JP2757945B2 - アルカリプロテアーゼプロモーター、同ターミネーター及びこれらからなる遺伝子発現用ユニット、並びにアルカリプロテアーゼのゲノム遺伝子 - Google Patents
アルカリプロテアーゼプロモーター、同ターミネーター及びこれらからなる遺伝子発現用ユニット、並びにアルカリプロテアーゼのゲノム遺伝子Info
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- JP2757945B2 JP2757945B2 JP1231660A JP23166089A JP2757945B2 JP 2757945 B2 JP2757945 B2 JP 2757945B2 JP 1231660 A JP1231660 A JP 1231660A JP 23166089 A JP23166089 A JP 23166089A JP 2757945 B2 JP2757945 B2 JP 2757945B2
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- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
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- C12N9/58—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from fungi
- C12N9/62—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from fungi from Aspergillus
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、新規な黄麹菌由来のアルカリプロテアーゼ
プロモーター、同ターミネーター、及びこれらからなる
遺伝子発現用ユニット、並びにアルカリプロテアーゼの
ゲノム遺伝子に関する。
プロモーター、同ターミネーター、及びこれらからなる
遺伝子発現用ユニット、並びにアルカリプロテアーゼの
ゲノム遺伝子に関する。
従来、黄麹菌の一種であるアセペルギルス・オリザー
（Aspergillus oryzaae）由来のアルカリプロテアーゼ
遺伝子の構造については、全く未知であり、また、該遺
伝子の単離すらされていないのが実情である。
（Aspergillus oryzaae）由来のアルカリプロテアーゼ
遺伝子の構造については、全く未知であり、また、該遺
伝子の単離すらされていないのが実情である。
アルカリプロテアーゼは、蛋白質又はその部分加水分
解物に作用して、ペプタイド結合を分解する加水分解酵
素であって、医薬、飲食品、洗剤等広範に用いられてい
る。
解物に作用して、ペプタイド結合を分解する加水分解酵
素であって、医薬、飲食品、洗剤等広範に用いられてい
る。
本発明者等は、先にアスペルギルス・オリゼー由来の
アルカリプロテアーゼ遺伝子について種々検討した結
果、アスペルギルス・オリゼー由来のアルカリプロテア
ーゼ遺伝子及びプレプロ型アルカリプロテアーゼ遺伝子
を初めて単離及び構造決定することに成功し、特許出願
を行った（特願昭63−51777号及び特願昭63−170018
号）が、これら遺伝子はアルカリプロテアーゼのmRNA由
来のものであってアルカリプロテアーゼのゲノム遺伝子
を取得し、これを構造決定した例は未だない。
アルカリプロテアーゼ遺伝子について種々検討した結
果、アスペルギルス・オリゼー由来のアルカリプロテア
ーゼ遺伝子及びプレプロ型アルカリプロテアーゼ遺伝子
を初めて単離及び構造決定することに成功し、特許出願
を行った（特願昭63−51777号及び特願昭63−170018
号）が、これら遺伝子はアルカリプロテアーゼのmRNA由
来のものであってアルカリプロテアーゼのゲノム遺伝子
を取得し、これを構造決定した例は未だない。
一方、これまで遺伝子工学を用いた物質生産のための
宿主としては、大腸菌、枯草菌、酵母、動物細胞等が検
定されてきたが、各々長所と短所があり、特に糖鎖を有
する蛋白質やある主の立体構造を有する蛋白質は大腸
菌、枯草菌、酵母では不適当である。また動物細胞では
その培養コストが高くなり、現実の構造では問題が多
い。そこで最近注目されているのげ、かびを宿主として
発現系である。例えばUpshallらの報告Bio Techonolog
y,5,1301−1304（1987）によれば、大腸菌や酵母では活
性ある形で発現されなかったTPA（Tissue Plasminogen
Activator）が、かび（Aspergiullus nidulans）では活
性を持った形で発現するとされている。
宿主としては、大腸菌、枯草菌、酵母、動物細胞等が検
定されてきたが、各々長所と短所があり、特に糖鎖を有
する蛋白質やある主の立体構造を有する蛋白質は大腸
菌、枯草菌、酵母では不適当である。また動物細胞では
その培養コストが高くなり、現実の構造では問題が多
い。そこで最近注目されているのげ、かびを宿主として
発現系である。例えばUpshallらの報告Bio Techonolog
y,5,1301−1304（1987）によれば、大腸菌や酵母では活
性ある形で発現されなかったTPA（Tissue Plasminogen
Activator）が、かび（Aspergiullus nidulans）では活
性を持った形で発現するとされている。
そして、このような状況下、かびの宿主−ベクター系
において、有効に機能するプロモーター、ターミネータ
ー等の開発は重要な意味を持ってきている。
において、有効に機能するプロモーター、ターミネータ
ー等の開発は重要な意味を持ってきている。
本発明の課題は、黄麹菌アルカリプロテアーゼのゲノ
ム遺伝子を得てその構造を解析して該ゲノム遺伝子のプ
ロモーター及びターミネーター領域を決定し、該ゼノム
遺伝子からかびの宿主−ベクター系において有効に機能
するプロモーター、ターミネーター及びこれらからなる
遺伝子発現用ユニットを新たに取得、提供することにあ
る。
ム遺伝子を得てその構造を解析して該ゲノム遺伝子のプ
ロモーター及びターミネーター領域を決定し、該ゼノム
遺伝子からかびの宿主−ベクター系において有効に機能
するプロモーター、ターミネーター及びこれらからなる
遺伝子発現用ユニットを新たに取得、提供することにあ
る。
本発明者等は、鋭意研究の結果、黄麹菌の染色体から
アルカルプロテアーゼのゲノム遺伝子を新たに得てその
構造を解析し、該ゲノム遺伝子５′側上流域にあるプロ
モーター領域および３′側下流域にあるターミネーター
領域の解析に成功し、本発明を完成したものである。
アルカルプロテアーゼのゲノム遺伝子を新たに得てその
構造を解析し、該ゲノム遺伝子５′側上流域にあるプロ
モーター領域および３′側下流域にあるターミネーター
領域の解析に成功し、本発明を完成したものである。
以下、本発明について詳述する。
本発明のアルカリプロテアーゼのゲノム遺伝子、該ゲ
ノム遺伝子のプロモーター、ターミネーターは以下のよ
うに調整する。
ノム遺伝子のプロモーター、ターミネーターは以下のよ
うに調整する。
黄麹菌（アスペルギルス・オリゼー）の菌株から公知
の手法（例えば、Oakleyらの報告Gene,61,385−399（19
87））に準じて染色DNAを抽出し、これを適当な制限酵
素によって部分消化し、プラスミドベクター（例えば、
pUC19など）に導入した後、宿主（例えば、大腸菌JM109
株,HB101株（宝酒造社製）など）を形質転換してジェノ
ミックライブラリーを得る。プローブ（例えば、cDNAプ
ロープ，合成プローブなど）によるスクリーニングによ
って陽性クローンを得、目的とするプラスミドDNAを回
