KR20040002806A

KR20040002806A - 한세눌라 폴리모르파 앱신 유전자 결손 변이주 및 이를이용한 재조합 단백질 생산 방법

Info

Publication number: KR20040002806A
Application number: KR1020030043017A
Authority: KR
Inventors: 강현아; 이상기; 손민정
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2002-06-29
Filing date: 2003-06-28
Publication date: 2004-01-07
Also published as: US20050239074A1; ATE480624T1; DE60334109D1; WO2004003204A1; US7262287B2; EP1534835A1; KR100496758B1; AU2003237061A8; EP1534835B1; EP1534835A4; AU2003237061A1

Abstract

본 발명은 한세눌라 폴리모르파 앱신1을 암호화하는HpYPS1유전자를 포함한 핵산 분자, 이에 암호화된 폴리펩타이드, 한세눌라 폴리모르파 앱신1을 암호화하는 HpYPS 유전자의 돌연변이로 인해 앱신 활성이 감소된 한세눌라 폴리모르파 변이주, 이 한세눌라 폴리모르파 변이주에 외래단백질을 암호화하는 유전자를 도입하여 제작된 외래 단백질을 발현하는 재조합 한세눌라 폴리모르파 균주, 이 재조합 한세눌라 폴리모르파 균주를 외래 단백질이 발현되도록 하는 조건하에서 배양하고 배양물로부터 외래 단백질을 분리함을 포함하여 외래 단백질을 제조하는 방법에 관한 것이다.

Description

한세눌라 폴리모르파 앱신 유전자 결손 변이주 및 이를 이용한 재조합 단백질 생산 방법 {Hansenula polymorpha yapsin deficient mutant strain and process for the preparation of recombinant proteins using the same}

본 발명은 메탄올자화 효모인 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha)로부터 재조합 단백질의 분해를 효율적으로 방지함으로써 분비 발현된 재조합 단백질을 고효율로 생산하는 방법에 관한 것이다. 보다 바람직하게는, 한세눌라 폴리모르파 균주의 앱신1 유전자를 파쇄시킴으로서 한세눌라 폴리모르파에서 생산된 염기성 또는 이염기성 아미노산 잔기 함유 단백질의 분해를 방지하여 재조합 단백질을 효율적으로 생산하는 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 한세눌라 폴리모르파 아스파틱 프로테아제 계열의 앱신1을 암호화하는HpYPS1유전자를 클로닝하고 이를 활용하여 앱신1 유전자가 파쇄된 한세눌라 폴리모르파 균주를 제작하고, 상기 균주를 숙주로 하는 형질전환체를 배양하여 인체 부갑상선 호르몬, 인체 혈장 알부민, 및 혈장 알부민 융합 단백질과 같은 단백질내에 염기성 또는 이염기성 아미노산 잔기를 갖는 재조합 단백질의 분해를 방지함으로써 완전한 형태의 재조합 단백질을 한세눌라 폴리모르파에서 고수율로 생산하는 방법에 관한 것이다.

최근 난치성 질환의 증가와 국민의료 수준의 향상에 따라 고순도 단백질성 의약품의 수요가 급증하면서 의약용 재조합 단백질이 건강 관련 생명공학 분야에서 차지하는 비중이 매우 높아지고 있다. 이에 따라 의약용 재조합 단백질 대량생산을 위한 숙주 시스템으로 단세포 진핵 미생물인 효모를 이용하는 빈도가 점차로 증가되고 있다. 특히 고등 동물세포와 매우 유사한 단백질 분비 경로를 지녔기에 효모는 인체 유래의 분비 단백질 생산을 위한 미생물 숙주시스템으로 애용되고 있다. 또한 대부분의 효모는 평상시 세포 밖으로 분비하는 단백질 수가 아주 적기 때문에 효모로부터 분비되는 재조합 단백질은 쉽게 회수되고 정제될 수 있는 장점도 있다. 근래에는 전통효모 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae) 외에도 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha)와 피키아 패스토리스(Pichia pastoris)를 필두로 하는 비전통 효모들을 이용한 혈청 단백질, 백신 및 여러 다양한 중요한 의료용 단백질들의 대량생산이 성공적으로 진행되고 있다(Gellissen G., Appl. Microbiol. Biotechnol. 54, 741 (2000)).

진핵 미생물인 효모는 포유동물 세포와 거의 동일한 방법으로 단백질을 분비하며 유사한 단백질 수식 및 절단과정을 갖고 있다. 분비 경로를 거치게 되는 단백질들은 소포체에서 그들의 최종적인 삼차구조를 갖추게 되고 당단백질인 경우 N- 및 O-결합형 당쇄가 부착된다. 추후 골지체로 운송된 단백질들은 올리고당의 첨가 또는 단백질 절단 같은 단백질 수식과정을 좀더 거친 후 여러 기관으로 운송되거나, 세포막의 성분으로 삽입되거나, 또는 세포 밖으로 배출된다. 이와 같이 효모에서의 단백질 분비과정은 여러 종류의 번역 후 수식(post-translational modification) 과정을 포함하고 있어 외래 단백질을 효모에서 분비 생산하고자 할 때 이에 따른 여러 문제점들이 발생될 수 있다. 특히 효모를 이용하여 재조합 단백질을 분비 생산할 때 생산성의 증가를 위해서는 효율적인 발현 및 분비 시스템의 사용은 필수적이지만 생산 분비된 외래단백질의 분해를 방지하는 것도 매우 중요하다. 재조합 효모를 고농도로 발효조에서 장시간 배양할 때 숙주세포로부터 자연적으로 분비되거나 또는 세포 분해(cell lysis)를 통해서 세포내에 존재하는 단백질 분해효소가 배지로 배출되어 생산된 재조합 단백질을 분해하여 전체적인 재조합 단백질의 생산성을 저하하는 문제가 생긴다. 이를 해결하기 위해 사카로마이세스 세레비시애, 한세눌라 폴리모르파, 피키아 패스토리스 등 재조합 단백질 발현시스템으로 개발되고 있는 효모들의 경우 여러 단백질 분해효소 결손 균주들이 개발되고 있는데 일차적으로 효모 액포(vacuole)에 존재하는 분해효소들을 암호화하는 유전자들,PEP4, PRB1, 또는CPY유전자가 파쇄된 균주들이 개발되었다(Alvarez et al., J. Biotechnol. 38, 81 (1994); Chen et al., Curr. Genet. 27, 201 (1995); Gleeson et al., Methods Mol. Biol. 103, 81 (1998); Kang et al. In Hansenula polymorpha (ed. Gellissen G.) p.124 (2001)). 이들 액포 분해효소들 외에도 골지체(Golgi)에 존재하는 카르복시펩티다아제 α를 암호화하는KEX1유전자가 파쇄된kex1△균주가 개발되어 사카로마이세스 세레비시애의 경우에는 히루딘(Hinnen et al., In Gene expression in recombinant microorganisms (ed. Smith A.), p121 (1995)), 한세눌라 폴리모르파의 경우는 인체 표피 성장인자(human epidermalgrowth factor)(Heo et al., Protein expr. purif. 24, 117 (2001)), 피키아 패스토리스의 경우에는 설치류 또는 인체 엔도스타틴(endostatin)의 C-말단 분해가 상당히 감소되는 효과가 있었다(Boehm et al., Yeast 15, 563-567 (1999)).

