PL184045B1 - Sposób polepszania reologicznych właściwości ciasta z mąki oraz jakości wytworzonego z ciasta wyrobu gotowego - Google Patents

Abstract

1. Sposób polepszania reologicznych wlasciwosci ciasta z maki oraz jakosci wytwo- rzonego z ciasta wyrobu gotowego, zwlaszcza chleba, makaronu lub ciasta spozywczego, przez dodawanie enzymu, znamienny tym, ze obejmuje dodawanie do skladników ciasta, do dodatków do ciasta lub do samego ciasta, skutecznej ilosci oksydazy heksozowej jako dodawanego enzymu, w zakresie od 1 do 10000 jednostek na kg maki, zdolnej co najmniej do utleniania maltozy. PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób polepszania reologicznych właściwości ciasta z mąki oraz jakości wytworzonego z ciasta wyrobu gotowego, zwłaszcza chleba, makaronu lub ciasta spożywczego, przez dodawanie enzymu, charakteryzujący się tym, że obejmuje dodawanie do składników ciasta, do dodatków do ciasta lub do samego ciasta, skutecznej ilości oksydazy heksozowej jako dodawanego enzymu, w zakresie od 1 do 10000 jednostek na kg mąki, zdolnej co najmniej do utleniania maltozy.

W sposobie korzystnie oksydazę heksozową dodaje się w ilości mieszczącej się w zakresie od 5 do 5000 jednostek na kilogram mąki.

W sposobie korzystnie oksydazę heksozową dodaje się w ilości mieszczącej się w zakresie od 10 do 10000 jednostek na kilogram mąki.

W sposobie korzystnie oksydazę heksozową dodaje się w ilości mieszczącej się w zakresie od 10 do 1000 jednostek na kilogram mąki.

W sposobie korzystnie do składników ciasta, do dodatków do ciasta lub do samego ciasta dodaje się co najmniej jeden dodatkowy enzym, zwłaszcza jako dodatkowy enzym dodaje

184 045 się enzym wybrany z grupy obejmującej celulazę, hemicelulazę, ksylanazę, enzym rozkładający skrobię, oksydazę glukozową, lipazę i proteazę.

Zgodnie więc ze swą cechą znamienną. wynalazek dotyczy sposobu polepszania reologicznych właściwości ciasta z mąki, jak również polepszania jakości gotowego produktu wytworzonego z ciasta, polegającego na dodaniu do składników ciasta, do dodatków do ciasta lub do samego ciasta, w ilości skutecznej, oksydoreduktazy, która jest, co najmniej, zdolna do utleniania maltozy, takiej jak, na przykład oksydaza heksozowa.

W opisie wynalazku przedstawiono także kompozycję polepszającą jakość produktów piekarniczych otrzymanych z ciasta, zawierającą oksydoreduktazę, która jest, co najmniej, zdolna do utleniania maltozy, oraz co najmniej jeden dalszy składnik ciasta lub dodatek do ciasta.

W opisie przedstawiono sposób wytwarzania produktu piekarniczego, obejmujący sporządzenie z mąki ciasta z dodaniem, w ilości skutecznej, oksydoreduktazy, która jest co najmniej zdolna do utleniania maltozy, a następnie wypieczenie ciasta, a także sposób wytwarzania produktu spożywczego na bazie ciasta, obejmujący dodanie do ciasta, w ilości skutecznej, oksydoreduktazy utleniającej maltozę.

Sposób według niniejszego wynalazku jest to sposób polepszania reologicznych właściwości ciasta z mąki. Sposób ten obejmuje, jak o tym wspomniano w powyższej części niniejszego opisu, dodanie, w ilości skutecznej, oksydoreduktazy utleniającej maltozę, albo do składnika wymienionego w recepturze ciasta, albo do samego ciasta sporządzonego ze zmieszania wszystkich przewidzianych recepturą składników. W kontekście niniejszego opisu, termin „ilość skuteczna” stosowany jest w celu zaznaczenia, że dana ilość wystarcza do nadania ciastu i/lub wyrobowi gotowemu polepszonych właściwości, zdefiniowanych w niniejszym opisie.

Zgodnie ze sposobem według wynalazku, jako oksydoreduktazę stosuje się oksydazę heksozową. Oksydazę heksozową można, jak to opisane szczegółowo w niniejszym opisie, otrzymać z glonów morskich, należących do tych gatunków, w przypadku których dochodzi do wytwarzania tego enzymu. Gatunki takie spotyka się w obrębie rodziny (Gigartinaceae, należącej do rzędu Gigartinales. Do przykładowych, wytwarzających oksydazę heksozową. glonów z gatunków należących do rodziny Gigartinaceae należą Chondrus crispus i Iridophycus flaccidum. Potencjalnym źródłem oksydazy heksozowej są także glony z gatunków należących do rzędu Cryptomeniales, włącznie z glonami z rodzaju Euthora, a mianowicie glony Euthora cristata.

W przypadku wykorzystania takich naturalnych źródeł oksydazy heksozowej, enzym, typowo, wyodrębnia się z surowca glonowego za pomocą ekstrakcji przy użyciu wodnego środowiska ekstrakcyjnego. Jako surowca użyć można glonów świeżych, zebranych z obszaru morskiego, w którym one rosną. Do wyekstrahowania oksydazy heksozowej można też użyć surowca glonowego uzyskanego po wysuszeniu ich plech, na przykład po wysuszeniu na powietrzu, w temperaturze otoczenia, albo po wysuszeniu z zastosowaniem jakiejkolwiek innej przemysłowej metody suszenia, takiej jak suszenie z obiegiem ogrzanego powietrza lub liofilizacja. Dla ułatwienia przeprowadzenia następnego etapu procesu, a mianowicie ekstrakcji, świeży lub wysuszony surowiec można poddać proszkowaniu, na przykład za pomocą mielenia lub mieszania.

Jako odpowiednie wodne środowiska ekstrakcyjne korzystnie stosuje się roztwory buforowe, na przykład o pH znajdującym się w zakresie od 5 do 8, takie jak 0,1 M bufor z fosforanem sodowym, 20 mM bufor z dietanoloaminą lub 20 mM bufor Tris-HCl. Typowo, oksydaza heksozowa zostaje wyekstrahowana z surowca glonowego za pomocą zawieszenia tegoż surowca w buforze i przetrzymanie utworzonej zawiesiny w temperaturze mieszczącej się w zakresie od 0 do 20° C, takiej jak temperatura około 5°C, w okresie od 1 do 5 dni, korzystnie przy mieszaniu.

Następnie zawieszony surowiec glonowy oddziela się od środowiska wodnego z wykorzystaniem odpowiedniego sposobu oddzielania, takiego jak odsączenie, odsiewanie lub odwirowanie, po czym z otrzymanego przesączu lub supematantu odzyskuje się oksydazę hekso184 045 zową. Ewentualnie, oddzielony surowiec glonowy poddaje się jeszcze dalszej obróbce w jednym, lub więcej niż jednym etapie ekstrakcji.

Ponieważ szereg różnych glonów morskich zawiera barwne pigmenty, takie jak fikocyjaniny, może okazać się potrzebne poddanie otrzymanego przesączu lub supernatantu dalszej obróbce w etapie oczyszczania. W etapie tym wspomniane pigmenty zostają usunięte. Przykładowo można podać, że pigmenty te można usunąć za pomocą zadania przesączu lub supernatanta rozpuszczalnikiem organicznym, w którym pigmenty te są rozpuszczalne, z następującym potem oddzieleniem rozpuszczalnika, zawierającego rozpuszczone w nim pigmenty, od środowiska wodnego. Alternatywnie, pigmenty można usunąć za pomocą poddania przesączu lub supernatantu obróbce w etapie chromatografii z interakcją hydrofobową.

Odzyskania oksydazy heksozowej z wodnego środowiska ekstrakcyjnego dokonuje się z wykorzystaniem odpowiednich, typowych sposobów postępowania, umożliwiających wyodrębnianie białek ze środowiska wodnego. Do sposobów tych, których przykłady zostaną opisane szczegółowo w dalszej części niniejszego opisu, należą typowe metody wyodrębniania białek, takie jak chromatografia jonowowymienna, z ewentualnie następującym po niej etapem zatężania, takim jak etap ultrafiltracji. Możliwe jest także odzyskanie enzymu za pomocą wprowadzenia substancji takich jak, na przykład, (NH4)2S04 lub glikol polietylenowy (PEG), powodujących wytrącenie się białka, z następującym potem oddzieleniem osadu i ewentualnym poddaniem go dalszej obróbce w warunkach umożliwiających rozpuszczenie się białka.

Dla pewnych zastosowań oksydazy heksozowej pożądane jest dostarczenie enzymu w postaci zasadniczo czystej, na przykład w postaci preparatu enzymatycznego w zasadzie nie zawierającego innych białek lub zanieczyszczeń niebiałkowych. Zgodnie z tym wymogiem, względnie surowy preparat enzymu otrzymany w powyżej opisanych etapach ekstrakcji i wyodrębniania można poddać obróbce w dalszych etapach oczyszczania, takich jak następne etapy chromatografii, chromatografii żelowej lub chromatoogniskowania, jak to także zostanie opisane przykładowo w dalszej części niniejszego opisu.

W korzystnym wariancie realizacji sposobu według wynalazku, ciasto z mąki sporządza się za pomocą zmieszania mąki z wodą, środkiem rozpulchniającym, takim jak drożdże lub typowy chemiczny środek rozpulchniający, oraz użyta w ilości skutecznej oksydazą heksozową, z zachowaniem warunków zapewniających utworzenie się ciasta. Jednakże, wynalazek obejmuje swym zakresem również możliwość dodania do stanowiącej ciasto mieszaniny także i dalszych składników.

Typowo, do tego rodzaju dalszych składników ciasta należą składniki ciasta zwykle stosowane, takie jak sól, środek słodzący, taki jak różne cukry, syropy lub sztuczne środki słodzące, substancje lipidowe, włączając w to tłuszcz kuchenny, margarynę, masło lub olej zwierzęcy lub roślinny, albo jeden, lub większą ilość dodatków do ciasta, takich jak emulgatory, enzymy rozkładające skrobię, enzymy rozkładające celulozę lub hemicelulozę, proteazy, lipazy, niespecyficzne środku utleniające, takie jak środki powyżej wymienione, środki aromatyzujące, kultury bakterii kwasu mlekowego, witaminy, substancje mineralne, hydrokoloidy, takie jak alginiany, karageniny, pektyny, gumy roślinne, włącznie z gumą guar i gumą z drzewa świętojańskiego oraz spożywcze substancje włókniste.

Do typowych emulgatorów stosowanych przy sporządzaniu produktów z ciasta sporządzonego z mąki należą, przykładowo, monoglicerydy, estry kwasu diacetylowinowego z mono- i diglicerydami kwasów tłuszczowych i lecytyny, na przykład lecytyny otrzymane z soi. Spośród enzymów rozkładających skrobię, szczególnie użyteczne, jako dodatki poprawiające jakość ciasta, są amylazy. α-Amylaza powoduje rozkład skrobi do dekstryn, które w dalszym ciągu, w wyniku działania β-amylazy, ulegają rozkładowi do maltozy. Do innych użytecznych w tym przypadku enzymów rozkładających skrobię, które można włączyć w skład ciasta, należą glukoamylazy i pululanazy. W kontekście niniejszego wynalazku, dalszymi budzącymi zainteresowanie enzymami sąksylanazy i inne oksydoreduktazy, takie jak oksydaza glukozowa, oksydaza piranozowa i oksydaza tiolowa.

Mąką korzystną jest w tym przypadku mąka pszenna, ale bierze się ta pod uwagę także ciasta sporządzone z mąki pochodzącej ze zbóż innych gatunków, takiej jak mąka otrzymana z ryżu, kukurydzy, jęczmienia, żyta i durry.

