ES2198059T3

ES2198059T3 - Composicion que comprende un enzima que posee actividad galactosa oxidasa y su utilizacion.

Info

Publication number: ES2198059T3
Application number: ES98933577T
Authority: ES
Inventors: Xavier Rouau; Mette Schroder; Jorn Borch Soe
Original assignee: Danisco AS; Danisco US Inc
Current assignee: DuPont Nutrition Biosciences ApS; Danisco US Inc
Priority date: 1997-07-18
Filing date: 1998-07-16
Publication date: 2004-01-16
Anticipated expiration: 2018-07-16
Also published as: DE69814088D1; DE69814088T2; AU8334798A; EP0999752B1; DK0999752T3; ATE238673T1; WO1999003351A1; EP0999752A1

Abstract

Un compuesto que mejora la masa y el pan, y que incluye una enzima que presenta actividad de galactosa oxidasa y un sustrato oxidable para esta enzima, y/o una enzima que es capaz de convertir un compuesto, por ejemplo, un compuesto que contiene galactosa, en un sustrato para la enzima que presenta actividad de galactosa oxidasa.

Description

Composición que comprende un enzima que posee actividad galactosa oxidasa y su utilización.

Campo de la invención

La presente invención se refiere al ámbito de la mejora de las características reológicas de las masas de harina y de la calidad de los productos de pan cocidos.

Antecedentes técnicos y técnica anterior

En la industria de la cocción, constituye un objetivo importante proporcionar productos de pan que tengan una estructura blanda de la miga, un volumen específico alto y que no sean propensos a echarse a perder durante el tiempo de conservación deseable de los productos de pan recién elaborados.

Un requisito previo para la obtención de productos de pan que tengan tal deseada cualidad, es la provisión de una masa con características estructurales y reológicas apropiadas. Con relación a esto, la ``fuerza'' o ``debilidad'' de las masas constituye un aspecto importante de la fabricación de productos terminados farináceos a partir de las masas, incluyendo la cocción. La ``fuerza'' o ``debilidad'' de una masa de harina está determinada en principio por el contenido proteico de la harina y en particular, el contenido y la calidad de las proteínas del gluten constituyen un importante factor al respecto. Las harinas con un escaso contenido proteico están caracterizadas generalmente como ``débiles''. Así, la masa elástica, extensible y cohesiva que se forma mezclando agua y harina débil será habitualmente muy extensible cuando se someta a esfuerzo, pero cuando se elimine éste, no volverá a sus dimensiones originales.

Las harinas con un alto contenido proteico están caracterizadas generalmente como harinas ``fuertes'' y la masa formada mezclando tal harina y agua, será menos extensible que la masa formada a partir de una harina débil, y el esfuerzo que se aplique durante la mezcla, se restaurará sin interrupción en mayor grado que en el caso de una masa formada a partir de la harina débil.

La harina fuerte es generalmente preferida en la mayoría de contextos del cocido a causa de las propiedades reológicas superiores y de manejo de la masa, y de la forma superior y de las calidades de textura de los productos terminados secados o cocidos, fabricados a partir de la masa de harina fuerte.

En las industrias de la molienda y panadería, es conocida la utilización de ``acondicionadores'' de la masa para reforzarla. Tales acondicionadores de masa son normalmente agentes oxidantes no específicos tales como, por ejemplo, yodatos, peróxidos, ácido ascórbico, K-bromato o azodicarbonamida y se añaden a la masa con el objetivo de mejorar la realización de la cocción de la harina para obtener una masa con una capacidad de alargamiento mejorada y poseer, de este modo, la fuerza y estabilidad deseadas. El mecanismo que subyace a este efecto de los agentes oxidantes es que las proteínas de la harina, en particular el gluten, contienen grupos tioles que, cuando se oxidan, forman enlaces disulfuro por los que la proteína forma una matriz más estable dando lugar a una mejor calidad de la masa y una mejora en el volumen y estructura de la miga de los productos cocidos.

Sin embargo, la utilización de varios de los agentes oxidantes habitualmente disponibles es objetada por los consumidores o no es permitida por las disposiciones que la regulan y de acuerdo con esto, se han intentado encontrar alternativas a estos aditivos convencionales de la masa y de la harina y la técnica anterior ha sugerido, por ejemplo, la utilización de glucosa oxidasa con este propósito.

De este modo, la patente US nº 2.783.150 da a conocer la adición de glucosa oxidasa a la harina para mejorar la fuerza de la masa, textura y apariencia del pan cocido. El documento CA 2.012.723 da a conocer composiciones que mejoran el pan, y que comprenden enzimas celulolíticos tales como xilanasas y glucosa oxidasa, añadiéndose esta última para reducir ciertos efectos desventajosos de los enzimas celulolíticos (fuerza reducida de la masa y adherencia), exponiéndose también que la adición de glucosa a la masa, es necesaria para obtener una actividad glucosa oxidasa suficiente.

El documento EP-B1-321 811 da a conocer la utilización de una composición enzimática que comprende glucosa oxidasa y sulfhidril oxidasa combinadas para mejorar las características reológicas de la masa. Se menciona en este documento de la técnica anterior que la utilización de la glucosa oxidasa sola no ha tenido éxito.

En el documento EP-B1-338 452 se da a conocer una composición enzimática para la mejora de la estabilidad de la masa, que comprende una mezcla de celulasa/hemicelulasa, glucosa oxidasa y opcionalmente sulfhidril oxidasa.

Sin embargo, la utilización de glucosa oxidasa como un aditivo que mejora la masa está limitada porque este enzima necesita la presencia de cantidades suficientes de glucosa como substrato con objeto de ser efectivo en un sistema de masa y generalmente, el contenido de glucosa en las harinas de cereal, es bajo. Por tanto, la ausencia de glucosa en la masa o su bajo contenido constituirá un factor limitante para la efectividad de la glucosa oxidasa como agente de mejora de la masa. Así, puede requerirse la adición de sacarosa o glucosa como substrato a la masa para obtener un efecto suficiente y la glucosa oxidasa no proporciona constantemente un efecto de mejora del pan o de la masa deseados, cuando se utilizan solos sin añadir otros enzimas.

Recientemente, se ha sugerido la utilización de hexosa oxidasa para mejorar la calidad de la masa de harina (WO 96/39851).

Las celulasas y/o las hemicelulasas (a las hemicelulasas se hace también referencia en la presente memoria como pentosanasas o xilanasas) que fragmentan los polisacáridos no almidonados contenidos en la harina, se utilizan como un medio para mejorar la calidad del pan. La fragmentación de los enlaces glicosídicos en los polisacáridos no almidonados afecta a la retención acuosa y a la capacidad de unión del agua, a la viscosidad y capacidad de impermeabilización de la masa, así como a la textura, aroma, sabor y frescura del pan. Generalmente hablando, la utilización de celulasas/hemicelulasas da lugar a una mejora de la elasticidad de la masa y a una mejora en el volumen del pan, de la estructura del grano y de las propiedades anti-caducidad del producto acabado de panadería.