최근 사카로마이세스 세레비시애에서 단일 또는 쌍으로 존재하는 염기성 아미노산(basic amino acids)을 인지하여 절단하는 활성을 지닌 효모 아스파틱 프로테아제 계통의 앱신(yapsin)이 세포막에 존재하는 새로운 프로테아제로 발견되었다(Egel-Mitani et al., Yeast 6, 127-137 (1990)). 최근 공개된 사카로마이세스 세레비시애 게놈 정보에 의해 효모 아스파틱 프로테아제들 중에서 가장 먼저 알려진 앱신1(yapsin1)[이전에는 yeast aspartic protease 3(YAP3)로 알려짐]과 그 후 발견된 앱신2(기존명 MKC7)(Komano and Fuller, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 7, 92,10752-10756 (1995))외에도 유사한 기능을 갖고 있다고 추측되는 단백질 분해효소로 앱신3, 앱신6 와 앱신7 등 최소한 다섯 가지 이상의 앱신 계통 분해효소들을 암호화하는 유전자들이 존재하는 것으로 보고되었다(Olsen et al. Biochem. J. 339, 407-411 (1999)). 아직 이들 앱신의 생리적 기능에 대해서는 규명되지 않았지만, 앱신의 프로테아제 활성에 의해서 사카로마이세스 세레비시애에서 분비 생산하고자 하는 목적 재조합 단백질이 절단된다는 연구사례에 대한 보고가 증가됨에 따라 앱신 결손 효모 균주가 재조합 단백질, 특히 염기성 아미노산을 지닌 외래 펩타이드 생산을 위해 매우 유용한 균주로 주목을 받고 있다. 현재까지 사카로마이세스 세레비시애에서 분비 생산하고자 했을 때 앱신에 의해 절단되는 문제가 보고된 재조합 단백질로는 인체 혈청 알부민(Kerry-williams et al., Yeast 14, 161-169 (1998)), 인체 부갑상선 호르몬((Kang et al., Appl Microgiol Biotechnol., 50, 187-192 (1998)); 대한민국특허등록 제0246932호(1999년 12월 8일)), 곤충 이뇨 호르몬(Copley et al., Biochem J., 330, 1333-1340 (1998)), 글루카곤 및 글루카곤 유사 펩타이드 (Egel-Mitani et al., Enzyme Microb Technol. 26, 671-677 (2000): 미국특허 6,110,703), 인체 엘라핀 전구체 (Bourbonnais et al., Protein Exp. Purif. 20, 485 (2000))가 알려져 있다. 특히 본 발명자들은YPS1결손 사카로마이세스 세레비시애 균주의 경우 발효조를 이용한 배양 말기에서는 hPTH의 분해가 상당히 진행되므로 이를 방지하기 위해 앱신2와 앱신3에 대한 유전자YPS2과YPS3이 함께 제거된 앱신 다중 결손 사카로마이세스 세레비시에 변이주(yps1△/yps2△/yps3△)를 개발하여 고농도 배양에서 관찰되는 인체 부갑상선 호르몬의 분해를 90% 이상 방지하는 성과를 얻었다(대한민국 특허출원 2000-51267 및 국제출원 PCT/KR01/01447).

메탄올자화 효모인 한세눌라 폴리모르파는 피키아 패스토리스와 더불어 강력하면서도 조절 가능한 프로모터들이 개발되어 있으며 외래 유전자를 숙주 염색체내로 다중 도입하는 장점이 있어 재조합 단백질 대량생산에 매우 유용한 효모 숙주로 각광을 받고 있다(Faber et al., Yeast 11, 1331(1995)). 현재까지 매우 다양한 종류의 많은 외래 단백질들이 발현되었는데, 그 발현 수준은 대부분 발효조를 이용한 고농도 배양시 1 g/L 이상이었고 재조합 파이타제(phytase)의 분비·생산의 경우 13.5 g/L 정도인 것으로 보고되어 이 한세눌라 폴리모르파 발현시스템은 현재 이용 가능한 여러 진핵세포 발현 시스템들 중에서 가장 강력한 시스템의 하나로 부각되고 있다(Mayer et al., Biotechnol. Bioeng. 63, 373-381 (1999)). 특히, 한세눌라 폴리모르파에서 초기에 생산된 재조합 단백질들의 일부는 이미 임상실험을 통과하여 시장에 진출(예, B형 간염 백신)되거나 현재 제품 개발 단계(예, 히루딘)에 있어 의약품으로 개발될 재조합 단백질 대량 생산을 위한 발현시스템으로 한세눌라 폴리모르파가 매우 적합하다고 평가되고 있다(Gellissen G., Appl Microbiol Biotechnol. 54 741-750 (2000)). 또한 최근 포스트 게놈 시대에 들어서 신규 유전자들의 기능 분석을 위한 고효율 발현시스템에 대한 수요의 증가로 인해, 한세눌라 폴리모르파를 이용한 발현 시스템은 고등 진핵세포 유래의 유용 단백질의 대량생산뿐만 아니라 신규 단백질들의 기능 및 구조분석에도 큰 일익을 담당할 것으로 기대된다.

이에 본 발명의 목적은 고효율 한세눌라 폴리모르파 발현시스템 개발을 위한 노력의 일환으로 앱신 계통의 프로테아제에 의해 원하지 않는 재조합 단백질의 절단 및 분해 문제를 해결하기 위해 한세눌라 폴리모르파 앱신1을 암호화하는 유전자HpYPS1을 클로닝하고 이를 활용하여HpYPS1유전자 결손 변이주를 제작하고 이를 재조합 단백질 발현 숙주로 이용하여, 한세눌라 폴리모르파에서 발현되는 재조합 단백질의 절단 및 분해를 방지하여 원형상태의 재조합 단백질을 고효율로 분비 생산하는 기술을 제공하는 것이다.

