CN1190871A - 改进面团性质的方法和面团改进组合物以及改进的食品 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种改进面团的流变性质和由这种面团得到的成品的品质的方法,该方法包括添加有效量的能氧化麦芽糖的氧化还原酶,特别是己糖氧化酶,例如从藻类品种(如Iridophyclus flaccidum,Chondrus crispus或Euthora cristata)分离出的己糖氧化酶;本发明也提供了包含所说的氧化还原酶的面团改进组合物。

Description

改进面团性质的方法和面团改进组合物以及改进的食品
本发明涉及提供具有改进的流变性质的面粉面团和具有高品质特性的谷粉类食品，本发明提供了一种含有氧化麦芽糖的氧化还原酶的组合物，当它作为组分添加到面团中时能赋予面团和由此制造的食品上述改进的性质，本发明还提供了制备改进的面团和谷粉类食品的方法。
具体地说，本发明涉及一种提供改进面粉面团流变性质的方法并涉及由这种面团制的烘烤食品或干制品，这种食品具有好的质地、食用品质和形状。
就这方面，面团的“强”或“弱”是由面团制造谷粉类成品包括烘烤食品的一个重要方面。面团的“强”或“弱”主要取决于其蛋白质含量，特别是面筋蛋白质的含量和质量是决定其“强”、“弱”的重要的因素。蛋白质含量低的面粉一般称为“弱”面粉。这样，水和“弱”面粉混合形成的有内聚性的可延伸的且弹性的团块受到压力时，通常具有高度延伸性，但当外力去除时，它不能恢复原状。
蛋白质含量高的面粉一般称为“强”面粉。这种面粉和水混合所形成的团块比弱面粉形成的团块延伸性小，混合时施加的压力会回复，而不会比“弱”面粉形成的面团块所呈现的断裂程度大。由于面团具有较好的流变性质和处理性质，和由于以“强”面粉面团制成的烘烤食品或干制品具有较佳的形状和质地品质，因此，大多数烘烤业通常优选强面粉。
由强面粉制成的面团一般较稳定。面团的稳定性是面团最重要的特性之一。根据美国谷类化学家协会(AACC)方法36-01A，术语“稳定性”被定义为“获得正向反应时面团经过的时间范围和圆形面团在一段时间内抵抗它自身重量而不至变平的性质”。根据相同的方法，术语“反应”被定义为“面团对已知和特定刺激、物质或一系列条件的反应，通常在与对照组比较下通过烘烤测定之”。
在焙烤食品业和面粉厂，人们已知用面团性能改进剂来强化面团。这一类面团性能改进剂通常是非特异性氧化剂，如碘酸盐、过氧化物、抗坏血酸、K-溴酸盐或偶氮二甲酰胺，添加它们的目的在于改进面粉的烘烤性能以获得具有改进的延伸性因而具有所需强度和稳定性的面团。氧化剂这一作用背后的机制是面粉蛋白质(特别是面筋)含有硫醇基，当它们被氧化时，会形成双硫键，使蛋白质形成更稳定的基质因，而形成更好的面团品质，同时使烤食品的体积与面包心结构得以提高。
除了上述由于抗坏血酸/抗坏血酸盐的氧化能力而使其作为面团性能改进剂外，这些化合物也可以作为氧化还原酶的底物，即EP 0 682 116 A1公开的抗坏血酸氧化酶。在底物存在下，这种酶把抗坏血酸/抗坏血酸盐转化成脱氢抗坏血酸和H2O2。该现有技术并没有提出在抗坏血酸/抗坏血酸盐的存在下抗坏血酸氧化酶具有改良面团的效果，但假设了有这种情况。
然而，一些当前可供使用的几种氧化剂受到消费者的反对或者得不到管理机构的允许，因此人们试图找到这些常规面粉和面团添加剂的替代品，现有技术已提出用葡糖氧化酶来达到这个目的。
这样，US 2,783,150公开了在面粉中添加葡糖氧化酶以提高面团的强度、质地及改进烘烤面包的外观。
CA 2,012,723公开了包含纤维素水解酶如木聚糖酶和葡糖和葡糖氧化酶的面包改良组合物，加入后者的目的是为了减少纤维素水解酶的不利影响(减小面团的强度和粘性)，该文献公开了在面团中需要添加葡萄糖是为了获得足够的葡糖氧化酶活性。
JP-92 084848提使用一种包含葡糖氧化酶和脂酶的面包改良组合物。
EP-B1-321 811公开了使用包含巯基氢氧化酶和葡糖氧化酶的酶组合物以改进面团的流变特性。在该现有技术文件中论及了单独使用葡糖氧化酶还没有成功。
在EP-B1-338 452中公开了改进面团稳定性的酶组合物，其含有纤维素酶/半纤维素酶、葡糖氧化酶和视需要含巯基氧化酶的混合物。
然而，葡糖氧化酶用作面团改进添加剂是有局限性的，因为这种酶要求有足量的葡萄糖作为底物才能在面团系统中保持其有效性，而通常谷类面粉中葡萄糖的含量很低。因此，面团中不含葡萄糖或葡萄糖含量低可能是葡糖氧化酶成为有效的面团改进剂的限制因素。
与此相比，谷类面粉中麦芽糖的含量通常明显地比葡萄糖高，因此，新鲜制备的面团中通常麦芽糖含量比葡萄糖多，于是，在实验中，分析得自小麦面粉悬浮液的上清液中的糖含量以及分析由此面粉和其它成分(包括水，酵母，盐的和蔗糖)制得的面团(如在下面实施例2.3所述)的糖含量，分析值如下(百分比以面粉重量计)：
     面粉    生面团蔗糖      0.3     ＜0.01半乳糖    0.001   0.01葡萄糖    0.25    0.72麦芽糖    2.6     1.4果糖      0.08    0.67乳糖     ＜0.01  ＜0.01
此外，麦芽糖的含量在由酵母发酵的面团中仍然处于一个比较高的水平上，或者甚至会增加，这是由于酵母主要利用葡萄糖，例如，在面团醒发过程中，由于面粉中本来就存在或面团中曾加入过淀粉降解酶(如β-淀粉酶)，而使面团中产生更多的麦芽糖。
现有技术已确认葡糖氧化酶对面包面团的流变特性和对相应的烘烤制品品质有改进作用，也了解使用这种酶有若干弊端。因此，可能需要在面团中添加蔗糖或葡萄糖作为酶的底物以获得足够的效果，未添加其它酶而单独使用葡糖氧化酶时，可能无法持续提供所需的面团或面包的改进作用。
然而，现在发现添加能够氧化麦芽糖的氧化还原酶，包括己糖氧化酶作为唯一的面团性能改进剂，即在面团中不用伴随加入供添加酶所需的底物或其它酶，结果当面团被延伸时，增加了抗断裂性，就是说，这种酶本身使面团的强度增加，从而使面团不易产生机械变形。一般认为，面团中添加己糖氧化酶有上述效果是因小麦面筋中含硫氨基酸中的硫醇基团间形成交联所致，这种现象是面团中由酶产生的H2O2与硫醇基团进行反应时后者被氧化而发生的。
己糖氧化酶(D-己糖：O2-氧化还原酶，EC 1.1.3.5)是一种酶，该酶在氧存在下可将D-葡萄糖和几个其它还原糖包括麦芽糖、葡萄糖、乳糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖和纤维素二糖氧化成对应的内酯，接着水解成各个醛糖二糖酸。因此，己糖氧化酶不同于葡糖氧化酶，后者只能转化D-葡萄糖，而己糖氧化酶能用于更宽范围的糖底物。被此酶催化的氧化反应说明如下：
或
