JPH0394690A - アルカリプロテアーゼプロモーター、同ターミネーター及びこれらからなる遺伝子発現用ユニット、並びにアルカリプロテアーゼのゲノム遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、新規な黄麹菌由来のアルカリプロテアーゼプ
ロモーター、同ターミネーター、及びこれらからなる遺
伝子発現用ユニット、並びにアルカリプロテアーゼのゲ
ノム遺伝子に関する。

〔従来の技術〕

従来、黄麹菌の一種であるアスペルギルス・オリゼー（
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ）由来のアルカ
リプロテアーゼ遺伝子の構造については、全く未知であ
り、また、該遺伝子の単離すらされていないのが実情で
ある。

アルカリプロテアーゼは、蛋白質又はその部分加水分解
物に作用して、ペブタイド結合を分解する加水分解酵素
であって、医薬、飲食品、洗剤等広範に用いられている
。

本発明者等は、先にアスペルギルス・オリゼー由来のア
ルカリプロテアーゼ遺伝子について種々検討した結果、
アスペルギルス・オリゼー由来のアルカリプロテアーゼ
遺伝子及びプレプロ型アルカリプロテアーゼ遺伝子を初
めて単離及び構造決定することに戒功し、特許出願を行
った（特願昭６３−５１７７７号及び特願昭６３−１７
０ＯＬ８号が、これら遺伝子はアルカリプロテアーゼの
ｍ　Ｒ　Ｎ　Ａ由来のものであってアルカリプロテアー
ゼのゲノム遺伝子を取得し、これを構造決定した例は未
だない。

一方、これまで遺伝子工学を用いた物質生産のための宿
主としては、大腸菌、枯草菌、酵母、動物細胞等が検討
されてきたが、各々長所と短所があり、特に糖鎖を有す
る蛋白質やある種の立体構造を有する蛋白質は大腸菌、
枯草菌、酵母では不適当である。また動物細胞ではその
培養コストが高くなり、現実の製造では問題が多い。そ
こで最近注目されているのが、かびを宿主とした発現系
である。例えばＵｐｓｈａｌｌらの報告Ｂｉｏ　Ｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｙ，５．　１３０１−１３０４（１９８７
）によれば、大腸菌や酵母では活性ある形で発現されな
かったＴ　Ｐ　Ａ　（ＴｉｓｓｕｅＰｌａｓｍｉｎｏｇ
ｅｎ　Ａｃｔｉｖａｔｏｒ）が、かび（Ａｓｐｅｒｇｉ
ｌｌｕｓ　ｎｉｄｕ　ｌａｎｓ）では活性を持った形で
発現するとされている。

そして、このような状況下、かびの宿主一ベクター系に
おいて、有効に機能するプロモーターターξネーター等
の開発は重要な意味を持ってきている。

〔発明が解決しようとする課題〕

本発明の課題は、黄麹菌アルカリプロテアーゼのゲノム
遺伝子を得てその構造を解析して該ゲノム遺伝子のプロ
モーター及びターミネーター領域を決定し、該ゲノム遺
伝子からかびの宿主一ベクター系において有効に機能す
るプロモーター、ターミネーター及びこれらからなる遺
伝子発現用ユニットを新たに取得、提供することにある
。

〔課題を解決するための手段〕

本発明者等は、鋭意研究の結果、黄麹菌の染色体からア
ルカリプロテアーゼのゲノム遺伝子を新たに得てその構
造を解析し、該ゲノム遺伝子５′側上流域にあるプロモ
ーター領域および３′側下流域にあるターミネーター領
域の解析に或功し、本発明を完或したものである。

以下、本発明について詳述する。

本発明のアルカリプロテアーゼのゲノム遺伝子、該ゲノ
ム遺伝子のプロモーター、ターミネーターは以下のよう
に調整する。

黄麹菌（アスペルギルス・オリゼー）の菌株から公知の
手法（例えば、Ｏａｋｌｅｙらの報告Ｇｅｎｅ，　６ｌ
．３８５−３９９　（１９８７）　）に準じて染色体Ｄ
ＮＡを抽出し、これを適当な制限酵素によって部分消化
し、プラスミドベクター（例えば、ｐＵｃ１９など）に
導入した後、宿主（例えば、大腸菌ＪＭ１０９株，　Ｈ
Ｂ　１０１株（宝酒造社製）など）を形質転換してジェ
ノミッタライブラリーを得る。プローブ（例えば、ｃＤ
ＮＡブローブ，合或ブローブなど）によるスクリーニン
グよって陽性クローンを得、目的とするプラスミドＤＮ
Ａを回収する。プラスミドＤＮＡを適当な制限酵素によ
って消化し、プラスミドベクター（例えば、ｐＵｃ１９
など）に導入して宿主（例えば、大腸菌ＪＭ　１０９株
）を形質転換し目的とするクローンを得る。

