JP3526708B2 - 放線菌プロモーター - Google Patents
放線菌プロモーターInfo
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- JP3526708B2 JP3526708B2 JP31774596A JP31774596A JP3526708B2 JP 3526708 B2 JP3526708 B2 JP 3526708B2 JP 31774596 A JP31774596 A JP 31774596A JP 31774596 A JP31774596 A JP 31774596A JP 3526708 B2 JP3526708 B2 JP 3526708B2
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- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、転写プロモーター
活性を有する新規ＤＮＡ、該ＤＮＡを含むことからなる
組換えＤＮＡベクター、該ベクターにより形質転換され
た宿主細胞、該宿主細胞の利用、およびプラバスタチン
・ナトリウムの新規製造方法に関する。本発明を利用す
ることにより、微生物培養による有用タンパク質の工業
的生産が可能である。
活性を有する新規ＤＮＡ、該ＤＮＡを含むことからなる
組換えＤＮＡベクター、該ベクターにより形質転換され
た宿主細胞、該宿主細胞の利用、およびプラバスタチン
・ナトリウムの新規製造方法に関する。本発明を利用す
ることにより、微生物培養による有用タンパク質の工業
的生産が可能である。
【０００２】
【従来の技術】近年の遺伝子工学の進歩により、微生物
細胞に外来遺伝子を導入し発現させることが可能になっ
た。中でも、遺伝子組換えタンパク質製造のために大腸
菌を宿主として利用する技術は特に発達しており、広く
工業的に実用化されている。また大腸菌以外では、酵母
による組換えタンパク質製造技術の工業化も進んでい
る。
細胞に外来遺伝子を導入し発現させることが可能になっ
た。中でも、遺伝子組換えタンパク質製造のために大腸
菌を宿主として利用する技術は特に発達しており、広く
工業的に実用化されている。また大腸菌以外では、酵母
による組換えタンパク質製造技術の工業化も進んでい
る。
【０００３】放線菌（特にストレプトミセス：Ｓｔｒｅ
ｐｔｏｍｙｃｅｓ属）は抗生物質の生産等に汎用されて
いる原核微生物である。放線菌においては、１９８０年
代にホップウッドらにより確立された宿主−ベクター系
により外来遺伝子の導入技術が一般化し［Hopwood, D.
A., et al. (1987) "Methods in Enzymology", 153,116
-166, Academic Press, New York 参照］、それを契機
に発現ベクター系の研究開発も進展し始めた。そのよう
な、放線菌の発現ベクター用の転写プロモーターとして
は、例えば抗生物質チオストレプトン誘導性のプロモー
ターであるｔｉｐＡ［Murakami, T., et al.(1989) J.
Bacteriol., 171, 1459 参照］等が知られている。
ｐｔｏｍｙｃｅｓ属）は抗生物質の生産等に汎用されて
いる原核微生物である。放線菌においては、１９８０年
代にホップウッドらにより確立された宿主−ベクター系
により外来遺伝子の導入技術が一般化し［Hopwood, D.
A., et al. (1987) "Methods in Enzymology", 153,116
-166, Academic Press, New York 参照］、それを契機
に発現ベクター系の研究開発も進展し始めた。そのよう
な、放線菌の発現ベクター用の転写プロモーターとして
は、例えば抗生物質チオストレプトン誘導性のプロモー
ターであるｔｉｐＡ［Murakami, T., et al.(1989) J.
Bacteriol., 171, 1459 参照］等が知られている。
【０００４】高脂血症薬プラバスタチン・ナトリウムは
血清中のコレステロールを低下させるという極めて優れ
た薬効を有することが知られている［Arai, et al. (19
88)Ann. Rep. Sankyo Res. Lab., 40, 1-38参照］。プ
ラバスタチン・ナトリウムは糸状菌ペニシリウム・シト
リナムの生産するＭＬ−２３６Ｂ・ナトリウムを基質と
して用い、放線菌ストレプトミセス・カルボフィラス等
を用いて微生物水酸化を行うことにより生産することが
できる。また、その水酸化を行う本体がシトクロムＰ−
４５０sca （以下「Ｐ−４５０sca 」のように略記す
る）系であることが既に明らかにされている［Serizawa
et al. (1990) Biochimica et Biophysica, 1084, 35-
40参照］。
血清中のコレステロールを低下させるという極めて優れ
た薬効を有することが知られている［Arai, et al. (19
88)Ann. Rep. Sankyo Res. Lab., 40, 1-38参照］。プ
ラバスタチン・ナトリウムは糸状菌ペニシリウム・シト
リナムの生産するＭＬ−２３６Ｂ・ナトリウムを基質と
して用い、放線菌ストレプトミセス・カルボフィラス等
を用いて微生物水酸化を行うことにより生産することが
できる。また、その水酸化を行う本体がシトクロムＰ−
４５０sca （以下「Ｐ−４５０sca 」のように略記す
る）系であることが既に明らかにされている［Serizawa
et al. (1990) Biochimica et Biophysica, 1084, 35-
40参照］。
【０００５】松岡らは、放線菌ストレプトミセス・カル
ボフィラスから、ＭＬ−２３６Ｂ・ナトリウムの６位水
酸化を触媒するＰ−４５０sca 分子種を精製し、その性
質を明らかにした［Matsuoka et al. (1989) Eur. J. B
iochem., 184, 707-713 参照］。また、芹澤らはストレ
プトミセス・カルボフィラスからＰ−４５０sca-2 をコ
ードするＤＮＡをクローニングし発現させた［特開平６
−７０７８０、およびWatanabe, I., et al (1995) Gen
e, 163, 81-85参照］。このＤＮＡは、Ｐ−４５０sca-2
遺伝子の５’側非翻訳領域の 1 kb 部位と共に、マル
チ・コピー・プラスミド pIJ 702 に組み込まれ、スト
レプト・リビダンス TK21 を形質転換するために用いら
れた。形質転換されたストレプト・リビダンス TK21
は、ストレプトミセス・カルボフィラスよりさらに早く
ML-236Bをプラバスタチン・ナトリウムに変換した。ゆ
えに、この 1 kb 部位は強いプロモーター活性を有して
いることが示された。しかるに、該部位において、プロ
モーター活性を有する領域の特定が行われておらず、し
かも、Ｐ−４５０sca-2 の発現調節機構は未解明であ
り、５’側非翻訳領域の鎖長を短くしてもその機能を保
持し得るか否かについては全く知られていない。
ボフィラスから、ＭＬ−２３６Ｂ・ナトリウムの６位水
酸化を触媒するＰ−４５０sca 分子種を精製し、その性
質を明らかにした［Matsuoka et al. (1989) Eur. J. B
iochem., 184, 707-713 参照］。また、芹澤らはストレ
プトミセス・カルボフィラスからＰ−４５０sca-2 をコ
ードするＤＮＡをクローニングし発現させた［特開平６
−７０７８０、およびWatanabe, I., et al (1995) Gen
e, 163, 81-85参照］。このＤＮＡは、Ｐ−４５０sca-2
遺伝子の５’側非翻訳領域の 1 kb 部位と共に、マル
チ・コピー・プラスミド pIJ 702 に組み込まれ、スト
レプト・リビダンス TK21 を形質転換するために用いら
れた。形質転換されたストレプト・リビダンス TK21
は、ストレプトミセス・カルボフィラスよりさらに早く
ML-236Bをプラバスタチン・ナトリウムに変換した。ゆ
えに、この 1 kb 部位は強いプロモーター活性を有して
いることが示された。しかるに、該部位において、プロ
モーター活性を有する領域の特定が行われておらず、し
かも、Ｐ−４５０sca-2 の発現調節機構は未解明であ
り、５’側非翻訳領域の鎖長を短くしてもその機能を保
持し得るか否かについては全く知られていない。
【０００６】同時に、本報告において、Ｐ−４５０
sca-2 の発現は転写における基質誘導（substrate indu
ction ）に従うことが示され、すなわち、ML-236B と
フェノバルビタールは、Ｐ−４５０の発現を３０倍増大
せしめることが見いだされた。この知見はノザン・ブロ
ッティングにより得られた。すなわち、ML-236B 非存在
下ではＰ−４５０遺伝子の転写は見いだされなかった
が、ML-236B 存在下では、３種の転写物が見いだされ
た。また、転写のレベルは基質存在下で最大値に到達す
るまで６時間以上も増大し続けた。
sca-2 の発現は転写における基質誘導（substrate indu
ction ）に従うことが示され、すなわち、ML-236B と
フェノバルビタールは、Ｐ−４５０の発現を３０倍増大
せしめることが見いだされた。この知見はノザン・ブロ
ッティングにより得られた。すなわち、ML-236B 非存在
下ではＰ−４５０遺伝子の転写は見いだされなかった
が、ML-236B 存在下では、３種の転写物が見いだされ
た。また、転写のレベルは基質存在下で最大値に到達す
るまで６時間以上も増大し続けた。
【０００７】この 1 kb 部位をプロモーターとして使用
する場合には転写が最大レベルに到達するまで６時間以
上も要し、工業上利用することは困難である。逆にいう
ならば、工業上利用するプロモーターは、基質誘導に従
わず、安定して恒常的にプロモーター活性を保持するも
のが好ましい。
する場合には転写が最大レベルに到達するまで６時間以
上も要し、工業上利用することは困難である。逆にいう
ならば、工業上利用するプロモーターは、基質誘導に従
わず、安定して恒常的にプロモーター活性を保持するも
のが好ましい。
【０００８】また、この 1 kb 部位は、上記の通り既に
分離されているものであるが、転写プロモーター活性を
有する領域の特定、および該プロモーターのヌクレオチ
ド配列決定は行われていない。一般に、組換えＤＮＡベ
クターで宿主細胞を形質転換する際、ベクターの鎖長が
長いほど宿主細胞に導入されにくく形質転換効率は低く
なる。それゆえ、プロモーターの鎖長は、その機能を損
なわない限りにおいてできるだけ短い方が好ましい。従
って、Ｐ−４５０sca-2 遺伝子の５’側非翻訳領域から
鎖長の短いプロモーターを、プロモーター活性を充分に
保持したままで分離・同定し、該プロモーターを組み込
んだ発現ベクターを作製することにより、組換えタンパ
ク質を工業的に生産するための実用的手段を提供するこ
とができる。
分離されているものであるが、転写プロモーター活性を
有する領域の特定、および該プロモーターのヌクレオチ
ド配列決定は行われていない。一般に、組換えＤＮＡベ
クターで宿主細胞を形質転換する際、ベクターの鎖長が
長いほど宿主細胞に導入されにくく形質転換効率は低く
なる。それゆえ、プロモーターの鎖長は、その機能を損
なわない限りにおいてできるだけ短い方が好ましい。従
って、Ｐ−４５０sca-2 遺伝子の５’側非翻訳領域から
鎖長の短いプロモーターを、プロモーター活性を充分に
保持したままで分離・同定し、該プロモーターを組み込
んだ発現ベクターを作製することにより、組換えタンパ
ク質を工業的に生産するための実用的手段を提供するこ
とができる。
【０００９】すなわち、本発明の目的は、基質誘導に従
わず転写プロモーター活性を有する新規ＤＮＡ、該ＤＮ
Ａを含む組換えＤＮＡベクター、該ベクターで形質転換
された宿主細胞、および、該宿主細胞を利用して組換え
タンパク質の製造方法を提供することにある。さらに、
組換えタンパク質としてＰ−４５０を発現する宿主を用
いて、プラバスタチン・ナトリウムの製造方法を提供す
ることも、本発明の目的の一つである。
わず転写プロモーター活性を有する新規ＤＮＡ、該ＤＮ
Ａを含む組換えＤＮＡベクター、該ベクターで形質転換
された宿主細胞、および、該宿主細胞を利用して組換え
タンパク質の製造方法を提供することにある。さらに、
組換えタンパク質としてＰ−４５０を発現する宿主を用
いて、プラバスタチン・ナトリウムの製造方法を提供す
ることも、本発明の目的の一つである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】本発明は、（１）転写プ
ロモーター活性を有し、ストレプトミセス・カルボフィ
ラスのチトクローム・Ｐ−４５０をコードするオープン
・リーディング・フレームの５’側に隣接する約１キロ
塩基対の非翻訳領域の一部から成り、基質誘導に従わな
いＤＮＡ、（２）ストレプトミセス・カルボフィラスに
属する菌株の少なくともひとつで転写プロモーター活性
を有する、（１）記載のＤＮＡ、（３）ストレプトミセ
ス・リビダンスに属する菌株の少なくともひとつで転写
プロモーター活性を有する、（１）記載のＤＮＡ、
（４）チトクローム・Ｐ−４５０がチトクローム・Ｐ−
４５０sca-2 である（１）乃至（３）のいずれかひとつ
に記載のＤＮＡ、（５）ＤＮＡ鎖の鎖長が、少なくとも
７４ 塩基対以上であることを特徴とする（１）乃至
（４）のいずれかひとつに記載のＤＮＡ、（６）ＤＮＡ
鎖の鎖長が、少なくとも ３００塩基対以上であること
を特徴とする（１）乃至（４）のいずれかひとつに記載
のＤＮＡ、（７）配列表の配列番号１に示されるヌクレ
オチド配列に含まれる連続する配列を含むことから成
り、該配列のヌクレオチド番号４２８のヌクレオチドを
開始点として５’方向へ連続することを特徴とする
（１）乃至（６）のいずれかひとつに記載のＤＮＡ、
（８）（１）乃至（７）のいずれかひとつに記載のＤＮ
Ａと実質的なヌクレオチド配列相同性を有し、転写プロ
モーター活性を有し、基質誘導に従わないＤＮＡ、
（９）配列表の配列番号１に示されるヌクレオチド配列
のヌクレオチド番号１から４２８のヌクレオチドから成
る配列と６０℃、６×ｓｓｃの条件下でハイブリダイズ
し、転写プロモーター活性を有し、基質誘導に従わない
ＤＮＡ、（１０）配列表の配列番号１に示されるヌクレ
オチド配列のヌクレオチド番号１から３２０のヌクレオ
チドから成る配列と６０℃、６×ｓｓｃの条件下でハイ
ブリダイズし、転写プロモーター活性を有し、基質誘導
に従わないＤＮＡ、（１１）配列表の配列番号１に示さ
れるヌクレオチド配列のヌクレオチド番号１から４２８
のヌクレオチドから成る、（１）記載のＤＮＡ、（１
２）配列表の配列番号１に示されるヌクレオチド配列の
ヌクレオチド番号１から３２０のヌクレオチドから成
る、（１）記載のＤＮＡ、（１３）配列表の配列番号１
に示されるヌクレオチド配列のヌクレオチド番号１から
１５８のヌクレオチドから成る、（１）記載のＤＮＡ、
（１４）配列表の配列番号１に示されるヌクレオチド配
列のヌクレオチド番号１から１０１のヌクレオチドから
成る、（１）記載のＤＮＡ、（１５）配列表の配列番号
１に示されるヌクレオチド配列のヌクレオチド番号１か
ら７４のヌクレオチドから成る、（１）記載のＤＮＡ、
（１６）ストレプトミセス・リビダンスＳＡＮＫ６２７
９５（ＦＥＲＭ ＢＰ−５２９９）から得られる、
（１）記載のＤＮＡ、（１７）（１）乃至（１６）のい
ずれかひとつに記載のＤＮＡを含むことから成る組換え
ＤＮＡベクター、（１８）（１）乃至（１６）のいずれ
かひとつに記載のＤＮＡ、および該ＤＮＡの制御下に所
望のポリペプチドをコードするＤＮＡを含むことから成
り、宿主細胞内で該所望のポリペプチドを産生させるこ
とを特徴とする（１７）記載の組換えＤＮＡベクター、
（１９）（１）乃至（１６）のいずれかひとつに記載の
ＤＮＡ、および該ＤＮＡの制御下にシトクロムＰ−４５
０sca-2 をコードするＤＮＡを含むことから成り、宿主
細胞内でシトクロムＰ−４５０sca-2 を産生させること
を特徴とする（１６）または（１７）記載の組換えＤＮ
Ａベクター、（２０）（１７）乃至（１９）のいずれか
ひとつに記載の組換えＤＮＡベクターにより形質転換さ
れた宿主細胞、（２１）放線菌であることを特徴とす
る、（２０）記載の宿主細胞、（２２）形質転換放線菌
株ストレプトミセス・リビダンス ＳＡＮＫ ６２７９
５（ＦＥＲＭ ＢＰ−５２９９）、（２３）（１７）ま
たは（１９）のいずれかひとつに記載の組換えＤＮＡベ
クターにより形質転換された宿主細胞を、該ベクター中
に含まれるＤＮＡによりコードされた所望のポリペプチ
ドの産生が可能な条件下で培養して該所望のポリペプチ
ドを産生させ、次いで、該所望のポリペプチドを回収す
ることを特徴とする、該所望のポリペプチドの製造方
法、（２４）（１９）記載の組換えＤＮＡベクターによ
り形質転換された放線菌ストレプトミセス・リビダンス
ＴＫ２１株を、該ベクター中に含まれるＤＮＡによりコ
ードされるシトクロムＰ−４５０sca-2 の産生が可能な
条件下で、ＭＬ−２３６Ｂ・ナトリウムを含む培地中で
培養し、該形質転換体が産生するシトクロムＰ−４５０
sca-2 の触媒作用により該形質転換体細胞内においてＭ
Ｌ−２３６Ｂ・ナトリウムをプラバスタチン・ナトリウ
ムに変換させ、次いで、該形質転換体細胞および／また
は培地よりプラバスタチン・ナトリウムを回収すること
を特徴とする、プラバスタチン・ナトリウムの製造方
法、（２５）形質転換された放線菌株がストレプトミセ
ス・リビダンス ＳＡＮＫ６２７９５（ＦＥＲＭ ＢＰ
−５２９９）である、（２４）記載のプラバスタチン・
ナトリウムの製造方法、に関する。
ロモーター活性を有し、ストレプトミセス・カルボフィ
ラスのチトクローム・Ｐ−４５０をコードするオープン
・リーディング・フレームの５’側に隣接する約１キロ
塩基対の非翻訳領域の一部から成り、基質誘導に従わな
いＤＮＡ、（２）ストレプトミセス・カルボフィラスに
属する菌株の少なくともひとつで転写プロモーター活性
を有する、（１）記載のＤＮＡ、（３）ストレプトミセ
ス・リビダンスに属する菌株の少なくともひとつで転写
プロモーター活性を有する、（１）記載のＤＮＡ、
（４）チトクローム・Ｐ−４５０がチトクローム・Ｐ−
４５０sca-2 である（１）乃至（３）のいずれかひとつ
に記載のＤＮＡ、（５）ＤＮＡ鎖の鎖長が、少なくとも
７４ 塩基対以上であることを特徴とする（１）乃至
（４）のいずれかひとつに記載のＤＮＡ、（６）ＤＮＡ
鎖の鎖長が、少なくとも ３００塩基対以上であること
を特徴とする（１）乃至（４）のいずれかひとつに記載
のＤＮＡ、（７）配列表の配列番号１に示されるヌクレ
オチド配列に含まれる連続する配列を含むことから成
り、該配列のヌクレオチド番号４２８のヌクレオチドを
開始点として５’方向へ連続することを特徴とする
（１）乃至（６）のいずれかひとつに記載のＤＮＡ、
（８）（１）乃至（７）のいずれかひとつに記載のＤＮ
Ａと実質的なヌクレオチド配列相同性を有し、転写プロ
モーター活性を有し、基質誘導に従わないＤＮＡ、
（９）配列表の配列番号１に示されるヌクレオチド配列
のヌクレオチド番号１から４２８のヌクレオチドから成
る配列と６０℃、６×ｓｓｃの条件下でハイブリダイズ
し、転写プロモーター活性を有し、基質誘導に従わない
ＤＮＡ、（１０）配列表の配列番号１に示されるヌクレ
オチド配列のヌクレオチド番号１から３２０のヌクレオ
チドから成る配列と６０℃、６×ｓｓｃの条件下でハイ
ブリダイズし、転写プロモーター活性を有し、基質誘導
に従わないＤＮＡ、（１１）配列表の配列番号１に示さ
れるヌクレオチド配列のヌクレオチド番号１から４２８
のヌクレオチドから成る、（１）記載のＤＮＡ、（１
２）配列表の配列番号１に示されるヌクレオチド配列の
ヌクレオチド番号１から３２０のヌクレオチドから成
る、（１）記載のＤＮＡ、（１３）配列表の配列番号１
に示されるヌクレオチド配列のヌクレオチド番号１から
１５８のヌクレオチドから成る、（１）記載のＤＮＡ、
（１４）配列表の配列番号１に示されるヌクレオチド配
列のヌクレオチド番号１から１０１のヌクレオチドから
成る、（１）記載のＤＮＡ、（１５）配列表の配列番号
１に示されるヌクレオチド配列のヌクレオチド番号１か
ら７４のヌクレオチドから成る、（１）記載のＤＮＡ、
（１６）ストレプトミセス・リビダンスＳＡＮＫ６２７
９５（ＦＥＲＭ ＢＰ−５２９９）から得られる、
（１）記載のＤＮＡ、（１７）（１）乃至（１６）のい
ずれかひとつに記載のＤＮＡを含むことから成る組換え
ＤＮＡベクター、（１８）（１）乃至（１６）のいずれ
かひとつに記載のＤＮＡ、および該ＤＮＡの制御下に所
望のポリペプチドをコードするＤＮＡを含むことから成
り、宿主細胞内で該所望のポリペプチドを産生させるこ
とを特徴とする（１７）記載の組換えＤＮＡベクター、
（１９）（１）乃至（１６）のいずれかひとつに記載の
ＤＮＡ、および該ＤＮＡの制御下にシトクロムＰ−４５
０sca-2 をコードするＤＮＡを含むことから成り、宿主
細胞内でシトクロムＰ−４５０sca-2 を産生させること
を特徴とする（１６）または（１７）記載の組換えＤＮ
Ａベクター、（２０）（１７）乃至（１９）のいずれか
ひとつに記載の組換えＤＮＡベクターにより形質転換さ
れた宿主細胞、（２１）放線菌であることを特徴とす
る、（２０）記載の宿主細胞、（２２）形質転換放線菌
株ストレプトミセス・リビダンス ＳＡＮＫ ６２７９
５（ＦＥＲＭ ＢＰ−５２９９）、（２３）（１７）ま
たは（１９）のいずれかひとつに記載の組換えＤＮＡベ
クターにより形質転換された宿主細胞を、該ベクター中
に含まれるＤＮＡによりコードされた所望のポリペプチ
ドの産生が可能な条件下で培養して該所望のポリペプチ
ドを産生させ、次いで、該所望のポリペプチドを回収す
ることを特徴とする、該所望のポリペプチドの製造方
法、（２４）（１９）記載の組換えＤＮＡベクターによ
り形質転換された放線菌ストレプトミセス・リビダンス
ＴＫ２１株を、該ベクター中に含まれるＤＮＡによりコ
ードされるシトクロムＰ−４５０sca-2 の産生が可能な
条件下で、ＭＬ−２３６Ｂ・ナトリウムを含む培地中で
培養し、該形質転換体が産生するシトクロムＰ−４５０
sca-2 の触媒作用により該形質転換体細胞内においてＭ
Ｌ−２３６Ｂ・ナトリウムをプラバスタチン・ナトリウ
ムに変換させ、次いで、該形質転換体細胞および／また
は培地よりプラバスタチン・ナトリウムを回収すること
を特徴とする、プラバスタチン・ナトリウムの製造方
法、（２５）形質転換された放線菌株がストレプトミセ
ス・リビダンス ＳＡＮＫ６２７９５（ＦＥＲＭ ＢＰ
−５２９９）である、（２４）記載のプラバスタチン・
ナトリウムの製造方法、に関する。
【００１１】本発明者らは、ストレプトミセス・カルボ
フィラスのＰ−４５０遺伝子に連結する５’−非翻訳領
域のサイズ、特に、Ｐ−４５０sca-2 遺伝子に連結する
５’−非翻訳領域のサイズを小さくしても（以下、これ
を「短縮化」という。）、転写のプロモーションに影響
を与えないこと、及び、かかる短縮化が行われた場合に