己糖氧化酶(以后也称为HOX)已从几种红藻类品种例如Iridophycusflaccidum(Bean和Hassid，1956，生物化学杂志，218：425-436)和角叉菜Chondrus crispus(Ikawa，1982，酶学方法，89：145-149)分离出来。另外，藻类品种Euthora cristata(Sullivan等，1973，生物化学和生物物理学报，309：11-22)也被证实能产生HOX。
根据本发明，其它己糖氧化酶的潜在来源包括微生物菌种或者陆生植物品种。作为这样一种植物来源的实例，Bean在生物化学杂志(1961)236：1235-1240中，已公开了一种从柑橘类水果中提取的氧化还原酶，该酶能氧化宽范围的糖，其中包括D-葡萄糖、D-半乳糖、纤维素二糖、乳糖、麦芽糖、D-2-脱氧葡萄糖、D-甘露糖、D-葡糖胺和D-木糖。另一个具有己糖氧化酶活性的酶的例子是Dowling等细菌学杂志(1956)72：555-560公开的鼻疽杆菌的酶系。
已经报道了从上述天然来源分离的己糖氧化酶在一些食品的生产中具有潜在的用途。这样，从Iridophycus flaccidum分离出的己糖氧化酶已显示了能够在牛奶中转化乳糖的同时产生相应的醛糖二糖酸，并显示在牛奶中作为酸化剂的潜在的意义，如代替酸化用微生物培养以达到同样目的(Rand，1972，食品科学杂志，37：698-701)。在这方面，己糖氧化酶被认为是比葡糖氧化酶更有意义的酶，因为后者只有添加葡萄糖或添加将乳糖转化成葡萄糖和半乳糖的乳糖降解酶时才能在牛奶或不含葡萄糖或少含葡萄糖的其它食品中发挥酶的有效作用。
氧化还原酶的能力(包括己糖氧化酶产生过氧化氢的能力)已用来改进食品(包括乳酪，黄油和果汁)的贮存稳定性，如在JP-B-73/016612中公开的。也有人提出氧化还原酶作为抗氧化剂在食品中有潜在的用途。
然而，本发明已证明已糖氧化酶在面粉面团制品(不仅包括面包制品也包括由面粉面团制成的其它制品如面条和营养面条制品)制造中作为面团性能改进剂的广泛用途。
因此，本发明第一个方面涉及改进面粉面团的流变性质和由此面团制成的成品品质的方法，该方法包括向面团成分、面团添加剂或面团中添加有效量的至少能够使麦芽糖氧化的氧化还原酶，如己糖氧化酶。
再一个方面，本发明也提供了面团焙烤食品改进组合物，其包含至少能够使麦芽糖氧化的氧化还原酶和至少一种其它面团成分或面团添加剂。
另一方面，本发明涉及制备焙烤食品的方法，该方法包括制备面粉面团和焙烤面团，所述制备面粉面团中包括添加有效量的至少能够使麦芽糖氧化的氧化还原酶；以及一种制备以面团为基料的食品的方法，包括向面团中加入有效量的麦芽糖氧化还原酶。
在一方面，本发明的方法是改进面团流变性质的一种方法。该方法包括，如上所述，将有效量的麦芽糖氧化还原酶添加到面团配方组分中或是混合所有面团组分形成的面团中。在本文上下文中，“有效量”是用来表示足以使面团和/或成品具有如本文中定义的改进的特性的量。
在按照本发明的方法的一个适用的实施方案中，氧化还原酶是己糖氧化酶。如本文详尽地描述的，己糖氧化酶能从天然产生该酶的海洋藻类品种中分离出来。这样的品种属于杉海苔科(Gigartinales目)。能产生己糖氧化酶的属于杉海苔科的藻类品种的例子是角叉菜Chondrus crispus和Iridophycus flaccidum。包括Euthora cristata品种在内的Cryptomeniales目的藻类品种也是己糖氧化酶的潜在来源。当用这样的天然来源来提取己糖氧化酶时，典型的例子是用含水的抽提介质从藻类原材料抽提。就原材料而言，可以使用从藻类所生长的海区收获的新鲜状态的藻类，或使用经干燥(如在环境温度下风干或经任何合适的工业干燥方法，如循环加热干燥或冷冻干燥)的植物体。为了有助于随后的抽提步骤，有利地是可将新鲜的或干燥的原材料弄碎如研磨法或掺合法。
作为水性抽提介质，pH范围为5-8的缓冲溶液，如0.1M磷酸钠缓冲液、20mM的三乙醇胺缓冲液或者20mM的三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)缓冲液是合适的。从藻类中提取己糖氧化酶的典型方法是将藻类原材料悬浮在缓冲液中，最好在搅拌下将这种悬浮液在0-20℃的范围，如在5℃下保持1至5天。
然后用适当的分离方法(如过滤，筛分或离心)从水性介质中分离悬浮的藻类材料，接着从滤液或上清液中回收己糖氧化酶。根据需要，将所分离的藻类材料进行一个或多个其它抽提步骤。
由于几种海藻包含有色的色素如藻青素，因此可能需要对滤液或上清液进行进一步的纯化以除去这些色素。作为一个例子，以色素可以溶解的有机溶剂处理滤液或上清液，并随后从水性介质中将含有已溶色素的溶剂加以分离，即可除去色素。另外，通过疏水相互作用色谱法也可将色素从滤液或上清液中除去。
任何可从水性介质中分离蛋白质的合适的常规方法都可用来从水性抽提介质中收集己糖氧化酶。这些方法的实例(在随后的内容中详尽地描述)包括用于蛋白质分离的常规方法，如离子交换色谱法，视需要随后可接浓缩步骤如超滤。也可通过添加如(NH)2SO4或聚乙二醇(PEG)物质使蛋白质沉淀，其后通过分离沉淀及视需要施以使蛋白质溶解的条件，以收集这种酶。
对于己糖氧化酶的某些应用来说，理想的是提供基本上纯的酶，如基本上不含其它蛋白质或非蛋白质污染物的制剂，从上述抽提和分离步骤所得粗制的酶制剂还需经进一步纯化步骤如色谱步骤、凝胶过滤或聚焦色谱法，这些将通过随后的实施例加以描述。
在按照本发明的方法的优选的实施方案中，通过混合面粉和水、膨松剂(如酵母或常规的化学膨松剂)以及有效量的己糖氧化酶在面团形成条件之下制备面团。当然，面团混合物中还可添加其它成分，也属本发明的范围之内。
典型地，这样的生面团组分包括常规面团组分，如盐、甜味剂(如食糖、糖浆或人工甜味剂)、类脂物质(包括起酥油、人造黄油、黄油或者动物或植物油)以及一种或多种面团添加剂(如乳化剂)、淀粉降解酶、纤维素或半纤维素降解酶、蛋白酶、脂酶、非特异性氧化剂(如以上提及的那些氧化剂)、调味剂、乳酸菌培养液、维生素、矿物质、亲水胶体如藻酸盐、角叉菜胶、果胶、植物胶(包括如瓜耳胶树胶和刺槐豆胶)和膳食纤维物质。
用于制造面粉面团制品的常规乳化剂的例子包括如单酸甘油酯、脂肪酸单和双甘油酯的二乙酰基酒石酸酯和卵磷脂(如从大豆获得)。在淀粉降解酶中，淀粉酶作为面团性能改进添加剂是特别适用的。α-淀粉酶使淀粉降解成为糊精，进一步受β-淀粉酶降解形成麦芽糖。添加到面团组合物中的其它适用的淀粉降解酶包括葡糖淀粉酶和支链淀粉酶。在本文的上下文中，其它有意义的酶是木聚糖酶和其它氧化还原酶，如葡糖氧化酶、吡喃糖氧化酶和巯基氧化酶。
一种优选的面粉是小麦面粉，但是也涉及包含由其它谷类品种(如，大米、玉米，大麦，黑麦和高粱)得来的面粉的面团。
通过混合面粉、水、按照本发明的氧化还原酶和其它可能的成分和添加剂来制备面团。氧化还原酶可与任何面团成分(包括水和面团成分混合物)或与任何添加剂或添加剂混合物一起加入。面团可用任何烘烤食品业或任何其它工厂中的普通的常规面团制备方法来制备。
