KR20040062304A - 앱신 다중 결손 효모 변이 균주 및 이를 이용한 재조합 단백질의 생산 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 앱신 다중 결손 효모 변이 균주 및 이를 이용한 재조합 단백질의 생산 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 효모 사카로마이세스 세레비시애 앱신 계열의 프로테아제를 코딩하는 앱신 6 및 앱신 7 유전자 중 하나 이상이 결손된 변이 균주 및 상기 변이 균주를 이용한 재조합 단백질의 대량 생산 방법에 관한 것이다. 본 발명의 앱신 다중 결손 효모 균주는 세포외로 분비된 재조합 단백질을 절단하는 프로테아제 활성이 감소되어 목적 단백질을 온전한 형태로 분리 및 정제할 수 있게 함으로써 산업적으로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

앱신 다중 결손 효모 변이 균주 및 이를 이용한 재조합 단백질의 생산 방법{Yeast mutant strains deficient in the multiple yapsin genes and method for the production of recombinant proteins using the same}
본 발명은 앱신 유전자가 결손된 변이 균주에 관한 것으로서 보다 구체적으로는 앱신 계열의 프로테아제를 코딩하는 유전자 중 하나 이상이 결손된 앱신 다중 결손 효모 변이 균주 및 이를 이용한 재조합 단백질의 대량 생산 방법에 관한 것이다.
전통효모 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae)의 경우 유전학적 조작이 용이할 뿐 아니라 균주 자체 및 발효 배양시의 그 특성이 많이 알려져 있어 유용한 재조합 단백질을 대량 생산하기 위한 산업적 균주로도 많이 이용되고 있다. 무엇보다도 사카로마이세스 세레비시애는 단세포 진핵 미생물로서 고등 진핵세포가 지닌 단백질 분비 경로와 매우 유사한 분비 경로를 지니고 있어 인간 유래의 단백질처럼 고등동물 유래의 분비 단백질 생산에 매우 유용한 숙주세포로사용되고 있다. 또한, 효모 자체적으로 세포 밖으로 분비하는 단백질이 적기 때문에 효모 분비 발현 시스템을 이용한 재조합 단백질 대량 생산은 재조합 단백질 분리 공정이 매우 간단하다는 장점을 지니고 있다(Ramanoset al., Yeast, 1992, 8, 423).
오랫동안 사카로마이세스 세레비시애는 세포 밖으로 분비되는 프로테아제가 거의 없다고 간주되었으나, 최근 사카로마이세스 세레비시애를 이용한 재조합 단백질 분비 발현에 관한 연구에서는 효모 자체에서 생산되는 프로테아제에 의해 세포 밖으로 분비된 외래 단백질을 분해하고 이것이 외래 단백질의 최종 생산성을 저해하는 주요 요인이 되고 있음을 보여주었다(Ramanoset al., Yeast, 1992, 8, 423). 특히, 이러한 현상은 효모의 고농도 배양 말기에 특히 두드러지게 관찰되고 있으며, 숙주세포로부터 자연적으로 분비되거나 또는 세포 분해(cell lysis)를 통해서 세포내에 존재하는 단백질 분해효소가 배지로 배출됨으로써 일어난다(Alvarezet al., J. Biotechnol.,1994, 38, 81; Chenet al.,Curr. Genet.,1995, 27, 201; Hinnenet al., In Gene expression in recombinant microorganisms(ed. Smith A.), 1995, 121).
최근 단일 또는 쌍으로 존재하는 염기성 아미노산(basic amino acids)을 인지하여 절단하는 활성을 지니며, 세포막에 존재하는 효모 아스파틱 프로테아제 계통의 앱신(yapsin)이 사카로마이세스 세레비시애에서 발견되었다(Egel-Mitaniet al., Yeast,1990, 6, 127). 최근 공개된 사카로마이세스 세레비시애 게놈 정보에의해 효모 아스파틱 프로테아제들 중에서 가장 먼저 알려진 앱신1(yapsin1)(이전에는 yeast aspartic protease 3(YAP3)로 알려짐)과 그 후 발견된 앱신2(기존에는MKC7으로 알려짐)(Komanoet al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 1995,7, 10752) 외에도 유사한 기능을 갖고 있다고 추측되는 단백질 분해효소로 앱신3, 앱신6 및 앱신7 등 최소한 다섯 가지 이상의 앱신 계통 분해효소들을 코딩하는 유전자들이 존재함이 보고되었다(Olsenet al., Biochem. J.,1999, 339). 사카로마이세스 세레비시애의 앱신 유전자인YPS1에 대해YPS2는 53%의 상동성을,YPS3은 47%,YPS5는 38%,YPS6은 36%의 상동성을 보이고,YPS7은 27%의 상동성을 보인다. 이중YPS5는 불완전한 앱신을 코딩하고 있는 유사 유전자(pseudo gene)으로 간주된다. 이들 앱신은 다른 아스파틱 프로테아제가 소수성 잔기를 자르는 것과 대조적으로 단일 또는 쌍으로 존재하는 염기성 아미노산 잔기를 자르며, GPI 앵커(glycosylphosphatidylinositol anchor)를 통해 세포 표면에 위치하는 공통점을 보인다. 아직 이들의 생리적 기능이 아직 명확하게 밝혀진 것은 아니나, 세포내의 위치를 고려할 때 이들 앱신들은 세포벽의 전구체나 세포벽 합성에 관련된 효소의 전구체를 프로세싱하는 기능을 할 것으로 생각된다(Joseeet al.,Biochem. J.,1995, 270, 20847). 또한, 앱신 1, 앱신 2는 스트레스 조건에서 중요한 역할을 한다고 추정되었다(Niamhet al.,Biochem., 1995, 34, 7430). 현재까지 앱신 1, 앱신 2, 앱신 3에 대해서는 생화학적 활성 분석 연구가 수행되었지만(Olsenet al., Biochem. J., 1999, 339, 407), 아직까지 앱신 6와 앱신 7에 관한 생화학적 활성에 관한 연구보고는 없다. 그러나, 아미노산 염기서열에 근거하면 앱신 6는앱신 1, 앱신 2와 마찬가지로 GPI 앵커를 통해 세포막에 부착되고, 앱신 7은 부가적인 프로세싱을 거쳐 세포벽으로 삽입될 것으로 예측된다(Grahamet al., Mol. Microbiol.,2000, 38, 839).
현재까지 이들 앱신들의 생리적 기능을 규명하는 것이 해결해야 할 흥미로운 기초 연구과제로 남아있기는 하지만, 앱신 1 또는 앱신 2의 경우 이들 프로테아제의 활성에 의해 사카로마이세스 세레비시애에서 생산하고자 하는 목적 재조합 단백질이 절단된다는 연구 사례의 보고가 증가됨에 따라 앱신 결손 효모 균주는 재조합 단백질, 특히 염기성 아미노산을 지닌 외래 펩타이드 생산을 위해 매우 유용한 산업 균주로 주목을 받고 있다. 앱신 1에 의한 절단이 보고된 재조합 단백질로는 인체 혈청 알부민(Kerry-williamset al., Yeast,1998, 14, 161), 글루카곤 및 글루카곤 유사 펩타이드(Egel-Mitaniet al., Enzyme Microb. Technol., 2000, 26, 671; 미국특허 제 6,110,703호), 인체 엘라핀 전구체(Bourbonnaiset al., Protein Exp. Purif., 2000, 20, 485) 등이 있고, 곤충 이뇨 호르몬의 경우는 앱신 1과 함께 앱신 2도 절단에 관여한다고 보고되었다(Copleyet al., Biochem. J.,1998, 330, 1333).