본 발명은 사카로마이세스 세레비시애에서 확인된 바와 같은 앱신 프로테아제 유전자를 한세눌라 폴리모르파 균주에서 탐색하여 한세눌라 폴리모르파 균주의 앱신1(HpYPS1) 암호화 유전자 서열을 제공한다.

또한, 본 발명은 한세눌라 폴리모르파 균주 유래의 아스파틱 프로테아제 활성을 갖는 앱신1 폴리펩타이드를 제공한다.

또한, 본 발명은 한세눌라 폴리모르파 균주에서 재조합적으로 생산된 외래 단백질의 분비를 위한 HpYPS1 폴리펩타이드의 분비 시그널 유전자 서열 및 펩타이드 서열을 제공한다.

본 발명은 또한, 원형 상태의 재조합 단백질을 고효율로 분비 생산하는 한세눌라 폴리모르파 균주 개발을 위해 상기 언급된 한세눌라 폴리모르파 앱신 프로테아제 유전자를 클로닝하고 이를 파쇄함으로써 한세눌라 폴리모르파에서 일어나는 재조합 단백질의 분해를 극소화함으로써 한세눌라 폴리모르파에서 재조합 단백질을 고효율로 분비·생산하는 발현시스템을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명자들은 한세눌라 폴리모르파 앱신1을 암호화하는 유전자HpYPS1를 클로닝하고 상기 확보된HpYPS1유전자의 기능 분석을 수행한 후HpYPS1유전자가 파쇄된 한세눌라 폴리모르파 변이주(hpyps1△)를 개발하고 이를 인체 부갑상선 호르몬, 인체 혈청 알부민 및 인체 혈청 알부민 융합 단백질을 포함하여 단백질내에 염기성 또는 이염기성 아미노산 잔기를 포함하는 단백질을 발현하는 숙주 균주로 사용하여 한세눌라 폴리모르파에서 발현 분비되는 재조합 단백질의 분해를 현저하게 방지하여 생산성을 증가시키는 방법을 제공한다.

도 1은 한세눌라 폴리모르파 앱신1을 암호화하는 유전자HpYPS1의 염기서열 및 예상되는 아미노산 서열을 나타낸 것이다(① : 신호서열, ② : 예상되는 GPI anchor, ③ : 소수성 아미노산- 골지막 정착 도메인).

도 2는 한세눌라 폴리모르파 앱신1과 사카로마이세스 세레비시애 앱신계통의단백질 분해효소들과 아미노산 서열을 비교한 것이다.

도 3은 한세눌라 폴리모르파 앱신1 유전자HpYPS1가 발현됨에 따라 사카로마이세스 세레비시애 앱신 다중 결손 유전자의 온도 민감성이 회복됨을 보여주는 기능보완(functional complementation) 실험 결과도이다.

도 4은 한세눌라 폴리모르파 앱신1 유전자 파쇄 변이주hpyps1△제작과정에 관한 도식이다.

도 5는 한세눌라 폴리모르파 야생형과 앱신1 유전자 파쇄 변이주인hpyps1△배양액의 단백질 분해 활성을 인체 부갑상선 호르몬을 기질로 사용하여 비교 분석한 결과도이다.

도 6은 한세눌라 폴리모르파용 인체 부갑상선 호르몬 발현 벡터 pMOXhPTH 제작 도식도이다.

도 7A는 발현벡터 pMOXhPTH로 형질전환된 한세눌라 폴리모르파 야생형과 변이주hpyps1△의 염색체를 분리하여 발현벡터 삽입 위치 및 카피수를 측정하기 위한 서던 블럿(Southern blot) 결과이다.

도 7B는 한세눌라 폴리모르파 야생형과 변이주hpyps1△형질전환체에서의 재조합 인체 부갑상선 호르몬의 발현 및 분해 양상을 비교 분석하기 위해 효모 배양액을 SDS-폴리아크릴 아마이드 전기영동한 후 염색한 결과이다.

도 8A는 한세눌라 폴리모르파 야생형과HpYPS1유전자가 파쇄된 변이주hpyps1△를 숙주로 사용하여 재조합 인체 혈장 알부민의 발현 및 분해 양상을 비교 분석한 결과도로서, 효모 배양액을 SDS-폴리아크릴 아마이드 전기영동한 후 염색한 결과이다.

도 8B는 한세눌라 폴리모르파 야생형과HpYPS1유전자가 파쇄된 변이주hpyps1△를 숙주로 사용하여 재조합 인체 혈장 알부민의 발현 및 분해 양상을 비교 분석한 결과도로서, 효모 배양액을 웨스턴 블럿(Western blot)으로 분석한 결과이다.

도 9는 한세눌라 폴리모르파용 알부민-TIMP2 융합단백질 발현 벡터 pYHSA13-T2 제작 도식도이다.

도 10은 한세눌라 폴리모르파 야생형과HpYPS1유전자가 파쇄된 변이주hpyps1△를 숙주로 사용하여 재조합 알부민-TIMP2 융합단백질의 발현 및 분해 양상을 비교 분석한 결과도로서, 효모 배양액을 웨스턴 블럿(Western blot)으로 분석한 결과이다. 이때, 레인 1은 pYHSA12(+)로 형질전환된 야생형 형질전환체, 레인 2 내지 5는 pYHSA13-TIMP2로 형질전환된 야생형 형질전환체, 레인 6 내지 9는 pYHSA13-TIMP2로 형질전환된 야생형 형질전환체 및 레인 10은 분리정제된 알부민 (200 ng)을 나타낸다.

한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha)는 탄소원 및 에너지원으로서 메탄올을 사용할 수 있는 효모이다. 본 발명에서는 한세눌라 폴리모르파 균주를 외래 단백질의 생산 방법에 사용하는 경우 균주내에 존재하는 아스파틱 프로테아제인 앱신 효소가 생산된 외래 단백질을 분해시킴으로써 외래 단백질의 수율이 낮아진다는 사실에 근거하여 앱신 효소가 파쇄된 한세눌라 폴리모르파 변이주를 제공하고자 한다.

본 발명에서 언급되는 바와 같이, 아스파틱 프로테아제의 서브패밀리인 앱신 효소 패밀리는 단백질의 염기성 또는 이염기성 아미노산 잔기에 대한 일반적인 절단 특이성을 갖는다. 이는 소수성 잔기를 절단하는 다른 아스파틱 프로테아제와는 다른 점이다.