本発明のプロモーターを含む遺伝子断片を組み込んだプ
ラスミドとしては、ｐＡＰＯ１７　（制限酵素地図は図
参照）が挙げられる。また、本発明のターミネーターを
含む遺伝子断片を組み込んだプラスミドとしては、ｐＡ
ＰＯ２５（制限酵素地図は図参照）が挙げられる。

ＤＮＡの塩基配列は公知の方法（例えば、キロシークエ
ンス法、マキサム・ギルバート法、ダイデオキシ法）に
よって解析した。

上記の様にして取得、構造決定された本発明の黄麹菌の
アルカリプロテアーゼのゲノム遺伝子は第１図の制限酵
素切断地図及び第４図の塩基配列を有し、下記本発明の
プロモーター、ターミネーター領域のほか、３つのイン
トロン配列を有している（図中、ＩＶＳ　　１〜３と表
示）。

また、本発明のプロモーターは、上記ゲノム遺伝子の５
′側上流域に存在し、ｌ１１０のｂｐのＤＮＡを有して
いる。その塩基配列を第２図に示すが、これは第４図の
ゲノム遺伝子の塩基配列塩基番号１０〜１１１０（Ｑに
相当するものである。

しかしながら、この第２図に示すもののほか、第２図に
示した塩基配列と一部分の塩基配列が異なるＤＮＡ，上
記の塩基配列の一部分からなるＤＮＡまたは上記の塩基
配列を少なくとも含んでいるＤＮＡであって、上記プロ
モーターと同等の機能を有するものも本発明に含まれる
。

さらに、本発明のターミネーターは上記ゲノム遺伝子が
３′側下流域に存在し、５３０ｂｐのＤＮＡを有してい
る。その塩基配列を、第３図に示すが、これは第４図の
ゲノム遺伝子の塩基配列中塩基番号２４５８０〜２９８
８Ｄに相当するものである。

また同様に、第３図に示すもののほか、第３図に示した
塩基配列と一部分の塩基配列が異なるＤＮＡ、上記の塩
基配列の一部分からなるＤＮＡまたは上記の塩基配列を
少なくとも含んでいるＤＮＡであって、上記ターミネー
ターと同等の機能を有するものも本発明に含まれる。

このプロモーターあるいはターξネーターを適当なプラ
スミドベクターに接続することにより黄麹菌での発現用
ベクターとして利用可能である。

そして、これらの本発明のプロモーター及びターミネー
ターは、これらをセットにして遺伝子発現用ユニットと
して用いることができる。

得られた発現用ベクターにウロキナーゼ，　Ｈｅｐａｔ
ｉｔｉｓ　Ｂ抗原，ヒト血清アルブξン，インターフェ
ロンα，インターフェロンγ、およびその誘導体の遺伝
子等を挿入し、さらに例えばアスペルギルス・オリゼー
、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・アワモリ
、アスペルギルス・ソヤー等の宿主を形質転換し、該形
質転換体で培養することにより目的化合物を得ることが
できる。

〔発明の効果〕

本発明により、アルカリプロテアーゼプロモーター、夕
一ξネーター及びこれらからなる発現用ユニット並びに
アルカリプロテアーゼのゲノム遺伝子を新たに提供する
ことができた。特に上記プロモーター、ターミネーター
及びこれらからなる発現用ユニットは適当なプラスミド
ベクターに接続することにより、黄麹菌、アスベルギル
ス・オリゼー、アスペルギルス・ニガー、アスペルギル
ス・アワモリ、アスペルギルス・ソヤー等のかびにおけ
る有用な発現用ベクターを構築することが可能であり、
本発明はかびの宿主−ベクター系を用いる有用物質の生
産において大いに寄与するものである。

