KR20010098713A - 유전자 클러스터의 유전자 - Google Patents

Abstract

ML-236B는 HMG-CoA 리덕타제의 억제제이고 상기의 다른 억제제, 프라바스타틴을 제조하는데 유용하다. ML-236B 생산 미생물을 사용한 ML-236B의 제조는 상기 미생물에 존재하는 폴리케티드 신타제 클러스터에 관련된 유전자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 사용하여 증강된다.

Description

유전자 클러스터의 유전자{GENES FROM A GENE CLUSTER}

본 발명은 유전자 클러스터, 및 더 특히 유전자 클러스터의 유전자에 관한 것이다.

더 특히 본 발명은 ML-236B 생산 미생물에 도입되었을 때 ML-236B 생산 미생물에서 HMG-CoA 리덕타제 억제제, ML-236B의 생합성을 촉진하는, DNA와 같은 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 추가로 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 삽입하는 벡터, 상기 벡터에 의해 형질전환되는 숙주 세포, 상기 벡터에 의해 발현되는 단백질, 상기 폴리뉴클레오티드 및/또는 단백질을 사용하여 ML-236B를 생성하는 방법(상기 숙주 세포의 배양물로부터 ML-236B를 회수하는 것을 포함함)에 관한 것이고, 또한 본 발명은 다른 연관된 측면에 관한 것이다.

프라바스타틴(pravastatin)은 HMG-CoA 리덕타제 억제제이다. 프라바스타틴 소듐은 지방과잉혈증 또는 지질과잉혈증의 치료에 사용됐고 혈청 콜레스테롤을 감소시킬 수 있는 약리학적으로 유용한 효과를 갖는다.스트렙토미세스 카르보필러스 (Streptomyces carbophilus)를 사용하여페니실륨 시트리눔(Penicillium citrinum)에 의해 생성되는 ML-236B의 미생물학적 전환에 의해 프라바스타틴을 수득할 수 있다[Endo, A.,et al., J. Antibiot., 29 1346 (1976); Matsuoka, T.,et al., Eur. J. Biochem., 184, 707 (1989) 및 일본 특허 출원 공보 제 57-2240 호에 기술되어 있음].

프라바스타틴의 전구체, ML-236B와 HMG-CoA 억제제, 로바스타틴은 모두 동일한 부분 구조를 공유한다고 보여졌다. 상기는 폴리케티드를 통해 생물학적으로 합성된다[Moore, R.N., et al., J. Am. Chem. Soc., 107, 3694 (1985); Shiao, M. and Don, H. S., Proc. Natl. Sci. Counc. Repub. China B, 11, 223 (1987)에 기술되어 있음].

폴리케티드는 아세트산, 프로피온산, 부티르산 등과 같은 저분자량의 카르복실산의 연속 축합 반응으로부터 생성되는 β-케토 탄소 사슬로부터 유도되는 화합물이다. 각각의 β-케토 카르보닐기의 축합 또는 환원의 경로에 따라 다양한 구조를 유도할 수 있다[Hopwood, D.A. and Sherman, D.H., Annu. Rev. Genet., 24, 37-66 (1990); Hutchinson, C.R. and Fujii, I., Annu. Rev. Microbiol., 49, 201-238 (1995)에 기술되어 있음].

폴리케티드의 합성에 기여하는 폴리케티드 신타제(이하 PKS 로 지칭함)는 사상균 및 세균에 존재하는 것으로 공지된 효소이다. 사상균의 효소는 분자생물학적 기술을 사용하여 연구되었다[Feng, G.H. and Leonard, T.J., J. Bacteriol., 177, 6246 (1995); Takano, Y.,et al., Mol. Gen. Genet. 249. 162 (1995)에 기술되어 있음]. 로바스타틴 생성 미생물인아스페르길루스 테레우스(Aspergillus terreus)에서, 로바스타틴의 생합성에 관련된 PKS 유전자를 분석했다[일본에서의 국제 출원 공개 (KOHYO) 제 9-504436 호에 기술되어 있고, 트리올 폴리케티드 신타제를 코딩하는 DNA 를 청구한, 상응하는 WO 9512661 을 보라].

사상균의 2 차 대사의 생합성에 관련된 유전자는 종종 게놈 상에서 클러스터를 형성한다. 폴리케티드의 생합성 경로에서, 상기 경로에 관여하는 유전자 클러스터가 존재하는 것으로 공지되어 있다.아스페르길루스 플라부스(Aspergillus flavus)및아스페르길루스 파라시티쿠스(Aspergillus parasiticus)에 의해 생성되는 폴리케티드인 아플라톡신(Aflatoxin)의 생합성에서, 상기 생합성에 관여하는 효소 단백질(예를 들어 PKS)을 코딩하는 유전자가 클러스터 구조를 형성하는 것으로 공지되었다. 아플라톡신의 생합성에 관여하는 유전자의 게놈 분석 및 비교를 수행했다[Yu, J.,et al., Appl. Environ. Microbiol., 61, 2365 (1995)를 보라].아스페르길루스 니둘란스(Aspergillus nidulans)에 의해 생성되는 스테리그마토시스틴(Sterigmatocystin)의 생합성에 관여하는 유전자가 그의 게놈 상에 약 60 kb 의 연속된 영역에 클러스터 구조를 형성한다고 보고되었다[Brown, D.W. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 1418 (1996)에 기술되어 있음].

로바스타틴 합성 동안 부단백질에 의해 폴리케티드 신타제 활성의 조절을 조사했다[Kennedy, J.et al., Science Vol 284, 1368 (1999)를 보라].

그러나, 현재까지는, ML-236B 의 생합성 및 상기를 조절하는 인자를 분자생물학적으로 분석하는 것이 불충분했다. 본 발명은 상기 문제에 착수하는 것을 시도한다.

도 1 은 DNA 벡터 pSAKcos1의 작제를 나타내는 도식이고;

도 2 는 pML48의 삽입 서열의 구조 유전자 분석의 결과이고;

도 3 은 pML48 의 삽입 서열의 노턴(Northern) 블롯 혼성화를 나타내고;

도 4 는 cDNA 발현 벡터 pSAK700 의 작제를 나타내는 도식이고;

도 5 는 pSAKexpR 형질전환체에서의mlcA 내지 E 및 R 의 전사에 대한 RT-PCR 분석을 나타낸다.

도 6 은 pSAKexpE 형질전환체에서의mlcE의 전사에 대한 RT-PCR 분석을 나타낸다.

본 발명에 따라, ML-236B 의 생합성을 촉진하는데 사용하기 적합한 폴리뉴클레오티드가 제공된다.

폴리뉴클레오티드는 전형적으로 서열 번호 38, 42, 44, 46, 48 또는 50 의 아미노산 서열을 포함하거나 상기 서열로 구성되는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드이다. 하나 이상의 결실, 부가, 치환 또는 변경을 갖는 변형 아미노산 서열을 코딩하는 그의 폴리뉴클레오티드 변이체도 또한 제공된다.

서열 목록에 대한 작성표

서열 목록은 본 특허 명세서의 일부를 형성한다. 이해를 돕기 위해, 서열 목록의 하기 작성표를 제공한다.

서열 번호 동정

1 pML48 인서트

2 서열 번호 1 에 상보적임

3 실시예 4 의 PCR 프라이머

4 실시예 4 의 PCR 프라이머

5 5'-RACE 용 올리고뉴클레오티드 DNA(1), 실시예 8

6 5'-RACE 용 올리고뉴클레오티드 DNA(1), 실시예 8

7 5'-RACE 용 올리고뉴클레오티드 DNA(1), 실시예 8

8 5'-RACE 용 올리고뉴클레오티드 DNA(1), 실시예 8

9 5'-RACE 용 올리고뉴클레오티드 DNA(1), 실시예 8

10 5'-RACE 용 올리고뉴클레오티드 DNA(1), 실시예 8

11 5'-RACE 용 올리고뉴클레오티드 DNA(2), 실시예 8

12 5'-RACE 용 올리고뉴클레오티드 DNA(2), 실시예 8

13 5'-RACE 용 올리고뉴클레오티드 DNA(2), 실시예 8

14 5'-RACE 용 올리고뉴클레오티드 DNA(2), 실시예 8

15 5'-RACE 용 올리고뉴클레오티드 DNA(2), 실시예 8

16 5'-RACE 용 올리고뉴클레오티드 DNA(2), 실시예 8

17 5'-말단 cDNA 프래그먼트, 실시예 8

18 5'-말단 cDNA 프래그먼트, 실시예 8

19 5'-말단 cDNA 프래그먼트, 실시예 8

20 5'-말단 cDNA 프래그먼트, 실시예 8

21 5'-말단 cDNA 프래그먼트, 실시예 8

22 5'-말단 cDNA 프래그먼트, 실시예 8

23 3'-RACE 용 올리고뉴클레오티드 DNA(3), 실시예 8

24 3'-RACE 용 올리고뉴클레오티드 DNA(3), 실시예 8

25 3'-RACE 용 올리고뉴클레오티드 DNA(3), 실시예 8

26 3'-RACE 용 올리고뉴클레오티드 DNA(3), 실시예 8

27 3'-RACE 용 올리고뉴클레오티드 DNA(3), 실시예 8

28 3'-RACE 용 올리고뉴클레오티드 DNA(3), 실시예 8

29 3'-말단 cDNA 프래그먼트, 실시예 8

30 3'-말단 cDNA 프래그먼트, 실시예 8

31 3'-말단 cDNA 프래그먼트, 실시예 8

32 3'-말단 cDNA 프래그먼트, 실시예 8

33 3'-말단 cDNA 프래그먼트, 실시예 8

34 3'-말단 cDNA 프래그먼트, 실시예 8

35 RT-PCR 프라이머, 실시예 9

36 RT-PCR 프라이머, 실시예 9

37mlcE; cDNA 뉴클레오티드 서열 및 추정된 아미노산 서열

38 추정된 mlcE 폴리펩티드

39 RT-PCR 프라이머, 실시예 12

40 RT-PCR 프라이머, 실시예 12

41mlcR; cDNA 뉴클레오티드 서열 및 추정된 아미노산 서열

42 추정된 mlcR 폴리펩티드

43mlcA; cDNA 뉴클레오티드 서열 및 추정된 아미노산 서열

44 추정된 mlcA 폴리펩티드

45mlcB; cDNA 뉴클레오티드 서열 및 추정된 아미노산 서열

46 추정된 mlcB 폴리펩티드

47mlcC; cDNA 뉴클레오티드 서열 및 추정된 아미노산 서열

48 추정된 mlcC 폴리펩티드

49mlcD; cDNA 뉴클레오티드 서열 및 추정된 아미노산 서열

50 추정된 mlcD 폴리펩티드

51 RT-PCR 프라이머, 실시예 17

52 RT-PCR 프라이머, 실시예 17

53 RT-PCR 프라이머, 실시예 17

54 RT-PCR 프라이머, 실시예 17

55 RT-PCR 프라이머, 실시예 17

56 RT-PCR 프라이머, 실시예 17

57 RT-PCR 프라이머, 실시예 17

58 RT-PCR 프라이머, 실시예 17

59 RT-PCR 프라이머, 실시예 17

60 RT-PCR 프라이머, 실시예 17

61 RT-PCR 프라이머, 실시예 17

62 RT-PCR 프라이머, 실시예 17

바람직한 구현

서열 번호 38, 42, 44, 46, 48 또는 50의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 cDNA, 게놈 DNA 또는 mRNA 일 수 있다. 상기 6 개의 서열 각각을 코딩하는 게놈 DNA를 구조 유전자mlcE,mlcR,mlcA,mlcB,mlcE 및mlcD 로 각각 지칭한다. 상기 지정에 얽매이지 않고, 본 발명자들은 구조 유전자가 히기 기능을 갖는 단백질을 코딩하는 것으로 믿는다.

mlcA 폴리케티드 신타제

mlcB 폴리케티드 신타제

mlcC P450 모노옥시게나제

mlcD HMG-CoA 리덕타제

mlcE 유출 펌프

mlcR 전사 인자

본 발명자들은mlcE 또는 mlcE에 상응하는 cDNA 의 삽입이 ML-236B의 생합성을 촉진할 수 있고mlcR 또는mlcR에 상응하는 cDNA 의 삽입이 ML-236B의 생합성을 촉진할 수 있다는 것을 발견했다. 또한,mlcR이mlcA 내지 D의 전사 발현을 자극한다. 유전자 붕괴 연구에서 나타난 것처럼,mlcA, B, C 및 D 는 독립적으로 또는 조합으로 ML-236B의 생성에 관여한다.

천연 또는 인공적인 변화에 의해 수득가능한mlcA, B 및/또는 C의 변이체가프라바스타틴 또는 로바스타틴과 같은 스타틴을 포함한 ML-236B의 유도체를 생성하는데 유용할 것이다. 상기 관점에서, 일반적으로스트렙토미세스 카르보필루스로 수행되는 ML-236B의 프라바스타틴으로의 미생물학적 전환이 필요하지 않고 오직 하나의 발효 단계로 상기 변이체를 이용하여 직접 프라바스타틴을 생성하는 것이 가능하다.

바람직한 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 37을 포함하거나, ML-236B의 생합성을 촉진할 수 있는 그의 돌연변이체 또는 변이체를 포함하는 서열을 포함한다. 상기 DNA 폴리뉴클레오티드는 형질전환된에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)pSAKexpE SANK 72499 (FERM BP-7005)로부터 수득가능하다.

다른 바람직한 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 41을 포함하거나, ML-236B의 생합성을 촉진할 수 있는 그의 돌연변이체 또는 변이체를 포함하는 서열을 포함한다. 상기 DNA 폴리뉴클레오티드는 형질전환된에스케리키아 콜라이pSAKexpR SANK 72599 (FERM BP-7006)로부터 수득가능하다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드를 하나 이상의 폴리뉴클레오티드와 작동성 조합물 형태로 사용할 수 있다. 바람직한 조합물은 ML-236B 생산 미생물에서 ML236B 의 생성을 증강시키는데 사용하기 적합하다.

상기 조합물의 예는 서열 번호 37의 폴리뉴클레오티드, 또는 서열 번호 37 그 자체, 41, 43, 45, 47 또는 49로부터 선택된 하나 이상의 서열과 조합된 형태로, 유사한 기능을 갖는 그의 변이체; 및 서열 번호 41의 폴리뉴클레오티드, 또는 서열 번호 37, 41 그 자체, 43, 45, 47 또는 49 로부터 선택된 하나 이상의 서열과조합된 형태로, 유사한 기능을 갖는 그의 변이체를 포함한다.

어떤 관점에서는, 폴리뉴클레오티드는 바람직하게는 서열 번호 38, 42, 44, 46, 48 또는 50의 아미노산 서열을 포함하거나 상기로 구성되는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드이고, 단독으로 또는 서열 번호 37, 서열 번호 41 또는 유사한 기능을 갖는 그의 변이체의 폴리뉴클레오티드와의 접합으로 ML-236B의 생합성을 촉진시킬 수 있다.

본 발명은 또한 본 발명의 폴리뉴클레오티드와 엄격한(stringent) 조건하에 혼성화할 수 있는 폴리뉴클레오티드로 확장된다. 상기 폴리뉴클레오티드는 ML-236B 생산 미생물에 도입되었을 때 ML-236B 생산 미생물에서 ML-236B의 생합성을 촉진하기 적합한 폴리뉴클레오티드로 확장된다.

폴리뉴클레오티드는 전형적으로 DNA, cDNA 또는 게놈 DNA, 또는 RNA이고, 센스 또는 안티센스일 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 전형적으로 다른 세포 성분이 없는 폴리뉴클레오티드와 같은 정제된 폴리뉴클레오티드이다.

본 발명은 하나 이상의 뉴클레오티드가 변한, 표시된 서열 번호 38, 42, 44, 46, 48 또는 50 의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 변형체로 확장된다. 변화는 자연적으로 발생할 수 있고, 유전자 코드의 트리플렛(triplet)의 중복 또는 축퇴 내에서 이루어질 수 있다. 따라서 상기의 축퇴적으로 변한 폴리뉴클레오티드는 동일한 아미노산 서열을 코딩한다. 상기 폴리뉴클레오티드 변이체 내에서, 단순히 cDNA 서열보다 엑손 및 인트론을 갖는 게놈 DNA 를 포함한다.

또한 본 발명은 하나 이상의 결실, 부가, 치환 또는 변경을 갖는 변형된 아미노산 서열을 코딩하는, 표시된 서열 번호 38, 42, 44, 46, 48 또는 50 의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 변이체로 확장된다. 따라서, 본 발명은 표시된 서열에 의해 코딩되는 것과 동일하거나 더 짧거나 더 긴 길이의 아미노산 서열을 코딩하는 표시된 서열의 폴리뉴클레오티드 변형체로 확장된다. 바람직하게는 변형체 폴리펩티드는 ML-236B의 합성을 촉진하는 능력을 갖고 있고, 바람직하게는 변이체 서열을 제공하는 모체(parent) 서열과 실직절으로 유사하거나 더 나은 활성을 갖는다.

폴리뉴클레오티드 변이체는 모체 서열과의 동일도를 갖는다. 적합하게는 동일도는 적어도 60%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 또는 100% 이다. 변이체의 동일도는 바람직하게는 상동성 조사를 수행하는 알고리듬을 사용하는 BLAST 프로그램과 같은 컴퓨터 소프트웨어로 평가한다.

어떤 측면에서는, 본 발명의 바람직한 폴리뉴클레오티드는 하기:

(a) 서열 목록의 서열 번호 37의 뉴클레오티드 제 1 번 내지 제 1662 번에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 하나 이상 포함하고, ML-236B 생산 미생물에 도입되었을 때 상기 ML-236B 생산 미생물에서 ML-236B의 생합성을 촉진하는 것을 특징으로 하는 DNA;

(b) 엄격한 조건하에 (a)에 기술된 DNA 와 혼성화하고, ML-236B 생산 미생물에 도입되었을 때 상기 ML-236B 생산 미생물에서 ML-236B의 생합성을 촉진하는 것을 특징으로 하는 DNA;

(c) 서열 목록의 서열 번호 41 의 뉴클레오티드 제 1 번 내지 제 1380 번에나타낸 뉴클레오티드 서열 하나 이상 포함하고, ML-236B 생산 미생물에 도입되었을 때 상기 ML-236B 생산 미생물에서 ML-236B의 생합성을 촉진하는 것을 특징으로 하는 DNA;

(d) 엄격한 조건하에 (c)에 기술된 DNA 와 혼성화하고, ML-236B 생산 미생물에 도입되었을 때 상기 ML-236B 생산 미생물에서 ML-236B 의 생합성을 촉진하는 것을 특징으로 하는 DNA

로 구성되는 군으로부터 선택되는 DNA이다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드는 ML-236B를 생산하는 미생물에서 ML-236B 의 생합성을 촉진한다. ML-236B 생산 미생물의 예는페니실륨(Penicillium)종, 예를 들어페니실륨 시트리눔, 페니실륨 브레비콤팍툼(Penicillium brevicompactum)[Brown, A.G.,et al., J. Chem. Soc. Perkin-1., 1165 (1976)에 기술되어 있음],페니실륨 시클로피움(Penicillim cyclopium)[Doss, S.L.,et al., J. Natl. Prod., 49, 357 (1986)에 기술되어 있음]등을 포함한다. 다른 예는유페니실륨 (Eupenicillium)종 M6603[Endo, A.,et al., J. Antibiot.-Tokyo, 39, 1609 (1986)에 기술되어 있음],파에실로미세스 비리디스(Paecilomyces viridis)FERM P-6236[일본 특허 출원 공보 제 58-98092 호에 기술되어 있음],파에실로미세스종 M2016[Endo, A.,et al., J. Antibiot.-Tokyo, 39, 1609 (1986)에 기술되어 있음],트리코데르마 롱기브라키아툼(Trichoderma longibrachiatum)M6735[Endo, A.,et al., J. Antibiot.-Tokyo, 39, 1609 (1986)에 기술되어 있음],히포미세스 크리소스페르무스(Hypomyces chrysospermus)IFO 7798[Endo, A.,et al., J. Antibiot.-Tokyo, 39, 1609 (1986)에 기술되어 있음],글리오클라디움 (Gliocladium)종 YJ-9515[WO 제 9806867 호에 기술되어 있음],트리코르데르마 비리데(Trichorderma viride)IFO 5836[일본 특허 공보 제 62-19159 호에 기술되어 있음],유페니실륨 레티쿨리스포룸(Eupenicillium reticulisporum)IFO 9022[일본 특허 공보 제 62-19159 호에 기술되어 있음], 또는 임의의 다른 적합한 생물을 포함한다.

