PT1149919E

PT1149919E - Genes relacionados com a biossíntese de ml-236b

Info

Publication number: PT1149919E
Application number: PT01303527T
Authority: PT
Inventors: Hiroji Yoshikawa; Yuki Abe; Chiho Ono
Original assignee: Daiichi Sankyo Co Ltd
Priority date: 2000-04-18
Filing date: 2001-04-18
Publication date: 2007-12-17
Also published as: MXPA01003913A; CZ20011367A3; DE60130394D1; CN1325959A; RU2236463C2; EP1149919B1; US20030078395A1; EP1149919A2; ES2293966T3; CN1325959B; HK1037683A1; TWI312807B; HUP0101569A2; KR100632174B1; KR20010098713A; NZ511166A; HU0101569D0; HUP0101569A3; AU3709201A; US20070111293A1

Description

ΡΕ1149919 1 DESCRIÇÃO " GENES RELACIONADOS COM A BIOSSÍNTESE DE ML-2"

Campo do invento 0 presente invento está relacionado com um grupo de genes e, mais particularmente, com genes de um agrupamento de genes.

Mais particularmente, o invento está relacionado com polinucleótidos, tais como DNA, que aceleram a biossintese de um inibidor da redutase de HMG-CoA, ML-236B, num microrganismo produtor de ML-236B, quando introduzido no microrganismo produtor de ML-236B. O invento ainda está relacionado com vectores nos quais os referidos polinucleótidos estão inseridos, células hospedeiras transformadas pelos referidos vectores, proteínas expressas pelos referidos vectores, um método para a produção de ML-236B usando os referidos polinucleótidos e/ou proteínas, em que o método se caracteriza pela recuperação de ML-236B a partir da cultura da referida célula hospedeira e o invento está ainda relacionado com outros aspectos associados.

Fundamento do invento A pravastatina é um inibidor da redutase de HMG-CoA. A pravastatina sódica tem sido usada no tratamento de 2 PE1149919 hiperlipémia ou hiperlipidémia e possui o efeito farmacológico útil de ser capaz de reduzir o colesterol do soro. A pravastatina pode ser obtida usando Streptomyces carbophillus através da conversão microbiana de ML-236B produzida por Penicillium citrinum [descrito em Endo, A., et al., J. Antibiot., 29 1346(1976); Matsuoka, T., et al.f Eur. J. Biochem, , 184, 707 (1989) e no Pedido de Patente Japonesa N° 57-2240].

Foi demonstrado que ML-236B, um precursor de pravastatina e lovastatina, um inibidor de HMG-CoA, partilha a mesma estrutura parcial. Eles são sintetizados biologicamente através de policetidos [descritos em Moore, R.N., et al., J. Am. Chem. Soc., 107, 3694 (1985); Shiao, 0M. e Don, H.S., Proc. Natl. Sei. Counc. Repub. China B, 223 (1987)] .

Os policetidos são compostos derivados de cadeias de carbono β-ceto que resultam de uma reacção de condensação continua de ácidos carboxilicos de baixo peso molecular, tais como ácido acético, ácido propriónico, ácido butírico ou similares. Várias estruturas podem ser derivadas dependendo da via de condensação ou redução de cada um dos grupos carbonilo β-ceto [descrito em Hopwood, D.A. e Sherman, D.H., Annu. Ver. Genet., 24, 37-66 (1990); Hutchinson, C.R. e Fujii, I., Annu. Ver. Microbiol., 49, 201-238 (1995) ] .

As sintetases de policetido (daqui em diante referidas como PKSs) que contribuem para a sintese de 3 PE1149919 policetidos são enzimas que se sabe estarem presentes em fungos filamentosos e bactérias. As enzimas dos fungos filamentosos têm sido estudadas usando técnicas de biologia molecular [como descrito em Feng, G.H. e Leonard, T.J., J. Bacteriol., 177, 6246 (1995); Takano, Y., et al., Mol. Gen. Genet. 249, 162 (1995)]. Em Aspergillus terreus, que é um microrganismo produtor de lovastatina, foi analisado um gene pks relacionado com a biossíntese de lovastatina [descrito no pedido de patente internacional publicada no Japão (KOHYO) N° 9-504436 e ver a correspondente WO 9512661 que reivindica DNA codificador de uma sintetase de triolpolicetido].

Os genes relacionados com a biossíntese de metabolitos secundários de fungos filamentosos muitas vezes encontram-se agrupados no genoma. Nas vias da biossíntese de policetidos, são conhecidos os grupos de genes que participam na referida via. Na biossíntese de Aflatoxina, que é um policetido produzido por Aspergillus flavus e Aspergillus parasiticus, é conhecido que os genes codificadores das enzimas que participam na referida biossíntese (tais como PKS) formam um agrupamento. Foi realizada a análise genómica e uma comparação dos genes que participam na biossíntese de Aflatoxina em cada um dos microrganismos [ver Yu, J., et al., Appl. Environ. Microbiol., 61, 2365 (1995)]. Foi descrito que os genes que participam na biossíntese de Esterigmatocistina produzida por Aspergillus nidulans formam um agrupamento com cerca de 60 Kb numa região contínua do seu genoma [descrito em Brown, D.W., et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 93, 1418 4 ΡΕ1149919 (1996) ] . A modulação da actividade de sintetase de policetido, através de proteínas acessórias, durante a síntese de lovastatina foi estudada [ver Kennedy, J., et al.r Science Vol. 284, 1368 (1999)].

No entanto, até à data, tem havido uma análise insuficiente da biologia molecular da biossíntese de ML-236B e dos factores que a regulam. 0 presente invento pretende abordar esta questão.

Sumário do invento

De acordo com o presente invento, é obtido um polinucleótido que é adequado para usar na aceleração da biossíntese de ML-236B, sendo um polinucleótido seleccionado do grupo constituído por: (a) um polinucleótido codificador de uma proteína tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:42; (b) um polinucleótido que compreende a sequência nucleotídica de SEQ ID NO:41, adequado para usar na aceleração da biossíntese de ML-236B; (c) um polinucleótido que consiste na sequência nucleotídica de SEQ ID NO:41; (d) um polinucleótido que híbrida com um 5 PE1149919 polinucleótido de acordo com (a) a (c) sob condições restringentes e que se caracteriza pela aceleração da biossintese de ML-236B, num microrganismo produtor de ML-236B, quando introduzido no referido microrganismo produtor de ML-236B; e (e) um mRNA que pode hibridar com um polinucleótido de (d) em condições restringentes. 0 polinucleótido é tipicamente um polinucleótido codificador de uma proteina incluindo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:42.

Tabela da lista de sequências

Uma lista de sequências faz parte desta descrição de patente. Para ajudar a compreensão é proporcionada a tabela das sequências listadas que se segue. SEQ ID NO: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Identidade Inserto de pML48 Complementar de SEQ ID NO: 1

Sequência iniciadora de PCR para o Exemplo 4 Sequência iniciadora de PCR para o Exemplo 4 Oligonucleótido de DNA (1) para 5'-RACE, Exemplo 8

Oligonucleótido de DNA (1) para 5'-RACE, Exemplo 8

Oligonucleótido de DNA (1) para 5'-RACE, Exemplo 8 ΡΕ1149919 6 para 5'-RACE, Exemplo para 5'-RACE, Exemplo para 5'-RACE, Exemplo para 5'-RACE, Exemplo para 5'-RACE, Exemplo para 5'-RACE, Exemplo cDNA, Exemplo 8 cDNA, Exemplo 8 cDNA, Exemplo 8 cDNA, Exemplo 8 cDNA, Exemplo 8 cDNA, Exemplo 8 para 3'-RACE, Exemplo para 3'-RACE, Exemplo para 3'-RACE, Exemplo para 3'-RACE, Exemplo para 3'-RACE, Exemplo para 3'-RACE, Exemplo cDNA, Exemplo 8 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39

Extremo 3 do fragmento de cDNA, Exemplo 8

Extremo 3' do fragmento de cDNA, Exemplo 8

Extremo 3'do fragmento de cDNA, Exemplo 8

Sequência iniciadora para RT-PCR, Exemplo 9

Sequência iniciadora para RT-PCR, Exemplo 9 mlcE; sequência nucleotidica do cDNA e sequência de aminoácidos deduzida

Polipeptideo mlcE deduzido

Sequência iniciadora de RT-PCR, Exemplo 12 7 ΡΕ1149919 40 Sequência iniciadora de RT-PCR, Exemplo 12 41 mlcR; sequência nucleotidica do cDNA e sequência de aminoácidos deduzida 42 Polipeptídeo mlcR deduzido 43 mica; sequência nucleotidica do cDNA e sequência de aminoácidos deduzida 44 Polipeptídeo mlcR deduzido 45 mlcB; sequência nucleotidica do cDNA e sequência de aminoácidos deduzida 46 Polipeptídeo mlcB deduzido 47 mlcC; sequência nucleotidica do cDNA e sequência de aminoácidos deduzida 48 Polipeptídeo mlcC deduzido 49 mlcO; sequência nucleotidica do cDNA e sequência de aminoácidos deduzida 50 Polipeptídeo mlcD deduzido 51 Sequência iniciadora para RT-PCR, Exemplo 17 52 Sequência iniciadora para RT-PCR, Exemplo 17 53 Sequência iniciadora para RT-PCR, Exemplo 17 54 Sequência iniciadora para RT-PCR, Exemplo 17 55 Sequência iniciadora para RT-PCR, Exemplo 17 56 Sequência iniciadora para RT-PCR, Exemplo 17 57 Sequência iniciadora para RT-PCR, Exemplo 17 58 Sequência iniciadora para RT-PCR, Exemplo 17 59 Sequência iniciadora para RT-PCR, Exemplo 17 60 Sequência iniciadora para RT-PCR, Exemplo 17 61 Sequência iniciadora para RT-PCR, Exemplo 17 62 Sequência iniciadora para RT-PCR, Exemplo 17

Os polinucleótidos codificadores das sequências ΡΕ1149919 de aminoácidos de SEQ ID NOS:: 38, 42, 44, 46, 48 ou 50 podem ser cDNA, DNA genómico ou mRNA. Os DNAs genómicos codificadores de cada uma destas seis sequências são referidos como genes estruturais mlcE, mlcR, mlcA, mlcB, mlcC e mlcO, respectivamente. Sem estarmos presos a estas designações, pensamos que os genes estruturais codificam proteínas com as seguintes funções: mlcA sintetase de policetido mlcB sintetase de policetido mlcC monoxigenase P450 mlcD redutase de HMG-CoA mlcE bomba de efluxo mlcR factor de transcrição

Descobrimos que a incorporação de mlcE, ou cDNA correspondendo a mlcE, pode acelerar a biossíntese de ML-236B e a incorporação de mlcR, ou de cDNA correspondendo a mlcR, pode acelerar a biossíntese de ML-236B. Ainda, mlcR estimula a transcrição de mlc A a D. mlc A, B, C e D estão envolvidos na produção de ML-236B, independentemente ou em combinação, como mostrado pelos estudos de destruição de genes.

As variantes de mlc A, B e/ou C obtidas por alteração natural ou artificial serão úteis para produzir derivados de ML-236B, incluindo estatinas tais como pravastatina ou lovastatina. Neste contexto, pode ser possível produzir pravastatina directamente, usando tais variantes, com apenas um passo de fermentação e sem a 9 ΡΕ1149919 necessidade da conversão microbiana de ML-236B em pravastatina realizada com Streptomyces carbophilus.

Um polinucleótido de DNA que inclui uma sequência compreendendo SEQ ID NO: 37, ou compreendendo um seu mutante ou variante, capaz de acelerar a biossintese de ML-236B é obtido a partir de Escherichia coli transformada pSAKexpE SANK 72499 (FERM BP-7005).

Um polinucleótido preferido inclui uma sequência compreendendo um polinucleótido seleccionado entre (a) a (e) acima, de preferência compreendendo SEQ ID NO: 41, capaz de acelerar a biossintese de ML-236B. Tal polinucleótido de DNA é obtido a partir de Escherichia coli pSAKexpR SANK 72599 (FERM BP-7006) transformada.

Os polinucleótidos deste invento como descrito em (a) a (e) acima podem ser empregues numa combinação operacional com um ou mais polinucleótidos, tais combinações sendo adequadas para usar no aumento da produção de ML-236B num microrganismo produtor de ML-236B.

Exemplos de tais combinações incluem um polinucleótido seleccionado entre (a) a (e) acima, de preferência o polinucleótido de SEQ ID NO: 41, em combinação com uma ou mais sequências seleccionadas de entre SEQ ID NO: 37, a própria 41, 43, 45, 47 ou 49.

Num aspecto, o polinucleótido é, de preferência, um polinucleótido codificador de uma proteína incluindo ou 10 ΡΕ1149919 consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 38, 42, 44, 46, 48 ou 50 e capaz de acelerar a biossíntese de ML-236B conjuntamente com um polinucleótido seleccionado entre (a) e (e) acima, de preferência SEQ ID NO: 41. O presente invento estende-se a polinucleótidos que sejam capazes de hibridar, em condições restringentes, com um polinucleótido deste invento. Tais polinucleótidos incluem polinucleótidos adequados para a acelerar a biossintesse de ML-3236B, num microrganismo produtor de ML-236B, quando introduzido no microrganismo produtor de ML-236B. O polinucleótido é tipicamente DNA, cDNA ou DNA genómico, ou RNA, e pode ser codificador ou complementar da sequência codificadora. O polinucleótido é, tipicamente, um polinucleótido purificado, como seja um polinucleótido sem a presença de outros componentes celulares.

As variantes polinucleotídicas codificam sequências de aminoácidos indicadas em SEQ ID NO: 38, 42, 44, 46, 48 ou 50, em que um ou mais nucleótidos foi alterado. As alterações podem ocorrer naturalmente e podem ser preparadas dentro da redundância ou degeneração dos tripletos do código genético. Tais polinucleótidos alterados por degeneração codificam assim a mesma sequência de aminoácidos. Dentro destas variantes polinucleotídicas, incluimos DNA genómico tendo exões e intrões, em vez de simplesmente a sequência de cDNA. 11 PE1149919

As variantes polinucleotídicas codificam as sequências de aminoácidos indicadas em SEQ ID NO: 38, 42, 44, 46, 48 ou 50 que codificam uma sequência de aminoácidos modificada tendo pelo menos uma deleção, adição, substituição ou alteração. As variantes polinucleotídicas das sequências indicadas codificam sequências de aminoácidos mais curtas, mais longas ou do mesmo tamanho das codificadas pelas sequências indicadas. De preferência, os polipeptideos variantes retêm capacidade para acelerar a síntese de ML-236B e, de preferência, possuem actividade substancialmente semelhante ou melhor que a sequência parental que deu origem à sequência variante.

As variantes polinucleotídicas retêm um determinado grau de identidade com a sequência parental. Adequadamente, o grau de identidade é pelo menos 60%, pelo menos 80%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% ou 100%. O grau de identidade de uma variante é, de preferência, avaliado por programas informáticos, tais como o programa BLAST que usa um algoritmo para efectuar as pesquisas de homologia.

Num aspecto, o polinucleótido preferido deste invento é DNA seleccionado do grupo consistindo em: (a) DNA que compreende uma ou mais sequências polinucleotídicas mostradas nos nucleótidos N°1 a 1380 de SEQ ID NO: 41 da Listagem de Sequências, e que é caracterizado pela aceleração da biossíntese de ML-236B num microrganismo produtor de ML-236B quando introduzido no referido microrganismo produtor de ML-236B; (b) DNA que híbrida com o DNA descrito em (a) em condições 12 ΡΕ1149919 restringentes e que se caracteriza pela aceleração da biossíntese de ML-236B num microrganismo produtor de ML-236B quando introduzido no referido microrganismo produtor de ML-236B.

Os polinucleótidos deste invento aceleram a biossíntese de ML-236B num microrganismo que produz ML-236B. Exemplos de microrganismos produtores de ML-236B incluem espécies de Penicíllíum, tais como Penícíllíum citrinum, Penicillium brevicompactum [descrito em Brown, A.G., et al., J. Chem. Soc. Perkin-1., 1165 (1976)], Penicillium cyclopium [descrito em Doss, S.L., et al., J. Natl. Prod., 49, 357 (1986)] ou similares. Outros exemplos incluem: Eupenicillium sp.M6603 [descrito em Endo, A., et al., J. Antibiot.-Tokyo, 39, 1609(1986)], Paecilomyces viridis FERM P-6236 [descrito na Publicação do Pedido de Patente Japonesa N° 58-98092], Paecilomyces sp. M2016 [descrito em Endo, A., et al., J. Antibiot. - Tokyo, 39, 1609 (1986)], Trichoderma longibrachiatum m6735 [descrito em Endo, A., et al., J. Antibiot. - Tokyo, 39, 1609 (1986)], Hypomyces chrysospermus IFO 7798 [descrito em Endo, A., et al., J. Antibiot. - Tokyo, 39, 1609 (1986)], Gliocladium sp. YJ9515 [descrito em WO 9806867],

Trichoderma viride IFO 5836 [descrito na Publicação de Patente Japonesa N°62-19159], Eupenicillium reticulisporum IFO 9022 [descrito na Publicação de Patente Japonesa N° 62-19159] ou qualquer outro organismo adequado.

Entre estes microrganismos produtores de ML-236B, é preferido Penicillium citrinum e Penicillium citrinum 13 PE1149919 estirpe SANK 13380 é a mais preferida. Penicillium citrinum estirpe SANK 13380 foi depositada no "Research Institute of Life Science and Technology of the Agency of Industrial Science and Technology", em 22 de Dezembro de 1992, com o depósito N° FERM BP-4129, de acordo com o Tratado de Budapeste sobre depósito de microrganismos. Exemplos de microrganismos produtores de ML-236B também incluem os isolados a partir de fontes naturais e os alterados naturalmente ou artificialmente. O invento ainda proporciona vectores compreendendo um polinucleótido deste invento, como seja o vector obtido a partir de Escherichia coli pSAKexpR SANK 72599 (FERM BP-7006). Como aqui descrito, um vector de acordo com o invento pode ainda compreender um polinucleótido tendo a sequência de nucleótidos de SEQ ID NO: 37; ou um vector de acordo com o invento pode ainda compreender um ou mais polipeptídeos seleccionados entre SEQ ID NO: 43, 45, 47 ou 49. O invento inclui vectores que não compreendem as sequências polinucleotidicas SEQ ID NO: 37, 43, 45, 47 ou 49; ou não compreendem as sequências polinucleotidicas SEQ ID NO: 43, 45, 47 ou 49. Tais vectores deste invento incluem vectores de expressão. São igualmente proporcionadas células hospedeiras transformadas por um vector deste invento, incluindo microrganismos produtores de ML-236B. Células hospedeiras deste invento incluem Penicillium citrinum e Escherichia coli, como seja Escherichia coli pSAKexpR SANK 72599 (FERM BP-7006). 14 PE1149919

Ainda, o invento estende-se a polipeptideos codificados por um polinucleótido deste invento. Exemplos de polipeptideos deste invento incluem a sequência de SEQ ID NO: 42, ou uma sua variante que tem pelo menos 80% de identidade com SEQ ID NO: 42 e que é capaz de acelerar a produção de ML236B num organismo produtor de ML236B. Outros polipeptideos são os codificados pelas outras sequências polinucleotídicas deste invento e variantes que mantêm algum grau de identidade.

Adequadamente o grau de identidade de variantes polipeptidicas com SEQ ID NO: 42 é pelo menos 80%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% ou 100%. O grau de identidade de uma variante é, de preferência, avaliado por programas informáticos, tais como o programa BLAST que usa um algoritmo para fazer as pesquisas de homologia.

Os polipeptideos deste invento incluem sequências mais curtas ou mais longas de SEQ ID NO: 42 ou suas variantes. Polipeptideos mais curtos compreendem sequências de aminoácidos parciais de SEQ ID NO: 42 ou suas variantes e, de preferência, retêm a capacidade para acelerar a biossintese de ML-236B. Polipeptideos mais longos compreendem a totalidade ou sequências de aminoácidos parciais de SEQ ID NO: 42 ou variantes das mesmas e, de preferência, mantêm a capacidade de acelerar a biossintese de ML-236B. Os polipeptideos mais longos incluem proteinas de fusão tais como proteína fundida com Fc.

Anticorpos contra polipeptideos deste invento, 15 ΡΕ1149919 tais como anticorpo policlonal e anticorpo monoclonal, são úteis na regulação da produção de ML-236B e na produção de derivados de ML-236B tais como estatinas, incluindo pravastatina e lovastatina. Ainda, o referido anticorpo pode ser, preferencialmente, usado na análise da biossintese de ML-236B e dos seus mecanismos reguladores. Tal análise é útil para a modulação da produção de ML-236B e para a produção de derivados de ML-236B.