Sin embargo, la utilización de celulasas o hemicelulasas implica ciertos efectos secundarios indeseables. En particular, se observa habitualmente que la adición de estos enzimas a las masas da lugar a que se convierten en demasiado flojas y pegajosas, lo que puede causar problemas. Es por tanto necesario utilizar dosis de celulasas o hemicelulasas que sean demasiado bajas para que se alcance un óptimo resultado de cocción, de forma que los enzimas en cuestión no puedan ser utilizados en toda su extensión. A un bajo nivel de dosis, las celulasas o hemicelulasas hacen que la manipulación mecánica de la masa sea más fácil, mientras que el efecto de tales enzimas sobre la tolerancia del procedimiento (estabilidad de la masa) pueda ser insuficiente cuando se utilizan solos, y de acuerdo con esto, tienen que utilizarse emulsificantes como aditivos.

Se ha encontrado ahora que los problemas mencionados asociados a la utilización de celulasas o hemicelulasas en masas de harina pueden reducirse o evitarse utilizando estos enzimas en combinación con una oxidorreductasa tal como la galactosa oxidasa bajo condiciones en las que substrato suficiente para el último enzima se encuentra en la masa. Por tanto, utilizando tal combinación de enzimas ha llegado a ser posible alcanzar el máximo efecto de las celulasas o hemicelulasas, incluyendo la utilización de estos enzimas en grandes cantidades en masas sin que tengan lugar la adherencia y/o la flojedad aquí mencionadas.

Siendo una oxidorreductasa, la galactosa oxidasa proporcionará, además de los efectos anteriores, el efecto de reforzamiento de la masa y por tanto mejorará las características reológicas de las masas de harina, como resultado de la formación de enlaces disulfuro en aminoácidos que contengan S y también, como se demostró por los inventores, como resultado de la unión del ácido ferúlico a otras mitades de ácido ferúlico.

La galactosa oxidasa (D-galactosa: oxígeno 6-oxidorreductasa, EC 1.1.3.9) es un enzima que en presencia de oxígeno es capaz de oxidar la galactosa a la correspondiente lactona, D-galacto-hexodialdosa con la hidrólisis subsiguiente al ácido aldobiónico. De acuerdo con esto, la oxidación catalizada por la galactosa puede ilustrarse de la siguiente manera:

D-galactosa + O_{2}\rightarrow\gamma-D-galacto-hexodialdosa + H_{2}O_{2}

Sin embargo, el contenido natural de galactosa o de otros substratos oxidables para la galactosa oxidasa en las harinas de los cereales, es muy bajo, típicamente del orden de 0,001 a 0,01% en peso. La utilización práctica de este enzima en una masa basada en la harina, no es por tanto posible, sin proporcionar a la masa una cantidad suficiente de substratos oxidables para el enzima.

Sumario de la invención

De acuerdo con lo anterior, la invención se refiere en un primer aspecto a una composición que comprende como primer componente un enzima que posee actividad de galactosa oxidasa y como segundo componente, un substrato oxidable para el enzima que tiene actividad galactosa oxidasa y/o un enzima que es capaz de convertir un compuesto que contiene galactosa en un substrato para el enzima que posee actividad galactosa oxidasa.

En aspectos ulteriores, la invención se refiere a un procedimiento para preparar una masa de harina, que comprende la adición a la masa de una cantidad de la composición anterior que es suficiente para obtener una cantidad de un enzima que tiene actividad galactosa oxidasa en la masa, que es del orden de 1 a 10.000 unidades por kg de masa, y un procedimiento para la preparación de un producto de panadería, que comprende la cocción de tal masa de harina.

En otro aspecto, todavía, la invención se refiere a la utilización de las composiciones mencionadas como agentes de mejora de la masa y/o del pan.

Descripción detallada de la invención

Según la invención, cualquier enzima tal que bajo condiciones de la masa sea capaz de oxidar un substrato que se encuentra de forma natural en la masa o que se genera en ella, es contemplado por el alcance de la invención.

Una oxidorreductasa preferida en la actualidad es un enzima que tiene actividad galactosa oxidasa incluyendo la D-galactosa:oxígeno 6-oxidorreductasa, EC 1.1.3.9 y otras oxirreductasas que en presencia del oxígeno son capaces de oxidar la D-galactosa. Tales enzimas incluyen por ejemplo, la hexosa oxidasa (EC 1.1.3.5), L-Sorbosa oxidasa (EC 1.1.3.11). Tales otras oxidorreductasas son abarcadas por la invención.

Un enzima apropiado con actividad galactosa oxidasa puede derivarse de cualquier fuente natural incluyendo una planta, un organismo procariótico tal como una especie bacteriana, un organismo eucariótico tal como una especie fúngica, incluyendo una especie de levadura y una especie de hongo filamentoso. Otras fuente posibles son los tejidos animales.

Es bien conocido que los fermentos en bruto, por ejemplo, de los hongos filamentosos contienen diversas actividades enzimáticas. Es posible que tales preparaciones enzimáticas en bruto puedan contener actividad galactosa oxidasa y puedan por tanto servir como fuentes de, por lo menos, preparaciones de oxidasa galactosa purificadas parcialmente. En esta conexión se contempla que pueden seleccionarse especies específicas de organismos que tienen una producción particularmente alta de galactosa oxidasa. Tales cepas seleccionadas pueden ser mejoradas con respecto a su producción de galactosa oxidasa mediante cualquier procedimiento de mejora de la cepa convencional, por ejemplo, utilizando la mutagénesis al azar o la mutagénesis sitio-dirigida.

El contenido natural de los substratos inmediatamente oxidables para un enzima activo galactosa oxidasa es, como se menciona anteriormente, tan bajo en las harinas de cereales que no puede esperarse cualquier efecto oxidante significativo de la galactosa oxidasa en una masa de harina, a no ser que se proporcione en la composición de la invención o en la masa, una cantidad apropiada de substrato oxidable para la galactosa oxidasa o se añada una cantidad extremadamente alta de galactosa oxidasa.

Según la invención, la composición contiene por tanto un substrato oxidable para la galactosa oxidasa y/o un enzima que es capaz de convertir un compuesto que contenga galactosa en un substrato para la galactosa oxidasa.

Aunque la D-galactosa como moléculas libres constituye el substrato oxidable obvio para una oxidoreductasa que posee actividad galactosa oxidasa, los substratos útiles para el enzima incluyen cualquier compuesto que contenga galactosa, en el que las mitades de galactosa se encuentran en una posición y configuración en las que pueden ser oxidadas por la galactosa oxidasa.

La harina de los cereales posee un contenido natural de polisacáridos no almidonados que comprenden mitades de galactosa como elementos estructurales, en particular compuestos de hemicelulosa, que incluyen compuestos a los que se alude generalmente en la técnica como pentosanos o xilanos. Se encontró que tales componentes estructurales de esto constituyen substratos útiles para la galactosa oxidasa.

Un tal substrato útil para la galactosa oxidasa es un producto de hidrólisis del arabinogalactano, que es un componente de los pentosanos solubles en agua que se encuentran presentes naturalmente en las harinas cereales. El arabinogalactano derivado del trigo y de otros granos de cereales, tal como centeno, cebada, arroz, mijo y avena, es una glicoproteína formada predominantemente por un polisacárido que contiene galactosa- y arabinosa- y una proteína. En la harina el contenido de la glicoproteína del arabinogalactano es típicamente del orden de un % del 0,2-0,4 en peso.

