
sustrato de una óxido-reductasa,
ascorbato-oxidasa que se describe en el documento EP
0682116 A1. En presencia de su sustrato, esta enzima convierte el
ácido ascórbico/ascorbato en ácido deshidroascórbico y
H_{2}O_{2}. Esta técnica anterior no sugiere que la ácido
ascórbico-oxidasa en presencia de ácido
ascórbico/ascorbato podrá tener un efecto acondicionador de las
pastas, pero asumiblemente este es el caso.
Sin embargo, los consumidores se oponen al uso
de varios de los agentes oxidantes actualmente disponibles o no
están permitidos por los entres legisladores y, por consiguiente, se
ha intentado encontrar alternativas a estos aditivos convencionales
de pastas y harinas y, entre otros compuestos, la técnica anterior
ha sugerido el uso de glucosa-oxidasa para este
fin.
Así, el documento US 2.783.150 describe la
adición de glucosa-oxidasa a harina para mejorar la
resistencia y la textura de la pasta y el aspecto del pan
horneado.
El documento CA 2.012.723 describe composiciones
que mejoran el pan que comprenden enzimas celulolíticas tales como
xilanasas y glucosa-oxidasa, añadiéndose la última
enzima para reducir ciertos efectos desventajosos de las enzimas
celulolíticas (reducida resistencia y pegajosidad de la pasta) y se
describe que se requiere la adición de glucosa a la pasta para
obtener una actividad suficiente de glucosaoxidasa.
\global\parskip1.000000\baselineskip
El documento
JP-A-92-084848
sugiere el uso de una composición que mejora el pan que comprende
glucosa-oxidasa y lipasa.
El documento
EP-B1-321811 describe el uso de una
composición enzimática que comprende
sulfidrilo-oxidasa y glucosa-oxidasa
para mejorar las características reológicas de las pastas. En este
documento de la técnica anterior se menciona que el uso de
glucosa-oxidasa sola no tuvo éxito.
En el documento
EP-B1-338452 se describe una
composición enzimática para mejorar la estabilidad de la pasta, que
comprende una mezcla de celulasa/hemicelulasa,
glucosa-oxidasa y opcionalmente
sulfidrilo-oxidasa.
Sin embargo, el uso de
glucosa-oxidasa como un aditivo mejorador de la
pasta tiene la limitación de que esta enzima requiere la presencia
de cantidades suficientes de glucosa como sustrato con el fin de ser
eficaz en un sistema de pasta y generalmente, el contenido de
glucosa en harinas de cereales es bajo. Por lo tanto, la ausencia de
glucosa o su bajo contenido en pastas será un factor limitante de la
efectividad de la glucosa-oxidasa como agente
mejorador de pastas.
En contraste, generalmente el contenido de
maltosa en harinas de cereales es significativamente mayor que el de
glucosa y, por consiguiente, una pasta recientemente preparada
contendrá normalmente más maltosa que glucosa. Así, en un
experimento en el que se analizó el contenido de azúcares en
sobrenadantes a partir de suspensiones de harina de trigo y de una
pasta preparada a partir de la harina y que además comprendía agua,
levadura, sal y sacarosa (como se describe en el ejemplo siguiente
2.3), se encontraron los siguientes valores (% en peso calculado
sobre la harina):
Además, el contenido de maltosa permanece en un
valor relativamente alto en una pasta que se fermentó mediante
levadura, puesto que la levadura utiliza primariamente glucosa, o
incluso puede aumentar en la pasta por ejemplo durante la actividad
de las levaduras debido a la actividad de las enzimas que degradan
el almidón tales como por ejemplo la
\beta-amilasa, que está intrínsecamente presente
en la harina o se añade a la pasta.
Mientras que la técnica anterior ha reconocido
los útiles efectos mejoradores de la glucosa-oxidasa
sobre las características reológicas de pastas de pan y sobre la
calidad de los correspondientes productos horneados, también se ha
dado cuenta que el uso de esta enzima tiene varios inconvenientes.
Así, se puede requerir añadir a la pasta sacarosa o glucosa como
sustrato para obtener un efecto suficiente y, cuando se usa sola sin
la adición de otras enzimas, la glucosa-oxidasa no
proporciona constantemente un efecto mejorador del pan o la pasta
deseado.
Sin embargo, ahora se ha encontrado que la
adición de una óxido-reductasa, que es capaz de
oxidar maltosa, que incluye hexosa-oxidasa como un
único agente acondicionador de la pasta, es decir, sin la adición
concomitante de un sustrato para la enzima añadida, o de otras
enzimas, a una pasta harinosa da lugar a un aumento de su
resistencia a la ruptura cuando la pasta se estira, es decir, esta
enzima confiere en sí misma a la pasta una resistencia aumentada
mediante la que la pasta llega a tener menos tendencia a la
deformación mecánica. Se contempla que este efecto de adición de
hexosa-oxidasa a una pasta es el resultado de la
formación de retículos entre grupos tiol en aminoácidos del gluten
de trigo que contienen grupos azufre que se produce cuando el
H_{2}O_{2} generada por la enzima en la pasta reacciona con los
grupos tiol que se oxidan por la misma.
La hexosa-oxidasa
(D-hexosa:O_{2}-oxido-reductasa,
EC 1.1.3.5) es una enzima que en presencia de oxígeno es capaz de
oxidar D-glucosa y varios otros azúcares reductores
que incluyen maltosa, glucosa, lactosa, galactosa, xilosa, arabinosa
y celobiosa, a sus correspondientes lactonas con subsiguiente
hidrólisis a los ácidos aldobiónicos respectivos. Por consiguiente,
las hexosa-oxidasas difieren de la
glucosa-oxidasa que sólo se puede convertir
D-glucosa, en que las
hexosa-oxidasas pueden utilizar un intervalo más
amplio de sustratos azúcares. La oxidación catalizada por la enzima
se puede ilustrar como sigue:
- \quad
- D-glucosa + O_{2} \longrightarrow \delta-D-gluconolactona + H_{2}O_{2},
\vskip1.000000\baselineskip
- \quad
- D-galactosa + O_{2} \longrightarrow \gamma-D-galactogalactona + H_{2}O_{2}
La hexosa-oxidasa (en lo que
sigue también denominada como HOX) se ha aislado de varias especies
de algas rojas tales como Iridophycus flaccidum (Bean and
Hassid, 1956, J. Biol. Chem., 218:425-436) y
Chondrus crispus (Ikawa 1982, Methods Enzymol.,
89:145-149). Adicionalmente, se ha mostrado que las
especies de algas Euthora cristata (Sullivan et al.,
1973, Biochemica et Biophysica Acta, 309:11-22)
produce HOX.
Otras fuentes potenciales de
hexosa-oxidasa según la invención incluyen especies
microbianas o especies de plantas que crecen en tierra. Así, como
ejemplo de tal fuente de plantas, Bean et al., Journal of
Biological Chemistry (1961) 236:1235-1240, han
descrito una oxido-reductasa de zumos de cítricos
que es capaz de oxidar un amplio intervalo de azúcares, que incluyen
D-glucosa, D-galactosa, celobiosa,
lactosa, maltosa, D-2-desoxiglucosa,
D-manosa, D-glucosamina y
D-xilosa. Otro ejemplo de una enzima que tiene
actividad hexosa-oxidasa es el sistema enzimático de
Malleomyces mallei descrito por Dowling et al.,
Journal of Bacteriology (1956) 72:555-560.
Se ha informado que la
hexosa-oxidasa aislada de las anteriores fuentes
naturales puede ser de uso potencial en la fabricación de ciertos
productos alimenticios. Así, se ha mostrado que la
hexosa-oxidasa aislada de Iridophycus
flaccidum es capaz de convertir lactosa en la leche con la
producción del correspondiente ácido aldobiónico y se ha mostrado
que es de potencial interés como agente acidulante de la leche, por
ejemplo para reemplazar los cultivos microbianos acidulantes para
ese propósito (Rand, 1972, Journal of Food Science,
37:698-701). A este respecto, la
hexosa-oxidasa se ha mencionado como una enzima más
interesante que la glucosa-oxidasa, ya que esta
última enzima sólo puede ser enzimáticamente eficaz en la leche u
otros productos alimenticios que no contengan glucosa o que tengan
un bajo contenido de glucosa, si también se añade glucosa o la
enzima que degrada la lactosa, la lactasa, que convierte la lactosa
en glucosa y galactosa.
También se ha utilizado la capacidad de las
oxido-reductasas que incluye la de la
hexosa-oxidasa para generar peróxido de hidrógeno,
para mejorar la estabilidad durante el almacenamiento de ciertos
productos alimenticios que incluyen queso, mantequilla y jugo de
frutas como se describe en el documento
JP-B-73/016612. También se ha
sugerido que las oxido-reductasas pueden ser
potencialmente útiles como antioxidantes en productos
alimenticios.