As células hospedeiras deste invento que possuem um vector deste invento podem ser usadas num método para a produção de ML-236B, compreendendo a cultura de tal célula hospedeira e depois recuperação de ML-236B a partir da cultura. Num método, o vector compreende mlcR e não genes adicionais tais como mlcA (SEQ ID NO: 43), mlcB (SEQ ID NO:45), mlcC (SEQ ID NO: 47) ou mlcD (SEQ ID NO:49). Neste método de produção de ML-236B, a célula hospedeira pode ser transformada com um vector compreendendo a sequência nucleotidica de SEQ ID NO: 41 (mlcR) . Um vector compreendendo mlcR (SEQ ID NO:41) pode não compreender a sequência polinucleotidica de SEQ ID NO:37 e/ou o vector pode não compreender pelo menos um polinucleótido codificador da sequência de aminoácidos de SEQ ID NOS:: 44, 46, 48 e/ou 50. Os métodos de produção de ML-236B podem ocorrer na ausência de um ou mais cDNAs correspondendo a SEQ ID NOS:: 37, 43, 45, 47 e/ou 49. Assim, a produção por um método deste invento pode ocorrer na ausência de mlcA, mlcB, mlcC e/ou mlcD recombinantes (polipeptideos) correspondendo a SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48 OU SEQ ID NO: 50. 16 ΡΕ1149919 0 invento ainda está relacionado com um método para a produção de pravastatina, o qual compreende um método para a produção de ML-236B de acordo com o invento e conversão de ML-236B em pravastatina.

Descrição de realizações especificas 0 presente invento será daqui em diante descrito mais detalhadamente.

Os inventores do presente invento clonaram DNA genómico compreendendo genes que participam na biossíntese de ML-236B em Penicíllíum citrinum. 0 DNA genómico é daqui em diante referido como DNA genómico relacionado com a biossintese de ML-236B e foi clonado a partir de uma biblioteca de DNA genómico de um microrganismo produtor de ML-236B. O DNA genómico foi analisado para se encontrar genes estruturais no referido DNA genómico, depois os cDNAs correspondentes aos referidos genes estruturais foram obtidos por transcrição reversa - reacção em cadeia da polimerase (daqui em diante referido como "RT-PCR") usando como matriz RNA total que contem mRNA de Penicillium citrinum. Encontrou-se que a biossintese de ML-236B num microrganismo produtor de ML-236B era acelerada quando o microrganismo produtor de ML-236B foi transformado por um vector de DNA recombinante contendo os referidos cDNAs. 0 presente invento está relacionado particularmente com cDNAs (daqui em diante referido como cDNA acelerador da biossintese de ML-236B) que acelera a 17 PE1149919 biossíntese de ML-236B num microrganismo produtor de ML-236B, quando introduzido no referido microrganismo produtor de ML-236B.

Um polinucleótido acelerador da biossíntese de ML-236B, inclui, como exemplo: (I) DNA obtido por síntese usando, como matriz, um produto transcrito (RNA mensageiro, daqui em diante referido como mRNA) de um gene estrutural que participa na biossíntese de ML-236B e que está presente no DNA genómico de um microrganismo produtor de ML-236B; (II) DNA de cadeia dupla formado como resultado da associação de um DNA (I) e da segunda cadeia de DNA sintetizada usando o DNA (I) como primeira cadeia; (III) DNA de cadeia dupla formado através da replicação ou amplificação do DNA de cadeia dupla (II), por exemplo, por um método de clonagem e similar; (IV) DNA que pode hibridar com um dos DNAs referidos atrás ou mRNA em condições restringentes. 0 DNA (IV) pode ser os nucleótidos 1 a 1380 de SEQ ID NO: 41, em que um ou mais nucleótidos são facultativamente substituídos, eliminados e/ou adicionados, e que pode acelerar a biossíntese de ML-236B num microrganismo produtor de ML-236B, quando introduzido no microrganismo produtor de ML-236B.

Quando dois ácidos nucleicos de cadeia simples hibridam, eles formam uma molécula de cadeia dupla numa região em que são complementares ou altamente 18 PE1149919 complementares um do outro e "condições restringentes" adequadamente refere-se ao caso em que a solução de hibridação é SSC 6X [SSC IX tem uma composição de NaCl 150 mM, citrato de sódio 15 mM] e a temperatura de hibridação é 55°C. O cDNA acelerador da biossintese de ML-236B pode ser obtido, por exemplo, através do isolamento de um clone contendo o cDNA derivado de uma biblioteca de cDNA de um microrganismo produtor de ML-236B. Como alternativa, RT-PCR pode ser usado empregando um par de sequências iniciadoras desenhado com base na sequência de nucleótidos de um DNA genómico relacionado com a biossintese de ML-236B juntamente com mRNA ou RNA total de um microrganismo produtor de ML-236B.

Um microrganismo produtor de ML-236B é um microrganismo tendo uma capacidade inerente para produzir ML-236B. Conforme indicado previamente, os exemplos de microrganismos produtores de ML-236B incluem espécies de Penicillium, tais como Penicillium citrinum, Peniccillium brevicompactum, Penicillium cyclopium ou similares e outros exemplos incluem: Eupenicillium sp. M6603, Paecilomyces vírídís FERM P-6236, Paecilomyces sp.M2016, Trichoderma Longibrachiatum M6735, Hypomyces chrysospermus IFO 7798, Gliocladium sp. YJ-9515, Trichoderma viridae IFO 5836, Eupenicillium reticulisporum IFO 9022 e quaisquer outros organismos adequados.

Entre estes microrganismos produtores de ML-236B, 19 PE1149919 prefere-se Penicillium citrinum, sendo mais preferido Penicillium citrinum estirpe SANK 13380. Penicillium citrinum estirpe SANK 13380 foi depositada no "Research Institute of Life Science and Technology of the Agency of Industrial Science and Technology", em 22 de Dezembro de 1992, com o depósito N° FERM BP-4129, de acordo com o Tratado de Budapeste sobre depósito de microrganismos. Exemplos de microrganismos produtores de ML-236B também incluem os isolados a partir de fontes naturais e os alterados naturalmente ou artificialmente. O DNA genómico relacionado com a biossintese de ML-236B pode ser obtido através do rastreio de uma biblioteca de DNA genómico de um microrganismo produtor de ML-236B com uma sonda adequada. Adequadamente, a sonda é projectada com base numa sequência de DNA que se prevê ter um papel na biossintese de ML-236B, adequadamente proveniente de fungos filamentosos. A escolha de métodos para criar uma biblioteca de DNA genómico não está limitada e pode ser usado qualquer método adequado, de preferência será um método geral para a construção de uma biblioteca de DNA genómico de um organismo eucariótico. Exemplos incluem o método de Maniatis et al., [Maniatis, T., et al., "Molecular cloning, a laboratory manual", 2o ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)]. Na área são conhecidos outros métodos adequados.

De forma geral o DNA genómico de um 20 PE1149919 microrganismo produtor de ML-236B pode ser obtido por recuperação das células de uma cultura do referido microrganismo produtor de ML-236B, rebentamento físico das mesmas, extracção do DNA presente nos seus núcleos e purificação do referido DNA. A cultura de um microrganismo produtor de ML-236B pode ser realizada em condições adeguadas para os microrganismos produtores de ML-236B particulares. Por exemplo, a cultura de Penícíllium citrinum, um microrganismo produtor de ML-236B preferido, pode ser realizada inoculando as células em meio MBG3-8 [composição: 7% (p/v) de glicerina, 3% (p/v) de glucose, 1% (p/v) de farinha de soja, 1% (p/v) de peptona (produzido por Kyokuto Seiyaku Kogyo), 1% (p/v) de melaço de milho (produzido por Honen), 0,5% (p/v) de nitrato de sódio, 0,1% (p/v) de sulfato de magnésio hepta-hidratado (pH 6,5] e incubação entre 22 e 28°C, com agitação, durante 3 a 7 dias. Uma preparação de agar inclinado para armazenamento da bactéria pode ser preparada vertendo meio de agar PGA fundido [composição: 200 g/1 de extracto de batata, 15% (p/v) de glicerina, 2% (p/v) de agar] num tubo de ensaio e permitindo que o agar solidifique em ângulo inclinado. Penicillium citrinum pode então ser inoculado no referido agar inclinado usando uma agulha de platina, seguido de incubação entre 22 e 28°C durante 7 a 15 dias. Os microrganismos ou bactérias crescidos desta forma podem ser mantidos continuamente no agar inclinado mantendo o agar entre 0 e 4°C. 21 PE1149919

As células de um microrganismo produtor de ML-236B cultivadas num meio liquido podem ser recuperadas por centrifugação e as cultivadas num meio sólido podem ser recuperadas raspando o meio sólido com um raspador de células ou similar. 0 rebentamento físico das células pode ser realizado triturando as células com um pilão e almofariz, após a sua congelação em azoto líquido ou similar. 0 DNA no núcleo das células rebentadas pode ser extraído usando um tensioactivo como seja dodecilsulfato de sódio (daqui em diante referido como SDS) ou outro tensioactivo adequado. 0 DNA genómico extraído foi adequadamente tratado com fenol -clorofórmio para remover proteína e recuperado como precipitado fazendo uma precipitação com etanol. 0 DNA genómico resultante foi fragmentado por digestão com uma enzima de restrição adequada. Não existe limite relativamente às enzimas de restrição que podem ser usadas para a digestão de restrição, sendo, de um modo geral, preferidas as enzimas de restrição disponíveis. Exemplos incluem Sau3AI. Na área são conhecidas outras enzimas adequadas. 0 DNA digerido é então sujeito a electroforese em gel e o DNA genómico tendo um tamanho adequado é recuperado do gel. 0 tamanho do fragmento de DNA não está particularmente limitado, mas é de preferência 20 Kb ou mais.

Igualmente, não existe limitação na escolha do vector de DNA usado na construção da biblioteca de DNA 22 PE1149919 genómico, desde que o vector tenha uma sequência de DNA necessária à replicação na célula hospedeira que será transformada pelo vector. Exemplos de vectores adequados incluem um vector plasmidico, um vector fágico, um vector cosmídeo, um vector BAC ou similares, sendo um cosmídeo o vector preferido. 0 vector de DNA é, de preferência, um vector de expressão. Mais de preferência, o vector de DNA compreende um DNA ou uma sequência nucleotídica que confere um fenótipo selectivo à célula hospedeira transformada pelo vector. 0 vector de DNA é adequadamente um vector que pode ser usado na clonagem e na expressão. De preferência o vector é um vector vai-vem que pode ser usado na transformação de um ou mais microrganismos hospedeiros. 0 vector vai-vem adequadamente possui uma sequência de DNA que permite a replicação numa célula hospedeira e, de preferência, uma sequência ou sequências que permitem a replicação numa série de diferentes células hospedeiras derivadas de grupos de microrganismos diferentes, tais como bactérias e fungos. Ainda, o vector vai-vem de preferência compreende uma sequência de DNA que pode proporcionar uma fenótipo seleccionável a uma gama de diferentes células hospedeiras, tais como células de diferentes grupos de microrganismos. A escolha da combinação dos grupos de microrganismos e células hospedeiras transformadas pelo vector vai-vem não está particularmente limitada, desde que um dos grupos de microrganismos possa ser usado na clonagem 23 PE1149919 e o outro tenha capacidade de produzir ML-236B. Tal combinação pode ser, por exemplo, uma combinação de uma bactéria e de um fungo filamentoso, uma combinação de levedura e de um fungo filamentoso, sendo preferida a combinação de uma bactéria e de um fungo filamentoso. A escolha da bactéria não está particularmente limitada desde que possa ser usada em biotecnologia, como seja por exemplo Escherichia coli, Bacillus subtilis ou similares. Escherichia coli é preferida e Escherichia coli XLl-Blue MR é mais preferida. De forma semelhante, não existe restrição nas espécies de leveduras desde que possam ser, de um modo geral, usadas em biotecnologia, como seja por exemplo, Saccharomyces cerevisiae ou similares. Exemplos de fungos filamentosos incluem microrganismos produtores de ML-236B descritos atrás. Na área são conhecidos outros exemplos de microrganismos adequados.

No presente invento, o grupo de microrganismos pode ser seleccionado entre bactérias, fungos filamentosos e leveduras.

Exemplos do vector vai-vem atrás referido incluem um vector cosmideo tendo um gene marcador adequado para selecção de um fenótipo e um local cos. São conhecidos na área outros vectores adequados. 0 vector preferido é pSAKcosl, construído através da inserção de um local cos do vector cosmideo pWEl5 (produzido pela STRATAGENE) no plasmídeo pSAK333, o qual compreende a sequência do gene da fosfotransferase de higromicina B de Escherichia coli [descrito na Publicação do Pedido de Patente Japonesa N° 3- 24 PE1149919 262486]. Na Figura 1 está apresentado um método para a construção de pSAKcosl. 0 presente invento não está limitado a este vector.

Uma biblioteca de DNA genómico pode ser preparada através da introdução de um vector vai-vem numa célula hospedeira, o vector contendo um fragmento de DNA genómico derivado de um microrganismo produtor de ML-236B. A célula hospedeira a ser usada é de preferência Escherichia coli, mais preferencialmente Escherichia coli XLl-Blue MR. Quando a célula hospedeira é Escherichia coli, a introdução pode ser realizada por encapsidação in vitro. No presente invento, a transformação também inclui a introdução do DNA estranho por encapsidação in vitro e uma célula transformada também abrange uma célula em que o DNA estranho é introduzido por encapsidação in vitro.

Uma biblioteca genómica pode ser testada para identificar um clone com interesse usando um anticorpo ou uma sonda de ácido nucleico, sendo preferida uma sonda de ácido nucleico. De preferência, a sonda de ácido nucleico é preparada com base na sequência nucleotídica de um gene ou DNA relacionado com a biossintese de policetidos, de preferência sendo uma sequência derivada de um fungo filamentoso. A escolha de um gene particular não está limitada, desde que esteja envolvido na biossintese de policetidos e a sua sequência nucleotídica seja conhecida. Exemplos de tais genes incluem o gene Aflatoxina PKS de Aspergillus flavus e Aspergillus parasiticus, o gene Esterigmatocistina PKS de Aspergillus nidulans ou similares. 25 ΡΕ1149919

Sondas de ácido nucleico adequadas podem ser obtidas, por exemplo, através da sintese de uma sonda oligonucleotidica compreendendo parte de uma sequência de DNA genómico conhecida como descrito atrás, ou através da preparação de sequências iniciadoras oligonucleotídicas e amplificação do DNA alvo usando a reacção em cadeia da polimerase [aqui referida como "PCR", descrito em Saiki, R.K., et al., Science, 239, 487 (1988)] e DNA genómico como matriz, ou por RT-PCR usando mRNA como matriz. Na área são conhecidos outros métodos adequados para obtenção de tais sondas.

Uma sonda de ácido nucleico pode ser obtida a partir de microrganismos produtores de ML-236B usando, por exemplo, PCR ou RT-PCR. A projecção das sequências iniciadoras usadas para PCR ou RT-PCR (daqui em diante referida como "sequência iniciadora para PCR") é, de preferência, realizada com base na sequência nucleotídica de um gene relacionado com a biossintese de policetidos para o qual é conhecida a sequência nucleotídica. De preferência, o gene é o gene Aflatoxina PKS de Aspergillus flavus, Aspergillus parasiticus ou o gene Esterigmatocistina PKS de Aspergillus nidulans.

As sequências iniciadoras para PCR são adequadamente projectadas de forma a compreender sequências nucleotídicas que codificam sequências de aminoácidos altamente conservadas dentro dos genes PKS. Métodos para identificar sequências nucleotídicas correspondendo a um determinado aminoácido incluem dedução com base na 26 PE1149919 utilização de codões da célula hospedeira e métodos de preparação de sequências oligonucleotidicas mistas usando múltiplos codões (daqui em diante referido como "oligonucleótidos degenerados"). Neste último caso, a multiplicidade de oligonucleótidos pode ser reduzida através da introdução de hipoxantina nas suas sequências nucleotidicas. A sequência iniciadora para PCR pode compreender uma sequência nucleotidica projectada para emparelhar com uma cadeia matriz, a sequência iniciadora sendo ligada a uma outra sequência adicional 5'. A escolha de tal sequência nucleotidica adicional 5' não está particularmente limitada, desde que a sequência iniciadora possa ser usada para PCR ou RT-PCR. Tal sequência 5' adicional pode ser, por exemplo, uma sequência nucleotidica conveniente para a operação de clonagem de um produto de PCR. Tal sequência nucleotidica pode ser, por exemplo, um local de clivagem por enzimas de restrição ou uma sequência nucleotidica contendo um local para enzimas de restrição.

Ainda, na projecção da sequência iniciadora para PCR, prefere-se que a soma do número de bases guanina (G) e o número de bases citosina (C) seja 40 a 60% do número total de bases. Ainda, de preferência, existe pouco ou nenhum auto-emparelhamento para uma determinada sequência iniciadora e, no caso de um par de sequências iniciadoras, de preferência pouco ou nenhum emparelhamento entre as sequências iniciadoras. O número de nucleótidos que constituem a 27 PE1149919 sequência iniciadora para PCR não está particularmente limitado, desde que possa ser usada para PCR. 0 limite inferior do número é de um modo geral 10 a 14 nucleótidos, com o limite superior estando limitado a 40 a 60 nucleótidos. De preferência, as sequências iniciadoras são oligonucleótidos de 14 a 40 nucleótidos de comprimento. A sequência iniciadora para PCR é de preferência DNA. Os nucleósidos na sequência iniciadora podem ser desoxiadenosina, desoxicitidina, desoxitimidina e desoxiguanosina e, ainda, desoxinosina. A posição 5' do nucleósido no extremo 5' da sequência iniciadora para PCR é adequadamente um grupo hidroxilo a que um ácido fosfórico é ligado por uma ligação éster. A síntese de uma sequência iniciadora para PCR pode ser realizada por métodos geralmente usados para a síntese de ácidos nucleicos, por exemplo o método de fosforamideto. Neste método pode ser preferencialmente usado um sintetizador automático de DNA. O DNA genómico e o mRNA derivados de um microrganismo produtor de ML-236B podem ser usados como matriz para PCR ou RT-PCR, respectivamente. RNA total pode também ser usado como matriz para RT-PCR em vez de mRNA. O produto de PCR ou de RT-PCR pode ser clonado através da incorporação num vector de DNA adequado. A escolha do vector de DNA usado no passo de clonagem, de um modo geral, não está limitado. Os kits para uma clonagem fácil dos produtos de PCR e de RT-PCR são comercializados. Por 28 PE1149919 exemplo, o "Original TA Cloning Kit" (fabricado pela Invitrogen: usando pCR2.1 como DNA vector) é adequado a tal clonagem.

Para se obter um produto de PCR clonado, as células hospedeiras transformadas, contendo plasmideos compreendendo o produto de PCR pretendido, são cultivadas e depois os plasmideos extraídos das células e purificados. 0 fragmento de DNA inserido é então recuperado a partir do plasmídeo resultante. A cultura das células hospedeiras transformadas é adequadamente realizada em condições adequadas para as células hospedeiras. Uma célula hospedeira adequada, Escherichia coli, pode ser cultivada em meio LB [1% (p/v) de triptona, 0,5% (p/v) de extracto de levedura, 0,5% (p/v) de cloreto de sódio], entre 30 e 37°C, durante 18 horas a dois dias com agitação. A preparação de plasmideos a partir de uma cultura de células hospedeiras transformadas pode ser realizada através da recuperação das células hospedeiras e do isolamento de plasmideos sem outros componentes celulares tais como DNA genómico ou proteína do hospedeiro. A preparação de DNA plasmídico a partir de uma cultura de Escherichia coli pode ser realizada de acordo com o método alcalino de Maniatis [descrito em Maniatis, T. et al., "Molecular cloning, a laboratory manual", 2o ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)]. Os kits para obtenção de um plasmídeo tendo um maior grau 29 PE1149919 de pureza podem ser obtidos no mercado. Prefere-se o "Plasmid Mini Kit" [fabricado pela Qiagen AG]. A concentração do DNA do plasmideo resultante pode ser determinada medindo a absorvância num comprimento de onda de 260 nm, após diluição adequada da amostra de DNA, e calculando com base no facto de uma solução com uma absorvância DO260 de 1 conter 50 pg/ml de DNA (descrito em Maniatis, T., et al., supra). A pureza do DNA pode ser calculada a partir da razão dos valores de absorvância nos comprimentos de onda de 280 nm e 260 nm (descrito em Maniatis, T., et al., supra) .

Os métodos de marcação de sondas de ácido nucleico podem ser, de um modo geral, classificados como radioactivos e não radioactivos. A escolha de um radionucleótido para marcação radioactiva não está, de um modo geral, limitada e pode ser, por exemplo, 32P, 35S, 14C ou similares. Na marcação prefere-se a utilização de 32P. A escolha do agente para marcação não radioactiva não está igualmente limitada, desde que possa ser usada, de um modo geral, na marcação de ácidos nucleicos e pode ser, por exemplo, digoxigenina, biotina ou similares, sendo preferida digoxigenina.

Os métodos para a marcação de uma sonda de ácido nucleico, de um modo geral, também não estão limitados. São preferidos os métodos normalmente usados, tais como, por exemplo, métodos que incorporam a marca no produto, por PCR 30 PE1149919 ou RT-PCR, usando como substrato nucleótidos marcados, translação de corte, utilização de sequências iniciadoras ao acaso, marcação terminal e métodos para a síntese de um oligonucleótido de DNA usando substratos nucleotídicos marcados. Um método adequado pode ser seleccionado de entre estes métodos dependendo do tipo de sonda de ácido nucleico. A presença no genoma de um microrganismo produtor de ML-236B de uma sequência nucleotídica que é a mesma da sequência nucleotídica de uma sonda de ácido nucleico particular pode ser confirmada por transferências para membrana e hibridação Southern com o DNA genómico do referido microrganismo produtor de ML-236B. A transferência para membranas e hibridação Southern pode ser realizada de acordo com o método de Maniatis [descrito em Maniatis, T., et al, supra] .

