KR100977446B1 - 분비 스트레스 반응을 조절하는 한세눌라 폴리모르파의신규한 유전자 및 상기 유전자를 이용하여 재조합 단백질의분비 발현 효율을 증가시키는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 분비 스트레스 반응을 조절하는 한세눌라 폴리모르파(Hancenula polymorpha)의 신규 유전자 및 상기 유전자를 이용하여 재조합 단백질의 분비 발현 효율을 증가시키는 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 한세눌라 폴리모르파에서 UPR (Unfolded Protein Response) 기작의 핵심 조절인자인 HpHAC1 유전자와 이에 의한 조절 기작을 규명하고, 이를 조작 및 활용하여 재조합 단백질의 분비 발현 효율을 증가시키는 방법에 관한 것이다.

본 발명에 따르면, 한세눌라 폴리모르파 분비 발현 시스템을 이용하여 산업용 또는 의약용으로 유용한 분비 단백질을 대량생산함으로서, 저렴한 비용으로 대량의 단백질을 생산할 수 있는 경제성을 획득할 수 있다. 따라서, 본 발명은 산업적으로 유용한 동시에 의약용 단백질에 적용할 시, 저렴한 비용으로 의약용 단백질을 생산하여 환자의 경제적 부담을 덜어줌으로서 인류의 보건 복지 향상에도 기여할 수 있다.

효모, 한세눌라 폴리모르파, 분비스트레스, UPR(Unfolded Protein Response), HAC1

Description

분비 스트레스 반응을 조절하는 한세눌라 폴리모르파의 신규한 유전자 및 상기 유전자를 이용하여 재조합 단백질의 분비 발현 효율을 증가시키는 방법{A NOVEL GENE FROM HANCENULA POLYMORPHA CAPABLE OF CONTROLLING UNFOLDED PROTEIN RESPONSE AND METHOD FOR INCREASING EFFECT OF SECRETION USING THE SAME}

도 1은 한세눌라 폴리모르파 (Hansenula polymorpha: H. polymorpha) HpHAC1 유전자의 염기서열 (A)과 역전사 중합효소연쇄반응을 통해서 상기 유전자의 스플라이싱을 확인한 실험결과 및 그 모식도(B)를 나타낸 것이다. 역전사 중합효소연쇄반응 산물을 아가로즈 젤 전기영동을 통해서 크기별로 분리하였으며, 스플라이싱을 통해서 크기가 줄어든 단편의 염기 서열을 분석하였다. 이로부터 HAC1 특이적 스플라이싱 부위를 확인하고, 그 부위을 밑줄로 표시하였다 (A). 상기 스플라이싱을 통해서 바뀌게 되는 스플라이싱 전과 후의 정지 코돈 (stop codon)은 굵은 문자로 각각 표시되었다.

도 2는 한세눌라 폴리모르파 HpHac1 단백질과 사카로마이세스 세레비지애의 ScHac1 단백질의 아미노산 서열의 비교 분석 결과 (A)와 상동성이 높은 부위를 나타낸 모식도 (B)이다.

도 3은 한세눌라 폴리모르파에서 분비 스트레스 해소 반응인 UPR (unfolded protein response)을 유도하는 조건을 탐색한 실험 결과들이다. (A)는 HpHAC1 mRNA의 스플라이싱을 이용하여 분석한 결과이며 (B)는 전통효모인 사카로마이세스 세레비지애에서 발현이 증가한다고 알려진 UPR의 전통 타겟 유전자들에 대응하는 한세눌라 폴리모르파 유전자들 (HpKAR2, HpPDI1, HpERO1)의 발현량 변화 양상을 분석한 것이다. 상기 실험들을 위해서는 지수 성장기에 있는 한세눌라 폴리모르파 야생형 균주를 사용했으며, 최적의 농도로 구해진 5 ug/ml 투니카마이신 (tunicamycin), 5 mM DTT (Dithiothreitol) 및 브레펠딘 (Blefeldin) A를 각각 30분, 60분, 120분 동안 시간별로 처리한 세포들을 회수하여 사용하였다.

도 4는 한세눌라 폴리모르파의 HpHAC1 유전자를 파쇄하기 위한 융합 중합효소연쇄 반응과 세포내 유전자 재조합에 관한 모식도이다.

도 5는 Hphac1 단백질 과발현 세포주를 만들기 위한 과정을 나타낸 모식도이다. 스플라이싱 된 HpHAC1 RNA를 역전사 중합효소연쇄반응을 통해서 증폭하고 이를 유전자 재조합 방법을 이용해서 한세눌라 폴리모르파용 벡터에 클로닝하여 pGAP-HpHAC1s 벡터를 제작하였다. 그리고, 이 벡터를 한세눌라 폴리모르파 균주에 형질전환으로 도입하여 과발현 균주를 제작하였다.

도 6은 한세눌라 폴리모르파 야생형과 HpHAC1 유전자가 파쇄된 HpHAC1Δ 변이주의 성장 특성을 분석한 그림이다. 액체 배양에서는 상기 두 균주를 OD₆₀₀=0.1로 초기 배양을 시작하여 2시간 간격으로 OD₆₀₀을 측정하였다 (A). 또한, 지수 성장기에 있는 상기 두 균주들의 배양액을 10배씩 연속적으로 희석하여 2 ㎕씩 최소 고체배지, 이노시톨(inositol)을 첨가한 최소고체배지, 이노시톨과 투니카마이신을 첨가한 고체배지에 각각 점적한 후 2일간 배양하여 성장 특성을 분석하였다 (B).

도 7은 한세눌라 폴리모르파 야생형 균주와 HpHAC1 유전자가 파쇄된 변이주 (HpHAC1Δ)를 지수성장기(OD₆₀₀=0.5)에서 마이크로어레이(Microarray) 실험을 통해서 전체적인 유전자 발현 양상의 차이를 분석한 그림이다. (A)는 전체적인 마이크로어레이 실험 디자인을 나타낸 모식도이고, (B)는 개별 유전자의 발현 차이를 비교한 산점도 (scatter plot)이다.

도 8은 두 종류의 마이크로어레이 실험을 통해서 Hphac1 단백질이 조절하는 UPR 타겟 유전자들을 선별하는 실험 및 결과의 모식도이다. (A)는 두 종류의 마이크로어레이 실험의 디자인을 나타낸 모식도이고, (B)는 두 실험을 통해서 선별된 HpHAC1이 조절하는 UPR 타겟 유전자들을 효모의 분비 발현 기능에 따라 나누고 그 갯수를 나타낸 모식도이다.

본 발명은 분비 스트레스 반응을 조절하는 한세눌라 폴리모르파(Hancenula polymorpha)의 신규 유전자 및 상기 유전자를 이용하여 재조합 단백질의 분비 발현 효율을 증가시키는 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 한세눌라 폴리모르파에서 UPR (Unfolded Protein Response) 기작의 핵심 조절인자인 HpHAC1 유전자와 이에 의한 조절 기작을 규명하고, 이를 조작 및 활용하여 재조합 단백질의 분비 발현 효율을 증가시키는 방법에 관한 것이다.

효모를 비롯한 모든 진핵세포들은 세균과 같은 원핵세포들과는 달리 소포체 (ER)라고 불리는 세포 내 소기관을 가지고 있어서, 밖으로 분비되는 단백질들이나 세포막 단백질들은 이 기관을 통해서 이동한다. 즉, 세포질이 아닌 외부로 나가는 단백질들은 라이보좀(ribosome)에서 번역되어 나오면서 곧바로 소포체로 전위 (translocation)되는데, 이러한 분비 과정 중에 폴딩이 불완전한 단백질들이 소포체 내에 축적되면 분비 스트레스 (ER stress)가 발생한다. 이렇게 소포체에서 분비 스트레스가 발생하면 이를 인식하여 발생된 분비 스트레스를 해소하려는 UPR이라고 불리는 대응 기작이 작동하게 된다. 이러한 UPR 기작은 진핵 단세포 미생물인 효모에서부터 인간과 같은 고등 생물에 이르는 모든 진핵 세포들에서 발견된다.

효모의 UPR 기작에 관한 게놈 수준에서의 본격적인 연구는 2000년대에 전통효모인 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae)를 대상으로 시작되었으며 (Cell 101, 249, 2000), 이러한 결과들을 바탕으로 조절 및 작용 기작의 규명이 이루어지고 있다 (Cell 107, 103, 2001; Nature 415, 92, 2002).