인체 부갑상선 호르몬(human parathyroid hormone, 이하 'hPTH'라 칭함)의 경우도 효모 사카로마이세스 세레비시애를 숙주세포로 이용하여 단백질을 분비 생산하는 경우, 효모 숙주세포 자체의 단백질 분해효소에 의해 세포 밖으로 분비된 대부분의 hPTH가 절단되는 것이 효모를 이용한 hPTH 생산시스템을 산업적으로 활용하는 데 있어서 큰 걸림돌이었다. 또한, 본 발명자들은 고농도의 L-알지닌을 배양배지에 첨가하면 hPTH의 절단이 현저하게 저해된다는 선행 연구결과(Chunget al., Biotechnol. Bioeng., 1998, 57, 245)에 기초하여YPS1유전자가 결손된 효모 균주의 개발을 통해 hPTH의 분해가 현저히 방지된 효모발현 시스템을 개발하였고(대한민국 특허등록 제0246932호; Kanget al., Appl. Microgiol. Biotechnol.,1998, 50, 187), 그 후 균주의 고농도 배양시 진행되는 hPTH의 분해(Chunget al., Process Biochem., 2000, 35, 503)를 방지하기 위해YPS1, YPS2및YPS3이 동시에 제거된 효모 균주(YPS1ΔYPS2ΔYPS3Δ)를 개발하였으며, 또한, 갈락토즈 피딩에 의한 고농도 균체 배양을 모방한 배양 말기에서 hPTH의 분해가 거의 90% 이상 방지된 효모 숙주세포를 개발하고 특허출원한 바 있다(대한민국 특허공개 제2002-17754호). 그러나, 발효조를 이용한 고농도 균체 배양 말기에 경우,YPS1ΔYPS2ΔYPS3Δ 균주에서도 아직 상당한 hPTH의 절단이 진행되고 있음을 관찰되었다. 이로부터 고농도 균체 배양 말기 조건에서는 앱신 1, 앱신 2와 앱신 3 이외의 나머지 앱신 프로테아제들의 활성으로 인해 재조합 단백질의 절단이 진행됨을 추측할 수 있다.
이에, 본 발명자들은 앱신 6 및/또는 앱신 7이 결손된 효모 변이 균주 및 상기 유전자 외에 앱신 1, 앱신 2 및/또는 앱신 3이 추가로 결손된 앱신 다중 결손 효모 변이 균주를 제조하고, 상기 균주가 목적 단백질을 완전한 형태로 분비함을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 앱신 6 및 앱신 7 유전자로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자가 결손된 앱신 결손 효모 변이 균주 및 상기에서 추가로 앱신 1, 앱신 2 및 앱신 3으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자가 결손된 앱신 결손 효모 변이 균주를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 상기 앱신 결손 효모 변이 균주를 이용한 재조합 단백질의 대량 생산 방법을 제공하는 것이다.
도 1a는 효모 사카로마이세스 세레비시애에서 팝-아웃(pop-out)이 가능한URA3선별표지를 사용한YPS6유전자 결손용 카세트 제작 과정을 나타낸 모식도이고,
도 1b는YPS6유전자 결손용 카세트를 이용하여 효모 사카로마이세스 세레비시애 균주의YPS6유전자와 상동성 재조합을 유도한 뒤URA3선별표지를 회수하는 과정을 나타낸 모식도이고,
도 2a는 효모 사카로마이세스 세레비시애에서 팝-아웃이 가능한URA3선별표지를 사용한YPS7유전자 결손용 카세트 제작 과정을 나타낸 모식도이고,
도 2b는YPS7유전자 결손용 카세트를 이용하여 효모 사카로마이세스 세레비시애 균주의YPS7유전자와 상동성 재조합을 유도한 뒤URA3선별표지를 회수하는 과정을 나타낸 모식도이고,
도 3은 사카로마이세스 세레비시애 앱신 다중 결손 변이주에서YPS6유전자 결손(A) 및YPS7유전자 결손(B) 여부를 확인한 PCR 전기영동 사진이고,
도 4a는 사카로마이세스 세레비시애 앱신 다중 결손 변이주를 플라스크 배양한 후 세포의 성장곡선을 나타낸 그래프이고,
도 4b는 사카로마이세스 세레비시애 앱신 다중 결손 변이주를 플레이트 배양한 후 다양한 배양 온도에서의 생장 양상을 보여주는 사진이고,
레인 1: L3262(WT), 레인 2: SLH11(YPS1Δ),
레인 3: SLH14(YPS1ΔYPS2Δ), 레인 4: SLH18(YPS1ΔYPS2ΔYPS3Δ),
레인 5: SLH23(YPS1ΔYPS2ΔYPS3ΔYPS6Δ),
레인 6: SLH28(YPS1ΔYPS2ΔYPS3ΔYPS6ΔYPS7Δ)
도 5a는 사카로마이세스 세레비시애 앱신 다중 결손 변이주의 pH 민감성을 보여주는 사진이고,
레인 1: L3262(WT), 레인 2: SLH11(YPS1Δ),
레인 3: SLH14(YPS1ΔYPS2Δ), 레인 4: SLH18(YPS1ΔYPS2ΔYPS3Δ),
레인 5: SLH23(YPS1ΔYPS2ΔYPS3ΔYPS6Δ),
레인 6: SLH28(YPS1ΔYPS2ΔYPS3ΔYPS6ΔYPS7Δ)
도 5b는 사카로마이세스 세레비시애 앱신 다중 결손 변이주의 염 민감성을 보여주는 사진이고,
레인 1: L3262(WT), 레인 2: YSH444(MATa hog1::TRP1),
레인 3: SLH11(YPS1Δ), 레인 4: SLH14(YPS1ΔYPS2Δ),
레인 5: SLH18(YPS1ΔYPS2ΔYPS3Δ),
레인 6: SLH23(YPS1ΔYPS2ΔYPS3ΔYPS6Δ),
레인 7: SLH28(YPS1ΔYPS2ΔYPS3ΔYPS6ΔYPS7Δ)
도 6a는 앱신 삼중 결손 변이주인 SLH18(YPS1ΔYPS2ΔYPS3Δ)을 숙주세포로 하여 재조합 인간 부갑상선 호르몬 발현 벡터를 도입한 후 갈락토오즈와 에탄올을 피딩 배지로 사용하여 유가식 배양을 한 후의 세포 생장곡선을 나타낸 그래프이고,
도 6b는 앱신 사중 결손 변이주인 SLH23(YPS1ΔYPS2ΔYPS3ΔYPS6Δ)을 숙주세포로 하여 재조합 hPTH 발현 벡터를 도입한 후 갈락토오즈와 에탄올을 피딩 배지로 사용하여 유가식 배양을 한 후의 세포 생장곡선을 나타낸 그래프이고,
도 6c는 앱신 오중 결손 변이주인 SLH28(YPS1ΔYPS2ΔYPS3ΔYPS6ΔYPS7Δ)을 숙주세포로 하여 hPTH 재조합 발현 벡터를 도입한 후 갈락토오즈와 에탄올을 피딩 배지로 사용하여 유가식 배양을 한 후의 세포 생장곡선을 나타낸 그래프이고,
도 7은 hPTH 발현벡터를 도입한 앱신 삼중 결손변이주 SLH18(YPS1ΔYPS2ΔYPS3Δ)(A), 앱신 사중 결손 변이주 SLH23(YPS1ΔYPS2ΔYPS3ΔYPS6Δ)(B), 앱신 오중 결손 변이주 SLH28(YPS1Δ/YPS2Δ/YPS3Δ/YPS6Δ/YPS7Δ)(C)을 고농도 균체 배양하여 분비된 hPTH의 분해 양상을 SDS-PAGE로 비교·분석한 사진이고,
도 8a는 재조합 인체 리포코틴 분비 발현을 하는 여러 앱신 결손 변이주들을 간헐적인 갈락토오즈 공급으로 고농도 배양을 유도한지 24시간 후 수득된 배양액을 이용하여 SDS-PAGE를 수행한 후 쿠마시 염색하거나 웨스턴 블럿으로 리포코틴의 발현 및 분해 양상을 분석한 결과를 보여주는 전기영동 사진이고,
도 8b는 재조합 인체 리포코틴 분비 발현을 하는 여러 앱신 결손 변이주들을간헐적인 갈락토오즈 공급으로 고농도 배양을 유도한지 48시간 후 수득된 배양액을 이용하여 SDS-PAGE를 수행한 후 쿠마시 염색한 전기영동 사진이고,
도 8c는 재조합 인체 리포코틴 분비 발현을 하는 여러 앱신 결손 변이주들을 간헐적인 갈락토오즈 공급으로 고농도 배양을 유도한지 72시간 후 수득된 배양액을 이용하여 SDS-PAGE를 수행한 후 쿠마시 염색한 전기영동 사진이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 앱신 6 및 앱신 7 유전자로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자가 결손된 앱신 결손 효모 변이 균주 및 상기에서 추가로 앱신 1, 앱신 2 및 앱신 3으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자가 결손된 앱신 결손 효모 변이 균주를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 앱신 결손 효모 변이 균주를 이용한 재조합 단백질의 대량 생산 방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 앱신 6 및 앱신 7 유전자(이하, 각각 "YPS6" 및 "YPS7"이라 약칭함)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자가 결손된 앱신 결손 효모 변이 균주를 제공한다. 상기에서 추가로 앱신 1, 앱신 2 및 앱신 3(이하, 각각 "YPS1", "YPS2" 및 "YPS3"이라 약칭함)으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자가 결손된 것이 바람직하다.