Sin embargo, la presente invención ha demostrado
que la hexosa-oxidasa es altamente útil como agente
acondicionante de la pasta en la fabricación de productos de pastas
de harinas que no sólo incluyen productos de panadería sino también
otros productos fabricados a partir de pastas de harinas tales como
tallarines y productos de pastas alimenticias.
Por consiguiente, en un primer aspecto la
invención se refiere a un método para mejorar las propiedades
reológicas de una pasta de harina y la calidad del producto acabado
fabricado a partir de la pasta, que comprende añadir a los
ingredientes de la pasta, aditivos de la pasta o a la pasta una
cantidad eficaz de una oxido-reductasa que al menos
sea capaz de oxidar maltosa, tal como por ejemplo una
hexosa-oxidasa.
En todavía otros aspectos, la invención se
refiere a un método para preparar un producto de panadería, que
comprende preparar una pasta de harina que incluye añadir una
cantidad eficaz de una oxido-reductasa que al menos
sea capaz de oxidar maltosa y cocer la pasta, y a un método para
preparar un producto alimenticio basado en una pasta que comprende
añadir a la pasta una cantidad eficaz de una
oxido-reductasa que oxida la maltosa.
En un aspecto, el presente método contempla un
método para mejorar las propiedades reológicas de pastas de harinas.
El método comprende, como se mencionó anteriormente, la adición de
una cantidad eficaz de una oxido-reductasa que oxida
la maltosa a un componente de la receta de la pasta o a la pasta que
resulta del mezclado de todos los componentes de la pasta. En el
contexto presente, "una cantidad eficaz" se usa para indicar
que la cantidad es suficiente para conferir a la pasta y/o al
producto acabado características mejoradas como se definen en esta
memoria.
En una realización útil del método según la
invención, la oxido-reductasa es una
hexosa-oxidasa. Como se describe con detalle en esta
memoria, la hexosa-oxidasa se puede aislar de
especies de algas marinas que producen de forma natural esa enzima.
Tales especies se encuentran en la familia Gigartinaceae que
pertenece al orden Gigartinales. Ejemplos de
hexosa-oxidasa que producen especies de algas que
pertenecen a las Gigartinaceae son Chondrus crispus e
Iridophycus flaccidum. También son fuentes potenciales de
hexosa-oxidasa las especies de algas del orden
Cryptomeniales, que incluyen las especie Euthora
cristata.
Cuando se usan dichas fuentes naturales para la
hexosa-oxidasa, típicamente la enzima se aísla del
material de partida, las algas, por extracción usando un medio de
extracción acuoso. Como material de partida se pueden usar algas en
su estado fresco como se cosechan del área marina en la que crecen,
o el material de algas se puede usar para la extracción de la
hexosa-oxidasa después de secar las láminas, por
ejemplo por secado con aire a la temperatura ambiente o por
cualquier método de secado industrial apropiado tal como secado con
aire caliente circulante o por liofilización. Con el fin de
facilitar la etapa de extracción subsiguiente, el material de
partida fresco o secado se puede ventajosamente triturar, por
ejemplo por molienda o mezcla.
Como medio de extracción acuoso son adecuadas
disoluciones amortiguadoras, que por ejemplo tengan un pH en el
intervalo de 5-8, tales como disolución
amortiguadora de fosfato de sodio 0,1 M, disolución amortiguadora de
trietanolamina 20 mM o disolución amortiguadora
Tris-HCl 20 mM. Típicamente, la
hexosa-oxidasa se extrae del material de algas
suspendiendo el material de partida en la disolución amortiguadora y
manteniendo la suspensión a una temperatura en el intervalo de
0-20ºC tal como a aproximadamente 5ºC durante 1 a 5
días, preferiblemente con agitación.
A continuación, el material de algas suspendido
se separa del medio acuoso mediante un método de preparación
adecuado tal como filtración, tamizado o centrifugación y la
hexosa-oxidasa se recupera subsiguientemente del
filtrado o del sobrenadante. Opcionalmente, el material de algas
separado se somete a una o más etapas de extracción.
Ya que varias algas marinas contienen pigmentos
coloreados tales como ficocianinas, se puede requerir someter al
filtrado o al sobrenadante a una etapa de purificación adicional
mediante la que se separan estos pigmentos. Como ejemplo, los
pigmentos se pueden separar tratando el filtrado o sobrenadante con
un disolvente orgánico en el que los pigmentos sean solubles y
separando subsiguientemente del medio acuoso el disolvente que
contiene los pigmentos disueltos. Alternativamente, los pigmentos se
pueden separar sometiendo el filtrado o el sobrenadante a una etapa
de cromatografía de interacción hidrófoba.
La recuperación de la
hexosa-oxidasa del medio de extracción acuoso se
lleva a cabo por cualquiera de los métodos convencionales que
permiten el aislamiento de proteínas de medios acuosos. Tales
métodos, ejemplos de los cuales se describirán con detalle en lo que
sigue, incluyen métodos convencionales para el aislamiento de
proteínas tales como cromatografía de intercambio iónico,
opcionalmente seguida por una etapa de concentración tal como
ultrafiltración. También es posible recuperar la enzima añadiendo
sustancias tales como, por ejemplo, (NH_{4})_{2}SO_{4}
o polietilenglicol (PEG) que provocan que la proteína precipite,
seguido por la separación del precipitado y sometiéndolo
opcionalmente a condiciones que permiten que la proteína se
disuelva.
Para ciertas aplicaciones de la
hexosa-oxidasa es deseable suministrar la enzima en
una forma sustancialmente pura, por ejemplo como una preparación
esencialmente sin otras proteínas o no proteínas concomitantes y,
por consiguiente, la preparación de la enzima relativamente bruta
que resulta de las anteriores etapas de extracción y aislamiento, se
puede someter a más etapas de purificación tales como más etapas
cromatográficas, de filtración por gel o cromatofocalización como
también se describirá a título de ejemplo en lo que sigue.
En una realización preferida del método según
la invención, se prepara una pasta de harina mezclando harina con
agua, un agente de fermentación tal como levadura o un agente de
fermentación químico convencional, y una cantidad eficaz de
hexosa-oxidasa en condiciones de formar una pasta.
Sin embargo, está dentro del alcance de la invención que se puedan
añadir más componentes a la mezcla de la pasta.
Típicamente, tales otros componentes de la pasta
incluyen componentes para pastas convencionalmente usados tales como
sal, un agente edulcorante tal como azúcares, jarabes o agentes
edulcorantes artificiales, sustancias lipídicas que incluyen
manteca, margarina, mantequilla o un aceite vegetal o animal y uno o
más aditivos para pastas tales como agentes emulsionantes, enzimas
que degradan el almidón, enzimas que degradan la celulosa o
hemicelulosa, proteasas, lipasas, agentes oxidantes no específicos
tales como los anteriormente mencionados, agentes saborizantes,
cultivos bacterianos de ácido láctico, vitaminas, minerales,
hidrocoloides tales como alginatos, carragenanos, pectinas, gomas
vegetales que incluyen, por ejemplo, goma guar y goma de
algarrobilla, sustancias que proporcionan fibra en la dieta.
Como ejemplo, los emulsionantes convencionales
usados para fabricar productos de pastas de harinas incluyen
monoglicéridos, diacetil-ácido tartárico, ésteres de mono- y
diglicéridos de ácidos grasos, y lecitinas, por ejemplo obtenidas a
partir de soja. Entre las enzimas que degradan el almidón, las
amilasas son particularmente útiles como aditivos que mejoran la
pasta. La \alpha-amilasa fracciona el almidón en
dextrinas que a su vez son fraccionadas por la
\beta-amilasa en maltosa. Otras enzimas útiles que
degradan el almidón que se pueden añadir a una composición de pasta
incluyen glucoamilasas y pululanasas. En el presente contexto, otras
enzimas interesantes son xilanasas y otras
oxido-reductasas tales como glucosaoxidasa,
piranosa-oxidasa y
sulfidril-oxidasa.
Una harina preferida es la harina de trigo, pero
también se contemplan pastas que comprenden harina derivada de otras
especies de cereales tales como de arroz, maíz, cebada, centeno y
sorgo.
La pasta se prepara mezclando harina, agua, la
oxido-reductasa según la invención y otros posibles
ingredientes y aditivos. La oxido-reductasa se puede
añadir junto cualquier ingrediente de la pasta que incluya el agua o
mezcla de ingredientes de la pasta o con cualquier aditivo o mezcla
de aditivos. La pasta se puede preparar por cualquier método
convencional de preparación de pastas común en la industria panadera
o en cualquier otra industria que fabrique productos basados en
pastas de harinas.
