JP2004275177A - 糸状菌を用いたタンパク質の効率的製造法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 本発明によれば、アスペルギルス・オリゼ(Aspergillus oryzae)由来の特定の非翻訳リーダー配列を用いることにより翻訳効率を増加させることが可能となり、発現効率の高い糸状菌用発現ベクターが提供される。これにより、種々の有用タンパク質をより効率的に大量製造することができる。
【選択図】なし
Description
(1)以下の(a)〜(d)のいずれかに記載の塩基配列を含むDNA:
(a)配列番号1〜4のいずれかに記載のアスペルギルス・オリゼ由来の非翻訳リーダー配列であって、その下流に置かれた目的のポリペプチドをコードするDNA配列の翻訳効率を増加させる機能を有する塩基配列
(b)配列番号1〜4に記載のいずれかの塩基配列において、1もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列であって、その下流に置かれた目的のポリペプチドをコードするDNA配列の翻訳効率を増加させる機能を有する塩基配列
(c)配列番号1〜4に記載のいずれかの塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつその下流に置かれた目的のポリペプチドをコードするDNA配列の翻訳効率を増加させる機能を有する塩基配列
(d)配列番号1〜4に記載のいずれかの塩基配列からなるDNAに対して少なくとも90%の相同性を有する塩基配列であって、その下流に置かれた目的のポリペプチドをコードするDNA配列の翻訳効率を増加させる機能を有する塩基配列、
(2)以下の(a)〜(d)のいずれかに記載の塩基配列を含むDNA:
(a)配列番号5〜8のいずれかに記載のアスペルギルス・オリゼ由来の非翻訳リーダー配列であって、その下流に置かれた目的のポリペプチドをコードするDNA配列の翻訳効率を増加させる機能を有する塩基配列
(b)配列番号5〜8に記載のいずれかの塩基配列において、1もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列であって、その下流に置かれた目的のポリペプチドをコードするDNA配列の翻訳効率を増加させる機能を有する塩基配列
(c)配列番号5〜8に記載のいずれかの塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつその下流に置かれた目的のポリペプチドをコードするDNA配列の翻訳効率を増加させる機能を有する塩基配列、
(d)配列番号5〜8に記載のいずれかの塩基配列からなるDNAに対して少なくとも90%の相同性を有する塩基配列であって、その下流に置かれた目的のポリペプチドをコードするDNA配列の翻訳効率を増加させる機能を有する塩基配列
(3)糸状菌細胞内において機能しうるプロモーター領域と、目的のポリペプチドをコードするDNA配列の間の非翻訳領域に(1)又は(2)記載の配列を含有することを特徴とする発現ベクター、
(4)プロモーターが、P-No8142であることを特徴とする、(3)記載の発現ベクター、
(5)目的のポリペプチドをコードするDNA配列が、βグルクロニダーゼ(GUS)をコードするuidA遺伝子であることを特徴とする(3)又は(4)に記載の発現ベクター、
(6)(3)〜(5)のいずれか1項に記載の発現ベクターを糸状菌に導入して得られた形質転換体、ならびに
(7)(6)に記載の形質転換体を利用することによるポリペプチドの製造法を提供する。
本発明発明者らは、配列番号1〜4に示す塩基配列(図3Bの配列の二重下線部に相当)を、非常に高い翻訳効率を示す新規5’UTR配列として新たに同定した。すなわち、本発明発明者らは、5’UTR領域に配列番号1〜4に示す配列を含有する発現ベクターを導入した形質転換体のβグルクロニダーゼ(GUS)活性は、これらの配列を含まない、GUS遺伝子(uidA)が元来有する大腸菌由来の5’UTR配列(pBI221由来の配列)を含有するコントロールベクター(pNANG8142)を導入した形質転換体のGUS活性に比べ2〜4倍増加することを見出した(図5参照)。これにより、糸状菌宿主において翻訳効率の高い5’UTR配列を提供するに至った。これらの配列は、1もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された配列であっても、同一条件下で配列番号1〜4のいずれかに示す塩基配列と同等の翻訳効率を保持するかぎり本発明に使用することができる。