CZ20011367A3

CZ20011367A3 - Polynukleotid, vektor, hostitelská buňka, polypeptid, protilátka a způsob přípravy ML-236B

Info

Publication number: CZ20011367A3
Application number: CZ20011367A
Authority: CZ
Inventors: Hiroji Yoshikawa; Yuki Abe; Chiho Ono
Original assignee: Sankyo Company Limited
Priority date: 2000-04-18
Filing date: 2001-04-17
Publication date: 2001-12-12
Also published as: DE60130394T2; EP1149919A3; NO328653B1; NO20011890L; US20070111293A1; RU2236463C2; US20030078395A1; PL202457B1; HUP0101569A2; IL142619A; HK1037683A1; BR0101518A; PL347118A1; DK1149919T3; US7056710B2; NZ511166A; AU783319B2; CY1106985T1; CN1325959A; PT1149919E

Description

Ά V ULoo A — Polynukleotid, vektor, hostitelská buňka, polypeptid, protilátka a způsob přípravy ML-236B

Oblast techniky

Vynález popisuje skupinu genů, zejména pak charakterizuje jednotlivé geny ze této skupiny genů.

Zvláště pak se vynález vztahuje na polynukleotidy, jako je DNA, které urychlují biosyntézu inhibitoru HMG-CoA reduktasy označeného ML-236B, a to v mikroorganismech produkujících ML-236B po zavedení této DNA. Vynález se dále vztahuje na vektory, do kterých jsou řečené polynukleotidy vloženy, hostitelské buňky transformované danými vektory, proteiny exprimované pomocí daných vektorů, způsob přípravy uvedených polynukleotidů a/nebo proteinů, kde způsob přípravy zahrnuje i izolaci ML-236B z kultury řečených hostitelských buněk a kdy se vynález vztahuje dále na všechny přidružené aspekty.

Dosavadní stav techniky

Pravastatin je inhibitor HMG-CoA reduktasy. Sodná sůl pravastatinu se používá k léčbě hyperlipemie nebo hyperlipidemie a má prokazatelný farmakologický vliv na snížení hladiny cholesterolu v séru. Pravastatin lze získat užitím Streptomyces carbophilus pomocí mikrobiální konverze ML-236B produkovaného Penicillium citrinum [popsáno v: Endo, A., a další, J. Antibiot.,29 1346(1976); Matsuoka, T., a další., Eur. J. Biochem., 184, 707 (1989) a v Japonské patentové publikaci č. 57-2240].

Bylo dokázáno, že jak ML-236B, jako prekurzor pravastatinu, tak lovastatin, který je inhibitorm HMG-CoA, obsahují tutéž parciální strukturu. Jsou biologicky syntetizovány cestou přes polyketidy [popsáno v: Moore, R.N., a další, J.Am.Chem.Soc.,107, 3694(1985); Shiao, M. a Don, H.S., Proč. Nati. Sci. Counc. Repub. China B, 11, 223(1987)]. Polyketidy jsou sloučeniny odvozené z β-keto uhlíkových řetězců, které vznikají kontinuální kondenzací karboxylových kyselin o nízkých molekulových hmotnostech, jako je kyselina octová, kyselina propionová, máselná a nebo dalších tohoto typu.V závislosti na způsobu kondenzace a následné redukce β-keto karbonylových skupin mohou vznikat různé struktury polyketidů [popsáno v: Hopwood, D.A. a Sherman, D.H., Annu. Rev.Genet. 24,37-66 (1990); Hutchinson, C. R. a Fujii, I., Annu. Rev. Microbiol. 49, 201-238 (1995)].

Polyketidsynthasy (dále v textu se používá zkratka PKS), které se podílejí na syntéze polyketidů, jsou enzymy, o kterých je známo, že se vyskytují ve vláknitých houbách a bakteriích. Enzymy vyskytující se ve vláknitých houbách byly již dříve studovány pomocí

: : : · :

• · * · · · · . . »·.» molekulárně biologických technik [jak je popsáno v: Feng, G.H. a Leonard, T. J., J. Bacteriol. 177,6246 (1995); Takano, Y„ a další, Mol. Gen. Genet. 249,162 (1995)]. U Aspergillus terreus, což je mikroorganismus produkující lovastatin, byl analyzován PKS gen podílející se na biosyntéze lovastatinu [popsáno v: Mezinárodní přihláška v Japonsku (KOHYO) č.9504436, a podívejte se také na odpovídající WO 9512661, kde jsou nároky na DNA kódující triolpolyketidsynthasu].

Příbuzné geny, vztahující se na biosyntézu sekundárních metabolitů vláknitých hub, velmi často tvoří v genomu skupiny (klastry). Také pro cesty biosyntézy polyketidů jsou takovéto genové skupiny, podílející se na řečené biosyntetické dráze, známy. Při biosyntéze aflatoxinu, což je polyketid produkovaný Aspergillus flavus a Aspergillus parasiticus, byly objeveny takovéto skupiny genů, kódující enzymové proteiny (tak jako PKS), které se podílejí na zmíněné biosyntéze. Byla provedena genomová analýza a srovnání genů účastnících se na biosyntéze aflatoxinu u každého z mikroorganismů [popsáno v: Yu, J., a další, Appl. Environ. Microbiol., 61, 2365 (1995)]. Dále je také známo, že geny podílející se na biosyntéze sterigmatocystinu produkovaného Aspergillus nidulans, tvoří také ve spojité oblasti genomu daného mikroorganismu klastrové struktury o velikosti asi 60 kb [popsáno v : Brown, D. W. a další, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 93,1418 (1996)].

Bylo zkoumáno i ovlivnění aktivity polyketidsynthasy pomocí doplňkových proteinů během syntézy lovastatinu [popsáno v: Kennedy, J, a další., Science Vol 284,1368 (1999)].

Avšak doposud nebyla provedena molekulárně biologická analýza biosyntézy ML-236B a faktorů tuto syntézu ovlivňujících. Předložený vynález se zabývá právě tímto problémem.

Podstata vynálezu

Podle předloženého vynálezu se připraví polynukleotid, který lze využít pro urychlení biosyntézy ML-236B.

Polynukleotid je typickým polynukleotidem kódujícím protein obsahující sekvenci aminokyselin uvedenou jako Sekvence pod identifikačními čísly - SEKV. ID. C. 38,42, 44, 46, 48 nebo 50. Také jsou připraveny varianty polynukleotidu, které kódují modifikovanou aminokyselinovou sekvenci obsahující jednu deleci, adici, substituci či alteraci.

Tabulka uvádějící seznam sekvencí

Seznam sekvencí tvoří součást této patentové přihlášky. Pomáhá k porozumění. Proto je uvedena následující tabulka se seznamem sekvencí.

identita

SEKV. ID. Č.

pML48 inzert komplementární k SEKV. ID. Č. 1

PCR primer pro Příklad 4

PCR primer pro Příklad 4 oligonukleotid DNA (1) pro 5’-RACE, Příklad 8 oligonukleotid DNA (1) pro 5’-RACE, Příklad 8 oligonukleotid DNA (1) pro 5’-RACE, Příklad 8 oligonukleotid DNA (1) pro 5’-RACE, Příklad 8 oligonukleotid DNA (1) pro 5’-RACE, Příklad 8 oligonukleotid DNA (1) pro 5’-RACE, Příklad 8 oligonukleotid DNA (2) pro 5’-RACE, Příklad 8 oligonukleotid DNA (2) pro 5’-RACE, Příklad 8 oligonukleotid DNA (2) pro 5’-RACE, Příklad 8 oligonukleotid DNA (2) pro 5’-RACE, Příklad 8 oligonukleotid DNA (2) pro 5’-RACE, Příklad 8 oligonukleotid DNA (2) pro 5’-RACE, Příklad 8

5’-end cDNA fragment, Příklad 8

5’-end cDNA fragment, Příklad 8 oligonukleotid DNA (3) pro 3’-RACE, Příklad 8 oligonukleotid DNA (3) pro 3’-RACE, Příklad 8 oligonukleotid DNA (3) pro 3’-RACE, Příklad 8 oligonukleotid DNA (3) pro 3’-RACE, Příklad 8 oligonukleotid DNA (3) pro 3’-RACE, Příklad 8 oligonukleotid DNA (3) pro 3’-RACE, Příklad 8

3'-end cDNA fragment, Příklad 8

RT-PCR příměr, Příklad 9

RT-PCR primer, Příklad 9 w/rE; cDNA nukleotidová sekvence a odvozená aminokyselinová odvozený mlcE polypeptid

RT-PCR primer, Příklad 12

RT-PCR primer, Příklad 12 mlcR; cDNA nukleotidová sekvence a odvozená aminokyselinová odvozený mlcR polypeptid mlcAr, cDNA nukleotidová sekvence a odvozená aminokyselinová odvozený mlcA polypeptid w/cB; cDNA nukleotidová sekvence a odvozená aminokyselinová odvozený mlcB polypeptid mlcC; cDNA nukleotidová sekvence a odvozená aminokyselinová odvozený mlcC polypeptid w/cD; cDNA nukleotidová sekvence a odvozená aminokyselinová odvozený mlcD polypeptid

RT-PCR primer, Příklad 17

RT-PCR přiměř, Příklad 17

RT-PCR primer, Příklad 17

Výhodné provedení vynálezu

Polynukleotidy kódující aminokyselinové sekvence SEKV. ID. Č. 38,42,44, 46,48 nebo 50 mohou být cDNA, genomová DNA nebo mRNA. Genomové DNA, kódující každou ze šesti sekvencí, jsou označeny jako strukturní geny mlcE, mlcR, mlcA, mlcB, mlcC a mlcO. Aniž bychom brali zřetel na tato označení, věříme, že tyto strukturní geny kódují proteiny s následujícími funkcemi:

mlcA polyketidsynthasa mlcB polyketidsynthasa mlcC P450 monooxygenasa mlcD HMG-CoA reduktasa mlcE efluxní pumpa mlcR transcripční faktor

Objevili jsme, že vložení mlcE nebo cDNA odpovídající mlcE může urychlit biosyntézu ML236B a dále, že vložení mlcB. nebo cDNA odpovídající mlcB může také urychlit biosyntézu ML-236B v buňce. Co více, mlcB stimuluje transkripční expresi mlcA a D. mlcA, B, C a D se účastní tvorby ML-236B, a to buď nezávisle nebo v kombinaci, jak bylo prokázáno studiemi se zavedením záměrného poškození genu.

K syntéze derivátů ML-236B, včetně statinů, jako je pravastatin a lovastatin, byly použity varianty mlcA, B a/nebo C, které je možno získat pomocí umělé nebo přirozeně zavedené změny. S ohledem na tento postup je možno získat pravastatin přímo použitím takovýchto variant v jediném fermentačním kroku, aniž by byla nutná mikrobiální konverze ML-236B na pravastatin běžně produkovaný Streptomyces carbophilus.

Ve výhodném provedení polynukleotid zahrnuje sekvenci obsahující SEKV. ID. Č. 37, nebo mutantní sekvenci či variantu této sekvence, která je schopna urychlit biosyntézu ML236B. Takovýto DNA polynukleotid je možno získat z bakterií Escherichia coli transformovaných vektory pSAKexpE SANK 72499 (FERM BP-7005).

V dalším výhodném provedení polynukleotid obsahuje sekvenci označenou SEKV. ID. Č. 41 nebo její mutantu či variantu, která je schopná urychlit biosyntézu ML-236B. Takovýto DNA polynukleotid je možno získat z bakterií Escherichia coli transformovaných vektory pSAKexpR SANK 72599 (FERM BP-7006).

Polynukleotidy uvedené ve vynálezu mohou být použity ve fimkční kombinaci s jedním či několika dalšími polynukleotidy. Zvláště výhodné kombinace je možné využít pro zvýšení produkce ML-236B v mikroorganismech produkujících ML-236B.

Příklady takovýchto kombinací zahrnují polynukleotid sekvence SEKV. ID. Č. 37 nebo jeho varianty mající podobné funkce, v kombinaci s jednou nebo více sekvencemi vybranými ze SEKV. ID. Č. 37 samotné, dále ze sekvencí 41,43,45,47 nebo 49; stejně polynukleotid o sekvenci SEKV. ID. Č. 41, nebo jeho varianty, které mají podobné funkce v kombinaci s jednou nebo více sekvencemi vybranými ze sekvence SEKV. ID. Č. 37, 41 samotných, nebo ze sekvencí 43, 45, 47 nebo 49.

Z tohoto hlediska je polynukleotid ve výhodném provedení nukleotid kódující protein obsahující nebo sestávající z aminokyselinových sekvencí SEKV. ID. Č. 38,42, 44, 46,48 nebo 50, který je schopen urychlit biosyntézu ML-236B samostaně nebo ve spojení s polynukleotidem SEKV. ID. Č. 37, SEKV. ID. Č. 41 nebo jejich variant, které mají podobné funkce.

Vynález dále popisuje další polynukleotidy, které jsou schopné za striktních podmínek hybridizovat s polynukleotidy uvedenými v předkládaném vynálezu. Takovéto polynukleotidy, jsou-li zavedeny do mikroorganismů produkujících ML-236B, rozšiřují rámec polynukleotidů vhodných pro zrychlení biosyntézy ML-236B v mikroorganismech produkujících ML-236B.

Typickým polynukleotidem je DNA, cDNA nebo genomová DNA, nebo RNA a mohou být jak sense tak antisense orientace. Polynukleotid je typicky purifikovaný polynukleotid, což je polynukleotid bez dalších buněčných komponent.

Předkládaný vynález rozšiřuje okruh variant polynukleotidů kódujících aminokyselinové sekvence popsané v SEKV. ID. Č. 38,42,44,46,48 nebo 50, kde jeden nebo více nukleotidů je změněno. Změny mohou být přirozeně se vyskytující a mohou být způsobeny nadbytečnými či degenerovanými triplety v genetickém kódu. Takovéto degenerativně pozměněné polynukleotidy kódují tutéž aminokyselelinovou sekvenci.

• «'

Do rámce těchto polynukleotidových variant zahrnujeme spíše genomovou DNA mající extrony a introny, než jednodušší cDNA sekvence.

Předkládaný vynález rozšiřuje okruh variant polynukleotidů kódujících aminokyselinové sekvence popsané v SEKV. ID. Č. 38,42,44,46,48 nebo 50, které kódují modifikované aminokyselinové sekvence mající alespoň jednu deleci, adici, substituci nebo alteraci. Tímto vynález rozšiřuje okruh variant polynukleotidů podle pospaných sekvencí o polynukleotidové sekvence kódující aminokyselinové sekvence, které jsou kratší, delší či stejné délky, jaké by měly být podle uvedených sekvencí. Ve výhodném uspořádání si varianty polynukleotidů zachovávají schopnost urychlit syntézu ML-236B a v ještě výhodnějším užití si zachovávají přibližně stejně vysokou nebo dokonce lepší aktivitu, než sekvence rodičovské, ze kterých tyto odvozené varianty vznikly.

Varianty polynukleotidových sekvencí si zachovávají určitou identitu s rodičovskými sekvencemi. Stupeň identity je výhodně přinejmenším alespoň 60 %, dále alespoň 80 %, nebo alespoň 90 % nebo alespoň 95 % nebo 100 %. Stupeň identity varianty se výhodně určuje pomocí počítačového software, jako je program BLAST, který používá algoritmus k určení homologních sekvencí.

Ve výhodném provedení je polynukleotid podle vynálezu DNA, vybraná ze skupiny obsahující:

(a) DNA, která se vyznačuje tím, že obsahuje jednu nebo více sekvencí uvedených v nukleotidu od č. 1 do 1662 v SEKV.ID Č. 37 v Seznamu sekvencí a která je charakterizovaná zvýšením rychlosti biosyntézy ML-236B v mikroorganismech produkujících ML-236B, do kterých byla tato sekvence zavedena;

(b) DNA, která hybridizuje za striktních podmínek s DNA popsanou v bodě (a) a která je chrakterizována zrychlením biosyntézy ML-236B v mikroorganismech produkujících ML236B, jestliže je do těchto mikroorganismů vložena;

(c) DNA, která obsahuje jednu nebo více nukleotidových sekvencí, popsaných pro nukleotid od č. 1 do 1380 v SEKV. ID. Č. 41 v Seznamu sekvencí a která je chrakterizována zrychlením biosyntézy ML-236B v mikroorganismech produkujících ML-236B, jestliže je do těchto mikroorganismů vložena;

(d) DNA, která hybridizuje za striktních podmínek s DNA popsanou v bodě (c) a která a je chrakterizována zrychlením biosyntézy ML-236B v mikroorganismech produkujících ML236B, jestliže je do těchto mikroorganismů vložena;

Polynukleotidy podle vynálezu urychlují biosyntézu ML-236B v mikroorganismech, které ML-236B produkují. Příklady mikroorganismů produkujících ML-236B zahrnují rody

8· · · · * • · » * • ♦ ·«· β · * e * β

Penicillium, jako je Penicillium citrinum, Penicillium brevicompactum [popsáno v : Brown, A.G, a další, J. Chem. Soc. Perkin-1., 1165(1976)], Penicillium cyclopium [popsáno v : Doss, S.L., a další, J. Nati. Prod.,49, 357 (1986)] nebo jinde. Další příklady zahrnují: Eupenicillium sp.M6603 [popsáno v: Endo, A., a další, J. Antibiot.-Tokyo, 39,1609(1986)], Paecilomyces viridis FERM P-6236 [popsáno v : Japonská patentová přihláška č,58-98092], Paecilomyces sp.M2016 [popsáno v: Endo, A., a další, J. Antibiot. -Tokyo, 39,1609 (1986)], Trichoderma longibrachiatum M6735 [popsáno v : Endo, A., a další, J. Antibiot.-Tokyo, 39,1609(1986)], Hypomyces chrysospermus IFO 7798 [popsáno v : Endo, A., a další, J. Antibiot.-Tokyo, 39, 1609(1986)], Gliocladium sp. YJ-9515 [popsáno v: WO 9806867], Trichorderma viride IFO 5836 [popsáno v . Japonská patentová přihláška č.62-19159], Eupenicillium reticulisporum IFO 9022 [popsáno v: Japonská patentová přihláška č.62-19159] a dále další vhodné použitelné mikroorganismy.

Mezi těmito mikroorganismy, které produkují ML-236B, je preferováno užití Penicillium citrinum, a ve zvláště výhodném provedení kmen Penicillium citrinum SANK 13380. Kmen Penicillium citrinum SANK 13380 byl uložen ve Výzkumném ústavu přírodních věd a technologií Agentury pro průmyslové vědy a technologie ( Research Institute of Life Science and Technology of the Agency of Industrial Science and Technology) 22. prosince 1992 pod přístupovým číslem FERM BP-4129, v souladu s Budapešťskou smlouvou o uchovávání mikroorganismů. Příklady mikroorganismů produkujících ML-236B také zahrnují ty izoláty z přírodních zdrojů, které byly mutovány jak přirozenou cestou, tak uměle.

Vynález dále zahrnuje vektory obsahující polynukleotidy podle vynálezu, jako jsou vektory získané z Escherichia coli pSAKexpE SANK 72499 (FERM BP-7005) nebo Escherichia coli pSAKexpR SANK 72599 (FERM BP-7006). Tyto vektory podle vynálezu zahrnují expresní vektory.

Hostitelské buňky transformované pomocí vektorů podle vynálezu jsou také součástí vynálezu, včetně těch, zahrnujících mikroorganismy produkující ML-236B. Hostitelské buňky podle vynálezu zahrnují Penicillium citrinum a Escherichia coli, jako jsou Escherichia coli pSAKexpE SANK 72499 (FERM BP-7005) nebo Escherichia coli pSAKexpR SANK 72599 (FERM BP-7006).

Vynález dále rozšiřuje okruh polypeptidů kódovaných polynukleotidy podle vynálezu. Příklady polypeptidů podle vynálezu zahrnují sekvenci SEKV. ID. Č. 38 nebo 42 nebo jejich varianty, které mají určený stupeň identity se seknencemi SEKV. ID. Č. 38 nebo 42 a které jsou schopné urychlit produkci ML-236B v mikroorganismech produkujících ML-236B. Dalšími polypeptidy jsou ty, které jsou kódovány dalšími polynukleotidovými sekvencemi ♦ ♦ · í ·' *

9» · · ->

• · ·« «9 » ♦ « ♦ · · » > * «>« podle vynálezu a jejich variantami majícími zachovaný určitý stupeň identity.

Ve výhodném uspořádání je stupeň identity polypeptidových variant se sekvencí SEKV. ID. Č. 38 nebo 42 přinejmenším alespoň 80 %, dále alespoň 95 % nebo alespoň 100 %. Stupeň identity varianty se výhodně určuje pomocí počítačových programů, jako je program BLAST, který k určení homologních sekvencí používá určitý algoritmus.

Polypeptidy podle vynálezu obsahují kratší či delší sekvence ze sekvence SEKV. ID. C. 38 nebo 42 nebo jejich variant. Kratší polypeptidy obsahují částečné aminokyselinové sekvence z SEKV. ID. Č. 38,42 nebo jejich varianty a ve výhodném uspořádání jim zůstává schopnost urychlit biosyntézu ML-236B. Delší polypeptidy obsahují celé nebo částečné aminokyselinové sekvence SEKV. ID. Č. 38,42 nebo jijich varianty a v ještě výhodnějším uspořádání jim zůstává schopnost urychlit biosyntézu ML-236B. Delší polypeptidy obsahují fuzní proteiny jako je Fc-fuzní protein.

Polypeptidy podle vynálezu zahrnují jednu ze sekvencí SEKV. ID. Č. 38, SEKV. ID.

Č. 42, SEKV. ID. Č. 44, SEKV. ID. Č. 46, SEKV. ID. Č. 48 nebo jejich varianty mající podobné funkce. Jsou také k dispozici protilátky generované proti polypeptidům podle vynálezu. Součástí vynálezu je také příprava jak monoklonálních, tak polyklonálních protilátek. Zmíněné protilátky je možné použít pro regulaci produkce ML-236B a pro přípravu derivátů ML-236B jako jsou statiny, včetně pravastatinu a lovastatinu. Co více, řečené protilátky se ve výhodném uspořádání používají k analýze biosyntézy ML-236B a k regulaci jejího mechanismu. Takováto analýza je užitečná pro ovlivnění produkce ML-236B a pro přípravu derivátů ML-236B.

Hostitelské buňky podle vynálezu, které obsahují vektor podle vynálezu mohou být užity ve způsobu přípravy ML-236B, což spočívá v napěstování takovýchto hostitelských buněk a následném získám ML-236B z kultury. V jednom způsobu přípravy vektor obsahuje geny mlcE nebo mlcR, avšak nikoli další geny, jako je mlcA, mlcB, mlcC nebo mlcD.

Příprava podle tohoto způsobu se může projevit v absenci rekombinantních polypeptidů mlcA, mlcB, mlcC and/or mlcD odpovídajících SEKV. ID. Č. 44, SEKV. ID. Č. 46, SEKV. ID. Č. 48 nebo SEKV. ID. Č. 50.

V dalším textu následuje popis specifických provedení vynálezu. Předkládaný vynález bude v dalším textu podrobněji popsán.

Autoři předkládaného vynálezu klonovali genomovou DNA obsahující geny podílející se na biosyntéze ML-236B v Penicillium citrinum. Genomová DNA je v dalším textu označována jako DNA příbuzná genomové DNA pro biosyntézu ML-236B a je klonována z DNA genomové knihovny mikroorganismů produkujících ML-236B. Genomová DNA byla • · analysována za účelem nalezení strukturních genů řečené genomové DNA. Potom byly připraveny cDNAodpovídající strukturním genům pomocí reversní transkripční polymerázové řetězové reakce (dále bude užíváno označení RT PCR) za užití celkové RNA, která obsahovala mRNA z Penicillium citrinum jako templát. Bylo shledáno, že biosyntéza ML236B v mikroorganismech produkujících ML-236B je urychlena, když jsou mikroorganismy produkující ML-236B transformovány rekombinantními DNA vektory obsahujícími řečené cDNA.

Předkládaný vynález se vztahuje zvláště k cDNA (dále označovaných jako cDNA urychlující biosyntézu ML-236B), které urychlují biosyntézu ML-236B v mikroorganismech produkujících ML-236B, jsou-li do těchto mikroorganismů vloženy.

Polynukleotid urychlující biosyntézu ML-236B podle předkládaného vynálezu, jako je cDNA urychlující biosyntézu ML-236B, lze získat následujícími příklady postupů:

(I) DNA, získaná syntézou z templátu za použití transkripčního produktu (messenger RNA, dále označovaná jako mRNA) ze strukturního genu, kteiý se podílí na biosyntéze ML-236B a který se nachází v genomové DNA mikroorganismu produkujícícho ML-236B;

(II) dvouvláknová DNA, která vznikla jako výsledek asociace DNA (I) a druhého vlákna DNA syntetizované pomocí DNA (I) jako prvního vlákna;

(III) dvouvláknová DNA, která vznikla jako výsledek replikace či amplifikace dvouvláknové DNA (II), například, pomocí postupu klonování nebo podobného;

(IV) DNA, která může hybridizovat za striktně určených podmínek s jednou z výše zmíněných DNA nebo mRNA.

DNA (IV) může být stejná, jaká byla nalezena v sekvenci kteréhokoli strukturního genu uvedeného v patentu, například nukleotid od 1 do 1662 v SEKV. ID. Č. 37 ze Seznamu sekvencí nebo nukleotid číslovaný od 1 do 1380 v SEKV. ID. Č. 41, kde je jeden nebo více nukleotidů volitelně substituovaných, deletovaných a/nebo přidaných a které mohou urychlit biosyntézu ML-236B v mikroorganismech produkujících ML-236B, jsou-li do těchto mikroorganismů vloženy.

Hybridizují-li dvě jednovláknové nukleové kyseliny, tvoří dvouvláknovou molekulu, a to v oblasti, kde jsou k sobě komplementární, či vzájemně vysoce komplementární a použité „striktní podmínky “ ve výhodném uspořádání odpovídají použití postupu, kdy hybridizační roztok je 6 x SSC [1 xSSC má složení 150mMNaCl, 15 mM citrát sodný], a teplota hybridizace je 55 °C.

cDNA urychlující biosyntézu ML-236B lze získat například izolací klonu obsahujícího cDNA z cDNA knihovny pro mikroorganismy produkujícíc ML-236B. Alternativním postupem je použití RT PCR, kdy jsou užity dva primery navržené na bázi nukleotidové sekvence pro DNA příbuznou s genomovou DNA účastnící se biosyntézy ML236B, či na bázi mRNA nebo z celkové RNA získané z mikroorganismů produkujících ML236B.

Mikroorganismus produkující ML-236B je mikroorganismus mající z podstaty schopnost produkovat ML-236B. Jak bylo uvedeno již dříve, příklady mikroorganismů produkujících ML-236B zahrnují druhy Penicillium, jako je Penicillium citrinum, Penicillium brevicompactum, Penicillium cyclopium a další podobné. Další příklady zahrnují: Eupenicillium sp.M6603, Paecilomyces viridis FERM P-6236, Paecilomyces sp.M2016, Trichoderma longibrachiatum M6735, Hypomyces chrysospermus IFO 7798, Gliocladium sp. YJ-9515, Trichorderma viride IFO 5836, Eupenicillium reticulisporum IFO 9022, a další vhodné organismy.

Mezi těmito mikroorganismy produkujícími ML-236B je ve výhodném uspořádání používán Penicillium citrinum a ještě výhodnějším uspořádání Penicillium citrinum kmen SANK 13380. Kmen Penicillium citrinum SANK 13380 byl uložen ve Výzkumném ústavu přírodních věd a technologií Agentury pro průmyslové vědy a technologie ( Research Institute of Life Science and Technology of the Agency of Industrial Science and Technology) 22. prosince 1992 pod přístupovým číslem FERM BP- 4129, v souladu s Budapešťskou smlouvou o uchovávání mikroorganismů. Příklady mikroorganismů produkujících ML-236B zahrnují jak izoláty z přírodních zdrojů, tak ty, co byly mutovány, a to jak přirozenou cestou, tak uměle.

DNA příbuzná genomové DNA pro biosyntézu ML-236B může být získána průzkumem genomové DNA knihovny organismu produkujícího ML-236B pomocí vhodné sondy. Výhodně je sonda navržena na bázi sekvence DNA, o které se předpokládá, že hraje roli při biosyntéze ML-236B, ve zvláště výhodném uspořádám pak je odvozena z vláknité houby.

Výběr postupů pro vytvoření genomové DNA knihovny není omezen na kterýkoli postup, může být použita jakákoli vhodná metoda všeobecně využívaná ke konstrukci genomové DNA knihovny eukaryotických organismů. Příklady vhodných postupů zahrnují metody popsané Maniatisem a dalšími. [Maniatis, T, a další, Molecular cloning, a laboratory manual, 2. vydám, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)]. Další vhodné postupy jsou všeobecně známy odborníkům v daném oboru.

V přehledu lze konstatovat, že genomová DNA z mikroorganismu produkujícího

ML-236B může být získána z buněk buněčné kultury zmíněných mikroorganismů produkujících ML-236B fyzikálním rozbitím buněk, extrakcí DNA přítomné v jejich jádře a purifikací zmíněné DNA.

Kultivace mikroorganismů produkujících ML-236B může být uskutečněna za podmínek vhodných právě pro tyto mikroorganismy produkující ML-236B. Například, kultivace Penicillium citrinum, organismu produkujícího ML-236B a užívaného ve výhodném provedení, se provádí inokulací buněk v médiu MBG3-8 [složení: 7 % hmotn. glycerin, 3 % hmotn. glucosa, 1 % hmotn. sojový prášek, 1 % hmotn. pepton (vyrobený firmou Kyokuto Seiyaku Kogyo), 1 % hmotn. Com steep liqueur (vyrobený firmou Honěn), 0,5 % hmotn. dusičnan sodný, 0,1 % hmotn. heptahydrát síranu hořečnatého (pH 6,5)], a inkubací při 22 až 28 °C s třepáním po dobu 3 až 7 dní. Šikmý agar pro uchovávání kultury se připraví nalitím rozpuštěného PGA agarového média [složení: 200 g/L bramborový extrakt, 15 % hmotn. glycerin, 2% hmotn. agar] do zkumavky. Agar se nechá v nakloněné zkumavce utuhnout. Penicillium citrinum se potom inokoluje na šikmý agar pomocí platinové jehly. Následuje inkubace při teplotě 22 až 28 °C po dobu 7 až 15 dnů. Mikroorganismy nebo bakterie mohou být ze šikmého agaru kontinuálně odebírány pro další použití. Šikmý agar s mikro-organismy nebo bakteriemi lze uchovávat při teplotách od 0 do 4 °C.

Buňky mikroorganismů produkujících ML-236B, které se kultivují v kapalném médiu, mohou být získány centriíugací a ty, které jsou pěstované na pevném médiu mohou být získány seškrábnutím buněk pomocí buněčné škrabky z povrchu média či podobnou metodou.

Vzniklá genomová DNA je rozdělena na fragmenty štěpením vhodnými restrikčními enzymy. Není žádné omezení pro užití jakýchkoli restrikčních enzymů k štěpení vzniklé DNA, ale dává se přednost běžně užívaným a dostupným enzymům. Příklady užitých restrikčních enzymů zahrnují Sau3AI. Ale lze použít i další vhodné restrikční enzymy, které jsou známé odborníkům v daném oboru. Naštěpená DNA je potom nanesena na elektroforézu a z gelu se vyřízne DNA mající odpovídající velikost. Velikost fragmentů DNA není ničím omezena, ale ve výhodném provedení dosahuje velikosti kolem 20 kb či více.

Neexistuje také žádné omezení na výběr DNA vektorů použitých ke konstrukci genomové DNA knihovny, podmínkou je, že vektor musí obsahovat DNA sekvenci nezbytnou pro replikaci v hostitelských buňkách, které jsou tímto vektorem transformovány. Příklady vhodných vektorů zahrnují plazmidový vektor, fágový vektor, kosmidový vektor, BAC vektor nebo jiné podobné, přičemž je preferováno užití kosmidového vektoru. DNA vektor je ve výhodném provedení expresní vektor. V ještě výhodnějším uspořádání DNA vektor obsahuje DNA nebo nukleotidovou sekvenci, která vnáší do hostitelských buněk, které jsou transformovány vektorem,vybraný fenotyp.

DNA vektor je ve výhodném provedení vektor, jenž může být užit jak pro klonování, tak pro expresi. Ve výhodném uspořádání je vektror binární vektor, který může být použit pro transformaci více než jednoho hostitelského mikroorganismu. Binární vektor ve výhodném provedení obsahuje DNA sekvenci či sekvence , které umožňují replikaci v hostitelské buňce, ve zvláště výhodném uspořádání umožňují replikaci ve větším počtu hostitelských buněk různých mikroorganismů, jako jsou bakterie nebo houby. V ještě výhodnějším provedení binární vektor obsahuje sekvenci DNA, která může vnést vybraný fenotyp do okruhu různých hostitelských buněk, což mohou být buňky různých skupin mikroorganismů.

Výběr kombinací skupin mikroorganismů a hostitelských buněk transformovaných binárním vektorem není prakticky omezen, pod podmínkou, že jedna skupina mikroorganismů se používá pro klonování a další má schopnost produkovat ML-236B. Takováto kombinace může být například kombinací bakterie a vláknité houby, kombinace kvasinky a vláknité houby, ve výhodném uspořádání je upřednostňována kombinace bakterie a vláknité houby. Výběr bakterie není prakticky omezen, užívají se všechny bakterie běžně užívané v biotechnologiích, jako je například Escherichia coli, Bacillus subtilis a další. Ve výhodném provedení se používá Escherichia coli a v ještě výhodnějším provedení kmen Escherichia coli XLl-Blue MR. Podobně tomu, není nijak omezen druh kvasinek, užívají se všechny druhy běžně používané pro biotechnologické účely, jako je například Saccharomyces cerevisiae a další. Příklady vláknitých hub zahrnují mikroorganismy produkující ML-236B popsané výše. Další vhodné příklady mikroorganismů jsou známy odborníkům v daném oboru.

Ve předloženém vynálezu skupinu mikroorganismů lze vybrat z bakterií, vláknitých hub a kvasinek.

Příklady výše zmíněných binárních vektorů zahrnují kosmidový vektor mající vhodný markerový gen pro selekci fenotypu a cos místo. Další vhodné vektory jsou známy odborníkům v daném oboru. Ve výhodnémm provedení se užívá vektor pSAKcosl, konstruovaný inzercí cos místa z kosmidového vektoru pWE15 (vyráběný firmou STRATAGENE) do plazmidu pSAK333, který obsahuje sekvenci hygromycin Bfosfotransferasového genu z Escherichia coli [popsáno v : Japonská patentová přihláška č.3262486]. Způsob přípravy pSAKcosl je zobrazen na obrázku 1. Předkládaný vynález se však neomezuje na použtí pouze tohoto vektoru.

·· · ·· ·♦ ·· ···· · · * · · · • · · ····· ··

Genomová DNA knihovna se připravuje zavedením binárního vektoru do hostitelských buněk, vektor obsahuje fragmenty genomové DNA z mikroorganismů produkujícího ML-236B. Ve výhodném provedení je hostitelskou buňkou Escherichia coli, v ještě výhodnějším uspořádání Escherichia coli kmen XLl-Blue MR. Je-li hostitelská buňka Escherichia coli, zavedení vektoru lze provést pakážováním in vitro. V předkládaném vynálezu se transformace provádí rovněž zavedením cizorodé DNA pomocí pakážování in vitro a transformovaná buňka zahrnuje také buňku, do které byla zavedena cizorodá DNA pomocí pakážování in vitro.