184 045

Ciasta sporządza się przez zmieszanie ze sobą mąki, wody, oksydoreduktazy według wynalazku i innych możliwych składników i dodatków. Oksydoreduktazę można wprowadzić razem którymkolwiek ze składników ciasta, włączając w to wodę lub mieszaninę składników ciasta, albo razem z którymkolwiek z dodatków do ciasta lub z mieszaniną tych dodatków. Ciasto można sporządzić jakimkolwiek zwyczajnym sposobem otrzymywania ciasta, powszechnie stosowanym w przemyśle piekarniczym lub w jakimkolwiek innym przemyśle wytwarzającym produkty na bazie ciasta z mąki.

Oksydoreduktazę można wprowadzić w postaci preparatu płynnego, albo jako kompozycję w postaci suchego proszku, czy to złożoną wyłącznie z enzymu jako jedynego składnika aktywnego, czy też zawierającą enzym w mieszaninie z jednym, lub większą ilością składników ciasta lub dodatków do ciasta. Normalnie wprowadzana ilość enzymu, jako składnika ciasta, sianowi tę ilość, która w efekcie zapewnia obecność w gotowym cieście od 1 do 10000 jednostek enzymu/kg mąki, korzystnie od 5 do 5000 jednostek/kg, na przykład od 10 do 1000 jednostek/kg. W korzystnych wykonaniach niniejszego wynalazku, ilość ta mieści się w zakresie od 20 do 500 jednostek/kg mąki. W kontekście niniejszego wynalazku, jedna jednostka oksydoreduktazy odpowiada tej ilości enzymu, która w określonych warunkach zapewnia przekształcenie 1 umola glukozy/minutę. Aktywność ustalono jako ilość jednostek/g preparatu enzymatycznego.

Wpływ oksydoreduktazy na reologiczne właściwości ciasta można zmierzyć metodami standardowymi zgodnie z warunkami podanymi przez International Association of Cereal Chemistry (ICC) i American Association of Cereal Chemistry (AACC), włącznie z metodą amylograficzną (ICC 126), metodą farynograficzną (AACC 54-21) i metodą ekstensjograficzną (AACC 54-10). Metoda ekstensjograficzna umożliwia zmierzenie, na przykład, zdolności ciasta do zatrzymywania gazu wywiązującego się w wyniku czynności drożdży i zdolności do wytrzymywania próby. W rezultacie, metoda ekstensjograficzna umożliwia dokonanie pomiaru względnej siły ciasta. Ciasto silne wykazuje wyżej położoną (a w niektórych przypadkach, dłuższą) krzywą wykreślaną przez ekstensjograf, niż ma to miejsce w przypadku ciasta słabego. W metodzie AaCc 54-10 zdefiniowano ekstensjograf w sposób następujący: „ekstensjograf rejestruje krzywą obciążanie-rozciąganie testowanego kawałka ciasta, aż do jego przerwania. Charakterystykę krzywych obciążanie-rozciąganie lub ekstensjogramów wykorzystuje się do oceny ogólnej jakości mąki i jej odpowiedzi na obecność środków polepszających jakość”.

W korzystnym wariancie realizacji sposobu według wynalazku, opór ciasta na rozciąganie w sensie stosunku między opornością na rozciąganie (wysokość krzywej B) a rozciągliwością (długość krzywej C), to znaczy stosunek B/C według pomiaru przeprowadzonego zgodnie z metodą AACC 54-10, jest zwiększony co najmniej o 10% w porównaniu z wartością stosunku dla podobnego skądinąd ciasta, ale nie zawierającego oksydoreduktazy. W korzystniejszych wariantach realizacji sposobu według wynalazku, stosunek oporności do rozciągania jest większy co najmniej o 20%, na przykład co najmniej o 50%, a w szczególności co najmniej o 100%.

Sposób według wynalazku można stosować dla każdego typu ciasta z mąki w celu polepszenia jego właściwości reologicznych, a także w celu polepszenia jakości gotowego wyrobu wytworzonego z ciasta danego typu. Toteż, sposób ten jest szczególnie odpowiedni, gdy chodzi o wytwarzanie wyrobów w rodzaju zwykłego chleba, rozpulchnianych przez drożdże, a w tym wyrobów z rodzaju chleba wytwarzanych z mąki pszennej, takich jak bochenki i bułki. Jednakże, uważa się, że sposobem tym można także polepszyć właściwości ciasta, w przypadku którego do rozpulchnienia dochodzi w wyniku dodania chemicznych środków rozpulchniających, włączając w to produkty typu wypieków cukierniczych, takie jak produkty ciastkarskie, włączając w to, przykładowo, placki typu „pound cakes” i bułki zwane „muffins”, albo placuszki typu „scones”.

Zgodnie z jedną ze swych interesujących cech znamiennych, wynalazek można wykorzystać do polepszenia reologicznych właściwości ciasta przeznaczonego do wyrobu produktów typu klusek różnego rodzaju, włącznie z „kluskami białymi” (ang. „white noodles”) i „makaronem chińskim” (ang. „chinese noodles”), a także do polepszania jakości struktury

184 045 gotowego produktu w postaci rozmaitych klusek. Typowa podstawowa receptura przyjęta przy wytwarzaniu klusek różnego rodzaju przewiduje udział następujących składników: mąka pszenna 100 części, sól 0,5 części, woda 33 części. Kluski w sposób typowy wytwarza się za pomocą zmieszania składników w odpowiednim mieszalniku, po którym następuje rozwałkowanie ciasta na kluski przy użyciu odpowiedniej maszyny do wyrobu klusek, z utworzeniem wstęg ciasta, które następnie suszy się na powietrzu.

Jakość gotowych klusek różnego rodzaju ocenia się na podstawie ich barwy, jakości kulinarnej i struktury. Kluski powinny gotować się tak szybko, jak tylko jest to możliwe, pozostawać ścisłe po ugotowaniu i, korzystnie, nie powinny tracić jakichkolwiek części stałych do wody użytej do ich ugotowania. Przy podawaniu do stołu, kluski te, korzystnie, powinny mieć gładką i zwartą powierzchnię, nie wykazującą lepkości oraz zapewniać wrażenie jędmości przy gryzieniu a także przyjemne odczucie w ustach. Poza tym, jest rzeczą ważną, aby kluski miały jasną barwę.

Ponieważ odpowiedniość mąki pszennej, jeśli chodzi o otrzymywanie różnego rodzaju klusek o pożądanych właściwościach pod względem struktury i jakości kulinarnej, może się zmieniać w zależności od roku i terenów uprawowych, zazwyczaj dodaje się do ciasta substancje poprawiające jakość w celu zrekompensowania nieoptymalnej jakości mąki. Typowo, do tego rodzaju środków poprawiających jakość należą spożywcze substancje włókniste, białka roślinne, emulgatory i hydrokoloidy, takie jak, na przykład, alginiany, karageniny, pektyny, gumy roślinne, w tym guma guar i guma z drzewa świętojańskiego, oraz amylazy.

Usiłuje się wykorzystać oksydazę glukozową jako środek polepszający jakość klusek. Jednakże, jak o tym wspomniano w powyższej części niniejszego opisu, zawartość glukozy w mące pszennej może być tak niska, że enzym ten może okazać się nieskuteczny.

Dlatego też, ważną cechą znamienną niniejszego wynalazku jest to, że oksydoreduktaza według wynalazku jest użyteczna jako środek polepszający jakość różnego rodzaju klusek, ewentualnie w kombinacji z innymi składnikami jednocześnie stosowanymi w celu polepszenia jakości klusek. Tak więc, bierze się pod uwagę, że kluski wytworzone zgodnie z opisanym powyżej sposobem postępowania będą odznaczać się lepszymi właściwościami pod względem barwy, jakości kulinarnej (zarówno jeśli chodzi o gotowanie, jak i o spożywanie), włącznie ze ścisłą, elastyczną i pozbawioną tendencji do zlepiania się strukturą i konsystencją.

Zgodnie z następnym użytecznym wariantem realizacji wynalazku, ciastem sporządzonym sposobem według wynalazku jest ciasto przeznaczone do wytwarzania rozmaitych wyrobów makaronowych. Produkty takie, do których należą, na przykład, „spaghetti” i „maccaroni”, typowo wytwarza się z ciasta zawierającego jako zasadnicze składniki mąkę i jaja. Po zmieszaniu składników formuje się ciasto odpowiednio do danego typu wyrobu makaronowego, po czym suszy na powietrzu. Przyjmuje się, że wprowadzenie dodatku do ciasta przeznaczonego do produkcji wyrobów makaronowych wywrze działanie wyraźnie polepszające jego jakość pod względem rozciągliwości i stabilności, co z kolei doprowadzi do polepszenia jakości gotowych wyrobów makaronowych tak pod względem struktury, jak i właściwości kulinarnych.

W opisie wynalazku przedstawiono także polepszającą jakość ciasta kompozycję zawierającą oksydoreduktazę i co najmniej jeden dalszy składnik ciasta lub dodatek do ciasta.

Jako oksydoreduktazę stosuje się oksydazę heksozową. Dalszym składnikiem lub dodatkiem może być którykolwiek ze składników lub dodatków powyżej opisanych. Kompozycja może stanowić, dogodnie, preparat płynny zawierający oksydoreduktazę. Korzystnie, jednak, kompozycja ma postać preparatu suchego. Rozumie się, że poziom aktywności oksydoreduktazy w kompozycji zależeć będzie od typu i ilości dalszych składników lub dodatków. Jednakże, obecność aktywności oksydoreduktazy może wyrażać się zawartością, korzystnie, od 10 do 100000 jednostek, korzystnie od 100 do 50000 jednostek, na przykład od 1000 do 100000 jednostek, a w tym od 2000 do 5000 jednostek.

Ewentualnie, kompozycja może występować w postaci składnika kompletnej mieszaniny dodatków do ciasta, albo wstępnie przygotowanej mieszaniny typu przedmieszki, przeznaczonej do użycia przy wytwarzaniu konkretnego wyrobu gotowego i zawierającej całość suchych składników i dodatków do tego ciasta. W konkretnych wykonaniach, kompozycja może

184 045 okazać się szczególnie przydatna przy wytwarzaniu produktów piekarniczych, albo wyrobu typu klusek różnego rodzaju lub rozmaitych wyrobów makaronowych.

Jak wyżej wspomniano, wynalazek niniejszy dotyczy sposobu wytwarzania produktów piekarniczych, obejmującego włączenie do ciasta oksydoreduktazy, takiej jak na przykład, oksydaza heksozową. W szczególności, sposób ten daje dobre wyniki w przypadku produktów piekarniczych takich, jak produkty wymienione w powyższej części niniejszego opisu, których objętość właściwa jest zwiększona w porównaniu z podobnymi skądinąd produktami piekarniczymi wytworzonymi z ciasta nie zawierającego oksydoreduktazy. W kontekście niniejszego opisu wyrażenia „objętość właściwa” używa się do wskazania stosunku między objętością i masą produktu. Nieoczekiwanie stwierdzono, że postępując zgodnie z powyżej opisanym sposobem, można wyraźnie zwiększyć objętość właściwą, na przykład co najmniej o 10%, korzystnie co najmniej o 20%, a w tym co najmniej o 30%, korzystnie co najmniej o 40%, a korzystniej co najmniej o 50%.

W korzystnym wariancie realizacji sposobu według wynalazku, do ciasta wprowadza się co najmniej jeden dalszy enzym. Odpowiednimi enzymami są w takim przypadku, przykładowo, celulaza, hemicelulaza, ksylanaza, enzym rozkładający skrobię, oksydaza glukozowa, lipaza i proteaza.

Wynalazek objaśniają następujące przykłady, nie ograniczające zakresu wynalazku w jakikolwiek sposób.