본 발명의 앱신 결손 효모 변이 균주에 있어서, 결손된 유전자는YPS1/YPS6,YPS2/YPS6,YPS3/YPS6,YPS1/YPS2/YPS6,YPS1/YPS3/YPS6,YPS2/YPS3/YPS6,YPS1/YPS2/YPS3/YPS6,YPS1/YPS7,YPS2/YPS7,YPS3/YPS7,YPS1/YPS2/YPS7,YPS1/YPS3/YPS7,YPS2/YPS3/YPS7,YPS1/YPS2/YPS3/YPS7및YPS1/YPS2/YPS3/YPS6/YPS7로 구성된 군으로부터 선택되는 것이 바람직하며,YPS1/YPS2/YPS3/YPS6또는YPS1/YPS2/YPS3/YPS6/YPS7이 결손된 것이 더욱 바람직하다.
앱신 유전자를 결손시키기 위한 효모 균주는 사카로마이세스 세레비시애, 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha), 피키아 패스토리스(Pichia pastoris), 야로위아 리포리티카(Yarrowia lipolytica), 스키조사카라마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe)로 구성된 군으로부터 선택되는 것이 바람직하며, 사라로마이세스 세레비시애인 것이 더욱 바람직하다.
본 발명의 변이 균주를 제조할 때에는 상기에 기재된 유전자를 결손시키기 위하여 효모 선별 표지를 사용하는 것이 바람직하다. 효모 선별 표지는 특별히 한정된 것은 아니나 팝-아웃(pop-out)이 가능한 것이면 어떤 것이든 무방하다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 URA3 선별표지를 사용하였다.
본 발명자들은YPS1,YPS2, YPS3및YPS6유전자가 동시에 결손된 앱신 사중 결손 효모 변이 균주 및YPS1,YPS2, YPS3,YPS6및YPS7이 동시에 결손된 앱신 오중 결손 효모 변이 균주를 제조하였으며, 이를 2002년 11월 27일자로 한국생명공학연구원 유전자 은행에 각각 기탁하였다(수탁번호: KCTC 10384BP 및 KCTC 10385BP).
본 발명의 효모 변이 균주는
1)YPS1,YPS2,YPS3,YPS6또는YPS7의 N 말단과 C 말단 부위를 코딩하는 유전자 절편 및 효모 선별 표지 유전자를 포함하는 카세트를 포함하는 유전자 결손 발현 벡터를 제조하는 단계;
2) 상기 단계 1에서 제조한 유전자 결손 발현 벡터를 팝 아웃이 가능한 배지에서 배양하여 효모 선별 유전자를 제거하는 단계;
3) 상기 단계 2에서 제조한 효모 선별 유전자가 제거된 균주의 게놈 DNA로부터 유전자 결손 카세트를 분리하는 단계;
4) 상기 단계 3에서 분리한 유전자 결손 카세트를 효모에 형질도입하여 상동성 재조합을 유도하는 단계; 및
5) 상기 단계 4에서 상동성 재조합이 유도되어 유전자가 결손된 변이 균주를 선별하는 단계를 통해 제조된다.
본 발명의 바람직한 실시예에서는 효모 사카로마이세스 세레비시애의 앱신 유전자YPS1,YPS2,YPS3, YPS6및YPS7으로 구성된 군으로부터 하나 이상의 유전자를 선택하여 돌연변이 균주를 제조하고(도 1,도 2및표 2참조), 상기 앱신 유전자 단일 또는 다중 결손 돌연변이 균주에 재조합 단백질 유전자를 도입하여 배양한 후 세포 배양액으로 분비되는 재조합 단백질 hPTH(인간 부갑상선 호르몬) 및 hLC I(인간 리포코틴 I)의 분해 양상을 분석한 결과, 상기 돌연변이 균주가 분비하는 재조합 단백질의 분해가 상당히 억제됨을 확인하였다(도 7및도 8참조).
또한, 본 발명은 상기 앱신 결손 변이 균주를 이용한 재조합 단백질의 대량 생산 방법을 제공한다.
본 발명의 재조합 단백질 대량 생산 방법은
1) 앱신 결손 변이 균주를 숙주세포로 하여 재조합 단백질 유전자를 포함한 발현 벡터를 도입하는 단계;
2) 단계 1에서 제조한 재조합 단백질 유전자가 도입된 앱신 결손 변이 균주를 배양하는 단계; 및
3) 단계 2의 배양 후 분비되는 재조합 단백질을 정제하는 단계를 포함한다.
상기 단계 1에 있어서, 앱신 결손 변이 균주는YPS6및YPS7유전자로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자가 결손된 것이 바람직하며,YPS1,YPS2및YPS3으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자가 추가로 결손된 것이 더욱 바람직하다.
상기 단계 1에 있어서, 재조합 단백질 유전자는 단일 또는 쌍으로 존재하는염기성 아미노산을 포함하는 재조합 단백질을 코딩하는 유전자인 것이 바람직하다. 상기에서 재조합 단백질은 인체 혈청 알부민, 글루카곤, 글루카곤 유사 펩타이드, 인체 엘라핀 전구체, 곤충 이뇨 호르몬, 인간 부갑상선 호르몬(hPTH) 및 인간 리포코틴 I(hLCI)으로 구성된 군으로부터 선택되는 것이 바람직하며, 인간 부갑상선 호르몬 또는 인간 리포코틴 I 유전자인 것이 더욱 바람직하다.
