BRPI0718518A2 - Marcador selecionável de acetolactato sintase (als) de trichoderma reesei - Google Patents

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MARCADOR SELECIONÁVEL DE ACETOLACTATO SINTASE (ALS) DE TRICHO- DERMA REESEr.

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS O presente pedido reivindica prioridade dos pedidos de patente

provisórios dos Estados Unidos US 60/846.804, depositado em 22 de se- tembro de 2006, e US 60/846.656, depositado em 22 de setembro de 2006, ambos aqui incorporados a título de referência em sua totalidade. Antecedentes da Invenção Plantas, fungos e bactérias sintetizam os aminoácidos valina,

Ieucina e isoleucina através de um curso comum. Uma das enzimas neste curso é acetolactato sintase (ALS) (de outro modo conhecida como acetoi- droxiácido sintase ou AHAS), que converte piruvato em 2-acetolactato como a primeira etapa na síntese de valina e leucina, e também converte piruvato 15 e 2-cetobutirato em 2-aceto-2-hidroxibutirato, o precursor de isoleucina. A atividade de acetolactato sintase do tipo selvagem é sensível à ação de vá- rias classes conhecidas de compostos tóxicos, incluindo compostos sulfoni- Iureia e imidazolinona. Deste modo, tais compostos tóxicos podem ser em- pregados para matar células contendo proteínas acetolactato sintase que 20 são sensíveis a esses compostos.

Essa descrição refere-se a enzimas acetolactato sintase que provêem resistência a compostos tóxicos, e então são marcadores selecio- náveis úteis para células recombinantes.

Sumário da Invenção Uma proteína acetolactato sintase que provê resistência a inibi-

dores de ALS, por exemplo, compostos sulfonilureia e imidazolinona, é pro- vida, bem como polinucleotídeo codificando a mesma. Em certas modalida- des, a seqüência de aminoácido da proteína acetolactato é pelo menos 80% idêntica à SEQ ID NO:1, a proteína acetolactato do tipo selvagem de Tricho- 30 derma reesei. Em modalidades particulares, a proteína ALS pode conter um aminoácido ácido na posição 190, um aminoácido ácido na posição 241 ou uma histidina na posição 372. Em algumas modalidades, o gene ou polipep- tídeo de ALS pode ser empregado como um marcador selecionável em uma variedade ampla de espécies. Em certos casos, a proteína pode ser de ocor- rência não-natural.

Em certas modalidades, um polinucleotídeo codificando ALS pode ser operavelmente ligado a um promotor e um terminador para prover expressão da proteína conferindo resistência a inibidor de ALS em uma célu- la hospedeira. O promotor e o terminador podem ser endógenos para a célu- la hospedeira em que o polinucleotídeo deve ser empregado e, em certos casos, o promotor e o terminador podem ser o promotor e o terminador de um gene de ALS da célula. O polinucleotídeo pode, em certas modalidades, conter uma estrutura de leitura aberta única codificando a proteína acetolac- tato sintase, caso onde o polinucleotídeo pode ser pelo menos 70% idêntico a ou pode hibridizar com SEQ ID NO.:2. Em outras modalidades, o polinu- cleotídeo pode compreender íntrons, caso onde o polinucleotídeo pode ter uma seqüência de nucleotídeo que é pelo menos 70% idêntica a ou pode hibridizar com SEQ ID NO.:4. Em outras modalidades, o polinucleotídeo po- de ser otimizado no códon para expressão da proteína acetolactato sintase em uma célula hospedeira particular.

Um vetor compreendendo o polinucleotídeo é também provido. Em adição ao polinucleotídeo, o vetor objeto pode conter um cassete de ex- pressão para expressão de uma proteína recombinante, por exemplo, uma enzima ou proteína terapêutica, na célula.

Uma célula hospedeira compreendendo o polinucleotídeo objeto é também provida. Em certas modalidades, a célula hospedeira é resistente 25 a um inibidor de ALS, por exemplo, um composto sulfonilureia ou imidazoli- nona tóxico. A célula hospedeira pode ser qualquer célula que seja sensível ao inibidor de ALS na ausência do polinucleotídeo. Em certas modalidades, a célula hospedeira pode ser uma célula de planta, por exemplo, uma célula de milho, soja ou Arabidopsis, uma célula fúngica, por exemplo, uma célula 30 fúngica filamentosa tal como uma célula de Trichoderma sp. ou Aspergillus sp. ou uma célula bacteriana, por exemplo, um Bacillus sp. Em modalidades particulares, a célula hospedeira é um fungo filamentoso. A célula pode estar presente in vivo ou em um organismo multicelular (por exemplo, uma planta). O polinucleotídeo pode estar presente em um genoma da célula hospedeira ou pode estar presente em um vetor que replica autonomamente na célula hospedeira.

É também provido um método de seleção de uma célula. Em

certas modalidades, o método inclui: introdução de um polinucleotídeo objeto que codifica uma ALS em uma pluralidade de células, contato da pluralidade de células com um inibidor de ALS e cultura das células para prover seleção da célula. Em certas modalidades, a célula é uma célula fúngica. A célula 10 pode ser culturada em um meio líquido contendo o inibidor de ALS ou um meio sólido contendo o inibidor de ALS. Esses métodos podem também in- cluir introdução de um segundo polinucleotídeo na célula hospedeira, onde o segundo polinucleotídeo codifica um polipeptídeo que deve ser produzido pela célula hospedeira. O polinucleotídeo objeto e o segundo polinucleotídeo 15 podem estar presentes no mesmo ácido nucleico ou um diferente, por e- xemplo, o mesmo vetor ou vetores diferentes. Se vetores diferentes forem empregados, eles podem ser cotransformados nas mesmas células.

São também providas modalidades relacionando-se aos promo- tores 1818A e 1818B.

Breve Descrição das Figuras

A figura 1 mostra a seqüência de aminoácido da proteína aceto- lactato sintase do tipo selvagem de T. reesei(SEQ ID NO.:1).

A figura 2 mostra a seqüência de nucleotídeo de um cDNA de- duzido de T. reesei (SEQ ID NO.:1) codificando a proteína acetolactato do tipo selvagem da figura 1.

A figura 3 mostra a seqüência de nucleotídeo de um gene de T. reesei (SEQ ID NO.:3) codificando a proteína acetolactato sintase do tipo selvagem da figura 1, em que o promotor está em itálico, a seqüência codifi- cando ALS está sublinhada (SEQ ID NO.:4) e a seqüência terminadora está em itálico e sublinhada.

A figura 4 é um diagrama geral de um vetor que pode ser usado para testar o marcador de ALS, em que o vetor inclui dois genes. Q primeiro gene corresponde a um polinucleotídeo codificando uma proteína de interes- se (por exemplo, uma enzima glicoamilase) e o segundo gene corresponde a um polinucelotídeo codificando o marcador de ALS.

As figuras 5A e 5B mostram a seqüência de nucleotídeo dos promotores 1818A (SEQ ID NO.:7) e 1818B (SEQ ID NO.:8), respectivamen- te.

A figura 6 mostra a seqüência de nucleotídeo (SEQ ID NO.:9) do vetor pTrex-glicoamilase usado para testar o marcador de ALS que compre- ende o promotor de cbhl de Trichoderma reesei, AttBI, um polinucleotídeo 10 codificando uma glicoamilase de Trichoderma reesei, attB2, o terminador de cbM de Trichoderma reesei e um marcador de ALS (A190D) no vetor de E. coli pSL1180.

A figura 7 ilustra um gel SDS-PAGE de amostras de sobrena- dante de transformante cultivado em frasco de agitação. A faixa 1 mostra o controle não-transformado. Expressão de glicoamilase de T. reesei é mos- trada nas faixas 3 e 4 como destacado pela seta.

A figura 8 é um diagrama do vetor usado para testar os promo- tores 1818A e 1818B.

A figura 9 mostra a seqüência de nucleotídeo de um construto usado para testar os promotores 1818A e 1818B (SEQ ID N0:10).

Descrição Detalhada Definições

A menos que de outro modo aqui definido, todos os termos téc- nicos e científicos usados aqui têm o mesmo significado que geralmente co- 25 nhecido por uma pessoa comum versada na técnica à qual a presente in- venção pertence. Singleton e outros, Dictionary of Microbiology and Molecu- lar Biology, 2a Ed., John Wiley and Sons, Nova York (1994) e Hale & Ma- rham, The Harper Collins Dictionary of Biology, Harper Perennial, NY (1991) provê um versado na técnica com dicionários gerais de muitos dos termos 30 usados na presente invenção. Embora quaisquer métodos e materiais simila- res ou equivalentes àqueles descritos aqui possam ser usados na prática ou teste da presente invenção, os métodos e materiais preferidos são descritos. Todas as patentes e publicações, incluindo todas as seqüências descritas dentro de tais patentes e publicações, referidas aqui são expres- samente incorporadas a título de referência.

Faixas numéricas são inclusivas dos números definindo a faixa.

A menos que de outro modo indicado, ácidos nucleicos são escritos da es- querda para a direita na orientação 5' a 3', seqüências de aminoácido são escritas da esquerda para a direita em orientação amino para carbóxi, res- pectivamente.

Os cabeçalhos providos aqui não são limitações dos vários as- pectos ou modalidades da invenção que possam ter tido por referência ao relatório como um todo. Deste modo, os termos definidos imediatamente abaixo são mais completamente definidos por referência ao relatório como um todo.

Conforme aqui usado, o termo "marcador selecionável" refere- se a um gene ou polinucleotídeo cuja expressão permite identificação de células que foram transformadas com um construto ou vetor de DNA con- tendo o gene ou polinucleotídeo. Marcadores selecionáveis podem prover resistência a compostos tóxicos tal como antibióticos, herbicidas e similares.

O termo "acetolactato sintase (ALS)" refere-se a uma enzima 20 que tem uma atividade definida como EC 2.2.1.6 de acordo com IUBMB Enzyme Nomenclature. A enzima catalisa uma reação entre duas moléculas de piruvato para produzir 2-acetolactato e CO2. A enzima requer tiamina di- fosfato e pode ser referida como acetoidroxiácido sintase (AHAS) em outro lugar.

O termo "inibidor de ALS" refere-se a um composto que inibe

proteína ALS do tipo selvagem e é tóxico para células que contêm ALS do tipo selvagem. Tais compostos incluem herbicidas conhecidos e incluem um composto sulfonilureia, imidazolinona, triazolopirimidina, pirimidiniltiobenzoa- to ou sulfonilamino-carbonil-triazolinona discutidos abaixo.

O termo "promotor" é definido aqui como um ácido nucleico que

direciona a transcrição de um polinucleotídeo a jusante em uma célula. Em certos casos, o polinucleotídeo pode conter uma seqüência de codificação e o promotor pode direcionar a transcrição da seqüência de codificação em RNA traduzível.

O termo "isolado" conforme aqui definido significa um composto, uma proteína, célula, seqüência de ácido nucleico ou aminoácido que é re- 5 movido de pelo menos um componente com o qual ele é naturalmente asso- ciado.