Przykład 1

1.1. Wyodrębnianie oksydazy heksozowej z Chondrus crispus.

Preparat oczyszczonej oksydazy heksozowej otrzymano z zastosowaniem poniższych sposobów ekstrakcji i oczyszczania. W trakcie przeprowadzania tych operacji i następującego po tym charakteryzowania oczyszczonego enzymu stosowano następujący test służący określaniu aktywności oksydazy heksozowej:

1.1.1. Test aktywności oksydazy heksozowej

Test ten oparty był na metodzie opisanej przez. Sullivana i Ikawę [Biochimica et Biophysica Acta, 309, 11 - 22 (1973)], ale z modyfikacją umożliwiającą przeprowadzenie testu na płytkach do mikromiareczkowania. Mieszanina używana w teście miała skład następujący :

150 pl p-D-glukozy, (0,1 M w 0,1 M buforze z fosforanem sodowym, pH 6,3), 120 μ1 0,1 M buforu z fosforanem sodowym, pH 6,3, 10 μ1 dichlorowodorku o-dianizydyny (Sigma D-3252, 3,0 mg/ml w H2O), 10 μ1 peroksydazy (pOd) (Sigma P-8125, 0,1 ml w 0,1 M buforze z fosforanem sodowym, pH 6,3) i 10 pł roztworu enzymu (HOX). Próby ślepe sporządzono za pomocą wprowadzenia buforu zamiast roztworu enzymu.

Inkubację rozpoczynano przez dodanie glukozy. Po upływie 15 minut trwania inkubacji w temperaturze 25°C odczytano na czynniku ELISA wartość absorbancji przy 405 nm. Wykreślono krzywą standardową przy użyciu zmieniających się stężeń H2O2 w miejsce roztworu enzymu.

Reakcję można przedstawić w następujący sposób:

XOX β-D-glukoza + H9O + O2 — kwas glukonowy + H2O2 POD

H2O2 + o-dianizydyna_rej — 2 H2O + o-anizydynauti;

Utleniona o-anizydyna ma barwę żółtą, absorbującą przy 405 nm.

1.1.2. Ekstrakcja.

Świeże plechy Chondrus crispus zebrano we Francji, wzdłuż wybrzeży Bretanii. Ten świeży surowiec zhomogenizowano w młynie kołkowym (Alpine). Do 100 g próbki zhomogenizowanego surowca liściowego wprowadzono 300 ml 0,1 M buforu z fosforanem sodowym, pH 6,8. Następnie, otrzymaną mieszaninę poddano działaniu dźwięków w kąpieli sonifikacyjnej w ciągu 5 minut, po czym poddano ekstrakcji przy stałej szybkości mieszania, w ciągu 4 dni, w temperaturze 5°C. Następnie, mieszaninę wirowano przy 47000 x g w ciągu 20 minut.

184 045

300 ml otrzymanego w ten sposób przezroczystego supernatantu o barwie różowej poddano odsalaniu metodą ultrafiltracji przy użyciu aparatu do ultrafiltracji Amicon, wyposażonego w membranę ultrafiltracyjną Omega (z odcięciem przy masie cząsteczkowej wynoszącej 10 kD, Filtron).

1.1.3. Etap wymiany anionowej.

Płyn utrzymany, pochodzący z etapu 1.1.2, naniesiono na 5 x 10 cm kolumnę 200 ml Q-Sepharose FF, zrównoważoną 20 mM trietanoloaminą pH 7,3. Kolumnę przemyto buforem do równoważenia i przeprowadzono elucję oksydazy heksozowej przy użyciu 450 ml gradientu od 0 do 1 M NaCl w buforze do równoważenia. Kolumnę eluowano z szybkością przepływu wynoszącą 6 ml/minutę. Zbierano frakcje o objętości 14 ml. Frakcje 9-17 (łączna objętość 125 ml) połączono ze sobą i zatężono metodą ultrafiltracji przy użyciu aparatu Amicon 8400 wyposażonego w membranę ultrufiltrucyjną Omegą (z odcięciem przy masie cząsteczkowej wynoszącej 10 kD, Filtron) do objętości 7,5 ml.

1.1.4. Chromatografia żelowa.

Na 2,6 x 60 cm kolumnę Superdex 200 do chromatografii żelowej, zrównoważoną 50 mM buforem z fosforanem sodowym, pH 6,4 naniesiono 7,5 ml otrzymanego jak wyżej płynu utrzymanego, po czym przeprowadzono elucję przy szybkości przepływu wynoszącej 1 ml/minutę. Zbierano frakcje o objętości 4 ml. Połączono ze sobą frakcje 17-28 (łączna objętość 50 ml) wykazujące obecność aktywności oksydazy heksozowej.

1.1.5. Chromutografiu z interakcją hydrofobową.

Do połączonych frakcji pochodzących z etapu chromatografii żelowej 1.1.4 wprowadzono siarczan amonowy do końcowego stężenia wynoszącego 2 M. Otrzymaną tak mieszaninę naniesiono na 1,6 x 16 cm kolumnę 32 ml Phenyl-Sepharose zrównoważoną 20 mM buforem z fosforanem sodowym, pH 6,3 i 2 M (NI l-tySO.;. Kolumnę przemyto buforem do równoważenia, po czym przeprowadzono elucję oksydazy heksozowej, przy szybkość przepływu wynoszącej 2 ml/minutę, z zastosowaniem 140 ml liniowego gradientu od 2 M do 0 M (NH4)2SO4 w 20 mM buforze z fosforanem sodowym. Zbierano frakcje o objętości 4 ml. Połączonej ze sobą frakcje 24 - 33, wykazujące obecność aktywności oksydazy heksozowej.

W dotychczasowym przebiegu procesu, enzymowi towarzyszy wspomniane powyżej różowe zabarwienie. Jednakże, zostaje ono oddzielone od oksydazy heksozowej właśnie w tym etapie oczyszczania.

1.1.6. Wymiana anionowa na kolumnie Mono Q.

Połączone frakcje pochodzące z powyżej opisanego etapu chromatografii, na Sepharose poddano odsalaniu metodą ultrafiltracji sposobem powyżej opisanym i na kolumnę Mono Q HR 5/5, zrównoważoną 20 mM trietunolouminą, pH 7,3, naniesiono 2 ml produktu odsalania. Następnie kolumnę eluowano przy użyciu 45 ml liniowego gradientu od 0 do 0,65 M NaCl w buforze do równoważenia, przy szybkości przepływu wynoszącej 1,5 ml/minutę. Zbierano frakcje o objętości 1,5 ml. Frakcje 14- 26 połączono ze sobą.

1.1.7. Wymiana anioniowa na kolumnie Mono P.

Zawierające oksydazę heksozową połączone frakcje z powyższego etapu 1.1.6 naniesiono na kolumnę Mono P HR 5/5. zrównoważoną 20 mM buforem bis-Tris, pH 6,5. Enzym eluowano przy użyciu 45 ml liniowego gradientu od 0 do 0,65 M NaCl w buforze do równoważenia, przy szybkości przepływu wynoszącej 1,5 ml/min. Zbierano frakcje o objętości 0,75 ml. Najwyższy poziom aktywności oksydazy heksozowej stwierdzono we frakcji 12.

1.2. Charakterystyka oczyszczonej oksydazy heksozowej.

Do przeprowadzonych jak niżej eksperymentów nad scharakteryzowaniem oksydazy heksozowej użyto połączonych trakcji pochodzących z powyższych etapów 1.1.6 i 1.1.7.

1.2.1. Określenie masy cząsteczkowej.

Wielkość oczyszczonej natywnej oksydazy heksozowej określono metodą chromatografii żelowej permeacyjnej przy użyciu kolumny Superose 6 HR 10/30, przy szybkości przepływu wynoszącej 0,5 ml/minutę, w 50 mM buforze zawierającym fosforan sodowy, pH 6,4. Jako wzorców wielkości użyto ferrytyny (440 kD), katarzy (232 kD), aldolazy (158 kD), albuminy surowicy bydlęcej (67 kD) i chymotrypsynogenu (25 kD). Określona w ten sposób masa cząsteczkowa oczyszczonej oksydazy heksozowej wynosiła 120 ± 10 kD.

184 045

1.2.2. Określenie optimum pH.

Mieszaniny użyte do określenia optimum pH (objętość końcowa 300 pl) zawierały 120 μΐ 0,1 M roztworu podstawowego w postaci układu: bufor z fosforanem sodowym/bufor cytrynianowy, o różnych wartościach pH. Wszystkie inne składniki mieszaniny użytej do badań były rozpuszczone w wodzie. pH oznaczano w rozcieńczonych roztworach buforu podstawowego w temperaturze 25°C.

Oksydaza heksozowa wykazywała aktywność enzymatyczną w zakresie pH od 3 do 8, ale optimum pH dla tej aktywności mieści się w zakresie od 3,5 do 5,5.

1.2.3. K_m oksydazy heksozowej dla, odpowiednio, glukozy i maltozy.

Dane kinetyczne były dopasowane do:

V = VmaxS/ (K_m + S) w którym to wzorze Vmax oznacza prędkość maksymalną, S oznacza stężenie substratu, a Km oznacza stężenie substratu, przy którym szybkość reakcji równa się połowie szybkości maksymalnej (stała Michaelisa), przy użyciu programu minikomputerowego dopasowania krzywej EZ-FlT [F.W. Perrella, Analytical Biochemistry, 174, 437 - 447 (1988)].

Dla aktywności enzymu otrzymano typową hiperboliczną krzywą nasycenia, jako funkcję, odpowiednio, glukozy i maltozy. Wartość Km obliczona dla glukozy wynosiła 2,7 mM ± 0,7 mM, a dla maltozy stwierdzono wartość Km wynoszącą43,7 ± 5,6 mM.

Przykład 2

Polepszające jakość ciasta działanie oksydazy heksozowej wyekstrahowanej z Chondrus crispus 2.1. Wyodrębnianie oksydazy heksozowej z Chondrus crispus.

Dla celów niniejszego eksperymentu oksydazę heksozową spreparowano w sposób następujący.

Surowiec, w postaci świeżych glonów Chondrus crispus, zebrano we Francji, u wybrzeży Bretanii. Surowiec ten zliofilizowano, a następnie zmielono. Sporządzono zawiesinę 40 g tego zmielonego materiału w 1000 ml 20 mM buforu z trietanoloaminą (TEA), pH 7,3, i pozostawiono ją na około 64 godziny, w temperaturze 5°C, przy łagodnym mieszaniu, po czym wirowano, przy 2000 x g, w ciągu 10 minut. Supernatant przesączono przez sączki szklane GF/A i GF/C, a następnie przesączono przez filtr o wielkości porów 45 μ im. z otrzymaniem 800 ml przesączu, stanowiącego preparat enzymatyczny o aktywności oksydazy heksozowej odpowiadającej aktywności oksydazy glukozowej wynoszącej 0,44 jednostki/g preparatu. Aktywność tę oznaczono z zastosowaniem poniższego sposobu postępowania.

Supernatant wprowadzono do kolumny chromatograficznej, o objętości złoża wynoszącej 330 ml, wypełnionej anionitem Q Sepharose Big Beads (objętość martwa 120 ml). Związane białka eluowano w ciągu 180 minut przy użyciu gradientu od 0 do 0,5 M NaCl w 20 mM buforze TEA, pH 7,3, a następnie 1 M NaCl w 20 mM buforze TEA. Zbierano frakcje o objętości 9 ml i poddawano je analizie pod względem aktywności oksydazy heksozowej, z zastosowaniem następującej metody analitycznej.

Frakcje 60 - 83, wykazujące obecność aktywności oksydazy heksozowej, połączono ze sobą (łączna objętość około 250 ml) i zatężono, a następnie odsolono metodą ultrafiltracji do objętości około 25 ml. Etap ten powtórzono dwukrotnie na utrzymanych płynach, do których dodano 100 ml 0,05 mM TEA. Utworzony tak utrzymany płyn, o objętości 25 ml, zawierał 0,95 jednostki aktywności oksydazy heksozowej/g.