본 발명의 재조합 단백질 대량 생산 방법은 앱신 유전자가 결손된 돌연변이 균주, 특히YPS6및/또는YPS7유전자에YPS1,YPS2및/또는YPS3유전자가 추가로 결손된 돌연변이 균주를 숙주세포로 사용하여 재조합 단백질 유전자를 도입한 돌연변이 균주를 사용하기 때문에 고농도 배양시 효모가 생산하는 앱신 계열의 프로테아제 분비에 의해 재조합 단백질이 분해되는 것을 상당한 정도로 억제시킬 수 있어 재조합 단백질을 고농도 및 고수율로 생산할 수 있는 방법이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> YPS6 유전자 결손 사카로마이세스 세레비시애 변이주 제작
<1-1> YPS6 유전자 결손용 벡터의 제조
앱신6을 코딩하는YPS6유전자 결손을 유도할 상동재조합(homologous recombination)에 필요한YPS6유전자의 N-말단과 C-말단 조각을 제조하기 위하여,Genbank에 공개되어 있는YPS6유전자의 염기서열에 근거하여 프라이머를 제작한 뒤 PCR을 수행하였다. 구체적으로, Genbank에 공개되어 있는YPS6유전자의 염기서열(Acession # NP_012305)에 근거하여 PCR 프라이머(primer)로 사용될 두 쌍의 올리고뉴클레오타이드를 제조하였다. 추후 유전자 조작 과정이 용이하도록 N-말단 조각을 위한 프라이머로는 5'-말단에EcoRl 제한 효소 인식 부위를 포함시킨 서열번호 1로 기재되는YPS6N'-(F) 프라이머 및 5'-말단에BamHl 제한 효소 인식 부위를 포함시킨 서열번호 2로 기재되는YPS6N'-(R) 프라이머를 제작하였다. 또한 C-말단 조각을 위한 프라이머로는 5'-말단에BamHl 제한 효소 인식 부위를 포함시킨 서열번호 3으로 기재되는YPS6C'-(F) 프라이머 및 5'-말단에Xbal 제한 효소 인식 부위를 포함시킨 서열번호 4로 기재되는YPS6C'-(R) 프라이머를 제작하였다. 상기에서 제조한 서열번호 1 및 서열번호 2의 한쌍의 프라이머 또는 서열번호 3 및 서열번호 4의 한쌍의 프라이머를 사용하여 사카로마이세스 세레비시애의 염색체 DNA를 전사체로 하여 PCR(Perkin Elmer GeneAmp PCR 2400 thermal cycle) 반응을 수행함으로써YPS6유전자의 N-말단(∼700bp)과 C-말단 조각(∼700bp)을 증폭하였다. PCR 반응은 95℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 60초 동안 반응을 25회 수행하였다. 상기 반응후 제조된YPS6N-말단 조각은EcoRl/BamHl로, C-말단 조각은BamHl/Xbal 제한 효소를 사용하여 절단한 뒤EcoRl/Xbal으로 절단된 pBluescript KS(+)벡터(Stratagene, La Jolla, Calif.)에 삽입하여 연결하였으며, 이를 'pB-YPS6NC'라 명명하였다. 상기에서 제조한 pB-YPS6NC 벡터의YPS6유전자 말단조각 사이에 존재하는BamHl 제한효소 자리로URA3pop-out 선별표지 DNA(Kanget al.,Appl. Microbiol. Biotechnol., 2000, 53, 575-582)를 도입하여YPS6유전자 결손을 위한 벡터를 제조하고 이를 'pB-YPS6::URA3:tc5'라 명명하였다(도 1a).
<1-2> YPS6 결손 변이 균주의 제조
YPS6결손용 변이 균주를 제조하기 위해 사카로마이세스 세레비시애 균주에YPS6결손용 DNA 단편을 도입하여 상동성재조합을 유도하였다. 구체적으로, 상기 실시예 <1-1>에서 제조한YPS6결손용 벡터 pB-YPS6::URA3:tc5를EcoRl/Xbal 처리하여 절단한 후YPS6결손용 DNA 단편을 제조하였다. 사카로마이세스 세레비시애 모균주 L3262(Kanget al.,Appl. Microbiol. Biotechnol., 2000, 53, 575-582)에 상기에서 제조한YPS6결손용 DNA 단편을 형질 도입하였다. 상기 형질 도입된 세포를 우라실(uracil)만이 결핍된 합성배지(SC-URA)(Laboratory course manual for methods in yeast genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.)에 배양하면서 우라실이 결핍되어도 생존하는 균주를 선별하였다. 상기 선별된 균주로부터URA3선별표지를 제거하기 위해 상기 선별된 균주를 5'-FOA(5-fluoroorotate) 배지가 포함된 플레이트에 도말하여 배양하였다(Adamset al., Methods in yeast genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1997). 상기 배지에서 배양하여URA3유전자가 상동재조합을 통해 팝-아웃(pop-out)된 균주를 선별하고, 이를 'YPS6::tc5'라 명명하였다(도 1b). 또한, Ura- 형질을 지니면서YPS1,YPS2및YPS3유전자가 결손된 변이주(대한민국 특허공개 제2002-17754호,표 1)를 이용하여YPS6유전자를 함께 결손시킨 변이주를 상기와 동일한 방법으로 제조하였다(표 2).
균주 균주의 특징(유전형)
L3262 사카로마이세스 세레비시애 모균주(MAT a ura3-52 leu2-3,112 his4-34)
SLH11 L3262로부터YPS1제거된 균주(MATa ura3-52 leu2-3,112 his4-34 YPS1::LEU2)
SLH12 L3262로부터YPS2제거된 균주(MATa ura3-52 leu2-3,112 his4-34 YPS2::HIS4)
SLH14 L3262로부터YPS1/YPS2제거된 균주(MATa ura3-52 leu2-3,112 his4-34 YPS1::LEU2 YPS2::HIS4)
SLH15 L3262로부터YPS3제거된 균주(MATa ura3-52 leu2-3,112 his4-34 YPS3::tc5)
SLH16 L3262로부터YPS1/YPS3제거된 균주(MATa ura3-52 leu2-3,112 his4-34 YPS1::LEU2 YPS3::tc5)
SLH17 L3262로부터YPS2/YPS3제거된 균주(MATa ura3-52 leu2-3,112 his4-34 YPS2::HIS4 YPS3::tc5)
SLH18 L3262로부터YPS1/YPS2/YPS3제거된 균주(MATa ura3-52 leu2-3,112 his4-34 YPS1::LEU2 YPS2::HIS4 YPS3::tc5)
균주 균주의 특징(유전형)
SLH19 L3262로부터YPS6제거된 균주(MATa ura3-52 leu2-3,112 his4-34 YPS6::tc5)
SLH20 L3262로부터YPS1/YPS6제거된 균주(MATa ura3-52 leu2-3,112 his4-34 YPS1::LEU2 YPS6::tc5)
SLH21 L3262로부터YPS1/YPS3/YPS6제거된 균주(MATa ura3-52 leu2-3,112 his4-34 YPS1::LEU2 YPS3::tc5 YPS6::tc5)
SLH22 L3262로부터YPS1/YPS2/YPS3/YPS6제거된 균주(MATa ura3-52 leu2-3,112 his4-34 YPS1::LEU2 YPS2::tc5 YPS3::tc5 YPS6::tc6)
SLH23 L3262로부터YPS1/YPS2/YPS3/YPS6제거된 균주(MATa ura3-52 leu2-3,112 his4-34 YPS1::LEU2 YPS2::HIS4 YPS3::tc5 YPS6::tc6)
SLH24 L3262로부터YPS7제거된 균주(MATa ura3-52 leu2-3,112 his4-34 YPS7::tc5)
SLH25 L3262로부터YPS1/YPS7제거된 균주(MATa ura3-52 leu2-3,112 his4-34 YPS1::LEU2 YPS7::tc5)
SLH26 L3262로부터YPS1/YPS3/YPS7제거된 균주(MATa ura3-52 leu2-3,112 his4-34 YPS1::LEU2 YPS3::tc5 YPS7::tc5)
SLH27 L3262로부터YPS1/YPS2/YPS3/YPS7제거된 균주(MATa ura3-52 leu2-3,112 his4-34 YPS1::LEU2 YPS2::HIS4 YPS3::tc5 YPS7::tc5)
SLH28 L3262로부터YPS1/YPS2/YPS3/YPS6/YPS7제거된 균주(MATa ura3-52 leu2-3,112 his4-34 YPS1::LEU2 YPS2::HIS4 YPS3::tc5 YPS6::tc6 YPS7::tc5)
SLH29 L3262로부터YPS1/YPS2/YPS6제거된 균주(MATa ura3-52 leu2-3,112 his4-34 YPS1::LEU2 YPS2::HIS4 YPS6::tc5)
SLH30 L3262로부터YPS1/YPS2/YPS7제거된 균주(MATa ura3-52 leu2-3,112 his4-34 YPS1::LEU2 YPS2::HIS4 YPS7::tc5)
상기 변이주들의YPS6유전자가 염색체상에서 결손되었는지를 확인하기 위해 서열번호 5로 기재되는YPS6F1 프라이머 및 서열번호 6으로 기재되는YPS6R1 프라이머를 사용하여 PCR 수행하였다. 상기 PCR 반응 결과, 야생형 균주에서는 2.7 kb 크기의 DNA 절편이 증폭된 반면YPS6유전자가 결손 변이주에서는 1.7 kb 크기의 DNA 절편이 증폭되어YPS6유전자가 결손되었음을 확인하였다(도 3의A).