본 발명자들은 한세눌라 폴리모르파 유래의 PCR 증폭된 염색체로부터 사카로마이세스 세레비시애 앱신1을 암호화하는 유전자(YPS1)와 유사성을 보이는 단편을 확보하고, 이에 대한 기능 연구를 통해 한세눌라 폴리모르파의HpYPS1유전자임을 확인하였다. 이러한HpYPS1유전자를 파쇄시킨 한세눌라 폴리모르파 변이주를 제작하여 이로부터 제조된 외래 단백질이 고수율로 생산된다는 사실을 확인하고 이로써 본 발명을 완성하였다.

한 가지 관점으로서, 본 발명은 도 1에 도시된 염기 서열을 포함하는 핵산분자를 제공한다.

보다 구체적으로는, 본 발명은 도 1에 도시된 한세눌라 폴리모르파 앱신1을 암호화하는 염기 서열을 포함하는 핵산 분자를 제공한다.

다른 관점으로서, 본 발명은 도 1에 도시된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 제공한다.

보다 구체적으로는, 본 발명은 도 1에 도시된 한세눌라 폴리모르파 앱신1(HpYPS1) 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 제공한다.

또 다른 관점으로서, 본 발명은 한세눌라 폴리모르파 균주에서 재조합적으로 생산된 외래 단백질의 분비를 위한 도 1에서 ①로 도시된 HpYPS1 폴리펩타이드의 분비 시그널 유전자 서열 및 펩타이드 서열을 제공한다.

또 다른 관점으로서, 본 발명은 한세눌라 폴리모르파 앱신1을 암호화하는HpYPS1유전자의 돌연변이로 인해 앱신 활성이 감소된 한세눌라 폴리모르파 변이주를 제공한다.

또 다른 관점으로서, 본 발명은 한세눌라 폴리모르파 변이주에 외래 단백질을 암호화하는 유전자를 도입하여 제작된 외래 단백질을 발현하는 재조합 한세눌라 폴리모르파 균주를 제공한다.

또 다른 관점으로서, 본 발명은 재조합 한세ㄴ눌라 폴리모르파 균주를 외래 단백질이 발현되도록 하는 조건하에서 배양하고 배양물로부터 외래 단백질을 분리함을 포함하여, 외래 단백질을 제조하는 방법을 제공한다.

보다 상세하게는, 본 발명은 한세눌라 폴리모르파에서 앱신계통의 단백질 분해효소에 대한 유전자HpYPS1이 결손된 효모 균주를 숙주로 하여 재조합 단백질을 분비 생산하는 방법을 포함한다. 본 발명은 한세눌라 폴리모르파 단백질 분해효소 앱신1을 암호화하는 유전자HpYPS1를 클로닝하는 과정; 사카로마이세스 세레비시애의 앱신 다중 결손 변이주의 온도 민감성 보완 실험을 통한 상기 확보된 한세눌라 폴리모르파HpYPS1유전자의 기능 분석 과정; 한세눌라 폴리모르파에서HpYPS1유전자가 파쇄된 변이주hpyps1△를 제작하고 앱신 활성을 분석하는 과정; 상기 한세눌라 폴리모르파 변이주hpyps1△를 숙주로 활용하여 인체 부갑상선 호르몬을 발현 분비하는 재조합 한세눌라 폴리모르파 균주hpyps1△-pMOXhPTH, 인체 혈청 알부민을 발현 분비하는 재조합 한세눌라 폴리모르파 균주hpyps1△-pYHSA12, 또는 인체 혈청 알부민과 융합된 TIMP2 단백질을 발현 분비하는 재조합 한세눌라 폴리모르파 균주hpyps1△-pYHSA13-TIMP2를 제작하여 재조합 단백질들의 분해 정도를 분석하는 과정으로 구성되어 있다. 따라서, 본 발명은 메탄올자화 효모 한세눌라 폴리모르파로부터 발현된 재조합 단백질의 분해를 방지함으로써 재조합 단백질을 효율적으로 생산하는 방법에 관한 것으로, 한세눌라 폴리모르파 아스파틱 프로테아제 계열의 앱신을 암호화하는HpYPS1유전자를 클로닝하고 이를 활용하여HpYPS1유전자가 결손된 한세눌라 폴리모르파 균주를 제작하고, 상기 균주를 숙주로 하는 형질전환체를 배양하여 재조합 단백질의 분해를 극소화함으로써 완전한 형태의 재조합 단백질을 고수율로 생산하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에서 클로닝한 한세눌라 폴리모르파YPS1유전자(HpYPS1)의 염기서열(서열번호 1)은 Accession Number AF493990로 GenBank에 기탁되었다. 또한, 한세눌라 폴리모르파 단백질 분해효소 앱신1을 암호화하는 유전자HpYPS1는 국제기탁기관(Korean Collection for Type Cultures)에 2002년 6월 18일에 기탁하고 수탁번호 KCTC 10285BP를 부여받았다. 한세눌라 폴리모르파에서HpYPS1유전자가 파쇄된 변이주hpyps1△도 국제기탁기관(Korean Collection for Type Cultures)에 2002년 6월 18일에 기탁하고 수탁번호 KCTC 10281BP를 부여받았다. 한 양태로서, 인체 부갑상선 호르몬을 발현 분비하는 재조합 한세눌라 폴리모르파 균주hpyps1△-pMOXhPTH 또한 국제기탁기관(Korean Collection for Type Cultures)에 2002년 6월 18일에 기탁하고 수탁번호 KCTC 10282BP를 부여받았다. 추가의 양태로서, 인체 혈청 알부민을 발현 분비하는 재조합 한세눌라 폴리모르파 균주hpyps1△-pYHSA12 또한 국제기탁기관(Korean Collection for Type Cultures)에 2002년 6월 18일에 기탁하고 수탁번호 KCTC 10283BP를 부여받았다. 또한, 알부민-TIMP2 융합단백질을 발현 분비하는 재조합 한세눌라 폴리모르파 균주 hpyps1△-pYHSA13-T2 역시 국제기탁기관(Korean Collection for Type Cultures)에 2003년 6월 23일에 기탁하고 수탁번호 KCTC 10485BP를 부여받았다.

이하 본 발명의 내용을 실시예를 통해 구체적으로 설명하기로 한다. 다만 하기 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 것일 뿐 본 발명의 권리범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.