O termo "seqüência de codificação" é definido aqui como um á- cido nucleico que, quando posto sob o controle de sequências-controle a- propriadas incluindo um promotor, é transcrito em mRNA que pode ser tra- 10 duzido em um polipeptídeo. Uma seqüência de codificação pode conter uma estrutura de leitura aberta única, ou várias estruturas de leitura aberta sepa- radas por íntrons, por exemplo. Uma seqüência de codificação pode ser cD- NA, DNA genômico, DNA sintético ou DNA recombinante, por exemplo. Uma seqüência de codificação geralmente inicia em um códon de início (por e- 15 xemplo, ATG) e termina em um códon de parada (por exemplo, UAA, UAG e UGA).

O termo "recombinante" refere-se a um polinucleotídeo ou poli- peptídeo que não acontece naturalmente em uma célula hospedeira. Uma molécula recombinante pode conter duas ou mais seqüências de ocorrência natural que são ligadas de uma maneira que não acontece naturalmente.

O termo "heterólogo" refere-se a elementos que não estão nor- malmente associados um com o outro. Por exemplo, uma proteína heterólo- ga é uma proteína que não é produzida em uma célula hospedeira do tipo selvagem, um promotor heterólogo é um promotor que não está presente em 25 ácido nucleico que é endógeno para uma célula hospedeira do tipo selva- gem e um promotor operavelmente ligado a uma seqüência de codificação heteróloga é um promotor que é operavelmente ligado a uma seqüência de codificação que não é geralmente operavelmente ligada a uma célula hos- pedeira do tipo selvagem.

O termo "operavelmente ligado" refere-se a uma disposição de

elementos que permite que eles sejam funcionalmente relacionados. Por exemplo, um promotor é operavelmente ligado a uma seqüência de codifica- ção se ele controlar a transcrição da seqüência, e uma seqüência de sinal é operavelmente ligada a uma proteína se a seqüência de sinal direcionar a proteína através do sistema de secreção de uma célula hospedeira.

O termo "ácido nucleico" compreende DNA, RNA1 de filamento simples ou duplo e modificações dos mesmos. Os termos "ácido nucleico" e "polinucleotídeo" podem ser usados intercomutavelmente aqui.

O termo "construto de DNA" conforme aqui usado significa uma seqüência de ácido nucleico que compreende pelo menos dois fragmentos de polinucleotídeo de DNA.

O termo "seqüência de sinal" ou "peptídeo de sinal" refere-se a

uma seqüência de aminoácidos na porção N-terminal de uma proteína que facilita a secreção da forma madura da proteína fora da célula. A forma ma- dura da proteína extracelular não tem a seqüência de sinal que é clivada durante o processo de secreção.

O termo "vetor" é definido aqui como um polinucleotídeo feito

para carregar seqüências de ácido nucleico a serem introduzidas em um ou mais tipos de célula. Vetores incluem vetores de clonagem, vetores de ex- pressão, vetores de embaralhamento, plasmídeos, fagos ou partículas de vírus, construtos de DNA, cassetes e similares. Vetores de expressão po- 20 dem incluir seqüências reguladoras tal como promotores, seqüências de si- nal, uma seqüência de codificação e terminadores de transcrição.

Um "vetor de expressão" conforme aqui usado significa um construto de DNA compreendendo uma seqüência de codificação que é ope- ravelmente ligada a sequências-controle adequadas capazes de realizar ex- 25 pressão de uma proteína em um hospedeiro adequado. Tais sequências- controle podem incluir um promotor para realizar a transcrição, uma seqüên- cia operadora adicional para controlar transcrição,uma seqüência codifican- do sítios de ligação de ribossomo adequados no mRNA, realçadores e se- qüências que controlam término de transcrição e tradução.

Conforme aqui usado, os termos "polipeptídeo" e "proteína" são

usados intercomutavelmente e incluem referência a um polímero de qual- quer número de resíduos de aminoácido. Os termos se aplicam a polímeros de aminoácido onde um ou mais resíduos de aminoácido são um análogo químico artificial de um aminoácido de ocorrência natural correspondente, bem como a polímeros de aminoácido de ocorrência natural. Os termos também se aplicam a polímeros contendo substituições de aminoácido con- 5 servativas de modo que o polipeptídeo permanece funcional. "Peptídeos" são polipeptídeos tendo menos do que 50 resíduos de aminoácidos.

Uma "célula hospedeira" é uma célula que contém um ácido nu- cleico recombinante objeto, ou no genoma da célula hospedeira ou em um vetor extracromossomal que replica autonomamente a partir do genoma da célula hospedeira. Uma célula hospedeira pode ser qualquer tipo de célula.

O termo "fungos filamentosos" refere-se a todas as formas fila- mentosas da subdivisão Eumycotina (Vide Alexopoulos, C.J. (1962), IN- TRODUCTORY MYCOLOGY, Wiley, Nova York). Esses fungos são caracte- rizados por um micélio vegetativo com uma parede celular composta de qui- 15 tina, glicanas e outros polissacarídeos complexos. Os fungos filamentosos da presente invenção são morfologicamente, fisiologicamente e genetica- mente distintos de leveduras. Crescimento vegetativo por fungos filamento- sos é através de alongamento hifal e catabolismo de carbono é aeróbico o- brigatório.

Uma célula "não-patogênica" é uma linhagem que é não-

patogênica para humanos.

"Transformação" significa introdução de DNA em uma célula de modo que o DNA é mantido na célula ou em um elemento extracromossomal ou integrante cromossomal.

A menos que de outro modo indicado todas as posições de ami-

noácido em uma proteína acetolato sintase são relativas à SEQ ID NO.:1, após alinhamento desta proteína com SEQ ID NO.:1 usando o programa BLASTP (Altschul, Nucl. Acids Res. 1997 25:3389-3402; Schàffer, Bioinfor- matics 1999 15:1000-1011) sob condições padrão, conforme disponível da 30 world wide website do National Center of Biotechnology Information (NCBI). Polinucleotídeos

É aqui provido um polinucleotídeo que codifica uma proteína a- cetolactato sintase que provê resistência a inibidores de ALS. Em certas modalidades, a proteína acetolactato sintase é uma proteína de ocorrência não-natural. Em termos gerais, o polinucleotídeo codifica uma proteína que: a) possui atividade de acetolactato sintase (isto é, pode catalisar uma reação 5 entre duas moléculas de piruvato para produzir 2-acetolactato), b) confere resistência a inibidores de ALS, por exemplo, compostos sulfonilureia e imi- dazolinona e c) tem uma seqüência de aminoácido que é pelo menos 85% idêntica (por exemplo, pelo menos 90% idêntica, pelo menos 93% idêntica, pelo menos 95% idêntica, pelo menos 96% idêntica, pelo menos 97% idênti- 10 ca, pelo menos 98% idêntica, pelo menos 98,5% idêntica, pelo menos 99% idêntica ou pelo menos 99,5% idêntica) à SEQ ID NO.:1, onde SEQ ID NO.:1 mostra a seqüência de aminoácido de uma acetolactato sintase do tipo sel- vagem de Trichoderma reesei.

Em certas modalidades, o polinucleotídeo pode codificar uma proteína tendo um ou mais de: a) um aminoácido ácido (por exemplo, Asp ou Glu) na posição 190, b) um aminoácido ácido (por exemplo, Asp ou Glu) na posição 241 ou um His na posição 372. Posições 190, 241 e 372 em proteí- na ALS de T. reesei do tipo selvagem estão sublinhadas na figura 1. Con- forme acima mencionado, posições 190, 241 e 372 em uma proteína ALS diferente (por exemplo, uma proteína ALS que é, por exemplo, mais curta, mais longa ou contém deleções e/ou inserções relativas à proteína ALS de T. reesei), são definidas aqui como sendo as posições na proteína que cor- respondem às (isto é, alinham com ou estão através da) posições 190, 241 e 372 da proteína ALS de T. reesei do tipo selvagem quando a proteína ALS de T. reesei do tipo selvagem e a outra proteína estão alinhadas usando mé- todos de alinhamento de seqüência padrão, por exemplo, BLASTP (Altschul, Nuci. Acids Res. 1997 25:3389-3402; Schàfer, Bioinformatics 1999 15:1000- 1011) usando parâmetros padrão. Proteínas ALS, em geral, são enzimas bem caracterizadas e foram investigadas em grande detalhe funcional e es- truturalmente. Proteínas ALS foram revistas em várias publicações (vide, por exemplo, Chipman, Biochim. Biophys. Acta 1998 1385:401-19; Chipman, Curr. Opin. Chem. Bioi. 2005 9:475-81) e foram cristalizadas (vide, por e- xemplo, Pang1 J. Biol. Chem. 2004 279:2242-53; Pang, J. Mol. Biol. 2002 317:249-62), bem como submetidas à mutagênese para identificar resíduos essenciais e não-essenciais (vide, por exemplo, lbdah, Biochemistry 1996 35:16282-91; Mendel, J. Mol. Biol. 2001:465-771; Hill1 Biochem. J. 1998 5 335:653-61). Outras mutações que conferem resistência à herbicida são também conhecidas (vide, por exemplo, Jung, Biochem. J. 2004 383:53-61; Duggelby, Eur. J. Biochem. 2003 207:2895-904). Ainda, as seqüências de aminoácido de várias centenas de proteínas ALS são conhecidas e publica- mente disponíveis através do banco de dados Genbank do NCBI. Deste mo- 10 do, uma ampla variedade de mudanças de aminoácido que poderiam ser feitas a uma proteína ALS objeto, algumas das quais podem conferir resis- tência a inibidores de ALS, sem abolir sua atividade seriam prontamente a- pa rentes.

Em certos casos, as mudanças de aminoácido descritas aqui 15 podem ser transferidas para qualquer outra proteína ALS, de qualquer espé- cie, para tornar aquela proteína resistente a herbicida. Em outras palavras, um aminoácido na posição 190, 241 ou 372 (com relação à SEQ ID NO.:1) de qualquer outra proteína ALS pode ser substituído por um aminoácido áci- do (por exemplo, Asp ou Glu), um aminoácido ácido (por exemplo, Asp ou 20 Glu) ou um His, respectivamente, para prover uma proteína ALS que confere resistência a um inibidor de ALS.

Por exemplo, as seqüências de aminoácido das proteínas ALS de várias espécies fúngicas são conhecidas e são depositadas no banco de dados Genbank da NCBI. Em certas modalidades, as alterações de aminoá- 25 cido descritas acima podem ser transferidas para as proteínas ALS daqueles fungos a fim de prover outras proteínas resistentes a inibidor de ALS. Em outras modalidades, a seqüência de aminoácido de outras proteínas ALS fúngicas pode ser empregada para fazer mudanças adicionais nas proteínas ALS baseadas em T. reesei objeto que não abolem a atividade de ALS des- 30 sas proteínas. Por exemplo, uma fusão entre duas proteínas ALS de espé- cies diferentes ou uma proteína contendo substituições, deleções ou inser- ções de aminoácido poderia ser feita. Seqüências de aminoácido ALS e- xemplares de outras espécies fúngicas, incluindo outras espécies fúngicas filamentosas, estão depositadas no banco de dados Genbank do NCBI como GIDS: 39977967 e 2547090 (Magnaporthe grisea), GID:85108881 (Neuros- pora crassa), GID:46108408 (Gibberella zeae), GID:90302929 (Coccidioides 5 immitis), GID:67537572 (Aspergillus nidulans), GID:70999742 (Aspergillus fumigatus), GIDs:83767597 e 83771596 (Aspergillus oryzae)\ GID:111063308 (Phaeosphaeria nodorum), GID:50547615 (Yarrowia lipolytica), GID:49657303 (Debaryomyces hansenii), GID:68468265 (Candida albicans), GID:21615550 (Daccharomycopsis fibuligera), GID:49641223 (Kluyveromyces Iaetis); 10 GID:49527687 (Candida glabrata) e GID:817866 (Saccharomyees eerevisia- e). Os acessos ao Genbank acima referidos são incorporados a título de re- ferência em sua totalidade, incluindo as seqüências de ácido nucleico e pro- teína nele, e as anotações dessas seqüências, como da primeira data de depósito deste pedido de patente.