また、配列番号1〜4のいずれかの塩基配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列であって、かつ、同一条件下でこれらの配列と同等の翻訳効率を保持するかぎり本発明に使用することができる。さらに配列番号1〜4のいずれかの塩基配列に対して、通常には少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、さらに好ましくは少なくとも90%(例えば少なくとも95%)の相同性を有する塩基配列であって、同一条件下にて、これらの配列と同等の翻訳効率を保持するかぎり本発明に使用することができる。当業者は、これらの塩基配列を有するDNAを、適当な方法を用いて選択、取得あるいは製造することができ、使用することができる。
以下の(a)〜(d)のいずれかに記載の塩基配列を含むDNA:
(a)配列番号1〜4のいずれかに記載のアスペルギルス・オリゼ由来の非翻訳リーダー配列であって、その下流に置かれた目的のポリペプチドをコードするDNA配列の翻訳効率を増加させる機能を有する塩基配列
(b)配列番号1〜4に記載のいずれかの塩基配列において、1もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列であって、その下流に置かれた目的のポリペプチドをコードするDNA配列の翻訳効率を増加させる機能を有する塩基配列
(c)配列番号1〜4に記載のいずれかの塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつその下流に置かれた目的のポリペプチドをコードするDNA配列の翻訳効率を増加させる機能を有する塩基配列
(d)配列番号1〜4に記載のいずれかの塩基配列からなるDNAに対して少なくとも90%の相同性を有する塩基配列であって、その下流に置かれた目的のポリペプチドをコードするDNA配列の翻訳効率を増加させる機能を有する塩基配列
を提供するものである。
糸状菌において、タンパク質の発現は、培養条件などの環境因子に応じて多段階で制御されている。しかし、細胞にとって重要なタンパク質、大量に生産されるタンパク質は、多くの場合、遺伝子の転写、翻訳、翻訳後修飾、他すべての制御段階が効率的に進んでいることが予想される。そこで、翻訳を効率的に開始することのできる5’UTRを取得するために、糸状菌で元来高発現している遺伝子からの取得を考え、ESTデータを利用することとした。すなわち、アスペルギルス・オリゼのESTデータよりさまざまな培養条件下で高発現している遺伝子を選抜し、その推定5’UTR配列を取得した。具体的には、液体培養(富栄養、グルコース)条件下で高発現していた既知遺伝子であるエノラーゼ遺伝子(enoA:the GenBank, EMBL and DDBJ Nucleotide Sequence Database accession No.D63941)、フルクトースビスリン酸アルドラーゼ遺伝子(fbaA:the GenBank, EMBL and DDBJ Nucleotide Sequence Database accession No.AB032272)、液体培養(貧栄養、炭素源なし)条件下で高発現していた機能未知遺伝子(h1)、液体培養(富栄養、グルコース、高温)条件下で高発現していた機能未知遺伝子(k2)、以上4遺伝子について推定5’UTR配列を取得した(それぞれ、配列表の配列番号1〜4に対応する)。なお、ここで言う「機能未知遺伝子」とは既知遺伝子データベース中に高いホモロジーを示す遺伝子が存在しないことを示す。また、「推定5’UTR配列」とはESTデータから得られる配列であって、推定される開始コドンより上流部分の配列をいうものとする。
上記方法により検討した結果、配列番号1〜4に示す配列(図3Bに示す配列の二重下線部に相当)がいずれも高い翻訳効率を示すことを見出した。
以下の(a)〜(d)のいずれかに記載の塩基配列を含むDNA:
(a)配列番号5〜8のいずれかに記載のアスペルギルス・オリゼ由来の非翻訳リーダー配列であって、その下流に置かれた目的のポリペプチドをコードするDNA配列の翻訳効率を増加させる機能を有する塩基配列
(b)配列番号5〜8に記載のいずれかの塩基配列において、1もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列であって、その下流に置かれた目的のポリペプチドをコードするDNA配列の翻訳効率を増加させる機能を有する塩基配列
(c)配列番号5〜8に記載のいずれかの塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつその下流に置かれた目的のポリペプチドをコードするDNA配列の翻訳効率を増加させる機能を有する塩基配列