Genomová knihovna může být prozkoumána pomocí protilátky či sondy na bázi nukleové kyseliny, čímž lze vybrat vhodný klon. Ve výhodném provedení se užívá sondy na bázi nukleové kyseliny. Ve výhodném provedení je nukleokyselinová sonda připravena na základě nukleotidové sekvence genu podobného genu nebo DNA vztahující se k biosyntéze polyketidů, ve výhodném uspořádání je sekvence odvozena z vláknité houby. Výběr jednotlivých genů není omezen, podmínkou je, aby se účastnily biosyntézy polyketidů a jejich nukleotidová sekvence musí být známa. Příklady takovýchto genů zahrnují gen pro aflatoxin PKS z Aspergillus flavus a Aspergillus parasiticus, gen pro Sterigmatocystin PKS z Aspergillus nidulans nebo jiné.

Vhodná sonda na bázi nukleové kyseliny může být získána například syntézou oligonukleotidové sondy obsahující část známé sekvence genomové DNA, tak, jak to bylo popsáno výše, nebo přípravou oligonukleotidových primerů a amplifikací cílové DNA pomocí polymerázové řetězové reakce, [dále v textuje používána zkratka PCR, popsáno v: Saiki, R. K., a další, Science, 239, 487 (1988)] a genomové DNA jako templátu, nebo pomocí RT-PCR za užití mRNA jako templátu. Odborníkům v daném oboru jsou známy ještě další způsoby přípravy takovýchto sond.

Specifickou sondu na bázi nukleových kyselin lze získat z mikroorganismů produkujících ML-236B za použití například PCR nebo RT-PCR. Návrh primerů užitých v PCR nebo RT-PCR (dále nazývaných jako primery pro PCR) se ve výhodném uspořádání vynálezu provádí na základě nukleotidové sekvence genu souvisejícího s biosyntézou polyketidů, jehož sekvence je známa. Ve výhodném provedení vynálezu je tento gen genem pro aflatoxin PKS z Aspergillus flavus, Aspergillus parasiticus, nebo gen pro sterigmatocystin PKS z Aspergillus nidulans.

Primery pro PCR lze vhodně navrhnout tak, aby obsahovaly nucleotidové sekvence, kkteré kódují aminokyselinové sekvence, které jsou v PKS genu vysoce konzervované. Způsob identifikace nukleotidových sekvencí odpvídá dané aminokyselinové sekvenci

• · · · • · ^e • * * · * • · *- * « • · · · • · « · · odvozené na základě užitých kodonů hostitelské buňky a metod umožňujících přípravu smíšených oligonukleotidových sekvencí pomocí užití násobných kodonů. (dále nazývanou jako ‘degenerované oligonukleotidy’). V posledně jmenovaném případě lze multiplicitu oligonukleotidů redukovat zavedením hypoxantinu do jejich nukleotidových sekvencí.

Primer pro PCR obsahuje nukleotidovou sekvenci navrženou tak, aby došlo k přisednutí na templátový řetězec, primer bývá připojen k dodatkové 5' sekvenci. Výběr takovéto 5' dodatkové nukleotidové sekvence není niěím omezen, za předpokladu, že primer může být užit pro PCR nebo RT-PCR. Takováto dodatková sekvence může obsahovat například nukleotidovou sekvenci vhodnou pro operace klonování PCR produktu. Takováto nukleotidová sekvence může být například štěpným místem pro restrikční enzym, nebo nukleotidová sekvence toto štěpné místo restrikčního enzymu obsahující.

Mimoto, v navrhování primeru pro PCR se preferuje, aby se celkový počet guaninových (G) a celkový počet cytosinových (C) baží pohyboval v rozmezí od 40 do 60 % celkového počtu baží. Mimoto se ve výhodném uspořádání dbá na to, aby primer na sebe vůvec či málo nasedal, v případě dvojice primerů, aby se nespojovaly (nenasedaly) na sebe vzájemně, nebo jen v minimální míře.

Bude-li primer použit pro PCR, není počet nukleotidů pro tvorbu primeru pro PCR prakticky ničím omezen. Spodní hranice počtu užitých nukleotidů se obecně pohybuje mezi 10 až 14 nukleotidy, horní hranice mezi 40 až 60 nukleotidy Ve výhodném provedení mají primery délku mezi 14 až 40 oligonukleotidy.

Primerem pro PCR je přednostně DNA. Nukleosidy v primeru mohou být deoxyadenosin, deoxycytidin, deoxythymidin a deoxyguanosin a ještě navíc deoxyinosin. Je vhodné, aby 5'-pozice v nukleosidu a 5'-konec primeru pro PCR nesly hydroxylovou skupinu nebo a hydroxylovou skupinu, na kterou je navázán pomocí esterové vazby jeden zbytek kyseliny fosorečné.

Syntézu primeru pro PCR lze provést způsoby obecně užívanými pro syntézu nukleových kyselin, například fosfoamiditové metody. Tyto metody jsou ve výhodném provedení vynálezu uskutečňovány na automatickém DNA syntetizátoru.

Jako templáty pro PCR a RT-PCR lze použít genomovou DNA a mRNA z mikroorganismů produkujících ML-236B. Místo mRNA může být také použita jako templát pro RT-PCR celková RNA.

PCR produkt nebo RT-PCR produkt lze klonovat pomocí začlenění do vhodných DNA vektorů. Výběr DNA vektorů použitých pro klonovací kroky není omezen. Soupravy pro snadné klonování PCR a RT-PCR produktů jsou komerčně dostupné. Jako příklad lze »· · ···· ·· • · ··« ·· ·· ·· ·· uvést Originál TA Cloning Kit (vyráběný firmou Invitrogen: užívající pCR 2.1 jako DNA vektor), který je vhodný pro takovýto druh klonování.

Za účelem získání klonovaného PCR produktu se musí pěstovat transformované hostitelské buňky obsahující plazmidy s vloženými požadovanými PCR produkty a po té musí být plazmidy z buněk vyjmuty a purifikovány. Vložený DNA fragment se potom získá ze vzniklého plazmidu.

Kultivaci transformovaných hostitelských buněk lze provést za podmínek vhodných pro daný druh hostitelských buněk. Ve výhodném uspořádání používané hostitelské buňky, Escherichia coli, se mohou kultivovat LB mediu [1 % hmotn. trypton, 0,5 % hmotn. kvasničný extract, 0,5 % hmotn. chlorid sodný] při teplotách v rozmezí od 30 do 37°C po dobu od 18 hodin do dvou dnů za třepání.

Příprava plazmidů z kultury transformovaných hostitelských buněk může být uskutečněna pomocí znovu napěstování hostitelských buněk a izolací plazmidů nekontaminovaného dalšími buněčnými komponentami, jako je genomová DNA nebo proteiny hostitelských buněk. Příprava plazmidové DNA z buněčné kultury Escherichia coli může být provedena alkalickou metodou podle Maniatise [popsáno v: Maniatis, T., a další., Molecular cloning, a laboratory manual, 2. vydání, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)]. Komerčně jsou dostupné i soupravy na získám plazmidu, pomocí nichž lze docílit vyšší čistoty. Ve výhodném provedení vynálezu se používá Plazmid Mini Kit [vyráběný firmou QIAGEN AG]. Mimoto je komerčně dostupná i souprava pro přípravu plazmidu ve velkém. Ve výhodném provedení vynálezu se používá Plasmid Maxi Kit (vyrobený firmou QIAGEN AG).

Koncentrace vzniklé plazmidové DNA se dá určit měřením absorbance při vlnové délce 260 nm po náležitém naředění DNA vzorku a výpočtem na základě předpokladu, že roztok mající hodnotu absorbance OD260 rovnající se 1 obsahuje 50 pg/ml DNA (popsáno v: Maniatis, T., a další, supra).

Čistota DNA může být určena výpočtem z poměru absorbancí při vlnových délkách 280 a 260 nm (popsáno v: Maniatis, T., a další, supra).

Způsoby značení nukleokyselinových sond lze obecně rozdělit na radioaktivní a neradioaktivní. Výběr radionuklidu pro radioaktivní značení není obecně ničím omezen a může to být například ³²P, ³⁵S, ¹⁴C a další. Ve výhodném uspořádání vynálezu se ke značení upřednostňuje užití ³²P. Výběr činidla pro neradioaktivní značení není také obecně ničím omezen, tak tedy lze pro neradioaktivní značení nukleové kyseliny obecně užít například, digoxigenin, biotin a další, ve výhodném provedení se užívá přednostně digoxigenin.

Způsob značení sond nukleových kyselin není obecně omezen. Přednostně se užívají běžné způsoby, například způsoby, jako metody zavádějící značku do PCR produktu pomocí PCR nebo RT-PCR užitím značených nukleotidových substrátů, nick translace, užití random primerů, terminalního značení a způsobů syntézy oligonukleotidové DNA pomocí značených nukleotidových substrátů. Vhodná metoda se vybere z předešlého výčtu v závislosti na druhu sondy nukleové kyseliny.

Potvrzení přítomnosti stejné nukleotidové sekvence v genomu mikroorganismu produkujícího ML-236B, která odpovídá nukleotidové sekvenci sondy se potvrdí v Southem blotu hybridizací s genomovou DNA řečeného mikroorganismu produkujícího ML-236B.

Southem blotová hybridizace se provádí podle postupu popsaného Maniatisem [popsáno v: Maniatis, T., a další, supra].

Značená nukleokyselinová sonda, připravená podle postupu popsaného výše, se užívá k prozkoumání genomové DNA knihovny. Výběr skríningového postupu není obecně omezen, za předpokladu, že je obecně vhodný pro klonování genu. Ve výhodném provedení vynálezu se používá postup hybridizace kolonií [popsáno v: Maniatis, T., a další, supra].

Kultivace kolonií užitých pro hybridizací kolonií se provádí za podmínek vhodných pro dané hostitelské buňky. Kultivace Escherichia coli, preferovaného hostitele, se děje inkubací buněk na LB agarovém mediu [1 % hmotn. trypton, 0,5 % hmotn. kvasničný extrakt, 0,5 % hmotn. chlorid sodný, 1,5 % hmotn. agarosa] při teplotách mezi 30 a 37 °C po dobu 18 hodin až dvou dnů.

Příprava rekombinantního DNA vektoru z pozitivního klonu získaného hybridizací kolonií se většinou provádí extrakcí plazmidu z kultury pozitivního klonu získaného hybridizací kolonií a jeho purifíkací.

Transformovný kmen Escherichia coli, Escherichia coli pML48 SANK71199 reprezentující pozitvní klon získaný podle způsobů popsaných ve vynálezu, byl uložen ve Výzkumném ústavu přírodních věd a technologií Agentury pro průmyslové vědy a technologie ( Research Institute of Life Science and Technology of the Agency of Industrial Science and Technology) 7.července 1999 pod přístupovým číslem FERM BP-6780, v souladu s Budapešťskou smlouvou o uchovávám mikroorganismů.

Typický DNA vektor nesený Escherichia coli pML48 SANK71199 byl označen jako pML48.

Potvrzení faktu, že rekombinantní DNA vektor, který je přítomen v pozitivním klonu obsahuje genomovou DNA související s biosyntézou ML-236B, lze vhodně provést pomocí určení nukleotidové sekvence inzertu rekombinatního DNA vektoru hybridizací v Southem

blotu nebo expresí inzertu a určení jeho funkce.

Nukleotidová sekvence DNA může být určena podle Maxamovy a Gilbertovy chemické modifikační techniky [popsáno v: Maxam, A. Μ. M. a Gilbert, W., Methods in Enzymology, 65,499 (1980)] nebo pomocí dideoxy řetězové terminační techniky [popsáno v: Messing, J. a Vieira, J., Gene, 19,269 (1982)]. Další způsoby určení těchto sekvencí jsou známy odborníkům v daném oboru. Plazmidová DNA, která se užívá k určení nukleotidové sekvence je ve výhodném provedení vysoce čistý vzorek, tak, jak je to popsáno výše.

Nukleotidová sekvence inzertu pML48 je ukázána v SEKV. ID. Č. 1 ze Seznamu sekvencí. Nukleotidová sekvence znázorněná v SEKV. ID. Č. 2 v Seznamu sekvencí je zcela komplementární k nukleotidové sekvenci znázorněné v SEKV ID. Č. 1. Obecně, nukleotidová sekvence genomové DNA může vykazovat genetický polymorfismus v rámci druhů, to znamená allogenní rozdíly. Mimoto je známo, že v procesu klonování DNA a jejího sekvenování, může docházet s jistou frekvencí výskytu k substitucím nukleotudů nebo jejich alteracím. Proto tedy, genomová DNA související s biosyntézou ML-236B ve vynálezu také obsahuje genomovou a další DNA, které mohou hybridizovat k nukleotidům DNA od č. 1 do 34203 podle sekvence SEKV. ID. Č. 1 nebo 2 ze Seznamu sekvencí. Ve výhodném provedení jsou to genomové nebo jiné DNA, které mohou hybridizovat za striktních podmínek k nukleotidům DNA od č. 1 do 34203 podle sekvence SEKV. ID. Č. 1 nebo 2 podle Seznamu sekvencí. Tyto DNA zahrnují nukleotidy DNA od č. 1 do 34203 podle sekvence označené SEKV. ID. C. 1 nebo 2 ze Seznamu sekvencí, v němž jeden nebo více nukleotidů je substituováno, deletováno a/nebo přidáno. Navíc tyto hybridizující genomové nebo další DNA mohou zahrnovat DNA mající původ v mikroorganismech produkujících ML-236B, avšak jiných než je Penicillium citrinwn SANK13380, ve výhodném uspořádání jsou tyto DNA schopné zlepšit produkci ML-236B, jsou-li zavedeny do mikroorganismů produkujících ML-236B.

Genomovou DNA související s biosyntézou ML-236B lze vhodně analyzovat pomocí následujícíchzpůsobů očíslovaných od 1) do 3).

1) Analýza pomocí počítačového programu analyzujícího geny

Geny obsažené v genomové DNA lze lokalizovat pomocí programu pro vyhledávání genů (dále označovaného jako „GRAIL“) a pomocí programu pro hledání homologních sekvencí (BLASTN a BLASTX).

GRAIL je program, který vyhledává strukturní geny v rámci genomové DNA pomocí dělení genomových sekvencí podle sedmi parametrů pro hodnocení výskytu genové sekvence a integrace výsledků pomocí neurální síťové metody [popsáno v: Uberbacher, E.C. a

Mural, R.J., Proč. Nati. Acad. Sci. USA., 88,11261 (1991)]. Jako příklad lze uvést ApoCom GRAIL Toolkit [vyrobeno firmou Apocom corporation].

BLAST je program používající algoritmus k určení homologie nukleotidových a aminokyselinových sekvencí [popsáno v: Altschul, S.F., Madden, T. L., a další, Nucl. Acids Res., 25,3389 (1997)].

Pozici a orientaci strukturního genu ve vzorku sekvence genomové DNA lze předpovědět na základě dělení DNA sekvence na části o vhodné délce a provedení výzkumu homologie v databázi genetických dat pomocí BLASTN. Pozici a orientaci strukturního genu ve vzorku sekvence testované genomové DNA lze předpovědět pomocí translace rozdělené sekvence genomové DNA do šesti translačních rámců (tři na sense vlákně a tři na antisense vlákně) a následujícím provedení průzkumu homologie odvozených aminokyselinových sekvencí v peptidové databázi BLASTX.

Kódující oblasti pro strukturní geny jsou někdy v genomové DNA přerušeny introny z eukaryotických organismů. K provedení analýzy, zda strukturní geny obsahují takovéto mezery, lze výhodně použít BLAST program pro sekvence obsahující mezery, který je efektivnější a nazývá se Gapped-BLAST program (instalovaný v BLAST2: Wisconsin GCG balíček ver. 10,0).

2) Analýza podle způsobu hybridizace v Northem blotu

Expresi strukturního genu předpovězenou na základě analýzy popsané v odstavci 1) lze studovat pomocí Northem blot hybridizačního postupu.

Ve výhodném provedení vynálezu se z mikroorganismu produkujícího ML-236B získá celková RNA. Kultura preferovaného mikroorganismu produkujícího ML-236B Penicillium citrinum se získá inokulací řečeného mikroorganismu získaného z konzervy na šikmém agaru do media MGB3-8, poté následuje inkubace s třepáním. Inkubace probíhá v rozmezí teplot mezi 22 až 28 °C, po dobu jednoho až čtyř dnů.

Výběr způsobu extrakce RNA z mikroorganismu produkujícího ML-236B není omezen a výhodně se využívá způsobu za užití činidel guanidinthiokyanát-horký fenol, guanidinthiokyanát - guanidinchlorovodíkové kyseliny a dalších podobných. Příklady komerčně dostupných kitů pro přípravu celkové RNA o vyšší čistotě zahrnují RNAasy Plant Mini Kit (vyrobený firmou Qiagen AG). Mimoto lze mRNA získat nanesením celkové RNA na oligo (dT) sloupec a vymýt ze sloupce adsorbovanou frakci.

Přenos RNA na membránu, přípravu sondy, hybridizaci a detekci signálu lze provést obdobně, tak jak to bylo popsáno výše pro hybridizaci v Southem blotu.

• · · · · ·· · ···· ··· · • · · · ♦ · · · ·

3) Analýza 5'- konce a 3'-konce transkriptu

Analýzu 5'- konce a 3'-konce každého transkriptu lze provést podle postupem ‘RACE’ (rapid amplification of cDNA ends). RACE je metoda pro získání cDNA obsahující známou oblast nukleotidů a neznámou oblast na 5'-konci nebo 3'-konci genu. Provádí se pomocí RT-PCR s mRNA jako templátem [popsáno v: Frohman. M. A., Methods Enzymol. 218, 340(1998)].

5'-RACE se provádí podle následujícího postupu. První vlákno cDNA se syntetizuje pomocí užití reversní transkripční reakce s mRNA jako templátem. Jako primer se používají antisense oligonukleotidy (1), které jsou navrženy podle známé části nukleotidové sekvence. Na 3'-konec prvního vlákna cDNA se přidají pomocí terminální deoxynukleotidylové transferasy homopolymemí nukleotidové řetězce (řetězce sestávající z jednoho druhu báze). Potom se pomocí PCR amplifikuje dvojvláknová cDNA v oblasti 5'-konce za použití prvního vlákna cDNA jako templátu. V amplifíkační reakci se používají dva primery; DNA oligonukleotid ze sense vlákna obsahující sekvenci, která je komplementární k homopolymemí sekvenci a oligonukleotid (2) na antisense vlákně 3'-konce oligonukleotidu DNA (1) [popsáno v: Frohman, M.A., Methods in Enzymol., 218, 340 (1993]. Souprava pro 5' RACE je komerčně dostupná, ve výhodném provedení vynálezu se používá 5' RACE Systém for Rapid Amplification of cDNA ends, Verze 2,0 (vyrobeno firmou GIBCO).

3' RACE je způsob využívající polyA oblast existující na 3'-konci mRNA. Zvláště pak primární vlákno cDNA se syntetizuje pomocí reversní transkripční reakce za užití mRNA jako templátu a oligo d(T) adaptéru jako primeru. Potom se amplifikuje dvojvláknová cDNA 3'-koncové oblasti pomocí PCR, kdy se použije primární vlákno cDNA jako templát. Jako primery se užívají jednak DNA oligonukleotid (3) na sense vlákně navržený podle známé části nukleotidové sekvence sense vlákna a jednak oligo d(T) adaptér na antisense vlákně. Souprava pro 3' RACE je komerčně dostupná, ve výhodném provedení vynálezu se používá Ready-To-Go T-primed First-Strand Kit (společnosti Phramacia).

Při navrhování primerů pro postup RACE založených na známých oblastech požadovaných nukleotidových sekvencí je výhodné využít výsledky analýz 1) a 2).

Pomocí postupů popsaných výše v analýzách označených 1) až 3) se dá odvodit orintace strukturního genu na sekvenci genomové DNA, lokalizacaci místa pro transkripční počátek v strukturním genu, pozici iniciačního kodónu pro translaci a translačního terminačního kodónu. Na základě výše zmíněných informací lze získat každý strukturní gen i jejich cDNA, jmenovitě cDNA urychlující biosyntézu ML-236B.

V inkorporované sekvenci rekombinantní DNA vektoru pML48 podle předkládaného vynálezu se předpokládá přítomnost šesti strukturních genů. Jsou nazvány mlcA mlcB, mlcC, mlcD, mlcE, a mlcR. Předpokládá se, že mezi těmito geny mají následující geny mlcA, mlcB, mlcE a mlcR kódující oblast v sekvenci nukleotidů uvedené v SEKV. ID. Č. 2 v Seznamu seknencí. Dále se předpokládá, že mlcC a mlcD mají kódující oblast v nukleotidové sekvenci uvedené pod označením SEKV. ID. Č. 1 v Seznamu sekvencí.

Výše zmíněné příklady postupů k získání specifických cDNA podílejících se na urychlení biosyntézy ML-236B získáním výše popsaných strukturních genů zahrnují: klonování pomocí RT-PCR za užití primerů navržených podle sekvence každého strukturního genu a ohraničujících jejich DNA a klonováním z cDNA knihovny pomocí vhodných DNA sond navržených podle známých nukleotidových sekvencí. Avšak mohou být použity i další metody, které jsou známy odborníkům v daném oboru. Za účelem exprese funkční cDNA získané podle těchto postupů, je výhodné získat klon cDNA o úplné délce (full length clon).

V následujícícm textu jsou popsány způsoby získání cDNA urychlující biosyntézu ML-236B za použití RT-PCR.

,K získání cDNA urychlující biosyntézu ML-236B je třeba navrhnout pár primerů pro RT-PCR, a to tak, aby selektivně nasedly na každý templátový řetězec. Avšak není nezbytně nutné, aby primery pro RT PCR byly plně komplementární s každou částí templátového řetězce, za předpokladu, že splňují podmínky popsané výše. Vhodné primery pro RT-PCR, které mohou přisednout na antisense řetězec (dále označované jako „sense primery“) jsou sense primery, které jsou úplně komplementární s částí antisense řetězce (dále označované jako „nesubstituované sense primery“) nebo sense primery, které nejsou úplně komplementární k části antisense řetězce (dále v textu označované jako „částečně substituované sense primery“). Další použitelné primery pro RT-PCR, které mohou přisedat na sense řetězec (dále v textu označované jako „antisense primery“) jsou antisense primery, které jsou úplně komplementární k části sense řetězce (dále v textu označované jako „nesubstituované antisense primery“) nebo antisense primery, které nejsou úplně komplementární k části sense řetězce (dále v textu označované jako „částečně substituované antisense primery“).

Sense primer lze vhodně navrhnout tak, že získaný RT-PCR produkt obsahuje ATG kodón v příhodné původní pozici pro započetí translace. Ve výhodném uspořádám vynálezu RT-PCR produkt obsahuje ve čtecím rámci majícím originální ATG startovní místo pouze správný terminační kodón pro translaci a neobsahuje další přidané (spurious) stop místa pro translaci. Pozice iniciačního kodónu pro translaci těchto strukturních genů předpovězená v «1 · Μ · * ·«· »··· * · * · ·· · • « # · · · · · ♦ ·· ·« ·4>·*···** • · · · · · · ··

0 * * · ·· ·· ·· * · předloženém vynálezu je pro geny, které jsou součástí SEKV. ID. Č. I a SEKV. ID. Č. 2 ze Seznamu sekvencí znázorěna v tabulce 5.

Na 5'-konci nesubstituovaného sense primeru je ve výhodném uspořádání nukleotid ‘A’ z translačního iniciačního kodónu ATG nebo báze vyskytující se na straně jeho 5'-konce.

Částečně substituovaný sense primer selektivně dosedá na specifickou oblast v SEKV. ID. Č. I nebo SEKV. ID. Č. 2 ze Seznamu sekvencí, nukleotidová sekvence SEKV. ID. Č. 2 v Seznamu sekvencí bývá úplně komplementární k SEKV. ID. Č. I ze Seznamu sekvencí.

Jestliže částečně substituovaný sense primer obsahuje nukleotidovou sekvenci přítomnou na 3'- straně iniciačního translačního kodónu ATQ je výhodné, aby v této oblasti neobsahoval nukleotidovou sekvenci, kterou mají terminační kodóny (TAA, TAG nebo TGA) ve stejném čtecím rámci jako je ATG

Částečně substituovaný sense primer může obsahovat nukleotid „A“, nukleotidovou sekvenci „AT“ nebo „ATG“ (dále v textu budou označeny jako „nukleotid nebo nukleotidová sekvence m’), která odpovídá nukleotidu „A“, nukleotidová sekvenci „AT“ nebo „ATG“ translačního iniciačního kodónu (dále v textu značeno jako „nukleotid nebo nukleotidová sekvence m). Jestliže nukleotid m’je „A“, odpovídající „A“ ze sekvence „m“, dáváme přednost tomu, aby m’ „A“ byl lokalizován na 3'-konci částečně substituovaného sense primeru. Podobně, jestliže m’je AT, dáváme přednost tomu, aby tato m’ AT sekvence byla lokalizována na 3'-konci částečně substituovaného sense primeru. Jestliže nukleotid nebo nukleotidová sekvence m' je „ATG“, odpovídající m’ „ATG“, dáváme přednost tomu, aby tyto trinukleotidy, které jsou 3 'vzhledem k ATG v primeru, netvořily stop kodóny. Jinými slovy, pro trinukleotidy, jejichž 5' koncový nukleotid je (3 x n + l)-tý nukleotid (n reprezentuje celé číslo rovné jedné nebo vyšší) počítáno od A v m’ „ATG“ ve směru 3’-konce, nukleotidová sekvence trinukleotidu není ve výhodném provedení vynálezu ani TAA, TAG ani TGA. Výše popsané příměry mohou být užity k získám cDNA mající kodón pro methionin v pozici odpovídající iniciačnímu translačnímu kodónu v mRNA, která byla použita jako templát v RT-PCT.

Je-li 3'-konec částečně substituovaného sense primeru nukleotid v pozici (3 x η + l), ve výhodném uspořádání vynálezu není trinukleotid, který začíná v této pozici TAA, TAG nebo TGA v RT-PCR produktu získaném pomocí částečně substituovaného sense primeru, jako jednoho z primerů a RNA nebo mRNA z mikroorganismu produkujícícho ML-236B jako templátu nebo v PCR produktu získaném pomocí genomové DNA nebo cDNA jako templatu.

Pozice nukleotidu se počítá od ‘A’ v translačním iniciačním kodónu „ATG“ ve směru od 3'konce a kde ‘n’ reprezentuje celé číslo od jedné výše.

Je-li 3'-konec částečně substituovaného sense primeru nukleotid v pozici (3 x n + 2), triplet, pro který je pozice 3 x n+2 centrálním nukleotidem není ve výhodném uspořádání žádná z následujících sekvencí TAA, TAG nebo TGApro PCR nebo RT-PCR produkt získaný postupem popsaným výše.

Je-li 3'-konec částečně substituovaného sense primeru nukleotid v pozici (3 x n + 3), triplet, pro který je pozice 3 x n+3 nukleotidem 3' není ve výhodném uspořádání žádná z následujících sekvencí TAA, TAG nebo TGA.

Požadavky kladené na sense primer jsou diskutovány výše.

Antisense primer je navržen tak, že tvoří dohromady se sense primerem pár. cDNA kódující každý ze strukturních genů (mlcA, mlcB, mlcC, mlcD, mlcE a mlcR) lze amplifikovat pomocí RT-PCR ve směru ekvivalentním od N-konce k C-konci odpovídajících peptidů.

Výběr nesubstituovaných antisense primerů není omezen, dokud má antisense primer nukleotidovou sekvenci komplementární k nukleotidové sekvenci umístěné v oblasti terminačního místa pro translaci cDNA. Ve výhodném provedení vynálezu má primer na 5konci bázi, která je komplementární k bázi na 3'-konci translačního terminačního kodónu nebo májící tuto bázi na straně 5'-konce řečeného primeru. Ve výhodném uspořádání se používá primer obsahující tři báze, které jsou komplementární k terminačnímu kodónu translace. Tabulky 8 až 10 udávají terminační kodóny translace pro každý strukturní gen, sekvence komplementární k terminačním kodónům translace, aminokyselinové zbytky z Ckonce peptidů kódovaných každým ze strukturních genů, nukleotidové sekvence kódující aminokyselinové zbytky a jejich pozici v SEKV. ID. Č. 1 nebo SEKV. ID. Č. 2.

Částečně substituované antisense primery selektivně nasedají na specifické oblasti v nukleotidové sekvenci SEKV. ID. Č. 1 nebo SEKV. ID. Č. 2 ze Seznamu sekvencí.

Tyto všechny výše popsané požadavky jsou kladeny na antisense primer.

Pokud jsou zachovány výše zmíněné požadavky, lze k 5'- konci sekvence částečně substituovaného sense primeru a částečně substituovaného antisense primeru přidat vhodnou sekvenci nukleotidů. Výběr takovéto nukleotidové sekvence není prakticky limitován, pokud se primery užijí pro PCR. Příklady vhodných sekvencí včetně nukleotidových sekvencí vhodných pro klonování PCR produktů, jako jsou štěpná místa pro restrikční enzymy a nukleotidové sekvence obsahující vhodná štěpná místa restrikčních enzymů.

• · · ·· · · · · • · · · · · · · · « « · ····· · ·

Kromě toho, že sense primery i antisense primery jsou vhodně navrženy podle výše uvedených postupů, jsou dále i ve shodě s obecnými pravidly pro navrhování primerů pro PCR.

Jak bylo popsáno výše, jako templát pro RT-PCR lze využít mRNA nebo celkovou RNA z mikroorganismu produkujícího ML-236B. V předkládaném vynálezu cDNA urychlující biosyntézu ML-236B odpovídájí strukturnímu genu mlcE. Lze je získat návržením a syntézou páru primerů vhodných pro amplifíkaci celé kódující oblasti insertní sekvence pML48 ze strukturního genu mlcE a potom provést RT-PCR pomocí celkové RNA z SANK13380 jako templátu [primery reprezentované pomocí jednotlivých nukleotidových sekvencí SEKV. ID. Č. 35 a 36 ze Seznamu sekvencí].

cDNA urychlující biosyntézu ML-236B odpovídají strukturnímu genu mlcR byla získána podobnou cestou pomocí primerů reprezentovaných jednotlivými nukleotidovými sekvencemi SEKV. ID. Č. 39 a 40 ze Seznamu sekvencí.

Jak bylo popsáno výše, produkt z RT-PCR může být klonován vložením do vhodných DNA vektorů. Výběr DNA vektorů užívaných pro účely takovéhoto klonování není omezen a lze použít všechny vhodné vektory obecně užívané pro klonování DNA fragmentů. Soupravy pro snadné klonování RT-PCR produktů jsou komerčně dostupné a ve výhodném uspořádání se používá Originál TA Cloning Kit [vyrobený firmou Invitrogen: pomocí pCR 2.1 jako DNA vektoru].

Potvrzení funkční exprese cDNA urychlující biosyntézu ML-236B získané pomocí výše zmíněných postupů v mikroorganismech produkujících ML-236B lze získat klonováním cDNA do DNA vektoru vhodného pro funkční expresi v ML-236B produkujících mikroorganismech. Vhodné buňky jsou po té transformovány pomocí rekombinantního DNA vektoru a srovnává se schopnost biosyntézy ML-236B v transformovaných a netransformovaných hostitelských buňkách. Jestliže cDNA urychlující biosyntézu ML-236B je funkčně exprimována v transformované buňce, potom je schopnost biosyntézy ML-236B u transformované buňky vylepšena ve srovnání s touto schopností u hostitelské buňky.

Výběr DNA vektoru vhodného pro expresi v mikroorganismech produkuj ícícch ML236B [dále v textu nazývaný jako funkční expresní vektor] není omezen, pokud tento vektor může trasformovat mikroorganismy produkující ML-236B a může funkčně exprimovat polypeptid, který je kódován cDNA urychlující biosyntézu ML-236B v tomto organismu. Ve výhodném uspořádání je vektor stabilní v hostitelské buňce a má nukleotidovou sekvenci, která mu dovoluje replikaci v hostitelské buňce.

Vektor pro funkční expresi může obsahovat jednu nebo více cDNA urychlujících • * · · · · ··· • · · · ···· · ·» · ······ · ··· ······ •4 ··· ·· · ·· * biosyntézu ML-236B, například cDNA odpovídající strukturním genům zm/cE a/nebo mlcR.

Vektor pro funkční expresi může obsahovat jeden nebo více druhů DNA jiných, než jsou cDNA odpovídající strukturním genům mlcE a/nebo mlcR, které urychlují biosyntézu ML-236B, jestliže jsou vneseny do mikroorganismů produkujících ML-236B. Příklady takovýchto DNA zahrnují: cDNA odpovídající strukturním genům mlcA., mlcR, mlcC, nebo znZcD, genomové DNA podobné DNA pro biosyntézu ML-236B, DNA kódující expresní regulační faktoiy urychlující biosyntézu cDNA podle vynálezu pro ML-236 a podobné.

Vektor pro funkční expresi ve výhodném provedení vynálezu obsahuje nukleotidovou sekvenci poskytující vybraný fenotyp plazmidu v hostitelských buňkách a ve výhodném provedení vynálezu je to obvykle binární (člunkový) vektor.

Kromě toho, selektivní fenotyp může být fenotyp pro rezistenci na léky a tak podobně, ve výhodném provedení vynálezu je to rezistence k antibiotiku a v ještě výhodnějším uspořádání je to rezistence k ampicilinu nebo rezistence k hygromycinu B.

V případě, že expresní vektor je binárním vektorem, vektor ve výhodném uspořádání vynálezu obsahuje nukleotidovou sekvenci, která umožňuje vektoru replikaci v hostitelské buňce určitého jednoho nebo skupiny mikroorganismů a dále nukleotidovou sekvenci nezbytnou pro expresi polypeptidu kódovaného inzertem vektoru v jiném typu hostitelské buňky. Ve výhodném provedení vektor poskytuje různé vybrané fenotypy pro každou hostitelskou buňku v různých transfomovaných skupinách mikroorganismů. Požadavky kladené na kombinaci skupin mikroorganismů jsou podobné požadavkům kladeným na binární vektor užitý pro klonování a expresi genomové DNA související s urychlením biosyntézy ML-236B, která je předmětem předkládaného vynálezu.

V předkládaném vynálezu je vhodným binárním vektorem DNA vektor pSAK700, konstruovaný kombinací promotoru 3-fosfoglycerátkinasy (dále označované jako pgk), který je odvozen z Aspergillus nidulans existujícího v DNA vektoru pSAK333 (popsáno v : Japonská patentová přihláška Č. 3-262486), adaptoru pro zavedení cizího genu a pgk terminátoru existujícím v tomto pořadí v DNA, (viz obrázek 4).

Polypeptid lze exprimovat v mikroorganismech produkujících ML-236B vnesením cDNA odpovídající strukturnímu genu mlcE, který je popsán výše, do expresního vektoru popsaného výše. V předkládaném vynálezu byl pomocí vnesení cDNA odpovídající strukturnímu genu mlcE do adaptorového místa pSAK700 získán rekombinantní expresní vektor pSAKexpE . Sekvence vnesená do pSAKexpE, zejména nukleotidová sekvence cDNA odpovídající strukturnímu genu mlcE, je znázorněna v SEKV. ID. Č. 37 v Seznamu sekvencí. Podobně, cDNA rekombinantní expresní vektor pSAKexpR byl získán pomocí • · · ·· ·· · · ···· ··· · ·· · ····· · • · « ·· · é- · · · vnesení cDNA odpovídající strukturnímu genu zn/cR do adaptorového místa pSAK700. Do pSAKexpR vnesená sekvence, zejména nukleotidová sekvence cDNA odpovídající strukturnímu genu m/cR, je znázorněna SEKV. ID. Č. 41 v Seznamu sekvencí.

