JPS62118883A - リパ−ゼの生産方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、リパーゼを生産する微生物を培養してリパー
ゼを生産する際に、アミノ酸、またはアミノ酸およびペ
プチドを主成分とする基質を流加することによって培養
液中のアミノ酸濃度を低濃度に保ちながら培養し、リパ
ーゼを生産する微生物のリパーゼ生産能を高めることを
特徴とする、油脂エステル交換反応のような非水系の反
応を触媒するのに適したリパーゼの生産方法に関する。

ｒ従来技術〕 従来、油脂の加水分解を触媒する酵素であるリパーゼは
、その基質となる油脂が水に不溶であり、さらに反応が
不均一系で行なわれるために他の加水分解酵素、たとえ
ばアミラーゼ、プロテアーゼなどと比較してその研究は
著しく遅れている。

しかし一方、その特徴ある基質特異性のために実用的な
用途も数多い。たとえばＲｈｌｚｏｐｕｓｄｅｌｅｍａ
ｒのリパーゼは、そのトリグリセリドに対する位置特異
性によって油脂の構造決定など油脂化学、生化学分野の
研究に利用されており、また血中脂質（リポプロティン
）によく作用することから臨床診断試薬としての応用も
期待されている。さらにその脂肪酸特異性によって食品
加工面でも乳製品フレバー製造にも利用されている。ま
た斜上のようなリパーゼによる加水分解反応を応用した
ものの他に、その逆反応である合成反応を利用した化粧
品香料の合成、油脂エステル交換反応による油脂の高付
加価値変換など、工業的にもその用途は広い。

このように、酵素として利用用途の高いリパーゼは自然
界に広く分布しているが、酵素資源としての見地からは
動物臓器や植物種子を給源とするものは無尽蔵にうろこ
とができず、また水に抽出されにくく不安定であるとい
う難点を有しているので、工業的生産の立場からは微生
物起源のものにその給源を依存している。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明者らは油脂のエステル交換反応を触媒するリパー
ゼを生産する微生物の培養方法を検討する過程において
、リパーゼを生産する微生物を培養する培地には有機窒
素源が必要であり、また使用した有機窒素源の種類によ
ってリパーゼを生産する微生物によるリパーゼの生産性
、すなわちエステル交換能に差が生じることを見い出し
た。

本発明者らが鋭意研究を重ねた結果、斜上のごとく培養
に用いた有機窒素源の種類によってリパーゼの生産性が
変化する原因は、有機窒素源中に含まれるアミノ酸含量
、すなわち培養液中のアミノ酸濃度の違いに起因してい
ることが明らかになった。

リパーゼを生産する微生物、たとえばリゾプス属（Ｒｈ
ｉｚｏｐｕｓ）の耐熱性菌株であるリゾプス・キネンシ
ス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ　ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）の培養で
は、培地中に存在するアミノ酸はミカエル−メンテンの
式にしたがってその資化速度は変化する。

すなわち、培地中に存在するアミノ酸のうち、その濃度
の高いアミノ酸はその資化速度が大きくなる。これら資
化されるアミノ酸のうち、ロイシン、フェニルアラニン
、リジンおよびアルギニン以外のアミノ酸の資化速度が
大きい（培地中のアミノ酸濃度が大きい）ばあいには、
リパーゼを生産する微生物によるリパーゼの生成が阻害
されることが本発明者らによって見い出された。特にこ
れらリパーゼの生成を阻害するアミノ酸のうち、グルタ
ミン酸、プロリン、グリシン、アラニンおよびアスパラ
ギン°酸は、その資化速度が大きい（培地中のアミノ酸
濃度が大きい）ばあいには、リパーゼ生成に対する阻害
が著しい。

一方、ロイシン、フェニルアラニン、リジンおよびアル
ギニンのようなアミノ酸に関しては、その資化速度が大
きくても（培地中の濃度が大きくても）特に阻害作用は
認められず、中でもフェニルアラニンに関しては逆に促
進効果さえ認められることがわかった。

したがって、培地に有機窒素源を用いてリパーゼを生産
する・微生物を培養する際にリパーゼを生産する微生物
によるリパーゼの生産性を高めるには、有機窒素源中の
アミノ酸組成が重要となる。すなわち有機窒素源中のア
ミノ酸のうち、リパーゼ生成に阻害をおよぼすアミノ酸
、たとえばグルタミン酸、プロリン、アラニン、グリシ
ンおよびアスパラギン酸などはその含有量が小さいか、
たとえ含有量が大きくても遊離アミノ酸として存在せず
、ペプチドなどの形態をとっていることが望まれる。