효모에서의 UPR 기작은 주로 HAC1이라 불리는 전사조절인자에 의해서 조절된다는 사실이 먼저 발견되었으나, 이후 고등생물들에서의 연구가 더욱 활발하게 이루어져 HAC1에 해당하는 XBP1 유전자 외에 ATF6, PERK 같은 다양한 조절인자들이 있다는 사실이 밝혀졌다.

진핵 단세포 미생물인 효모는 고등생물과 동일한 세포내 소기관을 갖추고, 매우 유사한 단백질 분비 기작을 보유하고 있어서 인체 유래 단백질을 발현하기 위한 경제성이 높고 조작이 용이한 재조합 발현 숙주로 각광을 받고 있다. 동물세포 발현 시스템은 복잡한 인체 유래의 당단백질들을 발현하는데 장점이 있으나, 낮은 생산성, 고가의 비용 및 장기간이 소요되는 생산 세포주 개발 기간 등이 큰 단점으로 작용하고 있다. 그리고, 이와 더불어 인간과 비슷하기 때문에 오히려 바이러스와 프라이온의 오염 가능성 등의 위험성을 가지고 있어 문제점으로 작용하고 있다. 이에 비해 효모는 저렴한 비용으로 손쉽게 원하는 재조합 단백질들을 생산할 수 있어서 경제성이 높으며, 거의 인류 문명이 발생한 시점에서부터 발효 과정에 많이 사용되어온 안전성이 입증된 미생물이다. 현재, 대부분의 효모들은 인간에게 안전한 미생물로 (GRAS, Generally Recognized As Safe) 여겨지고 있다.

효모들 중에서는 전통 효모인 사카로마이세스 세레비지애가 오랫동안 생물학 연구 대상이 되어 와서, 현재까지 많은 재조합 단백질의 생산 숙주로 활용되고 있다. 그러나, 산업적으로 활용하는데 있어서 중요한 활성형 단백질을 대량으로 분비 발현하는 능력이 피키아 파스토리스 (Pichia pastoris)나 한세눌라 폴리모르파와 같은 산업용 효모들보다 뒤쳐져서 점차로 분비 발현 숙주로서의 주도권을 잃어가고 있다.

메탄올자화 효모인 한세눌라 폴리모르파는 탁월한 재조합 단백질 분비 발현 숙주로서 최근 들어 큰 각광을 받고 있다. 13.5 g/리터의 경이적인 생산성을 보인 파이타이제 (phytase)의 생산을 비롯하여 의약용으로는 B형 간염 백신의 대량 생산에 성공하여 큰 주목을 받고 있다. 특히, B형 간염 백신의 경우에는 생산 숙주로서 한세눌라 폴리모르파의 경제성 덕분에 제 3세계에 저렴한 비용으로 공급을 하여 전 세계 인류의 보건 복지 증진에도 큰 기여를 하고 있다.

한세눌라 폴리모르파는 산업용 및 의약용 재조합 단백질 대량생산 숙주 시스템으로 이미 국제적으로 인정받고 있어 추후 한세눌라 폴리모르파를 이용한 재조합 단백질 생산 기술의 전망은 매우 높다. 따라서, 한세눌라 폴리모르파의 분비 발현 능력을 더욱 향상시켜서, 인체 유래 의약용 당단백질을 포함하는 고부가가치의 분비 단백질들을 고품질, 고효율로 생산하는 숙주로 개발하는 것은 시장과 산업계가 요구하는 기술이다.

본 발명자들은 지난 10여 년간 한세눌라 폴리모르파를 대상으로 재조합 단백질의 분비 발현을 위한 기초 및 응용 연구를 수행해왔으며, 최근에는 전체 유전체 수준에서 조절 기작을 분석할 수 있는 전체 게놈 마이크로어레이를 자체 제작하였다. 이를 바탕으로 한세눌라 폴리모르파의 분비 발현을 최적화하기 위한 세포 재설계 기술을 완성하기 위한 일환으로 가장 중요한 전사조절 인자인 HpHAC1 유전자를 동정하고, 이의 결손 및 과발현 균주를 만들어 이의 특성을 분석하였다. 그리고 더 나아가 이들을 대상으로 마이크로어레이 실험을 수행하여 분비 스트레스를 해소하는 UPR 기작을 이해할 수 있는 기초를 마련하였으며, 이를 바탕으로 한세눌라 폴리모르파의 분비 발현을 최적화하기 위한 방법들을 제공함으로서 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 서열번호 3으로 기재되는 아미노산 서열 또는 이와 90% 이상의 상동성을 갖고 분비 스트레스 해소 반응에 참여하는 유전자들의 발현을 증가시키는 활성을 나타내는 단백질을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 단백질을 코딩하는 핵산을 제공하는 것이다. 바람직하게는 서열번호 2로 기재되는 코딩 염기 서열을 가지나, 상기 유전자 특이적 스플라이싱이 일어나기 전의 전구체 형태인 서열번호 1의 염기서열 또는 그 단편들을 포함한다.

본 발명의 또 다른 목적은 서열번호 3으로 기재되는 아미노산 서열 또는 이와 90% 이상의 상동성을 갖고 분비 스트레스 해소 반응에 참여하는 유전자들의 발현을 증가시키는 전사인자 활성을 나타내는 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 재조합 벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 벡터로 형질 전환된 대장균 숙주 세포를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 한세눌라 폴리모르파 숙주 세포를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 분비 스트레스 해소 반응에 참여하는 유전자들의 발현을 증가시키는 신규한 전사인자 유전자 HpHAC1을 파쇄 또는 변이시켜 분비 스트레스 반응이 감소된 한세눌라 폴리모르파 변이주를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 HpHAC1 유전자의 상시 발현을 통해 양호한 성장을 보이는 생산 숙주를 개발하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 HpHAC1 유전자의 상시 발현 또는 과발현을 통해서 재조합 단백질의 분비 발현 능력이 향상된 생산 숙주를 제작하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 재조합 단백질의 생산 숙주로 각광받는 한세눌라 폴리모르파의 단백질 분비 발현을 최적화하여 생산성을 높이기 위한 세포 재설계 기술에 관한 것이다.

모든 진핵 세포에서 외부로 분비되는 단백질들은 번역과 동시에 소포체라는 세포내 소기관으로 이동해서 이곳에서 폴딩과 수식 과정이 이루어진다. 따라서,과발현 프로모터 (promoter) 등을 이용해서 재조합 단백질을 대량으로 분비 발현하게 되면, 소포체 내의 폴딩과 수식을 담당하는 단백질들이 처리할 수 있는 용량을 초과해서 들어오는 경우가 자주 발생한다. 이러한 특정 단백질의 과발현 등에 의해서 폴딩이나 수식이 불완전한 단백질들이 소포체 내에 축적되면, 이는 세포에 스트레스로 작용하게 되며 심한 경우 성장 저해나 괴사에 이르기까지 한다.

이와 같이 소포체에 폴딩 또는 수식이 불완전한 단백질들이 쌓여 분비 스트레스가 발생하면 이를 인식하여 UPR (unfolded protein response)이라고 불리는 대응 기작이 작동하여 분비 스트레스를 완화하게 된다.

전통 효모인 사카로마이세스 세레비지애에서는 주로 IRE1이라고 불리는 막단 백질이 폴딩이 불완전한 단백질을 인식하여 핵산분해 (nuclease) 활성이 활성화되면, 유일한 기질로 알려진 전사인자 HAC1의 전구체 mRNA를 절단하게 된다. 이렇게 절단된 HAC1의 mRNA는 tRNA 접합효소(ligase)에 의해 접합되어 HAC1 고유의 특이적 스플라이싱이 일어나고, 비로서 Hac1 단백질이 번역되어 나오게 된다.

본 발명자는 메탄올자화 효모인 한세눌라 폴리모르파 게놈 정보를 토대로 한세눌라 폴리모르파 DL-1 균주(Levine and Cooney, Appl. Microbiol., 26, 982-990)에서 HpHAC1 유전자를 발굴하여 상기 유전자가 분비 스트레스 발생시 HAC1 특이적 스플라이싱 기작을 가진다는 사실을 규명하였다. 이렇게 규명된 HpHAC1의 스플라이싱 된 활성화 mRNA의 염기 서열이 서열번호 2로 기재되었으며, 스플라이싱 되기 전의 전구체 염기 서열이 서열번호 1로 기재되었다.