Uma sonda de ácido nucleico marcada, preparada como descrito atrás, pode ser usada para testar uma biblioteca de DNA genómico. A escolha do método de rastreio não está particularmente limitada, desde que seja de um modo geral adequado para a clonagem de genes, mas é de preferência o método de hibridação de colónias [descrito em Maniatis, T., et al., supra]. A cultura das colónias usadas para hibridação de colónias é adequadamente realizada em condições adequadas para as células hospedeiras. A cultura de Escherichia coli, 31 ΡΕ1149919 um hospedeiro preferido, pode ser realizada por incubação em meio de agar LB [1% (p/v) de triptona, 0,5% (p/v) de extracto de levedura, 0,5% (p/v) de cloreto de sódio, 1,5% (p/v) de agarose], entre 30 e 37°C, durante 18 horas a dois dias. A preparação do vector de DNA recombinante a partir do clone positivo obtido por hibridação de colónias é, geralmente, realizado por extracção do plasmideo a partir da cultura do clone positivo e purificação do mesmo.

Uma estirpe de Escherichia coli transformada, Escherichia coli pML48 SANK71199, representando um clone positivo obtido de acordo com o presente invento, foi depositada no "Research Institute of Life Science and Technology of the Agency of Industrial Science and Technology", em 7 de Julho de 1999, de acordo com o Tratado de Budapeste sobre depósito de microrganismos e foi-lhe concedido o número de acesso FERM BP-6780.

Um vector de DNA típico contido em Escherichia coli pML48 SANK71199 foi designado como pML48. A confirmação de que o vector de DNA recombinante presente no clone positivo contem DNA genómico relacionado com a biossíntese de ML-236B pode ser adequadamente avaliado determinando a sequência nucleotídica do inserto do vector de DNA recombinante, transferência para membrana e hibridação Southern ou expressão do inserto para determinar a sua função. 32 PE1149919 A sequência nucleotídica de DNA pode ser determinada de acordo com a técnica de modificação química de Maxam e Gilbert [descrita em Maxam, A.M.M. e Gilbert, W., Methods in Enzymology, 65, 499 (1980)] ou pelo método de terminação de cadeias didesoxi [descrito em Messing, j. e Vieira, J., Gene 19, 269 (1982)]. Outros métodos adequados são conhecidos na área. O DNA plasmídico usado para determinação da sequência nucleotídica é, de preferência, uma amostra de elevado grau de pureza, como descrito atrás.

A sequência nucleotídica do inserto de pML48 está apresentada em SEQ ID NO:l da Listagem de Sequências. A sequência nucleotídica mostrada em SEQ ID NO: 2 da Listagem de Sequências é totalmente complementar da sequência nucleotídica mostrada em SEQ ID NO:l. De um modo geral uma sequência nucleotídica de um DNA genómico pode ter polimorfismos genéticos intra-específicos, ou seja diferenças alogénicas. Ainda, no processo de clonagem e sequenciação de DNA, sabe-se que podem ocorrer substituições nucleotídicas, ou outras alterações, com alguma frequência. Assim, o DNA genómico relacionado com a biossíntese de ML-236B do presente invento também inclui DNA genómico e outros DNAs que podem ser hibridados em condições restringentes com o DNA dos nucleótidos 1 a 34203 de SEQ ID NO: 1 ou 2 da Listagem de Sequências. Estes DNAs incluem o DNA do nucleótido N° 1 a 34203 de SEQ ID NO: 1 ou 2 da Listagem de Sequências, em que um ou mais nucleótidos são substituídos, eliminados e/ou adicionados. Ainda, estes DNAs genómicos ou outros que hibridam podem incluir DNA 33 PE1149919 derivado de microrganismos produtores de ML-236B diferentes de Penicillium citrínum SANK13380, de preferência, os capazes de aumentar a produção de ML-236B quando introduzidos num microrgarnismo produtor de ML-236B. 0 DNA genómico relacionado com a biossintese de ML-236B é adequadamente analisado de acordo com os métodos que se seguem 1) a 3). 1) Análise com programa informático de análise de genes.

Os genes dentro do DNA genómico podem ser localizados usando um programa para encontrar genes (daqui em diante referido como "GRAIL") e um programa de pesquisa de sequências homólogas (BLASTN e BLASTX). GRAIL é um programa que pesquisa genes estruturais no DNA genómico através da separação da sequência genómica em sete parâmetros para avaliação do aparecimento de uma sequência de um gene e integração dos resultados usando um método neutro [descrito em Uberbacher, E.C. & Mural, R.J., Proc. Natl. Acad. Sei. USA., 88, 11261 (1991)]. Como exemplo, pode ser usado o ApoCom GRAIL Toolkit [produzido pela Apocom]. 0 blast é um programa que usa um algoritmo para pesquisa de homologias de sequências nucleotidicas e sequências de aminoácidos [descrito em Altschuk, S.F., Madden, T.L., et al.r Nucl. Acids Res., 25, 3389 (1997)]. 34 PE1149919 A posição e a direcção de um gene estrutural numa amostra da sequência de DNA genómico podem ser previstas através da divisão da sequência de DNA em comprimentos adequados e fazendo uma pesquisa de homologia numa base de dados genéticos usando BLASTN. A posição e a direcção do gene estrutural numa sequência de DNA a ser testada podem também ser previstas através da tradução das sequências de DNA genómico nas seis grelhas de tradução (três no sentido codificador e as outras três na cadeia complementar) e fazendo uma pesquisa de homologia das sequências de aminoácidos derivadas numa base de dados de peptídeos usando BLASTX.

As regiões codificadoras para os genes estruturais no DNA genómico estão por vezes divididas com intrões nos organismos eucarióticos. Para análise dos genes estruturais tendo tais intervalos, o programa BLAST para sequências contendo intervalos é mais eficaz, sendo preferido o programa Gapped-BLAST (instalado em BLAST2: WISCONSIN GCG package ver. 10.0). 2) Análise de acordo com o método de transferência para membrana e hibridação Northern A expressão de um gene estrutural previsto pelos métodos de análise descritos no parágrafo 1) pode ser estudada usando o método de transferência para membrana e hibridação Northern.

Adequadamente, RNA total derivado de 35 PE1149919 microrganismos produtores de ML-236B foi obtido a partir de uma cultura do microrganismo. Uma cultura do microrganismo preferido produtor de ML-236B, Penicillium citrinum, pode ser obtida por inoculação do referido organismo derivado de agar inclinado em meio MGB3-8, seguido de incubação com agitação, entre 22 e 28°C, durante um a guatro dias. A escolha do método de extracção de RNA derivado de um microrganismo produtor de ML-236B não está limitado, sendo preferido o método de tiocianato de guanidina-fenol guente, o método de tiocianato de guanidina-guanidina ácido clorídrico ou similares. Exemplos de um kit comercial para a preparação de RNA total de grau de pureza elevado incluem "RNeasy Plant Mini Kit" (produzido pela Qiagen AG) . Ainda, o mRNA pode ser obtido aplicando RNA total numa coluna de oligo (dT) e recuperação da fracção adsorvida à coluna. A transferência de RNA para uma membrana, preparação de uma sonda, hibridação e detecção de um sinal podem ser realizadas de forma semelhante ao método de transferência para membrana e hibridação Southern descrito atrás. 3) Análise do extremo 5' e do extremo 3' do transcrito A análise do extremo 5' e do extremo 3' de cada transcrito pode ser realizada de acordo com o método de "RACE" (amplificação rápida dos extremos de cDNA). RACE é um método de obtenção de um cDNA abrangendo uma região 36 ΡΕ1149919 nucleotídica conhecida e uma região desconhecida nos extremos 5' e 3' de um gene, usando RT-PCR com mRNA como matriz [descrito em Frohman, M.A., Methods Enzymol. 218, 340 (1998)] . 5'-RACE pode ser realizado de acordo com o método que se segue. A primeira cadeia de um cDNA é sintetizada de acordo com uma reacção de transcriptase reversa, usando mRNA como matriz. Como sequência iniciadora, foram usados oligonucleótidos complementares da cadeia codificadora (1) projectados para uma parte conhecida de uma sequência nucleotídica. Uma cadeia nucleotídica homopolimérica (consistindo num único tipo de base) foi adicionada ao extremo 3' da primeira cadeia do cDNA usando transferase de desoxinucleotidilo terminal. Em seguida, o cDNA de cadeia dupla na região do extremo 5' foi amplificado por PCR usando a primeira cadeia do CDNA como matriz. Para amplificação, foram usadas duas sequências iniciadoras, um oligonucleótido de DNA derivado da cadeia codificadora contendo uma sequência complementar da sequência homopolimérica e um oligonucleótido (2) na cadeia complementar e no lado do extremo 3' do oligonucleótido de DNA (1) [descrito em Frohman, M.A., Methods in Enzymol., 218, 340 (1993)]. É comercializado um kit para 5'RACE, "5' RACE System para for Rapid amplification of cDNA ends", Versão 2.0 (fabricado pela GIBCO). 3'RACE é um método que usa a região poliA existente no extremo 3' do mRNA. Especificamente, a primeira cadeia de cDNA é sintetizada através de uma 37 ΡΕ1149919 reacção de transcriptase reversa usando mRNA como matriz e um adaptador oligo d(T) como sequência iniciadora. Em seguida, o cDNA de cadeia dupla na região 3' é amplificado por PCR usando a primeira cadeia do cDNA como matriz. Como sequências iniciadoras foram usados um oligonucleótido de DNA (3) na cadeia codificadora projectado para uma parte conhecida da sequência codificadora e o adaptador oligo d(T) na cadeia complementar. É comercializado um kit para 3'RACE, "Ready-To-Go T-primed First-Strand Kit" (Pharmacia).

Os resultados da análise 1) e 2) atrás foram preferencialmente usados no procedimento de RACE, na projecção das sequências iniciadoras baseadas numa parte conhecida da sequência nucleotídica com interesse.

Usando os métodos da análise descrita em 1) a 3) atrás, podem ser deduzidas a localização do local de iniciação da transcrição no gene estrutural, a posição do codão de iniciação da tradução e o codão de terminação da tradução e a sua posição. Baseado na referida informação, pode ser obtido cada um dos genes estruturais e o respectivo cDNA, nomeadamente cDNAs de aceleração da biossintese de ML-236B.

Seis genes estruturais foram assumidos como estando presentes na sequência incorporada num vector de DNA recombinante pML48 obtido de acordo com o presente invento. Foram designados mlcA, mlcB, mlcC, mlcD, mlcE e mlcR, respectivamente. Entre estes, mcA, mlcB, mlcE e mlcR 38 ΡΕ1149919 são assumidos como tendo uma região codificadora na sequência nucleotidica apresentada em SEQ ID NO: 2 da Listagem de Sequências. mlC e mlcD são assumidos como tendo uma região codificadora na sequência nucleotidica mostrada em SEQ ID NO: 1 da Listagem de Sequências.

Exemplos de um método para obtenção de cDNAs específicos aceleradores da biossintese de ML-236B correspondendo aos genes estruturais atrás referidos incluem: clonagem com RT-PCR usando sequências iniciadoras projectadas para a sequência de cada um dos genes estruturais e respectivo DNA flanqueante e clonagem a partir de uma biblioteca de cDNA usando sondas de DNA adequadas projectadas para sequências nucleotidicas conhecidas. São conhecidos na área outros métodos adequados. Para expressar funcionalmente o cDNA obtido de acordo com estes métodos, é preferível obter um cDNA de tamanho completo.

Descreve-se de seguida um método para obtenção de cDNA acelerador da biossintese de ML-236B usando RT-PCR. É necessário projectar um par de sequências iniciadoras para RT-PCR e para a obtenção de cDNA acelerador da biossintese de ML-236B para que a sequência iniciadora emparelhe selectivamente com uma cadeia matriz, permitindo a obtenção do cDNA. No entanto, não é essencial que as sequências iniciadoras para RT-PCR sejam totalmente complementares de uma parte de cada cadeia matriz, desde que satisfaçam a condição descrita atrás. Sequências 39 ΡΕ1149919 iniciadoras adequadas para RT-PCR que possam emparelhar com a cadeia complementar da cadeia codificadora (daqui em diante referido como "sequência iniciadora codificadora") são sequências iniciadoras codificadoras totalmente complementares de uma parte da cadeia complementar da cadeia codificadora (daqui em diante referido como "sequência iniciadora codificadora não substituída") ou sequências iniciadoras codificadoras que não são totalmente complementares de uma parte da cadeia complementar da cadeia codificadora (daqui em diante referido como "sequência iniciadora codificadora parcialmente substituída"). As outras sequências iniciadoras adequadas para RT-PCR que podem emparelhar com a cadeia codificadora (daqui em diante referido como "sequência iniciadora complementar da sequência codificadora") são sequências iniciadoras complementares da cadeia codificadora que são totalmente complementares de uma parte da cadeia codificadora (daqui em diante referido como "sequência iniciadora complementar da cadeia codificadora não substituída") ou sequências iniciadoras complementares da cadeia codificadora que não são totalmente complementares de uma parte da cadeia codificadora (daqui em diante referido como "sequência iniciadora complementar da cadeia codificadora parcialmente substituída").

Uma sequência iniciadora codificadora é adequadamente projectada para que o produto de RT-PCR obtido usando-a possua o codão ATG na posição original da iniciação da tradução. Adequadamente, o produto de RT-PCR também contem apenas o codão de terminação da tradução 40 ΡΕ1149919 correcto na grela de leitura tendo o local de iniciação ATG original e sem codões de paragem da tradução adicionais (espúrios). A posição do codão de iniciação da tradução dos genes estruturais previstos no presente invento está apresentada na Tabela 5 para genes localizados em SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2 da Listagem de Sequências. O extremo 5' da sequência iniciadora codificadora não substituída é adequadamente o nucleótido "A" do codão de iniciação da tradução ATG ou uma base existente no lado do extremo 5'.

Uma sequência iniciadora codificadora parcialmente substituída emparelha com uma região específica em SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2 da Listagem de sequências, a sequência de nucleótidos de SEQ ID NO: 2 da Listagem de Sequências sendo totalmente complementar de SEQ ID NO: 1 da Listagem de Sequências.

Quando uma sequência iniciadora codificadora parcialmente substituída possui uma sequência nucleotídica presente no lado 3' do codão de iniciação da tradução ATG, adequadamente não possui sequências nucleotidicas nesta região que sejam codões de terminação (TAA, TAG ou TGA) na mesma grelha de leitura do ATG.

Uma sequência iniciadora codificadora parcialmente substituída pode conter o nucleótido "A", sequência de nucleótidos "AT" ou "ATG" (daqui em diante referido como "nucleótido ou sequência de nucleótidos m'") que 41 ΡΕ1149919 corresponde ao nucleótido "A", à sequência de nucleótidos "AT" ou "ATG" do codão de iniciação da tradução (daqui em diante referido como "nucleótido ou sequência de nucleótidos m". Quando o nucleótido m' é "A", correspondendo ao "A" da sequência m, preferimos que o "A" de m' esteja situado no extremo 3' da sequência iniciadora codificadora parcialmente substituída. De forma semelhante, quando m' é "AT", preferimos que esta sequência "AT" de m' esteja situada no extremo 3' da sequência iniciadora codificadora parcialmente substituída. Quando o nucleótido ou a sequência de nucleótidos m é "ATG", correspondendo ao "ATG" de m', preferimos que os trinucleótidos que estão 3' relativamente ao ATG na sequência iniciadora não sejam codões de paragem. Por outras palavras, para os trinucleótidos cujo nucleótido do extremo 5' é o nucleótido (3x n+l)° (n representa um inteiro igual ou superior a um) contado a partir do A do "ATG" de m' na direcção do extremo 3', a sequência nucleotídica do trinucleótido é de preferência nem TAA, nem TAG ou TGA. As sequências iniciadoras descritas atrás podem ser usadas para obter cDNA tendo um codão de metionina na posição correspondente ao codão de iniciação da tradução do mRNA usado como matriz de RT-PCR.

Sempre que o extremo 3' de uma sequência iniciadora codificadora parcialmente substituída seja a posição nucleotídica (3 x n+1), de preferência o trinucleótido que começa nesta posição não é TAA, TAG ou TGA no produto de RT-PCR obtido usando a sequência iniciadora codificadora parcialmente substituída como uma 42 PE1149919 das sequências iniciadoras, e RNA ou mRNA do microrganismo produtor de ML-236B como matriz ou nos produtos de PCR obtidos usando DNA genómico ou cDNA como matriz. A posição de nucleótido é contada a partir do "A" do codão de iniciação da tradução "ATG" na direcção do extremo 3' e "n" representa um inteiro igual ou superior a um.

Quando o extremo 3' de uma sequência iniciadora codificadora parcialmente substituída é a posição nucleotídica (3 x n+2), o tripleto para o qual a posição 3 x n+2 é o nucleótido central é de preferência nenhuma das sequências TAA, TAG ou TGA para um produto de PCR ou RT-PCR obtido como atrás.

Quando o extremo 3' de uma sequência iniciadora codificadora parcialmente substituída é a posição nucleotídica (3 x n+3), o tripleto para o qual a posição (3 x n+3) é o nucleótido 3' é de preferência nenhuma das sequências TAA, TAG ou TGA.

Os requisitos para a sequência iniciadora codificadora são os discutidos atrás.

Uma sequência iniciadora complementar da sequência codificadora foi projectada de forma a quando usada conjuntamente com a sequência iniciadora codificadora, poder ser amplificado cDNA codificador de cada um dos genes estruturais (mlcA, mlcB, mlcC, mlcD, mlcE e mlcR) usando RT-PCR numa direcção equivalente ao extremo N para o extremo C dos peptídeos correspondentes. 43 ΡΕ1149919 A escolha da sequência iniciadora complementar da sequência codificadora não substituída não está limitada, desde que seja uma sequência iniciadora complementar da sequência codificadora tendo uma sequência nucleotidica complementar de uma sequência nucleotidica situada na região do local de terminação da tradução do cDNA. No entanto, é preferida uma sequência iniciadora tendo uma base do extremo 5' que é complementar da base no extremo 3' do codão de terminação da tradução ou tendo uma base no lado do extremo 5' da referida base da sequência iniciadora. É preferida uma sequência iniciadora contendo três bases complementares de um codão de terminação da tradução. As Tabelas 8 a 10 mostram o codão de terminação da tradução de cada um dos genes estruturais, a sequência complementar do codão de iniciação da tradução, um residuo de aminoácido no extremo C do peptideo codificado por cada um dos genes estruturais, a sequência nucleotidica codificadora o residuo de aminoácido e a sua posição em SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2.

Sequências iniciadoras complementares da sequência codificadora parcialmente substituídas emparelham selectivamente com uma região especifica na sequência nucleotidica de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2 da Listagem de Sequências.

Foram referidos atrás os requisitos para uma sequência iniciadora complementar da sequência codificadora. 44 ΡΕ1149919 É possível adicionar sequências nucleotídicas adequadas ao extremo 5' das sequências iniciadoras codificadoras parcialmente substituídas e às sequências iniciadoras complementares da sequência codificadora parcialmente substituídas, desde que sejam satisfeitos os requisitos atrás referidos. A escolha de tal sequência nucleotídica não está particularmente limitada, desde que a sequência iniciadora possa ser usada para PCR. Exemplos de sequências adequadas incluem sequências nucleotídicas convenientes para a clonaqem dos produtos de PCR, tais como locais de clivaqem por enzimas de restrição e sequências nucleotídicas contendo locais de clivagem por enzimas de restrição adequados.

Ainda, a sequência iniciadora codificadora e a sequência iniciadora complementar da sequência codificadora são adequadamente projectadas de acordo com a descrição atrás e de acordo com as regras gerais de projecção de sequências iniciadoras para PCR.

Como descrito atrás, mRNA ou RNA total derivado de microrganismo produtor de ML-2346B pode ser usado como matriz para RT-PCR. Um cDNA acelerador da biossíntese de ML-2346B correspondendo ao gene estrutural mlcE foi obtido projectando e sintetizando um par de sequências iniciadoras adequadas para amplificar toda a região codificadora do gene estrutural mlcE na sequência do inserto de pML48 e depois realização de RT-PCR usando RNA total de SANK13380 como matriz [sequências iniciadoras representadas respectivamente pelas sequências nucleotídicas SEQ id NOS: 45 ΡΕ1149919 35 e 36 da Listagem de Sequências].

Um cDNA acelerador da biossintese de ML-236B correspondendo ao gene estrutural mlcR foi obtido de forma semelhante usando as sequências iniciadoras representadas respectivamente pelas sequências nucleotidicas SEQ ID NOS: 39 e 40 da Listagem de Sequências.

Conforme descrito atrás, o produto de RT-PCR pode ser clonado através da inserção num vector de DNA adequado. A escolha do vector de DNA usado para tal clonagem não está limitada e é adequadamente um vector de DNA geralmente usado para clonagem de fragmentos de DNA. Os kits para uma clonagem fácil de um produto de RT-PCR são comercializados e é preferido o "Original TA Cloning kit" [fabricado pela Invitrogen, usando pCR2.1 como vector de DNA]. A confirmação da expressão funcional dos cDNAs aceleradores da biossintese de ML-236B obtidos, usando os métodos atrás descritos, num microrganismo produtor de ML-236B pode ser conseguida por clonagem do cDNA num vector de DNA adequado para a expressão funcional num microrganismo produtor de ML-236B. Células adequadas são então transformadas com o vector de DNA recombinante e comparada a capacidade de biossintese de ML-236B das células hospedeiras transformadas e não transformadas. Se o cDNA acelerador da biossintese de ML-236B for funcionalmente expresso na célula transformada, então a capacidade de biossintese de ML-236B da célula transformada é melhorada comparativamente com a de uma célula hospedeira. 46 ΡΕ1149919 A escolha do vector de DNA adequado para expressão num microrganismo produtor de ML-236B [daqui em diante referido como um vector de expressão funcional] não está particularmente limitada, desde que possa ser usado para transformar o microrganismo produtor de ML-236B e possa funcionalmente expressar o polipeptideo codificado pelo cDNA acelerador da biossíntese de ML-236B naquele organismo. De preferência, o vector é estável na célula hospedeira e tem uma sequência nucleotidica que permite a replicação na célula hospedeira. 0 vector para a expressão funcional pode conter um ou mais dos cDNAs aceleradores da biossíntese de ML-236B, por exemplo cDNAs correspondendo aos genes estruturais mlcR ou mlcR e mlcE.