La oxido-reductasa se puede
añadir como una preparación líquida o en la forma de una composición
de polvo seco que comprende la enzima como el único componente
activo o en mezcla con uno o más ingredientes o aditivos de la
pasta. La cantidad del componente enzimático añadido es normalmente
una cantidad que da lugar en presencia de la pasta acabada a 1 a
10.000 unidades por kg de harina, preferiblemente 5 a 5.000 unidades
tal como 10 a 1.000 unidades. En las realizaciones útiles, la
cantidad está en el intervalo de 20 a 500 unidades por kg de harina.
En el presente contexto 1 unidad de oxido-reductasa
corresponde a la cantidad de enzima que en las condiciones
especificadas da lugar a la conversión de 1 \mumol de glucosa por
minuto. La actividad se especifica como unidades por g de
preparación enzimática.
El efecto de la oxido-reductasa
sobre las propiedades reológicas de la pasta se puede medir mediante
métodos estándar según la "International Association of Cereal
Chemistry (ICC)" y la "American Association of Cereal
Chemistry (AACC)" que incluye el método de amilografía (ICC 126),
el método de farinografría (AACC 54-21) y el método
de extensigrafía (AACC 54-10). El método de
extensigrafía mide por ejemplo la capacidad de las pastas para
retener el gas desprendido por la levadura y la capacidad para
superar la actividad de las levaduras. En efecto, el método de
extensigrafía mide la resistencia relativa de una pasta. Una pasta
resistente exhibe una curva extensigráfica mayor y, en algunos
casos, más larga que una pasta débil. El método AACC
54-10 define la extensigrafría de la siguiente
manera: "la extensigrafía registra una curva de
carga-extensión de una probeta de ensayo hasta que
se rompe. Las características de las curvas
carga-extensión o extensigramas se usan para
evaluar la calidad general de una harina y su respuesta a agentes
mejoradores".
En una realización preferida del método según
la invención, la resistencia a la extensión de la pasta en términos
de la relación entre la resistencia a la extensión (altura de la
curva, B) y la extensibilidad (longitud de la curva, C), es decir la
relación B/C que se mide por el método AACC 54-10,
se incrementa en al menos un 10% relativa a la de otra pasta, por lo
demás similar, que no contiene oxido-reductasa. En
las realizaciones más preferidas, la resistencia a la extensión se
incrementa en al menos un 20%, tal como en al menos 50%, y en
particular en al menos 100%.
El método según la invención se puede usar para
cualquier tipo de pasta de harina con el fin de mejorar las
propiedades reológicas de la misma y la calidad de los productos
acabados fabricados a partir del tipo particular de harina. Así, el
método es altamente adecuado para la fabricación de tipos
convencionales de productos de panadería fermentados con levaduras,
incluyendo los productos de panadería basados en harina de trigo
tales como panes y bollos. Sin embargo, También se contempla que el
método puede mejorar las propiedades de las pastas en las que la
fermentación se provoca por la adición de agentes de fermentación
químicos, que incluyen productos dulces de panadería tales como
pasteles que incluyen como ejemplos pasteles triturados y molletes,
o bollos.
En un aspecto interesante, la invención se usa
para mejorar las propiedades reológicas de pastas para productos
tallarines que incluyen "tallarines blancos" y "tallarines
chinos" y para mejorar las calidades texturales de los productos
tallarines acabados. Una receta típica básica para la fabricación de
tallarines comprende los siguientes ingredientes: harina de trigo
100 partes, sal 0,5 partes y agua 33 partes. Típicamente, los
tallarines se preparan mezclando los ingredientes en un aparato para
mezclar apropiado seguido por laminación de la pasta de tallarines
usando una máquina apropiada de fabricar tallarines para formar las
cintas de tallarines que subsiguientemente se secan con aire.
La calidad de los tallarines acabados se evalúa
entre otros por su color, calidad al cocer y textura. Los tallarines
se deben cocer tan rápidamente como sea posible, permanecer firmes
después de cocer y preferiblemente no perder ningún sólido en el
agua de cocción. Al servir, preferiblemente los tallarines deben
tener una superficie lisa y firme, no mostrar pegajosidad y
proporcionar un "mordisco" firme y una buena sensación en la
boca. Es importante que los tallarines tengan un color claro.
Puesto que la adecuación de la harina de trigo
para proporcionar tallarines que tengan las calidades texturales y
de comer deseadas pueden variar según el año y el área de
crecimiento, es usual añadir a la pasta agentes mejoradores de los
tallarines con el fin de compensar la calidad subóptima de la
harina. Típicamente, tales agentes mejoradores comprenderán
sustancias que proporcionan fibra a la dieta, proteínas vegetales,
emulsionantes e hidrocoloides tales como por ejemplo alginatos,
carragenanos, pectinas, gomas vegetales que incluyen goma guar y
goma de algarrobilla, y amilasas.
Se ha intentado usar
glucosa-oxidasa como agente mejorador de los
tallarines. Sin embargo, como se mencionó anteriormente, el
contenido de glucosa en la harina de trigo puede ser tan bajo que
esta enzima no será eficaz.
Por lo tanto, es un aspecto importante de la
invención que la oxido-reductasa según la invención
sea útil como agente mejorador de los tallarines, opcionalmente en
combinación con otros componentes actualmente usados para mejorar la
calidad de los tallarines. Así, se contempla que los tallarines
preparados según el método anterior tendrán propiedades mejoradas
con respecto a las calidades del color, cocción y de comer, que
incluyen una consistencia y textura firme, elástica y no
pegajosa.
En otra realización útil, la pasta que se
prepara por el método según la invención es una pasta para preparar
un producto de una pasta alimenticia. Tales productos, que incluyen
como ejemplos los espaguetti y los macarrones, se preparan
típicamente a partir de una pasta que comprende como ingredientes
principales harina y huevos. Después de mezclar los ingredientes, se
conforma la pasta en el tipo deseado de producto de pasta y se seca
en aire. Se contempla que la adición a una pasta tendrá un efecto
mejorador significativo sobre su extensibilidad y estabilidad dando
lugar a un producto de pasta acabado que tiene calidades de comer y
texturales mejoradas.
La composición mejoradora de pastas puede
comprender la oxido-reductasa según la invención y
al menos otro ingrediente o aditivo de pastas.
En una realización preferida, la
oxido-reductasa es la
hexosa-oxidasa. El aditivo o ingrediente adicional
puede ser cualquiera de los ingredientes o aditivos que se
describieron anteriormente. Convenientemente, la composición puede
ser una preparación líquida que comprenda la
oxido-reductasa. Sin embargo, la composición está
convenientemente en forma de una composición seca. Se entenderá que
la cantidad de actividad de oxido-reductasa en la
composición dependerá de los tipos y cantidades de los ingredientes
o aditivos adicionales. Sin embargo, la cantidad de actividad de
oxido-reductasa está preferiblemente en el intervalo
de 10 a 100.000 unidades, preferiblemente en el intervalo de 100 a
50.000 unidades, tal como 1.000 a 10.000 unidades que incluyen 2.000
a 5.000 unidades.
Opcionalmente, la composición puede estar en
forma de una mezcla o premezcla completa de aditivos para pasta para
fabricar un producto acabado particular y que contenga todos los
ingredientes y aditivos secos para tal pasta. En realizaciones
específicas, la composición puede ser una particularmente útil para
preparar un producto horneado o en la fabricación de un producto de
tallarines o un producto de una pasta alimenticia.
Como se mencionó anteriormente, la presente
invención proporciona un método para preparar un producto de
panadería que incluye la adición a la pasta de una
oxido-reductasa tal como, por ejemplo,
hexosa-oxidasa. En particular, este método da lugar
a productos de panadería tales como los productos anteriormente
mencionados, en los que se aumenta el volumen específico en relación
a un producto de panadería por lo demás similar, preparado a partir
de una pasta que no contiene oxido-reductasa. En
este contexto, la expresión "volumen específico" se usa para
indicar la relación entre el volumen y el peso del producto.
Sorprendentemente, se ha encontrado que según el método anterior,
el volumen específico se puede aumentar significativamente tal como
al menos 10%, preferiblemente al menos 20%, incluyendo al menos 30%,
preferiblemente al menos 40%, y más preferiblemente al menos
50%.
En una realización ventajosa del método
anterior, al menos se añade a la pasta una enzima más. Ejemplos
adecuados de la misma incluyen una celulasa, una hemicelulasa, una
xilanasa, una enzima que degrade el almidón, una
glucosa-oxidasa, una lipasa y una proteasa.
Ahora, en los ejemplos siguientes se describirá
la invención a modo de ilustración.