氧化还原酶能作为一种液态制品添加或者以一种干燥的粉剂组合物形式(其中包含作为唯一的活性组分的酶或与一种或多种其它面团成分或添加剂的混合物)添加。添加的酶组分的量通常是在成品面团中每公斤面粉1到10,000单位，优选为5到5000单位如10到1000单位。在适用的实施方案中，每公斤面粉中的酶量在20至500单位的范围。在本文上下文中1氧化还原酶单位相当于特定条件下每分钟转化1μ摩尔葡萄糖的酶量。其活性以每克酶制剂中的氧化还原酶的单位数表示。
氧化还原酶对面团流变性质的改进效果可以通过以下方法测定：按照国际谷类化学协会(ICC)和美国谷类化学协会(AACC)的标准方法，包括面粉糊粘度图示仪法(ICC 126)、调粉性测定仪法(farinograph)(AACC 54-21)和延伸仪法(extensigraph)(AACC 54-10)。延伸仪法测定例如面团保持酵母产生的气体的能力和经受醒发的能力。实际上，延伸仪法测定面团的相对强度。强面团显示出比弱面团较高的和(在某些情况下)较长的延伸曲线。AACC法54-10以以下方式定义延伸仪：″延伸仪记录一块试验面团到破裂时的负载延伸曲线。负载-延伸曲线或延伸曲线(extensigrams)的特征是用来评估面粉的一般品质以及它对改进剂的反应″。
在按照本发明的方法的一个优选的实施方案中，面团的抗延伸性，以抗延伸性(曲线高度，B)与延伸性(曲线长度，C)间的比率(即B/C)表示，按照AACC方法54-10测定结果显示，相对于不含氧化酶的其它类似面团，增加至少10％。在更优选的实施方案中，抗延伸性增加至少20％，例如至少50％，特别是增加至少100％。
按照本发明的方法可以用于任何类型的面粉面团以改进其流变性质和由此特殊型面团制得的成品的品质。因此，本发明的方法很适合于制备传统上以酵母发酵的面包制品，包括小麦面粉制作的面包制品(如长面包和面包卷)。然而，一般认为本发明方法也可改进添加化学发酵剂引起膨松的面团的性质，包括甜烘烤食品，如糕饼制品，包括如磅饼和松饼或松软烤饼。
在一个有意义的方面，本发明是用来改进制作面条制品(包括“白面条”和“中国面条”)的面团的流变性质和改进面条成品的质地品质。用于面条制造的一个典型的基本配方包括以下成分：小麦面粉100份，盐0.5份和水33份。面条的典型制法是通过在合适的混合装置中混合各成分，随后用合适的面条机擀平面团而形成细面条，随后风干之。
成品面条的品质按它们的颜色、烹调品质和质地来估价。面条应尽快烹煮，在烹煮之后仍然结实，煮汤中最好未流失任何固体。所供应的面条应具有滑顺和结实的表面而不应显示粘性，并给出结实的咬感和好的口感。而且，重要的是面条要有浅的颜色。
由于提供具有所需的质地和食用品质的面条的小麦面粉的适宜性可能会随着年份和生长区域的不同而不同，因此，通常添加面条改进剂至面团中以弥补面粉欠适宜的质量。典型地，这样的改进剂包括膳食纤维物质、植物蛋白质、乳化剂和亲水胶体如藻酸盐、角叉菜胶、果胶、植物胶(包括瓜耳胶树胶和刺槐豆胶)和淀粉酶。
人们曾试图用葡糖氧化酶作为面条改进剂。但是，如上所述，小麦面粉中葡萄糖的含量可能太低致使这种酶不具效力。
因此本发明的一个重要方面是本发明的氧化还原酶是有效的面条改进剂(视需要与现用的改进面条品质的其它成分复配使用)。因此，可以认为按照上述方法制备的面条应在颜色、烹煮和食用品质方面的性质(包括结实，有弹性和质地不粘和均匀)得了到改进。
在另一实施方案中，本发明方法制备的面团是制备营养面食制品的面团。这样的制品(包括例如意大利面条和通心面)通常是以面粉和鸡蛋为主要成分的面团制备的。在混合各成分之后，使面团形成所需种类的面条制品和然后风干之。一般认为，而糊面团添加剂对其延伸性和稳定性有明显的改进效果从而制得具有改进质地和食用品质的面食成品。
在本发明的另一方面，本发明提供了面团改进组合物，该组合物包含本发明的氧化还原酶和至少一种其它面团成分或面团添加剂。
在一个优选的实施方案中，氧化还原酶是己糖氧化酶。其它成分或添加剂可以是以上描述的任何成分或添加剂。这种组合物可以方便地为包含氧化还原酶的液态制剂。然而，该组合物方便的是呈干燥的组合物形式。可以理解地是，在组合物中氧化还原酶活性的量取决于其它成分或添加剂的类型和量。然而，氧化还原酶活性的量在10至100,000单位的范围内较好，优选的在100至50,000单位的范围内，如1,000至10,000单位(包括2,000至5,000单位)。
根据需要，组合物可以是一种完全的面团添加剂的混合物，或包含这种面团的所有干燥的成分和添加剂的用于制备特定成品的预混合物形式。在特定的实施方案中，组合物对于制备烘烤食品或生产面条制品或者营养面食制品是特别有用的。
如上面提到的，本发明提供了一种用于制备烘烤食品的方法，该方法包括添加氧化还原酶如己糖氧化酶至面团中。尤其是，这种方法的结果是烘烤食品如以上提及的制品相对于以不包含氧化还原酶的面团制备的其它类似烘烤食品，其比容有所增加。在本文上下文中，“比容”用来表示产品的体积和重量之间的比率。人们惊奇发现按照上述方法，比容能显著地增加例如至少10％，优选增加至少20％，其中也有增加30％的，较好为至少40％，更好为至少50％。
在上述方法的一个有利的实施方案中，至少还有一种酶添加到面团中。这里合适的例子包括纤维素酶、半纤维素酶、木聚糖酶、淀粉降解酶、葡糖氧化酶、脂酶和蛋白酶。
现在通过以下的非限制性实施例的说明，对本发明加以叙述。实施例11.1.从Chondrus criscus获得的己糖氧化酶的纯化
纯化的己糖氧化酶制剂是利用以下抽提和纯化过程获得的。在这些过程和下面纯化酶的鉴定中，采用下列方法测定己糖氧化酶的活性：1.1.1己糖氧化酶的活性测定
本测定基于由Sullivan和Ikawa描述的方法(生物化学和生物物理学报，1973，309：11-22)，但是修改成为在微型滴定平板上进行。测定混合物包含150μl的β-D-葡萄糖(0.1M在0.1M pH＝6.3磷酸钠缓冲液中)，120μl 0.1M pH＝6.3磷酸钠缓冲液，10μl邻联茴香胺-二盐酸盐(西格马D-3252，在H2O中3.0毫克/毫升)，10μl过氧化物酶(POD)(西格马-8125，在0.1ml在0.1M pH＝6.3磷酸钠缓冲液中)和10μl酶(HOX)溶液。以添加缓冲液替代酶溶液作为对照溶液。
培养由葡萄糖的添加开始。在25℃下培养15分钟之后，在ELISA分析仪上读取405nm的吸光度。利用不同浓度的H2O2替代酶溶液来制作标准曲线。
这一反应可用以下方式描述： 被氧化的邻联茴香胺呈黄颜色，在405nm处有吸收。1.1.2抽提
新鲜的Chondrus crispus植物体是沿法国的布列塔尼地区海岸上收获的。新鲜材料在针状磨(Alpine)中均质化。向形成的100克均浆的植物体材料添加300毫升0.1M pH＝6.8磷酸钠缓冲液。混合物随后在超声浴中进行5分钟的超声处理，在5℃下持续旋转下提取4天，随后在47,000×g下将混合物离心20分钟。