<실시예 2> YPS7 유전자 결손 사카로마이세스 세레비시애 변이주 제작
<2-1> YPS7 유전자 결손용 벡터의 제조
앱신 7을 코딩하는YPS7유전자 결손용 벡터는 상기 실시예 1에 기재된YPS6결손용 벡터의 제조 방법과 동일하게 제작하였다. 구체적으로, Genbank에 공개되어 있는YPS7유전자의 염기서열(Acession # NP_010636)에 근거하여 PCR 프라이머(primer)로 사용될 두 쌍의 올리고뉴클레오타이드를 제조하였다. 추후 유전자 조작 과정이 용이하도록 N-말단 조각을 위한 프라이머로는 5'-말단에EcoRl 제한 효소 인식 부위를 포함시킨 서열번호 7로 기재되는YPS7N'-(F) 프라이머 및 5'-말단에BamHl 제한 효소 인식 부위를 포함시킨 서열번호 8로 기재되는YPS7N'-(R) 프라이머를 제작하였다. 또한, C-말단 조각을 위한 프라이머로는 5'-말단에BamHl 제한 효소 인식 부위를 포함시킨 서열번호 9로 기재되는YPS7C'-(F) 프라이머 및 5'-말단에Xbal 제한 효소 인식 부위를 포함시킨 서열번호 10으로 기재되는YPS7C'-(R) 프라이머를 제작하였다. 상기에서 제조한 서열번호 7 및 서열번호 8의 한쌍의 프라이머 또는 서열번호 9 및 서열번호 10의 한쌍의 프라이머를 사용하여 사카로마이세스 세레비시애의 염색체 DNA를 전사체로 해 PCR(Perkin Elmer GeneAmp PCR 2400 thermal cycle) 반응을 수행해YPS7유전자의 N-말단(∼700bp)과 C-말단 조각(∼700bp)을 증폭하였다. PCR 반응은 95℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 60초 동안 반응을 25회 수행하였다. 상기 반응후 제조된YPS7N-말단 조각은EcoRl/BamHl로, C-말단 조각은BamHl/Xbal 제한 효소를 사용하여 절단 한 뒤EcoRl/Xbal으로 절단된 pBluescript KS(+)벡터에 삽입하여 연결한 벡터를 제조하고 이를 'pB-YPS7NC'라 명명하였다. 상기에서 제조한 pB-YPS7NC 벡터의YPS7유전자 말단조각 사이에 존재하는BamHl 제한효소 자리로URA3pop-out 선별표지 DNA를 도입하여YPS7유전자 결손을 위한 벡터를 제조하고 이를 'pB-YPS7::URA3:tc5'라명명하였다(도 2a).
<2-2> YPS7 결손 변이 균주의 제조
YPS7결손용 변이 균주의 제조는 상기 실시예 1과 동일하게 사카로마이세스 세레비시애 균주에YPS7결손용 DNA 단편을 도입하여 상동성재조합을 유도하였다. 구체적으로, 상기 실시예 <2-1>에서 제조한YPS7결손용 벡터 pB-YPS7::URA3:tc5를EcoRl/Xbal 처리하여 절단한 후YPS7결손용 DNA 단편을 제조하였다. 사카로마이세스 세레비시애 모균주 L3262에 상기에서 제조한YPS7결손용 DNA 단편을 형질 도입하였다. 상기 형질 도입된 세포를 우라실(uracil)만이 결핍된 합성배지(SC-URA)에 배양하면서 우라실이 결핍되어도 생존하는 균주를 선별하였다. 상기 선별된 균주로부터URA3선별표지를 제거하기 위해 상기 선별된 균주를 5'-FOA(5-fluoroorotate) 배지가 포함된 플레이트에 도말하여 배양하였다(Adamset al., Methods in yeast genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1997). 상기 배지에서 배양하여URA3유전자가 상동재조합을 통해 팝-아웃된 균주를 선별하고, 이를 'YPS6::tc5'라 명명하였다(도 2b). 또한, Ura- 형질을 지니면서YPS1,YPS2및YPS3유전자가 결손된 변이주(대한민국 특허공개 제2002-17754호,표 1)를 이용하여YPS7유전자를 함께 결손시킨 변이주를 상기와 동일한 방법으로 제조한 뒤표 2에 기재된 바와 같이 균주를 명명하였다(표 2). 이들 변이주들 염색체상의YPS7유전자가 결손되었는지를 확인하기 위해 서열번호 11로 기재되는YPS7F1 프라이머 및 서열번호 12로 기재되는YPS7R1 프라이머를 사용하여 PCR 수행하였다. 상기PCR 반응 결과, 야생형 균주에서는 2.5 kb 크기의 DNA 절편이 증폭된 반면,YPS7유전자가 결손된 변이주에서는 1.5 kb 크기의 DNA 절편이 증폭되어YPS7유전자가 결손되었음을 확인하였다(도 2b).
본 발명자들은YPS1,YPS2및YPS3유전자에 추가로YPS6유전자가 동시에 결손됨을 확인한 앱신 사중 변이주를 'SLH23(YPS1ΔYPS2ΔYPS3ΔYPS6Δ)'라 명명하고,YPS1,YPS2및YPS3유전자에 추가로YPS6및YPS7유전자가 동시에 결손됨을 확인한 앱신 오중 변이주를 'SLH28(YPS1ΔYPS2ΔYPS3ΔYPS6ΔYPS7Δ)'이라 명명한 뒤 2002년 11월 27일자로 한국생명공학연구원 유전자 은행에 기탁하였다(수탁번호; KCTC 10384BP, KCTC 10385BP).