\vskip1.000000\baselineskip
Se obtuvo una preparación de
hexosa-oxidasa purificada usando los procedimientos
de extracción y purificación de más adelante. Durante estos
procedimientos y las caracterizaciones siguientes de la enzima
purificada, se usó el siguiente ensayo para la determinación de la
actividad de la hexosa-oxidasa:
El ensayo se basó en el método descrito por
Sullivan e Iwaka (Biochimica et Biophysica Acta, 1973,
309:11-22), pero modificado para realizarse en
placas de microvaloración. Una mezcla de ensayo contenía 150 \mul
de \beta-D-glucosa (0,1 M en
disolución amortiguadora de fosfato de sodio 0,1 M, pH 6,3), 120
\mul de disolución amortiguadora de fosfato de sodio 0,1 M, pH
6,3, 10 \mul de
o-dianisidina-dihidrocloruro (Sigma
D-3252, 3,0 mg/ml en H_{2}O), 10 \mul de
peroxidasa (POD) (Sigma P-8125, 0,1 ml en disolución
amortiguadora de fosfato de sodio 0,1 M, pH 6,3) y 10 \mul de
disolución enzimática (HOX). Se fabricaron blancos añadiendo
disolución amortiguadora en lugar de disolución enzimática.
La incubación se inició mediante la adición de
glucosa. Después de 15 minutos de incubación a 25ºC, se leyó a 25ºC
la absorbancia a 405 nm en un lector ELISA. Se construyó una curva
patrón usando concentraciones variables de H_{2}O_{2} en lugar
de la disolución enzimática.
La reacción se puede describir de la siguiente
manera:
- \quad
- \beta-D-glucosa + H_{2}O + O_{2} \ \frac{HOX}{POD} \ ácido glucónico + H_{2}O_{2}
\vskip1.000000\baselineskip
- \quad
- H_{2}O_{2} + o-dianisidina_{red} \longrightarrow 2 H_{2}O + o-dianisidina_{ox}
La o-dianisidina oxidada tiene
un color amarillo que absorbe a 405 nm.
Se recolectaron láminas frescas de Chondrus
crispus a lo largo de la costa de Bretaña, Francia. Este
material fresco se homogeneizó en un molino de púas (Alpine). Se
añadieron 300 ml de disolución amortiguadora de fosfato de sodio 0,1
M, pH 6,8, a una muestra de 100 g del material en láminas
homogeneizado resultante. La mezcla se sonicó subsiguientemente en
un baño de sonicación durante 5 minutos y a continuación se extrajo
a rotación constante durante 4 días a 5ºC, seguido por
centrifugación de la mezcla a 47.000 x g durante 20 minutos.
Se desalaron 300 ml del sobrenadante rosa claro
resultante por ultrafiltración usando una unidad de ultrafiltración
Amicon equipada con una membrana de ultrafiltración Omega (valor de
corte 10 kD, Filtron).
El retenido resultante a partir de 1.1.2 se
aplicó a una columna de 5 x 10 cm con 200 ml de
Q-Sepharosa FF equilibrada en trietanolamina 20 mM,
pH 7,3. La columna se lavó con la disolución amortiguadora de
equilibrado y la hexosa-oxidasa se eluyó con un
gradiente de 450 ml de 0 a 1 M de NaCl en la disolución
amortiguadora de equilibrado. La columna se eluyó a 6 ml/minuto, y
se recogieron fracciones de 14 ml. Las fracciones
9-17 (un total de 125 ml) se juntaron y se
concentraron hasta 7,5 ml por ultrafiltración usando una unidad
Amicon 8400 equipada con una membrana de ultrafiltración Omega
(valor de corte 10 kD, Filtron).
El anterior retenido de 7,5 ml se aplicó a una
columna de filtración por gel Superdex 200 de 2,6 x 60 cm,
equilibrada en una disolución amortiguadora de fosfato de sodio 50
mM, pH 6,4, y se eluyó a un caudal de 1 ml/minuto. Se recogieron
fracciones de 4 ml. Se juntaron las fracciones 17-28
(volumen total 50 ml) que contenían la actividad de la
hexosa-oxidasa.
A la mezcla resultante de la etapa 1.1.4 de
filtración por gel se añadió sulfato de amonio hasta una
concentración final de 2 M. A continuación, esta mezcla se aplicó a
una columna de 1,6 x 1,6 cm con 32 ml de
fenil-sepharosa equilibrada en una disolución
amortiguadora de fosfato de sodio 20 mM, pH 6,3, y
(NH_{4})_{2}SO_{4} 2 M. La columna se lavó con una
disolución amortiguadora de equilibrado seguido por elución de la
hexosa-oxidasa a un caudal de
2 ml/minuto usando una gradiente lineal 140 desde 2 M a 0 M de (NH_{4})_{2}SO_{4} en una disolución amortiguadora de fosfato de sodio 20 mM. Se recogieron fracciones de 4 ml y se juntaron las fracciones 24-33 que contenían la actividad de la hexosa-oxidasa.
2 ml/minuto usando una gradiente lineal 140 desde 2 M a 0 M de (NH_{4})_{2}SO_{4} en una disolución amortiguadora de fosfato de sodio 20 mM. Se recogieron fracciones de 4 ml y se juntaron las fracciones 24-33 que contenían la actividad de la hexosa-oxidasa.
El color rosa mencionado anteriormente acompaña
a la enzima, pero se separa de la hexosa-oxidasa en
esta etapa de purificación.
La mezcla anterior resultante de la anterior
etapa de cromatografía en fenil-sepharosa se desaló
por ultrafiltración como se describió anteriormente. Se aplicaron 2
ml de esta mezcla a una columna Mono Q HR 5/5 equilibrada en
trietanolamina 20 mM, pH 7,3. La columna se eluyó subsiguientemente
usando un gradiente lineal de 45 ml desde NaCl 0 a 0,65 M en la
disolución amortiguadora de equilibrado a un caudal de 1,5
ml/minuto. Se recogieron fracciones de 1,5 ml y se juntaron las
fracciones 14-24.
La mezcla que contenía la
hexosa-oxidasa de la anterior etapa 1.1.6 se aplicó
a una columna Mono P HR 5/5 equilibrada en disolución amortiguadora
bis-Tris 20 mM, pH 6,5. La enzima se eluyó usando un
gradiente lineal de
45 ml desde NaCl 0 a 0,65 M en la disolución amortiguadora de equilibrado a un caudal de 1,5 ml/minuto y se recogieron fracciones de 0,75 ml. La mayor actividad de la hexosa-oxidasa se encontró en la fracción 12.
45 ml desde NaCl 0 a 0,65 M en la disolución amortiguadora de equilibrado a un caudal de 1,5 ml/minuto y se recogieron fracciones de 0,75 ml. La mayor actividad de la hexosa-oxidasa se encontró en la fracción 12.
\vskip1.000000\baselineskip
Las mezclas de las etapas anteriores 1.1.6 y
1.1.7 que contenían hexosa-oxidasa se usaron en los
experimentos de caracterización de más adelante:
El tamaño de la hexosa-oxidasa
nativa purificada se determinó por cromatografía de exclusión
molecular usando una columna Superose 6 HR 10/30 a un caudal de 0,5
ml/minuto en una disolución amortiguadora de fosfato de sodio 50 mM,
pH 6,4. Como patrones de tamaño se usaron ferritina (440 kD),
catalasa (232 kD), aldolasa (158 kD), albúmina de suero bovino (67
kD) y quimotripsinógeno (25 kD). Se determinó que el peso molecular
de la hexosa-oxidasa purificada era 120 \pm 10
kD.
Las mezclas de ensayo para la determinación del
pH óptimo (volumen final 300 \mul) contenían 120 \mul de una
disolución madre 0,1 M de disolución amortiguadora fosfato de
sodio/citrato de sodio de valores variables de pH. Todos los otros
componentes de la mezcla de ensayo se disolvieron en H_{2}O. El pH
se determinó en las disoluciones amortiguadoras madre diluidas a
25ºC.
La hexosa-oxidasa mostró
actividad enzimática de pH 3 a pH 8, pero con el óptimo en el
intervalo de 3,5 a 5,5.
Los datos cinéticos se ajustaron a v =
V_{max}S/(K_{m} + S), en la que V_{max} es la velocidad
máxima, S es la concentración de sustrato y K_{m} es la
concentración que da 50% de la velocidad máxima (constante de
Michaelis), usando un programa de microordenador
EZ-FIT para ajustar curvas (Perrella, F.W., 1988,
Analytical Biochemistry, 174:437-447).
Se obtuvo una típica curva hiperbólica de
saturación para la actividad enzimática en función de glucosa y
maltosa, respectivamente. Se calculó que para la glucosa K_{m} era
2,7 mM \pm 0,7 mM y para la maltosa se encontró que el valor de
K_{m} era 43,7 \pm 5,6 mM.