2.2. Oznaczenie adtywmości oksydazy glukozowej.

Definicja: 1 jednostka oksydazy heksozowej (GOD) odpowiada tej ilości enzymu, która w określonych warunkach zapewnia przekształcenie 1 μι^σ^ glukozy/minutę. Aktywność tę ustala się jako ilość jednostek/gram preparatu enzymatycznego.

Odczynniki:

(i) Bufor : 20 g Na2HPO4 · 2 H2O rozpuszcza się w 900 ml wody destylowanej i pH doprowadza się do wartości 6,5;

(ii) Odczynnik barwiący (roztwór podstawowy): 200 mg 2,6-dichlorofenoloindofenolu (Sigma nr D-1878) rozpuszcza się, przy energicznym mieszaniu, w ciągu godziny, w 1000 ml wody destylowanej:

184 045 (iii) Peroksydazą (roztwór podstawowy) (Boehringer Mannheim nr 127 361): 10000 jednostek rozpuszcza się w 10 ml wody destylowanej, po czym dodaje się 4,2 g siarczanu amonowego;

(iv) Substrat: 10% wag/obj roztwór D-glukozy w buforze;

(v) Enzym wzorcowy : hydraza nr 1423 (z firmy Amano).

Zasada metody analitycznej i sposób postępowania:

Glukoza ulega przekształceniu w kwas glukonowy i H2O2, który jest następnie przekształcany, w wyniku działania peroksydazy, w H₂O i O₂. Powstający tlen utlenia błękitny barwnik, a mianowicie użyty jako odczynnik 2,6-dichlorofenoloindofenol, co powoduje zmianę jego barwy na purpurową. Powstałe w wyniku utlenienia zabarwienie mi przy się metodą spektrofotometryczną przy 590 nm i otrzymane wartości aktywności enzymatycznej przelicza się w stosunku do wartości otrzymanych dla wzorca.

2.3. Wpływ oddziaływania preparatu oksydazy heksozowej na poprzeczne sieciowanie między grupami tiolowymi w cieście sporządzonym z mąki pszennej.

Wpływ wywierany przez oksydazę heksozową na tworzenie poprzecznego sieciowania grup tiolowych badano za pomocą dokonywania pomiarów zawartości wolnych grup tiolowych w cieście sporządzonym z 1500 g mąki pszennej, 400 BU (Brabender Units) wody, 90 g drożdży, 20 g sacharozy i 20 g soli, do którego dodano, odpowiednio, po 0, 100, 250, 875 i 1250 jednostek powyższego preparatu oksydazy heksozowej/kg mąki. Pomiarów dokonywano zasadniczo zgodnie z wymogami kolorymetrycznej metody Ellmana (1958), jak to opisano także w Cereal Chemistry, 70, 22 - 26 (1983) . Metoda ta oparta jest na tej zasadzie, że kwas 5,5'-ditio-bis(2-nitrobenzoesowy) (DTNB) reaguje z grupami tiolowymi obecnymi w cieście, z utworzeniem silnie zabarwionego anionu kwasu 2-nitro-5-merkaptobenzoesowego, którego poziom mierzy się metodą spektrofotometryczną przy 412 nm.

Przyjmując, że względna zmiana ilości grup tiolowych w cieście zostaje odzwierciedlona zmianą gęstości optycznej (OD) będącą rezultatem reakcji zachodzącej w cieście między grupami tiolowymi a DTNB, otrzymano następujące wyniki:

Oksydaza heksozową	OD412
Jednostki GODfkg mąki
0	0,297
100	0,285
250	0,265
875	0,187
1250	0,138

Tak wiec, eksperyment ten wykazał wyraźne obniżenie się wartości OD, co wskazuje na zmniejszenie' się ilości wolnych grup tiolowych, proporcjonalnie do ilości wprowadzonych jednostek oksydazy heksozowej.

2.4, Polepszenie właściwości reologicznych ciasta przez dodanie oksydazy heksozowej.

Opisane powyżej ciasto poddano pomiarom ekstensjograficznym zgodnie z metodą AACC 54-10, przy dodaniu lub z pominięciem dodania preparatu oksydazy heksozowej w ilości odpowiadającej 100 jednostkom aktywności oksydazy heksozowej/kg mąki. Jako kontrola służyło ciasto, do którego nie dodano enzymu.

Zasada powyższej metody polega na tym, że ciasto, po uformowaniu i po okresie spoczynkowym wynoszącym, odpowiednio, 45, 90, 135 i 180 minut, w temperaturze 30° C, poddawane jest tostowi obciążanie-rozciąganie, z zastosowaniem ekstensjografu zdolnego do rejestrowania krzywej obciążanie-rozciąganie (ekstensjogram), wykazującej oporność ciasta na deformację fizyczną przy rozciąganiu. Z krzywej tej można obliczyć oporność na rozciąganie, B (wysokość krzywej) i rozciągliwość, C (całkowita długość krzywej). Wartość stosunku B/C (D) wskazuje na zdolność wypiekową ciasta z mąki.

Wyniki eksperymentu podsumowano w poniższej tabeli 2.1.

184 045

Tabela 2.1.

Pomiary ekstensjograficzne ciasta wzbogaconego dodatkiem 100 jednostek (GOD)oksydazy heksozowej (HOX)/kg mąki

Próbka	Czas (min)	B	C	D = B/C
Kontrola	45	230	180	1,3
HOX	45	320	180	1,8
Kontrola	90	290	161	1,8
HOX	90	450	148	3,0
Kontrola	135	290	167	1,7
HOX	135	490	146	3,4
Kontrola	180	300	168	1,8
HOX	180	500	154	3,2

Z danych zamieszczonych w powyższej tabeli widać jasno, że dodanie oksydazy heksozowej wywiera polepszający wpływ na oporność ciasta na rozciąganie, na co wskazują podwyższone wartości B. Odzwierciedla się to w niemal podwojeniu wielkości stosunku B/C, co stanowi wyraźną wskazówkę, że zdolność wypiekowa mąki uległa znaczącemu zwiększeniu w wyniku dodania oksydazy heksozowej.

W podobnym eksperymencie, wprowadzono 100 jednostek handlowego preparatu oksydazy glukozowej/kg mąki. Powyższe parametry zmierzono w taki sam jak wyżej sposób, przy użyciu jako kontroli ciasta bez dodatku enzymu. Wyniki tego eksperymentu przedstawiono w poniższej tabeli 2.2.

Tabela 2.2.

Pomiary ekstensjograficzne ciasta wzbogaconego dodatkiem 100 jednostek (GOD)oksydazy glukozowej (GOX)/kg mąki

Próbka	Czas (min)	B	C	D = B/C
Kontrolna	45	240	180	1,3
GOX	45	290	170	1,7
Kontrola	90	260	175	1,5
GOX	90	360	156	2,3
Kontrola	135	270	171	1,6
GOX	135	420	141	3,0

Gdy wyniki tych obu eksperymentów porówna się pod względem różnic między ciastem kontrolnym a ciastami wzbogaconymi dodatkiem oksydazy glukozowej lub oksydazy heksozowej, wtedy okazuje się, że oksydaza heksozową wywiera silniejsze działanie prowadzące do zwiększenia zdolności wypiekowej, niż czyni to oksydaza glukozowa. Poza tym, wartość stosunku B/C ulegała podwyższeniu szybciej w przypadku oksydazy heksozowej, niż w przypadku oksydazy glukozowej. Stanowi to oczywistą wskazówkę, że oksydaza heksozową powoduje zwiększenie zdolności wypiekowej w sposób bardziej skuteczny, niż czyni to oksydaza glukozowa (Fig. 1).

Przykład 3

Polepszające jakość ciasta działanie oksydazy heksozowej wyekstrahowanej z Chondrus crispus

Do eksperymentu tego zebrano świeże plechy wodorostu morskiego Chondrus crispus. Zbioru dokonano w Danii, wzdłuż wybrzeży Hirsholmene. Oksydazę heksozową wyodrębniono z zastosowaniem dwu różnych sposobów postępowania i uzyskane w ten sposób preparaty połączono z przeznaczeniem do wykorzystania w poniżej opisanym eksperymencie, dotyczącym poprawienia jakości ciasta.

184 045

3.1. Wyodrębnianie oksydazy heksozowej z Chondrus crispus (I).

Świeżo zebrane plechy, w ilości 954 g, przepłukano wodą destylowaną, po czym osuszono je przy użyciu ręcznika i przechowywano w ciekłym azocie. Następnie wodorost morski wymieszano w mieszalniku Waring, po czym do rozdrobnionego w ten sposób wodorostu morskiego dodano 1908 ml 0,1 M buforu z fosforanem sodowym, 1 M NaCl, pH 6,8. Następnie utworzoną w ten sposób mieszaninę poddano ekstrakcji, przy stałym mieszaniu, w ciągu 4 dni, w temperaturze 5°C, a potem wirowano, przy 20000 x g, w ciągu 30 minut.

Otrzymano w ten sposób 1910 ml supematantu (351,1 U/ml), który zatężono do objętości 440 ml, w temperaturze 40°C, w wyparce obrotowej Buchi Rotavapor R1 10. Otrzymany koncentrat poddano frakcjonowaniu przy użyciu siarczanu amonowego do 25%. Następnie mieszaninę mieszano w ciągu 30 minut, po czym wirowano, przy 47000 x g, w ciągu 20 minut. Otrzymano 395 ml supematantu, który poddano dializie przez noc, wobec 20 litrów 10 mM buforu z trietanoloaminą. (TEA), pil 7,3, do końcowej objętości 610 ml (367,1 U/ml).

Otrzymany jak wyżej płyn o objętości 610 ml naniesiono w dwu szarżach na 2,6 x 25 cm kolumnę 130 ml Q-Sepharose FF, zrównoważoną 20 mM buforu TEA, pH 7,3. Kolumnę przemyto buforem do równoważenia i związane białka eluowano przy użyciu 800 ml gradientu od 0 do 0,8 M NaCl w buforze do równoważenia. Kolumnę eluowano przy szybkości przepływu wynoszącej 4 ml/minutę. Zbierano frakcje o objętości 12 ml. Frakcje wykazujące obecność aktywności oksydazy heksozowej zebrano i połączono ze sobą, z otrzymaniem końcowej łącznej objętości 545 ml (241,4 U/ml).

3.2. Wyodrębnianie oksydazy heksozowej z Chondrus crispus (II).

Świeżo zebrane plechy, w ilości 1250 g, przepłukano wodą destylowaną, po czym osuszono je przy użyciu ręcznika i przechowywano w ciekłym azocie. Wodorost morski wymieszano w mieszalniku Waring, po czym do rozdrobnionego w ten sposób surowca dodano 2500 ml 0,1 M buforu z fosforanem sodowym, 1 M NaCl, pH 6,8. Otrzymaną tak mieszaninę poddano ekstrakcji, przy stałym mieszaniu, w ciągu 4 dni, w temperaturze 5°C, a następnie wirowano, przy 20000 x g, w ciągu 30 minut.

Otrzymano w ten sposób 2200 ml supematantu (332,8 U/ml), który zatężono do objętości 445 ml, w temperaturze 40°C, przy użyciu wyparki obrotowej Buchi Rotavapor RI 10. Otrzymany koncentrat poddano frakcjonowaniu przy użyciu siarczanu amonowego do 25%. Następnie mieszaninę mieszano w ciągu 30 minut i wirowano, przy 47000 x g, w ciągu 20 minut. Osad odrzucono, a 380 ml supematantu poddano dializie, przez noc, wobec 20 litrów 10 mM buforu TEA, pH 7,3, do końcowej objętości 850 ml (319,2 U/ml).