하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 3으로 기재되는 아미노산 서열 또는 이와 90% 이상의 상동성을 갖고 UPR 반응 경로의 타겟 유전자들의 발현을 증가시키는 활성을 나타내는 단백질을 제공한다.

보통 HAC1 유전자들의 전구체 mRNA는 2차원적인 구조 때문에 단백질을 코딩하는 번역 (translation) 과정이 일어나지 않으며, Ire1 단백질에 의한 스플라이싱 과정이 일어나야만 단백질의 번역이 일어날 수 있다. 따라서, HpHac1 단백질은 스플라이싱 된 후의 염기 서열에 의해서 결정되며, 이렇게 발현된 단백질은 UPR 경로에 있는 일군의 유전자들의 발현을 증가시키는 전사 인자 활성을 갖는다. 본 발명을 통해서 밝혀진 전사인자 활성을 갖는 HpHac1 단백질의 아미노산 서열이 서열번호 3에 기재되었다.

본 발명에 따르면, 한세눌라 폴리모르파의 HpHAC1 전사인자는 HAC1 특이적 스플라이싱을 통해서 서열번호 3으로 기재된 아미노산 서열을 가진다는 것이 확인되었다. 또한, 실시예 5에 기재된 마이크로어레이 실험을 통해서 상기 단백질은 UPR 반응 경로에 있는 타겟 유전자들의 발현을 증가시킨다는 사실도 밝혔다. 따라서, UPR 타겟 유전자들의 발현을 증가시키는 활성을 가지는 한 90% 이상의 상동성을 가지는 단백질 및 이의 단편도 본 발명의 범위에 포함된다.

본 발명에서 사용된 용어 "상동성"이란 야생형 (wild type) 아미노산 서열과의 유사한 정도를 나타내기 위한 것으로서, 본 발명의 HpHac1 단백질을 코딩하는 아미노산 서열과 바람직하게는 75% 이상, 보다 바람직하게는 85% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상 동일할 수 있는 아미노산 서열을 포함한다. 이러한 상동성의 비교는 육안으로나 구입이 용이한 비교 프로그램을 이용하여 수행할 수 있다. 시판되는 컴퓨터 프로그램은 2개 이상의 서열간의 상동성을 백분율(%)로 계산할 수 있으며, 상동성(%)은 인접한 서열에 대해 계산될 수 있다.

본 발명에서 사용된 용어 "UPR 타겟 유전자"란 소포체에서 발생한 분비 스트레스 반응을 해소하기 위하여 발현이 증가되는 유전자들을 지칭하며, 소포체 내에서 단백질의 폴딩과 수식을 도와주어서 분비 효율을 증가시키는 유전자들을 포함한다. 바람직하게는 실시예 5에서 마이크로어레이 실험을 통해서 밝혀진 일군의 유전자들을 포함한다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 단백질을 코딩하는 핵산을 제공한다.

한세눌라 폴리모르파의 HpHac1 단백질을 코딩하는 핵산 서열은 바람직하게는 서열번호 1 또는 2로 기재되는 핵산 서열을 가진다. 서열 번호 1은 비활성형의 전구체 mRNA이고, 분비 스트레스를 받으면 스플라이싱이라고 불리는 절단과 접합이 일어나 서열번호 2의 mRNA로 변환된다. 본 발명자는 실제 단백질 코딩 서열인 서열번호 2로 기재되는 핵산 서열을 가지는 한세눌라 폴리모르파의 HpHAC1 유전자를 GenBank에 기탁번호 제DQ679915호로 기탁하였다. 또한 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터 pGAP-HpHAC1s를 제작한 후 대장균 (Escherichia coli) DH5알파 균주에 형질전환으로 도입하여 2006년 06월 13일에 KCTC (Korean Collection for Type Cultures, 한국 대전광역시 유성구 어은동 52번지 한국생명공학연구원)에 기탁번호 제KCTC10960BP호로 기탁하였다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 서열번호 3으로 기재되는 아미노산 서열 또는 이와 90% 이상의 상동성을 갖고 UPR 타겟 유전자들의 발현을 증가시키는 전사인자 활성을 나타내는 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

이러한 재조합 벡터는 바람직하게는 서열번호 3으로 기재되는 아미노산 서열 또는 이와 90% 이상의 상동성을 갖고 UPR 타겟 유전자들의 발현을 증가시키는 전사인자 활성을 나타내는 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함한다.

본 발명에서 용어, "벡터"는 숙주 세포에 DNA를 도입하고자 하는 통상의 모든 수단을 의미하며, 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파아지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 포함한 통상의 모든 벡터를 포함한다.

적합한 벡터는 프로모터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인해 서 같은 발현 조절 엘리먼트 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 신호서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질 전환된 대장균 숙주세포를 제공하며, 바람직하게는 기탁번호 제KCTC 10960BP호로 기탁된 형질전환된 숙주세포를 제공한다.

또한, 본 발명자는 상기 재조합 벡터를 한세눌라 폴리모르파에도 도입하여 HpHAC1 단백질이 상시 발현되는 형질전환 숙주를 제작하였다. 상기 숙주는 상시 발현되는 HpHAC1 단백질에 의해 UPR 타겟 유전자들의 발현량이 증가하여 분비 발현 능력이 향상되는 특징을 가진다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질 전환된 한세눌라 폴리모르파 숙주 세포를 제공한다.

본 발명자는 한세눌라 폴리모르파의 분비 스트레스 해소 기작인 UPR 반응을 이해하기 위해서 HpHAC1 유전자가 결손된 한세눌라 폴리모르파 변이주 (Hphac1Δ)를 제작하였다. 게놈 상에서 목적한 유전자만의 특이적 불활성화는 당 분야에서 확립된 방법을 통하여 수행할 수 있으며, 방법은 특별히 제한되지 않는다.

본 발명에 있어서, HpHAC1 유전자를 특이적으로 결손 시키기 위하여는 융합 중합효소연쇄 반응과 세포내 상동 재조합 방법(homologous recombination)이 이용될 수 있다. HpHAC1 유전자의 5'-말단과 3'-말단의 절편 사이에 선별 마커를 포함하는 벡터로 한세눌라 폴리모르파를 형질전환시켜 게놈과 벡터사이에 재조합을 유도하였다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 HpHAC1 유전자를 파쇄 또는 변이시켜 분비 스트레스 반응이 감소된 한세눌라 폴리모르파 변이주를 제공한다.

본 발명에 따라 제조된 Hphac1Δ 균주는 기본 복합배지인 YPD에서 배양했을 때 지수성장기 후반부터 안정기에 이르기까지 야생형 균주에 비해 성장이 크게 지연되어 안정기에 늦게 도달하는 성장특성이 확인되었다 (도 5A). 이는 일반적으로 HAC1 결손 효모 균주들이 복합배지에서는 별다른 발현 형질을 보이지 않는 것에 비하면 이례적인 현상이다. 그리고, 전통 효모의 HAC1 결손 변이주들은 이노시톨(inositol)이 없을 때 자라지 못하는 이노시톨 성장 요구성을 나타내나, 한세눌라 폴리모르파 Hphac1Δ 균주는 이노시톨 성장 요구성이 없었다 (도 5B). 이노시톨의 존재 여부와 상관없이 야생형보다 더딘 성장을 하는 것을 고체 배양에서도 확인할 수 있었다. 또한, 당단백질의 당질화를 저해시켜 분비 스트레스를 유발하는 물질인 투니카마이신이 고체 배지에 포함된 경우, 야생형에 비해서 Hphac1Δ 균주의 성장이 크게 방해 받는 것이 확인된다.

상기한 바와 같은 본 발명에 따른 Hphac1Δ 균주가 포도당을 포함하는 복합 영양 배지에서 야생형에 비해서 지수성장기에서 성장이 느린 특성을 나타내는 것은 전통 효모 등에서는 관찰하지 못했던 특성으로, 한세눌라 폴리모르파에서는 HpHac1 단백질이 정상적인 성장 및 분열에서도 중요한 유전자 조절 역할을 수행함을 추론 할 수 있다. 전통 효모에서와 마찬가지로 투니카마이신 또는 DTT 처리 등과 같은 분비 스트레스 조건에서 야생형에 비해 Hphac1Δ 균주의 성장이 보다 저해됨을 관찰할 수 있었다.