\vskip1.000000\baselineskip
Para este experimento, se preparó
hexosa-oxidasa de la siguiente manera:
Se recogió material fresco de Chondrus
crispus en la costa de Bretaña, Francia. El material se
liofilizó y subsiguientemente se molió. Se suspendieron 40 g de este
material molido en 1.000 ml de disolución amortiguadora de
trietanolamina (TEA) 20 mM, pH 7,3, y se dejaron reposar a 5ºC
durante aproximadamente 64 horas con agitación suave, y a
continuación se centrifugaron a 2000 x g durante 10 minutos. El
sobrenadante se filtró a través de filtros de vidrio de GF/A y GF/C
seguido por filtración a través de un filtro de tamaño de poro de 45
\mum para obtener una preparación del filtrado de 800 ml que tenía
actividad de hexosa-oxidasa que correspondía a una
actividad de glucosa-oxidasa de 0,44 unidades por g
de preparación. La actividad se determinó usando el procedimiento
de más adelante.
El sobrenadante se aplicó en una columna
cromatográfica de 330 ml de volumen de lecho con bolas grandes
intercambio aniónico de Sepharosa Q (volumen muerto 120 ml). Las
proteínas enlazadas se eluyeron en 180 minutos usando un gradiente
de 0 a 0,5 M de NaCl en una disolución amortiguadora de TEA 20 mM,
pH 7,3, seguido por NaCl 1 M en una disolución amortiguadora de TEA
20 mM, y se recogieron fracciones de 9 ml y se analizaron respecto a
la actividad de hexosa-oxidasa usando el
procedimiento analítico de más adelante.
Se juntaron las fracciones 60-83
que contenían la actividad de la hexosa-oxidasa
(aproximadamente 250 ml) y se concentraron y desalaron por
ultrafiltración hasta a aproximadamente 25 ml. Esta etapa se repitió
dos veces con los retenidos a los que se añadieron 100 ml de TEA
0,05 mM. El retenido de 25 ml resultante contenía 0,95 unidades de
actividad de glucosa-oxidasa por g.
Definición: 1 unidad de
glucosa-oxidasa (GOD) corresponde a la cantidad de
enzima que en las condiciones especificadas da lugar a la conversión
de 1 \mumol de glucosa por minuto. La actividad se especifica como
unidades por g de preparación enzimática.
Reactivos: (i) disolución amortiguadora:
se disuelven 20 g de Na_{2}HPO_{4}-2H_{2}O en
900 ml de agua destilada y se ajusta el pH a 6,5; (ii) reactivo
colorante (disolución madre): se disuelven 200 mg de
2,6-dicloro-fenol-indofenol,
Sigma nº D-1878, en 1000 ml de agua destilada con
agitación vigorosa durante 1 hora; (iii) peroxidasa (disolución
madre): Boehringer Mannheim nº 127361, se disuelven 10.000 unidades
en 10 ml de agua destilada y se añaden
4,2 g de sulfato de amonio; (iv) sustrato: disolución de D-glucosa al 10% peso/volumen en disolución amortiguadora, (v) enzima patrón: hidrasa #1423 de Amano.
4,2 g de sulfato de amonio; (iv) sustrato: disolución de D-glucosa al 10% peso/volumen en disolución amortiguadora, (v) enzima patrón: hidrasa #1423 de Amano.
Principio y procedimiento analítico: la
glucosa se convierte en ácido glucónico y H_{2}O_{2}, que
subsiguientemente se convierte por la peroxidasa en H_{2}O y
O_{2}. El oxígeno generado oxida el reactivo colorante azul
2,6-dicloro-fenol-indofenol
que de este modo cambia su color a púrpura. El color oxidado se mide
espectrofotométricamente a 590 nm y los valores de la actividad
enzimática se calculan con relación a un patrón.
Se estudió el efecto de la
hexosa-oxidasa sobre la formación de reticulación
entre grupos tiol midiendo el contenido de grupos tiol libres en una
pasta preparada a partir de 1500 g de harina de trigo, 400 Unidades
Brabender (BU) de agua, 90 g de levadura, 20 g de sacarosa y 20 g de
sal a los que se añadieron 0, 100, 250, 875 y 1250 unidades por kg
de harina, respectivamente, de la anterior preparación de
hexosaoxidasa. Esencialmente, la medida se llevó a cabo según el
método colorimétrico de Ellman (1958) como También se describe en
Cereal Chemistry, 1983, 70, 22-26. Este método se
basa en el principio de que el
5,5'-ditio-bis(ácido
2-nitrobenzoico) (DTNB) reacciona con los grupos
tiol en la pasta para formar un anión altamente coloreado de ácido
2-nitro-5-mercapto-benzoico,
que se mide espectrofotométricamente a 412 nm.
Suponiendo que el cambio relativo de la cantidad
de grupos tiol en una pasta se refleja como el cambio de la densidad
óptica (OD) que resulta de la reacción entre los grupos tiol y el
DTNB en la pasta, se obtuvieron los siguientes resultados:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Así, este experimento mostró una disminución
significativa de la OD, que indicó una reducción del contenido de
grupos tiol libres que se proporcionaron a la cantidad añadida de
actividad de hexosaoxidasa.
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La pasta anterior se sometió a medidas
extensigráficas según el método AACC 54-10, con y
sin la adición de una cantidad de la preparación de
hexosa-oxidasa correspondiente a 100 unidades/kg de
harina de actividad de hexosa-oxidasa. La pasta sin
adición de enzima sirvió como testigo.
El principio del método anterior es que las
pasta después de formarse se somete a un ensayo de
carga-extensión después de reposar a 30ºC durante
45, 90, 135 y 180 minutos, respectivamente, usando un extensógrafo
capaz de registrar una curva de carga-extensión
(extensigrama) que es un índice de la resistencia de la pasta a la
deformación física cuando se estira. A partir de esta curva, se
pueden calcular la resistencia a la extensión, B (altura de la
curva) y la extensibilidad, C (longitud total de la curva). La
relación B/C (D) es un índice de la resistencia al horneado de la
pasta de harina.
Los resultados del experimento se sumarizan en
la tabla 2.1 más adelante.
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Es evidente a partir de esta tabla que la
adición de hexosa-oxidasa (HOX) tiene un efecto
mejorador sobre la resistencia de la pasta a la extensión como
indica el incremento de los valores B. Esto se refleja en casi una
duplicación de la relación B/C como un claro índice de que la
resistencia al horneado de la harina aumenta significativamente
mediante la adición de hexosa-oxidasa.
En un experimento similar, se añadieron 100
unidades/kg de harina de un producto comercial de
glucosa-oxidasa y los anteriores parámetros se
midieron de la misma manera usando como testigo una pasta a la que
no se añadió enzima. Los resultados de este experimento se muestran
en la tabla 2.2. más adelante:
Cuando se comparan los resultados de los dos
experimentos anteriores con respecto a las diferencias entre la
pasta testigo y las pastas suplementadas con
hexosa-oxidasa o glucosa-oxidasa,
parece que la hexosa-oxidasa tiene un efecto de
refuerzo más fuerte que la glucosa-oxidasa. Además,
la relación B/C aumenta más rápidamente con la
hexosa-oxidasa en relación a la
glucosa-oxidasa, lo que es un claro índice de que el
aumento de la resistencia al horneado se confiere más eficientemente
mediante la hexosaoxidasa que mediante la
glucosa-oxidasa (Fig. 1).
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Para este experimento, se recolectaron láminas
frescas de algas Chondrus crispus junto a la costa de
Hirsholmene, Dinamarca. La hexosa-oxidasa se aisló
usando dos procedimientos de extracción diferentes, y los materiales
de ambos se juntaron para el experimento mejorador de la pasta de
más adelante.
Se enjuagaron 954 g de láminas frescas con agua
destilada, se secaron con una toalla y se almacenaron en nitrógeno
líquido. Las algas se mezclaron usando un mezclador Waring y se
añadieron a las algas mezcladas 1908 ml de disolución amortiguadora
de fosfato de sodio 0,1 M, NaCl 1 M, pH 6,8. La mezcla se extrajo
con agitación constante durante 4 días a 5ºC, seguido por
centrifugación de la mezcla a 20.000 x g durante 30 minutos.
Los 1910 ml resultantes de sobrenadante (351,1
U/ml) se concentraron hasta 440 ml a 40ºC en un Rotavapor Büchi
R110. El concentrado se fraccionó en sulfato de amonio al 25%. La
mezcla se agitó durante 30 minutos y se centrifugó durante 20
minutos a 47.000 x g. El sobrenadante (395 ml) se dializó durante
toda la noche frente a 20 l de disolución amortiguadora de
trietanolamina (TEA) 10 mM, pH 7,3, hasta un volumen final de 610 ml
(367,1 U/ml).