Los arabinogalactanos son estructuras muy ramificadas en las que los residuos de galactosa están unidos glicosidícamente uno a otro con engarces \beta-(1->3)- y \beta(1->6) para formar cadenas de galactano. Unidades sencillas de arabinosa se unen \beta-glicosidicamente a las cadenas del galactano. La despolimerización completa del arabinogalactano requiere las etapas de fragmentación de la arabinosa a partir de la cadena de galactano mediante una arabinofuranosidasa, que hidroliza los engarces \beta-(1->3)- y \beta(1->6) mediante galactanasas para obtener residuos oligoméricos o diméricos de galactosa y liberando finalmente unidades únicas de galactosa haciendo reaccionar los oligómeros o dímeros con una \beta-galactosidasa.

Según la invención, cualquiera de los productos del final anterior de la hidrólisis de los arabinogalactanos ha mostrado ser un substrato apropiado para la galactosa oxidasa. Particularmente, se encontró sorprendentemente que las mitades de la galactosa cuando se encuentran en un galactano, éste es significativamente más accesible a la oxidación mediante la galactosa oxidasa que lo son los monómeros de galactosa.

En formas de realización apropiadas, la composición que contiene la galactosa oxidasa según la invención, incluye por tanto un compuesto substrato que se selecciona de entre el grupo formado por un galactano, un oligómero o dímero de galactosa, o galactosa.

También se contempla que la lactosa, la cual puede, por ejemplo, incorporarse a una masa de harina en forma de polvo de leche, puede utilizarse como un compuesto substrato para la galactosa oxidasa.

En ciertas formas de realización preferidas de la invención, la composición que contiene galactosa oxidasa comprende como segundo componente un enzima que es capaz de convertir un compuesto que contiene galactosa que en sí mismo no constituye un substrato para la galactosa oxidasa, en un substrato para la galactosa oxidasa. El compuesto que contiene galactosa que va a convertirse puede también ser un compuesto que puede actuar como un substrato para la galactosa oxidasa, pero que al ser tratado con un segundo componente enzimático, se convierte en un producto que se oxida más fácilmente por la galactosa oxidasa.

Así, la formación de un substrato oxidable en la masa para la galactosa oxidasa mediante tal segundo componente enzimático llevaría a las siguientes reacciones:

1

Tal compuesto convertible que contiene galactosa (substrato I) puede ser un compuesto que se encuentra presente de forma natural en la harina de los cereales en una cuantía que, mediante la actividad enzimática del enzima que hidroliza el segundo componente anterior, es suficiente para proporcionar el substrato oxidable requerido para la galactosa oxidasa o un componente suyo, o, si tal compuesto substrato no se encuentra en cantidad suficiente en la harina, puede añadirse a la composición de la invención en la cantidad necesaria.

El compuesto substrato que contiene galactosa puede ser uno que no se encuentre presente de forma natural en las harinas de cereales tal como, por ejemplo, una goma, que incluye una goma de legumbre y una goma de algarroba. Sin embargo, constituye un aspecto significativo de la invención que el compuesto del substrato para el segundo componente enzimático pueda ser un compuesto que contenga galactosa que esté naturalmente en la harina del cereal tal como compuestos a los que se hace referencia generalmente como hemicelulosa, pentosanos o xilanos.

Según la invención, un segundo componente enzimático apropiado es un enzima que puede hidrolizar o de otro modo degradar compuestos que tengan galactosa o sus componentes estructurales para proporcionar un substrato oxidable para la galactosa oxidasa. En esta conexión, enzimas particularmente útiles incluyen una hemicelulasa, una pentosanasa, una xilanasa, una arabinofuranosidasa, una galactanasa, una mannanasa y una \beta-galactosidasa.

Según la invención, la composición que contiene galactosa oxidasa puede comprender otros componentes que se utilizan convencionalmente en composiciones que mejoran el pan o la masa. Tales otros componentes incluyen por ejemplo otros componentes enzimáticos tales como celulasas, el enzima que degrada el almidón, incluyendo amilasas y pululanasas, lipasas, proteasas y oxidorreductasas distintas que la galactosa oxidasa, y compuestos convencionales aditivos no enzimáticos de la masa que incluyen como ejemplos agentes fermentadores, emulsificadores, agentes conservantes, agentes oxidantes tales como por ejemplo uyodatos, peróxidos, ácido ascórbico, K-bromato o azodicarbonamida.

Constituye un aspecto interesante de la invención que la cantidad y el tipo del segundo componente de la composición puede seleccionarse de forma que se obtenga cualquier nivel de actividad específicamente deseable de la oxidorreductasa.

La composición de la invención está provista apropiadamente con una cantidad de galactosa oxidasa que es del orden de 1 a 10.000 unidades (Sigma) por g, definiéndose una unidad Sigma como la cantidad de galactosa oxidasa que producirá una \DeltaA_{425} de 1,0 por minuto a un pH de 6,0 a 25ºC en un sistema de peroxidasa y o-tolidina, con un volumen de reacción de 3,4 ml y un paso de luz de 1 cm (G.Avigad et al., J.Biol.Chem. 237:2736, 1962). En formas de realización útiles, la cantidad de galactosa oxidasa es del orden de 100 a 5.000 unidades por g, tal como 500 a 4.000 unidades.

Para ciertas aplicaciones, es deseable proporcionar la galactosa oxidasa en una forma sustancialmente pura, por ejemplo, como una preparación esencialmente sin otras proteínas o contaminantes no proteicos, y de acuerdo con esto, una preparación enzimática relativamente en bruto resultante de un procedimiento convencional de extracción y aislamiento del enzima a partir de un organismo fuente, puede someterse a ulteriores etapas de purificación tales como otros pasos cromatográficas, filtración en gel o cromatoenfoque.

En otros aspectos, la invención se refiere a un procedimiento para preparar una masa de harina, que comprende la adición a la masa de una cantidad de la composición anterior que sea suficiente para obtener una cantidad de galactosa oxidasa en la masa que sea del orden de 1 a 10.000 unidades por kg de harina, y un procedimiento para preparar un producto de panadería, que comprende cocer tal masa de harina.

En una forma de realización preferida del procedimiento según la invención, se prepara una masa de harina mezclando harina con agua, un agente fermentador tal como la levadura o un agente fermentador químico convencional, y una cantidad efectiva de una composición que contiene galactosa oxidasa bajo las condiciones de formación de la masa. Es, sin embargo, dentro del alcance de la invención que pueden añadirse otros componentes a la mezcla de

\hbox{la masa}

.

Típicamente, tales otros componentes de la masa incluyen componentes de la masa utilizados convencionalmente tales como sal, un agente endulzante como azúcares, jarabes o agentes endulzantes artificiales, sustancias lipídicas que incluyen materia grasa, margarina, mantequilla o un aceite vegetal o animal y uno o más aditivos convencionales de la masa, tales como agentes emulsificantes, enzimas degradantes del almidón, enzimas que degraden la celulosa, proteasas, lipasas, agentes de oxidación no específicos tales como los mencionados anteriormente, agentes de sabor, cultivos bacterianos de ácidos lácticos, vitaminas, minerales, hidrocoloides tales como alginatos, carregenina, pectinas, gomas vegetales que incluyen por ejemplo, gomas de legumbres y goma de algarroba, y sustancias fibrosas en la dieta.