Otrzymany jak wyżej płyn o objętości 850 ml naniesiono na 2,6 x 25 cm kolumnę 130 ml Q-Sepharose FF, zrównoważoną 20 mM buforu TEA, pH 7,5. Kolumnę przemyto buforem do równoważenia i związane białka eluowano przy użyciu 800 ml gradientu od 0 do 0,8 M NaCl w buforze do równoważenia. Kolumnę eluowano przy szybkości przepływu wynoszącej 4 ml/minutę. Zbierano frakcje o objętości 12 ml. Frakcje wykazujące obecność aktywności oksydazy heksozowej zebrano i połączono ze sobą, z otrzymaniem końcowej łącznej objętości 288 ml.

Utrzymany płyn, otrzymany w powyższym etapie, naniesiono na 2,6 x 31 cm kolumnę ze 185 ml chelatującej Sepharose FV, naładowanej Ni²⁺, zrównoważoną 50 mM buforem z fosforanem sodowym, 1 M NaCl, pH 7,4. Związane białka eluowano przy użyciu 740 ml gradientu od 0 do 35 mM imidazolu, pH 4,7 w buforze do równoważenia. Kolumnę eluowano przy szybkości przepływu wynoszącej 2 ml/minutę. Zbierano frakcje o objętości 11 ml. Frakcje 41 - 54 połączono z otrzymaniem łącznej objętości 140 ml (352,3 U/ml). Pewna ilość oksydazy heksozowej przepłynęła przez kolumnę.

3.3. Połączenie ze sobą i zatężenie ekstraktów.

Powyższy przeciek, 140 ml preparatu wyodrębnionego sposobem II jak wyżej i 545 ml preparatu wyodrębnionego sposobem I jak wyżej połączono ze sobą, z otrzymaniem końcowej łącznej objętości 1120 ml (303,6 U/ml). Całość, o objętości 1120 ml, odparowano w wyparce obrotowej do objętości 210 ml i otrzymany koncentrat poddano dializie przez noc, wobec 20 litrów 10 mM buforu TEA, pH 7,3, do końcowej objętości 207 ml (1200,4 U/ml).

184 045

3.3.1. Etap wymiany anionowej.

Utrzymany płyn, otrzymany w powyższym etapie, naniesiono na 2,6 x 25 cm kolumnę 130 ml Q-Sepharose FF, zrównoważoną 20 mM trietanoloaminy, pH 7,3. Kolumnę przemyto buforem do równoważenia, po czym związane białko eluowano przy użyciu 800 ml gradientu od 0 do 0,8 M NaCl w buforze do równoważenia. Kolumnę eluowano przy szybkości przepływu wynoszącej 4 ml/minutę. Zbierano frakcje o objętości 12 ml. Frakcje 30 - 50 wykazujące aktywność oksydazy heksozowej zebrano i połączono ze sobą, z otrzymaniem łącznej objętości 260 ml (764,1 U/ml).

3.3.2. Aktywność innych enzymów.

Powyższy roztwór, powstały z połączenia wspomnianych frakcji, poddano badaniu pod względem wykazywania ubocznej aktywności innych enzymów, a mianowicie: katalazy, proteazy, ksylanazy, a- i β-amylazy oraz lipazy. Nie stwierdzono żadnej z tych aktywności w poddawanym, badaniu roztworze.

3.4. Polepszenie reologicznych właściwości ciasta przez dodanie oksydazy heksozowej.

Sporządzono ciasto z mąki pszennej, wody i soli, po czym dodano do niego, odpowiednio, 0, 72, 216 i 360 jednostek powyższego preparatu oksydazy heksozowej/kg mąki. Jako kontroli użyto ciasta, do którego nie dodano enzymu. Oprócz tego, sporządzono jeszcze dwa ciasta, do których dodano, odpowiednio, 216 i 360 jednostek preparatu Gluzyme/kg mąki (oksydaza glukozowa, dostępna ze spółki Novo Nordisk A/S, Dania).

Ciasta poddano pomiarom ekstensjograficznym zgodnie z modyfikacją powyżej wspomnianej metody AACC 54-10. Wyniki eksperymentu podsumowano w poniższej tabeli 3.1.

Tabela 3.1.

Pomiary ekstensjograficzne ciasta wzbogaconego oksydazą heksozową (HOX) lub oksydazą glukozową (jednostki/kg mąki)

Próbka	Czas (min)	B	C	D = B/C
Kontrola	45	250	158	1,6
HOX 72 U/kg	45	330	156	2,1
HOX 216 U/kg	45	460	153	3,0
HOX 360 U/kg	45	580	130	4,5
Gluzyme 72 U/kg	45	350	159	2,2
Gluzyme 216 U/kg	45	340	148	2,3
Gluzyme 360 U/kg	45	480	157	3,1
Kontrola	90	290	164	1,8
HOX 72 U/kg	90	470	145	3,2
HOX 216 U/kg	90	650	142	4,6
HOX 360 U/kg	90	870	116	7,5
Gluzyme 72 U/kg	90	450	147	3,1
Gluzyme 216 U/kg	90	480	138	3,5
Gluzyme 360 U/kg	90	500	152	3,2
Kontrola	135	330	156	2,1
HOX 72 U/kg	135	540	129	4,2
HOX 216 U/kg	135	750	125	6,0
HOX 360 U/kg	135	880	117	7,5
Gluzyme 72 U/kg	135	510	136	3,8
Gluzyme 216 U/kg	135	550	122	4,5
Gluzyme 360 U/kg	135	560	121	4,6

Z danych zamieszczonych w powyższej tabeli wynika w sposób oczywisty, że dodanie oksydazy heksozowej (HOX) łub oksydazy glukozowej doprowadzało w rezultacie do polepszenia oporności ciasta na rozciąganie, jak to wykazano przez wzrost wartości B. Odzwiercie184 045 dla się to podwyższeniem wartości stosunku B/C, co stanowi wyraźną wskazówkę, że zdolność wypiekowa mąki ulega znaczącemu zwiększeniu w wyniku dodania enzymów .

Również oczywistym faktem jest to, że oksydaza heksozową wywierała silniejsze działanie wzmacniające niż oksydaza glukozowa. Poza tym, wartość stosunku B/C zwiększała się szybciej w przypadku oksydazy heksozowej w porównaniu z oksydazą glukozową i stanowi to oczywistą wskazówkę, że oksydaza heksozową zapewnia wzmożenie zdolności wypiekowej w sposób bardziej skuteczny, niż czyni to oksydazą glukozowa.

Przykład 4

Polepszające jakość ciasta działanie oksydazy heksozowej wyekstrahowanej z Chondrus crispus

4.1. Wyodrębnianie oksydazy heksozowej z Chondrus crispus.

Świeżo plechy Chondrus crispus zebrano we Francji, wzdłuż wybrzeża Bretanii. Przepłukano w wodzie destylowanej 2285 g tego świeżego surowca, po czym osuszono go przy użyciu ręcznika i przechowywano w ciekłym azocie. Wodorost morski wymieszano w mieszalniku Waring, po czym do rozdrobnionego w ten sposób surowca dodano 4570 ml 0,1 M buforu z fosforanem sodowym, 1 M NaCl, pH 6,8. Utworzoną tak mieszaninę poddano ekstrakcji, przy stałym mieszaniu przy użyciu mieszadła magnetycznego, w ciągu 4 dni, w temperaturze 5°C, po czym wirowano, przy 20000 x g, w ciągu 30 minut.

Otrzymano 4930 ml supematantu (624,4 U/ml), który zatężono do objętości 1508 ml, w temperaturze 40°C, przy użyciu wyparki obrotowej Biichi Rotavapor RI 10. Otrzymany tak koncentrat poddano frakcjonowaniu przy użyciu glikolu polietylenowego do 3% (wag/obj). Otrzymaną mieszaninę mieszano w ciągu 30 minut i wirowano przy 47000 x g, w ciągu 30 minut. Osad odrzucono, a 1470 ml supematantu (2118,7 U/ml), poddano frakcjonowaniu przy użyciu PEG do 24%. Mieszaninę mieszano w ciągu 30 minut i wirowano, przy 47000 x g, w ciągu 30 minut. Supernatant odrzucono, a 414,15 g osadu zawieszono w 200 ml 20 mM buforu TEA, pH 7,3 i poddano dializie przez noc, w temperaturze 5°C, wobec 20 litrów 10 mM buforu TEA, pH 7,3.

Po zakończeniu dializy objętość wynosiła 650 ml (2968,6 U/ml). Zawiesinę wirowano, przy 20000 x g, w ciągu 30 minut, po czym osad odrzucono, a supernatant rozcieńczono do objętości 3200 ml wodą destylowaną..

Otrzymany jak wyżej produkt o objętości 3200 ml (829,9 U/ml) naniesiono na 10 x 14 cm kolumnę 1100 ml Q-Sepharose FF, zrównoważoną 20 mM buforem TEA, pH 7,3. Kolumnę przemyto buforem do równoważenia i związane białka eluowano przy użyciu 15000 ml gradientu od 0 do 0,8 M NaCl w buforze do równoważenia. Kolumnę eluowano przy szybkości przepływu wynoszącej 50 ml/minutę. Oksydaza heksozową przepływała przez kolumnę i zebrano 840 ml tego eluatu.

Do 840 ml zawiesiny wprowadzono ziemio okrzemkową i zawiesinę zatężono do 335 ml (2693,3 U/ml).

Otrzymaną jak wyżej mieszaninę o objętości 335 mi naniesiono na 3-litrową, 10 x 40 cm, kolumnę odsalającą Sephadex G25C. Kolumnę zrównoważono 20 mM buforu TEA, pH 3 i eluowano przy szybkości przepływu wynoszącej 100 ml/minutę. Zebrano 970 ml eluatu. Eluat ten naniesiono na 10 x 14 cm kolumnę z 1100 ml Q-Sepharose FF, zrównoważoną 20 mM TEA, pH 7,3. Kolumnę przemyto buforem do równoważenia i związane białka eluowano przy użyciu 15000 ml gradientu od 0 do 0,8 NaCl w buforze do równoważenia. Kolumnę eluowano przy szybkości przepływu wynoszącej 50 ml/min. Oksydaza heksozową przepłynęła przez kolumnę i zebrano 1035 ml tego eluatu.

Do powyższego eluatu o objętości 1035 ml wprowadzono siarczan amonowy do końcowego stężenia 2 M. Następnie utworzoną mieszaninę naniesiono w dwu szarżach na 5 x 10 cm kolumnę 200 ml Phenyl-Sepharose HP, zrównoważoną 25 mM buforu z fosforanem sodowym, pH 6,3, 2 M (NH^SC^. Kolumnę przemyto buforem do równoważenia, po czym związane białka eluowano, przy szybkości przepływu wynoszącej 50 ml/minutę, przy użyciu 5000 ml gradientu od 2 M do 0 M (NFD2SO4 w 25 mM buforze z fosforanem sodowym. Zbierano frakcje o objętości 500 ml i 29 ml z szarż, odpowiednio, 1 i 2. Frakcję 5 z szarży 1 i frakcje

184 045

27- 42 z szarży 2, wykazujące aktywność oksydazy heksozowej, połączono ze sobą, z otrzymaniem łącznej objętości 1050 ml (563,9 U/ml).

Powyższe połączone frakcje poddano odsalaniu na 3-litrowej kolumnie do chromatografii żelowej Sephadex G25C. Kolumnę zrównoważono 20 mM buforem TEA, pH 7,3 i eluowano, przy szybkości przepływu wynoszącej 100 ml/minutę. Zebrano w ten sposób 1000 ml eluatu.

Eluat ten, o objętości 1000 ml, zatężono do objętości 202 ml (2310,2 U/ml) i tak otrzymanego preparatu użyto do badań nad właściwościami reologicznymi.