Por causa da redundância do código genético, um polinucleotí-

deo objeto pode compreender qualquer uma de várias seqüências de nucle- otídeo. Em modalidades particulares, o polinucleotídeo objeto pode ter uma seqüência de nucleotídeo que é: a) pelo menos 70% idêntica (por exemplo, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou 20 pelo menos 99% idêntica a) ou b) hibridiza sob condições de hibridização estringentes para SEQ ID NO:2 ou SEQ ID NO:4, seqüências que são mos- tradas na seqüência de nucleotídeo de um cDNA do tipo selvagem e gene de T. reesei, respectivamente. Deste modo, o polipeptídio de codificação pode conter íntrons ou pode conter uma estrutura de leitura aberta única co- 25 dificando a proteína.

Como seria aparente, em certas modalidades, o polinucleotídeo pode ter uma seqüência de nucleotídeo que codifica uma proteína tendo um ou mais de: a) um aminoácido ácido (por exemplo, Asp ou Glu) na posição 190, b) um aminoácido ácido (por exemplo, Asp ou Glu) na posição 241 ou um His na posição 372.

O termo "identidade" no contexto de duas seqüências de ácido nucleico referem-se a resíduos de nucleotídeo nas duas seqüências que são iguais quando alinhados para correspondência máxima, conforme medido usando qualquer um dos algoritmos de comparação de seqüência que se- guem. Alinhamento ótimo de seqüências para comparação pode ser realiza- do, por exemplo, através do algoritmo de homologia local de Smith & Wa- 5 terman, Adv. Appi Math. 2:482 (1981), através do algoritmo de alinhamento de homologia de Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970), através da pesquisa pelo método de similaridade de Pearson & Lipman, Proc. Nat'1. Acad. Sei. USA 85:2444 (1988), através de implementações computadoriza- das desses algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA e TFASTA no Wisconsin 10 Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wl) ou através de inspeção visual.

Um exemplo de um algoritmo que é adequado para determina- ção de similaridade de seqüência é o algoritmo BLAST, que é descrito em Altusch e outros, J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990). Software para realizar 15 análises BLAST está publicamente disponível através do National Center for Biotechnology Information disponível no world wide web (www) nc- bi.nlm.nih.gov. O algoritmo BLAST realiza uma análise estatística da simila- ridade entre duas seqüências (vide, por exemplo, Karlin & Altschul, Proc. Nat'1 Acad. Sei. USA 90:5873-5787 (1993)). Uma seqüência de nucleotídeo 20 de pelo menos 100, pelo menos 500, pelo menos 1000, até o comprimento total das SEQ ID NO:2 ou 4 pode ser empregada em comparações de se- qüência.

Conforme acima mencionado, o polinucleotídeo pode incluir uma seqüência de nucleotídeo que hibridiza sob condições de hibridização 25 estringentes para um polinucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo da SEQ ID NO:2 ou 4, onde condições de hibridização estringentes compreen- dem condições de hibridização de estringência baixa, média, alta e muito alta.

Condições de "baixa estringência" referem-se à lavagem com uma solução de 1X SSC/SDS0,1% a 20°C por 15 minutos. Condições de "estringência média" referem-se à lavagem com uma solução de 1X SSC/SDS 0,1% a 65°C por 60 minutos. Condições de "alta estringência" re- fere-se à lavagem com uma solução de 0,2X SSC/SDS 0,1% a 65°C por 10 minutos. Condições de "estringência muito alta" referem-se à lavagem com uma solução de 0,2X SSC/SDS 0,1% a 65°C por 60 minutos.

Métodos de hibridização são descritos em mais detalhes em Sambrook e outros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a Ed., 1989 Cold Spring Harbor, NY). Em um ensaio de hibridização exemplar, uma a- mostra de DNA é eletroforada através de gel de agarose (por exemplo, aga- rose 0,8%) de modo que o fragmento de DNA pode ser visualizado através de tingimento com brometo de etídio. O gel é então rapidamente enxaguado em H2O destilada e subsequentemente despurinado em uma solução apro- priada (tal como, por exemplo, HCI a 0,25M) com agitação suave seguido por desnaturação por 30 minutos (em, por exemplo, NaOH a 0,4M) com agi- tação suave. Uma etapa de renaturação pode ser incluída, no qual o gel é posto em NaCI a 1,5M, Tris a 1M, pH 7,0 com agitação suave por 30 minu- tos. O DNA é então transferido para uma membrana positivamente carrega- da apropriada, por exemplo, membrana Maximum Strength Nytran Plus (Sc- hleicher & Schuell, Keene, N.H.), usando uma solução de transferência (tal como, por exemplo, 6X SSC, isto é, NaCI a 900 mM, citrato de trissódio 90 a mM). Uma vez a transferência completa, geralmente após cerca de 2 horas, a membrana é enxaguada em, por exemplo, 2X SSC (NaCI a 300 mM, citra- to de trissódio a 30 mM) e secada ao ar em temperatura ambiente. A mem- brana pode ser pré-hibridizada (por aproximadamente 2 horas ou mais) em uma solução de pré-hibridização adequada (tal como, por exemplo, uma so- lução aquosa contendo por 100 ml_: 20-50 ml_ de formamida, 25 ml_ de 20X SSPE (1X SSPE = NaCI a 0,18 M, EDTA a 1 mM, NaH2PO4 a 10 mM, pH 7,7), 2,5 ml_ de SDS 20% e 1 ml_ de 10 mg/mL de DNA de esperma de a- renque cisalhado). Como seria conhecido a um versado na técnica, a quan- tidade de formamida na solução de pré-hibridização pode ser variada de- pendendo da natureza da reação obtida de acordo com métodos de rotina. Então, uma quantidade menor de formamida pode resultar em hibridização mais completa em termos de identificação de moléculas de hibridização do que o mesmo procedimento usando uma quantidade maior de formamida. Por outro lado, uma faixa de hibridização forte pode ser mais facil e visual- mente identificada usando mais formamida.

Uma sonda de DNA de pelo menos 100, pelo menos 500, pelo menos 1000, até o comprimento total das SEQ ID NO:2 ou 4 pode ser em- pregada em ensaios de hibridização ou em comparações de seqüência. A sonda de DNA pode ser isolada através de eletroforese em gel de agarose, o fragmento excisado do gel e recuperado da agarose excisada. Este frag- mento purificado de DNA pode ser marcado (usando, por exemplo, o siste- ma de marcação Megaprime de acordo com as instruções do fabricante) pa- ra incorporar P32 no DNA. A sonda marcada é desnaturada através de aque- cimento para 95°C por 5 minutos e imediatamente adicionada à membrana e solução de pré-hibridização. A reação de hibridização deve prosseguir por um tempo apropriado e sob condições apropriadas, por exemplo, por 18 ho- ras a 37°C com agitação ou giro suave. A membrana é enxaguada (por e- xemplo, em 2X SSC/SDS 0,3%) e então lavada em uma solução de lavagem apropriada, conforme descrito acima, com agitação suave. Hibridização pode ser detectada através de autoradiografia.

Em modalidades particulares, o polinucleotídeo pode ser otimi- zado no códon para expressão em célula hospedeira particular. Em outras 20 modalidades, o polinucleotídeo pode ter uma seqüência de nucleotídeo que contém menos do que 10 (por exemplo, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1) diferenças comparado com a seqüência de ALS do tipo selvagem (por exemplo, ou a seqüência genômica ou de cDNA) da célula hospedeira particular em que o polinucleotídeo deve ser empregado.

Em certos casos, em adição a uma seqüência de codificação, o

polinucleotídeo pode conter ainda outros elementos que são necessários para expressão da proteína codificada em uma célula hospedeira. Por e- xemplo, em uma modalidade, o polinucleotídeo pode ser flanqueado por se- qüências para formar um cassete de expressão que provê expressão da pro- 30 teína codificada em uma célula hospedeira. Em certas modalidades, o cas- sete de expressão pode conter um promotor para transcrição da seqüência de codificação e um terminador transcripcional e uma seqüência codificando uma região não-traduzida 5' (UTR) que permite iniciação de tradução, cada um em ligação operável com a região de codificação. Promotores, realçado- res, terminadores, UTRs, sinais de poliadenilação e outras seqüências regu- ladoras para uma ampla variedade de células hospedeiras, particularmente 5 aquelas de plantas, bactérias e fungos, são bem conhecidos na técnica (vi- de, por exemplo, Ausubel e outros, Short Protocols in Molecular Biology, 3a ed., Wiley and Sons, 1995; Sambrook e outros, Molecular Cloning: A Labora- tory Manual, Segunda Edição, 1989 Cold Spring Harbor, N.Y.).

Em modalidades particulares, o cassete de expressão objeto 10 pode conter um promotor e um terminador para expressão da proteína obje- to em uma célula fúngica filamentosa. Exemplos de promotores e terminado- res adequados para direcionamento da transcrição de um ácido nucleico objeto em uma célula hospedeira fúngica filamentosa são promotores e ter- minados obtidos dos genes para amilase TAKA de Aspergillus oryzae, pro- 15 teinase aspártica de Rhizomucor miehei, alfa-amilase neutra de Aspergillus Niger, alfa-amilase estável a ácido de Aspergillus Niger, glicoamilase de As- pergillus Niger ou Aspergillus awamori (glaA), Iipase de Rhizomucor miehei, protease alcalina de Aspergillus oryzae, isomerase de triose fosfato de As- pergillus oryzae, acetamidase de Aspergilus nudulans, aminoglicosidase de 20 Fusarium venenatum, protease do tipo tripsina de Fusarium oxysporum (WO 96/00787), celobioidrolase I de Triehoderma reesei, celobioidrolase Il de Tri- ehoderma reesei, endoglucanase I de Triehoderma reesei, endoglucanase Il de Triehoderma reesei, endoglucanase Ill de Triehoderma reesei, endoglu- canase IV de Triehoderma reesei, endoglucanase V de Triehoderma reesei, 25 xilanase I de Triehoderma reesei, xilanase Il de Triehoderma reesei, beta- xilosidase de Triehoderma reesei, bem como o promotor de NA2-tpi (um hí- brido dos promotores dos genes para alfa-amilase neutra de Aspergillus Ni- ger e triose fosfato isomerase de Aspergillus oryzae); e seus promotores mu- tantes, truncados e híbridos dos mesmos.

O promotor e/ou terminador pode ser nativo ou não-endógeno

para a célula hospedeira na qual a proteína ALS objeto deve ser expressa e, em certas modalidades, o promotor e o terminador podem ser o promotor e terminador do gene de ALS da célula hospedeira. Por exemplo, em uma modalidade, um cassete de expressão para uso em células de Trichoderma reesei pode compreender o promotor do gene de ALS de Trichoderma ree- sei, a seqüência de codificação de ALS de Trichoderma reesei (contendo 5 uma ou mais das seqüências de nucleotídeo mostradas acima) e terminador de ALS de Trichoderma reesei, em ligação operável (figura 3). O promotor e/ou terminador pode ser de um gene de ALS da célula hospedeira na qual o polinucleotídeo deve ser empregado.