Um vector para a expressão funcional pode conter um ou mais tipos de DNA, diferentes do cDNA correspondendo ao gene estrutural mlcR ou mlcR e mlcE, que acelere a biossíntese de ML-236B quando introduzido no microrganismo produtor de ML-236B. Exemplos de tal DNA incluem: cDNAs correspondendo aos genes estruturais mlcA, mlcB, mlcC ou mlcD, DNA genómico relacionado com a biossíntese de ML-236B, DNA codificador de factores reguladores da expressão do cDNA acelerador da biossíntese de ML-236B do presente invento, ou similares.

Um vector para a expressão funcional, de preferência, compreende uma sequência nucleotidica que proporciona um fenótipo selectivo para o plasmídeo numa 47 ΡΕ1149919 célula hospedeira, e é, de preferência, um vector vai-vem.

Ainda, o fenótipo selectivo pode ser um fenótipo de resistência a drogas ou similares, sendo preferencialmente resistência a antibióticos, e, mais de preferência, resistência à ampicilina ou resistência à higromicina B.

No caso do vector de expressão ser um vector vai-vem, o vector adequadamente compreende uma sequência nucleotidica que permite ao vector replicar-se numa célula hospedeira de um dos grupos de microrganismos e uma sequência nuleotidica necessária para a expressão do polipeptideo codificado pelo inserto do vector num outro tipo de célula hospedeira. Prefere-se que o vector confira um fenótipo selectivo diferente a cada célula hospedeira dos diferentes grupos de microrganismos transformados. Os requisitos para combinações de grupos de microrganismos é semelhante aos requisitos para o vector vai-vem usado na clonagem e expressão de DNA genómico relacionado com a biossíntese de ML-236B descrito na presente descrição.

No presente invento, um vector vai-vem adequado é pSAK700, construído através da combinação, por esta ordem, do promotor 3-fosfoglicerato cinase (daqui em diante referido como "pgk") derivado de Aspergillus nidulans existente no vector de dna pSAK333 (descrito na Publicação do Pedido de Patente Japonesa N° 3-262486), um adaptador para inserção de um gene estranho e o terminador pgk existente no DNA, (ver Figura 4). 48 ΡΕ1149919

Um polipeptídeo pode ser expresso num microrganismo produtor de ML-236B através da inserção do cDNA correspondente ao gene estrutural mlcE, descrito atrás, no vector de expressão igualmente descrito atrás. Um vector de expressão de cDNA recombinante pSAKexpE foi obtido através da inserção do cDNA correspondente ao gene estrutural mlcE num local adaptador de pSAK700. A sequência incorporada em pSAKexpE, nomeadamente a sequência nucleotidica do cDNA correspondente ao gene estrutural mlcE está apresentada em SEQ ID NO: 37 da Listagem de Sequências. De forma semelhante, um vector de expressão de cDNA recombinante pSAKexpR foi obtido através da inserção do cDNA correspondente ao gene estrutural mlcR num local adaptador de pSAK700. A sequência inserida em pSAKexpE, nomeadamente a sequência nucleotidica do cDNA correspondente ao gene estrutural mlcR está, apresentada em SEQ ID NO: 41 da Listagem de Sequências.

Escherichia coli pSAKexpE SANK 72499, que é a estirpe de Escherichia coli transformada por pSAKexpE, foi depositada no "Research Institute of Life Science and Technology of the Agency of Industrial Science and Technology", em 25 de Janeiro de 2000, como depósito N° FERM BP-7005, de acordo com o Tratado de Budapeste sobre depósito de microrganismos. Escherichia coli pSAKexpE SANK 72599, que é a estirpe de Escherichia coli transformada por pSAKexpR, foi depositada no "Research institute of Life Science and Technology of the Agency of Industrial Science and Technology", em 25 de Janeiro de 2000, como depósito N° FERM BP-7006, de acordo com o Tratado de Budapeste sobre 49 ΡΕ1149919 depósito de microrganismos. Métodos adequados de transformação podem ser adequadamente seleccionados, dependendo da célula hospedeira, para obter expressão do cDNA acelerador da biossintese de ML-236B, DNA genómico relacionado com a biossintese de ML-236B ou seus fragmentos. A transformação de Penicillium citrinum, um microrganismo preferido produtor de ML-236B, pode ser realizada preparando protoplastos a partir de esporos de Penicillium citrinum, seguido da introdução do vector de dna recombinante no protoplasto [descrito em Nara, F., et al., Curr. Genet. 23, 28 (1993)].

Adequadamente, os esporos de uma cultura em agar inclinado de Penicillium citrinum são inoculados numa placa de meio de agar PGA e incubados entre 22 e 28°C, durante 10 a 14 dias. Os esporos são então colhidos da placa e 1 x 107 1 x 109 esporos inoculados em 50 a 100 ml de meio de cultura YPL-20 [composição: 0,1% (p/v) de extracto de levedura (fabricado pela Difco), 0,5% (p/v) de polipeptona (produzido pela Niheon Seiyaku), 20% (p/v) de lactose, pH 5,0], depois incubado entre 22 e 28°C durante 18 horas a dois dias. Os esporos que germinam são recuperados da cultura e tratados com enzimas que degradam a parede celular para originar protoplastos. A escolha da enzima que degrada a parede celular não está particularmente limitada, desde que seja degradada a parede celular de Penicillium citrinum e não tenha um efeito deletério para o microrganismo. Exemplos incluem: zimoliase, quitinase ou 50 ΡΕ1149919 similares . A mistura de um vector de DNA recombinante compreendendo um cDNA acelerador da biossintese de ML-236B e microrganismo produtor de ML-236B ou seu protoplasto, nas condições adequadas, permite a introdução do vector de DNA recombinante no referido protoplasto para se conseguir um transformante. A cultura dos transformantes do microrganismo produtor de ML-236B é convenientemente realizada em condições adequadas a cada célula hospedeira. A cultura de um transformante de Penicillium citrinum, um microrganismo preferido produtor de ML-236B, pode ser realizada cultivando o referido protoplasto transformado em condições adequadas à regeneração da parede celular e depois cultura. Nomeadamente, o protoplasto transformado de Penicillium citrinum pode ser introduzido em meio de agar com camada intermédia VGS [composição: meio mínimo de Vogel, 2% (p/v) de glucose, glucitol 1 M, 2% (p/v) de agar], o agar VGS da camada intermédia é em seguida intercalado entre o meio de agar VGS da camada inferior [composição: meio mínimo de Vogel, 2% (p/v) de glucose, glucitol 1 M, 2,7% (p/v) de agar] e o meio de agar VGS da camada superior [composição: meio mínimo de Vogel, 2% (p/v) de glucose, glucitol 1M, 1,5% (p/v) de agar] contendo 800 pg/ml de higromicina B, depois incubado entre 22 e 28°C, durante 7 a 15 dias. A estirpe resultante foi subcultivada com incubação entre 22 e 28°C em meio PGA. A estirpe foi inoculada com uma agulha de platina num agar inclinado preparado a partir de meio 51 ΡΕ1149919 PGA, incubada entre 22 e 28°C, durante 10 a 14 dias e depois mantido entre 0 e 4°C.

Como descrito atrás, ML-236B pode ser eficientemente produzido através da inoculação de um transformante de Penicillium citrinum obtido a partir de um agar inclinado como atrás e tendo uma parede celular regenerada, em meio MBG 3-8, seguido de incubação entre 22 e 28°C, durante 7 a 12 dias com agitação. Penicillium citrinum como hospedeiro pode ser cultivado em meio liquido assim como para produzir ML-236B. A purificação de ML-236B a partir da cultura de um transformante do microrganismo produtor de ML-236B pode ser realizada através da combinação de vários métodos normalmente usados para a purificação de produtos naturais. A escolha de tais métodos não está particularmente limitada e, pode ser, por exemplo, centrifugação, separação de sólidos e líquidos por filtração, tratamento com bases ou ácidos, extracção com solventes orgânicos, dissolução, métodos cromatográficos tais como cromatografia de adsorção, cromatografia de partição ou similares, e cristalização ou similares. ML-236B pode estar na forma de hidroxi-ácido ou lactona, que podem ser reciprocamente convertidos. O hidroxi-ácido pode ser convertido num seu sal mais estável. Usando tais propriedades físicas, pode ser obtido a forma de hidroxi-ácido de ML-236B (daqui em diante referido como hidroxi-ácido livre), sais de ML-236B hidroxi-ácido (daqui em diante referido como um sal de hidroxi-ácido) ou a forma de lactona de ML-263B (daqui em 52 ΡΕ1149919 diante referido como lactona). A cultura é sujeita a hidrólise alcalina, a uma temperatura elevada ou à temperatura ambiente, para abertura do anel e conversão num sal de hidroxi-ácido, e depois a solução de reacção é acidificada, seguido de filtração. 0 filtrado é extraído com um solvente orgânico que se separa da água para dar o produto pretendido na forma de hidroxi-ácido livre. A escolha do solvente orgânico não está particularmente limitada. Exemplos incluem: hidrocarbonetos alifáticos tais como hexano, heptano ou similares; hidrocarbonetos aromáticos tais como benzeno, tolueno ou similares; hidrocarbonetos halogenados tais como cloreto de metileno, clorofórmio ou similares; éteres tais como éter dietílico ou similares; ésteres tais como formato de etilo, acetato de etilo ou similares; ou uma mistura consistindo em dois ou mais solventes. 0 composto pretendido pode ser obtido como sal de hidroxi-ácido através da dissolução do hidroxi-ácido livre numa solução aquosa de um sal de metal alcalino como seja hidróxido de sódio.

Ainda, o composto pretendido pode ser obtido como lactona através do encerramento do anel por aquecimento do hidroxi-ácido livre num solvente orgânico a ser desidratado ou através de outros métodos adequados. É possível purificar e isolar o hidroxi-ácido livre, hidroxi-ácido ou lactona assim obtido usando 53 ΡΕ1149919 cromatografia em coluna ou similares. 0 suporte para a coluna usada na cromatografia não está particularmente limitado. Exemplos incluem: Sephadex LH-20 (produzido pela Pharmacia), Diaion HP-20 (produzido pela Mitsubishi Kagaku), sílica gel, suportes de fase reversa ou similares, sendo preferidos os suportes da série C18. A escolha de um método para a quantificação de ML-236B não está particularmente limitada, de preferência é um método usado, de um modo geral, para a quantificação de compostos orgânicos. Exemplos incluem: cromatografia líquida de alta resolução em fase reversa (daqui em diante referida como "HPLC de fase reversa") ou similares. A quantificação por HPLC de fase reversa pode ser realizada submetendo uma cultura de um microrganismo produtor de ML-236B a hidrólise alcalina, submetendo a fracção solúvel a HPLC de fase reversa usando uma coluna C18, medição da absorção de UV e conversão do valor de absorção numa quantidade de ML-236B. A escolha da coluna C18 não está particularmente limitada, de preferência sendo uma coluna C18 usada geralmente para HPLC de fase reversa. Exemplos incluem: SSC-ODS-262 (diâmetro de 6 mm, comprimento de 100 mm, fabricado por Senshu Kagaku) ou similares. A escolha do solvente para a fase móvel não está particularmente limitada, desde que seja um solvente normalmente usado para HPLC em fase reversa. É, por exemplo, 75% (v/v) metanol -0,1% (v/v) trietilamina - 0,1% (v/v) de ácido acético ou similares. Quando ML-236B é adicionado à temperatura ambiente a uma coluna SSC-ODS-262, em que se usa 75% (v/v) metanol - 0,1% (v/v) trietilmanina - 0,1% (v/v) ácido 54 ΡΕ1149919 acético como fase móvel, a uma velocidade de 2 ml/minuto, ML-236B é eluído após 4,0 minutos. ML-236B pode ser detectado usando um detector de UV para HPLC. O comprimento de onda absorvido para detecção por UV é 220 a 280 nm, de preferência 220 a 260 nm, mais de preferência 236 nm.

As composições farmacêuticas podem ser preparadas contendo ML-236B obtido usando o presente invento, juntamente com um veiculo farmacêutico.

Podem ser preparadas composições farmacêuticas contendo pravastatina preparada a partir de ML-236B, obtido usando o presente invento, juntamente com um veículo farmacêutico.

As composições farmacêuticas podem ser convencionais e as mesmas usadas para as formulações de ML-236B ou pravastatina já existentes. O invento é agora ilustrado mais detalhadamente com referência às Figuras e Exemplos que se seguem. Os Exemplos são ilustrativos do presente invento mas não lhe estão limitados.

Descrição das figuras

Figura 1 é um diagrama que descreve a construção do vector de DNA pSAKcosl;

Figura 2 é o resultado da análise dos genes 55 ΡΕ1149919 estruturais da sequência inserida de pML48;

Figura 3 mostra a transferência para membranas e hibridação Northern da sequência inserida de pML48;

Figura 4 é um diagrama que descreve a construção do vector de expressão de cDNA pSAK700; e

Figura 5 mostra a análise por RT-PCR da transcrição de mlcA-E e R num transformante pSAKexpR.

Figura 6 mostra a análise por RT-PCR da transcrição de mlcE num transformante pSAKexpE.

Exemplos do invento

Exemplo 1: Construção do vector pSAKcosl 0 plasmideo pSAK333 contendo o gene da fosfotransferase de higromicina B (daqui em diante referido como "HPT") derivado de Escherichia colí (Publicação do Pedido de Patente Japonesa N° 3-262486) foi digerido com a enzima de restrição BamHI (fabricado por Takara Shuzo Co., Ltd., Japão) e tratado para formar extremos cerses com polimerase do DNA de T4 (produzida por Takara Shuzo Co., Ltd., Japão). 0 fragmento de DNA obtido como atrás foi auto-ligado numa forma circular usando um kit de ligação de DNA ("DNA ligation kit Ver.2", produzido por Takara Shuzo Co., Ltd., Japão) e células competentes JM 109 de Escherichia 56 ΡΕ1149919 coli (produzidas por Takara Shuzo Co., Ltd., Japão) foram então transformadas com ele. Uma estirpe tendo um plasmídeo com o local BamHI eliminado foi seleccionada a partir de Escherichia coli transformada e foi designada pSAK360. pSAK360 foi digerido com a enzima de restrição PvuII e depois tratado com fosfatase alcalina para produzir um fragmento desfosforilado no extremo 5'. Um fragmento SalI-SacI (cerca de 3 Kb) contendo um local cos foi obtido a partir de um vector cosmideo pWEl5 (fabricado pela STRATAGENE) e foi tratado para formar extremos cerses com polimerase do DNA de T4. Foi subsequentemente ligado ao local PvuII de pSAK360. JM109 foi transformada com este DNA. As estirpes tendo um plasmideo no qual o fragmento Sall-Scal (cerca de 3 Kb) foi inserido no local PvuII foram seleccionadas a partir de Escherichia coli transformada e o plasmideo da estirpe foi designado pSAKcosl. pSAKcosl possui um local de clivagem para as enzimas de restrição BamHI, EcoRI e Notl, cada um dos locais derivado de pWEl5. pSAKcosl tem um gene de resistência à ampicilina e um gene de resistência à higromicina como marcas de selecção.

Nos exemplos que se seguem, em que Escherichia coli foi usada como hospedeiro, a selecção dos transformantes pSAKcosl ou transformantes pSAKcosl compreendendo um inserto de gene estranho, foi realizada pela adição de 40 μρ/ιηΐ de ampicilina (Ampicilina: produzida pela Sigma) ao meio relevante. Sempre que Penicillium citrinum SANK13380 foi usado como hospedeiro, a selecção dos transformantes pSAKcos ou transformantes 57 PE1149919 pSAKcosl compreendendo um inserto de gene estranho, foi realizada pela adição de 200 μρ/πιΐ de higromicina (Higromicina B: produzida pela Sigma) ao meio em causa. O método de construção de pSAKcosl está apresentado na Fig. 1.

Exemplo 2: Preparação de DNA genómico de Penicillium citrinum SANK 13380 1) Cultura de Penicillium citrinum SANK13380

Uma cultura de sementeira de Penicillium citrinum SANK 13380 foi preparada a partir de agar inclinado de meio PGA. Nomeadamente, o agar foi inoculado com Penicillium citrinum SANK 13380 usando uma agulha de platina e mantido a 26°C durante 14 dias. O agar inclinado foi guardado a 4°C. A cultura principal foi realizada através de cultura em meio líquido com arejamento. As células de um quadrado de 5 mm do agar inclinado atrás referido foram inoculadas em 50 ml de meio MBG3-8 num frasco cónico de 500 ml e incubadas a 26°C, com agitação a 210 rpm, durante cinco dias. 2) Preparação de DNA genómico a partir de Penicillium citrinum SANK 13380 A cultura obtida no passo 1) foi centrifugada a 58 ΡΕ1149919 10000 xg, à temperatura ambiente, durante 10 minutos e as células foram colhidas. 3 g (peso molhado) de células foram esmagadas num almofariz com gelo seco para formar um pó. As células esmagadas foram colocadas num tubo de centrífuga cheio com 20 ml de EDTA.2Na 62,5 mM (fabricado por Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) - 5% (p/v) SDS - tampão Tris ácido clorídrico 50 mM (fabricado por Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) (pH 8,0) e foram misturadas suavemente, depois deixadas em repouso a 0°C durante uma hora. Adicionou-se 10 ml de fenol saturado com Tris ácido clorídrico 10 mM - edta.2Na 0,1 mM (pH 8,0, daqui em diante referido como "TE") e a mistura foi suavemente agitada a 50° durante uma hora.

Após centrifugação à temperatura ambiente a 10000 xg durante 10 minutos, 15 ml da camada superior (fase aquosa) foi colocada num outro tubo de centrífuga. À solução adicionou-se 0,5 vezes o volume de fenol saturado com TE e 0,5 vezes o volume de solução de clorofórmio. A mistura foi agitada durante dois minutos e centrifugada à temperatura ambiente a 10000 xg durante 10 minutos (daqui em diante referido como "extracção com fenol-clorofórmio"). A 10 ml da fase superior (fase aquosa) adicionou-se 10 ml de acetato de amónio 8M (pH 7,5) e 25 ml de 2-propanol (produzido por Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), seguido de 80°C durante 15 minutos e centrifugação a 4°C a 10000 xg durante 10 minutos.

Após precipitação, os precipitados foram dissolvidos em 5 ml de TE, após o que se adicionou 20 μΐ de 59 PE1149919 10 mg/ml de ribonuclease A (produzida pela Sigma) e 250 unidades de ribonuclease TI (fabricado pela GIBCO Corporation), seguido de incubação a 37°C durante 20 minutos. 20 ml de 2-propanol foi adicionado e misturado suavemente. Subsequentemente, as fitas de DNA genómico foram enroladas na ponta de uma pipeta de Pasteur e dissolvidas em um ml de TE.

Em seguida, 0,1 vezes por volume de acetato de sódio 3M (pH 6,5) e 2,5 vezes por volume de etanol foram adicionados à solução de DNA. A solução foi arrefecida a -80°C durante 15 minutos e depois centrifugada a 4°C, a 10000 xg durante cinco minutos (daqui em diante referido como "precipitação com etanol") . O precipitado resultante foi dissolvido em 200 μΐ de TE originando uma fracção de DNA genómico.