4.2. Polepszenie właściwości reologicznych ciasta przez dodanie oksydazy heksozowej.

Sporządzono ciasto z mąki pszennej, wody i soli, po czym dodano, odpowiednio, 0, 288, 504 i 720 jednostek oksydoreduktazy (w postaci preparatu oksydazy heksozowej otrzymanego jak powyżej opisano)/kg mąki. Ciasto, do którego nie dodano enzymu, służyło jako kontrola. Oprócz tego, sporządzono jeszcze dwa ciasta, do których dodano, odpowiednio, 288 i 504 jednostek oksydoreduktazy/kg mąki, w postaci preparatu Gluzyme (oksydaza glikozowa dostępna ze spółki Novo Nordisk A/S, Dama).

Ciasta poddano pomiarom ekstensjograficznym zgodnie z modyfikacją metody AACC 54-10.

Wyniki eksperymentu podsumowano w poniższej tabeli 4.1.

Tabela 4.1.

Pomiary ekstensjograficzne ciasta wzbogaconego oksydazą heksozową (HOX) lub oksydazą glukozową (jednostki/kg mąki)

Próbka	Czas (min)	B	C	D = B/C
Kontrola	45	210	171	1,2
HOX 288 U/kg	45	490	139	3,5
HOX 504 U/kg	45	640	122	5,2
HOX 720 U/kg	45	730	109	6,7
Gluzyme 288 U/kg	45	350	165	2,1
Gluzyme 504 U/kg	45	385	153	2,5
Gluzyme 720 U/kg	45	435	148	2,9
Kontrola	90	275	182	1,5
HOX 288 U/kg	90	710	130	5,5
HOX 504 U/kg	90	825	106	7,8
HOX 720 U/kg	90	905	107	8,5
Gluzyme 288 U/kg	90	465	153	3,0
Gluzyme 504 U/kg	90	515	135	3,8
Gluzyme 720 U/kg	90	540	140	3,9
Kontrola	135	280	175	1,6
HOX 288 U/kg	135	745	102	7,3
HOX 504 U/kg	135	920	94	9,8
HOX 720 U/kg	135	-	80	-
Gluzyme 288 U/kg	135	525	129	4,1
Gluzyme 504 U/kg	135	595	129	4,6
Gluzyme 720 U/kg	135	630	121	5,2

Z danych zamieszczonych w powyższej tabeli wynika w sposób oczywisty, że dodanie oksydazy heksozowej (HOX) lub oksydazy glukozowej doprowadza w rezultacie do polepszenia oporności ciasta na rozciąganie, jak to wykazano przez, wzrost wartości B. Odzwierciedla się to podwyższeniem wartości stosunku B/C.

Również, oczywistym faktem jest to, że oksydaza heksozowa wywierała silniejsze działanie wzmacniające niż oksydaza glukozowa, przy czym skutek tego działania wzmacniającego obu

184 045 enzymów był proporcjonalny do ilości dodanego enzymu. Poza tym, wartość stosunku B/C zwiększała się szybciej w przypadku oksydazy heksozowej w porównaniu z oksydazą glukozową i stanowi to oczywistą wskazówkę, że oksydaza heksozową zapewnia wzmożenie zdolności wypiekowej w sposób bardziej skuteczny, niż czyni to oksydaza glukozowa.

Przykład 5

Działanie polepszające objętość właściwą chleba wywierane przez oksydazę heksozową wyekstrahowaną z Chondrus crispus.

5.1. Wyodrębnianie oksydazy heksozowej z Chondrus crispus.

Świeże plechy Chondrus crispus zebrano we Francji, wzdłuż wybrzeży Bretanii. Przepłukano wodą destylowaną 2191 g tego świeżego surowca i po osuszaniu ręcznikiem przechowywano go w ciekłym azocie. Wodorost morski wymieszano w mieszalniku Waming, po czym do rozdrobnionego w ten sposób surowca dodano 4382 ml 0,1 M buforu z fosforanem sodowym, 1 M NaCl, pH 6,8. Utworzoną tak mieszaninę poddano ekstrakcji, przy stałym mieszaniu z użyciem mieszadła magnetycznego, w ciągu 4 dni, w temperaturze 5°C, a następnie wirowano, przy 20000 x g, w ciągu 20 minut.

Otrzymany tak supernatant o objętości 4600 ml (746,1 U/ml) zatężono do objętości 850 ml, w temperaturze 40°C, przy użyciu wyparki obrotowej Buchi Rotavapor R110. Otrzymany koncentrat (3626,9 U/ml) poddano frakcjonowaniu przy użyciu glikolu polietylenowego do 3% (wag/obj). Otrzymaną mieszaninę mieszano w ciągu 30 minut i wirowano, przy 20000 x g, w ciągu 30 minut. Osad odrzucono, a 705 ml supematantu (2489,8 U/ml) poddano frakcjonowaniu przy użyciu glikolu polietylenowego do 25%. Mieszaninę mieszano w ciągu 30 minut i wirowano, przy 20000 x g, w ciągu 30 minut. Supernatant odrzucono, a 341 g osadu zawieszono w 225 ml 20 mM buforu TEA, pH 7,3. 500 ml utworzonej zawiesiny poddano odsalaniu na 3-litrowej, 10 x 40 cm, odsalającej kolumnie Sephadex G25C. Kolumnę zrównoważono 20 mM buforem TEA, pH 7,3 i eluowano przy szybkości przepływu wynoszącej 100 ml/minutę. Zebrano 1605 ml eluatu.

Do powyższego eluatu (687,5 U/ml) wprowadzono siarczan amonowy, do końcowego stężenia 2 M. Następnie mieszaninę tę naniesiono w dwu szarżach na 5 x 10 cm kolumnę 200 ml Phenyl-Sepharose HP, zrównoważoną 25 mM buforem z fosforanem sodowym, pH 6,3 i 2 M (NH4)2SC^4. Kolumnę przemyto buforem do równoważenia, po czym przeprowadzono elucję związanych białek, przy szybkości przepływu wynoszącej 50 ml/minutę, przy użyciu 5000 ml gradientu od 2 M do 0 M (NH4J2SO4 w 25 mM buforze z fosforanem sodowym. Zbierano frakcje o objętości 29 mi. Frakcje 85 - 105 z szarży 1 i frakcje 36 - 69 z szarży 2, wykazujące aktywność oksydazy heksozowej, połączono ze sobą, z otrzymaniem łącznej objętości 1485 ml (194,7 U/ml).

Powyższe połączone frakcje poddano odsalaniu na 3-litrowcj kolumnie do chromatografii żelowej Sephadex G25C, takiej samej, jakiej użyto w eksperymencie opisanym powyżej wp. 4.1. Kolumnę zrównoważono 20 mM buforem TEA, pH 7,3, po czym poddano elucji, przy szybkości przepływu wynoszącej 100 ml/minutę. Zebrano w ten sposób 1200 ml eluatu.

Powyższy eluat o objętości 1200 ml zatężono do objętości 685 ml (726,2 U/ml) i użyto do eksperymentów dotyczących wypiekania.

5.2. Polepszenie objętości właściwej chleba przez dodanie do ciasta oksydazy heksozowej.

Sporządzono ciasto z 1500 g mąki, 90 g drożdży, 24 g soli, 24 g cukru i 400 BU wody, po czym dodano do niego, odpowiednio, 0 lub 108 jednostek oksydazy heksozowej, wyodrębnionej sposobem powyżej opisanym, i 108 jednostek preparatu Gluzyme (oksydaza glukozowa dostępna z firmy Novo Nordisk, Dania)/kg mąki. Ciasto wymieszano przy użyciu mieszalnika Hobart w ciągu 2+9 minut, w temperaturze 26°C, po czym podzielono na dwie części i pozostawiono w spoczynku na 10 minut, w temperaturze 30°C, w szafkowej komorze grzejnej. Ciasto sfałdowano w urządzeniu Fortuna 3/17/7 i poddano sprawdzaniu w ciągu 45 minut, w temperaturze 34°C i przy wilgotności 85% RH. Następnie, tak sprawdzone ciasto pieczono w temperaturze 220° C w ciągu 17 minut, w piecu Bago (z wtryskiem pary trwającym 12 sekund).

Wyniki eksperymentu podsumowano w poniższej tabeli 5.1.

184 045

Tabela 5.1.

Polepszenie objętości właściwej chleba otrzymanego z ciasta wzbogaconego oksydazą heksozową lub oksydazą glukozową

	Objętość całkowita	Masa całkowita	Objętość właściwa
Kontrola	5325	1027	5,18
Oksydaza heksozową 108 U/kg	6650	1036	6,41
Gluzyme 108 U/kg	6075	1030	5,89

Z danych zamieszczonych w powyższej tabeli wynika w sposób oczywisty, że dodanie oksydazy heksozowej lub oksydazy glukozowej doprowadza w rezultacie do zwiększenia objętości całkowitej, przy utrzymaniu zasadniczo tej samej masy. Odzwierciedla się to podwyższeniem wartości objętości właściwej w porównaniu z wartością dla wypieczonego chleba, do którego nie dodano enzymów.

Jest również rzeczą oczywistą, że oksydaza heksozową wywiera znacząco większy wpływ na podwyższenie wartości objętości właściwej niż oksydaza glukozowa użyta w takiej samej dawce.

Przykład 6

Charakterystyka oczyszczonej oksydazy heksozowej

Preparatów otrzymanych w powyższych etapach wyodrębniania użyto do scharakteryzowania oksydazy heksozowej.

6.1. Barwienie na aktywność oksydazy heksozowej po przeprowadzeniu nie denaturującej elektroforezy w żelu poliakryloamidowym (PAGE).

Aktywność oksydazy heksozowej analizowano metodą natywnej PAGE przy użyciu uprzednio rozlanych żelów 8-16% Tris-glicyne Novex, zgodnie z instrukcjami wytwórcy (Novex, San Diego, USA). Po przeprowadzeniu elektroforezy, żele zabarwiono na aktywność oksydazy heksozowej za pomocą inkubowania żelu w roztworze zawierającym 50 mM bufor z fosforanem sodowym, pH 6,0, 100 mM glukozy, 50 mg/litr metylosiarczanu N-motylofenazoniowego (Sigma P9625) i 250 mg/litr błękitu nitrotetrazoliowego (Sigma N6876), tak, jak to opisał w swej pracy doktorskiej C.F.B. Witteveen: „Gluconate formation and polyol metabolism in Aspergillus niger”(1993). Po upływie około 30 minut, aktywność oksydazy heksozowej uwidoczniono jako podwójne pasmo, którego obie części położone były bardzo blisko siebie. Takie samo podwójne pasmo zaobserwowano w przypadku srebrowego barwienia natywnej PAGE oksydazy heksozowej. Masa cząsteczkowa oczyszczonej oksydazy heksozowej, oznaczona metodą natywnej PAGE, wynosiła 144 kD. Połowę żelu poddano barwieniu srebrowemu, a połowę zabarwiono na aktywność. Jako wzorców użyto albuminy surowicy bydlęcej (67 kD), dehydrogenazy mleczanowej (140 kD), katalazy (232 kD), ferrytyny (440 kD) i tyroglobuliny (669 kD).

6.2. Oznaczenie masy cząsteczkowej metodą SDS-PAGE.

Masę cząsteczkową oznaczono także z wykorzystaniem materiału, którego wpierw używano w metodzie natywnej PAGE, jak powyżej opisano, po wycięciu z żelu pasma użytego do barwienia na aktywność oksydazy heksozowej, z następującą po tym elektiro^ll^u^jjąprzy użyciu aparatu Electro-Eluter (model 422, Bio-Rad, CA, USA) zgodnie z zaleceniami wytwórcy. Białko wyizolowane metodą elektroelucji poddano SDS-PAGE i barwieniu srebrowemu. Materiał ten dał „jedno”, podwójne pasmo przy około 70 kD w żelach SDS-PAGE. Tak więc okazało się, że otrzymana metodą elektroelucji oksydaza heksozową jest dimerem złożonym z dwu podjednostek.