Los anteriores 610 ml se aplicaron en dos
experimentos a una columna de 2,6 x 25 cm con 130 ml de
Q-Sepharosa FF equilibrada en disolución
amortiguadora de TEA 20 mM, pH 7,3. La columna se lavó con la
disolución amortiguadora de equilibrado y las proteínas enlazadas se
eluyeron usando 800 ml de un gradiente de 0 a 0,8 M de NaCl en la
disolución amortiguadora de equilibrado. La columna se eluyó a 4
ml/minuto y se recogieron fracciones de 12 ml. Se recogieron las
fracciones que contenían la actividad de
hexosa-oxidasa y se juntaron hasta un volumen final
de 545 ml
(241,4 U/ml).
(241,4 U/ml).
Se enjuagaron 1250 g de láminas frescas con agua
destilada, se secaron con una toalla y se almacenaron en nitrógeno
líquido. Las algas se mezclaron usando un mezclador Waring, seguido
por la adición de 2500 ml de disolución amortiguadora de fosfato de
sodio 0,1 M, NaCl 1 M, pH 6,8. La mezcla se extrajo con agitación
continua durante 4 días a 5ºC, seguido por centrifugación a 20.000 x
g durante 30 minutos.
Los 2200 ml resultantes de sobrenadante (332,8
U/ml) se concentraron hasta 445 ml a 40ºC en un Rotavapor Büchi
R110. El concentrado resultante se fraccionó en sulfato de amonio al
25%. La mezcla se agitó durante 30 minutos y se centrifugó durante
20 minutos a 47.000 x g. El precipitado se descartó. Los 380 ml del
sobrenadante se dializaron durante toda la noche frente a 20 l de
disolución amortiguadora de TEA 10 mM, pH 7,3, hasta un volumen
final de 850 ml (319,2 U/ml).
Los anteriores 850 ml se aplicaron a una columna
de 2,6 x 25 cm con 130 ml de Q-Sepharosa FF
equilibrada en disolución amortiguadora de TEA 20 mM, pH 7,3. La
columna se lavó con la disolución amortiguadora de equilibrado y las
proteínas enlazadas se eluyeron usando un gradiente de 800 ml de
NaCl 0 a 0,8 M en la disolución de equilibrado. La columna se eluyó
a 4 ml/minuto y se recogieron fracciones de 12 ml. Se recogieron las
fracciones que contenían la actividad de
hexosa-oxidasa y se juntaron hasta un volumen final
de 288 ml.
El retenido de la etapa anterior se aplicó a una
columna de 2,6 x 31 cm con 185 ml de sepharosa FF quelante de
metales cargada con Ni2+ y equilibrada en fosfato de sodio 50 mM,
NaCl 1 M , pH 7,4. Las proteínas enlazadas se eluyeron con un
gradiente de 740 ml de imidazol 0 a 35 mM, pH 4,7, en la disolución
amortiguadora de equilibrado. La columna se eluyó a 2 ml/minuto y se
recogieron fracciones de 11 ml. Se juntaron las fracciones
41-54 (140 ml, 352,3 U/ml). Parte de la
hexosa-oxidasa se movió a través de la columna.
La parte que se movió a través de la columna y
los 140 ml de la purificación II y los 545 ml de la purificación I
se juntaron hasta un volumen final de 1120 ml (303,6 U/ml). Los 1120
ml de evaporaron en rotavapor hasta un volumen de 210 ml seguido por
diálisis durante toda la noche frente a 20 l de disolución
amortiguadora de TEA 10 mM, pH 7,3, hasta un volumen final de 207 ml
(1200,4 U/ml).
El retenido resultante de la etapa anterior se
aplicó a una columna de 2,6 x 25 cm con 130 ml de
Q-sepharosa FF equilibrada en trietanolamina 20 mM,
pH 7,3. La columna se lavó con la disolución amortiguadora de
equilibrado y las proteínas enlazadas se eluyeron usando un
gradiente de 800 ml de NaCl 0 a 0,8 M en la disolución amortiguadora
de equilibrado. La columna se eluyó a 4 ml/minuto, y se recogieron
fracciones de 12 ml. Se recogieron y juntaron las fracciones
30-50 que contenían la actividad de
hexosa-oxidasa (260 ml, 764,1 U/ml).
La anterior disolución juntada se ensayó
respecto a las siguientes actividades enzimáticas secundarias:
catalasa, proteasa, xilanasa, \alpha- y
\beta-amilasa y lipasa. No se encontró en la
disolución ninguna de estas actividades.
Se preparó una pasta a partir de harina de
trigo, agua y sal y se añadieron a la misma 0, 72, 216 y 360
unidades por kg de harina, respectivamente, de la anterior
preparación de hexosa-oxidasa. La pasta sin adición
de enzima sirvió como testigo. Además, se prepararon dos pastas a
las que se añadieron 216 y 360 unidades de Gluzyme, una
glucosa-oxidasa disponible a partir de Novo Nordisk
A/S, Dinamarca, por kg de harina, respectivamente.
Las pastas se sometieron a medidas
extensigráficas según una modificación del anterior método AACC
54-10. Los resultados del experimento se sumarizan
más adelante en la tabla 3.1.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
Es evidente a partir de la tabla anterior que la
adición de hexosa-oxidasa (HOX) o
glucosa-oxidasa tuvo un efecto mejorador sobre la
resistencia a la extensión de las pastas como indicó el aumento de
los valores B. Esto se refleja en un aumento de la relación B/C como
un claro índice de que la resistencia de la harina al horneado se
aumentó significativamente mediante la adición de enzimas.
También es evidente que la
hexosa-oxidasa tuvo un mayor efecto reforzante que
la glucosa-oxidasa. Además, la relación B/C aumentó
más rápidamente con hexosa-oxidasa en relación a la
glucosa-oxidasa, lo que es un claro índice de que el
aumento de la resistencia al horneado se confiere más eficientemente
mediante hexosa-oxidasa que mediante
glucosa-oxidasa.
Se recolectaron láminas frescas de Chondrus
crispus junto a la costa de Bretaña, Francia. Se enjuagaron con
agua 2285 g de este material fresco, se secaron con una toalla y se
almacenaron en nitrógeno líquido. Las algas se mezclaron usando un
mezclador Waring, seguido por la adición de 4570 ml de disolución
amortiguadora de fosfato de sodio
0,1 M, NaCl 1 M, pH 6,8. La mezcla se extrajo con agitación magnética continua durante 4 días a 5ºC, seguido por centrifugación a 20.000 x g durante 30 minutos.
0,1 M, NaCl 1 M, pH 6,8. La mezcla se extrajo con agitación magnética continua durante 4 días a 5ºC, seguido por centrifugación a 20.000 x g durante 30 minutos.
Los 4930 ml resultantes de sobrenadante (624,4
U/ml) se concentraron hasta 1508 ml a 40ºC en un Rotavapor Büchi
R110. El concentrado resultante se fraccionó en polietilenglicol al
3% (peso/volumen). La mezcla se agitó durante 30 minutos y se
centrifugó durante 30 minutos a 47.000 x g. Se descartó el pelet.
Los 1470 ml del sobrenadante (2118,7 U/ml) se fraccionaron en PEG al
24%. La mezcla se agitó durante 30 minutos y se centrifugó durante
30 minutos a 47.000 x g. El sobrenadante se descartó y los 414,5 g
de precipitado se resuspendieron en 200 ml de disolución
amortiguadora de TEA 20 mM, pH 7,3, seguido por diálisis durante
toda la noche a 5ºC frente a 20 l de disolución amortiguadora de TEA
10 mM, pH 7,3.
Después de la diálisis el volumen fue 650 ml
(2968,6 U/ml). La suspensión se centrifugó durante 30 minutos a
20.000 x g. El precipitado se descartó y el sobrenadante se diluyó
hasta 3200 ml con agua destilada.
Los anteriores 3200 ml (829,9 U/ml) se aplicaron
a una columna de 10 x 14 cm con 1100 ml de QSepharosa FF equilibrada
en disolución amortiguadora de TEA 20 mM, pH 7,3. La columna se lavó
con la disolución amortiguadora de equilibrado y las proteínas
enlazadas se eluyeron usando un gradiente de 15.000 ml de NaCl 0 a
0,8 M en la disolución de equilibrado. La columna se eluyó a 50
ml/minuto. La hexosa-oxidasa se movió a lo largo de
la columna y se recogieron 840 ml de ésta.
La suspensión de 840 ml se trató con kieselguhr
y se concentró hasta 335 ml (2693,3 U/ml).