収する。プラスミドDNAを適当な制限酵素によって消化
し、プラスミドベクター（例えば、pUP19など）に導入
して宿主（例えば、大腸菌JM109株）を形質転換し目的
とするクローンを得る。
の手法（例えば、Oakleyらの報告Gene,61,385−399（19
87））に準じて染色DNAを抽出し、これを適当な制限酵
素によって部分消化し、プラスミドベクター（例えば、
pUC19など）に導入した後、宿主（例えば、大腸菌JM109
株,HB101株（宝酒造社製）など）を形質転換してジェノ
ミックライブラリーを得る。プローブ（例えば、cDNAプ
ロープ，合成プローブなど）によるスクリーニングによ
って陽性クローンを得、目的とするプラスミドDNAを回
収する。プラスミドDNAを適当な制限酵素によって消化
し、プラスミドベクター（例えば、pUP19など）に導入
して宿主（例えば、大腸菌JM109株）を形質転換し目的
とするクローンを得る。
本発明のプロモーターを含む遺伝子断片を組み込んだ
プラスミドとしては、pAPO17（制限酵素地図は図参照）
が挙げられる。また、本発明のターミネーターを含む遺
伝子断片と組み込んだプラスミドとしては、pAPO25（制
限酵素地図は図参照）が挙げられる。
プラスミドとしては、pAPO17（制限酵素地図は図参照）
が挙げられる。また、本発明のターミネーターを含む遺
伝子断片と組み込んだプラスミドとしては、pAPO25（制
限酵素地図は図参照）が挙げられる。
DNAの塩基配列は公知の方法（例えば、キロシークエ
ンス法、マキサム・ギルバート法、ダイデオキシ法）に
よって解析した。
ンス法、マキサム・ギルバート法、ダイデオキシ法）に
よって解析した。
上記の様にして取得、構造決定された本発明の黄麹菌
のアルカリプロテアーゼのゲノム遺伝子は第１図の制限
酵素切断地図及び第４図の塩基配列を有し、下記本発明
のプロモーター、ターミネーター領域のほか、３つのイ
ントロン配列を有している（図中、IVS1〜３と表示）。
のアルカリプロテアーゼのゲノム遺伝子は第１図の制限
酵素切断地図及び第４図の塩基配列を有し、下記本発明
のプロモーター、ターミネーター領域のほか、３つのイ
ントロン配列を有している（図中、IVS1〜３と表示）。
また、本発明のプロモーターは、上記ゲノム遺伝子の
５′側上流域に存在し、1110のbpのDNAを有している。
その塩基配列を第２図に示すが、これは第４図のゲノム
遺伝子の塩基配列塩基番号１（Ｃ）〜1110（Ｃ）に相当
するものである。
５′側上流域に存在し、1110のbpのDNAを有している。
その塩基配列を第２図に示すが、これは第４図のゲノム
遺伝子の塩基配列塩基番号１（Ｃ）〜1110（Ｃ）に相当
するものである。
しかしながら、この第２図に示すもののほか、第２図
に示した塩基配列と一部分の塩基配列が異なるDNA、上
記の塩基配列の一部分からなるDNAまたは上記の塩基配
列を少なくとも含んでいるDNAであって、上記プロモー
ターと同等の機能を有するものも本発明に含まれる。
に示した塩基配列と一部分の塩基配列が異なるDNA、上
記の塩基配列の一部分からなるDNAまたは上記の塩基配
列を少なくとも含んでいるDNAであって、上記プロモー
ターと同等の機能を有するものも本発明に含まれる。
さらに、本発明のターミネーターは上記ゲノム遺伝子
が３′側下流域に存在し、530bpのDNAを有している。そ
の塩基配列を、第３図に示すが、これは第４図のゲノム
遺伝子の塩基配列中塩基番号2458（Ｇ）〜2988（Ｇ）に
相当するものである。
が３′側下流域に存在し、530bpのDNAを有している。そ
の塩基配列を、第３図に示すが、これは第４図のゲノム
遺伝子の塩基配列中塩基番号2458（Ｇ）〜2988（Ｇ）に
相当するものである。
また同様に、第３図に示すもののほか、第３図に示し
た塩基配列と一部分の塩基配列が異なるDNA、上記の塩
基配列の一部分からなるDNAまたは上記の塩基配列を少
なくとも含んでいるDNAであって、上記ターミネーター
と同等の機能を有するものも本発明に含まれる。
た塩基配列と一部分の塩基配列が異なるDNA、上記の塩
基配列の一部分からなるDNAまたは上記の塩基配列を少
なくとも含んでいるDNAであって、上記ターミネーター
と同等の機能を有するものも本発明に含まれる。
このプローモーターあるいはターミネーターを適当な
プラスミドベクターに接続することにより黄麹菌での発
現用ベクターとして利用可能である。
プラスミドベクターに接続することにより黄麹菌での発
現用ベクターとして利用可能である。
そして、これらの本発明のプロモーター及びターミネ
ーターは、これらをセットにして遺伝子発現用ユニット
として用いることができる。
ーターは、これらをセットにして遺伝子発現用ユニット
として用いることができる。
得られた本発明ベクターにウロキナーゼ,Hepatitis B
抗原，ヒト血清アルブミン，インターフェロンα，イン
ターフェロンγ、およびその誘導体の遺伝子等を挿入
し、さらに例えばアスペルギルス・オリゼー、アスペル
ギルス・ニガー、アスペルギルス・アワモリ、アスペル
ギルス・ソヤー等の宿主を形質転換し、該形質転換体で
培養することにより目的化合物を得ることができる。
抗原，ヒト血清アルブミン，インターフェロンα，イン
ターフェロンγ、およびその誘導体の遺伝子等を挿入
し、さらに例えばアスペルギルス・オリゼー、アスペル
ギルス・ニガー、アスペルギルス・アワモリ、アスペル
ギルス・ソヤー等の宿主を形質転換し、該形質転換体で
培養することにより目的化合物を得ることができる。
本発明により、アルカリプロテアーゼプロモータ、タ
ーミネータ及びこれらからなる発現用ユニット並びにア
ルカルプロテアーゼのゲノム遺伝子を新たに提供するこ
とができた。特に上記プロモーター、ターミネーター及
びこれらからなる発現用ユニットは適当なプラスミドベ
クターに接続することにより、黄麹菌、アスペルギルス
・オリゼー、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス
・アワモリ、アスペルギルス・ソヤー等のかびにおける
有用な発現用ベクターを構築することが可能であり、本
発明はかびの宿主−ベクター形を用いる有用物質の生産
において大いに寄与するものである。
ーミネータ及びこれらからなる発現用ユニット並びにア
ルカルプロテアーゼのゲノム遺伝子を新たに提供するこ
とができた。特に上記プロモーター、ターミネーター及
びこれらからなる発現用ユニットは適当なプラスミドベ
クターに接続することにより、黄麹菌、アスペルギルス
・オリゼー、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス
・アワモリ、アスペルギルス・ソヤー等のかびにおける
有用な発現用ベクターを構築することが可能であり、本
発明はかびの宿主−ベクター形を用いる有用物質の生産
において大いに寄与するものである。
以下に実施例を示すが、本発明は特にこれに限定され
るものではない。
るものではない。
1.アスペルギルス・オリゼー染色体DNAの調製 アスペルギルス・オリゼーの染色体DNA抽出には、以
下に記した方法で行った。まず、アスペルギルス・オリ
ゼーATCC20386株をスラントから一白金耳とり、50mlのY
PS培値（１％イーストエクストラクト、２％バクトペプ
トン、２％可溶性でんぷん）に植菌し、30℃で２日間培
養した。この培養液をさらに３の三角フラスコに500m
lのYPS培値を入れたものに接種し、30℃で一昼夜培養し
た。集菌は３枚に重ねたガーゼで濾過することにより行
い、集めた菌体は、20mM EDTA（pH8.0）溶液で２回洗浄
した。さらに抽出バッファー（100mMトリス−塩酸,pH8.