O polinucleotídeo pode ser integrado no genoma da célula hos- pedeira ou pode estar presente em um vetor que replica autonomamente na célula hospedeira.

Ácido Nucléico Recombinante

Um ácido nucleico recombinante compreendendo um polinu- cleotídeo objeto é também provido. Um ácido nucleico recombinante objeto 15 pode compreender um polinucleotídeo objeto, por exemplo, um cassete de expressão para produção de uma proteína ALS de conferência de resistên- cia em uma célula hospedeira, bem como um segundo cassete de expres- são para expressão de uma proteína de interesse na célula hospedeira. Em uma modalidade particular, o polinucleotídeo objeto é empregado como um 20 marcador para seleção de células hospedeiras que contêm o ácido nucleico recombinante sobre outras células que não contêm o ácido nucleico recom- binante (isto é, o polinucleotídeo objeto é empregado como um "marcador selecionável" para células que contêm o polinucleotídeo objeto).

A proteína de interesse codificada pelo segundo cassete de ex- pressão pode ser, por exemplo, uma enzima, uma proteína terapêutica, uma proteína repórter, um aditivo alimentar ou um gênero alimentício ou simila- res.

Em uma modalidade, a proteína de interesse codificada pelo segundo cassete de expressão pode ser uma enzima tal como uma carboi- drase, tal como uma α-amilase, uma α-amilase alcalina, uma β-amilase, uma celulase; uma dextranase, uma α-glicosidase, uma α-galactosidase, uma glicoamilase, uma hemicelulase, uma pentosanase, uma xilanase, uma in- vertase, uma lactase, uma naringanase, uma pectinase ou uma pululanase; uma protease tal como uma protease ácida, uma protease alcalina, brome- laina, ficina, uma protease neutra, papaína, pepsina, uma peptidase, rennet, renina, quimosina, subtilisina, termolisina, uma proteinase aspártica ou trip- 5 sina; uma Iipase ou esterase, tal como trigliceridase, uma fosfolipase, uma esterase pré-gástrica, uma fosfatase, uma fitase, uma amidase, uma iminoa- cilase, uma glutaminase, uma Iisozima ou uma penicilina acilase; uma iso- merase tal como glicose isomerase; uma oxidorredutase, por exemplo, uma aminoácido oxidase, uma catalase, uma cloroperoxidase, uma glicose oxida- 10 se, uma hidroxiesteróide desidrogenase ou uma peroxidase; uma Iiase tal como uma acetolactato descarboxilase, uma β-descarboxilase aspártica, uma fumarese ou uma histadese; uma transferase tal como ciclodextrina glicosiltransferase; ou uma ligase, por exemplo. Em modalidades particula- res, a proteína pode ser uma aminopeptidase, uma carboxipeptidase, uma 15 quitinase, uma cutinase, uma desoxirribonuclease, uma a-galactosidase, uma β-galactosídase, uma β-glicosidase, uma lacase, uma manosidase, uma mutanase, uma enzima pectinolítica, uma polifenoloxidase, ribonuclease ou transglutaminase, por exemplo. A enzima pode ser uma enzima do tipo sel- vagem ou uma variante de uma enzima do tipo selvagem. Em adição a en- 20 zima pode ser uma enzima híbrida que inclui fragmentos de enzimas diferen- tes.

Em outra modalidade, a proteína de interesse codificada pelo segundo cassete de expressão pode ser uma proteína terapêutica (isto é, uma proteína tendo uma atividade biológica terapêutica). Exemplos de prote- 25 ínas terapêuticas adequadas incluem: eritropoietina, citocinas tal como inter- feron-a, interferon-β, interferon-γ, interferon-o e granulócito-CSF, GM-CSF, fatores de coagulação tal como fator VII, fator IX e proteína C humana, anti- trombina III, trombina, receptor de cadeia α de IgE solúvel, IgG, fragmentos de IgG, fusões de IgG, IgM, IgA, e inibidor de interleucinas, urocinase, qui- 30 mase ureia tripsina, proteínas de ligação de IGF, fator de crescimento epi- dermal, fator de liberação de hormônio do crescimento, proteína de fusão de anexina V, angiostatina, fator-2 de crescimento endotelial vascular, fator-1 inibidor de progenitor mielóide, osteoprotegerina, α-1-antitripsina, α-feto pro- teínas, Dnase II, kringle 3 de plasminogênio humano, glicocerebrosidase, proteína de ligação de TNF, hormônio de estimulação de folículo, antígeno 4-lg associado a linfócito T citotóxico, ativador de transmembrana e modula- 5 dor de cálcio e Iigante de ciclofilina, fusão Fc de receptor de TNF solúvel, agonista de receptor de proteína 1 do tipo glucagon e IL-2. Proteínas de an- ticorpo, por exemplo, anticorpos monoclonais que podem ser humanizados, são de interesse particular.

Em uma modalidade adicional, a proteína codificada pelo se- 10 gundo cassete de expressão pode ser uma proteína repórter. Tais proteínas repórter podem ser opticamente detectáveis ou colorigênicas, por exemplo. Nesta modalidade, a proteína pode ser uma β-galactosidase (IacZ), β- glucuronidase (GUS), luciferase, fosfatase alcalina, nopalina sintase (NOS), cloranfenicol acetiltransferase (CAT), peroxidase de rábano silvestre (HRP) 15 ou uma proteína verde fluorescente, por exemplo, proteína verde fluorescen- te (GFP) ou um derivado da mesma.

Em certas modalidades, particularmente aquelas nas quais a cé- lula hospedeira é uma célula hospedeira fúngica filamentosa, a seqüência de codificação do segundo cassete de expressão pode codificar uma proteína 20 de fusão. Em algumas dessas modalidades, a proteína de fusão pode prover secreção da proteína a partir da célula hospedeira na qual ela é expressa e, desta maneira, pode conter uma seqüência de sinal operavelmente ligada ao terminal N da proteína, onde a seqüência de sinal contém uma seqüência de aminoácidos que direciona a proteína para o sistema secretor da célula hos- 25 pedeira, resultando em secreção da proteína a partir da célula hospedeira no meio no qual a célula hospedeira está crescendo. A seqüência de sinal é clivada a partir da proteína de fusão antes da secreção da proteína. A se- qüência de sinal empregada pode ser endógena ou não-endógena para a célula hospedeira e, em certas modalidades, pode ser seqüência de sinal de 30 uma proteína que é conhecida ser altamente secretada na partir de uma cé- lula hospedeira. Em modalidades particulares, a proteína de seqüência de sinal pode ser qualquer seqüência de sinal que facilite a secreção de proteí- na a partir de uma célula hospedeira fúngica filamentosa (por exemplo, Tri- choderma ou Aspergillus). Tal seqüência de sinal inclui, mas não está limita- da a: a seqüência de sinal de celobioidrolase I, celobioidrolase II, endoglu- canase I, endoglucanase II, endoglucanases III, α-amilase, aspartil protea- ses, glicoamilase, manase, glicosidase e endopeptidase B de cevada (vide Saarelainen, AppI. Environ. Microbiol., 1997 63:4938-4940), por exemplo. Outras de seqüências de sinal são aquelas originando-se do gene de amilo- glicosidase (GA) fúngica (glA), o gene de fator α (leveduras, por exemplo, Saccharomyces, Kluyveromyces e Hansenula) ou o gene de α-amilase (Ba- cillus). Em certas modalidades, então, o ácido nucleico recombinante objeto pode compreender: um ácido nucleico codificando seqüência de sinal opera- velmente ligada a um ácido nucleico de codificação de proteína, onde a tra- dução do ácido nucleico em uma célula hospedeira produz uma proteína de fusão compreendendo uma proteína tendo uma seqüência de sinal N- terminal para secreção da proteína a partir da célula hospedeira.

Em modalidades particulares, a proteína de fusão pode conter uma "proteína-veículo", que é uma porção de uma proteína que é endógena para e altamente secretada pela célula hospedeira. Proteínas-veículos ade- quadas incluem aquelas de mannanase I de T. reesei (Man5A ou MANI), 20 celobioidrolase Il de T. reesei (Cel6A ou CBHII) (vide, por exemplo, Palo- heimo e outros, AppI. Environ. Microbiol. 2003, Dezembro; 69(12):7073- 7082) ou celobioidrolase I de T. reesei (CHBI). Em uma modalidade, a prote- ína-veículo é uma proteína CBH1 de T. reesei truncada que inclui a região de núcleo de CBH1 e parte da região de ligação de CBH1. Uma proteína de 25 fusão contendo, do terminal amino para o terminal carbóxi, uma seqüência de sinal, uma proteína-veículo e uma proteína objeto em ligação operável é então provida, bem como um ácido nucleico codificando a mesma.

Em certas modalidades, o polinucleotídeo pode ser otimizado no códon para expressão da proteína em uma célula hospedeira particular. Uma vez que tabelas de uso de códon listando o uso de cada códon em mui- tas células são conhecidas na técnica (vide, por exemplo, Nakamura e ou- tros, Nuel. Aeids Res. 200 28:292) ou prontamente deriváveis, tais ácidos nucleicos podem ser prontamente determinados dando a seqüência de ami- noácido de uma proteína a ser expressa.

Um ácido nucleico recombinante objeto pode estar presente, por exemplo, integrado, em um genoma (isto é, o genoma nuclear) de uma célu- 5 Ia hospedeira, ou pode estar presente em um vetor, por exemplo, um vetor de fago, plasmídeo, viral ou retroviral, que replica autonomamente na célula hospedeira. Em certas modalidades, o vetor contém ainda o segundo casse- te de expressão discutido acima. Em certas modalidades, o vetor pode ser um vetor de expressão para expressão de um polipeptídio recombinante em 10 uma célula fúngica filamentosa.

Vetores para expressão de proteínas recombinantes são bem conhecidos na técnica (Ausubel e outros, Short Protocols in Molecular Bio- Iogy, 3a ed., Wiley & Sons, 1995; Sambrook e outros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edição, (1989) Cold Spring Harbor, N.Y.).

Métodos de Seleção

Um método para seleção de células hospedeiras que contêm um polinucleotídeo objeto é também provido. Em certas modalidades, o mé- todo inclui introdução de um polinucleotídeo objeto em uma pluralidade de células, contato da pluralidade de células com um inibidor de ALS, por e- 20 xemplo, um composto sulfonilureia ou imidazolinona tóxico e cultura das cé- lulas para prover a seleção da célula. A célula pode ser selecionada em meio sólido, por exemplo, plaqueando uma pluralidade de células em uma placa de ágar contendo o inibidor de ALS, ou em meio líquido, por exemplo, através de cultura de uma pluralidade de em um meio líquido contendo o 25 inibidor de ALS.