상기 ML-236B 생산 미생물 중,페니실륨 시트리눔이 바람직하고,페니실륨 시트리눔균주 SANK 13380 이 더 바람직하다.페니실륨 시트리눔SANK 13380 균주는 미생물 수탁에 관한 부다페스트 조약에 따라 1992년 12월 22일자로 통상산업성 공업기술원 생명공학 공업기술연구원에 수탁 번호 제 FERM BP-4129 호로 수탁됐다. ML-236B 생산 미생물의 예는 또한 천연원으로부터 분리된 것 및 자연적으로 또는 인공적으로 돌연변이된 것을 포함한다.

본 발명은 또한 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 예를 들어에스케리키아 콜라이pSAKexpE SANK 72499 (FERM BP-7005) 또는에스케리키아 콜라이pSAKexpR SANK 72599 (FERM BP-7006)으로부터 수득가능한 벡터를 제공한다. 본 발명의 상기 벡터는 발현 벡터를 포함한다.

ML-236B 생산 미생물을 포함하여, 본 발명의 벡터에 의해 형질전환된 숙주 세포가 또한 제공된다. 본 발명의 숙주 세포는페니실륨 시트리눔및에스케리키아 콜라이, 예를 들어에스케리키아 콜라이pSAKexpE SANK 72499 (FERM BP-7005) 또는에스케리키아 콜라이pSAKexpR SANK 72599 (FERM BP-7006)를 포함한다.

또한, 본 발명은 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드로확장된다. 본 발명의 폴리펩티드의 예는 서열 번호 38 또는 42의 서열, 또는 서열 번호 38 또는 42에 대해 특정한 동일도를 갖고 ML236B 생산 생물에서 ML236B 생성을 촉진할 수 있는 그의 변이체를 포함한다. 다른 폴리펩티드는 본 발명의 다른 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 것, 및 동일도를 갖는 변이체이다.

적합하게는 서열 번호 38 또는 42에 대한 폴리펩티드 변이체의 동일도는 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 또는 100% 이다. 변이체의 동일도는 바람직하게는 상동성 조사 수행용 알고리듬을 사용하는 BLAST 프로그램과 같은 컴퓨터 소프트웨어에 의해 평가된다.

본 발명의 폴리펩티드는 서열 번호 38 또는 42 또는 변이체의 더 짧거나 더 긴 서열을 포함한다. 더 짧은 폴리펩티드는 서열 번호 38, 42 또는 그의 변이체의 부분 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 ML236B의 생합성을 촉진하는 능력을 유지한다. 더 긴 폴리펩티드는 서열 번호 38, 42 또는 그의 변이체의 전체 또는 부분 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 ML236B의 생합성을 촉진하는 능력을 유지한다. 더 긴 폴리펩티드는 Fc-융합 단백질과 같은 융합 단백질을 포함한다.

본 발명의 폴리펩티드는 서열 번호 38, 서열 번호 42, 서열 번호 44, 서열 번호 46, 서열 번호 48, 또는 유사한 기능을 갖는 그의 변이체의 서열을 갖는 것을 포함한다. 본 발명의 폴리펩티드에 대한 항체도 또한 제공된다. 폴리클론 항체 및 모노클론 항체 모두가 본 발명에 의해 제공된다. 상기 항체는 ML-236B 생성을 조절하고, 프라바스타틴 및 로바스타틴을 포함한 스타틴과 같은 ML-236B의 유도체를 생산하는데 유용하다. 또한, 상기 항체는 바람직하게는 ML-236B 생합성 및 그의 조절 메카니즘의 분석에 사용될 수 있다. 상기 분석은 ML-236B 생성을 조절하하고, ML-236B의 유도체를 생성하는데 유용하다.

본 발명의 벡터를 갖는 본 발명의 숙주 세포는 상기 숙주 세포를 배양하고 이어서 배양물로부터 ML-236B를 회수하는 것을 포함하는 ML-236B 생산 방법에 사용될 수 있다. 어떤 방법에서는, 벡터가 mlcE 또는 mlcR을 포함하고, mlcA, mlcB, mlcC 또는 mlcD 와 같은 추가의 유전자는 포함하지 않는다.

본 발명의 방법에 의한 생산은, 서열 번호 44, 서열 번호 46, 서열 번호 48 또는 서열 번호 50 에 상응하는 재조합체 mlcA, mlcB, mlcC 및/또는 mlcD (폴리펩티드)의 부존재하에 이루어질 수 있다.

본 발명은 이후 더 상세하게 기술될 것이다.

본 발명의 발명자들은페니실륨 시트리눔에 ML-236B 의 생합성에 관여하는 유전자를 포함하는 게놈 DNA를 클로닝했다. 게놈 DNA는 이후 ML-236B 생합성에 관련된 게놈 DNA로 지칭되고, ML-236B 생산 미생물의 게놈 DNA 라이브러리로부터 클로닝됐다. 게놈 DNA를 분석하여 상기 게놈 DNA 상에서 구조 유전자를 발견하고 이어서 상기 구조 유전자에 상응하는 cDNA를페니실륨 시트리눔의 mRNA를 포함하는 전체 RNA를 주형으로 사용하여 역전사-폴리머라제 사슬 반응(이후 "RT-PCR"로 지칭함)에 의해 수득했다. ML-236B 생산 미생물이 상기 cDNA를 포함하는 재조합된 DNA벡터에 의해 형질전환될 경우 ML-236B 생산 미생물에서의 ML-236B의 생합성이 촉진되었다는 것을 발견했다.

본 발명은 특히 ML-236B 생산 미생물에 도입되었을 때 상기 ML-236B 생산 미생물에서 ML-236B의 생합성을 촉진하는 cDNA(이후 ML-236B 생합성 촉진 cDNA로 지칭함)에 관한 것이다.

본 발명의 ML-236B 생합성 촉진 폴리뉴클레오티드, 예를 들어 ML-236B 생합성 촉진 cDNA는 그 예로 하기:

(I) ML-236B 의 생합성에 관여하고 ML-236B 생산 미생물의 게놈 DNA 에 존재하는 구조 유전자의 전사 생성물(메신저 RNA, 이하 mRNA 로 지칭함)을 주형으로 사용하는 합성에 의해 수득가능한 DNA;

(II) DNA (I) 및 제 1 가닥으로서 DNA (I)을 사용하여 합성된 제 2 가닥 DNA 의 회합의 결과로 형성된 이중 가닥 DNA;

(III) 이중 가닥 DNA (II)를 복제 또는 증폭시킴으로써(예를 들어, 클로닝 등의 방법에 의함) 형성된 이중 가닥 DNA;

(IV) 엄격한 조건하에 상기 DNA 또는 mRNA 중 하나와 혼성화할 수 있는 DNA

를 포함한다.

DNA (IV)는 그의 임의의 구조 유전자 서열에 나타난 것, 예를 들어 서열 목록의 서열 번호 37 의 뉴클레오티드 번호 제 1 번 내지 제 1662 번 또는 서열 번호 41 의 뉴클레오티드 번호 제 1 번 내지 제 1380 번일 수 있고, 여기서 하나 이상의 뉴클레오티드는 임의로 치환, 결실 및/또는 부가되고, 상기는 ML-236B 생산 미생물에 도입되었을 때 ML-236B 생산 미생물에서 ML-236B의 생합성을 촉진시킬 수 있다.

2 개의 단일 가닥 핵산이 혼성화될 때, 상기는 서로 상보적이거나 매우 상보적인 영역에서 이중 가닥 분자를 형성하고, "엄격한 조건"은 적합하게는 혼성화 용액이 6 x SSC [1 x SSC는 150 mM NaCl, 시트르산 나트륨 15 mM의 조성물을 갖음]인 경우를 가리키고, 혼성화 온도는 55℃ 이다.

ML-236B 생합성 촉진 cDNA는 예를 들어 ML-236B 생산 미생물의 cDNA 라이브러리로부터 cDNA를 포함하는 클론을 분리함으로써 수득될 수 있다. 대안으로, ML-236B 생합성에 관련된 DNA의 뉴클레오티드 서열을 기준으로 고안된 프라이머 쌍을 ML-236B 생산 미생물의 mRNA 또는 총 RNA와 함께 사용하는 RT-PCR을 사용할 수 있다.

ML-236B 생산 미생물은 ML-236B를 생성하는 능력을 유전적으로 갖는 미생물이다. 상기에 표시된 것처럼 ML-236B 생산 미생물의 예는페니실륨종, 예를 들어페니실륨 시트리눔,페니실륨 브레비콤팍툼,페니실륨 시클로피움등을 포함하고 다른 예는유페니실륨종 M6603,파에실로미세스 비리디스FERM P-6236,파에실로미세스종 M2016,트리코데르마 롱기브라키아툼M6735,히포미세스 크리소스페르무스IFO 7798,글리오클라디움종 YJ-9515,트리코르데르마 비리데IFO 5836,유페니실륨 레티쿨리스포룸IFO 9022, 및 임의의 다른 적합한 생물을 포함한다.

상기 ML-236B 생산 미생물 중,페니실륨 시트리눔이 바람직하고,페니실륨균주 SANK 13380 이 더 바람직하다.페니실륨SANK 13380 균주는 미생물 수탁에 대한 부다페스트 조약에 따라 1992년 12월 22일자로 통상산업성 공업기술원 생명공학 공업기술연구원에 수탁 번호 제 FERM BP-4129 호로 수탁됐다. ML-236B 생산 미생물의 예는 또한 천연원으로부터 분리된 것 및 자연적으로 또는 인공적으로 돌연변이된 것을 포함한다.

ML-236B 생합성에 관련된 게놈 DNA는 적합한 프로브로 ML-236B 생산 미생물의 게놈 DNA 라이브러리를 스크리닝함으로써 수득될 수 있다. 적합하게는 프로브는 ML-236B 생합성을 담당할 것으로 예상되는 DNA 서열을 기준으로 고안되고, 적합하게는 사상균으로터 기원한다.

게놈 DNA 라이브러리를 만드는 방법을 선택하는 것은 제한되지 않고, 임의의 적합한 방법이 사용될 수 있고, 바람직하게는 진핵 생물의 게놈 DNA 라이브러리를 작제하는 통상적인 방법이 바람직하다. 그의 예는 마니아티스(Maniatis) 등의 방법을 포함한다[Maniatis, T.,et al., Molecular cloning, a laboratory manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, 미국 뉴욕주의 콜드 스프링 하버 소재 (1989)]. 다른 적합한 방법이 당 업계에 공지되어 있다.

개요로, ML-236B 생산 미생물로부터의 게놈 DNA를, 상기 ML-236B 생산 미생물의 배양물로부터 세포를 회수하고, 물리적으로 세포를 파쇄하고, 그의 핵에 존재하는 DNA 를 추출하고 상기 DNA를 정제함으로써 수득할 수 있다.

ML-236B 생산 미생물의 배양은 특히 ML-236B 생산 미생물에 적합한 조건하에서 수행할 수 있다. 예를 들어, 바람직한 ML-236B 생산 미생물인페니실륨 시트리눔의 배양을 MBG3-8 배지[조성물: 7%(w/v) 글리세린, 3%(w/v) 글루코스, 1%(w/v) 콩 분말, 1%(w/v) 펩톤(Kyokuto Seiyaku Kogyo corporation제), 1%(w/v) 콘 스팁 리쿠에르(Corn steep liqueur, Honen corporation제), 0.5%(w/v) 질산나트륨, 0.1%(w/v) 마그네슘 술페이트 헵타히드레이트(pH 6.5)]에 세포를 접종하고, 22 내지 28℃에서 3 내지 7 시간 동안 진탕시키면서 인큐베이션함으로써 수행할 수 있다. 용융된 PGA 아가 배지[조성물: 200 g/L 감자 추출물, 15%(w/v) 글리세린, 2%(w/v) 아가]를 시험관에 붓고, 아가를 비스듬히 고체화시킴으로써 세균 저장용 슬랜트를 제조할 수 있다. 이어서페니실륨 시트리눔을 백금니를 사용하여 슬랜트에 접종시키고 22 내지 28℃에서 7 내지 15 일 동안 인큐베이션할 수 있다. 슬랜트를 0 내지 4℃ 로 저장함으로써 상기 방법으로 생장한 미생물 또는 세균이 슬랜트에 계속 유지될 수 있다.

액체 배지에서 배양된 ML-236B 생산 미생물의 세포는 원심분리에 의해 회수할 수 있고, 고체 배지에서 배양된 것은 고체 배지로부터 세포 스크레이퍼 (scraper) 등으로 긁어서 회수할 수 있다.

액체 질소 등으로 세포를 동결시킨 후 막자 및 막자사발을 사용하여 세포를 갈아서 세포의 물리적인 파쇄를 수행할 수 있다. 소듐 도데실술페이트(이후 SDS 로 지칭함)와 같은 계면활성제 또는 적합한 다른 계면활성제를 사용하여 파쇄된 세포의 핵에 있는 DNA를 추출할 수 있다. 추출된 게놈 DNA를 페놀-클로로포름으로 적합하게 처리하여 단백질을 제거하고, 에탄올 침전을 수행함으로써 침전물로서 회수한다.

생성되는 게놈 DNA를 적합한 제한 효소로 소화시킴으로써 프래그먼트화한다. 제한 소화용으로 사용될 수 있는 제한 효소에 대한 한계는 없고, 통상 시판되는 제한 효소가 바람직하다. 그의 예는 Sau3AI를 포함한다. 적합한 다른 효소는 당 업계에 공지되어 있다. 이어서 소화된 DNA를 겔 전기영동하고, 적합한 크기를 갖는 게놈 DNA를 겔로부터 회수한다. DNA 프래그먼트의 크기는 특별히 제한되지 않지만,바람직하게는 20 kb 이상이다.

마찬가지로 벡터에 의해 형질전환될 숙주 세포에서 복제에 필요한 DNA 서열을 벡터가 갖는한, 게놈 DNA 라이브러리의 작제에 사용되는 DNA 벡터의 선택에 대한 제한은 없다. 적합한 벡터의 예는 플라스미드 벡터, 파지 벡터, 코스미드 벡터, BAC 벡터 등을 포함하고, 코스미드 벡터가 바람직하다. DNA 벡터는 바람직하게는 발현 벡터이다. 더 바람직하게는, DNA 벡터가 벡터에 의해 형질전환된 숙주 세포 상에 선택적인 표현형을 부여하는 뉴클레오티드 서열 또는 DNA 를 포함한다.

DNA 벡터는 적합하게는 클로닝 및 발현 모두에 사용될 수 있는 벡터이다. 바람직하게는 벡터는 하나 이상의 미생물 숙주의 형질전환에 사용될 수 있는 셔틀 벡터이다. 셔틀 벡터는 적합하게는 숙주 세포에서 복제를 허용하는 DNA 서열, 및 바람직하게는 세균 및 균류와 같은 상이한 미생물군으로부터의 다수의 상이한 숙주 세포에서 복제를 허용하는 서열(들)을 갖는다. 또한, 셔틀 벡터는 바람직하게는 상이한 미생물군으로부터의 세포와 같은 상이한 숙주 세포의 범위에 대해 선택가능한 표현형을 제공할 수 있는 DNA 서열을 포함한다.

만약 미생물군 중 하나가 클로닝에 사용될 수 있고 다른 하나가 ML-236B 생성 능력을 갖는다면, 셔틀 벡터에 의해 형질전환되는 숙주 세포 및 미생물군의 조합을 선택하는 것을 특별히 제한 받지 않는다. 상기 조합은 예를 들어 박테리아 및 사상균의 조합, 효모 및 사상균의 조합일 수 있고, 세균 및 사상균의 조합이 바람직하다. 통상 생물공학에서 사용될 수 있는 것, 예를 들어에스케리키아 콜라이, 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis)등이라면, 세균의 선택은 특별히 제한 받지 않는다.에스케리키아 콜라이가 바람직하고,에스케리키아 콜라이XL1-Blue MR 이 더 바람직하다. 유사하게, 통상 생물공학에서 사용될 수 있는 것, 예를 들어사카로미세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)등이라면, 효모 종에 대한 제한은 없다. 사상균의 예는 상기의 ML-236B 생산 미생물을 포함한다. 미생물의 적합한 다른 예는 당 업계에 공지되어 있다.

본 발명에서, 미생물군은 세균, 사상균 및 효모로부터 선택될 수 있다.

상기에서 언급된 셔틀 벡터의 예는 표현형을 선택하기 위한 적합한 마커(marker) 유전자 및 코스(cos) 부위를 갖는 코스미드 벡터를 포함한다. 다른 적합한 벡터는 당 업계에 공지되어 있다. 바람직한 벡터는 코스미드 벡터 pWE15(STRATAGENE제)로부터의 코스 부위를 플라스미드 pSAK333에 삽입함으로써 작제된 pSAKcos1 이고, 상기는에스케리키아 콜라이하이그로마이신 B 포스포트랜스퍼라제 유전자의 서열을 포함한다[일본 특허 츨원 공보 제 3-262486 호에 기술되어 있음]. pSAKcos1을 작제하는 방법을 도 1 에 나타낸다. 본 발명은 상기 벡터에 의해 한정되지 않는다.

셔틀 벡터, 즉 ML-236B 생산 미생물로부터의 게놈 DNA 프래그먼트를 포함하는 벡터를 숙주 세포에 도입함으로써 게놈 DNA 라이브러리를 제조할 수 있다. 사용되는 숙주 세포는 바람직하게는에스케리키아콜라이, 더 바람직하게는에스케리키아 콜라이XL1-Blue MR이다. 숙주 세포가에스케리키아 콜라이인 경우, 시험관내 패키징에 의해 도입이 수행될 수 있다. 본 발명에서, 형질전환은 또한 시험관내 패키징에 의한 외래 DNA의 도입을 포함하고, 형질전환된 세포는 또한 외래 DNA가 시험관내 패키징에 의해 도입된 세포를 포함한다.

목적 클론을 동정하기 위해 항체 또는 핵산 프로브를 사용하여 게놈 라이브러리를 스크리닝할 수 있고, 핵산 프로브가 바람직하다. 바람직하게는 핵산 프로브는 폴리케티드 생합성에 관련된 유전자 또는 DNA의 뉴클레오티드 서열을 기준으로 제조되고, 바람직하게는 사상균으로부터 유래되는 서열이다. 폴리케티드의 생합성에 관련되고 그의 뉴클레오티드 서열이 공지되어 있다면 특정 유전자의 선택은 제한 받지 않는다. 상기 유전자의 예는아스페르길루스 플라부스및아스페르길루스 파라시티쿠스의 아플라톡신 PKS 유전자,아스페르길루스 니둘란스의 스테리그마토시스틴 PKS 유전자 등을 포함한다.

예를 들어, 상기의 공지된 게놈 DNA 서열의 일부를 구성하는 올리고뉴클레오티드 프로브를 합성하거나, 올리고뉴클레오티드 프라이머를 제조하고 게놈 DNA를 주형으로 폴리머라제 사슬 반응[이후 "PCR"로 지칭함, Saiki, R.K.,et al., Science, 239, 487 (1988)에 기술되어 있음]을 사용하여 표적 DNA를 증폭시키거나, mRNA를 주형으로 사용하여 RT-PCR에 의해 적합한 핵산 프로브를 수득할 수 있다. 상기 프로브를 수득하는 적합한 다른 방법은 당 업계에 잘 공지되어 있다.

ML-236B 생산 미생물로부터 예를 들어 PCR 또는 RT-PCR을 사용하여 핵산 프로브를 수득할 수 있다. PCR 또는 RT-PCR에 사용되는 프라이머(이하 "PCR용 프라이머"로 지칭함)의 고안은 바람직하게는 뉴클레오티드 서열이 공지된 폴리케티드 생합성에 관련된 유전자의 뉴클레오티드 서열을 기준으로 수행된다. 바람직하게는 유전자는아스페르길루스 플라부스,아스페르길루스 파라시티쿠스의 아플라톡신PKS 유전자, 또는아스페르길루스 니둘란스의 스테리그마토시스틴 PKS 유전자이다.

