NO328653B1

NO328653B1 - Polynukleotid, vektor, vertscelle, polypeptid, fremgangsmate for fremstilling av ML-236B samt fremgangsmate for fremstilling av pravastatin.

Info

Publication number: NO328653B1
Application number: NO20011890A
Authority: NO
Inventors: Hiroji Yoshikawa; Yuki Abe; Chiho Ono
Original assignee: Sankyo Co
Priority date: 2000-04-18
Filing date: 2001-04-17
Publication date: 2010-04-19
Also published as: DE60130394T2; EP1149919A3; NO20011890L; US20070111293A1; RU2236463C2; US20030078395A1; PL202457B1; HUP0101569A2; IL142619A; HK1037683A1; BR0101518A; PL347118A1; DK1149919T3; US7056710B2; NZ511166A; AU783319B2; CY1106985T1; CN1325959A; PT1149919E; CZ20011367A3

Description

Oppfinnelsens område

Foreliggende oppfinnelse vedrører polynukleotid, vektor, vertscelle, polypeptid, fremgangsmåte for fremstilling av ML-236B samt fremgangsmåte for fremstilling av pravastatin.

Oppfinnelsens bakgrunn

Pravastatin er en HMG-CoA-reduktaseinhibitor. Pravastatin-natrium er blitt brukt ved behandlingen av hyperlipemi eller hyperlipidemi og har den nyttige farmakologiske effekt ved å være i stand til å redusere serumkolesterol. Pravastatin kan fås ved å anvende Streptomyces carbophilus ved hjelp av mikrobiell omdannelse av ML-236B fremstilt ved hjelp av Penicillium citrinum [beskrevet i Endo, A. et al., J. Antibiot., 29, 1346

(1976), Matsuoka, T. et al., Eur. J. Biochem., 184, 707 (1989), og i japansk patentsøknad med publikasjonsnr. 57-2240].

Det er blitt vist at både ML-236B, en forløper for pravastatin, og lovastatin, en HMG-CoA-inhibitor, har til felles den samme delstruktur. De syntetiseres biologisk via polyketider [beskrevet i Moore, R.N. et al., J. Am. Chem. Soc, 207, 3694

(1985), Shiao, M. og Don, H.S., Proe. Nati. Sei. Counc. Repub. China B, 11, 223 (1987)].

Polyketider er forbindelser avledet fra en (3-keto-karbonkjede som fås fra en sammenhengende kondensasjonsreaksjon av karboksylsyrer med lav molekylvekt, slik som eddiksyre, propionsyre, smørsyre eller lignende. Forskjellige strukturer kan avledes avhengig av reaksjonssporet for kondensasjon eller reduksjon av hver av (3-keto-karbonylgruppene [beskrevet i Hopwood, D.A. og Sherman, D.H., Annu. Rev. Genet., 24, 37-66

(1990); Hutchinson, CR. og Fujii, I., Annu. Rev. Microbiol.,

49, 201-238 (1995)].

Polyketidsyntaser (heretter henvist til som PKS-er) som bidrar til syntesen av polyketider, er enzymer som er kjent for å være til stede i filamentære sopper og bakterier. Enzymene fra filamentære sopper er blitt undersøkt ved å anvende molekylær-biologiske teknikker [som beskrevet i Feng, G.H. og Leonard, T.J., J. Bacteriol., 177, 6246 (1995); Takano, Y. et al., Mol. Gen. Genet. 249, 162 (1995)]. I Aspergillus terreus som er en lovastatinproduserende mikroorganisme, er et PKS-gen som angår biosyntesen av lovastatin, blitt analysert [beskrevet i inter-nasjonal søknad gjort allment tilgjengelig i Japan (KOHYO) nr. 9-504436, og se tilsvarende WO 9512661 hvor det kreves DNA som koder for en triolpolyketidsyntase].

Gener som angår biosyntese av sekundære metabolitter fra filamentære sopper, danner ofte en klynge på genomet. I reaksjonssporene for biosyntesen av polyketider er det kjent at det foreligger genklynger som deltar i reaksjonssporet. I biosyntesen av "Aflatoxin", som er et polyketid produsert av Aspergillus flavus og Aspergillus parasiticus, har gener som koder for enzymproteiner som deltar i biosyntesen (slik som PKS), vært kjent for å danne en klyngestruktur. Genomanalyse og en sammenligning av gener som deltar i biosyntesen av Aflatoxin i hver av mikroorganismene, er blitt utført [se Yu, J. et al., Appl. Environ. Microbiol., 61, 2365 (1995)]. Det er blitt rapportert at gener som deltar i biosyntese av Sterigmatocystin produsert av Aspergillus nidulans, danner en klyngestruktur på ca. 60 kb av en sammenhengende region på sitt genom [beskrevet i Brown, D.W. et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 93, 1418

(1996)].

Hendrickson et al., (Chemistry and Biology, 1999, Vol. 6, No. 10, pp. 429-439, ISSN: 1074-5521) raporterer om et foreslått lovastatinnonaketidsyntesegen og et mulig lovastatin-diketidsyntasegen.

Modulasjonen av polyketidsyntaseaktivitet ved hjelp av hjelpeproteiner under lovastatinsyntese er blitt undersøkt [se Kennedy, J. et al., Science, vol. 284, 1368 (1999)].

Hittil har det imidlertid vært utilstrekkelig molekylær biologisk analyse av biosyntesen av ML-236B, og faktorer som regulerer den. Foreliggende oppfinnelse går ut på å løse dette problemet.

Oppsummering av oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelse omfatter et polynukleotid, kjennetegnet ved at det er valgt fra gruppen bestående av: (a) et polynukleotid som koder for et protein med aminosyresekvensen ifølge SEQ ID NO: 42, (b) et polynukleotid som omfatter nukleotidsekvensen ifølge SEQ ID NO: 41, som er egnet for anvendelse ved akselerering av biosyntesen av ML-236B. (c) et polynukleotid som består av nukleotidsekvensen ifølge SEKV. ID. NR.: 41. (d) et polynukleotid som hybridiserer med et polynukleotid ifølge (a) til (c) under stringente betingelser, og som er kjennetegnet ved akselerering av biosyntesen av ML-23B i en ML-236B-produserende mikroorganisme som er innført i den ML-236B-produserende mikroorganismen, og (e) et mRNA som kan hybridisere med et polynukleotid ifølge (d) under stringente betingelser.

Videre omfatter oppfinnelsen en vektor,

kjennetegnet ved at den omfatter et polynukleotid ifølge oppfinnelsen.

Videre omfatter oppfinnelsen en vertscelle ifølge oppfinnelsen.

Videre omfatter oppfinnelsen et polypeptid, kjennetegnet ved at det kodes for av et polynukleotid ifølge oppfinnelsen.

Videre omfatter oppfinnelsen en fremgangsmåte for fremstilling av ML-236B, kjennetegnet ved at den omfatter å dyrke en vertscelle ifølge oppfinnelsen og deretter gjenvinne ML-236B fra kulturen.

Videre omfatter oppfinnelsen en fremgangsmåte for fremstilling av pravastatin, kjennetegnet ved at en fremgangsmåte ifølge oppfinnelse, og ML-236B omdannes til pravastatin.

Polynukleotidet er vanligvis et polynukleotid som koder for et protein som inkluderer eller består av aminosyresekvensen ifølge SEQ ID NO: 38, 42, 44, 46, 48 eller 50. Det er også tilveiebrakt polynukleotidvarianter derav som koder for en modifisert aminosyresekvens som har minst én delesjon, addisjon, substitusjon eller endring.

Tabulering for sekvensliste

En sekvensliste utgjør en del av denne patentbeskriv-else. Som et hjelpemiddel for å forstå, gir vi den følgende tabulering av de angitte sekvenser.

Foretrukne utførelsesformer

Polynukleotidene som koder for aminosyresekvensene ifølge SEQ ID NO: 38, 42, 44, 46, 48 eller 50 kan være cDNA, genom-DNA eller mRNA. Det genomiske DNA som koder for hver av disse seks sekvensene, er henvist til som strukturelle gener henholdsvis mlcE, mlcR, mlcA, mlcB, mlcC og mlcD. Uten å være bundet til disse betegnelsene, antar vi at de strukturelle genene koder for proteiner med de følgende funksjoner:

mlcA polyketidsyntase

mlcB polyketidsyntase

mlcC P450 monooksygenase

mlcD HMG-CoA-reduktase

mlcE efflukspumpe

mlcR transkripsjonsfaktor

Vi har oppdaget at inkorporeringen av mlcE eller cDNA som tilsvarer mlcE, kan akselerere biosyntesen av ML-236B, og inkorporeringen av mlcR eller cDNA som tilsvarer mlcR, kan akselerere biosyntesen av ML-236B. Dessuten stimulerer mlcR transkripsjonen ekspresjon av mlcA til D. mlcA, B, C og D er involvert i fremstillingen av ML-236B, uavhengig av andre eller i kombinasjon, og vist ved hjelp genoppbrytningsundersøkelser.

Varianter av mlcA, B og/eller C som lar seg erholde ved hjelp av naturlig eller kunstig endring, vil være anvendbare for å fremstille derivater av ML-236B, inkludert statiner, slik som pravastatin eller lovastatin. I dette henseende kan det være mulig å produsere pravastatin direkte ved å anvende slike varianter med bare det ene fermenteringstrinn og uten behov for mikrobiell omdannelse av ML-236B til pravastatin som for tiden utføres med Streptomyces carbophilus.

Et foretrukket polynukleotid omfatter en sekvens som omfatter SEQ ID NO: 37, eller som omfatter en mutant eller variant derav som er i stand til å akselerere biosyntesen av ML-236B. Et slikt DNA-polynukleotid lar seg erholde fra transformert Escherichia coli pSAKexpE SANK 72499 (FERM BP-7005).

Et annet foretrukket polynukleotid omfatter en sekvens som omfatter SEQ ID NO: 41, eller som omfatter en mutant eller variant derav som er i stand til å akselerere biosyntesen av ML- 236B. Et slikt DNA-polynukleotid lar seg erholde fra transformert Escherichia coli pSAKexpR SANK 72599 (FERM BP-7006).

Polynukleotidene ifølge denne oppfinnelsen kan anvendes i operativ kombinasjon med ett eller flere polynukleotider. Foretrukne kombinasjoner er egnet for anvendelse ved forbedring av produksjonen av ML-236B i en ML-236B-produserende mikroorganisme .

Eksempler på slike kombinasjoner omfatter polynukleotidet ifølge SEQ ID NO: 37 eller en variant derav som har lignende funksjon, i kombinasjon med én eller flere sekvenser valgt fra SEQ ID NO: 37 selv, 41, 43, 45, 47 eller 49, samt polynukleotidet ifølge SEQ ID NO: 41 eller en variant derav som har en lignende funksjon, i kombinasjon med én eller flere sekvenser valgt fra SEQ ID NO: 37, 41 selv, 43, 45, 47 eller 49.

Ved ett aspekt er polynukleotidet fortrinnsvis et polynukleotid som koder for et protein som omfatter eller består av aminosyresekvensen ifølge SEQ ID NO: 38, 42, 44, 46, 48 eller 50, og som er i stand til å akselerere biosyntesen av ML-236B alene eller sammen med polynukleotidet ifølge SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 41 eller en variant derav som har en lignende funksjon.

Foreliggende oppfinnelse strekker seg videre til polynukleotider som er i stand til å hybridisere under stringente betingelser med et polynukleotid ifølge denne oppfinnelsen. Slike polynukleotider strekker seg til polynukleotider som er egnet for å akselerere biosyntesen av ML-236B i en ML-236B-produserende mikroorganisme når de innføres i den ML-236B-produserende mikroorganisme.

Polynukleotidet er vanligvis DNA, cDNA eller genomisk DNA, eller RNA, og kan være sense eller antisense. Polynukleotidet er vanligvis et renset polynukleotid, slik som et polynukleotid som er fritt for andre cellulære komponenter.

Foreliggende oppfinnelse strekker seg til polynukleotidvarianter som koder for aminosyresekvenser ifølge de angitte SEQ ID NO: 38, 42, 44, 46, 48 eller 50 hvor ett eller flere nukleotider er blitt endret. Endringene kan oppstå naturlig, og kan være gjort innenfor overfloden eller degenerasjonen av triplettene i den genetiske kode. Slike degenerativt endrede polynukleotider koder således for den samme aminosyresekvens. Innenfor disse polynukleotidvariantene kan vi inkludere genomisk DNA som har ekstroner og introner, og ikke bare cDNA-sekvensen.

Foreliggende oppfinnelse strekker seg videre til polynukleotidvarianter som koder for aminosyresekvenser med de angitte SEQ ID NO: 38, 42, 44, 46, 48 eller 50 som koder for en modifisert aminosyresekvens med minst én delesjon, addisjon, substitusjon eller endring. Oppfinnelsen strekker seg således til polynukleotidvarianter av de angitte sekvenser som koder for aminosyresekvenser som er kortere, lengre eller har den samme lengde som den kodet for av de angitte sekvenser. Fortrinnsvis bibeholder variantpolypeptidene en evne til å akselerere syntesen av ML-236B, og som fortrinnsvis har aktivitet som er i det vesentlige lik med eller bedre enn foreldresekvensen som gir opphav til variantsekvensen.

Polynukleotidvariantene bibeholder en grad av identitet med foreldresekvensen. Passende er identitetsgraden minst 60%, minst 80%, minst 90% eller minst 95% eller 100%. Identitetsgraden til en variant fastlegges fortrinnsvis ved hjelp av datamaskinprogramvare, slik som BLAST-programmet som gjør bruk av en algoritme for å utføre homologisøk.

Ved ett aspekt er det foretrukne polynukleotid ifølge denne oppfinnelsen DNA valgt fra gruppen bestående av: (a) DNA som omfatter én eller flere nukleotidsekvenser vist i nukleotid nr. 1 til 1662 i SEQ ID NO: 37 i sekvenslisten, og som er kjennetegnet ved å akselerere biosyntesen av ML-236B i en ML-236B-produserende mikroorganisme når det innføres i den ML-236B-produserende mikroorganisme; (b) DNA som hybridiserer med det DNA som er beskrevet i (a) under den stringente betingelse, og som er kjennetegnet ved å akselerere biosyntesen av ML-236B i en ML-236B-produserende mikroorganisme når det innføres i den ML-236B-produserende mikroorganisme; (c) DNA som omfatter én eller flere av nukleotidsekvensene vist i nukleotid nr. 1 til 1380 i•SEQ ID NO: 41 i sekvenslisten, og som er kjennetegnet ved å akselerere biosyntesen av ML-236B i en ML-236B-produserende mikroorganisme når det innføres i den ML-236B-produserende mikroorganisme; og (d) DNA som hybridiserer med det DNA som er beskrevet i (c) under den stringente betingelse, og som er kjennetegnet ved å

akselerere biosyntesen av ML-236B i en ML-236B-produserende mikroorganisme når det innføres i den ML-236B-produserende mikroorganisme.

Polynukleotidene ifølge denne oppfinnelsen akselererer biosyntesen av ML-236B i en mikroorganisme som produserer ML-236B. Eksempler på ML-236B-produserende mikroorganismer omfatter Penicillium- arter, slik som Penicillium citrinum, Penicillium brevicompactum [beskrevet i Brown, A.G. et al., J. Chem. Soc. Perkin-1., 1165 (1976)], Penicillium cyclopium [beskrevet i Doss, S.L. et al., J. Nati. Prod., 49, 357 (1986)] eller lignende. Andre eksempler omfatter: Eupenicillium sp. M6603 [beskrevet i Endo, A. et al., J. Antibiot.-Tokyo, 39, 1609

(1986)], Paecilomyces viridis FERM P-6236 [beskrevet i japansk patentsøknad med publikasjonsnr. 58-98092], Paecilomyces sp.

M2016 [beskrevet i Endo, A. et al., J. Antibiot.-Tokyo, 39, 1609

(1986)], Trichoderma longibrachiatum M6735 [beskrevet i Endo, A. et al., J. Antibiot.-Tokyo, 39, 1609 (1986)], Hypomyces chrysospermus IFO 7798 [beskrevet i Endo, A. et al., J. Antibiot.-Tokyo, 39, 1609 (1986)], Gliocladium sp. YJ-9515 [beskrevet i WO 9806867], Triahorderma viride IFO 5836 [beskrevet i japansk patentpublikasjon nr. 62-19159], Eupenicillium reticulisporum IFO 9022 [beskrevet i japansk patentpublikasjon nr. 62-19159], eller hvilken som helst annen egnet organisme.

Blant disse ML-236B-produserende mikroorganismer er Penicillium citrinum foretrukket, og Penicillium citrinum-stammen SANK 13380 er mest foretrukket. Penicillium citrinum SANK 13380-stammen ble deponert ved Research Institute of Life Science and Technology of the Agency of Industrial Science and Technology 22. desember 1992 under deponeringsnr. FERM BP-4129 i overensstemmelse med Budapestkonvensjonen vedrørende deponering av mikroorganismer. Eksempler på ML-236B-produserende mikroorganismer omfatter også de som er isolert fra naturlige kilder, og de som er mutert naturlig eller kunstig.

Oppfinnelsen tilveiebringer videre vektorer som omfatter et polynukleotid ifølge denne oppfinnelsen, slik som vektoren som lar seg erholde fra Escherichia coli pSAKexpE SANK 72499 (FERM BP-7005) eller Escherichia coli pSAKexpR SANK 72599 (FERM BP-7006). Slike vektorer ifølge denne oppfinnelsen omfatter ekspresjonsvektorer.

Vertsceller transformert ved hjelp av en vektor ifølge denne oppfinnelsen, er også tilveiebrakt, inkludert ML-236B-produserende mikroorganismer. Vertscellene omfatter Penicillium citrinum og Escherichia coli, slik som Escherichia coli pSAKexpE SANK 72499 (FERM BP-7005) eller Escherichia coli pSAKexpR SANK 72599 (FERM BP-7006).

I tillegg strekker oppfinnelsen seg til polypeptider som kodes for av et polynukleotid ifølge denne oppfinnelsen. Eksempler på polypeptider omfatter sekvensen ifølge SEQ ID NO: 38 eller 42, eller en variant derav som har en spesifisert grad av identitet med SEQ ID NO: 38 eller 42, og som er i stand til å akselerere ML-236B-produksjon i en ML-236B-produserende organisme. Andre polypeptider er de som kodes for av de øvrige polynukleotidsekvensene ifølge oppfinnelsen, og varianter som bibeholder en grad av identitet.

Passende er identitetsgraden mellom polypeptidvarianter og SEQ ID NO: 38 eller 42 minst 80%, minst 90% eller minst 95% eller 100%. Identitetsgraden til en variant fastlegges fortrinnsvis ved hjelp av datamaskinprogramvare, slik som BLAST-programmet som gjør bruk av en algoritme for å utføre homo-logisøk.