(d)配列番号5〜8に記載のいずれかの塩基配列からなるDNAに対して少なくとも90%の相同性を有する塩基配列であって、その下流に置かれた目的のポリペプチドをコードするDNA配列の翻訳効率を増加させる機能を有する塩基配列
を提供するものである。
生物は、様々な外的刺激(ストレス)に対応するため多様な応答機構を備えており、ストレス応答として知られている。ストレス応答は、細菌から高等動植物まで極めて一般的かつ普遍的な機構であり、細胞あるいは生物個体の生存にとって必須の応答であると考えられる。代表的なストレス応答として熱ショック応答が挙げられる。これは、細胞が高温状態にさらされたとき、その危機的状況から細胞を守るために必要な一群のタンパク質「熱ショックタンパク質(HSP)」が転写レベルで誘導され、生合成される機構である。また、熱ショックタンパク質は高温だけでなく、各種の物理化学的ストレス(圧力、紫外線、重金属イオン、酸素濃度など)によっても発現が誘導され、これらストレスによりダメージを受けた(変性した)タンパク質の高次構造を修復する機能を保持していることから分子シャペロンとも呼ばれる。このように、熱ショックタンパク質は細胞の生存のために重要な役割を担っており、外部環境の変化に応じてすばやく生合成されなければならない。つまり、これらのタンパク質の生合成は転写誘導以降のプロセスも効率的に進行していることが予想される。このような観点から、翻訳を効率的に開始することのできる5'UTRの取得源として熱ショックタンパク質遺伝子に注目した。すなわち、他起源の糸状菌において既にクローニングされている熱ショックタンパク質遺伝子と相同性の高い遺伝子をアスペルギルス・オリゼのESTデータより抽出し、その推定5'UTR配列を取得した。具体的には、Aspergillus nidulans のシャペロン/熱ショックタンパク質遺伝子(Awh11)、おなじくAspergillus nidulans のHSP30遺伝子(hsp30)、Neurospora crassa のHSP70遺伝子(hsp70)、Aspergillus niger のtigA、以上4遺伝子と相同性の高い遺伝子についてその推定5'UTR配列を取得した。「推定5'UTR配列」とはESTデータから得られる配列であって、推定される開始コドンより上流部分の配列をいうものとする。また、開始コドンの推定は、既知遺伝子のフレーム(アミノ酸配列の読み枠)を参考にして行った。5’UTR配列を取得する方法の一例としては、前記PCR法が挙げられるがそれ以外の方法であっても当業者は適宜使用することができる。
上記方法により検討した結果、配列番号5〜8に示す配列(図7Bに示す配列の二重下線部に相当)がいずれも非常に高い翻訳効率を示すことを見出した。当業者は上記の5’UTRの翻訳効率の評価法を適宜変更・修飾して用いることができる。
コントロールベクターpNANG8142(下記参照)の5’UTR領域において、3’側の一部分(pBI221由来の配列)を、アスペルギルス・オリゼ由来の各種5’UTR配列(配列番号1〜4)に置換したベクターを用いてGUS発現量を比較し、置換効果を調べた。
糸状菌用高発現ベクターpNAN8142(図1)のマルチクローニングサイト(MCS)を利用し、大腸菌のβグルクロニダーゼ(GUS)遺伝子uidA、およびuidAが元来有する5’UTR配列(pBI221由来の配列)を導入したコントロールベクターpNANG8142(図2)を構築した。
まず、pBI221(クローンテック社)のGUS遺伝子の5’上流のSmaIサイトで消化し、これにSalIリンカーを付けてセルフライゲーションした後、次に3’下流のSacIサイトで消化後、平滑末端化してXbaIリンカーを付け同様にセルフライゲーションしてpBI221-SXを得た。このpBI221-SXからGUS遺伝子を含む約1.9kbのSalI-XbaI断片を切り出し、pNAN8142のマルチクローニングサイトのSalI、XbaIサイトに挿入してGUS発現用コントロールベクターpNANG8142を得た。このベクターにおける5’UTR部分の概要を図3A(配列番号9)に模式的に示す。
アスペルギルス・オリゼのゲノムDNAを常法により調整し、PCR用のテンプレートとした。次にESTデータより選抜した4遺伝子(enoA、fbaA、h1、k2)の推定5’UTR配列について、上流にHindIIIサイトが、下流にGUS遺伝子の一部およびStuIサイトが付加するようにプライマーを設計しPCR反応を行った。下流に付加した配列は5’−ATGTTAAGGCCT−3’(AGGCCT:StuIサイト)となる。得られた増幅産物をHindIII、StuIで消化し以後の操作に用いた。