Emulsificadores convencionales utilizados para fabricar productos de masa de harina incluyen como ejemplos monoglicéridos, ácido tartárico diacetilo, ésteres de mono y diglicéridos de los ácidos grasos, y lecitinas, por ejemplo, obtenida de la soja. Entre los enzimas degradantes del almidón, las amilasas son particularmente útiles como aditivos que mejoran la masa, la \alpha-amilasa rompe el almidón a dextrinas que son posteriormente fragmentadas por la \beta-amilasa a maltosa. Otros útiles enzimas degradantes del almidón que pueden añadirse a una composición de la masa incluyen glucoamilasas y pululanasas. En este contexto, otros enzimas interesantes con xilanasas y otras óxidoreductasas tales como hexosa oxidasa, glucosa oxidasa, piranosa oxidasa y sulfhidril oxidasa.

Una harina preferida es la harina de trigo, pero las masas que comprenden harinas derivadas de otras especies de cereales tales como arroz, maíz, cebada, centeno y durra (planta africana) también se contemplan.

La masa se prepara mezclando harina, agua, la oxidorreductasa según la invención y otros posibles ingredientes y aditivos. La composición según la invención puede añadirse junto con cualquier ingrediente de la masa incluyendo el agua o la mezcla de ingredientes de la masa o con cualquier aditivo o mezcla de aditivos. La masa puede prepararse mediante cualquier procedimiento convencional de preparación de la masa habitual en la industria panadera o en cualquier otra industria que fabrique productos basados en la masa de harina.

La cantidad de la composición añadida normalmente es una cantidad que resulta en la presencia en la masa acabada de 1 a 10.000 unidades de galactosa oxidasa por kg de harina, preferentemente de 5 a 5.000 unidades tales como 10 a 1000 unidades. En formas de realización útiles, la cantidad es del orden de 20 a 500 unidades por kg de harina.

El efecto de la galactosa oxidasa sobre las propiedades reológicas de la masa puede medirse mediante procedimientos estándar según la International Association of Cereal Chemistry (ICC) y la American Association of Cereal Chemistry (AACC) incluyendo el procedimiento del amilógrafo (ICC 126), el procedimiento del farinógrafo (AACC 54-21) y el procedimiento del extensígrafo (AACC 54-10). El procedimiento del extensígrafo mide, por ejemplo, la capacidad de la masa para conservar el gas desprendido por las levaduras y la capacidad para resistir la impermeabilización. En efecto, el procedimiento del extensígrafo mide la fuerza relativa de una masa. Una masa fuerte exhibe una curva más alta y, en algunos casos, más larga del extensígrafo que una masa débil. El procedimiento AACC 54-10 define al extensígrafo de la siguiente forma: ``el extensígrafo registra una curva de extensión de la carga para una pieza de prueba de la masa, hasta que se rompe. Las características de las curvas de extensión de la carga o extensigramas se utilizan para evaluar la calidad general de la harina y de su respuesta a los agentes que la mejoran''.

En una forma de realización preferida del procedimiento según la invención, la resistencia a la extensión de la masa en términos de la proporción entre la resistencia a la extensión (altura de la curva, B) y la extensibilidad (longitud de la curva, C), es decir, la relación B/C medida mediante el procedimiento AACC 54-10 aumenta un 10% por lo menos respecto a la de una masa similar que no contiene la galactosa oxidasa. En formas de realización más preferidas, la resistencia a la extensión aumenta en por lo menos un 20%, tanto como por lo menos 5% y en particular por lo menos un 100%.

El procedimiento según la invención puede utilizarse para cualquier tipo de masa de harina con el objetivo de mejorar sus propiedades reológicas y la calidad de los productos acabados fabricados a partir del tipo particular de masa. Así, el procedimiento es muy apropiado para la obtención de tipos convencionales de productos de pan fermentado por la levadura incluyendo los productos del pan basados en la harina de trigo tales como panes y piezas de masa cocidas. Sin embargo, se contempla que el procedimiento también puede mejorar las propiedades de las masas en las que la fermentación está causada por la adición de agentes de fermentación química, incluyendo productos dulces de panadería tales como pastelillos incluyendo como ejemplos pastelillos de una libra y panecillos, o tortas.

En un aspecto interesante, el procedimiento de la invención se utiliza para mejorar las propiedades reológicas de las masas planeadas para los productos tipo fideos que incluyen los ``fideos blancos'' y los ``fideos chinos'' y mejorar la calidad de la textura de los productos tipo fideo acabados. Una receta básica típica para la fabricación de fideos comprende los siguientes ingredientes: harina de trigo 100 partes, sal 0,5 partes y agua 33 partes. Los fideos se preparan típicamente mezclando los ingredientes en un aparato apropiado de mezcla, seguido por el enrollamiento de la masa de los fideos utilizando un aparato apropiado para fideos para formar los cordones de los fideos que se secaron al aire seguidamente.

La calidad de los fideos acabados se evalúa mediante su color, calidad de cocinado y textura. Los fideos deberán cocinarse tan pronto como sea posible, conservar la firmeza después de cocinar y no deberán preferentemente soltar ningún sólido al agua de cocción. Al servir, los fideos deberán tener preferentemente una superficie firme y suave, sin mostrar adherencia y proporcionando una ``adherencia'' firme y un buen sabor. Además, es importante que los fideos tengan un ligero color.

Ya que la conveniencia de la harina de trigo para proporcionar fideos con las deseadas cualidades de textura y comestibilidad, puede variar según al año y al área de crecimiento, es habitual añadir agentes para la masa que mejoren los fideos con objeto de compensar la calidad sub-óptima de la harina. Típicamente, tales agentes comprenderán sustancias fibrosas en la dieta, proteínas vegetales, emulsificadores e hidrocoloides tales como por ejemplo, alginatos, carrageninas, pectinas, gomas vegetales que incluyen por ejemplo, gomas de legumbres y gomas de algarroba, y amilasas.

Constituye por tanto un aspecto importante de la invención que la composición que contiene la galactosa-oxidasa según la invención es útil como un agente que mejora los fideos, opcionalmente en combinación con otros componentes utilizados habitualmente para mejorar la calidad de los fideos. Así, se contempla que los fideos preparados según el procedimiento mencionado tendrán propiedades mejoradas respecto al color, elaboración y cualidades comestibles incluyendo una textura y consistencia firme, elástica y adherente.

En otra forma de realización útil, la masa, que se prepara mediante el procedimiento según la invención, es una masa para la preparación de un producto de pasta alimenticia. Tales productos que incluyen como ejemplos spaghetti y macarrones se preparan típicamente a partir de una masa que comprende como ingredientes principales harina tal como, por ejemplo, sémola, agua y/o y huevos. Después de mezclar los ingredientes, se forma la masa para el tipo deseado de producto de pasta, secándose al aire. Se contempla que la adición a una masa de pasta tendrá un efecto de mejora significativo sobre su extensibilidad y estabilidad, dando lugar a un producto de pasta acabado con cualidades mejoradas de textura y de comestibilidad.

Todavía en otro aspecto, la invención se refiere a la utilización de una galactosa oxidasa como un agente que mejora una masa y/o el pan. En formas de realización específicas, tal utilización incluye que se añade la galactosa- oxidasa a los ingredientes de la masa, aditivos de la masa o a ésta, en forma de una preparación que no contiene sustancialmente otras actividades enzimáticas, es decir, como, por lo menos, una preparación parcialmente purificada, por ejemplo, basada en un extracto enzimático en bruto o en un medio de fermentación en el que se ha cultivado un organismo productor de galactosa-oxidasa. Para ciertos objetivos, en los que no es necesario la utilización de tal preparación enzimática purificada, la galactosa oxidasa puede proveerse en forma de una preparación enzimática en bruto.