以下に実施例を示すが、本発明は特にこれに限定される
ものではない。

〔実施例〕

１．アスペルギルス・オ　ゼー　　　ＤＮＡのアスペル
ギルス・オリゼーの染色体ＤＮＡ抽出には、以下に記し
た方法で行った。まず、アスペルギルス・オリゼーＡＴ
ＣＣ２０３８６株をスラントから一白金耳とり、５０ｄ
のＹＰＳ培地（１％イーストエクストラクト、２％バク
トペブトン、２％可溶性でんぷん）に植菌し、３０℃で
２日間培養した。この培養液をさらに３ｌの三角フラス
コに５００ｄのＹＰＳ培地を入れたものに接種し、３０
゜Ｃで一昼夜培養した。集菌は３枚に重ねたガーゼで濾
過することにより行い、集めた菌体は、２０ｍＭ　ＥＤ
ＴＡ（ｐＨ８．０）溶液で２回洗浄した。さらに抽出バ
ッファ一（１００ｍＭ　｝リスー塩酸．　ｐＨ８．０、
１０ｍＭ　ＥＤＴＡ．　　１％ラウリル硫酸ナトリウム
）で１回洗浄後、濾紙で水分を除去した．この湿菌体と
同重量の滅菌済海砂Ｂ（ナカライテスク社製）を混合し
、冷却した乳ばちで約５分間すりつぶした。６０ｍｌの
抽出バッファ一（前記）を添加し、さらに約５分間すり
つぶした。すりつぶした菌体を遠心管に入れて遠心分離
し、上清を滅菌した新しい遠心管に移した。この上清に
最終濃度５μｇｏｄになるようにＲＮａｓｅ　Ａ（シグ
マ社製）を添加し、６０゜Ｃで２０分間反応させた。１
７６倍容の３Ｍ酢酸カリウム溶液を添加し、室温で１５
分間放置後、遠心分離し、上清を滅菌した新しい遠心管
に移した。同容積の↑Ｅ飽和フェノール（同体積の１０
０ｍＭ　Ｔｒｉｓ一塩酸．　１０ｍＭ　ＥＤＴＡ，ｐＨ
８．０溶液で平衡化させたちの）で２回抽出、さらに同
容積のエーテルで３回抽出した。抽出後の溶液に２倍容
のエタノールを界面を乱さないようにゆっくりと添加し
、界面に生じた染色体ＤＮＡをパスツールピペットでま
き取った。まき取ったＤＮＡは７０％エタノール、９０
％エタノール、ｌ００％エタノールの順にリンスし、乾
燥後、ＴＥバッファ（１０ｎｃＭ　　｝リスー塩酸、１
　ｍＭ　ＥＤＴＡ　　ｐＨ８．０）に溶解した． プロー゛の八 一般に、ｃＤＮＡを用いてそのジエノミック遺伝子をク
ローニングする場合、ｃＤＮＡ自体をプローブにしてハ
イブリダイゼーションする場合が多い。ところが目的の
遺伝子がファミリーを形威している場合や、偽遺伝子を
有している場合には、ｃＤＮＡをプローブとして用いる
とその特異性が低くなってしまう。そこでアルカリプロ
テアーゼ遺伝子のクローニングには、ｃＤＮＡの配列（
特願昭６３−　１７００１８号）のうち、５′側と３′
側の非翻訳領域を基にした合或オリゴヌクレオチドをプ
ローブとして用いた。合戊したオリゴヌクレオチドの配
列を以下に示す。

ＡＰ−２３；　　　５′＞　　ＧＣＧ　　ＣＡＡ　　Ｇ
ＡＡ　　ＣＡＡ　　ＣＴＣ　　ＡＡＧ　　ＴＣＧ　　Ｇ
ＡＧＧＡＴ　ＡＧＡ　＜３′ ＡＰ−２４：　　５”＞　ＣＡＴ　ＧＴＡ　ＣＡＧ　Ａ
ＧＴ　ＡＴＡ　ＣＴＴ　ＡＴＧ　ＧＴＡＧＴＡ　　ＧＴ
Ｃ　　＜３′ ＡＰ−２３は、アルカリプロテアーゼｃＤＮＡ（特願昭
６３−１７００１８号）の５′側非翻訳領域の配列を基
に設計した３０塩基長（ｍａｒ）のオリゴヌクレオチド
で、ＡＰ−２４は３′側非翻訳領域の配列を基に設計し
た３０ｍａｒのオリゴヌクレオチドである。これらのオ
リゴヌクレオチドは製造業者により指示された試薬と方
法を用いて、ＤＮＡ合戒機（３８１Ａ）　（アプライド
　バイオシステム社製）で合威した。合成オリゴヌクレ
オチドの放射性標識は、［ｒ−″２Ｐｌａｒｐ（アマシ
ャム社製）とＴ４ボリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造製
）を用いて行った。