基質誘導の要求性が除かれることを見いだした。基質誘
導の要求性を除去すると、恒常的な転写プロモーター活
性を有するプロモーターを得ることができる。さらに、
短縮化されたプロモーター領域は、１キロ塩基対（以
下、「1 kbp 」のように表示する。）を有するプロモー
ターの基本値（基質非存在下での値）より高いプロモー
ター活性を有していた。
フィラスのＰ−４５０遺伝子に連結する５’−非翻訳領
域のサイズ、特に、Ｐ−４５０sca-2 遺伝子に連結する
５’−非翻訳領域のサイズを小さくしても（以下、これ
を「短縮化」という。）、転写のプロモーションに影響
を与えないこと、及び、かかる短縮化が行われた場合に
基質誘導の要求性が除かれることを見いだした。基質誘
導の要求性を除去すると、恒常的な転写プロモーター活
性を有するプロモーターを得ることができる。さらに、
短縮化されたプロモーター領域は、１キロ塩基対（以
下、「1 kbp 」のように表示する。）を有するプロモー
ターの基本値（基質非存在下での値）より高いプロモー
ター活性を有していた。
【００１２】さらに短縮化されたプロモーターの転写活
性は恒常的であり、ＭＬ−２３６Ｂや他の好適な基質と
６時間以上共存した後に初めてプロモーター活性の最大
値が発揮されるような基質誘導に従うプロモーターに比
較して、工業的な使用に適している。
性は恒常的であり、ＭＬ−２３６Ｂや他の好適な基質と
６時間以上共存した後に初めてプロモーター活性の最大
値が発揮されるような基質誘導に従うプロモーターに比
較して、工業的な使用に適している。
【００１３】本発明の、転写プロモーター活性を有し、
ストレプトミセス・カルボフィラスのチトクローム・Ｐ
−４５０をコードするオープン・リーディング・フレー
ムの５’側に隣接する約１キロ塩基対長の非翻訳領域の
一部から成り、基質誘導に従わないＤＮＡのうち好適に
は 160 bp であり、さらに好適には 300 bp である。本
発明のＤＮＡを得るための短縮化は、制限エンドヌクレ
アーゼによる特異的切断部位の切断やエキソヌクレアー
ゼによる３’側または５’側からの切断等、当該技術分
野で周知の方法にて行うことができる。
ストレプトミセス・カルボフィラスのチトクローム・Ｐ
−４５０をコードするオープン・リーディング・フレー
ムの５’側に隣接する約１キロ塩基対長の非翻訳領域の
一部から成り、基質誘導に従わないＤＮＡのうち好適に
は 160 bp であり、さらに好適には 300 bp である。本
発明のＤＮＡを得るための短縮化は、制限エンドヌクレ
アーゼによる特異的切断部位の切断やエキソヌクレアー
ゼによる３’側または５’側からの切断等、当該技術分
野で周知の方法にて行うことができる。
【００１４】本発明者らは、該約１キロ塩基対長の非翻
訳領域の５’側の切断が特に好適な結果を生じ、該プロ
モーター配列の３’側に位置する 74 bp の部位でさえ
依然としてプロモーター活性を有することを確認した。
したがって、好適な例として、本発明のＤＮＡは、前述
の 1 kbp の５’−非翻訳領域’の５’末端より３’末
端方向に部分的に切断されたＤＮＡである。このような
ＤＮＡが転写プロモーター活性を有し、基質誘導に従わ
ない限り、特に長さの限定はない。
訳領域の５’側の切断が特に好適な結果を生じ、該プロ
モーター配列の３’側に位置する 74 bp の部位でさえ
依然としてプロモーター活性を有することを確認した。
したがって、好適な例として、本発明のＤＮＡは、前述
の 1 kbp の５’−非翻訳領域’の５’末端より３’末
端方向に部分的に切断されたＤＮＡである。このような
ＤＮＡが転写プロモーター活性を有し、基質誘導に従わ
ない限り、特に長さの限定はない。
【００１５】また、本発明者らが見いだした複数の具体
的なＤＮＡは、前述の 1 kbp の５’−非翻訳領域’の
５’末端より３’末端方向に部分的に切断されたＤＮＡ
であり、したがってチトクローム・Ｐ−４５０をコード
するオープン・リーディング・フレームの５’側に隣接
するものであるが、本発明のＤＮＡは特に領域の限定は
なく、該 1 kb の領域中のうちのいずれの部分的領域
も、このようなＤＮＡが転写プロモーター活性を有し、
基質誘導に従わない限り、本発明に含まれる。本発明者
らは、428 bp と全長 1 kbp の間に基質誘導の依存性
が失われる塩基対を有するプロモーターが存在すること
も見いだした。428 bp との特異的な長さを有する配列
は５’末端よりの切断で得られたが、該 1 kb の領域
中のうちのいずれの 428 bp の配列も、転写プロモータ
ー活性を有し、基質誘導に従わない限り、本発明に含ま
れる。
的なＤＮＡは、前述の 1 kbp の５’−非翻訳領域’の
５’末端より３’末端方向に部分的に切断されたＤＮＡ
であり、したがってチトクローム・Ｐ−４５０をコード
するオープン・リーディング・フレームの５’側に隣接
するものであるが、本発明のＤＮＡは特に領域の限定は
なく、該 1 kb の領域中のうちのいずれの部分的領域
も、このようなＤＮＡが転写プロモーター活性を有し、
基質誘導に従わない限り、本発明に含まれる。本発明者
らは、428 bp と全長 1 kbp の間に基質誘導の依存性
が失われる塩基対を有するプロモーターが存在すること
も見いだした。428 bp との特異的な長さを有する配列
は５’末端よりの切断で得られたが、該 1 kb の領域
中のうちのいずれの 428 bp の配列も、転写プロモータ
ー活性を有し、基質誘導に従わない限り、本発明に含ま
れる。
【００１６】「基質誘導」なる概念は、一般的には生体
内の特定の系が特定の基質の存在下で初めて機能するこ
とをいい、本発明の属する技術分野で周知である。Ｐ−
４５０sca-2 の場合は、この現象は mRNA の転写を誘導
するためにプロモーター部位に作用する、ＭＬ−２３６
Ｂのような基質により達成される。ＭＬ−２３６ＢがＰ
−４５０sca-2 の天然の基質か否かは明らかではない。
したがって、該５’−非翻訳領域のプロモーターを誘導
し得るような、ＭＬ−２３６Ｂと異なる基質も存在し得
る。そのような該５’−非翻訳領域のプロモーターを誘
導し得る基質として、フェノバルビタールが挙げられ
る。
内の特定の系が特定の基質の存在下で初めて機能するこ
とをいい、本発明の属する技術分野で周知である。Ｐ−
４５０sca-2 の場合は、この現象は mRNA の転写を誘導
するためにプロモーター部位に作用する、ＭＬ−２３６
Ｂのような基質により達成される。ＭＬ−２３６ＢがＰ
−４５０sca-2 の天然の基質か否かは明らかではない。
したがって、該５’−非翻訳領域のプロモーターを誘導
し得るような、ＭＬ−２３６Ｂと異なる基質も存在し得
る。そのような該５’−非翻訳領域のプロモーターを誘
導し得る基質として、フェノバルビタールが挙げられ
る。
【００１７】本発明の各ＤＮＡは、公知の放線菌プロモ
ーターを含むいかなる公知のＤＮＡとの間にもヌクレオ
チド配列相同性はなく、新規なヌクレオチド配列を有し
ていた。
ーターを含むいかなる公知のＤＮＡとの間にもヌクレオ
チド配列相同性はなく、新規なヌクレオチド配列を有し
ていた。
【００１８】本発明者らはまた、該転写プロモーターを
含む組換えＤＮＡベクターを作成し、該ベクターを利用
して放線菌ストレプトミセス・リビダンスＴＫ２１株を
形質転換し、Ｐ−４５０sca-2 遺伝子を該菌株で発現さ
せることに成功した。さらに、前記の形質転換されたス
トレプトミセス・リビダンスを利用してＭＬ−２３６Ｂ
・ナトリウムからプラバスタチン・ナトリウムを製造す
ることに成功し、本発明を完成した。
含む組換えＤＮＡベクターを作成し、該ベクターを利用
して放線菌ストレプトミセス・リビダンスＴＫ２１株を
形質転換し、Ｐ−４５０sca-2 遺伝子を該菌株で発現さ
せることに成功した。さらに、前記の形質転換されたス
トレプトミセス・リビダンスを利用してＭＬ−２３６Ｂ
・ナトリウムからプラバスタチン・ナトリウムを製造す
ることに成功し、本発明を完成した。
【００１９】本発明においては、タンパク質もしくはペ
プチドの細胞内生合成過程において該タンパク質もしく
は該ペプチドをコードするＤＮＡからｍＲＮＡへの転写
を開始させる機能を有するＤＮＡを「転写プロモータ
ー」と呼び、このような機能を「転写プロモーター活
性」と呼ぶ。本発明においては、そのような転写プロモ
ーター活性を有するＤＮＡとして、配列表の配列番号１
のヌクレオチド番号１〜４２８のヌクレオチド配列で示
されるＤＮＡを例示している。また、当該配列を含むこ
とから成り、さらに上流および／または下流に他のヌク
レオチド配列が付加したＤＮＡも本発明に含まれる。さ
らに、該ＤＮＡと全く同一の配列を有していなくても、
該ＤＮＡにハイブリダイズする、該ＤＮＡの全体または
一部との間に高いヌクレオチド配列相同性を有するＤＮ
Ａが転写プロモーター活性を有することがある。そのよ
うな、配列表の配列番号１のヌクレオチド番号１〜４２
８のＤＮＡとハイブリダイズし、かつ転写プロモーター
活性を有するＤＮＡも本発明に含まれる。
プチドの細胞内生合成過程において該タンパク質もしく
は該ペプチドをコードするＤＮＡからｍＲＮＡへの転写
を開始させる機能を有するＤＮＡを「転写プロモータ
ー」と呼び、このような機能を「転写プロモーター活
性」と呼ぶ。本発明においては、そのような転写プロモ
ーター活性を有するＤＮＡとして、配列表の配列番号１
のヌクレオチド番号１〜４２８のヌクレオチド配列で示
されるＤＮＡを例示している。また、当該配列を含むこ
とから成り、さらに上流および／または下流に他のヌク
レオチド配列が付加したＤＮＡも本発明に含まれる。さ
らに、該ＤＮＡと全く同一の配列を有していなくても、
該ＤＮＡにハイブリダイズする、該ＤＮＡの全体または
一部との間に高いヌクレオチド配列相同性を有するＤＮ
Ａが転写プロモーター活性を有することがある。そのよ
うな、配列表の配列番号１のヌクレオチド番号１〜４２
８のＤＮＡとハイブリダイズし、かつ転写プロモーター
活性を有するＤＮＡも本発明に含まれる。
【００２０】本発明の転写プロモーター活性を有するＤ
ＮＡは、これを好適なベクターに組込み、さらに、該Ｄ
ＮＡの制御下に所望のポリペプチドをコードするＤＮＡ
を組み込んで組換えＤＮＡベクターを作成し、好適な宿
主細胞に導入することにより、該ポリペプチドの産生に
利用することができる。このような組換えＤＮＡベクタ
ー、該ベクターにより形質転換された宿主細胞、および
該宿主細胞を利用した所望のポリペプチドの製造方法も
本発明に含まれる。所望のポリペプチドは例えば、新規
または公知のタンパク質（またはペプチド）の天然型、
改変型、重合型、２種類以上の異なるタンパク質（また
はペプチド）の融合体、あるいは新規に設計されたポリ
ペプチド等、いかなるアミノ酸配列を有するものでもよ
い。このようなポリペプチドのうち、好適にはシトクロ
ムＰ−４５０sca-2 である。
ＮＡは、これを好適なベクターに組込み、さらに、該Ｄ
ＮＡの制御下に所望のポリペプチドをコードするＤＮＡ
を組み込んで組換えＤＮＡベクターを作成し、好適な宿
主細胞に導入することにより、該ポリペプチドの産生に
利用することができる。このような組換えＤＮＡベクタ
ー、該ベクターにより形質転換された宿主細胞、および
該宿主細胞を利用した所望のポリペプチドの製造方法も
本発明に含まれる。所望のポリペプチドは例えば、新規
または公知のタンパク質（またはペプチド）の天然型、
改変型、重合型、２種類以上の異なるタンパク質（また
はペプチド）の融合体、あるいは新規に設計されたポリ
ペプチド等、いかなるアミノ酸配列を有するものでもよ
い。このようなポリペプチドのうち、好適にはシトクロ
ムＰ−４５０sca-2 である。
【００２１】本発明の組換えＤＮＡベクターの作製の基
礎となるベクターは、宿主細胞内で自己複製可能である
もの、すなわち自己複製するために必要なヌクレオチド
配列を含むものであればよいが、好適には放線菌用のプ
ラスミドベクターｐＩＪ７０２である。宿主細胞は使用
するベクターに適したものであればよく、天然から採取
したもの、または購入もしくは分譲によって入手可能な
ものを利用することができる。好適には放線菌であり、
さらに好適には放線菌ストレプトミセス・カルボフィラ
スまたはストレプトミセス・リビダンスであり、最も好
ましくは放線菌ストレプトミセス・リビダンスＴＫ２１
株である。
礎となるベクターは、宿主細胞内で自己複製可能である
もの、すなわち自己複製するために必要なヌクレオチド
配列を含むものであればよいが、好適には放線菌用のプ
ラスミドベクターｐＩＪ７０２である。宿主細胞は使用
するベクターに適したものであればよく、天然から採取
したもの、または購入もしくは分譲によって入手可能な
ものを利用することができる。好適には放線菌であり、
さらに好適には放線菌ストレプトミセス・カルボフィラ
スまたはストレプトミセス・リビダンスであり、最も好
ましくは放線菌ストレプトミセス・リビダンスＴＫ２１
株である。
【００２２】本発明のＤＮＡの制御下にシトクロムＰ−
４５０sca-2 をコードするＤＮＡを連結した組換え発現
ベクターで放線菌ストレプトミセス・リビダンスを形質
転換し、該形質転換菌をＭＬ−２３６Ｂ・ナトリウムを
含む培地中で培養すると、該形質転換菌により産生され
るシトクロムＰ−４５０sca-2 の触媒作用により、ＭＬ
−２３６Ｂ・ナトリウムをプラバスタチン・ナトリウム
に変換させることができる。このようにして生産された
プラバスタチン・ナトリウムは、公知の方法により回収
することができる。本発明にはこのようなプラバスタチ
ン・ナトリウムの製造方法も含まれる。
４５０sca-2 をコードするＤＮＡを連結した組換え発現
ベクターで放線菌ストレプトミセス・リビダンスを形質
転換し、該形質転換菌をＭＬ−２３６Ｂ・ナトリウムを
含む培地中で培養すると、該形質転換菌により産生され
るシトクロムＰ−４５０sca-2 の触媒作用により、ＭＬ
−２３６Ｂ・ナトリウムをプラバスタチン・ナトリウム
に変換させることができる。このようにして生産された
プラバスタチン・ナトリウムは、公知の方法により回収
することができる。本発明にはこのようなプラバスタチ
ン・ナトリウムの製造方法も含まれる。
【００２３】
【発明の実施の形態】本発明のＤＮＡは、放線菌ストレ
プトミセス・カルボフィラスから、渡辺らの方法［Wata
nabe, I., et al (1995) Gene, 163, 81-85 参照］によ
り該ＤＮＡをクローニングすることにより得られる。Ｄ
ＮＡの供給源となる微生物は、本発明においては、放線
菌ストレプトミセス・カルボフィラスが好適であり、さ
らに、ＳＡＮＫ ６２５８５株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１１
４５）が好適である。すなわち、ストレプトミセス・カ
ルボフィラスから調製した全ＤＮＡを用いて、ｐＵＣ１
８（宝酒造（株）社製）等をベクターとするゲノム・ラ
イブラリーを作製し、このライブラリーについてＰ−４
５０sca-2 ポリペプチドのＮ末端アミノ酸配列から予測
されるオリゴヌクレオチドを合成してプローブに用い、
コロニー・ハイブリダイゼーション法［Maniatis,T. et
al.(1982) "Molecular Cloning-A Laboratory Manua
l", Cold Spring Harbor Laboratory, New York 参照］
等によりスクリーニングすることにより本発明のＤＮＡ
の全部または一部を含むＤＮＡを保持するクローンを取
得することができる。そのようにして取得したＤＮＡが
本発明のＤＮＡの一部のみしか含んでいない場合であっ
ても、取得したＤＮＡを鋳型として標識プローブを作製
し、ゲノム・ライブラリーのスクリーニングを繰り返す
ことにより、最終的に本発明のＤＮＡの全てを含むＤＮ
Ａを保持するクローンを取得することが可能である。し
かしながら、本発明のＤＮＡをクローニングする方法は
上記に限定されるわけではなく、例えば、クローニング
ベクターはｐＢＲ３２２等他の市販のものを用いてもよ
い。
プトミセス・カルボフィラスから、渡辺らの方法［Wata
nabe, I., et al (1995) Gene, 163, 81-85 参照］によ
り該ＤＮＡをクローニングすることにより得られる。Ｄ
ＮＡの供給源となる微生物は、本発明においては、放線
菌ストレプトミセス・カルボフィラスが好適であり、さ
らに、ＳＡＮＫ ６２５８５株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１１
４５）が好適である。すなわち、ストレプトミセス・カ
ルボフィラスから調製した全ＤＮＡを用いて、ｐＵＣ１
８（宝酒造（株）社製）等をベクターとするゲノム・ラ
イブラリーを作製し、このライブラリーについてＰ−４
５０sca-2 ポリペプチドのＮ末端アミノ酸配列から予測
されるオリゴヌクレオチドを合成してプローブに用い、
コロニー・ハイブリダイゼーション法［Maniatis,T. et
al.(1982) "Molecular Cloning-A Laboratory Manua
l", Cold Spring Harbor Laboratory, New York 参照］
等によりスクリーニングすることにより本発明のＤＮＡ
の全部または一部を含むＤＮＡを保持するクローンを取
得することができる。そのようにして取得したＤＮＡが
本発明のＤＮＡの一部のみしか含んでいない場合であっ
ても、取得したＤＮＡを鋳型として標識プローブを作製
し、ゲノム・ライブラリーのスクリーニングを繰り返す
ことにより、最終的に本発明のＤＮＡの全てを含むＤＮ
Ａを保持するクローンを取得することが可能である。し
かしながら、本発明のＤＮＡをクローニングする方法は
上記に限定されるわけではなく、例えば、クローニング
ベクターはｐＢＲ３２２等他の市販のものを用いてもよ
い。
【００２４】得られたクローンより本発明のＤＮＡを採
取する方法は、当業者に周知の方法［Maniatis,T. et a
l.(1982) "Molecular Cloning-A Laboratory Manual",
ColdSpring Harbor Laboratory, New York 参照］に従
い実施できる。例えば細胞よりプラスミドＤＮＡに相当
する画分を分離し、該プラスミドＤＮＡより本発明のＤ
ＮＡを制限酵素等を用いて切り出すことにより行ない得
る。なお、本発明の形質転換放線菌株ストレプトミセス
・リビダンス ＳＡＮＫ ６２７９５は工業技術院生命
工学工業技術研究所に平成７年１１月２１日付で国際寄
託され、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−５２９９が付され
た。該菌株は、配列表の配列番号１のヌクレオチド番号
１〜４２８のヌクレオチド配列からなる転写プロモータ
ー活性を有するＤＮＡ、およびシトクロムＰ−４５０
sca-2 をコードするＤＮＡを含み、かつ該プロモーター
活性により該タンパク質を放線菌細胞で産生させること
ができる組換えＤＮＡベクターであるｐＳＣＡ３１０−
Δ４２８を保持する放線菌である。従って、該菌株を培
養後、菌体よりｐＳＣＡ３１０−Δ４２８を単離し、こ
れを制限酵素で消化してから配列表の配列番号１のヌク
レオチド番号１〜４２８のヌクレオチド配列からなるＤ
ＮＡを単離することができる。
取する方法は、当業者に周知の方法［Maniatis,T. et a
l.(1982) "Molecular Cloning-A Laboratory Manual",
ColdSpring Harbor Laboratory, New York 参照］に従
い実施できる。例えば細胞よりプラスミドＤＮＡに相当
する画分を分離し、該プラスミドＤＮＡより本発明のＤ
ＮＡを制限酵素等を用いて切り出すことにより行ない得
る。なお、本発明の形質転換放線菌株ストレプトミセス
・リビダンス ＳＡＮＫ ６２７９５は工業技術院生命
工学工業技術研究所に平成７年１１月２１日付で国際寄
託され、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−５２９９が付され
た。該菌株は、配列表の配列番号１のヌクレオチド番号
１〜４２８のヌクレオチド配列からなる転写プロモータ
ー活性を有するＤＮＡ、およびシトクロムＰ−４５０
sca-2 をコードするＤＮＡを含み、かつ該プロモーター
活性により該タンパク質を放線菌細胞で産生させること
ができる組換えＤＮＡベクターであるｐＳＣＡ３１０−
Δ４２８を保持する放線菌である。従って、該菌株を培
養後、菌体よりｐＳＣＡ３１０−Δ４２８を単離し、こ
れを制限酵素で消化してから配列表の配列番号１のヌク
レオチド番号１〜４２８のヌクレオチド配列からなるＤ
ＮＡを単離することができる。
【００２５】このようにして得られるＤＮＡのヌクレオ
チド配列決定は、例えばマキサム−ギルバートの化学修
飾法［Maxam, A. M. and Gilbert, W. (1980) Methods
in Enzymology 65,499-559参照］やＭ１３ファージを用
いるジデオキシヌクレオチド鎖終結法［Messing, J. an
d Vieira, J., (1982) Gene, 19, 269-276参照］等によ
り行なうことができる。
チド配列決定は、例えばマキサム−ギルバートの化学修
飾法［Maxam, A. M. and Gilbert, W. (1980) Methods
in Enzymology 65,499-559参照］やＭ１３ファージを用
いるジデオキシヌクレオチド鎖終結法［Messing, J. an
d Vieira, J., (1982) Gene, 19, 269-276参照］等によ
り行なうことができる。
【００２６】また、本発明のＤＮＡは例えば配列表の配
列番号１のヌクレオチド番号１〜４２８のヌクレオチド
配列を含むＤＮＡをホスファイト・トリエステル法［Hu
nkapillar, M., et al. (1984) Nature, 310, 105-111
参照］等、当業者に周知の方法に従い化学合成すること
により得ることも可能である。
列番号１のヌクレオチド番号１〜４２８のヌクレオチド
配列を含むＤＮＡをホスファイト・トリエステル法［Hu
nkapillar, M., et al. (1984) Nature, 310, 105-111
参照］等、当業者に周知の方法に従い化学合成すること
により得ることも可能である。
【００２７】あるＤＮＡが配列表の配列番号１のヌクレ
オチド番号１〜４２８のヌクレオチド配列を含むことか
らなるＤＮＡとハイブリダイズするか否かは、以下のよ
うにして調べることができる。すなわち、まず被検検体
のＤＮＡを必要に応じてアガロースゲル電気泳動した
後、ニトロセルロースまたはナイロン等の膜にブロット
し、吸着したＤＮＡを熱処理や紫外線照射等により膜に
固定する。配列表の配列番号１のヌクレオチド番号１〜
４２８のヌクレオチド配列を含むことからなるＤＮＡ
を、ランダムプライマー法［Feinberg, A. P., et al.