<실시예 1>

한세눌라 폴리모르파 앱신1 유전자HpYPS1클로닝 및 염기서열 분석

한세눌라 폴리모르파에서 앱신1을 암호화하는 유전자를 찾아내기 위해 한세눌라 폴리모르파에 대해 보고된 무작위 염기 서열 (random sequenced tag, RST) (Blandin et al., FEBS Lett. 487, 76, (2000)) 정보를 토대로 한 쌍의 합성 올리고뉴클레오타이드(5'-GAAGTGCAGCAGCAGCTCCTGAACC-3'; 서열번호 3, 5'-GGCTGATGACGGCTCGGTCACGATGG-3'; 서열번호 4)를 제작하고 이들을 프라이머로 이용한 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction; PCR)을 통해 한세눌라 폴리모르파 DL-1L 유래의 염색체로부터 0.88 kb DNA 절편을 증폭하고 이를 탐침으로 사용하여 서던 블롯(Southern blot)을 실시하였다. 서던 블롯 결과를 바탕으로 한세눌라 폴리모르파 염색체 DNA에서 3.5 kb의 HindⅢ 절편을 추출해내어 게놈 라이브러리를 제조하고 이를 대장균에 형질전환시켰다. 콜로니(colony) PCR을 통해서HpYPS1DNA 탐침과 반응하는 DNA 절편을 분리하고 염기서열 분석을 수행하여 사카로마이세스 세레비시애 YPS1 유전자와 높은 유사성을 보이는 1728 bp 크기의 개방 판독 프레임(open reading frame:ORF)이 포함된 DNA 절편을 확보하였다(도 1). 한세눌라 폴리모르파YPS1유전자(HpYPS1) 산물의 경우 사카로마이세스 세레비시애 앱신1에서 보고되었듯이 N-말단의 1-17 아미노산이 신호서열이며, C-말단의 556-575 아미노산들로 구성된 지역은 골지막에 정착할 수 있는 도메인(domain)으로 추정되며 사카로마이세스 세레비시애 앱신들처럼 글라이코실포스파티딜이노시톨 (glycosylphosphatidylinositol) 앵커(anchor)가 부착될 수 있는 구조적인 특징을 갖고 있다(도 1). 한세눌라 폴리모르파 앱신1(서열번호 2)은 사카로마이세스 세레비시애 앱신1과 36% 동일성과 52%의 높은 유사성을 보이며 그 외의 앱신 프로테아제와도 30% 이상의 동일성을 보인다(도 2, 표 1).

HpYPS1과ScYPS유전자들과의 동일성 및 유사성 비교

	ScYPS1	ScYPS2	ScYPS3	ScYPS6	ScYPS7
HpYPS1	36%(52%)	31%(49%)	30%(44%)	26%(44%)	29%(34%)

* 유사성은 ( )안에 표시

<실시예 2>

한세눌라 폴리모르파HpYPS1유전자의 기능 분석

전통 효모 사카로마이세스 세레비시애의 경우, 사카로마이세스 세레비시애 W303 균주 배경으로 제작된 YPS1과 YPS2 이중 결손 변이주의 경우 37℃에서는 자라지 못하는 높은 온도 민감성을 보인다고 보고되었고(Komano and Fuller, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 7,92,10752-10756 (1995)), 본 발명자들이 사카로마이세스 세레비시애 L3262 배경으로 제작한 앱신 다중 결손 변이주인YPS1/YPS2/YPS33개의 유전자가 파쇄된 균주인 SLH18(yps1△/yps2△/yps3△)(대한민국 등록특허 제10-0386836호)에서도 고온에 대한 온도 민감성을 보이는 특징이 관찰되었다. 한세눌라 폴리모르파 앱신1 유전자HpYPS1의 기능을 분석하기 위한 방법의 일환으로HpYPS1유전자를 상기 사카로마이세스 세레비시애 다중 앱신 변이주에 리튬 클로라이드-DMSO 방법(Hill et al., Nucleic Acid Res., 19, 5791 (1991))에 따라서 형질전환시켜 한세눌라 폴리모르파 앱신1 유전자 발현이 사카로마이세스 세레비시애 다중 앱신 변이주들의 온도 민감성을 회복시킬 수 있는지를 살펴보는 기능보완(functional complementation) 실험을 수행하였다.HpYPS1유전자를 사카로마이세스 세레비시애에서 발현시키기 위해HpYPS1유전자가 포함된 3.2 kb DNA 절편을 사카로마이세스 세레비시애용 벡터 YEp352(Hill et al., Yeast 2, 163, (1986))에 삽입하여 YEp-HpYPS1을 제작하였다. 도 3에서 보듯이HpYPS1유전자가 포함된 벡터인 YEp352-HpYPS1로 형질전환된 사카로마이세스 세레비시애 앱신 다중 결손 변이주들은 30℃와 37℃에서 배양했을 때 37℃에서도 야생형과 같은 생장을 보였지만, 대조구로 사용된 YEp352 벡터만으로 형질전환된 앱신 다중 결손 변이주는 37℃에서 성장하지 못했다. 이는 사카로마이세스 세레비시애 앱신 유전자의 다중 결손으로 인한 온도 민감성을 한세눌라 폴리모르파의 앱신 1 유전자 발현에 의해 극복됨을 입증함으로서 본 발명에서 클로닝한 한세눌라 폴리모르파 유전자HpYPS1이 사카로마이세스 세레비시애의 앱신 유전자와 기능적인 상동체임을 뒷받침해주는 근거가 된다.