利用装备有Omega(10kD截留值，Filtron)超滤膜的Amicon超滤设备，对300ml形成的清晰的粉红上清液进行超滤脱盐。1.1.3阴离子交换步骤
将1.1.2形成的存留物施加于以20mM三乙醇胺(pH＝7.3)平衡过的200m1Q-琼脂糖FF之5×10cm凝胶柱。用平衡缓冲液洗凝胶柱和用450ml在平衡缓冲液中含0到1M NaCl4的梯度液洗脱己糖氧化酶。柱以6ml/分钟速度洗脱，收集流出级分，每级分14ml。利用装备有Omega(10kD截留值，Filtron)超滤膜的Amicon 8400超滤装置，通过超滤作用将收集的9-17(总125ml)级分浓缩到7.5ml。1.1.4.凝胶过滤
将上述7.5ml存留物施加于以50mM磷酸钠缓冲液(pH6.4)平衡过的葡聚糖凝胶Superdex 200 2.6×60cm凝胶过滤柱，以1ml/分钟的流速洗脱。收集流出级分，每级分4ml。合并具有己糖氧化酶活性的17-28级分(总体积50ml)。1.1.5疏水相互作用色谱法
向从凝胶过滤步骤1.1.4产生的合并液中加入硫酸铵至最终浓度为2M，然后将这一混合物施加于在20mM磷酸钠缓冲液(pH＝6.3)和2M硫酸铵中平衡过的具32ml苯基琼脂糖的1.6×16cm凝胶柱上。用平衡缓冲液洗柱后，用在20mM磷酸钠缓冲液中含2M到0M硫酸铵的140ml线性梯度液以2ml/分钟流速洗脱己糖氧化酶，。收集流出级分，每级分4ml，合并具有己糖氧化酶活性的24-33级分。
以上提及的粉红颜色伴随着酶，但根据此纯化步骤可将其与己糖氧化酶分离。1.1.6.Mono Q阴离子交换
用上述超滤法使上述苯基琼脂糖凝胶色谱步骤产生的合并液脱盐。取2ml这种合并液施加于在20mM三乙醇胺(pH＝7.3)中平衡过的Mono Q溶靛素橙HR5/5柱上。其后用在平衡缓冲液中含0到0.65 M NaCl的45ml线性梯度液以1.5毫升/分钟的流速洗脱。收集流出级分，每级分1.5ml，合并14-24级分。1.1.7 Mono P阴离子交换
将从以上1.1.6步骤中得来的含己糖氧化酶的合并液施加于在20mM-双三羟甲基氨基甲烷缓冲液(pH＝6.5)中平衡过的Mono P溶靛素橙HR5/5柱。用在平衡缓冲液中含0到0.65 M NaCl的45ml线性梯度液以1.5ml/分钟的流速洗脱酶。收集流出级分，每级分0.75ml。在级分12中发现最高的己糖氧化酶活性。1.2.纯化的己糖氧化酶的鉴定
从上述步骤第1.1.6和1.1.7得到的含己糖氧化酶的合并液用于以下鉴定实验：1.2.1.分子量测定
使用琼脂糖6KR 10/30柱的凝胶渗透色谱法于50mM磷酸钠缓冲液(pH＝6.4)中以0.5ml/分钟的流速测定纯化的原态己糖氧化酶的大小。铁蛋白(440kD)、过氧化氢酶(232kD)、醛缩酶(158kD)、牛血清白蛋白(67kD)和胰凝乳蛋白酶原(25kD)用作大小的标准。经测定，纯化己糖氧化酶的分子量为120±10kD。1.2.2.最适pH的测定
用于测定最适pH的检测混合物(终体积300μl)含有120μl不同pH值的0.1M磷酸钠/柠檬酸盐缓冲液的贮备溶液。将所有其它检测混合物组分溶于水中。于25℃下在稀释的贮备缓冲溶液中测定pH。
己糖氧化酶在pH 3到8内显示酶促活性，但在3.5至5.5的范围内最佳。1.2.3己糖氧化酶对葡萄糖和麦芽糖的K。
利用EZ-FIT曲线拟合微机程序(Perrella，F.W.，1988，分析生物化学，174：437-447)，将动力学数据拟合于公式V＝VmasS(Km+S)，其中Vmax是最大速度，S是底物浓度，Km为达到50％最大速率时之浓度(Michaelis常数)。
以酶的活性分别作为葡萄糖和麦芽糖的函数得到典型的双曲饱和曲线。葡萄糖Km计算值为2.7mM±0.7mM，麦芽糖的Km是43.7±5.6mM。实施例2从Chondrus criscus提取的己糖氧化酶的面团改进作用2.1.Chondrus criscus己糖氧化酶的纯化
在这一实验中，己糖氧化酶以下列方法制备：
从法国的布列塔尼海岸收集新鲜的Chondrus crispus材料。将材料冷冻干燥，随后被碾碎。将40g这种碾碎的材料悬浮在1000 m120mM的三乙醇胺缓冲液(pH＝7.3)中，在5℃下轻轻搅拌大约64小时，以2000×g离心10分钟。上清液通过GF/A和GF/C玻璃滤器过滤，随后通过45μm孔径滤器过滤以获得800ml具有相当于每克制剂为0.44单位的葡糖氧化酶活性的己糖氧化酶活性的滤液。活性的测定用以下方法进行。
将上清液施加于具有阴离子交换Q琼脂糖Big Beads(死体积120ml)的330ml床体积的色谱柱上。结合的蛋白质用在20mM TEA缓冲液(pH＝7.3)中含0-0.5M NaCl的梯度液洗脱，随后用在20mM TEA缓冲液中的1M NaCl洗脱，收集流出的级分，每级分9ml组分，用以下分析方法对己糖氧化酶活性进行分析。
合并具有己糖氧化酶活性的60-83级分(大约250ml)，经超滤法浓缩和脱盐后大约为25ml。向剩余物添加100 ml0.05 mM TEA，对其重复前步骤两次。形成的25ml的剩余物每克具有0.95葡糖氧化酶活性单位。2.2.葡萄糖氧化酶活性的测定定义：1葡糖氧化酶(GOD)单位相当于在特定条件下每分钟转化1μmole葡萄糖的酶量。此活性以每克酶制剂的单位数表示。
试剂：(i)缓冲液：20g Na2HPO4-2H2O溶解在900ml蒸馏水中，pH调整到6.5；(ii)染色试剂(贮备溶液)：200mg 2，6-二氯-苯酚-靛酚(西格马No.D-1878)在剧烈搅拌1小时下溶解在1000ml蒸馏水中；(iii)过氧化物酶(贮备溶液)：Boehringer Mannheim No.127 361，10,000单位溶解在10ml蒸馏水中，并添加4.2g硫酸铵；(iv)底物：在缓冲液中的10％w/v D-葡萄糖溶液，(v)标准酶；得自Amano的水化酶#1423。
分析原理和方法：葡萄糖被转化成葡萄糖酸和H2O2，之后H2O2被过氧化物酶转化成H2O和O2。产生的氧气将蓝色染料2，6-二氯-苯酚-靛酚氧化，使其变为紫色。经氧化的颜色于590nm进行分光光度测定，相对于标准，计算酶活性值。2.3.己糖氧化酶制剂对小麦面粉面团中的硫醇基团之间交联作用的影响
通过测量在面团中游离的硫醇基团的含量来研究己糖氧化酶制剂对硫醇基团之间的交联作用的影响，其中面团由1500克小麦面粉，400Brabender单位(BU)的水，90g酵母，20g蔗糖和20g盐混合，并在每千克面粉中分别添加0，100，250，875，1250单位上述己糖氧化酶制剂。基本依据Ellman(1958)比色法以及谷类化学杂志(1983，70，22-26)中所述的比色法进行测定。这一方法基于的原则是5.5′-联硫基-双(2-硝基苯甲酸)-(DTNB)与面团中硫醇基团进行反应形成深色的2-硝基-5-巯基-苯甲酸阴离子，可在412nm处由分光光度法测定。