Escherichia coli pSAKexpE SANK 72499 je kmen Escherichia coli transformovaný pSAKexpE, který byl uložen v Research Institute of Life Science and Technology of the Agency of Industrial Science and Technology dne 25. ledna 2000 pod postupovým číslem FERM BP-7005 v souladu s Budapešťskou smlouvou o ukládání mikroorganismů. Escherichia coli pSAKexpR SANK 72599 je kmen Escherichia coli transformovaný pSAKexpR a byl uložen v Research Institute of Life Science and Technology of the Agency of Industrial Science and Technology dne 25. ledna 2000 pod přístupovým číslem FERM BP7006 v souladu s Budapešťskou smlouvou o ukládání mikroorganismů.

Aby bylo docíleno exprese cDNA urychlující biosyntézu ML-236B, příbuzné genomové DNA urychlující biosyntézu ML-236B nebo jejich fragmentů, byly také vybrány vhodné způsoby transformace, které závisí na hostitelské buňce. Transformace Penicillium citrinum, což je ve výhodném uspořádání mikroorganismus produkující ML-236B, může být dosaženo pomocí přípravy protoplastů ze spor Penicillium citrinum a po té vnesení rekombinantního vektoru DNA do protoplastů [popsáno v: Nara, F., a dalš, Curr. Genet. 23, 28 (1993)].

Vhodné spory získané z kultury Penicillium citrinum uchovávané na šikmém agaru se inokulují na plotny PGA agarového media a po té se inkubují při 22 až 28 °C po dobu 10 až 14 dnů. Spory se po napěstování sklidí z ploten alxl0⁷-lxl0⁹ spor se inokuluje do 50 až 100 ml YPL-20 kultivačního media [složení: 0,1 % hmotn. kvasničný extrakt (vyrobený firmou Difco), 0,5 % hmotn. polypepton (vyrobený firmou Nihon Seiyaku), 20 % hmotn. laktosa, pH 5,0] a potom se inkubují při 22 až 28 °C po dobu 18 hodin až dvou dnů. Z kultury se získají klíčící spory a nechájí se na ně působit enzymy degradující buněčnou stěnu; tak jsou získány protoplasty. Výběr enzymů degradujícíh buněčnou stěnu není omezen, pokud se jimi degraduje buněčná stěna Penicillium citrinum a nemají škodlivý vliv na mikroorganismus. Příklady těchto enzymů jsou: zymolyasa, chitinasa a další podobné.

Smíchání rekombinantního DNA vektoru obsahujícího cDNA urychlující biosyntézu ML-236B a mikroorganismů produkujících ML-236B nebo jejich protoplastů, dovoluje za určitých vhodných podmínek vnesení rekombinantího DNA vektoru do zmíněných protoplastů, čímž vzniká transformant.

Kultivaci transformantů mikroorganismů produkujících ML-236B je výhodné uskutečnit za podmínek vhodných pro každou zvolenou hostitelskou buňku. Kultivaci ·· · · · · · · · • · · · ··· · · · • · · ····· ·· transformantu Penicillium citrinum, mikroorganismu preferovaného jako mikroorganismus produkující ML-236B, lze provést kultivací dříve transformovaného protoplastu za podmínek vhodných k regeneraci buněčné stěny a následným pěstováním. Zejména transformovaný protoplast Penicillium citrinum lze nanést na VGS středně vrstvě agarové medium [složení: Vogelovo minimální medium, 2 % hmotn. glukosa, 1M glucitol, 1,5 % hmotn. agar] a VGS agarové medium pro horní vrstvu medium [složení: Vogelovo minimální medium, 2 % hmotn. glukosa, 1M glucitol, 1,5 % hmotn. agar] obsahující 800 pg/l hygromycinu B. Zde se potom inkubuje po dobu při 22 až 28 °C po dobu 7 až 15 dnů. Vzniklé kmeny se rozklonují inkubací při teplotě 22 až 28 °C na PGA mediu. Kmen se inokuluje pomocí platinové jehly na šikmý gel připravený z PGA media, potom se inkubuje při teplotě 22 až °C po dobu 10 až 14 dnů. Uchovávání kmene se děje při teplotě 0 až 4 °C.

Jak bylo popsáno výše, ML-236B lze efektivně produkovat inokulací Penicillium citrinum transformantem získaným z šikmého agaru, tak, jak je popsáno výše, kteiý má obnovené buněčné stěny, v mediu MBG 3-8, následnou inkubací při 22 až 28 °C po dobu 7 až 12 dnů za třepání. Za účelem produkukce ML-263B lze Penicillium citrinum, jako hostitele, pěstovat v tekutém mediu......

Purifikace ML-236B z kultury transformovaného mikroorganismu produkujícího ML-236B se provede kombinací různých metod obecně užívaných pro purifikace produktů v přirozeném stavu. Výběr takovýchto metod není omezen a může zahrnovat například centrifugaci, separaci pevných a kapalných součástí pomocí filtrace, působení louhů a kyselin, extrakci pomocí organických rozpouštědel, rozpouštěním, chromatografické postupy, jako je adsorpční chromatografie, dělící chromatografie a další podobné postupy, dále pak krystalizaci a podobné postupy. ML-236B může být buď ve formě hydroxykyseliny nebo laktonu, které mohou být vratně měněny. Hydroxykyselina se konvertuje na svoji sůl, která je daleko stabilnější. Využitím těchto fyzikálních vlastností lze získat ML-236B buď ve formě hydroxykyseliny (dále označováno jako volná hydroxykyselina), solí hydroxykyseliny ML236B (dále označováno jako sůl hydroxykyseliny) nebo jako laktonová forma ML-236B (dále značeno jako lakton).

Kultura se podrobí alkalické hydrolýze za zvýšené teploty nebo za pokojové teploty. Tím se otevře kruh a nastane konverze na sůl hydroxykyseliny. Dále se reakční roztok okyselí a následuje filtrace. Filtrát se extrahuje pomocí organických rozpouštědel, kterými se oddělí voda a získá se tak požadovaný produkt ve formě volné hydroxykyseliny. Výběr organického rozpouštědla není ničím omezen. Příklady různých rozpouštědel zahrnují: alifatické uhlovodíky jako je hexan, heptan a další podobné; aromatické uhlovodíky jako je benzen, ·· · 9 9 · · 99

9 9 9 9 9 9 ··· • · · ····· · · toluen a další podobné; halogenované uhlovodíky jako je metylchlorid, chloroform a další; étery, jako je dietylether a další; estery jako je etylmravenčnan, etylacetát a další; nebo směsi sestávající ze dvou Či více rozpuštědel.

Požadovaná sloučenina může být získána jako sůl hydroxykyseliny pomocí rozpuštění volné hydroxykyseliny ve vodném roztoku soli alkalického kovu, jako je hydroxid sodný.

Mimoto, požadovaná sloučenina může být získána jako lakton, uzavřením kruhu zahřátím volné hydroxykyseliny v organickém rozpouštědle, dehydratací nebo pomocí dalších vhodných způsobů.

Je možné purifíkovat a izolovat volné hydroxykyseliny, hydroxykyseliny nebo laktony získat tyto pomocí sloupcové chromatografie a dalších podobných metod. Doporučení pro užití sloupců v chromatografii není ničím omezeno. Příklady těchto sloupců zahrnují: Sephadex LH-20 (vyrobeno firmou Pharmacia), Diaion HP-20 (vyrobeno firmou Mitsubishi Kagaku), silikagel, nosič pro reversní fázi a další podobné, ve výhodném uspořádání vynálezu se doporučuje užití nosičů série Cl8.

Výběr způsobů kvantifikace ML-236B není ničím omezen, výhodně se užívají způsoby běžně používané pro kvantifikaci organických sloučenin. Příklady těchto metod zahrnují: reversní fázi vysokotlaké kapalinové chromatografie (dále nazývané „reversní fáze HPLC“) a další. Kvantifikaci pomocí reversní fáze HPLC lze provést podrobením kultury mikroorganismu produkujícího ML-236B alkalické hydrolýze, nanesením rozpustné fáze na reversní fázi HPLC za užití sloupce Cl8, měřením UV absorpce a přepočtem hodnot absorbance na jednotky odpovídající množství ML-236B. Výběr sloupců C18 není ničím omezen, ve výhodném provedení vynálezu je Cl 8 sloupec užívaný obecně pro reversní fázi HPLC. Příklady těchto sloupců zahrnují následujícíc: SSC-ODS-262 (průměr 6 mm, délka 100 mm, vyroben firmou Senshu Kagaku) nebo další. Výběr rozpouštědel pro mobilní fázi není také ničím zvláštním omezen, za předpokladu, že jsou to rozpouštědla obecně užívaná pro reversní fázi HPLC. Je to například 75 % obj. methanol - 0,1% obj. trietylamin - 0,1 % obj. kyselina octová a další. Nanese-li se ML-236B při pokojové teplotě na sloupec SSCODS-262, kde je jako mobilní fáze užita směs rozpuštědel 75 % obj. methanol - 0,1 % obj. trietylamin -0,1 % obj. kyselina octová při rychlosti 2 ml/minutu, ML-236B se eluuje po 4,0 minutách. ML-236B může být detekován pomocí UV detektoru pro HPLC. Absorpční vlnové délky pro UV detekci leží v rozmezí 220 až 280 nm, ve výhodném uspořádání mezi 220 až 260 nm, v ještě výhodnějším provedení vynálezu se absorpční vlnová délka rovná 236 nm.

Pomocí předkládaného vynálezu jsou připraveny farmaceutické kompozice obsahující ML-236B získaný způsoby popsanými ve vynálezu, které obsahují ještě farmaceutický nosič.

Dále jsou připraveny farmaceutiské kompozice obahující pravastatin připravený z ML-236B získaného užitím předkládaného vynálezu, které obsahují ještě farmaceutický nosič.

Farmaceutické kompozice podle vynálezu mohou být tradiční a tytéž, jako ty, které byly využity pro již existující sestavení ML-236B nebo pravastatin.

Způsoby léčby jsou také součástí předkládaného vynálezu a zahrnují sloučeniny nebo kompozice k léčení hyperlipemie a dalších stavů.

Vynález je v dalším textu popsán do větších detailů pomocí následujících obrázků a příkladů. Příklady jsou ilustrativní, ale nikoli vyčerpávající, pro užití předkládaného vynálezu. Přehled obrázků na výkrese

Obrázek 1 je diagram znázorňující konstrukci DNA vektoru pSAKcosl;

Obrázek 2 znázorňuje výsledky strukturním genové analýzy pro vloženou sekvenci pML48;

Obrázek 3 ukazuje hybridizaci metodou Northem blotu pro vloženou sekvenci pML48;

Obrázek 4 je diagram znázorňující konstrukci cDNA expresního vektoru pSAK700;

Obrázek 5 ukazuje RT-PCR analýzu přepisu mlc A-E a R v pSAKexpR transformantu.

Obrázek 6 ukazuje RT-PCR analýzu pro přepis mlcE v pSAKexpE transformantu.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1: Konstrukce vektoru pSAKcosls

Plazmid pSAK333 obsahující gen pro hygromycin B fosfotransferasu (dále označovaný jako „HPT“) získaný původně z Escherichia coli (Japonská patentová přihláška Č. 3-262486) byl naštěpen restrikčním enzymem BamHI (výrobek firmy Takara Shuzo Co., Ltd., Japonsko) a

po té byl ošetřen pomocí T4DNA polymerasy (výrobek firmy Takara Shuzo Co., Ltd., Japonsko), aby vznikly tupé konce.

DNA fragment získaný způsobem popsaným výše se samočinně ligoval do cirkulámí formy pomocí soupravy DNA ligation kit Ver.2 (výrobek firmy Takara Shuzo Co., Ltd., Japonsko) a tímto fragmentem byly transformovány kompetentní buňky kmene JM 109 Escherichia coli (výrobek firmy Takara Shuzo Co., Ltd., Japonsko). Z transformovaných buněk Escherichia coli byl vybrán kmen, obsahující plazmid, ve kterém bylo vynecháno štěpné místo pro BamHI, který byl označen jako pSAK360.

pSAK 360 byl naštěpen restrikčním enzymem PvuII, dále ošetřen alkalickou fosfatasou, čímž se získaly fragmenty, které byly na 5’- konci defosforylovány.

Z kosmidového vektoru pWE15 (vyráběný firmou STRATAGENE ) byl získán fragment SallScal (kolem 3 kb) obsahující cos místo, na který se působilo T4 DNA polymerasou, aby byly získány tupé konce. Tento vektor byl následně ligován do PvuII místa pSAK360. Takto získanou DNA byly transformovány buňky JMI 09. Z transformovaných Escherichia coli byly vybrány kmeny, které obsahovaly plazmid se zabudovaným fragmentem Sall-Scal (kolem 3kb) do místa PvuII. Kmeny nesoucí tento plazmid byly označeny pSAKcosl. pSAKcosl obsahuje štěpné místo pro restrikční enzymy BamHI, EcoRI a Notl, každé místo má svůj původ v pWE15. pSAKcosl nese gen pro ampicilinovou resistenci a gen pro rezistenci k hygromycinu jakpo selekční markéry.

V následujících příkladech, kdy se užívá Escherichia coli jako hostitelského organismu, se provádí selekce pSAKcosl transformantů nebo transformantů pSAKcosl obsahujících cizí genový inzert, pomocí přidání 40 pg/ml ampicilinu (Ampicilin: vyrobeno firmou Sigma) do užívaného media. Používá-li se jako hostitelský organismus Penicillium citrinum kmen SANK13380, selekce pSAKcosl transformantů nebo transformantů pSAKcosl obsahujících cizí genový inzert se provádí přidáním 200 pg/ml hygromycinu (Hygromycin B: vyrobeno firmou Sigma) do používaného media.

Způsob konstrukce pSAKcosl je zobrazena na obrázku 1.

Příklad 2: Příprava genomové DNA z Penicillium citrinum kmene SANK 13380

1) Kultura Penicillium citrinum kmene SANK 13380

Výsev kultury Penicillium citrinum kmene SANK 13380 byl proveden na šikmém PGAagarovém mediu. Jmenovitě, agar byl inokulován Penicillium citrinum SANK 13380 za užití platinové jehly a byl udržován při 26 °C po dobu 14 dnů. Kultura byla po té skladována při 4 °C.

Hlavní kultivace se prováděla v tekuté provzdušněné kultuře. Buňky z 5 mm čtverečních odebraných z kultury uchovávané na šikmém agaru, zmíněné výše, se inokulovaly do 50 ml MBG3-8 media v 500 ml konických lahvích a ponechaly se inkubovat při 26 °C za třepání při otáčkách 210 ot./min po dobu 5 dnů.

2) Příprava genomové DNA z Penicillium citrinum SANK 13380

Kultura získaná v kroku 1) se centrifuguje při 10000 x G za pokojové teploty po dobu 10 minut a buňky se sklidí. 3 g (mokrá váha) buněk se třou v třecí misce vychlazené pomocí suchého ledu, až vznikne jejich prášková forma. Rozetřené buňky se vloží do centrifiigační kyvety naplněné pufrem obsahujícícm 20 ml 62,5 mM EDTA-2Na (výrobek firmy Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) - 5% hmotn. SDS - 50 mM Tris-chlorovodíkové kyseliny (výrobek firmy Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) (pH 8,0) a lehce se promíchají. Potom se nechají stát při teplotě 0 °C po dobu jedné hodiny. Následně se přidá 10 ml fenolu nasyceného směsí 10 mM Tris-chlorovodíková kyselina - 0,1 mM EDTA-2Na (pH 8,0, dále označováno „TE“). Směs se nechá jemně míchat po dobu 1 hodiny při teplotě 50 °C.

Po centrifugaci při pokojové teplotě, 10000 x G po dobu 10 minut se odebere 15 ml horní vrstvy-vodné fáze a přemístí se do další centrifugační zkumavky. K roztoku se přidá poloviční objem ΊΈ nasyceného fenolem a poloviční objem roztoku chloroformu. Směs se nechá míchat po dobu dvou minut a poté se centrifuguje při pokojové teplotě při 10000 x G po dobu 10 minut (tento proces se dále nazývá „fenol-chloroformová extrakce“). K 10 ml vrchní vrstvy (vodní fáze) se přidá 10 ml 8M octanu amonného (pH 7,5) a 25 ml 2-propanolu (výrobek firmy Wako Pure Chemical Industries, Ltd.); následuje zchlazení na -80 °C po dobu 15 minut a centrifugace při 4 °C a 10000 x G po dobu 10 minut.

Po precipitaci se precipitát rozpustí v 5 ml ΊΈ, do kterého byly přidáno 20 μΐ roztoku 10 mg/ml ribonukleasy A (vyrobeno firmou Sigma) a 250 jednotek ribonukleasy TI (vyrobeno firmou GIBCO). Následuje inkubace při 37 °C po dobu 20 minut. Po té se do směsi přidá 20 ml 2-propanolu a nechá se mírně míchat. Následně se vlákna genomové DNA namotají na špičku Pasteurovy pipety a rozpustí se v jednom ml TE pufru.

Do roztoku DNA se přidá 0,1 násobek objemu 3 M octanu sodného (pH 6,5) a 2,5 násobek objemu ethanolu. Roztok se nechá chladit při - 80 °C po dobu 15 minut a potom se centrifuguje při 4 °C, 10000 x G po dobu pěti minut (dále se tento postup bude nazývat „ethanolové srážení“). Vzniklá sraženina se rozpustí v 200 μΐ TE a vzniklý roztok je frakce genomové DNA.

Příklad 3: Příprava genomové DNA knihovny Penicillium citrinum SANK13380

1) Příprava genomových fragmentů DNA

K vodnému roztoku 100 μΐ genomové DNA (50 pg) z Penicillium citrinum SANK13380 získané postupem popsaným v příkladě 2 se přidá 0,25 jednotek Sau3 AI (Takara Shuzo Co., Ltd., Japonsko). V intervalech 10, 30, 60,90 a 120 s se odebírají ze směsi vzorky po 20 μΐ a ke každému vzorku se přidá 0,5 M EDTA (pH 8,0), čímž se ukončí reakce katalyzovaná restrikčními enzymy. Vzniklé, částečně naštěpené, fragmenty DNA se rozdělí pomocí elektroforézy na agarosovém gelu a z agarosy se vyjmou fragmenty obsahující DNA o molekulové hmotnosti 30 kb a více.

Vyříznutý gel je následně rozdrcen a vzniklá drť se vloží do centrifugačně filtrační jednotky Ultra Free C3 Centrifuged Filtration Unit (vyrobeno firmou Japan Milipore). Gel se chladí na -80 °C po dobu 15 minut, dokud nezmrzne. Potom je gel roztaven zahřátím inkubací při 37 °C po dobu 10 minut. Pro extrakci DNA se vzniklý roztok se centrifuguje při 5000 x G po dobu 5 minut. DNA se podrobí fenol - chloroformové extrakci a ethanolovému srážení. Vzniklé precipitáty se rozpustí v odpovídajícím malém množství TE.

2) Úprava DNA vektoru pSAKcosl pSAKcosl se štěpí pomocí restrikčních enzymů BamHI (Takara Shuzo Co., Ltd., Japonsko) a po té se podrobí působení alkalické fosfatasy (Takara Shuzo Co., Ltd., Japonsko) při 65 °C po dobu 30 minut. Výsledná reakční směs se podrobí následně fenol-chloroformové extrakci a ethanolovému srážení. Vzniklý precipitát se rozpustí v malém množství TE.

3) Ligace a in vitro pakážování

Smíchá se fragment genomové DNA (2 pg) popsaný v předchozím kroku 1) a pSAKcosl (1 pg), který byl podroben úpravě popsané výše. Po té se provede ligace při 16 °C po dobu 16 hodin za užití DNA ligačního kitu Ver.2 (Takara Shuzo Co., Ltd., Japonsko). Vzniklý reakční roztok se podrobí fenol - chloroformové extrakci a ethanolovému srážení. Vzniklé precipitáty se rozpustí v 5 μΐ TE. Takto vzniklý roztok ligačního produktu se podrobí in vitro pakážování pomocí GIGAPAKII Gold kitu (vyrobeno firmou STRATAGENE), tímto se získají transformanty Escherichia coli obsahující rekombinantní DNA vektor. Na plotnu, na které se vytvořily kolonie transformantů Escherichia coli se přidají 3 ml LB media a po té se kolonie z plotny sklidí seškrábáním kolonií pomocí buněčné škrabky (dále se tento produkt nazývá získané buňky- roztok 1). Plotna se omyje ještě dalšími 3 ml LB media a buňky takto získané se nazývají jako získané buňky - roztok 2. K roztokům získaných buněk 1 i 2 se přidá glycerol do konečné koncentrace 18 % (dále označováno jako roztok obsahující buňky Escherichia coli), který se uchovává při - 80 °C jako genomová DNA knihovna Penicillium citrinum SANK13380.

Příklad 4: Amplifikace fragmentů PKS genu pomocí PCR za užití genomové DNA z Penicillium citrinum SANK13380 jako templátu

1) Návrh a syntéza primerů pro PCR

Na základě aminokyselinové sekvence genu PKS z Aspergillus flavus (popsáno v: Brown, D.W., a další, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 93,1418 (1996)) byly navrženy a syntetizovány degenerované primery, které jsou uvedeny v sekvencích označených SEKV. ID. Č. 3 a 4 uvedných v seznamu sekvencí. Syntéza byla provedena fosfoamiditovou metodou. SEKV. ID. Č. 3 ze Seznamu sekvencí:

gayacngcntgyasttc

SEKV. ID. Č. 4 ze Seznamu sekvencí: tcnccnknrcwgtgncc .

V uvedených nukleotidových sekvencích SEKV. ID. Č. 3 a 4, n reprezentuje inosin (hypoxanthin), y reprezentuje t nebo c, s reprezentuje g nebo c, k reprezentuje g nebo t, r reprezentuje g nebo a, dále w reprezentuje a nebo t.

2) Amplifikace segmentů DNA pomocí PCR μΐ reakčního roztoku obsahuje primery pro PCR popsané v předchozím kroku 1) (každý v koncentraci 100 pmol), genomová DNA z Penicillium citrinum SANK13380 získané postupem v Příkladu 2 (500 ng), 0,2 mM dATP, 0,2 mM dCTP, 0,2 mM dGTP, 0,2 mM dTTP, 50 mM chlorid draselný, 2 mM chlorid hořečnatý a 1,25 jednotek Ex. Tac DNA polymerasy (Takara Shuzo Co., Ltd., Japonsko). Uvedený roztok se podrobí reakčním cyklům sestávajících ze tří následných kroků: jedna minuta při 94 °C, dvě minuty při 58 °C a 3 minuty při 70 °C. Uvedený cyklus tří kroků se 30 krát opakoval; tímto způsobem došlo k amplifikaci DNA fragmentů. PCR rekce byla prováděna v termocyklátoru TaKaRa PCR Thermal Cycler MP TP 3000 (výrobek firmy Takara Shuzo Co., Ltd., Japonsko).

Amplifikované DNA fragmenty byly podrobeny elektroforéze na agarosovém gelu a agarosový gel obsahující DNA fragmenty mající velikost okolo 1,0 až 2,0 kb byly z gelu vyříznuty. Z vyříznutého gelu se získala DNA a poté se podrobila fenol-chloroformové extrakci a ethanolovému srážení. Vzniklé percipitáty se rozpustily v malém nožství TE.

3) Ligace a transformace

Fragmenty DNA získané postupem popsaným v kroku 2) byly ligovány do plazmidu pCR 2.1 za užití TA klonovacího systému CR2,1 (vyrobeno firmou Invitrogen), přičemž plazmid je dodáván jako součást soupravy. Za účelem získání transformantů byl plazmid transformován do Escherichia coli kmene JMI09.

Z výsledných transformantů bylo vybráno několik kolonií a ty byly množeny podle způsobu přípravy popsaném Maniatisem a dalšími, [popsáno v: Maniatis, T., a další, Molecular cloning, laboratorní manuál, druhé vydám, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)]. Jmenovitě, každá kolonie se inokulovala do 24 ml zkumavky obsahující 2 ml LB media a po té se ponechala inkubovat při 37 °C po dobu 18 hodin s třepáním.

Rekombinantní DNA vektor byl připraven z kultury aplikací alkalické metody (popsáno v: Maniatis, T., a další, supra). Jmenovitě 1,5 ml kultivačního media se centrifugovalo při pokojové teplotě při 10000 x G po dobu dvou minut. Buňky tvořily potom precipitát. K buňkám se přidalo 100 μΐ roztoku 50 mM glukosy, 25 mM Tris chlorovodíkové kyseliny, 10 mM EDTA (pH 8,0). Vytvořila se suspenze. K této suspenzi bylo přidáno 200 μΐ 0,2 N hydroxidu sodného - 1 % hmotn. SDS. Suspenze se nechala mírně míchat, docházelo k lyži mikroorganismů. K následné denaturaci proteinů bylo přidáno 150 μΐ roztoku 3 M octanu draselného - 11,5 % hmotn. kyseliny octové, potom následovala centriíugace při pokojové teplotě při 10000 x G po dobu 10 minut. Shromáždil se supematant. Supematant byl podroben fenol - chloroformové extrakci a ethanolovému srážení. Vznikající precipitát se rozpustil v 50 μΐ TE obsahujícím 40 pg/ml ribonukleasy A (výrobek firmy Sigma).

Každý z rekombinantních DNA vektorů byl naštěpen restrikčními enzymy a podroben elektroforéze. Nukleotidové sekvence DNA inzertů v rekombinantních DNA vektorech byly určeny pomocí sekvenace DNA na sekvenátoru (model 377: výrobek firmy Perkin Elmer, Japonsko) a to pro všechny inzerty, které poskytly pro toto štěpení na elektroforéze rozdílné výsledky.

Touto cestou byl identifikován kmen mající rekombinantní vektor DNA obsahující PKS fragment odvozený z Penicillium citrinum.

Příklad 5: Hybridizace genomu Penicillium citrinum SANK13380 pomocí metody Southem blotu

1) Elektroforéza a přenos na membránu

Genomová DNA (10 pg) z Penicillium citrinum SANK13380 získaná postupem popsaným v příkladu 2 byla naštěpena restrikčními enzymy EcoRI, Sáli, HindlII nebo Sací (všechny enzymy jsou výrobky firmy Takara Shuzo Co., Ltd., Japonsko) a po té byla podrobena elektroforéze na agarosovém gelu. Gel byl připraven použitím agarosy L03 TAKARA (Takara Shuzo Co., Ltd., Japonsko). Po elektroforéze se gel ponořil do roztoku 0,25 N kyseliny chlorovodíkové (vyrobena firmou Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) a zde se inkuboval po dobu 10 minut při pokojové teplotě za stálého jemného třepání. Potom byl gel přenesen do roztoku 0,4 N hydroxidu sodného (výrobek firmy Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) a zde byl ponechán na inkubaci za jemného třepám po dobu 30 minut za pokojové teploty. Pomocí alkalického způsobu přenosu popsaném Maniatisem a dalšími, (supra), byla DNA obsažená v gelu přenesena na nylonovou membránu Hybond ™-N+ (výrobek firmy Amensham) a zde byla zafixována. Membrána byla dvakrát promyta pomocí roztoku 2 x SSC (1 x SSC obsahuje 150 mM NaCl, 15 mM citrát sodný) a potom byla membrána usušena vzduchem.

2) Hybridizace a detekce signálu

Membrána získaná v kroku 1) se hybridizovala s fragmentem PKS genu získaným podle postupu popsaného v příkladu 4 výše jako sondou.

Pro získání sondy byl 1 pg DNA fragmentu genu PKS získaného postupem popsaným v příkladu 4 označen DIG DNA Labeling Křtem (výrobce Boeringer-Mannheim) a po té byla směs 10 minut po vařena a před vlastním použitím rychle zchlazena.

Membrána popsaná v kroku 1) se ponořila do roztoku hybridizační kapaliny (DIG Easy Hyb: výrobce Boehringer-Mannheim), potom byla podrobena prehybridazační úpravě promytím za třepání při 20 ot./min při teplotě 42 °C po dobu 2 hodin. Následně byla k hybridizační kapalině přidána výše zmíněná značená sonda a hybridizace probíhala dále za třepání při 20 ot./min při teplotě 42 °C po dobu 18 hodin za užití Multishaker Oven HB (výrobce firma TAITEC). Membrána, která byla podrobena hybridizaci, byla poté třikrát promyta při pokojové teplotě po dobu 20 minut roztokem 2 x SSC a dvakrát promyta za užití roztoku 0,1 x SSC při 55 °C po dobu 30 minut.

Na promytou membránu se působilo činidly soupravy DIG Luminescent Detection Kit for Nucleic Acids (výrobce Boehringer-Mannheim) a exponoval se film citlivý na X paprsky (Lumifilm, výrobce Boehringer-Mannheim). Fotografie se získaly pomocí Fuji medical film procesoru FPM 800A (výrobce Fuji Film Corporation).

• · · ·· ·* ·· · • · · · «·* · · · ♦ • · · ·*>··· ·· « ·· ·*··<···· ·

Získaný výsledek potvrdil, že fragment genu PKS získaný postupem podle příkladu 4 je přítomen v genomu Penicillium citrinum .

Příklad 6: Analýza genomové DNA knihovny z Penicillium citrinum SANK13380 pomocí fragmentu genu PKS jako sondy

Klonování fragmentů genomové DNA obsahujících PKS gen bylo provedeno pomocí metody hybridizace kolonií.

1) Příprava membrány

Suspenze buněk Escherichia coli uchovávané jako genomová DNA knihovna Penicillium citrinum SANK13380 (popsáno v příkladu 3) byla naředěna a rozetřena na plotny s agarovým LB mediem, a to tak, aby mohlo na plotně vyrůst od 5000 do 10000 kolonií. Plotna byla vložena do inkubátoru a ponechána tam při 26 °C po dobu 18 hodin a potom dána na jednu hodinu k ochlazení do 4 °C. Membrána Hybond ™-N+ (výrobek firmy Amasham) byla položena na plotnu a uvedena na jednu minutu v kontakt s jejím povrchem. Membrána, na jejímž povrchu byly zachyceny kolonie, se opatrně sundala z plotny. Povrchem, kterým přišla do styku s koloniemi otočeným nahoru, byla membrána ponořena do 200 ml roztoku o složení 1,5 M chlorid sodný, 0,5 N hydroxid sodný na dobu 7 minut. Po té byla membrána namočena do 200 ml roztoku o složení 1,5 M chlorid sodný, 0,5 M Tris chlorovodíková kyselina, 1 mM EDTA (pH 7,5) na dobu tří minut. Tento krok se ještě jednou opakoval. Potom byla membrána promyta 400 ml 2 x SSC. Nakonec byla membrána sušena na vzduchu po dobu 30 minut.

2) Hybridizace

Jako sonda byl použit insert DNA z PKS genu získaný postupem popsaným v příkladu 4 v množství (1 pg). DNA byla označena pomocí DIG DNA Labeling Kit (výrobek firmy Boeringer-Mannheim) a potom povařena po dobu 10 minutes a před dalším použitím rychle zchlazena.

Membrána popsaná v kroku 1) se ponořila do roztoku hybridizační kapaliny (DIG Easy Hyb: výrobce Boeringer-Mannheim) a potom byla podrobena prehybridazační úpravě promytím za třepám při 20 ot./min při teplotě 42 °C po dobu 2 hodin. Následně byla k hybridizační kapalině přidána výše zmíněná značená sonda a hybridizace probíhala dále za třepání při 20 ot./min při teplotě 42 °C po dobu 18 hodin za užití Multishaker Oven HB (výrobce firma TAITEC). Membrána, která byla podrobena hybridizaci, byla poté třikrát promyta roztokem 2 x SSC při pokojové teplotě po dobu 20 minut a dvakrát byla promyta za užití roztoku 0,1 x SSC při 68 °C po dobu 30 minut.

Na promytou membránu se působilo činidly soupravy DIG Luminescent Detection Kit for Nucleic Acids (výrobce Boehringer-Mannheim) a exponoval se film citlivý na X paprsky (Lumifilm, výrobce Boehringer-Mannheim). Fotografie byly provedeny pomocí Fuji medical film procesoru FPM 800A (výrobce Fuji Film Corporation).

Výše zmíněné kroky 1) a 2) jsou nazývány analýzami.

Kolonie na plotně, kde byl detekován pozivní signál při prvním prozkoumání, se pomocí škrabky shrnuly a resuspendovaly se v LB mediu. Po té, co byly buňky adekvátně naředěny, byly vysety na vhodnou plotnu. Za účelem purifikace pozitivních klonů byla následně provedena druhá analýza.

Pozitivní klon získaný v popisovaném příkladu, jmenovitě transformovaný do Escherichia coli kmene pML48 SANK71199 byl uložen v Research Institute of Life Science and Technology of the Agency of Industrial Science and Technology dne 7. července 1999 pod přístupovým číslem FERM BP-6780 v souladu s Budapešťskou smlouvou o ukládání mikroorganismů.

Příklad 7: Analýza vložené sekvence rekombinantmho DNA vekctoru pML48 (1)

Kultivace kmene Escherichia coli pML48 SANK71199 získaného postupem popsaným v příkladu 6 a příprava rekombinatního DNA vektoru z kultury byla provedena podobnými postupy, jaké byly popsány v příkladu 4.

Získaný DNA vektor byl označen jako pML48. Insert v pML48, což je genomová DNA související s biosyntézou ML-236B, byl naštěpen různými restrikčmmi enzymy a vzniklé fragmenty byly subklonovány do plazmidu pUC119 (výrobek firmy Takara Shuzo Co., Ltd., Japonsko). Za použití výsledných subklonů jako sond, byla provedena hybridizace metodou Southem blotu, a to postupem obdobným tomu, který byl popsán v příkladu 5. Jmenovitě, produkty získané restrikcí pML48 různými restrikčními enzymy byly podrobeny rozdělení na elektroforéze a DNA byly přeneseny na membránu a po té byla provedena hybridizace. Jako výsledek tohoto postupu byla získána metodami obecně používanými v tomto oboru mapa restrikčního štěpení sekvence vložené do pML48.

Nukleotidová sekvence nukleotidového inzertu v každém subklonu byla určena pomocí DNA sekvenátoru model 377 (výrobek firmy Perkin Elmer Japonsko Co.Ltd.), následně byla určena vlastní nukleotidová sekvence pML48.

Vložená sekvence pML48 sestávala celkově z 34203 baží.

Nukleotidová sekvence vložené sekvence pML48 je uvedena v SEKV. ID. Č. 1 a 2

v Seznamu sekvencí. Sekvence popsané v SEKV. ID. Č. 1 a 2 v Seznamu sekvencí jsou vzájemně komplementární.

Existence strukturních genů v sekvenci inzertu pML48 byla analyzována pomocí programu k průzkumu genů nazvaného GRAIL (ApoCom GRAIL Toolkit: vyrobeno společností Apocom Corporation) a homologie byla zkoumána pomocí programu BLAST (Gapped-BLAST (BLAST2): instalovaný v Wisconsin GCG balíčku Ver,1.0).

Jako výsledek tohoto zkoumání byla ve vložené sekvenci pML48 předpovězena přítomnost šesti různých strukturních genů. Tyto geny byly označeny mlcA, mlcB, mlcC, mlcD, mlcE a mlcR. Dále bylo předpovězeno, že mlcA, mlcB, mlcE a mlcR mají kódující oblasti v nukleotidové sekvenci SEKV. ID. Č. 2 v Seznamu sekvencí a mlcC a mlcD mají kódující oblast v nukleotidové sekvenci označené SEKV. ID. Č. 1 v Seznamu sekvencí. Byla také předpovězena relativní poloha a délka každého z předpokládaných strukturních genů vložené sekvence.