３．サザーン　ハイブＩ　イゼーシゴン前項で作製した
合或オリゴヌクレオチドプローブを用い、アスペルギル
ス・オリゼーＡＴＣＣ２０３８６株の染色体ＤＮＡに対
し、サザーン　ハイブリダイゼーション法によって、ア
ルカリプロテアーゼ遺伝子の解析を行った。まず、アス
ペルギルス・オリゼーの染色体ＤＮＡをいくつかの制限
酵素（例えば、ＢａｍＨ　Ｉ　＋　ＥｃｏＲ　Ｉなど）
で消化後、アガロースゲル電気泳動にて分離した。泳動
後、サザーン　トランスファー法により、ＤＮＡをニト
ロセルロースフィルターにプロッテイングした。サザー
ン　トランスファー法としては、Ｍａｎｆａｔｉｓらの
方法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，　Ａ　Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ＋Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒ
ｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ．　　Ｃ
ｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａ−ｒｂｏｒ，　ＮＹ．（１
９８２））に従った。ハイプリダイゼーシ．ンは、６　
ＸＳＳＣ（０．９Ｍ　ＮａＣｌ，０．０９Ｍクエン酸三
ナトリウム），　０．５％ラウリル硫酸ナトリウム，５
×デンハルツ溶液（０．１％　フィコール，０，１％ポ
リビニルビロリドン，０．１％　ウシ血清アルプミン）
，０．０ＩＭ　ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０），　１００ｔｌ
ｇ／ｍ１｝ランスファ一ＲＮＡの溶液中で４２゜Ｃで行
った。プローブは、約１．　Ｏ　ＸＩＯ’　ｃｐｍ／ｒ
ｄの濃度で添加した。洗浄は６×ＳＳＣ，　０．５％ラ
ウリル硫酸ナトリウムの溶液を用い、４５゜Ｃで３回行
った。フィルターを風乾後、−８０゜ＣでＸ線フィルム
（富士フィルム製ＲＸ）にかけ、オートラジオグラフ像
を得た。その結果、ＡＰ−２３，ＡＰ−２４の両プロー
ブともアスペルギルス・オリゼー染色体制限酵素消化物
に対し、単一で明瞭なバンドが得られた。

４　−イブ−１−の　１ 前項のサザーン　ハイブリダイゼーションの結果、ＡＰ
−２３１ローブを用いた場合、アスペルギルス・オリゼ
ー染色体ＤＮＡのＢｇｌ　ＩＩ消化物に対し、約６．　
５　ｋｂのハンドが見られ、ＡＰ−２４では旧ｎｄＩ［
Ｉ消化物に対し、約４．５ｋｂのバンドが見られた。Ｂ
ｇｌ　ｎ及びＨｉｎｄ　ＩＩＩは、アルカリプロテアー
ゼｃＤＮＡ中に存在する制限酵素であるため、両制限酵
素ＤＮＡ断片をクローニングすることで、アルカリプロ
テアーゼ遺伝子のほぼ全領域をクローニングできると考
えられる。そこで、これらの制限酵素を用いたアスベル
ギルス・オリゼーのジェノミックライブラリーを作製し
た。まず、第１項で調製したアスペルギルス・オリゼー
の染色体ＤＮＡ約２００ｕｇを５００ｕｎｉｔのＢｇｌ
　ＵおよびＨｉｎｄｌｎ　（宝酒造製）で３７゜Ｃ，一
夜消化し、０．８％のアガロースゲル電気泳動（３０Ｖ
で一夜）を行い、同時に泳動した分子量マーカーのサイ
ズ・を基に、ＢｇｌＩＩ消化物に対しては５．０〜？．
Ｏｋｂ　（キロベース〉の大きさのＤＮＡ断片を、Ｈｉ
ｎｄｌＩ［消化物に対しては３．０　〜５．０ｋｂのＤ
ＮＡの断片をそれぞれ抽出、精製した。アガロースゲル
からの抽出精製は、Ｍａｎｉａｔｉｓ　（前述）の方法
を用いて行うことができる。一方、ベクターとしてはｐ
Ｕｃ１９を用い、Ｂｇｌ　ＩＩと同じ平滑末端を生じる
Ｂａｍ｝ｌ　Ｉおよび旧ｎｄＩ［Ｉで消化後、アルカリ
フォスファターゼ（宝酒造製）で末端を脱リン酸化して
、セルフライゲーションを防止した。