<실시예 3> 앱신 다중 결손 변이주의 성장 특징
<3-1> 성장 속도 측정
상기 실시예 1 및 실시예 2에서 제작된 앱신 프로테아제 결손 변이주(표 2)들의 생리적 특징을 분석하였다. 먼저, 앱신 유전자들 중YPS1만 결손된 변이주 SLH11(YPS1Δ), YPS1과YPS2유전자가 결손된 이중 결손 변이주 SLH14(YPS1ΔYPS2Δ), YPS1, YPS2, YPS3유전자가 결손된 삼중 결손 변이주 SLH18(YPS1ΔYPS2ΔYPS3Δ), YPS1, YPS2, YPS3, YPS6유전자가 결손된 사중 결손 변이주 SLH23(YPS1ΔYPS2ΔYPS3ΔYPS6Δ),YPS1, YPS2, YPS3, YPS6, YPS7유전자 모두가 결손된 오중 결손 변이주 SLH28(YPS1ΔYPS2ΔYPS3ΔYPS6ΔYPS7Δ)들의 생리적 특성을 분석하기 위해 성장 양상을 여러 다양한 배양 조건에서 비교 분석하였다. 먼저, 변이 균주의 생장속도를 분석하기 위해 상기에서 제작한 균주들을 각각 액체 YPD 배지(효모 추출물 1%, 박토 펩톤 2%, 포도당 1%) 3 ㎖에 접종하고 30℃에서 190 rpm으로 16시간 동안 배양하였다. 상기 배양후 OD600이 1이 되었을 때 배양액을 취한 후(OD가 1일 경우 세포의 수는 3 ×107세포수/㎖), 상기 배양액을 3 ×106세포수/㎖, 3 ×105세포수/㎖, 3 ×104세포수/㎖ 및 3 ×103세포수/㎖이 되도록 희석하여 평판배지에 스파팅(spotting)한 후 세포수를 측정함으로써 세포의 성장 속도를 분석하였다.
그 결과, 상기 앱신 변이주들은 야생형과 거의 동일한 성장 속도를 보였지만 다섯 개의 앱신 유전자가 동시에 결손된 오중 앱신 결손 변이주인 SLH28의 경우는 야생형에 비해 성장 속도가 다소 감소되었다(도 4a).
<3-2> 온도에 대한 민감성 조사
변이 균주들의 온도 민감성 분석을 하기 위해 상기 실시예 <3-1>과 동일한 조건으로 변이 균주를 YPD 배지에 스파팅한 후 37℃ 및 30℃에서 48시간, 20℃에서 72시간, 16℃에서 120시간의 조건으로 배양하였다. 상기 배양후 각 배양 조건에서의 세포의 성장 정도를 측정하여 온도 민감성 분석하였다.
그 결과, 높은 온도인 37℃에서는 앱손 이중 결손 변이주인 SLH14는 야생형 균주에 비해 성장하지 못하였고, 삼중, 사중 및 오중 결손 변이주인 SLH18, SLH23, SLH28에서는 상기 엡손 이중 결손 변이주보다 훨씬 더 명백하게 성장하지 못하여 앱신 다중 변이주는 야생형과는 달리 높은 온도에 민감함을 알 수 있었다. 그러나, 상기 앱신 변이주들은 정상적인 온도인 30℃와 낮은 온도인 20℃와 16℃에서는 성장이 전혀 감소되지 않고 야생형과 동등한 정도로 성장하였다(도 4b).
<3-3> 항생제 및 삼투압에 대한 민감성 조사
항생제가 앱신 결손 변이주의 성장에 미치는 영향을 분석하기 위해 YPD 배지에 50 ㎍/㎖의 하이그로마이신 B(hygromycin B)(Sigma, St. Louis, Mo.)를 첨가하여 상기 앱신 다중 결손 변이주들을 30℃에서 배양한 결과, 모든 앱신 다중 결손 변이주는 성장하기 못했다.
또한, 삼투압의 조절이 앱신 결손 변이주의 성장에 미치는 영향을 분석하기 위해 YPD 배지에 삼투압 안정제인 1M 소비톨(sorbitol)를 첨가하여 높은 온도인 37℃에서 배양한 결과, 모든 앱신 다중 결손 변이주는 1M 소비톨을 첨가하지 않고 배양한 것에 비해 세포의 성장 정도가 야생형 균주의 수준으로 회복되었다. 상기 결과를 통해, 앱신 다중 결손 변이주들의 세포벽은 야생형에 비해 약화되어 있음을 알 수 있었다.
<3-4> pH에 대한 민감성 조사
앱신 결손 변이주의 pH 민감성을 분석하기 위해 pH 3.5인 산성 조건과 pH 8.0인 알칼리성 조건에서 야생형 균주 및 앱신 결손 변이주를 배양하여 성장 정도를 분석하였다. 구체적으로, YPD 배지에 0.05 M 숙신산 완충용액(sucinic acid, pH 3.0)을 첨가하여 pH 3.5로 조정하거나 YPD 배지에 p.1 M 트리스 완충용액(Tris-Cl, pH 8.25)을 첨가하여 pH 8.0으로 조정한 배지를 제조한 후 상기에서 제조한 앱신 다중 결손 변이주를 스파팅하여 배양하였다. 그 결과, 산성 조건 및 알칼리성 조건에서는YPS1만 파쇄된 변이주 SLH11은 성장한 반면, 앱신 다중 결손 변이주인 SLH14,SLH18,SLH23,SLH28은 성장하지 못하였으며, 여기에 삼투압 안정제인 1M 소비톨을 첨가하여 배양한 결과, 산성 조건에서는 성장이 회복되지 못하였으나 pH 8.0 알칼리성 조건에서는 성장이 다소 회복되는 것을 관찰하였다(도 5a).
<3-5> 염에 대한 민감성 조사
앱신 다중 결손 변이주의 염에 대한 민감성 분석을 하기 위해 0.4M NaCl 또는 0.8M NaCl이 첨가된 YPD 배지에 상기 앱신 다중 결손 변이주를 스파팅하여 배양한 후 이들의 성장 정도를 분석하였다. 그 결과, 0.4M NaCl이 첨가된 배지에서는 앱신 다중 결손 균주들의 성장이 야생형과 같이 잘 자란 반면, 0.8M NaCl이 첨가된 배지에서는 특히 앱신 유전자가 세개 이상 결손된 변이주인 SLH18,SLH23 및 SLH28의 생장이 다소 감소하였다(도 5b).
상기에서 살펴본 바와 같이, 앱신 결손 변이주들은 야생형 균주에 비해 높은 온도, 높은 염도, 극심한 pH 등 스트레스가 주어지는 조건에서 성장이 급격히 감소하거나 생존하지 못하는 생리적 특징을 보였다. 따라서, 앱신 프로테아제들은 정상적인 배양 조건에서는 세포 생존에 불필요하지만 여러 스트레스 조건에서 세포가 저항성을 가지고 살아가기 위해 필요한 기능을 수행하는 단백질들의 프로세싱에 관여함을 알 수 있다.