0、10mM EDTA,1％ラウリル硫酸ナトリウム）で１回洗浄
後、濾紙で水分を除去した。この湿菌体と同重量の滅菌
済海砂Ｂ（ナカライテクス社製）を混合し、冷却した乳
ばちで約５分間すりつぶした。60mlの抽出バッファー
（前記）を添加し、さらに約５分間すりつぶした。すり
つぶした菌体を遠心管に入れて遠心分離し、上清を滅菌
した新しい遠心管に移した。この上清に最終濃度５μg/
mlになるようにRNase A（シグマ社製）を添加し、60℃
で20分間反応させた。1/6倍容の3M酢酸カリウム溶液を
添加し、室温で15分間放置後、遠心分離し、上清を滅菌
した新しい遠心管に移した。同容積のTE飽和フェノール
（同体積の100mM Tris−塩酸,10mM EDTA,pH8.0溶液で平
衡化させたもの）で２回抽出し、さらに同容積のエーテ
ルで３回抽出した。抽出後の溶液に２倍容のエタノール
を界面に乱さないようにゆっくりと添加し、界面に生じ
た染色体DNAをパスツールピペットでまき取った。まき
取ったDNAは70％エタノール、90％エタノール、100％エ
タノールの順にリンスし、乾燥後、TEバッファー（10mM
トリスー塩酸、1mM EDTA pH8.0）に溶解した。
下に記した方法で行った。まず、アスペルギルス・オリ
ゼーATCC20386株をスラントから一白金耳とり、50mlのY
PS培値（１％イーストエクストラクト、２％バクトペプ
トン、２％可溶性でんぷん）に植菌し、30℃で２日間培
養した。この培養液をさらに３の三角フラスコに500m
lのYPS培値を入れたものに接種し、30℃で一昼夜培養し
た。集菌は３枚に重ねたガーゼで濾過することにより行
い、集めた菌体は、20mM EDTA（pH8.0）溶液で２回洗浄
した。さらに抽出バッファー（100mMトリス−塩酸,pH8.
0、10mM EDTA,1％ラウリル硫酸ナトリウム）で１回洗浄
後、濾紙で水分を除去した。この湿菌体と同重量の滅菌
済海砂Ｂ（ナカライテクス社製）を混合し、冷却した乳
ばちで約５分間すりつぶした。60mlの抽出バッファー
（前記）を添加し、さらに約５分間すりつぶした。すり
つぶした菌体を遠心管に入れて遠心分離し、上清を滅菌
した新しい遠心管に移した。この上清に最終濃度５μg/
mlになるようにRNase A（シグマ社製）を添加し、60℃
で20分間反応させた。1/6倍容の3M酢酸カリウム溶液を
添加し、室温で15分間放置後、遠心分離し、上清を滅菌
した新しい遠心管に移した。同容積のTE飽和フェノール
（同体積の100mM Tris−塩酸,10mM EDTA,pH8.0溶液で平
衡化させたもの）で２回抽出し、さらに同容積のエーテ
ルで３回抽出した。抽出後の溶液に２倍容のエタノール
を界面に乱さないようにゆっくりと添加し、界面に生じ
た染色体DNAをパスツールピペットでまき取った。まき
取ったDNAは70％エタノール、90％エタノール、100％エ
タノールの順にリンスし、乾燥後、TEバッファー（10mM
トリスー塩酸、1mM EDTA pH8.0）に溶解した。
2.プローブの合成 一般に、cDNAを用いてそのジェノミック遺伝子をクロ
ーニングする場合、cDNA自体をプローブにしてハイブリ
ダイゼーションする場合が多い。ところが目的の遺伝子
がファミリーを形成している場合や、偽遺伝子を有して
いる場合には、cDNAをプローブとして用いることとその
特異性が低くなってしまう。そこでアルカリプロテアー
ゼ遺伝子のクローニングには、cDNAの配列（特願昭63−
170018号）のうち、５′側と３′側の非翻訳領域を基に
した合成オリゴヌクレオチドをプローブとして用いた。
合成したオリゴヌクレオチドの配列を以下に示す。
ーニングする場合、cDNA自体をプローブにしてハイブリ
ダイゼーションする場合が多い。ところが目的の遺伝子
がファミリーを形成している場合や、偽遺伝子を有して
いる場合には、cDNAをプローブとして用いることとその
特異性が低くなってしまう。そこでアルカリプロテアー
ゼ遺伝子のクローニングには、cDNAの配列（特願昭63−
170018号）のうち、５′側と３′側の非翻訳領域を基に
した合成オリゴヌクレオチドをプローブとして用いた。
合成したオリゴヌクレオチドの配列を以下に示す。
AP−23;5′＞GCG CAA GAA CAA CTC AAG TCG GAG GAT AGA＜３′ AP−24;5′＞CAT GTA CAG AGT ATA CTT ATG GAT GTA GTC＜３′ AP−23は、アルカリプロテアーゼcDNA（特願昭63−17
0018号）の５′側非翻訳領域の配列を基に設計した30塩
基長（mer）のオリゴヌクレオチドで、AP−24は３′側
非翻訳領域の配列を基に設計した30merのオリゴヌクレ
オチドである。これらのオリゴヌクレオチドは製造業者
により指示された試薬と方法を用いて、DNA合成機（381
A）（アプライド バイオシステム社製）で合成した。
合成オリゴヌクレオチドの放射性標識は、［γ−32P］A
TP（アマシャム社製）とT4ポリヌクレオチドキナーゼ
（宝酒造製）を用いて行った。
0018号）の５′側非翻訳領域の配列を基に設計した30塩
基長（mer）のオリゴヌクレオチドで、AP−24は３′側
非翻訳領域の配列を基に設計した30merのオリゴヌクレ
オチドである。これらのオリゴヌクレオチドは製造業者
により指示された試薬と方法を用いて、DNA合成機（381
A）（アプライド バイオシステム社製）で合成した。
合成オリゴヌクレオチドの放射性標識は、［γ−32P］A
TP（アマシャム社製）とT4ポリヌクレオチドキナーゼ
（宝酒造製）を用いて行った。
3.サザーン ハイブリダイゼーション 前項で作製した合成オリゴヌクレオチドプローブを用
い、アスペルギルス・オリゼーATCC20386株の染色体DNA
に対し、サザーン ハイブリダイゼーション法によっ
て、アルカリプロテアーゼ遺伝子の解析を行った。ま
ず、アスペルギルス・オリゼーの染色体DNAをいくつか
の制限酵素（例えば、BamH I,EcoR Iなど）で消化後、
アガロースゲル電気泳動にて分離した。泳動後、サザー
ン トランスファー法により、DNAをニトロセルロース
フィルターにブロッティングした。サザーン トランス
ファー法としては、Maniatisらの方法（Molecular Clon
ing,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laborat
ory,Cold Spring Harbor,NY.（1982））に従った。ハイ
ブリダイゼーションは、６×SSC（0.9M NaCl,0.90Mクエ