6.3. Oznaczenie wartości pi oksydazy heksozowej.

Próbki wykazujące obecność aktywności oksydazy heksozowej analizowano metodą ogniskowania izoelektrycznego (IEF) przy użyciu uprzednio rozlanego żelu 3-10 IEF zgodnie z zaleceniami wytwórcy (Novex, San Diego, USA). Po przeprowadzeniu elektroforezy, połowę żelu poddano barwieniu srebrowemu, a drugą połowę barwieniu z udziałem błękitu nitrotetrazoliowego, jak to powyżej opisano w p. 6.1.

Oksydaza heksozową barwiła się jako podwójne pasmo. Wartość pi dla pierwszego pasma wynosiła 4,79, a wartość pi dla drugiego pasma wynosiła 4,64. Jako wzorców użyto

184 045 trypsynogenu (9,30), pasma zasadowego lektyny z soczewicy (8,65), pasma pośredniego lektyny z soczewicy (8,45), pasma kwaśnego lektyny z soczewicy (8,15), pasma kwaśnego końskiej mioglobiny (6,85), ludzkiej anhydrazy karbonowej B (5,85), fi-llii^tfo^^ll^lbuliny A (5,20), inhibitora trypsyny z soi (4,55) i amyloglukozydazy (3,50).

6.4. Oznaczenie wartości K_m oksydazy heksozowej dla różnych cukrów.

Wartość K_m oksydazy heksozowej oznaczono dla siedmiu różnych cukrów, jak to powyżej opisano w p. 1.2.3. Otrzymane wyniki podsumowano w poniższej tabeli 6.1.

T a b e 1a 6.1.

Oznaczenie wartości Km oksydazy heksozowej dla różnych cukrów

Substrat	Km (mM)	CV (mM)
D-Glukoza	2,7	0,7
D-Galaktoza	3,6	1
Celobioza	20,2	7,8
Maltoza	43,7	5,6
Laktoza	90,3	20,6
Ksyloza	102	26
Arabinoza	531	158

(CV współczynnik zmienności)

6.5. Określenie sekwencji peptydów w oksydazie heksozowej.

μΐ mieszaniny otrzymanej po elektroelucji sposobem opisanym powyżej w p. 6.2 zawieszono w 450 μl 0,1% kwasu trifluorooctowego (TFA).

W celu usunięcia Tris, glicyny i SDS, powyższą mieszaninę poddano chromatografii metodą HPLC z odwróconymi lazami. Otrzymany roztwór naniesiono, w 9 szarżach, na 4,6 x 30 cm kolumnę Brownlee C2, zrównoważoną 0,1% TFA. Kolumnę przemyto buforem do równoważenia i związane peptydy eluowano przy użyciu 1 ml gradientu od 10 do 80% acetonitrylu w 0,1% TFA, przy szybkości przepływu wynoszącej 0,7 ml/min. Frakcje z najszerszego piku zawierające enzym zebrano i zliolilizowano.

6.5.1. Trawienie endoproteinaząLys-C.

Otrzymany jak wyżej zliofilizowany enzym rozpuszczono w 50 μΐ 8 M mocznika, 0,4 M NH4HCO3 pH 8,4. Denaturację i redukcję białka przeprowadzono za pomocą dodania 5 jtl 45 mM ditiotreitolu, pod warstwą azotu, w temperaturze 50°C, w ciągu 15 minut. Następnie roztwór schłodzono do temperatury pokojowej i dodano 5 μ1 100 mM jodoacetamidu. Tworzenie pochodnych cystein prowadzono, w ciągu 15 minut, w temperaturze pokojowej, bez dostępu światła, w atmosferze azotu. Następnie, roztwór zawieszono w 135 fil wody i przeprowadzono trawienie w temperaturze 37°C, w atmosferze azotu, w ciągu 24 godzin, przez wprowadzenie 5 pg endoproteinazy Lys-C rozpuszczonej w 5 μ l wody. Reakcję zakończono za pomocą zamrożenia omawianej mieszaniny w temperaturze -20°C.

6.5.1.2. Rozdzielenie peptydów metodą HPLC z odwróconymi fazami.

Otrzymane peptydy rozdzielono metodą HPLC z odwróconymi fazami na 0,46 x 15 cm kolumnie VYDAC Cl 8 (The Separation Group, CA, USA), przy użyciu jako rozpuszczalnika A 0,1% TFA w wodzie, a jako rozpuszczalnika B 0,1% TFA w acetonitrylu.

6.5.3. Sekwencjonowanie peptydu.

Sekwencjonowania dokonano przy użyciu sekwenatora Applied Biosystems 476A (Applied Biosystems, CA, USA), z zastosowaniem systemu „pulsed-liquid fast cycles” zgodnie z instrukcjami wytwórcy. Zidentyfikowano w ten sposób peptyd o przedstawionej poniżej sekwencji aminokwasów :

DPGYIYIDYNAGTPDKPDP.

184 045

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 60 egz

Cena 4.00 zł.

Wa r s za w a „ dnia 2004.02.13

URZĄD PATENTOWY R2Έ0 ZYP03P0LT TEJ P01..3KIEJ Zespó i Bada ń i o r ni a. .1 nop i' a w ny c h

A1. Nieρodległości 1S8 00-9 50 W a i- s z a w a

Znak: DR/ Pat 184045

T-42063/WJ

Witusowska Jadwiga PATPOL. Spółka z o.o. ul. Nowoursynowska 162 J Warszawa

POST A N 0 W I Ε N I £ i·'! a ρ o d s t a w i e a r t. 5 5 usta w y z d η i a 3 0 c z e r w c a 2000 r. Pr a w o

Pi Μ własności przemysłowej /Dz.U. Nr 49 z 2001 r„„ ροζ.508/. w związku ze stwierdzonymi błędami drukarskimi w opisie patentowym Nr. Pat 184045 Urząd Patentowy RP postanawia:

j . Sp rostować b i: ędy d i- u ka r s k i e w t reśc i op i s u na str..8 wiersz 12 od góry z sianowi tę ilość na sta now i tę i 1 ośćna s t i'·11 w i. e r s z 27 od góry z Połączonej na Połączono i wiersz 8 od dołu z trakcji na frakcji, na. str „13 w i e r sz 6 od do ł u z j es t tostowi. na j es t testowi oraz, na str„21 wiersz 22 od góry z odwróconymi lazami. na odwróconymi fazami”.

„Ogłosić w Wiadomościach Urzędu Patentowego „Nie publikować ponownie sprostowanego opisu patentowego

Na niniejsze postanowienie stronie służy wniosek o ponowne rozpatrzenie sprawy w Izbie Odwoławczej Urzędu Patentowego RP w terminie jednego miesiąca od dnia jego doręczenia

Claims (6)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób polepszania reologicznych właściwości ciasta z mąki oraz jakości wytworzonego z ciasta wyrobu gotowego, zwłaszcza chleba, makaronu lub ciasta spożywczego, przez dodawanie enzymu, znamienny tym, że obejmuje dodawanie do składników ciasta, do dodatków do ciasta lub do samego ciasta, skutecznej ilości oksydazy heksozowej jako dodawanego enzymu, w zakresie od 1 do 10000 jednostek na kg mąki, zdolnej co najmniej do utleniania maltozy.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że oksydazę heksozową dodaje się w ilości mieszczącej się w zakresie od 5 do 5000 jednostek na kilogram mąki.
3. 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że oksydazę heksozową dodaje się w ilości mieszczącej się w zakresie od 10 do 10000 jednostek na kilogram mąki.
4. 4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że oksydazę heksozową dodaje się w ilości mieszczącej się w zakresie od 10 do 1000 jednostek na kilogram mąki.
5. 5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że do składników ciasta, do dodatków do ciasta lub do samego ciasta dodaje się co najmniej jeden dodatkowy enzym.
6. 6. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że jako dodatkowy enzym dodaje się enzym wybrany z grupy obejmującej celulazę, hemicelulazę, ksylanazę, enzym rozkładający skrobię, oksydazę glukozową, lipazę i proteazę.

   Wynalazek dotyczy sposobu polepszania reologicznych właściwości ciasta z mąki oraz jakości wytworzonych z ciasta mącznych produktów spożywczych. W opisie przedstawiono także kompozycję zawierającą oksydoreduktazę utleniającą maltozę, zdolną do nadawania tych polepszonych właściwości ciastu i wytworzonym z niego gotowym produktom spożywczym, a to dzięki dodaniu tej kompozycji do ciasta jako jego składnika. Opis wynalazku przestawia także sposób wytwarzania ciasta i mącznych produktów spożywczych o polepszonej jakości.

   Opis wynalazku przedstawia, w szczególności, sposób wytwarzania z mąki ciasta odznaczającego się polepszonymi właściwościami reologicznymi, oraz produktów gotowych wytworzonych z takiego ciasta przez wypieczenie lub wysuszenie, odznaczających się polepszoną charakterystyką w odniesieniu do struktury, jakości kulinarnej i wvmiarowości.

   W związku z tym, „siła” lub „słabość” ciasta stanowi ważny aspekt procesów wytwarzania z ciasta gotowych mącznych produktów spożywczych, włączając w to wypiekanie. „Siła” lub „słabość” ciasta jest, w pierwszym rzędzie, określana przez zawartość białka w tym cieście, i w tym aspekcie ważnym czynnikiem jest, zwłaszcza, zawartość i jakość białka glutenowego. Mąki o niskiej zawartości białka określa się, na ogół, jako mąki słabe. Tak więc, spoista, rozciągliwa, gumowata masa, tworząca się w wyniku zmieszania ze sobą wody i słabej mąki będzie, po poddaniu jej naprężaniu, wykazywać rozciągliwość, lecz nie będzie ona powracać do pierwotnych rozmiarów po ustaniu naprężania.

   Mąki o wysokiej zawartości białka określa się, na ogół, jako mąki „silne” i masą utworzoną w wyniku zmieszania ze sobą takiej mąki i wody będzie mniej rozciągliwą od masy utworzonej z mąki słabej. A przy tym, naprężenie występujące w trakcie mieszania powróci do poprzedniego poziomu bez spowodowania, w znaczniejszym stopniu, rozerwania struktury, co zachodzi w przypadku masy ciasta utworzonego z mąki słabej. Na ogół, w większości zastosowań piekarniczych preferuje się mąkę silną, a to ze względu na lepsze właściwości reologiczne i manipulacyjne ciasta, a także z uwagi na wyższą jakość formy i struktury pro184 045 duktów gotowych, otrzymanych (przez wypieczenie lub wysuszenie) z ciasta sporządzonego z mąki silnej.

   Ciasto utworzone z mąki silnej jest, na ogół, bardziej stabilne. Stabilność ciasta jest jedną z najważniejszych charakterystycznych właściwości ciasta z mąki. Zgodnie z określeniem podanym przez American Association of Cereal Chemists (AACC) Method 36-01A, termin „stabilność” można zdefiniować jako „zakres czasu dla ciasta, w którym uzyskuje się pozytywną odpowiedź i tę właściwość swobodnie pozostawionego ciasta, dzięki której opiera się ono spłaszczeniu, pod wpływem swego własnego ciężaru, z upływem czasu”. Według tej samej metody, termin „odpowiedź” określa się jako „reakcję ciasta na działanie znanego i konkretnego bodźca, substancji lub zespołu warunków, zazwyczaj określanych jako pieczenie, w porównaniu z kontrolą”.