Polypeptidene omfatter kortere eller lengre sekvenser av SEQ ID NO: 38 eller 42, eller varianter. Kortere polypeptider omfatter partielle aminosyresekvenser av SEQ ID NO: 38, 42 eller varianter derav, og fortrinnsvis bibeholdes evne til å akselerere biosyntesen av ML-236B. Lengre polypeptider omfatter hele eller en del av aminosyresekvensene ifølge SEQ ID NO: 38, 42 eller varianter derav, og bibeholder fortrinnsvis evne til å akselerere biosyntesen av ML-236B. Lengre polypeptider omfatter fusjonsproteiner, slik som Fc-kondensert protein.

Polypeptider ifølge denne oppfinnelsen omfatter ett som har sekvensen ifølge SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48 eller en variant derav som har den samme funksjon. Antistoff mot polypeptider ifølge denne oppfinnelsen er også tilveiebrakt. Både polyklonalt antistoff og monoklonalt antistoff er tilveiebrakt ved hjelp av denne oppfinnelsen. Antistoffet kan anvendes til regulering av ML-236B-produksjon og til fremstilling av derivater av ML-236B, slik som statiner som omfatter pravastatin og lovastatin. Antistoffet kan dessuten fortrinnsvis anvendes til analyse av ML-236B-biosyntese og regulatormekanismer derav. Slik analyse kan anvendes til modulering av ML-236B-produksjon og til tilveiebringelse av derivater av ML-236B.

Vertscellene ifølge denne oppfinnelsen som har en vektor ifølge denne oppfinnelsen, kan anvendes ved en fremgangsmåte for fremstilling av ML-236B som omfatter dyrking av en slik vertscelle og så utvinning av ML-236B fra kulturen. Ved én fremgangsmåte omfatter vektoren mlcE eller mlcR, og ingen ytterligere gener, slik som mlcA, mlcB, mlcC eller mlcD.

Fremstilling ved hjelp av en fremgangsmåte ifølge denne oppfinnelsen kan skje i fravær av rekombinant mlcA, mlcB, mlcC og/eller mlcD (polypeptider) som tilsvarer SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48 eller SEQ ID NO: 50.

Beskrivelse av bestemte utførelsesformer

Foreliggende oppfinnelsen vil heretter bli beskrevet nærmere.

Oppfinnerne av foreliggende oppfinnelse har klonet

genomisk DNA som omfatter gener som deltar i biosyntesen av ML-236B i Penicillium citrinum. Det genomiske DNA henvises heretter til som ML-236B-biosynteserelatert, genomisk DNA, og ble klonet fra et genomisk DNA-bibliotek fra en ML-236B-produserende mikroorganisme. Det genomiske DNA ble analysert for å finne strukturelle gener på det genomiske DNA, så ble cDNA-er som tilsvarer de strukturelle genene, erholdt ved hjelp av revers-transkripsjon-polymerasekjedereaksjon (heretter henvist til som en "RT-PCR") under anvendelse av total-RNA som inneholder mRNA fra Penicillium citrinum som et templat. Det ble funnet at biosyntesen av ML-236B i en ML-236B-produserende mikroorganisme ble akselerert når den ML-236B-produserende mikroorganisme ble transformert ved hjelp av en rekombinant DNA-vektor som inneholder cDNA-ene.

Foreliggende oppfinnelse vedrører særlig cDNA-er (heretter henvist til som ML-236B-biosynteseakselererende cDNA) som akselererer biosyntesen av ML-236B i en ML-236B-produserende mikroorganisme når de innføres i den ML-236B-produserende mikroorganisme .

Et ML-236B-biosynteseakselererende polynukleotid ifølge foreliggende oppfinnelse, slik som ML-236B-biosynteseakselerer-ende cDNA, omfatter f.eks.: (I) DNA som lar seg erholde ved syntese under anvendelse av et transkribert produkt (budbringer-RNA, heretter henvist til som mRNA) av et strukturelt gen som et templat, som deltar i biosyntesen av ML-236B og som foreligger i det genomiske DNA fra en ML-236B-produserende mikroorganisme; (II) dobbelttrådet DNA dannet som et resultat av forbindelse mellom et DNA (I) og det andretråds-DNA som syntetiseres ved å anvende DNA (I) som en førstetråd; (III) dobbelttrådet DNA dannet ved å replikere eller amplifisere det dobbelttrådede DNA (II), f.eks. ved hjelp av en kloningsfremgangsmåte eller lignende; og (IV) DNA som kan hybridisere med ett av de ovenfor nevnte DNA-er eller mRNA under stringente betingelser.

DNA (IV) kan være de som er vist i hvilke som helst av de strukturelle gensekvensene her, f.eks. nukleotid nr. 1 til 1662 i SEQ ID NO: 37 i sekvenslisten, eller nukleotidnumrene 1-1380 i SEQ ID NO: 41, hvor ett eller flere nukleotider eventuelt er substituert, deletert og/eller addert, og som kan akselerere biosyntesen av ML-236B i en ML-236B-produserende mikroorganisme når det innføres i den ML-236B-produserende mikroorganisme.

Når to enkelttrådede nukleinsyrer hybridiserer, danner de et dobbelttrådet molekyl i en region hvor de er komplementære eller svært komplementære med hverandre, og "stringente betingelser" henviser passende til det tilfellet hvor hybridiserings-oppløsningen er 6 x SSC [1 x SSC har en sammensetning på 150 mM NaCl, 15 mM natriumsitrat], og temperaturen for hybridiseringen er 55 °C. ML-236B-biosynteseakselererende cDNA kan f.eks. fås ved å isolere en klon som inneholder cDNA-et fra et cDNA-bibliotek fra en ML-236B-produserende mikroorganisme. Som et alternativ kan RT-PCR brukes ved å anvende et par av primere utformet på grunnlag av nukleotidsekvensen til et ML-236B-biosynteserela-tert, genomisk DNA sammen med mRNA eller total-RNA fra en ML-236B-produserende mikroorganisme.

En ML-236B-produserende mikroorganisme er en mikroorganisme som iboende har en evne til å produsere ML-236B. Som tidligere angitt, omfatter eksempler på ML-236B-produserende mikroorganismer Penicillium- arter, slik som Penicillium citrinum, Penicillium brevicompactum, Penicillium cyclopium eller lignende, og andre eksempler omfatter: Eupenicillium sp. M6603, Paecilomyces viridis FERM P-6236, Paecilomyces sp. M2016, Trichoderma longibrachiatum M6735, Hypomyces chrysospermus IFO 7798, Gliocladium sp. YJ-9515, Trichorderma viride IFO 5836, Eupencillium reticulisporum IFO 9022 og eventuelt andre egnede organismer.

Blant disse ML-236B-produserende mikroorganismer er Penicillium citrinum foretrukket, og Penicillium citrinum-stammen SANK 13380 er mest foretrukket. Penicillium citrinum SANK 13380-stammen ble deponert ved Research Institute of Life Science and Technology of the Agency of Industrial Science and Technology 22. desember 1992 under deponeringsnr. FERM BP-4129 i overensstemmelse med Budapestkonvensjonen vedrørende deponering av mikroorganismer. Eksempler på ML-236B-produserende mikroorganismer omfatter også både de som er isolert fra naturlige kilder, og de som er mutert naturlig eller kunstig. ML-236B-biosynteserelatert, genomisk DNA kan fås ved hjelp av skreening av et genomisk DNA-bibliotek fra en ML-236B-produserende mikroorganisme med en egnet probe. Passende utformes proben på grunnlag av en DNA-sekvens forutsagt å ha en rolle i ML-236B-biosyntese, som passende skriver seg fra en filamentær s opp.

Valget av fremgangsmåter for å danne et genomisk DNA-bibliotek er begrenset, og hvilken som helst egnet metode kan brukes, fortrinnsvis en generell metode for å konstruere et genomisk DNA-bibliotek fra en eukaryot organisme. Eksempler på dette omfatter metoden til Maniatis et al. [Maniatis, T. et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. utg., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)]. Andre egnede metoder er kjent innenfor teknikken.

I korte trekk kan genomisk DNA fra en ML-236B-produserende mikroorganisme fås ved å utvinne celler fra en kultur av den ML-236B-produserende mikroorganisme, ved fysisk å bryte opp cellene, ekstrahere DNA som er til stede i kjernene, og rense DNA-et.

Dyrking av en ML-236B-produserende mikroorganisme kan utføres under betingelser som er egnet for de bestemte ML-236B-produserende mikroorganismer. For eksempel kan dyrking av Penicillium citrinum, en foretrukket ML-236B-produserende mikroorganisme, utføres ved å inokulere cellene i MBG3-8-medium [sammensetning: 7% (vekt/volum) glyserol, 3% (vekt/volum) glukose, 1% (vekt/volum) soyabønnepulver, 1% (vekt/volum) pepton (produsert av Kyokuto Seiyaku Kogyo Corporation), 1%

(vekt/volum) maisstøpvæske (produsert av Honen Corporation), 0,5% (vekt/volum) natriumnitrat, 0,1% (vekt/volum) magnesium-sulfatheptahydrat (pH 6,5)] og inkubere ved 22-28 °C med risting i 3-7 dager. En skråagar for lagring av bakterien kan fremstilles ved å helle smeltet PGA-agarmedium [sammensetning: 200 g/l potetekstrakt, 15% (vekt/volum) glyserol, 2%

(vekt/volum) agar] i et prøverør og la agaren størkne ved en vinkel. Penicillium citrinum kan så inokuleres i skråagaren under anvendelse av en platinanål, etterfulgt av inkubasjon ved 22-28 °C i 7 til 15 dager. Mikroorganismer eller bakterier dyrket på denne måte, kan sammenhengende holdes på agaren ved å bevare skråagaren ved 0 til 4 °C.

Celler av en ML-236B-produserende mikroorganisme dyrket i et flytende medium, kan utvinnes ved sentrifugering, og de som dyrkes på et fast medium, kan utvinnes ved å skrape fra det faste medium med en celleskraper eller lignende.

Fysisk oppbrytning av celler kan utføres ved å male opp cellene under anvendelse av en pistill og en morter, etter nedfrysing av dem med flytende nitrogen eller lignende. DNA i kjernene til den oppbrutte celle kan ekstraheres ved å anvende et slikt overflateaktivt middel som natriumdodecylsulfat (heretter henvist til som SDS) eller annet egnet overflateaktivt middel. Det ekstraherte genomiske DNA behandles passende med fenol-kloroform for å fjerne protein og utvinnes som en utfelling ved å utføre en etanolutfelling.

Det resulterende genomiske DNA fragmenteres ved for-døyelse med et egnet restriksjonsenzym. Det er ingen begrensning på restriksjonsenzymene som kan anvendes til restriksjons-fordøyelsen, idet generelt tilgjengelige restriksjonsenzymer er foretrukket. Eksempler på slike omfatter Sau3AI. Andre egnede enzymer er kjent innenfor teknikken. Fordøyd DNA underkastes så gelelektroforese, og genomisk DNA som har en egnet størrelse, utvinnes fra gelen. Størrelsen på DNA-fragmentet er ikke spesielt begrenset, men er fortrinnsvis 20 kb eller mer.

Det er likeledes ingen begrensning på valget av DNA-vektor som skal anvendes ved konstruksjon av det genomiske DNA-bibliotek, så lenge som vektoren har en DNA-sekvens som er nødvendig for replikasjon i vertscellen som skal transformeres ved hjelp av vektoren. Eksempler på egnede vektorer omfatter en plasmidvektor, en fagvektor, en kosmidvektor, en BAC-vektor eller lignende, idet en kosmidvektor er foretrukket. DNA-vektoren er fortrinnsvis en ekspresjonsvektor. Nærmere bestemt omfatter DNA-vektoren en DNA- eller nukleotidsekvens som gir en selektiv fenotype til vertscellen som transformeres ved hjelp av vektoren.

DNA-vektoren er passende en vektor som kan brukes ved både kloning og ekspresjon. Fortrinnsvis er vektoren en fergevektor som kan brukes til transformasjon av mer enn én mikro-organismevert. Fergevektoren som er egnet, har en DNA-sekvens som tillater replikasjon i en vertscelle, og fortrinnsvis en sekvens eller sekvenser som tillater replikasjon i en rekke forskjellige vertsceller fra forskjellige mikroorganismegrupper, slik som bakterier og sopper. Dessuten omfatter fergevektoren fortrinnsvis en DNA-sekvens som kan tilveiebringe en selekterbar fenotype for en rekke forskjellige vertsceller, slik som celler fra forskjellige mikroorganismegrupper.

Valget av kombinasjon av en mikroorganismegruppe og vertsceller transformert ved hjelp av fergevektoren, er ikke spesielt begrenset, forutsatt at én av mikroorganismegruppene kan brukes ved kloning og den andre har ML-236B-produserende evne. En slik kombinasjon kan f.eks. være en kombinasjon av en bakterie og en filamentær sopp, en kombinasjon av gjær og filamentær sopp, idet en kombinasjon av en bakterie og filamentær sopp er foretrukket. Valget av bakterie er ikke spesielt begrenset så lenge som den kan brukes generelt innen bioteknologi, slik som f.eks. Escherichia coli, Bacillus subtilis eller lignende. Escherichia coli er foretrukket, og Escherichia coli XLl-Blue MR er mest foretrukket. Likeledes er det ingen begrensning på gjærart så lenge som den kan anvendes generelt innen bioteknologi, slik som f.eks. Saccharomyces cerevisiae eller lignende. Eksempler på filamentære sopper omfatter ML-236B-produserende mikroorganismer beskrevet ovenfor. Andre egnede eksempler på mikroorganismer er kjent innenfor teknikken.

Ved foreliggende oppfinnelse kan mikroorganismegruppen velges fra bakterier, filamentære sopper og gjær.

Eksempler på den ovenfor nevnte fergevektor omfatter en kosmidvektor som har et egnet markørgen for selektering av en fenotype, og et cos-sete. Andre egnede vektorer er kjent innenfor teknikken. Den foretrukne vektor er pSAKcosl, konstruert ved innføyelse av et cos-sete fra kosmidvektor pWE15 (produsert av STRATAGENE) i plasmid pSAK333, som omfatter sekvensen fra Escherichia coli hygromycin B-fosfotransferasegen [beskrevet i japansk patentsøknad med publikasjonsnr. 3-262486]. En fremgangsmåte for konstruksjon av pSAKcosl er vist i figur 1. Foreliggende oppfinnelse er ikke begrenset til denne vektoren.

Et genomisk DNA-bibliotek kan fremstilles ved å innføre en fergevektor i en vertscelle, idet vektoren inneholder et genomisk DNA-fragment fra en ML-236B-produserende mikroorganisme. Vertscellen som skal anvendes, er fortrinnsvis Escherichia coli, mer foretrukket Escherichia coli XLl-Blue MR. Når vertscellen er Escherichia coli, kan innføring utføres ved hjelp av in vitro-pakking. I foreliggende oppfinnelse dekker transformasjon også innføringen av fremmed-DNA ved hjelp av in vitro-pakking, og en transformert celle dekker også en celle hvor fremmed-DNA innføres ved hjelp av in vitro-pakking.

Et genomisk bibliotek kan skreenes for å identifisere en ønsket klon ved å anvende et antistoff eller en nukleinsyreprobe, idet en nukleinsyreprobe er foretrukket. Fortrinnsvis fremstilles nukleinsyreproben basert på nukleotidsekvensen til et gen eller DNA relatert til polyketidbiosyntese, fortrinnsvis en sekvens avledet fra en filamentær sopp. Valget av bestemt gen er ikke begrenset, så lenge som det er involvert i biosyntese av polyketider og nukleotidsekvensen derav er kjent. Eksempler på slike gener omfatter Aflatoxin PKS-genet fra Aspergillus flavus og Aspergillus parasiticus, Sterigmatocystin-PKS-genet fra Aspergillus nidulans eller lignende.

Egnede nukleinsyreprober kan f.eks. fås ved å syntetis-ere en oligonukleotidprobe som omfatter en del av en kjent genomisk DNA-sekvens, som beskrevet ovenfor, eller ved å fremstille oligonukleotidprimere og amplifisere mål-DNA-et ved å anvende polymerasekjedereaksjonen [heretter henvist til som "PCR", beskrevet i Saiki, R.K. et al., Science, 239, 487 (1988)] og genomisk DNA som et templat, eller ved hjelp av RT-PCR under anvendelse av mRNA som et templat. Andre egnede fremgangsmåter for erholdelse av slike prober er velkjente innenfor teknikken.

En nukleinsyreprobe kan fås fra en ML-236B-produserende mikroorganisme ved f.eks. å anvende PCR eller RT-PCR. Utforming av primerne som brukes for PCR eller RT-PCR (heretter henvist til som "primer for PCR"), utføres fortrinnsvis basert på nukleotidsekvensen til et gen som er relatert til polyketidbiosyntese, og hvor nukleotidsekvensen er kjent. Fortrinnsvis er genet Aflatoxin PKS-genet til Aspergillus flavus, Aspergillus parasiticus eller Sterigmatocystin PKS-genet til Aspergillus nidulans.

Primeren for PCR utformes passende til å omfatte nukleotidsekvenser som koder for aminosyresekvenser som er høykonservert i PKS-gener. Fremgangsmåter for å identifisere nukleotidsekvenser som tilsvarer en bestemt aminosyresekvens, omfatter utledning på grunnlag av kodonbruken til vertscellen, og fremgangsmåter for å lage blandede oligonukleotidsekvenser under anvendelse av multippelkodoner (heretter henvist til som "degenererte oligonukleotider"). I det sistnevnte tilfellet kan multiplisiteten av oligonukleotider reduseres ved å innføre hypoksantin i deres nukleotidsekvenser.

Primer for PCR kan omfatte en nukleotidsekvens utformet for å annealere med en templatkjede, idet primeren er knyttet til en ytterligere 5'-sekvens. Valget av en slik ytterligere 5'-nukleotidsekvens er ikke spesielt begrenset, så lenge som primeren kan brukes til PCR eller RT-PCR. En slik ytterligere 5'-sekvens kan f.eks. være en nukleotidsekvens som er passende for kloningsoperasjonen av et PCR-produkt. En slik nukleotidsekvens kan f.eks. være et restriksjonsenzym-spaltingssete eller en nukleotidsekvens som inneholder et restriksjonsenzym-spaltingssete.

Ved utforming av primeren for PCR er det dessuten foretrukket at summen av antallet guanin- (G) og antallet cytosin- (C) baser er 40 til 60% av totalantallet baser. Fortrinnsvis er det dessuten lite eller ingen selv-annealering for en bestemt primer, og i tilfellet med et par primere, fortrinnsvis liten eller ingen annealering mellom primerne.