<실시예 3>

HpYPS1유전자 파쇄 균주 제작 및 앱신 활성 분석

상기 확보된HpYPS1유전자를 활용하여 한세눌라 폴리모르파 앱신 결손 변이주hpyps1△를 개발하여 앱신에 의한 단백질 분해 활성 변화여부를 분석하였다. 한세눌라 폴리모르파 앱신 1을 암호화하는HpYPS1유전자가 파쇄된 변이주를 제작하기 위해 한세눌라 폴리모르파 염색체 DNA로부터 표 2에 기술된 프라이머를 이용한 융합 중합효소 연쇄반응(fusion PCR)(Oldenhurg et al., Nucleic Acid Res. 25, 451, (1997))을 수행하고, 이로부터 얻은 DNA 절편을 한세눌라 폴리모르파 DL1-LdU (leu2△ura3::lacz; Kang et al., InHansenula polymorpha:Biology and Application (Ed. G. Gellissen), pp 124 (2002)) 균주에 형질전환시켜 세포내 상동 재조합(in vivohomologous recombination)을 유도함으로써 유전자의 파쇄를 시도하였다. 더 상세히 설명하면, 우선 1차 중합효소 연쇄반응에 의하여HpYPS1유전자의 N-말단과 C-말단 그리고 URA3 유전자를 확보하고, 2차 결합 중합효소 연쇄반응에 의해서HpYPS1유전자의 N-말단과 C-말단을 각각 URA3 유전자의 N-말단과 C-말단에 결합시켰다. 이와 같은 방법으로 확보한 각각의 DNA 두 절편을 효모의 세포 내로 도입시킨 후 일차적으로URA3선별 표지로 유라실(uracil)이 결핍된 최소배지에서 자라는 형질전환체들을 골라내고, 이차적으로 중합효소 연쇄반응을 통해 야생형 균주와 다르게 증폭된 DNA 절편을 확인하여HpYPS1유전자가 파쇄된 한세눌라 폴리모르파 변이주인hpyps1△(leu2 △ura3::lacz yps1:: URA3) 균주를 제작하였다(도 4).

상기 제작된 한세눌라 폴리모르파hpyps1△변이주와 야생형 균주의 앱신 활성을 비교하기 위해 인체 부갑상선 호르몬(human parathyroid hormone; hPTH)을 기질로 사용하여 YPD (1% 효모추출물, 2% 펩톤, 2% 글루코즈) 배지에서 10시간 배양하여 확보한 효모 배양액의 단백질 분해 활성을 분석하였다. 기질로 작용하는 hPTH(약 1.6 ㎍)을 1/4배로 희석한 효모 배양액 20 ㎕와 혼합하여 37℃에서 각각 2시간, 4시간, 6시간 반응시켜 SDS-폴리아크릴아마이드 젤에 걸어 앱신 활성에 의한인체 부갑상선 호르몬의 분해정도를 비교 분석하였다. 도 5에서 보듯이 야생형의 배양액은 이미 2시간 이후부터 배양액에 남아 있는 hPTH을 관찰하기 어려운 반면hpyps1△변이주의 배양액은 반응시간이 늘어남에 따라 hPTH의 양이 다소 감소되기는 하나 상당량이 남아있었다. 이는 한세눌라 폴리모르파HpYPS1결손변이주인hpyps1△의 배양액은 야생형 균주의 배양액에 비해 현저하게 감소된 hPTH 분해 활성을 갖고 있음을 시사한다. 상기 결과는 사카로마이세스 세레비시애YPS1결손 변이주를 대상으로 수행된 선행연구(Kang et al., Appl Microbiol Biotechnol. 50, 187, (1998))와 동일한 결과를 보여주고 있어HpYPS1가 한세눌라 폴리모르파의 앱신 프로테아제를 암호화하는 유전자이며 본 발명에서 개발된HpYPS1결손 변이주는 앱신 활성이 감소되었음을 뒷받침해주고 있다.

HpYPS1유전자 파쇄를 위한 결합 중합효소 연쇄반응에 사용된 프라이머

프라이머	서열	서열번호
YPS(NF)	5'-GGACACGCAAGAGGTGTCTG- 3'	5
YPS(NR+rp)	5'-AGCTCGCTACCCGGGGATCCGCAACTTTCATTGTGTCAAC- 3'	6
YPS(CF+rp)	5'-GCACATCCCCCTTTCGCCAGCCTCTTCGGTGCGGTTGACC- 3'	7
YPS(CR)	5'-GCTCGGCTCCAGGATTCAGG- 3'	8
URA3N-S	5'-GGATCCCCGGGTACCGAGCT- 3'	9
URA3N-A	5'-CACCGGTAGCTAATGATCCC- 3'	10
URA3C-S	5'-CGAACATCCAAGTGGGCCGA- 3'	11
URA3C-A	5'-CTGGCGAAAGGGGGATGTGC- 3'	12

<실시예 4>

hPTH 발현 재조합 한세눌라 폴리모르파 균주 제작 및 hPTH 발현 분석

실제적으로 인체 부갑상선 호르몬 (hPTH)을 한세눌라 폴리모르파에서 분비 발현시키기 위해 한세눌라 폴리모르파용 인체 부갑상선 호르몬 발현 벡터인 pMOXhPTH를 도 6에 제시된 방법으로 제작하였다. 즉, 사카로마이세스 세래비시애 발현 벡터인 pG10-hPTH(Chung et al., Biotechnol Bioeng. 57, 245, (1998))에서 신호서열(signal sequence)과 hPTH를 포함하는 0.53 kb 크기의 EcoRⅠ/SalⅠ 절편을 확보하여 한세눌라 폴리모르파용 인체 혈장 알부민 발현 벡터인 pYHSA12(Kang et al., Biotechnol Bioeng. 76, 175, (2001))에서 알부민 유전자가 제거된 7.8 kb 크기의 XbaⅠ/EcoRⅠ절편을 확보하여 두 DNA 절편을 연결함으로써 pMOXhPTH를 제작하였다. 상기 제작된 벡터 pMOXhPTH를 한세눌라 폴리모르파hpyps1△변이주와 야생형 균주에 도입하여 루이신(leucine)이 결핍된 최소배지에서 자라는 형질전환체들을 선별하고, 이와 같은 방법으로 확보한 Leu+ 형질전환체들을 안정화시키기 위해 접종 후 매 24 시간마다 루이신이 결핍된 액체 최소 선택 배지로 옮겨주기를 5회 반복하였다(Sohn et al., Appl Microbiol Biotechnol. 51, 800, (1999)). 이와 같은 방법으로 확보한 Leu+ 형질전환체들의 배양액을 다양한 농도의 G418이 포함된 최소배지에 도말하고, 37℃에서 배양하여 얻은 여러 콜로니(colony)로부터 염색체 DNA를 분리하여 1.5 kb 한세눌라 폴리모르파LEU2유전자를 탐침으로 Sambrook 등(Molecular cloning Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)의 방법에 의해 서던 블롯(Southern blot)을 수행함으로써 발현 벡터의 염색체로의 삽입을 확인하였다 (도 7A). 탐침으로 사용한 한세눌라 폴리모르파LEU2유전자는 비방사성 DNA 표지 및 감지 키트 (Non-radioactive DNA labelling and detection kit)를 사용하여 디그옥시제닌(digoxigenin)으로 표지하여 제조하였다. 예측한대로, G418 농도가 높은 배지에서 선별된 형질전환체들에서 벡터 pMOXhPTH의 다중 도입이 관찰되었으며 염색체상의LEU2유전자 시그널과 삽입된 벡터상의LEU2유전자 시그널의 강도를 비교하면 최대 5 내지 6개 카피수 정도가 삽입된 것으로 추정된다.