La invención se ilustra además mediante los siguientes ejemplos no limitativos y los dibujos, en los que

la Figura 1 muestra la oxidación del ácido 2,2'-azino-bis(3-etilbenztiazolina -6-sulfónico) (ABTS) en una mezcla reactiva que contiene ABTS, galactosa oxidasa, arabinogalactano y una de las preparaciones enzimáticas: (i) enzima pectolítico 2524-70 (P70), (ii) enzima pectolítico 2524-71 (P71) y (iii) Grindamyl S 100, respectivamente (10 mg/ml).

La Figura 2 muestra la dependencia del pH de la reacción entre el arabinogalactano y la preparación enzimática en bruto de Aspergillus P70,

La Figura 3 ilustra la tasa de generación de substrato oxidable para la galactosa oxidasa a partir del arabinogalactano que ha reaccionado con la preparación enzimática en bruto P70, determinada mediante el ensayo ABTS, y

La Figura 4 ilustra la oxidación mediante la galactosa oxidasa de los substratos siguientes que contienen galactosa; (i) galactosa, (ii) di-galactosa y (iii) arabinogalactano (5 mg/ml) tratados con 300 \mul de arabinofuranosidasa (64U/ml).

Ejemplo 1

Una preparación soluble en agua de pentosanos (WSP) se aisló a partir de harina Thesee tal como se describe por Faurot et al., Lebensm.- Wiss. u-Technol. 28:436-444, 1995.

La preparación WSP se utilizó como la fuente para aislar el arabinogalactano, el cual a su vez se utilizó como substrato para determinar la actividad oxidante de la galactosa oxidasa. La preparación WSP puede también utilizarse como fuente de arabinoxilano.

1.1. Purificación del arabinogalactano a partir de los pentosanos solubles en agua Reactivos

Solución de amiloglicosidasa: 10 mg/ml de aminoglicosidasa (101332, Merck) se disolvieron en tampón de 0,01 M acetato, pH 5,0.

Solución pronase: 10 mg/ml de pronasa (165921, Boehringer Mannheim) se disolvió en un tampón de 0,5 M fosfato, pH 7,5.

Procedimiento

25 g de WSP (harina Thesee) se añadieron a 880 ml de agua Millipore. ajustándose el pH a 5,5. La solución resultante se agitó durante la noche. 10 ml de la solución de amiloglucosidasa se añadieron y la reacción enzimática se dejó que tuviera lugar durante 2 horas a 40ºC bajo agitación. Se ajustó el pH a 7,5 añadiendo 100 ml de tampón fosfato. Posteriormente, se añadieron 10 ml de solución pronase y la mezcla resultante se incubó a 40ºC durante 2 horas. La mezcla se calentó a 95ºC y se mantuvo a esta temperatura durante 10 minutos para inactivar la pronase. Posteriormente, la mezcla se enfrió hasta temperatura ambiente y se centrifugó durante 30 minutos a 4ºC (12.000 x g). El sobrenadante resultante se ajustó con etanol al 96% para obtener una solución de pentosan a una concentración del 60% (v/v) de etanol.

Precipitación del arabinoxilano

La solución de pentosán anteriormente obtenida se sometió a precipitación durante 1 hora a 4ºC, lavándose el precipitado dos veces con etanol al 60% sobre un filtro de vidrio (nº 2) utilizando el vacío sin secar totalmente el precipitado. Lavados posteriores del precipitado con etanol al 96%, etanol absoluto y finalmente con acetona, dio lugar a un precipitado de arabinoxilano que se secó a 35ºC por la noche.

Aislamiento de arabinogalactano

El sobrenadante obtenido después de la precipitación anterior del arabinoxilano, se ajustó al 80% de etanol, y se sometió a precipitación de arabinogalactano. El precipitado se disolvió en agua Millipore (2% peso/vol), se precipitó en 80% de etanol, se desechó el sobrenadante y el precipitado se centrifugó a 12.000 x g durante 30 minutos a 4ºC. El sedimento resultante se disolvió en agua Millipore y se liofilizó.

1.2 Generación de substratos oxidables para la galactosa oxidasa a partir del arabinogalactano

La generación de substratos oxidables a partir del arabinogalactano se ensayó tratando la solución anterior de arabinogalactano con 3 distintas preparaciones enzimáticas.

La capacidad de las soluciones enzimáticas resultantes tratadas para actuar como substrato mediante la galactosa oxidasa dando lugar a la producción de H_{2}O_{2}, se ensayó utilizando ABTS. La oxidación de ABTS mediante la H_{2}O_{2} producida, conducirá, en presencia de una peroxidasa, a la formación de un compuesto coloreado que puede detectarse mediante medición de la densidad óptica (OD) de las mezclas reactivas a 420 nm.

250 \mul del arabinogalactano precipitado anteriormente disuelto en tampón de acetato sódico 0,1 M (20 mg/ml), pH 5,0, se incubaron a temperatura ambiente durante 90 minutos con 5 \mul de las siguientes preparaciones enzimáticas:

(i): Enzima pectolítico 2524-70 (P70) (10 mg/ml), Danisco. Ingredientes. Esta preparación es un fermento en bruto de Aspergillus niger que contiene varias actividades enzimáticas tales como actividad pectolítica.

(ii): Enzima pectolítico 2524-71 (P71) (10 mg/ml), Danisco. Ingredientes. Esta preparación es también un fermento en bruto de Aspergillus niger que contiene varias actividades enzimáticas tales como actividad pectolítica, y

(iii): Grindamyl S 100 (10 mg/ml), Danisco. Ingredientes. Este producto enzimático comercial es también un fermento en bruto de Aspergillus niger que se utiliza principalmente como una fuente de actividades amilásicas y xilanásicas.

Las reacciones enzimáticas finalizaron hirviendo durante 5 minutos. Las muestras se centrifugaron a 12.000 x g y los sobrenadantes se utilizaron para pruebas posteriores con el ensayo ABTS.

1.2.1 Ensayo ABTS

Mezcla reactiva del ensayo ABTS: 6,25 mg ABTS (Sigma A-1888) disueltos en 10 ml de tampón de fosfato sódico 0,1 M, pH 6,4, se mezcla con 160 \mul de galactosa oxidasa (30 unidades /ml) (Sigma G-7400) y 160 \mul de peroxidasa (200 U/ml) (Sigma P-8124). Se añade tampón de fosfato sódico 0,1 M, pH 6,4, a 25 ml.

La mezcla reactiva de ABTS se incuba con un substrato potencial para que va a ser ensayado para la galactosa oxidasa, leyéndose inmediatamente la absorbancia a 420 nm.

1.2.2. Efecto de tratar el arabinogalactano con las preparaciones enzimáticas anteriores (i), (ii) y (iii) sobre la generación de substratos oxidables para la galactosa oxidasa

800 \mul de la mezcla reactiva ABTS se incubaron con 50 \mul de solución de arabinogalactano tratada enzimáticamente en cubetas durante 30 minutos a temperatura ambiente. Se leyó inmediatamente la absorbancia a 420 nm. Los resultados se muestran en la Figura 1. Puede apreciarse que cuando el arabinogalactano se trató con la preparación P70, se formaron substratos oxidables para la galactosa oxidasa, mientras que el tratamiento con P71 y Grindamyl S 100 no condujo a la formación de substratos oxidables a pH 5,0. Los experimentos realizados con P71 a pH 3,0, sin embargo, dieron lugar a substratos oxidables para la galactosa oxidasa.