Antallet nukleotider som utgjør primeren for PCR, er ikke spesielt begrenset, så lenge som den kan brukes til PCR. Den nedre grense for antallet er generelt 10 til 14 nukleotider, idet den øvre grense er 40 til 60 nukleotider. Fortrinnsvis er primere 14 til 40 oligonukleotider lange.

Primeren for PCR er fortrinnsvis DNA. Nukleosider i primeren kan være deoksyadenosin, deoksycytidin, deoksytymidin og deoksyguanosin, og i tillegg deoksyinosin. 5<1->stillingen i nukleosidet i 5<1->enden av primeren for PCR er fortrinnsvis en hydroksylgruppe eller en hydroksygruppe hvortil én fosforsyre er bundet ved hjelp av en esterbinding.

Syntese av primer for PCR kan utføres ved hjelp av fremgangsmåter som brukes generelt til syntese av nukleinsyrer, f.eks. fosfoamidittmetoden. Et automatisert DNA-synteseapparat kan fortrinnsvis brukes ved en slik fremgangsmåte.

Genomisk DNA og mRNA fra en ML-236B-produserende mikroorganisme kan anvendes som et templat for henholdsvis PCR eller RT-PCR. Total-RNA kan også anvendes som et templat for RT-PCR i stedet for mRNA.

PCR-produktet eller RT-PCR-produktet kan klones ved inkorporering i en egnet DNA-vektor. Valget av DNA-vektor som brukes til kloningstrinnet, er ikke generelt begrenset. Sett for lettvint kloning av PCR- og RT-PCR-produkter er kommersielt tilgjengelige. Som eksempel er det opprinnelige TA-kloningssett

(produsert av Invitrogen: ved å anvende pCR2.1 som DNA-vektor)

egnet for slik kloning.

For å oppnå et klonet PCR-produkt dyrkes transformerte vertsceller som inneholder plasmider som omfatter det ønskede PCR-produkt, og så ekstraheres plasmidene fra cellene og renses. Det innføyde DNA-fragment gjenvinnes så fra det resulterende plasmid.

Dyrking av de transformerte vertsceller utføres passende under betingelser som er egnet for vertscellene. En foretrukket vertscelle, Escherichia coli, kan dyrkes i LB-medium [1% (vekt/volum) trypton, 0,5% (vekt/volum) gjærekstrakt, 0,5%

(vekt/volum) natriumklorid] ved 30 til 37 °C i 18 timer til 2 dager med risting.

Fremstilling av plasmider fra en kultur av de transformerte vertscellene kan utføres ved å utvinne vertscellene og isolere plasmider som er fri for andre cellulære komponenter, slik som genomisk DNA eller vertsprotein. Fremstilling av plasmid-DNA fra en kultur fra Escherichia coli kan utføres i henhold til den alkaliske metode til Maniatis [beskrevet i Maniatis, T. et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. utg., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.

(1989)]. Sett for å oppnå et plasmid som har høyere renhet, er kommersielt tilgjengelige. Plasmid-minisettet [produsert av QIAGEN AG] er foretrukket. Dessuten er et sett for massepro-duksjon av et plasmid kommersielt tilgjengelig. Plasmid-maksi-settet (produsert av QIAGEN AG) er foretrukket.

Konsentrasjonen av det resulterende plasmid-DNA kan bestemmes ved å måle absorbans ved en bølgelengde på 260 nm etter passende fortynning av DNA-prøve, og beregne på det grunnlag at en oppløsning med en absorbans OD26opå 1 inneholder 50 ug/ml DNA (beskrevet i Maniatis, T. et al., supra).

Renhet av DNA kan beregnes fra et forhold mellom absorbans ved en bølgelengde på 280 og 260 nm (beskrevet i Maniatis, T. et al., supra).

Fremgangsmåter for merking av nukleinsyreprober kan generelt klassifiseres som radioaktiv merking og ikke-radioaktiv merking. Valget av radionukleotid for radioaktiv merking er ikke generelt begrenset og kan f.eks. være 32P, 35S,1<4>C eller lignende. Bruken av<32>P ved merking er foretrukket. Valget av middel for ikke-radioaktiv merking er heller ikke generelt begrenset, så lenge som det kan brukes generelt for merking av nukleinsyre, og kan f.eks. være digoksigenin, biotin eller lignende, idet digoksigenin er foretrukket.

Fremgangsmåter for merkingen av nukleinsyreprobe er heller ikke generelt begrenset. Foretrukket er vanlig brukte metoder, slik som f.eks. metoder som inkorporerer markøren i produktet ved hjelp av PCR eller RT-PCR under anvendelse av merkede nukleotidsubstrater, "nick"-translasjon, anvendelse av vilkårlige primere, endemerking og metoder for syntetisering av oligonukleotid-DNA under anvendelse av merkede nukleotidsubstrater. En egnet metode kan velges fra disse metodene, avhengig av typen av nukleinsyreprobe.

Tilstedeværelsen i genomet av en ML-236B-produserende mikroorganisme med en nukleotidsekvens som er den samme som nukleotidsekvensen til en bestemt nukleinsyreprobe, kan be-kreftes ved hjelp av Southern blot-hybridisering med det genomiske DNA til den ML-236B-produserende mikroorganisme.

Southern blot-hybridisering kan utføres i henhold til metoden til Maniatis (beskrevet i Maniatis, T. et al., supra).

En merket nukleinsyreprobe, fremstilt som beskrevet ovenfor, kan brukes til å skreene et genomisk DNA-bibliotek. Valget av skreeningsmetode er ikke spesielt begrenset, så lenge som den er generelt passende for genkloning, men den er fortrinnsvis kolonihybridiseringsmetoden (beskrevet i Maniatis, T. et al., supra) .

Dyrking av koloniene som brukes til kolonihybridisering, utføres passende under betingelser som er egnet for vertscellene. Dyrking av Escherichia coli, en foretrukket vert, kan utføres ved inkubasjon i LB-agarmedium [1% (vekt/volum) trypton, 0,5% (vekt/volum) gjærekstrakt, 0,5% (vekt/volum) natriumklorid, 1,5% (vekt/volum) agarose] ved 30-37 °C i 18 timer til 2 dager.

Fremstilling av rekombinant DNA-vektor fra den positive klon erholdt ved hjelp av kolonihybridisering, utføres generelt ved å ekstrahere plasmidet fra kulturen med den positive klon og rense den.

En transformert Escherichia coli-stamme, Escherichia coli pML48 SANK71199 som representerer en positiv klon erholdt i henhold til foreliggende oppfinnelse, ble deponert ved Research Institute of Life Science and Technology of the Agency of Industrial Science and Technology 7. juli 1999 i henhold til Budapestkonvensjonen vedrørende deponering av mikroorganismer, og ble tildelt deponeringsnr. FERM BP-6780.

En typisk DNA-vektor som bæres av Escherichia coli pML48 SANK71199, ble betegnet pML48.

Bekreftelse av at den rekombinante DNA-vektor som er til stede i den positive klon, inneholder ML-236B-biosyntese-relatert, genomisk DNA, kan passende fastlegges med bestemmelse av nukleotidsekvensen til den rekombinante DNA-vektorinnføyelse, Southern blot-hybridisering eller ekspresjon av innføyelsen for å bestemme funksjon.

Nukleotidsekvensen til DNA kan bestemmes i henhold til Maxam og Gilbert sin kjemiske modifikasjonsteknikk [beskrevet i Maxam, A.M.M. og Gilbert W., Methods in Enzymology, 65, 499

(1980)] eller dideoksykjedetermineringsmetoden [beskrevet i Messing, J. og Vieira, J. Gene, 19, 269 (1982)]. Andre egnede metoder er velkjente innenfor teknikken. Plasmid-DNA som brukes til bestemmelse av nukleotidsekvens, er fortrinnsvis en prøve med høy renhet, som beskrevet ovenfor. Nukleotidsekvensen til pML48-innføyelsen er vist i SEQ ID NO: 1 i sekvenslisten. Nukleotidsekvensen vist i SEQ ID NO: 2 i sekvenslisten, er fullstendig komplementær med nukleotidsekvensen vist i SEQ ID NO: 1. Generelt kan en nukleotidsekvens i et genomisk DNA ha genetiske polymorfismer med en art, dvs. allogene forskjeller. I fremgangsmåten for DNA-kloning og sekvensering er det dessuten kjent at nukleotidsubstitusjoner eller andre endringer kan opptre ved en viss hyppighet. Følgelig omfatter det ML-236B-biosynteserelaterte, genomiske DNA ifølge foreliggende oppfinnelse også genomiske og andre DNA-er som kan hybridiseres til DNA med nukleotid nr. 1 til 34203 i SEQ ID NO: 1 eller 2 i sekvenslisten. Foretrukket er genomiske eller andre DNA-er som kan hybridiseres under stringent betingelse til DNA med nukleotid nr. 1 til 34203 i SEQ ID NO: 1 eller 2 i sekvenslisten. Disse DNA-ene omfatter DNA-et med nukleotid nr. 1 til 34203 i SEQ ID NO: 1 eller 2 i sekvenslisten, hvor ett eller flere nukleotider er substituert, delert og/eller addert. I tillegg kan disse hybridiserende genomiske eller andre DNA-er omfatte DNA som skriver seg fra andre ML-236B-produserende mikroorganismer enn Penicillium citrinum SANK13380, fortrinnsvis de som er i stand til å forbedre produksjonen av ML-236B når de innføres i en ML-236B-produserende mikroorganisme. ML-236B-biosynteserelatert, genomisk DNA analyseres passende i overensstemmelse med de følgende metoder 1) til 3).

1) Analyse med genanalyserende programvare

Gener innenfor genomisk DNA kan lokaliseres ved å anvende et program for å finne gener (heretter henvist til som "GRAIL"), og et program for leting etter homologe sekvenser

(BLASTN og BLASTX).

GRAIL er et program som leter etter strukturgener i genomisk DNA ved å separere den genomiske sekvens i syv para-metere for evaluering av fremkomsten av en gensekvens, og inte-grasjon av resultatene under anvendelse av en nøytral netto-metode [beskrevet i Uberbacher, E.C.&Mural, R.J., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 88, 11261 (1991)]. Som eksempel kan "ApoCom GRAIL Toolkit" [produsert av Apocom Corporation] anvendes.

BLAST er et program hvor det anvendes en algoritme for utførelse av homologisøk av nukleotidsekvenser og aminosyresekvenser [beskrevet i Altschul, S.F., Madden, T.L. et al., Nucl. Acids Res., 25, 3389 (1997)].

Stillingen og retningen til et strukturgen på en genomisk DNA-prøvesekvens kan forutsis ved å dele opp DNA-sekvensen i passende lengder og utføre et homologisøk i en genetisk database under anvendelse av BLASTN. Stillingen og retningen til strukturgenet på en DNA-sekvens som skal testes, kan også forutsis ved å translatere de oppdelte genomiske DNA-sekvenser i de seks translasjonsrammene (tre på sense-tråden og de øvrige tre på antisense-tråden) og utføre et homologisøk for de avledede aminosyresekvenser i en peptiddatabase under anvendelse av BLASTX.

Kodende regioner for strukturelle gener i genomisk DNA splittes noen ganger med introner i eukaryote organismer. For analyse av strukturelle gener som har slike åpninger, er BLAST-programmet for sekvenser som inneholder åpninger, mer effektivt, idet "Gapped"-BLAST-programmet (installert i BLAST2: WISCONSIN GCG "package ver." 10.0) er foretrukket.

2) Analyse ifølge Northern blot-hybridiseringsmetode

Ekspresjon av et strukturelt gen forutsagt ved hjelp av analysemetodene beskrevet i avsnitt 1), kan undersøkes ved å anvende Northern blot-hybridiseringsmetoden.

Passende fås total-RNA fra en ML-236B-produserende mikroorganisme fra en kultur av mikroorganismen. En kultur av den foretrukne ML-236B-produserende mikroorganisme Penicillium citrinum kan fås ved å inokulere mikroorganismen fra en skråagar i MGB3-8-medium, etterfulgt av inkubasjon med risting, idet man inkuberer ved 22-28 °C i 1 til 4 dager.

Valget av ekstraksjonsmetode for RNA fra en ML-236B-produserende mikroorganisme er ikke begrenset, og foretrukket er guanidintiocyanat-varmfenol-metoden, guanidintiocyanat-guanidin-saltsyre-metoden eller lignende. Eksempler på et kommersielt tilgjengelig sett for fremstilling av total-RNA med høyere renhet omfatter "RNeasy Plant Mini Kit" (produsert av Qiagen AG). Dessuten kan mRNA fås ved å anvende total-RNA på en oligo(dT)kolonne og utvinne fraksjonen adsorbert i kolonnen.

Overføring av RNA til en membran, fremstilling av en probe, hybridisering og påvisning av et signal kan utføres på en lignende måte med den ovenfor nevnte Southern blot-hybridiseringsmetode .

3) Analyse av 5<1->ende og 3'-ende av transkript

Analyse av 5'-enden og 3'-enden av hvert transkript kan utføres i henhold til "RACE"-metoden (rapid amplification av cDNA-ender). RACE er en metode for å oppnå et cDNA som omfatter en kjent nukleotidregion og en ukjent region i 5'-enden eller 3'-enden av et gen, hvor man anvender RT-PCR med mRNA som et templat [beskrevet i Frohman, M.A., Methods Enzymol. 218, 340

(1998)].

5'-RACE kan utføres i henhold til den følgende metode. Den første tråden i et cDNA syntetiseres i henhold til en reverstranskriptasereaksjon under anvendelse av mRNA som templat. Som primer anvendes antisense-oligonukleotider (1) som er utformet til en kjent del av nukleotidsekvensen. En homopolymer nukleotidkjede (bestående av én type base) adderes til 3<1->enden av den første tråden i cDNA under anvendelse av terminal-deoksy-nukleotidyltransferase. Så amplifiseres dobbelttrådet cDNA i 5'-

enderegionen ved hjelp av PCR under anvendelse av den første tråden i cDNA-et som templat. For amplifikasjon anvendes 2 primere; et DNA-oligonukleotid fra sense-tråden inneholdende en sekvens som er komplementær til den homopolymere sekvens, og et oligonukleotid (2) på antisense-tråden og på 3'-endesiden av oligonukleotid-DNA-et (1) [beskrevet i Frohman, M.A., Methods in Enzymol., 218, 340 (1993)]. Et sett for 5'-RACE er kommersielt tilgjengelig, passende 5<1->RACE "System for Rapid Amplification of cDNA ends", versjon 2.0 (produsert av GIBCO Corporation).

3'-RACE er en metode hvor det anvendes polyA-regionen som foreligger i 3'-enden av mRNA. Nærmere bestemt syntetiseres den første tråden i cDNA gjennom en reverstranskriptasereaksjon under anvendelse av mRNA som templat, og en oligo d(T)-adapter som primer. Så amplifiseres dobbelttrådet cDNA i 3<1->enderegionen ved hjelp av PCR under anvendelse av den første tråden i cDNA-et som templat. Som primere anvendes et DNA-oligonukleotid (3) på sense-tråden utformet til en kjent del av nukleotidsekvensen i sense-tråden, og oligo d(T)-adapteren på antisense-tråden. Et sett for 3<1->RACE er kommersielt tilgjengelig, passende settet "Ready-To-Go T-primed First-Strand" (Pharmacia Corporation).

Resultatene av analyse 1) og 2) ovenfor anvendes fortrinnsvis i RACE-fremgangsmåten, ved utformingen av primerne basert på en kjent del av den aktuelle nukleotidsekvens.

Ved å anvende metodene for analysen beskrevet i 1) til 3) ovenfor, kan retningen av et strukturelt gen på en genomisk DNA-sekvens, lokaliseringen av transkripsjonsinitieringssete i det strukturelle gen, stillingen til translasjonsinitierings-kodoner, samt translasjonstermineringskodon og stilling derav utledes. Basert på informasjonen ovenfor, kan hvert strukturelt gen og cDNA derav, nemlig ML-236B-biosynteseakselererende cDNA-er , erholdes.

Seks strukturelle gener antas å være til stede på den inkorporerte sekvens i en rekombinant DNA-vektor pML48 erholdt ifølge foreliggende oppfinnelse. De kalles henholdsvis mlcA, mlcB, mlcC, mlcD, mlcE og mlcR. Blant disse antas mlcA, mlcB, mlcE og mlcR å ha en kodende region på nukleotidsekvensen vist i SEQ ID NO: 2 i sekvenslisten. mlcC og mlcD antas å ha en kodende region på nukleotidsekvensen vist i SEQ ID NO: 1 sekvenslisten.

Eksempler på en metode for å oppnå de spesifikke ML-236B-biosynteseakselererende cDNA-er som tilsvarer de ovenfor nevnte strukturelle gener, omfatter: kloning med RT-PCR under anvendelse av primere utformet for sekvensen til hvert av de strukturelle genene og som flankerer DNA derav, og kloning fra et cDNA-bibliotek under anvendelse av passende DNA-prober utformet for kjente nukleotidsekvenser. Andre egnede metoder er velkjente innenfor teknikken. For å uttrykke funksjonelt cDNA som oppnås ifølge disse metodene, er det foretrukket å oppnå et fullengde-cDNA.

En metode for oppnåelse av ML-236B-biosynteseakseler-erende cDNA under anvendelse av RT-PCR er forklart nedenunder.

Et par primere for RT-PCR og for erholdelse av ML-236B-biosynteseakselererende cDNA må utformes slik at det selektivt annealerer med hver templatkjede for å muliggjøre oppnåelse av cDNA. Det er imidlertid ikke av avgjørende betydning at primerne for RT-PCR er fullstendig komplementære til en del av hver templatkjede, forutsatt at de tilfredsstiller betingelsen beskrevet ovenfor. Egnede primere for RT-PCR som kan annealere med antisense-kjeden (heretter henvist til som "sense-primer"), er sense-primere som er fullstendig komplementære til en del av antisense-kjeden (heretter henvist til som "usubstituert sense-primer") eller sense-primere som ikke er fullstendig komplementære til en del av antisense-kjeden (heretter henvist til som "partielt substituert sense-primer"). De øvrige egnede primere for RT-PCR som kan annealere med sense-kjeden (heretter henvist til som "antisense-primer"), er antisense-primere som er fullstendig komplementære til en del av sense-kjeden (heretter henvist til som "usubstituert antisense-primer") eller antisense-primere som ikke er fullstendig komplementære til en del av sense-kjeden (heretter henvist til som "partielt substituert antisense-primer").