Výsledky z popisovaného příkladu jsou ukázány na obrázku 2. Každá šipka indikuje lokalizaci, směr a relativní velikost každého strukturního genu v inzertu pML48. Šipka směřující vlevo znázorňuje existenci kódující oblasti strukturního genu (mlcA, B, E nebo R) nacházející se v sekvenci označené SEKV. ID. Č. 2. Šipka směřující vpravo znázorňuje, že kódující oblast strukturního genu (mlcC nebo D) existuje na SEKV. ID.Č. 1.

Příklad 8: Analýza vložené sekvence- inzertu rekombinantního DNA vektoru pML48 (2)

Analýza exprese strukturních genů, jejichž existence byla předpovězena v příkladu 7, byla provedena pomocí hybridizace metodou Northem blotu a RACE. Dále byla provedena analýza oblastí 5'- a 3'-konce.

1) Příprava celkové RNA z Penicillium citrinum kmene SANK13380

Buňky z 5 mm čtverečních odebrané z kultury Penicillium citrinum kmene SANK13380 uchovávané na šikmém agaru (popsáno v příkladu 2) se inokulovaly do 10 ml MBG3-8 media ve 100 ml konické láhvi a ponechalo se inkubovat při 26 °C za třepání po dobu 3 dnů.

Příprava celkové RNA z kultury se prováděla pomocí soupravy RNAeasy Plant Mini Kit (výrobek firmy Qiagen AG), která používá guanidin - isothiokyanátovou metodu. Jmenovitě, pro získání buněk se kultura centrifuguje při pokojové teplotě při 5000 x G po dobu 10 minut. Následně se 2 g (mokrá váha) buněk nechají zmrznout v tekutém dusíku a potom se rozetřou tloučkem v třecí misce na prášek. Rozdrcené buňky se suspendují ve 4 ml ···· · · · · ·· · ·· · ♦ · · · · · ·· • · ········· · ··· ···« · ·* •« ··· ·· ·· ·· ··* lyzovacího pufru (je součástí soupravy). Na každou z deseti centrifugovatelných kolonek obsažených v soupravě QIAshredder spin columns se nanese 450 μΐ suspenze a kolonky se centrifugují při pokojové teplotě při 1000 x G po dobu 10 minut. Shraňují se vzniklé eluáty, ke kterým se přidá 225 μΐ ethanolu, tento roztok se potom přenese na centrifugovatelné mini kolonky (RNA mini spin column) obsažené v soupravě. Kolonky se promyjí promývacím pufrem, který je také součástí soupravy. Potom následuje eluce adsorbované RNA z každé kolonky pomocí 50 μΐ destilované vody zbavené ribonukleasy. Eluent se užívá jako frakce celkové RNA.

2) Hybridizace Northem blotem

Připravil se vzorek RNA přidáním 2,25 μΐ vodného roztoku obsahujícího 20 pg celkové RNA z Penicillium citrinum kmene SANK13380 k jednomu μΐ 10 x MOPS (složení: 200 mM 3-morfolinopropansírová kyselina, 50 mM octan sodný, 10 mM EDTA-2Na; pH 7,0; k užití po sterilizaci v autoklávu při 121 °C po dobu 20 minut; vyrobeno Dojinkagaku Laboratory Co.Ltd.), 1,75 μΐ formaldehydu a 5 μΐ formamidu, vše se promíchalo. Vzorek RNA byl inkubován při 65 °C po dobu 10 minut, potom rychle zchlazen v ledové vodě a nanesen na agarosový gel, kde byl podroben elektroforéze. Gel pro elektroforézu byl připraven smícháním 10 ml 10 x MOPS a jednoho gramu Agarosy L03 „TAKARA“ (výrobek firmy Takara Shuzo Co., Ltd., Japonsko) s 72 ml vody, která byla ošetřena dietylpyrokabonátem (výrobek firmy Sigma). Roztok s agarosou se zahřál, aby se agarosa rozpustila, potom byl zchlazen a bylo přidáno 18 ml formaldehydu. Jako vzorkový pufr byl použit 1 x MOPS (připravený ředěním 10 x MOPS s desetinásobkem vody). RNA byla po elektroforetickém rozdělení přenesena na membránu Hybond ™-N+ (výrobek firmy Amasham) v 10 X SSC.

Jako sondy byly užity DNA fragmenty a, b, c, d a e, získané štěpením vložené sekvence z pML48 pomocí restrikčních enzymů 1 a 2. Tyto sondy jsou znázorněny v následující tabulce 1. Lokalizace každé sondy v inzertu pML48 je ukázána na horním panelu obrázku 3.

• · • · · · · · · ♦ • · · ····· · • « · · · · «·· ·· ·· · *

Tabulka 1

Sondy pro hybridizaci Northem blotem

Sonda	Restrikční Enzym 1	Nukleotid č. v štěpném místě restrikčmho enzymu *	Restrikční Enzym 2	Nukleotid č. v štěpném místě restrikčmho enzymu*
A	EcoRI	6319 až 6324	EcoRI	15799 až 15804
b	BamHI	16793 až 16798	Pstl	18164 až 18169
c	KpnI	26025 až 26030	BamHI	27413 až 27418
d	Sáli	28691až 28696	Sáli	29551 až 29556
e	HindlII	33050 až 33055	Sací	34039 až 34044

— ^{1 1} '. V ¹ * Každý nukleotid je možné nalézt v SEKV. ID. C. 1 ze Seznamu sekvencí

Značení sond, jejich hybridizace a detekce signálu byly provedeny podle postupu popsaného pro hybridizaci metodou Southem blotu, tak jak to bylo popsáno v příkladu 5.

Výsledky dokumentující uvedený příklad jsou ukázány v dolním panelu na obrázku 3.

Každý vzniklý signál dokazuje existenci transkripčmho produktu homologního k nukleotidivé sekvenci každé sondy.

Výsledky dokazují, že strukturní geny, jejichž přítomnost ve vložené sekvenci pML48 byla předpovězena v předkládaném vynálezu, jmenovitě mlcA mlcB, mlcC mlcD, mlcE a mlcR se přepisují v Penicillium citrinum kmenu SANK13380.

Pozice každého signálu však neznázorňuje relativní velikost transkripčního produktu.

3) Určení sekvence 5'-konce pomocí 5'RACE cDNA obsahující 5'-koncovou oblast každého strukturního genu byla získána pomocí systému 5' RACE (Systém for Rapid Amplification of cDNA ends, Verze 2.0; vyrobeno firmou GIBCO).

Byly připraveny dva druhy antisense oligonucleotidových DNA. Návrh sekvencí byl založen na nukleotidové sekvenci, o které se předpokládalo, že se nachází v kódující oblasti blízko 5'41 ·· · ·· ·· ·· · 4 · · ··· · ·· · * · ······· * • · · · ·· ··· · · ·Ζ· ·· ·· ····* konce každého ze strukturních genů ve vložené sekvenci pML48, tak, jak to bylo predikováno ve výsledcích příkladu 7 a v odstavci 2) popisovaného příkladu.

Nukleotidová sekvence antisense oligonukleotidu DNA (1), navržená na základě nukleotidové sekvence 3'-konce každého strukturního genu, je ukázána v tabulce 2.

Nukleotidová sekvence antisense oligonukleotidu DNA (2), navržená na základě nukleotidové sekvence 5'- konce každého strukturního genu, je ukázána v tabulce 3.

Tabulka 2: Oligonukleotid DNA (1) použitý pro určení sekvence 5'-konce metodou 5'RACE

Gen	SEKV. ID. Č. podle Seznamu sekvencí	Nukleotidová Sekvence
mlcA	SEKV. ID. Č. 5	catgttcaatttgctctc
mlcB	SEKV. ID. Č. 6	ctggatcagacttttctgc
mlcC	SEKV. ID. Č. 7	gtcgcagtagcatgggcc
mlcD	SEKV. ID. Č. 8	gtcagagtgatgctcttctc
mlcE	SEKV. ID. Č. 9	gttgagaggattgtgagggc
mlcR	SEKV. ID. Č.10	ttgcttgtgttggattgtc

Tabulka 3: Oligonukleotid DNA (2) použitý pro určení sekvence 5'-konce metodou 5'RACE

Gen	SEKV. ID. Č. podle Seznamu sekvencí	Nukleotidová sekvence
mlcA	SEKV. ID. Č. 11	catggtactctcgcccgttc
mlcB	SEKV. ID. Č. 12	cccccagtacgtaagctc
mlcC	SEKV. ID. Č. 13	ccataatgagtgtgactgttc
mlcD	SEKV. ID. Č. 14	caacatctgcatccccgtc
mlcE	SEKV. ID. Č. 15	ggaaggcaaagaaagtgtac
mlcR	SEKV. ID. Č. 16	agattcattgctgttggcatc

První vlákno cDNA bylo syntetizováno podle nukleotidu DNA(l) jako primerů pomocí reversní transkripční reakce a celkové RNA z Penicillium citrinum kmene SANK13380 jako templátu. Jmenovitě, byla připravena 24 μΐ reakční směs obsahující jeden pg celkové RNA, 2,5 pmol oligonukleotidu DNA (1) a jeden μΐ reversní transkriptasy SUPER SCRIPTTMII (je součástí soupravy). Za účelem purifikace prvního vlákna cDNA byla tato reakční směs inkubována při 16 °C po dobu jedné hodiny a reakční produkt byl nanesen na GLASSMAX spin cartridge, která je taktéž součástí soupravy.

Pomocí terminální deoxyribonukleotidyltransferasy byl na 3'- konec cDNA přidán řetězec poly-C.

μΐ reakční směsi obsahující první řetězec cDNA, na jehož 3'-konec byl přidán póly C řetězec, bylo smícháno s 40 pmol oligonukleotidu DNA (2) a 40 pmol Abriged Anchor Primer (je součástí soupravy). Po té následovala inkubace při 94 °C dvě minuty. Inkubační cyklus skládající se z 30 s při 94 °C, 30 s při 55 °C a dvou minut při 72 °C se opakoval 35 krát. Nakonec následovala ještě pětiminutová inkubace při 72 °C a následně potom při 4 °C po dobu 18 hodin. Vzniklý produkt byl podroben elektroforéze na agarosovém gelu a DNA se vyizolovala z gelu. Výsledný produkt byl přečištěn pomocí fenol-chloroformové extrakce a ethanolového srážení. Následně byl klonován způsobem podobným způsobu popsanému v příkladu 4 do pCR 2.1.

Postup posaný výše je 5'-RACE.

Byla určena nukleotidová sekvence fragmentu cDNA obsahující 5'-konec a byla předpovězena pozice pro iniciační počátek transkripce a pro translační iniciační kodón.

Tabulka 4 ukazuje sekvenci, označenou podle Seznamu sekvencí SEKV. ID. Č., ve které nalezená nukleotidová sekvence 5'-konce cDNA fragmentu odpovídá sekvenci obsažené v každém ze strukturních genů. Sekvence 5'-konců byly získány popsaným postupem 5' RACE. Tabulka 5 ukazuje SEKV. ID. Č., ve které je pro každý strukturní gen vyznačena existence iniciačního bodu transkripce a iniciačního bodu translace.

Tabulka 4: SEKV. ID. Č., které znázorňují nukleotidové sekvence fragmentu 5'-konce cDNA

Gen	SEKV. ID. Č. podle Seznamu sekvencí
MlcA	SEKV. ID. Č. 17
mlcB	SEKV. ID. Č. 18
mlcC	SEKV. ID. Č. 19
mlcD	SEKV. ID. Č. 20
mlcE	SEKV. ID. Č. 21
mlcR	SEKV. ID. Č. 22

...

e » · · ·

Tabulka 5: Pozice transkripčního počátku a iniciačního translačního bodu pro každý gen

Gen Č.	SEKV. ID. Č. ve které se nachází iniciační kodón pro translaci	Nukleotidové číslo v SEKV. ID. Č. 1 nebo SEKV. ID. Č. 2
		Transkripční iniciační počátek	Translačm iniciační kodón
mlcA	SEKV. ID. Č. 2	22913	23045 až 23047
mlcB	SEKV. ID. Č. 2	11689	11748 až 11750
mlcC	SEKV. ID. Č. 1	11631	11796 až 11798
mlcD	SEKV. ID. Č. 1	24066	24321 až 24323
mlcE	SEKV. ID. Č. 2	3399	3545 až 3547
mlcR	SEKV. ID. Č. 2	365	400 až 402

* nukleotidové sekvence znázorněné v SEKV. ID. Č. 1 a 2 podle Seznamu sekvencí jsou vzájemně zcela komplementární.

4) Určení sekvence 3'-konce pomocí 3' RACE cDNA obsahující oblast 3'-konce každého strukturního genu získaná pomocí Ready To Go: T-Primed First-Strand kit (výrobek firmy Pharmacia).

Takto byl připraven predikcí na základě výsledků získaných postupem popsaným v příkladu 7 a odstavci 2) tohoto příkladu jeden druh sense oligonukleotidu DNA (3), o kterém se předpokládá, že se nachází v kódující oblasti a v blízkosti 3'- konce v každém strukturním genu nacházejícím se ve vložené sekvenci v pML48.

Nukleotidová sekvence oligonukleotidu DNA (3) určená pro každý strukturní gen je ukázána v tabulce 6.

• · · · · ·· ·· ··

Tabulka 6: Oligonukleotid DNA (3) upoužitý k určení sekvence 3'- konce podle 3' RACE

Gen	SEKV. ID. Č. Sekvence podle Seznamu sekvencí	Nukleotidová sekvence
mlcA	SEKV. ID. Č. 23	atcataccatcttcaacaac
mlcB	SEKV. ID. Č. 24	gctagaataggttacaagcc
mlcC	SEKV. ID. Č. 25	acattgccaggcacccagac
mlcD	SEKV. ID. Č. 26	caacgcccaagctgccaatc
mlcE	SEKV. ID. Č. 27	gtcttttcctactatctacc
mlcR	SEKV. ID. Č. 28	ctttcccagctgctactatc

První vlákno cDNA bylo syntetizováno pomocí reversní transkripční reakce za užití NotI-d(T)18 jako primeru (je součástí kitu) a celkové RNA z Penicillium citrinum kmene SANK13380 (jeden pg) jako templátu.

100 μΐ reakční směsi obsahující primární vlákno cDNA, 40 pmol oligonukleotidu DNA (3) a Notl-d(T) 18 primer (který je součástí kitu) bylo inkubováno při 94 °C po dobu dvou minut. Reakce se skládala z opakování 35 cyklů skládajících se z inkubace 30 s při 94 °C, 30 s při 55 °C a dvou minut při 72 °C. Následovala inkubace při 72 °C po dobu 5 minut a při 4 °C po dobu 18 hodin. Výsledný produkt byl podroben elektroforetickému rozdělení na agarosovém gelu a potom byla z gelu vyizolována DNA. Product se purifikoval pomocí fenol — chloroformové extrakce a ethanolového srážení. Potom byl přečištěný produkt klonován za užití podobného způsobu, jako byl postup popsaný v příkladu 4 do pCR 2.1.

Výše popsaný postup je 3'-RACE.

Byla určena nukleotidová sekvence cDNA na 3'- konci a byla předpovězena pozice pro terminační kodón translace.

Tabulka 7 vyznačuje SEKV. ID. Č. podle Seznamu sekvencí, ve které nukleotidová sekvence 3'-konce cDNA fragmentu odpovídá každému z popsaných strukturních genů. Sekvence byly získány postupem 3' RACE. Tabulka 8 ukazuje terminační kodón translace a jeho pozici v sekvencích SEKV. ID. Č. 1 a 2 podle Seznamu sekvencí.

Tabulka 7: SEKV. ID. Č., ve které se nachází nukleotidová sekvence 3'-konce cDNA fragmentu.

Gen	SEKV. ID. Č. v Seznamu sekvencí
mlcA	SEKV. ID. Č. 29
mlcB	SEKV. ID. Č. 30
mlcC	SEKV. ID. Č. 31
mlcD	SEKV. ID. Č. 32
mlcE	SEKV. ID. Č. 33
mlcR	SEKV. ID. Č. 34

Tabulka 8: Terminační kodón translace a jeho pozice v každém ze strukturních genů

Gen	Terminační kodón translace	SEKV. ID. Č., ve které se terminační kodón translace nachází	Čísla nukleotidů pro terminační kodón translace v SEKV. ID. Č. 1 nebo SEKV. ID. Č. 2
mlcA	tag	SEKV. ID. Č. 2	32723 až 32725
mlcB	taa	SEKV. ID. Č. 2	19840 až 19842
mlcC	taa	SEKV. ID. Č. 1	13479 až 13481
mlcD	tga	SEKV. ID. Č. 1	27890 až 27892
mlcE	tga	SEKV. ID. Č. 2	5730 až 5732
mlcR	tag	SEKV. ID. Č. 2	1915 až 1917

* nukleotidové sekvence uvedené v SEKV. ID. Č.l a 2 podle Seznamu sekvencí jsou vzájemně zcela komplementární.

Tabulka 9 ukazuje C-koncové aminokyselinové zbytky z polypeptidu, o kterém se soudí, že je kodóván nukleotidovou sekvencí každého strukturního genu, nukleotidovou sekvenci trinukleotidů kódujících aminokyselinové zbytky a pozicí trinukleotidů.

Tabulka 9: C-koncový aminokyselinový zbytek polypetidu kódovaného každým ze strukturních genů

Gen	C-koncový aminokyselino vý zbytek	Nukleotidová sekvence trinukleotidu kódují cícho aminokyselinu	SEKV ID Č, ve které se trinukleotid vyskytuje	Nukleotidové číslo trinukleotidu v SEKV. ID. Č. 1 nebo 2
MlcA	alanin	gcc	SEKV. ID. Č.2	32720 až 32722
MlcB	serin	agt	SEKV. ID. Č.2	19837 až 19839
MlcC	cystein	tgc	SEKV. ID. Č.l	13476 až 13478
MlcD	arginin	cgc	SEKV. ID. Č.l	27887 až 27889
MlcE	alanin	gct	SEKV. ID. Č.2	5727 až 5729
MlcR	alanin	gct	SEKV. ID. Č.2	1912 až 1914
* nukleotidové sekvence uvedené v SEKV.	D. Č.l a 2 podle Seznamu sekvencí jsou

vzájemně zcela komplementární.

Tabulka 10 shrnuje sekvence komplementární k sekvencím pro terminační translační kodón uvdené v Tabulce 8, SEKV. ID. Č., ve kterých se komplementární sekvence vyskytuje a pozici komplementární sekvence.

Tabulka 10: Sekvence komplementární k sekvenci terminačmho kodónu translace pro každý strukturní gen

Gen	Sekvence komplementární k sekvenci terminačmho kodónu translace	SEKV. ID. Č. kde se komplementární sekvence vyskytují	Nukleotidové číslo komplementární sekvence v SEKV. ID. Č. 1 nebo SEKV. ID. Č.2
MlcA	cta	SEKV. ID. Č.l	1479 až 1481
MlcB	tta	SEKV. ID. Č.l	14362 až 14364
MlcC	tta	SEKV. ID. Č.2	20723 až 20725
MlcD	tca	SEKV. ID. Č.2	6312 až 6314
MlcE	tca	SEKV. ID. Č.l	28472 až 28474
MlcR	cta	SEKV. ID. Č.l	32287 až 32289

• · · ·· · ··· ♦ «··· ···♦··· ·· · ····»· · · • · · · · · ·* · · _f ' · · · ·· ·· ··* · · * nukleotidové sekvence uvedené v SEKV. ID. Č.l a 2 podle Seznamu sekvencí jsou vzájemně zcela komplementární.

Jak bylo popsáno výše, byla určena pozice každého strukturního genu a jeho směr. Na základě výše zmíněných informací mohou být získány transkripčm a translačm produkty každého strukturního genu.

Příklad 9: Získání cDNA odpovídající strukturnímu genu mlcE

1) Příprava celkové RNA

Celková RNA z Penicillium citrinum byla připravena podle způsobu popsaného v přikladu 8.

2) Návrh primeru

Za účelem získám cDNA úplné délky odpovídající strukturnímu genu mlcE určenému v příkladu 8, byly navrženy a syntetizovány následující primery: sense primer 5'-gttaacatgtcagaacctctaccccc-3' (Viz SEKV. ID. Č. 35 ze Seznamu sekvencí); a antisense primer 5'-aatatttcaagcatcagtctcaggcac-3': (Viz SEKV. ID. Č. 36 ze Seznamu sekvencí).

Primery jsou odvozeny ze sekvence 5'-konce upstream oblasti strukturního genu mlcE a ze sekvence 3'-konce downstream oblasti téhož genu. Syntéza primerů byla učiněna pomocí fosfoamiditové metody.

3) RT-PCR

Za účelem získání cDNA úplné délky kódující genový produkt mlcE byla použita souprava vyrobená firmou Takara RNA LA PCR kit (AMV) Ver. 1,1.

V reakci bylo použito 20 μΐ následující reakční směsi o složení: jeden pg celkové RNA, 2,5 pmol Random 9 mers primeru (součástí soupravy) a jeden μΐ reversního transkripčního enzymu (enzym je součástí soupravy). Reakční směs se nechala inkubovat při 42 °C po dobu 30 minut, tak se připravilo primární vlákno cDNA. Aktivita reversního transkripčního enzymu byla zastavena zahříváním směsi při 99 °C po dobu pěti minut.

100 μΐ druhé rekční směsi obsahující celkové množství první reakční směsi s primárním vláknem cDNA (viz výše), 40 pmol sense primeru a 40 pmol antisense primeru se nechalo inkubovat při 94 °C po dobu dvou minut. Inkubační cyklus se skládal z 30 opakování cyklů : 30 s při 94 °C, 30 s při 60 °C a dvě minuty při 72 °C, následovala inkubace při 72 °C po dobu pěti minut a při 4 °C po dobu 18 hodin. Výsledný produkt byl podroben elektroforetickému dělení na agarosovém gelu, ze kterého byl také získán výsledný produkt.

Produkt byl přečištěn fenol - chloroformovou extrakcí a ethanolovým srážením. Potom byl použit k transformaci kompetentních buněk Escherichia coli kmene JMI 09 (výrobek firmy Takara Shuzo Co., Ltd., Japonsko). Transformace byla provedena obdobným způsobem, jaký byl popsán v příkladu 4 za užití pCR 2.1. Z transformovaných buněk Escherichia coli byl vybrán kmen buněk nesoucí plazmid, který obsahoval požadovaný DNA fragment Plazmid obsažený a nesený tímto kmenem buněk byl nazván pCRexpE.

Byla určena nukleotidová sekvence vložené DNA výsledného rekombinantního DNA vektoru pCRexpE. Vložená DNA obsahuje cDNA úplné délky odpovídající strukturnímu genu mlcE. Nukleotidová sekvence této DNA a aminokyselinová sekvence peptidu, která byla odvozena na jejím základě, jsou uvedeny v SEKV. ID. Č. 37 a/nebo v SEKV. ID. Č. 38 podle Seznamu sekvencí.

Nejblíže známá sekvence odpovídající svým složením genu mlc E (polypeptidu) byla nalezena v ORF 10 na genu ze seskupení genů souvisejících s biosyntézou lovastatinu. Nalezená identita byla 70 %.

Příklad 10: Konstrukce expresního vektoru pSAK 700 cDNA expresní vektor pSAK700 byl konstruován pomocí užití vektorů pSAK333 a pSAK360 popsaných v příkladu 1.

pSAK333 byl štěpen dvěma restrikčními enzymy BamH I a Hind ΙΠ (vyrobeny firmou Takara Shuzo Co., Ltd., Japonsko) a po té byla provedena elektroforéza na agarosovém gelu. Z gelu byl vyříznut fragment o velikosti 4,1 kb a po té byl konec DNA fragmentu zatupen pomocí působení T4-DNA polymerasy (výrobek firmy Takara Shuzo Co., Ltd., Japonsko).

K oběma výše zmíněným fragmentům byl pomocí soupravy DNA ligation kit Ver.2 (výrobek firmy Takara Shuzo Co., Ltd., Japonsko) připojen adaptér EcoRI-Notl-BamHI adapter (výrobek firmy Takara Shuzo Co., Ltd., Japonsko). Kompetentní buňka Escherichia coli kmene JMI09 (výrobek firmy Takara Shuzo Co., Ltd., Japonsko) byla natransformována ligovanou DNA. Kmen nesoucí plazmid, který měl adaptér, byl izolován z transformovaných buněk Escherichia coli a plazmid obsažený v tomto kmenu byl označen jako pSAK410.

pSAK360 byl naštěpen dvěma restrikčními enzymy Pvu II a Ssp I a po té byla restrikční směs podrobena elektroforetickému dělení na agarosovém gelu. Z gelu byl izolován DNA fragment (velikost okolo 2,8 kb) obsahující promotor a terminátor 3-fofoglycerátkinasy (dále nazývaný jako „pgk“) gen a HPT mající svůj původ v Escherichia coli.

Oba výše zmíněné DNA fragmenty byly vloženy pomocí restrikčního místa Pvu II do • » * ·· ·· ·♦ · • · · I · · · · ·· · • · « ····· ··· • · · · · ·· ··· ·· ··· ······· v· «·· ♦· ♦· ···>· plazmidu pSAK410 užitím soupravy pro ligaci DNA ligation kit Ver.2 (výrobek firmy Takara

Shuzo Co., Ltd., Japonsko). Escherichia coli kompetentní buňka kmene JMI09 (výrobek firmy Takara Shuzo Co., Ltd., Japonsko) byla natransformována ligovanou DNA. Kmen nesoucí plazmid, který obsahoval DNA fragment byl izolován z transformovaných buněk

Escherichia coli a plazmid obsažený v tomto kmenu byl označen jako pSAK700.

Konstrukce pSAK700 je ukázána na obrázku 4.

pSAK 700 obsahuje po jednom restrikčním místě pro všechny následující restrikční enzymy: BamHI a Notl. pSAK700 obsahuje dále gen resistence k ampicilinu (dále označovaný jako „Amp^r“) a gen resistence k hygromycinu HTP jako selekční markéry.

V následujících příkladech, je-li Escherichia coli užita jako hostitelský organismus, výběr buněk transformovaných plazmidy pSAK700 nebo pSAK700 obsahujícími inzerty cizorodé DNA se provádí za přidání 40 pg/ml ampicilinu do daného užitého media.

Je-li jako hostitelský organismus užit Penicillium citrinum SANK13380, selekce buněk transformovaných pSAK700 nebo pSAK700 obsahující inzert cizorodé DNA byla provedena přidáním 200 pg/ml hygromycinu k danému mediu.

Příklad 11: Konstrukce cDNA expresního vektoru pSAKexpE

Rekombinantní DNA vektor pCRexpE získaný v příkladu 9 byl štěpen při 37 °C po dobu 2 hodin restrikčními enzymy Hpal a SspI (výrobky firmy Takara Shuzo Co., Ltd., Japonsko) a výsledná restrikční směs se podrobila elektroforetickému dělem na agarosovém gelu. Z gelu byl získán proužek mající velikost kolem l,7kb, odpovídající cDNA úplné délky pro mlcE.

Plazmid pSAK700 se nechal reagovat po dobu jedné hodiny při 37 °C s restrikčním enzymem Notl (výrobek firmy Takara Shuzo Co., Ltd., Japonsko) a konec naštěpeného vektoru se nechal zatupit pomocí užití T4 DNA polymerasy (Takara Shuzo Co., Ltd., Japonsko) při 37 °C po dobu 5 minut. Po té se vektor podrobil fenol-chloroformové extrakci a ethanolovému srážení. Vysrážená DNA se rozpustila v malém množství TE pufru. Do této reakční směsi se přidala alkalická fosfatasa a směs se nechala inkubovat při 65 °C po dobu 30 minut. pSAK700, připravený postupem popsaným výše, byl ligován s DNA fragmentem o velikosti 1,7 kb získaným v kroku 1), a to za užití soupravy DNA ligation kit Ver.2 (výrobek firmy Takara Shuzo Co., Ltd., Japonsko). Kompetentní buňky Escherichia coli kmene JMI09 se transformovaly za užití výše zmíněné ligované DNA. Byl získán kmen Escherichia coli transformovaný cDNA expresním vektorem.

·· « · · ·· ·· « * · 4 · · · · · ·

Transformované buňky Escherichia coli, označené jako Escherichia coli pSAKexpE SANK 72499, získané v tomto popisovaném příkladu, byly uloženy 25.ledna 2000 v Research Institute of Life Science and Technology of the Agency of Industrial Science and Technology pod přístupovým číslem FERM BP-7005 v souladu s Budapešťskou smlouvou o ukládání mikroorganismů.

Příklad 12: Získání cDNA odpovídající strukturnímu genu mlcR

1) Příprava celkové RNA

Celková RNA z Penicillium citrinum byla připravena podle postupu popsaného v příkladu 8.

2) Návrh primerů

Za účelem získání cDNA úplné délky odpovídající strukturnímu genu mlcR určenému v příkladu 8, byly navrženy a syntetizovány následující primery: sense primer : 5'-ggatccatgtccctgccgcatgcaacgattc-3': (Viz SEKV. ID. Č. 39 v Seznamu sekvencí); a antisense primer 5'-ggatccctaagcaatattgtgtttcttcgc-3': (Viz SEKV. ID. Č. 40 v Seznamu Sekvencí).

Primery byly navrženy pomocí sekvence 5'-konce upstream oblasti strukturního genu tmZcR a dále pomocí sekvence 3'-konce downstream oblasti téhož genu. Syntéza byla provedena pomocí fosfoamiditové metody.

3) RT-PCR

Za účelem získání cDNA úplné délky genu kódujícího produkt mlcR, byla použita souprava Takara RNA LA PCR kit (AMV) Ver. 1,1.

Jmenovitě, 20 μΐ reakční směsi obsahující jeden μg celkové RNA, 2,5 pmol Random mers primer (je součástí soupravy) a jeden μΐ reversního transkripčmho enzymu (je součástí soupravy) se nechalo inkubovat při 42 °C po dobu 30 minut. Tak bylo připraveno primární vlákno cDNA. Reversní transkripčm enzym byl potom deaktivován zahřátím na 99 °C po dobu pěti minut.

100 μΐ druhé reakční směsi obsahující celkové množství reakční směsi s primárním vláknem cDNA (viz výše), 40 pmol sense primeru a 40 pmol antisense primeru bylo inkubováno při 94 °C po dobu dvou minut. Dále následovalo třicet opakování inkubačmho cyklu skládajícího se z 30 s při 94 °C, 30 s při 60 °C a dvou minut při 72 °C. Po té

následovaly další inkubační kroky při 72 °C po dobu pěti minut a při 4 °C po dobu 18 hodin. Výsledný produkt byl podroben elektroforetickému dělem na agarosovém gelu a DNA byla extrahována z gelu. Product byl purifikován pomocí fenol - chloroformové extrakce a ethanolového srážení. Potom byl užit k transformaci kompetentních buněk Escherichia coli kmenu JMI 09 (výrobek firmy Takara Shuzo Co., Ltd., Japonsko). Transformace byla provedena postupem podobným postupu popsanému v příkladu 4 za užití pCR2.1.

Z transformovaných buněk Escherichia coli, byl vybrán kmen nesoucí plazmid obsahující DNA fragment a tento kmen byl označen jako pCRexpR.

Byla určena nukleotidová sekvence vložené DNA vzniklého rekombinantního DNA vektoru pCRexpR. Vložená DNA obsahuje cDNA úplné délky odpovídající strukturnímu genu mlcR. Nukleotidová sekvence tohoto inzertu a aminokyselinová sekvence peptidu od této sekvence odvozená, jsou uvedeny v SEKV. ID. Č. 41 a/nebo SEKV. ID. Č. 42 podle Seznamu sekvencí.

Sekvence odpovídající nejvyšší identitou nalezené sekvenci genu mlcR (peptidu) je známá sekvence pro lovE nalézající se ve skupině genů souvisejících s biosyntézou lovastatinu, kdy identita dosahuje 34 %.

Příklad 13: Konstrukce cDNA expresního vektoru pSAKexpR

Rekombinantm DNA vektor pCRexpR získaný v příkladu 12 se nechal reagovat při 37 °C po dobu 2 hodin s restrikčním enzymem BamHI (výrobek firmy Takara Shuzo Co., Ltd., Japonsko) a reakční produkt byl podroben elektroforetickému dělení na agarosovém gelu. Z gelu byl vyříznut proužek odpovídající velikostí úplné cDNA pro mlcR (okolo 1,4 kb).

Po reakci pSAK700 s restrikčním enzymem BamHI (výrobek firmy Takara Shuzo Co., Ltd., Japonsko) při 37 °C po dobu jedné hodiny, byla do reakční směsi přidána alkalická fosfatasa (výrobek firmy Takara Shuzo Co., Ltd., Japonsko) a směs se nechala reagovat při 65 °C po dobu 30 minut. pSAK700 naštěpený BamHI, tak jak bylo popsáno výše, byl ligován s 1,4 kb fragmentem DNA získaným v kroku 1) pomocí soupravy DNA ligation kit Ver.2 (výrobek firmy Takara Shuzo Co., Ltd., Japonsko). Kompetentní buňky Escherichia coli kmene JMI09 se transformovaly ligační směsí obsahující danou DNA. Byl získán kmen Escherichia coli transformovaný cDNA z expresního vektoru.

Transformované buňky Escherichia coli, označené jako Escherichia coli pSAKexpR SANK 72599, získané v tomto popisovaném příkladu, byly uloženy 25.ledna 2000 v Research

Institute of Life Science and Technology of the Agency of Industrial Science and Technology pod přístupovým číslem FERM BP-7006 v souladu s Budapešťskou smlouvou o ukládání mikroorganismů.

Příklad 14: Transformace mikroorganismů produkujících ML-236B

1) Příprava protoplastů

Spory Penicillium citrinum kmene SANK 13380 z kultury uchovávané na šikmém agarovém mediu byly inokulovány na PGA agarové medium a potom inkubovány při °C po dobu 14 dnů. Spory Penicillium citrinum kmene SANK 13380 se potom vyizolovaly z kultury a následně bylo 1 x 10⁸ spor inokulováno do 80 ml of YPL-20 kultivačního media a inokulované medium bylo inkubováno při 26 °C po dobu jednoho dne. Po potvrzení klíčem spor pozorováním pod mikroskopem, se klíčící spory centrifugovaly při pokojové teplotě při 5000 x G po dobu deseti minut a tak byly odděleny od media ve formě precipitátu.

Spory se promyly třikrát sterilizovanou vodou a začala příprava protoplastů. V prvním kroku bylo rozpuštěno 200 mg zymolyasy 20 T (výrobek firmy Seikagaku Kogyo) a 100 mg chitinasy (výrobek firmy Sigma) v 10 ml roztoku 0,55 M chloridu hořečnatého. Po té se roztok centrifugoval při pokojové teplotě při 5000 x G po dobu 10 minut. Výsledný supematant byl používán jako enzymový roztok. 20 ml enzymového roztoku a 0,5 g (mokrá váha) klíčících spor bylo vloženo do 100 ml konické láhhe a bylo za mírného třepání inkubováno při 30 °C po dobu 60 minut. Potom se pomocí sledování mikroskopem zjišťovalo, zda se z klíčících spor staly protoplasty. Reakční roztok se filtroval přes 3G-2 skleněný filtr (výrobek firmy HARIO). Filtrát se centrifugoval při pokojové teplotě při 1000 x G po dobu 10 minut, čímž se protoplasty získaly jako precipitát.

2) Transformace

Protoplasty získané v kroku 1) se dvakrát promyly 30 ml roztoku 0,55 M chloridu hořečnatého a jednou 30 ml roztoku obsahujícího 0,55 M chlorid hořečnatý, 50 mM chlorid vápenatý a 10 mM 3-morfolinopropansulfonát (pH 6,3 nebo nižší, dále v textuje tento roztok označován jako MCM roztok). Protoplasty byly potom resuspendovány ve 100 μΐ roztoku obsahujícího 4 % hmotn. polyethylenglykol 8000,10 mM 3-morfolinopropansulfonát, 0,0025% hmotn. heparin (výrobek firmy Sigma), 50 mM chlorid hořečnatý (pH 6,3 nebo nižší, v dalšímm textuje tento roztok označován jako „transformační roztok“).