ン酸三ナトリウム）,0.5％ラウリル硫酸ナトリウム,5×
デンハルツ溶液（0.1％フィーコール,0.1％ポリビニル
ビロリドン,0.1％ウシ血清アルブミン）,0.01M EDTA（p
H8.0）,100μg/mlトランファーRNAの溶液中で42℃で行
った。プローブは、約1.0×107cpm/mlの濃度で添加し
た。洗浄は６×SSC,0.5％ラウリル硫酸ナトリウムの溶
液を用い、45℃で３回行った。フィルターを風乾後、−
80℃でＸ線フィルム（富士フィルム製RX）にかけ、オー
トラジオグラフ像を得た。その結果、AP−23,AP−24の
両プローブともアスペルギルス・オリゼー染色体制限酵
素消化物に対し、単一で明瞭なバンドが得られた。
い、アスペルギルス・オリゼーATCC20386株の染色体DNA
に対し、サザーン ハイブリダイゼーション法によっ
て、アルカリプロテアーゼ遺伝子の解析を行った。ま
ず、アスペルギルス・オリゼーの染色体DNAをいくつか
の制限酵素（例えば、BamH I,EcoR Iなど）で消化後、
アガロースゲル電気泳動にて分離した。泳動後、サザー
ン トランスファー法により、DNAをニトロセルロース
フィルターにブロッティングした。サザーン トランス
ファー法としては、Maniatisらの方法（Molecular Clon
ing,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laborat
ory,Cold Spring Harbor,NY.（1982））に従った。ハイ
ブリダイゼーションは、６×SSC（0.9M NaCl,0.90Mクエ
ン酸三ナトリウム）,0.5％ラウリル硫酸ナトリウム,5×
デンハルツ溶液（0.1％フィーコール,0.1％ポリビニル
ビロリドン,0.1％ウシ血清アルブミン）,0.01M EDTA（p
H8.0）,100μg/mlトランファーRNAの溶液中で42℃で行
った。プローブは、約1.0×107cpm/mlの濃度で添加し
た。洗浄は６×SSC,0.5％ラウリル硫酸ナトリウムの溶
液を用い、45℃で３回行った。フィルターを風乾後、−
80℃でＸ線フィルム（富士フィルム製RX）にかけ、オー
トラジオグラフ像を得た。その結果、AP−23,AP−24の
両プローブともアスペルギルス・オリゼー染色体制限酵
素消化物に対し、単一で明瞭なバンドが得られた。
4.ライブラリーの作製 前項のサザーン ハイブリダイゼーションの結果、AP
−23プローブを用いた場合、アスペルギルス・オリゼー
染色体DNAのBg1 II消化物に対し、約6.5kbのバンドが見
られ、AP−24ではHind III消化物に対し、約4.5kbのバ
ンドが見られた。Bg1 II及びHind IIIは、アルカリプロ
テアーゼcDNA中に存在する制限酵素であるため、両制限
酵素DNA断片をクローニングすることで、アルカルプロ
テアーゼ遺伝子のほぼ全領域をクローニングできると考
えられる。そこで、これらの制限酵素を用いたアスペル
ギルス・オリゼーのジェノミックライブラリーを作製し
た。まず、第１項で調製したアスペルギルス・オリゼー
の染色体DNA約200μｇを500unitのBg1 IIおよびHind II
I（宝酒造製）で37℃，一夜消化し、0.8％のアガロース
ゲル電気泳動（30Vで一夜）を行い、同時に泳動した分
子量マーカーのサイズを基に、Bg1 II消化物に対しては
5.0〜7.0kb（キロベース）の大きさのDNA断片を、Hind
III消化物に対しては3.0〜5.0kbのDNAの断片をそれぞれ
抽出、精製した。アガロースゲルからの抽出精製は、Ma
niatis（前述）の方法を用いて行うことができる。一
方、ベクターとしてはpUC19を用い、Bg1 IIと同じ平滑
末端を生じるBamH IおよびHind IIIで消化後、アルカリ
フォスファターゼ（宝酒造製）で末端を脱リン酸化し
て、セルフライゲーションを防止した。
−23プローブを用いた場合、アスペルギルス・オリゼー
染色体DNAのBg1 II消化物に対し、約6.5kbのバンドが見
られ、AP−24ではHind III消化物に対し、約4.5kbのバ
ンドが見られた。Bg1 II及びHind IIIは、アルカリプロ
テアーゼcDNA中に存在する制限酵素であるため、両制限
酵素DNA断片をクローニングすることで、アルカルプロ
テアーゼ遺伝子のほぼ全領域をクローニングできると考
えられる。そこで、これらの制限酵素を用いたアスペル
ギルス・オリゼーのジェノミックライブラリーを作製し
た。まず、第１項で調製したアスペルギルス・オリゼー
の染色体DNA約200μｇを500unitのBg1 IIおよびHind II
I（宝酒造製）で37℃，一夜消化し、0.8％のアガロース
ゲル電気泳動（30Vで一夜）を行い、同時に泳動した分
子量マーカーのサイズを基に、Bg1 II消化物に対しては
5.0〜7.0kb（キロベース）の大きさのDNA断片を、Hind
III消化物に対しては3.0〜5.0kbのDNAの断片をそれぞれ
抽出、精製した。アガロースゲルからの抽出精製は、Ma
niatis（前述）の方法を用いて行うことができる。一
方、ベクターとしてはpUC19を用い、Bg1 IIと同じ平滑
末端を生じるBamH IおよびHind IIIで消化後、アルカリ
フォスファターゼ（宝酒造製）で末端を脱リン酸化し
て、セルフライゲーションを防止した。
前記のBg1 II消化物の5.0〜7.0kbDNA断片とBamH I消
化したpUC19、Hind III消化物の3.0〜5.0kbDNA断片とHi
nd III消化したpUC19をそれぞれ混合し、“ライゲーシ
ョンキット（宝酒造製）”によりライゲーションを行
い、その混合物を用いて大腸菌HB101株のコンピテント
セル（宝酒造製）を形質転換した。形質転換した大腸菌
は、その一部は形質転換頻度測定のためにＬ寒天培地
（１％トリプトン、0.5イーストエクストラクト、１％N
aCl、1.5％寒天）にプレーティングを行い、残りはさら
に50倍容のＬ−ブロス（１％トリプトン、0.5％イース
トエクストラクト、１％NaCl）を添加し、37℃で一夜培
養してコロニーを増幅させた後、アスペルギルス・オリ
ゼー ジェノミックライブラリーとして−80℃で保存し
た。
化したpUC19、Hind III消化物の3.0〜5.0kbDNA断片とHi
nd III消化したpUC19をそれぞれ混合し、“ライゲーシ
ョンキット（宝酒造製）”によりライゲーションを行
い、その混合物を用いて大腸菌HB101株のコンピテント
セル（宝酒造製）を形質転換した。形質転換した大腸菌
は、その一部は形質転換頻度測定のためにＬ寒天培地
（１％トリプトン、0.5イーストエクストラクト、１％N