En sense-primer utformes passende slik at RT-PCR-produktet som fås under anvendelse av den, inneholder kodonet ATG i den opprinnelige stilling for translasjonsinitiering. Passende inneholder RT-PCR-produktet også bare det korrekte translasjonstermineringskodon i leserammen som har det originale ATG-startsete, og ingen ytterligere (uekte) translasjonelle stoppseter. Stillingen til translasjonsinitieringskodonet i disse strukturelle genene forutsagt ved foreliggende oppfinnelse, er vist i tabell 5 for gener lokalisert i SEQ ID NO: 1 og SEQ ID NO: 2 i sekvenslisten.

5<1->enden av den usubstituerte sense-primer er passende nukleotidet "A" i translasjonsinitieringskodonet ATG, eller en base som befinner seg på 5'-endesiden derav.

En partielt substituert sense-primer annealerer selektivt med en spesifikk region i SEQ ID NO: 1 eller SEQ ID NO: 2 i sekvenslisten, idet nukleotidsekvensen til SEQ ID NO: 2 i sekvenslisten er fullstendig komplementær til SEQ ID NO: li sekvenslisten.

Når en partielt substituert sense-primer inneholder en nukleotidsekvens som er til stede på 3'-siden av translasjonsinitieringskodonet ATG, inneholder den passende ikke nukleotidsekvenser i denne regionen som er termineringskodoner (TAA, TAG eller TGA) i den samme leseramme som ATG.

En partielt substituert sense-primer kan inneholde nukleotid "A", nukleotidsekvens "AT" eller "ATG" (heretter henvist til som "nukleotid eller nukleotidsekvens m' ") som tilsvarer nukleotid "A", nukleotidsekvens "AT" eller "ATG" i translasjonsinitieringskodonet (heretter henvist til som "nukleotid eller nukleotidsekvens m"). Når nukleotidet rn' er "A", som tilsvarer "A" i sekvens "m", foretrekker vi at m'-"A" befinner seg i 3'-enden av den partielt substituerte sense-primer. Likeledes foretrekker vi, når m<1>er "AT", at denne m'-"AT"-sekvens befinner seg i 3'-enden av den partielt substituerte sense-primer. Når nukleotidet eller nukleotidsekvensen m er "ATG", svarende til m'-"ATG", foretrekker vi at disse tri-nukleotidene som er 3' i forhold til ATG i primeren, ikke er stoppkodoner. Med andre ord, for trinukleotider hvis 5'-ende-nukleotid er (3 x n + 1) nukleotid (n er et helt tall på én eller høyere) tellet fra A i m'-"ATG" i retningen til 3'-enden, er nukleotidsekvensen i trinukleotidet fortrinnsvis verken TAA, TAG eller TGA. Primere beskrevet ovenfor, kan anvendes til å oppnå cDNA som har et metioninkodon i stillingen som tilsvarer det translasjonene initieringskodon i mRNA som brukes som et RT-PCR-templat.

Når 3'-enden av den partielt substituerte sense-primer er nukleotidstilling (3 x n + 1), er trinukleotidet som begynner i denne stillingen, fortrinnsvis ikke TAA, TAG eller TGA i RT-PCR-produktet erholdt ved å anvende den partielt substituerte sense-primer som én av primerne, og RNA eller mRNA i den ML-236B-produserende mikroorganisme som templat, eller i PCR-produktene erholdt ved å anvende genomisk DNA eller cDNA som templat. Nukleotidstillingen telles fra "A" i translasjonsinitieringskodonet "ATG" i retningen mot 3'-enden, og hvor "n" er et helt tall på én eller høyere.

Når 3<1->enden av en partielt substituert sense-primer er nukleotidstilling (3 x n + 2), er tripletten som stilling 3 x n + 2 er det sentrale nukleotid i, fortrinnsvis ingen av sekvensene TAA, TAG eller TGA for et PCR- eller RT-PCR-produkt erholdt som ovenfor.

Når 3'-enden av en partielt substituert sense-primer er nukleotidstilling (3 x n + 3), er den tripletten som stilling (3 x n + 3) er 3'-nukleotidet for, fortrinnsvis ingen av sekvensene TAA, TAG eller TGA.

Kravene til sense-primeren er som omtalt ovenfor.

En antisense-primer er utformet slik at, når den pares sammen med sense-primeren, kan cDNA som koder for hvert av de strukturelle genene (mlcA, mlcB, mlcC, mlcD, mlcE og mlcR), amplifiseres ved å anvende RT-PCR i en retning ekvivalent med N-enden til C-enden av de tilsvarende peptider.

Valget av usubstituert antisense-primer er ikke begrenset, så lenge som det er en antisense-primer som har en nukleotidsekvens som er komplementær til en nukleotidsekvens lokalisert i regionen til det translasjonene termineringssete i cDNA-et. En primer som har en 5'-endebase som er komplementær til basen i 3'-enden av translasjonstermineringskodonet, eller som har en base på 5'-endesiden av primerbasen, er imidlertid foretrukket. En primer som inneholder tre baser som er komplementære til et translasjonstermineringskodon, er mest foretrukket. Tabellene 8-10 viser translasjonstermineringskodonet til hvert strukturelt gen, sekvensen som er komplementær til translasjonstermineringskodonet, en aminosyrerest i C-enden av peptidet kodet for av hvert strukturelt gen, nukleotidsekvensen som koder for aminosyreresten, og stillingen derav i SEQ ID NO: 1 eller SEQ ID NO: 2.

Partielt substituerte antisense-primere annealerer selektivt med en spesifikk region i nukleotidsekvensen ifølge SEQ ID NO: 1 eller SEQ ID NO: 2 i sekvenslisten.

Det ovenfor nevnte er krav til en antisense-primer.

Det er mulig å addere egnede nukleotidsekvenser til 5'-enden av de partielt substituerte sense-primere og de partielt substituerte antisense-primere, så lenge som de ovenfor nevnte krav er tilfredsstilt. Valget av en slik nukleotidsekvens er ikke spesielt begrenset, så lenge som primeren kan brukes til PCR. Eksempler på egnede sekvenser omfatter nukleotidsekvenser som er passende for kloningen av PCR-produkter, slik som restriksjonsenzymspaltingsseter og nukleotidsekvens inneholdende egnede restriksjonsenzymspaltingsseter.

I tillegg utformes sense-primeren og antisense-primeren passende i henhold til beskrivelsen ovenfor og i overensstemmelse med den generelle utforming av primer for PCR.

Som beskrevet ovenfor, kan mRNA eller total-RNA fra en ML-236B-produserende mikroorganisme anvendes som et templat for RT-PCR. Ved foreliggende oppfinnelse ble et ML-236B-biosyntese-akselererende cDNA som tilsvarer det strukturelle gen mlcE, erholdt ved utforming og syntetisering av et par primere egnet til å amplifisere hele den kodende region i det strukturelle gen mlcE i pML48-innføyelsessekvensen, og så utføre RT-PCR under anvendelse av total-RNA fra SANK13380 som templat (primere representert ved nukleotidsekvensene henholdsvis SEQ ID NO: 35 og 36 i sekvenslisten).

Et ML-236B-bi.osynteseakselererende cDNA som tilsvarer det strukturelle gen mlcR, ble erholdt på en lignende måte ved å anvende primere representert ved nukleotidsekvensene henholdsvis SEQ ID NO: 39 og 40 i sekvenslisten.

Som beskrevet ovenfor, kan RT-PCR-produktet klones ved inkorporering i en egnet DNA-vektor. Valget av DNA-vektor som anvendes for slik kloning, er ikke begrenset, og er passende en DNA-vektor som generelt anvendes til kloning av DNA-fragmenter. Sett for lettvint utførelse av kloning av et RT-PCR-produkt er kommersielt tilgjengelig, og det originale TA kloningssett

(produsert av Invitrogen: ved å anvende pCR2.1 som DNA-vektor)

er foretrukket.

Bekreftelse av funksjonell ekspresjon av ML-236B-biosynteseakselererende cDNA-er erholdt ved å anvende metodene ovenfor i en ML-236B-produserende mikroorganisme, kan fås ved kloning av cDNA i en DNA-vektor egnet for funksjonell ekspresjon i en ML-236B-produserende mikroorganisme. Egnede celler transformeres så med den rekombinante DNA-vektor, og ML-236B-bio-synteseevnen til de transformerte celler og ikke-transformerte vertsceller sammenlignes. Dersom ML-236B-biosynteseakselererende cDNA uttrykkes funksjonelt i den transformerte celle, så er ML-236B-biosynteseevnen til den transformerte celle forbedret sammenlignet med evnen til en vertscelle.

Valget av DNA-vektor som er egnet for ekspresjon i en ML-236B-produserende mikroorganisme (heretter henvist til som en funksjonell ekspresjonsvektor), er ikke spesielt begrenset, så lenge som den kan brukes til å transformere den ML-236B-produserende mikroorganisme og kan uttrykke polypeptidet kodet for av det ML-236B-biosynteseakselererende cDNA funksjonelt i den organismen. Fortrinnsvis er vektoren stabil i vertscellen og har en nukleotidsekvens som muliggjør replikasjon i vertscellen.

Vektoren for funksjonell ekspresjon kan inneholde ett eller mer enn ett av ML-236B-biosynteseakselererende cDNA-er, f.eks. cDNA-er som tilsvarer de strukturelle genene mlcE og/eller mlcR.

En vektor for funksjonell ekspresjon kan inneholde én eller mer enn én type DNA, forskjellig fra cDNA som tilsvarer de strukturelle genene mlcE og/eller mlcR, som akselererer biosyntese av ML-236B når det innføres i ML-236B-produserende mikroorganisme. Eksempler på slikt DNA omfatter: cDNA-er som tilsvarer strukturelle gener mlcA, mlcB, mlcC eller mlcD, ML-236B-biosynteserelatert, genomisk DNA, DNA som koder for ekspre-sjonsregulatorfaktorer for ML-236B-biosynteseakselererende cDNA ifølge foreliggende oppfinnelse, eller lignende.

En vektor for funksjonell ekspresjon omfatter fortrinnsvis en nukleotidsekvens som gir en selektiv fenotype til plasmidet i en vertscelle, og er fortrinnsvis en fergevektor.

Dessuten kan den selektive fenotype være en lege-middelresistent fenotype eller lignende, fortrinnsvis anti-biotikumresistens, eller mest foretrukket resistens mot ampicillin eller resistens mot hygromycin B.

I det tilfellet at ekspresjonsvektoren er en fergevektor, omfatter vektoren passende en nukleotidsekvens som lar vektoren replikere i en vertscelle fra én av mikroorganismegruppene, og en nukleotidsekvens som er nødvendig for ekspresjonen av polypeptid kodet for av vektorinnføyelsen i en annen vertscelletype. Det er foretrukket at vektoren gir en forskjellig selektiv fenotype til hver vertscelle fra de forskjellige mikroorganismegruppene som transformeres. Kravene til kombinasjoner av mikroorganismegrupper er lik med kravet til fergevektoren som brukes for kloning og ekspresjon av ML-236B-biosynteserelatert, genomisk DNA beskrevet i foreliggende beskrivelse.

Ved foreliggende oppfinnelse er en egnet fergevektor-DNA-vektor pSAK700, konstruert ved å kombinere 3-fosfoglyserat-kinasen (heretter henvist til som "pgk"), promoter som skriver seg fra Aspergillus nidulans som foreligger i DNA-vektoren pSAK333 (beskrevet i japansk patentsøknad med publikasjonsnr. 3-262486), en adapter for inkorporering av et fremmedgen, og pgk-terminator som foreligger i DNA-et, i denne rekkefølge (se figur 4) .

Et polypeptid kan uttrykkes i en ML-236B-produserende mikroorganisme ved å inkorporere cDNA-et som tilsvarer det strukturelle gen mlcE beskrevet ovenfor i ekspresjonsvektoren som er beskrevet ovenfor. Ved foreliggende oppfinnelse er en rekombinant cDNA-ekspresjonsvektor pSAKexpE blitt erholdt ved å inkorporere cDNA som tilsvarer det strukturelle gen mlcE, et adaptersete i pSAK700. Den inkorporerte sekvens i pSAKexpE, nemlig nukleotidsekvensen til cDNA som tilsvarer det strukturelle gen mlcE, er vist i SEQ ID NO: 37 i sekvenslisten. Likeledes er en rekombinant cDNA-ekspresjonsvektor pSAKexpR, blitt erholdt ved å inkorporere cDNA som tilsvarer det strukturelle gen mlcR i et adaptersete i pSAK700. Den inkorporerte sekvens i pSAKexpR, nemlig nukleotidsekvensen til cDNA som tilsvarer det strukturelle gen mlcR, er vist i SEQ ID NO: 41 i sekvenslisten.

Escherichia coli pSAKexpE SANK 724 99 som er Escherichia coli-stamme transformert ved hjelp av pSAKexpE, ble deponert ved Research Institute of Life Science and Technology of the Agency of Industrial Science and Technology 25. januar 2000 under deponeringsnr. FERM BP-7005 i overensstemmelse med Budapest konvensjonen vedrørende deponering av mikroorganismer. Escherichia coli pSAKexpR SANK 72599 som er Escherichia coli-stamme transformert ved hjelp av pSAKexpR, ble deponert ved Research Institute of Life Science and Technology of the Agency of Industrial Science and Technology 25. januar 2000 under deponeringsnr. FERM BP-7006 i overensstemmelse med Budapestkonvensjonen vedrørende deponering av mikroorganismer.

Egnede fremgangsmåter for transformasjon kan passende utvelges, avhengig av vertscellen, slik at man oppnår ekspresjon av ML-236B-biosynteseakselererende cDNA, ML-236B-biosyntese-relatert, genomisk DNA eller fragmenter derav. Transformasjon av Penicillium citrinum, en foretrukket ML-236B-produserende mikroorganisme, kan utføres ved å fremstille protoplaster fra sporer av Penicillium citrinum og så innføre rekombinant DNA-vektor i protoplasten [beskrevet i Nara, F. et al., Curr. Genet. 23, 28 (1993)].

Egnede sporer fra en skråagarkultur av Penicillium citrinum inokuleres på en plate av PGA-agarmedium og inkuberes ved 22-28 °C i 10-14 dager. Sporene innhøstes så fra platen og 1 x IO<7>- 1 x IO<9>sporer inokuleres i 50-100 ml YPL-20-dyrknings-medium [sammensetning: 0,1% (vekt/volum) gjærekstrakt (produsert av Difco Corporation), 0,5% (vekt/volum) polypepton (produsert av Nihon Seiyaku Corporation), 20% (vekt/volum) laktose, pH 5,0], og så inkuberes det ved 22-28 °C i 18 timer i 2 dager. Kimsporene utvinnes fra kulturen og behandles med celleveggnedbrytende enzymer, hvorved man får protoplaster. Valget av celleveggnedbrytende enzym er ikke spesielt begrenset, så lenge som det kan bryte ned celleveggen til Penicillium citrinum og ikke har en skadelig effekt på mikroorganismen. Eksempel på slike omfatter: zymolyase, chitinase eller lignende.

Blanding av en rekombinant DNA-vektor som omfatter et ML-236B-biosynteseakselererende cDNA og ML-236B-produserende mikroorganisme, eller protoplasten derav, under egnede betingelser muliggjør innføring av den rekombinante DNA-vektor i protoplasten, hvorved man får en transformant.

Dyrking av transformanter av ML-236B-produserende mikroorganisme utføres passende under betingelser som er egnet for hver av vertscellene. Dyrking av en transformant av Penicillium citrinum, en foretrukket ML-236B-produserende mikro organisme, kan utføres ved å dyrke den på forhånd transformerte protoplast under betingelser som er passende for å regenerere en cellevegg, og så dyrke. Den transformerte protoplasten av Penicillium citrinum kan nemlig innføres i VGS-midtlagsagarmedium [sammensetning: Vogel minimalmedium, 2% (vekt/volum) glukose,

1 M glusitol, 2% (vekt/volum) agar], VGS-midtlagsagaren plass-eres så mellom VGS-underlagsagarmedium [sammensetning: Vogel minimalmedium, 2% (vekt/volum) glukose, 1 M glusitol, 2,7%

(vekt/volum) agar] og VGS-topplagsagarmedium [sammensetning: Vogel minimalmedium, 2% (vekt/volum) glukose, 1 M glusitol, 1,5%

(vekt/volum) agar] inneholdende 800 jig/ml hygromycin B, og så inkuberes det ved 22-28 °C i 7-15 dager. Den resulterende stamme underdyrkes med inkubasjon ved 22-28 °C på PGA-medium. Stammen inokuleres med en platinanål i en skråkultur fremstilt av PGA-medium, inkubert ved 22-28 °C i 10-14 dager, og holdes så ved 0-4 °C.

Som beskrevet ovenfor, kan ML-236B fremstilles effektivt ved å inokulere en Penicillium citrinum- transformant erholdt fra en skråkultur som ovenfor, og som har en regenerert cellevegg, i MBG 3-8-medium, etterfulgt av inkubasjon ved 22-28 °C i 7-12 dager med risting. Penicillium citrinum som vert kan også dyrkes i væskemedium slik at ML-236B fremstilles.

Rensing av ML-236B fra kultur av en transformant av ML-236B-produserende mikroorganisme kan utføres ved å kombinere forskjellige metoder som anvendes generelt til rensing av naturlige produkter. Valget av slike metoder er ikke spesielt begrenset og kan f.eks. være ved sentrifugering, separasjon av faste stoffer og væsker ved filtrering, behandling med base eller syre, ekstraksjon med organiske oppløsningsmidler, opp-løsning, kromatografimetoder, slik som adsorpsjonskromatografi, fordelingskromatografi eller lignende, og krystallisasjon eller lignende. ML-236B kan være i enten hydroksysyre- eller lakton-form, som kan omdannes til hverandre. Hydroksysyren lar seg omdanne til et salt derav som er mer stabilt. Ved å anvende slike fysikalske egenskaper kan det oppnås ML-236B-hydroksy-syreformen (heretter henvist til som fri hydroksysyre), salter av ML-236B-hydroksysyre (heretter henvist til som et salt av hydroksysyre) eller ML-236B-laktonformen (heretter henvist til som lakton).

Kulturen underkastes alkalisk hydrolyse ved forhøyet temperatur eller romtemperatur for ringåpning og omdannelse til et salt av hydroksysyre, og reaksjonsoppløsningen surgjøres så, etterfulgt av filtrering. Filtratet ekstraheres med et organisk oppløsningsmiddel som skilles fra vann slik at et påtenkt produkt fås som en fri hydroksysyre. Valget av organisk oppløs-ningsmiddel er ikke spesielt begrenset. Eksempler på dette omfatter: alifatiske hydrokarboner, slik som heksan, heptan eller lignende; aromatiske hydrokarboner, slik som benzen, toluen eller lignende; halogenerte hydrokarboner, slik som metylenklorid, kloroform eller lignende; etere, slik som dietyl-eter eller lignende; estere, slik som etylformiat, etylacetat eller lignende; eller en blanding bestående av to eller flere oppløsningsmidler.