Exemplo 3: Preparação de biblioteca de DNA genómico de Penicillium citrinum SANK13380 1) Preparação de fragmento de DNA genómico 0,25 unidades de Sau3Al (Takara Shuzo Co., Ltd., Japão) foram adicionadas a 100 μΐ de uma solução aquosa de DNA genómico (50 μg) de Penicillium citrinum SANK13380 obtido no Exemplo 2. Após intervalos de 10, 30, 60, 90 e 120 segundos, amostras de 20 μΐ da mistura foram colhidas e adicionado EDTA 0,5 M (pH 8,0) a cada uma das amostras para terminar a reacção da enzima de restrição. Os fragmentos de DNA parcialmente digeridos resultantes foram separados por 60 PE1149919 electrof orese em gel de agarose e recuperado o gel de agarose contendo fragmentos de DNA de 30 Kb ou mais. O gel recuperado foi finamente triturado e colocado numa unidade de ultrafiltração, "Ultra Free C3 Centrifuged Filtration Unit" (fabricada pela Japan

Millipore). O gel foi arrefecido a -80°C durante 15 minutos até congelar e depois fundido por incubação a 37°C durante 10 minutos. Centrifugou-se a 5000 xg durante 5 minutos para extrair DNA. O DNA foi sujeito a extracção com fenol- clorofórmio e precipitação com etanol. Os precipitados resultantes foram dissolvidos numa pequena quantidade adequada de TE. 2) Pré-tratamento de DNA vector pSAKcosl pSAKcosl foi digerido com a enzima de restrição BamHI (Takara Shuzo Co., Ltd., Japão) e depois sujeito a tratamento com fosfatase alcalina a 65°C durante 30 minutos. A solução de reacção resultante foi sujeita a extracção com fenol-clorofórmio e precipitação com etanol. O precipitado resultante foi dissolvido numa pequena quantidade de TE. 3) Ligação e encapsidação in vitro O fragmento de DNA genómico (2 pg) descrito no passo 1) acima e pSAKcosl (1 μρ) sujeito a pré-tratamento como acima foram misturados e depois ligados a 16°C durante 16 horas usando um kit de ligação de DNA ("DNA ligation 61 PE1149919

kit" Ver.2, Takara Shuzo Co., Ltd., Japão). A solução de reacção resultante foi sujeita a extracção com fenol-clorofórmio e precipitação com etanol. Os precipitados resultantes foram dissolvidos em 5 μΐ de TE. A solução do produto de ligação foi sujeita a encapsidação in vitro usando o kit GIGAPAK II Gold (produzido pela STRATAGENE Corporation) para obter transformantes de Escherichia coli contendo um vector de DNA recombinante. 3 ml de meio LB foram vertidos numa placa sobre a qual se formaram as colónias dos transformantes de Escherichia coli e depois as colónias na placa foram recuperadas usando um raspador de células (referido como "solução recuperada 1"). A placa foi lavada com mais 3 ml de meio LB e as células recuperadas (referido como "solução recuperada 2") . Adicionou-se glicerol a uma mistura das soluções recuperadas 1 e 2, para se conseguir uma concentração final de 18% (referido como solução de células de Escherichia coli), que foi mantido a -80°C como uma biblioteca de DNA genómico de Penicillium citrinum SANK13380.

Exemplo 4: Amplificação do fragmento do gene PKS por PCR usando DNA genómico de Penicillium citrinum SANK13380 como matriz 1) Projecção e síntese de sequências iniciadoras

para PCR

Baseado na sequência de aminoácidos de um gene PKS de Aspergillus flavus (descrito em Brown, D.W., et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 93, 1418 (1996)), foram 62 ΡΕ1149919 projectadas e sintetizadas sequências iniciadoras degeneradas mostradas em SEQ ID NOS: 3 e 4 da Listagem de Sequências. A síntese foi realizada de acordo com o método de fosforamideto. SEQ ID NO: 3 da Listagem de Sequências: gayacngcntgyasttc SEQ ID NO: 4 da Listagem de Sequências: tcnccnknrcwgtgncc

Na sequência de nucleótidos de SEQ ID NOS: 3 e 4, n representa inosina (hipoxantina), y representa t ou c, s representa g ou c, k representa g ou t, r representa g ou a e w representa a ou t.

2) Amplificação do segmento de DNA por PCR 50 μΐ de solução de reacção foram preparados contendo as sequências iniciadoras do PCR descritas no passo 1) acima (100 pmoles de cada), DNA genómico de Penicillium citrínum SANK13380 obtido no Exemplo 2 (500

ng) , ATP 0,2 mM, dCTP 0,2 mM, dGTP 0,2 mM, dTTP 0,2 mM, cloreto de potássio 50 mM, cloreto de magnésio 2 mM e 1,25 unidades de polimerase do DNA Taq (Takara Shuzo Co., Ltd., Japão). A solução foi sujeita a um ciclo de reacção consistindo em três passos consecutivos como se seguem: um minuto a 94°c, dois minutos a 58°C e 3 minutos a 70°C. O ciclo foi repetido 30 vezes para amplificar o fragmento de DNA. Realizou-se PCR usando o termociclador TaKaRa PCR 63 ΡΕ1149919

Thermal Cycler MP TP 3000 (fabricado por Takara Shuzo Co., Ltd., Japão).

Os fragmentos de DNA amplificados foram sujeitos a electroforese em gel de agarose e depois fragmentos de DNA em agarose tendo um tamanho de cerca de 1,0 a 2,0 Kb foram recuperados. O DNA foi recuperado do gel e sujeito a extracção com fenol-clorofórmio e precipitação com etanol. O precipitado resultante foi dissolvido numa pequena quantidade de TE. 3) Ligação e transformação O fragmento de DNA obtido no passo 2) foi ligado ao plasmideo pCR.l usando o sistema de clonagem TA pCR2.1 (fabricado pela Invitrogen Corporation), o plasmideo constituindo parte do kit. O plasmideo foi usado para transformar Escherichia coli JM 109 para se obter transformantes.

Foram seleccionadas várias colónias a partir dos transformantes resultantes e foram cultivadas de acordo com o método de Maniatis, et al., [Maniatis, T., et al., Molecular cloning, a laboratory manual, 2o ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)]. Nomeadamente, cada uma das colónias foi inoculada num tubo de ensaio de 24 ml contendo 2 ml de meio LB e foi incubada a 37°C durante 18 horas com agitação.

Um vector de DNA recombinante foi preparado a 64 ΡΕ1149919 partir da cultura de acordo com o método de fosfatase alcalina (descrito em Maniatis, T., et al. , supra).

Nomeadamente, 1,5 ml da solução de cultura foram centrifugados à temperatura ambiente a 10000 xg durante dois minutos. As células foram então recuperadas do precipitado. Às células adicionou-se 100 μΐ de uma solução de glucose 50 mM, Tris-ácido clorídrico 25 mM, EDTA 10 mM (pH 8,0), para formar uma suspensão. A isto adicionou-se 200 μΐ de hidróxido de sódio 0,2N - 1% (p/v) SDS. A suspensão foi agitada suavemente para lisar os microrganismos. 150 μΐ de acetato de potássio 3M - 11,5% (p/v) de ácido acético foram então adicionados para desnaturar qualquer proteína, seguido de centrifugação à temperatura ambiente a 10000 xg durante 10 minutos. O sobrenadante foi recuperado. O sobrenadante foi sujeito a extracção com fenol-clorofórmio e precipitação com etanol. O precipitado resultante foi dissolvido em 50 μΐ de TE contendo 40 μρ/ΓηΙ de ribonuclease A (produzido pela Sigma) .

Cada um dos vectores de DNA recombinante foi digerido com enzimas de restrição e sujeito a electroforese. As sequências nucleotidicas dos insertos de DNA nos vectores de DNA recombinante foram determinadas usando um sequenciador de DNA (modelo 377: fabricado pela Perkin Elmer Japão) para todos os insertos tendo padrões de digestão diferentes em electroforese.

Desta forma, foi identificado um transformante tendo um vector de DNA recombinante possuidor de um fragmento PKS derivado de Penicillium citrinum. 65 PE1149919

Exemplo 5: Transferência para membrana e hibridação Southern de DNA genómico de Penicillivm citrinvm SANK13380 1) Electroforese e transferência para membrana 0 DNA genómico (10 pg) de Penicillium citrinum SANK13380, obtido no Exemplo 2, foi digerido com as enzimas de restrição EcoRI, Sall, HindIII ou Saci (todas produzidas pela Takara Shuzo Co., Ltd., Japão) e depois sujeitas a electroforese em gel de agarose. O gel foi preparado usando agarose L03 "TAKARA" (Takara Shuzo Co., Ltd., Japão). Após electroforese, o gel foi embebido em ácido clorídrico 0,25N (fabricado por Wako Pure Chemicals Industries, Ltd.) e incubado à temperatura ambiente durante 10 minutos com agitação suave. O gel foi transferido para hidróxido de sódio 0,4N (produzido por Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), e incubado à temperatura ambiente, durante 30 minutos, com agitação suave. Usando o método da transferência alcalina de Maniatis et al. (supra), o DNA no gel foi transferido para uma membrana de nylon Hybond™ -N+ (fabricada pela Amersham) e fixado. A membrana foi lavada com SSC 2X (SSC lx contem NaCl 150 mM, citrato de sódio 15 mM) e depois seco ao ar. 2) Hibridação e detecção de sinal A membrana obtida no passo 1) foi hibridada com o fragmento do gene PKS obtido no Exemplo 4 como sonda. 66 ΡΕ1149919

Para a sonda, 1 μς do fragmento de DNA do gene PKS obtido no Exemplo 4 foi marcado com o kit de marcação "DIG DNA Labeling kit" (fabricado pela Boehringer-Mannheim) e foi fervido durante 10 minutos e depois rapidamente arrefecido antes de usar. A membrana descrita no passo 1) foi embebida em liquido de hibridação (DIG Easy Hybond, fabricado pela Boehringer-Mannheim) e depois sujeito a pré-hibridação com agitação a 20 rpm, a 42°C, durante 2 horas. Em seguida, a sonda marcada atrás referida foi adicionada ao líquido de hibridação e a hibridação foi efectuada com agitação a 20 rpm a 42°C durante 18 horas usando o Multishaker Oven HB (fabricado por TAITEC). A membrana sujeita a hibridação foi então submetida a três lavagens usando SSC 2X, à temperatura ambiente, durante 20 minutos, e duas lavagens usando SSC 0,1X, a 55° durante 30 minutos. A membrana lavada foi tratada com o kit de detecção de luminescência "DIG Luminescent Detection Kit for Nucleic Acids" (fabricado pela Boehringer-Mannheim) e exposta a filme de raios X (Lumifilm, fabricado pela Boehringer-Mannheim). A exposição foi realizada com o processador de películas médicas Fuji FPM 800A (fabricado pela Fuji Film).

Como resultado, confirmou-se que o fragmento do gene PKS obtido no Exemplo 4 existia no genoma de

Penicillium citrinum. 67 PE1149919

Exemplo 6: Rastreio da biblioteca de DNA genómico de Penicillium citrinum SANK13380 usando como sonda o fragmento do gene PKS A clonagem de uma fragmento de DNA genómico contendo um gene PKS foi realizada usando um método de hibridação de colónias. 1) Preparação da membrana A solução de células de Escherichia coli, mantida como uma biblioteca de DNA genómico de Penicillium citrinum SANK13380 (descrita no Exemplo 3), foi diluída e espalhada sobre uma placa de meio LB com agar, de forma a crescerem 5000 a 10000 colónias por placa. A placa foi mantida a 26°C durante 18 horas e arrefecida a 4°C durante uma hora. Hybond™ - N+ (fabricado pela Amersham) foi colocado sobre a placa e posto em contacto com ela durante um minuto. A membrana sobre a qual as colónias aderiram foi cuidadosamente removida da placa. A superfície que tinha estado em contacto com as colónias foi virada para cima e embebida em 200 ml de uma solução de cloreto de sódio 1,5M, hidróxido de sódio 0,5 N durante 7 minutos e depois embebida em 200 ml de uma solução de cloreto de sódio 1,5M, Tris ácido clorídrico 0,5M, EDTA 1 mM (pH 7,5) durante três minutos e depois lavada com 400 ml de SSC 2X. A membrana lavada foi seca ao ar durante 30 minutos. 2) Hibridação 68 PE1149919 0 DNA do inserto do gene PKS obtido no Exemplo 4 (1 μρ) foi usado como sonda. 0 DNA foi marcado usando o kit de marcação "DIG DNA Labeling kit" (fabricado pela Boehringer-Mannheim) e foi fervido durante 10 minutos e depois rapidamente arrefecido antes de usar. A membrana descrita no passo 1) foi embebida em líquido de hibridação (DIG Easy Hybond, fabricado pela Boehringer-Mannheim) e depois sujeita a pré-hibridação com agitação a 20 rpm, a 42°C, durante 2 horas. Em seguida, a sonda marcada atrás referida foi adicionada ao líquido de hibridação e a hibridação foi efectuada com agitação a 20 rpm a 42°C durante 18 horas usando o Multishaker Oven HB (fabricado por TAITEC Corporation). A membrana sujeita a hibridação foi então submetida a três lavagens usando SSC 2X à temperatura ambiente, durante 20 minutos e duas lavagens com SSC 0,1X a 55° durante 30 minutos. A membrana lavada foi tratada com o kit de detecção de luminescência "DIG Luminescent Detection Kit for Nucleic Acids" (fabricado pela Boehringer-Mannheim) e exposto a filme e raios X (Lumifilm, fabricado pela Boehringer-Mannheim). A exposição foi realizada com o processador de películas médicas Fuji FPM 800A (fabricado pela Fuji Film).

Os passos 1) e 2) atrás são referidos como

Rastreio.

As colónias na placa em que foi detectado o sinal 69 PE1149919 positivo no primeiro rastreio foram raspadas e as células recuperadas ressuspensas em meio LB. Em seguida, as células foram diluídas e espalhadas numa placa adequada. Subsequentemente, um segundo rastreio foi efectuado para purificar o clone positivo. 0 clone positivo obtido no presente exemplo, nomeadamente de Escherichia coli transformada, Escherichia coli estirpepML48 SANK71199 foi depositado no "Research Institute of Life Science and Technology of the Agency of Industrial Science and Technology", em 7 de Julho de 1999, com o número de depósito FERM BP-6 780 de acordo com o Tratado de Budapeste sobre depósito de microrganismos.

Exemplo 7: Análise da sequência inserida de um vector de DNA recombinante pML48 (1) A cultura de Escherichia coli estirpe pML48 SANK7119 obtida no Exemplo 6 e a preparação de um vector de DNA recombinante a partir da cultura foram realizadas de forma semelhante ao descrito no Exemplo 4. 0 vector de DNA obtido foi designado como pML48. 0 inserto do pML48, que é um DNA genómico relacionado com a biossíntese de ML-236B, foi digerido com várias enzimas de restrição e os fragmentos resultantes subclonados em pUC119 (fabricado por Takara Shuzo Co., Ltd. Japão). Usando os subclones resultantes como sondas, a transferência para membrana e hibridação Southern foi realizada por um método semelhante ao descrito no Exemplo 5. Nomeadamente, os 70 PE1149919 produtos obtidos por digestão de pML48 com várias enzimas de restrição foram sujeitos a electroforese e os DNAs foram transferidos para uma membrana e sujeitos a hibridação. Como resultado, foi construído um mapa de locais de restrição da sequência inserida no pML48 usando técnicas conhecidas na área. A sequência nucleotídica da sequência inserida de cada um dos subclones foi determinada usando o sequenciador de DNA modelo 377 (fabricado pela Perkin Elmer Japan Co. Ltd.), seguido da determinação da totalidade da sequência nucleotídica de pML48. A sequência inserida do pML48 consistiu num total de 34203 bases. A sequência nucleotídica da sequência inserida do pML48 está descrita em SEQ ID NOS: 1 e 2 da Listagem de Sequências. A sequência descrita em SEQ ID NOS: 1 e 2 da Listagem de Sequências são totalmente complementares uma da outra. A presença de genes estruturais, na sequência do inserto de pML48, foi analisada usando um programa de pesquisa de genes GRAIL (ApoCom GRAIL Toolkit: produzido pela Apocom) e um programa de pesquisa de homologia BLAST (Gapped-BLAST (BLAST2): instalado no pacote WISCONSIN GCG ver.10.0).

Como resultado, foi prevista a existência de seis 71 ΡΕ1149919 genes estruturais diferentes na sequência inserida de pML48 e foram designados mlcA, mlcB, mlcC, mlcD, mlcE e mlcR, respectivamente. Ainda, foi previsto que mlcA, mlcB, mlcE e mlcR possuem uma região codificadora na sequência nucleotidica de SEQ ID NO: 2 da Listagem de Sequências e mlcC e mlcD possuem uma região codificadora na sequência nucleotidica de SEQ ID NO: 1 da Listagem de Sequências. Foram igualmente previstos a posição relativa e o comprimento de cada um dos genes estruturais deduzidos da sequência inserida.

Os resultados do presente invento estão apresentados na Figura 2. Cada uma das setas indica a localização, direcção e tamanho relativo de cada um dos genes estruturais no inserto de pML48. Uma seta que aponta para a esquerda indica a existência de uma região codificadora de um gene estrutural (mlcA, B, E ou R) em SEQ ID NO: 2. Uma seta que aponta para a direita indica a existência de uma região codificadora de um gene estrutural (mlcC ou D) em SEQ ID NO: 1.

Exemplo 8: Análise da sequência inserida de um vector de DNA recombinante pML48 (2) A análise da expressão dos genes estruturais, cuja existência foi prevista no Exemplo 7, foi realizada por transferência para membrana e hibridação Northern e RACE. Foi realizada a análise das regiões dos extremos 5' e 72 PE1149919 1) Preparação de RNA total de Penicillium citrinum SANK13380

As células de um quadrado de 5 mm na cultura em agar inclinado de Penicillium citrinum SANK13380 (descrita no Exemplo 2) foram inoculadas em 10 ml de meio MGB3-8 num erlenmeyer de 100 ml e incubadas a 26°C durante 3 dias com agitação. A preparação de RNA total a partir da cultura foi realizada com o kit "Rneasy Plant Mini Kit" (fabricado pela Qiagen AG) que usa o método de isotiocianato de guanidina. Nomeadamente, a cultura foi centrifugada à temperatura ambiente a 5000 xg durante 10 minutos para recuperar as células. Subsequentemente, 2 g (peso molhado) das células foram congeladas em azoto liquido e depois trituradas num almofariz para formar um pó. As células trituradas foram suspensas em 4 ml de tampão de lise (incluso no kit) . 450 μΐ da suspensão foram vertidos sobre 10 colunas de centrifugação QIAshredder contidas no kit e depois centrifugados à temperatura ambiente, a 1000 xg, durante 10 minutos. Cada um dos eluatos resultantes foi recuperado e adicionou-se 225 μΐ de etanol, sendo em seguida aplicado numa coluna "RNA mini spin" também inclusa no kit. A coluna foi lavada com tampão de lavagem contido no kit, seguido de eluição do material adsorvido em cada coluna com 50 μΐ de água destilada sem ribonucleases. O eluato foi usado como fracção de RNA total. 2) Transferência para membrana e hibridação

Northern 73 ΡΕ1149919

Uma amostra de RNA foi produzida adicionando 2,25 μΐ de uma solução aquosa contendo 20 μ9 de RNA total de Penicillium citrinum SANK13380 a um μΐ de MOPS 10X (composição: ácido 3-morfolinopropanossulfónico 200 mM, acetato de sódio 50 mM, EDTA.2Na 10 mM; pH 7,0; usado após esterilização a 121°C durante 20 minutos num autoclave; fabricado pela Dojinkagaku Laboratory Co. Ltd.), 1,75 μΐ de formaldeido, seguido de mistura. A amostra de RNA foi mantida a 65°C durante 10 minutos, depois rapidamente arrefecida em água com gelo e sujeita a electroforese em gel de agarose. O gel para a electroforese foi preparado misturando 10 ml de MOPS 10X e um grama de Agarose L03 "TAKARA" (fabricado por Takara Shuzo Co., Ltd. Japão) com 72 ml de água tratada com éster dietilico do ácido pirocarbónico (produzido pela Sigma Corporation), aquecido para dissolver a agarose e depois arrefecido, seguido da adição de 18 ml de formaldeido. Como tampão de amostra usou-se MOPS IX (preparado diluindo MOPS 10X com 10 volumes de água) . O RNA no gel foi transferido para Hybond™-N+ (produzido pela Amersham Corporation) em SSC 10X.

Os fragmentos de DNA a, b, c, d e e, obtidos por digestão da sequência do inserto de pML48 com as enzimas de restrição 1 e 2 apresentadas na Tabela 1 que se segue, foram usados como sondas. A localização de cada sonda no inserto de pML48 está apresentada no painel superior da Figura 3.

Tabela 1 74 ΡΕ1149919

Sonda para hibridação de transferências Northern

Sonda Enzima de restrição 1 N° do nucleótido do local da enzima de restrição* Enzima de restrição 2 N° do nucleótido do local da enzima de restrição* a EcoRI 6319 a 6324 EcoRI 15799 a 15804 b BamHI 16793 a 16798 PstI 18164 a 18169 c Kpnl 26025 a 26030 BamHI 27413 a 27418 d Sall 28691 a 28696 Sall 29551 a 29556 e HindIII 33050 a 33055 Saci 34039 a 34044 * Cada n° de nucleótido existe em SEQ ID NO: 1 da Listagem de Sequências A marcação das sondas, hibridação e detecção do sinal foram realizadas de acordo com a transferência para membranas e hibridação Southern descrita no Exemplo 5.

Os resultados do Exemplo estão apresentados no painel inferior da Figura 3.

Cada um dos sinais mostra a existência de um produto de transcrição homólogo da sequência nucleotidica de cada sonda.

Os resultados sugerem que os genes estruturais deduzidos na sequência do inserto de pML48 no presente exemplo, nomeadamente mlcA, mlcB, mlcC, mlcD, mlcE e mlcR, foram transcritos em Penicillium citrinum SANK13380. A posição de cada sinal não mostra o tamanho 75 ΡΕ1149919 relativo do produto de transcrição.

3) Determinação do extremo 5' da sequência de acordo com 5'RACE 0 cDNA contendo a região do extremo 5' de cada gene estrutural foi obtido usando o sistema 5'RACE para amplificação rápida de extremos de cDNA ("5' RACE System for Rapid Amplification of cDNA ends", Versão 2.0) (fabricado pela GIBCO).