Bylo smícháno 96 μΐ transformačního roztoku obsahujícího okolo 5 x 10⁷ protoplastů ·· · · 4 ·· ·· · • 444 4444444 ·» · 4 · 4 4 4 444 • a a 4444 44a « · 4 4-4 44 «4 44444 a 10 μΐ TE obsahujícího 120 pg plazmidu pSAKexpE nebo pSAKexpR. Reakční směs se promíchala a následně se nechala stát v ledu po dobu 30 minut. Potom bylo do směsi přidáno 1.2 ml roztoku 20 % hmota, polyetylenglykolu, 50 mM roztok chloridu hořečnatého, 10 mM roztok 3-morfolinopropansulfonátu (pH 6,3). Kapalina se jemně přidávala pipetováním a po té se nechala směs stát při pokojové teplotě po dobu 20 minut. K reakční směsi se potom přidalo 10 ml roztoku MCM a směs se nechala jemně míchat. Potom se protoplasty oddělily centriíugací při pokojové teplotě při 1000 x G po dobu 10 minut. Transformované protoplasty se po centrifugaci získaly ve formě precipitátu.

3) Regenerace buněčné stěny u transformovaných protoplastů

Transformované protoplasty získané v kroku 2) byly resuspendovány v 5 ml tekutého VGS agarového media pro střední vrstvu a touto směsí byla převrstvena vrstva 10 ml tuhého VGS spodního agarového media nalitého na plotně. Plotna se nechala inkubovat při 26 °C po dobu jednoho dne, po této inkubaci se nalitá plotna s oběma medii převrstvila 10 ml tekutého VGS horního agarového media obsahujícího 5 mg hygromycinu B na plotnu (konečná koncentrace hygromycinu je 200 pg/ml). Po inkubaci při 26 °C po dobu 14 dnů, byly oba kmeny (to znamená, ty kmeny, které byly odvozeny od protoplastů transformovaných pSAKexpE nebo pSAKexpR ) subklonovány na PGA agarové medium obsahující 200 pg/ml hygromycinu B a dále dále subklonovány na připravené šikmé PGA agarové medium, kde se nechaly inkubovat při 26 °C po dobu 14 dnů.

Kultury zálohované na šikmém agarovém mediu se uchovávaly při 4 °C.

Testovací příklad 1: Srovnání schopnosti bosyntézy ML-236B v transformovaných a původních kmenech

Transformované kmeny získané podle postupu popsaného v příkladu 14 a Penicillium citrinum kmen SANK 13380 byly kultivovány a v každé kultuře bylo měřeno množství vzniklého ML-236B.

Inokulum spor o velikosti 5 mm čtverečních se odebralo ze zásobních šikmých agarových kultur obsahujících transformované kmeny a nechalo se kultivovat postupem popsaným v příkladu 14. Stejným způsobem popsaným v příkladu 2 se připravila kultura obsahující Penicillium citrinum kmen SANK 13380. Buňky byly poté inokulovány do 10 ml MBG3-8 media nalitého do 100 ml konických lahví, kde se nechaly inkubovat při 24 °C po dobu dvou dnů, po té následovalo přidání 3,5 ml roztoku 50 % hmota, glycerinu. Následovala kultivace probíhající ještě po dobu 10 dnů při 24 °C za třepám.

K 10 ml kultury se přidá 50 ml 0.2 N hydroxidu sodného, potom pokračuje inkubace při 26 °C jednu hodinu za třepání. Kultura se centrifuguje při pokojové teplotě a při 3000 x G po dobu dvou minut. Oddělí se jeden mililitr supematantu, smíchá se s 9 ml 75 % methanolu a vzniklý vzorek se podrobí dělení na HPLC.

Jako sloupec pro HPLC se používá SSC-ODS-262 (mající průměr 6 mm, délku 100 mm, vyrobené firmou Senshu Kagaku Co.Ltd.). Složení mobilní fáze je následující: 75 % obj. methanol - 0,1 % obj. trietylamin - 0,1 % obj. kyselina octová. Eluce se provádí za pokojové teploty a průtokové rychlosti 2 ml/minutu. Za těchto podmínek se ML-236B eluoval za 4 minuty po nanesení na sloupec. Detekce se prováděla pomocí UV detektoru při absorpční vlnové délce 236 nm.

Schopnost biosyntézy ML-236B byla zvýšena ve třech kmenech z osmi kmenů transformovaných pSAKexpE. Schopnost biosyntézy ML-236B těchto kmenů byla ve srovnání s původním kmenem v průměru o 10 % vyšší. Schopnost biosyntézy ML-236B těchto tří kmenů zůstala stabilně zachována také po jejich subklonování do subkultur, také po jejich převedení na monospóry a po dalších podobných postupech. Výsledky potvrdily, že inzert v plazmidu pSAKexpE obsahuje cDNA urychlující biosyntézu ML-236B.

Schopnost bisyntézy ML-236B byla zvýšena v pěti kmenech mezi kmeny transformovanými pSAKexpR. Schopnost biosyntézy ML-236B byla u těchto kmenů ve srovnání s kmenem původním přibližně o 15 % vyšší. Schopnost biosyntézy ML-236B u těchto pěti kmenů zůstala stabilně zachována také po převedení na monospóry a po dalších podobných postupech. Výsledky potvrdily, že inzert v plazmidu pSAKexpR obsahuje cDNA urychlující biosyntézu ML-236B.

Z výše uvedených výsledků vyplývá, že cDNA získaná z mikroorganismů produkujících ML-236B podle postupu popsaných v předkládaném vynálezu urychluje po svém vnesení do mikroorganismů produkujících ML-236B biosyntézu ML-236B .

Příklad 15: Určení sekvence cDNA odpovídajících strukturním genům mlc A-D.

Byla určena sekvence cDNA odpovídajících strukturnímu genu mlc mlc A.

Primární vlákno cDNA bylo syntetizováno pomocí soupravy TAKARA LA PCR kit verl,l (Takara Shuzo Co., Ltd.). K amplifikaci cDNA úplné délky, či částečných délek, bylo provedeno několik PCR reakcí.Primámí vlákno cDNA bylo použito jako templát a několik oddělených párů oligonukleotidů jako primery.

• · · · · · · · ·· · ····· ··

K určení sekvencí byl použit následující cyklus - 30 opakování následujících inkubací 30 s při 94 °C, 30 s při 60 °C a pět minut při 72 °C . Sekvenační souprava Big Dye Primer/Terminator Cycle Sequencing Kit a sekvenátor ABI Prism 377 byly použity pro vlastní určení sekvencí (PE Applied Biosystems).

Produkt každé reakce byl po té jednotlivě vložen do plazmidu pCR 2.1.

Od každého rekombinantního plazmidu byly získány transformanty Escherichia coli.

Pro každý inzert v získaných rekombinantních plazmidech byly určeny nukleotidové sekvence.

Na základě srovnání mezi několika nukleotidovými sekvencemi výše zmíněných RTPCR produktů byly určeny sekvence exonů a intronů a z nich potom odvozen strukturní gen mlc A.

Poté byla určena sekvence cDNA odpovídajícíc strukturnímu genu mlc A, která je uvedena v Seznamu sekvencí jako SEKV. ID. Č. 43. Také byla odvozena aminokyselinová sekvence polypeptidu kódovaného výše zmíněnou cDNA (SEKV. ID. Č. 44) a dále také na základě výzkumu homologií, založeného na porovnám aminokyselinových sekvencí, byla odvozena předpokládaná funkce tohoto polypeptidu.

Nejblížší známá homologm sekvence pro mlc A (polypeptid) byla LNKS(ZovB) ve skupině genů souvisejících s biosyntézou lovastatinu, kdy identita dosahovala 60 %.

Podobným způsobem byla odvozena sekvence cDNA odpovídající strukturnímu genu mlc B, která byla označena v Seznamu sekvncí jakoSEKV. ID. Č. 45. Byla odvozena odpovídající aminokyselinová sekvence polypeptidu kódovaného výše zmíněnou cDNA a označena v seznamu sekvencí jako SEKV. ID. C. 46 a byla také odvozena funkce daného polypeptidu, a to na základě výzkumu homologie aminokyselinových sekvencí.

Nejblížší známá homologm sekvence pro mlc B (polypeptid) byla LNKS(ZovF) ve skupině genů souvisejících s biosyntézou lovastatinu, kdy identita dosahovala 61 %.

Podobným způsobem byla odvozena sekvence cDNA odpovídající strukturnímu genu mlc C, která byla označena v Seznamu sekvncí jakoSEKV. ID. Č. 47. Byla odvozena odpovídající aminokyselinová sekvence polypeptidu kódovaného výše zmíněnou cDNA a označena v seznamu sekvencí jako SEKV. ID. Č. 48 a byla také odvozena funkce daného polypeptidu, a to na základě výzkumu homologie aminokyselinových sekvencí.

Nejblížší známá homologní sekvence pro mlc C (polypeptid) byla LNKS(ZovA) ve skupině genů souvisejících s biosyntézou lovastatinu, kdy identita dosahovala 72 %.

Dále byla podobným způsobem odvozena i sekvence cDNA odpovídající strukturnímu genu mlc D, která byla označena v Seznamu sekvncí jako SEKV. ID. Č. 49. Byla odvozena

odpovídající aminokyselinová sekvence polypeptidu kódovaného výše zmíněnou cDNA a označena v seznamu sekvencí jako SEKV. ID. Č. 50 a byla také odvozena funkce daného polypeptidu, a to na základě výzkumu homologie aminokyselinových sekvencí.

Nejblížší známá homologm sekvence pro mlc D (polypeptid) byl ORF8 ve skupině genů souvisejících s biosyntézou lovastatinu, kdy identita dosahovala 63 %.

Byly určeny následující pozice pro exony každého strukturního genu v sekvencích označených v Seznamu sekvencí jako SEKV. ID. Č. 1 nebo SEKV. ID. Č. 2:

Tabulka 11: Pozice exonů v mlcA-D v inzertech pML48

	SEKV ID kde se exon vyskytuje	Exon Číslo	Nukleotidové číslo v SEKV. ID. Č. 1 nebo SEKV. ID. Č. 2
MlcK	2	1	22913	až	22945
2	23003	až	23846
3	23634	až	23846
4	23918	až	24143
5	24221	až	24562
6	24627	až	27420
7	27479	až	27699
8	27761	až	30041
9	30112	až	30454
10	30514	až	30916
11	30972	až	32910
MlcB	2	1	11689	až	12002
2	12106	až	12192
3	12247	až	12304
4	12359	až	12692
5	12761	v az	13271
6	13330	až	13918
7	13995	až	20052
MlcC	1	1	11631	až	12140
2	12207	až	12378
3	12442	až	13606
MlcO	1	1	24066	až	24185
2	24270	až	27463
3	27514	až	28130

Byly určeny následující pozice pro terminátory transkripce každého strukturního genu v sekvencích označených v Seznamu sekvencí jako SEKV. ID. Č. 1 nebo SEKV. ID. Č. 2:

···· ··· ··· • · · ····<· · ·

Tabulka 12: Pozice terminátorů transkripce u strukturních genů mlc A-E a R v inzertech pML48

Gen	SEKV. ID. Č. kde se nachází terminační místo pro translaci	Nukleotidové číslo transkripčního terminačního místa v SEKV. ID. Č. 1 nebo SEKV. ID. Č. 2
mlcA	SEKV. ID. Č. 2	32910
mlcB	SEKV. ID. Č. 2	20052
mlcC	SEKV. ID. Č. 1	13606
mlcD	SEKV. ID. Č. 1	28130
mlcE	SEKV. ID. Č. 2	5814
mlcR	SEKV. ID. Č. 2	1918

Příklad 16: Studie poškození genu

Strukturní geny mlc A, B nebo D z P. citrinum byly pozměněny pomocí místně směrované mutagenizace za užití postupu homologní rekombinace.

Rekombinantní plazmid pro získám pozměněné mutanty strukturního genu mlcA z P. citrinum byl konstruován pomocí plazmidu pSAK333.

Byl získán interní fragment 4,1-kb Kpn\ z lokusu pro mlcA na plazmidovém inzertu z pML48. Tento fragment byl purifikován, jeho konce zatupeny pomocí soupravy DNA Blunting Kit (Takara Shuzo Co., Ltd.) a tento fragment byl ligován do plazmidu pSAK333 štěpeného PuuTÍ. Výsledný plazmid byl označen jako pdismlcA.

P. citrinum kmen SANK13380 byl transformován pomocí pdis/wZc^.

Hybridizace genomové DNA z pdiswZc^ transformantu postupem Southem blotu byla použita k potvrzení změny ve strukturním genu mlcA..

Výsledný mutant mlc A- neprodukoval ani ML-236B ani jeho prekursory. Rekombinantní plazmid pro získání pozměněné mutanty strukturního genu tmZcB z P. citrinum byl konstruován pomocí plazmidu pSAK333.

Byl získán interní fragment 1,4-kb Psi- BamHI z lokusu pro mlc B na plazmidovém inzertu z pML48. Tento fragment byl purifikován, jeho konce zatupeny pomocí soupravy DNA Blunting Kit (Takara Shuzo Co., Ltd.) a tento fragment byl ligován do plazmidu pSAK333 štěpeného PuuQ.. Výsledný plazmid byl označen jako pdismlcB.

P. citrinum kmen SANK13380 byl transformován pomocí pdismlcB.

Hybridizace genomové DNA z pdismZcB transformantu postupem Southem blotu byla použita k potvrzení změny ve strukturním genu mlcB.

···· · · · ··· ·· · ····· ··

Výsledný mutant mlcB- neprodukoval ML-236B, ale ML-236A, což je prekursor ML236B.

Rekombinantní plazmid pro získání pozměněné mutanty strukturního genu mlčD z P. citrinum byl konstruován pomocí plazmidu pSAK333.

Byl získán fragment o velikosti 1,4-kb Kpn\ -ΒαηϊΆ z lokusu pro mlc\J na plazmidovém inzertu z pML48. Tento fragment byl purifikován, jeho konce zatupeny pomocí soupravy DNA Blunting Kit (Takara Shuzo Co., Ltd.) a tento fragment byl ligován do plazmidu pSAK333 štěpeného PuuII. Výsledný plazmid byl označen jako pdisw/cA

P. citrinum kmen SANK13380 byl transformován pomocí pdism/cD.

Hybridizace genomové DNA z pdisw/cZ) transformantu postupem Southem blotu byla použita k potvrzení změny ve strukturním genu mlcY)

Množství ML-236B produkované výslednou mutantou mlcD- dosahovalo přibližně % množství produkovaného netransformovaným hostitelským kmenem.

Příklad 17: Funkční analýza mlc R v pSAKexpR transformantech.

Dva pSAKexpR transformanty, které byly získány postupem popsaným v příkladu 12, označené jako TRI a TR2 a dále netransformované hostitelské buňky Penicillium citrinum kmene SANK13380 byly inokulovány do MBG3-8 media a jednotlivě inkubovány, jak je popsáno v příkladu 8.

Z každé kultury byla extrahována celková RNA postupem popsaným v příkladu 8.

Byla provedena RT-PCR s užitím výše zmíněné celkové RNA jako templátu a páru oligonukleotidů navržených na základě nukleotidové sekvence strukturních genů mlc A, B, C D E nebo R jako primerů.

Tabulka 13: Nukleotidová sekvence párů primerů pro RT-PCR.

Cíl <T-PCR	Primer 1	SEKV .ID. Č.	Primer 2	SEKV .ID. Č.
mlcA	5 ’ -gcaagctctgctaccagcac-3 ’	51	5 ’ -ctaggccaacttcagagccg- 3’	52
mlcB	5 ’ -agtcatgcaggatctgggtc-3 ’	53	5 ’ -gcagacacatcggtgaagtc- 3’	54

···· · · * · · · ·· · · · · · · · · • · · · · · · · · · · «· · · · · · ·· ·· ··· ·· · · · · ·

mlcC	5 ’-aaaccgcacctgtctattcc-3 ’	55	5 ’ -ctttgtggttggatgcatac-3 ’	56
mlcD	5 ’ -cgctctatcatttcgaggac-3 ’	57	5 ’ -tcaatagacggcatggagac- 3’	58
mlcE	5 ’ -atgtcagaacctctaccccc-3 ’	59	5 ’ -tcaagcatcagtctcaggca-3 ’	60
mlcR	5’atgtccctgccgcatgcaac-3'	61	5 ’ -ctaagcaatattgtgtttct-3 ’	62

Výsledky analýzy RT-PCR jsou ukázány na obrázku 5 pro netransformovaný kmen Pencillium citrinum 13380 a pro dva transformanty označené TRI, TR2.

Strukturní geny mlc A, B, C, D a R byly exprimovány první, druhý a třetí den kultivace v pSAKexpR transformantech.

Naopak, všechny tyto strukturní geny se exprimovaly v netransformovaných hostitelských buňkách jen třetí den kultivace.

Pro strukturní gen mlcE nebyl shledán rozdíl v expresi mezi pSAKexpR transformovanými a netransformovanými hostitelskými buňkami.

Získané výsledky naznačují, že protein kódovaný cDNA odpovídající strukturnímu genu mlc R indukuje transkripci nějakých jiných, dalších strukturních genů, (například mlc A, B, C, D) nacházejících se ve skupině genů souvisejících s biosyntézou ML-236B.

Příklad 18: Funkční analýza mlc E v pSAKexpE transformantech

Transformant pSAKexpE označený jako TE1, který byl získán postupem popsaným v příkladu 12 a dále netransformované hostitelské buňky Penicillium citrinum kmene SANK13380, byly inokulovány do MBG3-8 media a inkubovány jednotlivě tak, jak je to popsáno v příkladu 8.

Byla provedena RT-PCR s užitím výše zmíněné celkové RNA jako templátu a páru oligonukleotidů navržených na základě nukleotidové sekvence strukturních genů mlc A, B, C D E nebo R jako primerů. Primery použité v tomto příkladu jsou identické s primery v příkladu předcházejícím.

Výsledky analýzy RT-PCR jsou ukázány na obrázku 6 pro netransformovaný kmen Pencillium citrinum 13380 a pro transformant označený TE1.

Strukturní gen mlc E byl exprimován první, druhý a třetí den kultivace v pSAKexpE transformantech.

Naopak, strukturní gen mlc E se exprimoval v netransformovaných hostitelských buňkách jen třetí den kultivace.

Na druhé straně nebyl nalezen žádný rozdíl v expresi strukturních genů mlc A, B, C , D a R mezi netransformovanými hostitelskými buňkami a mezi SAKexpE transformantem (data nejsou uvedena).

Výsledky naznačují, že protein kódovaný cDNA odpovídající strukturnímu genu mlc E urychluje biosyntézu ML-236B nezávisle na strukturních genech mlc A, B, C, D a R.

SEZNAM SEKVENCÍ <110> Sankyo Company. Limited

<120>	Geny ze skupiny genů
<130>	EPP83481
<150>	JP 2000-116591
<151>	2000-04-18
<150>	JP 2000-117458
<151>	2000-04-19
<160>	62
<170>	Patent ve verzi	3.0
<210>	1
<211>	34203
<212>	DNA
<213>	Penicillium citrinum

<400> 1 gatcaatact	acgtcgttgt	tatttccttg	tcagtaatga	ctaacaaatt	ccccagaaca	60
gacgaagtca	cagctcacac	cacaagagaa	aatgagtcca	gcgaggatta	cagatttctc	120
gccaggcaaa	ccgagaaaag	ctctcttatg	catccacggt	gccgggtgct	cagcagccat	180
attccgcgtc	cagatctcta	aactgcgcgt	ggcgttgaaa	aacgagtttg	aattcgtata	240
tgcgaccgcg	ccgtttagct	ccagccccgg	acccggcgtg	cttcctgtct	tccaaggcat	300
gggtccatac	tacacctggt	tccaaaagca	tcatgacgcc	gttacaaaca	cgacaacccc	360
cacggtgggc	gatagagtag	cggctgtgat	cgggcctgtg	caaaagaccg	tccaagattg	420
gtctataact	aacccacagg	cacccattgt	cggcatagtg	gccttctctg	agggcgcatt	480

·· ··· · » ··

ggtcgccact	ttgctgctcc	atcaacagca	aatgggaaaa	ctgccatggt	ttccgaaaat	540
gagcattgct	gttttgattt	gctgtttcta	tagcgatgaa	gccagagatt	acatgagagc	600
cgaggcgcaa	gacgacgacg	acaagctaat	aatcaacgtg	ccgacactgc	atcttcacgg	660
tcgtcaagat	tttgctctcc	aagggtcgag	acagatggtt	gaaacacatt	acctgcctca	720
gaatgcagat	gtactcgagt	ttcagggaaa	gcataatttt	cccaacagac	cgagtgatgt	780
ccaggagacg	gtcaagcgct	tccaacagct	atatcaaaag	gtcaagatgt	caggttcatt	840
tgtctaggtg	agacaacagg	gtatatagca	aggctctggc	tctcatgcct	agtccatacc	900
acatttttac	tgaacaaatt	tgaatagttc	taatcttaca	cggtttgaat	gctcaccttc	960
caagggtgat	ttagttatag	tggtcgcgac	catctcataa	atatttcgtg	aacatatttt	1020
ggatagatca	tggaaggctc	gttctgaaca	ggcatgacag	acatctaaaa	ccactcgatc	1080
accacaacaa	ggcactaaac	cagtaactat	ggaactattt	gcaatggcgt	cgaatttata	1140
tacaggatgg	attgaaatca	attccaagcc	ttggaggttt	caccttcctc	acagagtctt	1200
tcgaaacgcg	ctaccgaggt	atatttatca	ccgttacggt	actctgaacc	gcgctatcta	1260
acttgatgtt	acgattgctg	caataaagaa	gagcaacgaa	ggtagaagta	attttgacaa	1320
agatacaaga	cgaattcgct	atttgtagat	gaatatgcgt	gtgtcaattg	acgccgaatt	1380
caggatagat	ttgccatctg	ctctattgcc	aatttctaat	ccatctttat	catgaacaac	1440
actcaaacca	cacatctgaa	ttcacggcgc	tgaacgatct	aggccaactt	cagagccggg	1500
ttcatcgaga	acatagtgag	gattgaagaa	aagtggtcta	caaaggcctg	agcgtgctca	1560
gggccataca	gcgagctctg	aagtttgaca	tgaatgagtg	ggtccttggt	agggtcatcc	1620
cacatctcga	gaacgatgtc	ataaggagtg	cgctcacggg	aagcgagaac	actcgtcatt	1680
ttggcattgc	caattgagcc	actctccgct	tgaccctgct	tgtaatcaaa	gacagcctgg	1740
aacaaggggg	cgtgtgtctg	agtcttgggt	tcctcgcctg	aggtagggag	attcaggcct	1800
agacagtcga	ggatgacgcc	atacggcacc	cgcgcgtgtt	gcatggcctc	acgcacactg	1860
tccttggtgg	ctacaaggtg	ctcgccgaat	gtcttgctgc	cgacgaactc	atcaaagcgc	1920
aggggaagca	cgttagcgaa	aaagcccatc	gccgaaattt	cttccatggt	ggatcggttg	1980
gtttcggcga	ggccgatggt	tatgtctttg	ctgccggtaa	gacgcgccaa	caaaacgtgg	2040
taggcggcca	ggtagaactg	catgggggtt	gccttgtgct	tgcggctccg	ctctttgatt	2100
cggaaggcga	ccatgggatc	taaacgagca	attgcttcat	actgctgcca	cgtgaatggc	2160
tgtatttgct	gctgctctga	attggcagca	gggtcattga	tcagattcat	gatgggaagc	2220
acggttggcg	cagatgacga	gactttgcta	tgcatggact	tccagaacgc	gatatcgtcc	2280
cccattcgcc	cattttccag	gttttcccgc	tgttggacgg	ctagatcaga	gaattgggtc	2340

* · · ·« · · <· · ···· ··· ··· ·· · ····· ·· • · · · · · · » · · · • · · ···· · · • v ·>· ·· · · ·· ·

gatggtcgct	gcattttcac	cccgctgtaa	atctgcccga	tctcattgaa	caggttttct	2400
gttgttgagc	catcaccaac	taatctgtgg	tagccgatta	ccaacaggtg	gtcatctgtg	2460
ccccagtaga	aatcaacgag	tctgagagtg	tcacctgtgg	agatgctata	gtttgtcttc	2520
tcgagtttcc	ggtactcttc	ctctgcctcc	gcagcgttgt	tcacctgaac	aaagtgcact	2580
ctgttctccg	ggttcttgag	aaccacttgg	acgggaccat	ttaaatcgct	gctatagtca	2640
tcgccagtaa	caaagcacgt	acggaagatc	tcgtgacggc	gcaatgaggc	tttcagagcc	2700
cgcctcaacc	ggtcgaggtc	aatggtaccc	ttcatgaaca	tgccaatagt	gttgttgaag	2760
atggtatgat	cttttaccat	ttgttgctgc	ctccaggaat	actcctggcc	aagggacaac	2820
ctctcgcgac	gaagaatctt	acggcctccc	tgctcattat	cgtcctcttg	ctcttcatcc	2880
tcttcggctg	acgacgcatc	tgtgctggta	gcagagcttg	cttcatcatg	gctgtctgtt	2940
ggtgtcggag	aagccccgct	gtccgaggtt	cccgtggaat	caccaatttg	caacagcagc	3000
ggaatggatg	tagctgggag	tcgggtggcc	gcgtcgtcgg	caagatcagc	gacagaagca	3060
ccgccaagta	ccctcaagag	tgggaggtca	aggtagagtt	gctttgagaa	ccatgagccg	3120
acagtcactg	cacccaagga	gtcgacacct	tgatcaatga	gaggaatggt	tgggtccacg	3180
ctctccccgt	ccgaaacttg	gagggtaaca	cggagtttct	cagatagacc	atctgcaact	3240
ttgttagttt	gaactcgata	tcaggaaacg	catgagagat	aacttaccaa	tcacgatttg	3300
ccgaacttgg	tctaaagttg	ttgcttgttt	gagctggtcg	gcaatggagc	ctttagaccc	3360
tgatccattg	tcgccaccgt	ctccgcgttg	accgggaatt	ttgaagtttc	cgaaacgagg	3420
gtcgttgaag	taaataattc	gatcttgaag	cgcagggtca	agatctggga	tacccgtggt	3480
aagctcaagg	tccgccatgt	caatgaccgt	cttgcgctgt	ggttgctgcc	gggcacgctg	3540
gtcagacacg	accgcttcgg	cgaaaagcgt	gtgcagctca	tgctcttcaa	ctgagtcaaa	3600
catgaaacgg	atagcatcaa	agtcctcctc	catctcggcc	ctcgtgacaa	accctacacc	3660
gtaaacggca	ccaatatcga	tggttgatcc	ctgtggttgt	gcgttagtaa	cttgacgtcg	3720
atgcatgata	attcaggggt	agaaaatacc	gccaatcctc	tggcgcaccg	ttgctgggcc	3780
agagcctgta	ggtaggcatt	cgcagcgcca	tagttggact	ggccaggatt	gccaataact	3840
gcaacaatgg	acgaaaacat	gatgaagaag	tcgagcgcct	tgctgcccgt	ctgttcggag	3900
aaccgttcat	gaagaatgcg	tgctccttgt	accttgggct	tcaacaccat	gtccatcatc	3960
tggtggtcca	tgttcttcag	catgacatcc	tgcagcacca	aaggcccgaa	cgcgatgccg	4020
gcaacaggtg	gcaacttcat	atcgacaagc	ttgccaaggc	cagcatcgac	tgaatcctca	4080
ttggcaacat	ccctaaagaa	agtaattgga	taagtaaacg	aggatgtggt	agcaaggtgt	4140

« · c

gatgtgatat	caatcaactt	acattgacag	aacggtgatg	tcaccaccaa	gtgcctccat	4200
gttggcgatc	catttgggat	caagtcgagg	gttccggcta	gtgagcacaa	catggcgggc	4260
gccatgcaag	atcatccagc	gacagagaga	gcgaccaagg	tccccggtaa	gaccaacaag	4320
caaatacgtc	ttcttgttgg	aaaataagtt	accagagtcg	atggggcaaa	tcctagcgga	4380
cacctcattt	tccttccagt	cgatgacggt	ggccagattg	aagcgttggt	cattgtggtt	4440
gacagagagc	tgaccaggca	agagaatttg	tgtggctgta	ataactttct	cagtgtcgtc	4500
gacagtcgac	gcagagacgg	tattttttgc	cattgccaca	gagtgctcga	ggattggaat	4560
atcctcaaca	tgactaactt	tgtatgtgga	agctgtactt	cggataagat	agtcaccact	4620
gtacatgaag	caactgggtg	gtagcaactt	ggccaaacgg	ttggttatcc	cggcagcagt	4680
ccggtcggta	gacaagtcaa	agaatgccat	catgtttgtc	ggcaggctgt	gtttcagccg	4740
agcgtcggtt	tccttggcat	gtaatcggat	ccaaggagcc	ggaatagttt	tgacgtcgga	4800
cagagttgtt	gccaaatgaa	cctgaacacc	gtaggttttg	gccgactcca	gaattgcttt	4860
gacgcagaag	attgggggct	ccataatcag	aattgatgca	tcagagccaa	aggactgagc	4920
gctagagaga	attgtt.tcgg	caaggagggc	tgcagctgtg	gacaacaaga	aggaactatc	4980
ctcgccttcc	gccatgttat	cgggcagact	atgcatgtag	tttctcggta	catgcagtat	5040
agatccattc	ttctcagcca	gggcgactac	aggcacctca	catgtattct	ccagaatact	5100
gccctgcacg	acatggaagt	atccgagatg	gcccacgcga	attgcctggg	gaagagcgta	5160
gcgaacacga	acagttgctt	ttccagcatg	acgagcgtct	tctaacgaat	cacacgtctc	5220
ggttgactca	agatagtaca	tcgatgagga	tgctcccctc	gcctctttca	gtgcaatggc	5280
cgtcttggac	gaattaaagt	taccgaaaat	tggacgacga	gacgagttca	tacggtcgtt	5340
cctagcaata	tcctgcttca	aacgagggac	ccaggcacga	cccttgcacc	agtacacttc	5400
gggctcatga	gtccatgtta	ttgattccaa	aagctgatca	tcgctctcct	cgaagcgcaa	5460
aagttgctca	acgaagaatt	tggtgtctag	gttctccaca	gtatcgacat	cgaagacgtg	5520
cgttcccaag	tcagggttct	cgagcttgat	tgtcctcaac	attccgatgg	tgctggcctg	5580
gtggggatga	tcaatccagg	cattctctgt	cagccacatc	atgcgtccgg	cgtagaagag	5640
aagagacttg	actgcctcaa	acttgtcctc	ttcaaggttg	caaaacactt	catcatcaag	5700
ttccgagagg	atgacaaaag	tcgacttagg	ctgcaaggcc	gggtcgtcga	gaacactttc	5760
cagccgcttg	acggagtgga	tgtgtctatg	cggtagggca	gctttcatgt	cgttcaaaat	5820
gcgttcggtt	tttgtcgatt	cgccaccgat	aaccactaat	ggcgggtatg	agtccttcaa	5880
tggagcagaa	agtggatcat	acaaacgctc	aacggtggca	tccacagcat	gtgtactgaa	5940
gacagacggg	atcaaatcat	cctctcgatc	aagtgtccga	ctatcgacgc	cagagaaccc	6000

aactctcttg	agggtatgct	cccattggtc	aacggacccc	gaggcactca	aagcacgagt	.6060
ttcgtcttct	ccagtccatc	gatcagcgaa	aagcccagag	atgaaggcga	ggcgagcagg	6120
ctcgcgatgg	gtgaccccga	aagtaaccaa	gtgaccaccc	ggcttgagca	aggaccttat	6180
gtgagccaat	ttttcctcga	agttggagct	ggcatggagg	acatcggatg	caataatcag	6240
atcgtaggag	tgaggcttga	atccttgctc	tgctgggctt	ctgttgatgt	ctagtgcctc	6300
aaactgcatg	agaccgtcga	attcggaaag	ttgttcacgg	gccttgccaa	taacatccgc	6360
cgagatgtca	gtgcaagtgt	aactgttgaa	accaagttga	ggtgatgcaa	gaacgcgctt	6420
cgtggcgatg	cctgtaccca	agcctaaaaa	gcgaacgaca	gattagcaaa	ctgcctagtt	6480
acttacattt	cagattcgac	ttaccgatct	caaggatatc	aatggattgg	tagcgatgag	6540
caatttggct	aaccagatcc	tgaacgacgt	gtattgctga	gccaaaggcg	agcttgttgg	6600
tatagtactc	ggtgaacaac	ccatcgcggt	tcatgatatc	caaaggatcc	ccgttcccgc	6660
gaacaattga	aattaattct	ttgcctaccc	tttggatcag	gcgcacatgt	gggtgggacg	6720
agttgcttca	agtaaaaggt	taatataaaa	gaatgaaaaa	acacggaaca	gctttgggtg	6780
tacctttcac	acatttgctc	aatgtgaaca	gaagtgtcct	cctcccaaga	ctcctggtac	6840
cactgatggt	ggccagcccg	agcatcggcc	tgaacctggt	cacaccattc	aatgtacttc	6900
tgggaatgga	ggtcggcatt	ttgacggtcg	tcgggggtta	tctgggctag	gaaggatttg	6960
atgtagaagt	aaacgattcg	ctcgatggtc	agaatgtcct	ccttgtcccg	agctatgatc	7020
aacgtcgcag	ggtcctccag	cagtttttcg	ggcgtgaggg	gtccccagac	ccactttgcg	7080
aagattcggt	ggtcggtcga	agcagtcggg	ggagagaaag	gcttaaagac	aatgttatca	7140
acttggaaaa	gcgttgtctt	ggtcgaatcg	tacaccgtga	tgtcgccgct	caggaaatca	7200
cccttgtcgt	gtgtgttgat	tgtgtcaaac	gcaagctcgg	tttcaccaga	attacccgcc	7260
gatatacaga	gcgatggaat	cagagtcact	ctgtcaacgt	gagtaggcac	gtacaatgag	7320
cgtaggcgac	gatctcctgg	agaggaatac	gctccaatga	cagtctggaa	cgcgatgtcc	7380
aggggcgctg	ggtggagcaa	gaggggctca	ttgcgcaatt	catccttaag	tggaaggaaa	7440
gccaaggtgc	cgctagcttt	ggagtcggcc	cttctcatgg	tctgcaaacg	acggaagtct	7500
ttgctgtagt	catacccaag	gaggtcaagt	tcccgataga	agaaatcgat	gttgacattg	7560
ttcatctggg	ggtactcttc	ctcaggtggc	ggcaaaagct	gcgatgacgg	tgatgcctcg	7620
ccaagggtta	tgacgatttg	gcctttggcg	gatgtcgaaa	gctcactctc	ctttgccaga	7680
caggaatcaa	taacaaattt	gaccgtgact	tggccatccg	catcattgtc	actggtgact	7740
tcggctgtca	agttcagctc	cacggaggtg	ttttcatctt	caaacacgat	ggctttgttg	7800