上記取得5’UTR配列(enoA 5'UTR, fbaA 5'UTR, h1 5'UTR, k2 5'UTR、それぞれ配列番号1、2、3および4)を導入したGUS発現ベクターを以下のように構築した。ここでは、一例としてenoA 遺伝子の5’UTR配列(配列番号1)を導入したベクターpNANG-enoAUTR(図4)の構築方法について示す。
まず、pBI221よりGUS遺伝子の部分領域StuIサイトからSnaBIサイトまでを含む約0.4kbの断片をPCR法により取得した。ここでStuIサイトとは本来のGUS遺伝子が有しないサイトであり、本来のGUS遺伝子の開始コドン以下の下流の配列5’−ATGTTACGTCCT−3’において下線の2塩基をそれぞれC→A、T→Gに置換することにより造成された認識サイト(AGGCCT)である(この塩基置換はGUS遺伝子においてアミノ酸配列の置換を伴わない塩基置換である)。またSnaBIサイトの下流にはXbaIサイトを付加させるようにプライマーを設計しPCRに用いた。この増幅断片をpUC19のSmaIサイトに導入し、pUC-uidA1を得た。次に、実施例1の(2)で得られたenoA遺伝子の5’UTR断片を、HindIII、StuI消化したpUC-uidA1に導入し、pUC-uidA2を得た。次に、実施例1の(1)で得られたpNANG8142をSnaBI、XbaIで消化し、約1.5kbのGUS遺伝子部分断片を切り出し、この断片をSnaBI、XbaI消化したpUC-uidA2に導入することによりpUC-uidA3を得た。次に、pUC-uidA3をHindIII消化後、平滑末端化処理を行い、さらにXbaIで消化することにより、enoA遺伝子の5’UTR配列とGUS遺伝子全長を含む約1.9kbの断片を切り出した。この断片を、XhoI消化後平滑末端化処理を行い、さらにXbaIで消化したpNAN8142に導入することにより、enoA遺伝子の5’UTR配列を含むGUS発現ベクターpNANG-enoAUTRを得た。ここで、平滑末端化処理にはT4DNAポリメラーゼを用いているため、平滑化されたHindIII、XhoI末端のライゲーションにより再びHindIIIサイト(AAGCTT)が造成されている。
なお、他の5’UTR配列を導入したベクターについては、実施例1の(2)で取得したそれぞれの断片を、HindIII、StuI消化によりenoA遺伝子の5’UTR配列部分を除いたpNANG-enoAUTRに導入することにより構築した(pNANG-fbaAUTR、pNANG-h1UTR、pNANG-k2UTR)。これらのベクターの5’UTR部分の概要を図3Bに模式的に示す(配列番号10〜13)。図3Bに示した塩基配列(配列番号10〜13)については実際に解析を行い、確認した。
上述のように得られた5種類のGUS発現ベクター(pNANG8142、pNANG-enoAUTR、pNANG-fbaAUTR、pNANG-h1UTR、pNANG-k2UTR)を用いて、常法(プロトプラスト−PEG法)によりアスペルギルス・オリゼを形質転換し、ベクターが宿主ゲノムのniaD座位に1コピーのみ導入された形質転換体を選択した。形質転換体をデキストリン・ペプトン培地(2%デキストリン、1%ポリペプトン、0.5%KH2PO4、0.05%、MgSO4・7H2O)で30℃、2日間振とう培養後、集菌し、乳鉢を用いて液体窒素中ですりつぶした。この菌体破砕物を緩衝液に懸濁し、遠心分離した上清を粗酵素液とした。得られた粗酵素液のGUS活性を公知の方法(Proc Natl Acad Sci,1986年,第83巻,第22号,p.8447−8451)に準じて測定した。その結果を図5に示す。
本発明の5’UTRのかわりにpBI221の5’UTR配列を有するコントロールベクター(pNANG8142)導入株と比較し、いずれの株においても顕著なGUS活性の上昇が確認された。pNANG-fbaAUTR導入株で約2倍、pNANG-enoAUTR、pNANG-h1UTR、pNANG-k2UTR各導入株においては約4倍の活性上昇を示した。
実施例1の(3)で構築した、アスペルギルス・オリゼ由来の各種非翻訳リーダー配列(5’UTR配列)を導入したGUS発現ベクターの導入株において、顕著なGUS活性の上昇が確認された。しかし、GUS活性の上昇は、翻訳効率の増加以外にも、転写活性を増加させるcis因子がその非翻訳リーダー配列内にあることや、転写産物(mRNA)の安定性が増加したことなどによるmRNA量の増加が原因として考えられる。そこで、mRNA量の確認を目的にノザン解析を行った。