Foram produzidos dois tipos de DNAs oligonucleotidicos complementares da cadeia codificadora. A projecção baseou-se na sequência nucleotidica deduzida para a região codificadora e perto do extremo 5' de cada gene estrutural no inserto de pML48, conforme previsto pelos resultados do Exemplo 7 e no ponto 2) do presente exemplo. A sequência nucleotidica do DNA oligonucleotidico complementar da cadeia codificadora (1) desenhado com base na sequência nucleotidica do extremo 3' de cada gene estrutural está apresentada na Tabela 2. A sequência nucleotidica do DNA oligonucleotidico complementar da cadeia codificadora (2), projectado com base na sequência nucleotidica do extremo 5' de cada gene estrutural está apresentada na Tabela 3. 76 ΡΕ1149919

Tabela 2: DNA oligonucleotídico (1) usado para determinação da sequência do extremo 5' de acordo com 5'RACE

Gene SEQ id NO: Da Listagem de Sequências Sequência nucleotidica mlcA SEQ ID NO:5 gcatgttcaatttgctctc mlcB SEQ ID NO:6 ctggatcagacttttctgc mlcC SEQ ID NO:7 gtcgcagtagcatgggcc mlcD SEQ ID NO:8 gtcagagtgatgctcttctc mlcE SEQ ID NO:9 gttgagaggattgtgagggc mlcR SEQ ID NO:10 ttgcttgtgttggattgtc

Tabela 3: DNA oligonucleotidico (2) usado para determinação da sequência do extremo 5' de acordo com 5'RACE

Gene SEQ ID NO: Da Listagem de Sequências Sequência nucleotidica mlcA SEQ ID NO:11 catggtactctcgcccgttc mlcB SEQ ID NO:12 ctccccagtacgtaagctc mlcC SEQ ID NO:13 ccataatgagtgtgactgttc mlcD SEQ ID NO:14 gaacatctgcatccccgtc mlcE SEQ ID NO:15 ggaaggcaaagaaagtgtac mlcR SEQ ID NO:16 agattcattgctgttggcatc A primeira cadeia de cDNA foi sintetizada de acordo com uma reacção de transcrição reversa usando o DNA oligonucleotidico (1) como sonda, e RNA total de Penicillium citrinum SANK13380 como matriz. Nomeadamente, 24 μΐ da mistura de reacção compreendendo um pg de RNA total, 2,5 pmoles de DNA oligonucleotidico (1) e um μΐ de 77 ΡΕ1149919 transcriptase reversa SUPER SCRIPT™II (incluída no kit) foram incubados a 16°C durante uma hora e o produto de reacção foi adicionado a uma cassete de centrifugação GLASSMAX contida no kit, para purificar a primeira cadeia de cDNA.

Uma cadeia poli C foi adicionada ao extremo 3' da primeira cadeia de cDNA usando transferase terminal de desoxirribonucleotidilo inclusa no kit. 50 μΐ da mistura de reacção compreendendo a primeira cadeia de cDNA à qual foi adicionada a cadeia poli C do extremo 3', foram misturados com 40 pmoles de DNA oligonucleotídico (2) e 40 pmoles de "Abriged Anchor Primer" (contido no kit), seguido de incubação a 94°C durante dois minutos. O ciclo de incubação de 30 segundos a 94°C, 30 segundos a 55°C e dois minutos a 72°C, foi então repetido 35 vezes, seguido de incubação a 72°C durante 5 minutos e 4°C durante 18 horas. O produto resultante foi sujeito a electroforese em gel de agarose e o DNA foi recuperado do gel. O produto foi purificado por extracção com fenol-clorofórmio e precipitação com etanol e clonado de forma semelhante ao método descrito no Exemplo 4 usando pCR2.1. A operação descrita atrás é 5'-RACE. A sequência nucleotídica do fragmento de cDNA contendo o extremo 5' foi determinada e a posição do ponto de iniciação da transcrição e o codão de iniciação da 78 ΡΕ1149919 tradução foram previstos. A Tabela 4 mostra a "SEQ ID NO:" em que a sequência nucleotidica do fragmento de cDNA do extremo 5' correspondendo a cada gene estrutural obtido por 5'RACE está descrita. A Tabela 5 mostra a "SEQ ID NO:" em que existem o ponto de iniciação da transcrição e o ponto de iniciação da tradução de cada gene estrutural e a posição do ponto de iniciação da transcrição e ponto de iniciação da tradução.

Tabela 4: "SEQ ID NOS:" em que está apresentada a sequência nucleotidica do extremo 5' do fragmento de cDNA

Gene SEQ ID NO: da Listagem de Sequências mlcA SEQ ID NO: 17 mlcB SEQ ID NO: 18 mlcC SEQ ID NO: 19 mlcD SEQ ID NO: 20 mlcE SEQ ID NO: 21 mlcR SEQ ID NO: 22 79 PE1149919

Tabela 5: Posição do ponto de iniciação da transcrição e do ponto de iniciação da tradução de cade gene

Gene N°. SEQ ID NO: em que existe o codão de iniciação da tradução Número do nucleótido em SEQ ID NO:1 ou SEQ ID NO:2 Ponto de iniciação da transcrição Codão de iniciação da tradução mlcA SEQ ID NO:2 22913 23045 a 23047 mlcB SEQ ID NO:2 11689 11748 a 11750 mlcC SEQ ID NO:1 111631 11796 a 11798 mlcD SEQ ID NO:1 24066 24321 a 24323 mlcE SEQ ID NO:2 3399 3545 a 3547 mlcR SEQ ID NO:2 365 400 a 402 * As sequências nucleotidicas mostradas em SEQ ID NO: 1 e 2 da Listagem de Sequências são totalmente complementares uma da outra.

4) Determinação da sequência do extremo 3' de acordo com 3'RACE cDNA contendo a região do extremo 3' de cada gene estrutural foi obtido usando o kit "Ready To Go: T-Primed First-Strand kit" (fabricado pela Pharmacia).

Foi produzido um tipo de DNA oligonucleotidico codificador (3) presumido como estando na região 80 PE1149919 codificadora e perto do extremo 3' em cada gene estrutural na sequência do inserto de pML48, previsto dos resultados do Exemplo 7 e do item 2) do presente exemplo. A sequência nucleotidica do DNA oligonucleotídico (3) produzido para cada gene estrutural está apresentada na Tabela 6.

Tabela 6: DNA oligonucleotídico (3) usado para determinação da sequência do extremo 3' de acordo com 3'-RACE

Gene SEQ ID NO: Da Listagem de Sequências Sequência nucleotidica mlcA SEQ ID NO:23 atcataccatcttcaacaac mlcB SEQ ID NO:24 gctagaataggttacaagcc mlcC SEQ ID NO:25 acattgccaggcacccagac mlcD SEQ ID NO:26 caacgccaagctgccaatc mlcE SEQ ID NO:2 7 gtcttttcctactatctacc mlcR SEQ ID NO:28 ctttcccagctgctactatc A primeira cadeia de cDNA foi sintetizada através de reacção de transcrição reversa usando a sequência iniciadora NotI-d(T)18 (contida no kit) e RNA total de Penicillium citrinum SANK13380 (um pg) como matriz. 100 μΐ da mistura de reacção compreendendo a primeira cadeia de cDNA, 40 pmoles de DNA oligonucleotídico (3) e a sequência iniciadora Noti-d(T)18 (inclusa no kit) foram mantidos a 94°C durante dois minutos. Um ciclo de incubação de 30 segundos a 94°C, 30 segundos a 55°C e dois 81 ΡΕ1149919 minutos a 72°C foi repetido 35 vezes, seguido de incubação a 72°C durante cinco minutos e a 4°C durante 18 horas. 0 produto resultante foi sujeito a electroforese em gel de agarose e o DNA foi então recuperado do gel. 0 produto foi purificado por extracção com fenol-clorofórmio e precipitação com etanol e clonado de forma semelhante ao método descrito no Exemplo 4 usando pCR2.1. A operação descrita atrás é 3'-RACE. A sequência nucleotidica do cDNA no extremo 3' foi determinada e a posição do codão de iniciação da tradução foi prevista. A Tabela 7 mostra a "SEQ ID NO:" da Listagem de Sequências em que é descrita a sequência nucleotidica do extremo 3' do fragmento de cDNA correspondendo a cada gene estrutural obtido por 3'-RACE. A Tabela 8 mostra o codão de terminação da tradução e a posição do codão baseada em SEQ ID NOS: 1 e 2 da Listagem de Sequências. 82 PE1149919

Tabela 7: SEQ ID NOS: em que está apresentada a sequência nucleotídica do extremo 3' do fragmento de cDNA

Gene SEQ ID NO: da Listagem de Sequências mlcA SEQ ID NO: 29 mlcB SEQ ID NO: 30 mlcC SEQ ID NO: 31 mlcD SEQ ID NO: 32 mlcE SEQ ID NO: 33 mlcR SEQ ID NO: 34

Tabela 8: Codão de terminação da tradução e posição do codão de terminação de cada gene estrutural

Gene Codão de terminação da tradução SEQ ID NO: em que existe o codão de terminação da tradução N° de nucleótido do codão de terminação da tradução em SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2 mlcA tag SEQ ID NO:2 32723 a 32725 mlcB taa SEQ ID NO:2 19840 a 19842 mlcC taa SEQ ID NO:1 13840 a 13481 mlcD tga SEQ ID NO:1 27890 a 27892 mlcE tga SEQ ID NO:2 5730 a 5732 mlcR tag SEQ ID NO:2 1915 a 1971 * As sequências nucleotidicas mostradas em SEQ ID NO: 1 e 2 da Listagem de Sequências são totalmente complementares uma da outra. 83 ΡΕ1149919 A Tabela 9 mostra o resíduo de aminoácido exterminai do polipeptídeo previsto como sendo codificado por cada gene estrutural, a sequência nucleotídica do trinucleótido codificador do resíduo de aminoácido e a posição do trinucleótido.

Tabela 9: Resíduo de aminoácido C-terminal do polipeptídeo codificado por cada gene estrutural

Gene Resíduo de aminoácido C-terminal Sequência nucleotídia do trinucleótido codificador do aminoácido SEQ ID em que existe o trinucleótido N° de Nucleótido do trinucleótido em SEQ ID 1 ou 2 mlcA Alanina gee SEQ ID NO:2 32720 a 32722 mlcB Serina agt SEQ ID NO:2 19837 a 19839 mlcC Cisteína tgc SEQ ID NO:1 13476 a 13478 mlcD Arginina ege SEQ ID NO:1 27887 a 27889 mlcE Alanina gct SEQ ID NO:2 5727 a 5729 mlcR alanina gct SEQ ID NO:2 1912 a 1914 * As sequências nucleotídicas mostradas em SEQ ID NO: 1 e 2 da Listagem de Sequências são totalmente complementares uma da outra. A Tabela 10 resume a sequência complementar do codão de terminação da tradução mostrado na Tabela 8, a SEQ ID em que a sequência complementar existe e a posição da sequência complementar. 84 ΡΕ1149919

Tabela 10: Sequência complementar do codão de iniciação da tradução de cada gene estrutural

Gene Sequência complementar do codão de terminação da tradução SEQ ID NO: em que existe a sequência complementar No. do Nucleótido da sequência complementar em SEQ ID NO:1 OU SEQ ID NO:2 mlcA Cta SEQ ID NO:1 1479 a 1481 mlcB Tta SEQ ID NO:1 14362 a 14364 mlcC Tta SEQ ID NO:2 20723 a 20725 mlcD Tca SEQ ID NO:2 6312 a 6314 mlcE Tca SEQ ID NO:1 28472 a 28474 mlcR cta SEQ ID NO:1 32287 a 32289 * As sequências nucleotidicas mostradas em SEQ ID NO: 1 e 2 da Listagem de Sequências são totalmente complementares uma da outra.

Como descrito atrás, a posição de cada gene estrutural, a sua direcção e a sua posição foram determinadas. Baseado na informação dada, pode ser obtido o produto de transcrição e o produto de tradução de cada gene estrutural.

Exemplo 9: Obtenção de cDNA correspondendo ao gene estrutural mlcE 1) Preparação de RNA total RNA total de Penicillium citrinum foi preparado 85 ΡΕ1149919 de acordo com o método do Exemplo 8. 2) Projecção da sequência iniciadora

Para obter um cDNA de tamanho completo correspondendo ao gene estrutural mlcE determinado no Exemplo 8, foram projectadas e sintetizadas as seguintes sequências iniciadoras:

Sequência iniciadora codificadora 5'- gttaacatgtcagaacctctaccccc-3' (Ver SEQ id 35 da Listagem de

Sequências) e

Sequência iniciadora complementar da sequência codificadora 5'-aatatttcaagcatcagtctcaggcac-3' (Ver SEQ ID 36 da

Listagem de Sequências).

As sequências iniciadoras são derivadas, respectivamente, da sequência na região a montante do extremo 5' do gene estrutural mlcE e da sequência da região a jusante do extremo 3'. A síntese foi realizada de acordo com o método de fosforamideto. 3) RT -PCR Para obter um cDNA de codificador do produto do gene mlcE "Takara RNA LA PCR kit" (AMV) Ver. 1.1. tamanho completo foi usado o kit

Especificamente, 20 μΐ de uma mistura de reacção 86 ΡΕ1149919 compreendendo um μρ de RNA total, 2,5 pmoles de sequência iniciadora 9meros ao acaso (incluído no kit) foi incubado a 42°C, durante 30 minutos, para produzir a primeira cadeia de cDNA. A enzima de transcrição reversa foi então desactivada por aquecimento a 99°C durante cinco minutos. 100 μΐ de uma segunda mistura de reacção compreendendo a quantidade total da mistura de reacção da primeira cadeia de cDNA (atrás), 40 pmoles de sequência iniciadora codificadora e 40 pmoles de sequência iniciadora complementar da sequência codificadora foram incubados a 94°C durante dois minutos. Um ciclo de incubação de 30 segundos a 94°C, 30 segundos a 60°C e dois minutos a 72°C foi repetido 30 vezes, seguido de incubação a 72°C durante cinco minutos e a 4°C durante 18 horas. O produto resultante foi sujeito a electroforese em gel de agarose e o DNA recuperado do gel. O produto foi purificado por extracção com fenol-clorofórmio e precipitação com etanol e usado para transformar células competentes de Escherichia coli estirpe JM109 (fabricado por Takara Shuzo Co., Japão) de forma semelhante ao método descrito no Exemplo 4 usando pCR2.1. Um transformante portador de um plasmídeo tendo o fragmento de DNA foi seleccionado a partir de Escherichia coli transformada e o plasmídeo do transformante foi designado pCRexpE. A sequência nucleotídica do DNA inserido no vector de DNA recombinante resultante pCRexpE foi determinada. O DNA inserido continha cDNA de tamanho completo correspondendo ao gene estrutural mlcE. A sua 87 ΡΕ1149919 sequência nucleotídica e uma sequência de aminoácidos do peptídeo deduzida da sequência nucleotídica estão apresentados em SEQ ID NO: 37 e/ou SEQ ID NO: 38 da Listagem de Sequências. A sequência conhecida mais próxima para mlcE (polipeptideo) foi a ORFIO no grupo de genes relacionado com a biossíntese de lovastatina, com 70% de identidade.

Exemplo 10: Construção do vector de expressão pSAK700 O vector de expressão de cDNA pSAK700 foi construído usando os vectores pSAK333 e pSAK360 descrito no Exemplo 1. pSAK333 foi digerido com as enzimas de restrição BamHI e Hindlll (fabricadas por Takara Shuzo Co., Ltd, Japão) e depois sujeito a electroforese em gel de agarose. Um fragmento de 4,1 Kb foi recuperado do gel e os extremos do fragmento de DNA foram tornados cerses com polimerase do DNA de T4 (produzida por Takara Shuzo Co., Ltd., Japão).

Um adaptador EcoRI-NotI-BamHI (produzido por Takara Shuzo Co., Ltd., Japão) foi ligado ao fragmento de DNA atrás referido usando o kit de ligação de DNA (fabricado por Takara Shuzo Co., Ltd., Japão). Células competentes de Escherichia coli estirpe JM109 (produzidas por Takara Shuzo Co., Ltd., Japão) foram transformadas com o DNA ligado. Um transformante portador do plasmídeo tendo 88 ΡΕ1149919 o adaptador foi seleccionado a partir da Escherichia coli transformada e o plasmídeo do transformante foi designado pSAK410. pSAK360 foi digerido com as enzimas de restrição PvuII e SspI e sujeito a electroforese. Um fragmento de DNA (cerca de 2,9 Kb) contendo o promotor e o terminador do gene da 3-fosfoglicerato cinase (daqui em diante referido como "pgk") e HPT derivado de Escherichia coli foi recuperado do gel. 0 fragmento de DNA recuperado atrás referido foi ligado ao local PvuII de pSAK410 usando o kit de ligação de DNA ("DNA ligation kit" Ver.2, fabricado por Takara Shuzo Co., Ltd. Japão). Células competentes de Escherichia coli estirpe JM109 foram transformadas com o DNA ligado. Um transformante portador do plasmideo tendo o fragmento de DNA foi seleccionado a partir de Escherichia coli transformada e o plasmídeo do transformante foi designado pSAK700. A construção de pSAK700 está apresentada na

Figura 4. pSAK700 tem um local de restrição para cada uma das enzimas BamHI e NotI. pSAK700 também tem um gene de resistência à ampicilina (daqui em diante referido como "Amp") e o gene de resistência à higromicina http como marcas de de selecção. Nos exemplos que se seguem, quando Escherichia coli é usada como hospedeiro, a selecção das 89 ΡΕ1149919 células transformadas por pSAK700 ou por pSAK700 compreendendo um inserto de DNA estranho, foi realizada pela adição de 40 pg/ml de ampiclina ao meio em questão. Quando Penicillium citrinum SANK13380 foi usado como hospedeiro, a selecção das células transformadas por pSAK700 ou por pSAK700 compreendendo um inserto de DNA estranho, foi realizada através da adição de 200 pg/ml de higromicina ao meio em questão.

Exemplo 11: Construção do vector de expressão de cDNA pSAKexpE O vector de DNA recombinante pCRexpE obtido no Exemplo 9 reagiu a 37°C durante 2 horas na presença das enzimas de restrição Hpal e SspI (produzidas por Takara Shuzo Co., Ltd., Japão) e o produto de reacção foi sujeito a electroforese em gel de agarose. Uma banda contendo um cDNA de tamanho completo de mlcE com cerca de 1,7 Kb foi recuperada do gel.

Após reacção de pSAK700 com a enzima de restrição Notl (produzida por Takara Shuzo Co., Ltd. Japão) a 37°C durante uma hora, os extremos do vector foram tornados cerses com polimerase do DNA de T4 (Takara Shuzo Co., Ltd., Japão) a 37°C durante 5 minutos. Em seguida, o vector foi sujeito a extracção com fenol-clorofórmio e precipitação com etanol. O DNA precipitado foi dissolvido numa pequena quantidade de TE. A fosfatase alcalina foi adicionada e a mistura incubada a 65°C, durante 30 minutos. pSAK700, preparado como descrito atrás, foi ligado ao fragmento de 90 PE1149919 DNA de 1,7 Kb obtido no passo 1) usando o kit de ligação de DNA8"DNA ligation kit" Ver.2, fabricado por Takara Shuzo Co., Ltd. Japão). Células competentes de Escherichia coli estirpe JM109 foram transformadas com o DNA ligado. Foi obtido um transformante de Escherichia coli transformado pelo vector de expressão de cDNA.

Escherichia coli transformada, desiganda Escherichia coli pSAKexpE SANK 72499, obtida no presente exemplo foi depositada no Research Institute of Life Science and Technology of the Agency of Industrial Science and Technology, em 25 de Janeiro, 2000 com o depósito N° FERM BP-7005, de acordo com o Tratado de Budapeste sobre Depósito de Microrganismos.

Exemplo 12: Obtenção de cDNA correspondendo ao gene estrutural mlcR 1) Preparação de RNA total RNA total de Penicillium citrinum foi preparado de acordo com o método do Exemplo 8. 2) Projecção de sequências iniciadoras

Para obter um cDNA de tamanho completo correspondendo ao gene estrutural mlcR determinado no Exemplo 8, foram projectadas e sintetizadas as seguintes sequências iniciadoras: 91 ΡΕ1149919

Sequência iniciadora codificadora: 5'- ggatccatgtccctgccgcatgcaacgattc-3': (Ver SEQ ID 39 da Listagem de Sequências); e

Sequência iniciadora complementar da cadeia codificadora: 5'-ggatccctaagcaatattgtgtttcttcgc-3': (Ver SEQ ID 40 da Listagem de Sequências).

As sequências iniciadoras foram projectadas a partir da sequência da região a montante do extremo 5' do gene estrutural mlcR e a partir da sequência da região a jusante do extremo 3'. A síntese foi realizada de acordo com o método de fosforamideto.

3) RT-PCR

Para obter um CDNA de tamanho completo codificador do produto do gene mlcR, foi usado o kit "Takara RNA LA PCR kit" (AMV) Ver. 1.1.