しかし、一般に微生物の培養に用いられる有機窒素源、
たとえば酵母エキス、肉エキス、マルトエキスおよび蒸
留廃液濃縮物（ＤＯ３）などは斜上の要件を満たしてお
らず、グルタミン酸、アラニン、グリシンおよびプロリ
ンなどのようなリパーゼ生成に阻害をおよぼすアミノ酸
の含量が大きい。したがって、一般的な回分培養で斜上
の有機窒素源を使用しても微生物によるリパーゼの生産
性を高めることはできない。したがって回分培養におい
てリパーゼの生産性を高めるには天然蛋白源、たとえば
コーングルテンミール、血粉、フェザ−ミールまたは脱
脂大豆粕などを、適当な基質特異性を有するプロテアー
ゼ、たとえばパパイン、ペプシンまたはパンクレアチン
などで分解して斜上のようなリパーゼの生成を阻害する
アミノ酸をできるだけペプチドの形態をとった状態で分
解を停止させて有機窒素源を製造しなければならない。

しかし、リパーゼを生産する微生物の培養工程に新たに
斜上のような有機窒素源の製造工程を付加することは経
済的にも不利であり、リパーゼの生産コストの上昇につ
ながり望ましくない。

本発明は、リパーゼを生産する微生物の培養に用いる有
機窒素源の種類によらずにリパーゼの生産性を高める方
法であり、有機窒素源としては天然に存在する有機窒素
源、たとえば酵母エキス、肉エキス、マルトエキス、フ
ィシュソリュプルおよび蒸留廃液濃縮物（ＤＤＳ）など
を用いることができる。

つぎに、本発明をさらに詳しく説明する。

〔作　用〕

すでに述べたように、リパーゼを生産する微生物、たと
えばリゾプス属の耐熱性菌株であるリゾプス・キネンシ
スでは、アミノ酸の資化速度はミカエル−メンテンの式
にしたがうので、たとえばグルタミン酸、プロリン、グ
リシン、アラニンおよびアスパラギン酸などのようなリ
パーゼの生成に阻害作用をおよぼすアミノ酸の培地中の
濃度を低く保つことによりその資化速度は小さくなり、
阻害作用は解除される。本発明は、アミノ酸源を流加す
ることによって培地中のアミノ酸濃度を低く保ち、アミ
ノ酸の資化速度を小さくして微生物を培養することによ
ってリパーゼの生成を高める方法である。

本発明者らは、天然に存在する有機窒素源、たとえば酵
母エキス、肉エキス、マルトエキス、プロエキスＰ（大
豆粕とグルテンの加水分解物）、フィシュソリュプルお
よび蒸留廃液濃縮物（ＤＤＳ）などの種々の流加量と培
地中の各アミノ酸濃度およびリパーゼ生成の関係を検討
した結果、培地中のトータルアミノ酸濃度で５０００ｐ
ｐｍ以下になるような流加量で培養した時、はじめてリ
パーゼ活性が上昇し、リパーゼの生産性が急激に上昇す
ることを認めた。

また個々のアミノ酸についてみると、リパーゼ生成を阻
害するアミノ酸、すなわちロイシン、フェニルアラニン
、リジンおよびアルギニン以外のアミノ酸については、
その培地中での個々の濃度が１１０００ｐｐをこえると
リパーゼの生成が抑制され、特に阻害効果の著しいグル
タミン酸、プロリン、グリシン、アラニンおよびアスパ
ラギン酸については５ｏｏｐｐｍ以上になるとリパーゼ
の生成が抑制されることが認められた。したがって、こ
れらリパーゼ生成に阻害作用をおよぼすアミノ酸につい
てはその個々の培地中濃度が１１０００ｐｐ以下になる
ように、またグルタミン酸、プロリン、グリシン、アラ
ニンおよびアスパラギン酸については５００ｐｐｍ以下
になるように基質を流加することが望ましい。

さらに流加する基質中にアミノ酸またはベブ°チド以外
の成分、たとえば後述する如き炭素源などが多量に含ま
れていると、流加によってトータルアミノ酸濃度および
個々のアミノ酸濃度を斜上の範囲に保ってもアミノ酸や
ペプチドは炭素源の代謝のための窒素源として使われて
しまい、リパーゼ生成には有効に働かずリパーゼの生産
性を向上させることができない。したがって流加する基
質は、主成分としてアミノ酸、またはアミノ酸およびペ
プチドを４０％以上、さらに好ましくは６０％以上の含
毒で含んでいることが必須であり、炭素源となる基質中
の炭水化物、糖類、有機酸などは２０％以下、好ましく
は１０％以下であることが望ましい。

現在のところ、培地中の各アミノ酸濃度をオンラインで
検出できるセンサーは存在しない。

そこで斜上のようなアミノ酸レベルにコントロールする
具体的な方法としては、一定流量で基質を流加し、培養
のある時期以降に斜上のようなアミノ酸レベルを実現し
リパーゼの生産性を高める定流量流加法、および、あら
かじめ菌体濃度、流加量および培地中のアミノ酸濃度の
関係を求めておき、菌体の増殖カーブに対応して斜上の
アミノ酸レベルに保てるように流加量を変化させるプロ
グラム流加法がある。