본 발명자는 야생형 및 HpHAC1 파쇄 균주를 대상으로 성장의 차이가 나타나기 직전의 지수성장기에서 마이크로어레이 실험을 수행하여 유전체의 발현 양상에 어떠한 차이가 나타나는지를 분석하였다. 야생형에 비해서 Hphac1Δ 균주에서 발현이 감소한 유전자들은 대부분 전사 조절 인자인 HpHac1 단백질에 의해서 조절을 받는 유전자들로 예상되며, 전통 효모에서 UPR 타겟 유전자로 알려진 유전자들이 포함된다. 반면에 야생형에 비해 Hphac1Δ 균주에서 발현이 증가한 유전자들에는 UPR 타겟 유전자들 외의 스트레스 반응 유전자들이 대거 포함되었다. 즉, 분비 스트레스 반응을 완화시켜서 분비 발현 효율을 증가시키는 HpHAC1 유전자의 결손시 일반적인 성장 환경에서도 세포는 스트레스를 받게 된다. 그리고, 이 스트레스를 해소하기 위해서 다른 스트레스 반응 유전자들의 발현량이 대거 증가되는 것이다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 HpHAC1 유전자의 상시 발현을 통해 성장 동안에 발생할 수 있는 분비 스트레스가 해소되어 양호한 성장을 보이는 생산 숙주를 개발하는 방법을 제공한다.

본 발명에서는 한세눌라 폴리모르파 야생형 균주와 상기 Hphac1Δ 변이주를 대상으로 마이크로어레이 실험을 수행하여 HpHac1 단백질이 직접 발현을 조절하는 UPR 타겟 유전자들이 선별되었다. 이러한 유전자 군에는 소포체에서 단백질의 폴딩을 도와주는 샤페론 (chaperone) 및 이황화결합을 도와주는 유전자 (KAR2, ERO1, SCJ1, LHS1, PDI1 등) 등이 포함되고, 당단백질의 당질화를 도와주는 단백질 군이 대거 포함된다. 또한, 단백질의 분비를 위해서 필요한 소포체와 골지체간의 소포 이동과 관련된 유전자들(SEC66, SEC61, SEC31, SEC4, TPM1, VPS29, SEC21, SEC26, RET2)도 포함된다.

상기한 바와 같은 HpHac1 단백질이 발현을 증가시키는 유전자군에 대한 분석 결과는 HpHAC1이 한세눌라 폴리모르파의 분비 발현 효율을 향상시키는 기능이 있다는 사실을 입증하는 것이다. 특히, 분비 능력 향상과 함께 당단백질의 당질화 능력을 향상시킴으로서 고부가가치의 인체 유래 의약용 당단백질의 분비 발현에 적합한 생산 숙주를 만드는데 유용할 것이다. 따라서, HpHac1 단백질의 상시 발현 또는 과발현을 통해서 재조합 단백질의 분비 발현 능력이 향상된 한세눌라 폴리모르파 생산 숙주를 제작할 수 있다.

본 발명에 따라 생산될 수 있는 재조합 단백질은 예를 들어 EPO, 인터페론-알파, 인터페론-베타, 인터페론-감마, G-CSF 등의 사이토카인; VIII 인자, IX 인자, 인간 단백질 C 등의 응집인자; 면역글로블린, Fab, 이중 특이 항체, 단일 사슬 항체, diabody 등의 치료용 항체류, Fc 융합 단백질; 글루코세레브로시데이즈, 알파-갈락토시데이즈, 알파-L-이듀로니데이즈, 알파-글루코시데이즈 등의 효소치료제; 내피성장인자; 성장호르몬 방출인자; 티파노소마크루지 트랜스-시알리다제 (Typanosoma cruzi trans-sialidase); HIV 외피 단백질(HIV envelope protein); 인플루엔자 바이러스 A 헤마글루티닌 (influenza virus A haemagglutinin); 인플루엔자 뉴라미니다제 (influenza neuraminidase); 소의 엔테로카이네이즈 (enterokinase) 활성인자; 소의 포진 바이러스 타입-1 당단백질 D (Bovine herpes virus type-1 glycoprotein D); 인간 안지오스타틴(human angiostatin); 인간 B7-1, B7-2 및 B-7 수용체 CTLA-4; 인간 조직 인자 (human tissue factor); 성장인자 (예를 들면 혈소판-유래 성장인자); 인간 알파-안티트립신 (human alpha-antitrypsin); 조직 플라즈미노겐활성화인자 (tissue plasminogen activator); 플라즈미노겐 활성화인자 억제인자-1(plasminogen activator inhibitor-1); 우로키나제 (urokinase); 플라즈미노겐; 및 트롬빈 등을 포함한다.

본 발명에 따라 생산된 재조합 단백질은 종래기술에서 알려진 일반적인 방법들에 의해 정제될 수 있으며, 정제될 특정 단백질의 특성에 따라 정제방법을 선택할 수 있다. 예를 들면 침전법, 면역흡착법, 분획화법 또는 다양한 크로마토그래피법 등의 정제방법이 있으며, 이에 제한되지는 않는다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 HpHAC1 유전자의 상시 발현 또는 과발현을 통해서 재조합 단백질의 분비발현 능력이 향상된 생산 숙주를 제작하는 방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 실시예에 의거하여 보다 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 목적일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1

한세눌라 폴리모르파 HpHAC1 의 스플라이싱 확인

최근에 완성된 한세눌라 폴리모르파에 대한 유전체 염기서열 데이터베이스(Ramezani-Red et al., FEMS Yeast Res., 4, 207-5, 2003)로부터 사카로마이세스 세레비지애의 UPR 조절 전사인자인 ScHAC1 유전자와 가장 유사성을 보이는 ORF(open reading frame)의 염기서열 정보를 얻을 수 있었으나 (도 1A), 그 유사성이 15% 정도로 매우 낮아 실험을 통해서 이 예측이 맞는지를 확인할 필요가 있었다. 상기 유전자가 실제로 사카로마이세스 세레비지애의 ScHAC1에 대응하는 유전자인지를 확인하기 위해서, 가장 큰 특징인 UPR 조건에서 이 유전자가 특이적(non-conventional) 스플라이싱이 되는지를 역전사 중합효소연쇄반응 (RT-PCR)을 사용해서 확인하였다.

한세눌라 폴리모르파 DL-1 균주 (Levine and Cooney, Appl. Microbiol., 26, 982-990, (1973))에 분비단백질 스트레스 유발 물질인 DTT를 여러 농도로 처리한 후 세포를 회수하여 액체질소에서 급속 냉각시킨 후 -70 ℃에 보관하였다. 그리고, 얼린 세포를 얼음에서 천천히 녹인 후 DEPC (Diethylpyrocabohydrate) 처리한 증류수로 세척한 후, 다음과 같은 방법으로 RNA를 분리 정제하였다. 750 ㎕의 TES (10 mM Tris-Cl pH 7.5, 1 mM EDTA, pH 8.0, 0.5% SDS) 용액을 넣고 같은 양의 산성 페놀-클로로포름을 넣은 후 65℃에서 10 분간 가열하고 10초간 볼텍싱 (vortexing)하는 과정을 번갈아가면서 1시간 동안 반복했다. 다시, 1분간 얼음에서 식힌 후 20초 동안 볼텍싱하고 14,000 rpm으로 15분 동안 상온에서 원심 분리했다. 700 ㎕의 상등액 만을 조심스럽게 새 튜브로 옮기고 같은 양의 산성 페놀-클로로포름을 넣어 잘 섞어주고, 4 ℃에서 14,000rpm으로 5분 동안 원심 분리했다. 다시 600 ㎕ 상등액을 조심스럽게 새 튜브로 옮긴 후, 같은 양의 클로로포름-아이소아밀알콜을 넣어 잘 섞어주고 상기 조건과 동일하게 원심 분리하였다. 최종적으 로 상등액만을 취해 2.5 배 부피의 100% 에탄올과 1/10 부피의 3 M 소듐 아세테이트를 넣어 10 초간 볼텍싱하고 -70 ℃에서 30분 (-20 ℃에서 약 16시간) 동안 보관하였다. 다시, 70% 에탄올로 세척하고, 침전물을 공기 중에서 건조하였다. 마른 침전물을 물에 녹인 후 분리한 RNA의 정량을 위해 OD₂₈₀ 및 OD₂₆₀의 값을 측정하고, 1.2% 아가로즈 젤 전기영동을 통해 순도를 확인하였다. 상기와 같이 추출된 RNA 100 ug을 미국 콰이아젠(Qiagen) 사의 알엔이지 미니 키트 (RNeasy Mini Kit)을 사용하여, 제공된 안내서의 방법에 따라 추가 정제하였다. 최종적으로 회수한 RNA는 위와 동일하게 OD₂₈₀과 OD₂₆₀ 값 및 젤 전기영동 방법으로 농도 및 순도를 확인하였다.