Especificamente, 20 μΐ de uma mistura de reacção compreendendo um μρ de RNA total, 2,5 pmoles de sequência iniciadora 9meros ao acaso (incluída no kit) foram incubados a 42°C durante 30 minutos para produzir a primeira cadeia de cDNA. A enzima de transcrição reversa foi então desactivada por aquecimento a 99°C durante cinco minutos. 100 μΐ de uma segunda mistura de reacção compreendendo a quantidade total da mistura de reacção da primeira cadeia de cDNA (atrás), 40 pmoles de sequência 92 ΡΕ1149919 iniciadora codificadora e 40 pmoles de sequência iniciadora complementar da sequência codificadora foram incubados a 94°C durante dois minutos. Um ciclo de incubação de 30 segundos a 94°C, 30 segundos a 60°C e dois minutos a 72°C foi repetido 30 vezes, seguido de incubação a 72°C durante cinco minutos e a 4°C durante 18 horas. O produto resultante foi sujeito a electroforese em gel de agarose e o DNA recuperado do gel. O produto foi purifiado por extracção com fenol-clorofórmio e precipitação com etanol e usado para transformar células competentes de Escherichia coli estirpe JM109 (produzidas por Takara Shuzo Co., Japão) de forma semelhante ao método descrito no Exemplo 4 usando pCR2.1. Um transformante portador de um plasmideo tendo o fragmento de DNA foi seleccionado a partir de Escherichia coli transformada e o plasmideo do transformante foi designado pCRexpR. A sequência nucleotidica do DNA inserido no vector de DNA recombinante resultante pCRexpR foi determinada. O DNA inserido continha cDNA de tamanho completo correspondendo ao gene estrutural mlcR. A sua sequência nucleotidica e uma sequência de aminoácidos do peptideo deduzida da sequência nucleotidica estão apresentadas em SEQ ID NO: 41 e/ou SEQ ID NO: 42 da Listagem de Sequências. A sequência conhecida mais próxima para mlcR (polipeptídeo) foi lovE no grupo de genes relacionado com a biossintese de lovastatina, com 34% de identidade. 93 PE1149919

Exemplo 13: Construção do vector de expressão de cDNA pSAKexpR 0 vector de DNA recombinante pCRexpE obtido no Exemplo 12 reagiu a 37°C, durante 2 horas, na presença da enzima de restrição BamHI (produzida por Takara Shuzo Co., Ltd., Japão) e o produto de reacção foi sujeito a electroforese em gel de agarose. Uma banda contendo um cDNA de tamanho completo de mlcR com cerca de 1,4 Kb foi recuperada do gel.

Após reacção de pSAK700 com a enzima de restrição BamHI (produzido por Takara Shuzo Co., Ltd. Japão) a 37°C durante uma hora, adicionou-se fosfatase alcalina (Takara Shuzo Co., Ltd., Japão) e a reacção decorreu a 65°C durante 30 minutos. pSAK700, digerido com BamHI como descrito atrás, foi ligado ao fragmento de DNA de 1,4 Kb obtido no passo 1) usando um kit de ligação de DNA ("DNA ligation kit Ver.2, fabricado por Takara Shuzo Co., Ltd. Japão). Células competentes de Escherichia coli estirpe JM109 foram transformadas com o DNA ligado. Foi obtido um transformante de Escherichia coli transformado pelo vector de expressão de cDNA.

Escherichia coli transformada, designada Escherichia coli pSAKexpE SANK 72599, obtida no presente exemplo foi depositada no "Research Institute of Life Science and Technology of the Agency of Industrial Science and Technology", em 25 de Janeiro de 2000, com o depósito N° FERM BP-7006, de acordo com o Tratado de Budapeste sobre 94 ΡΕ1149919

Depósito de Microrganismos.

Exemplo 14: Transformação de microrganismos produtores de ML-236B 1) Preparação de protoplastos

Esporos de uma cultura em agar inclinado de Penicillium citrinum estirpe SANK 13380 foram inoculados em meio de agar PGA, depois foram incubados a 26°C durante 14 dias. Os esporos de Penicillium citrinum estirpe SANK 13380 foram então recuperados da cultura e 1 x 108 dos esporos foram inoculados em 80 ml de meio de cultura YPL-20, incubados a 26 °C durante um dia. Após confirmação da germinação dos esporos através da observação ao microscópio, os esporos germinados foram centrifugados à temperatura ambiente a 5000 xg durante dez minutos e recuperados como um precipitado.

Os esporos foram lavados com água esterilizada três vezes e usados para formar protoplastos. Nomeadamente, 200 mg de zimoliase 20T (produzida por Seikagaku Kogyo) e 100 mg de quitinase (produzida por Sigma) foram dissolvidas em 10 ml de solução de cloreto de magnésio 0,55 M, e centrifugadas à temperatura ambiente, a 5000 xg, durante 10 minutos. O sobrenadante resultante foi usado como uma solução enzimática. 20 ml da solução enzimática e 0,5 g (peso molhado) de esporos germinados foram colocados num erlenmeyer de 100 ml e incubados, com agitação suave, a 30°C durante 60 minutos. Após confirmação de que os esporos 95 PE1149919 germinados se tornaram protoplastos usando um microscópio, a solução de reacção foi filtrada através de um filtro de vidro 3G-2 (fabricado pela HARIO) . 0 filtrado foi centrifugado à temperatura ambiente, a 1000 xg, durante 10 minutos e depois os protoplastos foram recuperados como um precipitado. 2) Transformação

Os protoplastos obtidos no passo 1) foram lavados duas vezes com 30 ml de cloreto de magnésio 0,55M e uma vez com 30 ml de uma solução consistindo em cloreto de magnésio 0,55M, cloreto de cálcio 50 mM e 3-morfolinoproprano-sulfonato 10 mM (pH 6,3 ou menos, daqui em diante referido como uma solução MCM). Os protoplastos foram então suspensos em 100 μΐ de uma solução de 4% (p/v) de polietilenoglicol 8000, 3-morfolinopropano-sulfonato 10 mM, 0,0025% (p/v) de heparina (produzida pela Sigma), cloreto de magnésio 50 mM (pH 6,3 ou menos, daqui em diante referido como "solução de transformação"). 96 μΐ de solução de transformação contendo cerca de 5 x 107 protoplastos e 10 μΐ de TE contendo 120 pg de pSAKexpE ou pSAKexpR, foram misturados e deixados em gelo durante 30 minutos. Adicionou-se 1,2 ml de uma solução de 20% (p/v) de polietilenoglicol, cloreto de magnésio 50 mM, ácido 3-morfolinopropranossulfónico 10 mM (pH 6,3). O liquido foi então suavemente pipetado e depois deixado à temperatura ambiente durante 20 minutos. Em seguida adicionou-se 10 ml de solução de MCM, seguido de mistura 96 ΡΕ1149919 suave, e centrifugação à temperatura ambiente a 1000 xg durante 10 minutos. Os protoplastos transformados foram recuperados do precipitado. 3) Regeneração da parede celular dos protoplastos transformados

Os protoplastos transformados obtidos no passo 2) foram suspensos em 5 ml de meio de agar VGS liquido da camada média e semeados em 10 ml de meio de agar VGS solidificado da camada inferior da placa. A placa foi incubada a 26°C durante um dia, após o que foi coberta com 10 ml de meio de agar VGS liquido da camada superior contendo 5 mg de higromicina B por placa (concentração final de higromicina de 200 pg/ml) . Após incubação a 26°C durante 14 dias, ambas as estirpes (i.e. as estirpes derivadas dos protoplastos transformados com pSAKexpE ou pSAKexpR) foram subcultivados em meio de agar PGA contendo 200 pg/ml de higromicina B, e subcultivado em agar inclinado preparado com meio de agar PGA, incubado a 26°C durante 14 dias.

As culturas em agar inclinado foram mantidas a 4°C.

Teste do Exemplo 1: Comparação da capacidade de biossíntese de ML-236B em estirpes transformadas e originais

As estirpes transformadas obtidas no Exemplo 14 e 97 ΡΕ1149919

Penicillium citrinum SANK 13380 foram cultivadas e medida a quantidade de ML-236B em cada cultura.

Um inoculo, consistindo num quadrado de 5 mm de esporos, foi crescido a partir das culturas de agar inclinado em que as estirpes transformadas foram cultivadas, como descrito no Exemplo 14 e a partir do agar inclinado descrito no Exemplo 2, relativo a Penicillium citrinum SANK 13380. As células foram inoculadas em 10 ml de meio MBG3-8 num erlenmeyer de 100 ml, depois incubadas a 24°C durante dois dias com agitação, seguido da adição de 3,5 ml de solução de glicerina a 50% (p/v) . Em seguida, a cultura foi continuada a 24°C durante 10 dias com agitação. A 10 ml da cultura adicionou-se 50 ml de hidróxido de sódio 0,2N, seguido de incubação a 26 °C durante uma hora com agitação. A cultura foi centrifugada à temperatura ambiente a 3000 xg durante dois minutos. Um ml do sobrenadante foi recuperado, misturado com 9 ml de metanol a 75% e submetido a HPLC. SSC-ODS-262 (tendo um diâmetro de 6 mm, 100 mmm de comprimento, fabricado por Senshu Kagaku Co., Ltd.) foi usado como coluna de HPLC e 75% (v/v) metabol - 0,1% (v/v) trietilamina - 0,1% (v/v) de ácido acético foi usado como fase móvel. A eluição foi realizada à temperatura ambiente a um fluxo de 2 ml/minuto. Nestas condições, ML-236B foi eluído 4 minutos após adição à coluna. A detecção foi realizada com um detector de UV a um comprimento de onda de absorção de 236 nm. 98 ΡΕ1149919 A capacidade de biossíntese de ML-236B foi aumentada em três estirpes entre as oito estirpes transformadas com pSAKexpE. A capacidade de biosintese de ML-236B destas estirpes foi 10% superior em média comparativamente com a estirpe original. A capacidade de biossíntese ML-236B destas três estirpes foi igualmente mantida estavelmente após subcultura, como seja tratamento de monosporos ou similares. Estes resultados indicam que o inserto de pSAKexpE é um cDNA acelerador da biossíntese de ML-236B. A capacidade de biossíntese de ML-236B foi aumentada em cinco estirpes entre as estirpes transformadas com pSAKexpR. A capacidade de biosintese de ML-236B destas estirpes foi 15% superior em média comparativamente com a estirpe original. A capacidade de biossíntese ML-236B destas cinco estirpes foi igualmente mantida estavelmente após subcultura, como seja tratamento de monosporos ou similares. Estes resultados indicam que o inserto de pSAKexpR é um cDNA acelerador da biossíntese de ML-236B.

Assim, o cDNA acelerador da biossíntese de ML-236B obtido a partir de microrganismos produtores de ML-236B de acordo com o presente invento, acelera a biossíntese de ML-236B em microrganismos produtores de ML-236B quando introduzido no microrganismo produtor de ML-236B.

Exemplo 15: Determinação da sequência de cDNAs correspondendo aos genes estruturais mlc A-D. 99 ΡΕ1149919

Determinou-se a sequência do cDNA correspondente ao gene estrutural mlcA. A primeira cadeia de cDNA foi sintetizada com o kit "TAKARA LA PCR kit verl.l" (Takara Shuzo Co., Ltd.). Foram realizados vários PCRs para amplificação da região completa ou parcial do cDNA usando a primeira cadeia de cDNA como matriz e vários pares distintos de oligonucleótidos como sequências iniciadoras. 0 ciclo de 30 segundos a 94°C, 30 segundos a 60°C e cinco minutos a 72°C foi repetido 30 vezes usando o kit "Big Dye Primer/Terminator Cycle Sequencing kit" e o sequenciador ABI Prism 377 (PE Applied Biosystems). O produto de cada reacção foi inserido individualmente no plasmideo pCR2.1.

Obtiveram-se transformantes de Escherichia coli para cada plasmideo recombinante.

As sequências nucleotidicas de cada inserto dos plasmideos recombinantes derivados dos referidos transformantes foram determinadas.

As sequências de exões e intrões foram determinadas com base numa comparação da sequência nucleotidica de vários produtos de RT-PCR referidos atrás com a do gene estrutural mlcA. 100 ΡΕ1149919

Em seguida, a sequência do cDNA correspondendo ao gene estrutural mlcA foi determinada (SEQ ID NO: 43). A correspondente sequência de aminoácidos do polipeptideo codificado pelo referido cDNA foi deduzida (SEQ ID NO: 44) e uma função do polipeptideo foi assumida com base na pesquisa de homologia usando a sequência de aminoácidos. A sequência conhecida mais próxima para mlcA (polipeptideo) foi LNKS (ΙονB) no grupo de genes relacionado com a biossintese de lovastatina, com 60% de identidade.

De forma semelhante, determinou-se a sequência de cDNA correspondendo ao gene estrutural mlcB (SEQ ID NO: 45). A sequência de aminoácido correspondente ao polipeptideo codificado pelo referido cDNA foi deduzida (SEQ ID NO: 46) e uma função do polipeptideo foi assumida com base numa pesquisa de homologia usando a sequência de aminoácidos. A sequência conhecida mais próxima para mlcB (polipeptideo) foi LDKS (lovF) no grupo de genes relacionado com a biossintese de lovastatina, com 61% de identidade.

De forma semelhante, determinou-se a sequência de cDNA correspondendo ao gene estrutural mlcC (SEQ ID NO: 47). A sequência de aminoácido correspondente ao polipeptideo codificado pelo referido cDNA foi deduzida (SEQ ID NO: 48) e uma função do polipeptideo foi assumida 101 PE1149919 com base numa pesquisa de homologia usando a sequência de aminoácidos.

A sequência conhecida mais próxima para mlcC (polipeptideo) foi lovA no grupo de genes relacionado com a biossintese de lovastatina, com 72% de identidade.

Ainda, determinou-se a sequência de cDNA correspondendo ao gene estrutural mlcD (SEQ ID NO: 49). A sequência de aminoácido correspondente ao polipeptideo codificado pelo referido cDNA foi deduzida (SEQ ID NO: 50) e uma função do polipeptideo foi assumida com base numa pesquisa de homologia usando a sequência de aminoácidos.

A sequência conhecida mais próxima para mlcD (polipeptideo) foi a ORF8 no grupo de genes relacionado com a biossintese de lovastatina, com 63% de identidade.

As posições dos exões de cada um dos genes estruturais em SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2 foram determinadas, como se segue:

Tabela 11: Posições dos exões de mlcA-D em insertos de pML48 SEQ ID onde existe SEQ ID Número do exão Número de nucleótido de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2 mlcA 2 1 22913 a 22945 2 23003 a 23846 102 ΡΕ1149919 3 23634 a 23846 4 23918 a 24143 5 24221 a 24562 6 24627 a 27420 7 27479 a 27699 8 27761 a 30041 9 30112 a 30454 10 30514 a 30916 11 30972 a 32910 mlcB 2 1 11689 a 12002 2 12106 a 12192 3 12247 a 12304 4 12359 a 12692 5 12761 a 13271 6 13330 a 13918 7 13995 a 20052 MlcC 1 1 11631 a 12140 2 12207 a 12378 3 12442 a 13606 mlcD 1 1 24066 a 24185 2 24270 a 27463 3 27514 a 28130 A posição do local de terminação da transcrição para cada gene estrutural em SEQ ID NO:l ou SEQ ID NO:2 foi determinada como se segue:

Tabela 12: Posição dos locais de terminação da transcrição dos genes estruturais mlcA-E e R nos insertos de pML48 103 PE1149919

Gene SEQ ID NO: onde existe o local de terminação da transcrição Número de nucleótido do local de terminação da transcrição em SEQ ID NO:1 ou SEQ ID NO:2 mlcA SEQ ID NO: 2 32910 mlcB SEQ ID NO: 2 20052 mlcC SEQ ID NO: 1 13606 mlcD SEQ ID NO: 1 28130 mlcE SEQ ID NO: 2 5814 mlcR SEQ ID NO: 2 1918

Exemplo 16: Estudos de destruição de genes

Os genes estruturais mlc A, B ou D de P. citrinum foram interrompidos através de mutagénese dirigida usando recombinação homóloga. O plasmideo recombinante para obtenção do mutante tendo o gene estrutural mlcA de P. citrinum destruído foi construído usando o plasmideo pSAK333.

Um fragmento interno Kpnl de 4,1 Kb do locus mlcA no inserto de pML48 foi recuperado, purificado, dotado de extremos cerses com o "DNA blunting Kit" (Takara Shuzo Co., Ltd.) e foi ligado a pSAK333 digerido com Pvull. O plasmideo resultante foi designado pdismlcA. P. citrinum SANK13380 foi transformado com pdismlcA. 104 ΡΕ1149919 A transferência para membranas e a hibridação Southern de DNA genómico do transformante pdismlcA foram realizadas para confirmar a disrupção do gene estrutural mlcA. O mutante resultante com mlcA destruído não produziu ML-236B ou o seu precursor. O plasmídeo recombinante para obtenção do mutante tendo o gene estrutural mlcB de P. citrinum destruído foi construído usando o plasmídeo pSAK333.

Um fragmento PstI-BamHI de 1,4 Kb do locus mlcB no inserto de pML48 foi recuperado, purificado, dotado de extremos cerses com o "DNA blunting Kit" (Takara Shuzo Co., Ltd.) e foi ligado a pSAK333 digerido com PvuII. O plasmídeo resultante foi designado pdismlcB. P. citrinum SANK13380 foi transformado com pdismlcB. A transferência para membranas e a hibridação

Southern de DNA genómico do transformante pdismlcB foram realizadas para confirmar a disrupção do gene estrutural mlcB. O mutante resultante com mlcB destruído não produziu ML-236B, mas sim ML-236A, o precursor de ML-236B. O plasmídeo recombinante para obtenção do mutante tendo o gene estrutural mlcD de P. citrinum destruído foi 105 ΡΕ1149919 construído usando o plasmídeo pSAK333.

Um fragmento Kpnl-BamHI de 1,4 Kb do locus mlcD no inserto de pML48 foi recuperado, purificado, dotado de extremos cerses com o "DNA blunting Kit" (Takara Shuzo Co., Ltd.) e foi ligado a pSAK333 digerido com PvuII. O plasmídeo resultante foi designado pdismlcD. P. citrinum SANK13380 foi transformado com pdismlcD. A transferência para membranas e a hibridação Southern de DNA genómico do transformante pdismlcD foram realizadas para confirmar a disrupção do gene estrutural mlcD. A quantidade de ML-236B produzida pelo mutante resultante com mlcD destruído foi cerca de 30% da produzida pelo hospedeiro controlo não transformado.

Exemplo 17: Análise funcional de mlcR nos transformantes pSAKexpR

Dois dos transformantes com pSAKexpR que foram obtidos no Exemplo 12, designados TRl e TR2 respectivamente e células hospedeiras não transformadas, Penicillium citrinum SANK13380, foram inoculados em meio MBG3-8 e incubado individualmente como descrito no Exemplo 8. RNA total foi extraído a partir de cada uma das 106 PE1149919 culturas descritas no Exemplo 8.

Realizou-se RT-PCR usando RNA total como matriz e e como sequências iniciadoras um par de oligonucleótidos projectados com base na sequência nucleotidica dos genes estruturais mlc A, B, C, D, E ou R.

Tabela 13: Sequências nucleotidicas de pares de sequências iniciadoras para RT-PCR.

Alvo de RT-PCR Sequência iniciadora 1 SEQ ID NO: Sequência iniciadora 2 SEQ ID NO: ml cA 5 ' - gcaagctctgctaccagcac-3 ' 51 5'- ctaggccaacttcagagccg- 3' 52 mlcB 5 ' - agtcatgcaggatctgggtc-3' 53 5'- gcagacacatcggtgaagtc- 3' 54 mlcC 5'aaaccgcacctgtctattcc-3 ' 55 5'- ctttgtggttggatgcatac- 3' 56 mlcD 5 ' - cgctctatcatttcgaggac-3' 57 5'- tcaatagacggcatggagac- 3' 58 mlcE 5 ' - atgtcagaacctctaccccc-3 ' 59 5'- tcaagcatcagtctcaggca- 3' 60 mlcR 5 ' - atgtccctgccgcatgcaac-3 ' 61 5'- ctaagcaatattgtgtttct- 3' 62 107 ΡΕ1149919

Os resultados da análise RT-PCR estão apresentados na Figura 5 para Penicillium citrinum 13380 não transformado e para os dois transformantes designados TRl e TR2.

Os genes estruturais mlc A, B, C, D e R foram expressos no primeiro, segundo e terceiro dia de cultura dos transformantes pSAKexpR.

Pelo contrário, todos estes genes estruturais foram expressos apenas no terceiro dia de cultura nas células hospedeiras não transformadas. Não houve diferença na expressão do gene estrutural mlcE entre transformantes pSAKexpR e células hospedeiras não transformadas.

Os resultados sugerem que uma proteína codificada pelo cDNA correspondendo a um gene estrutural mlcR induza transcrições de alguns dos outros genes estruturais (por exemplo, mlc A, B, C, D) situados no grupo de genes relacionados com a biossíntese de ML-236B.

Exemplo 18: Análise funcional de mlcE nos transformantes pSAKexpE

Um transformante pSAKexpE designado TEl que foi obtido no Exemplo 12, e células hospedeiras não transformadas, Penicillium citrinum SANK13380, foram 108 ΡΕ1149919 inoculados em meio MBG3-8 e incubados individualmente como descrito no Exemplo 8. RNA total foi extraído de cada uma das culturas descritas no Exemplo 8. RT-PCR foi realizado usando o referido RNA total como matriz e como sequências iniciadoras um par de oligonucleótidos projectados com base na sequência nucleotídica dos genes estruturais mlc A, B, C, D, E ou R. As sequências iniciadoras usadas no presente exemplo foram idênticas às da tabela do Exemplo anterior.

Os resultados de RT-PCR estão apresentados na Figura 6 para Penicillium citrinum não transformado e para um transformante designado TEl. O gene estrutural mlc E foi expresso no primeiro, segundo e terceiro dia de cultura nos transformantes pSAKexpE.

Pelo contrário, o gene estrutural mlc E foi expresso apenas no terceiro dia de cultura das células hospedeiras não transformadas.

Por outro lado, não houve diferença na expressão dos genes estruturais mlc A, B, C, D e R entre o transformante pSAKexpE e células hospedeiras não transformadas (dados não apresentados).