atgctcatgt	ccaagatttc	caggagctga	acttgggcgg	cacgctcacc	agccaccttc	7860
atggcagctt	ccatggccat	aattatgtac	ccagcagcgg	ggaacacagt	ctggccttgt	7920
agcgcatgac	cgtcgagcca	ttccagatcc	cggggcctga	tgaagtttgt	ccactggaag	7980
gtcgatgctg	tgctgtaaga	agaaagcttt	ccaagcagaa	gatggggcgc	acctccacga	8040
agatgctggc	gggtggagcg	agattctgcc	cagtattgac	gagtatgatc	ccaagagtat	8100
gtgggcaatg	actttgacag	gttttgaacg	gcacgatcgg	gccggacttg	ttgtacgaag	8160
ccctcggcgt	cgatactccg	aactccgaaa	cgctcccaaa	tgtatcccag	acctccagca	8220
aaagcgtcca	catcgtcaac	gtttcgtgcc	aagcacccgg	tatacggcag	ctccacaccg	8280
gcaagagcat	ccttgatggt	ggctagacac	ggacccttga	gagcagggtg	ggcgccaatt	8340
tcgatggcga	cgtcgattag	acgatgagtg	atgactgctt	tctgcacagc	ctgcgagaac	8400
aagaccggag	agacgagatt	gtctttccaa	taagcgggca	tcacatcctg	tacagtcatt	8460
tgcttgctgg	tctcgtggac	ggcagagaac	caagcaacac	tatcgttacc	ttggccatcg	8520
gcaacagcac	agtcgcactc	cagcaatgcc	ttgacatatg	gagctgcgca	tgggtgcatg	8580
tgatgcgaat	ggtaggcctt	gtcaactctc	aagattctgg	caaaagtgga	ttcatcctcc	8640
aagacacctt	caacgtgctg	gatagcatcc	atgtcgccgg	agaaggtcac	actatccggt	8700
gaattgctag	cggcgacgca	gacccgaccc	tcaaaggctt	cgagctcgca	tagttccttt	8760
gcgtcatcgt	acgacatacc	tgccgctagc	atagcgcctg	tctggccgct	tggagaagag	8820
gcatgctccg	cggacacaac	tccacgcaga	tgcgcaatac	ggatagcttg	agtggcactg	8880
atgaatcctg	ccgcaaaggc	acaggcaatc	tcacctgaac	tgtggccgac	aattgcactg	8940
aactcgatac	cagctgcagc	gagaagtcgg	accagaacga	tttgtacggc	gcagcataga	9000
ggctgggaga	agctggcgag	tctgacgttt	gaggcatccc	cttcaagcat	gagctggtca	9060
tacagtgtcc	acgtaggccg	atacttttca	ggcagtgttt	gcagtgaatt	atccagctct	9120
tcgagaatgc	ctctcacaaa	tggcataccc	accatgagct	tcttcagcat	gcccggccac	9180
tgtgcacctt	ggccagtaaa	gacacctagt	acgcgagggt	tgtcattcgc	gtcggtgcgg	9240
aagtcggtga	cgacctcacc	gtccgcgatg	gcagcctcca	gtgccgcgcg	ggctacttcc	9300
ttgttgtgtg	ctgcaatcgc	acgacggaag	ggcaagatag	accgtttctc	aagtaaggta	9360
tatgcgatat	catgcatgtc	cacgtcatca	tgcgtttcca	gaaattggag	catattttct	9420
agcgttgcct	tcatggagcg	ctgcgacttc	gatgaaagca	caaggggcaa	gctgcatgca	9480
tctgcatctg	aggtcacctc	tgttaccact	gctgtcggct	tgtgtggagg	agccatatac	9540
tcttcgataa	tagcatgggc	atttgtacca	ccaaatcctg	atgtgtttat	atgtttagct	9600
aacttcactt	tcgttctcaa	gaagtgcagt	tgaatcctta	ccaaatgaat	taacgctgac	9660

tctgcgaggc	tgcccgggcg	caacaatcgg	ccattctgtg	gcctccgttg	caattttcaa	9720
gtgcgtatag	aacggagcga	cacggggact	gatcttctca	aacagcaggt	ttggcgggat	9780
cacgccattt	cgtacagcaa	acgatgcctt	cattaagccc	gcaataccag	cagtgccttc	9840
cgtgtgaccg	agaactgtct	tgatgctgcc	gacaaaaagc	tcatctttct	cgccgtcgct	9900
gtcgattgtt	ccatccttgt	gtccgaagaa	ggctgttgca	atagcctcag	cttcctgtgg	9960
gtcaccggct	ggtgtaccag	ttcctgggat	cttcgtgtta	gggagagaga	gactttctgc	10020
aacttccata	aggctgatac	ttccagggaa	taccacttac	catgggcttc	aaagaactgg	10080
cagcgttcct	gggggttggt	aatatcaaga	ccagccttgg	catatgtggc	ccgaatgagg	10140
gcttcttgtg	cgctatggtt	tggcattgtg	atacctgtcg	ttcggccatc	ttggttgata	10200
ccggtctctc	ggataacaca	ctcgatactg	tccccgtcgc	gcagtgcctg	gctcagcgtt	10260
ttcaggacaa	tagagcaaac	accttcctaa	aaagcagtta	caggaggtca	gtgccatctt	10320
gctttttttg	aaaggaattg	atgcattgtc	aacttactcc	tctggcatat	ccatcggcag	10380
cagcatccca	cattcgagat	ctaccattgg	gggacagcat	gttcaatttg	ctctccatta	10440
caaaggtcat	ggggcccaat	atcagattcg	caccggctgc	aaccgccatg	gtactctcgc	10500
ccgttctaag	ctgttggacg	gccagatgca	cggcagctaa	ggatgaacta	caggctgtgt	10560
cgatcgtcat	ctgcagaatc	agtcaggaat	ctgtcagcac	ttgacgaagt	cgggctcgct	10620
caatgagtgg	cactcacact	cggcccatgc	cagtcgaaga	agtatgatac	acggttggag	10680
gccacactga	cagctacccc	cgtggcagag	tatgtaggaa	tactatccaa	ttcacgcgtc	10740
acgatagtct	catagtcatg	cgtcatcata	ccgacgtaca	cagcagtaga	ggatccttga	10800
aggccttgga	tccgtaggcc	tgcgttggat	acagcttcat	agaccgtctc	cagcagcagc	10860
ctttgctgtg	ggtcaatcgt	ttcggcctct	ccagcttgga	tgttgaagaa	agaggcatca	10920
aaaccgcgta	gatcctcctg	cagcaagtat	gcaaagggtg	cgttcgtgcg	cccggggtga	10980
gtgccatcgg	ggctgtaaaa	tgtatcgacg	tcaaatctct	ccttagggat	cttggtctgt	11040
acatcccggg	gctctttgag	cagctcccaa	agttttgatg	gtgtgttgac	accacctgga	11100
aaccgacaac	cgcttcccac	taccacaatt	ggctcgtttg	gatagttggc	ttgatccata	11160
actgctgatc	ctgtttttgg	gcgataggat	tgggattaaa	ccttgtcttg	cgtcagtaga	11220
tcttctcact	gcatgccggg	cacaacattt	gttcttacag	aatcgcagag	ttgaatctct	11280
gagcgaacaa	gccggccttg	caaccgatac	cgtcgttata	tttacttgca	cgtatcagta	11340
ctcatctaga	ttcggacaat	ttcaagatcc	attctagtac	tcaaatgccc	ccacttccca	11400
gcaatgcaag	ctcggcacct	agcaaaccct	cccggcgtca	ttcggtgcac	gaatagccat	11460

Ί • ·

tcctccatac	ggcgttattc	ggtcacacga	ggctgaatga	atcaaacgtg	aatatcaatt	11520
ggctgtatca	aggtgaaacc	gagtttttca	ctcggattgt	tcttgtgctg	ctcggtgaag	11580
ctgctcctaa	aggaaacaac	cgaactgccc	catccaggta	aacttcgatt	gggggggggg	11640
tttttttttt	ttcaaggttg	actggaagag	tgctctcggc	cacaaaatcc	cagaagcatt	11700
agtgctgtta	ttcgattata	aaccgtcgca	gcgctctcat	tcttcgctct	ttcttctttt	11760
ccactggtgt	gcataggtcc	tatctgtctc	acgcaatgct	cggccaggtt	cttctgaccg	11820
tcgaatcgta	ccaatgggta	tcgacccctc	aagcccttgt	ggcggtcgca	gtgcttctta	11880
gtctcatcgc	ctaccgtttg	cgggggcgcc	agtccgaact	gcaagtctat	aatcccaaaa	11940
aatggtggga	gttgacgacc	atgagggcta	ggcaggactt	cgatacgtat	ggtccgagct	12000
ggatcgaagc	ttggttctcg	aaaaacgaca	agcccctgcg	cttcattgtt	gattccggct	12060
attgcaccat	cctcccatcg	tccatggccg	acgagtttcg	gaaaatcaaa	gatatgtgca	12120
tgtacaagtt	tttggcggat	gtatgacctc	tgaattttcc	attgttgtaa	ctcaatgacg	12180
tctctaagat	tctgatgaat	gtataggact	ttcactctca	tctccctgga	ttcgacgggt	12240
tcaaggaaat	ctgccaggat	gcacatcttg	tcaacaaagt	tgttttgaac	cagttacaaa	12300
cccaagcccc	caagtacaca	aagccattgg	ctaccttggc	cgacgctact	attgccaagt	12360
tgttcggtaa	aagcgagggt	aagtgtcaat	ttttctgtct	tgagcattga	gcctctggct	12420
gacataccgc	gaatatacta	gagtggcaaa	ccgcacctgt	ctattccaat	ggattggacc	12480
ttgtcacacg	aacagtcaca	ctcattatgg	tcggcgacaa	aatctgccac	aatgaggagt	12540
ggctggatat	tgcaaagaac	catgccgtga	gtgtggcggt	acaagctcgc	caacttcgcg	12600
tatggcccat	gctactgcga	ccgctcgctc	actggtttca	accgcaagga	cgcaaattgc	12660
gtgaccaagt	gcgccgcgca	cgaaagatca	ttgatcctga	gattcagcga	cgacgtgctg	12720
aaaaggccgc	atgtgtagcg	aagggcgtgc	agccgcccca	gtacgtcgat	accatgcaat	12780
ggtttgaaga	caccgccgac	ggccgctggt	acgatgtggc	gggtgctcag	ctcgctatgg	12840
atttcgccgg	catctacgcc	tcgacggatc	ttttcgtcgg	tgcccttgtg	gacattgcca	12900
ggcacccaga	ccttattcag	cctctccgcc	aagagatccg	cactgtaatc	ggagaagggg	12960
gctggacgcc	tgcctctctg	ttcaagctga	agctcctcga	cagctgcatg	aaagagacgc	13020
agcgaatcaa	gccggtcgag	tgcgccacta	tgcgcagtac	cgctctcaga	gacatcactc	13080
tatccaatgg	cctcttcatt	cccaagggcg	agttggccgc	tgtggctgca	gaccgcatga	13140
acaaccctga	tgtgtgggaa	aaccccgaaa	attatgatcc	ctaccgattt	atgcgcatgc	13200
gcgaggatcc	agacaaggcc	ttcaccgctc	aattggagaa	taccaacggt	gatcacatcg	13260
gcttcggctg	gaacccacgc	gcttgtcccg	ggcggttctt	cgcctcgaag	gaaatcaaga	13320

ttctcctcgc	tcatatactg	attcagtatg	atgtgaagcc	tgtaccagga	gacgatgaca	13380
aatactaccg	tcacgctttt	agcgttcgta	tgcatccaac	cacaaagctc	atggtacgcc	13440
ggcgcaacga	ggacatcccg	ctccctcatg	accggtgcta	agatataaca	cgcaaactaa	13500
aacaaatatg	catccgtccc	caggcttatt	ccaatagttt	ccgtcccaga	gaaactaggt	13560
gctgtattag	tcgagtaggt	tagtaaaata	aaacgcattt	tattcgattg	tgatgccttc	13620
tttgtaatcg	aacgtggtgt	agactttggc	tatgtgcgag	agacagaaac	acagagagag	13680
agaagggaga	gagtgtgtat	tcctgctacg	cagagcggcc	atctgcttct	ataccgccag	13740
ctacaccgcc	acgtagggaa	gtcggcagta	atgaagcttt	tctcccggta	caatcaccga	13800
tctccccatt	ctctcaggcg	ttgactggcg	cttacgatga	cgagggctta	ggctctgtta	13860
agtcttgatg	ttcctactca	acatccccga	ctaggcgaaa	gagaggacgg	cgcaacgacg	13920
tggacacaag	tactccctcc	cgccttccga	ctacatatcc	acaatctgta	cccactgccc	13980
gtgccaacgc	ctttcgaccg	ttcaacgcgc	atttacaagg	cttgcgggaa	tcataatgga	14040
gagaaaaaga	gagaactttt	gacagtcaag	cctccgaggt	gctaagacag	cttccctggt	14100
agtataaaaa	gcattcactc	ttccgacttc	gagaacgagt	gcacatgtgt	actttgttgc	14160
ttctcagggc	cactgtaatg	gtatttcagg	tatctctatt	tactgctatc	cagaagtcag	14220
gcattaaata	gtcaggctca	gcccaggctc	gattcagatt	ggattcaggc	ttcagaccat	14280
ggccgctatg	ctccttcgta	ctatacctcc	gtcgagctat	acccgcttgg	ccagacaaaa	14340
ggcttcactg	aacccttcaa	cttaactgca	tttcgccaca	actaactcga	cgaggccggc	14400
gatggtgtta	ccattcatga	gctcaaagat	cgacacatca	acatggattt	cagatgtgat	14460
ccagtttcga	agttcaatgg	cgacgagtga	gtctacgccg	acacctgcca	ggtttttgga	14520
cgaggacatg	tcgtcttctg	ccagaccaaa	cattcgcatc	agcttttccg	tcattgcttt	14580
gaggacgata	gaaatggcct	cgtcgtgaga	ggtgaccctg	cttagttggg	cccgcacgcc	14640
atctggtcct	tttttatgcg	aagagacaaa	ggattggtct	gcatgaagga	cttggcggta	14700
tttaagtccc	acaaaccgct	gttcctgtat	ccagtttgcc	tcggtccagt	gagcacccgg	14760
ggatgtgttg	attcctgtaa	ccacagctgc	gggaggtgat	ggaaattgag	gggaagaaca	14820
caggattgcc	ttctccaaca	catccatgac	gtccttttca	tgcataggct	tgtaacctat	14880
tctagcgagc	cggtcggcca	caccacggcc	agtttcagcc	acgtatccaa	cagacttgac	14940
catgcccaag	tcaatggtga	cagccggcat	gccatgggct	ctccggtggt	gcgcaagtgc	15000
gtcctggaat	gcaccagcag	ctgcgtaatt	ggcctggcct	gccccaccca	tgaccccaac	15060
aagggatgag	agcatcacga	agaagtcaac	atcctgtgcg	atcttgtgaa	gataccaact	15120

accctgtact	tttgggcgtg	ttgctgcatt	aaattcatcc	aatgtcattc	gcgatagaag	15180
cgcgtccttg	agaaccatgg	caccttgtat	gatacctcga	attggcggtg	catgtgcttc	15240
ttcgcacaac	cggagcacct	tggtgacctg	atcttgatct	gagatgtcac	atgcgtgtag	15300
atagacagcg	cactgttgat	tttgcaagct	ggttatgaat	ggactggcct	ttgcacttct	15360
cgataggata	atcaagtgct	tcgcgccatg	atcaacaagc	cactgacaga	tctgctttcc	15420
aattcccccc	agcccaccag	caactaggta	agaactgtca	ggcttcagct	tcagcgagaa	15480
ccctccatcg	ccgactggga	ccagttcgtc	cccagataca	ttgaccacaa	ctttgccaac	15540
atgctgacca	ctctgcatcg	tacggaaggc	cttctcgatg	tttgacaagg	agtgctgctg	15600
gattggacca	atcaagccaa	tcgcttttgt	ctcgaggagt	tttgtgacat	ggttcaacgc	15660
ttcggatact	tcttcacttt	tggctctttg	ccacgagaga	agatcaattg	atgtgaaaga	15720
gacgtcccgg	gtgaatggca	gcatgtcaag	tctgctgttt	tgctccaggt	ccttttttcc	15780
aatctcaaca	aatctgccga	attcggccat	gcagtcaaag	cttgcttgga	ggagttgacc	15840
tgccaatgag	tttagaacga	catgaacgcc	aagtccgccc	gtgtaggctt	tgatgccgtc	15900
gacgaataag	tcattcctgc	tcgagaagat	atgatccgga	ttgatgccga	atttatcgcc	15960
gacaaagtca	cgcttggctt	gagttcccgc	tgtgacgaag	acctcggcac	ccgcaagctg	16020
ggacaaaatg	atcgctgctt	gaccgacgcc	tccagctcca	ctgtggatca	agactctttc	16080
gcctcgtcgt	agctttgccg	tggtataaag	cgcaatatat	gcggtagtga	aagccagggg	16140
gaccgaagcg	gcttctggga	agcccatttc	gtccggaata	cggacgacat	tagtgtacgg	16200
cgtctgtgtt	ctggtcgccc	aatggccttt	cagtagtgca	catacgcggt	cccctaatct	16260
gaggccttgg	ctagcggcag	cagctccacc	gagctttgtg	atcactccgg	cgcattcgaa	16320
gcccatcaca	cggttggcct	ccaattgacc	catggcaacc	atgacatccc	gaaaattgag	16380
accgaaagct	ttgggttcga	tttctaccca	atcatccgga	agatccttgc	cttcacgtcc	16440
ttcgtcgtct	cgaaattgca	gggagtctaa	gagccctggc	gtctcaacct	ccatccgcag	16500
acgacgcccg	ggttgctcga	acggctgcag	tgtgacctca	accgcttctt	ggtccttcca	16560
gtgcgggtca	ttgaaaagtc	gcggtacgtg	gatgacgccg	tttctctctg	caaattcaaa	16620
ctccttgtct	tcggaaaggt	cgccgaggcg	gccattgaag	atattgcaga	tagcatacag	16680
ggactcgtgg	gtgtatgcgt	ttcgagaagg	atcgagatcc	aacgatacat	attccttccc	16740
gttattttcg	ttgcggatgg	tacgcagcag	accaatatgt	agagctttcc	atggatcctc	16800
ggagctcatg	gctgctcctc	tagacaccca	gagaagtgcg	ttgcagttat	tcagcatcgc	16860
ggtgatggat	ttgaaggtct	cgcttcccac	ctctccaagg	agcgaggact	ccatttcccc	16920
aagaaaaatg	catgtccttc	cagtggtatc	tacctcgccc	agagcgttga	tcgatgggct	16980

• · ··· ·· ··

agaactggtc	ttttcacaaa	ttgctgcctg	gagactttcc	agccaagatg	aaggaggtcg	17040
gagcgctccg	tgcagcaaaa	gcacctccga	ttctgccact	gtatccgggg	ttgtattctc	17100
ttttctagcc	gtcgatagca	ttgtgctgat	catgtaaaac	tcatcgtctt	cacaatcacg	17160
aacctccaat	tccacaccgt	tgaaaccgct	cgtgtccaac	atggtgttcc	aaagatcggt	17220
agtgagcgat	ggcgtcgact	tccgctcagg	ctcctcactg	agccaccaac	ctggcaacag	17280
tccgaaggta	aagaacaaat	cgagctgatc	cctggtagtc	tcaaccaaaa	tcaagttgcc	17340
cccaggcttg	agcaattttc	gaacgttact	cagtgttcgt	ttcatgcatc	gagttgcatg	17400
caggacctgg	caagccacga	ccacatcgta	ggtggcacat	tcaaaccctt	gttgctcggg	17460
atcgctttca	atatccaatt	ttttgaaagt	catcacgtct	tgccaatccg	caaattgctc	17520
acgcgccgac	tcgaaaaacc	cggcagacac	atcggtgaag	tcataacgat	cgatcggctt	17580
ggtgtttccc	aatgcattga	caataagctt	tgtgcagccg	cccgtgcctc	cgccaatctc	17640
caaaatgcga	gaacgcgggt	tcttgtgggc	gcaaagtcgg	atcagctcgc	tggcttgtgc	17700
gtttgatcgg	ctccatttga	ttgcgttgac	gtagtatctg	cttagcagct	gatcttgcat	17760
catcaactca	agtggctctg	tttcgcggcg	tagcattgct	attaactgag	gtcctagacg	17820
agaaatcatc	tcgccattga	cgctttctcc	agcgactctg	gcctgtaggc	atttcttctg	17880
ctcagcatcg	tcacttagcc	agtcgcaact	ggctgggctg	agcttgtttt	gtctcgcaag	17940
gtccaattgg	acattcatcc	aatcgaaata	cttctgaagg	tggccatcca	gatgttggat	18000
atcagaattt	gtcaaatcag	tgacagcctc	ctgtataaag	ttgatcgtgc	atcttcggag	18060
gtccatcatg	agttccgttt	ctttcgtctc	agcctcagtg	ctcaactttt	ctttgagcca	18120
agtggagtca	cccaagctga	tgtcaggggc	ccaaacccag	gagctgcagg	cattttctgt	18180
gtcgttggag	tctgactttt	ggtcagagaa	gctgcttcca	accgactgga	aaacaaggcc	18240
ttcaatctct	atgactggga	ttccgtccga	gggagaagaa	ccgctatcat	agtcatcaaa	18300
cactgccaag	tcggtagaga	aggattgaga	gttgcgatcc	ttgatgctgg	cctgtgcgtc	18360
cagagcatca	ccagcctcca	agtcagccag	gctagaggat	attttgacat	ttcttagcct	18420
ccttggtacc	atggccgttt	tcatacgtgt	tcccgcgtag	ggtaacaccg	tgtatgccgc	18480
ctggatcacc	gagtccagag	tagtaggatg	gacgatgtgt	cgattctcgt	acgagtgagg	18540
catagccgag	gcagtgtcag	caatggaaaa	tctgcaaaac	gagccctgtc	cattgttttg	18600
aattcgctga	atgttctgaa	aaatgggtcc	gtggcatatc	ccattcgcgt	gtaaggactc	18660
ccagagatcg	ttgggatcaa	tgctccggtt	atctgagcct	agattcaacc	tgcgtgaggc	18720
ttccacagtt	gaacagtcaa	ggtggcttct	ttcgctctcc	gaacgtatta	atccggtgca	18780

• · ·· · ···· ·· · ·· ··· ·· · · · · ···

gtgttctgtc	caggtattat	tttcgcccga	aattgagtgc	acagaaaatt	gatgccagtt	18840
ctttgtgccg	agggaccttt	cctcacatga	acggatcgtt	aggcgcaggt	caacctctgc	18900
ttctgcatca	gcgggtatta	tgagagcctg	cgcgagttca	acgtcacgca	agttgtagtt	18960
gatgctagcc	cccgcaactg	gtgggcagac	ttgtgaaaac	ccctcgatgg	ccatgctgat	19020
gaagccagct	cccggaaaga	tgatgctcga	accaacgacg	tgatctcgta	tccatggaat	19080
atctgacaga	cggagaacat	gtttccattt	aggcgcgaaa	tgaggagaga	gagattcccg	19140
tgagcctatc	aaagtgtgag	gcggatgggt	tctctgtttg	gactcacgac	tgccgcgagg	19200
ctctctccaa	taacgggttt	ggtgattcca	cgggtacgcc	ggcaaatcgc	tcagtacctt	19260
cactctgggc	tcttttcttc	catgaggaaa	gtttatagcg	tccattttga	gcccataacc	19320
cttgcttatc	aactccgtag	cagcacgata	cattgtctcc	aacgagcttc	tgccgcgaga	19380
aaggcaactg	agatagttta	tatctgttcc	tttcagaccc	agatcctgca	tgacttggtt	19440
gattggacca	ccaagcgctc	cgtgaggccc	tatttcaata	atcacatcga	cggctttctc	19500
tttggtgttg	ggatcaaagc	acatctcgcg	gagtgaggac	tcgaactcta	ccggctgtag	19560
catactatcc	atccagtgtg	tgggatccaa	tagcaattta	agatcggtca	tgcgactacc	19620
agtcttaggt	gatgaatata	atacaccctt	tgaggtgtca	gcattgggat	tgtcgttgtt	19680
gttatccgag	ttgaacagat	ctctcagtga	cgccccaaag	gcatctgcca	ttggtcgcat	19740
gtggcttgaa	tggaaggctt	cagtgacttt	cagtttcctg	gtaaagatgc	catcggcgtg	19800
taacaacttt	tcaagtttct	cgattgcacc	caaatctccc	gacaccgtca	cactacattg	19860
actgttgata	catccaacca	ccacacagcc	gtcctcctgg	ttgagacgcg	aaatgtaaac	19920
attggtctca	ctgcgaccaa	gacccaccgc	catcattcct	cctttggctg	ccaatgcggg	19980
cttgggctta	gtggtcaata	caccgcgtat	ataagtgatc	ccaatggccg	accgcgcgga	20040
taaagcccca	gctgcgtagg	cagcagcagc	ctctccactt	gagtgactgg	ttatccccgt	20100
tggccgaatt	ccccatgacc	aaaggagacg	cacaagtgca	atttggatag	cggttgacag	20160
tggtagactg	tattcggcat	catttacccg	agtcgtcagc	tcatcacggt	ggagctcctc	20220
tgtgcaattg	aatgttagta	cctcaagctt	gatacagtat	tacttttccc	gggctcgcaa	20280
cttacccata	aaattccaac	tcgcgcccag	ttgcttgatg	tagccatcac	attcaagaat	20340
cgcctgtttg	aatactggga	atgtattgac	cagctctctg	cccattgcat	gccactgcgc	20400
cccctgaccg	gtgaatacaa	atccgagccg	tactttctca	ttcgctcgtt	ttggttgatt	20460
ggactcatcg	ctgagggcag	aaacaaggcc	gccaaggctg	tctgctacat	acactgacgt	20520
ccatggcaga	atggaacggc	gagagcctag	tgtataggcg	aggctggcga	ggaagggttc	20580
cccgtcaatg	tcagcgacgg	atttaatgta	gtctcgcagg	cttgctatcg	ttcgccgaca	20640

• ·

agcttgctcg	tccttggcac	gcacaacgta	tatgcggctc	tgtttggaac	catcctcaac	20700
cctaccatgc	tcagagttac	cattgacatg	cacttgatcc	tctggcaggg	ccaatgatgc	20760
gcgatcatat	gattccaaaa	tgacgtgagc	attcgaacca	ccaaagccga	agttattgac	20820
agatgcgcga	cgagtcccat	ctttcacagg	ccagtcttga	gcagacatgg	ggatctttga	20880
aacattaacc	tttgaaacat	ataactgaat	ctgcgaatgc	gcaaagcctt	accttgatgt	20940
tcttttggtc	aagcatcagc	ttgctgttct	tttgcaggaa	ccgcgcatta	gggggaatca	21000
agcccttctc	caaggccaag	gccaccttga	ttatactggc	caggccactg	gcggcttctg	21060
tatggccaat	atttgctttc	acagagccaa	ggtgcagagg	atgtccttta	aaagctgctg	21120
aaattgctga	gatttcaagg	gggtcaccag	ttggtgttcc	agttccgtgg	gcctccacgt	21180
acgaggtcaa	cgacatatct	agcccagcct	tatcgtaaca	ctcctggatc	agacttttct	21240
gcgccacatc	actcggcgca	gtaattgcgg	gtgttttgcc	atcctggttc	agcgctgtct	21300
ctcgaatgac	ggctcggata	gggtcttggt	ctcgcaacgc	gttagggagg	gcctttatta	21360
ccagagcggc	aattccttcc	ccgcgaccat	atccattcgc	tcgaggatca	aaagagtacg	21420
agataccatc	cggggacaaa	aatctgtcat	tgagcaacaa	ggattgctta	gttcaagact	21480
ctcgatctgg	aatcttcttc	ggaaaactca	ccccaggttt	gacatcgtaa	caaaaacatc	21540
gggattgagc	agaagatttg	caccgataac	gatggctgta	tctgactccc	cagtacgtaa	21600
gctctggcac	gccaagtgca	gtgcggtcaa	tgtcgtcgaa	caggccgtgt	caaccgtcac	21660
gctgggacca	cgtaagtcgt	agaagtgtga	tatccggttc	gaaagcattg	ttcctgagtt	21720
gccagttatg	aaataacgcg	gaactgtctc	ggggtcacga	ttgagcgaat	cctgatagtc	21780
gtggtacatg	acacccccaa	acaccgacgt	attagagcct	gccataccat	cgatggtgat	21840
accggctgga	tgatggtcag	tgacgtttgc	ttacagtgag	gatgacccac	actacatacc	21900
actctccagc	gattcgtaga	ccacctcaag	cataagccga	tactgcggat	ccatgcactg	21960
tccaatatta	gatctctgcg	tcccgggtta	gatcaattga	aataatcata	cgctggcgac	22020
ctctgtggtc	atgttgaaga	acgcggcgtc	aaataaagca	ggatcctcgt	cgatgaagtg	22080
tccacccttt	acgtgggtct	atccagtcat	ccttggagtc	agtaaccaag	cttcagtgat	22140
gctcaaatct	tgtgtcaaat	attcaaaaca	agatataaat	gcatgcatgt	tagatactca	22200
cggacccgac	cctttcgcca	ttcgggtggt	atactcctct	cacattgaat	cgcgaggagg	22260
ggaccttaga	ccaggcactg	cctcctcttt	caaccatttc	ccaaagcttc	tgtggactcg	22320
ttgcatctcc	agcaaatcga	catcccattc	caactatggc	aatgggcgtg	gatgtgttag	22380
agcaagccga	gcctgccatt	gcggttgcgg	ttgcggttgc	ggttgcggtt	gcggttacgg	22440

• · · ·· · · ·· ···· ··· ·· ·· · ····· ··

cgcjgggtatt	gttcattcca	acgttgtttc	attgactgat	atatcagtcg	ccctggtgat	22500
aaaaccgttg	atagtcttcc	aacagtctac	aggtccctgg	catagctata	gatgcataag	22560
ctgcccccga	cacgtgattc	atagttcggg	gtttgttttc	atcttggacg	tgacacgata	22620
ttcgctctgt	gcccatggga	aaccccggac	caccatgcta	tgctcggggc	aataccttag	22680
aggtaccggt	tcgggaggca	ttgtctgtcg	tcacgataat	cccgagtcaa	aacgccgatg	22740
ggaaaccgtc	gaacaagacg	aaacaggtca	ggccggccag	gtagttttcg	ggtataatgg	22800
aggctgtcag	aatccgatac	tccgtacaca	gatgcgaaat	acgcatacga	gctatcaaac	22860
caaacgaatc	caaaagcctt	ggaaaagctt	ggaaaggctt	agtgggtaat	cctgtcccaa	22920
ggtttgttga	gggcctgagc	gcagggtggg	tcctgtaagc	agttggtaat	tcaatttcca	22980
acaatacaca	atccccaaaa	tttgcattat	cggttgacta	agacaagcaa	acaaaatata	23040
tgcaggaagc	gcaattcatc	gcgagcaaac	gatcatcatg	agcatgtgac	cctttcctct	23100
tttttctact	tcggaaggcg	gcatgatcat	ctgtcagaac	tcccaatcgg	gagcaatacc	23160
ataccttacg	gcaccccact	cagacccatg	cacaaagaaa	atccatgcgc	cgaatattga	23220
agccttggca	acaaagcccc	gtgtaactcc	gaaggtatcc	aaagaccgag	agacgccgat	23280
ttgagagaca	cgtacggagg	tccacacaaa	atgttcccga	gtctatacac	tatactccaa	23340
actgacttct	tgtctacctg	ggtatcttgt	tcaggttgct	gtttactgag	ataaatgata	23400
ccgggggggg	gggggggggg	gggggttgac	actggctttt	cgtggacaga	ataataccca	23460
tacatccctg	cgtaagtagt	cgtttcgaga	agaatgtgtt	tcgtggtgca	ttactccgta	23520
ggcacaatat	atttccattc	ctcacgaagt	ggcctcgtcc	gggcgtgatc	gatgcagctt	23580
gccgccccac	caaaaaagga	ccacaatacg	agtcagatta	gaaacgtcta	acaggacgtc	23640
tatgtaagag	gacgctcctt	tgtatgtcgg	atctaggcat	gacaaaataa	ctatacctag	23700
gtagtgttct	gtcttattgg	tcatttggcc	tactttcgga	acaatcttgg	aagttcacat	23760
tcctaggtat	cagggcaatt	gattggtgtc	cccagaattc	ttttttctcg	aataaaggat	23820
aaatttatgc	ataaaaacct	tggaaactga	gcatagttat	gagcacaaat	actagttttc	23880
agtgcaattg	gtcctactat	cctttgcttg	gtacccctta	ccaattatac	cctaggcagc	23940
agttgacacc	ggtcatgaat	ccattcataa	^aggtgg^acca	gatgcaggga	taaggaagcg	24000
aatctttccg	ctgcctcagc	ctcaggggcg	cgcgccattt	gttattttct	tctactcatt	24060
tcccgtacct	aggaactgtt	cagttgtccc	tcccaacccc	ttgggccgaa	caaccttcct	24120
ccaatctacg	acggcagatt	atacctaggc	gcctaaccga	ttaggttgct	cattcgattt	24180
tggaggtatg	cactttatct	caagccctaa	ttcccaattg	aagtgctttt	ccgtccccat	24240
ttgcagagct	gactagattc	ttttctcaga	gactacctag	ctataggtac	cactccaagc	24300

tgtagcacag	acctttcagc	atggtcgctt	cgttgctacc	ctctcgcttt	cgcggtaggg	24360
aatcaatgaa	tcagcagcac	cctctacgct	cgggaaatcg	ggcattgacc	tccacactcc	24420
aatttctatc	caaaacggcg	tgtctacacc	cgatccatac	cgtttgcacc	atagctattc	24480
tagctagtac	cacatacgtt	ggactactca	aagacagctt	cttccatggc	cccgcaaacg	24540
ttgataaagc	agaatggggc	tctttggtcg	aaggaagtcg	aagcttgatc	accggcccac	24600
agaatggctg	gaagtggcag	agcttcgacg	gggatgcaga	tgttctcgga	gatttcaacc	24660
atcaagcact	aatgaccttg	gtattcccgg	ggtcatatgg	ggttgcatct	caagcagcct	24720
caccattcct	tgctcccctc	cctgtgaacc	tatctgtgat	tgaccttccc	tcaacgtcga	24780
gccctttaac	cgcctattcg	aaagataaag	ttttcgcctt	ctctgtggaa	tacagcagcg	24840
cgccggaact	cgtggctgct	gttcaagaaa	tccccaacaa	cagtgccgac	ctgaaattgc	24900
aggagacgca	attgatcgag	atggaacgcc	agatgtggat	catgaaggct	gccagggctc	24960
acacaaaacg	cagccttgct	caatgggtgc	acgatacctg	gacagagtct	cttgatctta	25020
tcaagagcgc	tcaaacgctc	gacgtggttg	tcatggtgct	aggttatata	tcaatgcact	25080
tgactttcgt	ctcactcttc	ctcagcatga	aaaaattggg	atcgaaggtt	tggctggcta	25140
caagcgtcct	tttgtcgtca	acatttgcct	ttctcctcgg	tctcgacgtg	gccataagac	25200
taggggttcc	gatgagcatg	aggttgctat	ccgaaggcct	ccccttcttg	gtggtgatcg	25260
ttggctttga	gaagagcatc	actctgacca	gggctgtttt	gtcctatgct	gtgcagcacc	25320
gaaagcccca	gaagatacag	tctgaccagg	gtagcgtgac	agccattgct	gaaagtacca	25380
tcaattacgc	cgtacgaagc	gccattcggg	agaagggtta	caatatcgtg	tgccactacg	25440
tggtcgagat	cctgctccta	gttatcggtg	ctgtcttagg	catccaaggt	gggctacagc	25500
acttctgtgt	tctagctgca	ttgatcctgt	tctttgactg	tctgctgctg	tttacattct	25560
acactgcgat	tctgtctatc	aagctcgagg	taaaccgcct	caaacgtcat	atcaacatgc	25620
ggtacgcgtt	ggaagatgag	ggtctcagtc	agcggacggc	ggagagtgtc	gcgaccagca	25680
atgatgccca	agacagtgca	cgtacatatc	tgtttggcaa	tgatatgaaa	ggcagcagtg	25740
ttccgaagtt	caaattctgg	atggtcgttg	gtttccttat	cgtcaacctc	gtcaacatcg	25800
gctccaccct	tttccaagcc	tcttctagtg	gatcgttgtc	cagtatatca	tcttggaccg	25860
aaagtctgag	cggatcggcc	attaaacccc	cgcttgagcc	cttcaaggta	gctggaagtg	25920
gactagatga	actacttttc	caggcaagag	ggcgcggtca	atcgactatg	gtcactgtcc	25980
tcgcccccat	caagtacgaa	ctagagtatc	cttccattca	ccgtggtacc	tcgcagctac	26040
acgagtatgg	agttggtgga	aaaatggtcg	gtagcctgct	caccagcctg	gaagatcccg	26100