PCR용 프라이머는 적합하게는 PKS 유전자 내에 많이 보존된 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하도록 고안된다. 주어진 아미노산 서열에 상응하는 뉴클레오티드 서열을 동정하는 방법은 숙주 세포의 코돈 사용(codon usage)을 기준으로 한 추정, 및 다중 코돈을 사용하여 혼합된 올리고뉴클레오티드 서열(이하 '축퇴 올리고뉴클레오티드'로 지칭함)을 만드는 방법을 포함한다. 후자의 경우에, 올리고뉴클레오티드의 다중성은 그의 뉴클레오티드 서열에 히포크산틴을 도임함으로써 감소될 수 있다.

PCR용 프라이머는 주형 사슬에 어닐링하도록 고안된 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있고, 프라이머는 부가 5'서열에 연결된다. 상기 부가 5'뉴클레오티드 서열은 프라이머가 PCR 또는 RT-PCR에 사용될 수 있는 것이라면 특별히 제한 받지 않는다. 상기 부가 5'서열은 예를 들어 PCR 생성물의 클로닝 작업에 편리한 뉴클레오티드 서열일 수 있다. 상기 뉴클레오티드 서열은 예를 들어 제한 효소 절단 부위 또는 제한 효소 절단 부위를 포함하는 뉴클레오티드 서열일 수 있다.

또한, PCR용 프라이머를 고안할 때, 구아닌(G)의 수 및 시토신(C) 염기의 수의 총 합이 총 염기수의 40 내지 60% 인 것이 바람직하다. 또한, 바람직하게는 주어진 프라이머에 대한 자가-어닐링이 거의 없거나 전혀 없고, 프라이머 쌍의 경우 바람직하게는 프라이머 사이의 어닐링이 거의 없거나 전혀 없다.

PCR용 프라이머를 구성하는 뉴클레오티드의 수는 PCR 용으로 사용될 수 있는 것이라면 특별히 제한 받지 않는다. 상기 수의 하한선은 통상 10 내지 14 개의 뉴클레오티드이고, 상한선은 40 내지 60 개의 뉴클레오티드이다. 바람직하게는 프라이머는 14 내지 40 개의 길이의 올리고뉴클레오티드이다.

PCR용 프라이머는 바람직하게는 DNA이다. 프라이머의 뉴클레오티드는 데옥시 아데노신, 데옥시 시티딘, 데옥시 티미딘, 및 데옥시 구아노신, 및 추가로 데옥시 이노신일 수 있다. PCR용 프라이머의 5'-말단에 있는 뉴클레오티드의 5'-위치는 적합하게는 하나의 인산이 에스테르 연결에 의해 결합된 히드록시기 또는 히드록실기이다.

PCR용 프라이머의 합성은 핵산의 합성에 통상 사용되는 방법, 예를 들어 포스포아미디트(phosphoamidite) 방법에 의해 수행될 수 있다. 바람직하게는 자동화 DNA 합성기가 상기 방법에서 사용될 수 있다.

ML-236B 생산 미생물로부터의 게놈 DNA 및 mRNA를 PCR 또는 RT-PCR용 주형으로 각각 사용할 수 있다. 총 RNA를 mRNA 대신에 RT-PCR용 주형으로 사용할 수 있다.

PCR 생성물 또는 RT-PCR 생성물을 적합한 DNA 벡터로의 삽입에 의해 클로닝할 수 있다. 클로닝 단계에 사용되는 DNA 벡터의 선택은 통상 제한 받지 않는다. PCR 또는 RT-PCR 생성물의 용이한 클로닝용 키트는 시판되고 있다. 그 예로, Original TA Cloning Kit(Invitrogen제: DNA 벡터로 pCR2.1 을 사용함)가 상기 클로닝에 적합하다.

클로닝된 PCR 생성물을 수득하기 위해, 목적 PCR 생성물을 포함하는 플라스미드를 함유하는 형질전환된 숙주 세포를 배양하고, 이어서 상기 세포로부터 플라스미드를 추출하고 정제한다. 이이서 삽입된 DNA 프래그먼트를 생성된 플라스미드로부터 회수한다.

형질전환된 숙주 세포의 배양은 적합하게는 숙주 세포에 적절한 조건하에 수행한다. 바람직한 숙주 세포,에스케리키아 콜라이를 LB 배지[1%(w/v) 트립톤, 0.5%(w/v) 효모 추출물, 0.5%(w/v) 염화나트륨]에서 18 시간 내지 2 일 동안 30 내지 37℃에서 진탕시키면서 배양할 수 있다.

형질전환된 숙주 세포의 배양물로부터의 플라스미드의 제조는 숙주 세포를 회수하고 게놈 DNA 또는 숙주의 단백질과 같은 다른 세포 성분이 없는 플라스미드를 분리함으로써 수행할 수 있다.에스케리키아 콜라이의 배양물로부터의 플라스미드 DNA의 제조는 마니아티스의 알칼라인법에 따라 수행할 수 있다[Maniatis, T.,et al., Molecular cloning, a laboratory manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, 미국 뉴욕주의 콜드 스프링 하버 소재 (1989)에 기술되어 있음]. 더 높은 순도를 갖는 플라스미드를 수득하기 위한 키트가 시판된다. 플라스미드 미니 키트(Plasmid Mini Kit)[QIAGEN AG제]가 바람직하다. 또한, 플라스미드의 대량 생산용 키트가 시판되고 있다. 플라스미드 막시 키트(Plasmid Maxi Kit, QIAGEN AG 제)가 바람직하다.

DNA 시료의 알맞은 희석 후에 260 nm 의 파장에서 흡광도를 측정하고 흡광도 OD₂₆₀1 의 용액은 DNA 50 ㎍/ml 를 포함한다는 것을 기준으로 계산함으로써 생성되는 플라스미드 DNA의 농도를 결정할 수 있다(Maniatis, T.,et al., supra 에 기술되어 있음).

DNA의 순도는 280 및 260 nm 의 파장에서 흡광도의 비로부터 계산될 수 있다 (Maniatis, T.,et al., supra 에 기술되어 있음).

핵산 프로브의 표지 방법은 통상 방사능 표지 및 비방사능 표지로 분류될 수 있다. 방사능 표지용 방사성뉴클레오티드의 선택은 통상 제한 받지 않고 예를 들어³²P,³⁵S,¹⁴C 등일 수 있다. 표지에³²P 를 사용하는 것이 바람직하다. 비빙사능 표지용 제제의 선택은 핵산의 표지에 일반적으로 사용되는 것이라면 통상 제한 받지 않고, 예를 들어 디곡스게닌, 비오틴 등일 수 있고, 디곡신이 바람직하다.

또한, 핵산 프로브의 표지 방법은 통상 제한 받지 않는다. 일반적으로 사용되는 방법, 예를 들어 표지된 뉴클레오티드 기질, 틈(nick) 번역, 랜덤 프라이머의 사용, 종결 표지를 사용하는 PCR 또는 RT-PCR 에 의한 생성물에 표지를 섞는 방법, 및 표지된 뉴클레오티드 기질을 사용하여 올리고뉴클레오티드 DNA를 합성하는 방법이 바람직하다. 핵산 프로브의 종류에 따라 상기 방법으로부터 적합한 방법을 선택할 수 있다.

특정 핵산 프로브의 뉴클레오티드 서열과 동일한 뉴클레오티드 서열의 ML-236B 생산 미생물의 게놈에서의 존재를 상기 ML-236B 생산 미생물의 게놈 DNA 와의 서턴 블롯(Southern blot) 혼성화로 확인할 수 있다.

서턴 블롯 혼성화는 마니아티스의 방법에 따라 수행할 수 있다[Maniatis, T.,et al., supra 에 기술되어 있음].

상기와 같이 제조된 표지된 핵산 프로브는 게놈 DNA 라이브러리를 스크리닝하는데 사용할 수 있다. 스크리닝 방법의 선택은 일반적으로 유전자 클로닝에 적절하다면 특별히 제한 받지 않지만, 콜로니 혼성화 방법이 바람직하다[Maniatis, T.,et al., supra 에 기술되어 있음].

콜로니 혼성화에 사용되는 콜로니의 배양을 적합하게는 숙주 세포에 적절한 조건하에서 수행한다. 바람직한 숙주인에스케리키아 콜라이의 배양을 LB 아가 배지 [1%(w/v) 트립톤, 0.5%(w/v) 효모 추출물, 0.5%(w/v) 염화나트륨, 1.5%(w/v) 아가로스]에서 18 시간 내지 2 일 동안 30 내지 37℃에서 인큐베이션에 의해 수행할 수 있다.

콜로니 혼성화에 의해 수득된 포지티브 클론으로부터의 재조합 DNA 벡터의 제조는 통상 포지티브 클론의 배양물으로부터 플라스미드를 추출하고 정제함으로써 수행될 수 있다.

본 발명에 따라 수득되는 포지티브 클론을 나타내는 형질전환된에스케리키아 콜라이균주,에스케리키아 콜라이pML48 SANK71199 는 미생물 수탁에 관한 부다페스트 조약에 따라 1999년 7월 7일자로 통상산업성 공업기술원 생명공학 공업기술연구원에 수탁되었고 수탁 번호 FERM BP-6780를 부여 받았다.

에스케리키아 콜라이pML48 SANK71199에 보유되는 전형적인 DNA 벡터는 pML48 로 명명됐다.

포지티브 클론에 존재하는 재조합 DNA 벡터가 ML-236B 생합성에 관련된 게놈 DNA 를 포함한다는 것은 재조합 DNA 벡터 인서트의 뉴클레오티드 서열의 결정, 서턴 블롯 혼성화 또는 기능을 결정하는 인서트의 발현에 의해 적합하게 확인할 수 있다.

막삼(Maxam) 및 길버트(Gilbert)의 화학적 변형 기술[Maxam, A.M.M. and Gilbert, W., Methods in Enzymology, 65, 499 (1980)에 기술되어 있음] 또는 디데옥시 사슬 종결 방법[Messing, J. and Vieira, J., Gene, 19, 269 (1982)에 기술되어 있음]에 따라 DNA의 뉴클레오티드 서열을 결정할 수 있다. 적합한 다른 방법이 당 업계에 잘 공지되어 있다. 뉴클레오티드 서열의 결정에 사용되는 플라스미드 DNA는 바람직하게는 상기에 기술된 것처럼 높은 순도의 시료이다.

pML48 인서트의 뉴클레오티드 서열이 서열 목록의 서열 번호 1 에 나타나 있다. 서열 목록의 서열 번호 2 에 나타낸 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 1 에 나타낸 뉴클레오티드 서열에 완전히 상보적이다. 통상, 게놈 DNA 의 뉴클레오티드 서열은 종 내에서 유전적 다형성, 즉 동종간 차이를 갖는다. 또한, DNA 클로닝 및 서열화의 방법에서, 뉴클레오티드 치환, 또는 다른 변경이 특정 빈도로 발생한다고 공지되어 있다. 따라서, 본 발명의 ML-236B 생합성에 관련된 게놈 DNA 는 또한 서열 목록의 서열 번호 1 또는 2의 뉴클레오티드 제 1 번 내지 제 34203 번의 DNA 에 혼성화될 수 있는 게놈 및 다른 DNA를 포함한다. 엄격한 조건하에 서열 목록의 서열 번호 1 또는 2의 뉴클레오티드 제 1 번 내지 제 34203 번의 DNA 에 혼성화될 수 있는 게놈 또는 다른 DNA가 바람직하다. 상기 DNA 는 서열 목록의 서열 번호 1 또는 2의 뉴클레오티드 제 1 번 내지 제 34203 번의 DNA를 포함하고, 여기서 하나 이상의 뉴클레오티드가 치환, 결실 및/또는 부가된다. 또한, 상기의 혼성 게놈 또는다른 DNA는페니실륨 시트리눔SANK13380 외의 ML-236B 생산 미생물로부터 나오는 DNA를 포함할 수 있고, 바람직하게는 ML-236B 생산 미생물에 도입되었을 때 ML-236B 의 생성을 향상시킬 수 있는 것이다.

ML-236B 생합성에 관련된 게놈 DNA 는 적절하게는 하기 방법 1) 내지 3) 에 따라 분석된다.

1) 유전자 분석 소프트웨어로의 분석

게놈 DNA 내의 유전자는 유전자를 찾는 프로그램(이하 "GRAIL"로 지칭함) 및 상동성 서열 조사 프로그램(BLASTN 및 BLASTX)를 사용하여 위치화될 수 있다.

GRAIL 는 게놈 서열을 7 개의 파라미터로 분해하여 유전자 서열의 특징을 평가하고, 뉴럴 넷(neural net) 방법을 사용하여 결과를 통합함으로써 게놈 DNA 의 구조 유전자를 조사하는 프로그램이다[Uberbracher, E.C. & Mural, R.J., Proc. Natl. Acad. Sci, USA., 88, 11261 (1991)에 기술되어 있음]. 그 예로, ApoCom GRAIL Toolkit[Apocom corporation제]을 사용할 수 있다.

BLAST 는 뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열의 상동성 조사를 수행하는 알고리듬을 사용하는 프로그램이다〔Altschul, S.F., Madden, T. L.,et al., Nucl. Acids Res., 25, 3389 (1997)에 기술되어 있음〕

시료 게놈 DNA 서열 상의 구조 유전자의 위치 및 방향은 DNA 서열을 적합한 길이로 나누고 BLASTN을 사용하여 유전자 데이타 베이스의 상동성 조사를 수행함으로써 예측될 수 있다. 시험되는 DNA 서열 상의 구조 유전자의 위치 및 방향은 또한 6 개의 번역 프레임(센스 가닥 상의 3 개 및 안티센스 가닥 상의 다른 3 개)으로 나누어진 게놈 DNA 서열을 번역하고 BLASTX를 사용하여 펩티드 데이터 베이스에서 유도된 아미노산 서열의 상동성 조사를 수행함으로써 예측될 수 있다.

게놈 DNA의 구조 유전자에 대한 코딩 영역은 때때로 진핵 생물의 인트론으로 분할된다. 상기 갭을 갖는 구조 유전자의 분석을 위해 갭을 포함하는 서열을 분석하는 BLAST 프로그램이 더 효과적이고, Gapped-BLAST 프로그램(BLAST2: WISCONSIN GCG 패키지 버전 10.0 에 설치되어 있음)이 바람직하다.

2) 노턴(Northern) 블롯 혼성화 방법에 따른 분석

단락 1)에 기술된 분석법에 의해 예측된 구조 유전자의 발현을 노턴 블롯 혼성화법을 사용하여 연구할 수 있다.

적합하게는 ML-236B 생산 미생물로부터의 총 RNA는 미생물의 배양으로부터 수득된다. 바람직한 ML-236B 생산 미생물페니실륨 시트리눔의 배양물은 슬랜트으로부터의 상기 미생물을 MGB3-8 배지에 접종하고 이어서 진탕시키면서 22 내지 28℃에서 1 일 내지 4 일 동안 인큐베이션함으로써 수득될 수 잇다.

ML-236B 생산 미생물로부터 RNA를 추출하는 방법의 선택은 제한 받지 않고, 구아니딘 티오시아네이트-고온 페놀 방법, 구아니딘 티오시아네이트-구아니딘 염산 방법 등이 바람직하다. 높은 순도의 총 RNA 제조용으로 시판되는 키트의 예는 RNeasy Plant Mini Kit(Qiagen AG제)을 포함한다. 또한, mRNA는 총 RNA를 올리고(dT)칼럼에 적용하고, 칼럼에 흡수된 분획을 회수함으로써 수득할 수 있다.

RNA의 막으로의 전달, 프로브의 제조, 혼성화 및 신호의 검출은 상기에 언급된 서턴 블롯 혼성화 방법과 유사한 방법으로 수행할 수 있다.

3) 전사체의 5'-말단 및 3'-말단의 분석

각각의 전사체의 5'-말단 및 3'-말단의 분석은 'RACE'(cDNA 말단의 빠른 증폭) 방법에 따라 수행할 수 있다. RACE 는 mRNA를 주형으로 RT-PCR을 사용하여 유전자의 5'-말단 또는 3'-말단에 있는 공지된 뉴클레오티드 및 공지되지 않은 영역을 포함하는 cDNA를 수득하는 방법이다[Frohman, M. A., Methods Enzymol. 218, 340 (1998)에 기술되어 있음].

5'-RACE 는 하기 방법에 따라 수행할 수 있다. cDNA 의 제 1 가닥을 mRNA 를 주형으로 사용하는 역전사효소 반응에 따라 합성한다. 프라이머로, 뉴클레오티드 서열의 공지된 부분으로 고안된 안티센스 올리고뉴클레오티드(1)을 사용한다. 동종중합체성 뉴클레오티드 사슬(한 가지 종류의 염기로 구성됨)을 말단 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제를 사용하여 cDNA의 제 1 가닥의 3'-말단에 첨가한다. 이어서, cDNA 의 제 1 가닥을 주형으로 사용하여 PCR 로 5'-말단 영역의 이중 가닥 cDNA를 증폭한다. 증폭을 위해, 2 개의 프라이머를 사용한다; 동종중합체성 서열에 상보적인 서열을 포함하는 센스 가닥으로부터의 DNA 올리고뉴클레오티드 및 안티센스 가닥 및 올리고뉴클레오티드 DNA (1)의 3'-말단 쪽 상의 올리고뉴클레오티드 (2)[Frohman, M.A., Methods in Enzymol., 218, 340 (1993)에 기술되어 있음]. 5' RACE 용 키트는 시판되고 있고, 5' RACE System for Rapid Amplication of cDNA ends, 버전 2.0(GIBCO제)이 적합하다.

3' RACE 는 mRNA 의 3'-말단에 존재하는 폴리A 영역을 사용하는 방법이다. 구체적으로, cDNA 의 제 1 가닥을, mRNA를 주형으로 하고 올리고 d(T) 아답터를 프라이머로 사용하는 역전사효소 반응으로 합성한다. 이어서, 3'-말단 영역의 이중 가닥 cDNA를 cDNA의 제 1 가닥을 주형으로 사용하여 PCR로 증폭한다. 프라이머로, 센스 가닥의 뉴클레오티드 서열의 공지된 부분으로 고안된 센스 가닥 상의 DNA 올리고뉴클레오티드 (3), 및 안티센스 가닥 상의 올리고 d(T) 아답터를 사용한다. 3' RACE 용 키트는 시판되고 있고, Ready-To-Go T-primed First-Strand Kit (Phramacia corporation제)가 적합하다.

상기 분석 1) 및 2) 의 결과는 바람직하게는 원하는 뉴클레오티드 서열의 공지된 부분을 기준으로 프라이머를 고안할 때 RACE 방법에 사용된다.

상기 1) 내지 3)에 기술된 분석법을 사용하여, 게놈 DNA 서열 상의 구조 유전자의 방향, 구조 유전자의 전사 개시 부위의 위치, 번역 개시 코돈의 위치, 및 번역 종결 코돈 및 그의 위치를 추정할 수 있다. 상기 정보를 기준으로, 각각의 구조 유전자, 및 그의 cDNA, 즉 ML-236B 생합성 촉진 cDNA를 수득할 수 있다.

6 개의 구조 유전자가 본 발명에 따라 수득된 재조합 DNA 벡터 pML48 에 삽입된 서열상에 존재하는 것으로 여겨진다. 상기를 각각 mlcA, mlcB, mlcC, mlcD, mlcE, 및 mlcR로 명명한다. 상기 중, mlcA, mlcB, mlcE 및 mlcR이 서열 목록의 서열 번호 2에 나타낸 뉴클레오티드 서열 상에 코딩 영역을 갖는 것으로 여겨진다. mlcC 및 mlcD 는 서열 목록의 서열 번호 1 에 나타낸 뉴클레오티드 서열 상에 코딩 영역을 갖는 것으로 여겨진다.

상기에 언급된 구조 유전자에 상응하는 특정 ML-236B 생합성 촉진 cDNA을 수득하는 방법의 예는 각각의 구조 유전자 및 그의 양쪽에 있는 DNA의 서열로 고안된프라이머를 사용한 RT-PCR 로의 클로닝, 및 공지된 뉴클레오티드 서열로 고안된 적절한 DNA 프로브를 사용한 cDNA 라이브러리로부터의 클로닝을 포함한다. 다른 적합한 방법은 당 업계에 잘 공지되어 있다. 상기 방법에 따라 수득되는 cDNA를 기능적으로 발현시키기 위해, 완전한 길이의 cDNA를 수득하는 것이 바람직하다.