假设在面团中的硫醇基团的量的相对变化由面团中硫醇基团和DTNB之间的反应引起的光密度(OD)的变化反映，获得了如下结果：
己糖氧化酶GOD单位/千克面粉   OD412
0                0.297
100              0.285
250              0.265
875              0.187
1250             0.138
这样，本实验显示OD明显减少，表明游离硫醇基团含量的减少与添加的己糖氧化酶活性的量成比例。2.4.添加己糖氧化酶对面团流变特性的改进
根据AACC方法54-10以延伸仪对对添加或不添加相当于每公斤面粉100单位己糖氧化酶活性的己糖氧化酶制剂的面团进行测定。不添加酶的面团作为对照组。
上述方法的原则是在面团形成之后，在30℃下分别放置45，90，135，180分钟后接受负载-延伸试验，使用能记录负载-延伸曲线的延伸仪进行试验，负载-延伸曲线指示当被拉伸时面团的抗物理变形性能。从这条曲线中能够计算出抗延伸性B(曲线的高度)和延伸性C(曲线的全长)。B/C比(D)是面粉面团的烘烤强度的指标。实验结果汇于下表2.1中。表2.1每千克面粉补充了100GOD单位己糖氧化酶(HOX)的面团的延伸仪测定试样    时间(分)   B      C    D＝B/C对照      45      230    180    1.3HOX       45      320    180    1.8对照      90      290    161    1.8HOX       90      450    148    3.0对照      135     290    167    1.7HOX       135     490    146    3.4对照      180     300    168    1.8HOX       180     500    154    3.2
从表中明显看出，添加己糖氧化酶(HOX)对面团的抗延伸性有改进，这由B值的增加指示出来。几乎达两倍的B/C比值明显反映出面粉的烘烤强度由于添加己糖氧化酶而显著提高。
在类似的实验中，每千克面粉加入100单位市售的葡糖氧化酶产品，以相同的方式测定上述参数，以未加酶的面团为对照组。实验结果如下表2.2所示：表2.2每千克面粉补充了100 GOD单位葡萄糖氧化酶(GOX)的面团的延伸仪测定试样    时间(分)  B     C    D＝B/C对照    45      240    180    1.3GOX     45      290    170    1.7对照    90      260    175    1.5GOX     90      360    156    2.3对照    135     270    171    1.6GOX     135     420    141    3.0当比较上述两种实验结果时，补充己糖氧化酶或补充葡糖氧化酶的面团与对照之间的差异显示己糖氧化酶比葡糖氧化酶有更强的加强效果。进而，相对葡萄糖氧化酶，添加己糖氧化酶的B/C比增加的更快，这一点清楚地表明，与葡糖氧化酶相比，己糖氧化酶赋予焙烤强度更有效(图1)。实施例3从Chondrus criscus提取的己糖氧化酶的面团改进效果
为了进行这一实验，从丹麦的Hirsholmene海岸收获新鲜的Chondruscrispus海草植物体。用两个不同的抽提方法分离己糖氧化酶，合并两种方法得到的物料用于下面的面团改进实验。3.1 Chondrus criscus I己糖氧化酶的纯化
新鲜的植物体954g用蒸馏水冲洗，用毛巾擦干并存储在液氮中。用韦林氏渗合器混合海藻，将1908 m10.1 M磷酸钠缓冲液、1M NaCl(pH6.8)添加到混合海藻中。在5℃持续搅拌4天提取混合物，随后在20,000×g下将混合物离心30分钟。
将形成的1910ml上清液(351.1U/ml)在B_chi旋转蒸发仪R110中于40℃下浓缩到440ml。浓缩液经硫酸铵盐析至25％。搅拌混合物30分钟，在47,000×g下离心20分钟。将上清液(395ml)以10mM三乙醇胺缓冲液(pH＝7.3)20升透析过夜，最后的体积为610ml(367.1U/ml)。
将上述610ml分两次施加于在20mM TEA缓冲液(pH＝7.3)中平衡过的130ml Q-琼脂糖FF的2.6×25cm柱。以平衡缓冲液洗柱，用在平衡缓冲液中含0到0.8M NaCl的梯度液800 ml洗脱结合蛋白质。洗脱液流速为每分钟4ml洗，收集流出级分，每级分12ml。收集具有己糖氧化酶活性的级分，合并至终体积为545ml(241.4U/ml)。3.2.Chondrus crispus II的己糖氧化酶的纯化
用蒸馏水冲洗1250g新鲜的植物体，用毛巾擦干并存储于液氮中。用韦林氏掺合器将海藻混合，随后添加2500ml的0.1M磷酸钠缓冲液、1MNaCl(pH＝6.8)。在5℃持续搅拌4天提取混合物，随后在20,000×g下将混合物离心30分钟。
形成的2200ml上清液(332.8U/ml)在B_chi旋转蒸发仪R110中于40℃下浓缩到445ml。浓缩液经硫酸铵盐析至25％。搅拌混合物30分钟，在47,000×g离心20分钟。弃去沉淀。将上清液(380ml)以10mM三乙醇胺缓冲液(pH＝7.3)20升透析过夜，最后的体积为850 ml(319.2U/ml)。
将上述850ml施加于20m MTEA缓冲液(pH＝7.3)中平衡过的130ml Q-琼脂糖FF 2.6×25cm柱。以平衡缓冲液洗柱，用在平衡缓冲液中含0到0.8M NaCl的梯度液800ml洗脱结合蛋白质。洗脱液流速为每分钟4ml，收集流出级分，每级分12ml。收集具有己糖氧化酶活性的级分，合并终体积为288ml。
上述步骤得到的存留液施加于具有185ml金属螯合琼脂糖FF(载有Ni2+)和在50mM磷酸钠、1M NaCl(pH＝7.4)中平衡过的2.6×31cm柱。用在平衡缓冲液中含0到35mM咪唑的740ml梯度液(pH＝4.7)洗脱结合蛋白质。洗脱液流速为2ml/分钟，收集流出的级分，每级分11ml。合并41-54级分(140ml，352.3 U/ml)。一些己糖氧化酶确实通过了柱。3.3.提取物的合并和浓缩
过柱的和从纯化II得来的140ml以及从纯化I得来的545ml合并成终体积为1120ml(303.6 U/ml)。将1120ml循环蒸发至210ml的体积，随后以10mM三乙醇胺缓冲液(pH＝7.3)20升透析过夜，最后的体积为207ml(1200.4U/ml)。3.3.1阴离子交换步骤