상기와 같은 방법으로 정제한 RNA를 주형으로 역전사 반응을 통해 cDNA를 합성하였고, 다시 이를 주형으로 한 쌍의 프라이머 (HpHAC1-S-for, HaHAC1-S-rev)를 사용하여 중합효소연쇄반응 (Polymerase Chain Reaction; PCR)을 수행하였다 (표 1 참조). 그리고, 중합효소연쇄반응의 생산물은 아가로즈 젤 전기영동을 통해 분석하였으며, 5 mM DTT를 15분간 처리한 샘플에서 HpHAC1 유전자가 스플라이싱 되어서 2개의 밴드로 나타나는 것을 확인할 수 있었다 (도 1B). 아가로스 젤 데이터 옆의 모식도는 HpHAC1이 비활성화형 (HpHAC1 ^u)에서 스플라이싱을 통해 활성화형 (HpHAC1 ⁱ)으로 바뀌는 것을 나타내었다. 확보된 유전자 단편의 염기 서열을 분석하여 HpHAC1의 스플라이싱되는 부위를 확인할 수 있었고, 이 부위는 도 1A에 밑줄로 나타내었다. 주목할 점은 스플라이싱을 통해서 단백질의 C 말단 부위의 아미노산 서열이 변하여 원래 서열과는 다른 서열로 바뀐다. 비활성화형에 있던 정지 코돈 또한 스플라이싱을 통해서 잘려나가고 뒷부분에 있던 새로운 정지 코돈이 이를 대체한다.

상기 실험에서 얻어진 결과를 토대로 스플라이싱된 HpHAC1의 아미노산 서열과 ScHAC1의 아미노산 서열간의 상동성을 웹에서 이용 가능한 소프트웨어 (GENEDOC, http://www.psc.edu/biomed/genedoc)로 분석한 결과, 8%의 동일성(identity)과 15%의 유사성(similarity)을 보여 두 종간에 낮은 상동성이 있다는 것을 알 수 있었다. 그러나, 전사조절인자로써의 중요한 DNA 결합 부위인 염기 모티프 (basic motif) 및 루신 지퍼 (leucine zipper) 부분에 있어서는 68%의 동일성과 77%의 유사성으로 아주 높은 상동성을 보이는 것을 알 수 있었다 (도 2).

실시예 2

한세눌라 폴리모르파에서 UPR(unfold protein response) 유도 조건 탐색

UPR 반응이 유도되었는지는 역전사효소중합 반응(RT-PCR)을 이용하여 HpHAC1 유전자의 스플라이싱 유무(도 3A) 및 전통적인 UPR 타겟 유전자들의 발현량 증가(도 3B)로 확인하였다. 한세눌라 폴리모르파 CBS 4732로부터 유래된 A16 균주를 사용하여 투니카마이신과 같은 당질화 저해제 처리, DTT (Dithiothreitol)에 의한 환원 스트레스 유발 및 브레펠딘 (Blefeldin) A 처리에 의한 단백질의 소포체 이동 방해 등과 같은 다양한 분비 스트레스를 유발하여 어느 정도의 농도들에서 UPR 반응이 일어나는지를 탐색하였다.

우선, 효모의 배양을 위해서는 글루코즈를 주탄소원으로 포함하고 있는 YPD (yeast extract 1%, bacto peptone 2%, glucose 2%) 배지를 주로 사용하였다. 3 ml YPD 배지에 170 rpm으로 37 ℃에서 16 시간 동안 종균 배양한 후, 50 ml YPD 배지에 600 nm에서의 OD (OD₆₀₀)가 0.1이 되도록 접종한 후 같은 조건으로 본 배양하여 OD₆₀₀이 0.3-0.4이 되는 시점에서 세포들을 회수하였다. 이 세포들을 pH 5.4의 YPD 배지와 다양한 농도의 투니카마이신, DTT 및 브레펠딘 A를 포함한 pH 5.4, YPD 배지에 균등하게 분주하여 같은 조건으로 배양하여 30 분, 1 시간, 2 시간이 되는 시점에서 각각의 OD₆₀₀ 값을 측정하고 세포들을 회수하였다. 그리고, 이 세포들로부터 RNA의 추출과 정제 및 역전사 중합효소연쇄 반응은 상기 실시예 1에서와 같은 방법을 사용하여 수행하였다. HpHAC1의 스플라이싱 확인을 위해서는 표 1에 기술된 프라이머 HpHAC1-S-for와 HaHAC1-S-rev를 사용하였으며, 전통적인 UPR 타겟 유전자들의 발현량 확인 실험을 위해서는 표 2에 기술된 프라이머들을 사용하여 중합효소연쇄반응 실험을 수행하였다.

여러 농도별로 투니카마이신, DTT 및 브레펠딘 A를 처리한 시료에서 HpHAC1의 스플라이싱 유무를 확인한 결과 5 ㎍/ml 투니카마이신, 5mM DTT, 5㎍/ml 브레펠딘 A에서 적당한 정도의 HpHAC1 스플라이싱 패턴을 확인할 수 있었다. 시간별 조건 탐색에서는 분비단백질의 당질화를 저해하는 투니카마이신과 단백질의 소포체 유출을 방해하는 브레펠딘 A를 처리한 시료의 경우와 단백질의 이황화결합을 방해하의 분비 스트레스를 유발하는 DTT를 처리한 시료가 다른 양상을 보였다. 투니카마이신과 브레펠딘 A의 경우에는 스플라이싱 패턴이 크게 증가하는 반면, DTT의 경우에는 전반적으로 스플라이싱 정도가 적을 뿐만 아니라 30분에서 제일 높은 스플라이싱 양상을 보이고 시간이 지남에 따라 줄어드는 양상을 관찰할 수 있었다 (도 3A).

전통효모인 사카로마이세스 세르비지애에서 UPR에 의해 발현량이 증가한다고 알려진 타겟 유전자들인 ScKAR2, ScPDI1 및 ScERO1에 대응하는 한세눌라 폴리모르파의 유전자들 (HpKAR2, HpPDI1, HpERO1)에 대해서 반정량 (semi-quantitative) 역전사 중합효소연쇄 반응 실험을 수행하였다. 그리고, 비교를 위한 대조구로 HpACT1에 대해서도 동인한 조건으로 역전사 중합효소연쇄 반응 실험을 수행하였다. 실험결과, HpKAR2, HpERO1 및 HpPDI1 모두 분비 스트레스 반응에 의해서 발현량이 증가하는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 3

HpHAC1 유전자 결손 및 과발현 균주 제작과 특성 분석

HpHAC1 유전자가 파쇄된 한세눌라 폴리모르파 변이주를 제작하기 위해서 융합 중합효소연쇄반응(PCR)과 세포 내 유전자 재조합 (in vivo DNA recombination) 기술을 사용하여 유전자를 파쇄하였다 (Oldenburg et al., Nucleic Acid Res., 25, 451, 1997).

1차 중합효소연쇄반응에서는 표 1에 기술된 네 쌍의 프라이머를 이용하여 LEU2 유전자 (N-말단; LeuN-for, LeuN-rev, C-말단; LeuC-for, LeuC-rev)와 HpHAC1 유전자 (N-말단; HpHAC1-N-for, HpHAC1-N-rev, C-말단; HpHAC1-C-for, HpHAC1-C-rev) 각각의 N-말단과 C-말단을 증폭한 후, 이차 융합 중합효소연쇄반응에서 두 쌍의 프라이머를 이용하여 HpHAC1 유전자의 N-말단과 LEU2 유전자의 N-말단을 연결(HpHAC1-N-for, LeuN-rev)시키고 LEU2 유전자의 C-말단과 HpHAC1 유전자의 C-말단을 연결(LeuC-for, HpHAC1-C-rev)하였다. 확보한 각각의 DNA 조각 두 개를 효모 세포 내로 도입한 후 세포내 유전자 재조합에 의해서 HpHAC1 유전자가 파쇄된 형질전환체를 선별하였다 (도 4). 일차적으로 LEU2 선별 표지로 루신 (Leucin)이 결핍된 최소배지에서 성장하는 형질전환체들을 선별한 후 중합효소 연쇄반응에 의해서 야생형 균주와 다르게 증폭된 DNA 조각을 확인하여 HpHAC1 유전자가 파쇄된 한세눌라 폴리모르파 변이주인 Hphac1Δ (hac1::LEU2) 균주를 제작하였다.