RT-PCR를 사용하여 ML-236B 생합성 촉진 cDNA를 수득하는 방법을 하기에 설명한다.

RT-PCR용 및 ML-236B 생합성 촉진 cDNA를 수득하기 위한 프라이머 쌍을 고안하여 각각의 주형 사슬과 선택적으로 어닐링하여 cDNA를 수득하게 할 필요가 있다. 그러나, 만약 RT-PCR용 프라이머가 상기 조건을 만족한다면 각각의 주형 사슬의 일부에 완전히 상보적인 것이 필수적이지는 않다. 안티센스 사슬과 어닐링할 수 있는 적합한 RT-PCR용 프라이머(이하 "센스 프라이머"로 지칭함)는 안티센스 사슬의 부분에 완전히 상보적인 센스 프라이머(이하 "비치환 센스 프라이머"로 지칭함) 또는 안티센스 사슬의 부분에 완전히 상보적이지 않은 센스 프라이머(이하 "부분적으로 치환된 센스 프라이머"로 지칭함)이다. 센스 사슬과 어닐링 할 수 있는 다른 적합한 RT-PCR용 프라이머(이하 "안티센스 프라이머"로 지칭함)는 센스 사슬의 일부에 완전히 상보적인 안티센스 프라이머(이하 "비치환 안티센스 프라이머"로 지칭함) 또는 센스 사슬의 일부에 완전히 상보적이지 않은 안티센스 프라이머(이하 "부분적으로 치환된 안티센스 프라이머"로 지칭함)이다.

센스 프라이머를 적합하게 고안하여 상기를 사용하여 수득한 RT-PCR 생성물은 번역 개시의 원래 위치에 코돈 ATG를 포함한다. 적합하게는 RT-PCR 생성물은또한 원래의 ATG 시작 부위를 갖는 판독 프레임 내에 올바른 번역 종결 코돈만을 포함하고, 추가(의사(擬似)) 번역 정지 부위는 포함하지 않는다. 본 발명에서 예측된 상기 구조 유전자의 번역 개시 코돈의 위치는 서열 목록의 서열 번호 1 및 서열 번호 2에 위치한 유전자에 대해 표 5에 나타낸다.

비치환 센스 프라이머의 5'-말단은 적합하게는 번역 개시 코돈 ATG 의 뉴클레오티드 'A', 또는 그의 5'-말단 쪽에 존재하는 염기이다.

부분적으로 치환된 센스 프라이머는 서열 목록의 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 특정 영역과 선택적으로 어닐링하고, 서열 목록의 서열 번호 2의 뉴클레오티드 서열은 서열 목록의 서열 번호 1에 완전히 상보적이다.

부분적으로 치환된 센스 프라이머가 번역 개시 코돈 ATG 의 3'-말단에 존재하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 경우, 상기는 적합하게는 동일한 판독 프레임 내의 종결 코돈(TAA, TAG 또는 TGA)인 상기 영역내의 뉴클레오티드 서열을 ATG 로 포함하지 않는다.

부분적으로 치환된 센스 프라이머는 뉴클레오티드 "A", 뉴클레오티드 "A"에 상응하는 뉴클레오티드 서열 "AT" 또는 "ATG"(이하 "뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 서열 m'"로 지칭함), 번역 개시 코돈의 뉴클레오티드 서열 "AT" 또는 "ATG"(이하 "뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 서열 m"로 지칭함)을 포함한다. 뉴클레오티드 m' 가 서열 "m" 의 "A" 에 상응하는 "A" 인 경우, 본 발명자들은 m'"A" 가 부분적으로 치환된 센스 프라이머의 3'-말단에 위치하는 것을 선호한다. 유사하게 m' 가 "AT" 인 경우, 본 발명자들은 m'"AT" 서열이 부분적으로 치환된 센스 프라이머의 3'-말단에 위치하는 것을 선호한다. 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 서열 m 이 m'"ATG" 에 상응하는 "ATG" 인 경우, 본 발명자들은 프라이머의 ATG 에 대해 3' 인 상기 트리뉴클레오티드가 정지 코돈이 아닌 것을 선호한다. 즉, 5'-말단 뉴클레오티드가 3'-말단의 방향으로 m'"ATG"의 A 로부터 세어서 (3 x n + 1)번째 뉴클레오티드(n 은 1 이상의 정수를 나타냄)인 트리뉴클레오티드에 대해, 트리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열은 바람직하게는 TAA, TAG, TGA 가 모두 아니다. RT-PCR 주형으로 사용되는 mRNA 의 번역 개시 코돈에 상응하는 위치에 메티오닌 코돈을 갖는 cDNA를 수득하기 위해 상기 프라이머를 사용할 수 있다.

부분적으로 치환된 센스 프라이머의 3'-말단이 뉴클레오티드 위치(3 x n + 1)인 경우, 바람직하게는 상기 위치에서 시작되는 트리뉴클레오티드는, 프라이머의 하나로 부분적으로 치환된 센스 프라이머를 사용하고, ML-236B 생산 미생물의 RNA 또는 mRNA를 주형으로 사용하여 수득되는 RT-PCR 생성물, 또는 게놈 DNA 또는 cDNA를 주형으로 사용하여 수득되는 PCR 생성물에서 TAA, TAG 또는 TGA 가 아니다. 뉴클레오티드 위치는 3'-말단의 방향에서 번역 개시 코돈 "ATG"의 'A'로부터 세고, 'n'은 1 이상의 정수를 나타낸다.

부분적으로 치환된 센스 프라이머의 3'-말단이 뉴클레오티드 위치(3 x n + 2)인 경우, 위치 3 x n + 2 가 중심 뉴클레오티드인 트리플렛은 바람직하게는 상기처럼 수득된 PCR 또는 RT-PCR 생성물에 있어서 서열 TAA, TAG 또는 TGA 중 어느 것도 아니다.

부분적으로 치환된 센스 프라이머의 3'-말단이 뉴클레오티드 위치(3 x n +3)인 경우, 위치(3 x n + 3)이 3' 뉴클레오티드인 트리플렛은 바람직하게는 서열 TAA, TAG 또는 TGA 중 어느 것도 아니다.

센스 프라이머에 대한 요구조건은 상기에서 논의된 것과 동일하다.

센스 프라이머와 함께 쌍을 이룰 때, 상응하는 펩티드의 N-말단에서 C-말단으로의 방향과 동일한 방향으로 RT-PCR를 사용하여 각각의 구조 유전자(mlcA, mlcB, mlcC, mlcD, mlcE, 및 mlcR)를 코딩하는 cDNA를 증폭시킬 수 있도록 안티센스 프라이머를 고안한다.

비치환 안티센스 프라이머가 cDNA 의 번역 종결 부위의 영역에 위치한 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 갖는 안티센스 프라이머라면 비치환 안티센스 프라이머의 선택은 제한 받지 않는다. 그러나, 번역 종결 코돈의 3'-말단에 있는 염기에 상보적인 5'-말단 염기를 갖는 프라이머, 또는 상기 프라이머 염기의 5'-말단 쪽의 염기를 갖는 프라이머가 바람직하다. 번역 종결 코돈에 상보적인 3 개의 염기를 포함하는 프라이머가 더 바람직하다. 표 8 내지 10 은 각각의 구조 유전자의 번역 종결 코돈, 번역 종결 코돈에 상보적인 서열, 각각의 유전자에 의해 코딩되는 펩티드의 C-말단의 아미노산 잔기, 아미노산 잔기를 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 및 서열 번호 1 또는 서열 번호 2 에서의 그의 위치를 나타낸다.

부분적으로 치환된 안티센스 프라이머는 서열 목록의 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 뉴클레오티드 서열의 특정 영역과 선택적으로 어닐링한다.

상기는 안티센스 프라이머에 대한 요구조건이다.

상기 언급된 요구 조건이 충족된다면 부분적으로 치환된 센스 프아이머 및부분적으로 치환된 안티센스 프라이머의 5'-말단에 적합한 뉴클레오티드 서열을 첨가하는 것이 가능하다. 프라이머가 PCR 에 사용될 수 있는 것이라면 상기 뉴클레오티드 서열의 선택은 특별히 제한 받지 않는다. 적합한 서열의 예는 PCR 생성물의 클로닝에 편리한 뉴클레오티드 서열, 예를 들어 제한 효소 절단 부위 및 적합한 제한 효소 절단 부위를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.

또한, 센스 프라이머 및 안티센스 프라이머를 상기 설명 및 PCR용 프라이머의 통상적인 고안에 따라 적합하게 고안한다.

상기와 같이, ML-236B 생산 미생물로부터의 mRNA 또는 전체 RNA를 RT-PCR 용 주형으로 사용할 수 있다. 본 발명에서, pML48 인서트 서열 내의 구조 유전자 mlcE 의 코딩 영역의 모두를 증폭시키는데 적합한 프라이머[서열 목록의 서열 번호 35 및 36 의 뉴클레오티드 서열로 각각 나타낸 프라이머] 쌍을 고안하고 합성하고 이어서 SANK13380 의 전체 RNA를 주형으로 사용하여 RT-PCR를 수행함으로써 구조 유전자 mlcE 에 상응하는 ML-236B 생합성 촉진 cDNA를 수득했다.

서열 목록의 서열 번호 39 및 40 의 뉴클레오티드 서열로 각각 나타낸 프라이머를 사용하여 유사한 방식으로 구조 유전자 mlcR 에 상응하는 ML-236B 생합성 촉진 cDNA를 수득했다.

상기에 기술된 것처럼, 적합한 DNA 벡터에 삽입함으로써 RT-PCR 생성물을 클로닝할 수 있다. 상기 클로닝에 사용되는 DNA 벡터의 선택은 제한 받지 않고, 적합하게는 DNA 프래그먼트의 클로닝에 통상 사용되는 DNA 벡터이다. RT-PCR 생성물의 클로닝을 용이하게 수행하기 위한 키트는 시판되고 있고, Original TA CloningKit[Invitrogen제: pCR2.1을 DNA 벡터로 사용함]이 바람직하다.

상기 방법을 사용하여 ML-236B 생산 미생물에서 수득된 ML-236B 생합성 촉진 cDNA의 기능적 발현은 ML-236B 생산 미생물에서의 기능적 발현에 적합한 DNA 벡터에 cDNA를 클로닝함으로써 확인할 수 있다. 이어서 적합한 세포를 재조합 DNA 벡터로 형질전환하고, 형질전환된 세포 및 형질전환되지 않은 숙주 세포의 ML-236B 생합성 능력을 비교한다. 만약 ML-236B 생합성 촉진 cDNA 가 형질전환된 세포에서 기능적으로 발현된다면, 숙주 세포의 ML-236B 생합성 능력에 비해 형질전환된 세포의 ML-236B 생합성 능력이 향상된다.

ML-236B 생산 미생물에서 발현에 적합한 DNA 벡터[이하 기능적인 발현 벡터로 지칭함]의 선택은 상기가 ML-236B 생산 미생물을 형질전환시키는데 사용될 수 있고 상기 생물 내에서 ML-236B 생합성 촉진 cDNA 에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 기능적으로 발현시킬 수 있는 것이라면 제한 받지 않는다. 바람직하게는 벡터는 숙주 세포에서 안정적이고, 숙주 세포에서 복제를 허용하는 뉴클레오티드 서열을 갖는다.

기능적 발현을 위한 벡터는 하나 이상의 ML-236B 생합성 촉진 cDNA, 예를 들어 구조 유전자 mlcE 및/또는 mlcR 에 상응하는 cDNA를 포함할 수 있다.

기능적인 발현을 위한 벡터는 ML-236B 생산 미생물에 도입되었을 때 ML-236B 의 생합성을 촉진하는 구조 유전자mlcE 및/또는mlcR 에 상응하는 cDNA 이외에 한 가지 이상의 DNA를 포함할 수 있다. 상기 DNA의 예는 구조 유전자mlcA,mlcB,mlcC, 또는mlcD 에 상응하는 cDNA, ML-236B 생합성에 관련된 게놈 DNA, 본 발명의ML-236B 생합성 촉진 cDNA 의 발현 조절 인자를 코딩하는 DNA 등을 포함한다.

기능적인 발현을 위한 벡터는 바람직하게는 숙주 세포의 플라스미드에 선택적 표현형을 제공하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 바람직하게는 셔틀 벡터이다.

또한, 선택적 표현형은 약물 내성 표현형 등일 수 있고, 바람직하게는 항생물질 내성이고, 더 바람직하게는 암피실린에 대한 내성 또는 하이그로마이신 B 에 대한 내성이다.

발현 벡터가 셔틀 벡터인 경우, 벡터는 적합하게는 벡터가 미생물 군 중 하나의 숙주 세포에서 복제하게 하는 뉴클레오티드 서열, 및 다른 숙주 세포 유형에서 벡터 인서트에 의해 코딩된 폴리펩티드의 발현에 필요한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 벡터가, 형질전환된 상이한 미생물군의 각각의 숙주 세포에 대한 상이한 선택적 표현형을 제공하는 것이 바람직하다. 미생물군의 조합에 대한 요구 조건은 본 명세서에 기술된 ML-236B 생합성에 관련된 게놈 DNA의 클로닝 및 발현에 사용되는 셔틀 벡터에 대한 요구조건과 유사하다.

본 발명에서, 적합한 셔틀 벡터 DNA 벡터는 DNA 벡터 pSAK333 에 존재하는아스페르길루스 니둘란스로부터 나온 3-포스포글리세레이트 키나제(이하 "pgk"로 지칭함) 프로모터(일본 특허 출원 공보 제 3-262486 호에 기술되어 있음), 외래 유전자 삽입용 아답터, 및 DNA 에 존재하는 pgk 터미네이터를 상기 순서로 조합하여 작제된 pSAK700 이다(도 4를 보라).

상기 구조 유전자mlcE 에 상응하는 cDNA를 상기 발현 벡터에 삽입함으로써ML-236B 생산 미생물에서 폴리펩티드가 발현될 수 있다. 본 발명에서, 재조합 cDNA 발현 벡터 pSAKexpE를 pSAK700의 아답터 부위에 구조 유전자mlcE에 상응하는 cDNA를 삽입함으로써 수득했다. pSAKexpE에 삽입된 서열, 즉 구조 유전자mlcE 에 상응하는 cDNA의 뉴클레오티드 서열을 서열 목록의 서열 번호 37에 나타낸다. 유사하게 재조합 cDNA 발현 벡터 pSAKexpR을 pSAK700의 아답터 부위에 구조 유전자mlcR에 상응하는 cDNA를 삽입함으로써 수득했다. pSAKexpR에 삽입된 서열, 즉 구조 유전자mlcR에 상응하는 cDNA의 뉴클레오티드 서열을 서열 목록의 서열 번호 41 에 나타낸다.

pSAKexpE에 의해 형질전환된에스케리키아 콜라이균주인에스케리키아 콜라이pSAKexpE SANK 72499는 미생물 수탁에 관한 부다페스트 조약에 따라, 2000년 1월 25일자로 통상산업성 공업기술원 생명공학 공업기술연구원에 수탁 번호 FERM BP-7005로 수탁됐다. pSAKexpR 에 의해 형질전환된에스케리키아 콜라이균주인에스케리키아 콜라이pSAKexpR SANK 72599 는 미생물 수탁에 관한 부다페스트 조약에 따라, 2000년 1월 25일자로 통상산업성 공업기술원 생명공학 공업기술연구원에 수탁 번호 FERM BP-7006으로 수탁됐다.

적합한 형질전환 방법을 숙주 세포에 따라 적절하게 선택하여 ML-236B 생합성 촉진 cDNA, ML-236B 생합성에 관련된 게놈 DNA 또는 그의 프래그먼트의 발현을 얻을 수 있다.페니실륨 시트리눔의 포자로부터 원형질체를 제조하고, 이어서 재조합 DNA 벡터를 원형질체에 도입함으로써 바람직한 ML-236B 생산 미생물인페니실륨 시트리눔의 형질전환을 수행할 수 있다[Nara, F.,et al., Curr. Genet. 23, 28(1993)에 기술되어 있음].

적합하게는페니실륨 시트리눔배양물의 슬랜트로부터의 포자를 PGA 아가 배지의 플레이트에 접종하고 22 내지 28℃에서 10 내지 14 일 동안 인큐베이션한다. 이이서 포자를 플레이트로부터 수거하고 1 x 10⁷내지 1 x 10⁹개의 포자를 YPL-20 배양 배지[조성물: 0.1%(w/v) 효모 추출물(Difco corporation제), 0.5%(w/v) 폴리펩톤(Nihon Seiyaku corporation제), 락토스 20%(w/v), pH 5.0] 50 내지 100 ml 에 접종하고, 이어서 22 내지 28℃에서 18 시간 내지 2 일 동안 인큐베이션한다. 발아 포자를 배양물로부터 회수하고, 세포벽 분해 효소로 처리하여 원형질체를 수득한다. 세포벽 분해 효소의 선택은페니실륨 시트리눔의 세포벽을 분해할 수 있는 것이고 미생물에 해로운 효과를 주지 않는다면 특별히 제한 받지 않는다. 그의 예는 자이몰리아제(zymolyase), 키틴아제 (chitinase) 등을 포함한다.

적절한 조건하에서 ML-236B 생합성 촉진 cDNA을 포함하는 재조합 DNA 벡터 및 ML-236B 생산 미생물, 또는 그의 원형질체의 혼합으로 재조합 DNA 벡터가 상기 원형질체에 도입하게 하여 형질전환체를 제공한다.

ML-236B 생산 미생물의 형질전환체의 배양을 적합하게는 각각의 숙주 세포에 적합한 조건하에서 수행한다. 세포벽을 재생성하는데 적절한 조건하에서 앞서 형질전환된 원형질체를 접종하고 배양함으로써 바람직한 ML-236B 생산 미생물인페니실륨 시트리눔의 형질전환체의 배양을 수행할 수 있다. 즉,페니실륨 시트리눔의 형질전환된 원형질체를 VGS 중간층 아가 배지[조성물: 보겔(Vogel) 최소 배지,2%(w/v) 글루코스, 1 M 글리시톨, 2%(w/v) 아가]에 도입하고, 이어서 VGS 중간층 아가를 VGS 하층 아가 배지[조성물: 보겔 최소 배지, 2%(w/v) 글루코스, 1 M 글리시톨, 2.7%(w/v) 아가]와 VGS 상층 아가 배지[조성물: 보겔 최소 배지, 2%(w/v) 글루코스, 1 M 글리시톨, 1.5%(w/v) 아가](하이그로마이신 B 800 ㎍/ml 를 포함함) 사이에 끼우고, 이어서 22 내지 28℃에서 7 내지 15 일 동안 인큐베이션할 수 있다. 생성된 균주를 PGA 배지 상에서 22 내지 28℃에서의 인큐베이션으로 계대배양한다. 균주를 백금니로 PGA 배지로 제조된 슬랜트에 접종하고 22 내지 28℃에서 10 내지 14 일 동안 인큐베이션하고, 이어서 0 내지 4℃에서 저장한다.

상기에서 기술된 것처럼, 상기의 슬랜트으로부터 수득되고, 재생성된 세포벽을 갖는페니실륨 시트리눔형질전환체를 MBG 3-8 배지에 접종하고, 이이서 22 내지 28℃에서 7 내지 12 일 동안 진탕시키면서 인큐베이션함으로써 ML-236B 가 효율적으로 생산될 수 있다. 숙주 세포로페니실륨 시트리눔을 액체 배지에서 배양하여 마찬가지로 ML-236B를 생성할 수 있다.

천연 생성물의 정제에 통상 사용되는 각종 방법을 조합하여 ML-236B 생산 미생물의 형질전환체의 배양물로부터 ML-236B를 정제하는 것을 수행할 수 있다. 상기 방법의 선택은 특별히 제한 받지 않고, 예를 들어 원심분리, 여과에 의한 고체와 액체의 분리, 알칼리 또는 산의 처리, 유기 용매로의 추출, 용해, 흡수 크로마토그래피, 부분 크로마토그래피 등과 같은 크로마토그래피 방법, 및 결정화법 등일 수 있다. ML-236B는 상호 전환될 수 있는 히드록시산 또는 락톤 형태로 존재할 수 있다. 히드록시산은 더 안정적인 그의 염으로 전환된다. 상기 물리적 특성을 사용하여, ML-236B 히드록시산 형태(이하 자유 히드록시산으로 지칭함), ML-236B 히드록시산의 염(이하 히드록시산의 염으로 지칭함), 또는 ML236B 락톤 형태(이하 락톤으로 지칭함)를 수득할 수 있다.