Los anteriores 335 ml se aplicaron a una columna
de 10 x 40 cm de desalación con 3 l de Sephadex G25C. La columna se
equilibró en disolución amortiguadora de TEA 20 mM, pH 7,3, se eluyó
a un caudal de 100 ml/minuto y se recogieron 970 ml de eluido. Este
eluido se aplicó a una columna de 10 x 14 cm con 1100 ml de
Q-Sepharosa FF equilibrada en TEA 20 mM, pH 7,3. La
columna se lavó con la disolución amortiguadora de equilibrado y las
proteínas enlazadas se eluyeron usando un gradiente de 15.000 ml de
NaCl 0 a 0,8 M en la disolución amortiguadora de equilibrado. La
columna se eluyó a 50 ml/min. La hexosa-oxidasa se
movió a lo largo de la columna y se recogieron 1035 ml de ésta.
Al eluido anterior (1035 ml) se añadió sulfato
de amonio hasta una concentración final de 2 M. A continuación, la
mezcla se aplicó en dos ensayos a una columna de 5 x 10 cm con 200
ml de fenil-sepharosa HP equilibrada en disolución
amortiguadora de fosfato de sodio 25 mM, pH 6,3, y
(NH_{4})_{2}SO_{4} 2 M. La columna se lavó con la
disolución amortiguadora de equilibrado seguido por la elución de
las proteínas enlazadas a un caudal de 50 ml/minuto usando un
gradiente de 5.000 ml de (NH_{4})_{2}SO_{4} 2 M a 0 M
en disolución amortiguadora de fosfato de sodio 25 mM. De los
ensayos 1 y 2 se recogieron, respectivamente, fracciones de 500 y 29
ml. La fracción 5 del ensayo 1, y las fracciones
27-42 del ensayo 2 que contenían la actividad de
hexosa-oxidasa se juntaron hasta un total de 1050
ml
(563,9 U/ml).
(563,9 U/ml).
La mezcla anterior se desaló mediante una
columna de filtración por gel con 3 l de Sephadex G25C. La columna
se equilibró en disolución amortiguadora de TEA 20 mM, pH 7,3, y se
eluyó a un caudal de 100 ml/minuto y se recogieron 1.000 ml de
eluido.
Los 1.000 ml de eluido se concentraron hasta 202
ml (2310,2 U/ml) y esta preparación se usó para el ensayo de
reología siguiente.
\vskip1.000000\baselineskip
Se preparó una pasta a partir de harina de
trigo, agua y sal y se añadieron a la misma 0, 288, 504 y 720
unidades de oxido-reductasa, respectivamente, de la
anterior preparación de hexosa-oxidasa por kg de
harina. La pasta sin adición de enzima sirvió como testigo. Además,
se prepararon dos pastas a las que se añadieron 288 y 504 unidades
de oxido-reductasa por kg de harina,
respectivamente, de Gluzyme, una glucosa-oxidasa
disponible a partir de Novo Nordisk A/S, Dinamarca.
Las pastas se sometieron a medidas
extensigráficas según una modificación del anterior método AACC
54-10.
Los resultados del experimento se sumarizan más
adelante en la tabla 4.1.
Es evidente a partir de los resultados
anteriores que la adición de hexosa-oxidasa (HOX) o
glucosaoxidasa tiene un efecto mejorador sobre la resistencia de las
pastas a la extensión como indica el aumento de los valores B. Esto
se refleja en un aumento de la relación B/C.
También es evidente que la
hexosa-oxidasa tiene un efecto reforzante más fuerte
que la glucosa-oxidasa, siendo el efecto reforzante
de ambas enzimas proporcional a la cantidad de enzima añadida.
Además, la relación B/C aumentó más rápidamente con
hexosa-oxidasa en relación a la
glucosa-oxidasa, lo que es un claro índice de que el
aumento de la resistencia al horneado se confiere más eficientemente
mediante hexosa-oxidasa que mediante
glucosa-oxidasa.
\vskip1.000000\baselineskip
Se cosecharon láminas frescas de Chondrus
crispus junto a la costa de Bretaña, Francia. Se enjuagaron con
agua destilada 2191 g de este material fresco, se secaron con una
toalla y se almacenaron en nitrógeno líquido. Las algas se mezclaron
usando un mezclador Waring, seguido por la adición de 4382 ml de
disolución amortiguadora de fosfato de sodio 0,1 M, NaCl 1 M, pH
6,8. La mezcla se extrajo con agitación magnética continua durante 4
días a 5ºC, seguido por centrifugación a 20.000 x g durante 20
minutos.
Los 4600 ml resultantes de sobrenadante (746,1
U/ml) se concentraron hasta 850 ml a 40ºC en un Rotavapor Büchi
R110. Este concentrado (3626,9 U/ml) se fraccionó en
polietilenglicol al 3% (peso/volumen). La mezcla se agitó durante 30
minutos y se centrifugó durante 30 minutos a 20.000 x g. El
precipitado se descartó. Los 705 ml del sobrenadante (2489,8 U/ml)
se fraccionaron en PEG al 25%. La mezcla se agitó durante 30 minutos
y se centrifugó durante 30 minutos a 20.000 x g. El sobrenadante se
descartó y los 341 g de precipitado se resuspendieron en 225 ml de
disolución amortiguadora de TEA 20 mM, pH 7,3. La suspensión (500
ml) se desaló en una columna de desalación de 10 x 40 cm con 3 l de
Sephadex G25C. La columna se equilibró en disolución amortiguadora
de TEA 20 mM, pH 7,3, y se eluyó a un caudal de 100 ml/minuto. Se
recogieron 1605 ml de eluido.
Se añadió sulfato de amonio al eluido anterior
(687,5 U/ml) hasta una concentración final de 2 M. A continuación,
la mezcla se aplicó en dos pruebas a una columna de 5 x 10 cm con
200 ml de fenil-sepharosa HP equilibrada en una
disolución amortiguadora de fosfato de sodio 25 mM, pH 6,3 y
(NH_{4})_{2}SO_{4} 2 M. La columna se lavó con la
disolución amortiguadora de equilibrado seguido por elución de las
proteínas enlazadas a un caudal de 50 ml/minuto usando un gradiente
de 5.000 ml de (NH_{4})_{2}SO_{4} 2 M a 0 M en
disolución amortiguadora de fosfato de sodio 25 mM. Se recogieron
fracciones de 29 ml. Las fracciones 85-105 del
ensayo 1 y las fracciones 36-69 del ensayo 2, que
contenían la actividad de hexosa-oxidasa, se
juntaron hasta un total de 1485 ml (194,7 U/ml).
La mezcla anterior se desaló mediante una
columna de filtración por gel con 3 l de Sephadex G25C, la misma que
se usó en 4.1. La columna se equilibró en disolución amortiguadora
de TEA 20 mM, pH 7,3, y se eluyó a un caudal de 100 ml/minuto. Se
recogieron 1.200 ml de eluido.
Los 1.200 ml de eluido se concentraron hasta 685
ml (726,2 U/ml) y se usaron para los experimentos de horneado.
Se preparó una pasta a partir de 1500 g de
harina de trigo, 90 g de levadura, 24 g de sal, 24 g de azúcar y 400
BU de agua y se añadieron a la misma 0 ó 108 unidades de la
hexosa-oxidasa purificada anteriormente y 108
unidades de Gluzyme (glucosa-oxidasa disponible a
partir de Novo Nordisk, Dinamarca), respectivamente, por kg de
harina. La pasta se mezcló en un mezclador Hobart durante 2+9
minutos a 26ºC y se dividió en dos partes seguido por reposo durante
10 minutos a 30ºC en una cabina de calentamiento, moldeo con una
Fortuna 3/17/7 y actividad de las levaduras durante 45 minutos a
34ºC y 85% de HR. La pasta así sometida a la actividad de las
levaduras se coció a 220ºC durante 17 minutos con vapor 12 sec. en
un horno Bago.
Los resultados del experimento se sumarizan en
la tabla 5.1 más adelante.
Es evidente a partir de la tabla anterior que la
adición de hexosa-oxidasa o
glucosa-oxidasa tuvo el efecto de aumentar el
volumen total, siendo el peso esencialmente el mismo. Esto se
refleja en un aumento del volumen específico en comparación con el
pan cocido sin adición de enzimas.
También es evidente que la
hexosa-oxidasa tiene un efecto significativamente
mayor sobre el aumento del volumen específico que el que tiene la
glucosa-oxidasa a la misma dosis.
Se usaron preparaciones de las anteriores
purificaciones para la caracterización de la
hexosa-oxidasa.