前記のＢｇｌ　ＩＩ消化物の５．０〜？．ＯｋｂＤＮＡ
断片とＢａｗｌ　Ｉ消化したｐＵｃ１９、旧ｎｄＩＩＩ
消化物の３．０〜５，ＯｋｂＤＮＡ断片と旧ｎｄＩ［消
化したｐＵｃ１９をそれぞれ混合し、“ライゲーション
キット（宝酒造製）”によりライゲーションを行い、そ
の混合物を用いてｔＪｓ菌ＨＢ　１０１株のコンビテン
トセル（宝酒造製〉を形質転換した。形質転換した大腸
菌は、その一部は形質転換頻度測定のためにＬ寒天培地
（１％トリプトン、０．５イーストエクストラクト、１
％ＮａＣｌ、１．５％寒天）にプレーティングを行い、
残りはさらに５０倍容のＬ−ブロス（１％トリブトン、
０．５％イーストエクストラクト、ｌ％ＮａＣ１）を添
加し、３７℃で一夜培養してコロニーを増幅させた後、
アスペルギルス・オリゼー　ジェノミックライブラリー
として−８０″Ｃで保存した。

５．コロニー　ハイブ　　イゼーシゴンコロニー　ハイ
プリダイゼーションは以下に示した様に行った。まず、
アスペルギルス・オリゼー　ジエノミッタライブラリー
を、直径１　５０ｍｍプレートあたり約ｉｏ．ｏｏｏク
ローンになるようにブレーティングし、３７℃で一夜培
養した。プレートの培地には５０μｇ／ｔａｌｌの濃度
でアンビシリンを添加したＬ寒天培地を用いた。培養後
、ナイロンフィルターＣＮＥＮ製Ｃｏｌｏｎｙ／Ｐｌａ
ｑｕｅ　Ｓｃｒｅｅｎ）を寒天の上から静かに乗せてコ
ロニーをナイロンフィルターに移した。コロニーを移し
たナイロンフィルターは０．５Ｎ　ＮａＯＨに浸して溶
菌、ＤＮＡを変性させた後、ＩＭ　　｝リス塩酸（ｐＨ
７．５）溶液に浸して中和し、乾燥させて変性したＤＮ
Ａを固定した。ハイプリダイゼーションは、作製したフ
ィルターをビニールバックに入れ、サザーン　ハイプリ
ダイゼーションの場合と同じ条件で行った。その結果、
ＡＰ−２３及びＡＰ−２４の両プロープともハイブリダ
イズするクローンがいくつか得られた。これらのクロー
ンよりアルカリーＳＯＳ法（Ｍａｎｉａｔｉｓ，　ｆｆ
ｆ述）にてプラスミドＤＮＡを抽出し、ジデオキシ法に
よって塩基配列を決定したところアルカリプロテアーゼ
のｃＤＮＡ配列と一致した。

ＡＰ−２３ブローブとハイブリダイズする約６．５ｋｂ
のＢｇＩＩ１断片を含むプラスミドをｐＡＰＯ１？、Ａ
Ｐ−２４プローブとハイブリダイズする約４．５ｋｂの
旧ｎｄＩ［断片を含むプラス果ドをｐＡＰＯ２５として
以下解析を進めた。

前項で得たｐＡＰＯ１７およびｐＡＰＯ２５について、
いくつかの制限酵素で消化後、アガロースゲル電気泳動
により断片パターンを観察することによりそれらの制限
酵素断片地図を作製した。その結果を第１図に示す。両
プラス果ドが含んでいた遺伝子断片は、旧ｎｄｌｌｌと
Ｂｇｌ　Ｉｔ部位の間で重複しており、両プラスミドで
アルカリプロテアーゼ遺伝子のほぼ全領域をクローニン
グできた。そこで第２図に示す様に適当な制限酵素部位
を使ってＤＮＡ配列の決定を行った。ＤＮＡ配列の決定
法としてはジデオキシ法を用い、その反応は“Ｍ１３シ
ークエンスキット″（宝酒造製）、ポリアクリルアミド
電気泳動は“ＤＮＡ塩基配列分析用電気泳動装置゛（宝
酒造製）を用いて行った。得られたジェノミック遺伝子
の塩基配列と、アルカリプロテアーゼｃＤＮＡの塩基配
列（特願昭６３−１７００１８号）を比較し、アルカリ
プロテアーゼ遺伝子にはそのプレプロ頌域に１箇所、成
熟蛋白質領域に２箇所の計３箇所のイントロン配列が存
在している事が分った． 一　　　占の゛ クローニングしたアルカリプロテアーゼ遺伝子のプロモ
ーター領域を解析するため、転写開始点の決定を行った
。転写開始点の決定には、Ｓ１マッピング法やプライマ
ー　エクステンション法があるが、本実験ではプライマ
ー　エクステンション法で行った．プライマーとしては
、アルカリプロテアーゼ蛋白の１２番目から１７番目（
プレ領域内）のアミノ酸をコードしているＤＮＡの逆鎖
を基に合威したオリゴヌクレオチドを用いた。以下にそ
の配列を示す。