한세눌라 폴리모르파 HpHAC1 유전자가 과발현된 변이주를 제작하기 위해 상기 실시예 1에서 확보된 cDNA를 주형으로 하고, 표 1에 기술된 프라이머 HpHAC1s_for와 HpHAC1s_rev를 사용하여 중합효소 연쇄 반응을 통하여 HpHAC1 유전자를 증폭하였다. 그리고, 상기 HpHAC1 유전자와 LEU2 선별 표지 유전자와 다중복제유전자(HARS)가 포함된 pGAP 벡터에 각각 EcoRI과 HindIII 제한효소를 처리한 후, 이들을 접합(ligation)하고 대장균에 도입하여 클로닝하였다 (도 6). 클로닝 확인은 중합효소연쇄반응 및 염기 서열 분석으로 하였으며, 스플라이싱된 mRNA에 대응하는 cDNA가 포함된 재조합 벡터 pGAP-HpHAC1s를 선별하였다. 그리고, 이렇게 확보된 상기 벡터를 효모 세포내로 도입하였고, LEU2 표지 유전자를 이용해서 루신 (Leucin)이 결핍된 최소배지에서 성장하는 형질전환체들을 선별하였다. 그리고, 이 형질전환체들의 DNA를 추출하고 이를 주형으로 중합효소연쇄반응 실험을 수행해서 HpHAC1 유전자가 도입되어 과발현되는 형질전환체 DL1-H1s 균주를 최종 제작하였다.

실시예 4

한세눌라 폴리모르파 야생형과 HpHAC1 결손 균주의 유전체 발현 양상 분석

상기 실시예 3에서 언급한 바와 같이 HpHAC1 결손 균주는 야생형보다 성장이 느려서 이의 이유에 대한 단서를 찾기 위하여 대표적인 기능유전체 연구 방법인 마이크로어레이(microarray) 실험 방법을 사용하였다. 야생형 균주로는 한세눌라 폴리모르파 DL1 균주에 루신 유전자가 들어간 DL1L 균주를 사용하였으며, HpHAC1 결손 균주 (Hphac1Δ)는 상기 실시예 3에서 제작된 균주를 사용하였다. 포도당을 주탄소원으로 포함하고 있는 복합배지인 YPD에서 배양하다 지수성장기 시점에서 두 균주를 각각 회수하여 이로부터 RNA를 분리 정제해서 전체 전사체의 양 차이를 마이크로어레이를 사용하여 비교 분석하였다 (도 3).

실험 방법을 보다 상세히 설명하면 다음과 같다: 한세눌라 폴리모르파 DL1L과 Hphac1 Δ 균주를 3 ml YPD 배지에 37 ℃, 170 rpm으로 16시간 동안 종균 배양하였다. 그리고, 이를 50 ml YPD 배지에 OD₆₀₀이 0.1이 되도록 균주를 접종한 후, 동일한 조건으로 본 배양하여 성장의 차이가 보이기 이전의 지수 성장기인 OD₆₀₀이 0.5가 되는 시점에서 세포들을 회수하였다. 총 RNA는 상기 회수된 세포들로부터 실시예 1에 기술한 방법과 동일하게 분리 정제하였다.

마이크로어레이 실험을 위한 cDNA의 제조, 하이브리다이제이션 및 형광표지 등에 사용된 모든 시약과 실험은 제니스피어(Genisphere)사의 3DNA^TM 서브마이크로 EX 익스프레션 어레이 검출 키트와 제공된 안내서를 토대로 수행 하였다. 간략히 기술하면, cDNA 합성을 위해서는 총 RNA 70 ug이 사용되었으며 키트에서 제공된 RT 프라이머를 넣고 80℃에서 10분간 반응시켰다. 얼음에서 냉각 후 RNA 분해효소 저해제인 수퍼레이즈-인 (Superase-In^TM)과 RT 버퍼, dNTP 혼합물과 역전사 효소 혼합물을 첨가하여 42 ℃에서 2시간 반응시키고 0.5 M NaOH/50 mM EDTA 3.5 ul을 첨가해 반응을 중지시켰다. DNA/RNA 하이브리드를 변성시키기 위해 65 ℃에서 20분 반응시키고 1M Tris-HCl 완충액(pH 7.5)으로 반응을 중화시켰다. 그리고, 이렇게 얻어진 cDNA 반응물을 콰이아젠(Qiagen)사의 PCR 정제 키트를 사용하여 정제 농축하고, 하이브리다이제이션 버퍼, LNA dT 블록커(blocker)를 첨가하여 80 ℃에서 10분, 50 ℃에서 20분간 반응시키고 어레이 슬라이드에 떨어뜨려 45℃, 18 시간 동안 암반응하였다. 슬라이드를 2 × SSC/0.1% SDS, 2 × SSC, 0.2 × SSC 및 증류수로 씻어 주고 완전히 건조하였다. 다음으로 형광 물질인 3DNA 캡쳐 시약, 하이브리다이제이션 완충액을 혼합하여 80 ℃에서 10분, 50 ℃에서 20분간 반응시키고 이 반응물을 앞의 슬라이드에 떨어뜨려 50 ℃에서 6시간 동안 암반응하였다. 그리고, 앞과 동일한 세척 과정을 거쳐 최종 마이크로어레이 슬라이드를 얻었다.

상기 마이크로어레이 슬라이드를 스캔어레이 (ScanArray) 5000으로 스캐닝하여 어레이 이미지를 확보하였다. 그리고, 상기 이미지를 액손 (Axon)사의 진픽스 (GenePix 4.0) 프로그램을 이용하여, 스팟 발견 (spot finding), 정량 (quantification), 바탕 측정 (background estimation)의 세 단계로 이루어진 이미지 프로세싱 과정을 거쳐서 실험 오차들을 교정하였다. 그리고, 상기 프로그램을 이용하여 발현 차이를 분석하였다.

지수성장기에서 야생형과 Hphac1Δ 균주의 전사체 발현 차이를 분석한 결과, 아직 성장의 차이가 나타나지 않는 시점임에도 다양한 유전자들이 발현량 차이를 보였다 (도 7B). 야생형에 비해 Hphac1Δ 균주에서 발현이 감소한 유전자들은 대부분 전사조절 인자인 HpHac1 단백질에 의해서 조절을 받는 UPR 관련 유전자들로 예상되며, 전통효모에서 UPR의 타겟 유전자로 알려진 유전자들이 대거 포함되었다 (표 2). 보다 자세히 살펴보면, 소포체에서 단백질의 폴딩을 도와주는 샤페론(chaperon) 유전자들 (KAR2, ERO1, SCJ1, LHS1), 당단백질의 당질화와 관련된 유전자들 (OST1, OST4, SWP1, WBP1, STT3, MNN2, MNN9, KTR1, KTR4, PMI40, PMT2, PMT5)과 단백질 분비 관련 유전자들 (ERV41, VIP36, SEC53, YSY6, EMP79)의 발현이 HpHAC1 유전자의 결손 시 감소되었다.