• ·

tcctctccaa	atgggtgttt	gtggcacttg	ccctaagtgt	cgctctgaac	agctatctgt	26160
tcaaggccgc	cagactggga	atcaaagatc	ctaatctccc	gagtcaccca	gttgatccag	26220
ttgagcttga	ccaggccgaa	agcttcaacg	ctgcccagaa	ccagacccct	cagattcaat	26280
caagtctcca	agctcctcag	accagagtgt	tcactcctac	caccaccgac	agtgacagtg	26340
atgcctcatt	agtcttaatt	aaagcatctc	taaaggtcac	taagcgagca	gaaggaaaga	26400
cagccactag	tgaacttccc	gtgtctcgca	cacaaatcga	actggacaat	ttgctgaagc	26460
agaacacaat	cagcgagttg	aacgatgagg	atgtcgttgc	cttgtctttg	cggggaaagg	26520
ttcccgggta	tgccctagag	aagagtctca	aagactgcac	tcgtgccgtc	aaggttcgcc	26580
gctctatcat	ttcgaggaca	ccggctaccg	cagagcttac	aagtatgctg	gagcactcga	26640
agctgccgta	cgaaaactac	gcctgggaac	gcgtgctcgg	tgcatgttgc	gagaacgtta	26700
ttggctatat	gccagtccct	gttggcgtcg	ccggtcctat	tgttatcgac	ggcaagagtt	26760
atttcattcc	tatggcaacc	accgagggcg	tcctcgtcgc	tagtgctagc	cgtggcagta	26820
aggcaatcaa	cctcggtggc	ggtgccgtga	cagtcctgac	tggcgacggt	atgacacgag	26880
gcccgtgtgt	gaagtttgat	gtccttgaac	gagctggtgc	tgctaagatc	tggctcgatt	26940
cggacgtcgg	ccagaccgta	atgaaagaag	ccttcaattc	aaccagcaga	tttgcgcgct	27000
tacaaagtat	gcggacaact	atcgccggta	ctcacttata	tattcgattt	aagactacta	27060
ctggcgacgc	tatgggaatg	aatatgattt	ctaagggcgt	ggagcatgca	ctgaatgtta	27120
tggcgacaga	ggcaggtttc	agcgatatga	atattattac	cctatcagga	aattactgta	27180
cggataagaa	accttcagct	ttgaattgga	tcgatggacg	gggcaagggc	attgtggccg	27240
aagccatcat	accggcgaac	gttgtcaggg	atgtcttaaa	gagcgatgtg	gatagcatgg	27300
ttcagctcaa	catatcgaaa	aatctgattg	ggtccgctat	ggctggctca	gttggcggct	27360
tcaacgccca	agctgccaat	cttgcggcag	ccattttcat	tgccacaggt	caggatccgg	27420
cgcaagttgt	ggagagcgct	aactgcatca	ctctcatgaa	caagtaagtt	gaaagcggcc	27480
gcttacttgg	aaacattcac	taatcctgtt	tagtcttcgc	ggatcgcttc	aaatctctgt	27540
ctccatgccg	tctattgagg	ttggaacgtt	gggcggtggt	acgattctgg	agccccaggg	27600
cgcaatgctt	gacatgcttg	gtgtccgcgg	atcacacccg	accactcccg	gtgagaatgc	27660
acgtcaactt	gcgcgcatca	tcggaagcgc	tgttttggct	ggggagctct	cgctatgtgc	27720
tgccctagcc	gccggtcacc	tggtcaaggc	gcacatggcg	cacaaccgtt	ctgccccggc	27780
atcttcagcc	ccttctcgaa	gtgtctcccc	gtcaggcgga	accaggacag	tccctgttcc	27840
taacaatgca	ctgaggccga	gtgctgcagc	tactgatcgg	gctcgacgct	gattaggtcg	27900
gaatcttagg	agcattccaa	gctccgtacc	ccctccagtg	gattcattgc	aggaggatca	27960

tattttttct	cattggttgt	tattgtcata	attttcaaaa	gcacaatgca	atgagacagg	28020
caggtggtag	agtgaacggc	cagaaagggt	atctcatgtt	tatatgttgt	tgaaatttac	28080
gatgcaagta	gtagggaaga	agaatatata	aagagatggt	ccttttccag	agagtgttta	28140
ggtctgatcc	ctcataatta	tttaatgagt	gaaagctttg	ttcaagctat	aacttactga	28200
gtaggttgaa	tgttgatctg	attcattcct	gaggtatcag	gattgatgcc	tgaaacatca	28260
atcatccatt	gtcagatgcc	gtaactaact	aactatgaat	ctcaacatag	ttatatgttg	28320
ccaatctagc	cacggtgact	agaaccttga	gatggactta	gactagacat	gggtcgcggg	28380
caatgacata	tagaatcttt	gaaatcgaca	ttaattaagt	atgtggagat	tctttgtgga	28440
ggcacggtaa	tgtgtctatc	tagcaacgcg	gtcaagcatc	agtctcaggc	acagcccggg	28500
tgtcgttttt	ggttgcaatc	ttccgccatc	ccattccaaa	ggcaaacaca	aacgtgcacg	28560
ccgtagctcc	cactgctaag	taaaaagtat	gatcaacggc	gagactgtaa	gcttttacaa	28620
cccctggaag	gttattcttg	ctgaccacat	ctctgaagcc	agtcgcccct	gctgccgtca	28680
cggcctgcgt	gtcgacagtg	ggcgcatact	tgctcaggcc	agttctcaaa	ccggacccaa	28740
agacaaggtt	agcaaagtcc	aggaagagcg	atcctccaaa	cgtctgtcca	aacacggcga	28800
gagaaattcc	gagggcacct	tgttcgggcg	aaagcgtgct	ttggatggcg	atgataggct	28860
ggccattgag	tattgatgtc	agcgtctagc	ggttgcatgc	tcttcttgct	ttgatacaaa	28920
gccgaaagcg	tgagagatga	tcaaaggttt	catagcttac	cgtttgcatg	ccacaaccac	28980
gaccgaagcc	cgcgataaat	tggtacatga	cccatttcac	agttgatgta	tggggctgga	29040
aggtggatac	cagacctgcg	cctatggcga	cgagaacagc	gctgcctagg	gcccaaggca	29100
aatagtatcc	tgtctttcca	actggtgcgt	catatgtcag	tatacacgat	atccaagccc	29160
gatgtcagac	ggttgtggca	agaaaggagc	catagaaatg	gacggggtgg	agaaaaatgt	29220
gtacgcgagt	ttcacttact	tgcgaagcca	gaaaccatag	ccataatgac	ttgtccaaga	29280
attccaggca	acatgtacac	accactcagt	gtgggagaaa	catccttcac	agcctggaag	29340
tagatcggta	gatagtagga	aaagacaagc	aaggagccag	agaaaaagcc	cataaataaa	29400
caagagcacc	acacttgtcg	tttaccagcc	actgagccag	gaatcatggc	aacagcatcg	29460
ccaacatgac	gctcccatag	cacgaacgca	atcagagcaa	accctccgcc	acagaacagg	29520
ccgatgatga	cggaacttcg	ccaggtgtag	gtcgaccctc	cccattctag	tgcgagggaa	29580
atcatggttg	cgaaggctgc	aaagaccaca	aagcctacaa	ggtccagttt	gcgaagtgtg	29640
gattttatgt	tggccattgg	tttgtcggtc	gagagttcgc	tgtccgtgga	tgaaattcgg	29700
tcgggtatgg	tgatgacgag	aaggaggaat	gcagcgacag	cgccgatggg	gagattgata	29760

• · • ·

taaaagcctg	aattccaagt	gagaacatgg	acaacaatca	taaaaaggcc	aaaggtcaac	29820
atacaccatc	gccaagtggc	gtgttgagtg	aaagcacctc	cgagcagtgg	tccacagaca	29880
atggcaatct	gactaactga	aaacatattg	tcagacgacg	aaccgttcgt	ttggggtaca	29940
tcagatcttg	agatgacata	cgacccatca	tcactccaat	caaaacttca	tatgcgaggt	30000
cagcgtgtac	acggcaccca	gcagacttcc	aaaaatcggt	tcccttacct	ggttgcttgt	30060
gcttaggagc	agctgttgag	aggattgtga	gggctccgtt	gacaagacct	gagcctccca	30120
ttccagcaac	ggcccgccca	acaatcaaca	tggtggaaga	tcttgcggca	ccgcatagca	30180
ccgagcctag	ttcaaaaata	cagaggaagg	caaagaaagt	gtacttcaag	cccaagagtg	30240
tatacaattt	accggccagg	ggctggagag	cacagctaaa	tatgatgtta	gctaatctgt	30300
tcgtacaatg	aacaaggtca	aggagaacag	agccatactt	agccagaaga	taagcactgc	30360
cgtaccaccc	tacatcgttc	agagagtgga	actcgcttgt	gatatgtggg	attgcctgtg	30420
gctggagtca	attgactgtg	ctgcgctctg	ttctgaggta	gccaccatct	taccgtgacg	30480
ataatggaca	tatcaaggag	catcaaaaat	gctacgaaag	taactgaagc	aaccaccagc	30540
ccgagcttga	ggcctgtgat	gtgctgggac	ttggactcag	tcgcttcgag	cgtgtcattt	30600
tgactttctt	ccttctgtgg	ccttggttcc	ccttctttag	ggggtagagg	ttctgacatc	30660
gcgcaattcc	ttccgacttt	tgcttcaagg	ggcggtgtga	atctctactg	cgcggcgctt	30720
ctatagtacc	tgtgttttgg	tgtatgaatg	atctcgctct	cgttgtttcg	ttaaggtccg	30780
ctagcctgaa	gtcagattga	tggatgggga	tcaggggaaa	ttggcgacgt	ctttaatttt	30840
gcttttcttt	gttaccggaa	gtgttgcggt	attagcgtgt	ctgggcttat	ttacgacgca	30900
caagatgcat	tgaactggcc	ccactgctag	atctcactag	tattgtggtt	gtaatttacc	30960
tatactccat	attgactggg	caggttttga	acacaaccca	caccccccca	tactacacat	31020
tagttttgca	tattttcctg	ggggccaaaa	aaaccccaaa	aggcttcaat	attttgcggc	31080
caatggagag	tgtaactaat	ttggcccaca	ctccggtggt	atcaatcgga	tctcactgca	31140
tatatgatga	aagcaagagg	gggcaggaga	tacgctcttt	attggctgtc	tgcgcgaagc	31200
tgggcaaatg	caaataaaaa	gacaaacaac	cagctggaag	accgggcgac	aaacatggtt	31260
tacctaacac	cctcgatccc	aacaatgtgc	atgttaatca	atgtgctccg	tggggagtat	31320
gaactataac	atacgaagca	gccattcatg	tcaaaaaaaa	aaccaggcga	atgggcgtcg	31380
tcaacggttt	cacataagta	ctatattgta	ctaactaccc	gtgagactgg	agagaacagt	31440
ctcgcgcgaa	gaaacgataa	gagcatcggt	catatcggtc	catctcggtc	taagtgtatg	31500
agaatattcc	gacgtgaatc	catccgtcag	tgatcaatgt	ctccaagtaa	ttcatcattt	31560
caattaccct	cgctttactc	cgtagaatac	aagaccttac	tagcgcaaac	aagtgggggc	31620

• « ♦

• « • · • · «

♦ · ·

taacggtgtg	atctccttcc	gttgcggccg	ccacctcggt	tccagccgta	atacgacgac	31680
ccgtctatcg	cgacccccta	gccttggcca	tttttggcgt	tacagtaaag	ctttggagag	31740
aaacgccaag	ggaaaatgct	agccaccaat	tctataaatt	actcttcaca	tgcagctagt	31800
atcactggta	agtctacggg	gcacatgtaa	aatttttatt	actttctaat	aatctttcca	31860
agttcttttc	cacggggccc	caatgcttaa	aatactcaaa	agacgtgaaa	aacctgcaag	31920
ccgccagtga	tatcacacgt	aatgcctcaa	cagcctgatt	ccgagccatt	atatgctgtt	31980
tgatgatctc	aaattgagat	ggcgagcgct	ggatctggga	aattggtagt	gggattggta	32040
tagaaacgta	agtgcagaag	accatgtaat	aagtacatat	ggaggctatg	tgatggcccg	32100
atctagtttc	ttcaatatag	cgctgggtat	aaaaaaaagc	aggggctttc	tcagggtaat	32160
gtcgcagtct	acaacgagtg	gcgtccactg	acagggaaag	gcgagcgggg	ctatgctacc	32220
ttcaatttcc	atagaggggg	gatgcaccat	ctccgacaat	ctatagttac	tcaaacaggt	32280
acggtactaa	gcaatattgt	gtttcttcgc	taatgcgaat	atttccttat	agcaacgtcg	32340
caacacattt	atcgtcttcc	ctgaggcctt	tgttgacttg	ggctcttcgt	ctccggcttc	32400
gtcactccaa	agcacagata	ggagacgaga	ggccggcgtt	atggttttat	tttcagcgcc	32460
aaggatttgc	cacgatgtgc	ttggcatatc	tgataggacc	tattccccct	ctcccggtca	32520
gcgcattgct	gatgtatgca	agggaagaaa	agactggtgg	ttatcggtcc	cacttactag	32580
acgaatagat	gccgcagccc	cgtgctcctg	tgctatcccc	aaagcagtct	caatctcact	32640
caatagtcga	aggcttacac	gcaatgtcgt	gcatgcagaa	gataaggcgt	gcatgaatgg	32700
gtcgagatgt	gaaatgagct	cgccgatatg	aagattagag	tgaaacgagg	gaagtgcttc	32760
ggctcttcca	ttgtcatttc	tagtggttga	gccagaccag	taccaatcca	ttcgtgtgct	32820
ttgcttttgt	ccacaaggtt	gggctttcat	cacctcggat	agtagcagct	gggaaagtga	32880
tgtcatgatt	ttgacagaca	acatgtagca	atgcaccgcc	atgaacaagt	tcttggtttg	32940
cagacaccca	tctaacatgc	tgctattgct	gctcgtgatc	acacgttctt	gaagatgtag	33000
tagcaatcta	ccaaaggcat	tcaaaaagtc	ccctatcggg	tctaggaaga	agctttagcg	33060
acaatcaaga	ggcagtaaac	aggcagaatt	gaaaatctca	cagcttaaaa	ttttttgctt	33120
gggccattcc	acagtcaccc	cgtggagtat	tacctctagg	tcctgtgaca	catccgacag	33180
actttcgaaa	aggtctcgtt	gcgtgttgct	tgtgttggat	tgtccggatg	acgagttccc	33240
ctctacttcg	aggtcaaaca	gcgatggcga	gacaggcgcc	gttgcatcca	aagggccttc	33300
aaagtcgtag	cctagatctg	gtatccccga	agattcattg	ctgttggcat	cgtcgcgaaa	33360
tgtatttggc	tgaggccagc	cgccgggaaa	cgactcggga	tcatcaaagt	tgattgatgt	33420

atcatagaat	tgcagggttg	ccgctgatgg	ttctgataat	gtttccttga	gtgccgaggt	33480
gccaatatgc	gtaggtggtg	agcagtaagg	tggaggagtc	tctgccaatg	atgagaagac	33540
cgtagaagat	gtcgcggtca	tcggttgtga	ggtttctgtg	gctcttgtag	ttccagctgc	33600
ggcttcttta	tgtaaattgc	gcttgggtag	cctttcgctg	tacacacacc	ttaatccggc	33660
ttgttgacaa	cgttgacact	gagcacggac	taaattggca	ttgctaccgg	tacatttgag	33720
cttttgtgca	tgacaccggt	cacatgagcg	tcgaaacgcg	cgacggcgta	ggttcgtcgg	33780
aatcgttgca	tgcggcaggg	acataattat	tggattaaga	tcaaataatg	tgaggtgaga	33840
ctttgcatgt	tcctggatct	ttatgtattg	gaattggaga	gtaagctcgt	gcaggagata	33900
agttcaggtc	gtcttgctgg	aagacttact	aagttatatg	caaacaagtg	ttttcgagcg	33960
gacaccaaaa	gccaatagtc	ttactatgaa	tgtcttttca	gtcacccgga	gaaatactct	34020
tagcctctgc	tcttatgcga	gctcatcaaa	gctgggcata	cataccccat	ccagcgccac	34080
gtattacact	agaaagagtt	ctaaaagaaa	tagattcggc	cccccatctg	gctatcatat	34140
atgccagatg	aaatacctgt	aacgtggggc	ataaaaaggc	aggctctagt	ctaccagcag	34200

atc 34203

<210>	2
<211>	34203
<212>	DNA
<213>	Penicillium citrinum
<400>	2

gatctgctgg	tagactagag	cctgcctttt	tatgccccac	gttacaggta	tttcatctgg	60
catatatgat	agccagatgg	ggggccgaat	ctatttcttt	tagaactctt	tctagtgtaa	120
tacgtggcgc	tggatggggt	atgtatgccc	agctttgatg	agctcgcata	agagcagagg	180
ctaagagtat	ttctccgggt	gactgaaaag	acattcatag	taagactatt	ggcttttggt	240
gtccgctcga	aaacacttgt	ttgcatataa	cttagtaagt	cttccagcaa	gacgacctga	300
acttatctcc	tgcacgagct	tactctccaa	ttccaataca	taaagatcca	ggaacatgca	360
aagtctcacc	tcacattatt	tgatcttaat	ccaataatta	tgtccctgcc	gcatgcaacg	420
attccgacga	acctacgccg	tcgcgcgttt	cgacgctcat	gtgaccggtg	tcatgcacaa	480
aagctcaaat	gtaccggtag	caatgccaat	ttagtccgtg	ctcagtgtca	acgttgtcaa	540
caagccggat	taaggtgtgt	gtacagcgaa	aggctaccca	agcgcaattt	acataaagaa	600
gccgcagctg	gaactacaag	agccacagaa	acctcacaac	cgatgaccgc	gacatcttct	660

acggtcttct	catcattggc	agagactcct	ccaccttact	gctcaccacc	tacgcatatt	720
ggcacctcgg	cactcaagga	aacattatca	gaaccatcag	cggcaaccct	gcaattctat	780
gatacatcaa	tcaactttga	tgatcccgag	tcgtttcccg	gcggctggcc	tcagccaaat	840
acatttcgcg	acgatgccaa	cagcaatgaa	tcttcgggga	taccagatct	aggctacgac	900
tttgaaggcc	ctttggatgc	aacggcgcct	gtctcgccat	cgctgtttga	cctcgaagta	960
gaggggaact	cgtcatccgg	acaatccaac	acaagcaaca	cgcaacgaga	ccttttcgaa	1020
agtctgtcgg	atgtgtcaca	ggacctagag	gtaatactcc	acggggtgac	tgtggaatgg	1080
cccaagcaaa	aaattttaag	ctgtgagatt	ttcaattctg	cctgtttact	gcctcttgat	1140
tgtcgctaaa	gcttcttcct	agacccgata	ggggactttt	tgaatgcctt	tggtagattg	1200
ctactacatc	ttcaagaacg	tgtgatcacg	agcagcaata	gcagcatgtt	agatgggtgt	1260
ctgcaaacca	agaacttgtt	catggcggtg	cattgctaca	tgttgtctgt	caaaatcatg	1320
acatcacttt	cccagctgct	actatccgag	gtgatgaaag	cccaaccttg	tggacaaaag	1380
caaagcacac	gaatggattg	gtactggtct	ggctcaacca	ctagaaatga	caatggaaga	1440
gccgaagcac	ttccctcgtt	tcactctaat	cttcatatcg	gcgagctcat	ttcacatctc	1500
gacccattca	tgcacgcctt	atcttctgca	tgcacgacat	tgcgtgtaag	ccttcgacta	1560
ttgagtgaga	ttgagactgc	tttggggata	gcacaggagc	acggggctgc	ggcatctatt	1620
cgtctagtaa	gtgggaccga	taaccaccag	tcttttcttc	ccttgcatac	atcagcaatg	1680
cgctgaccgg	gagaggggga	ataggtccta	tcagatatgc	caagcacatc	gtggcaaatc	1740
cttggcgctg	aaaataaaac	cataacgccg	gcctctcgtc	tcctatctgt	gctttggagt	1800
gacgaagccg	gagacgaaga	gcccaagtca	acaaaggcct	cagggaagac	gataaatgtg	1860
ttgcgacgtt	gctataagga	aatattcgca	ttagcgaaga	aacacaatat	tgcttagtac	1920
cgtacctgtt	tgagtaacta	tagattgtcg	gagatggtgc	atcccccctc	tatggaaatt	1980
gaaggtagca	tagccccgct	cgcctttccc	tgtcagtgga	cgccactcgt	tgtagactgc	2040
gacattaccc	tgagaaagcc	cctgcttttt	tttataccca	gcgctatatt	gaagaaacta	2100
gatcgggcca	tcacatagcc	tccatatgta	cttattaóat	ggtcttctgc	acttacgttt	2160
ctataccaat	cccactacca	atttcccaga	tccagcgctc	gccatctcaa	tttgagatca	2220
tcaaacagca	tataatggct	cggaatcagg	ctgttgaggc	attacgtgtg	atatcactgg	2280
cggcttgcag	gtttttcacg	tcttttgagt	attttaagca	ttggggcccc	gtggaaaaga	2340
acttggaaag	attattagaa	agtaataaaa	attttacatg	tgccccgtag	acttaccagt	2400
gatactagct	gcatgtgaag	agtaatttat	agaattggtg	gctagcattt	tcccttggcg	2460

tttctctcca	aagctttact	gtaacgccaa	aaatggccaa	ggctaggggg	tcgcgataga	2520
cgggtcgtcg	tattacggct	ggaaccgagg	tggcggccgc	aacggaagga	gatcacaccg	2580
ttagccccca	cttgtttgcg	ctagtaaggt	cttgtattct	acggagtaaa	gcgagggtaa	2640
ttgaaatgat	gaattacttg	gagacattga	tcactgacgg	atggattcac	gtcggaatat	2700
tctcatacac	ttagaccgag	atggaccgat	atgaccgatg	ctcttatcgt	ttcttcgcgc	2760
gagactgttc	tctccagtct	cacgggtagt	tagtacaata	tagtacttat	gtgaaaccgt	2820
tgacgacgcc	cattcgcctg	gttttttttt	tgacatgaat	ggctgcttcg	tatgttatag	2880
ttcatactcc	ccacggagca	cattgattaa	catgcacatt	gttgggatcg	agggtgttag	2940
gtaaaccatg	tttgtcgccc	ggtcttccag	ctggttgttt	gtctttttat	ttgcatttgc	3000
ccagcttcgc	gcagacagcc	aataaagagc	gtatctcctg	ccccctcttg	ctttcatcat	3060
atatgcagtg	agatccgatt	gataccaccg	gagtgtgggc	caaattagtt	acactctcca	3120
ttggccgcaa	aatattgaag	ccttttgggg	tttttttggc	ccccaggaaa	atatgcaaaa	3180
ctaatgtgta	gtatgggggg	gtgtgggttg	tgttcaaaac	ctgcccagtc	aatatggagt	3240
ataggtaaat	tacaaccaca	atactagtga	gatctagcag	tggggccagt	tcaatgcatc	3300
ttgtgcgtcg	taaataagcc	cagacacgct	aataccgcaa	cacttccggt	aacaaagaaa	3360
agcaaaatta	aagacgtcgc	caatttcccc	tgatccccat	ccatcaatct	gacttcaggc	3420
tagcggacct	taacgaaaca	acgagagcga	gatcattcat	acaccaaaac	acaggtacta	3480
tagaagcgcc	gcgcagtaga	gattcacacc	gccccttgaa	gcaaaagtcg	gaaggaattg	3540
cgcgatgtca	gaacctctac	cccctaaaga	aggggaacca	aggccacaga	aggaagaaag	3600
tcaaaatgac	acgctcgaag	cgactgagtc	caagtcccag	cacatcacag	gcctcaagct	3660
cgggctggtg	gttgcttcag	ttactttcgt	agcatttttg	atgctccttg	atatgtccat	3720
tatcgtcacg	gtaagatggt	ggctacctca	gaacagagcg	cagcacagtc	aattgactcc	3780
agccacaggc	aatcccacat	atcacaagcg	agttccactc	tctgaacgat	gtagggtggt	3840
acggcagtgc	ttatcttctg	gctaagtatg	gctctgttct	ccttgacctt	gttcattgta	3900
cgaacagatt	agctaacatc	atatttagct	gtgctctcca	gcccctggcc	ggtaaattgt	3960
atacactctt	gggcttgaag	tacactttct	ttgccttcct	ctgtattttt	gaactaggct	4020
cggtgctatg	cggtgccgca	agatcttcca	ccatgttgat	tgttgggcgg	gccgttgctg	4080
gaatgggagg	ctcaggtctt	gtcaacggag	ccctcacaat	cctctcaaca	gctgctccta	4140
agcacaagca	accaggtaag	ggaaccgatt	tttggaagtc	tgctgggtgc	cgtgtacacg	4200
ctgacctcgc	atatgaagtt	ttgattggag	tgatgatggg	tcgtatgtca	tctcaagatc	4260
tgatgtaccc	caaacgaacg	gttcgtcgtc	tgacaatatg	ttttcagtta	gtcagattgc	4320

·· · · ·· ·· · ···· · * * * · · · • » · ·►···> « * · • » · · 9 * . · · *· e • · « «··· 9*· • 9 ··· ·9 ·· 9 *>···

cattgtctgt	ggaccactgc	tcggaggtgc	tttcactcaa	cacgccactt	ggcgatggtg	4380
tatgttgacc	tttggccttt	ttatgattgt	tgtccatgtt	ctcacttgga	attcaggctt	4440
ttatatcaat	ctccccatcg	gcgctgtcgc	tgcattcctc	cttctcgtca	tcaccatacc	4500
cgaccgaatt	tcatccacgg	acagcgaact	ctcgaccgac	aaaccaatgg	ccaacataaa	4560
atccacactt	cgcaaactgg	accttgtagg	ctttgtggtc	tttgcagcct	tcgcaaccat	4620
gatttccctc	gcactagaat	ggggagggtc	gacctacacc	tggcgaagtt	ccgtcatcat	4680
cggcctgttc	tgtggcggag	ggtttgctct	gattgcgttc	gtgctatggg	agcgtcatgt	4740
tggcgatgct	gttgccatga	ttcctggctc	agtggctggt	aaacgacaag	tgtggtgctc	4800
ttgtttattt	atgggctttt	tctctggctc	cttgcttgtc	ttttcctact	atctaccgat	4860
ctacttccag	gctgtgaagg	atgtttctcc	cacactgagt	ggtgtgtaca	tgttgcctgg	4920
aattcttgga	caagtcatta	tggctatggt	ttctggcttc	gcaagtaagt	gaaactcgcg	4980
tacacatttt	tctccacccc	gtccatttct	atggctcctt	tcttgccaca	accgtctgac	5040
atcgggcttg	gatatcgtgt	atactgacat	atgacgcacc	agttggaaag	acaggatact	5100
atttgccttg	ggccctaggc	agcgctgttc	tcgtcgccat	aggcgcaggt	ctggtatcca	5160
ccttccagcc	ccatacatca	actgtgaaat	gggtcatgta	ccaatttatc	gcgggcttcg	5220
gtcgtggttg	tggcatgcaa	acggtaagct	atgaaacctt	tgatcatctc	tcacgctttc	5280
ggctttgtat	caaagcaaga	agagcatgca	accgctagac	gctgacatca	atactcaatg	5340
gccagcctat	catcgccatc	caaagcacgc	tttcgcccga	acaaggtgcc	ctcggaattt	5400
ctctcgccgt	gtttggacag	acgtttggag	gatcgctctt	cctggacttt	gctaaccttg	5460
tctttgggtc	cggtttgaga	actggcctga	gcaagtatgc	gcccactgtc	gacacgcagg	5520
ccgtgacggc	agcaggggcg	actggcttca	gagatgtggt	cagcaagaat	aaccttccag	5580
gggttgtaaa	agcttacagt	ctcgccgttg	atcatacttt	ttacttagca	gtgggagcta	5640
cggcgtgcac	gtttgtgttt	gcctttggaa	tgggatggcg	gaagattgca	accaaaaacg	5700
acacccgggc	tgtgcctgag	actgatgctt	gaccgcgttg	ctagatagac	acattaccgt	5760
gcctccacaa	agaatctcca	catacttaat	taatgtcgat	ttcaaagatt	ctatatgtca	5820
ttgcccgcga	cccatgtcta	gtctaagtcc	atctcaaggt	tctagtcacc	gtggctagat	5880
tggcaacata	taactatgtt	gagattcata	gttagttagt	tacggcatct	gacaatggat	5940
gattgatgtt	tcaggcatca	atcctgatac	ctcaggaatg	aatcagatca	acattcaacc	6000
tactcagtaa	gttatagctt	gaacaaagct	ttcactcatt	aaataattat	gagggatcag	6060
acctaaacac	tctctggaaa	aggaccatct	ctttatatat	tcttcttccc	tactacttgc	6120

atcgtaaatt	tcaacaacat	ataaacatga	gatacccttt	ctggccgttc	actctaccac	6180
ctgcctgtct	cattgcattg	tgcttttgaa	aattatgaca	ataacaacca	atgagaaaaa	6240
atatgatcct	cctgcaatga	atccactgga	gggggtacgg	agcttggaat	gctcctaaga	6300
ttccgaccta	atcagcgtcg	agcccgatca	gtagctgcag	cactcggcct	cagtgcattg	6360
ttaggaacag	ggactgtcct	ggttccgcct	gacggggaga	cacttcgaga	aggggctgaa	6420
gatgccgggg	cagaacggtt	gtgcgccatg	tgcgccttga	ccaggtgacc	ggcggctagg	6480
gcagcacata	gcgagagctc	cccagccaaa	acagcgcttc	cgatgatgcg	cgcaagttga	6540
cgtgcattct	caccgggagt	ggtcgggtgt	gatccgcgga	caccaagcat	gtcaagcatt	6600
gcgccctggg	gctccagaat	cgtaccaccg	cccaacgttc	caacctcaat	agacggcatg	6660
gagacagaga	tttgaagcga	tccgcgaaga	ctaaacagga	ttagtgaatg	tttccaagta	6720
agcggccgct	ttcaacttac	ttgttcatga	gagtgatgca	gttagcgctc	tccacaactt	6780
gcgccggatc	ctgacctgtg	gcaatgaaaa	tggctgccgc	aagattggca	gcttgggcgt	6840
tgaagccgcc	aactgagcca	gccatagcgg	acccaatcag	atttttcgat	atgttgagct	6900
gaaccatgct	atccacatcg	ctctttaaga	catccctgac	aacgttcgcc	ggtatgatgg	6960
cttcggccac	aatgcccttg	ccccgtccat	cgatccaatt	caaagctgaa	ggtttcttat	7020
ccgtacagta	atttcctgat	agggtaataa	tattcatatc	gctgaaacct	gcctctgtcg	7080
ccataacatt	cagtgcatgc	tccacgccct	tagaaatcat	attcattccc	atagcgtcgc	7140
cagtagtagt	cttaaatcga	atatataagt	gagtaccggc	gatagttgtc	cgcatacttt	7200
gtaagcgcgc	aaatctgctg	gttgaattga	aggcttcttt	cattacggtc	tggccgacgt	7260
ccgaatcgag	ccagatctta	gcagcaccag	ctcgttcaag	gacatcaaac	ttcacacacg	7320
ggcctcgtgt	cataccgtcg	ccagtcagga	ctgtcacggc	accgccaccg	aggttgattg	7380
ccttactgcc	acggctagca	ctagcgacga	ggacgccctc	ggtggttgcc	ataggaatga	7440
aataactctt	gccgtcgata	acaataggac	cggcgacgcc	aacagggact	ggcatatagc	7500
caataacgtt	ctcgcaacat	gcaccgagca	cgcgttccca	ggcgtagttt	tcgtacggca	7560
gcttcgagtg	ctccagcata	cttgtaagct	ctgcggtagc	cggtgtcctc	gaaatgatag	7620
agcggcgaac	cttgacggca	cgagtgcagt	ctttgagact	cttctctagg	gcatacccgg	7680
gaacctttcc	ccgcaaagac	aaggcaacga	catcctcatc	gttcaactcg	ctgattgtgt	7740
tctgcttcag	caaattgtcc	agttcgattt	gtgtgcgaga	cacgggaagt	tcactagtgg	7800
ctgtctttcc	ttctgctcgc	ttagtgacct	ttagagatgc	tttaattaag	actaatgagg	7860
catcactgtc	actgtcggtg	gtggtaggag	tgaacactct	ggtctgagga	gcttggagac	7920
ttgattgaat	ctgaggggtc	tggttctggg	cagcgttgaa	gctttcggcc	tggtcaagct	7980