ＡＰ−２６：　　５’＞　ＣＧＣ　ＧＧＧ　ＡＡＧ　Ｇ
ＡＴ　ＡＧＣ　ＴＣＣ　＜３’ＡＰ−２６の配列をアプ
ライド　バイオシステム社製“’ＤＮＡ合戒機（３８１
Ａ）”゜で合成した。合成したオリゴヌクレオチドの精
製は、アプライド　バイオシステム社製′゜オリゴヌク
レオチド精製カートリッジ”を用いた。ＡＰ−２６の末
端ラベリングは［γ−”Ｐ］ＡＴＰとＴ４ポリヌクレオ
チドキナーゼを用いて行った。反応は５０ｍＭ　　｝リ
スー塩酸（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ　ＭｇＣｈ，　１０
ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）の溶液中で３７゜Ｃ
，　　１時間反応させた。ラベルに用いられなかった［
γ一”Ｐ］ＡＴＰは“ＮＥＮＳＯＲＢ”２０”゜カラム
（Ｎ　Ｅ　Ｎ製）を使って除去し、以上の操作でｌμｇ
ＤＮＡ当り約１０’ｃρｍの放射活性を持つオリゴヌク
レオチドが得られた。

次に、アルカリプロテアーゼｃＤＮＡのクローニングの
際に鋳型として用いたｍＲＮＡ（特願昭６３−　１７０
０１８号）約３μｇと０Ｐでラベルした上記プライマー
ＡＰ−２６約Ｌｏｎｇを混合して６μｌとし、それにｌ
μｌの１０×逆転写酵素用バッファ一（５０１　トリス
ー塩酸ｐＨ８．０、５００ｍＭ　ＫＣＩ，　１００ｍＭ
ＭｇＣ１ｚ）を添加し、７０″Ｃで５分間加熱処理後、
室温で２０分間放置し、プライマーとｍＲＮＡのアニー
リングを行った。

次にこの溶液に１０ｍＭ　ＤＴＴ　　ｌμｌ、２０ｍＭ
　ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ，　ｄＧＴＰ．　ｄＣＴＰ，　ｄ
ＴＴＰの等モル混合物）、リボヌクレアーゼインヒビタ
ー（１１７ｕｎｉｔｓ／　ｕ　ｌ　，宝酒造製）０．５
μｌ、逆転写酵素（宝酒造製２２ｕｎｉｔｓ／μｆ）０
．５μ２を添加し、４２゜Ｃで１時間反応させた後、ホ
ルムアミド溶液（９５％ホルムアミド、０．１キシレン
シアノール、０．１％ブロムフェノールブルー）　１０
μｌを添加して反応を停止した。

次に上記で得られた反応液１〜３μｌを、６％アクリル
アミドー尿素ゲルにアブライした。同時に、ｐＡＰＯ１
７を鋳型とし、ＡＰ−２６をプライマーとしてジデオキ
シ反応させた液をサイズマーカーとして同じゲルに泳動
した。この結果、プライマーエクステンションした反応
液ではバンドが３本見られ、アルカリプロテアーゼ遺伝
子の転写開始点は３箇所存在する事がわかった。その結
果を第４図に示す。決定した最上流の転写開始点の３０
〜４０塩基上流に、いわゆるＴＡＴＡボックスと考えら
れる配列ＴＡＴＡＡＡＴが存在しており、８０〜９ｏ塩
基上流には、ＣＡＡＴボックスと考えられる配列ＣＣＡ
ＡＡＴが存在している。