aCl、1.5％寒天）にプレーティングを行い、残りはさら
に50倍容のＬ−ブロス（１％トリプトン、0.5％イース
トエクストラクト、１％NaCl）を添加し、37℃で一夜培
養してコロニーを増幅させた後、アスペルギルス・オリ
ゼー ジェノミックライブラリーとして−80℃で保存し
た。
5.コロニー ハイブリダイゼーション コロニー ハイブリダイゼーションは以下に示した様
に行った。まず、アスペルギルス・オリゼー ジェノミ
ックライブラリーを、直径150mmプレートあたり約10,00
0クローンになるようブレーティングし、37℃で一夜培
養した。プレートの培地には50μg/mlの濃度でアンピシ
リンを添加したＬ寒天培地を用いた。培養後、ナインロ
ンフィルター（NEN製Colony/Plaque Screen）を寒天の
上から静かに乗せてコロニーをナインロンフィルターに
移した。コロナーを移したナイロンフィルターは0.5N N
aOHに浸して溶菌、DNAを変性させた後、1Mトリス塩酸
（pH7.5）溶液に浸して中和し、乾燥させて変性したDNA
を固定した。ハイブリダイゼーションは、作製したフィ
ルターをビニールバックに入れ、サザーン ハイブリダ
イゼーションの場合と同じ条件で行った。その結果、AP
−23及びAP−24の両プローブともハイブリダイズするク
ローンがいつくか得られた。これらのクローンよりアル
カル−SDS法（Maniatis,前述）にてプラスミドDNAを抽
出し、ジデオキシ法によって塩基配列を決定したところ
アルカリプロテアーゼのcDNA配列と一致した。
に行った。まず、アスペルギルス・オリゼー ジェノミ
ックライブラリーを、直径150mmプレートあたり約10,00
0クローンになるようブレーティングし、37℃で一夜培
養した。プレートの培地には50μg/mlの濃度でアンピシ
リンを添加したＬ寒天培地を用いた。培養後、ナインロ
ンフィルター（NEN製Colony/Plaque Screen）を寒天の
上から静かに乗せてコロニーをナインロンフィルターに
移した。コロナーを移したナイロンフィルターは0.5N N
aOHに浸して溶菌、DNAを変性させた後、1Mトリス塩酸
（pH7.5）溶液に浸して中和し、乾燥させて変性したDNA
を固定した。ハイブリダイゼーションは、作製したフィ
ルターをビニールバックに入れ、サザーン ハイブリダ
イゼーションの場合と同じ条件で行った。その結果、AP
−23及びAP−24の両プローブともハイブリダイズするク
ローンがいつくか得られた。これらのクローンよりアル
カル−SDS法（Maniatis,前述）にてプラスミドDNAを抽
出し、ジデオキシ法によって塩基配列を決定したところ
アルカリプロテアーゼのcDNA配列と一致した。
AP−23プローブとハイブリダイズする約6.5kbのBg1 I
I断片を含むプラスミドをpAPO17、AP−24プローブとハ
イブリダイズする約4.5kbのHind III断片を含むプラス
ミドをpAPO25として以下解析を進めた。
I断片を含むプラスミドをpAPO17、AP−24プローブとハ
イブリダイズする約4.5kbのHind III断片を含むプラス
ミドをpAPO25として以下解析を進めた。
6.アルカリプロテアーゼのゲノム遺伝子の取得及びDNA
配列の決定 前項で得たpAPO17およびpAPO25について、いくつかの
制限酵素で消化後、アガロースゲル電気泳動により断片
パターンを観察することによりそれらの制限酵素断片地
図を作製した。その結果を第１図に示す。両プラスミド
が含んでいた遺伝子断片は、Bind IIIとBg1 II部位の間
で重複しており、両プラスミドでアルカリプロテアーゼ
遺伝子のほぼ全領域をクローニングできた。そこで第２
図に示す様に適当な制限酵素部位を使ってDNA配列の決
定を行った。DNA配列の決定法としてはジデオキシ法を
用い、その反応は“M13シークエンスキット”（宝酒造
製）、ポリアクリルアミド電気泳動は“DNA塩基配列分
析用電気泳動装置”（宝酒造製）を用いて行った。得ら
れたジェノミック遺伝子の塩基配列と、アルカリプロテ
アーゼcDNAの塩基配列（特願昭63−170018号）を比較
し、アルカリプロテアーゼ遺伝子にはそのプレプロ領域
に１箇所、成熟蛋白質領域に２箇所の計３箇所のイント
ロン配列が存在している事が分かった。
配列の決定 前項で得たpAPO17およびpAPO25について、いくつかの
制限酵素で消化後、アガロースゲル電気泳動により断片
パターンを観察することによりそれらの制限酵素断片地
図を作製した。その結果を第１図に示す。両プラスミド
が含んでいた遺伝子断片は、Bind IIIとBg1 II部位の間
で重複しており、両プラスミドでアルカリプロテアーゼ
遺伝子のほぼ全領域をクローニングできた。そこで第２
図に示す様に適当な制限酵素部位を使ってDNA配列の決
定を行った。DNA配列の決定法としてはジデオキシ法を
用い、その反応は“M13シークエンスキット”（宝酒造
製）、ポリアクリルアミド電気泳動は“DNA塩基配列分
析用電気泳動装置”（宝酒造製）を用いて行った。得ら
れたジェノミック遺伝子の塩基配列と、アルカリプロテ
アーゼcDNAの塩基配列（特願昭63−170018号）を比較
し、アルカリプロテアーゼ遺伝子にはそのプレプロ領域
に１箇所、成熟蛋白質領域に２箇所の計３箇所のイント
ロン配列が存在している事が分かった。
7.転写開始点の決定 クローニングしたアルカリプロテアーゼ遺伝子のプロ
モーター領域を解析するため、転写開始点の決定を行っ
た。転写開始点の決定には、S1マッピング法やプライマ
ー エクステンション法があるが、本実施例ではプライ
マー エクステンション法で行った。プライマーとして
は、アルカリプロテアーゼ蛋白の12番目から17番目（プ
レ領域内）のアミノ酸をコードしているDNAの逆鎖を基
に合成したオリゴヌクレオチドを用いた。以下にその配
列を示す。
モーター領域を解析するため、転写開始点の決定を行っ
た。転写開始点の決定には、S1マッピング法やプライマ
ー エクステンション法があるが、本実施例ではプライ
マー エクステンション法で行った。プライマーとして
は、アルカリプロテアーゼ蛋白の12番目から17番目（プ
レ領域内）のアミノ酸をコードしているDNAの逆鎖を基
に合成したオリゴヌクレオチドを用いた。以下にその配
列を示す。
AP−26;5′＞CGC GGG AAG GAT AGC TCC＜３′ AP−26の配列をアプライド バイオシステム社製“DN
A合成機（381A）”で合成した。合成したオリゴヌクレ
オチドの精製は、アプライド バイオシステム社製“オ
リゴヌクレオチド精製カートリッジ”を用いた。AP−26