기 능	발현이 감소한 유전자
단백질 폴딩	KAR2, ERO1, SCJ1, LHS1, HAC1
글라이코실레이션	OST1, OST4, STT3, WBP1, SWP1, PMT2, PMT5, PMT40, MNN2, MNN9, KTR1, KTR4
분비( Secretion )	ERV41, VIP36, SEC53, YSY6, EMP70
단백질 분해	CPS1, asparaginase amidase N, YBR139W

야생형에 비해 Hphac1 Δ 균주에서 발현이 증가한 유전자들을 보면, HSP26 , HSP78, HSP12 , HSP10 , HSP42 , HSP104 , HSP60 , DDR48 , SIT1 , STI1 , SIS1 , HSC82와 같은 스트레스 회복에 관련된 HSP (heat shock protein) 계열, 세포내 유전물질이나 단백질 손상을 유도하는 활성산소를 제거하는 유전자들 (SKN7 , SOD2 , HYR1), 단백질의 폴딩을 도와주는 일군의 유전자들 (MTL1, MDJ1, DNAJ, CRP6), 폴딩이 불완전한 단백질을 분해하는 역할을 담당하는 유전자들 (PRB1 , BUL1 , CDC48 , HUL5) 및 일반적인 스트레스 상황에서 세포내 구조체 보호 역할을 하는 트리할로스 (trehalose) 합성과 관련된 유전자들(TPS1, TPS3)의 발현이 증가하는 양상을 보였다 (표 3). 이 결과는 분비 스트레스 반응을 완화시켜주기 위한 유전자들의 발현을 증가시켜주는 HpHAC1 유전자의 결손 시, 일반적인 성장 환경에서도 분비 스트레스를 해소하지 못해서 HpHAC1에 의해서 조절 받지 않는 다른 스트레스 완화 유전자들의 발현이 증가하는 것이라고 추론할 수 있다. 즉, HpHAC1의 결손으로 일군의 분비 스트레스 완화 유전자들이 그 기능을 수행하지 못해서 상대적으로 다른 스트레스 완화 유전자들의 발현이 증가한 것으로 해석할 수 있다.

기 능	발현이 증가한 유전자
스트레스 반응	HSP26, HSP78, HSP12, HSP10, HSP42, HSP104, HSP60, DDR48, SIT1, STI1, SIS1, HSC82
산화 스트레스	SKN7, SOD2, HYR1
트레할로스( Trehalose )	TPS1, TPS3
단백질 분해	PRB1, BUL1, CDC48, HUL5
단백질 폴딩	MTL1, MDJ1, DNA, CRP6
세포벽 ( Cell wall )	DNA4, ECM13, BGL2, GSC2, WSC4, CCW1, CRH1
시그널링 ( Signaling )	MSG5, CMK1
전달 ( Transport )	SIT1, ITR1, AGP2, PMC1, ENB1, TNA1

실시예 5

HpHac1 단백질이 조절하는 UPR 타겟 유전자들의 선별

HpHac1 단백질이 조절하는 UPR 타겟 유전자들을 선별하기 위해서 두 종류의 마이크로어레이 실험을 수행하였다. 먼저, 야생형 균주를 대상으로 지수성장기까지 배양하다 둘로 나누어 한 쪽은 투니카마이신 또는 DTT를 처리한 후 계속 배양하고, 다른 한 쪽은 대조구로서 처리 없이 배양을 하였다. 30분, 60분 및 120분에서 각각 세포들을 회수하여 상기 실시예 4에서 기술한 바와 같이 마이크로어레이 실험을 수행하였다 (도 8A 왼쪽). 두 번째 마이크로어레이 실험에서는 야생형 균주와 Hphac1Δ 균주를 각각 지수성장기까지 배양한 후 두 세포들에 모두 투니카마신 또는 DTT를 처리하여 각각 30분, 60분 및 120분에서 세포들을 회수하여 마이크로어레이 실험을 수행하였다 (도 8A 오른쪽)

첫 번째 마이크로어레이 실험에서는 투니카마이신 또는 DTT 처리 시 발현이 증가하는 모든 유전자들을 선별하여 분비 또는 유사 스트레스에 반응하는 유전자 군을 잡을 수 있었다. 두 번째 마이크로어레이 실험은 분비 스트레스 조건 하에서 야생형과 Hphac1Δ 균주의 유전자 발현 양상의 차이를 비교 분석함으로서 HpHAC1이 직접 조절하는 UPR 타겟 유전자들을 선별하기 위한 것이다. 따라서, 첫 번째 마이크로어레이 실험에서 선별된 전체 유전자 군에서 두 번째 마이크로어레이 실험에서 HpHac1 단백질 의존적으로 발현이 증가하는 유전자 군만을 선별하여 Hphac1 파쇄로 인하여 발생할 수 있는 간접적인 효과들을 제거하였다. 또한, 위의 두 실험에서 모두 단백질의 이황화 결합을 방해하는 DTT와 단백질의 당질화를 저해하는 투니카마이신 처리라는 두 종류의 분비 스트레스를 각각 주었으며, 두 종류의 분비 스트레스 하에서 모두 발현량이 증가하는 유전자들만을 선별함으로서 각각의 처리에 의해서 발생할 수 있는 부반응들을 제거하였다.

상기와 같이 엄격한 기준을 적용하여 HpHac1 단백질에 의해서 조절되는 UPR 타겟 유전자들을 선별하여 표 4에 기술하였다. 이렇게 선별된 유전자들에는 특정 기능의 유전자군들이 주로 포함되었다. 특히, 소포체에서 단백질의 정상적인 폴딩을 도와주는 샤페론 및 이황화결합 형성 유전자들 (KAR2 , ERO1 , SCJ1 , LHS1 , PDI1)과 당단백질의 당질화와 관련된 유전자들 (ALG5 , OPU24 , OST1 , OST2 , OST4 , SWP1 , WBP1, KTR1, OCR5, GPI17, MNN4, MNN10, KTR4)이 대거 포함되었다 (도 8B). 또한, 분비 단백질들을 소포체에서 골지체로 수송하는데 관련된 유전자들 (SEC66, SEC61, SEC31, SEC4, TPM1, VPS29)과 골지체에서 소포체로 소포 (vesicle)를 역수송하는데 관련된 유전자들 (SEC21 , SEC26 , RET2)의 발현도 두드러졌다.

기 능	HpHAC1이 발현을 조절하는 유전자
전위 ( TRANSLOCATION )	SEC66, SEC61
글라이코실레이션 /변성( MODIFICATION )
Core oligosacchride synthesis	ALG5, GPI17, OPU24
Oligosacchryltransferase	OST1, OST2, OST4, SWP1, WBP1
Golgi/O-linked glycosylation	KTR4, KTR1, MNN2, MNN4, MNN10, OCR5,
단백질 폴딩
Chaperones	LHS1, SCJ1, KAR2
Disulfide bond formation	ERO1, PDI1
단백질 분해	아스파라기나제 아미다제 N, CUE1
VESICLE TRAFFICKING / TRANSPORT
Budding (ER-Golgi)	SEC31, SEC4, TPM1, VPS29
Retrieval (Golgi-ER)	SEC21, SEC26, RET2
세포벽 생합성	DCW1
CYTOSKELETON	ARC35, CAP2, ARP2, SLA2, ARC19, ARC15, PAN1

본 발명에서는 한세눌라 폴리모르파 분비 스트레스 해소 반응의 핵심 조절 인자인 HpHAC1 유전자를 동정하고, 실제 HpHAC1 단백질을 코딩할 수 있는 HAC1 특이적 스플라이싱된 mRNA도 동정하고 그 염기서열 또한 규명하였다. 또한, 본 발명에서는 마이크로어레이 실험을 통하여 HpHac1 단백질이 직접 발현을 조절하는 분비 스트레스 해소 반응에 참여하는 유전자들도 규명하였다.

본 발명에 따르면, HpHac1 단백질의 상시 발현 또는 과발현을 통하여 한세눌라 폴리모르파의 분비 발현 능력 및 성장 능력을 향상 시킬 수 있는 방법을 제공할 수 있다.

또한, 본 발명에 따르면, 분비 발현 능력과 성장 능력이 향상된 한세눌라 폴리모르파 생산 숙주를 개발할 수 있다. 이렇게 개발된 한세눌라 폴리모르파 분비 발현 시스템을 이용하여 산업용 또는 의약용으로 유용한 분비 단백질을 대량생산함으로서, 저렴한 비용으로 대량의 단백질을 생산할 수 있는 경제성을 획득할 수 있 다. 따라서, 본 발명은 산업적으로 유용한 동시에 의약용 단백질에 적용할 시, 저렴한 비용으로 의약용 단백질을 생산하여 환자의 경제적 부담을 덜어줌으로서 인류의 보건 복지 향상에도 기여할 수 있다.