从上述步骤形成的存留液施加于在20mM三乙醇胺缓冲液(pH＝7.3)中平衡过的130ml Q-琼脂糖FF的2.6×25cm柱上。以平衡缓冲液洗柱，用在平衡缓冲液中含0到0.8M NaCl的梯度液800ml洗脱结合蛋白质。洗脱液流速为每分钟4ml，收集流出的级分，每级分12ml。收集并合并具有己糖氧化酶活性的(260m1764.1U/ml)30-50级分。3.3.2其它酶的活性
对上述合并的溶液进行以下酶的活性试验：过氧化氢酶，蛋白酶，木聚糖酶，α-和β-淀粉酶和脂酶。在溶液中没有发现这些酶的活性。3.4添加己糖氧化酶对面团流变特性的改进
由小麦面粉、水和盐制备面团，每公斤面粉分别添加0、72、216、360单位上述己糖氧化酶制剂。以没有添加酶的面团为对照组。此外，制备两种面团，其中每千克面粉分别添加216和360单位Gluzyme(一种葡糖氧化酶，可从丹麦的Novo Nordisk A/S买到)。
按照上述AACC法54-10的修改方法对面团进行延伸仪测量。实验结果汇于下面表3.1中。表3.1补充己糖氧化酶(HOX)或葡萄糖氧化酶(单位/千克面粉)的面团延伸仪测定结果试样               时    间B      C    D＝B/C
               (分)对照                45     250    158    1.6HOX72 U/千克        45     330    156    2.1HOX 216 U/千克      45     460    153    3.0HOX 360 U/千克      45     580    130    4.5Gluzyme 72 U/千克   45     350    159    2.2Gluzyme 216 U/千克  45     340    148    2.3Gluzyme 360 U/千克  45     480    157    3.1对照                90     290    164    1.8HOX 72 U/千克       90     470    145    3.2HOX 216 U/千克      90     650    142    4.6HOX 360 U/千克      90     870    116    7.5Gluzyme 72 U/千克   90     450    147    3.1Gluzyme 216 U/千克  90     480    138    3.5Gluzyme 360 U/千克  90     500    152    3.2对照                135    330    156    2.1HOX 72 U/千克       135    540    129    4.2HOX 216 U/千克      135    750    125    6.0HOX 360 U/千克      135    880    117    7.5Gluzyme 72 U/千克   135    510    136    3.8Gluzyme 216 U/千克  135    550    122    4.5Gluzyme 360 U/千克  135    560    121    4.6从表中明显看出明，添加己糖氧化酶(HOX)或葡萄糖氧化酶对面团的抗延伸性有改进，这由B值的增加指示出来。B/C比值的增加明显表示面粉的烘烤的强度由于酶的添加而显著提高。
己糖氧化酶比葡糖氧化酶有更强的加强作用也是明显的。此外，相对葡萄糖氧化酶而言，添加己糖氧化酶的B/C比增加得更快，这一点清楚的表明，与葡糖氧化酶相比，己糖氧化酶赋予焙烤强度更有效。实施例4从Chondrus crispus提取的己糖氧化酶的面团改进作用4.1.Chondrus crispus己糖氧化酶的纯化
在法国的布列塔尼海岸收集新鲜的Chondrus crispus材料。2285g新鲜的植物体以蒸馏水冲洗，以毛巾擦干并被存储在液氮中。用韦林氏掺合器将海藻混合，随后加入0.1M的磷酸钠缓冲液4570ml、1MNaCl(pH＝6.8)。混合物在5℃，持续用电磁搅拌器搅拌4天进行提取，随后在20,000×g下离心30分钟。
形成的4930ml上清液(624.4U/ml)在B_chi旋转蒸发仪R110中于40C下浓缩到1580ml。浓缩液经聚乙二醇(PEG)分级沉淀得3％(w/v)。搅拌混合物30分钟，在47,000×g离心30分钟，弃去沉淀。将1470ml(2118.7U/ml)上清液经PEG分级沉淀到24％。搅拌混合物30分钟，并在47,000×g离心30分钟，弃去上清液，将414.15g沉淀再悬浮在200ml 20mMTEA缓冲液(pH＝7.3)中，随后在5℃下以20升10mM TEA缓冲液(pH＝7.3)透析过夜。
透析之后的体积为650ml(2968.6 U/ml)。将悬浮液在20,000×g下离心30分钟。弃去沉淀，上清液以蒸馏水稀释成为3200ml。
将上述3200ml(829.9U/ml)施加于在20mMTEA缓冲液(pH＝7.3)中平衡过的1100ml Q-琼脂糖FF的10×14cm柱中。以平衡缓冲液洗柱，用在平衡缓冲液中含0到0.8M NaCl的梯度液15000ml洗脱结合蛋白质。洗脱液流速为每分钟50ml。一些己糖氧化酶确实通过了柱，收集之，体积为840ml。
用硅藻土处理840ml悬液，并浓缩至335ml(2693.3 U/ml)。
将上述335ml施加于3升Sephadex G25C 10×40cm脱盐柱。柱用20mMTEA缓冲液(pH＝7.3)平衡，以100ml/分钟的流速洗脱，收集970ml洗脱液。将洗脱液施加于在20mM TEA缓冲液(pH＝7.3)中平衡过的1100mlQ-琼脂糖FF的10×14cm 柱上。以平衡缓冲液洗涤柱，用在平衡缓冲液中含0到0.8MNaCl的梯度液15000ml洗脱结合蛋白质。洗脱液流速为50ml/分钟。己糖氧化酶确实通过了柱，收集之，体积为1035ml。
向上述洗脱液(1035ml)加入硫酸铵使终浓度为2M。将混合物分两次施加于在25mM磷酸钠缓冲液(pH＝6.3)和2M(NH4)2SO4中平衡过的200ml苯基琼脂糖凝胶HP的5×10cm柱。以平衡缓冲液洗柱，随后用在25mM的磷酸钠缓冲液中含2到0M的(NH4)2SO4梯度液5000ml以50ml/分的速度洗脱结合蛋白质。分别在第一和第二次中收集洗脱液500和29ml。合并具有己糖氧化酶活性的第一次中的级分5和第二次中的级分27-42，共1050ml(563.9 U/ml)。
上述合并液用3升SephadexG25C凝胶过滤柱脱盐。柱以20mM TEA缓冲液(pH 7.3)平衡并以100ml/分钟的速度洗脱，收集1,000ml洗脱液。
将1,000ml洗脱液浓缩成202ml(2310.2 U/ml)，将这一制剂用于下面的流变性能检验。4.2.添加己糖氧化酶对面团流变特性的改进