상기 hPTH 발현 벡터가 염색체로 삽입되었음이 확인된 hPTH 발현 재조합 효모 균주들중 일부 균주들(a, b, c, d, e, f)을 YPM(1% yeast extract, 2% peptone, 2% methanol)배지에 접종하여 37℃에서 12시간, 24시간 후 얻은 효모 배양액을 TCA(trichloroacetic acid)로 처리해 세포 밖으로 분비된 단백질을 20배로 농축하고 15% SDS-폴리아크릴아마이드 젤에 걸어 전기영동을 수행한 후 쿠마시 브릴리언트 블루 R-250(Coomassie Brilliant Blue R-250)으로 염색하였다(도 7B). 한세눌라 폴리모르파 야생형과hpyps1△변이주에서 분비 발현된 인체 부갑상선 호르몬을 비교해 보았을 때 야생형으로부터 수득한 배양액에서는 대부분의 hPTH가 분해되어 미량의 분해산물(d1)만이 관찰되고 온전한 크기의 hPTH(i)는 관찰하기 어려운 것과 대조적으로hpyps1△변이주로부터 수득한 단백질에서는 단지 12시간 배양 후에 명확하게 온전한 크기의 hPTH의 분비발현이 관찰되었다. 비록hpyps1△변이주에서도 배양시간이 길어짐에 따라 C-말단이 분해된 형태의 hPTH라고 여겨지는 밴드(d2)가 관찰되면서 온전한 크기의 hPTH는 감소되지만, 이 같은 결과는 앱신1 유전자가 파쇄된hpyps1△변이주는 앱신 활성의 감소로 인해 재조합 인체 부갑상선 호르몬 분해가 크게 방지되므로 야생형에 비해 재조합 hPTH 분비발현을 위한 숙주로 매우 유용한 균주임을 보여주고 있다.

<실시예 5>

한세눌라 폴리모르파HpYPS1유전자 결손 변이주에서의 재조합 인체 혈장 알부민(HSA)의 발현 분비 분석

사카로마이에스 세레비지애에서 분비 발현되는 인체 혈장 알부민(HSA)는 완전한 형태인 67 kDa로 발견되지만 일부 45 kDa의 분해된 형태의 재조합 단백질 역시 관찰되고 있다. 사카로마이세스 세레비지애 앱신1 유전자가 파쇄된 균주를 숙주로 사용하는 경우, 효모 세포 배양액으로 분비된 인체 혈장 알부민의 분해, 특히 45 kDa 크기의 분해산물의 생성이 감소된다고 보고되었다(Kerry Williams et al., Yeast 14, 161, (1998)). 본 발명에서 개발된 한세눌라 폴리모르파HpYPS1유전자 결손 변이주에서의 재조합 인체 혈장 알부민의 발현 및 분해양상을 분석하기 위하여 LEU2 선별표지와 G418에 따른 벡터 삽입수를 조절할 수 있는 특징을 가진 벡터에 MOX 프로모터와 인체 혈장 알부민을 결합시킨 발현벡터 pYHSA12(Kang et al., Biotech Bioeng. 76, 175, (2001))로hpyps1△변이주를 형질전환시켰다. 재조합 한세눌라 폴리모르파 야생형 균주와hpyps1△변이주를 YPGM (1% 효모추출물, 2% 펩톤, 1% 글리세롤, 2% 메탄올) 배지에서 배양하여 확보된 배양액을 SDS-폴리아크릴아마이드 젤을 걸어 질산은(silver nitrate)를 이용해 염색하거나 나이트로셀룰로즈 막(nitrocellulose membrane)에 이동시킨 후 HSA 항체에 의한 웨스턴 블롯(Western blot)을 통하여 HSA의 발현 및 분해양상을 살펴보았다. 도 8에서 보듯이 특히 24시간 배양후 야생형 균주보다hpyps1△변이주에서 보다 많은 양의HSA가 발현·분비되는 것을 관찰 할 수 있으며, 비록 전반적인 알부민 분해가 크게 방지되지는 않았지만 특히 사카로마이세스 세레비시애에서 관찰되었듯이 45 kDa 크기의 분해산물 생성이 야생형에 비하여hpyps1△변이주에서 다소 감소함을 볼 수 있다. 고농도 발효조로 배양하는 경우 45 kDa 크기의 알부민 분해산물 생성이 더욱 심각한 문제로 제기됨을 고려할 때,hpyps1△변이주를 숙주로 하는 알부민 생산 시스템이 야생형 균주를 숙주로 이용한 생산 시스템에 비해서 주목할 만한 알부민 분해 감소로 인한 생산량의 증대가 기대된다.

<실시예 6>

한세눌라 폴리모르파HpYPS1유전자 결손 변이주에서의 재조합 알부민 융합 TIMP2 (HSA-TIMP2))의 발현 분비 분석

단백질 치료제의 혈액 지속성을 증가시키기 위한 일환으로 최근에는 안정성이 매우 긴 혈액 단백질인 알부민에 융합된 형태로 재조합 단백질을 발현시킴으로써 의료용 단백질의 생체내 반감기(in vivohalf-life)를 증가시키는 기술개발 연구가 각광을 받고 있다(Smith et al., Bioconjugate Chem. 12, 750-756, (2001); Sheffield et al. Blood Coagul Fibrinol. 12, 433-443, (2001)). 본 발명자들도 차세대 혈관신생 억제제 및 항암제로 관심을 받고 있는 TIMP-2를 알부민에 융합된 재조합 단백질로 효모 사카로마이세스 세레비시애에서 발현시켜in vivo안정성이 크게 증가된 재조합 TIMP-2를 개발한 바 있다(대한민국 특허출원 제 10-2001-0027823호, 제PCT/KR03/00015호). 본 발명에서 개발된 한세눌라 폴리모르파HpYPS1유전자 결손 변이주(hpyps1△)에서 알부민과 융합된 형태의 재조합 HSA-TIMP2 재조합 발현 양상 및 분해양상을 분석하기 위하여 한세눌라 폴리모르파용 HSA-TIMP2 발현 벡터인 YHSA13-T2를 도 9에 제시된 방법으로 제작하였다. 즉,HSA및TIMP2유전자를 표 3에 기재된 PCR 프이머들을 사용하여 우선 각각의 유전자를 확보한 후 이를 1:1의 비율로 첨가하여 Fusion PCR을 수행하여HSA(1.8 kb)와TIMP2(0.586 kb)가 연결된 2.4 kbHSA-TIMP2DNA 절편을 확보하여 pGEM T 벡터 (Promega, USA)에 클로닝하여 pTHSA-TIMP2를 제작하였다. 확보된HSA-TIMP2DNA 절편의 염기서열을 서열분석으로 확인한 후 pTHSA-TIMP2를XbaI과SpeI로 절단하여 1.2 kbXbaI/SpeIHSA-TIMP2유전자 절편을 얻어서 알부민 유전자가 삽입되어 있는 한세눌라 폴리모르파 다중병렬 도입벡터인 pYHSA12(+)(Kang et al.,Biotechnol. Bioeng.76, 175-185, (2001))를XbaI로 절단한 후 연결시켜 pYHSA13-T2 (도 9)를 제작하였다.