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> A NOVEL GENE FROM HANCENULA POLYMORPHA CAPABLE OF CONTROLLING UNFOLDED PROTEIN RESPONSE AND METHOD FOR INCREASING EFFECT OF SECRETION USING THE SAME <130> PA9606-371KR <160> 3 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1197 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HpHAC1 gene <400> 1 atgactgctc tcaacagctc tgtccagcac caagaagtct cttcggactt gccttttgga 60 actctacctc caagaaagcg tgccaagacc gaagaggaga aagagcaaag aagagttgaa 120 agaatcttga gaaacagaag ggcagctcac gcgtctagag aaaagaagag aagacatgtt 180 gagtacctgg aaaactatgt gactgatctg gagtctgcgc tggcgacaca tgagggcaat 240 tatcggaaga tggccaaaat tcaatcgagc ctgatatctc tgttgtctga acatggaatc 300 gattactcgt ctgtggattt agctgttgaa ccatgtccta aagttgaaag accggaaggt 360 ttggagttga ctggttcaat tccagtgaaa aaacagaaaa tcgcctcggc gaaatcgccc 420 aaatcgttat cgagaaaatc gaagtcggaa atcccatcac caagttttga tgagaatatt 480 ttttctgagg aggaaaacga acatgacgat ggtattgagg aatacgggaa agcaggacaa 540 gaagcaaccg aggctccatc cttgtctcac aaccgcaaaa gaaaggcgca agatgcttat 600 atctcgcctc cgggctccac ctccccatcc aagttgaaac ttgaagaaga cgaaaggatc 660 tccaaacatg aatacagtaa cttgtttgat gacaccgatg acattttccc gtcggagaag 720 tcatcaagtc tcgagctgta taaacaggat gatctgacca tggcatcatt tgtgaaacaa 780 gaagaggaag aaatggtgcc atttgtgaaa caggaagacg agttcaagtt tcctgattcg 840 ggtttcaacg ctgacgattg tcatcttatc caagtggaag acctctgctc ttttaatagc 900 gtgcatcatc cagcagtgat gattgtaaag ttatgaaaga ctcaaatgtt tgaagcgatt 960 cagtggaagc aacttgaaat gagactggtt ttttgggtat ttgtttgaca gtctcatctc 1020 aagtatgggt atgagttatt tggttatctt gtgctctgct tctactcgct ttaattgtta 1080 agttggtcag cagcaccatt aacagcagag agtatcgaca accactttga atttgcagca 1140 ccattaacag cagagagtat cgacaaccac tttgaatttg acgactattt gtcttga 1197 <210> 2 <211> 978 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> spliced HpHAC1 gene <400> 2 atgactgctc tcaacagctc tgtccagcac caagaagtct cttcggactt gccttttgga 60 actctacctc caagaaagcg tgccaagacc gaagaggaga aagagcaaag aagagttgaa 120 agaatcttga gaaacagaag ggcagctcac gcgtctagag aaaagaagag aagacatgtt 180 gagtacctgg aaaactatgt gactgatctg gagtctgcgc tggcgacaca tgagggcaat 240 tatcggaaga tggccaaaat tcaatcgagc ctgatatctc tgttgtctga acatggaatc 300 gattactcgt ctgtggattt agctgttgaa ccatgtccta aagttgaaag accggaaggt 360 ttggagttga ctggttcaat tccagtgaaa aaacagaaaa tcgcctcggc gaaatcgccc 420 aaatcgttat cgagaaaatc gaagtcggaa atcccatcac caagttttga tgagaatatt 480 ttttctgagg aggaaaacga acatgacgat ggtattgagg aatacgggaa agcaggacaa 540 gaagcaaccg aggctccatc cttgtctcac aaccgcaaaa gaaaggcgca agatgcttat 600 atctcgcctc cgggctccac ctccccatcc aagttgaaac ttgaagaaga cgaaaggatc 660 tccaaacatg aatacagtaa cttgtttgat gacaccgatg acattttccc gtcggagaag 720 tcatcaagtc tcgagctgta taaacaggat gatctgacca tggcatcatt tgtgaaacaa 780 gaagaggaag aaatggtgcc atttgtgaaa caggaagacg agttcaagtt tcctgattcg 840 ggtttcaacg ctgacgattg tcatcttatc caagtggaag acctctgctc ttttaatagc 900 gtgcatcatc cagcagcagc accattaaca gcagagagta tcgacaacca ctttgaattt 960 gacgactatt tgtcttga 978 <210> 3 <211> 325 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HpHac1 Protein Amino Acid <400> 3 Met Thr Ala Leu Asn Ser Ser Val Gln His Gln Glu Val Ser Ser Asp 1 5 10 15 Leu Pro Phe Gly Thr Leu Pro Pro Arg Lys Arg Ala Lys Thr Glu Glu 20 25 30 Glu Lys Glu Gln Arg Arg Val Glu Arg Ile Leu Arg Asn Arg Arg Ala 35 40 45 Ala His Ala Ser Arg Glu Lys Lys Arg Arg His Val Glu Tyr Leu Glu 50 55 60 Asn Tyr Val Thr Asp Leu Glu Ser Ala Leu Ala Thr His Glu Gly Asn 65 70 75 80 Tyr Arg Lys Met Ala Lys Ile Gln Ser Ser Leu Ile Ser Leu Leu Ser 85 90 95 Glu His Gly Ile Asp Tyr Ser Ser Val Asp Leu Ala Val Glu Pro Cys 100 105 110 Pro Lys Val Glu Arg Pro Glu Gly Leu Glu Leu Thr Gly Ser Ile Pro 115 120 125 Val Lys Lys Gln Lys Ile Ala Ser Ala Lys Ser Pro Lys Ser Leu Ser 130 135 140 Arg Lys Ser Lys Ser Glu Ile Pro Ser Pro Ser Phe Asp Glu Asn Ile 145 150 155 160 Phe Ser Glu Glu Glu Asn Glu His Asp Asp Gly Ile Glu Glu Tyr Gly 165 170 175 Lys Ala Gly Gln Glu Ala Thr Glu Ala Pro Ser Leu Ser His Asn Arg 180 185 190 Lys Arg Lys Ala Gln Asp Ala Tyr Ile Ser Pro Pro Gly Ser Thr Ser 195 200 205 Pro Ser Lys Leu Lys Leu Glu Glu Asp Glu Arg Ile Ser Lys His Glu 210 215 220 Tyr Ser Asn Leu Phe Asp Asp Thr Asp Asp Ile Phe Pro Ser Glu Lys 225 230 235 240 Ser Ser Ser Leu Glu Leu Tyr Lys Gln Asp Asp Leu Thr Met Ala Ser 245 250 255 Phe Val Lys Gln Glu Glu Glu Glu Met Val Pro Phe Val Lys Gln Glu 260 265 270 Asp Glu Phe Lys Phe Pro Asp Ser Gly Phe Asn Ala Asp Asp Cys His 275 280 285 Leu Ile Gln Val Glu Asp Leu Cys Ser Phe Asn Ser Val His His Pro 290 295 300 Ala Ala Ala Pro Leu Thr Ala Glu Ser Ile Asp Asn His Phe Glu Phe 305 310 315 320 Asp Asp Tyr Leu Ser 325

Claims (11)

1. 서열번호 3으로 기재되는 아미노산 서열 또는 이와 90% 이상의 상동성을 갖고 분비 스트레스 해소 반응에 참여하는 유전자들의 발현을 증가시키는 활성을 나타내는 단백질.
2. 제 1항의 단백질을 코딩하는 핵산 또는 그의 절편.
3. 제 2항에 있어서, 서열번호 1 또는 2로 기재되는 뉴클레오타이드 서열을 가지는 핵산 또는 그의 절편.
4. 제 2항의 핵산 또는 그의 절편을 포함하는 재조합 벡터.
5. 서열번호 2로 기재되는 DNA 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
6. 기탁번호 제KCTC 10960BP호로 기탁된 재조합 벡터.
7. 제 4항에 따른 재조합 벡터로 형질전환된 한세눌라 폴리모르파 변이주.
8. 한세눌라 폴리모르파 유래의 전사인자 유전자 HpHAC1을 파쇄 또는 변이시켜 분비 스트레스 반응이 감소된 한세눌라 폴리모르파 변이주.
9. 분비 스트레스 해소 반응에 참여하는 유전자들의 발현을 증가시키는 전사인자 유전자 HpHAC1 (기탁번호 DQ679915).
10. 제 7항 또는 제 8항에 따른 변이주를 이용하는 단계를 포함하는 재조합 단백질의 제조방법.
11. 제 10항에 따른 방법으로 제조되어 수득된 재조합 단백질.

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