1.2.3. Efecto del pH sobre la generación de substratos oxidables para la galactosa oxidasa a partir del arabinolactano tratado con P70

800 \mul de la mezcla reactiva ABTS se incubaron con valores pH del orden de 3 a 7 con 50 \mul de la solución de arabinogalactano tratada enzimáticamente en cubetas durante 30 minutos a temperatura ambiente. Se leyó inmediatamente la absorbancia a 420 nm. Los resultados se muestran en la Figura 2. Puede apreciarse que se generaron niveles altos de substratos oxidables a valores de pH del orden de 3,5 a 6, con un pH óptimo de 5 aproximadamente. A pH 3, sólo se detectó el 34% de la actividad máxima y a pH 7, se obtuvo solamente una actividad del 12% de la actividad máxima.

1.2.4. Efecto del tiempo de incubación sobre la generación de substrato oxidable para la galactosa oxidasa mediante P70

300 \mul de arabinogalactano (20 mg/ml) se incubaron con 5 \mul de P70 y la reacción enzimática se detuvo a distintos intervalos de tiempo. La generación de substratos oxidables para la galactosa oxidasa se detectó utilizando el ensayo ABTS. Los resultados se muestran en la Figura 3. A partir de la figura es evidente, que la tasa de generación de substrato oxidable fue particularmente alta durante los primeros 15 minutos. Después de 30 minutos de reacción, se produjo un nivel máximo de oxidación de galactosa oxidasa. Aumentando el tiempo de reacción posteriormente, no se incrementó la liberación posterior de substratos oxidables.

1.2.5. Identificación de las actividades enzimáticas degradantes del arabinogalactano presente en P70

P70 se fraccionó mediante cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC) y las fracciones se rastrearon respecto a varias actividades enzimáticas.

p-nitrofenil \beta-D-galactopiranosido (pNPG) y p-nitrofenil 6-O-\beta-D-galactopiranosil-\beta-D-galactopiranósido

\break

(pNPGG) se utilizaron como substratos para detectar las actividades de la \beta-galactosidasa y de la 1->6-galactanasa, detectando respectivamente unidades únicas de galactosa liberando enzimas y enzimas capaces de liberar el dímero de galactosa unido 1->6 a partir de una unidad paranitrofenol. Las fracciones se rastrearon también respecto a la actividad arabinofuranosidásica utilizando p-nitrofenil \alpha-L-arabinofuranósido (pNPA) y la actividad endo-xilanásica.

La actividad de la galactosidasa se detectó en dos picos alrededor de la fracción 10 y de la fracción 17, mientras que la actividad de la 1->6 galactanasa representaba un pico único (fracciones 8 y 9). Azúcares reductores liberados siguieron a la actividad arabinofuranosidásica, principalmente en las fracciones 8 y 9.

La liberación de arabinosa y de di-galactosa a partir del arabinogalactano correspondió a actividades medidas sobre substratos p-nitrofenil, liberándose la máxima cantidad de arabinosa en la fracción 8, mientras que la di-galactosa tuvo un máximo alrededor de la fracción 9. La liberación de galactosa se observó solo en las fracciones 8 y 9. Así, las fracciones 8 y 9 contenía arabinofuranosidasa, actividades que liberaban di-galactosa y actividades que liberaban unidades de galactosa.

La actividad endo-xilanasa se encontró en las fracciones 12 y 13.

Ejemplo 2 Oxidación de compuestos que contienen galactosa mediante la galactosa oxidasa

Se compararon tres distintos compuestos que contenían galactosa como substratos para la galactosa oxidasa; (i) arabinogalactano tratado con arabinofuranosidasa, es decir, arabinogalactano fragmentado con arabinosa, (ii) galactosa y (iii) di- galactosa (Figura 4). Puede apreciarse que el arabinogalactano libre de arabinosa fue el más favorable de los substratos ensayados cuando se comparó sobre una base equivalente de galactosa oxidasa. La di-galactosa se oxidó casi tan bien, pero la galactosa fue tres veces menos efectiva aproximadamente como substrato para la galactosa oxidasa comparada con el arabinogalactano tratado con la arabinofuranosidasa.

Ejemplo 3 El efecto de la galactosa oxidasa sobre la harina en un sistema modelo de la masa 3.1 Obtención de galactosa oxidasa purificada a partir de una preparación en bruto de galactosa oxidasa

Una preparación disponible comercialmente de galactosa oxidasa es el fermento en bruto del enzima, obtenido en Sigma, nº de catálogo G7400.

Esta preparación contiene una mezcla de las actividades enzimáticas y se purificó para asegurarse de que cualquier efecto oxidativo obtenido era sólo el resultado de la actividad de la galactosa oxidasa. G7400 se proporcionó como una cantidad de polvo liofilizado de una preparación enzimática en bruto que contenía una actividad declarada de 10.000 unidades Sigma. La preparación se purificó en las 3 etapas siguientes:

1): Las 10.000 unidades de galactosa oxidasa se disolvieron en 60 ml de agua y se filtraron a través de un filtro GF/B y posteriormente a través de un filtro de 0,45 \mum. Este filtrado se aplicó a una columna de desalación Sephadex G25 C de 550 ml (XK50, 5 x 28,5 cm). La columna se equilibró en 20 mM de un tampón de trietanolamina (TEA), pH 7,3 y se eluyó con una velocidad de flujo de 15 ml/minuto.

2): El eluído resultante de la etapa anterior se aplicó a una columna con 20 ml de Q-Sepharose 15 (XK16) equilibrada en 20 mM de trietanolamina, pH 7,3. La columna se lavó con el tampón de equilibración y las proteínas unidas se eluyeron utilizando 1 M NaCl en el tampón de equilibración. La columna se eluyó con una velocidad de 5 ml/minuto. Se recuperaron y agruparon fracciones que contenían actividad de galactosa oxidasa.

3): La muestra agrupada anteriormente se purificó posteriormente mediante cromatografía de interacción hidrofóbica aplicando la muestra a una columna Source Q15 (XK26) de 20 ml. La columna se lavó con sulfato amónico 1 M en 20 mM de acetato sódico, pH 5,0. La columna se eluyó utilizando 20 mM de acetato sódico, pH 5,0 con una velocidad de 5 ml/minuto. Se recuperaron y agruparon fracciones que contenían actividad de galactosa oxidasa, determinada mediante el ensayo que sigue a continuación.

La actividad de la galactosa oxidasa se determinó mediante un ensayo en placa de la agarosa según el procedimiento siguiente:

(i): Se preparó una solución de substrato mezclando 3,4 g de D-galactosa y 44, 4 mg de ABTS en un matraz volumétrico de 100 seguido por la adición de 60 ml de un tampón de acetato sódico 0,1 M desgaseado, pH 5,6, 1 ml de solución de peroxidasa y 0,0088 g de ácido L-ascórbico. Se añadió tampón adicional a 100 ml.

(ii): Se preparó una solución de agarosa disolviendo 2 g de agarosa en 100 ml del tampón anterior a 70ºC.

(iii): Se combinaron volúmenes iguales de la solución del substrato (pre-calentada a 70ºC) y de la solución calentada de agarosa, vertiéndose en placas de petri. Después de la solidificación, se hicieron pocillos en el medio de substrato/agarosa, y se cargaron con muestras de las fracciones. Las placas se incubaron a 40ºC y se detectó la presencia de actividad galactosa oxidasa en una muestra mediante la aparición de una zona verde oscura alrededor de los pocillos cargados.