Em certas modalidades, os métodos de seleção objeto podem ser empregados para selecionar células contendo um segundo cassete de expressão que codifica uma proteína de interesse. O segundo cassete de expressão pode estar presente em um ácido nucleico recombinante que 30 também contém o presente polinucleotídeo de codificação de proteína ALS (isto é, em uma molécula de ácido nucleico recombinante única). Nessas modalidades, os presentes métodos de seleção podem ser empregados pa- ra selecionar células que contêm o ácido nucleico recombinante. Uma vez que o ácido nucleico recombinante também contém o segundo cassete de expressão, células que contêm o segundo cassete de expressão são sele- cionadas usando o inibidor de ALS. Em modalidades alternativas, o segundo 5 cassete de expressão pode estar presente em um ácido nucleico recombi- nante que não contém o presente polinucleotídeo de codificação de proteína ALS (por exemplo, um vetor diferente). Nessas modalidades, um polinucleo- tídeo objeto pode ser cotransformado com (isto é, transformado ao mesmo tempo que) uma molécula de polinucleotídeo separada e distinta (por exem- 10 pio, uma molécula ou vetor de ácido nucleico diferente) que contém o casse- te de expressão. Deste modo, os presentes métodos de seleção podem ser empregados para selecionar células que contêm o segundo cassete de ex- pressão, mesmo que o segundo cassete de expressão esteja em uma molé- cula de ácido nucleico diferente ao polinucleotídeo.

Deste modo, os presentes métodos de seleção podem ser em-

pregados para selecionar células hospedeiras que expressam a proteína de interesse. A proteína de interesse pode ser nativa ou não-nativa para as cé- lulas hospedeiras usadas.

A concentração exata de inibidor de ALS empregada pode variar de acordo com o inibidor de ALS particular usado e o tipo de célula hospe- deira a ser selecionado. Em termos gerais, o inibidor de ALS é usado em uma concentração que provê seleção da célula hospedeira contendo o poli- nucleotídeo. Em certas modalidades, o inibidor de ALS pode ser empregado em uma concentração de 0,5 ppm a 10.000 ppm, por exemplo, 1 ppm a 10.000 ppm ou 10 ppm a 1.000 ppm. Por exemplo, em certos casos, o inibi- dor de ALS pode ser empregado em uma concentração na faixa de 25 ppm a 100 ppm, por exemplo, 50 ppm ou 100 ppm, ou em uma concentração na faixa de 100 ppm a 500 ppm, por exemplo, 200 ppm ou 500 ppm. Por exem- plo, em uma modalidade, o inibidor de ALS pode ser empregado em uma concentração na faixa de 1 pg/ml a 1 mg/ml, por exemplo, 10 pg/ml a 500 Mg/ml.

Inibidores de ALS incluem quaisquer compostos que: a) matem células que não têm resistência aos compostos através da inibição de uma enzima de ALS e b) não matem células tendo um polinucleotídeo objeto. Ini- bidores de ALS de interesse particular incluem sulfonilureia (SU), imidazoli- nona (IMI), triazolpirimidina (TP)1 pirimidiniltiobenzoato (PTB) e compostos 5 sulfonilamino-carbonil-triazolinona (SCT) que são inibidores de ALS conhe- cidos e, em certos casos, podem ser geralmente empregados como herbici- das. Exemplos de compostos sulfonilureia que podem ser empregados nos métodos objetos incluem: I) fenilsulfonilureias, incluindo a) clorimuron etila (vide Agricultural Chemicals Book Il "Herbicides" de W.T. Thompson, 10 Thompson Publications, Fresno Calif., U.S.A. 1990 página 152); b) primisui- furon (CGA 136.872, vide Brighton Crop Prot. Conf. "Weeds" 1989, p. 41- 48), c) 3-(4-etil-6-metóxi-1,3,5-triazin-2-il)-1-(2,3-di-idro-1,1-dioxo-2-metil benzo[b]tiofen-7-sulfonil)-ureia (vide, por exemplo, EP-A-79.683), d) 3-(4- etóxi-6-etil-1,3,5-triazin-2-il)-1-(2,3-di-idro-1,1-dioxo-2-metilbenzo[b]tiofen-7- 15 sulfonil)ureia (vide, por exemplo, EP-A-79.683), e) tribenuron-metila (vide "The Pesticide Manual", British Crop Protection Council 9th Edition (1990/91), página 840), f) metsulfuron-metila (vide, Proc. Int. Congr. Plant Prot., 10a, 1983, vol. 1, 324), g) clorsulfuron (vide patente U.S. N0 4.127.405; Weeds Weed Control, 1980, 21a, 24), h) triasulfuron (vide "The Pesticide 20 Manual", 9a Ed., p. 837) e i) sulfumeturon-metila (vide "The Pesticide Manu- al", 9a Ed., p. 774); II) tienilsulfonilureias, por exemplo, tifensulfuron-metila (vide Agricultural Chemicals Book Il "Herbicides" de W.T. Thompson, Thompson Publications, Freso Calif., U.S.A. 1990, página 155); III) pirazolil- sulfonilureias, por exemplo: a) pirazolsulfuron-etila (NC 311, vide "The Pesti- 25 cide Manual", 9a Ed., p. 735) e b) metil 3-cloro-5-(4,6-dimetoxipiridin-2- ilcarbamoilsulfonil)-1-metil-pirazol-4-carboxilato (vide EP 282.613); IV) deri- vados de sulfonodiamina, por exemplo, amidosulfuron e análogos estruturais (vide EP-A-0.131258 e Z. Pfl. Krankh, Pfl. Schutz, Special Issue XII, 489-497 (1990); V) piridilsulfonilureias, por exemplo: a) nicosulfuron (SL-950, vide 30 Kimura e outros, Brighton Crop Protectin Conference "Weeds", 1989, p. 29- 34); b) DPX-E 9636 (vide Brignton Crop Prot. Conf. - Weeds - 1989, p. 23 et seq.) e c) piridilsulfonilureias como são descritos nos pedidos de patente A- lemãs P 4000503.8 (WO-91/10660) e P 4030577.5 e VI) Fenoxisulfonilureias tal como aquelas descritas nas, por exemplo, EP-A-0.342.569, EP-A-4.163, EP-A-113.956, patente norte-americana N0 4.678.500 e pat. norte-americana N0 4.581.059. Exemplos de compostos imidazolinona que podem ser em- 5 pregados nos métodos objeto incluem: a) imazetapir (vide "The Pesticide Manual" de Ch. R. Worthing, 8a Edição, 1987, do British Crop Protection Council, página 473), b) imazaquin (vide "The Pesticide Manual" de Ch. R. Worthing, 8a Edição, 1987, do British Crop Protection Council, página 474) e c) imazetapir (nome químico: ácido rac-2-[4,5-di-idro-4-metil-4-(1-metiletil)-5- 10 oxo-1 H-imidazol-2-il]-5-metil-3-piridino-carboxílico; vide "Weed Techn.", 1991 (5), 430-433 e 434-438) e outros compostos relacionados.

Células Hospedeiras

Uma célula hospedeira compreendendo um ácido nucleico re- combinante objeto é também provida. A célula hospedeira pode ser qualquer 15 tipo de célula, por exemplo, células hospedeiras bacterianas (tal como E. coli, Bacillus sp. ou Streptomyyces sp.), fúngicas (tal como fúngica não- filamentosa ou filamentosa) ou de planta (tal como uma Arabidopsis, planta de milho ou soja). Em algumas modalidades, a célula hospedeira pode ser uma célula de uma espécie que tem uma história de uso para produção de 20 proteínas que têm status GRAS, isto é, uma Geralmente Reconhecida como Segura, pelo FDA.

Em modalidades particulares, a célula hospedeira objeto pode ser uma célula fúngica da espécie que segue: Triehoderma (por exemplo, Triehoderma reesei (previamente classificada como T. Iongibraehiatum e 25 atualmente também conhecida como Hypoerea jeeorina), Triehoderma viride, Triehoderma koningii e Trichoderma harzianum)); Penieillium sp., Humieola sp. (por exemplo, Humieola insolens e Humieola grisea)\ Chrysosporium sp. (por exemplo, C. lueknowense), Glioeladium sp., Aspergillus sp. (por exem- plo, Aspergillus oryzae, Aspergillus Niger, Aspergillus nidulans, Aspergillus 30 kawaehi, Aspergillus aeuleatus, Aspergillus japonieus, Aspergillus sojae e Aspergillus awamori), Fusarium sp., Mueor sp., Neurospora sp., Hypoerea sp. ou Emerieella sp. (Vide também Innis e outros (1985) Sei., 228:21-26), dentre outros.

Células hospedeiras bacterianas exemplares incluem Bacillus sp., incluindo, mas não limitado a, B. subtilis, B. licheniformis, B. lentus, B. brevis, B. stearothermophilus, B. alkalophilus, B. amyloliquefaciens, B. clau- 5 sii, B. halodurans, B. megaterium, B. coagulans, B. circulans, B. Iautus e B. thuringiensis e Streptomyces sp., incluindo, mas não limitado a: S. lividans,

S. carbophilus e S. helvaticus.

Células hospedeiras de planta exemplares incluem células de planta monocotiledôneas e dicotiledôneas, incluindo, mas não limitado a, 10 células hospedeiras de milho (Zea mays), Brassica sp., arroz (Oryza sativa), trigo (Tritieum aestivum), soja (Glyeine Max), tabaco (Nieotiana tabaeum) e Arabidopsis thaliana e tomate (Lyeopersieon eseulentum). Uma célula hos- pedeira pode ser uma célula hospedeira cultivada in vitro ou uma célula hos- pedeira de um organismo multicelular, isto é, uma planta. Métodos de trans- 15 ferência de ácidos nucleicos exógenos para tais células hospedeiras são bem conhecidos na técnica.

Em modalidades particulares, uma célula fúngica objeto pode ser uma linhagem de Triehoderma e particularmente T. reesei que inclui e- quivalentes funcionais de RL-P37 (Sheir-Neiss e outros (1984) AppI. Miero- 20 biol. Bioteehnology, 20:46-53). Outras linhagens hospedeiras úteis incluem: NRRL 15709, ATCC 13631, ATCC 26921 (QM 9414) ATCC 32098, ATCC 32086 e ATCC 56765 (RUT-30). Em outras modalidades, célula hospedeira fúngica pode ser de uma linhagem de Aspergillus sp., incluindo ATCC 22342, ATCC 44733, ATCC 14331, ATCC 11490, NRRL 3112 e linhagens 25 derivadas da mesma.

Em algumas modalidades, uma célula hospedeira pode ser uma em que os genes nativos foram deletados ou inativados. Por exemplo, genes correspondendo a genes de protease (por exemplo, aspartil protease) (Berka e outros (1990), Gene 86:153-162 e USP 6.509.171) ou genes correspon- 30 dendo a genes de celulase podem ser deletados ou inativados (por exemplo, ebl71, ebh2 e egl 1 e egl2) tal como a linhagem quadruplamente deletada de T. reesei descrita no WO 05/001036 e derivados da mesma. Introdução de um ácido nucleico em uma célula hospedeira in- clui técnicas tal como transformação; eletroporação; microinjeção nuclear; transdução; transfecção (por exemplo, transfecção mediada por lipofecção e mediada por DEAE-Dextrina); incubação com precipitado de fosfato de cál- 5 cio; bombardeamento de alta velocidade com microprojéteis revestidos com DNA; e fusão de protoplasto. Técnicas de transformação gerais são conhe- cidas na técnica (vide, por exemplo, Ausubel e outros (1987), supra, capítulo 9; e Sambrook (1989) supra e Campbell e outros (1989) Curr. Genet. 16:53- 56). Referência é também feita aos WO 05/001036; USP 6.022.725; USP 10 6.103.490; USP 6.268.328; e pedidos de patente norte-americana publica- dos 20060041113, 200600403532, 20060040353 e 20050208623, cujas pu- blicações são aqui incorporadas a título de referência.