Den påtenkte forbindelse kan fås som et hydroksy-syresalt ved å oppløse den frie hydroksysyre i en vandig oppløsning av et alkalimetallsalt, slik som natriumhydroksid.

Dessuten kan den påtenkte forbindelse fås som lakton gjennom ringlukning ved oppvarming av den frie hydroksysyre i et organisk oppløsningsmiddel som skal dehydratiseres, eller ved hjelp av andre egnede metoder.

Det er mulig å rense og isolere den frie hydroksysyre, hydroksysyren eller laktonet som derved fås, ved å anvende kolonnekromatografi eller lignende. Bæreren for kolonnen som brukes i kromatografi, er ikke spesielt begrenset. Eksempler på slike omfatter: "Sephadex LH-20" (produsert av Pharmacia Corporation), "Diaion HP-20" (produsert av Mitsubishi Kagaku Corporation), silikagel, reversfasebærere eller lignende, idet bærere av C18-serien er foretrukket.

Valget av en fremgangsmåte for kvantifisering av ML-236B er ikke spesielt begrenset, men det er fortrinnsvis en fremgangsmåte som generelt anvendes til kvantifisering av organiske forbindelser. Eksempler på slike omfatter: reversfase-væskekromatografi med høy yteevne (heretter henvist til som "reversfase-HPLC") eller lignende. Kvantifisering ifølge reversfase-HPLC kan utføres ved å underkaste en kultur av en ML-236B-produserende mikroorganisme for alkalisk hydrolyse, underkaste

den oppløselige fraksjon for reversfase-HPLC under anvendelse av en C18-kolonne, måle UV-absorpsjon og omdanne absorpsjonsverdien

til en mengde av ML-236B. Valg av C18-kolonne er ikke spesielt begrenset, men er fortrinnsvis en C18-kolonne brukt til generell reversfase-HPLC. Eksempler på slike omfatter: SSC-ODS-262 (diameter 6 mm, lengde 100 mm, produsert av Senshu Kagaku Corporation) eller lignende. Valget av oppløsningsmiddel for fasen som er i bevegelse, er ikke spesielt begrenset, så lenge som det er et oppløsningsmiddel som generelt anvendes til reversfase-HPLC. Det er f.eks. 75 volum% metanol - 0,1 volum% trietylamin -

0,1 volum% eddiksyre eller lignende. Når ML-236B tilsettes ved romtemperatur til en SSC-ODS-262-kolonne, hvor 75 volum% metanol - 0,1 volum% trietylamin - 0,1 volum% eddiksyre anvendes som fase i bevegelse ved en hastighet på 2 ml/minutt, elueres ML-236B etter 4,0 minutter. ML-236B kan påvises ved å anvende en UV-detektor for HPLC. Den absorberte bølgelengde for UV-påvisning er 220-280 nm, fortrinnsvis 220-260 nm, mest foretrukket 236 nm.

Det tilveiebringes farmasøytiske preparater som inneholder ML-236B erholdt ved å anvende foreliggende oppfinnelse, sammen med en farmasøytisk bærer.

Det tilveiebringes også farmasøytiske preparater som inneholder pravastatin fremstilt fra ML-236B erholdt ved å anvende foreliggende oppfinnelse, sammen med en farmasøytisk bærer.

De farmasøytiske preparater ifølge denne oppfinnelsen kan være vanlige og de samme som de som anvendes for eksister-ende formuleringer av ML-236B eller pravastatin.

Behandlingsmetoder er også en del av denne oppfinnelsen og gjør bruk av forbindelsene eller preparatene til å behandle hyperlipemi og andre tilstander.

Oppfinnelsen vil nå bli illustrert nærmere med hen-visning til de etterfølgende figurer og eksempler.

Beskrivelse av figurene

Figur 1 er et diagram som viser konstruksjonen av DNA-vektor pSAKcosl. Figur 2 er resultatene av strukturell genanalyse av den innføyde sekvens pML4 8. Figur 3 viser Northern blot-hybridisering av den inn-føyde sekvens pML48. Figur 4 er et diagram som viser konstruksjonen av cDNA-ekspresjonsvektor pSAK700. Figur 5 viser RT-PCR-analyse for transkripsjon av mlcA-E og R i en pSAKexpR-transformant. Figur 6 viser RT-PCR-analyse for transkripsjon av mlcE i en pSAKexpE-transformant.

Eksempler på oppfinnelsen

Eksempel 1: Konstruksjon av pSAKcosl- vektor

Plasmid pSAK333 som inneholder hygromycin B-fosfotrans-ferasegenet (heretter henvist til som "HPT"), som skriver seg fra Escherichia coli (japansk patentsøknad med publikasjonsnr. 3-262486), ble fordøyd med restriksjonsenzym BamHI (produsert av Takara Shuzo Co., Ltd., Japan) og ble behandlet med T4DNA-polymerase slik at det ble dannet butte ender (produsert av Takara Shuzo Co., Ltd., Japan).

DNA-fragmentet erholdt som ovenfor, ble selvligert i en sirkulær form ved å anvende DNA-ligeringssett Ver.2 (produsert av Takara Shuzo Co., Ltd., Japan), og kompetente celler JM 109 av Escherichia coli (produsert av Takara Shuzo Co., Ltd., Japan) ble så transformert med dette. En stamme med et plasmid hvor BamHI-setet var delert, ble valgt ut fra den transformerte Escherichia coli, og ble betegnet pSAK360.

pSAK360 ble fordøyd med restriksjonsenzym PvuII og så behandlet med alkalisk fosfatase, hvorved det ble fremstilt et fragment defosforylert i 5'-enden. Et Sall-Scal-fragment (ca. 3 kb) inneholdende et cos-sete, ble erholdt fra en kosmidvektor pWE15 (fremstilt av STRATAGENE) og ble behandlet med T4DNA-polymerase slik at det ble dannet butte ender. Det ble deretter ligert til PvuII-setet i pSAK360. JM109 ble transformert med dette DNA. De stammene som hadde et plasmid hvori Sall-Scal-fragment (ca. 3 kb) var innføyd i PvuII-setet, ble valgt ut fra den transformerte Escherichia coli, og plasmidet båret av stammen, ble betegnet pSAKcosl. pSAKcosl inneholder et spaltingssete for restriksjonsenzymene BamHI, EcoRI og Noti, hvor hvert sete skrev seg fra pWE15. pSAKcosl har et ampicillin-resistensgen og et hygromycinresistensgen som utvelgelses-markører.

I de etterfølgende eksempler hvor Escherichia coli ble brukt som en vert, ble utvelgelse av pSAKcosl-transformanter eller transformanter av pSAKcosl som omfatter en fremmedgen-innføyelse, utført ved å tilsette 40 ug/ml ampicillin (Ampicillin: produsert av Sigma Corporation) til det relevante medium. Når Penicillium citrinum SANK13380 ble brukt som vert, ble utvelgelse av pSAKcosl-transformanter eller transformanter av pSAKcosl som omfatter en fremmedgeninnføyelse, utført ved å tilsette 200 ug/ml hygromycin (hygromycin B: produsert av Sigma Corporation) til det relevante medium.

Fremgangsmåten for konstruksjon av pSAKcosl er vist i figur 1.

Eksempel 2: Fremstilling av genomisk DNA fra Penicillium citrinum SANK 13380

1) Kultur av Penicillium citrinum SANK 13380

En inokulasjonskultur av Penicillium citrinum SANK 13380 ble laget på en PGA-mediumskråagar. Agaren ble således inokulert med Penicillium citrinum SANK 13380 under anvendelse av en platinanål og holdt ved 26 °C i 14 dager. Skråagaren ble holdt ved 4 °C.

Hoveddyrking ble utført ved hjelp av flytende kultur med lufting. Celler fra et 5 mm kvadrat av den ovenfor nevnte skråagar ble inokulert i 50 ml MBG3-8-medium i 500 ml konisk kolbe og inkubert ved 26 °C med risting ved 210 rpm i 5 dager.

2) Fremstilling av genomisk DNA fra Penicillium citrinum SANK 13380

Kulturen erholdt i trinn 1), ble sentrifugert i 10 000 x G ved romtemperatur i 10 minutter, og cellene ble innhøstet.

3 g (våtvekt) av celler ble brutt opp i en morter avkjølt med tørris slik at de var i form av et pulver. De oppbrutte celler ble plassert i et sentrifugerør fylt med 20 ml 62,5 mM EDTA-2Na (produsert av Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) - 5%

(vekt/volum) SDS - 50 mM Tris-saltsyre (produsert av Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) buffer (pH 8,0) og ble forsiktig blandet, og fikk så stå ved 0 °C i 1 time. 10 ml fenol mettet med 10 mM Tris-saltsyre - 0,1 mM EDTA-2Na (pH 8,0, heretter henvist

til som "TE") ble tilsatt og blandingen forsiktig omrørt ved 50 °C i 1 time.

Etter sentrifugering ved romtemperatur ved 10 000 x G i 10 minutter ble 15 ml av topplaget (vannfasen) plassert i et annet sentrifugerør. Til oppløsningen ble det tilsatt 0,5 ganger volum av TE-mettet fenol og 0,5 ganger volum av kloroformoppløs-ning. Blandingen ble omrørt i 2 minutter og sentrifugert ved romtemperatur ved 10 000 x G i 10 minutter (heretter henvist til som "fenol-kloroform-ekstraksjon"). Til 10 ml av topplaget (vannfasen) ble det tilsatt 10 ml 8 M ammoniumacetat (pH 7,5) og 25 ml 2-propanol (produsert av Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), etterfulgt av avkjøling ved -80 °C i 15 minutter og sentrifugering ved 4 °C ved 10 000 x G i 10 minutter.

Etter utfelling ble utfellingene oppløst i 5 ml TE, hvoretter 20 ul 10 mg/ml ribonuklease A (produsert av Sigma Corporation) og 250 enheter ribonuklease Tl (produsert av GIBCO Corporation) ble tilsatt, etterfulgt av inkubasjon ved 37 °C i 20 minutter. 20 ml 2-propanol ble tilsatt, og det ble forsiktig blandet. Deretter ble tråder av genomisk DNA viklet opp på toppen av en Pasteur-pipette og oppløst i 1 ml TE.

Deretter ble 0,1 ganger volum av 3 M natriumacetat (pH 6,5) og 2,5 ganger volum etanol tilsatt til DNA-oppløsningen. Oppløsningen ble avkjølt til -80 °C i 15 minutter og så sentrifugert ved 4 °C og 10 000 x G i 5 minutter (heretter henvist til som "etanolutfelling"). Den resulterende utfelling ble oppløst i 200 ul TE og var en genomisk DNA-fraksjon.

Eksempel 3: Fremstilling av genomisk DNA- bibliotek fra Penicillium citrinum SANK 13380

1) Fremstilling av genomisk DNA-fragment

0,25 enheter Sau3AI (Takara Shuzo Co., Ltd., Japan) ble tilsatt til 100 ul av en vandig oppløsning av genomisk DNA

(50 ug) av Penicillium citrinum SANK 13380 erholdt i eksempel 2. Etter intervaller på 10, 30, 60, 90 og 120 sekunder ble det tatt 20 ul prøver av blandingen, og 0,5 M EDTA (pH 8,0) ble tilsatt til hver prøve for å avslutte restriksjonsenzymreaksjonen. De resulterende, delvis fordøyde DNA-fragmenter ble separert ved

hjelp av agarosegelelektroforese, og agarosegel ble utvunnet inneholdende DNA-fragmenter på 30 kb eller mer.

Den utvundne gel ble finmalt og plassert i "Ultra Free C3 Centrifuged Filtration Unit" (produsert av Japan Millipore Corporation). Gelen ble avkjølt ved -80 °C i 15 minutter inntil den var nedfryst, og gelen ble så smeltet ved inkubasjon av den ved 37 °C i 10 minutter. Det ble sentrifugert ved 5 000 x G i 5 minutter for å ekstrahere DNA. DNA-et ble underkastet fenol-kloroform-ekstraksjon og etanolutfelling. De resulterende ut-fellinger ble oppløst i en liten, passende mengde TE.

2) Forbehandling av DNA-vektor pSAKcosl

pSAKcosl ble fordøyd med restriksjonsenzym BamHI (Takara Shuzo Co., Ltd., Japan) og så underkastet alkalisk fosfatase (Takara Shuzo Co., Ltd., Japan), behandlet ved 65 °C i 30 minutter. Den resulterende reaksjonsoppløsning ble underkastet fenol-kloroform-ekstraksjon og etanolutfelling. Den resulterende utfelling ble oppløst i en liten mengde TE.

3) Ligering og in vitro-pakking

Det genomiske DNA-fragment (2 ug) beskrevet i trinn 1) ovenfor og pSAKcosl (1 ug) underkastet forbehandling som ovenfor, ble blandet og så ligert ved 16 °C i 16 timer under anvendelse av DNA-ligeringssett Ver.2 (Takara Shuzo Co., Ltd., Japan). Den resulterende reaksjonsoppløsning ble underkastet fenol-klorof orm-ekstraksjon og etanolutfelling. De resulterende ut-fellinger ble oppløst i 5 ul TE. Ligeringsproduktoppløsningen ble underkastet in vitro-pakking under anvendelse av "GIGAPAK II Gold"-sett (produsert av STRATAGENE Corporation), hvorved man fikk Escherichia coli-transformanter som inneholder en rekombinant DNA-vektor. 3 ml LB-medium ble helt over på en plate hvor kolonier av Escherichia coli-transformant var dannet, og så ble koloniene på platen utvunnet ved å anvende en celleskrape (henvist til som "utvunnet oppløsning 1"). Platen ble vasket med ytterligere 3 ml LB-medium og celler utvunnet (henvist til som "utvunnet oppløsning 2"). Glyserol ble tilsatt til en blanding av utvunnet oppløsning 1 og 2, hvorved man fikk en sluttkonsentrasjon på 18% (henvist til som Escherichia coli-celleoppløs- ning) som ble holdt ved -80 °C som et genomisk DNA-bibliotek fra Penicillium citrinum SANK 13380.

Eksempel 4: Amplifikasjon av PKS- genfragment ved hjelp av PCR under anvendelse av genomisk DNA fra Penicillium citrinum SANK 13380 som templat

1) Utforming og syntese av primere for PCR

Basert på aminosyresekvensen til et PKS-gen fra Aspergillus flavus (beskrevet i Brown, D.W. et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 93, 1418 (1996)), ble degenererte primere vist i SEQ ID NO: 3 og 4 i sekvenslisten, utformet og syntetisert. Syntesen ble utført i henhold til fosfoamidittmetoden.

SEQ ID NO: 3 i sekvenslisten:

gayacngentgyastte

SEQ ID NO: 4 i sekvenslisten:

tcnccnknrcwgtgncc

I nukleotidsekvensen ifølge SEQ ID NO: 3 og 4 er n inosin (hypoksantin), y er t eller c, s er g eller c, k er g eller t, r er g eller a, og w er a eller t.

2) Amplifikasjon av DNA-segment ved hjelp av PCR

50 ul reaksjonsoppløsning ble fremstilt inneholdende primerne for PCR beskrevet i trinn 1) ovenfor (hver 100 pmol), genomisk DNA fra Penicillium citrinum SANK 13380 erholdt i eksempel 2 (500 ng), 0,2 mM dATP, 0,2 mM dCTP, 0,2 mM dGTP, 0,2 mM dTTP, 50 mM kaliumklorid, 2 mM magnesiumklorid og 1,25 enheter Ex. Tac DNA-polymerase (Takara Shuzo Co., Ltd., Japan). Oppløs-ningen ble underkastet en reaksjonssyklus bestående av tre på hverandre følgende trinn som følger: 1 minutt ved 94 °C, 2 minutter ved 58 °C og 3 minutter ved 70 °C. Syklusen ble gjentatt 30 ganger for å amplifisere DNA-fragmentet. PCR ble utført ved å anvende "TaKaRa PCR Thermal Cycler MP TP 3000" (produsert av Takara Shuzo Co., Ltd., Japan).

De amplifiserte DNA-fragmenter ble underkastet agarosegelelektroforese, og så ble det utvunnet agaroseholdige DNA-fragmenter med en størrelse på ca. 1,0 til 2,0 kb. DNA ble utvunnet fra gelen og underkastet fenol-kloroform-ekstraksjon og etanolutfelling. Den resulterende utfelling ble oppløst i en liten mengde TE.

3) Ligering og transformasjon

DNA-fragmentet erholdt i trinn 2), ble ligert til plasmidet pCR2.1 under anvendelse av TA-kloningssystemet pCR2.1 (produsert av Invitrogen Corporation), idet plasmidet ble tilveiebrakt som del av settet. Plasmidet ble transformert i Escherichia coli JM109 for å tilveiebringe transformanter.

Flere kolonier ble valgt ut fra de resulterende transformanter og ble dyrket i henhold til metoden til Maniatis et al., [beskrevet i Maniatis, T. et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. utg., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)]. Hver av koloniene ble således inokulert i et 24 ml prøverør inneholdende 2 ml LB-medium og ble inkubert ved 37 °C i 18 timer med risting.

En rekombinant DNA-vektor ble fremstilt fra kulturen i henhold til den alkaliske metode (beskrevet i Maniatis, T. et al., supra). 1,5 ml av kulturoppløsningen ble således sentrifugert ved romtemperatur ved 10 000 x G i 2 minutter. Cellene ble så utvunnet fra utfellingen. Til cellene ble det tilsatt 100 ul av en oppløsning av 50 mM glukose, 25 mM Tris-saltsyre, 10 mM EDTA (pH 8,0), hvorved det ble dannet en suspensjon. Til denne ble det tilsatt 200 ul 0,2 N natriumhydroksid - 1%

(vekt/volum) SDS. Suspensjonen ble forsiktig omrørt for å lysere mikroorganismene. 150 ul 3 M kaliumacetat - 11,5% (vekt/volum) eddiksyre ble så tilsatt for å denaturere eventuelt protein, etterfulgt av sentrifugering ved romtemperatur ved 10 000 x G i 10 minutter. Supernatanten ble utvunnet. Supernatanten ble underkastet fenol-kloroform-ekstraksjon og etanolutfelling. Den resulterende utfelling ble oppløst i 50 ul TE inneholdende 40 ug/ml ribonuklease A (produsert av Sigma Corporation).