   W przemyśle piekarniczym i młynarskim znane jest stosowanie środków kondycjonujących ciasto w celu jego wzmocnienia. Tymi „kondycjonerami” ciasta są zazwyczaj niespecyficzne środki utleniające, takie jak jodany, nadtlenki, kwas askorbinowy, bromian potasowy i azodikarboamid. Dodaje się je do ciasta po to, aby uzyskać polepszenie zdolności wypiekowej mąki oraz w celu otrzymania ciasta o polepszonej zdolności do rozciągliwości, a dzięki temu posiadającego pożądaną siłę i stabilność. Mechanizm działania środków utleniających polega na tym, że przy utlenianiu zawierających grupy tiolowe białek obecnych w mące, w szczególności glutenu, dochodzi do powstawania wiązań disulfidowych, dzięki którym białko tworzy matrycę bardziej stabilną, a to z kolei prowadzi do lepszej jakości ciasta oraz do zwiększenia objętości i polepszenia porowatości miękiszu wyrobów wypiekanych.

   Oprócz tego, poza opisaną powyżej użytecznością kwasu askorbinowego/askorbinianu jako środka kondycjonującego ciasto, wynikającą z jego zdolności do utleniania, związki te mogą także działać jako substraty dla oksydoreduktazy, a mianowicie oksydazy askorbinianowej, ujawnionej w EP 0 682 116 Al. W obecności swego substratu, enzym ten przekształca kwas askorbinowy/askorbinian w kwas dehydroaskorbinowy i H2O2. W dotychczasowym stanie techniki nie zasugerowano, że oksydaza kwasu askorbinowego w obecności kwasu askorbinowego/askorbinianu może wywierać działanie środka kondycjonującego ciasto, ale przypuszczalnie jest to przypadek.

   Jednakże, stosowanie rozmaitych, aktualnie dostępnych środków utleniających albo spotyka się ze sprzeciwem konsumentów, albo nie jest dozwolone przez odnośne władze ustalające przepisy. W tej sytuacji, czyni się wysiłki do znalezienia alternatyw dla tych typowych dodatków do mąki i ciasta i w dotychczasowym stanie techniki sugerowano użycie w tym celu oksydazy glukozowej.

   I tak, w US 2783150 ujawniono dodanie do mąki oksydazy glukozowej w celu polepszenia siły ciasta i jego struktury oraz wyglądu wypieczonego chleba.

   W CA 2012723 ujawniono kompozycje polepszające jakość chleba, zawierające enzymy celulolityczne, takie jak ksylanazy, oraz oksydazę glukozową, przy czym ten ostatni enzym dodawany jest w celu osłabienia pewnych niekorzystnych oddziaływań enzymów celulolitycznych (zmniejszanie siły i kleistość ciasta). Ujawniono, że dla uzyskania dostatecznej aktywności oksydazy glukozowej potrzebne jest dodanie do ciasta glukozy.

   W JP-A-92-084848 zasugerowano użycie polepszającej jakość chleba kompozycji zawierającej oksydazę glukozową i lipazę.

   W EP-B1-321 811 ujawniono zastosowanie kompozycji enzymatycznej zawierającej oksydazę tiolową i oksydazę glukozową w celu polepszenia reologicznych właściwości ciasta. W tym pochodzącym z dotychczasowego stanu techniki dokumencie wspomniano, że użycie samej oksydazy glukozowej nie zapewnia uzyskania pomyślnego rezultatu.

   W EP-B1-338 452 ujawniono kompozycję enzymatyczną przeznaczoną do polepszania stabilności ciasta, która to kompozycja stanowi mieszaninę celulazy/hemicelulazy, oksydazy glukozowej oraz, ewentualnie, oksydazy tiolowej.

   Jednakże, użycie oksydazy glukozowej jako dodatku polepszającego jakość ciasta związane jest z pewnymi ograniczeniami. A mianowicie, enzym ten wymaga, jako substratu, glukozy obecnej w ilości dostatecznej do zapewnienia skuteczności jego działania w układzie stworzonym przez ciasto, podczas gdy, ogólnie, zawartość glukozy w mąkach zbożowych jest

   184 045 niska. Stąd też, brak glukozy w cieście, lub niski poziom zawartości glukozy w cieście, będzie stanowić czynnik ograniczający skuteczność działania oksydazy glukozowej jako środka polepszającego jakość ciasta.

   W przeciwieństwie do tego, zawartość maltozy w mąkach zbożowych jest, na ogół, wyraźnie wyższa od zawartości glukozy i zgodnie z tym, ciasto świeżo sporządzone zawierać będzie więcej maltozy niż glukozy. Toteż, w eksperymentach, w których dokonano analizy zawartości cukrów w supematantach zawiesin utworzonych z mąki pszennej i ciasta sporządzonego z mąki, z zawartością, oprócz tego, wody, drożdży, soli i sacharozy (jak to opisano w poniższym przykładzie 2.3) otrzymano następujące wartości (% wag w przeliczeniu na ciężar mąki):

   Mąka Ciasto Sacharoza 0,3 <0,01 Galaktoza 0,001 0,01 Glukoza 0,25 0,72 Maltoza 2,6 1,4 Fruktoza 0,08 0,67 Laktoza <00^1 <00)1

   Poza tym, zawartość maltozy utrzymuje się na względnie wysokim poziomie w cieście rozpulchnionym przy użyciu drożdży (ponieważ drożdże w pierwszym rzędzie zużywają glukozę) a nawet może uleć podwyższeniu w cieście, na przykład podczas sprawdzania, w wyniku działania enzymów rozkładających skrobię, takich jak β-amylaza, która jest nieodłącznie obecna w mące, albo jest dodawana do ciasta.

   Aczkolwiek w dotychczasowym stanie techniki poznano użyteczne, polepszające oddziaływanie oksydazy glukozowej na reologiczne właściwości ciasta przeznaczonego do produkcji chleba, a także na jakość odpowiednich wypieków, zdano sobie również sprawę z tego, że użycie tego enzymu połączone jest z szeregiem różnych wad. I tak, może okazać się konieczne dodanie do ciasta sacharozy lub glukozy, jako substratu, w celu uzyskania wystarczającego działania enzymu. Oprócz tego, oksydaza glukozowa użyta sama, a więc bez dodatku innych enzymów, nie zapewnia w sposób stały uzyskiwania pożądanego efektu, jeśli chodzi o polepszenie jakości ciasta lub chleba.

   Jednakże, obecnie stwierdzono, że dodanie do sporządzonego z mąki ciasta oksydoreduktazy zdolnej do utleniania maltozy, włączając w to oksydazę heksozową, jako jedynego środka kondycjonującego ciasto, a więc z pominięciem jednoczesnego wprowadzania substratu dla dodawanego enzymu, lub innych enzymów, prowadzi do zwiększonej oporności tegoż ciasta na rozerwania, gdy ciasto to poddaje się rozciąganiu. Oznacza to więc, że enzym ten nadaje ciastu sam z siebie zwiększoną siłę, dzięki czemu ciasto staje się mniej skłonne do deformacji pod wpływem działania czynników mechanicznych. Bierze się przy tym pod uwagę, że taki skutek dodania do ciasta oksydazy heksozowej jest wynikiem powstawania wiązań poprzecznych między grupami tiolowymi w zawierających siarkę aminokwasach obecnych w glutenie pszenicy, do czego dochodzi wtedy, gdy H2O2 tworzony przez enzym w cieście reaguje z grupami tiolowymi, które zostają w ten sposób utlenione.

   Oksydaza heksozową (oksydoreduktaza D-heksoza : tlen, EC 1.1.3.5) jest enzymem, który w obecności tlenu wykazuje zdolność utleniania D-glukozy, a także szeregu różnych innych cukrów redukujących, włączając w to maltozę, glukozę, laktozę, galaktozę, ksytozę, arabinozę i celobiozę, do odpowiadających im laktonów, z następującą po tym hydrolizą do odnośnych kwasów aldobionowych. Zgodnie z tym, oksydazy heksozowe tym różnią, się od oksydazy glukozowej (która może jedynie przekształcać D-glukozę), że oksydazy heksozowe są w stanie wykorzystywać substraty cukrowe w szerszym zakresie. Proces utleniania katalizowanego przez omawiany enzym można objaśnić w sposób następujący :

   184 045

   D-glukoza + O₂ — δ-D-glukonolakton + H₂O₂, albo

   D-galaktoza + 0₂ —► γ-D-galaktogalakton + H₂O₂.

   Oksydazę heksozową (w dalszej części niniejszego opisu nazywaną, skrótowo HOX) izoluje się z krasnorostów rozmaitych gatunków, takich jak Iridophycus flaccidum [Bean and Hassid, J. Biol. Chem., 218, 425 - 436 (1956)] i Chondrus crispus [Ikawa, Methods Enzymol., 89, 145 - 149 (1982)]. Poza tym wykazano, że także glony z gatunku Euthora cristata [Sullivan i in., Biochemica et Biophysica Acta, 309, 11 - 22 (1973)] wytwarzają HOX.

   Do innych potencjalnych źródeł oksydazy heksozowej według wynalazku należą drobnoustroje lub rośliny z gatunków rosnących na lądzie. I tak, jako przykładowy enzym pochodzący ze źródła roślinnego została ujawniona [Bean i in., Journal of Biological Chemistry, 236, 1235 - 1240 (1961)] oksydoreduktaza z owoców cytrusowych, zdolna do utleniania cukrów w szerokim zakresie, włączając w to D-glukozę, D-galaktozę, celobiozę, laktozę, maltozę, D-2-deoksyglukozę, D-mannozę, D-glikozaminę i D-ksylozę. Innym przykładem enzymu wykazującym aktywność oksydazy heksozowej jest układ enzymatyczny występujący w Malleomyces mallei, ujawniony przez. Dowlinga i in. [Journal of Bacteriology, 72, 555 - 560 (1956)].

   Doniesiono, że oksydaza heksozową wyodrębniona z powyżej wspomnianych źródeł naturalnych może znaleźć praktyczne zastosowanie przy wytwarzaniu pewnych produktów spożywczych, i tak, na przykład, wykazano, że oksydaza heksozową wyodrębniona z Iridophycus flaccidum jest zdolna do przekształcania laktozy w mleku, z wytworzeniem odpowiedniego kwasu aldobionoweqo. Stwierdzono również, że budzi ona szczególne zainteresowanie jako potencjalny środek zakwaszający mleko, na przykład jako środek zastępujący kwaszące kultury drobnoustrojów stosowane w tym przeznaczeniu [Rand, Journal ot Food Science, 37, 698 - 701 (1972)]. Z tego punktu widzenia, oksydazę heksozową wymieniono jako enzym bardziej interesujący niż oksydaza glukozowa, ponieważ ta ostatnia może przejawiać aktywność enzymatyczną, w mleku lub innych produktach spożywczych w ogóle nie zawierających glukozy, lub zawierających jedynie niewielką ilość glukozy, tylko wtedy, gdy zostanie dodana glukoza lub laktaza (enzym rozkładający laktozę, który przekształca laktozę w glukozę i galaktozę).

   Zdolność oksydoreduktaz, włącznie ze zdolnością oksydazy heksozowej, do wytwarzania nadtlenku wodoru wykorzystano także do polepszenia trwałości pewnych produktów spożywczych przy przechowywaniu. Są to, na przykład, takie produkty, jak sery, masło i soki owocowe, jak to ujawniono w JP-B-73/016612. Sugeruje się również potencjalną użyteczność oksydoreduktaz jako przeciwutleniaczy w produktach spożywczych.

   Jednakże, w niniejszym wynalazku zademonstrowano, że oksydaza heksozową jest wysoce użyteczna, jako środek kondycjonujący ciasto, przy wytwarzaniu produktów z ciasta sporządzonego z mąki, przy czym dotyczy to nie tylko wyrobów w rodzaju chleba, ale także i innych wyrobów wytwarzanych z ciasta sporządzonego z mąki, takich jak różnego rodzaju kluski i rozmaite wyroby makaronowe.