Transformação e expressão de proteína em Aspergillus e Tri- choderma são adicionalmente descritas na, por exemplo, Pat. norte- 15 americana N0 5.364.770; Pat. U.S. N0 6.022.725; e Nevalainen e outros, 1992, The Molecular Biology of Trichoderma and its Application to the Ex- pression of Both Homologous and Heterologous Genes, em MOLECULAR INDUSTRIAL MYCOLOGY, Eds. Leon e Berka, Marcel Dekker, Inc. pp. 129- 148.

Conforme acima mencionado, uma célula hospedeira pode con-

ter ainda um ácido nucleico recombinante para expressão de uma proteína de interesse em uma célula hospedeira, em adição ao ácido nucleico codifi- cando ALS. O ácido nucleico recombinante objeto e o ácido nucleico codifi- cando ALS podem ser ligados intimamente em c/s, ou no genoma ou em um 25 plasmídeo, de modo que o inibidor de ALS seleciona o ácido nucleico re- combinante, e então seleciona as células que produzem a proteína.

Produção de Proteína

Métodos de uso da célula hospedeira descrita acima são tam- bém providos. Em certas modalidades, os métodos objetos incluem: cultura da célula compreendendo um ácido nucleico recombinante compreendendo um primeiro cassete de expressão para produção de uma enzima ALS obje- to e um segundo cassete de expressão para produção de uma proteína, pa- ra produzir a proteína. Em certas modalidades e conforme acima discutido, a proteína pode ser secretada no meio de cultura. Deste modo, certas modali- dades do método incluem a etapa de recuperação da proteína a partir do meio de cultura.

5 Células podem ser culturadas em um meio padrão contendo

sais fisiológicos e nutrientes (vide, por exemplo, Pourquie, J. e outros, BIO- CHEMISTRY AND GENETICS OF CELLULOSE DEGRADATION, Eds. Au- bert, J. P. e outros, Academic Press, pp. 71-86, 1988 e llmen, M. e outros (1997) AppI. Environ. MicrobioL 63:1298-1306). Meios preparados comerci- 10 almente comuns (por exemplo, caldo de Extrato de Malte de Levedura (YM), caldo Luria Bertani (LB) e caldo de Dextrose Sabouraud (SD) também en- contram uso na presente invenção. Condições de cultura preferidas para um dado fungo filamentoso são conhecidas na técnica e podem ser encontradas na literatura científica e/ou da fonte dos fungos tal como o American Type 15 Culture Collection (ATCC) e Fungai Genetics Stock Center.

Em algumas modalidades, uma célula hospedeira objeto pode ser culturada sob condições de fermentação em batelada ou contínua. Uma fermentação em batelada clássica é um sistema fechado, em que a compo- sição do meio é ajustada no início da fermentação e não é submetida a alte- 20 rações artificiais durante a fermentação. Então, no início da fermentação, o meio é inoculado com o(s) organismo(s) desejado(s). Neste método, fermen- tação é permitida acontecer sem a adição de quaisquer componentes ao sistema. Tipicamente, uma fermentação em batelada qualifica como uma "batelada" com relação à adição da fonte de carbono e tentativas são fre- 25 quentemente feitas em controlar fatores tal como pH e concentração de oxi- gênio. As composições de metabólito e biomassa do sistema de batelada mudam constantemente até o momento que a fermentação é parada. Dentro das culturas de batelada, as células progridem através de uma fase Iag está- tica para uma fase Iog de crescimento alta e finalmente para uma fase esta- 30 cionária onde a taxa de crescimento é diminuída ou parada. Se não tratadas, células na fase estacionária eventualmente morrem. Em geral, células na fase Iog são responsáveis pelo volume da produção de produto final. Uma variação do sistema de batelada padrão é o sistema "de fermentação em batelada alimentada", que também encontra uso com a pre- sente invenção. Nesta variação de um sistema em batelada típico, o substra- to é adicionado em incrementos conforme a fermentação progride. Sistemas 5 fed-batch são úteis quando repressão de catabólito está apta a inibir o meta- bolismo das células e onde for desejável ter quantidades limitadas de subs- trato no meio. Medição da concentração de substrato real nos sistemas fed- batch é difícil e então estimada com base nas mudanças de fatores mensu- ráveis tal como pH, oxigênio dissolvido e a pressão parcial de gases residu- 10 ais tal como CO2. Fermentações em batelada e fed-batch são comuns e co- nhecidas na técnica.

Fermentação contínua é um sistema aberto onde um meio de fermentação definido é adicionado continuamente a um biorreator e uma quantidade igual de meio condicionado é removida simultaneamente para 15 processamento. Fermentação contínua geralmente mantém as culturas em uma densidade alta constante onde as células estão principalmente em crescimento de fase log.

Fermentação contínua permite a modulação de um fator ou qualquer número de fatores que afetam crescimento celular e/ou concentra- ção de produto final. Por exemplo, em uma modalidade, um nutriente Iimitan- te tal como a fonte de carbono ou fonte de nitrogênio é mantido em uma taxa fixa e todos os outros parâmetros são deixados moderar. Em outros siste- mas, vários fatores que afetam o crescimento podem ser alterados continu- amente enquanto a concentração celular, medida através de turbidez média, é mantida constante. Sistemas contínuos tentam manter condições de cres- cimento de estado uniforme. Então, perda celular devido a meio ser extraído deve ser equilibrada contra a taxa de crescimento celular na fermentação. Métodos de modulação de nutrientes e fatores de crescimento para proces- sos de fermentação contínuos bem como técnicas para maximização da taxa de formação de produto são conhecidos.

Uma célula hospedeira fúngica pode ser culturada em um meio padrão contendo sais e nutrientes fisiológicos (vide, por exemplo, Pourquie, J. e outros, BIOCHEMISTRY AND GENETICS OF CELLULOSE DEGRA- DATION, Eds. Aubert, J. P. e outros, Academic Press, pp. 71-86, 1988 e Il- men, M. e outros (1997) AppI. Environ. Microbiol. 63:1298-1306). Meios co- mercialmente preparados comuns (por exemplo, caldo de Extrato de Malte 5 de Levedura (YM), caldo Luria Bertani (LB) e caldo de Dextrose Sabouraud (SD) também encontram uso nos presentes métodos. Condições de cultura preferidas para células hospedeiras fúngicas são conhecidas na técnica e podem ser encontradas na literatura científica e/ou da fonte dos fungos tal como a American Type Culture Collection (ATCC) e Fungai Genetics Stoek 10 Center.

Proteína pode ser recuperada dos meios de crescimento através de qualquer meio conveniente, por exemplo, através de precipitação, centri- fugação, afinidade, filtragem ou qualquer outro método conhecido na técnica. Em outra modalidade, uma cultura de células é provida, onde a cultura de 15 células compreende: a) meio de crescimento e b) a célula hospedeira acima descrito.

Promotores 1818A e 1818B

Um promotor que pode ser usado para expressar uma proteína em uma célula hospedeira é também provido. Em uma modalidade, o pro- 20 motor compreende a seqüência de nucleotídeo da SEQ ID NO:7 ou 8 (mos- trada nas figuras 5A e 5B, respectivamente) ou uma subsequência ou equi- valente funcional da mesma que tem atividade promotora em uma célula hospedeira. Também providos são ácidos nucleicos recombinantes e vetores contendo o promotor e células hospedeiras contendo o ácido nucleico ou 25 vetor. Métodos de produção de uma proteína usando as células hospedeiras são também providos.

Em certas modalidades, o promotor pode compreender a se- qüência de nucleotídeo de: a) SEQ ID NO:7 ou 8; b) uma subsequência de SEQ ID NO:7 ou 8 que retém atividade de promotor; c) uma seqüência fun- 30 cionalmente equivalente de SEQ ID NO:7 ou 8 que retém a atividade de promotor ou d) uma seqüência de ácido nucleico que hibridiza sob condições de hibridização estringentes com SEQ ID NO:7 ou 8 ou a subsequência da mesma. Em modalidades particulares, a seqüência de nucleotídeo pode ser pelo menos 80% idêntica à seqüência de nucleotídeo da SEQ ID NO:7 ou 8.

Em modalidades particulares, uma subsequência de um promo- tor objeto pode conter pelo menos cerca de 100 nucleotídeos, pelo menos 5 cerca de 200 nucleotídeos; pelo menos cerca de 250 nucleotídeos; pelo me- nos cerca de 300 nucleotídeos; pelo menos cerca de 350 nucleotídeos; pelo menos cerca de 400 nucleotídeos; pelo menos cerca de 450 nucleotídeos; pelo menos cerca de 500 nucleotídeos; pelo menos cerca de 550 nucleotí- deos; pelo menos cerca de 600 nucleotídeos; pelo menos cerca de 650 nu- 10 cleotídeos; pelo menos cerca de 700 nucleotídeos; pelo menos cerca de 800 nucleotídeos; pelo menos cerca de 850 nucleotídeos que são contíguos na SEQ ID NO:7 ou 8, a seqüência contínua completa da SEQ ID NO:7 ou 8 ou um equivalente funcional da mesma que retém atividade promotora.

Em certas modalidades, um promotor equivalente funcional po- 15 de incluir uma ou mais mudanças (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou 9, mais de 10, até 20 ou 30 ou mais mudanças) com relação à seqüência de nucleotídeo da SEQ ID NO:7 ou 8, onde uma mudança pode ser uma dele- ção, substituição ou inserção, por exemplo. Em uma modalidade exemplar, a seqüência de nucleotídeo do promotor equivalente funcional pode incluir 20 uma a cinco diferenças de nucleotídeo com relação à seqüência de nucleotí- deo do promotor de origem tal como SEQ ID NO:7 ou 8.

Em outras modalidades, o promotor pode incluir uma seqüência de nucleotídeo que hibridiza sob condições de hibridização estringentes para um polinucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo da SEQ ID NO:7 ou 8, 25 onde condições de hibridização estringentes compreendem condições de hibridização de estringência baixa, média, alta e muito alta, onde tais condi- ções são descritas acima.

Em outra modalidade, um promotor objeto pode conter uma se- qüência de nucleotídeo continua que é pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idêntica à SEQ ID NO:7 ou 8 ou uma sub- sequência da mesma. Em uma modalidade, o promotor objeto pode conter uma seqüência de nucleotídeo contígua que é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID NO:7 ou 8.

Conforme mencionado na seção Exemplos abaixo, o ácido nu- cleico das SEQ ID NOS:7 e 8 foi obtido de Trichoderma reesei, um fungo filamentoso. Como ficaria prontamente aparente, equivalentes funcionais de SEQ ID NOS:7 e 8 que retêm atividade promotora podem ser identificados através de seqüências de identificação que são similares às SEQ ID NOS:7 e 8 em outros fungos filamentosos. Uma vez que a maioria ou todas das se- qüências de genoma de outros fungos filamentosos, por exemplo, Aspergil- Ius (por exemplo, Aspergillus fumigatus, Aspergiluus oryzae (vide, por exem- plo, Machida e outros, Nature, 2005, 438, 1157-1161), Aspergillus nidulans, Aspergillus fumigatus, Aspergillus Niger, Aspergillus flavus, Aspergillus ter- reus), Neurospora (por exemplo, Neurospora crassa) e Fusarium (por exem- plo, Fusarium graminearum) estão disponíveis, equivalentes funcionais de SEQ ID NOS:7 e 8 que têm atividade promotora são prontamente identificá- veis.