Hver av de rekombinante DNA-vektorene ble fordøyd med restriksjonsenzymer og underkastet elektroforese. Nukleotidsekvensene til DNA-innføyelsene i de rekombinante DNA-vektorene ble bestemt ved å anvende et DNA-sekvenseringsapparat (modell 377, produsert av Perkin Eimer Japan) for alle innføyelser med forskjellige fordøyelsesmønstre på elektroforese.

På denne måte ble det identifisert en stamme med rekombinant DNA-vektor inneholdende et PKS-fragment avledet fra Penicillium citrinum.

Eksempel 5: Genomisk Southern blotting- hybridisering av Peni - cillium citrinum SANK 13380

1) Elektroforese og overføring til membran

Det genomiske DNA (10 ug) fra Penicillium citrinum SANK 13380 erholdt i eksempel 2, ble fordøyd med restriksjonsenzymene EcoRI, Sali, Hindlll eller Sacl (alle produsert av Takara Shuzo Co., Ltd., Japan), og så underkastet agarosegelelektroforese. Gelen ble laget ved å anvende agarose L03 "TAKARA" (Takara Shuzo Co., Ltd., Japan). Etter elektroforese ble gelen bløtlagt i 0,25 N saltsyre (produsert av Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), og det ble inkubert ved romtemperatur i 10 minutter med forsiktig risting. Gelen ble overført til 0,4 N natriumhydroksid (produsert av Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) og forsiktig inkubert ved romtemperatur i 30 minutter. Ved å anvende den alkaliske overføringsmetode til Maniatis et al. [ supra) ble DNA i gelen overført på en nylonmembran "Hybond"-N+ (produsert av Amersham Corporation) og fiksert på den. Membranen ble vasket med 2 x SSC (1 x SSC inneholder 150 mM NaCl, 15 mM natriumsitrat) og så lufttørket.

2) Hybridisering og påvisning av signal

Membranen erholdt i trinn 1), ble hybridisert med PKS-genfragmentet erholdt i eksempel 4 som en probe.

For proben ble 1 ug av PKS-geninnføyelsesfragment-DNA-et erholdt i eksempel 4, merket med et DIG DNA merkingssett (produsert av Boehringer-Mannheim) og ble kokt i 10 minutter og så hurtig avkjølt like før bruk.

Membranen beskrevet i trinn 1), ble bløtlagt i hybri-diseringsvæske ("DIG Easy Hyb", produsert av Boehringer-Mannheim) og så underkastet forhybridisering med risting ved 20 rpm og 42 °C i 2 timer. Så ble den ovenfor nevnte, merkede probe tilsatt til hybridiseringsvæsken, og hybridisering ble utført med risting ved 20 rpm og 42 °C i 18 timer under anvendelse av "Multishaker Oven HB" (produsert av TAITEC Corporation). Membranen underkastet hybridisering, ble så underkastet tre vaskinger under anvendelse av 2 x SSC ved romtemperatur i 20 minutter, og to vaskinger under anvendelse av 0,1 x SSC ved

55 °C i 30 minutter.

Den vaskede membran ble behandlet med DIG lumines-cerende påvisningssett for nukleinsyrer (produsert av Boehringer-Mannheim) og eksponert for røntgenfilm (Lumifilm, produsert av Boehringer-Mannheim). Eksponering ble utført ved å anvende Fuji medisinsk filmprosessor FPM 800A (produsert av Fuji Film Corporation).

Som et resultat av dette ble det bekreftet at PKS-genfragmentet erholdt i eksempel 4, besto av genomet til Penicillium citrinum.

Eksempel 6: Skreening av genomisk DNA- bibliotek fra Penicillium citrinum SANK 13380 under anvendelse av PKS- genfragment som en probe

Kloning av et genomisk DNA-fragment inneholdende et PKS-gen, ble utført ved å anvende en kolonihybridiseringsmetode.

1) Fremstilling av membran

Escherichia coli-celleoppløsningen holdt som et genomisk DNA-bibliotek fra Penicillium citrinum SANK 13380 (beskrevet i eksempel 3), ble fortynnet og spredd ut på en LB-agarmediumplate, slik at 5 000 til 10 000 kolonier vil kunne vokse pr. plate. Platen ble holdt ved 26 °C i 18 timer og avkjølt ved 4 °C i 1 time. "Hybond"-N+ (produsert av Amersham Corporation) ble plassert på platen og brakt i kontakt med den i ett minutt. Membranen som kolonien var festet på, ble forsiktig fjernet fra platen. Overflaten som hadde vært i kontakt med koloniene, ble snudd opp ned og bløtlagt i 200 ml av en oppløsning av 1,5 M natriumklorid, 0,5 N natriumhydroksid i 7 minutter, og så bløt-lagt i 200 ml av en oppløsning av 1,5 M natriumklorid, 0,5 M Tris-saltsyre, 1 mM EDTA (pH 7,5) i 3 minutter to ganger, og så vasket med 400 ml 2 x SSC. Den vaskede membran ble lufttørket i 30 minutter.

2) Hybridisering

PKS-geninnføyelses-DNA-et erholdt i eksempel 4 (1 ug), ble brukt som en probe. DNA-et ble merket med anvendelse av et DIG DNA-merkingssett (produsert av Boehringer-Mannheim) og ble kokt i 10 minutter og hurtig avkjølt like før bruk.

Membranen beskrevet i trinn 1), ble bløtlagt i hybridi-seringsvæske ("DIG Easy Hyb", produsert av Boehringer-Mannheim) og så underkastet forhybridiseringsvasking ved 20 rpm og 42 °C i 2 timer. Så ble den ovenfor nevnte, merkede probe tilsatt til hybridiseringsvæsken, og hybridisering ble utført ved 20 rpm og

42 °C i 18 timer under anvendelse av "Multishaker Oven HB"

(produsert av TAITEC Corporation). Membranen som var underkastet hybridisering, ble underkastet tre vaskinger under anvendelse av 2 x SSC ved romtemperatur i 20 minutter og to vaskinger under anvendelse av 0,1 x SSC ved 68 °C i 30 minutter.

Den vaskede membran ble behandlet med DIG lumines-cerende påvisningssett for nukleinsyrer (produsert av Boehringer Mannheim) og eksponert for røntgenfilm (Lumifilm, produsert av Boehringer-Mannheim). Eksponering ble utført ved å anvende Fuji medisinsk filmprosessor FPM 800A (produsert av Fuji Film Corporation) .

De ovenfor nevnte trinn 1) og 2) er henvist til som skreening.

Kolonier på platen hvor det positive signal ble påvist ved den første skreening, ble skrapet av og utvundne celler oppslemmet i LB-medium. Så ble celler fortynnet passende og spredd ut på en egnet plate. Deretter ble en andre skreening utført for å rense den positive klon.

Den positive klon erholdt i det foreliggende eksempel, nemlig transformert Escherichia coli, Escherichia coli pML48 SANK 71199-stammen, ble deponert ved Research Institute of Life Science and Technology of the Agency of Industrial Science and Technology 7. juli 1999 under deponeringsnr. FERM BP-6780 i overensstemmelse med Budapestkonvensjonen vedrørende deponering av mikroorganismer.

Eksempel 7: Analyse av den innføyde sekvens av en rekombinant DNA- vektor pML4 8 ( 1)

Dyrking av Escherichia coli pML48 SANK 71199-stammen erholdt i eksempel 6 og fremstilling av en rekombinant DNA-vektor fra kulturen, ble utført på en lignende måte som den som er beskrevet i eksempel 4.

Den erholdte DNA-vektor ble betegnet pML48. Innføyelsen av pML48 som er et ML-236B-biosynteserelatert, genomisk DNA, ble fordøyd med forskjellige restriksjonsenzymer og resulterende fragmenter underklonet i pUC119 (produsert av Takara Shuzo Co., Ltd., Japan). Ved å anvende de resulterende subkloner som prober ble Southern blot-hybridisering utført ved hjelp av en lignende metode som den som er beskrevet i eksempel 5. Produktene som ble erholdt ved fordøyelse av pML48 med forskjellige restriksjonsenzymer, ble således underkastet elektroforese, og DNA-ene ble overført til en membran og underkastet hybridisering. Som et resultat av dette ble det laget et restriksjonsenzymspaltings-kart over den innføyde sekvens i pML48 ved å anvende teknikker som er standard innenfor fagområdet.

Nukleotidsekvensen til den innføyde sekvens i hver av subklonene ble bestemt ved å anvende DNA-sekvenseringsapparat modell 377 (produsert av Perkin Eimer Japan Co., Ltd.), etterfulgt av bestemmelse av hele nukleotidsekvensen til pML48.

Den innføyde sekvens av pML48 besto av i alt 34203 baser.

Nukleotidsekvensen til den innføyde sekvens av pML48 er beskrevet i SEQ ID NO: 1 og 2 i sekvenslisten. Sekvensene beskrevet i SEQ ID NO: 1 og 2 i sekvenslisten er fullstendig komplementære med hverandre.

Eksistens av strukturelle gener på pML48-innføyelses-sekvensen ble analysert ved å anvende et gensøkprogram GRAIL ("ApoCom GRAIL Toolkit": produsert av Apocom Corporation) og et homologisøkprogram BLAST ("Gapped-BLAST" (BLAST 2): installert i WISCONSIN GCG-pakningsver.10.0).

Som et resultat av dette ble det forutsagt å eksistere seks forskjellige strukturelle gener i den innføyde sekvens av pML48, og de ble betegnet henholdsvis mlcA, mlcB, mlcC, mlcD, mlcE og mlcR. Dessuten ble det forutsagt at mlcA, mlcB, mlcE og mlcR har en kodende region i nukleotidsekvensen ifølge SEQ ID NO: 2 i sekvenslisten, og mlcC og mlcD har en kodende region i nukleotidsekvensen ifølge SEQ ID NO: 1 i sekvenslisten. Den relative stilling og lengde av hvert av de antatte strukturgener i den innføyde sekvens ble også forutsagt.

Resultatene av foreliggende eksempel er vist i figur 2. Hver pil indikerer lokalisering, retning og relativ størrelse til hvert strukturelt gen på pML48-innføyelsen. En pil som peker mot venstre, indikerer at den kodende region i et strukturelt gen eksisterer (mlcA, B, E eller R) på SEQ ID NO: 2. En pil som peker mot høyre, indikerer at den kodende region i et strukturelt gen (mlcC eller D) eksisterer på SEQ ID NO: 1.

Eksempel 8: Analyse av den innføyde sekvens av en rekombinant DNA- vektor pML4 8 ( 2)

Analyse av ekspresjon av de strukturelle gener hvis eksistens ble forutsagt i eksempel 7, ble utført ved hjelp av Northern blot-hybridisering og RACE. Analyse av 5'- og 3<1->ende-regioner ble utført.

1) Fremstilling av total-RNA fra Penicillium citrinum SANK 13380

Celler fra et 5 mm kvadrat i Penicillium citrinum SANK 13380-skråkulturen (beskrevet i eksempel 2) ble inokulert i 10 ml MGB3-8-medium i en 100 ml konisk kolbe, og det ble inkubert ved 26 °C i 3 dager med risting.

Fremstilling av total-RNA fra kulturen ble utført med "RNeasy Plant"-minisettet (produsert av Qiagen AG) hvor det gjøres bruk av guanidin-isotiocyanat-metoden. Kulturen ble således sentrifugert ved romtemperatur og 5 000 x G i 10 minutter for å utvinne celler. Deretter ble 2 g (våtvekt) av cellene nedfryst med flytende nitrogen og så knust i en morter for å lage et pulver. De knuste celler ble oppslemmet i 4 ml buffer for lyse (omfattet av settet). 450 ul av suspensjonen ble helt over i hver av 10 QIAshredder-spinnkolonner inneholdt i settet, og så sentrifugert ved romtemperatur ved 1 000 x G i 10 minutter. Hver av de resulterende eluenter ble utvunnet, og 225 ul etanol ble tilsatt til disse, som så ble tilsatt til en RNA mini-spinn-kolonne inneholdende settet. Kolonnen ble vasket med buffer for vasking inneholdt i settet, etterfulgt av eluer ing av adsorbat i hver kolonne med 50 ul ribonukleasefritt, destillert vann. Eluenten ble brukt som total RNA-fraksjon.

2) Northern blot-hybridisering

En RNA-prøve ble fremstilt ved å tilsette 2,25 ul av en vandig oppløsning inneholdende 20 ul total-RNA fra Penicillium citrinum SANK 13380 til: 1 ul 10 x MOPS (sammensetning: 200 mM 3-morfolinopropansulfonsyre, 50 mM natriumacetat, 10 mM EDTA-2Na, pH 7,0; brukt etter sterilisering ved 121 °C i 20 minutter i en autoklav, produsert av Dojinkagaku Laboratory Co. Ltd.), 1,75 ul formaldehyd og 5 ul formamid, etterfulgt av blanding. RNA-prøven ble holdt ved 65 °C i 10 minutter og så hurtig avkjølt i isvann og underkastet agarosegelelektroforese. Gelen for elektroforesen ble fremstilt ved å blande 10 ml 10 x MOPS og 1 g Agarose L03 "TAKARA" (produsert av Takara Shuzo Co., Ltd., Japan) med 72 ml pyrokarbonsyredietylesterbehandlingsvann (produsert av Sigma Corporation), varmet opp for å oppløse agarosen og så avkjølt, etterfulgt av tilsetning av 18 ml formaldehyd. Som prøvebuffer ble det brukt 1 x MOPS (fremstilt ved å fortynne 10 x MOPS med 10 ganger vann). RNA i gelen ble overført til "Hybond"-N+ (produsert av Amersham Corporation) i 10 x SSC.

DNA-fragmentene a, b, c, d og e, erholdt ved fordøyelse av den innføyde sekvens pML48 med restriksjonsenzymer 1 og 2 vist i den etterfølgende tabell 1, ble brukt som prober. Lokalisering av hver probe på pML48-innføyelsen er vist i det øverste panelet i figur 3.

Merking av prober, hybridisering og påvisning av signal ble utført i henhold til Southern blot-hybridisering beskrevet i eksempel 5.

Resultatene fra eksemplet er vist i det nedre panel i figur 3.

Hvert signal viser eksistensen av et transkripsjonspro-dukt som er homologt med nukleotidsekvensen i hver probe.

Resultatene tyder på at de strukturelle genene forutsagt å foreligge i den innføyde sekvens pML48 i foreliggende eksempel, nemlig mlcA, mlcB, mlcC, mlcD, mlcE og mlcR, ble transkribert i Penicillium citrinum SANK 13380.

Stillingen til hvert signal viser ikke den relative størrelse til transkripsjonsproduktet.

3) Bestemmelse av 5'-endesekvens ifølge 51 RACE

cDNA inneholdende 5<1->enderegionen til hvert strukturelt gen ble erholdt ved å anvende 51 RACE System for Rapid Amplification av cDNA-ender, versjon 2.0 (produsert av GIBCO Corporation) .

To typer antisense-oligonukleotid-DNA-er ble fremstilt. Utformingen var basert på nukleotidsekvensen antatt å være i den kodende region og nær 5'-enden til hvert strukturelt gen i den innføyde sekvens fra pML48, som forutsagt ved hjelp av resultatene i eksempel 7 og punkt 2) i foreliggende eksempel.

Nukleotidsekvensen til antisense-oligonukleotid-DNA-et (1) utformet basert på nukleotidsekvensen på 3'-endesiden av hvert strukturelt gen, er vist i tabell 2. Nukleotidsekvensen til antisense-oligonukleotid-DNA-et (2), utformet basert på nukleotidsekvensen på 5'-endesiden av hvert strukturelt gen, ble vist i tabell 3.

Den første cDNA-tråden ble syntetisert ifølge en reverstranskripsjonsreaksjon under anvendelse av oligonukleotid-DNA-et (1) som en primer, og total-RNA fra Penicillium citrinum SANK 13380 som templat. 24 ul av reaksjonsblandingen omfattende 1 ug total-RNA, 2,5 pmol oligonukleotid-DNA (1) og 1 ul SUPER SCRIPTTM II reverstranskriptase (inneholdt i settet) ble således inkubert ved 16 °C i 1 time, og reaksjonsproduktet ble tilsatt til GLASSMAX spinnpatron inneholdt i settet, for å rense den første cDNA-tråd.

En poly C-kjede ble addert til 3'-enden av cDNA-førstetråden under anvendelse av terminal-deoksyribonukleo-tidyltransferase inneholdt i settet. 50 ul av reaksjonsblandingen omfattende den første cDNA-tråd hvortil 3'-ende-poly C-kjeden var blitt addert, ble blandet med 4 0 pmol oligonukleotid-DNA (2) og 4 0 pmol Abridged Anchor Primer (inneholdt i settet), etterfulgt av inkubasjon ved 94 °C i 2 minutter. Inkubasjonssyklusen på 30 sekunder ved 94 °C,

30 sekunder ved 55 °C og 2 minutter ved 72 °C ble så gjentatt

35 ganger, etterfulgt av inkubasjon ved 72 °C i 5 minutter og ved 4 °C i 18 timer. Det resulterende produkt ble underkastet agarosegelelektroforese, og DNA ble utvunnet fra gelen. Produktet ble renset ved hjelp av fenol-kloroform-ekstraksjon og etanolutfelling og klonet på en lignende måte som ved fremgangsmåten beskrevet i eksempel 4 under anvendelse av pCR 2.1.

Operasjonen beskrevet ovenfor, er 5'-RACE.

Nukleotidsekvensen til cDNA-fragmentet inneholdende 5'-ende, ble bestemt, og stilling for transkripsjonsinitierings-punkt og translasjonsinitieringskodon ble forutsagt.

Tabell 4 viser SEQ ID NO: hvor nukleotidsekvensen til 5'-ende-cDNA-fragmentet som tilsvarer hvert strukturelt gen erholdt ved hjelp av 5' RACE, ble beskrevet. Tabell 5 viser det SEQ ID NO: hvor transkripsjonsinitieringspunktet og transla-sjonsinitieringspunktet i hvert strukturelt gen foreligger, og stillingen til transkripsjonsinitieringspunktet og translasjons-initieringspunktet.

4) Bestemmelse av 3'-endesekvens ifølge 3' RACE

cDNA inneholdende 3<1->enderegionen til hvert strukturelt gen, ble erholdt ved å anvende "Ready To Go: T-Primed First-Strand kit" (produsert av Pharmacia Corporation).

Én type sense-oligonukleotid-DNA (3) antatt å være i kodende region og nær 3'-enden i hvert strukturelt gen i den innføyde sekvens i pML48, ble fremstilt, forutsagt fra resultatene i eksempel 7 og punkt 2) i foreliggende eksempel.

Nukleotidsekvensen til oligonukleotid-DNA (3) fremstilt for hvert strukturelt gen, er vist i tabell 6.