また本発明に適用できる基質は前述のように主成分とし
てアミノ酸、またはアミノ酸およびペプチドを含んでい
るので、これらの資化に対応して培地中にはアンモニウ
ムイオンが発生する。したがって、このアンモニウムイ
オン濃度または発生速度をアンモニウムイオン電極を用
いて測定し、そのフィードバックにより流加量をコント
ロールして培地中のアミノ酸レベルをコントロールする
ことも可能である。

本発明に用いられるリパーゼを生産する微生物としては
リゾプス属（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）、アスペルギルス属（
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）　、ムコール属（Ｍｕｅｏｒ
）の微生物がある。

また本発明によって生産性を高められたリパーゼは、油
脂のエステル交換反応のような非水系の反応に対して特
に著しい活性の上昇を示した。

〔実施例〕

つぎに実施例を用いて、本発明をさらに詳しく説明する
が、本発明はもとよりかかる実施例のみに限定されるも
のではない。

実施例１ 有機窒素源として肉エキス（和光純薬■製、アミノ義金
ｆｉｔ４５％）を用いて、第１表に示す培地組成、ｐｌ
＋５．８　、温度３０℃、撹拌数４００ｒｐＨ％通気ｆ
ｌｉｌｋ　０．５ＶＶＭでリゾプス・キネンシス（Ｒｈ
ｉｚｏｐｕｓ　　ｃｈｌｎｅｎｓｉｓ）の回分培養およ
び定流量流加培養を行なった。

流加培養方法としては、あらかじめ無機塩およびオレイ
ン酸のみを含んだ培地３ｇに、前培養よりのリゾプス・
キネンシスを植菌し、肉エキス濃度１２０ｇ＃の流加基
質を１５ｃｃ／時のスピードで６７時間流加して培養し
、はぼ回分培養のばあいと同量の基質を供給した。培養
開始後１０時間ごとに培養液中の菌体をサンプリングし
、吸引濾過を行なって分離した。

えられた菌体を水道水で２回、ついで８０％アセトン水
溶液で２回洗浄したのち、常温で２４時間真空乾燥した
。このようにしてえられた乾燥菌体を用いて第２表に示
す反応系でエステル交換反応を行なった。えられたエス
テル交換反応率の比較を第１図に示す。第１図がらゎが
るように、定流量流加培養によってエステル交換反応率
は急激に上昇した。

第　　１　　表 第　　２　　表 実施例２ 実施例１の有機窒素源を酵母エキス（大五栄養■製、全
窒素ｌＯ〜１３％）にかえて、実施例１と同じ培地組成
および培養条件でアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒ
ｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｃｒ）の回分培養および流加培養
を行なった。

流加培養では、流加量を実施例１のような定流ｍ流加で
はなく、プログラム発生器を用いて流加量を第２図のよ
うな曲線にしたがって変化させるプログラム制御を行な
った。他の流加培養の手順は、実施例１と同じであった
。

実施例１と同様にして調製した乾燥菌体のエステル交換
能を回分培養のばあいとプログラム制御流加培養のばあ
いとを比較して第３図に示した。培養初期よりプログラ
ム制御によって高いエステル交換反応率かえられた。

実施例３ 有機窒素源としてプロエキスＰ（播州調味料■製、アミ
ノ成金ｆｆ１８３％）を用いて、ムコール会ジャバニカ
ス（Ｍｕｃｏｒ　ｊａｖａｎｉｃｕｓ）の回分培養およ
び流加培垂を行なった。回分培養については実施例１と
同様に行ない、流加培養についてはアンモニウムイオン
電極を用いて培地中のアンモニウムイオン濃度を１１０
００ｐｐとなるようにｏｎ−ｏｆｆ’コントロールして
基質を流加した。実施例１と同様にして調製した乾燥菌
体のエステル交換能を第４図に比較して示す。

アンモニウムイオン濃度を指標として流加することよっ
てリパーゼの生産性を高めることができた。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例１において回分培養および定流量流加培
養したばあいの培養時間とエステル交換反応率の関係を
示すグラフ、第２図は実施例２の流加培養においてプロ
グラム発生器を用いて調節した流加量と培養時間の関係
を示すグラフ、第３図は実施例２において回分培養およ
びプログラム制御流加培養したばあいの培養時間とエス
テル交換反応率の関係を示すグラフ、第４図は実施例３
において回分培養および流加培養したばあいの培養時間
とエステル交換反応率の関係を示すグラフをそれぞれあ
られす。 培養時間（ｈｒ） 、Ｔ２図 培養時間（ｈｒ）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　リパーゼを生産する微生物を培養する際に、アミノ
   酸、またはアミノ酸およびペプチドを主成分とする基質
   を流加することによって培養液中のアミノ酸濃度を低濃
   度に保ちながら培養し、リパーゼを生産する微生物のリ
   パーゼ生産能を高めることを特徴とするリパーゼの生産
   方法。 ２　リパーゼを生産する微生物がリゾプス属（Ｒｈｉｚ
   ｏｐｕｓ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕ
   ｓ）またはムコール属（Ｍｕｃｏｒ）に属する微生物で
   ある特許請求の範囲第１項記載の生産方法。