形質転換体を15mlのデキストリン・ペプトン培地で30℃、2日間振とう培養後、ガラスフィルターで集菌し、滅菌水で洗浄した。この菌体を新しいデキストリン・ペプトン培地15mlに移し、さらに30℃で12時間振とう培養後、おなじくガラスフィルターで集菌し滅菌水で洗浄した後、RNAの抽出に用いた。RNAの抽出にはセパゾール RNA I Super(ナカライテスク社)を用いた。得られた総RNA5μgについて、ホルムアルデヒド・アガロースゲル電気泳動を行い、Hybond-N+メンブレン(アマシャムファルマシアバイオテク社)にブロットした後、GUS遺伝子領域をプローブとしたノザン解析を行った。プローブの標識および検出は、AlkPhos Direct System(アマシャムファルマシアバイオテク社) を用いた。
この結果、図6に示すように、いずれの形質転換体においても検出されたシグナルの強さは同等であり、ほぼ同程度のGUS遺伝子のmRNAが蓄積していることが確認された。
このように、各形質転換体のmRNA量に違いは認められず、また、発現するGUSタンパク質はアミノ酸配列において全く同一であることから、取得したアスペルギルス・オリゼ由来の各種非翻訳リーダー配列(5’UTR配列)を導入した形質転換体で確認されたGUS活性の上昇は、翻訳段階で生じており、単位mRNAあたりの翻訳効率が上昇したためであることが示唆された。
コントロールベクターpNANG8142において、プロモーター(P-No8142)の転写開始点下流(3’側)の5’UTR領域の大部分を、アスペルギルス・オリゼ由来の各種5’UTR配列(配列番号5〜8)に置換したベクターを用いてGUS発現量を比較し、置換効果を調べた。
pNANG8142に含まれるプロモーター(P-No8142)領域において、転写開始点より下流の5’UTRに相当する領域(図7Aの点線部分に相当)の大部分を削除した領域を、新たなプロモーター領域(P-No8142d)として取得した。具体的には、pNANG8142(図2)のP-No8142領域(PstI-SalI領域)において、5’端はそのままに、3’端についてはSalIサイト(GTCGAC:図7AのSalIサイトに等しい)から上流(5’側)に107塩基欠失させ、その間の領域について、PCR増幅を行った。なお、増幅断片の下流にはHindIIIサイトが付加するようにプライマーを設計した。得られた増幅産物をPstI、HindIIIで消化し以後の操作に用いた。
ESTデータより抽出した、4種類の熱ショックタンパク質遺伝子ホモログ、Awh11ホモログ(AoAwh11)、hsp30ホモログ(Aohsp30)、hsp70ホモログ(Aohsp70)、tigAホモログ(AotigA)の推定5’UTR配列について、実施例1の(2)に記載した方法と同様、上流にHindIII配列サイトが、下流にGUS遺伝子の一部およびStuIサイトが付加するようにプライマーを設計しPCR反応を行った。得られた増幅産物をHindIII、StuIで消化し以後の操作に用いた。
ここでは、一例としてAwh11ホモログ(AoAwh11)遺伝子の5’UTR配列(配列番号5)を導入したベクターpNANGd-AoAwh11UTR(図8)の構築方法について示す。
まず、実施例2の(1)で得られたP-No8142d断片を、PstI、HindIII消化によりP-No8142断片を取り除いたpNANG-enoAUTR(実施例1の(3)により得られたもの:図4参照)に導入し、pNANGd-enoAUTRを得た。次に、実施例2の(2)で得られたAoAwh11の5’UTR断片を、HindIII、StuI消化によりenoA遺伝子の5’UTR断片を取り除いたpNANGd-enoAUTRに導入し、pNANGd-AoAwh11UTRを得た。pNANGd-AoAwh11UTRではコントロールベクターpNANG8142の5’UTR領域の大部分をAoAwh11の5’UTR配列に置換した構造となっている。なお、他の5’UTR配列を導入したベクターについては、実施例2の(2)で取得したそれぞれの断片を、HindIII、StuI消化によりAoAwh11の5’UTR配列部分を取り除いたpNANGd-AoAwh11UTRに導入することにより構築した(pNANGd-Aohsp30UTR、pNANGd-Aohsp70UTR、pNANGd-AotigAUTR)。これらのベクターの5’UTR部分の概要を図7Bに模式的に示す(配列番号14〜17)。図7Bに示した塩基配列については実際に解析を行い、確認した。
上述のように得られた4種類のGUS発現ベクター(pNANGd-AoAwh11UTR、pNANGd-Aohsp30UTR、pNANGd-Aohsp70UTR、pNANGd-AotigAUTR)を用いて、実施例1の(4)に記載した手順に従い形質転換体を取得し、GUS活性を測定した。その結果を図9に示す。