고리를 열기 위해 고온 또는 실온에서 배양물을 알칼리성 가수분해하여 히드록시산의 염으로 전환하고, 이어서 반응액을 산성화하고 여과한다. 여과물을 물로부터 분리시키는 유기 용매로 추출하여 자유 히드록산으로 의도되는 생성물을 제공한다. 유기 용매의 선택은 특별히 제한 받지 않는다. 그의 예는 지방족 탄화수소(예를 들어 헥산, 헵탄 등); 방향족 탄화수소(예를 들어 벤젠, 톨루엔 등); 할로겐화 탄화수소(예를 들어 메틸렌 클로라이드, 클로로포름 등); 에테르(예를 들어 디에틸 에테르 등); 에스테르(예를 들어 에틸 포르메이트, 에틸 아세테이트 등); 또는 2 개 이상의 용매로 구성된 혼합물을 포함한다.

수산화나트륨과 같은 알칼리금속염의 수용액에 자유 히드록시산을 용해시킴으로써 의도된 화합물을 히드록시산염으로 수득할 수 있다.

또한, 유기 용매에서 자유 히드록시산을 가열하여 탈수시키거나, 다른 적합한 방법에 의해 고리를 폐쇄하여 의도된 화합물을 락톤으로 수득할 수 있다.

칼럼 크로마토그래피 등을 사용하여 수득된 자유 히드록시산, 히드록시산 또는 락톤을 정제 분리하는 것이 가능하다. 크로마토그래피에 사용되는 칼럼의 지지체는 특별히 제한 받지 않는다. 그의 예는 Sephadex LH-20(Pharmacia corporation제), Diaion HP-20(Mitsubishi Kagaku corporation제), 실리카 겔, 역상 지지체 등을 포함하고, C18 시리즈의 지지체가 바람직하다.

ML-236B 정량화 방법의 선택은 특별히 제한 받지 않고, 유기 화합물의 정량화에 통상 사용되는 방법이 바람직하다. 그의 예는 역상 고성능 액체 크로마토그래피(이하 "역상 HPLC"로 지칭함) 등을 포함한다. 역상 HPLC 에 따른 정량화는, ML-236B 생산 미생물의 배양물을 알칼리성 가수분해하고, 용해성 분획을 C18 칼럼을 사용하여 역상 HPLC 에 가하고, UV 흡광도를 측정하고, 흡광도 값을 ML-236B 의 양으로 전환함으로써 수행될 수 있다. C18 칼럼의 선택은 특별히 제한 받지 않고, 통상적인 역상 HPLC에 사용되는 C18 칼럼이 바람직하다. 그의 예는 SSC-ODS-262(직경 6 mm, 길이 100 mm, Senshu Kagaku corporation제) 등을 포함한다. 상을 이동시키는 용매의 선택은 역상 HPLC에 통상 사용되는 용매라면 특별히 제한 받지 않는다. 예를 들어 75%(v/v) 메탄올-0.1%(v/v) 트리에틸 아민-0.1%(v/v) 아세트산 등이다. ML-236B를 SSC-ODS-262 칼럼에 실온에서 첨가할 때, 75%(v/v) 메탄올-0.1%(v/v) 트리에틸 아민-0.1%(v/v) 아세트산이 2 ml/분의 속도로 상을 이동시키면서 사용될 경우, ML-236B 가 4.0 분 후에 용출된다. HPLC 용 UV 검출기를 사용하여 ML-236B를 검출할 수 있다. UV 검출용 흡수 파장은 220 내지 280 nm, 바람직하게는 220 내지 260 nm, 더 바람직하게는 236 nm 이다.

본 발명을 사용하여 수득된 ML-236B를 포함하는 제약학적 조성물이 제약학적 담체와 함께 제공된다.

본 발명을 사용하여 수득된 ML-236B로부터 제조되는 프라바스타틴을 함유하는 제약학적 조성물이 제약학적 담체와 함께 제공된다.

본 발명의 제약학적 조성물은 종래의 것일 수 있고 ML-236B 또는 프라바스타틴의 현존하는 제제로 사용되는 것과 동일한 것일 수 있다.

치료 방법은 본 발명의 일부일 수 있고 지방과잉혈증 및 다른 질환을 치료하기 위한 화합물 또는 조성물을 사용한다.

본 발명은 이제 하기 도면 및 실시예를 참고하여 더 자세히 설명된다. 실시예는 본 발명을 설명하지만 여기에 제한되지는 않는다.

실시예

실시예 1: pSAKcos1 벡터의 작제

에스케리키아 콜라이로부터 유래하는 하이그로마이신 B 포스포트랜스퍼라제 유전자 (이하, "HPT"라 칭함)을 포함하는 플라스미드 pSAK333 (일본 특허 출원 공개 공보 제3-262486호)를 제한 효소 BamHI (일본의 Takara Shuzo Co., Ltd제)으로 절단하고 T4 DNA 폴리머라제 (일본의 Takara Shuzo Co., Ltd제)로 처리하여 블런트 말단을 형성하였다.

상기와 같이 얻은 DNA 프래그먼트를 DNA 라이게이션 키트 버전 2 (일본의 Takara Shuzo Co., Ltd제)를 사용하여 원형으로 자가 라이게이션시키고, 이어서 이를 사용하여 콤피턴트 세포인 에스케리키아 콜라이 JM 109 (일본의 Takara Shuzo Co., Ltd제)를 형질전환시켰다. BamHI 부위가 결실된 플라스미드를 보유하는 균주를 형질전환 에스케리키아 콜라이로부터 선발하여 pSAK360으로 명명하였다.

pSAK360을 제한 효소 PvuII로 절단하고, 이어서 알칼라인 포스파타제로 처리하여 5'-말단이 탈인산화된 프래그먼트를 생성하였다. cos 부위를 포함하는 SalI-ScaI 프래그먼트 (약 3 kb)를 코스미드 벡터 pWE15 (STRATAGENE 제)로부터 얻고,이를 T4 DNA 폴리머라제로 처리하여 블런트 말단을 형성하였다. 그 후, 이를 pSAK360의 PvuII 부위로 라이게이션하였다. 상기 DNA로 JM109를 형질전환시켰다. PvuII 부위에 SalI-ScaI 프래그먼트 (약 3 kb)가 삽입된 플라스미드를 보유하는 균주를 형질전환 에스케리키아 콜라이로부터 선발하고, 상기 균주에 의해 보유되는 플라스미드를 pSAKcos1으로 명명하였다. pSAKcos1은 제한 효소 BamHI, EcoR1 및 NotI의 절단 부위를 포함하는데, 각각의 부위는 pWE15로부터 유래하였다. pSAKcos1은 선발 마커로서 암피실린 내성 유전자 및 하이그로마이신 내성 유전자를 보유한다.

에스케리키아 콜라이를 숙주로 사용하는 하기 실시예에 있어서, pSAKcos1 형질전환체, 또는 외래 유전자 인서트를 포함하는 pSAKcos1의 형질전환체의 선발은 관련 배지에 40 μg/ml의 암피실린을 첨가함으로써 수행하였다 (암피실린: Sigma Corporation제). 페니실륨 시트리눔 (Penicillium citrinum) SANK13380을 숙주로 사용하는 경우, pSAKcos1 형질전환체, 또는 외래 유전자 인서트를 포함하는 pSAKcos1의 형질전환체의 선발은 관련 배지에 200 μg/ml의 하이그로마이신을 첨가함으로써 수행하였다 (하이그로마이신: Sigma Corporation제).

pSAKcos1의 작제 방법을 도 1에 나타내었다.

실시예 2: 페니실륨 시트리눔 SANK 13380의 게놈 DNA의 제조

1) 페니실륨 시트리눔 SANK 13380의 배양

페니실륨 시트리눔 SANK 13380의 종배양 (seed culture)을 PGA 아가 배지의 슬랜트 상에서 수행하였다. 즉, 백금니를 사용하여 페니실륨 시트리눔 SANK 13380을 아가에 접종하여, 이를 26℃에서 14일 동안 유지하였다. 슬랜트를 4℃에서 유지하였다.

주 배양은 액체 통기 배양법으로 수행하였다. 5 mm²의 상기 슬랜트로부터의 세포를 500 ml의 코니칼 플라스크 중 MBG3-8 배지 50 ml에 접종하고, 210 rpm에서 진탕시키면서 26℃에서 5일 동안 배양하였다.

2) 페니실륨 시트리눔 SANK 13380으로부터의 게놈 DNA의 제조

단계 1)에서 얻은 배양물을 10000 x G, 실온에서 10분 동안 원심분리하여 세포를 수집하였다. 드라이 아이스로 냉각시킨 모르타르에서 3 g (습윤 중량)의 세포를 파쇄하여 분말의 형태가 되도록 하였다. 20 ml의 62.5 mM EDTA·2Na (Wako Pure Chemical Industries, LTD.제) - 5% (w/v) SDS - 50 mM 트리스 염산 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.제) 완충제 (pH 8.0)가 충진된 원심분리 튜브에 상기 파쇄 세포를 넣고, 온화하게 혼합시키고, 이어서 0℃에서 1시간 동안 정치시켰다. 10 mM의 트리스 염산 및 0.1 mM EDTA·2Na (pH 8.0, 이하, "TE"로 칭함)로 포화된 페놀 10 ml을 여기에 첨가하고, 혼합물을 50℃에서 1시간 동안 온화하게 교반시켰다.

실온, 10000 x G에서 10 분 동안 원심분리한 후, 15 ml의 상층 (수상)을 다른 원심분리 튜브에 넣었다. 상기 용액에 0.5배 부피의 TE 포화 페놀 및 0.5배 부피의 클로로포름 용액을 첨가하였다. 혼합물을 2분 동안 교반시키고, 실온, 10000 x G 에서 10 분 동안 원심분리하였다 (이하, "페놀 클로로포름 추출"이라 칭함).상층 (수상) 10 ml에 10 ml의 8M 아세트산암모늄 (pH 7.5) 및 25 ml의 2-프로판올 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 제)을 첨가하고, 이어서 -80℃에서 15분 동안 냉각시키고, 4℃, 10000 x G 에서 10 분 동안 원심분리하였다.

침전 후, 침전물을 5 ml의 TE에 용해시킨 후, 20 μl의 10 mg/ml 리보뉴클레아제 A (Sigma corporation 제) 및 250 단위의 리보뉴클레아제 T1 (GIBCO corporation 제)을 여기에 첨가하고, 이어서 37℃에서 20분 동안 인큐베이션시켰다. 여기에 20 ml의 2-프로판올을 첨가하고, 온화하게 혼합하였다. 그 후, 게놈 DNA의 쓰레드 (thread)를 파스퇴르 피펫 팁에 스풀링하고, 1 ml의 TE에 용해시켰다.

다음, 0.1 배 부피의 3 M 아세트산나트륨 (pH 6.5) 및 2.5 배 부피의 에탄올을 상기 DNA 용액에 첨가하였다. 이 용액을 -80℃에서 15분 동안 냉각시키고, 이어서 4℃, 10000 x G 에서 5분 동안 원심분리하였다 (이하, 본원에서 "에탄올 침전"이라 칭함). 생성된 침전물을 200 μl의 TE에 용해시켰는데, 이는 게놈 DNA 분획이었다.

실시예 3: 페니실륨 시트리눔 SANK13380의 게놈 DNA 라이브러리의 제조

1) 게놈 DNA 프래그먼트의 제조

0.25 단위의 Sau3AI (일본의 Takara Shuzo Co., Ltd.제) 를 실시예 2에서 얻은 페니실륨 시트리눔 SANK13380의 게놈 DNA (50 μg)의 수용액 100 μl에 첨가하였다. 10, 30, 60, 90 및 120 초의 간격 후에, 20 μl의 혼합물 시료를 취하고, 각각의 시료에 0.5 M EDTA (pH 8.0) 를 첨가하여 제한 효소 반응을 중지시켰다.생성된 부분 절단 DNA 프래그먼트를 아가로스 겔 전기영동으로 분리하고, 30 kb 이상의 DNA 프래그먼트를 포함하는 아가로스 겔을 회수하였다.

회수 겔을 미분화하고, 울트라 프리 C3 원심분리 여과 단위 (Ultra Free C3 Centrifuged Filtration Unit, Japan Milipore corporation제)에 넣었다. 겔을 -80℃에서 15분 동안 냉각시켜 동결시키고, 이어서 겔을 37℃에서 10분 동안 인큐베이션함으로써 용융시켰다. 이를 5000 x G 에서 5 분 동안 원심분리시켜 DNA를 추출하였다. DNA를 페놀-클로로포름으로 추출하여 에탄올로 침전시켰다. 생성된 침전물을 적당한 소량의 TE에 용해시켰다.

2) DNA 벡터 pSAKcos1의 예비처리

pSAKcos1를 제한효소 BamHI (일본의 Takara Shuzo Co., Ltd.제)으로 절단하고, 이어서 65℃에서 30분 동안 처리한 알칼라인 포스파타제 (일본의 Takara Shuzo Co., Ltd.제) 로 처리하였다. 생성된 반응 용액을 페놀-클로로포름으로 추출하고, 에탄올로 침전시켰다. 생성된 침전물을 적당한 소량의 TE에 용해시켰다.

3) 라이게이션 및 시험관내 패키징

상기 단계 1)에 기술된 게놈 DNA 프래그먼트 (2 μg) 및 상기와 같이 예비처리한 pSAKcos1 (1 μg)을 혼합시키고, 이어서 DNA 라이게이션 키트 버전 2 (일본의 Takara Shuzo Co., Ltd.제)를 사용하여 16℃에서 16시간 동안 라이게이션시켰다. 생성된 반응 용액을 페놀 - 클로로포름으로 추출하고 에탄올로 침전시켰다. 생성된 침전물을 5 μl의 TE에 용해시켰다. 라이게이션 생성물 용액을, GIGAPAK II Gold kit (STRATAGENE corporation제)를 사용하여 시험관내 패키징에 적용하여 재조합 DNA 벡터를 포함하는 에스케리키아 콜라이 형질전환체를 얻었다. 3 ml 의 LB 배지를 에스케리키아 콜라이 형질전환체가 형성된 플레이트 상에 붓고, 이어서 플레이트 상의 콜로니를 세포 스크레이퍼를 사용하여 회수하였다 ("회수 용액 1"로 칭함). 플레이트를 3 ml 의 LB 배지로 추가로 세척하고, 세포를 회수하였다 ("회수 용액 2"로 칭함). 글리세롤을 회수 용액 1 및 2의 혼합물에 첨가하여 18%의 최종 농도를 얻었으며 (에스케리키아 콜라이 세포 용액으로 칭함), 이를 페니실륨 시트리눔 SANK13380의 게놈 DNA 라이브러리로서 -80℃에서 유지하였다.

실시예 4: 페니실륨 시트리눔 SANK13380의 게놈 DNA를 주형으로 사용한 PCR에 의한 PKS 유전자 프래그먼트의 증폭

1) PCR을 위한 프라이머의 고안 및 합성

아스페르길루스 플라부스 (Aspergillus flavus)의PKS 유전자의 아미노산 서열 (Brown, D.W. 등의 문헌 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 1418 (1996)])을 기초로 하여 , 서열 목록의 서열 번호 3 및 4에 나타낸 축중 (degenerate) 프라이머를 고안 합성하였다. 합성은 포스포아미다이트 방법에 따라 수행하였다.

서열 목록의 서열 번호 3:

gayacngcntgyasttc

서열 목록의 서열 번호 4:

tcnccnknrcwgtgncc

서열 번호 3 및 4의 뉴클레오티드 서열에 있어서, n은 이노신 (하이포잔틴)을 나타내고, y 는 t 또는 c를 나타내고, s는 g 또는 c를 나타내고, k는 g 또는 t를 나타내고, r은 g 또는 a를 나타내고, w 는 a 또는 t를 나타낸다.

2) PCR에 의한 DNA 단편의 증폭

상기 단계 1)의 PCR 프라이머 (각각 100 pmol), 실시예 2에서 얻은 페니실륨 시트리눔 SANK13380의 게놈 DNA (500 ng), 0.2 mM 의 dATP, 0.2 mM 의 dCTP, 0.2 mM 의 dGTP, 0.2 mM 의 dTTP, 50 mM 의 염화칼륨, 2 mM 의 염화마그네슘 및 1.25 단위의 Ex. Tac DNA 폴리머라제 (일본의 Takara Shuzo Co., Ltd. 제)를 포함하는 50 μl의 반응 용액을 제조하였다. 이 용액을 하기의 연속 3단계로 구성된 반응 사이클에 적용하였다: 94℃에서 1분, 58℃에서 2분 및 70℃에서 3분. 이 사이클을 30회 반복하여 DNA 프래그먼트를 증폭시켰다. TaKaRa PCR Thermal Cycler MP TP 3000 (일본의 Takara Shuzo Co., Ltd.제)를 사용하여 PCR을 수행하였다.

증폭 DNA 프래그먼트를 아가로스 겔 전기영동에 적용하고, 이어서 크기가 약 1.0 내지 2.0 kb인 DNA 프래그먼트를 포함하는 아가로스를 회수하였다. DNA를 겔로부터 회수하고, 이를 페놀-클로로포름으로 추출하고 에탄올로 침전시켰다. 생성된 침전물을 소량의 TE에 용해시켰다.

3) 라이게이션 및 형질전환

단계 2)에서 얻은 DNA 프래그먼트를 TA 클로닝 시스템 pCR 2.1(Invitrogen corporation제)을 사용하여 플라스미드 pCR2.1에 라이게이션시켰는데, 이 플라스미드는 상기 키트의 일부로 제공된다. 이 플라스미드로 에스케리키아 콜라이 JM109를 형질전환시켜 형질전환체를 생성하였다.

생성된 형질전환체로부터 여러 콜로니를 선발하여 Maniatis 등의 방법 (문헌[Maniatis, T. 등, Molecular cloning, a laboratory manual, 제2판, Cold Spring Harbor Laboratory, 미국 뉴욕주의 콜드 스프링 하버 소재(1989)]에 기술되어 있음)에 따라 배양하였다. 즉, 각각의 콜로니를 2 ml 의 LB 배지를 포함하는 24 ml의 시험관에 접종하고, 37℃에서 18시간 동안 진탕 배양하였다.

재조합 DNA 벡터를 알칼라인 방법(Maniatis, T. 등의 상기 문헌에 기술되어 있음)에 따라 배양물로부터 제조하였다. 즉, 1.5 ml 의 배양액을 실온, 10000 x G 에서 2분 동안 원심분리하였다. 이어서 침전물로부터 세포를 회수하였다. 100 μl 의 50 mM 글루코스, 25 mM 트리스 염산, 10 mM EDTA의 용액 (pH 8.0)을 세포에 첨가하여 현탁물을 형성하였다. 여기에 200 μl 의 0.2 N 수산화나트륨- 1%(w/v) SDS를 첨가하였다. 이 현탁물을 온화하게 교반하여 미생물을 용균시켰다. 이어서 150 μl 의 3 M 아세트산칼륨 - 11.5%(w/v) 아세트산을 첨가하여 모든 단백질을 변성시키고, 이어서 실온, 10000 x G에서 10 분 동안 원심분리시켰다. 상청액을 회수하였다. 이 상청액을 페놀-클로로포름으로 추출하고 에탄올로 침전시켰다. 생성된 침전물을 40 μg/ml 의 리보뉴클레아제 A (Sigma corporation제)를 포함하는 50 μl 의 TE에 용해시켰다.

각각의 재조합 DNA 벡터를 제한 효소로 절단하고, 전기영동에 적용하였다. 전기영동 상에서 상이한 절단 패턴을 가지는 모든 인서트에 있어서, 재조합 DNA 벡터 중 DNA 인서트의 뉴클레오티드 서열을 DNA 서열 결정기(모델 377: 일본의 Perkin Elmer제)를 사용하여 결정하였다.

이러한 방식으로 페니실륨 시트리눔으로부터 유래된 PKS 프래그먼트를 포함하는 재조합 DNA 벡터를 보유하는 균주를 동정하였다.