La proteína eluida se sometió a SDS-PAGE y se tiñó con plata y basándose en el hecho de que sólo se encontró una banda visible de 75 kDa aproximadamente en el gel, se concluyó que la preparación en bruto se había purificado hasta sólo contener galactosa oxidasa. La galactosa oxidasa purificada se marcó con 2524-122-2 y la preparación enzimática marcada contenía 69,4 unidades por ml.

3.2 Efecto de la galactosa oxidasa purificada sobre el entrecruzamiento entre grupos tiol en un sistema modelo de la masa de harina de trigo

El efecto de la anterior galactosa oxidasa purificada sola y combinada con P70 (Enzima pectolítico 2524-70, Danisco Ingredients) sobre la formación del entrecruzamiento de grupos tiol, se estudió midiendo el contenido de grupos tiol libres en un sistema modelo de la masa.

3.2.1. Reactivos

(i): 0,558 g de EDTA y 12,114 g de TRIS se disolvieron en 500 ml de agua destilada. Se ajustó el pH a 8,0 con HCl;

(ii): 0,396 g del ácido 5, 5'-ditio-bis(2-nitrobenzoico) (DTNB) se disolvieron en el reactivo (1) en 50 ml. Este reactivo es sensible a la luz del día y se mantuvo en frascos cubiertos con espuma de aluminio.

3.2.2. Procedimiento

Se preparó la masa modelo en tubos Wheaton de 15 ml a partir de 1 g de harina Corde Noir y 20 mg de NaCl, a la que se añadió 0, 3.470 y 5.205 unidades de galactosa oxidasa purificada por kg de harina, respectivamente, en combinación con 0, 2.500 y 5.000 ppm, respectivamente de P70, y agua en una cantidad de 3 ml. También se analizó un blanco sin harina y enzima. Las mezclas se agitaron durante 10 minutos.

Posteriormente, se añadieron 5 ml de reactivo (ii) y los tubos se cubrieron para evitar la exposición a la luz del día, continuándose la agitación durante 10 minutos. Se transfirieron 2 ml de la mezcla reactiva resultante a un tubo de centrífuga de 3 ml, realizándose la centrifugación a 10.000 x g durante 10 minutos. Se transfirieron alícuotas de

\hbox{0,100
ml}

del sobrenadante resultante a placas ELISA y se midieron la OD a 420 nm.

La medición se llevó a cabo esencialmente según el método colorimétrico de Ellman (1958) como se ha descrito también en Cereal Chemistry, 1983, 70, 22-26. Este procedimiento se basa en el principio de que DTNB reacciona con grupos tiol en la masa, para formar un anión muy coloreado del ácido 2-nitro -5-mercapto-benzoico, que se mide utilizando un espectrofotómetro a 420 nm.

3.2.3. Resultados

Asumiendo que el cambio relativo de la cantidad de grupos tiol en una masa se ve reflejado como el cambio en la densidad óptica (OD) que resulta de la reacción entre los grupos tiol y DTNB en la masa, se obtuvieron los resultados siguiente (promedio de dos determinaciones):

Pectolasa 2524-70	Galactosa oxidasa 2524-122-2	Tiol
ppm	U/kg de harina	\mumol/g de harina
0	0	0,714
2500	0	0,657
5000	0	0,650
0	3470	0,433
2500	3470	0,407
5000	3470	0,313
0	5205	0,213
2500	5205	-0,068
5000	5205	-0,071

De esta forma, este experimento mostró una disminución significativa en el contenido de grupos tiol libres, que fue proporcional a la cantidad de galactosa oxidasa que se añadió. Cuando se añadió P70, la disminución en el contenido de los grupos tiol libres, fue significativamente más alta con una concentración más baja de la actividad de la galactosa, indicando que existe un efecto interactivo entre P70 y la galactosa oxidasa.

Ejemplo 4 4.1. Mejora del volumen específico del pan añadiendo galactosa oxidasa y P70 a la masa

Se prepararon masas a partir de 40 g de harina, 300 mg de levadura liofilizada, 20 ml de NaCl al 4,4%. Se añadieron a ello soluciones enzimáticas (véase la tabla 4.1). Como un control, sirvió una masa preparada sin añadir la solución enzimática. Las masas se mezclaron durante 5 minutos, seguido por un reposo durante 5 minutos antes de dividirlas en 3 piezas, cada una de 15 g aproximadamente. Posteriormente, las masas se impermeabilizaron durante 30 minutos a 25ºC y 80-85% RH, seguido por el moldeado y atribución de forma, situándolas en platillos antes de impermeabilizarlas durante 2 horas y 30 minutos a 25ºC y 80-85% RH. Dos de las piezas de masa impermeabilizadas de esta forma, se cocieron a 250ºC durante 7 minutos para proporcionar barras (de pan), y la tercera pieza de masa se congeló inmediatamente para análisis bioquímico posterior.

La adherencia de la masa se evaluó después de 40 minutos de añadir la solución enzimática y el aumento en el volumen específico del pan se calculó como el aumento porcentual en el volumen comparado con el volumen de una barra de pan preparada a partir de la masa, sin añadir la solución enzimática.

Los resultados del experimento se resumen en la tabla 4.1 a continuación.

\newpage

TABLA 4.1

Mejora de los volúmenes específicos de barras de pan preparadas a partir de masas de harina Thesee suplementadas con galactosa oxidasa (Unidades por kg de harina) y el enzima pectolítico 2524-70 (P70) (\mul por kg de harina)

Solución enzimática	Aumento específico del volumen (%)	Adherencia
Galactosa oxidasa, 150 U	0
P70, 250 \mul	16	+++
P70, 250 \mul + Galactosa oxidasa, 150 U	18
P70, 250 \mul + Galactosa oxidasa, 225 U	16
P70, 250 \mul + Galactosa oxidasa, 113 U	17	++
P70, 375 \mul + Galactosa oxidasa, 225 U	18
P70, 125 \mul + Galactosa oxidasa, 75 U	14	+
P70, 375 \mul + Galactosa oxidasa, 338 U	21	+

La adición de galactosa oxidasa (150 U/kg) sola no tuvo efecto sobre el aumento del volumen específico o en la calidad del pan. La adición de P70 (250 \mul/kg) solo dio lugar a un aumento del volumen específico, sin embargo, esto fue seguido por una disminución en la calidad de la masa, ya que ésta se encontró muy pegajosa.

A partir de la tabla anterior se pone en evidencia que la adición de galactosa oxidasa y P70 tuvo un efecto de aumento en el volumen específico, cuando se comparó con el pan cocido sin añadir enzimas. El aumento más grande en el volumen específico se encontró con la adición de 375 \mul de P70 por kg de harina y 338 U de galactosa oxidasa por kg de harina. Sin embargo, este aumento se siguió de una disminución en la calidad de la masa, encontrándose asimismo que la masa se había vuelto pegajosa. Los mejores resultados respecto tanto al volumen específico como a la calidad de la masa, se obtuvieron añadiendo 250 \mul/kg de P70 y 150 U/kg de galactosa oxidasa.