HSA-TIMP2 융합 유전자 제작에 사용된 PCR 프라이머들

프라이머	서열	비고
HSA EcoR F	5' gaattcatgaagtgggtaaccttt 3'(서열번호 13)	HSA 정방향
Hs-R2	5' taagcctaaggcagcttgac 3'(서열번호 14)	HSA 역방향
H-T2-F	5'caagctgccttaggcttatgcagctgctccccggtg 3'(서열번호 15)	Timp2 정방향, HSA C-말단의 18bp 포함하여 fusion PCR에 사용
R-T2-Sp	5' actagtgatttatgggtcctcgatg 3'(서열번호 16)	Timp2 역방향

상기 제작된 알부민 융합 단백질 발현 벡터들을 한세눌라 폴리모르파 DL1-L(leu2)과hpyps1△ (leu2 hpyps1::URA3) 변이주에 도입시켜 일차적으로 Leu2⁺형질전환체를 확보한 후 이들을 취합하여 선택배지 상에서 5번 계대배양하여 발현벡터가 숙주의 염색체 DNA로의 다중 도입되도록 하였다. 이후, 항생제 G418이 다양한 농도로 포함된 배지에 평판배지 당 1x 10⁵~⁶씩 도말하여 G418에 대해 내성을 갖는 형질전환체를 선별하였다. 서던 블롯으로 발현벡터 pYHSA13-T2가 숙주내의 염색체로 삽입이 확인된 형질전환체들이 예상한 크기의 융합 단백질을 분비 발현하는지를 확인하기 위해서 우선 YPM에서 48 시간 배양하여 확보된 효모 배양액을 알부민에 대한 항체를 사용하여 웨스턴 블롯으로 분석하였다. 도 10에서 보듯이 예상한대로 HSA (66.5 kDa)에 보다 크기가 증가된 융합 단백질 HSA-TIMP2 (88 kDa)가 분비 발현됨이 관찰되었다. 흥미롭게도, 앱신 결손변이주인hpyps1△의 경우 분해산물 없이 온전한 크기의 88 kDa HSA-TIMP2 만이 관찰되었다. 그러나, 야생형 DL1 균주에서는 HSA-TIMP2 크기 88 kDa의 바로 아래 분해 산물로 추정되는 밴드가 관찰되었다. 따라서, 분해산물의 감소로 인해hpyps1△변이주의 경우 야생형 균주에 비해 HSA-Timp2 융합 단백질의 발현량이 약 2배 정도 높았다. 이는hpyps1△변이주가 상기 제시된 재조합 알부민 분비 발현뿐만 아니라 알부민에 융합된 형태로 발현되는 재조합 단백질의 분비 생산의 경우에 있어서도 앱신1에 의한 단백질 분해가 방지됨을 보여주고 있다.

이상 설명한 바와 같이, 본 발명은 단백질 분해효소 앱신1 유전자가 결손된 한세눌라 폴리모르파 균주(hpyps1△)를 재조합 단백질 생산 숙주로 이용하면 앱신 활성에 의한 재조합 단백질의 절단을 현저하게 감소시킴으로써 완전한 형태의 재조합 단백질을 높은 수율로 분비·생산할 수 있어 한세눌라 폴리모르파를 이용한 재조합 단백질 생산을 도모하는 생명공학산업에 있어서 매우 유용하다.

Claims

도 1에 도시된 염기 서열을 포함하는 핵산 분자.
제1항에 있어서, 한세눌라 폴리모르파 앱신1을 암호화하는HpYPS1유전자인 핵산 분자(기탁번호 KCTC 10285BP).
도 1에 도시된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드.
제3항에 있어서, 염기성 또는 이염기성 아미노산 잔기를 포함하는 단백질을 절단할 수 있는 한세눌라 폴리모르파 앱신1인 폴리펩타이드.
제3항에 있어서, 외래 단백질 분비 시그널로 사용되는 HpYPS1 폴리펩타이드의 분비 시그널 펩타이드.
한세눌라 폴리모르파 앱신1을 암호화하는HpYPS1유전자의 돌연변이로 인해 앱신 활성이 감소된 한세눌라 폴리모르파 변이주.
제6항에 있어서, 기탁번호 KCTC 10281BP로 기탁된 한세눌라 폴리모르파 변이주.
제6항의 한세눌라 폴리모르파 변이주에 외래 단백질을 암호화하는 유전자를 도입하여 제작된 외래 단백질을 발현하는 재조합 한세눌라 폴리모르파 균주.
제8항에 있어서,hpyps1△-pMOXhPTH (KCTC 10282BP)인 재조합 한세눌라 폴리모르파 균주.
제8항에 있어서,hpyps1△-pYHSA12 (KCTC 10283BP)인 재조합 한세눌라 폴리모르파 균주.
제8항에 있어서,hpyps1△-pYHSA13-TIMP2 (KCTC 10485BP)인 재조합 한세눌라 폴리모르파 균주.
제8항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 한세눌라 폴리모르파 앱신1 파쇄 균주를 숙주로 하여 외래 단백질을 발현시킴으로 특징으로 하여, 외래 단백질을 제조 및 분리하는 방법.
제12항에서 있어서, 외래 단백질이 앱신1에 의해 절단될 수 있는 염기성 또는 이염기성 아미노산 잔기를 지닌 재조합 단백질인 방법.
제13항에 있어서, 염기성 또는 이염기성 아미노산 잔기를 지닌 단백질이 인체 부갑상선 호르몬, 인체 혈청 알부민, 알부민 융합 단백질을 포함하는 방법.