<실시예 4> 앱신 결손 변이주가 재조합 hPTH의 분해에 미치는 영향 분석
<4-1> 재조합 hPTH가 도입된 앱신 결손 변이주의 성장 분석
상기 실시예 1 및 실시예 2에서 제작한 앱신 변이주 중 네 개의 앱신 유전자가 결손된 사중 앱신 결손 변이주인 SLH23(YPS1ΔYPS2ΔYPS3ΔYPS6Δ) 및 다섯 개의 앱신 유전자가 동시에 결손된 오중 앱신 결손 균주 SLH28(YPS1ΔYPS2ΔYPS3ΔYPS6ΔYPS7Δ)를 숙주세포로 하여 재조합 hPTH(human parathyroid hormone)를 발현시킨 후 고농도 균체 배양을 수행하여 선행발명(대한민국 특허공개 제2002-17754)에서 개발된 앱신 삼중 결손 균주 SLH18(YPS1ΔYPS2ΔYPS3Δ)를 숙주세포로 사용한 경우와 함게 균주의 성장을 비교 분석하였다. 구체적으로, hPTH를 발현시키기 위한 벡터로GAL10프로모터::ppL::hPTH 유전자::GAL7터미네이터 유전자의 순으로 구성된 hTPH 발현카세트를 가지고 있는 사카로마이세스 세레비시애 플라스미드인 pG10-hPTH (Chunget al.,Biotechnol. Bioeng., 1998, 57, 245)을 사용하였다. 상기 pG10-hPTH 발현 벡터를 SLH18, SLH23 및 SLH28 변이 균주에 형질 도입한 후 선별된 돌연변이 균주를 갈락토오즈와 에탄올을 피딩 배지(feeding media)로 하는 유가식 배양으로 배양하였다(Songetet al.,Process Biochemistry, 2000, 35, 503). 먼저 상기 선별된 돌연변이 균주를 10 ㎖의 YNBCAD(0.67% 아미노산이 없는 효모 나이트로젠 베이스, 2% 글루코즈 및 0.5% 카사미노산) 배지에서 배양한 후 상기 배양액의 종균을100 ㎖의 YNBCAD 배지에서 플라스크 배양한 후 2.5 ℓ의 주 배양액(글루코즈 20 g/ℓ, 효모 추출물 40 g/ℓ, 카사미노산 5 g/ℓ 및 KH2PO410 g/ℓ)에 접종하였다. 800 g/ℓ의 에탄올과 400 g/ℓ의 갈락토오즈를 피딩 배지로 준비하였고, 피딩시에는 에탄올과 갈락토오즈의 농도를 각각 20 g/ℓ와 10 g/ℓ로 맞추어 주었다. 피딩 방법은 초기의 탄소원인 글루코즈가 고갈된 후 에탄올과 갈락토오즈를 첨가하여 외래 단백질의 발현을 유도하고 세포 생장을 지속시키는 것이다. 배양 12시간 후에 글루코오즈는 모두 소모되었으며 이때 준비한 에탄올과 갈락토오즈를 첨가하였다. 그 이후에는 pH와 세포 농도가 상승할 때 마다 배양 배지내의 농도가 각각 에탄올은 20 g/ℓ 및 갈락토오즈는 10 g/ℓ가 되도록 간헐적으로 피딩 배지를 공급하였다. 배양 온도와 pH는 각각 30℃ 및 5.5로 일정하게 유지시켰다.
그 결과, SLH18 변이주의 경우는 30 시간 이후에도 세포의 생장속도가 꾸준히 증가하였지만, SLH23과 SLH28 변이주들은 30시간 이후에는 정체기(stationary phase)에 접어들어 갈락토오즈와 에탄올를 계속 소모하기는 하여도 균체의 농도는 더 이상 증가하지 않았다(도 6).
<4-2> 재조합 hPTH가 도입된 앱신 결손 변이주의 hPTH 분비 발현 분석
재조합 hPTH가 도입된 앱신 결손 변이주가 생산하는 hPTH의 분비에 앱신 결손이 미치는 영향을 분석하였다. 구체적으로, 상기 실시예 <4-1>에서 제조한 앱신결손 변이주를 배양한 후 세포 배양 배지를 수득하여 TCA(trichloroacetic acid)로 침전시킨 후 SDS-PAGE로 전기영동하여 분리한 후 쿠마시 염색법으로 염색하였다.
그 결과, 배양 배지로 분비 축적된 hPTH의 분해경향은 SLH18의 경우에는 발효시간이 경과함에 따라 6 kDa, 4 kDa에 위치하는 단편들이 증가하면서 상대적으로 완전한 크기의 hPTH 양은 감소하는 경향을 보였다(도 7의A). 그러나, SLH23과 SLH28의 경우에는 완전한 크기의 hPTH의 양은 어느 정도 일정하게 유지되는 경향을 보이지만 SLH18에 비하여 hPTH의 분해가 억제되는 경향이 관찰되었다(도 7의B,도 7의C). 따라서, 상기 고농도 균체 배양 실험결과를 통해 앱신 유전자YPS1,YPS2및YPS3까지 결손된 앱신 삼중 결손 변이주인 SLH18(YPS1ΔYPS2ΔYPS3Δ)보다는YPS6및/또는YPS7유전자가 추가로 결손된 균주인 SLH23(YPS1ΔYPS2ΔYPS3ΔYPS6Δ)과 SLH28(YPS1ΔYPS2ΔYPS3ΔYPS6ΔYPS7Δ)에서 배양배지로 분비된 hPTH의 분해가 현저히 억제됨을 확인함으로써,YPS6및/또는YPS7유전자가 추가로 결손된 앱신 다중 결손 변이주들이 높은 수율로 완전한 형태의 hPTH를 생산하는 숙주세포로 적합함을 알 수 있었다.
<실시예 5> 앱신 결손 변이주에서의 인체 리포코틴 분비 발현 분석
인체 리포코틴-I(human lipocortin-I: hLC I)은 스테로이드 호르몬인 글루코콜티코이드 투여시 세포내외의 농도가 증가하는 대표적인 단백질로서 시험관에서 포스포리파제 A2(PLA2) 활성에 대한 저해작용을 나타내며 또한 칼슘 존재하에 인지질과 결합하는 기능을 지니고 있다. 리포코틴은 생체 내에서 염증 반응에 관여하는 PLA2의 활성을 억제하는 소염작용에 관여하므로 이를 재조합 의약용 단백질로 개발하기 위한 관심을 받고 있으며 지금까지 여러 다양한 숙주세포 시스템에서 발현이 시도되었다(Wallneret al.,Nature, 1990, 320, 77; Huhet al.,Kor. Biochem. J., 1990, 23, 459; Giga-Hamaet al.,Bio/Technol,1994, 12, 400). 분자량이 37 kDa인 hLC I은 346개의 아미노산으로 이루어져 있는 데(Wonget al.,Biochem. J, 1991, 15,313) 특이하게도 단일 또는 쌍으로 이루어진 염기성 아미노산 함량이 매우 높아 효모에서 분비 발현시 앱신 프로테아제들의 공격을 받을 가능성이 매우 높다. 실제로 본 발명자들이 hLC I을 사카로마이세스 세레비시애에서 분비 발현을 시도한 경우, hLC I의 발현 효율 자체는 높지만 거의 분해된 형태의 hLC I으로 발현 분비되어 큰 문제점으로 지적되었다(Chunget al.,Biotechnol. Bioeng., 1996, 49, 473).