コントロールベクター(pNANG8142)導入株と比較し、本発明の5’UTR配列を有するGUS発現ベクター導入株では、いずれの株においても顕著なGUS活性の上昇が確認された。pNANGd-Aohsp30UTR導入株で約8倍、pNANGd-Aohsp70UTR導入株で約10倍、pNANGd-AoAwh11UTRおよびpNANGd-AotigAUTR各導入株においては約12倍の活性上昇を示した。
実施例1の(5)に記載した手順に従い、ノザン解析を行った。
この結果、図10に示すように、コントロールベクターpNANG8142導入株、pNANGd-Aohsp30UTR導入株、pNANGd-Aohsp70UTR導入株間ではGUS遺伝子のmRNA量に大きな差は見られず、pNANGd-Aohsp30UTR導入株、pNANGd-Aohsp70UTR導入株で見られた顕著なGUS活性の上昇が翻訳レベルで生じたものであることが確認された。一方、pNANGd-AoAwh11UTR導入株、pNANGd-AotigAUTR導入株ではpNANG8142導入株と比較し、GUS遺伝子mRNA量の増加が観察された。
このことから、用いたAoAwh11およびAotigAの5’UTR配列は、転写を促進させる効果、あるいは生じたmRNAの安定性を増加させる効果を有していると推察された。しかしながら、これらの株で見られたmRNA量の増加はGUS活性の上昇量を説明できる程の顕著な差ではないことから、GUS活性が上昇した主な要因はやはり翻訳レベルにあり、単位mRNAあたりの翻訳効率が上昇したためであることが示唆された。
Claims (7)
- 以下の(a)〜(d)のいずれかに記載の塩基配列を含むDNA:
(a)配列番号1〜4のいずれかに記載のアスペルギルス・オリゼ由来の非翻訳リーダー配列であって、その下流に置かれた目的のポリペプチドをコードするDNA配列の翻訳効率を増加させる機能を有する塩基配列
(b)配列番号1〜4に記載のいずれかの塩基配列において、1もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列であって、その下流に置かれた目的のポリペプチドをコードするDNA配列の翻訳効率を増加させる機能を有する塩基配列
(c)配列番号1〜4に記載のいずれかの塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつその下流に置かれた目的のポリペプチドをコードするDNA配列の翻訳効率を増加させる機能を有する塩基配列
(d)配列番号1〜4に記載のいずれかの塩基配列からなるDNAに対して少なくとも90%の相同性を有する塩基配列であって、その下流に置かれた目的のポリペプチドをコードするDNA配列の翻訳効率を増加させる機能を有する塩基配列。 - 以下の(a)〜(d)のいずれかに記載の塩基配列を含むDNA:
(a)配列番号5〜8のいずれかに記載のアスペルギルス・オリゼ由来の非翻訳リーダー配列であって、その下流に置かれた目的のポリペプチドをコードするDNA配列の翻訳効率を増加させる機能を有する塩基配列
(b)配列番号5〜8に記載のいずれかの塩基配列において、1もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列であって、その下流に置かれた目的のポリペプチドをコードするDNA配列の翻訳効率を増加させる機能を有する塩基配列
(c)配列番号5〜8に記載のいずれかの塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつその下流に置かれた目的のポリペプチドをコードするDNA配列の翻訳効率を増加させる機能を有する塩基配列
(d)配列番号5〜8に記載のいずれかの塩基配列からなるDNAに対して少なくとも90%の相同性を有する塩基配列であって、その下流に置かれた目的のポリペプチドをコードするDNA配列の翻訳効率を増加させる機能を有する塩基配列。 - 糸状菌細胞内において機能しうるプロモーター領域と、目的のポリペプチドをコードするDNA配列の間の非翻訳領域に請求項1又は2記載の配列を含有することを特徴とする発現ベクター。
- プロモーターが、P-No8142であることを特徴とする、請求項3記載の発現ベクター。
- 目的のポリペプチドをコードするDNA配列が、βグルクロニダーゼ(GUS)をコードするuidA遺伝子であることを特徴とする請求項3又は4に記載の発現ベクター。
- 請求項3〜5のいずれか1項に記載の発現ベクターを糸状菌に導入して得られた形質転換体。
- 請求項6に記載の形質転換体を利用することによるポリペプチドの製造法。
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