실시예 5: 페니실륨 시트리눔 SANK13380의 게놈의 서턴 (Southern) 블로팅 혼성화

1) 전기영동 및 막으로의 이동

실시예 2에서 얻은 페니실륨 시트리눔 SANK13380의 게놈 DNA (10 μg)을 제한 효소 EcoRI, SalI, HindIII 또는 Sac1 (이들 모두는 일본의 Takara Shuzo Co., Ltd.제임)으로 절단하고, 이어서 아가로스 겔 전기영동에 적용하였다. 겔은 아가로스 L03 "TAKARA" (일본의 Takara Shuzo Co., Ltd.제)를 사용하여 제조하였다. 전기영동 후에 겔을 0.25 N 염산 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.제)에 침지시키고, 실온에서 10분 동안 온화하게 진탕시키면서 인큐베이션하였다. 겔을 0.4 N 수산화나트륨 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.제)으로 옮기고, 실온에서 30분 동안 온화하게 인큐베이션하였다. Maniatis 등 (상기 문헌 참조)의 알칼라인 이동법을 사용하여, 겔의 DNA를 나일론 막 Hybond(상표명)-N⁺(Amersham corporation제) 상에 이동시키고, 상기에 고정화하였다. 이 막을 2 x SSC (1 x SSC는 150 mM NaCl, 15 mM 시트르산나트륨을 포함함)로 세척하고, 이어서 공기 건조시켰다.

2) 혼성화 및 신호의 검출

실시예 4에서 얻은 PKS 유전자 프래그먼트를 프로브로 사용하여 단계 1)에서 얻은 막을 혼성화하였다.

프로브에 있어서, 실시예 4에서 얻은 PKS 유전자 인서트 프래그먼트 DNA 1 μg을 DIG DNA 표지 키트 (Boeringer-Mannheim제)로 표지화하고, 10분 동안 비등시키고 이어서 사용 직전에 신속하게 냉각시켰다.

단계 1)에 기술된 막을 혼성화 액체 (DIG Easy Hyb: Boeringer-Mannheim제)에 침지시키고, 이어서 20 rpm, 42℃에서 2시간 동안 진탕시키면서 예비혼성화하였다. 이어서, 상기 표지 프로브를 혼성화 액체에 첨가하고, 다중진탕기 오븐 (Multishaker Oven) HB (TAITEC corporation제)을 사용하여 20 rpm , 42℃에서 18시간 동안 진탕시키면서 혼성화를 수행하였다. 이어서 혼성화를 실시한 막을 2 x SSC를 사용하여 실온에서 20분 동안 3회, 0.1 x SSC를 사용하여 55℃에서 30분 동안 2회 세척하였다.

세척 막을 핵산의 DIG 발광성 검출 키트 (DIG Luminescent Detection Kit for Nucleic Acids, Boeringer-Mannheim제)로 처리하고, X선 필름 (Lumifilm, Boeringer-Mannheim제)에 노출시켰다. 후지 의학 필름 프로세서 FPM 800A (Fuji Film Corporation제)을 사용하여 노출을 수행하였다.

그 결과, 실시예 4에서 얻은 PKS 유전자 프래그먼트가 페니실륨 시트리눔의 게놈 상에 존재함이 확인되었다.

실시예 6: PKS 유전자 프래그먼트를 프로브로 사용한 페니실륨 시트리눔 SANK13380의 게놈 DNA 라이브러리의 스크리닝

콜로니 혼성화 방법을 사용하여 PKS 유전자를 포함하는 게놈 DNA 프래그먼트의 클로닝을 수행하였다.

1) 막의 제조

페니실륨 시트리눔 SANK13380의 게놈 DNA 라이브러리로 유지된 에스케리키아 콜라이 세포 용액 (실시예 3에 기술됨)을 희석시키고, 플레이트 당 5000 내지 10000개의 콜로니가 생장할 수 있도록 LB 아가 배지 플레이트 상에 도말하였다. 플레이트를 26℃에서 18시간 동안 유지하고, 4℃에서 1시간 동안 냉각시켰다. Hybond (상표명)-N⁺(Amasham corporation제)를 플레이트 상에 놓고, 플레이트와 1분 동안 접촉시켰다. 콜로니가 점착된 막을 조심스럽게 플레이트로부터 옮겼다. 콜로니와 접촉한 표면을 위로 하여, 200 ml의 1.5 M 염화나트륨, 0.5 N 수산화나트륨 용액에 7분 동안 침지시키고, 이어서 200 ml의 1.5 M 염화나트륨, 0.5 M 트리스 염산, 1 mM EDTA의 용액 (pH 7.5)에 3분 동안 2회 침지시키고, 이어서 400 ml의 2 x SSC로 세척하였다. 세척 막을 30분 동안 공기 건조시켰다.

2) 혼성화

실시예 4에서 얻은 PKS 유전자 인서트 DNA (1 μg)을 프로브로 사용하였다. DNA를 DIG DNA 표지 키트 (Boeringer-Mannheim제)를 사용하여 표지화하고 10분 동안 비등시키고 사용 직전에 신속하게 냉각시켰다.

단계 1)에 기술한 막을 혼성화 액체 (DIG Easy Hyb: Boeringer-Mannheim제)에 침지시키고, 이어서 20 rpm, 42℃에서 2시간 동안 예비혼성화 세척하였다. 이어서 상기 표지 프로브를 혼성화 액체에 첨가하고, 20 rpm, 42℃에서 18 시간 동안 다중진탕기 오븐 HB (TAITEC corporation제)를 사용하여 혼성화를 수행하였다. 혼성화 실시 막을 2 x SSC를 사용하여 실온에서 20 분 동안 3회, 그리고 0.1 x SSC를 사용하여 68℃에서 30분 동안 2회 세척하였다.

세척 막을 핵산의 DIG 발광성 검출 키트 (Boeringer-Mannheim제)로 처리하고, X선 필름에 노출시켰다 (Lumifilm, Boeringer-Mannheim제). 후지 의학 필름 프로세서 FPM 800A (Fuji Film Corporation제)을 사용하여 노출을 수행하였다.

상기 단계 1) 및 2)를 스크리닝으로 칭한다.

제1 스크리닝에서 양성 신호가 검출된 플레이트 상의 콜로니를 긁어내어 회수 세포를 LB 배지에 현탁시켰다. 이어서 세포를 적당하게 희석시키고, 적합한 플레이트 상에 도말하였다. 그 후, 제2 스크리닝을 수행하여 양성 클론을 정제하였다.

본 실시예에서 얻은 양성 클론, 즉, 형질전환 에스케리키아 콜라이인 에스케리키아 콜라이 pML48 SANK71199 균주는 미생물 기탁에 관한 부다페스트 조약에 따라 수탁 번호 FERM BP-6780 하에 1999년 7월 7일에 일본 통상산업성 공업기술원 생명공학 공업기술 연구원에 기탁되었다.

실시예 7: 재조합 DNA 벡터 pML48의 삽입 서열의 분석 (1)

실시예 6에서 얻은 에스케리키아 콜라이 pML48 SANK71199 균주의 배양 및 상기 배양물로부터의 재조합 DNA 벡터의 제조는 실시예 4에 기술된 것과 유사한 방식으로 수행하였다.

얻어진 DNA 벡터를 pML48로 명명하였다. ML-236B 생합성 관련 게놈 DNA인 pML48의 인서트를 여러 제한 효소로 절단하고, 생성된 프래그먼트를 pUC119 (일본의 Takara Shuzo Co., Ltd제) 내로 서브클로닝하였다. 생성된 서브클론을 프로브로 사용하여, 실시예 5에 기술된 것과 유사한 방법으로 서턴 블롯 혼성화를 수행하였다. 즉, 여러 제한 효소로 pML48을 절단함으로써 얻어진 생성물을 전기영동하고, DNA를 막으로 이동시켜 혼성화를 수행하였다. 그 결과, pML48의 삽입 서열의 제한 효소 절단 지도를 당 업계의 표준 기술을 사용하여 만들었다.

각각의 서브클론의 삽입 서열의 뉴클레오티드 서열을 DNA 서열결정기 모델 377 (Perkin Elmer Japan Co.Ltd 제)를 사용하여 결정하고, 이어서 pML48의 전체 뉴클레오티드 서열을 결정하였다.

pML48의 삽입 서열은 총 34203개의 염기로 구성되었다.

pML48의 삽입 서열의 뉴클레오티드의 서열은 서열 목록의 서열 번호 1 및 2에 기술되어 있다. 서열 목록의 서열 번호 1 및 2에 기술된 서열은 서로 완전히 상보적이다.

pML48 인서트 서열 상의 구조 유전자의 존재는, 유전자 탐색 프로그램 GRAIL (ApoCom GRAIL Toolkit: Apocom Corporation제) 및 상동성 탐색 프로그램 BLAST (Gapped-BLAST (BLAST2): 위스콘신 GCG 패키지 버전 10.0에 설치됨)을 사용하여 분석하였다.

그 결과, pML48의 삽입 서열에는 6개의 상이한 구조 유전자가 존재하는 것으로 예측되었으며, 이들은 각각 mlcA, mlcB, mlcC, mlcD, mlcE 및 mlcR로 명명되었다. 또한, mlcA, mlcB, mlcE 및 mlcR은 서열 목록의 서열 번호 2의 뉴클레오티드 서열 내에 코딩 영역을 가지며, mlcC 및 mlcD은 서열 목록의 서열 번호 1의 뉴클레오티드 서열 내에 코딩 영역을 가지는 것으로 예측되었다. 삽입 서열의 추정 구조 유전자 각각의 상대적인 위치 및 길이도 또한 예측되었다.

본 실시예의 결과를 도 2에 나타내었다. 각각의 화살표는 pML48 인서트 상의 각각의 구조 유전자의 위치화, 방향 및 상대적인 크기를 나타낸다. 좌측으로 향하는 화살표는 구조 유전자의 코딩 영역(mlcA, B, E 또는 R)이 서열 번호 2 상에 존재한다는 것을 나타낸다. 우측으로 향하는 화살표는 구조 유전자의 코딩 영역 (mlcC 또는 D)가 서열 번호 1에 존재한다는 것을 나타낸다.

실시예 8: 재조합 DNA 벡터 pML48의 삽입 서열의 분석 (2)

실시예 7에서 그의 존재가 예측된 구조 유전자의 발현 분석을 노턴 (Northern) 블롯 혼성화 및 RACE에 의해 실시하였다. 5- 및 3-말단 영역의 분석을 수행하였다.

1) 페니실륨 시트리눔 SANK13380의 전체 RNA의 제조

페니실륨 시트리눔 SANK13380 슬랜트 배양물 중 5 mm²으로부터의 세포 (실시예 2에 기술됨)을 100 ml의 코니칼 플라스크 중 10 ml의 MBG3-8 배지에 접종하고, 26℃에서 3일 동안 진탕 배양하였다.

배양물로부터의 전체 RNA의 제조는 구아니딘-이소티오시아네이트 방법을 사용하는 RNeasy Plant Mini Kit (Qiagen AG제)을 사용하여 수행하였다 즉, 배양물을 실온, 5000 x G에서 10분 동안 원심분리시켜 세포를 회수하였다. 그 후, 액체 질소로 2g (습윤 중량)의 세포를 동결시키고 이어서 모르타르에서 파쇄하여 분말을생성하였다. 파쇄 세포를 4 ml의 용균 완충제 (키트 중에 포함됨)에 현탁시켰다. 450 μl의 현탁물을 키트에 포함된 10개의 QIAshredder 스핀 컬럼 각각에 붓고, 이어서 실온, 1000 x G 에서 10 분 동안 원심분리시켰다. 생성된 용출액 각각을 회수하고, 여기에 225 μl의 에탄올을 첨가하고, 이어서 키트에 포함된 RNA 미니 스핀 컬럼에 첨가하였다. 컬럼을 키트에 포함된 세척 완충제로 세척하고, 이어서 리보뉴클레아제가 없는 50 μl의 증류수로 각각의 컬럼 중 흡착물을 용출시켰다. 용출액을 전체 RNA 분획으로 사용하였다.

2) 노턴 블롯 혼성화

페니실륨 시트리눔 SANK13380의 전체 RNA 20 μg을 포함하는 수용액 2.25 μl를 1 μl의 10 x MOPS (조성: 200 mM의 3-모르폴리노 프로판 술폰산, 50 mM의 아세트산나트륨, 10 mM EDTA·2Na; pH 7.0; 오토클레이브에서 121℃에서 20분 동안 살균한 후 사용; Dojinkagaku Laboratory Co.Ltd. 제), 1.75 μl의 포름알데히드 및 5 μl의 포름아미드에 첨가하고, 이어서 혼합함으로써 RNA 시료를 제조하였다. RNA 시료를 65℃에서 10분 동안 유지하고, 이어서 빙수에서 신속하게 냉각시키고, 아가로스 겔 전기영동에 적용하였다. 전기영동용 겔은 10 ml의 10 x MOPS 및 1 그램의 아가로스 L03 "TAKARA" (일본의 Takara Shuzo Co., Ltd.제)를 72 ml의 피로카르본산 디에틸 에스테르 처리 물 (Sigma Corporation제)과 혼합하고 가열하여 아가로스를 용해시키고, 이어서 냉각시키고, 이어서 18 ml의 포름알데히드를 첨가함으로써 제조하였다. 시료 완충제로는 1 x MOPS (10 x MOPS를 10배의 물로 희석시켜제조)를 사용하였다. 겔 중 RNA를 10 X SSC 에서 Hybond(상표명)-N⁺(Amasham corporation제)로 이동시켰다.

pML48의 삽입 서열을 하기 표 1에 나타낸 제한 효소 1 및 2로 절단함으로써 얻은 DNA 프래그먼트 a, b, c, d 및 e를 프로브로 사용하였다. pML48 인서트 상의 각각의 프로브의 위치는 도 3의 상부 패널에 나타내었다.

노턴 블롯 혼성화용 프로브

프로브	제한효소 1	제한효소 부위의 뉴클레오티드 번호	제한효소 2	세한효소 부위의 뉴클레오티드 번호
a	EcoRI	6319 내지 6324	EcoRI	15799 내지 15804
b	BamHI	16793 내지 16798	PstI	18164 내지 18169
c	KpnI	26025 내지 26030	BamHI	27413 내지 27418
d	SalI	28691 내지 28696	SalI	29551 내지 29556
e	HindIII	33050 내지 33055	SacI	34039 내지 34044

* 각각의 뉴클레오티드 번호는 서열 목록의 서열 번호 1에 존재한다.

프로브의 표지, 혼성화 및 신호의 검출은 실시예 5에 기술되어 있는 서턴 블롯 혼성화에 따라 수행하였다.

실시예의 결과를 도 3의 하부 패널에 나타내었다.

각각의 신호는 각각의 프로브의 뉴클레오티드 서열에 상동성인 전사 생성물의 존재를 나타낸다.

상기 결과는, 본 실시예의 pML48의 삽입 서열에 존재하는 것으로 예측된 구조 유전자, 즉, mlcA mlcB, mlcC mlcD, mlcE 및 mlcR이 페니실륨 시트리눔 SANK13380에서 전사되었음을 나타낸다.

각각의 신호의 위치는 전사 생성물의 상대적인 크기를 나타내지는 않는다.

3) 5'RACE 에 따른 5'-말단 서열의 결정

cDNA 말단의 빠른 증폭을 위한 5'RACE System, 버전 2.0 (GIBCO corporation제)을 사용하여 각각의 구조 유전자의 5'-말단 영역을 포함하는 cDNA 를 수득했다.

2 종류의 안티센스 올리고뉴클레오티드 DNA 를 생성했다. 실시예 7 의 결과 및 본 실시예의 항목 2)에 의해 예측되는 것처럼, pML48 의 삽입 서열에 있는 각각의 구조 유전자의 5'-말단 주위 및 코딩 영역에 존재할 것으로 추정되는 뉴클레오티드 서열을 기준으로 고안했다.

각각의 구조 유전자의 3'-말단 쪽의 뉴클레오티드 서열을 기준으로 고안된 안티센스 올리고뉴클레오티드 DNA (1)의 뉴클레오티드 서열을 표 2 에 나타낸다. 각각의 구조 유전자의 5'-말단 쪽의 뉴클레오티드 서열을 기준으로 고안된 안티센스 올리고뉴클레오티드 DNA (2)의 뉴클레오티드 서열을 표 3 에 나타낸다.

올리고뉴클레오티드 DNA (1)을 프라이머로,페니실륨 시트리눔SANK13380 의 전체 RNA 를 주형으로 사용하여 역전사효소 반응에 따라 cDNA 의 제 1 가닥을 합성했다. 즉, 전체 RNA 1 ㎍, 올리고뉴클레오티드 DNA (1) 2.5 pmol 및 SUPER SCRIPTTM II 역전사효소(키트에 포함되어 있음) 1 ㎕를 포함하는 반응 혼합물 24 ㎕ 를 16℃ 에서 1 시간 동안 인큐베이션하고, 반응 생성물을 키트에 포함된 GLASSMAX 스핀 카트리지에 첨가하여 cDNA의 제 1 가닥을 정제했다.

키트에 포함된 말단 데옥시리보뉴클레오티딜 트랜스퍼라제를 사용하여 cDNA 제 1 가닥의 3'-말단에 폴리 C 사슬을 첨가했다.

3'-말단 폴리 C 사슬을 첨가한 cDNA의 제 1 가닥을 포함하는 반응 혼합물 50 ㎕ 를 올리고뉴클레오티드 DNA (2) 40 pmol 및 Abriged Anchor Primer(키트에 포함되어 있음) 40 pmol 과 혼합하고 94℃에서 2 분 동안 인큐베이션했다. 이어서, 94℃에서 30 초, 55℃에서 30 초 및 72℃에서 2 분인 인큐베이션 주기를 35회 반복하고, 72℃ 에서 5 분 및 4℃ 에서 18 시간 동안 인큐베이션했다. 생성물을 아가로스 겔 전기영동하고 DNA를 겔로부터 회수했다. 생성물을 페놀-클로로포름 추출 및 에탄올 침전으로 정제하고, pCR 2.1 을 사용하여 실시예 4에 기술된 방법과 유사한 방식으로 클로닝했다.

상기 조작은 5'-RACE이다.

5'-말단을 포함하는 cDNA 프래그먼트의 뉴클레오티드 서열을 결정하고, 전사 개시점 및 번역 개시 코돈의 위치를 예측했다.

표 4 는 5'RACE에 의해 수득된 각각의 구조 유전자에 상응하는 5'-말단 cDNA 프래그먼트의 뉴클레오티드 서열이 기술된 서열 번호를 나타낸다. 표 5 는 각각의 구조 유전자의 전사 개시점 및 번역 개시점이 존재하는 서열 번호, 및 전사 개시점 및 번역 개시점의 위치를 나타낸다.

* 서열 목록의 서열 번호 1 및 2에 나타낸 뉴클레오티드 서열은 서로 완전히 상보적이다.

4) 3'RACE에 상응하는 3'-말단 서열의 결정

Ready To Go:T-Primed First-Strand 키트(Pharmacia corporation제)을 사용하여 각각의 구조 유전자의 3'-말단 영역을 포함하는 cDNA 를 수득했다.

pML48의 삽입된 서열에 있는 각각의 구조 유전자의 3'-말단 주위 및 코딩 영역에 존재할 것으로 추정되는 한 종류의 센스 올리고뉴클레오티드 DNA (3)을 생성하고, 실시예 7 및 본 실시예의 항목 2)의 결과로부터 예측했다.

각각의 구조 유전자에 대해 생성된 올리고뉴클레오티드 DNA (3)의 뉴클레오티드 서열을 표 6 에 나타낸다.

NotI-d(T)18 프라이머(키트에 포함되어 있음), 및 주형으로페니실륨 시트리눔SANK13380의 전체 RNA (1 ㎍)를 사용하여 역전사효소 반응으로 cDNA 의 제 1 가닥을 합성했다.

cDNA 의 제 1 가닥, 올리고뉴클레오티드 DNA (3) 40 pmol 및 NotI-d(T)18 프라이머(키트에 포함되어 있음)을 포함하는 반응 혼합물 100 ㎕ 를 94℃에서 2 분 동안 유지시켰다. 94℃에서 30 초, 55℃에서 30 초 및 72℃에서 2 분인 인큐베이션 주기를 35회 반복하고, 72℃에서 5 분 및 4℃에서 18 시간 동안 인큐베이션했다. 생성물을 아가로세 겔 전기영동하고, DNA 를 겔로부터 회수했다. 생성물을 페놀-클로로포름 추출 및 에탄올 침전으로 정제하고, pCR 2.1을 사용하여 실시예 4 에 기술된 방법과 유사한 방식으로 클로닝했다.