(1983) Anal. Biochem., 132, 6-13参照］、ニックトラ
ンスレーション法［Maniatis, T., et al. (1982) "Mol
ecular Cloning: A Laboratory Manual" Cold Spring H
arbor Laboratory, New York参照］等に従って、 32 Ｐ
等の放射性同位元素、ビオチン、ジゴキシゲニンまたは
酵素等で標識したプローブを作製する。該プローブを含
むハイブリダイゼーション溶液中に膜を浸して、所定の
温度でインキュベーションした後、膜を洗浄し、それぞ
れの標識に即した方法によりプローブを検出する。ハイ
ブリダイゼーション溶液中に含まれるＳＳＣ（ｓａｌｉ
ｎｅ−ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ：「クエン酸ナト
リウム−生理食塩水液」；１×ＳＳＣは０．１５Ｍの塩
化ナトリウム、１５ｍＭのクエン酸ナトリウムを含む）
の濃度は好適には４乃至８×ＳＳＣ、さらに好適には６
×ＳＳＣである。また、インキュベーション温度は好適
には３０乃至７０℃、さらに好適には６０℃である。
オチド番号１〜４２８のヌクレオチド配列を含むことか
らなるＤＮＡとハイブリダイズするか否かは、以下のよ
うにして調べることができる。すなわち、まず被検検体
のＤＮＡを必要に応じてアガロースゲル電気泳動した
後、ニトロセルロースまたはナイロン等の膜にブロット
し、吸着したＤＮＡを熱処理や紫外線照射等により膜に
固定する。配列表の配列番号１のヌクレオチド番号１〜
４２８のヌクレオチド配列を含むことからなるＤＮＡ
を、ランダムプライマー法［Feinberg, A. P., et al.
(1983) Anal. Biochem., 132, 6-13参照］、ニックトラ
ンスレーション法［Maniatis, T., et al. (1982) "Mol
ecular Cloning: A Laboratory Manual" Cold Spring H
arbor Laboratory, New York参照］等に従って、 32 Ｐ
等の放射性同位元素、ビオチン、ジゴキシゲニンまたは
酵素等で標識したプローブを作製する。該プローブを含
むハイブリダイゼーション溶液中に膜を浸して、所定の
温度でインキュベーションした後、膜を洗浄し、それぞ
れの標識に即した方法によりプローブを検出する。ハイ
ブリダイゼーション溶液中に含まれるＳＳＣ（ｓａｌｉ
ｎｅ−ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ：「クエン酸ナト
リウム−生理食塩水液」；１×ＳＳＣは０．１５Ｍの塩
化ナトリウム、１５ｍＭのクエン酸ナトリウムを含む）
の濃度は好適には４乃至８×ＳＳＣ、さらに好適には６
×ＳＳＣである。また、インキュベーション温度は好適
には３０乃至７０℃、さらに好適には６０℃である。
【００２８】上記の方法を利用することにより、配列表
の配列番号１のヌクレオチド番号１〜４２８のヌクレオ
チド配列を含むＤＮＡとハイブリダイズするＤＮＡを、
種々のゲノムライブラリーからクローニングすることが
できる。さらに、そのようにして得たＤＮＡは、当業者
に周知の方法により人工的に改変することができる。具
体的には例えば、サイトスペシフィック・ミュータジェ
ネシス［Mark, D. F.,et al. (1984) Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA, 81, 5662-5666参照］等の方法を用いて、
ＤＮＡの所望の位置の１個または２個以上のヌクレオチ
ドが置換、欠失または挿入された改変体を作製すること
が可能である。そのような人工改変体も、転写プロモー
ター活性を有する限り、本発明に含まれる。
の配列番号１のヌクレオチド番号１〜４２８のヌクレオ
チド配列を含むＤＮＡとハイブリダイズするＤＮＡを、
種々のゲノムライブラリーからクローニングすることが
できる。さらに、そのようにして得たＤＮＡは、当業者
に周知の方法により人工的に改変することができる。具
体的には例えば、サイトスペシフィック・ミュータジェ
ネシス［Mark, D. F.,et al. (1984) Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA, 81, 5662-5666参照］等の方法を用いて、
ＤＮＡの所望の位置の１個または２個以上のヌクレオチ
ドが置換、欠失または挿入された改変体を作製すること
が可能である。そのような人工改変体も、転写プロモー
ター活性を有する限り、本発明に含まれる。
【００２９】上記のごとくして得られた本発明のＤＮＡ
が転写プロモーター活性を有するものであることを確認
するためには、（ｉ）該ＤＮＡの制御下に好適なタンパ
ク質をコードするＤＮＡを連結したものを好適なベクタ
ー（例えば、放線菌用のプラスミドｐＩＪ７０２［Kat
z, E., et al. (1983) J Gen. Microbiol., 129, 2703-
2714 参照］等）に挿入した組換えＤＮＡベクターを作
製し、（ｉｉ）該ベクターが細胞内で保持され、かつ自
己複製され得るような好適な宿主細胞（例えば、ｐＩＪ
７０２を利用したベクターに対しては放線菌ストレプト
ミセス・リビダンス等）を該ベクターで形質転換した
後、以下に挙げるような方法により該タンパク質をコー
ドする遺伝子の発現を調べることができる。形質転換
は、例えば放線菌の場合はホップウッドらの文献［Hopw
ood, D. A., et al. (1985) "Genetic Manipulation of
Streptomyces: A Laboratory Manual", The John Inne
s Foundation, Norwich 参照］に従って実施することが
できる。なお、転写プロモーター活性の確認を容易にす
るためには、発現させようとする遺伝子は形質転換前の
宿主細胞中に存在しないかまたは発現していないものが
好ましい。
が転写プロモーター活性を有するものであることを確認
するためには、（ｉ）該ＤＮＡの制御下に好適なタンパ
ク質をコードするＤＮＡを連結したものを好適なベクタ
ー（例えば、放線菌用のプラスミドｐＩＪ７０２［Kat
z, E., et al. (1983) J Gen. Microbiol., 129, 2703-
2714 参照］等）に挿入した組換えＤＮＡベクターを作
製し、（ｉｉ）該ベクターが細胞内で保持され、かつ自
己複製され得るような好適な宿主細胞（例えば、ｐＩＪ
７０２を利用したベクターに対しては放線菌ストレプト
ミセス・リビダンス等）を該ベクターで形質転換した
後、以下に挙げるような方法により該タンパク質をコー
ドする遺伝子の発現を調べることができる。形質転換
は、例えば放線菌の場合はホップウッドらの文献［Hopw
ood, D. A., et al. (1985) "Genetic Manipulation of
Streptomyces: A Laboratory Manual", The John Inne
s Foundation, Norwich 参照］に従って実施することが
できる。なお、転写プロモーター活性の確認を容易にす
るためには、発現させようとする遺伝子は形質転換前の
宿主細胞中に存在しないかまたは発現していないものが
好ましい。
【００３０】ａ）ノーザンハイブリダイゼーション法
［Maniatis, T., et al. (1982) "Molecular Cloning:
A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laborator
y, NewYork 参照］：形質転換後の宿主細胞を培養し、
該細胞から抽出・精製したＲＮＡをアガロースゲル電気
泳動した後、ニトロセルロースまたはナイロン等の膜に
ブロットする。32Ｐ等の放射性同位元素またはビオチ
ン、ジゴキシゲニン、酵素等で標識した該タンパク質遺
伝子を特異的に検出するプローブ（ＤＮＡ、ＲＮＡまた
は合成オリゴヌクレオチド）を用いて、ハイブリダイゼ
ーション法により、該タンパク質遺伝子から転写された
ｍＲＮＡを検出する。
［Maniatis, T., et al. (1982) "Molecular Cloning:
A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laborator
y, NewYork 参照］：形質転換後の宿主細胞を培養し、
該細胞から抽出・精製したＲＮＡをアガロースゲル電気
泳動した後、ニトロセルロースまたはナイロン等の膜に
ブロットする。32Ｐ等の放射性同位元素またはビオチ
ン、ジゴキシゲニン、酵素等で標識した該タンパク質遺
伝子を特異的に検出するプローブ（ＤＮＡ、ＲＮＡまた
は合成オリゴヌクレオチド）を用いて、ハイブリダイゼ
ーション法により、該タンパク質遺伝子から転写された
ｍＲＮＡを検出する。
【００３１】ｂ）ＲＮＡ−ＰＣＲ法［Innis, M. A., et
al. (1990) "PCR PROTOCOLS", Academic Press, New Y
ork 参照］：ノーザンハイブリダイゼーション法と同様
にＲＮＡを調製する。つぎに、該ＲＮＡを鋳型とし、オ
リゴ（ｄＴ）、または発現させようとしたタンパク質遺
伝子の一部に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチド
をプライマーとして用いて、逆転写酵素によりｃＤＮＡ
を合成する。さらに、このｃＤＮＡを鋳型として、該タ
ンパク質遺伝子配列に特異的な２種類のオリゴヌクレオ
チドプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣ
Ｒ）を行って、両プライマー間の配列を有するＤＮＡを
増幅する。反応後のサンプルを電気泳動して、期待され
る長さのバンドの有無により所望の遺伝子が転写されて
いるか否かを判定する。
al. (1990) "PCR PROTOCOLS", Academic Press, New Y
ork 参照］：ノーザンハイブリダイゼーション法と同様
にＲＮＡを調製する。つぎに、該ＲＮＡを鋳型とし、オ
リゴ（ｄＴ）、または発現させようとしたタンパク質遺
伝子の一部に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチド
をプライマーとして用いて、逆転写酵素によりｃＤＮＡ
を合成する。さらに、このｃＤＮＡを鋳型として、該タ
ンパク質遺伝子配列に特異的な２種類のオリゴヌクレオ
チドプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣ
Ｒ）を行って、両プライマー間の配列を有するＤＮＡを
増幅する。反応後のサンプルを電気泳動して、期待され
る長さのバンドの有無により所望の遺伝子が転写されて
いるか否かを判定する。
【００３２】ｃ）生産されたタンパク質の生理活性を調
べる方法：本発明のＤＮＡの３’末端に、酵素等固有の
活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを連結した
組換えＤＮＡベクターを作製し、該ベクターで形質転換
した細胞における該タンパク質の活性を測定する。例え
ば、シトクロムＰ−４５０sca-2 をコードするＤＮＡを
連結したベクターを、Ｐ−４５０sca-2 を産生しない放
線菌株であるストレプトミセス・リビダンスに導入し、
この形質転換体をＭＬ−２３６Ｂ・ナトリウムの存在下
で培養してプラバスタチン・ナトリウムの生成量を測定
する。あるいは、薬剤耐性遺伝子を利用する方法、クロ
ラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子
［Gorman, C. M. et al. (1982) Mol. Cell. Biol., 2,
1044-1051参照］やルシフェラーゼ遺伝子［de Wet, J.
R. et al. (1987) Mol. Cell. Biol., 7, 725-737参
照］等をリポーターとして利用する方法等が実施できる
が、これらに限定されない。
べる方法：本発明のＤＮＡの３’末端に、酵素等固有の
活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを連結した
組換えＤＮＡベクターを作製し、該ベクターで形質転換
した細胞における該タンパク質の活性を測定する。例え
ば、シトクロムＰ−４５０sca-2 をコードするＤＮＡを
連結したベクターを、Ｐ−４５０sca-2 を産生しない放
線菌株であるストレプトミセス・リビダンスに導入し、
この形質転換体をＭＬ−２３６Ｂ・ナトリウムの存在下
で培養してプラバスタチン・ナトリウムの生成量を測定
する。あるいは、薬剤耐性遺伝子を利用する方法、クロ
ラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子
［Gorman, C. M. et al. (1982) Mol. Cell. Biol., 2,
1044-1051参照］やルシフェラーゼ遺伝子［de Wet, J.
R. et al. (1987) Mol. Cell. Biol., 7, 725-737参
照］等をリポーターとして利用する方法等が実施できる
が、これらに限定されない。
【００３３】ｄ）特異的な抗体を用いてタンパク質を同
定する方法 本発明のＤＮＡの３’末端に、特異的な抗体が入手可能
なタンパク質をコードするＤＮＡを連結した組換えＤＮ
Ａベクターを作成し、該ベクターで形質転換した細胞の
培養液または細胞破砕液と該抗体を反応させ、抗原抗体
複合体の量を測定する。該測定方法としては、例えば、
ラジオイムノアッセイ法［Berson, R. S., et al. (197
3) "Methods in Investigative and Diagnostic Endocr
inology", Vol.2A, 2B, North-Holland Publishing C
o., Amsterdam 参照］、エンザイムイムノアッセイ法
［Engvall, E., (1980) Methods in Enzymology, 70
(A), 419-439 参照］、ウエスタンブロット法［Harlo
w，E., et al. (1988) "Antibodies− A Laboratory Ma
nual", p.471, Cold Spring Harbor Laboratory, New Y
ork参照］、免疫沈降法［Kessler, S. W., (1981) "Met
hods in Enzymology", 73(B), 442-459参照］等が挙げ
られるが、これらに限定されない。
定する方法 本発明のＤＮＡの３’末端に、特異的な抗体が入手可能
なタンパク質をコードするＤＮＡを連結した組換えＤＮ
Ａベクターを作成し、該ベクターで形質転換した細胞の
培養液または細胞破砕液と該抗体を反応させ、抗原抗体
複合体の量を測定する。該測定方法としては、例えば、
ラジオイムノアッセイ法［Berson, R. S., et al. (197
3) "Methods in Investigative and Diagnostic Endocr
inology", Vol.2A, 2B, North-Holland Publishing C
o., Amsterdam 参照］、エンザイムイムノアッセイ法
［Engvall, E., (1980) Methods in Enzymology, 70
(A), 419-439 参照］、ウエスタンブロット法［Harlo
w，E., et al. (1988) "Antibodies− A Laboratory Ma
nual", p.471, Cold Spring Harbor Laboratory, New Y
ork参照］、免疫沈降法［Kessler, S. W., (1981) "Met
hods in Enzymology", 73(B), 442-459参照］等が挙げ
られるが、これらに限定されない。
【００３４】ただし、本発明のＤＮＡの転写プロモータ
ー活性を調べる方法はこれらに限定されず、例えば、発
現させようとするタンパク質が、活性や抗原性以外の固
有の性質を有する場合は、該性質を利用した方法を用い
ることができる。
ー活性を調べる方法はこれらに限定されず、例えば、発
現させようとするタンパク質が、活性や抗原性以外の固
有の性質を有する場合は、該性質を利用した方法を用い
ることができる。
【００３５】このようにして単離された本発明のＤＮＡ
を、好適なベクターに再び組込み、さらに、該ＤＮＡの
制御下に所望のポリペプチドをコードするＤＮＡを組み
込むことにより、他の宿主細胞を形質転換させ、該宿主
細胞において該ポリペプチドを産生させることが可能で
ある。このポリペプチドは例えば、新規または公知のタ
ンパク質（またはペプチド）の天然型、改変型、重合
型、２種類以上の異なるタンパク質（またはペプチド）
の融合体、あるいは新規に設計されたポリペプチド等、
いかなるアミノ酸配列を有するものでもよい。該ポリペ
プチドのうち、好適にはシトクロムＰ−４５０sca-2 で
あり、該タンパク質を発現させるベクターとしてはｐＳ
ＣＡ３１０−Δ４２８を例示できる。該ベクターは前述
の寄託菌株ストレプトミセス・リビダンス ＳＡＮＫ
６２７９５（ＦＥＲＭ ＢＰ−５２９９）より単離する
ことができる。
を、好適なベクターに再び組込み、さらに、該ＤＮＡの
制御下に所望のポリペプチドをコードするＤＮＡを組み
込むことにより、他の宿主細胞を形質転換させ、該宿主
細胞において該ポリペプチドを産生させることが可能で
ある。このポリペプチドは例えば、新規または公知のタ
ンパク質（またはペプチド）の天然型、改変型、重合
型、２種類以上の異なるタンパク質（またはペプチド）
の融合体、あるいは新規に設計されたポリペプチド等、
いかなるアミノ酸配列を有するものでもよい。該ポリペ
プチドのうち、好適にはシトクロムＰ−４５０sca-2 で
あり、該タンパク質を発現させるベクターとしてはｐＳ
ＣＡ３１０−Δ４２８を例示できる。該ベクターは前述
の寄託菌株ストレプトミセス・リビダンス ＳＡＮＫ
６２７９５（ＦＥＲＭ ＢＰ−５２９９）より単離する
ことができる。
【００３６】宿主としては、例えば放線菌ストレプトミ
セス・リビダンス（Streptomyces lividans ）やストレ
プトミセス・カルボフィラス（Streptomyces carbophil
us）、大腸菌(Escherichia coli)や枯草菌(Bacillus su
btilis) 等が挙げられる。
セス・リビダンス（Streptomyces lividans ）やストレ
プトミセス・カルボフィラス（Streptomyces carbophil
us）、大腸菌(Escherichia coli)や枯草菌(Bacillus su
btilis) 等が挙げられる。
【００３７】目的の遺伝子をこれらの宿主細胞内で形質
発現させるには、宿主と適合し得る種由来のレプリコ
ン、すなわち複製起点および調節配列を含んでいるプラ
スミドベクターで宿主細胞を形質転換すればよい。また
ベクターは形質転換細胞に表現形質（表現型）の選択性
を付与することができる配列を持つものが望ましい。
発現させるには、宿主と適合し得る種由来のレプリコ
ン、すなわち複製起点および調節配列を含んでいるプラ
スミドベクターで宿主細胞を形質転換すればよい。また
ベクターは形質転換細胞に表現形質（表現型）の選択性
を付与することができる配列を持つものが望ましい。
【００３８】例えば、宿主細胞として放線菌を利用する
場合の形質転換法としては、リゾチームを利用して放線
菌をスフェロプラスト化した後、組換えＤＮＡベクター
とポリエチレングリコールを含む緩衝液とを加えて該ベ
クターを細胞内に取り込ませる方法［Thompson, C. J.,
et al. (1982) J. Bacteriol., 151, 668-677またはHo
pwood, D. A., et al. (1985) "Genetic Manipulation
of Streptomyces: A Laboratory Manual", The John In
nes Foundation, Norwich 参照］がよく用いられる。ま
た、形質転換株の選択マーカーとしてはチオストレプト
ン耐性遺伝子［Hopwood, D. A., et al. (1987) "Metho
ds in Enzymology" 153, 116, AcademicPress, New Yor
k参照］がよく用いられるが、これに限定されない。
場合の形質転換法としては、リゾチームを利用して放線
菌をスフェロプラスト化した後、組換えＤＮＡベクター
とポリエチレングリコールを含む緩衝液とを加えて該ベ
クターを細胞内に取り込ませる方法［Thompson, C. J.,
et al. (1982) J. Bacteriol., 151, 668-677またはHo
pwood, D. A., et al. (1985) "Genetic Manipulation
of Streptomyces: A Laboratory Manual", The John In
nes Foundation, Norwich 参照］がよく用いられる。ま
た、形質転換株の選択マーカーとしてはチオストレプト
ン耐性遺伝子［Hopwood, D. A., et al. (1987) "Metho
ds in Enzymology" 153, 116, AcademicPress, New Yor
k参照］がよく用いられるが、これに限定されない。
【００３９】宿主細胞として大腸菌を利用する場合の形
質転換法としては、大腸菌に塩化カルシウムや塩化マグ
ネシウムまたは塩化ルビジウムを共存させて調製したコ
ンピテント細胞に、組換えＤＮＡベクターを加える方法
［Hanahan, D., (1983) J. Mol. Biol. 166, 557-580参
照］、大腸菌と組換えＤＮＡベクターの浮遊液に高電圧
パルスを加えることにより該ベクターを細胞内に取り込
ませる方法［エレクトロポレーション法：Dower, W.
J., et al. (1988) Nucleic Acids Res., 16, 6127およ
び Calvin, N. M., et al. (1988) J. Bacteriol., 17
0, 2796参照］がよく用いられる。また、形質転換株の
選択マーカーとしてはアンピシリンやテトラサイクリン
等の薬剤耐性マーカー遺伝子がよく用いられ、これらの
マーカーを当業者に周知の方法により利用することがで
きる［Maniatis, T., et al. (1982)"Molecular Clonin
g: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Labora
tory,New York 参照］が、これらに限定されない。
質転換法としては、大腸菌に塩化カルシウムや塩化マグ
ネシウムまたは塩化ルビジウムを共存させて調製したコ
ンピテント細胞に、組換えＤＮＡベクターを加える方法
［Hanahan, D., (1983) J. Mol. Biol. 166, 557-580参
照］、大腸菌と組換えＤＮＡベクターの浮遊液に高電圧
パルスを加えることにより該ベクターを細胞内に取り込
ませる方法［エレクトロポレーション法：Dower, W.