4.2. Efecto de P70 y de la galactosa oxidasa sobre distintos tipos de harina

Utilizando el procedimiento descrito en 3.1, el efecto sobre el volumen específico y la adherencia de P70 (

\hbox{250  \mu l/kg}

de harina) y la galactosa oxidasa (150 U/kg de harina) se ensayó utilizando 8 harinas distintas. Los resultados se muestran en la tabla 4.2 a continuación.

TABLA 4.2

Mejora de los volúmenes específicos de las barras de pan preparadas a partir de masas de harina suplementadas con galactosa oxidasa (150 U/kg de harina) y el enzima pectolítico 2524-70 (P70) (250 \mul/kg de harina)

Harina	Aumento específico del volumen (%)	Adherencia
Thesee	18
Camp Remi	15
Paris	12
Soisson	10
Arminda	9
Annecy	9
Tremie	8	+
Or	6

A partir de estos resultados, es evidente que las dosis aplicadas de P70 y de galactosa oxidasa dieron lugar a un aumento en el volumen específico para todas las harinas de los tipos ensayados. Se encontró que todas las masas no mostraban adherencia, excepto las preparadas con harina Tremie. Sin embargo, la masa de control preparada a partir de la harina Tremie, sin añadir enzimas, también se encontró que era adherente.

4.3. Efecto de la arabinofuranosidasa sobre el volumen específico y la calidad del pan preparado a partir de la harina Thesee

Se ha mostrado en el Ejemplo 1 que la acción de la arabinofuranosidasa sobre el arabinogalactano es capaz de producir substrato para la galactosa oxidasa. Se prepararon masas tal como se describe anteriormente y a ellas se añadieron distintas combinaciones de los enzimas galactosa oxidasa, Grindamyl S 100 (Danisco Ingredients) y la arabinofuranosidasa, determinándose el efecto sobre el volumen específico y la adherencia (véase Tabla 4.3). Como control, se utilizó masa fabricada a partir de harina Thesee y a la que se añadió glucosa oxidasa y Grindamyl S 100.

Los resultados se muestran en la Tabla 4.3 a continuación.

TABLA 4.3

Efecto sobre los volúmenes específicos y la calidad de la masa de pan preparadas a partir de las masas de harina Thesee suplementadas con galactosa oxidasa (U/kg de harina), Grindamyl S 100 (ppm) y arabinofuranosidasa (U/kg harina)

Enzimas	Aumento específico del volumen (%)	Adherencia
Grindamyl S 100	500 ppm	19	++++
Arabinofuranosidasa	30 U	0
Grindamyl S 100	500 ppm	19	++
Arabinofuranosidasa	30 U
Galactosa oxidasa	150 U
Grindamyl S 100	500 ppm	18	+++
Arabinofuranosidasa	100 U
Galactosa oxidasa	150 U
Grindamyl S 100	500 ppm	20	+
Galactosa oxidasa	150 U
Grindamyl S 100	500 ppm	22	++
Galactosa oxidasa	100 ppm

Se sabe que el Grindamyl da lugar a un aumento del volumen específico del pan, cuando se aplica sobre la masa. Como los resultados anteriores muestran, este enzima posee el efecto secundario negativo de producir masas extremadamente adherentes. Como puede apreciarse a partir de los resultados anteriores, este efecto secundario puede reducirse significativamente añadiendo galactosa oxidasa. La adición de arabinofuranosidasa no redujo la adherencia de la masa.

El aumento en el volumen específico observado con la adición de Grindamyl S 100 (500 ppm) y galactosa oxidasa (150 U/kg de harina) es equivalente al obtenido con la adición de Grindamyl S 100 (500 ppm) y glucosa oxidasa (

\hbox{100 
ppm}

); sin embargo, se encontró que las masas que contienen galactosa oxidasa eran menos adherentes.

Claims

1. Composición que comprende como primer componente una galactosa oxidasa (EC 1.1.3.9) y como segundo componente un substrato oxidable para la galactosa oxidasa y/o un enzima que es capaz de convertir un compuesto en un substrato para la galactosa oxidasa.

2. Composición según la reivindicación 1, en la que el segundo componente substrato oxidable es por lo menos dimérico respecto a la galactosa.

3. Composición según la reivindicación 1 ó 2, en la que la galactosa oxidasa deriva de un organismo que se selecciona a partir del grupo formado por una especie vegetal, una especie fúngica y una especie bacteriana.

4. Composición según la reivindicación 1, en la que el compuesto que puede convertirse en un substrato para la galactosa oxidasa, es un compuesto que contiene galactosa.

5. Composición según la reivindicación 1, en la que el compuesto que puede convertirse en un substrato para la galactosa oxidasa, es un compuesto que se encuentra naturalmente en la harina de los cereales o un componente suyo.

6. Composición según la reivindicación 5, en la que el compuesto que se encuentra naturalmente en la harina de los cereales, es un pentosano o un xilano.

7. Composición según la reivindicación 1, que comprende un compuesto que es un substrato oxidable para la galactosa oxidasa.

8. Composición según la reivindicación 7, en la que dicho compuesto del substrato oxidable es un componente de un compuesto que se encuentra naturalmente en la harina de los cereales.

9. Composición según la reivindicación 8, en la que el compuesto substrato oxidable se selecciona a partir del grupo formado por un galactano, un oligómero o dímero de galactosa, o gla galactosa.

10. Composición según la reivindicación 9, en la que el compuesto substrato oxidable es la lactosa.

11. Compuesto según la reivindicación 1, en la que el segundo componente es un enzima seleccionado a partir del grupo formado por una hemicelulosa, una pentosanasa, una xilanasa, una arabinofuranosidasa, una mannanasa, una galactanasa y una \beta-galactosidasa.

12. Composición según la reivindicación 1, que comprende otro componente enzimático seleccionado a partir del grupo formado por una celulasa, el enzima degradante del almidón, una lipasa y una proteasa.

13. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 que comprende además un compuesto aditivo no enzimático de la masa.

14. Composición según la reivindicación 1, en la que la cantidad de galactosa oxidasa es del orden de 1 a 10.000 unidades por g.

15. Procedimiento para la preparación de una masa de harina, que comprende la adición a la masa de una cantidad de la composición según cualquiera de las reivindicaciones 1-14, que es suficiente para obtener una cuantía de actividad de la galactosa oxidasa en la masa que es del orden de 1 a 10.000 unidades por kg de harina.

16. Procedimiento según la reivindicación 15, en el que la masa de harina es una masa de fideos.

17. Procedimiento según la reivindicación 16, en el que la masa es una masa de pasta alimentaria.

18. Procedimiento para la preparación de un producto de panadería, que comprende el cocido de la masa de harina obtenida mediante el procedimiento según la reivindicación 15.

19. Utilización de la composición según la reivindicación 1 como un agente para mejorar la masa y/o el pan.

20. Utilización según la reivindicación 19, en la que la composición comprende otro componente enzimático seleccionado a partir del grupo formado por una celulasa, un enzima degradante del almidón, una lipasa y una proteasa.

21. Utilización según la reivindicación 19 ó 20, en la que la composición es otra que comprende un compuesto aditivo no enzimático de la masa.

\newpage

22. Utilización según la reivindicación 19 ó 20, en la que la galactosa oxidasa se añade a los ingredientes de la masa, a los aditivos de la masa o a ésta, en forma de una preparación que no contiene sustancialmente otras actividades enzimáticas.

23. Utilización según la reivindicación 19, en la que la galactosa oxidasa se provee en forma de una preparación enzimática en bruto.