の末端ラベリングは［γ−32P］ATPとT4ポリヌクレオチ
ドキナーゼを用いて行った。反応は50mMトリス−塩酸
（pH8.0）、10mM MaCl2,10mMジチオスレイトール（DT
T）の溶液中で37℃,1時間反応させた。ラベルに用いら
れなかった［γ−32P］ATPは“NENSORBTM20"カラム（NE
N製）を使って除去し、以上の操作で１μgDNA当り約107
cpmの放射活性を持つオリゴヌクレオチドが得られた。
A合成機（381A）”で合成した。合成したオリゴヌクレ
オチドの精製は、アプライド バイオシステム社製“オ
リゴヌクレオチド精製カートリッジ”を用いた。AP−26
の末端ラベリングは［γ−32P］ATPとT4ポリヌクレオチ
ドキナーゼを用いて行った。反応は50mMトリス−塩酸
（pH8.0）、10mM MaCl2,10mMジチオスレイトール（DT
T）の溶液中で37℃,1時間反応させた。ラベルに用いら
れなかった［γ−32P］ATPは“NENSORBTM20"カラム（NE
N製）を使って除去し、以上の操作で１μgDNA当り約107
cpmの放射活性を持つオリゴヌクレオチドが得られた。
次に、アルカリプロテアーゼcDNAのクローニングの際
に鋳型して用いたmRNA（特願昭63−170018号）約３μｇ
と32Pでラベルした上記プライマーAP−26約10ngを混合
して６μとし、それに１μの10×逆転写酵素用バッ
ファー（50mM トリス−塩酸pH0.8、500mM KCl、100mM
MgCl2）を添加し、70℃で５分間加熱処理後、室温で20
分間放置し、プライマーとmRNAのアニーリングを行っ
た。
に鋳型して用いたmRNA（特願昭63−170018号）約３μｇ
と32Pでラベルした上記プライマーAP−26約10ngを混合
して６μとし、それに１μの10×逆転写酵素用バッ
ファー（50mM トリス−塩酸pH0.8、500mM KCl、100mM
MgCl2）を添加し、70℃で５分間加熱処理後、室温で20
分間放置し、プライマーとmRNAのアニーリングを行っ
た。
次にこの溶液に10mM DTT1μ、20mM dNTP（dATP,dGT
P,dCTP,dTTPの等モル混合物）、リボヌクレアーゼイン
ヒビター（117units/μ，宝酒造製）0.5μ、逆転写
酵素（宝酒造製22units/μ）0.5μを添加し、42℃
で１時間反応させた後、ホルムアミド溶液（95％ホルム
アミド、0.1キシレンシアノール、0.1％ブロムフェノー
ルブルー）10μを添加して反応を停止した。
P,dCTP,dTTPの等モル混合物）、リボヌクレアーゼイン
ヒビター（117units/μ，宝酒造製）0.5μ、逆転写
酵素（宝酒造製22units/μ）0.5μを添加し、42℃
で１時間反応させた後、ホルムアミド溶液（95％ホルム
アミド、0.1キシレンシアノール、0.1％ブロムフェノー
ルブルー）10μを添加して反応を停止した。
次に上記で得られた反応液１〜３μを、６％アクリ
ルアミド−尿素ゲルにアプライした。同時に、pAPO17を
鋳型とし、AP−26をプライマーとしてジデオキシ反応さ
せた後をサイズマーカーとして同じゲルに泳動した。こ
の結果、プライマーエクステンションした反応液ではバ
ンドが３本見られ、アルカリプロテアーゼ遺伝子の転写
開始点は３箇所存在する事がわかった。その結果を第２
図に示す。決定した最上流の転写開始点30〜40塩基上流
に、いわゆるTATAボックスと考えられる配列TATAATが存
在しており、80〜90塩基上流には、CATTボックスと考え
られる配列CCAAATが存在している。
ルアミド−尿素ゲルにアプライした。同時に、pAPO17を
鋳型とし、AP−26をプライマーとしてジデオキシ反応さ
せた後をサイズマーカーとして同じゲルに泳動した。こ
の結果、プライマーエクステンションした反応液ではバ
ンドが３本見られ、アルカリプロテアーゼ遺伝子の転写
開始点は３箇所存在する事がわかった。その結果を第２
図に示す。決定した最上流の転写開始点30〜40塩基上流
に、いわゆるTATAボックスと考えられる配列TATAATが存
在しており、80〜90塩基上流には、CATTボックスと考え
られる配列CCAAATが存在している。
8.アルカリプロテアーゼゲノム遺伝子の連結 ２つのDNA断片（pAPO17,pAPO25）にクローニングされ
たアルカリプロテアーゼゲノム遺伝子を連結するために
第５図に示した操作を行った。まず、約50μｇのpAPO17
をNco I（宝酒造製）で消化後、“DNAブランティングキ
ット”（宝酒造製）を用いて平滑末端化した。この消化
断片にBamH Iリンカー（宝酒造製）５μｇを混合し、
“DNAライゲーションキット”（宝酒造製）を用いて両
者をライゲーションし、エタノール沈澱でDNAを精製
後、BamH IおよびHind III（宝酒造製）で消化した。こ
のDNA混合物を１％アガロースゲル電気泳動により分離
し、アルカリプロテアーゼゲノム遺伝子の５′側を含む
約1200bpのDNA断片をゲルから回収、精製した。ゲルか
らのDNA回収法は、Maniatisら（前述）の方法で行うこ
とができる。一方、pAPO25は、約50μｇをPst I（宝酒
造製）を消化後、“DNAブランティングキット”（宝酒
造製）で平滑末端にし、同様にBamH Iリンカー５μｇを
混合して“DNAライゲーションキット”（宝酒造製）を
用いてライゲーションした。ライゲーション後、エタノ
ール沈澱により精製し、BamH IおよびHind IIIで消化し
た。
たアルカリプロテアーゼゲノム遺伝子を連結するために
第５図に示した操作を行った。まず、約50μｇのpAPO17
をNco I（宝酒造製）で消化後、“DNAブランティングキ
ット”（宝酒造製）を用いて平滑末端化した。この消化
断片にBamH Iリンカー（宝酒造製）５μｇを混合し、
“DNAライゲーションキット”（宝酒造製）を用いて両
者をライゲーションし、エタノール沈澱でDNAを精製
後、BamH IおよびHind III（宝酒造製）で消化した。こ
のDNA混合物を１％アガロースゲル電気泳動により分離
し、アルカリプロテアーゼゲノム遺伝子の５′側を含む
約1200bpのDNA断片をゲルから回収、精製した。ゲルか
らのDNA回収法は、Maniatisら（前述）の方法で行うこ
とができる。一方、pAPO25は、約50μｇをPst I（宝酒
造製）を消化後、“DNAブランティングキット”（宝酒
造製）で平滑末端にし、同様にBamH Iリンカー５μｇを
混合して“DNAライゲーションキット”（宝酒造製）を
用いてライゲーションした。ライゲーション後、エタノ