由小麦面粉、水和盐制备面团，每公斤面粉分别添加0、288、504、720单位的氧化还原酶制剂。以不添加酶的面团为对照。此外，两种面团分别添加288和504单位/千克面粉的Gluzyme(一种葡糖氧化酶，可从丹麦的Novo Nordisk A/S买到)。
按照上述AACC法54-10之修改方法对面团进行延伸仪测量。实验结果汇于下面表4.1中。表4.1补充己糖氧化酶(HOX)或葡萄糖氧化酶(单位/千克面粉)的面团的延伸仪测定结果样品             时  间    B    C  D＝B/C
               (分)对照                45    210  171  1.2HOX 288 U/千克      45    490  139  3.5HOX 504 U/千克      45    640  122  5.2HOX 720 U/千克      45    730  109  6.7Gluzyme 288 U/千克  45    350  165  2.1Gluzyme 504 U/千克  45    385  153  2.5Gluzyme 720 U/千克  45    435  148  2.9对照                90    275  182  1.5HOX 288 U/千克      90    710  130  5.5HOX 504 U/千克      90    825  106  7.8HOX 72 0 U/千克     90    905  107  8.5Gluzyme 288 U/千克  90    465  153  3.0Gluzyme 504 U/千克  90    515  135  3.8Gluzyme 720 U/千克  90    540  140  3.9对照                135   280  175  1.6HOX 288 U/千克      135   745  102  7.3HOX 504 U/千克      135   920  94   9.8HOX 720 U/千克      135        80Gluzyme 288 U/千克  135   525  129  4.1Gluzyme 504 U/千克  135   595  129  4.6Gluzyme 720 U/千克  135   630  121  5.2
从表中明显地看出，添加己糖氧化酶(HOX)或葡萄糖氧化酶面团的抗延伸性有改进，这由B值的增加指示出来。这也从B/C值的增加反映出来。
己糖氧化酶比葡糖氧化酶有更强的加强效果，两种酶的增强作用与所添加的酶量成比例，也是明显的。此外，相对葡萄糖氧化酶，添加己糖氧化酶的B/C比增加得更快，这一点清楚的表明，与葡糖氧化酶相比，己糖氧化酶赋予焙烤强度更有效。实施例5从Chondrus criscus提取的己糖氧化酶对面包比容的改进效果5.1 Chondrus crispus己糖氧化酶的纯化
从法国的布列塔尼海岸收集新鲜的Chondrus crispus材料。将2191g新鲜的植物体用蒸馏水冲洗，以毛巾擦燥并被存储在液氮中。用韦林氏掺合器将海藻混合，随后加入0.1M的磷酸钠缓冲液4382ml，1MNaCl(pH＝6.8)。持续以电磁搅拌器搅拌下，于5℃提取混合物4天，随后在20,000×g下离心20分钟。
将形成的4600ml上清液(746.1U/ml)在B_chi旋转蒸发仪R110中在40℃下浓缩到850ml。浓缩液经聚乙二醇分级沉淀得3％(w/v)。搅拌混合物30分钟，在20,000×g离心30分钟。弃去沉淀。将705ml(2489.8 U/ml)上清液经PEG分级沉淀得25％。搅拌混合物30分钟，并在20,000×g离心30分钟。弃去上清液，将341g沉淀再悬浮在225m120mM TEA缓冲液(pH＝7.3)中，该悬浮液500ml在3升SebhadexG25C 10×40cm脱盐柱上脱盐。柱用20mM TEA缓冲液(pH＝7.3)平衡，以100ml/分钟的流速洗脱，收集1605ml洗脱液。
向上述洗脱液(687.5 U/ml)中加入硫酸铵，使终浓度为2M。将混合物分两次施加于在25mM磷酸钠缓冲液(pH＝6.3)、2M(NH4)2SO4中平衡过的200ml苯基琼脂糖凝胶HP5×10cm柱。以平衡缓冲液洗柱，随后用在25mM磷酸钠缓冲液中含2到0M(NH4)2SO4的梯度液5000ml以50ml/分的速度洗脱结合蛋白质。收集流出的级分，每级分29ml。合并具有己糖氧化酶活性的第一次中的85-105级分和第二次中的36-69级分，共1485ml(194.7U/ml)。
上述合并液用Sephadex G25C凝胶过滤柱脱盐。柱以20mM TEA缓冲液(pH 7.3)平衡，并以100ml/分钟的速度洗脱，收集1,200ml洗脱液。
将1,200ml洗脱液浓缩成685ml(726.2 U/ml)，以此制剂用于下面的焙烤试验。5.2面团中添加己糖氧化酶对面包比容的改进
以1500g面粉、90g酵母、24g盐、24g食糖和400 BU水制备面团，每千克面粉分别添加0或108单位上述经纯化的己糖氧化酶和108单位Gluzyme(葡糖氧化酶在丹麦Novo Nordisk买到)。面团在Hobart混合器中混合2+9分钟(26℃下)，将其分为两部分，随后在加热箱中30℃静置10分钟，以Fortuna 3/17/7成型，在34℃和RH＝85％条件下醒发45分钟。醒发后的面团在Bago烤箱中用12sec.蒸汽在220℃下烘烤17分钟。
实验结果汇于下表5.1中：表5.1补充了己糖氧化酶或葡糖氧化酶(单位/千克面粉)的面团制得的面包比容的改进
                总体积  总重量   比容对照                 5325    1027    5.18己糖氧化酶108U/千克  6650    1036    6.41Gluzyme108U/千克    6075     1030    5.89
从上表可以明显看出，添加己糖氧化酶或葡糖氧化酶对重量基本相同的面团制的面包的总体积有增加作用。这反映在与没有加酶的焙烤的面包相比，比容的增加。
表中也可明显地看出，在相同用量下，己糖氧化酶比葡糖氧化酶对比容有更明显的增加效果。实施例6提纯的己糖氧化酶的鉴定
以上纯化的己糖氧化酶制剂鉴定己糖氧化酶。6.1.在非变性PAGE后对己糖氧化酶活性进行染色