상기 조작이 3'-RACE 이다.

3'-말단의 cDNA의 뉴클레오티드 서열을 결정하고, 번역 종결 코돈의 위치를 예측했다.

표 7은 3'RACE 에 의해 수득된 각각의 구조 유전자에 상응하는 3'-말단 cDNA 프래그먼트의 뉴클레오티드 서열이 기술된 서열 목록의 서열 번호를 나타낸다. 표 8은 번역 종결 코돈 및 서열 목록의 서열 번호 1 및 2 를 기준으로한 코돈의 위치를 나타낸다.

* 서열 목록의 서열 번호 1 및 2에 나타낸 뉴클레오티드 서열은 서로 완전히 상보적이다.

표 9 는 각각의 구조 유전자에 의해 코딩되는 것으로 예측되는 폴리펩티드의 C-말단 아미노산 잔기, 아미노산 잔기를 코딩하는 트리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열 및 트리뉴클레오티드의 위치를 나타낸다.

* 서열 목록의 서열 번호 1 및 2 에 나타낸 뉴클레오티드 서열은 서로 완전히 상보적이다.

표 10 은 표 8 에 나타낸 번역 종결 코돈에 상보적인 서열, 상보적인 서열이 존재하는 서열 번호 및 상보적인 서열의 위치를 요약한다.

* 서열 목록의 서열 번호 1 및 2에 나타낸 뉴클레오티드 서열은 서로 완전히 상보적이다.

상기에서처럼, 각각의 구조 유전자의 위치, 그의 방향 및 그의 위치를 확정했다. 상기 정보를 기준으로, 각각의 구조 유전자의 전사 생성물 및 번역 생성물을 수득할 수 있다.

실시예 9: 구조 유전자 mlcE 에 상응하는 cDNA 의 수득

1) 전체 RNA 의 제조

페니실륨 시트리눔의 전체 RNA 를 실시예 8 의 방법에 따라 제조했다.

2) 프라이머의 고안

실시예 8 에서 결정된 구조 유전자 mlcE 에 상응하는 완전한 길이의 cDNA 를 수득하기 위해 하기 프라이머를 고안하고 합성했다:

센스 프라이머 5'-gttaacatgtcagaacctctaccccc-3' (서열 목록의 서열 번호 35를 보라); 및

안티센스 프라이머 5'-aatatttcaagcatcagtctcaggcac-3' (서열 목록의 서열 번호 36을 보라).

프라이머는 구조 유전자mlcE의 5'-말단 상류 영역의 서열, 및 3'-말단 하류 영역의 서열로부터 각각 유도된다. 포스포아미디트 방법에 따라 합성을 수행했다.

3) RT-PCR

mlcE의 유전자 생성물을 코딩하는 완전한 길이의 cDNA를 수득하기 위해 Takara RNA LA PCR 키트(AMV) 버전 1.1을 사용했다.

구체적으로, 전체 RNA 1 ㎍, 랜덤 9머 프라이머 2.5 pmol(키트에 포함되어 있음), 및 역전사효소 1 ㎕(키트에 포함되어 있음)을 포함하는 반응 혼합물 20 ㎕ 를 42℃에서 30 분 동안 인큐베이션하여 cDNA의 제 1 가닥을 생성했다. 이이서 역전사 효소를 99℃에서 5분 동안 가열하여 비활성화시켰다.

상기 cDNA의 제 1 가닥의 반응 혼합물의 총량, 센스 프라이머 40 pmol 및 안티센스 프라이머 40 pmol을 포함하는 제 2 반응 혼합물 100 ㎕를 94℃에서 2분 동안 인큐베이션했다. 94℃에서 30 초, 60℃에서 30 초 및 72℃에서 2 분인 인큐베이션 주기를 30회 반복하고, 72℃에서 5 분 및 4℃에서 18 시간 동안 인큐베이션하였다. 생성물을 아가로스 겔 전기영동하고 DNA를 겔로부터 회수했다. 생성물을 페놀-클로로포름 추출 및 에탄올 침전으로 정제하고, pCR 2.1을 사용하여 실시예 4에 기술된 방법과 유사한 방식으로에스케리키아 콜라이콤피턴트 세포 JM109 균주(일본의 Takara Shuzo Co., Ltd.제)을 형질전환하는 데 사용했다. DNA 프래그먼트를 갖는 플라스미드를 보유하는 균주는 형질전환된에스케리키아 콜라이로부터 선택되고, 균주에 보유된 플라스미드를 pCRexpE 로 명명했다.

생성된 재조합 DNA 벡터 pCRexpE의 삽입 DNA의 뉴클레오티드 서열을 결정했다. 삽입 DNA는 구조 유전자 mlcE에 상응하는 완전한 길이의 cDNA 를 포함했다. 그의 뉴클레오티드 서열 및 뉴클레오티드 서열로부터 추정된 펩티드의 아미노산 서열을 서열 목록의 서열 번호 37 및/또는 서열 번호 38 에 나타낸다.

mlcE (폴리펩티드)에 대해 가장 최근에 공지된 서열은 로바스타틴의 생합성에 관련된 유전자 클러스터 상의 ORF10 였고 동일도는 70%였다.

실시예 10: 발현 벡터 pSAK700 의 구성

cDNA 발현 벡터 pSAK700은 실시예 1에 기술한 pSAK333 및 pSAK360 을 사용하여 작제했다.

pSAK333을 제한 효소 BamHI 및 HindIII (일본의 Takara Shuzo Co., Ltd.제) 모두로 소화시키고, 이어서 아가로스 겔 전기영동을 하였다. 4.1 kb 프래그먼트를 겔로부터 회수하고, DNA 프래그먼트의 말단을 T4-DNA 폴리머라제(일본의 Takara Shuzo Co., Ltd.제)로 블런트말단화하였다.

EcoRI-NotI-BamHI 아답터(일본의 Takara Shuzo Co., Ltd.제)을 DNA 라이게이션 키트 버전 2(일본의 Takara Shuzo Co., Ltd.제)를 사용하여 상기에 언급된 DNA 프래그먼트에 연결하였다.에스케리키아 콜라이콤피턴트 세포 JM109 균주 (일본의 Takara Shuzo Co., Ltd.제)를 라이게이션된 DNA 로 형질전환했다. 아답터를 갖는 플라스미드를 보유하는 균주를 형질전환된에스케리키아 콜라이로부터 선택하고, 균주에 보유된 플라스미드를 pSAK410 으로 명명했다.

pSAK360 을 제한 효소 Pvu II 및 Ssp I 모두로 소화시키고 전기영동하였다. 3-포스포글리세레이트 키나제(이하 "pgk"로 지칭함) 유전자의 프로모터 및 터미네이터 및에스케리키아 콜라이로부터 나온 HPT 를 포함하는 DNA 프래그먼트(약 2.9 kb)을 겔로부터 회수했다.

상기에 언급한 회수된 DNA 프래그먼트를 DNA 라이게이션 키트 버전 2 (일본의 Takara Shuzo Co., Ltd.제)를 사용하여 pSAK410 의 Pvu II 부위에 연결했다.에스케리키아 콜라이콤피턴트 세포 JM109 균주를 라이게이션된 DNA 로 형질전환했다. DNA 프래그먼트를 갖는 플라스미드를 보유하는 균주를 형질전환된에스케리키아 콜라이로부터 선택하고, 균주에 보유된 플라스미드를 pSAK700 로 명명했다.

pSAK700의 작제는 도 4 에 나타낸다.

pSAK700은 효소 BamHI 및 NotI 각각에 대해 하나의 제한 효소 부위를 갖는다. pSAK700은 또한 암피실린 내성 유전자(이하 "Amp^r"로 지칭함) 및 하이그로마이신 내성 유전자 HTP 를 선발 마커로 갖는다. 하기 실시예에서,에스케리키아 콜라이를 숙주 세포로 사용할 경우, pSAK700 또는 외래 DNA 인서트를 포함하는 pSAK700 에 의해 형질전환된 세포의 선택을 관련 배지에 암피실린 40 ㎍/ml 을 첨가함으로써 수행했다.페니실륨 시트리눔SANK13380을 숙주로 사용할 경우, pSAK700 또는 외래 DNA 인서트를 포함하는 pSAK700에 의해 형질전환된 세포의 선택을 관련 배지에 하이그로마이신 200 ㎍/ml 을 첨가함으로써 수행했다.

실시예 11: cDNA 발현 벡터 pSAKexpE 의 작제

실시예 9에서 수득한 재조합 DNA 벡터 pCRexpE 를 제한 효소 HpaI 및 SspI (일본의 Takara Shuzo Co., Ltd.제)의 존재하에 37℃에서 2 시간 동안 반응시키고, 반응 생성물을 아가로스 겔 전기영동하였다. 1.7 kb 주위의 mlcE의 완전한 길이의 cDNA를 포함하는 밴드를 겔로부터 회수했다.

pSAK700 를 제한 효소 NotI(일본의 Takara Shuzo Co., Ltd.제)와 37℃ 에서 1 시간 동안 반응시킨 후, 벡터의 말단을 T4 DNA 폴리머라제(Takara Shuzo Co., Ltd., 일본)로 37℃ 에서 5 분 동안 블런트말단화하였다. 이어서, 벡터를 페놀 클로로포름으로 추출하고 에탄올로 침전시켰다. 침전된 DNA를 소량의 TE 에 용해시켰다. 알칼라인 포스파타제를 상기에 첨가하고 65℃에서 30 분 동안 인큐베이션했다. 상기에서처럼 제조된 pSAK700를 DNA 라이게이션 키트 버전 2 (일본의 Takara Shuzo Co., Ltd.제)를 사용하여 단계 1)에서 수득된 DNA 프래그먼트 1.7 kb에 라이게이션했다.에스케리키아 콜라이콤피턴트 세포 JM109 균주를 라이게이션된 DNA를 사용하여 형질전환했다. cDNA 발현 벡터에 의해 형질전환된에스케리키아 콜라이균주를 수득했다.

본 실시예에서 수득된,에스케리키아 콜라이pSAKexpE SANK 72499 로 명명된 형질전환된에스케리키아 콜라이는 미생물 수탁에 관한 부다페스트 조약에 따라 2000년 1월 25일자로 통상산업성 공업기술원 생명공학 공업기술연구원에 수탁 번호 FERM BP-7005로 수탁됐다.

실시예 12: 구조 유전자 mlcR 에 상응하는 cDNA 의 수득

1) 전체 RNA 의 제조

페니실리움 시트리눔의 전체 RNA 를 실시예 8의 방법에 따라 제조했다.

2) 프라이머의 고안

실시예 8에서 결정된 구조 유전자 mlcR에 상응하는 완전한 길이의 cDNA 를 수득하기 위해 하기 프라이머를 고안하고 합성했다:

센스 프라이머 5'-ggatccatgtccctgccgcatgcaacgattc-3' (서열 목록의 서열 번호 39를 보라)

안티센스 프라이머 5'-ggatccctaagcaatattgtgtttcttcgc-3' (서열 목록의 서열 번호 40을 보라).

프라이머를 구조 유전자mlcR 의 5'-말단 상류 영역의 서열, 및 3'-말단 하류 영역의 서열로부터 각각 고안했다. 포스포아미디트 방법에 따라 합성을 수행했다.

3) RT-PCR

mlcR의 유전자 생성물을 코딩하는 완전한 길이의 cDNA 를 수득하기 위해 Takara RNA LA PCR 키트(AMV) 버전 1.1 을 사용했다.

구체적으로, 전체 RNA 1 ㎍, 랜덤 9머 프라이머 2.5 pmol(키트에 포함되어 있음), 및 역전사효소 1 ㎕(키트에 포함되어 있음)을 포함하는 반응 혼합물 20 ㎕ 를 42℃에서 30 분 동안 인큐베이션하여 cDNA의 제 1 가닥을 생성했다. 이이서 역전사 효소를 99℃에서 5분 동안 가열하여 불활성화시켰다.

상기 cDNA의 제 1 가닥의 반응 혼합물의 총량, 센스 프라이머 40 pmol 및 안티센스 프라이머 40 pmol을 포함하는 제 2 반응 혼합물 100 ㎕를 94℃에서 2 분 동안 인큐베이션했다. 94℃에서 30 초, 60℃에서 30 초 및 72℃에서 2 분인 인큐베이션 주기를 30회 반복하고, 72℃에서 5 분 및 4℃에서 18 시간 동안 인큐베이션하였다. 생성물을 아가로스 겔 전기영동하고 DNA 를 겔로부터 회수했다. 생성물을 페놀-클로로포름 추출 및 에탄올 침전으로 정제하고, pCR 2.1을 사용하여 실시예 4 에 기술된 방법과 유사한 방식으로에스케리키아 콜라이콤피턴트 세포 JM109 균주 (일본의 Takara Shuzo Co., Ltd.제)를 형질전환하는 데 사용했다. DNA 프래그먼트를 갖는 플라스미드를 보유하는 균주는 형질전환된에스케리키아 콜라이로부터 선택되고, 균주에 보유된 플라스미드를 pCRexpR로 명명했다.

생성된 재조합 DNA 벡터 pCRexpR 의 삽입된 DNA 의 뉴클레오티드 서열을 결정했다. 삽입된 DNA는 구조 유전자 mlcR 에 상응하는 완전한 길이의 cDNA를 포함했다. 그의 뉴클레오티드 서열 및 뉴클레오티드 서열로부터 추정된 펩티드의 아미노산 서열을 서열 목록의 서열 번호 41 및/또는 서열 번호 42 에 나타낸다.

mlcR (폴리펩티드)에 대해 가장 최근에 공지된 서열은 로바스타틴의 생합성에 관련된 유전자 클러스터 상의lovE 였고 동일도는 34%이다.

실시예 13: cDNA 발현 벡터 pSAKexpR 의 구성

실시예 12에서 수득한 재조합 DNA 벡터 pCRexpR을 제한 효소 BamHI (일본의 Takara Shuzo Co., Ltd.제)의 존재하에 37℃ 에서 2 시간 동안 반응시키고, 반응 생성물을 아가로스 겔 전기영동하였다. 1.4 kb 주위의 mlcR 의 완전한 길이의cDNA 를 포함하는 밴드를 겔로부터 회수했다.

pSAK700 를 제한 효소 BamHI(일본의 Takara Shuzo Co., Ltd.제)와 37℃ 에서 1 시간 동안 반응시킨 후, 알칼라인 포스파타제(일본의 Takara Shuzo Co., Ltd.제)를 첨가하고 65℃에서 30 분 동안 인큐베이션했다. 상기에 기술된 것처럼 BamHI 로 소화된 pSAK700을 DNA 라이게이션 키트 버전 2 (일본의 Takara Shuzo Co., Ltd.제)를 사용하여 단계 1)에서 수득된 DNA 프래그먼트 1.4 kb 에 라이게이션했다.에스케리키아 콜라이콤피턴트 세포 JM109 균주를 라이게이션된 DNA로 형질전환했다. cDNA 발현 벡터에 의해 형질전환된에스케리키아 콜라이균주를 수득했다.

본 실시예에서 수득된,에스케리키아 콜라이pSAKexpR SANK 72599로 명명된 형질전환된에스케리키아 콜라이는 미생물 수탁에 관한 부다페스트 조약에 따라 2000년 1월 25일자로 통상산업성 공업기술원 생명공학 공업기술연구원에 수탁 번호 FERM BP-7006으로 수탁됐다.

실시예 14: ML-236B 생산 미생물의 형질전환

1) 원형질체의 제조

페니실륨 시트리눔SANK 13380 균주의 배양물의 슬랜트으로부터의 포자를 PGA 아가 배지에 접종하고, 이어서 26℃에서 14 일 동안 배양했다. 이어서,페니실륨 시트리눔SANK 13380 균주의 포자를 배양물로부터 회수하고, 포자 1 x 10⁸개를 YPL-20 배양 배지 80 ml 에 접종하고, 26℃에서 1 일 동안 인큐베이션했다. 현미경으로 관찰하여 포자의 발아를 확인한 후, 발아 포자를 실온, 5000 x G에서 10 분동안 원심분리하고, 침전물로 회수했다.

포자를 멸균수로 3회 세척하여 원형질체를 수득했다. 즉, 자이몰리아제 20T (Seikagaku Kogyo corporation제) 200 mg 및 키틴아제(Sigma 사에서 제조함) 100 mg 을 0.55 M 염화마그네슘 용액 10 ml 에 용해하고, 실온, 5000 x G에서 10 분 동안 원심분리했다. 생성된 상층액을 효소액으로 사용했다. 효소액 20 ml 및 발아 포자 0.5 g(습윤 중량)를 100 ml 코니칼 플라스크에 넣고 온화하게 진탕시키면서 30℃ 에서 60 분 동안 인큐베이션했다. 발아 포자가 원형질체가 되는 것을 현미경을 사용하여 확인한 후, 반응액을 3G-2 유리 여과기(HARIO corporation제)을 통해 여과했다. 여과액을 실온, 1000 x G에서 10 분 동안 원심분리하고, 이어서 침전물로 원형질체를 회수했다.

2) 형질전환

단계 1)에서 수득한 원형질체를 0.55 M 염화마그네슘 30 ml로 2회, 0.55 M 염화마그네슘, 50 mM 염화칼슘 및 10 mM 3-모르폴리노 프로판 술포네이트로 구성된 용액(pH 6.3 이하, 이후 MCM 용액으로 지칭함) 30 ml로 1회 세척했다. 이어서 원형질체를 4%(w/v) 폴리에틸렌 글리콜 8000, 10 mM 3-모르폴리노 프로판 술포네이트, 0.0025%(w/v) 헤파린(Sigma corporation제), 50 mM 염화마그네슘의 용액(pH 6.3 이하, 이후 "형질전환액"으로 지칭함) 100 ㎕ 에 현탁시켰다.

약 5 x 10⁷개의 원형질체를 함유하는 형질전환액 96 ㎕ 및 pSAKexpE 또는 pSAKexpR 120 ㎍을 포함하는 TE 10 ㎕를 혼합하고, 얼음 상에 30 분 동안 두었다.여기에 20%(w/v) 폴리에틸렌 글리콜, 염화마그네슘 50 mM, 3-모르폴리노 프로판 술폰산 10 mM의 용액 1.2 ml (pH 6.3)을 첨가했다. 이어서 액체를 온화하게 피펫팅하고 실온에서 20 분 동안 두었다. 여기에 MCM 용액 10 ml 를 첨가하고, 조심스럽게 혼합하고, 실온, 1000 x G에서 10 분 동안 원심분리했다. 형질전환된 원형질체를 침전물로부터 회수했다.

3) 형질전환된 원형질체의 세포벽의 재생성

단계 2)에서 수득한 형질전환된 원형질체를 액체 VGS 중간층 아가 배지 5 ml 에 현탁시키고, 고체화된 VGS 하층 아가 배지 플레이트 10 ml 상에 쌓았다. 플레이트를 26℃에서 1 일 동안 인큐베이션한 후, 플레이트 당 하이그로마이신 B 5 mg 을 포함하는 액체 VGS 상층 아가 배지(하이그로마이신의 최종 농도 200 ㎍/ml) 10 ml 을 상부에 쌓았다. 26℃에서 14 일 동안 인큐베이션한 후, 두개의 균주(즉, pSAKexpE, 또는 pSAKexpR 로 형질전환된 원형질체로부터 유래한 상기 균주)를 하이그로마이신 B 200 ㎍/ml 을 함유하는 PGA 아가 배지에 계대배양하고, PGA 아가 배지로 제조된 슬랜트상에서 계대배양하고, 26℃ 에서 14 일 동안 인큐베이션했다.

슬랜트를 4℃에서 보관했다.

시험예 1: 형질전환된 균주와 원래 균주의 ML-236B 생합성 능력의 비교

실시예 14 에서 수득한 형질전환된 균주 및페니실륨 시트리눔SANK 13380 을 배양하고 각각의 배양물의 ML-236B 량을 측정했다.