ール沈澱により精製し、BamH IおよびHind IIIで消化し
た。
このDNA消化物を１％アガロースゲル電気泳動により
分離し、アルカリプロテアーゼゲノム遺伝子の３′側を
含む約1800bpのDNA断片をゲルから回収、精製した。
分離し、アルカリプロテアーゼゲノム遺伝子の３′側を
含む約1800bpのDNA断片をゲルから回収、精製した。
前述のアルカリプロテアーゼ５′側のDAN断片（約120
0bp,BamH I/Hind III断片）と３′側DNA断片（約1800b
p,BamH I/Hind III断片）をそれぞれ約３μｇずつ混合
し、“DNAライゲーションキット”によりライゲーショ
ン後、BamH Iで消化した。消化したDNAを１％アガロー
スゲル電気泳動で分離し、目的の大きさのDNA断片（約3
kp）を回収、精製した。このアルカリプロテアーゼゲノ
ム遺伝子を含むDNA断片をBamH Iで消化したpUC19と混合
してライゲーション後、大腸菌JM109株コンピンテント
セル（宝酒造製）に導入し、アンピシリン耐性を獲得し
た形質転換株をスクリーニングすることで目的のプラス
ミドpAP1725を有するクローンを得た。pAP1725は、pUC1
9のBamH I部位に、アルカリプロテアーゼゲノム遺伝子
（約3kp）が挿入されたDNAである。
0bp,BamH I/Hind III断片）と３′側DNA断片（約1800b
p,BamH I/Hind III断片）をそれぞれ約３μｇずつ混合
し、“DNAライゲーションキット”によりライゲーショ
ン後、BamH Iで消化した。消化したDNAを１％アガロー
スゲル電気泳動で分離し、目的の大きさのDNA断片（約3
kp）を回収、精製した。このアルカリプロテアーゼゲノ
ム遺伝子を含むDNA断片をBamH Iで消化したpUC19と混合
してライゲーション後、大腸菌JM109株コンピンテント
セル（宝酒造製）に導入し、アンピシリン耐性を獲得し
た形質転換株をスクリーニングすることで目的のプラス
ミドpAP1725を有するクローンを得た。pAP1725は、pUC1
9のBamH I部位に、アルカリプロテアーゼゲノム遺伝子
（約3kp）が挿入されたDNAである。
9.発現ベクターの作製 アルカリプロテアーゼ遺伝子のプロモーター、ターミ
ネーターを用いた発現ベクターの作製は第６図に示した
ストラテジーで行った。
ネーターを用いた発現ベクターの作製は第６図に示した
ストラテジーで行った。
まず、ターミネーター領域を単離するため、約10μｇ
のpAPAO25をAf1 II（宝酒造製）で消化後、“DNAブラン
ティングキット”（宝酒造製）用いて切断箇所を平滑末
端化した。エタノール沈澱により精製した後、さらにPs
t I（宝酒造製）で消化し、１％アガロースゲル電気泳
動により消化断片を分離した。このうちアルカリプロテ
アーゼのターミネーター領域のDNA断片（約500bp）をア
ガロースゲルより抽出、精製した。一方、ベクターとな
るpUC19をPst IおよびHinc II（宝酒造製）で消化後、
アルカリフォスファターゼ（宝酒造製）で切断点を脱リ
ン酸化させた。この切断したベクター（約100ng）と前
述のターミネーターDNA断片（約500bp）を混合し、“DA
Nライゲーションキット”（宝酒造製）でライゲーショ
ンし、その混合物で大腸菌JM109株（宝酒造製）を形質
転換した。アンピシリン耐性を獲得したクローンから、
プラスミドDNAを抽出してスクリーニングを行い、目的
のプラスミドpAPO44を得た。
のpAPAO25をAf1 II（宝酒造製）で消化後、“DNAブラン
ティングキット”（宝酒造製）用いて切断箇所を平滑末
端化した。エタノール沈澱により精製した後、さらにPs
t I（宝酒造製）で消化し、１％アガロースゲル電気泳
動により消化断片を分離した。このうちアルカリプロテ
アーゼのターミネーター領域のDNA断片（約500bp）をア
ガロースゲルより抽出、精製した。一方、ベクターとな
るpUC19をPst IおよびHinc II（宝酒造製）で消化後、
アルカリフォスファターゼ（宝酒造製）で切断点を脱リ
ン酸化させた。この切断したベクター（約100ng）と前
述のターミネーターDNA断片（約500bp）を混合し、“DA
Nライゲーションキット”（宝酒造製）でライゲーショ
ンし、その混合物で大腸菌JM109株（宝酒造製）を形質
転換した。アンピシリン耐性を獲得したクローンから、
プラスミドDNAを抽出してスクリーニングを行い、目的
のプラスミドpAPO44を得た。
次にプロモーター領域を単離するため、約10μｇのpA
PO17をNco I（宝酒造製）で消化後“DNAブランティング
キット”を用いて切断箇所を平滑末端化した。エタノー
ル沈澱後、EcoR Iリニカー（宝酒造製）２μｇと混合
し、“DANライゲーションキット”を用いてライゲーシ
ョンした。ライゲーションしたDNA混合物をEcoR Iおよ
びFsp I（New England Biolab社製）で消化し、１％ア
ガロースゲル電気作動により消化断片を分離した。分離
したDNA断片のうち、アルカリプロテアーゼ プロモー
ター領域を含むDNA断片（約1100bp）をアガロースゲル
より抽出し、精製した。
PO17をNco I（宝酒造製）で消化後“DNAブランティング
キット”を用いて切断箇所を平滑末端化した。エタノー
ル沈澱後、EcoR Iリニカー（宝酒造製）２μｇと混合
し、“DANライゲーションキット”を用いてライゲーシ
ョンした。ライゲーションしたDNA混合物をEcoR Iおよ
びFsp I（New England Biolab社製）で消化し、１％ア
ガロースゲル電気作動により消化断片を分離した。分離
したDNA断片のうち、アルカリプロテアーゼ プロモー
ター領域を含むDNA断片（約1100bp）をアガロースゲル
より抽出し、精製した。
次に、ターミーネーター領域をサブクローニングした
プラスミドpAPO44約10μｇをEcoR IおよびSma I（宝酒
造製）で消化後、アルカリフォスファターゼで脱リン酸
化したもの（約100ng）と前記のプロモーター断片（約1
100bp,約100ng）を混合し“DNAライゲーションキット”
によりライゲーションし、大腸菌JM109部を形質転換し
た。得られたアンピシリン耐性株からプラスミドDNAを
抽出してスクリーニングを行い、目的のプラスミドpAPO
45を得た。pAPO45はアルカリプロテアーゼのプローモー
ター、ターミネーターが連結されたプラスミドで、単一
認識部位であるBamH I部位に異種遺伝子を挿入する事で
発現させうるベクターである。
プラスミドpAPO44約10μｇをEcoR IおよびSma I（宝酒