８．アルカリプロテアーゼゲノム遺伝子の連結２つのＤ
ＮＡ断片（ｐＡＰＯ１７，　ｐＡＰＯ２５）にクローニ
ングされたアルカリプロテアーゼゲノム遺伝子を連結す
るために第５図に示した操作を行った。まず、約５０ｕ
ｇのｐＡＰＯ１７をＮｃｏＴ　（宝酒造製）で消化後、
“ＤＮＡプランティングキット′”　（宝酒造製）を用
いて平滑末端化した。この消化断片にＢａｍＨ　Ｉリン
カー（宝酒造！！！）　　５μｇを混合し、“ＤＮＡラ
イゲーションキノト”　（宝酒造製）を用いて両者をラ
イゲーションし、エタノール沈澱でＤＮＡを精製後、Ｂ
ａｍＨ　ｒおよび旧ｎｄＩ［［（宝酒造製）で消化した
。このＤＮＡ混合物を１％アガロースゲル電気泳動によ
り分離し、アルカリプロテアーゼゲノム遺伝子の５′側
を含む約１２００ｂｐのＤＮＡ断片をゲルから回収、精
製した。ゲルからのＤＮＡ回収法は、Ｍａｎｉａｔｉｓ
ら（前述）の方法で行うことができる。一方、ｐＡＰＯ
２５は、約５０　ｐ　ｇをＰｓｔｌ　（宝酒造製）を消
化後、”　Ｄ　Ｎ　Ａプランティングキット”（宝酒造
製）で平滑末端にし、同様にＢａｍＨ　Ｉリンカー５μ
ｇを混合して“ＤＮＡライゲーションキット゛（宝酒造
製）を用いてライゲーションした。

ライゲーション後、エタノール沈澱により精製し、Ｂａ
ｍＨ　Ｉおよび旧ｎｄＩ［Ｉで消化した。

このＤＮＡ消化物を１％アガロースゲル’Ｑｌｌ？Ｃ　
泳動により分離し、アルカリプロテアーゼゲノム遺伝子
の３′側を含む約１８００ｂｐのＤＮＡ断片をゲルから
回収、精製した。

前述のアルカリプロテアーゼ５′側ＤＮＡ断片（約１２
００ｂｐ，　ＢａｍＨＩ／Ｈｉｎｄ　ｍ断片）と３′側
ＤＮＡ断片（約１８００ｂｐ．　Ｂａｍｌ｛Ｉ／Ｈｉｎ
ｄ　ＩＩＩ断片）をそれぞれ約３μｇずつ混合し、“Ｄ
ＮＡライゲーションキット”によりライゲーション後、
ＢａｍＨ　Ｉで消化した。

消化したＤＮＡをｌ％アガロースゲル電気泳動で分離し
、目的の大きさのＤＮＡ断片（約３　ｋｐ）を回収、精
製した。このアルカリプロテアーゼゲノム遺伝子を含む
ＤＮＡ断片をＢａｍＨ　Ｉで消化したｐｌｌｃ１９と混
合してライゲーション後、大腸菌ＪＭ１０９株コンビテ
ントセル（宝酒造製）に導入し、アンピシリン耐性を獲
得した形質転換株をスクリーニングすることで目的のプ
ラスξドｐＡＰ１７２５（宝酒造製）を有するクローン
を得た。ｐＡＰ１？２５は、ｐｕｃ１９のＢａ＋ｎＨ　
１部位に、アルカリプロテアーゼゲノム遺伝子（約３ｋ
ρ）が挿入されたＤＮＡである。

９．発現ベクターの作製 アルカリプロテアーゼ遺伝子のプロモーターターミネー
ターを用いた発現ベクターの作製は第６図に示したスト
ラテジーで行った。

まず、ターミネーター領域を単離するため、約１０μｇ
のＩ）ＡＰＯ２’）をＡｎｌｌ（宝酒造製）で消化後゛
ＤＮＡプランテイングキット゜゛　（宝酒造製）を用い
て切断箇所を平滑末端化した。エタノール沈澱により精
製した後、さらにＰｓｔｌ　（宝酒造製）で消化し、１
％アガロースゲル電気泳動により消化断片を分離した。

このうちアルカリプロテアーゼのターξネーター領域の
ＤＮＡ断片（約５００ｂｐ）をアガロースゲルより抽出
、精製した。一方、ベクターとなるｐＵｃ１９をＰｓｔ
ｌおよび旧ｎｃＩＩ（宝酒造製）で消化後、アルカリフ
ォスファターゼ（宝酒造製）で切断点を脱リン酸化させ
た．この切断したベクター（約１００ｎｇ）と前述のタ
ーミネーターＤＮＡ断片（約５００ｂｐ）を混合し、“
ＤＮＡライゲーションキット″　（宝酒造製）でライゲ
ーションし、その混合物で大腸菌ＪＭ１０９株（宝酒造
製）を形質転換した．アンピシリン耐性を獲得したクロ
ーンから、プラスミドＤＮＡを抽出してスクリーニング
を行い、目的のブラス逅ドｐＡＰＯ４４を得た。