Den første tråd i cDNA ble syntetisert ved hjelp av en reverstranskripsjonsreaksjon under anvendelse av Notl-d(T) 18-primeren (inneholdt i settet), og total-RNA fra Penicillium citrinum (1 ug) som templat.

100 ul av reaksjonsblandingen som omfatter den første tråd i cDNA, 40 pmol oligonukleotid-DNA (3) og Notl-d(T) 18-primer (inneholdt i settet), ble holdt ved 94 °C i 2 minutter. En inkubasjonssyklus på 30 sekunder ved 94 °C, 30 sekunder ved 55 °C og 2 minutter ved 72 °C ble gjentatt 35 ganger, etterfulgt av inkubasjon ved 72 °C i 5 minutter og ved 4 °C i 18 timer. Det resulterende produkt ble underkastet agarosegelelektroforese, og så ble DNA utvunnet fra gelen. Produktet ble renset ved hjelp av fenol-kloroform-ekstraksjon og etanolutfelling og klonet på en lignende måte som ved fremgangsmåten beskrevet i eksempel 4, under anvendelse av pCR 2.1.

Operasjonen beskrevet ovenfor, er 3'-RACE.

Nukleotidsekvensen til cDNA i 3'-enden ble bestemt, og stillingen til translasjonstermineringskodonet ble forutsagt.

Tabell 7 viser SEQ ID NO: i sekvenslisten hvor nukleotidsekvensen i 3'-ende-cDNA-fragmentet som tilsvarer hvert strukturelt gen erholdt ved hjelp av 3' RACE, er beskrevet. Tabell 8 viser det translasjonstermineringskodonet og stillingen til kodonet basert på SEQ ID NO: 1 og 2 i sekvenslisten.

Tabell 9 viser den C-terminale aminosyrerest i polypeptidet forutsagt å være kodet for av hvert strukturelt gen, nukleotidsekvensen til trinukleotidet som koder for aminosyreresten, og stillingen til trinukleotidet.

Tabell 10 oppsummerer sekvenskomplementariteten til translasjonstermineringskodonet vist i tabell 8, SEQ ID hvor den komplementære sekvens foreligger og stillingen til den komplementære sekvens.

Som beskrevet ovenfor, ble stillingen til hvert strukturelt gen, retningen derav og stillingen derav fastlagt. Basert på informasjonen ovenfor, kan transkripsjonsproduktet og trans-las j onsproduktet av hvert strukturelt gen erholdes.

Eksempel 9: Erholdelse av cDNA som tilsvarer det strukturelle gen mlcE

1) Fremstilling av total-RNA

Total-RNA fra Penicillium citrinum ble fremstilt i henhold til fremgangsmåten i eksempel 8.

2) Utforming av primer

For å oppnå et fullengde-cDNA som tilsvarer det strukturelle gen mlcE bestemt i eksempel 8, ble de følgende primere utformet og syntetisert: sense-primer 5<1->gttaacatgtcagaacctctaccccc-3' (SEQ ID NO: 35 i sekvenslisten), og

antisense-primer 5<1->aatatttcaagcatcagtctcaggcac-3<1>: (se SEQ ID NO: 36 i sekvenslisten.

Primerne avledes fra henholdsvis sekvensen i 5'-ende-oppstrømsregionen til strukturelt gen mlcE og fra sekvensen i 3<1->ende-nedstrømsregionen. Syntese ble utført i henhold til fosfoamidittmetoden.

3) RT-PCR

For å oppnå et fullengde-cDNA som koder for genpro-duktet fra mlcE, ble Takara RNA LA PCR-settet (AMV) versjon 1.1 brukt.

Nærmere bestemt ble 20 ul av en reaksjonsblanding som omfatter 1 ug total-RNA, 2,5 pmol Random 9-mers primer (inneholdt i settet) og 1 ul reverstranskripsjonsenzym (inneholdt i settet) inkubert ved 42 °C i 30 minutter for å fremstille første-tråden i cDNA. Reverstranskripsjonsenzymet ble så deaktivert ved oppvarming ved 99 °C i 5 minutter.

100 ul av en andre reaksjonsblanding som omfatter totalmengden av reaksjonsblandingen i førstetråden av cDNA (ovenfor), 40 pmol sense-primer og 40 pmol antisense-primer ble inkubert ved 94 °C i 2 minutter. En inkubasjonssyklus på 30 sekunder ved 94 °C, 30 sekunder ved 60 °C og 2 minutter ved 72 °C ble gjentatt 30 ganger, etterfulgt av inkubasjon ved 72 °C i 5 minutter og ved 4 °C i 18 timer. Det resulterende produkt ble underkastet agarosegelelektroforese, og DNA ble utvunnet fra gelen. Produktet ble renset ved hjelp av fenol-kloroform-ekstraksjon og etanolutfelling og brukt til å transformere Escherichia coli kompetent celle JM109-stamme (produsert av Takara Shuzo Co., Ltd., Japan) på en lignende måte som en fremgangsmåte beskrevet i eksempel 4 under anvendelse av pCR 2.1. En stamme som bærer et plasmid som har DNA-fragmentet, ble

valgt ut fra den transformerte Escherichia coli, og plasmidet båret av stammen, ble betegnet som pCRexpE.

Nukleotidsekvensen til det innføyde DNA i den resulterende rekombinante DNA-vektor pCRexpE ble bestemt. Det inn-føyde DNA inneholdt fullengde-cDNA som tilsvarer strukturelt gen mlcE. Nukleotidsekvensen derav og en aminosyresekvens for peptidet utledet fra nukleotidsekvensen, er vist i SEQ ID NO: 37 og/eller SEQ ID NO: 38 i sekvenslisten.

Den nærmeste kjente sekvens for mlcE (polypeptid) var ORF10 på genklyngen som er relatert til biosyntese av lovastatin, med 70% identitet.

Eksempel 10: Konstruksjon av ekspresjonsvektoren pSAK700

cDNA-ekspresjonsvektor pSAK700 ble konstruert ved å anvende vektoren pSAK333 og pSAK360 beskrevet i eksempel 1.

pSAK333 ble fordøyd med både restriksjonsenzym BamHI og Hindlll (produsert av Takara Shuzo Co., Ltd., Japan) og så underkastet agarosegelelektroforese. Det ble utvunnet et 4,1 kb stort fragment fra gelen, og enden av DNA-fragmentet ble gjort buttendet med T4-DNA-polymerase (produsert av Takara Shuzo Co., Ltd., Japan).

En EcoRI-Notl-BamHI-adapter (produsert av Takara Shuzo Co., Ltd., Japan) ble bundet til det ovenfor nevnte DNA-fragment ved å anvende DNA-ligeringssett versjon 2 (produsert av Takara Shuzo Co., Ltd., Japan). Escherichia coli kompetent celle JM109-stamme (produsert av Takara Shuzo Co., Ltd., Japan) ble transformert med ligert DNA. En stamme som bærer plasmidet som har adapteren, ble valgt ut fra den transformerte Escherichia coli, og plasmidet båret av stammen, ble betegnet som pSAK410.

pSAK360 ble fordøyd med begge restriksjonsenzymene PvuII og Sspl og underkastet elektroforese. Et DNA-fragment (ca. 2,9 kb) inneholdende promoteren og terminatoren for 3-fosfo-glyseratkinasegen (heretter henvist til som "pgk") og HPT som skriver seg fra Escherichia coli, ble utvunnet fra gelen.

Det utvundne, ovenfor nevnte DNA-fragment ble bundet

til PvuII-setet i pSAK410 under anvendelse av DNA-ligeringssett versjon 2 (produsert av Takara Shuzo Co., Ltd., Japan). Escherichia coli kompetent celle JM109-stammen ble transformert med det ligerte DNA. En stamme som bærer plasmidet som har DNA-frag-

mentet, ble valgt ut fra den transformerte Escherichia coli, og plasmidet båret av stammen, ble betegnet som pSAK700.

Konstruksjonen av pSAK700 er vist i figur 4.

pSAK700 har ett restriksjonsenzymsete for hvert av enzymene BamHI og Noti. pSAK700 har også et ampicillinresistens-gen (heretter henvist til som "Amp<r>" og hygromycinresistensgen HTP som en seleksjonsmarkør. I de etterfølgende eksempler ble, når Escherichia coli anvendes som vert, utvelgelse av celler transformert ved hjelp av pSAK700 eller ved hjelp av pSAK700 som omfatter en fremmed-DNA-innføyelse, utført ved å tilsette 40 ug/ml ampicillin til det relevante medium. Når Penicillium citrinum SANK 13380 anvendes som vert, ble utvelgelse av celler transformert ved hjelp av pSAK700 eller ved hjelp av pSAK700 omfattende en fremmed-DNA-innføyelse, utført ved å tilsette 200 jig/ml hygromycin til det relevante medium.

Eksempel 11: Konstruksjon av cDNA- ekspresjonsvektor pSAKexpE

Rekombinant DNA-vektor pCRexpE erholdt i eksempel 9, ble omsatt ved 37 °C i 2 timer i nærvær av restriksjonsenzymene Hpal og Sspl (produsert av Takara Shuzo Co., Ltd., Japan), og reaksjonsproduktet ble underkastet agarosegelelektroforese. Et bånd inneholdende et fullengde-cDNA fra mlcE rundt 1,7 kb, ble utvunnet fra gelen.

Etter å ha omsatt pSAK700 med restriksjonsenzymet Noti (produsert av Takara Shuzo Co., Ltd., Japan) ved 37 °C i 1 time ble enden av vektoren gjort buttendet med T4-DNA-polymerase (Takara Shuzo Co., Ltd., Japan) ved 37 °C i 5 minutter. Så ble vektoren underkastet fenol-kloroform-ekstraksjon og etanol-utf elling. Det utfelte DNA ble oppløst i en liten mengde TE. Alkalisk fosfatase ble tilsatt og ble inkubert ved 65 °C i 30 minutter. pSAK700, fremstilt som beskrevet ovenfor, ble ligert til 1,7 kb av DNA-fragment erholdt i trinn 1) under anvendelse av DNA-ligeringssett versjon 2 (produsert av Takara Shuzo Co., Ltd., Japan). Escherichia coli kompetent celle JM109-stamme ble transformert ved å anvende det ligerte DNA. En Escherichia coli-stamme transformert ved hjelp av cDNA-ekspresjonsvektor, ble erholdt.

Den transformerte Escherichia coli, kalt Escherichia coli pSAKexpE SANK 72499, erholdt i det foreliggende eksempel, ble deponert ved Research Institute of Life Science and Technology of the Agency of Industrial Science and Technology 25. januar 2000 under deponeringsnr. FERM BP-7005 i overensstemmelse med Budapestkonvensjonen vedrørende deponering av mikroorganismer .

Eksempel 12: Erholdelse av cDNA som tilsvarer det strukturelle gen mlcR

1) Fremstilling av total-RNA

Total-RNA fra Penicillium citrinum ble fremstilt i henhold til metoden ifølge eksempel 8.

2) Utforming av primer

For å oppnå et fullengde-cDNA som tilsvarer det strukturelle gen mlcR bestemt i eksempel 8, ble de følgende primere utformet og syntetisert:

Primerne ble utformet fra henholdsvis sekvensen i 5'-ende-oppstrømsregionen i strukturelt gen mlcR og fra sekvensen i 3'-ende-nedstrømsregionen. Syntese ble utført i henhold til fosfoamidittmetoden.

3) RT-PCR

For å oppnå et fullengde-cDNA som koder for genpro-duktet av mlcR, ble det brukt et Takara RNA LA PCR-sett (AMV) versjon 1.1.

Nærmere bestemt ble 20 ul av en reaksjonsblanding som omfatter 1 ug total-RNA, 2,5 pmol Random 9-mers primer (inneholdt i settet) og 1 ul reverstranskripsjonsenzym (inneholdt i settet) inkubert ved 42 °C i 30 minutter for å fremstille den første tråden i cDNA. Reverstranskripsjonsenzymet ble så deaktivert ved oppvarming ved 99 °C i 5 minutter.

100 ul av en andre reaksjonsblanding som omfatter totalmengden av reaksjonsblandingen av den første tråd i cDNA (ovenfor), 40 pmol sense-primer og 40 pmol antisense-primer ble inkubert ved 94 °C i 2 minutter. En inkubasjonssyklus på 30 sekunder ved 94 °C, 30 sekunder ved 60 °C og 2 minutter ved 72 °C ble gjentatt 30 ganger, etterfulgt av inkubasjon ved 72 °C i 5 minutter og ved 4 °C i 18 timer. Det resulterende produkt ble underkastet agarosegelelektroforese, og DNA ble utvunnet fra gelen. Produktet ble renset ved hjelp av fenol-kloroform-ekstraksjon og etanolutfelling og brukt til å transformere Escherichia coli kompetent celle JM109-stamme (produsert av Takara Shuzo Co., Ltd., Japan) på en lignende måte som en fremgangsmåte beskrevet i eksempel 4 under anvendelse av pCR 2.1. En stamme som bærer et plasmid med DNA-fragmentet, ble valgt ut fra den transformerte Escherichia coli, og plasmidet båret av stammen, ble betegnet som pCRexpR.

Nukleotidsekvensen til det innføyde DNA i den resulterende rekombinante DNA-vektor pCRexpR ble bestemt. Det inn-føyde DNA inneholdt fullengde-cDNA som tilsvarer strukturelt gen mlcR. Nukleotidsekvensen derav og en aminosyresekvens for peptidet utledet fra nukleotidsekvensen, er vist i SEQ ID NO: 41 og/eller SEQ ID NO: 42 i sekvenslisten.

Den nærmeste kjente sekvens for mlcR (polypeptid) var lovE på genklyngen som er relatert til biosyntese av lovastatin, med 34% identitet.

Eksempel 13: Konstruksjon av cDNA- ekspresjonsvektor pSAKexpR

Rekombinant DNA-vektor pCRexpR erholdt i eksempel 12, ble omsatt ved 37 °C i 2 timer i nærvær av restriksjonsenzymet BamHI (produsert av Takara Shuzo Co., Ltd., Japan), og reaksjonsproduktet ble underkastet agarosegelelektroforese. Et bånd inneholdende et fullengde-cDNA fra mlcR rundt 1,4 kb, ble utvunnet fra gelen.

Etter å ha omsatt pSAK700 med restriksjonsenzymet BamHI (produsert av Takara Shuzo Co., Ltd., Japan) ved 37 °C i 1 time ble alkalisk fosfatase (produsert av Takara Shuzo Co., Ltd., Japan) tilsatt, og det ble omsatt ved 65 °C i 30 minutter. pSAK700 fordøyd med BamHI som beskrevet ovenfor, ble ligert til 1,4 kb DNA-fragment erholdt i trinn 1) under anvendelse av DNA- ligeringssett versjon 2 (produsert av Takara Shuzo Co., Ltd., Japan). Escherichia coli kompetent celle JM109-stamme ble transformert med det ligerte DNA. En Escherichia coii-stamme transformert ved hjelp av cDNA-ekspresjonsvektor, ble erholdt.

Den transformerte Escherichia coli, kalt Escherichia coli pSAKexpR SANK 72599, erholdt i det foreliggende eksempel, ble deponert ved Research Institute of Life Science and Technology of the Agency of Industrial Science and Technology 25. januar 2000 under deponeringsnr. FERM BP-7006 i overensstemmelse med Budapestkonvensjonen vedrørende deponering av mikroorganismer .

Eksempel 14: Transformasjon av ML- 236B- produserende mikroorganismer

1) Fremstilling av protoplaster

Sporer fra en skråkultur av Penicillium citrinum SANK 13380-stamme ble inokulert på et PGA-agarmedium og så inkubert ved 26 °C i 14 dager. Sporene av Penicillium citrinum SANK 13380-stamme ble så utvunnet fra kulturen, og 1 x IO<8>sporer ble inokulert i 80 ml YPL-20-dyrkningsmedium og inkubert ved 26 °C i 1 dag. Etter bekreftelse av spiring av sporene ved observasjon under et mikroskop ble de spirte sporer sentrifugert ved romtemperatur ved 5 000 x G i 10 minutter og utvunnet som en utfelling.

Sporene ble vasket med sterilisert vann tre ganger for å danne protoplaster. 200 mg zymolyase 20 T (produsert av Seikagaku Kogyo Corporation) og 100 mg chitinase (produsert av Sigma Corporation) ble således oppløst i 10 ml 0,55 M magnesi-umkloridoppløsning og sentrifugert ved romtemperatur ved 5 000 x G i 10 minutter. Den resulterende supernatant ble brukt som en enzymoppløsning. 20 ml av enzymoppløsningen og 0,5 g (våtvekt) spirende sporer ble plassert i 100 ml konisk kolbe og inkubert med forsiktig risting ved 30 °C i 60 minutter. Etter å ha bekreftet at de spirende sporer ble protoplaster under anvendelse av et mikroskop, ble reaksjonsoppløsningen filtrert gjennom 3G-2 glassfilter (produsert av HAR10 Corporation). Filtratet ble sentrifugert ved romtemperatur ved 1 000 x G i 10 minutter, og så ble protoplastene utvunnet som en utfelling.

2) Transformasjon

Protoplastene erholdt i trinn 1), ble vasket to ganger med 30 ml 0,55 M magnesiumklorid og én gang med 30 ml av en oppløsning bestående av 0,55 M magnesiumklorid, 50 mM kalsium-klorid og 10 mM 3-morfolinopropansulfonat (pH 6,3 eller lavere, heretter henvist til som MCM-oppløsning). Protoplaster ble så oppslemmet i 100 ul av en oppløsning av 4% (vekt/volum) polyetylenglykol 8000, 10 mM 3-morfolinopropansulfonat, 0,0025%

(vekt/volum) heparin (produsert av Sigma Corporation), 50 mM magnesiumklorid (pH 6,3 eller lavere, heretter henvist til som "transformasjonsoppløsning"). 96 ul transformasjonsoppløsning inneholdende ca. 5 x IO<7>protoplaster og 10 ul TE inneholdende 120 ug pSAKexpE eller pSAKexpR, ble blandet og fikk stå på is i 30 minutter. Til dette ble det tilsatt 1,2 ml av en oppløsning av 20% (vekt/volum) polyetylenglykol, 50 mM magnesiumklorid, 10 mM 3-morfolino-propan-sulfonsyre (pH 6,3). Væsken ble så forsiktig pipettert og fikk så stå ved romtemperatur i 20 minutter. Til denne ble det tilsatt 10 ml MCM-oppløsning, etterfulgt av forsiktig blanding og sentrifugering ved romtemperatur ved 1 000 x G i 10 minutter. De transformerte protoplaster ble utvunnet fra utfellingen. 3) Regenerering av celleveggen til transformerte protoplaster

De transformerte protoplaster erholdt i trinn 2), ble oppslemmet i 5 ml flytende VGS midtlagsagarmedium og belagt på 10 ml størknet VGS nedre agarmediumplate. Platen ble inkubert ved 26 °C i 1 dag, hvoretter 10 ml flytende VGS toppagarmedium inneholdende 5 mg hygromycin B pr. plate (sluttkonsentrasjon av hygromycin på 200 ug/ml) ble lagt på toppen. Etter inkubasjon ved 26 °C i 14 dager ble begge stammene (dvs. de stammene som er avledet fra protoplaster transformert med pSAKexpE, eller pSAKexpR) underdyrket på PGA-agarmedium inneholdende 200 ug/ml hygromycin B, og underdyrket på en skråkultur fremstilt med PGA-agarmedium, inkubert ved 2 6 °C i 14 dager.