J., et al. (1988) Nucleic Acids Res., 16, 6127およ
び Calvin, N. M., et al. (1988) J. Bacteriol., 17
0, 2796参照］がよく用いられる。また、形質転換株の
選択マーカーとしてはアンピシリンやテトラサイクリン
等の薬剤耐性マーカー遺伝子がよく用いられ、これらの
マーカーを当業者に周知の方法により利用することがで
きる［Maniatis, T., et al. (1982)"Molecular Clonin
g: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Labora
tory,New York 参照］が、これらに限定されない。
【００４０】宿主細胞として枯草菌を利用する場合の形
質転換法としては、リゾチームを利用して枯草菌をプロ
トプラスト化した後、組換えＤＮＡベクターとポリエチ
レングリコールを含む緩衝液とを加えて該ベクターを細
胞内に取り込ませる方法［Cheng, S., et al. (1979) M
ol. Gen. Genet., 168, 111 参照］、前述のエレクトロ
ポレーション法等がよく用いられる。また、形質転換株
の選択マーカーとしてはクロラムフェニコール等の薬剤
耐性マーカー遺伝子等がよく用いられるが、これらに限
定されない。
質転換法としては、リゾチームを利用して枯草菌をプロ
トプラスト化した後、組換えＤＮＡベクターとポリエチ
レングリコールを含む緩衝液とを加えて該ベクターを細
胞内に取り込ませる方法［Cheng, S., et al. (1979) M
ol. Gen. Genet., 168, 111 参照］、前述のエレクトロ
ポレーション法等がよく用いられる。また、形質転換株
の選択マーカーとしてはクロラムフェニコール等の薬剤
耐性マーカー遺伝子等がよく用いられるが、これらに限
定されない。
【００４１】上記で得られる所望の形質転換体は、当業
者に周知の方法で培養することができ、該培養により細
胞内または細胞外に所望のポリペプチドが産生される。
該培養に用いられる培地としては、採用した宿主細胞に
応じて慣用される各種のものを適宜選択できる。また、
所望のポリペプチド産生が可能であるような宿主細胞の
培養条件としては、通常該宿主細胞を好適に培養する条
件を採用できるが、該ポリペプチドの性質等により適宜
変更することもできる。
者に周知の方法で培養することができ、該培養により細
胞内または細胞外に所望のポリペプチドが産生される。
該培養に用いられる培地としては、採用した宿主細胞に
応じて慣用される各種のものを適宜選択できる。また、
所望のポリペプチド産生が可能であるような宿主細胞の
培養条件としては、通常該宿主細胞を好適に培養する条
件を採用できるが、該ポリペプチドの性質等により適宜
変更することもできる。
【００４２】例えば、放線菌の場合は、放線菌が通常利
用する栄養物を含有する培地で培養することができる。
該栄養物としては、一般微生物培養に利用される、当業
者に周知のものが使用できる。例えば、炭素源としてグ
ルコース、シュークロース、澱粉、グリセリン、水飴、
糖蜜、大豆油等を使用し得る。また窒素源としては大豆
粉、小麦胚芽、肉エキス、ペプトン、コーンスチーブリ
カー、乾燥酵母、硫酸アンモニウム等を使用し得る。そ
の他必要に応じて食塩、塩化カリ、炭酸カルシウム、リ
ン酸塩等の無機塩の他、菌の発育を助け、所望のポリペ
プチドの産生促進に必要な添加物を適宜組み合わせ使用
することができる。培養方法としては、微生物一般に用
いられる培養法、例えば液体培養法が可能であり、工業
的には深部培養法が適している。培養は好気的条件で行
われ、培養温度は２０〜３７℃、好適には２６〜２８℃
である。
用する栄養物を含有する培地で培養することができる。
該栄養物としては、一般微生物培養に利用される、当業
者に周知のものが使用できる。例えば、炭素源としてグ
ルコース、シュークロース、澱粉、グリセリン、水飴、
糖蜜、大豆油等を使用し得る。また窒素源としては大豆
粉、小麦胚芽、肉エキス、ペプトン、コーンスチーブリ
カー、乾燥酵母、硫酸アンモニウム等を使用し得る。そ
の他必要に応じて食塩、塩化カリ、炭酸カルシウム、リ
ン酸塩等の無機塩の他、菌の発育を助け、所望のポリペ
プチドの産生促進に必要な添加物を適宜組み合わせ使用
することができる。培養方法としては、微生物一般に用
いられる培養法、例えば液体培養法が可能であり、工業
的には深部培養法が適している。培養は好気的条件で行
われ、培養温度は２０〜３７℃、好適には２６〜２８℃
である。
【００４３】上記のような条件で培養することにより形
質転換体の細胞内または細胞外に産生されるポリペプチ
ドは、該ポリペプチドの物理的性質や化学的性質等を利
用した各種の当業者に周知の分離操作法により、分離・
精製し、回収することができる。該ポリペプチドが細胞
外に放出される場合は、培養液を遠心して得られる上清
から該ポリペプチドを分離・精製し、回収することがで
きる。細胞内に蓄積された該ポリペプチドを分離・精製
するためには、まずプロテアーゼ阻害剤を含む溶液中に
懸濁しておいた細胞を、超音波破砕機等、当業者に周知
の手段を用いて破砕しておく。その後の分離・精製およ
び回収方法としては、具体的には例えば通常の蛋白沈殿
剤による処理、限外濾過、分子ふるいクロマトグラフィ
ー（ゲル濾過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換
体クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィ
ー、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)等の各種液体ク
ロマトグラフィー、透析法、これらの組合せ等が挙げら
れる。
質転換体の細胞内または細胞外に産生されるポリペプチ
ドは、該ポリペプチドの物理的性質や化学的性質等を利
用した各種の当業者に周知の分離操作法により、分離・
精製し、回収することができる。該ポリペプチドが細胞
外に放出される場合は、培養液を遠心して得られる上清
から該ポリペプチドを分離・精製し、回収することがで
きる。細胞内に蓄積された該ポリペプチドを分離・精製
するためには、まずプロテアーゼ阻害剤を含む溶液中に
懸濁しておいた細胞を、超音波破砕機等、当業者に周知
の手段を用いて破砕しておく。その後の分離・精製およ
び回収方法としては、具体的には例えば通常の蛋白沈殿
剤による処理、限外濾過、分子ふるいクロマトグラフィ
ー（ゲル濾過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換
体クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィ
ー、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)等の各種液体ク
ロマトグラフィー、透析法、これらの組合せ等が挙げら
れる。
【００４４】上記方法により、容易に高収率、高純度で
所望のポリペプチドを工業的規模で製造できる。
所望のポリペプチドを工業的規模で製造できる。
【００４５】また、本発明の組換えＤＮＡベクターで形
質転換された宿主細胞により産生されるポリペプチドの
活性を、未精製または部分精製の標品で利用することも
可能である。例えば、本発明の転写プロモーターＤＮＡ
およびＰ−４５０sca-2 をコードするＤＮＡを組み込ん
だ組換えＤＮＡベクターを放線菌ストレプトミセス・リ
ビダンスへ導入し、産生されたＰ−４５０sca-2 ポリペ
プチドに該放線菌細胞内で電子伝達系を構成させること
により、ＭＬ−２３６Ｂ・ナトリウムの６位水酸化反応
を触媒する形質転換体微生物を取得することができる。
該形質転換体は、プラバスタチン・ナトリウム等の製造
プロセスに利用することができ、該プロセスにより製造
されるプラバスタチン・ナトリウムは芹澤らの方法［Se
rizawa,N., et al. (1983) J. Antibiotics, 36, 608
参照］により回収することができる。そのような形質転
換体として、前述した寄託菌株ストレプトミセス・リビ
ダンス ＳＡＮＫ ６２７９５（ＦＥＲＭ ＢＰ−５２
９９）を例示できる。
質転換された宿主細胞により産生されるポリペプチドの
活性を、未精製または部分精製の標品で利用することも
可能である。例えば、本発明の転写プロモーターＤＮＡ
およびＰ−４５０sca-2 をコードするＤＮＡを組み込ん
だ組換えＤＮＡベクターを放線菌ストレプトミセス・リ
ビダンスへ導入し、産生されたＰ−４５０sca-2 ポリペ
プチドに該放線菌細胞内で電子伝達系を構成させること
により、ＭＬ−２３６Ｂ・ナトリウムの６位水酸化反応
を触媒する形質転換体微生物を取得することができる。
該形質転換体は、プラバスタチン・ナトリウム等の製造
プロセスに利用することができ、該プロセスにより製造
されるプラバスタチン・ナトリウムは芹澤らの方法［Se
rizawa,N., et al. (1983) J. Antibiotics, 36, 608
参照］により回収することができる。そのような形質転
換体として、前述した寄託菌株ストレプトミセス・リビ
ダンス ＳＡＮＫ ６２７９５（ＦＥＲＭ ＢＰ−５２
９９）を例示できる。
【００４６】
【実施例】以下に実施例を挙げ、本発明を詳細に説明す
るが、本発明はこれに限定されない。
るが、本発明はこれに限定されない。
【００４７】実施例１． 転写プロモーター活性を有す
るＤＮＡの分離、およびシトクロムＰ−４５０sca-2 発
現用プラスミドベクターの構築（１−１）プラスミドｐＳＣＡ１０１およびｐＳＣＡ１
０８の構築 プラスミドｐＳＣＡ１０１およびｐＳＣＡ１０８は、渡
辺らの方法によりストレプトミセス・カルボフィラスの
染色体ＤＮＡからシトクロムｐ４５０sca-2 遺伝子をク
ローニングし、市販のプラスミドベクターにこれらの遺
伝子を組み込むことにより得た［Watanabe, I., et al
(1995) Gene, 163, 81-85 および特開平６−７０７８０
参照］。すなわち、プラスミドｐＳＣＡ１０１は、シト
クロムｐ４５０sca-2 遺伝子のＮ末端領域および５’側
非翻訳領域を含む１．７ｋｂｐのＰｖｕＩＩ消化ＤＮＡ
断片をプラスミドベクターｐＢＲ３２２（宝酒造（株）
社製）のＰｖｕＩＩ切断部位に組み込んだものであり、
また、ｐＳＣＡ１０８はシトクロムｐ４５０sca-2 のコ
ード領域の全長を含む２．０ｋｂｐのＳａｃＩ消化ＤＮ
Ａ断片をプラスミドベクターｐＵＣ１８（宝酒造（株）
社製）のＳａｃＩ切断部位に組み込んだものである。
るＤＮＡの分離、およびシトクロムＰ−４５０sca-2 発
現用プラスミドベクターの構築（１−１）プラスミドｐＳＣＡ１０１およびｐＳＣＡ１
０８の構築 プラスミドｐＳＣＡ１０１およびｐＳＣＡ１０８は、渡
辺らの方法によりストレプトミセス・カルボフィラスの
染色体ＤＮＡからシトクロムｐ４５０sca-2 遺伝子をク
ローニングし、市販のプラスミドベクターにこれらの遺
伝子を組み込むことにより得た［Watanabe, I., et al
(1995) Gene, 163, 81-85 および特開平６−７０７８０
参照］。すなわち、プラスミドｐＳＣＡ１０１は、シト
クロムｐ４５０sca-2 遺伝子のＮ末端領域および５’側
非翻訳領域を含む１．７ｋｂｐのＰｖｕＩＩ消化ＤＮＡ
断片をプラスミドベクターｐＢＲ３２２（宝酒造（株）
社製）のＰｖｕＩＩ切断部位に組み込んだものであり、
また、ｐＳＣＡ１０８はシトクロムｐ４５０sca-2 のコ
ード領域の全長を含む２．０ｋｂｐのＳａｃＩ消化ＤＮ
Ａ断片をプラスミドベクターｐＵＣ１８（宝酒造（株）
社製）のＳａｃＩ切断部位に組み込んだものである。
【００４８】（１−２）プラスミドｐＳＣＡ１０６の構
築 まず、１０μｇのｐＳＣＡ１０１を１００単位の制限酵
素ＰｖｕＩＩで３７℃下、３時間消化し、１％のアガロ
ースゲルで電気泳動した。
築 まず、１０μｇのｐＳＣＡ１０１を１００単位の制限酵
素ＰｖｕＩＩで３７℃下、３時間消化し、１％のアガロ
ースゲルで電気泳動した。
【００４９】電気泳動後のゲルを０．５μｇ／ｍｌの臭
化エチジウム溶液中で２０分間振盪して染色した後、ゲ
ルをトランスイルミネーター上に置いて観察しながら
１．７ｋｂｐに相当するバンド部分を剃刀刃を用いて分
離した。これを透析膜（排出限界分子量１２０００〜１
４０００、ギブコ社製）中に移し密閉したものを９０ｍ
Ｍのほう酸、２．５ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（以
下「ＥＤＴＡ」という）を含む９０ｍＭのトリス−塩酸
緩衝液（ｐＨ８．３）を入れたサブマリン型電気泳動漕
中に入れ、１００Ｖ、２時間通電することにより、ＤＮ
Ａ断片をアガロースゲルから溶出させた。透析膜中の溶
液を当業者に周知の方法によりフェノール・クロロホル
ム処理し、水層をエタノール処理してＤＮＡを沈殿させ
た後、沈殿したＤＮＡを減圧乾燥した［Maniatis, T. e
t al. (1986) Molecular Cloning-A Laboratory Manua
l, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harb
or,New York参照］（以下、本段落の一連の操作を「切
り出し」という）。
化エチジウム溶液中で２０分間振盪して染色した後、ゲ
ルをトランスイルミネーター上に置いて観察しながら
１．７ｋｂｐに相当するバンド部分を剃刀刃を用いて分
離した。これを透析膜（排出限界分子量１２０００〜１
４０００、ギブコ社製）中に移し密閉したものを９０ｍ
Ｍのほう酸、２．５ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（以
下「ＥＤＴＡ」という）を含む９０ｍＭのトリス−塩酸
緩衝液（ｐＨ８．３）を入れたサブマリン型電気泳動漕
中に入れ、１００Ｖ、２時間通電することにより、ＤＮ
Ａ断片をアガロースゲルから溶出させた。透析膜中の溶
液を当業者に周知の方法によりフェノール・クロロホル
ム処理し、水層をエタノール処理してＤＮＡを沈殿させ
た後、沈殿したＤＮＡを減圧乾燥した［Maniatis, T. e
t al. (1986) Molecular Cloning-A Laboratory Manua
l, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harb
or,New York参照］（以下、本段落の一連の操作を「切
り出し」という）。
【００５０】次に、プラスミドベクターｐＵＣ１１９
（宝酒造（株）社製）１０μｇを１００単位の制限酵素
ＳｍａＩで２５℃下、３時間消化してから、フェノール
・クロロホルム処理し、水層をエタノール処理してＤＮ
Ａを沈殿させた後、沈殿したＤＮＡを減圧乾燥した。こ
のＳｍａＩ消化したｐＵＣ１１９に、４単位のアルカリ
フォスファターゼ（東洋紡（株）社製）を添加し、１ｍ
Ｍ ＥＤＴＡを含む１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ８．０：以下「ＴＥ緩衝液」という）２００μｌ中
で、３７℃下、３０分間反応させることにより、該Ｓｍ
ａＩ消化ｐＵＣ１１９の末端を脱リン酸化した。反応後
の溶液をフェノール・クロロホルム処理し、水層をエタ
ノール処理してＤＮＡを沈殿させた後、沈殿したＤＮＡ
を減圧乾燥した。このＳｍａＩ消化し末端を脱リン酸化
した１００ｎｇのｐＵＣ１１９に、Ｐ４５０sca-2 遺伝
子のＮ末端領域および５’側非翻訳領域を含む１．７ｋ
ｂｐのＰｖｕＩＩ消化ＤＮＡ断片５０ｎｇを加え、さら
にＴ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造（株）社製）を１８００
単位添加し、反応緩衝液（６．６ｍＭの塩化マグネシウ
ム、１０ｍＭのジチオスレイトール、０．１ｍＭのＡＴ
Ｐ、６６ｍＭのトリス−塩酸（ｐＨ７．６）：以下「Ｔ
４ＤＮＡリガーゼ反応緩衝液」という。）５０μｌ中で
１６℃下、２時間反応させた。反応液の一部で大腸菌Ｈ
Ｂ１０１株をハナハンの方法［Hanahan, D. (1980) J.
Mol. Biol., 166, 557-580参照］に従って形質転換し、
アンピシリンを１００μｇ／ｍｌ含む培地（１０ｇ／リ
ットルのトリプトン、５ｇ／リットルのイーストエキス
トラクト及び５ｇ／リットルの塩化ナトリウムを含む：
以下「Ｌ培地」という。）に接種した。該形質転換菌を
３７℃下で培養してアンピシリン耐性コロニーを選択
し、Ｌ培地で培養して菌体を集めプラスミドＤＮＡを調
製した。このＤＮＡの一部を制限酵素消化し、アガロー
スゲル電気泳動を行って、期待された通りのプラスミド
が構築されていることを確認した。このプラスミドをｐ
ＳＣＡ１０６と命名した。
（宝酒造（株）社製）１０μｇを１００単位の制限酵素
ＳｍａＩで２５℃下、３時間消化してから、フェノール
・クロロホルム処理し、水層をエタノール処理してＤＮ
Ａを沈殿させた後、沈殿したＤＮＡを減圧乾燥した。こ
のＳｍａＩ消化したｐＵＣ１１９に、４単位のアルカリ
フォスファターゼ（東洋紡（株）社製）を添加し、１ｍ
Ｍ ＥＤＴＡを含む１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ８．０：以下「ＴＥ緩衝液」という）２００μｌ中
で、３７℃下、３０分間反応させることにより、該Ｓｍ
ａＩ消化ｐＵＣ１１９の末端を脱リン酸化した。反応後
の溶液をフェノール・クロロホルム処理し、水層をエタ
ノール処理してＤＮＡを沈殿させた後、沈殿したＤＮＡ
を減圧乾燥した。このＳｍａＩ消化し末端を脱リン酸化
した１００ｎｇのｐＵＣ１１９に、Ｐ４５０sca-2 遺伝
子のＮ末端領域および５’側非翻訳領域を含む１．７ｋ
ｂｐのＰｖｕＩＩ消化ＤＮＡ断片５０ｎｇを加え、さら
にＴ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造（株）社製）を１８００
単位添加し、反応緩衝液（６．６ｍＭの塩化マグネシウ
ム、１０ｍＭのジチオスレイトール、０．１ｍＭのＡＴ
Ｐ、６６ｍＭのトリス−塩酸（ｐＨ７．６）：以下「Ｔ
４ＤＮＡリガーゼ反応緩衝液」という。）５０μｌ中で
１６℃下、２時間反応させた。反応液の一部で大腸菌Ｈ
Ｂ１０１株をハナハンの方法［Hanahan, D. (1980) J.
Mol. Biol., 166, 557-580参照］に従って形質転換し、
アンピシリンを１００μｇ／ｍｌ含む培地（１０ｇ／リ
ットルのトリプトン、５ｇ／リットルのイーストエキス
トラクト及び５ｇ／リットルの塩化ナトリウムを含む：
以下「Ｌ培地」という。）に接種した。該形質転換菌を
３７℃下で培養してアンピシリン耐性コロニーを選択
し、Ｌ培地で培養して菌体を集めプラスミドＤＮＡを調
製した。このＤＮＡの一部を制限酵素消化し、アガロー
スゲル電気泳動を行って、期待された通りのプラスミド
が構築されていることを確認した。このプラスミドをｐ
ＳＣＡ１０６と命名した。
【００５１】（１−３）プラスミドｐＳＣＡ１１１の構
築 プラスミドｐＳＣＡ１０６が有するｐ４５０sca-2 のプ
ロモーター領域とｐＳＣＡ１０８が有するｐ４５０
sca-2 の構造遺伝子全長を連結したプラスミドｐＳＣＡ
１１１の構築は次の方法に従った。すなわち、まず１０
μｇのｐＳＣＡ１０８を１００単位の制限酵素ＳａｃＩ
で３７℃下、５時間消化し、１％アガロースゲルで電気
泳動した後、２．０ｋｂｐのＳａｃＩ消化ＤＮＡ断片を
切り出した。一方、１０μｇのｐＳＣＡ１０６を１００
単位の制限酵素ＳａｃＩで３７℃下、３時間消化し、１
％アガロースゲルで電気泳動した後、４ｋｂｐのＳａｃ
Ｉ消化ＤＮＡ断片を切り出した。この４ｋｂｐのＳａｃ
Ｉ消化ＤＮＡ断片の末端を、前記ＳｍａＩ消化ｐＵＣ１
１９と同様の方法で脱リン酸化した。脱リン酸化反応後
の溶液をフェノール・クロロホルム処理し、水層をエタ
ノール処理してＤＮＡを沈殿させた後、沈殿したＤＮＡ
を減圧乾燥した。このＳａｃＩ消化および脱リン酸化し
たｐＳＣＡ１０６の４ｋｂｐのＤＮＡ断片１００ｎｇ
と、ｐ４５０sca-2の構造遺伝子全長を含む２．０ｋｂ
ｐのＳａｃＩ消化ＤＮＡ断片５０ｎｇを混合し、さらに
Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１８００単位を添加し、Ｔ４ＤＮＡ
リガーゼ反応緩衝液５０μｌ中で、１６℃下、２時間反
応させた。以下、（１−２）で記載した方法と同様にし
て大腸菌を形質転換し、プラスミドｐＳＣＡ１１１を得
た。
築 プラスミドｐＳＣＡ１０６が有するｐ４５０sca-2 のプ
ロモーター領域とｐＳＣＡ１０８が有するｐ４５０
sca-2 の構造遺伝子全長を連結したプラスミドｐＳＣＡ
１１１の構築は次の方法に従った。すなわち、まず１０
μｇのｐＳＣＡ１０８を１００単位の制限酵素ＳａｃＩ
で３７℃下、５時間消化し、１％アガロースゲルで電気
泳動した後、２．０ｋｂｐのＳａｃＩ消化ＤＮＡ断片を
切り出した。一方、１０μｇのｐＳＣＡ１０６を１００
単位の制限酵素ＳａｃＩで３７℃下、３時間消化し、１
％アガロースゲルで電気泳動した後、４ｋｂｐのＳａｃ
Ｉ消化ＤＮＡ断片を切り出した。この４ｋｂｐのＳａｃ
Ｉ消化ＤＮＡ断片の末端を、前記ＳｍａＩ消化ｐＵＣ１
１９と同様の方法で脱リン酸化した。脱リン酸化反応後
の溶液をフェノール・クロロホルム処理し、水層をエタ
ノール処理してＤＮＡを沈殿させた後、沈殿したＤＮＡ
を減圧乾燥した。このＳａｃＩ消化および脱リン酸化し
たｐＳＣＡ１０６の４ｋｂｐのＤＮＡ断片１００ｎｇ
と、ｐ４５０sca-2の構造遺伝子全長を含む２．０ｋｂ
ｐのＳａｃＩ消化ＤＮＡ断片５０ｎｇを混合し、さらに
Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１８００単位を添加し、Ｔ４ＤＮＡ
リガーゼ反応緩衝液５０μｌ中で、１６℃下、２時間反
応させた。以下、（１−２）で記載した方法と同様にし
て大腸菌を形質転換し、プラスミドｐＳＣＡ１１１を得
た。
【００５２】（１−４）プラスミドｐＳＣＡ２１２の構
築 １０μｇのｐＳＣＡ１１１を１００単位の制限酵素Ｘｂ
ａＩおよび１００単位の制限酵素ＰｓｔＩで３７℃、３
時間消化した後、フェノール・クロロホルム処理し、水
層をエタノール処理してＤＮＡを沈殿させ、沈殿したＤ
ＮＡを減圧乾燥した。
築 １０μｇのｐＳＣＡ１１１を１００単位の制限酵素Ｘｂ
ａＩおよび１００単位の制限酵素ＰｓｔＩで３７℃、３
時間消化した後、フェノール・クロロホルム処理し、水
層をエタノール処理してＤＮＡを沈殿させ、沈殿したＤ
ＮＡを減圧乾燥した。
【００５３】このＸｂａＩおよびＰｓｔＩで消化したｐ
ＳＣＡ１１１中に含まれるＰ−４５０sca-2 遺伝子の
５’非翻訳領域の５’末側を、ヘニコフの方法［Heniko
ff, S.(1984) Gene, 28, 351-359 参照］により欠失さ
せた。すなわち、ＸｂａＩおよびＰｓｔＩで消化した１
０μｇのｐＳＣＡ１１１に対して、２００単位のエキソ
ヌクレアーゼＩＩＩ（宝酒造（株）社製）を添加し、５
ｍＭの塩化マグネシウム、１０ｍＭの２−メルカプトエ
タノールを含む５０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ
８．０）１００μｌ中で、３７℃下、１〜５分間反応さ
せた。反応停止は６５℃で５分間加温することにより行
った。反応停止後、該反応液をフェノール・クロロホル
ム処理し、水層をエタノール処理してＤＮＡを沈殿さ
せ、沈殿したＤＮＡを減圧乾燥した。次に、このＤＮＡ
に５０単位のムングビーンヌクレアーゼ（宝酒造（株）
社製）を添加し、１００ｍＭの塩化ナトリウム、１ｍＭ
の酢酸亜鉛および５％（ｖ／ｖ）のグリセロールを含む
３０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）４０μｌ中で、３
７℃下、３０分反応させた。該反応液をフェノール・ク
ロロホルム処理し、水層をエタノール処理してＤＮＡを
沈殿させ、沈殿したＤＮＡを減圧乾燥した。このＤＮＡ
に５単位のＴ４ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造（株）社
製）を添加し、６６ｍＭの酢酸カリウム、１０ｍＭの酢
酸マグネシウム、０．５ｍＭのジチオスレイトールおよ
び０．１ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン（宝酒造
（株）社製）を含む３３ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．９）１０μｌ中で、３７℃下、５分間反応させ、
末端を平滑化した。この反応液をフェノール・クロロホ
ルム処理し、水層をエタノール処理してＤＮＡを沈殿さ
せ、沈殿したＤＮＡを減圧乾燥した。このＤＮＡに１０
単位のアルカリフォスファターゼを添加し、１ｍＭの塩
化マグネシウムを含む５０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液
（ｐＨ９．０）４００μｌ中で３７℃下、３０分間反応
させた。反応後、フェノール・クロロホルム処理し、水
層をエタノール処理してＤＮＡを沈殿させ、沈殿したＤ
ＮＡを減圧乾燥した。このＤＮＡに、リン酸化ＸｂａＩ
リンカー（宝酒造（株）社製）を１００ｎｇ、Ｔ４ＤＮ
Ａリガーゼを１８００単位添加し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ
反応緩衝液５０μｌ中で１６℃下、２時間反応させた。
以下、（１−２）で記載した方法と同様にして大腸菌を
形質転換し、両末端が連結して環状化したプラスミドｐ
ＳＣＡ２１２を得た。
ＳＣＡ１１１中に含まれるＰ−４５０sca-2 遺伝子の
５’非翻訳領域の５’末側を、ヘニコフの方法［Heniko
ff, S.(1984) Gene, 28, 351-359 参照］により欠失さ
せた。すなわち、ＸｂａＩおよびＰｓｔＩで消化した１
０μｇのｐＳＣＡ１１１に対して、２００単位のエキソ
ヌクレアーゼＩＩＩ（宝酒造（株）社製）を添加し、５
ｍＭの塩化マグネシウム、１０ｍＭの２−メルカプトエ
タノールを含む５０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ
８．０）１００μｌ中で、３７℃下、１〜５分間反応さ
せた。反応停止は６５℃で５分間加温することにより行
った。反応停止後、該反応液をフェノール・クロロホル
ム処理し、水層をエタノール処理してＤＮＡを沈殿さ
せ、沈殿したＤＮＡを減圧乾燥した。次に、このＤＮＡ
に５０単位のムングビーンヌクレアーゼ（宝酒造（株）
社製）を添加し、１００ｍＭの塩化ナトリウム、１ｍＭ
の酢酸亜鉛および５％（ｖ／ｖ）のグリセロールを含む
３０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）４０μｌ中で、３
７℃下、３０分反応させた。該反応液をフェノール・ク
ロロホルム処理し、水層をエタノール処理してＤＮＡを
沈殿させ、沈殿したＤＮＡを減圧乾燥した。このＤＮＡ
に５単位のＴ４ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造（株）社
製）を添加し、６６ｍＭの酢酸カリウム、１０ｍＭの酢
酸マグネシウム、０．５ｍＭのジチオスレイトールおよ
び０．１ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン（宝酒造
（株）社製）を含む３３ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．９）１０μｌ中で、３７℃下、５分間反応させ、
末端を平滑化した。この反応液をフェノール・クロロホ
ルム処理し、水層をエタノール処理してＤＮＡを沈殿さ
せ、沈殿したＤＮＡを減圧乾燥した。このＤＮＡに１０
単位のアルカリフォスファターゼを添加し、１ｍＭの塩
化マグネシウムを含む５０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液
（ｐＨ９．０）４００μｌ中で３７℃下、３０分間反応
させた。反応後、フェノール・クロロホルム処理し、水
層をエタノール処理してＤＮＡを沈殿させ、沈殿したＤ
ＮＡを減圧乾燥した。このＤＮＡに、リン酸化ＸｂａＩ
リンカー（宝酒造（株）社製）を１００ｎｇ、Ｔ４ＤＮ
Ａリガーゼを１８００単位添加し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ
反応緩衝液５０μｌ中で１６℃下、２時間反応させた。
以下、（１−２）で記載した方法と同様にして大腸菌を
形質転換し、両末端が連結して環状化したプラスミドｐ
ＳＣＡ２１２を得た。
【００５４】（１−５）プラスミドｐＳＣＡ３０１の構
築 放線菌用の多コピープラスミドｐＩＪ７０２［Katz,
E., et al. (1983) J. Gen. Microbiol. 129, 2703-271
4 参照］１０μｇを１００単位の制限酵素ＳａｃＩ、お
よび１００単位の制限酵素ＳｐｈＩで３７℃、３時間消
化した後、１％アガロースゲルで電気泳動し、５．４ｋ
ｂｐのバンドに相当するＤＮＡ断片を切り出した。
築 放線菌用の多コピープラスミドｐＩＪ７０２［Katz,
E., et al. (1983) J. Gen. Microbiol. 129, 2703-271
4 参照］１０μｇを１００単位の制限酵素ＳａｃＩ、お
よび１００単位の制限酵素ＳｐｈＩで３７℃、３時間消
化した後、１％アガロースゲルで電気泳動し、５．４ｋ
ｂｐのバンドに相当するＤＮＡ断片を切り出した。
【００５５】配列中にＨｉｎｄＩＩＩ切断部位およびＥ
ｃｏＲＩ切断部位を有し、かつＳａｃＩおよびＳｐｈＩ
切断末端を有する２本鎖オリゴヌクレオチドを作製する
ために、下記の配列で表されるオリゴヌクレオチドをＤ
ＮＡ合成機（モデル３８０、アプライドバイオシステム
ズ社製）を用いてホスホアミダイト法［Beaucage, S.