Conforme acima mencionado, um promotor objeto pode ter ati- vidade promotora em uma célula hospedeira. Atividade promotora pode ser detectada usando qualquer ensaio adequado. Em certas modalidades, um 20 promotor objeto pode ser operavelmente ligado a um polinucleotídeo, e transcrição do polinucleotídeo pode ser detectada usando qualquer método adequado, por exemplo, Northern blotting ou RT-PCR, etc. Em outras moda- lidades, o promotor pode ser operavelmente ligado a um polinucleotídeo que codifica uma proteína, por exemplo, uma proteína repórter, e a atividade do 25 promotor pode ser avaliada através da detecção da proteína. Nessas moda- lidades, se necessário, uma região 5' não-traduzida pode ser ligada ao pro- motor de modo que o transcrito resultante tem uma 5' UTR seguida por uma seqüência de codificação. Como seria reconhecido, os resultados obtidos a partir de tal ensaio podem ser comparados com resultados comparados com 30 um controle adequado, por exemplo, um controle negativo ou positivo, para determinar a significãncia de resultados obtidos. Qualquer célula hospedeira, por exemplo, uma célula bacteriana tal como uma célula hospedeira E. coli, Bacillus ou Streptomyces, ou uma célula fúngica filamentosa, por exemplo, uma célula hospedeira Aspergillus ssp., Trichoderma SSP. ou Fusarium ssp. pode ser empregada. Não há nenhuma necessidade que um promotor objeto esteja contido dentro de uma célula hospedeira particular. Em certos casos, 5 o promotor pode ser testado quando à atividade promotora em uma célula hospedeira Triehoderma reesei.

Um ácido nucleico recombinante compreendendo o promotor objeto é também provido. Em certos casos, o ácido nucleico recombinante pode compreender um promotor objeto e um polinucleotídeo, onde o promo- 10 tor e o polinucleotídeo são operavelmente ligados de modo que o promotor causa transcrição do polinucleotídeo em uma célula. Em certos casos, o promotor e o polinucleotídeo não estão normalmente ligados em natureza, isto é, são heterólogos um para o outro. Em certos casos, o polinucleotídeo pode conter uma seqüência de codificação para uma proteína. A proteína 15 pode ser uma enzima, uma proteína repórter ou terapêutica (por exemplo, uma proteína de anticorpo), conforme acima discutido, por exemplo. Em cer- tas modalidades, a proteína pode ser uma proteína de fusão que pode, em certos casos, conter uma seqüência de sinal ou porção-veículo para secre- ção da proteína.

Um vetor de ácido nucleico compreendendo o ácido nucleico re-

combinante objeto é também provido, bem como uma célula hospedeira con- tendo o mesmo. Em certas modalidades, o ácido nucleico recombinante po- de estar presente no genoma da célula hospedeira. Em outras modalidades, o ácido nucleico recombinante pode estar presente em um vetor que replica 25 na célula. A célula hospedeira pode ser qualquer uma de uma variedade de células hospedeiras diferentes, incluindo células bacterianas, fúngicas, de levedura, de planta e demamífero. Em uma modalidade, a célula hospedeira pode ser uma célula hospedeira fúngica filamentosa, e, em outra modalida- de, a célula hospedeira pode ser uma célula bacteriana.

Uma cultura de células compreendendo meio de cultura e uma

célula hospedeira objeto é também provida.

Um método de produção de uma proteína é também provido. Em termos gerais, este método inclui manutenção de uma cultura objeto de células sob condições adequadas para produzir a proteína. Este método po- de incluir ainda recuperação da proteína a partir do meio de cultura.

A fim de ilustrar mais a presente invenção e vantagens da mes- ma, os exemplos específicos que seguem são dados com a compreensão de que eles estão sendo oferecidos para ilustrar a presente invenção e não de- vem ser considerados de modo algum como limitando seu escopo.

Exemplo 1

Isolamento de genes de ALS de células resistentes à clorimuron-etila Clorimuron-etila (Chem Service Inc., West Chester, PA), recém-

preparada e dissolvida em DMF para uma concentração de 20 mg/ml, foi adicionada em várias concentrações a ágar Vogels derretido imediatamente antes de verter as placas para produzir meios contendo 25, 50, 100, 200, 300, 400 ou 500 ppm de clorimuron etila.

Aproximadamente 25 milhões de esporos da linhagem T. reesei

QM6a (ATCC13631) foram plaqueadas em cada placa. Após 10 dias de crescimento a 28°C, cinco colônias foram isoladas, duas de placas de 50 ppm e uma de cada uma das placas de 25, 200 e 300 ppm. As colônias fo- ram mais isoladas fazendo novas listras delas sobre placas de ágar Vogels fresco contendo 200 ppm de clorimuron etila.

DNA genômico foi preparado a partir de cada uma de cinco li- nhagens resistentes à clorimuron etila a fim de amplificar e sequenciar o ge- ne de acetolactato sintase (ais) dessas linhagens. Polimerase de DNA Her- culase (Stratagene, La Jolla, CA) foi usada para amplificação seguindo ins- 25 truções do fabricante e os iniciadores que seguem: Avançado (5'-3') GGCGCGCCTGAGACAATGGCCGGCAATGGTAAAAA (SEQ ID NO:5) e Reverso (5'-3') GCGATCGCCATCCCGTCGCGTCAAAAACACTGC (SEQ ID NO:6).

Sítios de restrição únicos foram adicionados às extremidades 5' dos primers para manipulação subsequente. Os fragmentos de 4,1 kb resul- tantes foram isolados, sequenciados e comparados com a seqüência do ge- ne de acetolactato sintase de T. reesei (do website JGI genome). Três mutações por ponto únicas no gene ais que confere resis- tência à clorimuron etila foram identificadas.

Comparado com a seqüência da proteína acetolactato sintase de T. reesei do tipo selvagem (figura 1; SEQ ID NO:1), as proteínas aceto- 5 Iactato sintase resistentes à clorimuron etila tinham cada uma das substitui- ções de aminoácido que seguem: A190D, K241E ou R372H. Os aminoáci- dos nas posições 190, 241 e 372 da proteína acetolactato sintase de T. ree- sei do tipo selvagem de SEQ ID NO:1 estão sublinhados.

Comparado com a seqüência do cDNA deduzido da acetolactato 10 sintase de T. reesei do tipo selvagem (figura 2; SEQ ID NO:2), os cDNAs de acetolactato sintase resistentes à clorimuron etila tinham cada uma das substituições de nucleotídeo que seguem: C596A (esta corresponde à subs- tituição de aminoácido A190D), A721G (esta corresponde á substituição de aminoácido K241E) ou G1115A (esta corresponde à substituição de aminoá- 15 cido R372H). Cada um dos códons alterados (GCC, que é alterado para GAC; AAG, que é alterado para GAG; e GCT, que é alterado para CAT) é indicado na figura 2.

Comparado com a seqüência do gene de acetolactato sintase de T. reesei do tipo selvagem (figura 3; SEQ ID NO:3), os genes de aceto- 20 Iactato sintase resistentes à clorimuron etila tinham cada um uma das substi- tuições de nucleotídeo que seguem: C1023A (esta corresponde à substitui- ção de aminoácido A190D), A1175G (esta corresponde à substituição de aminoácido K241E) ou G1569A (esta corresponde à substituição de aminoá- cido R372H).

Por causa da degeneração do código genético, outras mutações

na seqüência de codificação de a/s podem codificar a substituição de amino- ácido A190D, K241E ou R372H.

Exemplo 2

Transformação de T. reesei com gene de acetolactato sintase A190D O vetor pTrex-glicoamilase foi criado para expressar uma glico-

amilase derivada de Trichoderma reesei em T. reesei. A figura 4 mostra um diagrama geral do vetor. Três construtos de vetor diferentes foram feitos com promotores diferentes: 1818A, 1818B e o promotor de cbhl de T. reesei. A figura 5 ilustra as seqüências do promotor designado 1818A e a figura 5B ilustra as seqüências do promotor 1818B.

A seqüência de nucleotídeo inteira do pTrex-glicoamilase inclu- 5 indo o promotor de cbhl é mostrada na figura 6. O vetor pTrex-glicoamilase é baseado no vetor pTrex3g conforme descrito em detalhes no WO 05/001036. Resumindo, o pTrex3g é baseado no vetor de E. coli pSL1180 (Pharmacia, Inc., Piscataway, NJ) que é um vetor baseado em fagemídeo pCU18 com um sítio de clonagem múltiplo estendido contendo seqüências 10 de reconhecimento de enzima de restrição de 64 hexâmeros. Ele foi chama- do um vetor de destino Gateway (Hartley, J.L. e outros (2000) Genome Re- search 10:1788-1795) para permitir inserção usando Tecnologia Gateway (Invitrogen) de qualquer estrutura de leitura aberta desejada entre as regiões promotora e terminadora do gene de cbhl de T. reesei.

No vetor pTrex-glicoamilase, o gene de ALS A190D está sob

controle de seu promotor e terminador nativo e é usado para substituir o marcador selecionável fúngico amdS que é usado em pTrex3g.

O vetor foi transformado na linhagem de T. reesei deletada de quad (Achb 1, Acbh2, Aeg/1 e Aegl2) (WO 05/001036) originalmente derivada de RL-P37 (Sheir-Neiss e outros (1984) AppI. MicrobioL BiotechnoL 20:46- 53; USP 4.797.361) usando o procedimento mostrado abaixo.

Uma suspensão de esporos (aproximadamente 5x108 espo- ros/ml) da linhagem de Trichoderma foi preparada. 100 ul-200 ul de suspen- são de esporo foram espalhados no centro de placas de meio Vogels modifi- cado com 200 ppm de clorimuron etila e deixados secar.

Vogels modificado tinha a composição que segue: 2,5 g/L de Ci- trato de Na3*2H20, 5,0 g/L de KH2PO4, 2,0 g/L de NH4NO3, 0,2 g/L de Mg- SO4 7H20), 0,1 g/L de CaCI2‘2H20, 5 mL/L de Solução de Elementos Traços Vogels Modificado, 2,5 mL/L de Solução de Biotina Vogels Modificado, 20 30 g/L de solução de elementos traços Vogels Modificado continha 50 g/L de Ácido Cítrico, 50 g/L de ZnS04*7H20, 10 g/L Fe(NH4)2S04*6H20, 2,5 g/L de CuSO4 5H20, 0,5 g/L de MnS04*4H20, 0,5 g/L de H3BO3, 0,5 g/L de NaMo- O4 2 H2O.

Solução de Biotina de Vogels Modificado (Modified Vogels Biotin Solution) continha 0,1 g IL de d-Biotina. Após autoclave as adições que se- guem são feitas antes de verter as placas: 20 mL/L de glicose 50%, 10 mL/L de 20 mg/mL de clorimuron etila dissolvido em DMF.