按照制造厂商的指导(Novex，San Diego，USA)，用预制的8-16％的Tris-甘氨酸Novex凝胶以原态PAGE对己糖氧化酶活性进行分析。电泳后，凝胶在包含50mM磷酸钠缓冲液(pH＝6.0)、100mM葡萄糖、50mg/l吩嗪甲硫酸盐(西格马P9625)和250mg/l氮蓝四唑(西格马N6876)(如Witteveen，C.F.B.1993在博士论文中描述的″在黑曲霉中的葡糖酸盐形成和多元醇代谢)的溶液中温育，对凝胶进行己糖氧化酶活性染色。在大约30分钟后可看出呈彼此靠近的双色带的己糖氧化酶活性。当己糖氧化酶原态PAGE银染时，也看见相同的双色带。利用原态PAGE测定的纯化己糖氧化酶的分子量为144KD。将凝胶的一半银染，另一半为活性染色。所用的标准蛋白质为牛血清白蛋白(67 KD)，乳酸脱氢酶(140 kD)，过氧化氢酶(232 kD)，铁蛋白(440 kD)和甲状腺球蛋白(669 kD)。6.2利用SDS-PAGE测定分子量
分子量也可由以上描述的第一次施加于原态PAGE上的物质测定，在活性染色，将己糖氧化酶色带从凝胶中割离，然后按照制造厂商建议用Electro-Eluter(422型，Bio-Rad，CA，USA)进行电洗脱。将经电洗脱的蛋白质进行SDS-PAGE和银染色。这种物质在SDS-PAGE凝胶中约70 kDa处呈现“一条”双色带。因此经电洗脱的己糖氧化酶是两个亚单位的二聚体。6.3己糖氧化酶的pI的测定
含己糖氧化酶活性的试样按照制造商的推荐(Novex，San Diego，US)采用预制3-10IEF凝胶的等电点聚焦(IEF)法进行分析。在电泳后，一半的凝胶被银染，其另一半以氮蓝四唑染色(如6.1描述的)。
经染色的己糖氧化酶成为双色带。第一带的pI是4.79，第二带的pI是4.64。所用的标准为胰蛋白酶原(9.30)，小扁豆凝集素碱性带(8.65)，小扁豆凝集素中间带(8.45)，小扁豆凝集素酸性带(8.15)，马肌红蛋白酸性带(6.85)，人碳酸酐酶B(5.85)，β-乳球蛋白(5.20)，大豆胰蛋白酶抑制剂(3.50)和淀粉葡糖苷酶(3.50)。6.4测定己糖氧化酶对不同糖的Km
根据1.2.3所述，对7种不同的糖测定己糖氧化酶的Km。结果汇于表6.1中。表6.1测定己糖氧化酶的Km对不同糖底物        Km(mM)    CV(mM)D-葡萄糖      2.7     0.7D-半乳糖      3.6     1纤维素二糖    20.2    7.8麦芽糖        43.7    5.6乳糖          90.3    20.6木糖          102     26阿糖          531     158(CV＝变异系数)6.5己糖氧化酶肽序列的测定
将6.2中的电洗脱混合物50μl悬浮在450μl 0.1％的三氟乙酸(TFA)中。
为去掉Tris、甘氨酸和SDS，将上述混合物在反相HPLC上进行层析。形成的溶液分九次施加于在0.1％三氟乙酸中平衡过的4.6×30cm的Brownlee C2柱上。以平衡缓冲液洗柱，以0.7ml/分钟的流速用0.1％的TFA中含10至80％乙腈的14ml梯度液洗脱结合肽；收集含有酶最大峰值的级分，冷冻干燥之。6.5.1内切蛋白酶Lys-C消化
将形成的冻干酶溶解在50μl 8M尿素、0.4 M NH4HCO3(pH＝8.4)中。通过添加5μl 45mM二硫苏糖醇，并于50℃置于N2气氛中15分钟进行蛋白质的变性和还原。将溶液冷却到室温并加入5μl 100mM碘乙酰胺，在室温无光有N2的条件下，将半胱氨酸衍生化15分钟。其后，将溶液悬浮在135μl水中，于37℃在N2下，添加溶于5μl水中的5μg内切蛋白酶Lys-C进行消化24小时。于-20℃冷冻反应混合物以终止反应。6.5.2肽的反相HPLC分离
在VYDAC C18 0.46×15cm柱(The Separation Group，CA，美国)上以溶剂A(水中0.1％的TFA)和溶剂B(在乙腈中的0.1％的TFA)经反相HPLC分离形成的肽。6.5.3肽测序
按照制造商的说明，在应用生物系统476A测序仪(应用生物系统，CA，美国)上利用脉冲-液态快速循环进行测序。鉴定出具有以下氨基酸序列的肽：D P G Y I V I D V N A G T P D K P D P。

Claims (26)

1.一种改进面粉面团的流变性质和由该面团制得的成品品质的方法，该方法包括在面团成分、面团添加剂或面团中加入有效量的至少能够使麦芽糖氧化的氧化还原酶。
2.按照权利要求1的方法，其中氧化还原酶是己糖氧化酶。
3.按照权利要求2的方法，其中己糖氧化酶得自选自藻类品种、植物品种和微生物品种的来源。
4.按照权利要求3的方法，其中己糖氧化酶得自Chondrus crispus。
5.按照权利要求2的方法，其中己糖氧化酶的添加量范围是每千克面粉1至10,000单位。
6.按照权利要求5的方法，其中己糖氧化酶的添加量范围是每千克面粉10至1000单位。
7.按照权利要求1或2的方法，其中以AACC法54-10测定的抗延伸性(曲线的高度，B)和延伸性(曲线的长度，C)之比(即B/C比)来表示的面团的抗延伸展性，相对于不含氧化还原酶的其它类似面团增加至少10％。
8.按照权利要求1的方法，其中成品是面包。
9.按照权利要求1的方法，其中成品是面条制品。
10.按照权利要求1的方法，其中成品是营养面食制品。
11.按照权利要求1的方法，其中至少将一种其它酶添加到面团成分、面团添加剂或面团中。
12.按照权利要求11的方法，其中所说的其它酶选自纤维素酶、半纤维素酶、木聚糖酶、淀粉降解酶、葡糖氧化酶、脂酶和蛋白酶。
13.一种面团改进组合物，该组合物包含一种至少能够氧化麦芽糖的氧化还原酶，和至少一种其它面团成分或面团添加剂。
14.按照权利要求13的组合物，其中氧化还原酶得自选自藻类品种、植物品种和微生物品种的来源。
15.按照权利要求14的组合物，其中氧化还原酶是己糖氧化酶。
16.按照权利要求15的组合物，其中己糖氧化酶得自Chondruscrispus。
17.按照权利要求13的组合物，其是一种用于制备焙烤制品或者制备面条制品或营养面食制品的预混合物。
18.按照权利要求13的组合物，其包含选自乳化剂和亲水胶体的添加剂。
19.按照权利要求18的组合物，其中亲水胶体选自藻酸盐、角叉菜胶、果胶和植物胶。
20.一种制备焙烤食品的方法，该方法包括制备于其中添加了有效量的至少能够使麦芽糖氧化的氧化还原酶的面团并烘烤该面团。
21.按照权利要求20的方法，其中焙烤食品的比容与以不含氧化还原酶的面团制备的其它类似焙烤食品相比，有所增加。
22.按照权利要求21的方法，其中比容增加至少20％。
23.按照权利要求20的方法，其中将至少一种其它酶添加到面团中。
24.按照权利要求20的方法，其中所说的其它酶选自纤维素酶、半纤维素酶、木聚糖酶、淀粉降解酶、葡糖氧化酶、脂酶和蛋白酶。
25.按照权利要求20的方法，其中氧化还原酶是己糖氧化酶。
26.一种制备以面粉面团为基料的食品的方法，该方法包括向面团中加入有效量的氧化麦芽糖的氧化还原酶。
27.按照权利要求26的方法，其中氧化还原酶是己糖氧化酶。
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