L., et al (1981) Tetrahedron Letters 22, 1859-1862
参照］により合成した。
ｃｏＲＩ切断部位を有し、かつＳａｃＩおよびＳｐｈＩ
切断末端を有する２本鎖オリゴヌクレオチドを作製する
ために、下記の配列で表されるオリゴヌクレオチドをＤ
ＮＡ合成機（モデル３８０、アプライドバイオシステム
ズ社製）を用いてホスホアミダイト法［Beaucage, S.
L., et al (1981) Tetrahedron Letters 22, 1859-1862
参照］により合成した。
【００５６】5'-GATCTAAGCTTGAATTCGCATG-3' （配列表
の配列番号２） 5'-CGAATTCAAGCTTA-3' （配列表の配列番号３） これら２種類のオリゴヌクレオチド各１４μｍｏｌずつ
を４００μｌのＴＥ緩衝液中で混合し、１００℃で５分
間加熱後、緩やかに２５℃まで冷却することにより、こ
れら２種類のオリゴヌクレオチドの相補的な配列の間で
２本鎖を形成させた。
の配列番号２） 5'-CGAATTCAAGCTTA-3' （配列表の配列番号３） これら２種類のオリゴヌクレオチド各１４μｍｏｌずつ
を４００μｌのＴＥ緩衝液中で混合し、１００℃で５分
間加熱後、緩やかに２５℃まで冷却することにより、こ
れら２種類のオリゴヌクレオチドの相補的な配列の間で
２本鎖を形成させた。
【００５７】ＳａｃＩおよびＳｐｈＩで消化したｐＩＪ
７０２の５．４ｋｂｐの断片１μｇに、上記２本鎖オリ
ゴヌクレオチド１００ｎｇを加え、さらにＴ４ＤＮＡリ
ガーゼを１８００単位添加し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ反応
緩衝液１００μｌ中で１６℃下、２時間反応させた。次
いで、以下の［１］に記載した方法により、スフェロプ
ラスト化させた放線菌ストレプトミセス・リビダンスＴ
Ｋ２１株をこの反応液中に含まれるＤＮＡで形質転換
し、さらにチオストレプトン存在下で培養して耐性菌を
選択した。さらに、以下の［２］に記載した方法によ
り、該耐性菌からプラスミドを単離した。
７０２の５．４ｋｂｐの断片１μｇに、上記２本鎖オリ
ゴヌクレオチド１００ｎｇを加え、さらにＴ４ＤＮＡリ
ガーゼを１８００単位添加し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ反応
緩衝液１００μｌ中で１６℃下、２時間反応させた。次
いで、以下の［１］に記載した方法により、スフェロプ
ラスト化させた放線菌ストレプトミセス・リビダンスＴ
Ｋ２１株をこの反応液中に含まれるＤＮＡで形質転換
し、さらにチオストレプトン存在下で培養して耐性菌を
選択した。さらに、以下の［２］に記載した方法によ
り、該耐性菌からプラスミドを単離した。
【００５８】［１］ストレプトミセス・リビダンスＴＫ
２１株の形質転換法 ストレプトミセス・リビダンスＴＫ２１株の形質転換は
トンプソンらの方法［Thompson, C. J., et al. (1982)
J. Bacteriol., 151, 668-677参照］に準じて行った。
すなわち、ストレプトミセス・リビダンスＴＫ２１株
［Hopwood, D. A., et al. (1983) J. Gen. Microbio
l., 129, 2257-2269参照］を２０ｍｌのＧＰＹ培地a)に
植菌し、２８℃、１２０ｒｐｍで３日間培養した。テフ
ロンホモジナイザーを用いて前培養液中の菌体をほぐ
し、そのうちの５ｍｌを１１０ｍｌのＳ−ＧＧＣy 培地
b)に植菌して、坂口フラスコで２８℃、１２０ｒｐｍで
２４時間本培養した。本培養後、培養液を３０００ｒｐ
ｍ、４℃で１０分間遠心して菌体を回収した。この菌体
をＰ緩衝液c)で洗浄し、再度３０００ｒｐｍ、４℃で１
０分間遠心して沈殿を得た。Ｐ緩衝液による洗浄はさら
に２回行い、湿菌体を得た。湿菌体１ｇに対してＰ緩衝
液を１０ｍｌ加え、これを湿菌体懸濁液とした。湿菌体
懸濁液に同量の２０ｍｇ／ｍｌのリゾチームを含むＰ緩
衝液を加え、３０℃、１２０ｒｐｍで１．５時間穏やか
に振盪して、ストレプトミセス・リビダンスＴＫ２１株
をスフェロプラスト化した。この懸濁液を８枚重ねのガ
ーゼを用いて２回濾過した後、３０００ｒｐｍ、４℃で
１０分間遠心分離し沈殿を得た。再びＰ緩衝液でスフェ
ロプラストを２回洗浄し、３０００ｒｐｍ、４℃で、１
０分間遠心分離し沈殿を得た。これにＰ緩衝液０．８ｍ
ｌを加えて懸濁し氷上で静置した。このストレプトミセ
ス・リビダンスＴＫ２１株のスフェロプラスト懸濁液１
００μｌにＴ４ＤＮＡリガーゼ反応液を２０μｌ加え、
氷上で２分間静置した。次いで、２０％（ｗ／ｖ）のポ
リエチレングリコール１５４０を含むＰ緩衝液を５００
μｌ加え、氷上で２分間静置後、Ｐ緩衝液を５ｍｌ加え
た。このうち１００μｌを２％（ｗ／ｖ）バクトアガー
を含む再生培地d)１０ｍｌ上に穏やかに塗抹し、２８℃
で約２０時間静置培養した。この培地プレートに４５℃
の０．７％（ｗ／ｖ）バクトアガーを含む再生培地にチ
オストレプトンを７５μｌ／ｍｌになるように溶解した
ものを５ｍｌ重層して２８℃で培養した。３〜５日後に
チオストレプトン耐性株を分離した。
２１株の形質転換法 ストレプトミセス・リビダンスＴＫ２１株の形質転換は
トンプソンらの方法［Thompson, C. J., et al. (1982)
J. Bacteriol., 151, 668-677参照］に準じて行った。
すなわち、ストレプトミセス・リビダンスＴＫ２１株
［Hopwood, D. A., et al. (1983) J. Gen. Microbio
l., 129, 2257-2269参照］を２０ｍｌのＧＰＹ培地a)に
植菌し、２８℃、１２０ｒｐｍで３日間培養した。テフ
ロンホモジナイザーを用いて前培養液中の菌体をほぐ
し、そのうちの５ｍｌを１１０ｍｌのＳ−ＧＧＣy 培地
b)に植菌して、坂口フラスコで２８℃、１２０ｒｐｍで
２４時間本培養した。本培養後、培養液を３０００ｒｐ
ｍ、４℃で１０分間遠心して菌体を回収した。この菌体
をＰ緩衝液c)で洗浄し、再度３０００ｒｐｍ、４℃で１
０分間遠心して沈殿を得た。Ｐ緩衝液による洗浄はさら
に２回行い、湿菌体を得た。湿菌体１ｇに対してＰ緩衝
液を１０ｍｌ加え、これを湿菌体懸濁液とした。湿菌体
懸濁液に同量の２０ｍｇ／ｍｌのリゾチームを含むＰ緩
衝液を加え、３０℃、１２０ｒｐｍで１．５時間穏やか
に振盪して、ストレプトミセス・リビダンスＴＫ２１株
をスフェロプラスト化した。この懸濁液を８枚重ねのガ
ーゼを用いて２回濾過した後、３０００ｒｐｍ、４℃で
１０分間遠心分離し沈殿を得た。再びＰ緩衝液でスフェ
ロプラストを２回洗浄し、３０００ｒｐｍ、４℃で、１
０分間遠心分離し沈殿を得た。これにＰ緩衝液０．８ｍ
ｌを加えて懸濁し氷上で静置した。このストレプトミセ
ス・リビダンスＴＫ２１株のスフェロプラスト懸濁液１
００μｌにＴ４ＤＮＡリガーゼ反応液を２０μｌ加え、
氷上で２分間静置した。次いで、２０％（ｗ／ｖ）のポ
リエチレングリコール１５４０を含むＰ緩衝液を５００
μｌ加え、氷上で２分間静置後、Ｐ緩衝液を５ｍｌ加え
た。このうち１００μｌを２％（ｗ／ｖ）バクトアガー
を含む再生培地d)１０ｍｌ上に穏やかに塗抹し、２８℃
で約２０時間静置培養した。この培地プレートに４５℃
の０．７％（ｗ／ｖ）バクトアガーを含む再生培地にチ
オストレプトンを７５μｌ／ｍｌになるように溶解した
ものを５ｍｌ重層して２８℃で培養した。３〜５日後に
チオストレプトン耐性株を分離した。
【００５９】上記形質転換操作で使用した培地および緩
衝液の組成は、それぞれ以下の通りであった。なお、溶
媒としては全て蒸留水を使用した。
衝液の組成は、それぞれ以下の通りであった。なお、溶
媒としては全て蒸留水を使用した。
【００６０】
ａ）ＧＰＹ培地
グルコース ２０ｇ／リットル（ｗ／ｖ）
ポリペプトン １０ｇ／リットル（ｗ／ｖ）
イーストエキストラクト １ｇ／リットル（ｗ／ｖ）
（ｐＨ７．０−７．２）
ｂ）Ｓ−ＧＧＣy 培地
Ａ液
サッカロース ３４０ｇ／リットル（ｗ／ｖ）
グリセロール ４ｇ／リットル（ｗ／ｖ）
グリシン １ｇ／リットル（ｗ／ｖ）
カザミノ酸 ４ｇ／リットル（ｗ／ｖ）
イーストエキストラクト １ｇ／リットル（ｗ／ｖ）
硫酸マグネシウム７水和物 １ｇ／リットル（ｗ／ｖ）
塩化カルシウム２水和物 ０．１ｇ／リットル（ｗ／ｖ）
微量金属塩溶液e) ４ｍｌ／リットル（ｖ／ｖ）
Ｂ液
リン酸２水素カリウム ２０ｇ／リットル（ｗ／ｖ）
リン酸水素２カリウム１２水和物 ８０ｇ／リットル（ｗ／ｖ）
Ａ液とＢ液は別滅菌し、Ａ液１００ｍｌとＢ液１０ｍｌを混合した。
【００６１】
ｃ）Ｐ緩衝液
サッカロース １０２ｇ／リットル（ｗ／ｖ）
硫酸カリウム ０．２４８ｇ／リットル（ｗ／ｖ）
塩化マグネシウム６水和物 ２．００ｇ／リットル（ｗ／ｖ）
微量金属塩溶液e) １．９８ｍｌ／リットル（ｖ／ｖ）
リン酸２水素カリウム ４９．５ｇ／リットル（ｗ／ｖ）
塩化カルシウム１水和物 ３．６４ｇ／リットル（ｗ／ｖ）
ＴＥＳ（ｐＨ７．２） ５．６７ｇ／リットル（ｗ／ｖ）
ｄ）再生培地
サッカロース １００ｇ／リットル（ｗ／ｖ）
グルコース ９．６９ｇ／リットル（ｗ／ｖ）
カザミノ酸 ９６．９ｍｇ／リットル（ｗ／ｖ）
イーストエキストラクト １．９４ｇ／リットル（ｗ／ｖ）
マルトエキストラクト ４．８４ｇ／リットル（ｗ／ｖ）
硫酸カリウム ２４３ｍｇ／リットル（ｗ／ｖ）
塩化マグネシウム６水和物 ９．８４ｇ／リットル（ｗ／ｖ）
リン酸２水素カリウム ４８．４ｍｇ／リットル（ｗ／ｖ）
塩化カルシウム２水和物 ２．８５ｇ／リットル（ｗ／ｖ）
ＴＥＳ（ｐＨ７．２） ５．５６ｇ／リットル（ｗ／ｖ）
微量金属塩溶液e) １．９４ｍｌ／リットル（ｖ／ｖ）
水酸化ナトリウム ０．００４８４Ｎ
Ｌ−プロリン ２．９１ｇ／リットル（ｗ／ｖ）
ＤＬ−ノルロイシン ４８．４ｍｇ／リットル（ｗ／ｖ）
Ｌ−チロシン ０．９６９ｇ／リットル（ｗ／ｖ）
ｅ）微量金属塩溶液
塩化亜鉛 ４０ｍｇ／リットル（ｗ／ｖ）
塩化鉄（ＩＩ）６水和物 ２００ｍｇ／リットル（ｗ／ｖ）
塩化銅（ＩＩ）２水和物 １０ｍｇ／リットル（ｗ／ｖ）
塩化マンガン（ＩＩ）４水和物 １０ｍｇ／リットル（ｗ／ｖ）
ほう酸ナトリウム１０水和物 １０ｍｇ／リットル（ｗ／ｖ）
モリブデン酸アンモニウム４水和物 １０ｍｇ／リットル（ｗ／ｖ）
［２］放線菌からのプラスミド単離法
上記［１］で得られたチオストレプトン耐性菌株を２５
μｇ／ｍｌのチオストレプトンを含むＧＰＹ培地１００
ｍｌ中、２８℃、２００ｒｐｍで３日間培養した。培養
液を遠心分離し（５０００ｒｐｍ、４℃、１０分）、沈
殿した菌体を回収した。この菌体を１０ｍｇ／ｍｌのリ
ゾチーム（シグマ社製）、５０ｍＭのグルコース、１０
ｍＭのＥＤＴＡを含む２５ｍＭのトリス−塩酸緩衝液
（ｐＨ８．０）４ｍｌに懸濁し、３０℃で１時間保温し
た。この懸濁液に０．２Ｍの水酸化ナトリウムを含む１
％（ｗ／ｖ）ドデシル硫酸ナトリウム溶液を８ｍｌ加え
攪拌した後、氷上で１０分間静置した。さらに、３Ｍの
酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ４．８）を６ｍｌ加え攪拌し
た後、遠心分離（１００００ｒｐｍ、４℃、１５分）し
て上清を回収した。１０ｍｌの吸着用緩衝液（７５０ｍ
Ｍの塩化ナトリウム、１５％（ｖ／ｖ）エタノール、
０．１５％（ｖ／ｖ）トライトンＸ−１００を含む５０
ｍＭの３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（以
下「ＭＯＰＳ」という）（ｐＨ７．０））で平衡化した
キアゲンチップ５００カラム（フナコシ（株）社製）
に、回収した上清を全量供与した後、３０ｍｌの洗浄用
緩衝液（１Ｍの塩化ナトリウム、１５％（ｖ／ｖ）エタ
ノールを含む５０ｍＭのＭＯＰＳ（ｐＨ７．０））によ
りカラムを洗浄した。次いで、１５ｍｌの溶出用緩衝液
（１．２５Ｍの塩化ナトリウム、１５％（ｖ／ｖ）エタ
ノールを含む５０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．
５））により、プラスミドを含む溶出画分を得た。該溶
出画分に１０．５ｍｌのイソプロパノールを加えた後、
１００００ｒｐｍ、４℃で、１５分間遠心分離し、沈殿
したＤＮＡを回収した。このＤＮＡを４００μｌのＴＥ
緩衝液に溶解し、２ｍｇ／ｍｌのリボヌクレアーゼＡ
（シグマ社製）を５μｌ加えて、３７℃で３０分保温し
た。以下、このＤＮＡ溶液をフェノール・クロロホルム
処理し、水層をエタノール処理してＤＮＡを沈殿させた
後、沈殿したＤＮＡを減圧乾燥してプラスミドｐＳＣＡ
３０１を得た。
μｇ／ｍｌのチオストレプトンを含むＧＰＹ培地１００
ｍｌ中、２８℃、２００ｒｐｍで３日間培養した。培養
液を遠心分離し（５０００ｒｐｍ、４℃、１０分）、沈
殿した菌体を回収した。この菌体を１０ｍｇ／ｍｌのリ
ゾチーム（シグマ社製）、５０ｍＭのグルコース、１０
ｍＭのＥＤＴＡを含む２５ｍＭのトリス−塩酸緩衝液
（ｐＨ８．０）４ｍｌに懸濁し、３０℃で１時間保温し
た。この懸濁液に０．２Ｍの水酸化ナトリウムを含む１
％（ｗ／ｖ）ドデシル硫酸ナトリウム溶液を８ｍｌ加え
攪拌した後、氷上で１０分間静置した。さらに、３Ｍの
酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ４．８）を６ｍｌ加え攪拌し
た後、遠心分離（１００００ｒｐｍ、４℃、１５分）し
て上清を回収した。１０ｍｌの吸着用緩衝液（７５０ｍ
Ｍの塩化ナトリウム、１５％（ｖ／ｖ）エタノール、
０．１５％（ｖ／ｖ）トライトンＸ−１００を含む５０
ｍＭの３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（以
下「ＭＯＰＳ」という）（ｐＨ７．０））で平衡化した
キアゲンチップ５００カラム（フナコシ（株）社製）
に、回収した上清を全量供与した後、３０ｍｌの洗浄用
緩衝液（１Ｍの塩化ナトリウム、１５％（ｖ／ｖ）エタ
ノールを含む５０ｍＭのＭＯＰＳ（ｐＨ７．０））によ
りカラムを洗浄した。次いで、１５ｍｌの溶出用緩衝液
（１．２５Ｍの塩化ナトリウム、１５％（ｖ／ｖ）エタ
ノールを含む５０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．
５））により、プラスミドを含む溶出画分を得た。該溶
出画分に１０．５ｍｌのイソプロパノールを加えた後、
１００００ｒｐｍ、４℃で、１５分間遠心分離し、沈殿
したＤＮＡを回収した。このＤＮＡを４００μｌのＴＥ
緩衝液に溶解し、２ｍｇ／ｍｌのリボヌクレアーゼＡ
（シグマ社製）を５μｌ加えて、３７℃で３０分保温し
た。以下、このＤＮＡ溶液をフェノール・クロロホルム
処理し、水層をエタノール処理してＤＮＡを沈殿させた
後、沈殿したＤＮＡを減圧乾燥してプラスミドｐＳＣＡ
３０１を得た。
【００６２】（１−６）プラスミドｐＳＣＡ３１０−Δ
４２８の構築 １０μｇのｐＳＣＡ３０１に１００単位のＥｃｏＲＩ、
および１００単位のＨｉｎｄＩＩＩを加え、３７℃下、
３時間消化した後、フェノール・クロロホルム処理し、
水層をエタノール処理してＤＮＡを沈殿させ、沈殿した
ＤＮＡを減圧乾燥した。
４２８の構築 １０μｇのｐＳＣＡ３０１に１００単位のＥｃｏＲＩ、
および１００単位のＨｉｎｄＩＩＩを加え、３７℃下、
３時間消化した後、フェノール・クロロホルム処理し、
水層をエタノール処理してＤＮＡを沈殿させ、沈殿した
ＤＮＡを減圧乾燥した。
【００６３】一方、１０μｇのｐＳＣＡ２１２を１００
単位の制限酵素ＥｃｏＲＩ、および１００単位の制限酵
素ＨｉｎｄＩＩＩで３７℃、３時間消化した後、１％ア
ガロースゲルで電気泳動し、シトクロムＰ−４５０
sca-2 遺伝子を含む２．２ｋｂｐのＤＮＡ断片を切り出
した。
単位の制限酵素ＥｃｏＲＩ、および１００単位の制限酵
素ＨｉｎｄＩＩＩで３７℃、３時間消化した後、１％ア
ガロースゲルで電気泳動し、シトクロムＰ−４５０
sca-2 遺伝子を含む２．２ｋｂｐのＤＮＡ断片を切り出
した。
【００６４】ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ消化した
ｐＳＣＡ３０１ １００ｎｇに、ｐＳＣＡ２１２から切
り出したＰ−４５０sca-2 遺伝子を含む２．２ｋｂｐの
ＤＮＡ断片を２００ｎｇ加え、さらにＴ４ＤＮＡリガー
ゼを１８００単位添加し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ反応緩衝
液１００μｌ中で１６℃下、２時間反応させた。以下、
（１−５）の［１］で記載した方法と同様にして、この
反応液に含まれるＤＮＡでストレプトミセス・リビダン
スを形質転換し、チオストレプトン耐性菌を選択した結
果、ストレプトミセス・リビダンス ＳＡＮＫ ６２７
９５株を得た。さらに、（１−５）の［２］で記載した
方法と同様にして、該菌株を培養してプラスミドｐＳＣ
Ａ３１０−Δ４２８を得た。
ｐＳＣＡ３０１ １００ｎｇに、ｐＳＣＡ２１２から切
り出したＰ−４５０sca-2 遺伝子を含む２．２ｋｂｐの
ＤＮＡ断片を２００ｎｇ加え、さらにＴ４ＤＮＡリガー
ゼを１８００単位添加し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ反応緩衝
液１００μｌ中で１６℃下、２時間反応させた。以下、
（１−５）の［１］で記載した方法と同様にして、この
反応液に含まれるＤＮＡでストレプトミセス・リビダン
スを形質転換し、チオストレプトン耐性菌を選択した結
果、ストレプトミセス・リビダンス ＳＡＮＫ ６２７
９５株を得た。さらに、（１−５）の［２］で記載した
方法と同様にして、該菌株を培養してプラスミドｐＳＣ
Ａ３１０−Δ４２８を得た。
【００６５】以上の工程を図１に簡単に示した。ｐＳＣ
Ａ３１０−Δ４２８は、シトクロムＰ−４５０sca-2 遺
伝子発現調節領域の３’側約０．４ｋｂｐ、およびシト
クロムＰ−４５０sca-2 のオープンリーディングフレー
ムを含み、放線菌で複製可能なプラスミドベクターであ
る。
Ａ３１０−Δ４２８は、シトクロムＰ−４５０sca-2 遺
伝子発現調節領域の３’側約０．４ｋｂｐ、およびシト
クロムＰ−４５０sca-2 のオープンリーディングフレー
ムを含み、放線菌で複製可能なプラスミドベクターであ
る。
【００６６】（１−７）ｐＳＣＡ２０５の構築
プラスミドｐＳＣＡ２０５は、特開平6-70780 記載の方
法で構築した。
法で構築した。
【００６７】実施例１- ３で得られた ｐＳＣＡ１０１
１０μｇをPvuII １００ユニットで３７℃、３時間処
理後、１％アガロースゲル電気泳動を行い、Ｐ−４５０
sca- 2 遺伝子のＮ末端領域を含むPvuII 断片 1.7 kb を
切り出した。これを透析チューブに移し、１×ＴＢＥ緩
衝液中で１００Ｖ、２時間処理し、目的のＤＮＡ断片を
ゲルから溶出した。これを常法によりフェノール処理
し、エタノール沈殿後減圧乾燥した。
１０μｇをPvuII １００ユニットで３７℃、３時間処
理後、１％アガロースゲル電気泳動を行い、Ｐ−４５０
sca- 2 遺伝子のＮ末端領域を含むPvuII 断片 1.7 kb を
切り出した。これを透析チューブに移し、１×ＴＢＥ緩
衝液中で１００Ｖ、２時間処理し、目的のＤＮＡ断片を
ゲルから溶出した。これを常法によりフェノール処理
し、エタノール沈殿後減圧乾燥した。
【００６８】次に、ｐＵＣ１１９ １０μｇを SmaI １
００ユニットで３７℃、３時間処理し、常法によりフェ
ノール処理後エタノール沈殿し、減圧乾燥した。この S
maI処理した pｐＵＣ１１９を２００μｌのＴＥ緩衝液
に溶解し、アルカリフォスファターゼ（東洋紡（株）
製）を４ユニット加え、３７℃、３０分間反応させ末端
を脱リン酸化した。これを常法によりフェノール処理
後、エタノール沈殿減圧乾燥した。この SmaI 及びアル
カリフォスファターゼ処理したｐＵＣ１１９のSmaI部位
にＰ−４５０sca-2 のＮ末端領域を含む PvuII断片（1.