Transformação da linhagem de Trichoderma através do método de transformação biolística foi realizada usando um Biolistic® PDS-1000/he Particle Delivery System da Bio-Rad (Hercules, CA) seguindo as instruções do fabricante (vide WO 05/001036 e US 2006/0003408).

Transformantes foram isolados após 3 a 4 dias de crescimento a

28°C. Transformantes foram serialmente passados duas vezes em placas de Vogels fresco com 200 ppm de clorimuron etila a fim de isolar monocarions estáveis. Transformantes foram culturados e o sobrenadante culturado foi testado através de eletroforese em SDS Page e usando um ensaio de enzi- 15 ma. Um gel de SDS PAGE é mostrado na figura 7 ilustrando a expressão da glicoamilase de T. reesei.

Exemplo 3

Sequenciamento e clonagem dos promotores 1818A e 1818B

Os promotores 1818A e 1818B (conforme mostrado nas figuras 20 5A e 5B, respectivamente) foram identificados através de exploração do banco de dados de seqüência do genoma de Trichoderma reesei do US De- partment of Energy Joint Genome Institute (conforme encontrado no world web site de jgi.doe.gov) para seqüências a montante de ESTs altamente re- presentados.

Os promotores foram amplificados através de PCR e clonados

por trás de uma seqüência de codificação de glicoamilase de acordo com o mapa do vetor mostrado na figura 8. Toda a seqüência de nucleotídeo deste construto é mostrada na figura 9. O vetor usado é baseado no vetor p- Trex3g, que é descrito em detalhes no Exemplo 6 do WO 05/001036. Resu- 30 mindo, o pTrex3g é baseado no vetor de E. coli pSL1180 (Pharmacia, Inc., Piscataway, NJ) que é um vetor baseado em fagemídeo pUC118 com um sítio de clonagem múltiplo estendido contendo seqüências de reconhecimen- to de enzima de restrição de 64 hexâmeros. Ele foi chamado um vetor de destino Gateway (Hartley, J.L. e outros (2000) Genome Research 10:1788- 1795) para permitir inserção usando Tecnologia Gateway (Invitrogen) de qualquer estrutura de leitura aberta desejada entre as regiões de promotor e 5 terminador do gene cbhl de T. reesei. No vetor usado neste exemplo, o promotor de cbh 1 foi substituído ou com o promotor 1818A ou ο 1818B, o marcador selecionável amdS foi substituído com marcador de acetolactato sintase de Trichoderma reesei, dirigido pelos seus promotor e terminador nativos.

Exemplo 4

Transformação de células hospedeiras de T. reesei com vetores incluindo os promotores 1818A e 1818B

O vetor foi transformado na linhagem de T. reesei deletada de quad (Ac/?ò1, Acbh2, àegft e àegi2) (WO 05/001036) originalmente derivada de RL-P37 (Sheir-Neiss e outros (1984) AppI. Microbioi. Biotechnoi. 20:46- 53; USP 4.797.361) usando o procedimento mostrado abaixo.

Uma suspensão de esporos (aproximadamente 5x108 espo- ros/ml) da linhagem de Trichoderma foi preparada. 100 ul-200 ul de suspen- são de esporo foram espalhados no centro de placas de meio de Vogels 20 modificado com 200 ppm de clorimuron etila. Vogels modificado tinha a composição que segue: 2,5 g/L de Citrato de Na3*2H20, 5,0 g/L de KH2PO4, 2,0 g/L de NH4NO3, 0,2 g/L de MgS04*7H20), 0,1 g/L de CaCI2*2H20, 5 mL/L de Solução de Elementos Traços de Vogels Modificado (Modified Vogels Trace Elements Solution1 2,5 mL/L de Solução de Biotina de Vogels Modifi- 25 cado, 20 g/L de solução de elementos traços de Vogels Modificado continha 50 g/L de Ácido Cítrico, 50 g/L de ZnS04*7H20, 10 g/L Fe(NH4)2S04*6H20, 2,5 g/L de CuS04*5H20, 0,5 g/L de MnS04*4H20, 0,5 g/L de H3BO3, 0,5 g/L de NaMo04*2H20. Solução de Biotina de Vogels Modificado continha 0,1 g /L de d-Biotina. Após autoclave as adições que seguem são feitas antes de 30 verter as placas: 20 mL/L de glicose 50%, 10 mL/L de 20 mg/mL de clorimu- ron etila dissolvido em DMF. A suspensão foi deixada secar sobre a superfí- cie das placas de Vogels Modificado. Transformação da linhagem de Trichoderma através do método de transformação biolística foi realizada usando um Biolistic® PDS-1000/he Particle Delivery System da Bio-Rad (Hercules, CA) seguindo as instruções do fabricante (vide WO 05/001036 e US 2006/0003408).

Transformantes foram isolados.

Exemplo 5

Avaliação de transformantes quanto à expressão de atividade de glicoamila- se dirigida por promotores 1818A e 1818B

Transformantes estáveis foram cultivados em placas de Ágar de 10 Lactose de Vogels Modificado com amido (placas de Petri de 9 cm de diâ- metro). Após cerca de 4 dias de crescimento a 28°C, 10 ml de uma solução de 1 mg/ml de 4-metil-umbeliferil-a-D-glicose foram vertidos nas colônias de crescimento. Após 30 minutos em temperatura ambiente, linhagens expres- sando glicoamilase foram visualizadas como colônias azuis fluorescentes 15 quando vistas iluminadas por uma lâmpada UV de comprimento de onda longo. A linhagem controle de T. reesei de origem, não-transformada, não mostrou fluorescência azul.

Placas de Ágar de Lactose de Vogels Modificado com amido é a mesma receita de Ágar de Vogels Modificado exceto que 25 mL/L de solu- ção de α-lactose a 20% (adicionada após autoclave) substitui solução de glicose e 20 g/L de amido de milho Pure Food Powder são adicionados an- tes do autoclave.

O substrato de glicoamilase 4-metil-umbeliferil-a-D-glicose foi preparado como segue: 200 mg de 4-metil-umbeliferil-a-D-glicose (Sigma- Aldrich Co.) são dissolvidos em 5 ml de DMSO e 195 ml de Tampão de Fos- fato de Potássio 75 mM pH 6,3 são adicionados.

Exemplo 6

Experimentos de frasco agitado com transformantes de Trichoderma reesei Transformantes fúngicos individuais serão cultivados em cultura de frasco agitado para determinar o nível de expressão de proteína glicoami- lase. O experimento será conduzido essencialmente conforme descrito no Exemplo 1 da patente norte-americana 5.874.276 com a modificação que segue: 16 g/L de alfa-lactose substitui celulose em meio TSF.

Em geral, o protocolo de fermentação conforme descrito em Fo- reman e outros (Foreman e outros (2003) J. Biol. Chem. 278:31988-31997) será seguido. Meio mínimo Vogels (Davis e outros (1970) Methods in Enzy- mology, 17a, pg. 79-143 e Davis, Rowland, NEUROSPORA, CONTRIBUTI- ONS OF A MODEL ORGANISM, Oxford University Press (2000) contendo glicose 5% será inoculado com 1,5 ml de suspensão de esporo congelada. Após cerca de 48 horas, cada cultura será transferida para 6,2 L do mesmo meio em um fermentador Biolafitte de 14L. O fermentador será ativado a 25°C, 750 RPM e fluxo de ar de 8 litros padrão por minuto. Cerca de uma hora após a glicose inicial ser esgotada, uma alimentação de Iactose a 25% (p/p) será iniciada e alimentada de uma maneira Iimitante de carbono para prevenir acúmulo de lactose. As concentrações de glicose e Iactose serão monitoradas. Amostras serão obtidas em intervalos regulares para monitorar o progresso da fermentação. Amostras coletadas serão giradas em um tubo de centrífuga de 50 ml em uma velocidade % em uma centrífuga clínica da International Equipment Company (Needham Heights, MA). Amostras de sobrenadante cultivadas em frasco de agitação serão administradas em géis BIS-TRIS SDS-PAGE (Invitrogen) sob condições de redução com tampão de administração de SDS de MOPS (ácido morfolinopropanossulfônico) e tam- pão de amostra de LDS.

Claims (24)

1. Polinucleotídeo isolado codificando uma proteína acetolactato sintase que provê resistência a compostos sulfonilureia tóxicos, em que a seqüência de aminoácido da dita proteína acetolactato é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID NO:1.

2. Polinucleotídeo isolado de acordo com a reivindicação 1, em que a dita proteína contém um aminoácido ácido na posição 190.

3. Polinucleotídeo isolado de acordo com a reivindicação 1, em que a dita proteína contém um aminoácido básico na posição 241.

4. Polinucleotídeo isolado de acordo com a reivindicação 1, em que a dita proteína contém um aminoácido básico na posição 372.

5. Polinucleotídeo isolado de acordo com a reivindicação 1, em que o dito polinucleotídeo isolado é operavelmente ligado a um promotor e a um terminador.

6. Polinucleotídeo isolado de acordo com a reivindicação 1, em que o dito polinucleotídeo isolado compreende íntrons.

7. Polinucleotídeo isolado de acordo com a reivindicação 6, em que o dito polinucleotídeo isolado é pelo menos 95% idêntico à SEQ ID NO:1.

8. Polinucleotídeo isolado de acordo com a reivindicação 1, em que o dito polinucleotídeo isolado compreende uma estrutura de leitura aber- ta única.

9. Polinucleotídeo isolado de acordo com a reivindicação 1, em que o dito polinucleotídeo isolado é 95% idêntico à SEQ ID NO:2.

10. Polinucleotídeo isolado de acordo com a reivindicação 1, em que o dito polinucleotídeo isolado é otimizado no códon para expressão da dita proteína acetolactato sintase em uma célula hospedeira particular.

11. Vetor compreendendo o polinucleotídeo isolado como defi- nido na reivindicação 1.

12. Vetor de acordo com a reivindicação 11, em que o dito vetor compreende ainda um cassete de expressão para expressão de uma proteí- na recombinante.

13. Célula hospedeira compreendendo o polinucleotídeo isolado de acordo com a reivindicação 1, em que a dita célula hospedeira é resisten- te a compostos sulfonilureia tóxicos.

14. Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 13, em que a dita célula hospedeira é uma célula hospedeira fúngica.

15. Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 14, em que a dita célula hospedeira é uma célula hospedeira fúngica filamentosa.

16. Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 15, em que a dita célula hospedeira é uma célula hospedeira de Trichoderma reesei.

17. Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 13, em que a dita célula hospedeira é uma célula de planta.

18. Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 13, em que polinucleotídeo isolado está presente em um genoma da dita célula hospedeira.

19. Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 13, em que o dito polinucleotídeo isolado está presente em um vetor que replica au- tonomamente na dita célula hospedeira.

20. Método de seleção de uma célula compreendendo: introdução de um polinucleotídeo isolado como definido na rei- vindicação 1 em uma pluralidade de células; contato da dita pluralidade de células com composto sulfonilu- reia ou imidazolinona tóxico; e cultura das ditas células para prover seleção da dita célula.

21.Método de acordo com a reivindicação 20, em que a dita cé- lula é uma célula fúngica.

22. Método de acordo com a reivindicação 21, em que a dita cé- lula é uma célula de Trichoderma reesei.

23. Método de acordo com a reivindicação 20, em que a dita cé- lula é uma célula de planta.

24. Método de acordo com a reivindicação 20, compreendendo ainda cultura da dita célula em meio líquido.