Skråkulturene ble tatt vare på ved 4 °C.

Testeksempel 1: Sammenligning av ML- 236B- biosynteseevne hos transformerte og opprinnelige stammer

De transformerte stammene erholdt i eksempel 14 og Penicillium citrinum SANK 13380 ble dyrket, og mengden av ML-236B i hver kultur ble målt.

Et 5 mm kvadratisk inokulum av sporer ble dyrket fra skråkulturene hvor de transformerte stammene var dyrket, som beskrevet i eksempel 14, og fra skråkulturen beskrevet i eksempel 2, relatert til Penicillium citrinum SANK 13380. Celler ble inokulert i 10 ml MBG3-8-medium i en 100 ml konisk kolbe og så inkubert ved 24 °C i to dager med risting, etterfulgt av tilsetning av 3,5 ml 50% (vekt/volum) glyseroloppløsning. Så ble dyrking fortsatt ved 24 °C i 10 dager med risting.

Til 10 ml av kulturen ble det tilsatt 50 ml 0,2 N natriumhydroksid, etterfulgt av inkubasjon ved 26 °C i 1 time med risting. Kulturen ble sentrifugert ved romtemperatur ved 3 000 x G i 2 minutter. 1 ml av supernatanten ble utvunnet, blandet med

9 ml 75% metanol og underkastet HPLC.

SSC-ODS-262 (med en diameter på 6 mm, lengde på 100 mm, produsert av Senshu Kagaku Co., Ltd.) ble brukt som HPLC-kolonne, og 75 volum% metanol - 0,1 volum% trietylamin -

0,1 volum% eddiksyre ble brukt som mobil fase. Eluering ble utført ved romtemperatur ved en strømningshastighet på

2 ml/minutt. Under disse betingelsene ble ML-236B eluert i

4 minutter etter tilsetning til kolonnen. Påvisning ble utført med en UV-detektor ved absorpsjonsbølgelengde på 236 nm. ML-236B-biosynteseevne ble økt hos tre stammer blant de åtte pSAKexpE-transformerte stammer. ML-236B-biosynteseevne til disse stammene var 10% høyere gjennomsnittlig sammenlignet med den opprinnelige stamme. ML-236B-biosynteseevne til disse tre stammene ble også holdt stabil etter subkultur, slik som mono-sporebehandling eller lignende. Disse resultatene indikerer at innføyelsen av pSAKexpE er et ML-236B-biosyntesakselererende cDNA. ML-236B-biosynteseevne ble økt hos fem stammer blant de pSAKexpR-transformerte stammer. ML-236B-biosynteseevne til disse stammene var 15% høyere gjennomsnittlig sammenlignet med den opprinnelige stamme. ML-236B-biosynteseevne til disse fem stammene ble også holdt stabil etter subkultur, slik som mono- sporebehandling eller lignende. Disse resultatene indikerer at innføyelsen av pSAKexpE er et ML-236B-biosynteseakselererende cDNA. ML-236B-biosynteseakselererende cDNA erholdt fra en ML-236B-produserende mikroorganisme ifølge foreliggende oppfinnelse, akselererer således ML-236B-biosyntese hos den ML-236B-produserende mikroorganisme når det innføres i den ML-236B-produserende mikroorganisme.

Eksempel 15: Bestemmelse av sekvensen til cDNA- er som tilsvarer de strukturelle genene mlcA- D

Sekvensen til det cDNA som tilsvarer det strukturelle gen mlcA, ble bestemt.

Førstetråds-cDNA-et ble syntetisert med TAKARA LA PCR-sett versjon 1.1 (Takara Shuzo Co., Ltd.). Flere PCR-er ble utført for amplifikasjon av hele eller en del av regionen i cDNA-et under anvendelse av førstetråds-cDNA-et som et templat og flere atskilte par av oligonukleotider som primere.

Syklusen på 30 sekunder ved 94 °C, 30 sekunder ved 60 °C og 5 minutter ved 72 °C ble gjentatt 30 ganger under anvendelse av Big Dye Primer/Terminator Cycle-sekvenseringssettet og ABI Prism 377-sekvensen (PE Applied Biosystems).

Produktet av hver reaksjon ble innføyd i plasmid pCR2.1 individuelt.

Escherichia coli-transformanter av hvert rekombinant plasmid ble erholdt.

Nukleotidsekvensene til hver innføyelse i de rekombinante plasmidene erholdt fra transformantene, ble bestemt.

Sekvensene til eksoner og introner ble bestemt på grunnlag av en sammenligning mellom nukleotidsekvensen til flere RT-PCR-produkter nevnt ovenfor, og til det strukturelle gen mlcA.

Sekvensen til cDNA som tilsvarer det strukturelle gen mlcA, ble så bestemt (SEQ ID NO: 43). Den tilsvarende aminosyresekvens til polypeptid kodet for av nevnte cDNA, ble forutsagt (SEQ ID NO: 44), og en funksjon av polypeptidet ble antatt på grunnlag av et homologisøk under anvendelse av aminosyresekvensen.

Den nærmeste kjente sekvens for mlcA (polypeptid) var LNKS(lovB) i genklyngen som er relatert til biosyntese av lovastatin, med 60% identitet.

På en lignende måte ble sekvensen til cDNA som tilsvarer det strukturelle gen mlcB, bestemt (SEQ ID NO: 45). Den tilsvarende aminosyresekvens til polypeptid kodet for av nevnte cDNA, ble forutsagt (SEQ ID NO: 46), og en funksjon av polypeptidet ble antatt på grunnlag av et homologisøk under anvendelse av aminosyresekvensen.

Den nærmeste kjente sekvens for mlcB (polypeptid) var LDKS(lovF) i genklyngen som er relatert til biosyntese av lovastatin, med 61% identitet.

Likeledes ble sekvensen til cDNA som tilsvarer det strukturelle gen mlcC, bestemt (SEQ ID NO: 47). Den tilsvarende aminosyresekvens til polypeptid kodet for av nevnte cDNA, ble forutsagt (SEQ ID NO: 48), og en funksjon av polypeptidet ble antatt på grunnlag av et homologisøk under anvendelse av aminosyresekvensen.

Den nærmeste kjente sekvens for mlcC (polypeptid) var lovA i genklyngen som er relatert til biosyntese av lovastatin, med 72% identitet.

Dessuten ble sekvensen til cDNA som tilsvarer det strukturelle gen mlcD, bestemt (SEQ ID NO: 49). Den tilsvarende aminosyresekvens til polypeptid kodet for av nevnte cDNA, ble forutsagt (SEQ ID NO: 50), og en funksjon av polypeptidet ble antatt på grunnlag av et homologisøk under anvendelse av aminosyresekvensen.

Den nærmeste kjente sekvens for mlcD (polypeptid) var 0RF8 i genklyngen som er relatert til biosyntese av lovastatin, med 63% identitet.

Stillingene til eksoner i hvert strukturelt gen ifølge SEQ ID NO: 1 eller SEQ ID NO: 2 ble bestemt som følger:

Thr-stUlingene til transkripsjonelt termineringssete i hvert strukturelt gen i SEQ ID NO: 1 eller SEQ ID NO: 2 ble bestemt som følger:

Eksempel 16: Studier av genoppbrytning

De strukturelle genene mlcA, B eller D fra P. citrinum ble brutt opp via seterettet mutagenese under anvendelse av homolog rekombinasjon.

Det rekombinante plasmid for erholdelse av den strukturelt gen mlcA-oppbrutte mutant fra P. citrinum, ble konstruert ved å anvende et plasmid, pSAK333.

Et 4,1 kb stort internt Kpnl-fragment fra mlcA-stedet på pML4 8-innføyelsen ble utvunnet, renset, gjort buttendet med et DNA "Blunting"-sett (Takara Shuzo Co., Ltd.) og ble ligert til PuuII-fordøyd pSAK333. Det resulterende plasmid ble betegnet som pdismlcA.

P. citrinujn SANK 13380 ble transformert ved hjelp av pdismlcA.

Southern-hybridisering av genomisk DNA fra pdismlcA-transformant ble utført for å bekrefte oppbrytningen av det strukturelle gen mlcA.

Den resulterende mlcA-oppbrutte mutant produserte ikke ML-236B eller dens forløper i det hele tatt.

Det rekombinante plasmid for erholdelse av den strukturelt gen mlcB-oppbrutte mutant fra P. citrinum ble konstruert ved å anvende et plasmid pSAK333.

Det ble utvunnet et 1,4 kb stort PsI-BamHI-fragment fra mlcB-stedet på pML48-innføyelsen, renset, gjort buttendet med et DNA "Blunting"-sett (Takara Shuzo Co., Ltd.) og ligert til PuuII-fordøyd pSAK333. Det resulterende plasmid ble betegnet som pdismlcB.

P. citrinum SANK 13380 ble transformert ved hjelp av pdismlcB.

Southern-hybridisering av genomisk DNA fra pdismlcB-transformant ble utført for å bekrefte oppbrytningen av det strukturelle gen mlcB.

Den resulterende mlcB-oppbrutte mutant produserte ikke ML-236B, men ML-236A, forløperen til ML-236B.

Det rekombinante plasmid for erholdelse av den strukturelt gen mlcD-oppbrutte mutant fra P. citrinum ble konstruert ved å anvende et plasmid, pSAK333.

Et 1,4 kb stort Kpnl-BamHI-fragment fra mlcD-stedet på pML48-innføyelsen ble utvunnet, renset, gjort buttendet med et DNA "Blunting"-sett (Takara Shuzo Co., Ltd.) og ligert til PuuII-fordøyd pSAK333. Det resulterende plasmid ble betegnet som pdismlcD.

P. citrinum SANK 13380 ble transformert ved hjelp av pdismlcD.

Southern-hybridisering av genomisk DNA fra pdismlcD-transformant ble utført for å bekrefte oppbrytningen av det strukturelle gen mlcD.

Mengden av ML-236B produsert ved hjelp av resulterende mlcD-oppbrutt mutant, var ca. 30% av mengden av den utransformerte kontrollvert.

Eksempel 17: Funksjonell analyse av mlcR i pSAKexpR- transformanter

To av pSAKexpR-transformantene som ble erholdt i eksempel 12, betegnet som henholdsvis TRI og TR2, og utransformerte vertsceller, Penicillium citrinum SANK 13380, ble inokulert i MBG3-8-medium og inkubert individuelt som beskrevet i eksempel 8.

Total-RNA ble ekstrahert fra hver av kulturene beskrevet i eksempel 8.

RT-PCR ble utført ved å anvende nevnte total-RNA som et templat og et par oligonukleotider utformet på grunnlag av nukleotidsekvens til de strukturelle genene mlcA, B, C, D, E eller R som primere.

Resultatene av RT-PCR-analyse er vist i figur 5 for den utransformerte Penicillium citrinum 13380, og for de to transformantene betegnet TRI, TR2.

De strukturelle genene mlcA, B, C, D og R ble uttrykt på den første, andre og tredje dag av dyrking i pSAKexpR-transformanter.

I motsetning til dette ble alle disse strukturelle genene uttrykt bare på den tredje dag av dyrking i utransformerte vertsceller.

Det var ingen forskjell i ekspresjonen av det strukturelle gen mlcE mellom pSAKexpR-transformanter og utransformerte vertsceller.

Resultatene tyder på at et protein kodet for av cDNA som tilsvarer et strukturelt gen mlcR, induserer transkripsjoner av noen av de øvrige strukturelle genene (f.eks. mlcA, B, C, D) lokalisert i den ML-236B-biosynteserelaterte genklynge.

Eksempel 18: Funksjonell analyse av mlcE i pSAKexpE- transformanter

En pSAKexpE-transformant betegnet som TEI, som ble erholdt i eksempel 12, og dens utransformerte vertsceller, Penicillium citrinum SANK 13380, ble inokulert i MBG3-8-medium og inkubert individuelt som beskrevet i eksempel 8.

Total-RNA ble ekstrahert fra hver av kulturene beskrevet i eksempel 8.

RT-PCR ble utført ved å anvende nevnte total-RNA som et templat, og et par av oligonukleotider utformet på grunnlag av nukleotidsekvens til de strukturelle genene mlcA, B, C, D, E eller R som primere. Anvendte primere for det foreliggende eksempel var identiske med de som er angitt i tabellen i det forutgående eksempel.

Resultatene av RT-PCR-analyse er vist i figur 6 for den utransformerte Penicillium citrinum 13380, og for en transformant betegnet TEI.

Det strukturelle gen mlcE ble uttrykt på den første, andre og tredje dag av dyrking i pSAKexpE-transformanter.

I motsetning til dette ble det strukturelle gen mlcE uttrykt bare på den tredje dag av dyrking i utransformerte vertsceller.

På den annen side var det ingen forskjell i ekspresjonen av de strukturelle genene mlcA, B, C, D og R mellom pSAKexpE-transformant og utransformerte vertsceller (data ikke vist) .

Resultatene tyder på at et protein kodet for av cDNA som tilsvarer et strukturelt gen mlcE, akselererer ML-236B-biosyntese uavhengig av de strukturelle genene mlcA, B, C, D og

R.

Claims

1. Polynukleotid,karakterisert vedat det er valgt fra gruppen bestående av: (a) et polynukleotid som koder for et protein med aminosyresekvensen ifølge SEQ ID NO: 42, (b) et polynukleotid som omfatter nukleotidsekvensen ifølge SEQ ID NO: 41, som er egnet for anvendelse ved akselerering av biosyntesen av ML-236B. (c) et polynukleotid som består av nukleotidsekvensen ifølge SEKV. ID. NR.: 41. (d) et polynukleotid som hybridiserer med et polynukleotid ifølge (a) til (c) under stringente betingelser, og som er kjennetegnet ved akselerering av biosyntesen av ML-23B i en ML-236B-produserende mikroorganisme som er innført i den ML-236B-produserende mikroorganismen, og (e) et mRNA som kan hybridisere med et polynukleotid ifølge (d) under stringente betingelser.

2. Polynukleotid ifølge krav 1,karakterisert vedat det omfatter DNA som kan erholdes fra transformert Escherichia coli pSAKexpR SANK 72599, deponert ved Research Institute of Life Science and Technology med deponeringsnr. FERM BP-7006.

3. Polynukleotid ifølge ethvert av de foregående krav,karakterisert vedat de er i operativ kombinasjon med ett eller flere nukleotider, og kombinasjonen er egnet for anvendelse i forsterking av fremstillingen av ML-236B i en ML-236B-produserende mikroorganisme.

4. Polynukleotid ifølge krav 3,karakterisert vedat det omfatter et polynukleotid ifølge krav 1 eller 2 i konjugasjon med et polynukleotid som koder for et protein som inkluderer eller består av aminosyresekvensen ifølge SEKV. ID. NR.: 38, 42, 44, 46, 48 eller 50.

5. Polynukleotid ifølge krav 3,karakterisert vedat det omfatter polynukleotidet ifølge SEKV. ID. NR.: 41, i kombinasjon med én eller flere sekvenser valgt fra SEKV. ID. NR.: 37, 41, 43, 45, 47 eller 49.

6. Polynukleotid ifølge ethvert av de foregående krav,karakterisert vedat det er et DNA.

7. Polynukleotid ifølge ethvert av de foregående krav,karakterisert vedat det er et genomisk DNA.

8. Polynukleotid ifølge krav 1 til 6,karakterisert vedat det er et cDNA.

9. Vektor, karakterisert vedat den omfatter et polynukleotid ifølge ethvert av de foregående krav.

10. Vektor ifølge krav 9, karakterisert vedat vektoren ytterligere omfatter et polynukleotid som har nukleotidsekvensen ifølge SEKV. ID. NR.: 37.

11. Vektor ifølge krav 9 eller 10, karakterisert vedat den videre omfatter ett eller flere polynukleotider valgt fra SEKV. ID. NR.: 43, 45, 47 eller 49.

12. Vektor ifølge krav 9, karakterisert vedat den lar seg erholde fra Escherichia coli pSAKexpR SANK 72599, deponert ved Research Institute of Life Science and Technology med deponeringsnr. FERM BP-7006.

13. Vektor ifølge ethvert av kravene 9 til 12,karakterisert vedat den er en ekspresj onsvektor.

14*<.>Vertscelle, karakterisert vedat den er transformert av en vektor ifølge hvilket som helst av kravene 9 til 13.

15. Vertscelle ifølge krav 14, karakterisert vedat den er en ML-236B-produserende mikroorganisme.

16. Vertscelle ifølge krav 15, karakterisert vedat den er Peniciilium-art.

17. Vertscelle ifølge krav 15 eller 16,karakterisert vedat den er Penicillium citrinum.

18. Vertscelle ifølge krav 14, karakterisert vedat den er Escherichia coli.

19. Vertscelle ifølge krav 18, karakterisert vedat den er Escherichia coli pSAKexpR SANK 72599, deponert ved Research Institute of Life Science and Technology med deponeringsnr. FERM BP-7006.

20. Polypeptid, karakterisert vedat det kodes for av et polynukleotid ifølge hvilket som helst av kravene 1 til 8.

21. Polypeptid ifølge krav 20, karakterisert vedat det omfatter sekvensen ifølge SEQ ID NO: 42, eller en variant derav som har minst 80% identitet med SEQ ID NO: 42, og som er i stand til å akselerere ML-236B-produksjon i en ML-236B-produserende mikroorganisme.

22. Polypeptid ifølge krav 20, karakterisert vedat den består av sekvensen ifølge SEQ ID NO: 42.

23. Fremgangsmåte for fremstilling av ML-236B,karakterisert vedat den omfatter å dyrke en vertscelle ifølge ethvert av kravene 14 til 17 og deretter gjenvinne ML-236B fra kulturen.

24. Fremgangsmåte ifølge krav 23,karakterisert vedat vertcellen blir transformert med en vektor som omfatter nukleotidsekvensen ifølge SEKV. ID. NR.: 41.

25. Fremgangsmåte for fremstilling av pravastatin,karakterisert vedat en fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av kravene 23 til 24 utføres, og ML-236B omdannes til pravastatin.