7 kb）をＤＮＡライゲーションキット（宝酒造（株）
製）を用いて挿入し、このプラスミドをｐＳＣＡ１０６
とした。
００ユニットで３７℃、３時間処理し、常法によりフェ
ノール処理後エタノール沈殿し、減圧乾燥した。この S
maI処理した pｐＵＣ１１９を２００μｌのＴＥ緩衝液
に溶解し、アルカリフォスファターゼ（東洋紡（株）
製）を４ユニット加え、３７℃、３０分間反応させ末端
を脱リン酸化した。これを常法によりフェノール処理
後、エタノール沈殿減圧乾燥した。この SmaI 及びアル
カリフォスファターゼ処理したｐＵＣ１１９のSmaI部位
にＰ−４５０sca-2 のＮ末端領域を含む PvuII断片（1.
7 kb）をＤＮＡライゲーションキット（宝酒造（株）
製）を用いて挿入し、このプラスミドをｐＳＣＡ１０６
とした。
【００６９】次に、ｐＳＣＡ１０６が有するＰ−４５０
sca-2 のプロモーター領域とｐＳＣＡ１０８が有するＰ
−４５０sca-2 の構造遺伝子を連結したプラスミドｐＳ
ＣＡ１１１の構築は次のようにした。
sca-2 のプロモーター領域とｐＳＣＡ１０８が有するＰ
−４５０sca-2 の構造遺伝子を連結したプラスミドｐＳ
ＣＡ１１１の構築は次のようにした。
【００７０】すなわち、ｐＳＣＡ１０８ １０μｇをSa
cI １００ユニットで３７℃、５時間処理し、１％アガ
ロースゲル電気泳動でＰ−４５０sca-2 の構造遺伝子2.
0kbを分離した。このSacI断片（2.0kb ）を切り出し、
１×ＴＢＥ中で１００Ｖ、２時間処理し、ＤＮＡ断片を
溶出した。これを常法によりフェノール処理後、エタノ
ール沈殿減圧乾燥した。
cI １００ユニットで３７℃、５時間処理し、１％アガ
ロースゲル電気泳動でＰ−４５０sca-2 の構造遺伝子2.
0kbを分離した。このSacI断片（2.0kb ）を切り出し、
１×ＴＢＥ中で１００Ｖ、２時間処理し、ＤＮＡ断片を
溶出した。これを常法によりフェノール処理後、エタノ
ール沈殿減圧乾燥した。
【００７１】一方、ｐＳＣＡ１０６ １０μｇをＳａｃ
Ｉ １００ユニットで３７℃、５時間処理後、１％アガ
ロースゲル電気泳動によりSacI断片 4 kb を分離した。
この断片をゲルから切り出し透析チューブに移した後、
１×ＴＢＥ緩衝液中で１００Ｖ、２時間処理し、このＤ
ＮＡ断片を溶出した。これを常法によりフェノール処理
後、エタノール沈殿減圧乾燥した。これを２００μｌの
ＴＥ緩衝液に溶解し、アルカリフォスファターゼ（東洋
紡（株）製）４ユニットを加え、３７℃、３０分間処理
して末端をリン酸化した。これを再び常法によりフェノ
ール処理後、エタノール沈殿減圧乾燥した。
Ｉ １００ユニットで３７℃、５時間処理後、１％アガ
ロースゲル電気泳動によりSacI断片 4 kb を分離した。
この断片をゲルから切り出し透析チューブに移した後、
１×ＴＢＥ緩衝液中で１００Ｖ、２時間処理し、このＤ
ＮＡ断片を溶出した。これを常法によりフェノール処理
後、エタノール沈殿減圧乾燥した。これを２００μｌの
ＴＥ緩衝液に溶解し、アルカリフォスファターゼ（東洋
紡（株）製）４ユニットを加え、３７℃、３０分間処理
して末端をリン酸化した。これを再び常法によりフェノ
ール処理後、エタノール沈殿減圧乾燥した。
【００７２】ｐＳＣＡ１０６由来のアルカリフォスファ
ターゼ処理したSacI断片 4kbと、ｐＳＣＡ１０８由来の
SacI断片の連結は、ＤＮＡライゲーション・キット（宝
酒造（株）製）により行い、作成したプラスミドをｐＳ
ＣＡ１１１とした。
ターゼ処理したSacI断片 4kbと、ｐＳＣＡ１０８由来の
SacI断片の連結は、ＤＮＡライゲーション・キット（宝
酒造（株）製）により行い、作成したプラスミドをｐＳ
ＣＡ１１１とした。
【００７３】ｐＳＣＡ１１１ １０μｇを１００ユニッ
トのHind III で３７℃、５時間処理した。これを常法
によりフェノール処理後、エタノール沈殿減圧乾燥し
た。このHindIII 処理したｐＳＣＡＩＩＩをＤＮＡブラ
ンティングキット（宝酒造（株）製）により末端を平滑
化した。これを再び常法によりフェノール処理後、エタ
ノール沈殿減圧乾燥した。これをＴＥ緩衝液２００μｌ
に溶解し、アルカリフォスファターゼ（東洋紡（株））
４ユニットを加え、３７℃で３０分間反応させ、末端を
脱リン酸化した。これを再び常法によりフェノール処理
後、エタノール沈殿減圧乾燥した。以上の処理をしたｐ
ＳＣＡ１１１ １００μｇにSacIリンカー（宝酒造
（株））を16.5 ng 加えＤＮＡライゲーションキット
（宝酒造（株））によりこれらを環状化し、ｐＳＣＡ１
１１のHindIII 部位をSacI部位に置換したｐＳＣＡ１１
２を構築した。
トのHind III で３７℃、５時間処理した。これを常法
によりフェノール処理後、エタノール沈殿減圧乾燥し
た。このHindIII 処理したｐＳＣＡＩＩＩをＤＮＡブラ
ンティングキット（宝酒造（株）製）により末端を平滑
化した。これを再び常法によりフェノール処理後、エタ
ノール沈殿減圧乾燥した。これをＴＥ緩衝液２００μｌ
に溶解し、アルカリフォスファターゼ（東洋紡（株））
４ユニットを加え、３７℃で３０分間反応させ、末端を
脱リン酸化した。これを再び常法によりフェノール処理
後、エタノール沈殿減圧乾燥した。以上の処理をしたｐ
ＳＣＡ１１１ １００μｇにSacIリンカー（宝酒造
（株））を16.5 ng 加えＤＮＡライゲーションキット
（宝酒造（株））によりこれらを環状化し、ｐＳＣＡ１
１１のHindIII 部位をSacI部位に置換したｐＳＣＡ１１
２を構築した。
【００７４】ｐＳＣＡ１１２よりＰ−４５０sca-2 構造
遺伝子及びそのプロモーターを含むSacI 断片 2.8 kb
を取得するため、ｐＳＣＡ１１２の SacI による部分分
解を行った。すなわち、ｐＳＣＡ１１１ ２２．１ｍｇ
を SacI 1250 ユニットで３７℃、２２時間処理した。
これを１％アガロースゲル電気泳動を行い、ゲルを０．
５μｇ／ｍｌ 臭化エチヂウムにより染色後、SacI断片
2.8 kb を切り出した。これを透析チューブに移し、１
×ＴＢＥ緩衝液中で１５０Ｖ、１．５時間処理しSacI断
片2.8kb を溶出した。これを常法によりフェノール処理
後、エタノール沈殿減圧乾燥した。これを１ ｇ／ｍｌ
の塩化セシウムを含むＴＥ緩衝液に溶解し、０．１ ｍ
ｇ／ｍｌになるように臭化エチヂウムを加え、120,000
回転／分（ 650,000 × g）１５℃で２時間超遠心分離
し、SacI 断片 2.8 kb を分離後、塩化ナトリウム及び
50 mM トリス−塩酸緩衝液（ pH 8.0 ）で飽和させた
イソプロパノールで３回抽出して臭化エチヂウムを除
き、ＴＥ緩衝液中で一晩４℃で透析した。これを常法に
よりエタノール沈殿し、７０％エタノールで洗浄後減圧
乾燥し、部分精製 SacI 断片 2.8 kb を７６μｇ得た。
遺伝子及びそのプロモーターを含むSacI 断片 2.8 kb
を取得するため、ｐＳＣＡ１１２の SacI による部分分
解を行った。すなわち、ｐＳＣＡ１１１ ２２．１ｍｇ
を SacI 1250 ユニットで３７℃、２２時間処理した。
これを１％アガロースゲル電気泳動を行い、ゲルを０．
５μｇ／ｍｌ 臭化エチヂウムにより染色後、SacI断片
2.8 kb を切り出した。これを透析チューブに移し、１
×ＴＢＥ緩衝液中で１５０Ｖ、１．５時間処理しSacI断
片2.8kb を溶出した。これを常法によりフェノール処理
後、エタノール沈殿減圧乾燥した。これを１ ｇ／ｍｌ
の塩化セシウムを含むＴＥ緩衝液に溶解し、０．１ ｍ
ｇ／ｍｌになるように臭化エチヂウムを加え、120,000
回転／分（ 650,000 × g）１５℃で２時間超遠心分離
し、SacI 断片 2.8 kb を分離後、塩化ナトリウム及び
50 mM トリス−塩酸緩衝液（ pH 8.0 ）で飽和させた
イソプロパノールで３回抽出して臭化エチヂウムを除
き、ＴＥ緩衝液中で一晩４℃で透析した。これを常法に
よりエタノール沈殿し、７０％エタノールで洗浄後減圧
乾燥し、部分精製 SacI 断片 2.8 kb を７６μｇ得た。
【００７５】このようにして精製した SacI 断片 2.8 k
b はｐＳＣＡ１１２のｐＵＣ１１９に由来するＤＮＡ断
片3.2 kbを含んでいた。そこで、これを除くため部分精
製SacI 断片（ 2.8 kb ）７５μｇを２０５ユニットの
Pvu I で３７℃、１２時間処理した。これを再び１％
アガロースゲル電気泳動により分離し、SacI 断片2.8
kb のバンドを切り出した。これを透析チューブに移
し、１×ＴＢＥ中で１５０Ｖ、１時間処理し、ＤＮＡ断
片を溶出後、これを常法によりフェノール処理後、エタ
ノール沈殿減圧乾燥した。これを１ ｇ／ｍｌの塩化セ
シウムを含むＴＥ緩衝液に溶解し、０．１ ｍｇ／ｍｌ
になるように臭化エチジウムを加え、120,000 回転／分
（ 650,000 × g ）、１５℃で２時間超遠心分離し
た。SacI断片2.8 kbを分離後、塩化ナトリウム及び 50
mMトリス−塩酸緩衝液（ pH 8.0 ）で飽和したイソプロ
パノールで３回抽出して臭化エチヂウムを除き、ＴＥ緩
衝液中で４℃、一晩透析した。これを常法によりエタノ
ール沈殿し、７０％エタノールで洗浄後減圧乾燥し、Ｔ
Ｅ緩衝液２０μｌに溶解した。以上の操作によりＰ−４
５０sca-2 構造遺伝子及びそのプロモーターを含むSacI
断片（2.8 kb）を9.8 μｇ得た。
b はｐＳＣＡ１１２のｐＵＣ１１９に由来するＤＮＡ断
片3.2 kbを含んでいた。そこで、これを除くため部分精
製SacI 断片（ 2.8 kb ）７５μｇを２０５ユニットの
Pvu I で３７℃、１２時間処理した。これを再び１％
アガロースゲル電気泳動により分離し、SacI 断片2.8
kb のバンドを切り出した。これを透析チューブに移
し、１×ＴＢＥ中で１５０Ｖ、１時間処理し、ＤＮＡ断
片を溶出後、これを常法によりフェノール処理後、エタ
ノール沈殿減圧乾燥した。これを１ ｇ／ｍｌの塩化セ
シウムを含むＴＥ緩衝液に溶解し、０．１ ｍｇ／ｍｌ
になるように臭化エチジウムを加え、120,000 回転／分
（ 650,000 × g ）、１５℃で２時間超遠心分離し
た。SacI断片2.8 kbを分離後、塩化ナトリウム及び 50
mMトリス−塩酸緩衝液（ pH 8.0 ）で飽和したイソプロ
パノールで３回抽出して臭化エチヂウムを除き、ＴＥ緩
衝液中で４℃、一晩透析した。これを常法によりエタノ
ール沈殿し、７０％エタノールで洗浄後減圧乾燥し、Ｔ
Ｅ緩衝液２０μｌに溶解した。以上の操作によりＰ−４
５０sca-2 構造遺伝子及びそのプロモーターを含むSacI
断片（2.8 kb）を9.8 μｇ得た。
【００７６】一方、ｐＩＪ７０２ ２００μｇをSacI
３００ユニットで３７℃で２０時間処理した。これを常
法によりフェノール処理後、エタノール沈殿減圧乾燥し
た。これをＴＥ８００μｌに溶解し、アルカリフォスフ
ァターゼを８０ユニット加え、３７℃で３０分間処理
後、常法によりフェノール処理後、エタノール沈殿減圧
乾燥した。
３００ユニットで３７℃で２０時間処理した。これを常
法によりフェノール処理後、エタノール沈殿減圧乾燥し
た。これをＴＥ８００μｌに溶解し、アルカリフォスフ
ァターゼを８０ユニット加え、３７℃で３０分間処理
後、常法によりフェノール処理後、エタノール沈殿減圧
乾燥した。
【００７７】これを１ ｇ／ｍｌ の塩化セシウムを含
むＴＥ緩衝液に溶解し、０．１ｍｇ／ｍｌになるように
臭化エチヂウムを加え、120,000 回転／分（ 650,000
× g）、１５℃で２時間超遠心分離した。SacI 処理し
たｐＩＪ７０２のバンドを分離後、塩化ナトリウム及び
50 mM トリス−塩酸緩衝液（ pH 8.0 ）で飽和したイ
ソプロパノールで３回抽出し、臭化エチヂウムを除去し
た。これをＴＥ緩衝液に対して４℃で一晩透析後、常法
によりエタノール沈殿し、７０％エタノールで洗浄後、
減圧乾燥した。以上の処理により SacI 及びアルカリフ
ォスファターゼ処理したｐＩＪ７０２を３７μｇ得た。
むＴＥ緩衝液に溶解し、０．１ｍｇ／ｍｌになるように
臭化エチヂウムを加え、120,000 回転／分（ 650,000
× g）、１５℃で２時間超遠心分離した。SacI 処理し
たｐＩＪ７０２のバンドを分離後、塩化ナトリウム及び
50 mM トリス−塩酸緩衝液（ pH 8.0 ）で飽和したイ
ソプロパノールで３回抽出し、臭化エチヂウムを除去し
た。これをＴＥ緩衝液に対して４℃で一晩透析後、常法
によりエタノール沈殿し、７０％エタノールで洗浄後、
減圧乾燥した。以上の処理により SacI 及びアルカリフ
ォスファターゼ処理したｐＩＪ７０２を３７μｇ得た。
【００７８】SacI 及びアルカリフォスファターゼ処理
したｐＩＪ７０２ １ μｇにＰ−４５０sca-2 構造遺
伝子及びプロモーターを含む SacI 断片 2.8 kb を
2.4μｇ加え、ＤＮＡライゲーションキット（宝酒造
（株））により２つの断片を凍結後、これを用いてスト
レプトミセス・リビダンスＴＫ２１株を形質転換し、形
質転換株からホップ・ウッドらのアルカリ法及び超遠心
分離法（ホップウッドら：「ジェネティック・マニピュ
レーション・オブ・ストレプトミセス・ア・ラボラトリ
ー・マニュアル」（1985年、ノルウィッチ所在、ジョン
・インズ・インスティチュート［ Hopwood, et al., "G
enetic Manipulation of Streptomyces Alaboratory Ma
nual" (JohnInnes Institute, Norwich, 1985）により
プラスミドを精製し、ｐＳＣＡ２０５を得た。
したｐＩＪ７０２ １ μｇにＰ−４５０sca-2 構造遺
伝子及びプロモーターを含む SacI 断片 2.8 kb を
2.4μｇ加え、ＤＮＡライゲーションキット（宝酒造
（株））により２つの断片を凍結後、これを用いてスト
レプトミセス・リビダンスＴＫ２１株を形質転換し、形
質転換株からホップ・ウッドらのアルカリ法及び超遠心
分離法（ホップウッドら：「ジェネティック・マニピュ
レーション・オブ・ストレプトミセス・ア・ラボラトリ
ー・マニュアル」（1985年、ノルウィッチ所在、ジョン
・インズ・インスティチュート［ Hopwood, et al., "G
enetic Manipulation of Streptomyces Alaboratory Ma
nual" (JohnInnes Institute, Norwich, 1985）により
プラスミドを精製し、ｐＳＣＡ２０５を得た。
【００７９】実施例２． ヌクレオチド配列決定
プラスミドｐＳＣＡ３１０−Δ４２８をチャングらの方
法［Zhang, H. et al., (1988) Nucleic Acids Res., 1
6, 1220 参照］に準じてアルカリ変性し鋳型ＤＮＡを調
製した。すなわち、５μｇのｐＳＣＡ３１０−Δ４２８
を、０．２ｍＭのＥＤＴＡおよび０．２Ｍの水酸化ナト
リウムを含む１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．
０）２０μｌ中で、３７℃下、５分間保温してアルカリ
変性させた後、エタノール処理してＤＮＡを沈殿させ
た。沈殿したＤＮＡを７０％（ｖ／ｖ）エタノールで洗
浄し、減圧乾燥したものを、ヌクレオチド配列決定のた
めの鋳型ＤＮＡとした。ヌクレオチド配列の決定は７−
デアザシークェネース・バージョン２．０キット（東洋
紡（株）社製）を用いて行った。その結果、ｐＳＣＡ３
１０−Δ４２８中のシトクロムＰ−４５０sca-2 遺伝子
発現調節領域の３’側約０．４ｋｂｐ部分のヌクレオチ
ド配列は、配列表の配列番号１のヌクレオチド番号１〜
４２８のヌクレオチド配列で示される４２８ｂｐのＤＮ
Ａであることが判明した。
法［Zhang, H. et al., (1988) Nucleic Acids Res., 1
6, 1220 参照］に準じてアルカリ変性し鋳型ＤＮＡを調
製した。すなわち、５μｇのｐＳＣＡ３１０−Δ４２８
を、０．２ｍＭのＥＤＴＡおよび０．２Ｍの水酸化ナト
リウムを含む１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．
０）２０μｌ中で、３７℃下、５分間保温してアルカリ
変性させた後、エタノール処理してＤＮＡを沈殿させ
た。沈殿したＤＮＡを７０％（ｖ／ｖ）エタノールで洗
浄し、減圧乾燥したものを、ヌクレオチド配列決定のた
めの鋳型ＤＮＡとした。ヌクレオチド配列の決定は７−
デアザシークェネース・バージョン２．０キット（東洋
紡（株）社製）を用いて行った。その結果、ｐＳＣＡ３
１０−Δ４２８中のシトクロムＰ−４５０sca-2 遺伝子
発現調節領域の３’側約０．４ｋｂｐ部分のヌクレオチ
ド配列は、配列表の配列番号１のヌクレオチド番号１〜
４２８のヌクレオチド配列で示される４２８ｂｐのＤＮ
Ａであることが判明した。
【００８０】実施例３． プラバスタチン・ナトリウム
の生産のための培養、および生成量の測定 形質転換株ストレプトミセス・リビダンス ＳＡＮＫ
６２７９５株、およびストレプトミセス・リビダンスＴ
Ｋ２１株のそれぞれを、チオストレプトン２０μｇ／ｍ
ｌを含むイースト培地（２％（ｗ／ｖ）グルコース、１
％（ｗ／ｖ）ペプトン、および０．１％（ｗ／ｖ）酵母
エキス（ディフコ社製）、ｐＨ７．０）１００ｍｌを入
れた５００ｍｌ容三角フラスコに植菌し、２８℃、２０
０ｒｐｍで３日間前培養した。前培養液５ｍｌをチオス
トレプトン２０μｇ／ｍｌを含むイースト培地１００ｍ
ｌに入れ、２８℃で２４時間培養後、ＭＬ−２３６Ｂ・
ナトリウム［Endo, A., et al. (1976) J. Antibiotic
s, 29, 1346参照］を５００μｇ／ｍｌの最終濃度にな
るように添加し、２８℃、２００ｒｐｍでさらに振盪培
養した。培養液中に生成されたプラバスタチン・ナトリ
ウムの量を測定するため、ＭＬ−２３６Ｂ・ナトリウム
添加１時間後に培養液の一部をサンプルとして回収し、
高速液体クロマトグラフィーによる該サンプルの分画を
行った。高速液体クロマトグラフィーの実施条件は以下
の通りである。
の生産のための培養、および生成量の測定 形質転換株ストレプトミセス・リビダンス ＳＡＮＫ
６２７９５株、およびストレプトミセス・リビダンスＴ
Ｋ２１株のそれぞれを、チオストレプトン２０μｇ／ｍ
ｌを含むイースト培地（２％（ｗ／ｖ）グルコース、１
％（ｗ／ｖ）ペプトン、および０．１％（ｗ／ｖ）酵母
エキス（ディフコ社製）、ｐＨ７．０）１００ｍｌを入
れた５００ｍｌ容三角フラスコに植菌し、２８℃、２０
０ｒｐｍで３日間前培養した。前培養液５ｍｌをチオス
トレプトン２０μｇ／ｍｌを含むイースト培地１００ｍ
ｌに入れ、２８℃で２４時間培養後、ＭＬ−２３６Ｂ・
ナトリウム［Endo, A., et al. (1976) J. Antibiotic
s, 29, 1346参照］を５００μｇ／ｍｌの最終濃度にな
るように添加し、２８℃、２００ｒｐｍでさらに振盪培
養した。培養液中に生成されたプラバスタチン・ナトリ
ウムの量を測定するため、ＭＬ−２３６Ｂ・ナトリウム
添加１時間後に培養液の一部をサンプルとして回収し、
高速液体クロマトグラフィーによる該サンプルの分画を
行った。高速液体クロマトグラフィーの実施条件は以下
の通りである。
【００８１】カラム：ラジアルパックカートリッジＣ１
８（ウォーターズ社製） 溶媒： ３０％アセトニトリル、０．１％トリエチルア
ミンを含む０．１％リン酸緩衝液（ｐＨ３．２） 流速： １ｍｌ／分 検出波長：２３７ｎｍ プラバスタチン・ナトリウムの保持時間： １１．９分 上記と同一の条件で既知量のプラバスタチン・ナトリウ
ム標準品［Serizawa,N., et al. (1983) J. Antibiotic
s, 36, 608 参照］のクロマトグラフィーを行った。該