Os resultados sugerem que uma proteína codificada 109 ΡΕ1149919 E acelera a dos genes pelo cDNA correspondente ao gene estrutural mlc biossíntese de ML-236B independentemente estruturais mlc A, B, C, D e R. <110> Sankyo Company Limited <120> Genes derivados de um agrupamento de genes <130> EPP83481 <150> JP 2000-116591 <151> 2000-04-18 <150> JP 2000-117458 <151> 2000-04-19 <160> 62 <170> Patentln versão 3.0

<210> 1 <211> 34203 <212> DNA <213> Penicillium citrinum <400> 1 110 PE1149919 gatcaatact acftcfttgt tatctccttg tcaeftaacga cfca&caaatt ceccagâasa &o gacgaagtca cagetcacac caeaagagaa «atgagtcea gcgaggatea cagattfcctc ISO gçcaggeaaa ecgagaaaag ctctcttatgr catccacfgt gcegggtgct cagcageeac 19o attccgcftc eagatetcta aaetgegregt ggcfttgaaa aacgagtttg aattegtatã 240 tgegâcegeg ecgtttagcfc ccãgeecegg acecggcgcg cttccCgtct fcccáãggcat 10© ggfteeacac tacaeefcggfc cccaaaagca teatgacçcc gtcaeaaaeâ cgaeaaceee 36© eacggfcgggc gatagagtag cggctgtgat cgggcefcgtg caaaagaecg tceaagsttg 420 gtet&fcaaet aaeceacaggf escecafctgfc eggestagtg geettetdtg «ggg*gcatt 480 ggfccgeeact tfcgcfcgctcc atcaacagc# aatgggaaaa efcgecatggfc tfcecgaaaat 540 gageactgcfc ffctttgactt gecgttcçca tagçgatgaa gecagagafet aeacgsgafc 600 çgaggcgo&a gacgaçgaegf açsagetaat satçsaçgt.g çcgaesaçtgc acoçtçaçgg ç$© tcgfccaagat fctfcgctcfc.ee aagggtcgag acagatggtt ga&aç&cafct acct.gcct.ea 720 gaãfegcãgafc gtaetcgagt ttcsgggása geataafctfct eecaacagae cgágtgatgfc 7ÃO ccaggagacc gtcaagcgct tecsseagct atateaaaag f&eaáfatgt caggttcat.t 840 tgtctaggfcg agaçaacagg gtatatagca aggetefcggc tetc&tgcct agtccatacc 300 aeãfcfcttfcac tga.â.caaafct tgaâtagfctc taatcttaea eggtfctgaat. geceacetce SCO eáãgggtgat ttagtfcafcag fcggfcegegac eafceteataa afcatfctcgtg aaeetatttt 1020 ggatagatea tgfaaggcte fttctgaasa ggcatgaeag acatctaaaa ccaetegace 1080 aecacaaeaa ggeactsaae eagtMetafc ggaaetactt gcaatggegt çgaattKsfcâ 11*0 çaçaggatgg at tgaaatca ac.tcca.agcc ttggaggttt caccttcctc acagagt.çt.t lio o tcgaaacgeg ctaccgaggt atatttatea cegttacggt actctgaacc gegctafceta 1200 aettgatftt ãefsttgctg ca&taaagsâ gageaaegaa ggtagamgca attctgaeaa 1220 âgrataeaaga cgaattcgct atttgtagat gaatatgcgt gtgtcaattg acgccgaatt 1180 45 111 ΡΕ1149919 3480 caggatágst fctgc-estcfcg ctçMttgCC «afctOCti&tt ccatctttat catgaacaac 1440 astcaaacça eaeatefcgae. tfccseggcgc tgaacgafc«t aggccãactfc. cagagccggg 1500 fctcatcgaga acafcagtgag gattgaagaa «agfcgstcta CMUtggcetg 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fcgatcaatge gaggaatggt tgggtccaeg 3160 eteteeeegt eegaaaettíg gagggtaaca eggagttfcet eagatagacc atctgcaact 3240 ttgttagttfc gaactegats t.çaggaaacg catgagagafc aaettaecaá. tcacgattçg 3300 Gcgaact-tgg f ctaaagttg ttgcttgttt gagccggceg gcãatggage sfc£t.agaeec 336® tgatcc&ttf tcfccaccgt ctccgegttg aecsfggaatt ttgaagfcttç cgaaacgsgg 3420 gtçgfctg&sg tasatasecç gatcçtgaag egeagggBea agat.etgggá taecogtggt 112 fo*a«a«tg§' »®gí«a»ac#t a&eegtteat goaganogog ta9tgft«c& sgtsxttcag ffeg feaaetSísak tt§f<M(aeak oeefcaassjaa. g*tftf»0«fc çaafccaae&t $t*§£eptfca ««mggsat §0000^0889 M-çatcèagc çatgeagoag tep^egeot fegctcofctffc âeefcEfgfet eatg&eatee tgçagsaçc* atcgsçaogo fctgeeaaggc agfcasEfcgfa fcáafft&44©g aeattgacag «acggtgtatg «a&gfeagagg ffceeeggtcta gscagagafô fegascaagg castpçaea. fagtgetsga ggattggaat agetgtagÊE çggataag&t ο$£«»θ£&«£ ggeeaaasff fctfgttatee ©ggcageagt mtgsttgte ggeaggcfcft «fctocAfsejjf çç&aggagçe ggsiitagr.trt sgscg^êffs ftsfpfcttf gccgacteea gssêtgcifct aMtg&tgc» tcagsgccaá 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<210> 2 <211> 34203 <212> DNA <213> Penicillium citrinum <400> 2 gátetgctgg tagactagag eetgeetm eatatatgat agecagatgg ggggccgaat tacgt^fcgc fcggatfggffc atftatfece ctaagagtat fctetesfggt gacfcgaa&ag gtçcgttega aaacaettgt ttgcatataa actfcafccfcpç fegc<segagéfc tactcfeecaa aagt-etcacc tcaeattatt tgafcettaat attecg&cga aeetassgecg eegcgcgttt aafç««***t· gtaccggtag caatgccaat 126 atgcaccgcc atgaacaâft tcfctggt.ttg gctcgtgatc acaegttctt: gságatgtag ccetateggg tctaggaaga agetttageg gaaaatctca çgfettaaas. tttt-ttgctt taççtçtacg fceetgtgaça catccgacag tgtgttggat tftccgfafcg ãçgagttrcce gaeaggegee gttgcatcca sagggcettè agattcattg çtgttggc&t cgtegcgaaa cgaetcggga tçafce®s«gt tgattgatgt ttstgataat gtttscttga gtgecgsaggt tggaggagte tetgccaatg etgagaagac ggtfctctgfcg gctcttgtag ttccagcfcgc cetttegctg tacâcacaec ttaateeggc taaattggea ttgetaccgg tacatttgag tegaaacgeg cgacggcgfca ggttcgfccgg tfgattaags tesaataatf tgaggtgaga gaattggags gçsagrtcgt gçaggagata aafttaistgr eaaaeaagtg ttttcfageg tgtçttttcã 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<210> 3 <211> 17 <212> DNA <213> Sequência artifical <220> <221> misc_feature <222> Descrição da sequência artificial: uma sequência iniciadora mista que tem uma sequência de DNA deduzida a partir da sequência de aminoácidos de PKS de Aspergillus flavus. <220> <221> base modificada <222> (6)..(6) <223> i <220> <221> base modificada <222> (9)..(9) <223> i <400> 3 gayacngcnt gyasttc 17

<210> 4 <211> 17 <212> DNA <213> Sequência artifical <220> <221> misc_feature <222> Descrição da sequência artificial: uma sequência iniciadora mista que tem uma sequência de DNA deduzida a partir da sequência de aminoácidos de PKS de Aspergillus flavus. <220> <221> base modificada <222> (3)..(3) <223> i <220> <221> base modificada <222> (6)..(6) <223> i <220> <221> base modificada <222> (8) .. (8) <223> i <220> <221> base modificada <222> (15)..(15) ΡΕ1149919 <223> i <400> 4 tcnccnknrc wgtgncc

<210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Penicillium citrinum <400> 5 gcatgttcaa tttgctctc

<210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Penicillium citrinum <400> 6 ctggatcaga cttttctgc

<210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> Penicillium citrinum <400> 7 gtcgcagtag catgggcc

<210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Penicillium citrinum <400> 8 gtcagagtga tgctcttctc

<210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Penicillium citrinum <400> 9 gttgagagga ttgtgagggc

<210> 10 <211> 19 <212> DNA <213> Penicillium citrinum <400> 10 ttgcttgtgt tggattgtc

<210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Penicillium citrinum ΡΕ1149919 <400> 11 catggtactc tcgcccgttc <210> <211> 12 19 <212> DNA <213> Penicillium citrinum <400> 12 ctccccagtta cgtaagctc <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Penicillium citrinum <400> 13 ccataatgag tgtgactgtt c <210> 14 <211> 19 <212> DNA <213> Penicillium citrinum <400> 14 gaacatctgc atccccgtc <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Penicillium citrinum <400> 15 ggaaggcaaa gaaagtgtac <210> <211> 16 21 <212> DNA <213> Penicillium citrinum <400> 16 agattcattg ctgttggcat c <210> 17 <211> 722 <212> DNA <213> Penicillium citrinum <400> 17 146 ΡΕ1149919 ggcc&cgegt egeetàftac fgpggfggfg gggggggggg gcttgfctqgc tcegagattc <10 aaefcctgcga tfeeÈgttfca» teccaatcct ategcceaaa aacaggatca gcagttatgg 120

âtesagecaa etafcceaaao gagceaattg tggtagtgw áágcggtfcgt cggtttecag ISO gfcggtgteaa eacaccatca aaactttggg agctgctcaa ajjageeecgg gatgtacaga 240

ccakagarfeccc taagfagaga tttfaegteg atacatttfca cagscecgát ggeaetcãçç 3âS ccgrggcgcae gaacgcacec tttgcat&ct tgcfcgeagg* ggrafcctaege ggttttgatg 340 cctctttctt caacatccaa getggagãgg ccgaaacgat tgacccacag caaaggeegc 420 tgctggagac ggtctatgaa gctgtstcca acgcaggect Ãcggatceaâ ggccttcàag 400 gatcctctac tgctgtgtac gtcggfcatga tgacgcafcga etatgagace attgtgacgc 540 gtgaatfegga tagtattçct açatactctg ccaçgggggt agetgtcagfc gÇggecteea 600 aeçgfcgtatc atactlcttc gactggsatg ggcçgagtat gaçgategaç ac.agsccgta 666 gtfceateett agetgccgtf cafcétgsccg tec&àsofct tagaácgggc gagágtácca 720 1$ rm

<210> 18 <211> 760 <212> DNA <213> Penicillium citrinum <400> 18 ggfecaegcffc egactagtac ssss^gggg gsggggssss gaeEatcaac ggíLtetatKS 60 ecagggegac tgatatatca gtcaátgaaa caacgttggs atgaacaata ccceergccgt 12C aaeeg-câaçe gcaaccgcaa Ccgcaaccgc aaccgcaatg geaggetegg cEtgfctcEaa 180 cacatccacg cccattgcca tagE-tggâst gggatftcga tttgetagag atccaacgag 340 tccacagaag etttgggaaa tggttgaaag aggaggeagfe gcctggfecta aggtcccctc 300 ctogegattG aafcgtgagag gagtataçca ceegaatggc gaaagggtcg ggtccaecea 3$0 cgtaaagggt ggaeacttca tegacgagga tccfcgcttta ttfcçacgecg çgKtcttcaa 430 eatgaccaca gaggtcgeea gctgcat.ggs tccgcagtat cggcr.tatgc ttgaggtggt 480 ctacgaatcg ítt.ggsgagtg eeggt.aEcac catcgatggc açggeagfct ctaãtaeftc 540 ggtgtttggg ggegtcatgt aec&cgaeta teaggra&tcg etcaatcgog aeceegagác SOO agttecgcgt tafcttcataa çtggcaactc aggaaçaatf ofcttcgaacc ggatatcaca 660 cttctacgac ttacgtggtc ecagégtgas ggttgaeacg gcctgttcga cgacattgac 720 cgcactgcac ttggegtgee agagret tacg tactggggag 7S0

<210> 19 <211> 773 <212> DNA <213> Penicillium citrinum <400> 19 147 PE1149919 ggççacgçgt cgaetagcae gggggggggg ggttttfcttt ttttcaaggt tgacrtggaag 60 agtgctctcg gccacaaaat cccagaagca ttagtgctgt tattcgatta ta&aecgtcg 120 cagcgctctc atfccfctcgcfc ctttcttctt fcfcccsCtggt gtgcataggt cctatctgtc 180 tçacgcaatg ctcggccagg ttcttctgác cgtcgaateg Eacrçaatggg tatcgacccc 240 teaagceeEt gEggcggccg cagçgctoct tagtctcatc gcctaecgtt tgegggggeg .300 ccagtcegaa etgeaagtot afcaateeeaa aaaatggtgg gagttgaega ccatgagggc 360 taggcaggae ttcgatacgt atggtcegag ctggatcgaa gcttggttct ogaaaaacga 420 caagcocctg çgcfctcattg ttgatOcegg etattgeaeç atectcceat cgtccatggc 480 cgacgagctt cggaaaatca aagatacjtg catgtacaag tttttggcfg atgactEtca S40 etctcatcec cctggãttcf ãcgggtteaa ggãaateEgc eaggaEgeae atcttgccaa 600 caaagttgtt ttgaaccagt tacaaaocca agecccoaag tacâeaaagc cattggctas 669 cttggccgac getactattg ccaagttgtt cggtaaaagc g&ggagcggc aaaeegcaee 720 tgtetattce aatggattgg accttgteac âegaacagfcc acaetestta t$g 773

<210> 20 <211> 527 <212> DNA <213> Penicillium citrinum <400> 20 ggcca.cfcgfc cgactsgtae gggggggggg gtacefcagga aetgttcagt tgteeeteee 6 0 aacccefctgg gccgaácaae cttectccaa tçfcacgacfg cagafctatac ctaggcgcefc 120 aaccgattag gttgctcatt egactttgga gagactacot agetataggt accactecaa 180 gctgtagcae ggacctttca geatggtcgc ttcgttgeta ccctctcget ttcgcggtag 240 ggaatcaatg aateagcago aecctctaeg etcgggaaat egggeattga ectecacact 300 ecaafcttcta tccaaaacgg cgtft.ct.aea eccgatccai accgtttgca ccatagetat 360 tccagctagt accaeratacg ttggasfeaefc caaagacagc ttcfctecatg gececgcaaa 420 cgttgataaa geagaatggg gefcgfcttggt cgaaggaagt cgaagcttga fcçaccggeec 4Β·β acagaatggc tggaagtggc agagcttega eggggatgea gatgttc S27

<210> 21 <211> 522 <212> DNA <213> Penicillium citrinum <400> 21 148 PE1149919 ggco&egcsft cgaetagtae gggggggggg «999939933 ggatccate* aectgacttc SO aggetagcgg aeettsaega à&ca&cga$a gcfagatcat tcafcasacc» aa&çaçafgt J.20 actatagaag egeegegcag tagagatfcea eaccgcccefc tgaageaaaa gtçggaagga 180 attgegcgafc gtcageacct ctaccccct* eagftagggge aceoagacea çagaaggaag 24 O aaagtcaa&a tgasaefctc gaagcgactg «gtccaagtc ecagcacafcc acaggcctca 300 agctegggct ggtggttget tcagttactt tegtagcatt tttgatgrtc cttgat&tgt 3€0 eeafctafcegt oa«ggcaate ecacatatca caagcgagtt ecacfcctctg aacgatgftag 420 ggrtggtaegg cagfcgottafe gutetfgcta aetgtgctct ccagçeectg gosggtaaafc 480 tgtartacaofc cfcfcgggsfcfeg asgtacacfct tctttgeett ce $22

<210> 22 <211> 541 <212> DNA <213> Penicillium citrinum <400> 22 ggeeaegegc cgactagtac fgfggggggg ggetcacetc aoafcfcafcttg âtetfeaatce $0 aataattatg tcectgccgc atgc&ãegat ccegacgaac ctacgccgtc gcgcgtttcg 12Õ

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Lisboa, 4 de Dezembro de 2007

Claims

PE1149919 1 REIVINDICAÇÕES 1. Um polinucleótido seleccinado do grupo consistindo em: (a) um polinucleótido codificador de uma proteína tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 42; (b) um polinucleótido que compreende a sequência nucleotídica de SEQ ID NO: 41, adequado para usar na aceleração da biossíntese de ML-236B; (c) um polinucleótido que consiste na sequência nucleotídica de SEQ ID NO: 41, (d) um polinucleótido que híbrida com um polinucleótido de acordo com (a) a (c) em condições restringentes e que se caracteriza pela aceleração da biossóntese de ML-236B num microrganismo produtor de ML-236B quando introduzido no referido microrganismo produtor de ML-236B; e (e) um mRNA que pode hibridar com um polinucleótido de (d) em condições restringentes.
2. Um polinucleótido de acordo com a reivindicação 1 compreendendo DNA obtido a partir de Escherichia coli tansformada pSAKexpR SANK 72599 (FERM BP-7006) .
3. Um polinucleótido de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores em combinação operacional com um ou mais polinucleótidos; a referida combinação sendo adequada para usar na estimulação da produção de ML-236B 2 PE1149919 num microrganismo produtor de ML-236B.
4. Um polinucleótido de acordo com a reivindicação 3 compreendendo um polinucleótido da reivindicação 1 ou 2 conjuntamento com um polinucleótido codificador de uma proteina incluindo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 38, 42, 44, 46, 48 ou 50.
5. Um polinucleótido de acordo com a reivindicação 3 compreendendo o polinucleótido de SEQ ID NO: 41, em combinção com uma ou mais sequências seleccionadas entre SEQ ID NO: 37, 41, 43, 45, 47 ou 49.
6. Um polinucleótido de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores que é um DNA.
7. Um polinucleótido de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores que é um DNA genómico.
8. Um polinucleótido de acordo com as reivindicações 1-6 que é um cDNA.
9. Um vector compreendendo um polinucleótido de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores.
10. Um vector de acordo com a reivindicação 9, em que o vector ainda compreende um polinucleótido tendo a sequência nucleotídica de SEQ ID NO: 37. 3 ΡΕ1149919
11. Um vector de acordo com a reivindicação 9 ou reivindicação 10, em que o vector ainda compreende um ou mais polinucleótidos seleccionados entre SEQ ID NO: 43, 45, 47 ou 49.
12. Um vector de acordo com a reivindicação 9, em que o vector não compreende as sequências polinucleotídicas de SEQ ID NO: 37, 43, 45, 47 ou 49.
13. Um vector de acordo com a reivindicação 9 em que o vector não compreende as sequências polinucleotídicas de SEQ ID NOS: 43, 45, 47 ou 49.
14. Um vector de acordo com a reivindicação 9 obtido a partir de Escherichia coli pSAKexpR SANK 72599 (FERM BP-7006).
15. Um vector de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 14 que é um vector de expressão.
16. Uma célula hospedeira transformada por um vector de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 15.
17. Uma célula hospedeira de acordo com a reivindicação 16 caracterizada por ser um microrganismo produtor de ML-236B.
18. Uma célula hospedeira de acordo com a 4 ΡΕ1149919 reivindicação 17 caracterizada por ser uma espécie de Penicillium.
19. Uma célula hospedeira de acordo com a reivindicação 17 ou reivindicação 18 caracterizado por ser um Penicillium citrinum.
20. Uma célula hospedeira de acordo com a reivindicação 16 caracterizada por ser Escherichia coli.
21. Uma célula hospedeira de acordo com a reivindicação 20 caracrterizada por ser uma Escherichia coli pSAKexpR SANK 72599 (FERM BP-7006).
22. Um polipeptídeo codificado por um polinucleótido de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8.
23. Um polipeptideo compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 42 ou uma sua variante que tem pelo menos 80% de identidade com SEQ ID NO: 42 e que é capaz de acelerar a produção de ML-236B num organismo produtor de ML-236B.
24. Um polipeptideo consistindo na sequência de SEQ ID NO: 42.
25. Um método para a produção de ML-236B, compreendendo a cultura de uma célula hospedeira de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 19 e depois 5 PE1149919 recuperação de ML-236B a partir da cultura.
26. Um método de acordo com a reivindicação 25, em que a célula hospedeira é transformada com um vector compreendendo a sequência nucleotidica de SEQ ID NO: 41.
27. Um método de acordo com a reivindicação 26, em que o vector não compreende a sequência polinucleotídica de SEQ ID NO: 37.
28. Um método de acordo com a reivindicação 26 ou reivindicação 27, em que o vector não compreende pelo menos um polinucleótido codificador da sequência de aminoácidos de SEQ ID NOS: 44, 46, 48 e/ou 50.
29. Um método de acordo com qualquer uma das reivindicações 25 a 28 em que a produção ocorre na ausência de um ou mais de um polipeptídeo recombinante tendo uma sequência de aminoácidos correspondendo a SEQ ID NOS: 38, 44, 46, 48 e/ou 50.
30. Um método de acordo com qualquer uma das reivindicações 25 a 28, em que a produção ocorre na ausência de um ou mais cDNAs correspondendo a SEQ ID NOS: 37, 43, 45, 47 e/ou 49.
31. Um método de produção de pravastatina, que compreende a realização de um método de acordo com qualquer uma das reivindicações 25 a 30 e conversão de ML-236B em ΡΕ1149919 pravastatina. Lisboa, 4 de Dezembro de 2007