次にプロモーター領域を単離するため、約１０ｕｇのｐ
ＡＰＯ１７をＮｃｏｌ　（宝酒造製）で消化後”　Ｄ　
ＮＡプランティングキット”を用いて切断箇所を平滑末
端化した．エタノール沈澱後、ＥｃｏＲ　Ｉリニカー（
宝酒造製）２μｇと混合し“’ＤＮＡライゲーションキ
ット”を用いてライゲーションした。

ライゲーションしたＤＮＡ混合物をＥｃｏＲ　ｌおよび
ＦｓｐＩ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂ社製
）で消化し、１％ハガロースゲル電気作動により消化断
片を分離した。分離したＤＮＡ断片のうち、アルカリプ
ロテアーゼ　プロモーター領域を含むＤＮＡ断片（約１
１００ｂｐ）をアガロースゲルより抽出、精製した。

次に、ターミネーター領域をサブクローニングしたプラ
スミドｐＡＰＯ４４約１０μｇをＥｃｏＲ　ＩおよびＳ
ｍａｌ　（宝酒造製）で消化後、アルカリフォスファタ
ーゼで脱リン酸化したもの（約１００ｎｇ）と前記のプ
ロモーター断片（約１１００ｂｐ，約１００ｎｇ）を混
合し“ＤＮＡライゲーションキット”によりライゲーシ
ゴンし、大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した。得られた
アンビシリン耐性株からプラスミドＤＮＡを抽出してス
クリーニングを行い、目的のプラスミドｐＡＰＯ４５を
得た。ｐＡＰＯ４５はアルカリプロテアーゼのプロモー
ター、ターミネーターが連結されたブラスミドで、単一
認識部位であるＢａｗｌ｛　１部位に異種道伝子を挿入
する事で発現させうるベクターである。

【図面の簡単な説明】

第ｌ図は黄麹菌アルカリプロテアーゼのゲノム遺伝子の
制限酵素地図、第２図は黄麹菌アルカリプロテアーゼプ
ロモーターを含む黄麹菌アルカリプロテアーゼのゲノム
遺伝子上流域の塩基配列を示す図、第３図は黄麹菌アル
カリプロテアーゼターξネーターを含む黄麹菌アルカリ
プロテアーゼ遺伝子下流域の塩基配列を示す図、第４図
は黄麹菌アルカリプロテアーゼのゲノム遺伝子の全塩基
配列を示す図、第５図はアルカリプロテアーゼゲノム遺
伝子の連結手順を示す図、第６図は発現ベクターｐＡＰ
Ｏ４５の作或手順を示す図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、黄麹菌のアルカリプロテアーゼのゲノム遺伝子由来
   のアルカリプロテアーゼプロモーター。 ２、下記の塩基配列を有する請求項１記載のアルカリプ
   ロテアーゼプロモーター。 【遺伝子配列があります。】 ３、黄麹菌のアルカリプロテアーゼのゲノム遺伝子由来
   のアルカリプロテアーゼターミネーター。 ４、下記の塩基配列を有する請求項３記載のアルカリプ
   ロテアーゼターミネーター。 【遺伝子配列があります。】 ５、請求項１又は２記載のアルカリプロテアーゼプロモ
   ーター及び請求項３又は４記載のアルカリプロテアーゼ
   ターミネーターからなる遺伝子発現用ユニット。 ６、請求項１記載のアルカリプロテアーゼプロモーター
   領域及び請求項３記載のアルカリプロテアーゼターミネ
   ーター領域を含みかつ３つのイントロン配列を含む黄麹
   菌のアルカリプロテアーゼのゲノム遺伝子。 ７、下記の制限酵素切断地図で表される請求項６記載の
   アルカリプロテアーゼのゲノム遺伝子。 ▲数式、化学式、表等があります▼ ８、下記の塩基配列を有する請求項６または７記載のア
   ルカリプロテアーゼのゲノム遺伝子。 【遺伝子配列があります。】 【遺伝子配列があります。】 【遺伝子配列があります。】