標準品の検出チャートのピーク面積を基準にして、培養
液サンプルの検出チャートのプラバスタチンに相当する
ピークの面積から生成プラバスタチン・ナトリウム量を
算出した。ストレプトミセス・リビダンス ＳＡＮＫ
６２７９５株は、５１μｇ／ｍｌのプラバスタチン・ナ
トリウムを生成したのに対して、ストレプトミセス・リ
ビダンスＴＫ２１株はプラバスタチン・ナトリウムを生
成しなかった。
８（ウォーターズ社製） 溶媒： ３０％アセトニトリル、０．１％トリエチルア
ミンを含む０．１％リン酸緩衝液（ｐＨ３．２） 流速： １ｍｌ／分 検出波長：２３７ｎｍ プラバスタチン・ナトリウムの保持時間： １１．９分 上記と同一の条件で既知量のプラバスタチン・ナトリウ
ム標準品［Serizawa,N., et al. (1983) J. Antibiotic
s, 36, 608 参照］のクロマトグラフィーを行った。該
標準品の検出チャートのピーク面積を基準にして、培養
液サンプルの検出チャートのプラバスタチンに相当する
ピークの面積から生成プラバスタチン・ナトリウム量を
算出した。ストレプトミセス・リビダンス ＳＡＮＫ
６２７９５株は、５１μｇ／ｍｌのプラバスタチン・ナ
トリウムを生成したのに対して、ストレプトミセス・リ
ビダンスＴＫ２１株はプラバスタチン・ナトリウムを生
成しなかった。
【００８２】実施例４．プラスミドｐＳＣＡ３１０−△
３２０、ｐＳＣＡ３１０−△１５８、ｐＳＣＡ３１０−
△１０１及びｐＳＣＡ３１０−△７４の構築 Ｐ−４５０sca-2 遺伝子のプロモーター領域の性状をさ
らに詳しく解析するため、Ｐ−４５０sca-2 構造遺伝子
に隣接する５’プロモーター領域の長さの異なる各断片
を含む複数のプラスミドを構築した。これらのプラスミ
ド、ｐＳＣＡ３１０−△３２０、ｐＳＣＡ３１０−△１
５８、ｐＳＣＡ３１０−△１０１及びｐＳＣＡ３１０−
△７４は、以下の方法で構築された（構築の詳細は図２
に示してある。）。各々のプラスミドは５’から３’の
方向へ切断された該５’プロモーター領域が挿入されて
おり、実施例１−４記載の方法と同様の方法で調製され
た。切断断片の長さはエキソヌクレアーゼＩＩＩにより
切断した直後に正確に予測することはできないので、各
々のプラスミドは長さの異なるプロモーターを含んでい
る。
３２０、ｐＳＣＡ３１０−△１５８、ｐＳＣＡ３１０−
△１０１及びｐＳＣＡ３１０−△７４の構築 Ｐ−４５０sca-2 遺伝子のプロモーター領域の性状をさ
らに詳しく解析するため、Ｐ−４５０sca-2 構造遺伝子
に隣接する５’プロモーター領域の長さの異なる各断片
を含む複数のプラスミドを構築した。これらのプラスミ
ド、ｐＳＣＡ３１０−△３２０、ｐＳＣＡ３１０−△１
５８、ｐＳＣＡ３１０−△１０１及びｐＳＣＡ３１０−
△７４は、以下の方法で構築された（構築の詳細は図２
に示してある。）。各々のプラスミドは５’から３’の
方向へ切断された該５’プロモーター領域が挿入されて
おり、実施例１−４記載の方法と同様の方法で調製され
た。切断断片の長さはエキソヌクレアーゼＩＩＩにより
切断した直後に正確に予測することはできないので、各
々のプラスミドは長さの異なるプロモーターを含んでい
る。
【００８３】１）ｐＳＣＡ３１０−△３２０の構築
pSCA213 は実施例１−４に記載されたのと同様の方法で
pSCA 111 DNA から得られた（図２参照）。pSCA213 DN
A は EcoRI と Hind III で切断され、切断後の産物は
１％アガロースゲルで電気泳動された。Ｐ−４５０
sca-2 遺伝子及びこれに隣接する５’プロモーター領域
を含む約 2.1 kb の EcoRI- Hind III DNA断片がゲル
から切り出された。切り出されたDNA はフェノール・ク
ロロフォルムで処理され、エタノール沈殿処理の後減圧
下乾燥させた。
pSCA 111 DNA から得られた（図２参照）。pSCA213 DN
A は EcoRI と Hind III で切断され、切断後の産物は
１％アガロースゲルで電気泳動された。Ｐ−４５０
sca-2 遺伝子及びこれに隣接する５’プロモーター領域
を含む約 2.1 kb の EcoRI- Hind III DNA断片がゲル
から切り出された。切り出されたDNA はフェノール・ク
ロロフォルムで処理され、エタノール沈殿処理の後減圧
下乾燥させた。
【００８４】１００ μｇのpSCA301 は EcoRI 及び
Hind III により切断され、実施例１−６と同様に調製
された。このＤＮＡは、1800 単位の Ｔ４ リガーゼ
を含むリガーゼ緩衝液に、上記で得られた 2.1 kb の E
coRI- Hind III DNA 断片約200 ng とともに添加さ
れ、最終容積は 100 μl とした。反応は１６℃で２時
間行われた。反応終了後、前述の「 ［１］ストレプト
ミセス・リビダンスＴＫ２１株の形質転換法」に従い、
ライゲーションされたＤＮＡによりストレプトミセス・
リビダンスＴＫ２１株を形質転換した。この方法により
得られたチオストレプトン抵抗性のストレプトミセス・
リビダンス株は、ＴＫ２１／ｐＳＣＡ３１０−△３２０
と命名された。前述の「［２］放線菌からのプラスミド
単離法」に従い、この菌株よりプラスミドＤＮＡが得ら
れ、ｐＳＣＡ３１０−△３２０と命名された。
Hind III により切断され、実施例１−６と同様に調製
された。このＤＮＡは、1800 単位の Ｔ４ リガーゼ
を含むリガーゼ緩衝液に、上記で得られた 2.1 kb の E
coRI- Hind III DNA 断片約200 ng とともに添加さ
れ、最終容積は 100 μl とした。反応は１６℃で２時
間行われた。反応終了後、前述の「 ［１］ストレプト
ミセス・リビダンスＴＫ２１株の形質転換法」に従い、
ライゲーションされたＤＮＡによりストレプトミセス・
リビダンスＴＫ２１株を形質転換した。この方法により
得られたチオストレプトン抵抗性のストレプトミセス・
リビダンス株は、ＴＫ２１／ｐＳＣＡ３１０−△３２０
と命名された。前述の「［２］放線菌からのプラスミド
単離法」に従い、この菌株よりプラスミドＤＮＡが得ら
れ、ｐＳＣＡ３１０−△３２０と命名された。
【００８５】２）ｐＳＣＡ３１０−△１５８の構築
pSCA214 は実施例１−４に記載されたのと同様の方法で
pSCA 111 DNA から得られた（図２参照）。上記１）と
同様の方法で、pSCA214 DNA は EcoRI と Hind III で
切断され、切断後の産物は１％アガロースゲルで電気泳
動された。Ｐ−４５０sca-2 遺伝子及びこれに隣接する
５’プロモーター領域を含む約 1.93 kbの EcoRI- Hind
III DNA 断片がゲルから切り出された。この断片は、
上記１）と同様の方法で、pSCA301 を形質転換するため
に用いられた。
pSCA 111 DNA から得られた（図２参照）。上記１）と
同様の方法で、pSCA214 DNA は EcoRI と Hind III で
切断され、切断後の産物は１％アガロースゲルで電気泳
動された。Ｐ−４５０sca-2 遺伝子及びこれに隣接する
５’プロモーター領域を含む約 1.93 kbの EcoRI- Hind
III DNA 断片がゲルから切り出された。この断片は、
上記１）と同様の方法で、pSCA301 を形質転換するため
に用いられた。
【００８６】得られたチオストレプトン抵抗性のストレ
プトミセス・リビダンス株は、ＴＫ２１／ｐＳＣＡ３１
０−△１５８と命名された。この菌株よりプラスミドＤ
ＮＡが得られ、ｐＳＣＡ３１０−△１５８と命名され
た。
プトミセス・リビダンス株は、ＴＫ２１／ｐＳＣＡ３１
０−△１５８と命名された。この菌株よりプラスミドＤ
ＮＡが得られ、ｐＳＣＡ３１０−△１５８と命名され
た。
【００８７】３）ｐＳＣＡ３１０−△１０１の構築
pSCA215 は実施例１−４に記載されたのと同様の方法で
pSCA 111 DNA から得られた（図２参照）。上記１）と
同様の方法で、pSCA215 DNA は EcoRI と Hind III で
切断され、切断後の産物は１％アガロースゲルで電気泳
動された。Ｐ−４５０sca-2 遺伝子及びこれに隣接する
５’プロモーター領域を含む約 1.87 kbの EcoRI- Hind
III DNA 断片がゲルから切り出された。この断片は、
上記１）と同様の方法で、pSCA301 を形質転換するため
に用いられた。
pSCA 111 DNA から得られた（図２参照）。上記１）と
同様の方法で、pSCA215 DNA は EcoRI と Hind III で
切断され、切断後の産物は１％アガロースゲルで電気泳
動された。Ｐ−４５０sca-2 遺伝子及びこれに隣接する
５’プロモーター領域を含む約 1.87 kbの EcoRI- Hind
III DNA 断片がゲルから切り出された。この断片は、
上記１）と同様の方法で、pSCA301 を形質転換するため
に用いられた。
【００８８】得られたチオストレプトン抵抗性のストレ
プトミセス・リビダンス株は、ＴＫ２１／ｐＳＣＡ３１
０−△１０１と命名された。この菌株よりプラスミドＤ
ＮＡが得られ、ｐＳＣＡ３１０−△１０１と命名され
た。
プトミセス・リビダンス株は、ＴＫ２１／ｐＳＣＡ３１
０−△１０１と命名された。この菌株よりプラスミドＤ
ＮＡが得られ、ｐＳＣＡ３１０−△１０１と命名され
た。
【００８９】４）ｐＳＣＡ３１０−△７４の構築
pSCA216 は実施例１−４に記載されたのと同様の方法で
pSCA 111 DNA から得られた（図２参照）。上記１）と
同様の方法で、pSCA215 DNA は EcoRI と Hind III で
切断され、切断後の産物は１％アガロースゲルで電気泳
動された。Ｐ−４５０sca-2 遺伝子及びこれに隣接する
５’プロモーター領域を含む約 1.85 kbの EcoRI- Hind
III DNA 断片がゲルから切り出された。この断片は、
上記１）と同様の方法で、pSCA301 を形質転換するため
に用いられた。
pSCA 111 DNA から得られた（図２参照）。上記１）と
同様の方法で、pSCA215 DNA は EcoRI と Hind III で
切断され、切断後の産物は１％アガロースゲルで電気泳
動された。Ｐ−４５０sca-2 遺伝子及びこれに隣接する
５’プロモーター領域を含む約 1.85 kbの EcoRI- Hind
III DNA 断片がゲルから切り出された。この断片は、
上記１）と同様の方法で、pSCA301 を形質転換するため
に用いられた。
【００９０】得られたチオストレプトン抵抗性のストレ
プトミセス・リビダンス株は、ＴＫ２１／ｐＳＣＡ３１
０−△７４と命名された。この菌株よりプラスミドＤＮ
Ａが得られ、ｐＳＣＡ３１０−△７４と命名された。
プトミセス・リビダンス株は、ＴＫ２１／ｐＳＣＡ３１
０−△７４と命名された。この菌株よりプラスミドＤＮ
Ａが得られ、ｐＳＣＡ３１０−△７４と命名された。
【００９１】５）プロモ−タ−断片のサイズ及びヌクレ
オチド配列の決定 プラスミドｐＳＣＡ３１０−△３２０、ｐＳＣＡ３１０
−△１５８、ｐＳＣＡ３１０−△１０１及びｐＳＣＡ３
１０−△７４に存在する５’プロモーター断片の長さ
は、実施例２と同様の方法で決定された。
オチド配列の決定 プラスミドｐＳＣＡ３１０−△３２０、ｐＳＣＡ３１０
−△１５８、ｐＳＣＡ３１０−△１０１及びｐＳＣＡ３
１０−△７４に存在する５’プロモーター断片の長さ
は、実施例２と同様の方法で決定された。
【００９２】プラスミドｐＳＣＡ３１０−△３２０にお
いては、該５’プロモーター断片の長さは 320 bp であ
ることが示され、配列表の配列番号１のヌクレオチド番
号１０９−４２８のヌクレオチド配列に対応していた。
いては、該５’プロモーター断片の長さは 320 bp であ
ることが示され、配列表の配列番号１のヌクレオチド番
号１０９−４２８のヌクレオチド配列に対応していた。
【００９３】プラスミドｐＳＣＡ３１０−△１５８にお
いては、該５’プロモーター断片の長さは 158 bp であ
ることが示され、配列表の配列番号１のヌクレオチド番
号２７１−４２８のヌクレオチド配列に対応していた。
いては、該５’プロモーター断片の長さは 158 bp であ
ることが示され、配列表の配列番号１のヌクレオチド番
号２７１−４２８のヌクレオチド配列に対応していた。
【００９４】プラスミドｐＳＣＡ３１０−△１０１にお
いては、該５’プロモーター断片の長さは 101 bp であ
ることが示され、配列表の配列番号１のヌクレオチド番
号３２８−４２８のヌクレオチド配列に対応していた。
いては、該５’プロモーター断片の長さは 101 bp であ
ることが示され、配列表の配列番号１のヌクレオチド番
号３２８−４２８のヌクレオチド配列に対応していた。
【００９５】プラスミドｐＳＣＡ３１０−△７４におい
ては、該５’プロモーター断片の長さは 74 bpであるこ
とが示され、配列表の配列番号１のヌクレオチド番号３
５５−４２８のヌクレオチド配列に対応していた。
ては、該５’プロモーター断片の長さは 74 bpであるこ
とが示され、配列表の配列番号１のヌクレオチド番号３
５５−４２８のヌクレオチド配列に対応していた。
【００９６】６）プラバスタチン・ナトリウムのプラス
ミド依存性の生産 以下の形質転換体について、実施例３に記載した方法に
従い、プラバスタチン・ナトリウムの生産量が測定され
た：ストレプトミセス・リビダンスＴＫ２１／ｐＳＣＡ
３１０−△３２０、ストレプトミセス・リビダンスＴＫ
２１／ｐＳＣＡ３１０−△１５８、ストレプトミセス・
リビダンスＴＫ２１／ｐＳＣＡ３１０−△１０１及びス
トレプトミセス・リビダンスＴＫ２１／ｐＳＣＡ３１０
−△７４。ストレプトミセス・リビダンスＴＫ２１は、
コントロールとして用いられた。結果は以下の表１に示
される。
ミド依存性の生産 以下の形質転換体について、実施例３に記載した方法に
従い、プラバスタチン・ナトリウムの生産量が測定され
た：ストレプトミセス・リビダンスＴＫ２１／ｐＳＣＡ
３１０−△３２０、ストレプトミセス・リビダンスＴＫ
２１／ｐＳＣＡ３１０−△１５８、ストレプトミセス・
リビダンスＴＫ２１／ｐＳＣＡ３１０−△１０１及びス
トレプトミセス・リビダンスＴＫ２１／ｐＳＣＡ３１０
−△７４。ストレプトミセス・リビダンスＴＫ２１は、
コントロールとして用いられた。結果は以下の表１に示
される。
【００９７】
【表１】
ストレプトミセス・リビダンス形質転換体 プラバスタチン・ナトリウム
( μg/ml )
TK21/ｐＳＣＡ３１０−△３２０ 52
TK21/ｐＳＣＡ３１０−△１５８ 12
TK21/ｐＳＣＡ３１０−△１０１ 17
TK21/ｐＳＣＡ３１０−△７４ 16
TK21 0
このように、この実施例で調製されたプラスミドの５’
プロモーターのすべては、有用なプロモーター活性を示
すことが観察された。
プロモーターのすべては、有用なプロモーター活性を示
すことが観察された。
【００９８】実施例５．ノザン・ブロッティングにより
測定されるＭＬ−２３６Ｂによる転写誘導 １）全ＲＮＡの調製 以下のストレプトミセス・リビダンスの菌株、すなわ
ち、ストレプトミセス・リビダンスTK21/ ｐＳＣＡ２０
５、ストレプトミセス・リビダンス TK21/ｐＳＣＡ３１
０−△４２８、ストレプトミセス・リビダンス TK21/ｐ
ＳＣＡ３１０−△３２０、ストレプトミセス・リビダン
ス TK21/ｐＳＣＡ３１０−△１５８、ストレプトミセス
・リビダンス TK21/ｐＳＣＡ３１０−△１０１ 及びス
トレプトミセス・リビダンス TK21/ｐＳＣＡ３１０−△
７４は実施例３と同様の方法で培養した。
測定されるＭＬ−２３６Ｂによる転写誘導 １）全ＲＮＡの調製 以下のストレプトミセス・リビダンスの菌株、すなわ
ち、ストレプトミセス・リビダンスTK21/ ｐＳＣＡ２０
５、ストレプトミセス・リビダンス TK21/ｐＳＣＡ３１
０−△４２８、ストレプトミセス・リビダンス TK21/ｐ
ＳＣＡ３１０−△３２０、ストレプトミセス・リビダン
ス TK21/ｐＳＣＡ３１０−△１５８、ストレプトミセス
・リビダンス TK21/ｐＳＣＡ３１０−△１０１ 及びス
トレプトミセス・リビダンス TK21/ｐＳＣＡ３１０−△
７４は実施例３と同様の方法で培養した。
【００９９】実施例３と同様に、ＭＬ２３６−Ｂ・ナト
リウムは試験実験系においては最終濃度 500 μg/ml
となるように培養系に添加された。ネガティブ・コント
ロールの実験においては、培養系は同様に調製された
が、ＭＬ２３６−Ｂは添加されなかった。この段階で、
試験実験系にＭＬ−２３６Ｂが添加された後に、培養は
１時間、２８℃、２００ｒ．ｐ．ｍ．で継続された。こ
の後培養液は４℃、4,000 × g で１０分間遠心され、
ペレットは液体窒素中にて速やかに凍結され、-80 ℃以
下で保存された。
リウムは試験実験系においては最終濃度 500 μg/ml
となるように培養系に添加された。ネガティブ・コント
ロールの実験においては、培養系は同様に調製された
が、ＭＬ２３６−Ｂは添加されなかった。この段階で、
試験実験系にＭＬ−２３６Ｂが添加された後に、培養は
１時間、２８℃、２００ｒ．ｐ．ｍ．で継続された。こ
の後培養液は４℃、4,000 × g で１０分間遠心され、
ペレットは液体窒素中にて速やかに凍結され、-80 ℃以
下で保存された。
【０１００】あらかじめドライ・アイスで冷却した乳鉢
中で、凍結保存菌体３ｇを粉状になるまで粉砕した。こ
れをグアニジン・チオシアネート溶液（４Ｍ グアニジ
ンチオシアネート（フルカ社製）、４％（ｗ／ｖ）ザル
コシル（シグマ社製）、０．１％（ｗ／ｖ）、アンチフ
ォームＡ（シグマ社製）、２０ｍＭ ＥＤＴＡ・二ナト
リウム、４ｍＭ ２−メルカプトエタノール及び２５ｍ
Ｍクエン酸三ナトリウム（ｐＨ７．０））１５ｍｌで満
たしておいた遠沈管に移し、激しく攪拌後、ポリトロン
・ホモジナイザーを用いて３０秒菌体を破砕した。これ
を 9,000 r.p.m. （ 10,000 × g）、４℃で１５分間遠
心分離した。上清を再び 9,000 r.p.m.（ 10,000 ×
g）、４℃で１５分間遠心分離した。上清７ｍｌを、あ
らかじめ３ｍｌの０．１Ｍ ＥＤＴＡ・二ナトリウムを
含む５．７Ｍ 塩化セシウム溶液を入れておいた超遠心
管（１３ＰＡ；日立工機（株）社製）を静かに重層し、
3,000 r.p.m.（ 4,000 × g ）で１５時間遠心した。
遠心分離後、沈殿を０．３ｍｌ の１ ｍＭ ＥＤＴＡ
・二ナトリウムを含む１０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液
（ pH 8.0 ）（以下、「ＴＥ」という。）に溶解した。
これに３０μｌの３Ｍ酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液（ p
H 5.2 ）、及び 1 ml のエタノールを添加した。これ
を 14,500 r.p.m. （ 18,000 × g ）、４℃で１０分
間遠心分離し、沈殿に８０％（ｖ／ｖ）エタノールを添
加し、再び、 14,500 r.p.m. （ 18,000 × g ）、４
℃で５分間遠心分離した。沈殿を減圧乾燥後、４０μｌ
のＴＥに溶解したものを全ＲＮＡとした。
中で、凍結保存菌体３ｇを粉状になるまで粉砕した。こ
れをグアニジン・チオシアネート溶液（４Ｍ グアニジ
ンチオシアネート（フルカ社製）、４％（ｗ／ｖ）ザル
コシル（シグマ社製）、０．１％（ｗ／ｖ）、アンチフ
ォームＡ（シグマ社製）、２０ｍＭ ＥＤＴＡ・二ナト
リウム、４ｍＭ ２−メルカプトエタノール及び２５ｍ
Ｍクエン酸三ナトリウム（ｐＨ７．０））１５ｍｌで満
たしておいた遠沈管に移し、激しく攪拌後、ポリトロン
・ホモジナイザーを用いて３０秒菌体を破砕した。これ
を 9,000 r.p.m. （ 10,000 × g）、４℃で１５分間遠