Se analizó la actividad de la
hexosa-oxidasa mediante PAGE nativo usando geles
Novex prelaminados con Tris-glicina
8-16%, según las instrucciones del fabricante
(Novex, San Diego, EE.UU.). Después de la electroforesis, los geles
se revelaron respecto a la actividad de la
hexosa-oxidasa por incubación del gel en una
disolución que contenía una disolución amortiguadora de fosfato de
sodio 50 mM, pH 6,0, glucosa 100 mM, 50 mg/l de
fenazina-metosulfato (Sigma P9625) y 250 mg/l de
nitroazul-tetrazolio (sigma N6876) como se describe
en la tesis de doctorado de Witteveen, C.F.B. (1993) "Formación de
gluconato y metabolismo de polioles en Aspergillus niger".
Después de aproximadamente 30 minutos, la actividad de la
hexosa-oxidasa fue visible como una doble banda muy
próxima una a otra. También se vio la misma doble banda cuando se
reveló con plata un PAGE nativo de hexosa-oxidasa.
Se determinó que el peso molecular de la
hexosa-oxidasa purificada era 144 kD por PAGE
nativa. La mitad del gel se reveló con plata, y la otra mitad se
reveló respecto a la actividad. Como patrones se usaron albúmina de
suero bovino (67 kD), lactato-deshidrogenasa (140
kD), catalasa (232 kD), ferritina (440 kD) y tiroglobulina (669
kD).
También se determinó el peso molecular del
material que se aplicó primero a un PAGE nativo que se describió
anteriormente, después del revelado de la actividad la banda de
hexosa-oxidasa se cortó del gel y a continuación se
electroeluyó usando un Electro-Eluidor (modelo 422,
Bio-Rad, CA, EE.UU.) según las recomendaciones del
fabricante. La proteína electroeluida se sometió a
SDS-PAGE y se reveló con plata. Este material dio
"una" doble banda a aproximadamente 70 kDa en geles
SDS-PAGE. La hexosa-oxidasa
electroeluida es por lo tanto un dímero de dos subunidades.
Se analizaron muestras que contenían actividad
de hexosa-oxidasa por enfoque isoeléctrico (IEF)
usando un gel IEF prelaminado 3-10 según las
recomendaciones del fabricante (Novex, San Diego, EE.UU.). después
de la electroforesis, la mitad del gel se reveló con plata y la otra
mitad se reveló con nitroazul-tetrazolio como se
describió en 6.1.
La hexosa-oxidasa se reveló como
una doble banda. El pI de la primera banda fue 4,79, el pI de la
segunda banda fue 4,64. Como patrones se usaron tripsinógeno (9,30),
banda básica de lectina de lenteja (8,65), banda media de lectina de
lenteja (8,45), banda ácida de lectina de lenteja (8,15), banda
ácida de mioglobina de caballo (6,85), anhidrasa carbónica B humana
(5,85), \beta-lactoglobulina A (5,20), inhibidor
de tripsina de soja (4,55), y amiloglucosidasa (3,50).
La K_{m} de la hexosa-oxidasa
se determinó para 7 azúcares diferentes como se describió en 1.2.3.
Los resultados se sumarizan más adelante en la tabla 6.1.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se suspendieron 50 \mul de la mezcla
electroeluida en 6.2 en 450 l de ácido trifluoroacético 0,1%
(TFA).
Para separar el Tris, la glicina y el SDS, la
mezcla anterior se sometió a cromatografía HPLC de fase inversa. La
disolución resultante se aplicó en 9 ensayos a una columna Brownlee
C2 de 4,6 x 30 cm equilibrada en TFA 0,1%. La columna se lavó en la
disolución amortiguadora de equilibrado y los péptidos enlazados se
eluyeron con un gradiente de 14 ml de 10 a 80% de acetonitrilo en
TFA 0,1%, a un caudal de 0,7 ml/min. Se recogieron y liofilizaron
las fracciones del pico mayor que contenían el enzima.
La enzima liofilizada resultante se disolvió en
50 \mul de urea 8 M, NH_{4}HCO_{3} 0,4 M, pH 8,4. La
desnaturalización y reducción de la proteína se llevó a cabo
mediante la adición de 5 \mul de ditiotreitol 45 mM y bajo un
manto de N_{2} a 50ºC durante 15 min. La disolución se enfrió a
temperatura ambiente y se añadieron 5 \mul de yodoacetamida 100
mM, derivatizándose las cisteínas durante 15 min. a temperatura
ambiente en la oscuridad bajo N_{2}. Subsiguientemente, la
disolución se suspendió en 135 \mul de agua y se llevó a cabo la
digestión a 37ºC en N_{2} durante 24 horas mediante la adición de
5 \mug de endoproteinasa Lis-C disuelta en 5
\mul de agua. La reacción se terminó congelando la mezcla de
reacción a -20ºC.
Los péptidos resultantes se separaron por HPLC
en fase inversa en una columna VYDAC C18 de 0,46 x 15 cm (The
Separation Group, CA, EE.UU.) usando como disolvente A, TFA al 0,1%
en agua y como disolvente B, TFA al 0,1% en acetonitrilo.
El secuenciado se llevó a cabo en un
secuenciador Applied Biosystems 476A (Applied Biosystems, CA,
EE.UU.) usando ciclos rápidos de líquido pulsado según las
instrucciones del fabricante. Se identificó un péptido que tenía la
secuencia de aminoácidos de más adelante: D P G Y I V I D V N A G T
P D K P D P.
Claims (20)
1. Método para mejorar las propiedades
reológicas de una pasta de harina y la calidad del producto acabado
fabricado a partir de la pasta, que comprende añadir a los
ingredientes de la pasta, aditivos de la pasta o a la pasta una
cantidad eficaz de una oxido-reductasa que al menos
sea capaz de oxidar la maltosa.
2. Método según la reivindicación 1, en el que
la oxido-reductasa es
hexosa-oxidasa.
3. Método según la reivindicación 2, en el que
la hexosa-oxidasa se deriva de una fuente
seleccionada de una especie de algas, una especie de plantas y una
especie microbiana.
4. Método según la reivindicación 3, en el que
la hexosa-oxidasa se deriva de Chondrus
crispus.
5. Método según la reivindicación 2, en el que
la hexosa-oxidasa se añade en una cantidad que está
en el intervalo de 1 a 10.000 unidades por kg de harina.
6. Método según la reivindicación 5, en el que
la hexosa-oxidasa se añade en una cantidad que está
en el intervalo de 10 a 1.000 unidades por kg de harina.
7. Método según la reivindicación 1 ó 2, en el
que la resistencia a la extensión de la pasta en términos de la
relación entre la resistencia a la extensión (altura de la curva, B)
y la extensibilidad (longitud de la curva, C), es decir la relación
B/C, que se mide por el método AACC 54-10 aumenta en
al menos un 10% en relación a la de la pasta, por lo demás similar,
que no contiene oxido-reductasa.
8. Método según la reivindicación 1, en el que
el producto acabado es pan.
9. Método según la reivindicación 1, en el que
el producto acabado es un producto de tallarines.
10. Método según la reivindicación 1, en el que
el producto acabado es un producto de una pasta alimenticia.
11. Método según la reivindicación 1, en el que
al menos se añade una enzima adicional a los ingredientes de la
pasta, aditivos de la pasta o a la pasta.
12. Método según la reivindicación 11, en el
que la enzima adicional se selecciona del grupo que consta de una
celulasa, una hemicelulasa, una xilanasa, una enzima que degrada el
almidón, una glucosaoxidasa, una lipasa y una proteasa.
13. Método para preparar un producto de
panadería, método que comprende preparar una pasta de harina a la
que se añade una cantidad eficaz de una
oxido-reductasa que al menos sea capaz de oxidar la
maltosa, y cocer la pasta en un horno.
14. Método según la reivindicación 13, en el
que se aumenta el volumen específico del producto de panadería en
relación a un producto de panadería, por lo demás similar, preparado
a partir de una pasta que no contiene
oxido-reductasa.
15. Método según la reivindicación 14, en el
que el volumen especifico se aumenta en al menos un 20%.
16. Método según la reivindicación 13, en el
que al menos se añade a la pasta una enzima adicional.
17. Método según la reivindicación 16, en el
que la enzima adicional se selecciona de entre el grupo constituido
por una celulasa, una hemicelulasa, una xilanasa, una enzima que
degrada el almidón, una glucosaoxidasa, una lipasa y una
proteasa.
18. Método según la reivindicación 13, en el
que la oxido-reductasa es
hexosa-oxidasa.
19. Método para preparar un producto alimenticio
basado en una pasta de harinas, que comprende añadir a la pasta una
cantidad eficaz de una oxido-reductasa que oxida la
maltosa.
20. Método según la reivindicación 19, en el
que la oxido-reductasa es
hexosa-oxidasa.
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