造製）で消化後、アルカリフォスファターゼで脱リン酸
化したもの（約100ng）と前記のプロモーター断片（約1
100bp,約100ng）を混合し“DNAライゲーションキット”
によりライゲーションし、大腸菌JM109部を形質転換し
た。得られたアンピシリン耐性株からプラスミドDNAを
抽出してスクリーニングを行い、目的のプラスミドpAPO
45を得た。pAPO45はアルカリプロテアーゼのプローモー
ター、ターミネーターが連結されたプラスミドで、単一
認識部位であるBamH I部位に異種遺伝子を挿入する事で
発現させうるベクターである。
第１図は黄麹菌アルカリプロテアーゼのゲノム遺伝子の
制限酵素地図、第２図は黄麹菌アルカリプロテアーゼプ
ロモーターを含む黄麹菌アルカリプロテアーゼのゲノム
遺伝子上流域の塩基配列を示す図、第３図は黄麹菌アル
カリプロテアーゼターミネーターを含む黄麹菌アルカリ
プロテアーザ遺伝子下流域の塩基配列を示す図、第４図
は黄麹菌アルカリプロテアーゼのゲノム遺伝子の全塩基
配列を示す図、第５図はアルカリプロテアーゼゲノム遺
伝子の連結手順を示す図、第６図は発現ベクターpAPO45
の作成手順を示す図である。
制限酵素地図、第２図は黄麹菌アルカリプロテアーゼプ
ロモーターを含む黄麹菌アルカリプロテアーゼのゲノム
遺伝子上流域の塩基配列を示す図、第３図は黄麹菌アル
カリプロテアーゼターミネーターを含む黄麹菌アルカリ
プロテアーザ遺伝子下流域の塩基配列を示す図、第４図
は黄麹菌アルカリプロテアーゼのゲノム遺伝子の全塩基
配列を示す図、第５図はアルカリプロテアーゼゲノム遺
伝子の連結手順を示す図、第６図は発現ベクターpAPO45
の作成手順を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 真崎 厚司 大阪府枚方市招提大谷２丁目1180番地の １ 株式式社ミドリ十字中央研究所内 (72)発明者 川辺 晴英 大阪府枚方市招提大谷２丁目1180番地の １ 株式式社ミドリ十字中央研究所内 (72)発明者 有村 博文 大阪府枚方市招提大谷２丁目1180番地の １ 株式式社ミドリ十字中央研究所内 (72)発明者 辰巳 宏樹 千葉県野田市野田399番地 キッコーマ ン株式会社研究本部内 (72)発明者 村上 成治 千葉県野田市野田399番地 キッコーマ ン株式会社研究本部内 (72)発明者 中野 衛一 千葉県野田市野田399番地 キッコーマ ン株式会社研究本部内 (72)発明者 茂田井 宏 千葉県野田市野田399番地 キッコーマ ン株式会社研究本部内 (56)参考文献 特開 昭62−272988（ＪＰ，Ａ) Ａｇｒｉｃ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，52 （７）（1988），ｐ．1987−1988
Claims (7)
- 【請求項１】黄麹菌アスペルギルス・オリゼーATCC2038
6株のアルカリプロテアーゼのゲノム遺伝子を由来と
し、当該ゲノム遺伝子の５′側上流域からEcoR Iおよび
Fsp Iで切り出される、大きさが約1100bpであるアルカ
リプロテアーゼプロモーター。 - 【請求項２】下記の塩基配列を有する請求項１記載のア
ルカリプロテアーゼプロモーター。 - 【請求項３】黄麹菌アスペルギルス・オリゼーATCC2038
6株のアルカリプロテアーゼのゲノム遺伝子を由来と
し、当該ゲノム遺伝子の３′側下流域からAfl IIおよび
Pst Iで切り出される、大きさが約500bpであるアルカリ
プロテアーゼターミネーター。 - 【請求項４】下記の塩基配列を有する請求項３記載のア
ルカリプロテアーゼターミネーター。 - 【請求項５】請求項１又は２記載のアルカリプロテアー
ゼプロモーター及び請求項３又は４記載のアルカリプロ
テアーゼターミネーターからなる遺伝子発現用ユニッ
ト。 - 【請求項６】請求項１記載のアルカリプロテアーゼプロ
モーター領域及び請求項３記載のアルカリプロテアーゼ
ターミネーター領域を含み、下記の制限酵素切断地図で
表されるアルカリプロテアーゼのゲノム遺伝子。 - 【請求項７】下記の塩基配列を有する請求項６記載のア
ルカリプロテアーゼのゲノム遺伝子。
Priority Applications (3)
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|---|---|---|---|
| JP1231660A JP2757945B2 (ja) | 1989-09-08 | 1989-09-08 | アルカリプロテアーゼプロモーター、同ターミネーター及びこれらからなる遺伝子発現用ユニット、並びにアルカリプロテアーゼのゲノム遺伝子 |
| DE1990628014 DE69028014T2 (de) | 1989-09-08 | 1990-09-07 | Aus Promoter, Terminator und dem Gen der alkalischen Protease bestehende Genexpressionseinheit |
| EP19900309821 EP0427385B1 (en) | 1989-09-08 | 1990-09-07 | Gene expression unit comprising the promoter and the terminator as well as the gene of alkaline protease |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1231660A JP2757945B2 (ja) | 1989-09-08 | 1989-09-08 | アルカリプロテアーゼプロモーター、同ターミネーター及びこれらからなる遺伝子発現用ユニット、並びにアルカリプロテアーゼのゲノム遺伝子 |
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|---|---|
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| JP2757945B2 true JP2757945B2 (ja) | 1998-05-25 |
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| Ａｇｒｉｃ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，５２（７）（１９８８），ｐ．１９８７−１９８８ |
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