心分離した。上清を再び 9,000 r.p.m.（ 10,000 ×
g）、４℃で１５分間遠心分離した。上清７ｍｌを、あ
らかじめ３ｍｌの０．１Ｍ ＥＤＴＡ・二ナトリウムを
含む５．７Ｍ 塩化セシウム溶液を入れておいた超遠心
管（１３ＰＡ；日立工機（株）社製）を静かに重層し、
3,000 r.p.m.（ 4,000 × g ）で１５時間遠心した。
遠心分離後、沈殿を０．３ｍｌ の１ ｍＭ ＥＤＴＡ
・二ナトリウムを含む１０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液
（ pH 8.0 ）（以下、「ＴＥ」という。）に溶解した。
これに３０μｌの３Ｍ酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液（ p
H 5.2 ）、及び 1 ml のエタノールを添加した。これ
を 14,500 r.p.m. （ 18,000 × g ）、４℃で１０分
間遠心分離し、沈殿に８０％（ｖ／ｖ）エタノールを添
加し、再び、 14,500 r.p.m. （ 18,000 × g ）、４
℃で５分間遠心分離した。沈殿を減圧乾燥後、４０μｌ
のＴＥに溶解したものを全ＲＮＡとした。
【０１０１】２）プローブの調製
１０ μｇのプラスミド pSCA205 を１００単位の制限
酵素 PvuII で３７℃、３時間消化後、１％（w/v ）ア
ガロース・ゲルで電気泳動し、0.49 kb の PvuII 断片
を切り出した。この断片を当業者に周知の方法により、
フェノール・クロロフォルム抽出し、エタノール沈殿
後、減圧乾燥した。このＤＮＡ断片 500 ng をニック・
トランスレーション・キット（アマシャム社製）によ
り、32Ｐ−dCTP（6000Ci/mmole）を用いて標識した。標
識後のPvuII 断片（ 0.49 kb ）を２回エタノール沈殿
し、未反応の32Ｐ−dCTPを除去した。この方法により調
製したプローブは、400 μl のＴＥ緩衝液に溶解し、-2
0 ℃で保存した。
酵素 PvuII で３７℃、３時間消化後、１％（w/v ）ア
ガロース・ゲルで電気泳動し、0.49 kb の PvuII 断片
を切り出した。この断片を当業者に周知の方法により、
フェノール・クロロフォルム抽出し、エタノール沈殿
後、減圧乾燥した。このＤＮＡ断片 500 ng をニック・
トランスレーション・キット（アマシャム社製）によ
り、32Ｐ−dCTP（6000Ci/mmole）を用いて標識した。標
識後のPvuII 断片（ 0.49 kb ）を２回エタノール沈殿
し、未反応の32Ｐ−dCTPを除去した。この方法により調
製したプローブは、400 μl のＴＥ緩衝液に溶解し、-2
0 ℃で保存した。
【０１０２】３）ノザン・ハイブリダイゼーション
調製した全ＲＮＡ 10 μg をそれぞれ、0.92 M ホルム
アルデヒド、 8 mM 酢酸ナトリウム、1 mM EDTA を含む
20 mM MOPS （シグマ社製）緩衝液（ pH 7.0）中、1.2
%(w/v) アガロース・ゲルで、１００Ｖ、４時間電気泳
動した。電気泳動後、ゲルを０．１ Ｍ 酢酸アンモニ
ウムに浸して、穏やかに３０分間振とうした。引き続い
て、１Ｍ 酢酸アンモニウムを含む50 mM トリス−塩酸
緩衝液（pH 8.0 ）中でゲルを１時間振とう後、当業者
に周知の方法で、泳動した全ＲＮＡをナイロン・メンン
ブレンに転写した［マニアチスら（1982）「モレキュラ
ー・クローニング・ア・ラボラトリー・マニュアル」コ
ールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・ニュー
ヨーク、"Molecular Cloning-A Laboratory Manual" Co
ld Spring Harbor Laboratory, New York" 参照］。こ
れを80℃で減圧下、２時間焼きつけて、ＲＮＡをナイロ
ン・メンブレンに固定した。その後、ナイロン・メンブ
レンを50%(v/v)ホルムアミド、2.5 ×デンハルト溶液
a) 、100 μg/ml サケ精子ＤＮＡ、0.1%(w/v) ＳＤＳ
を含む 5 × SSPE b)30 ml に浸し、さらに、上記で調
製したＰ−４５０sca-2 の一部をコードする標識ＤＮＡ
断片（ 0.49 kb ）を１００ μｌ 添加して、４２
℃、一晩反応させた。その後、ナイロン・メンブレンを
0.1%(w/v) ＳＤＳを含む 2×SSPE 中で、室温で５分間
２回洗浄し、さらに 0.1%(w/v)ＳＤＳを含む 1×SSPE
中で、55℃、15 分間洗浄した。ナイロン・メンブレンを
風乾後、イメージ・アナライザー BA 100 （富士フィル
ム社製）を用いて、Ｐ−４５０sca-2 遺伝子の約 1.8 k
b のｍＲＮＡの相対的な生成量を測定した。その際、ス
トレプトミセス・リビダンス TK21/pSCA205 株における
ＭＬ２３６−Ｂ・ナトリウム無添加の場合を１として、
他の場合を相対強度で示した。その結果を表２に示す。
アルデヒド、 8 mM 酢酸ナトリウム、1 mM EDTA を含む
20 mM MOPS （シグマ社製）緩衝液（ pH 7.0）中、1.2
%(w/v) アガロース・ゲルで、１００Ｖ、４時間電気泳
動した。電気泳動後、ゲルを０．１ Ｍ 酢酸アンモニ
ウムに浸して、穏やかに３０分間振とうした。引き続い
て、１Ｍ 酢酸アンモニウムを含む50 mM トリス−塩酸
緩衝液（pH 8.0 ）中でゲルを１時間振とう後、当業者
に周知の方法で、泳動した全ＲＮＡをナイロン・メンン
ブレンに転写した［マニアチスら（1982）「モレキュラ
ー・クローニング・ア・ラボラトリー・マニュアル」コ
ールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・ニュー
ヨーク、"Molecular Cloning-A Laboratory Manual" Co
ld Spring Harbor Laboratory, New York" 参照］。こ
れを80℃で減圧下、２時間焼きつけて、ＲＮＡをナイロ
ン・メンブレンに固定した。その後、ナイロン・メンブ
レンを50%(v/v)ホルムアミド、2.5 ×デンハルト溶液
a) 、100 μg/ml サケ精子ＤＮＡ、0.1%(w/v) ＳＤＳ
を含む 5 × SSPE b)30 ml に浸し、さらに、上記で調
製したＰ−４５０sca-2 の一部をコードする標識ＤＮＡ
断片（ 0.49 kb ）を１００ μｌ 添加して、４２
℃、一晩反応させた。その後、ナイロン・メンブレンを
0.1%(w/v) ＳＤＳを含む 2×SSPE 中で、室温で５分間
２回洗浄し、さらに 0.1%(w/v)ＳＤＳを含む 1×SSPE
中で、55℃、15 分間洗浄した。ナイロン・メンブレンを
風乾後、イメージ・アナライザー BA 100 （富士フィル
ム社製）を用いて、Ｐ−４５０sca-2 遺伝子の約 1.8 k
b のｍＲＮＡの相対的な生成量を測定した。その際、ス
トレプトミセス・リビダンス TK21/pSCA205 株における
ＭＬ２３６−Ｂ・ナトリウム無添加の場合を１として、
他の場合を相対強度で示した。その結果を表２に示す。
【０１０３】
【表２】
Ｐ−４５０sca-2 遺伝子のｍＲＮＡの相対生成量
────────────────────────────────────
ストレプトミセス・リビダンス株名 ＭＬ２３６−Ｂ・ナトリウム
無添加 添加
────────────────────────────────────
TK21/ pSCA205 1.0 26
TK21/ pSCA310-△428 株 31 32
TK21/ pSCA310-△320 株 36 31
TK21/ pSCA310-△158 株 4.8 8.9
TK21/ pSCA310-△101 株 7.6 15
TK21/ pSCA310-△74 株 2.2 1.3
────────────────────────────────────
a) １×デンハルト溶液
ウシ血清アルブミン （シグマ社製） 0.2 g/l
フィコール400 （ファルマシア社製） 0.2 g/l
ポリビニルピロリドン （シグマ社製） 0.2 g/l
b) 1 × SSPE
塩化ナトリウム 180 mM
ＥＤＴＡ・二ナトリウム 0.1 mM
リン酸二水素ナトリウム・ニ水和物 18.6 mM
リン酸水素二ナトリウム・十二水和物 101 mM
５’上流非翻訳領域全長 1kb を有するストレプトミセ
ス・リビダンス TK21/pSCA205 株の場合は、プロモータ
ー活性はＭＬ−２３６Ｂ・ナトリウムに依存的だった
が、５’上流非翻訳領域を欠失させたストレプトミセス
・リビダンスTK21/ pSCA310-△428 株またはストレプト
ミセス・リビダンスTK21/ pSCA310-△320株の場合は、
Ｐ−４５０sca-2 遺伝子の転写は構成的となり、ＭＬ−
２３６Ｂ・ナトリウム非存在下でも、強い転写が確認さ
れた。
ス・リビダンス TK21/pSCA205 株の場合は、プロモータ
ー活性はＭＬ−２３６Ｂ・ナトリウムに依存的だった
が、５’上流非翻訳領域を欠失させたストレプトミセス
・リビダンスTK21/ pSCA310-△428 株またはストレプト
ミセス・リビダンスTK21/ pSCA310-△320株の場合は、
Ｐ−４５０sca-2 遺伝子の転写は構成的となり、ＭＬ−
２３６Ｂ・ナトリウム非存在下でも、強い転写が確認さ
れた。
【０１０４】
配列番号： １
配列の長さ： 428
配列の型： 核酸
鎖の数： 二本鎖
トポロジー： 直鎖状
配列の種類： Genomic DNA
ハイポセティカル： No
アンチセンス： No
起源：
生物名： ストレプトミセス・カルボフィラス
株名： ＳＡＮＫ ６２５８５ （ＦＥＲＭ ＢＰ−１
１４５） 配列： CAGCAGGACC AGGACGTCGC CGCGCAGTTC GCCGGTATCG GGGAGGTCGA CCTCGGAGAT 60 CTTCCCCAAC CGGCAGGCGT CGACCACGAG TTGGGCCCGG CTCGGCCACC TGCGGTAGAC 120 CGCCGCCTTT CCCGTGCGGG CCCGGACCGC CACCCGCTCC ATGGTGAGCG AGGCGTAACC 180 CACCTCGCCG AGCTCGTCCA AAGTCGCCAG CAGAATGGCG CTTTCCAGTT CCTCGCCGCG 240 ACGACGCGGG CCTTTGCGGT GGTCAAGGGG TGGTTCGGTG GCCGGTTCCG TGGCCGGTTC 300 GGCACTGTTG GGCACCCCTG CCTCCCGTGT CTGTCGCATA GGGGCCGTTG CGTTCTTCCG 360 GGTGGACAGC CTAGCCTCCA ACTTAGAGAA CAGTCCGTTC TTTAACGTCT GAGGTTTCGA 420 GGGTTTCG 428 配列番号： ２ 配列の長さ： 22 配列の型： 核酸 鎖の数： 一本鎖 トポロジー： 直鎖状 配列の種類： 他の核酸（Synthetic DNA ） ハイポセティカル： No アンチセンス： No 配列： GATCTAAGCT TGAATTCGCA TG 22 配列番号： ３ 配列の長さ： 14 配列の型： 核酸 鎖の数： 一本鎖 トポロジー： 直鎖状 配列の種類： 他の核酸（Synthetic DNA ） ハイポセティカル： No アンチセンス： No 配列： CGAATTCAAG CTTA 14
１４５） 配列： CAGCAGGACC AGGACGTCGC CGCGCAGTTC GCCGGTATCG GGGAGGTCGA CCTCGGAGAT 60 CTTCCCCAAC CGGCAGGCGT CGACCACGAG TTGGGCCCGG CTCGGCCACC TGCGGTAGAC 120 CGCCGCCTTT CCCGTGCGGG CCCGGACCGC CACCCGCTCC ATGGTGAGCG AGGCGTAACC 180 CACCTCGCCG AGCTCGTCCA AAGTCGCCAG CAGAATGGCG CTTTCCAGTT CCTCGCCGCG 240 ACGACGCGGG CCTTTGCGGT GGTCAAGGGG TGGTTCGGTG GCCGGTTCCG TGGCCGGTTC 300 GGCACTGTTG GGCACCCCTG CCTCCCGTGT CTGTCGCATA GGGGCCGTTG CGTTCTTCCG 360 GGTGGACAGC CTAGCCTCCA ACTTAGAGAA CAGTCCGTTC TTTAACGTCT GAGGTTTCGA 420 GGGTTTCG 428 配列番号： ２ 配列の長さ： 22 配列の型： 核酸 鎖の数： 一本鎖 トポロジー： 直鎖状 配列の種類： 他の核酸（Synthetic DNA ） ハイポセティカル： No アンチセンス： No 配列： GATCTAAGCT TGAATTCGCA TG 22 配列番号： ３ 配列の長さ： 14 配列の型： 核酸 鎖の数： 一本鎖 トポロジー： 直鎖状 配列の種類： 他の核酸（Synthetic DNA ） ハイポセティカル： No アンチセンス： No 配列： CGAATTCAAG CTTA 14
【０１０５】
【発明の効果】以上のごとく、本発明のＤＮＡを利用す
ることにより、宿主微生物に所望のポリペプチドを産生
させることが可能になった。さらに、放線菌ストレプト
ミセス・リビダンスＴＫ２１株にシトクロムＰ−４５０
sca-2 遺伝子を発現させることにより、高脂血症治療薬
プラバスタチンナトリウムを効率よく製造する微生物を
得ることが可能となった。
ることにより、宿主微生物に所望のポリペプチドを産生
させることが可能になった。さらに、放線菌ストレプト
ミセス・リビダンスＴＫ２１株にシトクロムＰ−４５０
sca-2 遺伝子を発現させることにより、高脂血症治療薬
プラバスタチンナトリウムを効率よく製造する微生物を
得ることが可能となった。
【図１】プラスミドｐＳＣＡ３１０−Δ４２８の構築図
【図２】プラスミドｐＳＣＡ３１０−Δ３２０、ｐＳＣ
Ａ３１０−Δ１５８、ｐＳＣＡ３１０−Δ１０１、ｐＳ
ＣＡ３１０−Δ７４の構築図
Ａ３１０−Δ１５８、ｐＳＣＡ３１０−Δ１０１、ｐＳ
ＣＡ３１０−Δ７４の構築図
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ
// Ａ６１Ｋ 31/235 Ａ６１Ｐ 3/06
Ａ６１Ｐ 3/06 Ｃ１２Ｒ 1:465
(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ
Ｃ１２Ｒ 1:465）
(Ｃ１２Ｎ 9/02
Ｃ１２Ｒ 1:465）
(Ｃ１２Ｐ 7/62
Ｃ１２Ｒ 1:465）
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
C12N 15/00 - 15/90
ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ
ｅｎｅＳｅｑ
ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ)
Claims (15)
- 【請求項１】転写プロモーター活性を有し、配列表の配
列番号１に示されるヌクレオチド配列の一部から成るＤ
ＮＡであって、少なくとも配列表の配列番号１に示され
るヌクレオチド配列のヌクレオチド番号１０９から４２
８のヌクレオチドから成る配列を含み、基質誘導に従わ
ないＤＮＡ。 - 【請求項２】ストレプトミセス・カルボフィラスに属す
る菌株の少なくともひとつで転写プロモーター活性を有
する、請求項１記載のＤＮＡ。 - 【請求項３】ストレプトミセス・リビダンスに属する菌
株の少なくともひとつで転写プロモーター活性を有す
る、請求項１記載のＤＮＡ。 - 【請求項４】配列表の配列番号１に示されるヌクレオチ
ド配列に含まれる連続する配列を含むことから成り、該
配列のヌクレオチド番号４２８のヌクレオチドを開始点
として５’方向へ連続することを特徴とする請求項１乃
至３のいずれかひとつに記載のＤＮＡ。 - 【請求項５】配列表の配列番号１に示されるヌクレオチ
ド配列のヌクレオチド番号１から４２８のヌクレオチド
から成る、請求項１記載のＤＮＡ。 - 【請求項６】配列表の配列番号１に示されるヌクレオチ
ド配列のヌクレオチド番号１０９から４２８のヌクレオ
チドから成る、請求項１記載のＤＮＡ。 - 【請求項７】ストレプトミセス・リビダンスＳＡＮＫ６
２７９５株（ＦＥＲＭ ＢＰ−５２９９）から得られ
る、請求項１記載のＤＮＡ。 - 【請求項８】請求項１乃至７のいずれかひとつに記載の
ＤＮＡ、および該ＤＮＡの制御下に所望のポリペプチド
をコードするＤＮＡを含むことから成り、宿主細胞内で
該所望のポリペプチドを産生させることを特徴とする組
換えＤＮＡベクター。 - 【請求項９】請求項１乃至７のいずれかひとつに記載の
ＤＮＡ、および該ＤＮＡの制御下にシトクロムＰ−４５
０sca-2 をコードするＤＮＡを含むことから成り、宿主
細胞内でシトクロムＰ−４５０sca-2 を産生させること
を特徴とする請求項８記載の組換えＤＮＡベクター。 - 【請求項１０】請求項８または９に記載の組換えＤＮＡ
ベクターにより形質転換された宿主細胞。 - 【請求項１１】放線菌であることを特徴とする、請求項
１０記載の宿主細胞。 - 【請求項１２】組み換えベクターｐＳＣＡ３１０−Δ４
２８を含む形質転換放線菌株ストレプトミセス・リビダ
ンス ＳＡＮＫ ６２７９５（ＦＥＲＭ ＢＰ−５２９
９）。 - 【請求項１３】請求項８または９に記載の組換えＤＮＡ
ベクターにより形質転換された宿主細胞を、該ベクター
中に含まれるＤＮＡによりコードされた所望のポリペプ
チドの産生が可能な条件下で培養して該所望のポリペプ
チドを産生させ、次いで、該所望のポリペプチドを回収
することを特徴とする、該所望のポリペプチドの製造方
法。 - 【請求項１４】請求項９記載の組換えＤＮＡベクターに
より形質転換された放線菌ストレプトミセス・リビダン
スＴＫ２１株を、該ベクター中に含まれるＤＮＡにより
コードされるシトクロムＰ−４５０sca-2 の産生が可能
な条件下で、ＭＬ−２３６Ｂ・ナトリウムを含む培地中
で培養し、該形質転換体が産生するシトクロムＰ−４５
０sca-2 の触媒作用により該形質転換体細胞内において
ＭＬ−２３６Ｂ・ナトリウムをプラバスタチン・ナトリ
ウムに変換させ、次いで、該形質転換体細胞および／ま
たは培地よりプラバスタチン・ナトリウムを回収するこ
とを特徴とする、プラバスタチン・ナトリウムの製造方
法。 - 【請求項１５】形質転換された放線菌株がストレプトミ
セス・リビダンス ＳＡＮＫ ６２７９５（ＦＥＲＭ
ＢＰ−５２９９）である、請求項１４記載のプラバスタ
チン・ナトリウムの製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP31774596A JP3526708B2 (ja) | 1995-11-29 | 1996-11-28 | 放線菌プロモーター |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7-310247 | 1995-11-29 | ||
| JP31024795 | 1995-11-29 | ||
| JP31774596A JP3526708B2 (ja) | 1995-11-29 | 1996-11-28 | 放線菌プロモーター |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
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1996
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