포자의 5 mm 정방형 접종물을 실시예 14에 기술된 것처럼 형질전환된 균주가 배양된 슬랜트으로부터 배양하고,페니실륨 시트리눔SANK 13380 과 관해서는 실시예 2에 기술된 슬랜트으로부터 배양했다. 세포를 100 ml 코니칼 플라스크 내의 MBG3-8 배지 10 ml에 접종하고, 이어서 24℃에서 2 일 동안 진탕시키면서 배양하고, 50%(w/v) 글리세린 용액 3.5 ml 를 첨가했다. 이어서 24℃에서 10 일 동안 진탕시키면서 배양을 지속시켰다.

0.2 N 수산화나트륨 50 ml을 배양물 10 ml에 첨가하고, 26℃에서 1 시간 동안 진탕시키면서 인큐베이션했다. 배양물을 실온, 3000 x G에서 2 분 동안 원심분리했다. 상청액 1 ml을 회수하고, 75% 메탄올 9 ml와 혼합하고 HPLC에 가했다.

SSC-ODS-262(직경 6 mm, 길이 100 mm, Senshu Kagaku Co.Ltd. 제)을 HPLC 칼럼으로 사용하고, 75%(v/v) 메탄올-0.1%(v/v) 트리에틸아민-0.1%(v/v)아세트산을 이동상으로 사용했다. 실온에서 유속 2 ml/분으로 용출을 수행했다. 상기 조건하에, 칼럼에 첨가한 후 4 분에 ML-236B가 용출됐다. UV 검출기로 236 nm 의 흡수 파장에서 검출을 수행했다.

ML-236B 생합성 능력은 8 개의 pSAKexpE 형질전환 균주 중 3 개의 균주에서 증가했다. 상기 균주의 ML-236B 생합성 능력은 원래 균주와 비교했을 때 평균적으로 10% 높았다. 상기 3 개의 균주의 ML-236B 생합성 능력은 또한 단포자처리 등과 같은 계대배양 후 안정적으로 유지되었다. 상기 결과는 pSAKexpE 의 인서트가 ML-236B 생합성 촉진 cDNA인 것을 나타낸다.

ML-236B 생합성 능력은 pSAKexpR 형질전환 균주 중 5 개 균주에서 증가했다. 상기 균주의 ML-236B 생합성 능력은 원래 균주에 비해 평균 15% 높았다. 상기 5 개의 균주의 ML-236B 생합성 능력은 또한 단포자 처리 등과 같은 계대배양 후 안정적으로 유지됐다. 상기 결과는 pSAKexpR의 인서트가 ML-236B 생합성 촉진 cDNA인 것을 나타낸다.

따라서, 본 발명에 따른 ML-236B 생산 미생물로부터 수득된 ML-236B 생합성 촉진 cDNA 는 ML-236B 생산 미생물에 도입되었을 때 ML-236B 생산 미생물에서 ML-236B 생합성을 촉진한다.

실시예 15: 구조 유전자 mlc A 내지 D에 상응하는 cDNA의 서열의 결정

구조 유전자mlcA 에 상응하는 cDNA의 서열을 결정했다.

TAKARA LA PCR 키트 버전 1.1(Takara Shuzo Co., Ltd.제)로 제 1 가닥 cDNA 를 합성했다. 제 1 가닥 cDNA 를 주형으로 하고 몇몇 분리된 쌍의 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 사용하여 cDNA의 전체 또는 부분 영역의 증폭을 위해 수차례의 PCR을 수행했다.

94℃에서 30 초, 60℃에서 30 초 및 72℃에서 5 분인 주기를 Big Dye Primer/Terminator Cycle Sequencing Kit 및 The ABI Prism 377 서열(PE Applied Biosystems)를 사용하여 30회 반복했다.

각각의 반응의 생성물을 플라스미드 pCR 2.1 에 개별적으로 삽입했다.

각각의 재조합 플라스미드의에스케리키아 콜라이형질전환체를 수득했다.

상기 형질전환체로부터 수득된 재조합 플라스미드의 각각의 인서트의 뉴클레오티드 서열을 결정했다.

엑손 및 인트론의 서열을 상기 언급된 몇몇 RT-PCR 생성물의 뉴클레오티드 서열과 구조 유전자mlcA 의 뉴클레오티드 서열을 비교한 것을 기준으로 결정했다.

그래서, 구조 유전자mlcA 에 상응하는 cDNA의 서열을 결정했다(서열 번호 43). 상기 cDNA 에 의해 코딩되는 폴리펩티드의 상응하는 아미노산 서열을 예측하고(서열 번호 44) 폴리펩티드의 기능을 아미노산 서열을 사용한 상동성 조사를 기준으로 추측했다.

mlcA (폴리펩티드)에 대해 가장 최근에 공지된 서열은 로바스타틴의 생합성에 관련된 유전자 클러스터 상의 LNKS(lovB)였고, 동일도는 60%이다.

유사한 방식으로, 구조 유전자mlcB 에 상응하는 cDNA의 서열을 결정했다(서열 번호 45). 상기 cDNA에 의해 코딩되는 폴리펩티드의 상응하는 아미노산 서열을 예측하고(서열 번호 46) 폴리펩티드의 기능을 아미노산 서열을 사용한 상동성 조사를 기준으로 추측했다.

mlcB (폴리펩티드)에 대해 가장 최근에 공지된 서열은 로바스타틴의 생합성에 관련된 유전자 클러스터 상의 LDKS(lovF)였고, 동일도는 61%이다.

유사하게, 구조 유전자mlcC 에 상응하는 cDNA 의 서열을 측정했다(서열 번호 47). 상기 cDNA에 의해 코딩되는 폴리펩티드의 상응하는 아미노산 서열을 예측하고(서열 번호 48) 폴리펩티드의 기능을 아미노산 서열을 사용한 상동성 조사를 기준으로 추측했다.

mlcC (폴리펩티드)에 대해 가장 최근에 공지된 서열은 로바스타틴의 생합성에 관련된 유전자 클러스터 상의lovA 였고, 동일도는72%이다.

또한, 구조 유전자mlcD 에 상응하는 cDNA의 서열을 결정했다(서열 번호 49). 상기 cDNA 에 의해 코딩되는 폴리펩티드의 상응하는 아미노산 서열을 예측하고(서열 번호 50) 폴리펩티드의 기능을 아미노산 서열을 사용한 상동성 조사를 기준으로 추측했다.

mlcD (폴리펩티드)에 대해 가장 최근에 공지된 서열은 로바스타틴의 생합성에 관련된 유전자 클러스터 상의 ORF8 였고, 동일도는 63%이다.

서열 번호 1 또는 서열 번호 2 상의 각각의 구조 유전자의 엑손의 위치가 결정되었고, 하기와 같다:

서열 번호 1 또는 서열 번호 2 상의 각각의 구조 유전자의 전사 종결 부위의 위치가 결정되었고 하기와 같다:

실시예 16: 유전자 붕괴 연구

피. 시트리눔(P. citrinum)의 구조 유전자mlcA, B 또는 D 를 상동성 재조합을 사용하여 부위 지정(directed) 돌연변이원을 통해 붕괴시켰다.

피. 시트리눔의 구조 유전자mlcA-붕괴 돌연변이체를 수득하기 위한 재조합 플라스미드를 플라스미드 pSAK333을 사용하여 작제했다.

pML48 인서트 상의mlcA 유전자좌의 4.1-kb 내부KpnI 프래그먼트를 회수, 정제하고 DNA Blunting Kit (Takara Shuzo Co., Ltd.)로 말단화한 블런트를PuuII로 소화된 pSAK333에 라이게이션했다. 생성된 플라스미드를 pdismlcA로 명명했다.

피. 시트리눔SANK13380을 pdismlcA로 형질전환했다.

pdismlcA 형질전환체의 게놈 DNA 의 서턴 혼성화를 수행하여 구조 유전자mlcA의 붕괴를 확인했다.

생성된mlcA-붕괴 돌연변이체는 ML-236B 또는 그의 전구체를 전혀 생성하지 않는다.

피. 시트리눔의 구조 유전자mlcB-붕괴 돌연변이체를 수득하기 위한 재조합 플라스미드를 플라스미드 pSAK333을 사용하여 작제했다.

pML48 인서트 상의mlcB 유전자좌의 1.4-kbPsI-BamHI 프래그먼트를 회수, 정제하고 DNA Blunting Kit (Takara Shuzo Co., Ltd.)로 블런트 말단화하고PuuII로 소화된 pSAK333에 라이게이션했다. 생성된 플라스미드를 pdismlcB로 명명했다.

피. 시트리눔SANK13380을 pdismlcB로 형질전환했다.

pdismlcB 형질전환체의 게놈 DNA의 서턴 혼성화를 수행하여 구조 유전자mlcB 의 붕괴를 확인했다.

생성된mlcB-붕괴 돌연변이체는 ML-236B를 생성하지 않고 ML-236B 의 전구체, ML-236A를 생성했다.

피. 시트리눔의 구조 유전자mlcD-붕괴 돌연변이체를 수득하기 위한 재조합 플라스미드를 플라스미드 pSAK333을 사용하여 작제했다.

pML48 인서트 상의mlcD 유전자좌의 1.4-kbKpnI-BamHI 프래그먼트를 회수, 정제하고 DNA Blunting Kit (Takara Shuzo Co., Ltd.)로 블런트 말단화하고PuuII로 소화된 pSAK333에 라이게이션했다. 생성된 플라스미드를 pdismlcD로 명명했다.

피. 시트리눔SANK13380 을 pdismlcD 로 형질전환했다.

pdismlcD 형질전환체의 게놈 DNA 의 서턴 혼성화를 수행하여 구조 유전자mlcD 의 붕괴를 확인했다.

생성된mlcD-붕괴 돌연변이체에 의해 생성된 ML-236B의 양은 형질전환되지 않은 대조 숙주의 양의 약 30% 였다.

실시예 17: pSAKexpR 형질전환체의 mlcR 의 기능 분석

실시예 12 에서 수득했고 각각 TR1 또는 TR2로 명명한 pSAKexpR 형질전환체 2 개, 및 형질전환되지 않은 숙주 세포,페니실륨 시트리눔SANK13380을 MBG3-8 배지에 접종하고 실시예 8 에 기술된 것처럼 개별적으로 인큐베이션했다.

전체 RNA 를 실시예 8 에 기술된 배양물 각각으로부터 추출했다.

상기 전체 RNA 를 주형으로 하고 구조 유전자 mlcA, B, C, D, E 또는 R 의 뉴클레오티드 서열을 기준으로 고안된 올리고뉴클레오티드 쌍을 프라이머로 사용하여 RT-PCR 을 수행했다.

형질전환되지 않은페니실륨 시트리눔13380, 및 TR1, TR2로 명명한 2 개의 형질전환체에 대한 RT-PCR 분석의 결과를 도 5에 나타낸다.

구조 유전자 mlcA, B, C, D 및 R이 pSAKexpR 형질전환체에서 배양의 첫째,둘째 및 셋째 날에 발현했다.

대조적으로, 상기 구조 유전자 모두가 형질전환되지 않은 숙주 세포에서 배양의 셋째 날에만 발현했다.

pSAKexpR 형질전환체와 형질전환되지 않은 숙주 세포 사이의 구조 유전자 mlcE 의 발현에서의 차이는 없었다.

상기 결과는 구조 유전자 mlcR에 상응하는 cDNA 에 의해 코딩되는 단백질이 ML-236B 생합성에 관련된 유전자 클러스터에 위치한 일부의 다른 구조 유전자(예를 들어 mlcA, B, C, D)의 전사를 유도한다는 것을 암시한다.

실시예 18: pSAKexpE 형질전환체의 mlcE 의 기능 분석

실시예 12 에서 수득되고 TE1으로 명명된 pSAKexpE 형질전환체, 및 형질전환되지 않은 그의 숙주 세포,페니실륨 시트리눔SANK13380을 MBG3-8 배지에 접종하고 실시예 8 에 기술된 것처럼 개별적으로 인큐베이션했다.

전체 RNA를 실시예 8 에 기술된 배양물 각각으로부터 추출했다.

상기 전체 RNA를 주형으로 하고 구조 유전자 mlcA, B, C, D, E 또는 R 의 뉴클레오티드 서열을 기준으로 고안된 올리고뉴클레오티드 쌍을 프라이머로 사용하여 RT-PCR을 수행했다. 본 실시예에 사용된 프라이머는 이전 실시예의 표의 것과 동일했다.

형질전환되지 않은페니실륨 시트리눔13380, 및 TE1으로 명명한 형질전환체에 대한 RT-PCR 분석의 결과를 도 6에 나타낸다.

구조 유전자 mlcE가 pSAKexpE 형질전환체에서 배양의 첫째, 둘째 및 셋째 날에 발현했다.

대조적으로, 구조 유전자 mlcE가 형질전환되지 않은 숙주 세포에서 배양의 셋째 날에만 발현했다.

반대로, pSAKexpE 형질전환체와 형질전환되지 않은 숙주 세포 사이의 구조 유전자 mlcA, B, C, D 및 R의 발현에서의 차이는 없었다(데이타는 나타내지 않음).

상기 결과는 구조 유전자 mlcE에 상응하는 cDNA에 의해 코딩되는 단백질이 mlcA, B, C, D 및 R의 ML-236B 생합성을 독립적으로 촉진한다는 것을 암시한다.

ML-236B는 HMG-CoA 리덕타제의 억제제이고 상기의 다른 억제제, 프라바스타틴을 제조하는데 유용하다. ML-236B 생산 미생물을 사용한 ML-236B의 제조는 상기 미생물에 존재하는 폴리케티드 신타제 클러스터에 관련된 유전자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 사용하여 증강된다.

Claims (41)

1. 하기:

   (a) 서열 번호 38의 아미노산 서열을 가지는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 또는 하나 이상의 결실, 부가, 치환 또는 변경을 가지는 변형 아미노산 서열을 코딩하며, ML-236B의 생합성을 촉진하는 데에 사용하기에 적합한 그의 폴리뉴클레오티드 변이체; 및

   (b) 서열 번호 42의 아미노산 서열을 가지는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 또는 하나 이상의 결실, 부가, 치환 또는 변경을 가지는 변형 아미노산을 코딩하며, ML-236B의 생합성을 촉진하는 데에 사용하기에 적합한 그의 폴리뉴클레오티드 변이체

   로 구성된 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드.
2. 제1항에 있어서, 서열 번호 37의 폴리뉴클레오티드, 또는 ML-236B의 생합성을 촉진하는 데에 사용하기에 적합한 그의 돌연변이체 또는 변이체를 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 서열 번호 37의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 형질전환 에스케리키아 콜라이 (Escherichia coli) pSAKexpE SANK 72499 (미생물 수탁번호 FERM BP-7005)로부터 얻어질 수 있는 DNA를 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
5. 제1항에 있어서, 서열 번호 41의 폴리뉴클레오티드, 또는 ML-236B의 생합성을 촉진하는 데에 사용하기에 적합한 그의 변이체를 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
6. 제1항 또는 제5항에 있어서, 서열 번호 41의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
7. 제1항, 제5항 또는 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 형질전환 에스케리키아 콜라이 pSAKexpR SANK 72599 (미생물 수탁번호 FERM BP-7006)로부터 얻어질 수 있는 DNA를 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 폴리뉴클레오티드와의 작동성 조합물 형태이며, 상기 조합물은 ML-236B 생산 미생물에 있어서 ML-236B의 생성을 증강시키는 데에 사용하기에 적합한 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
9. 제8항에 있어서, 서열 번호 37, 41, 43, 45, 47 또는 49의 서열로부터 선택된 하나 이상의 서열, 또는 유사한 기능을 가지는 그의 변이체와 조합된 형태의 서열 번호 37의 폴리뉴클레오티드, 또는 유사한 기능을 가지는 그의 변이체를 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
10. 제8항에 있어서, 서열 번호 37, 41, 43, 45, 47 또는 49의 서열로부터 선택된 하나 이상의 서열, 또는 유사한 기능을 가지는 그의 변이체와 조합된 형태의 서열 번호 41의 폴리뉴클레오티드, 또는 유사한 기능을 가지는 그의 변이체를 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
11. 엄격한 (stringent) 조건 하에서 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오티드와 혼성화할 수 있는 폴리뉴클레오티드.
12. 제11항에 있어서, ML-236B 생산 미생물에 도입할 경우 ML-236B 생산 미생물에서 ML-236B의 생합성을 촉진하는 데 적합한 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
13. 제11항 또는 제12항에 있어서, RNA인 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
15. 제14항에 있어서, 에스케리키아 콜라이 pSAKexpE SANK 72499 (미생물 수탁번호 FERM BP-7005) 또는 에스케리키아 콜라이 pSAKexpR SANK 72599 (미생물 수탁번호 FERM BP-7006)으로부터 얻어질 수 있는 것을 특징으로 하는 벡터.
16. 제14항 또는 제15항에 있어서, 발현 벡터인 것을 특징으로 하는 벡터.
17. 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 벡터로 형질전환된 숙주 세포.
18. 제17항에 있어서, ML-236B 생산 미생물인 것을 특징으로 하는 숙주 세포.
19. 제18항에 있어서, 페니실륨 시트리눔 (Penicillium citrinum)인 것을 특징으로 하는 숙주 세포.
20. 제17항에 있어서, 에스케리키아 콜라이인 것을 특징으로 하는 숙주 세포.
21. 제20항에 있어서, 에스케리키아 콜라이 pSAKexpE SANK 72499 (미생물 수탁번호 FERM PB-7005)인 것을 특징으로 하는 숙주 세포.
22. 제20항에 있어서, 에스케리키아 콜라이 pSAKexpR SANK 72599 (미생물 수탁번호 FERM BP-7006)인 것을 특징으로 하는 숙주 세포.
23. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
24. 서열 번호 38의 서열, 또는 서열 번호 38의 서열과 80% 이상의 동일성을 가지며 ML-236B 생산 유기체에서 ML-236B 생성을 촉진할 수 있는 그의 변이체를 포함하는 폴리펩티드.
25. 제24항에 있어서, 서열 번호 38의 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
26. 서열 번호 42의 서열, 또는 서열 번호 42의 서열과 80% 이상의 동일성을 가지며 ML-236B 생산 유기체에서 ML-236B 생성을 촉진할 수 있는 그의 변이체를 포함하는 폴리펩티드.
27. 제26항에 있어서, 서열 번호 42의 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
28. 제17항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 숙주 세포를 배양하고, 이어서 배양물로부터 ML-236B를 회수하는 것을 포함함을 특징으로 하는 ML-236B의 제조 방법.
29. 제28항에 있어서, 숙주 세포를 서열 번호 37 또는 서열 번호 41의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터로 형질전환시키는 것을 특징으로 하는 방법.
30. 제29항에 있어서, 벡터가 추가의 유전자를 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
31. 제28항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, ML-236B의 생성이 서열 번호 44, 46, 48 또는 50에 상응하는 재조합 mlcA, B, C 또는 D의 부재 하에서 일어나는 것을 특징으로 하는 방법.
32. 제28항 내지 제31항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조되는 것을 특징으로 하는 ML-236B.
33. 제28항 내지 제31항 중 어느 한 항에 따른 방법을 실시하고, ML-236B를 프라바스타틴으로 전환시키는 것을 포함함을 특징으로 하는 프라바스타틴의 제조 방법.
34. 서열 번호 38 또는 서열 번호 42의 단백질과 반응성인 항체.
35. 서열 번호 44, 46, 48 또는 50의 서열로부터 선택된 아미노산 서열을 가지는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 또는 결실, 치환, 부가 또는 변경을 가지는 상기 아미노산 서열의 변형체를 코딩하며 ML-236B의 생합성을 촉진하는 데 사용하기에 적합한 폴리뉴클레오티드 변이체.
36. 제35항에 있어서, 서열 번호 43, 45, 47 또는 49의 폴리뉴클레오티드로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
37. 제35항 또는 제36항에 있어서, 단독으로, 또는 서열 번호 37 또는 서열 번호 41의 폴리뉴클레오티드와 함께 ML-236B의 생합성을 촉진할 수 있는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
38. 제35항 내지 제37항 중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 벡터.
39. 제38항에 따른 벡터를 포함하는 것을 특징으로 하는 숙주 세포.
40. 제35항 내지 제37항 중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
41. 제39항에 따른 숙주 세포를 배양하고, 이어서 배양물로부터 ML-236B를 회수하는 것을 포함함을 특징으로 하는 ML-236B의 제조 방법.