본 발명자들은 사카로마이세스 세레비시애에서 분비 발현되는 재조합 hLCI의 분해에 앱신 프로테아제들이 관여하는 지 여부를 조사하기 위해, 여러 앱신 결손 균주들을 숙주세포로 이용하여 재조합 hLC I을 발현시킨 후 야생형과 비교 분석하였다. 구체적으로, 인간 리포코틴을 발현하기 위한 벡터로는GAL10프로모터::ppL::리포코틴 유전자::GAL7터미네이터 유전자의 순으로 구성된 발현카세트를 지니고 있는 사카로마이세스 세레비시애 플라스미드인 pYGLP10( Chunget al.,J. Ferment. Bioeng., 1997, 84, 446)을 사용하였다. 상기 실시예 4와 동일한 방법으로 상기 pYGLP10 발현 벡터를 본 발명의 앱신 결손 균주에 형질 도입하고 갈락토즈 및 에탄올 피딩을 통한 고농도 균체 배양을 하였다. 상기 배양 24시간 후 확보한 세포 배양 배지를 수득하여 TCA로 침전시킨 후 SDS-PAGE로 전기영동하여 분리한 후 쿠마시 염색법으로 염색하였다. 또한, 상기 SDS-PAGE로 전기 영동한 젤을 트랜스퍼 버퍼(10 mM CAPS)를 이용하여 100V에서 30분 동안 니트로셀룰로즈 필터(nitrocellulose filter)로 전이시킨 후 TBST 버퍼(TBS(0.15 M NaCl, 0.05 M Tris-Cl(pH 7.4), 0.005% Tween20), 0.05% Tween20)와 BSA(Bovine serum albumin)로 상온에서 30분동안 처리한 뒤 hLCI을 특이적으로 인식하는 모노클로날 항체(BD bioscience)를 1:5000으로 첨가하여 1시간 30분동안 반응시킨 후 TBST로 3번 세척하였다. 이를 알칼라인 포스파타제 융합 이차 항체(Biorad, Hercules, CA)로 1시간 30분 동안 처리하고 TBST로 세척한 후 NBT와 BCIP를 이용하여 발색시켰다.
그 결과, 야생형 균주의 경우 재조합 hLCI이 거의 다 분해되어 온전한 크기인 37 kDa의 hLC I은 거의 관찰되지 않았고 31 kDa의 분해산물인 d2만이 배양액에 축적된 주된 단백질로 관찰되었다. 또한,YPS1유전자가 결손된 균주 SLH11(YPS1Δ)의 경우 d2 형태의 분해산물이 다소 감소되고 그와 비례해서 좀 더 크기가 증가된 34 kDa의 리포코틴 분해산물인 d1이 관찰되었지만, 여전히 온전한 크기의 hLC I은 관찰되지 않았다. 이에 반해 앱신 유전자가 두 개 이상 결손된 다중 앱신 결손 변이주의 경우 온전한 크기의 hLCI이 배양 배지에 축적됨을 확인하였다(도 8a).
또한, 상기 균주를 48시간 동안 배양 후 확보된 배양배지를 분석한 결과, 앱신 이중 결손 변이주인 SLH14(YPS1ΔYPS2Δ)에서는 d1과 더불어 또 다른 형태의 32 kDa 크기의 hLCI 분해산물 d3가 관찰되고, 삼중 결손 변이주인 SLH18(YPS1ΔYPS2ΔYPS3Δ)에서도 d3 형태의 분해된 hLCI이 일부 관찰되었다(도 8b). 또한, 상기 균주를 72시간 배양한 후 확보된 배양 배지를 분석한 결과, SLH18 균주의 경우 d3 형태의 분해된 hLC I은 더욱 많은 양으로 축적되지만, 앱신 사중 변이주인 SLH23(YPS1ΔYPS2ΔYPS3ΔYPS6Δ),오중 변이주인 SLH28(YPS1ΔYPS2ΔYPS3ΔYPS6ΔYPS7Δ)에서는 d3 형태의 분해된 hLCI을 거의 관찰할 수 없었다(도 8c).
따라서,YPS1,YPS2,YPS3외에도YPS6과YPS7이 재조합 리포코틴 절단에 관여하며, 리포코틴 대량 생산을 위한 고농도 균체 배양시 온전한 형태의 리포코틴 발현 효율을 높이기 위해서는YPS6또는YPS7유전자 결손이 포함된 앱신 다중 결손 변이주들이 적합한 숙주세포임을 알 수 있었다.
상기 결과로부터, 본 발명의 앱신 다중 결손 효모 균주는 세포외로 분비된 재조합 단백질을 절단하는 프로테아제 활성이 감소되어 목적 단백질을 온전한 형태로 분리 및 정제할 수 있게 함으로써 산업적으로 유용하게 사용될 수 있다.
<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Yeast mutant strains deficient in the multiple yapsin genes and method for the production of recombinant proteins using the same <130> 2p-12-23 <160> 12 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> YPS6N'-(F) <400> 1 ttaagaattc atacgagcgt catatgtc 28 <210> 2 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> YPSN'-(R) <400> 2 cggaggatcc taaaacggtc aatgaacac 29 <210> 3 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> YPS6C'-(F) <400> 3 tcccggatcc tttagtacat gggtatataa g 31 <210> 4 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> YPS6C'-(R) <400> 4 actttctaga acaatacctc aagctacc 28 <210> 5 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> YPS6 F1 <400> 5 ttaagaattc atacgagcgt catatgtc 28 <210> 6 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> YPS6 R1 <400> 6 actttctaga acaatacctc aagctacc 28 <210> 7 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> YPS7N'-(F) <400> 7 ctatgaattc cagtgctttg tatcataccg 30 <210> 8 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> YPS7N'-(R) <400> 8 gataggatcc actagcaaac gttggcgttg 30 <210> 9 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> YPS7C'-(F) <400> 9 gtcaggatcc atgttcactg tcccaggtc 29 <210> 10 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> YPS7C'-(R) <400> 10 gtgttctaga ggataggtct gcaaaacac 29 <210> 11 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> YPS7 F1 <400> 11 ctatgaattc cagtgctttg tatcataccg 30 <210> 12 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> YPS7 R1 <400> 12 gtgttctaga ggataggtct gcaaaacac 29

Claims (9)

  1. YPS6및YPS7로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자가 결손된 앱신 결손 효모 변이 균주.
  2. 제 1항에 있어서,YPS1,YPS2및YPS3로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자가 추가로 결손된 것을 특징으로 하는 균주.
  3. 제 1항에 있어서, 효모는 사카로마이세스 세레비시애인 것을 특징으로 하는 균주.
  4. 제 2항에 있어서,YPS1,YPS2,YPS3및YPS6유전자가 결손된 것을 특징으로 하는 SLH23(YPS1ΔYPS2ΔYPS3ΔYPS6Δ) 균주;(수탁번호: KCTC 10384BP).
  5. 제 2항에 있어서,YPS1,YPS2,YPS3,YPS6및YPS7유전자가 결손된 것을 특징으로 하는 SLH28(YPS1ΔYPS2ΔYPS3ΔYPS6ΔYPS7Δ)균주;(수탁번호: KCTC10385BP).
  6. 1) 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항의 앱신 결손 변이 균주를 숙주세포로 하여 재조합 단백질 유전자를 포함한 발현 벡터를 도입하는 단계;
    2) 단계 1에서 제조한 재조합 단백질 유전자가 도입된 앱신 결손 변이 균주를 배양하는 단계; 및
    3) 단계 2의 배양 후 분비되는 재조합 단백질을 정제하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 단백질의 대량 생산 방법.
  7. 제 6항에 있어서, 재조합 단백질 유전자는 단일 또는 쌍으로 존재하는 염기성 아미노산 잔기를 포함하는 재조합 단백질을 코딩하는 유전자인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 7항에 있어서, 재조합 단백질은 인체 혈청 알부민, 글루카곤, 글루카곤 유사 펩타이드, 인체 엘라핀 전구체, 곤충 이뇨 호르몬, 인간 부갑상선 호르몬 및 인간 리포코틴 I으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 8항에 있어서, 재조합 단백질은 인간 부갑상선 호르몬 또는 인간 리포코틴 I인 것을 특징으로 하는 방법.
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