caactggatc	aactgggtga	ctcgggagat	taggatcttt	gattcccagt	ctggcggcct	8040
tgaacagata	gctgttcaga	gcgacactta	gggcaagtgc	cacaaacacc	catttggaga	8100
ggacgggatc	ttccaggctg	gtgagcaggc	taccgaccat	ttttccacca	actccatact	8160
cgtgtagctg	cgaggtacca	cggtgaatgg	aaggatactc	tagttcgtac	ttgatggggg	8220
cgaggacagt	gaccatagtc	gattgaccgc	gccctcttgc	ctggaaaagt	agttcatcta	8280
gtccacttcc	agctaccttg	aagggctcaa	gcgggggttt	aatggccgat	ccgctcagac	8340
tttcggtcca	agatgatata	ctggacaacg	atccactaga	agaggcttgg	aaaagggtgg	8400
agccgatgtt	gacgaggttg	acgataagga	aaccaacgac	catccagaat	ttgaacttcg	8460
gaacactgct	gcctttcata	tcattgccaa	acagatatgt	acgtgcactg	tcttgggcat	8520
cattgctggt	cgcgacactc	tccgccgtcc	gctgactgag	accctcatct	tccaacgcgt	8580
accgcatgtt	gatatgacgt	ttgaggcggt	ttacctcgag	cttgatagac	agaatcgcag	8640
tgtagaatgt	aaacagcagc	agacagtcaa	agaacaggat	caatgcagct	agaacacaga	8700
agtgctgtag	cccaccttgg	atgcctaaga	cagcaccgat	aactaggagc	aggatctcga	8760
ccacgtagtg	gcacacgata	ttgtaaccct	tctcccgaat	ggcgcttcgt	acggcgtaat	8820
tgatggtact	ttcagcaatg	gctgtcacgc	taccctggtc	agactgtatc	ttctggggct	8880
ttcggtgctg	cacagcatag	gacaaaacag	ccctggtcag	agtgatgctc	ttctcaaagc	8940
caacgatcac	caccaagaag	gggaggcctt	cggatagcaa	cctcatgctc	atcggaaccc	9000
ctagtcttat	ggccacgtcg	agaccgagga	gaaaggcaaa	tgttgacgac	aaaaggacgc	9060
ttgtagccag	ccaaaccttc	gatcccaatt	ttttcatgct	gaggaagagt	gagacgaaag	9120
tcaagtgcat	tgatatataa	cctagcacca	tgacaaccac	gtcgagcgtt	tgagcgctct	9180
tgataagatc	aagagactct	gtccaggtat	cgtgcaccca	ttgagcaagg	ctgcgttttg	9240
tgtgagccct	ggcagccttc	atgatccaca	tctggcgttc	catctcgatc	aattgcgtct	9300
cctgcaattt	caggtcggca	ctgttgttgg	ggatttcttg	aacagcagcc	acgagttccg	9360
gcgcgctgct	gtattccaca	gagaaggcga	aaactttatc	tttcgaatag	gcggttaaag	9420
ggctcgacgt	tgagggaagg	tcaatcacag	ataggttcac	agggagggga	gcaaggaatg	9480
gtgaggctgc	ttgagatgca	accccatatg	accccgggaa	taccaaggtc	attagtgctt	9540
gatggttgaa	atctccgaga	acatctgcát	ccccgtcgaa	gctctgccac	ttccagccat	9600
tctgtgggcc	ggtgatcaag	cttcgacttc	cttcgaccaa	agagccccat	tctgctttat	9660
caacgtttgc	ggggccatgg	aagaagctgt	ctttgagtag	tccaacgtat	gtggtactag	9720
ctagaatagc	tatggtgcaa	acggtatgga	tcgggtgtag	acacgccgtt	ttggatagaa	9780

attggagtgt	ggaggtcaat	gcccgatttc	ccgagcgtag	agggtgctgc	tgattcattg	9840
attccctacc	gcgaaagcga	gagggtagca	acgaagcgac	catgctgaaa	ggtctgtgct	9900
acagcttgga	gtggtaccta	tagctaggta	gtctctgaga	aaagaatcta	gtcagctctg	9960
caaatgggga	cggaaaagca	cttcaattgg	gaattagggc	ttgagataaa	gtgcatacct	10020
ccaaaatcga	atgagcaacc	taatcggtta	ggcgcctagg	tataatctgc	cgtcgtagat	10080
tggaggaagg	ttgttcggcc	caaggggttg	ggagggacaa	ctgaacagtt	cctaggtacg	10140
ggaaatgagt	agaagaaaat	aacaaatggc	gcgcgcccct	gaggctgagg	cagcggaaag	10200
attcgcttcc	ttatccctgc	atctggtcca	cctttatgaa	tggattcatg	accggtgtca	10260
actgctgcct	agggtataat	tggtaagggg	taccaagcaa	aggatagtag	gaccaattgc	10320
actgaaaact	agtatttgtg	ctcataacta	.tgctcagttt	ccaaggtttt	tatgcataaa	10380
tttatccttt	attcgagaaa	aaagaattct	ggggacacca	atcaattgcc	ctgataccta	10440
ggaatgtgaa	cttccaagat	tgttccgaaa	gtaggccaaa	tgaccaataa	gacagaacac	10500
tacctaggta	tagttatttt	gtcatgccta	gatccgacat	acaaaggagc	gtcctcttac	10560
atagacgtcc	tgttagacgt	ttctaatctg	actcgtattg	tggtcctttt	ttggtggggc	10620
ggcaagctgc	atcgatcacg	cccggacgag	gccacttcgt	gaggaatgga	aatatattgt	10680
gcctacggag	taatgcacca	cgaaacacat	tcttctcgaa	acgactactt	acgcagggat	10740
gtatgggtat	tattctgtcc	acgaaaagcc	agtgtcaacc	cccccccccc	cccccccccc	10800
cggtatcatt	tatctcagta	aacagcaacc	tgaacaagat	acccaggtag	acaagaagtc	10860
agtttggagt	atagtgtata	gactcgggaa	cattttgtgt	ggacctccgt	acgtgtctct	10920
caaatcggcg	tctctcggtc	tttggatacc	ttcggagtta	cacggggctt	tgttgccaag	10980
gcttcaatat	tcggcgcatg	gattttcttt	gtgcatgggt	ctgagtgggg	tgccgtaagg	11040
tatggtattg	ctcccgattg	ggagttctga	cagatgatca	tgccgccttc	cgaagtagaa	11100
aaaagaggaa	agggtcacat	gctcatgatg	atcgtttgct	cgcgatgaat	tgcgcttcct	11160
gcatatattt	tgtttgcttg	tcttagtcaa	ccgataatgc	aaattttggg	gattgtgtat	11220
tgttggaaat	tgaattacca	actgcttaca	ggacccaccc	tgcgctcagg	ccctcaacaa	11280
accttgggac	aggattaccc	actaagcctt	tccaagcttt	tccaaggctt	ttggattcgt	11340
ttggtttgat	agctcgtatg	cgtatttcgc	atctgtgtac	ggagtatcgg	attctgacag	11400
cctccattat	acccgaaaac	tacctggccg	gcctgacctg	tttcgtcttg	ttcgacggtt	11460
tcccatcggc	gttttgactc	gggattatcg	tgacgacaga	caatgcctcc	cgaaccggta	11520
cctctaaggt	attgccccga	gcatagcatg	gtggtccggg	gtttcccatg	ggcacagagc	11580
gaatatcgtg	tcacgtccaa	gatgaaaaca	aaccccgaac	tatgaatcac	gtgtcggggg	11640

···· ··· ··· • · · · · · · · · · • · ··· · · · * · · ··♦

cagcttatgc	atctatagct	atgccaggga	cctgtagact	gttggaagac	tatcaacggt	11700
tttatcacca	gggcgactga	tatatcagtc	aatgaaacaa	cgttggaatg	aacaataccc	11760
ccgccgtaac	cgcaaccgca	accgcaaccg	caaccgcaac	cgcaatggca	ggctcggctt	11820
gctctaacac	atccacgccc	attgccatag	ttggaatggg	atgtcgattt	gctggagatg	11880
caacgagtcc	acagaagctt	tgggaaatgg	ttgaaagagg	aggcagtgcc	tggtctaagg	11940
tcccctcctc	gcgattcaat	gtgagaggag	tataccaccc	gaatggcgaa	agggtcgggt	12000
ccgtgagtat	ctaacatgca	tgcatttata	tcttgttttg	aatatttgac	acaagatttg	12060
agcatcactg	aagcttggtt	actgactcca	aggatgactg	gatagaccca	cgtaaagggt	12120
ggacacttca	tcgacgagga	tcctgcttta	tttgacgccg	cgttcttcaa	catgaccaca	12180
gaggtcgcca	gcgtatgatt	atttcaattg	atctaacccg	ggacgcagag	atctaatatt	12240
ggacagtgca	tggatccgca	gtatcggctt	atgcttgagg	tggtctacga	atcgctggag	12300
agtggtatgt	agtgtgggtc	atcctcactg	taagcaaacg	tcactgacca	tcatccagcc	12360
ggtatcacca	tcgatggtat	ggcaggctct	aatacgtcgg	tgtttggggg	tgtcatgtac	12420
cacgactatc	aggattcgct	caatcgtgac	cccgagacag	ttccgcgtta	tttcataact	12480
ggcaactcag	gaacaatgct	ttcgaaccgg	atatcacact	tctacgactt	acgtggtccc	12540
agcgtgacgg	ttgacacggc	ctgttcgacg	acattgaccg	cactgcactt	ggcgtgccag	12600
agcttacgta	ctggggagtc	agatacagcc	atcgttatcg	gtgcaaatct	tctgctcaat	12660
cccgatgttt	ttgttacgat	gtcaaacctg	gggtgagttt	tccgaagaag	attccagatc	12720
gagagtcttg	aactaagcaa	tccttgttgc	tcaatgacag	atttttgtcc	ccggatggta	12780
tctcgtactc	ttttgatcct	cgagcgaatg	gatatggtcg	cggggaagga	attgccgctc	12840
tggtaataaa	ggccctccct	aacgcgttgc	gagaccaaga	ccctatccga	gccgtcattc	12900
gagagacagc	gctgaaccag	gatggcaaaa	cacccgcaat	tactgcgccg	agtgatgtgg	12960
cgcagaaaag	tctgatccag	gagtgttacg	ataaggctgg	gctagatatg	tcgttgacct	13020
cgtacgtgga	ggcccacgga	actggaacac	caactggtga	cccccttgaa	atctcagcaa	13080
tttcagcagc	ttttaaagga	catcctctgc	accttggctc	tgtgaaagca	aatattggcc	13140
atacagaagc	cgccagtggc	ctggccagta	taatcaaggt	ggccttggcc	ttggagaagg	13200
gcttgattcc	ccctaatgcg	cggttcctgc	aaaagaacag	caagctgatg	cttgaccaaa	13260
agaacatcaa	ggtaaggctt	tgcgcattcg	cagattcagt	tatatgtttc	aaaggttaat	13320
gtttcaaaga	tccccatgtc	tgctcaagac	tggcctgtga	aagatgggac	tcgtcgcgca	13380
tctgtcaata	acttcggctt	tggtggttcg	aatgctcacg	tcattttgga	atcatatgat	13440

cgcgcatcat	tggccctgcc	agaggatcaa	gtgcatgtca	atggtaactc	tgagcatggt	13500
agggttgagg	atggttccaa	acagagccgc	atatacgttg	tgcgtgccaa	ggacgagcaa	13560
gcttgtcggc	gaacgatagc	aagcctgcga	gactacatta	aatccgtcgc	tgacattgac	13620
ggggaaccct	tcctcgccag	cctcgcctat	acactaggct	ctcgccgttc	cattctgcca	13680
tggacgtcag	tgtatgtagc	agacagcctt	ggcggccttg	tttctgccct	cagcgatgag	13740
tccaatcaac	caaaacgagc	gaatgagaaa	gtacggctcg	gatttgtatt	caccggtcag	13800
ggggcgcagt	ggcatgcaat	gggcagagag	ctggtcaata	cattcccagt	attcaaacag	13860
gcgattcttg	aatgtgatgg	ctacatcaag	caactgggcg	cgagttggaa	ttttatgggt	13920
aagttgcgag	cccgggaaaa	gtaatactgt	atcaagcttg	aggtactaac	attcaattgc	13980
acagaggagc	tccaccgtga	tgagctgacg	actcgggtaa	atgatgccga	atacagtcta	14040
ccactgtcaa	ccgctatcca	aattgcactt	gtgcgtctcc	tttggtcatg	gggaattcgg	14100
ccaacgggga	taaccagtca	ctcaagtgga	gaggctgctg	ctgcctacgc	agctggggct	14160
ttatccgcgc	ggtcggccat	tgggatcact	tatatacgcg	gtgtattgac	cactaagccc	14220
aagcccgcat	tggcagccaa	aggaggaatg	atggcggtgg	gtcttggtcg	cagtgagacc	14280
aatgtttaca	tttcgcgtct.	caaccaggag	gacggctgtg	tggtggttgg	atgtatcaac	14340
agtcaatgta	gtgtgacggt	gtcgggagat	ttgggtgcaa	tcgagaaact	tgaaaagttg	14400
ttacacgccg	atggcatctt	taccaggaaa	ctgaaagtca	ctgaagcctt	ccattcaagc	14460
cacatgcgac	caatggcaga	tgcctttggg	gcgtcactga	gagatctgtt	caactcggat	14520
aacaacaacg	acaatcccaa	tgctgacacc	tcaaagggtg	tattatattc	atcacctaag	14580
actggtagtc	gcatgaccga	tcttaaattg	ctattggatc	ccacacactg	gatggatagt	14640
atgctacagc	cggtagagtt	cgagtcctca	ctccgcgaga	tgtgctttga	tcccaacacc	14700
aaagagaaag	ccgtcgatgt	gattattgaa	atagggcctc	acggagcgct	tggtggtcca	14760
atcaaccaag	tcatgcagga	tctgggtctg	aaaggaacag	atataaacta	tctcagttgc	14820
ctttctcgcg	gcagaagctc	gttggagaca	atgtatcgtg	ctgctacgga	gttgataagc	14880
aagggttatg	ggctcaaaat	ggacgctata	aactttcctc	atggaagaaa	agagcccaga	14940
gtgaaggtac	tgagcgattt	gccggcgtac	ccgtggaatc	accaaacccg	ttattggaga	15000
gagcctcgcg	gcagtcgtga	gtccaaacag	agaacccatc	cgcctcacac	tttgataggc	15060
tcacgggaat	ctctctctcc	tcatttcgcg	cctaaatgga	aacatgttct	ccgtctgtca	15120
gatattccat	ggatacgaga	tcacgtcgtt	ggttcgagca	tcatctttcc	gggagctggc	15180
ttcatcagca	tggccatcga	ggggttttca	caagtctgcc	caccagttgc	gggggctagc	15240
atcaactaca	acttgcgtga	cgttgaactc	gcgcaggctc	tcataatacc	cgctgatgca	15300

gaágcagagg	ttgacctgcg	cctaacgatc	cgttcatgtg	aggaaaggtc	cctcggcaca	15360
aagaactggc	atcaattttc	tgtgcactca	atttcgggcg	aaaataatac	ctggacagaa	15420
cactgcaccg	gattaatacg	ttcggagagc	gaaagaagcc	accttgactg	ttcaactgtg	15480
gaagcctcac	gcaggttgaa	tctaggctca	gataaccgga	gcattgatcc	caacgatctc	15540
tgggagtcct	tacacgcgaa	tgggatatgc	cacggaccca	tttttcagaa	cattcagcga	15600
attcaaaaca	atggacaggg	ctcgttttgc	agattttcca	ttgctgacac	tgcctcggct	15660
atgcctcact	cgtacgagaa	tcgacacatc	gtccatccta	ctactctgga	ctcggtgatc	15720
caggcggcat	acacggtgtt	accctacgcg	ggaacacgta	tgaaaacggc	catggtacca	15780
aggaggctaa	gaaatgtcaa	aatatcctct	agcctggctg	acttggaggc	tggtgatgct	15840
ctggacgcac	aggccagcat	caaggatcgc	aactctcaat	ccttctctac	cgacttggca	15900
gtgtttgatg	actatgatag	cggttcttct	ccctcggacg	gaatcccagt	catagagatt	15960
gaaggccttg	ttttccagtc	ggttggaagc	agcttctctg	accaaaagtc	agactccaac	16020
gacacagaaa	atgcctgcag	ctcctgggtt	tgggcccctg	acatcagctt	gggtgactcc	16080
acttggctca	aagaaaagtt	gagcactgag	gctgagacga	aagaaacgga	actcatgatg	16140
gacctccgaa	gatgcacgat	caactttata	caggaggctg	tcactgattt	gacaaattct	16200
gatatccaac	atctggatgg	ccaccttcag	aagtatttcg	attggatgaa	tgtccaattg	16260
gaccttgcga	gacaaaacaa	gctcagccca	gccagttgcg	actggctaag	tgacgatgct	16320
gagcagaaga	aatgcctaca	ggccagagtc	gctggagaaa	gcgtcaatgg	cgagatgatt	16380
tctcgtctag	gacctcagtt	aatagcaatg	ctacgccgcg	aaacagagcc	acttgagttg	16440
atgatgcaag	atcagctgct	aagcagatac	tacgtcaacg	caatcaaatg	gagccgatca	16500
aacgcacaag	ccagcgagct	gatccgactt	tgcgcccaca	agaacccgcg	ttctcgcatt	16560
ttggagattg	gcggaggcac	gggcggctgc	acaaagctta	ttgtcaatgc	attgggaaac	16620
accaagccga	tcgatcgtta	tgacttcacc	gatgtgtctg	ccgggttttt	cgagtcggcg	16680
cgtgagcaat	ttgcggattg	gcaagacgtg	atgactttca	aaaaattgga	tattgaaagc	16740
gatcccgagc	aacaagggtt	tgaatgtgcc	acctacgatg	tggtcgtggc	ttgccaggtc	16800
ctgcatgcaa	ctcgatgcat	gaaacgaaca	ctgagtaacg	ttcgaaaatt	gctcaagcct	16860
gggggcaact	tgattttggt	tgagactacc	agggatcagc	tcgatttgtt	ctttaccttc	16920
ggactgttgc	caggttggtg	gctcagtgag	gagcctgagc	ggaagtcgac	gccatcgctc	16980
actaccgatc	tttggaacac	catgttggac	acgagcggtt	tcaacggtgt	ggaattggag	17040
gttcgtgatt	gtgaagacga	tgagttttac	atgatcagca	caatgctatc	gacggctaga	17100

aaagagaata	caaccccgga	tacagtggca	gaatcggagg	tgcttttgct	gcacggagcg	17160
ctccgacctc	cttcatcttg	gctggaaagt	ctccaggcag	caatttgtga	aaagaccagt	17220
tctagcccat	cgatcaacgc	tctgggcgag	gtagatacca	ctggaaggac	atgcattttt	17280
cttggggaaa	tggagtcctc	gctccttgga	gaggtgggaa	gcgagacctt	caaatccatc	17340
accgcgatgc	tgaataactg	caacgcactt	ctctgggtgt	ctagaggagc	agccatgagc	17400
tccgaggatc	catggaaagc	tctacatatt	ggtctgctgc	gtaccatccg	caacgaaaat	17460
aacgggaagg	aatatgtatc	gttggatctc	gatccttctc	gaaacgcata	cacccacgag	17520
tccctgtatg	ctatctgcaa	tatcttcaat	ggccgcctcg	gcgacctttc	cgaagacaag	17580
gagtttgaat	ttgcagagag	aaacggcgtc	atccacgtac	cgcgactttt	caatgacccg	17640
cactggaagg	accaagaagc	ggttgaggtc	acactgcagc	cgttcgagca	acccgggcgt	17700
cgtctgcgga	tggaggttga	gacgccaggg	ctcttagact	ccctgcaatt	tcgagacgac	17760
gaaggacgtg	aaggcaagga	tcttccggat	gattgggtag	aaatcgaacc	caaagctttc	17820
ggtctcaatt	ttcgggatgt	catggttgcc	atgggtcaat	tggaggccaa	ccgtgtgatg	17880
ggcttcgaat	gcgccggagt	gatcacaaag	ctcggtggag	ctgctgccgc	tagccaaggc	17940
ctcagattag	gggaccgcgt	atgtgcacta	ctgaaaggcc	attgggcgac	cagaacacag	18000
acgccgtaca	ctaatgtcgt	ccgtattccg	gacgaaatgg	gcttcccaga	agccgcttcg	18060
gtccccctgg	ctttcactac	cgcatatatt	gcgctttata	ccacggcaaa	gctacgacga	18120
ggcgaaagag	tcttgatcca	cagtggagct	ggaggcgtcg	gtcaagcagc	gatcattttg	18180
tcccagcttg	cgggtgccga	ggtcttcgtc	acagcgggaa	ctcaagccaa	gcgtgacttt	18240
gtcggcgata	aattcggcat	caatccggat	catatcttct	cgagcaggaa	tgacttattc	18300
gtcgacggca	tcaaagccta	cacgggcgga	cttggcgttc	atgtcgttct	aaactcattg	18360
gcaggtcaac	tcctccaagc	aagctttgac	tgcatggccg	aattcggcag	atttgttgag	18420
attggaaaaa	aggacctgga	gcaaaacagc	agacttgaca	tgctgccatt	cacccgggac	18480
gtctctttca	catcaattga	tcttctctcg	tggcaaagag	ccaaaagtga	agaagtatcc	18540
gaagcgttga	accatgtcac	aaaactcctc	gagacaaaag	cgattggctt	gattggtcca	18600
atccagcagc	actccttgtc	aaacatcgag	aaggccttcc	gtacgatgca	gagtggtcag	18660
catgttggca	aagttgtggt	caatgtatct	ggggacgaac	tggtcccagt	cggcgatgga	18720
gggttctcgc	tgaagctgaa	gcctgacagt	tcttacctag	ttgctggtgg	gctgggggga	18780
attggaaagc	agatctgtca	gtggcttgtt	gatcatggcg	cgaagcactt	gattatccta	18840
tcgagaagtg	caaaggccag	tccattcata	accagcttgc	aaaatcaaca	gtgcgctgtc	18900
tatctacacg	catgtgacat	ctcagatcaa	gatcaggtca	ccaaggtgct	ccggttgtgc	18960

gaágaagcac	atgcaccgcc	aattcgaggt	atcatacaag	gtgccatggt	tctcaaggac	19020
gcgcttctat	cgcgaatgac	attggatgaa	tttaatgcag	caacacgccc	aaaagtacag	19080
ggtagttggt	atcttcacaa	gatcgcacag	gatgttgact	tcttcgtgat	gctctcatcc	19140
cttgttgggg	tcatgggtgg	ggcaggccag	gccaattacg	cagctgctgg	tgcattccag	19200
gacgcacttg	cgcaccaccg	gagagcccat	ggcatgccgg	ctgtcaccat	tgacttgggc	19260
atggtcaagt	ctgttggata	cgtggctgaa	actggccgtg	gtgtggccga	ccggctcgct	19320
agaataggtt	acaagcctat	gcatgaaaag	gacgtcatgg	atgtgttgga	gaaggcaatc	19380
ctgtgttctt	cccctcaatt	tccatcacct	cccgcagctg	tggttacagg	aatcaacaca	19440
tccccgggtg	ctcactggac	cgaggcaaac	tggatacagg	aacagcggtt	tgtgggactt	19500
aaataccgcc	aagtccttca	tgcagaccaa	tcctttgtct	cttcgcataa	aaaaggacca	19560
gatggcgtgc	gggcccaact	aagcagggtc	acctctcacg	acgaggccat	ttctatcgtc	19620
ctcaaagcaa	tgacggaaaa	gctgatgcga	atgtttggtc	tggcagaaga	cgacatgtcc	19680
tcgtccaaaa	acctggcagg	tgtcggcgta	gactcactcg	tcgccattga	acttcgaaac	19740
tggatcacat	ctgaaatcca	tgttgatgtg	tcgatctttg	agctcatgaa	tggtaacacc	19800
atcgccggcc	tcgtcgagtt	agttgtggcg	aaatgcagtt	aagttgaagg	gttcagtgaa	19860
gccttttgtc	tggccaagcg	ggtatagctc	gacggaggta	tagtacgaag	gagcatagcg	19920
gccatggtct	gaagcctgaa	tccaatctga	atcgagcctg	ggctgagcct	gactatttaa	19980
tgcctgactt	ctggatagca	gtaaatagag	atacctgaaa	taccattaca	gtggccctga	20040
gaagcaacaa	agtacacatg	tgcactcgtt	ctcgaagtcg	gaagagtgaa	tgctttttat	20100
actaccaggg	aagctgtctt	agcacctcgg	aggcttgact	gtcaaaagtt	ctctcttttt	20160
ctctccatta	tgattcccgc	aagccttgta	aatgcgcgtt	gaacggtcga	aaggcgttgg	20220
cacgggcagt	gggtacagat	tgtggatatg	tagtcggaag	gcgggaggga	gtacttgtgt	20280
ccacgtcgtt	gcgccgtcct	ctctttcgcc	tagtcgggga	tgttgagtag	gaacatcaag	20340
acttaacaga	gcctaagccc	tcgtcatcgt	aagcgccagt	caacgcctga	gagaatgggg	20400
agatcggtga	ttgtaccggg	agaaaagctt	cattactgcc	gacttcccta	cgtggcggtg	20460
tagctggcgg	tatagaagca	gatggccgct	ctgcgtagca	ggaatacaca	ctctctccct	20520
tctctctctc	tgtgtttctg	tctctcgcac	atagccaaag	tctacaccac	gttcgattac	20580
aaagaaggca	tcacaatcga	ataaaatgcg	ttttatttta	ctaacctact	cgactaatac	20640
agcacctagt	ttctctggga	cggaaactat	tggaataagc	ctggggacgg	atgcatattt	20700
gttttagttt	gcgtgttata	tcttagcacc	ggtcatgagg	gagcgggatg	tcctcgttgc	20760

gccggcgtac	catgagcttt	gtggttggat	gcatacgaac	gctaaaagcg	tgacggtagt	20820
atttgtcatc	gtctcctggt	acaggcttca	catcatactg	aatcagtata	tgagcgagga	20880
gaatcttgat	ttccttcgag	gcgaagaacc	gcccgggaca	agcgcgtggg	ttccagccga	20940
agccgatgtg	atcaccgttg	gtattctcca	attgagcggt	gaaggccttg	tctggatcct	21000
cgcgcatgcg	cataaatcgg	tagggatcat	aattttcggg	gttttcccac	acatcagggt	21060
tgttcatgcg	gtctgcagcc	acagcggcca	actcgccctt	gggaatgaag	aggccattgg	21120
atagagtgat	gtctctgaga	gcggtactgc	gcatagtggc	gcactcgacc	ggcttgattc	21180
gctgcgtctc	tttcatgcag	ctgtcgagga	gcttcagctt	gaacagagag	gcaggcgtcc	21240
agcccccttc	tccgattaca	gtgcggatct	cttggcggag	aggctgaata	aggtctgggt	21300
gcctggcaat	gtccacaagg	gcaccgacga	aaagatccgt	cgaggcgtag	atgccggcga	21360
aatccatagc	gagctgagca	cccgccacat	cgtaccagcg	gccgtcggcg	gtgtcttcaa	21420
accattgcat	ggtatcgacg	tactggggcg	gctgcacgcc	cttcgctaca	catgcggcct	21480
tttcagcacg	tcgtcgctga	atctcaggat	caatgatctt	tcgtgcgcgg	cgcacttggt	21540
cacgcaattt	gcgtccttgc	ggttgaaacc	agtgagcgag	cggtcgcagt	agcatgggcc	21600
atacgcgaag	ttggcgagct	tgtaccgcca	cactcacggc	atggttcttt	gcaatatcca	21660
gccactcctc	attgtggcag	attttgtcgc	cgaccataat	gagtgtgact	gttcgtgtga	21720
caaggtccaa	tccattggaa	tagacaggtg	cggtttgcca	ctctagtata	ttcgcggtat	21780
gtcagccaga	ggctcaatgc	tcaagacaga	aaaattgaca	cttaccctcg	cttttaccga	21840
acaacttggc	aatagtagcg	tcggccaagg	tagccaatgg	ctttgtgtac	ttgggggctt	21900
gggtttgtaa	ctggttcaaa	acaactttgt	tgacaagatg	tgcatcctgg	cagatttcct	21960
tgaacccgtc	gaatccaggg	agatgagagt ·	gaaagtccta	tacattcatc	agaatcttag	22020
agacgtcatt	gagttacaac	aatggaaaat	tcagaggtca	tacatccgcc	aaaaacttgt	22080
acatgcacat	atctttgatt	ttccgaaact	cgtcggccat	ggacgatggg	aggatggtgc	22140
aatagccgga	atcaacaatg	aagcgcaggg	gcttgtcgtt	tttcgagaac	caagcttcga	22200
tccagctcgg	accatacgta	tcgaagtcct	gcctagccct	catggtcgtc	aactcccacc	22260
attttttggg	attatagact	tgcagttcgg	actggcgccc	ccgcaaacgg	taggcgatga	22320
gactaagaag	cactgcgacc	gccacaaggg	cttgaggggt	cgatacccat	tggtacgatt	22380
cgacggtcag	aagaacctgg	ccgagcattg	cgtgagacag	ataggaccta	tgcacaccag	22440
tggaaaagaa	gaaagagcga	agaatgagag	cgctgcgacg	gtttataatc	gaataacagc	22500
actaatgctt	ctgggatttt	gtggccgaga	gcactcttcc	agtcaacctt	gaaaaaaaaa	22560
aaaccccccc	cccaatcgaa	gtttacctgg	atggggcagt	tcggttgttt	cctttaggag	22620

cagcttcacc	gagcagcaca	agaacaatcc	gagtgaaaaa	ctcggtttca	ccttgataca	22680
gccaattgat	attcacgttt	gattcattca	gcctcgtgtg	accgaataac	gccgtatgga	22740
ggaatggcta	ttcgtgcacc	gaatgacgcc	gggagggttt	gctaggtgcc	gagcttgcat	22800
tgctgggaag	tgggggcatt	tgagtactag	aatggatctt	gaaattgtcc	gaatctagat	22860
gagtactgat	acgtgcaagt	aaatataacg	acggtatcgg	ttgcaaggcc	ggcttgttcg	22920
ctcagagatt	caactctgcg	attctgtaag	aacaaatgtt	gtgcccggca	tgcagtgaga	22980
agatctactg	acgcaagaca	aggtttaatc	ccaatcctat	cgcccaaaaa	caggatcagc	23040
agttatggat	caagccaact	atccaaacga	gccaattgtg	gtagtgggaa	gcggttgtcg	23100
gtttccaggt	ggtgtcaaca	caccatcaaa	actttgggag	ctgctcaaag	agccccggga	23160
tgtacagacc	aagatcccta	aggagagatt	tgacgtcgat	acattttaca	gccccgatgg	23220
cactcacccc	gggcgcacga	acgcaccctt	tgcatacttg	ctgcaggagg	atctacgcgg	23280
ttttgatgcc	tctttcttca	acatccaagc	tggagaggcc	gaaacgattg	acccacagca	23340
aaggctgctg	ctggagacgg	tctatgaagc	tgtatccaac	gcaggcctac	ggatccaagg	23400
ccttcaagga	tcctctactg	ctgtgtacgt	cggtatgatg	acgcatgact	atgagactat	23460
cgtgacgcgt	gaattggata	gtattcctac	atactctgcc	acgggggtag	ctgtcagtgt	23520
ggcctccaac	cgtgtatcat	acttcttcga	ctggcatggg	ccgagtgtga	gtgccactca	23580
ttgagcgagc	ccgacttcgt	caagtgctga	cagattcctg	actgattctg	cagatgacga	23640
tcgacacagc	ctgtagttca	tccttagctg	ccgtgcatct	ggccgtccaa	cagcttagaa	23700
cgggcgagag	taccatggcg	gttgcagccg	gtgcgaatct	gatattgggc	cccatgacct	23760
ttgtaatgga	gagcaaattg	aacatgctgt	cccccaatgg	tagatctcga	atgtgggatg	23820
ctgctgccga	tggatatgcc	agaggagtaa	gttgacaatg	catcaattcc	tttcaaaaaa	23880
agcaagatgg	cactgacctc	ctgtaactgc	tttttaggaa	ggtgtttgct	ctattgtcct	23940
gaaaacgctg	agccaggcac	tgcgcgacgg	ggacagtatc	gagtgtgtta	tccgagagac	24000
cggtatcaac	caagatggcc	gaacgacagg	tatcacaatg	ccaaaccata	gcgcacaaga	24060
agccctcatt	cgggccacat	atgccaaggc	tggtcttgat	attaccaacc	cccaggaacg	24120
ctgccagttc	tttgaagccc	atggtaagtg	gtattccctg	gaagtatcag	ccttatggaa	24180
gttgcagaaa	gtctctctct	ccctaacacg	aagatcccag	gaactggtac	accagccggt	24240
gacccacagg	aagctgaggc	tattgcaaca	gccttcttcg	gacacaagga	tggaacaatc	24300
gacagcgacg	gcgagaaaga	tgagcttttt	gtcggcagca	tcaagacagt	tctcggtcac	24360
acggaaggca	ctgctggtat	tgcgggctta	atgaaggcat	cgtttgctgt	acgaaatggc	24420

« ·

gtgatcccgc	caaacctgct	gtttgagaag	atcagtcccc	gtgtcgctcc	gttctatacg	24480
cacttgaaaa	ttgcaacgga	ggccacagaa	tggccgattg	ttgcgcccgg	gcagcctcgc	24540
agagtcagcg	ttaattcatt	tggtaaggat	tcaactgcac	ttcttgagaa	cgaaagtgaa	24600
gttagctaaa	catataaaca	catcaggatt	tggtggtaca	aatgcccatg	ctattatcga	24660
agagtatatg	gctcctccac	acaagccgac	agcagtggta	acagaggtga	cctcagatgc	24720
agatgcatgc	agcttgcccc	ttgtgctttc	atcgaagtcg	cagcgctcca	tgaaggcaac	24780
gctagaaaat	atgctccaat	ttctggaaac	gcatgatgac	gtggacatgc	atgatatcgc	24840
atatacctta	cttgagaaac	ggtctatctt	gcccttccgt	cgtgcgattg	cagcacacaa	24900
caaggaagta	gcccgcgcgg	cactggaggc	tgccatcgcg	gacggtgagg	tcgtcaccga	24960
cttccgcacc	gacgcgaatg	acaaccctcg	cgtactaggt	gtctttactg	gccaaggtgc	25020
acagtggccg	ggcatgctga	agaagctcat	ggtgggtatg	ccatttgtga	gaggcattct	25080
cgaagagctg	gataattcac	tgcaaacact	gcctgaaaag	tatcggccta	cgtggacact	25140
gtatgaccag	ctcatgcttg	aaggggatgc	ctcaaacgtc	agactcgcca	gcttctccca	25200
gcctctatgc	tgcgccgtac	aaatcgttct	ggtccgactt	ctcgctgcag	ctggtatcga	25260
gttcagtgca	attgtcggcc	acagttcagg	tgagattgcc	tgtgcctttg	cggcaggatt	25320
catcagtgcc	actcaagcta	tccgtattgc	gcatctgcgt	ggagttgtgt	ccgcggagca	25380
tgcctcttct	ccaagcggcc	agacaggcgc	tatgctagcg	gcaggtatgt	cgtacgatga	25440
cgcaaaggaa	ctatgcgagc	tcgaagcctt	tgagggtcgg	gtctgcgtcg	ccgctagcaa	25500
ttcaccggat	agtgtgacct	tctccggcga	catggatgct	atccagcacg	ttgaaggtgt	25560
cttggaggat	gaatccactt	ttgccagaat	cttgagagtt	gacaaggcct	accattcgca	25620
tcacatgcac	ccatgcgcag	ctccatatgt	caaggcattg	ctggagtgcg	actgtgctgt	25680
tgccgatggc	caaggtaacg	atagtgttgc	ttggttctct	gccgtccacg	agaccagcaa	25740
gcaaatgact	gtacaggatg	tgatgcccgc	ttattggaaa	gacaatctcg	tctctccggt	25800
cttgttctcg	caggctgtgc	agaaagcagt	catcactcat	cgtctaatcg	acgtcgccat	25860
cgaaattggc	gcccaccctg	ctctcaaggg	tccgtgtcta	gccaccatca	aggatgctct	25920
tgccggtgtg	gagctgccgt	ataccgggtg	cttggcacga	aacgttgacg	atgtggacgc	25980
ttttgctgga	ggtctgggat	acatttggga	gcgtttcgga	gttcggagta	tcgacgccga	26040
gggcttcgta	caacaagtcc	ggcccgatcg	tgccgttcaa	aacctgtcaa	agtcattgcc	26100
cacatactct	tgggatcata	ctcgtcaata	ctgggcagaa	tctcgctcca	cccgccagca	26160
tcttcgtgga	ggtgcgcccc	atcttctgct	tggaaagctt	tcttcttaca	gcacagcatc	26220
gaccttccag	tggacaaact	tcatcaggcc	ccgggatctg	gaatggctcg	acggtcatgc	26280

• ♦ « ·

gctacaaggc	cagactgtgt	tccccgctgc	tgggtacata	attatggcca	tggaagctgc	26340
catgaaggtg	gctggtgagc	gtgccgccca	agttcagctc	ctggaaatct	tggacatgag	26400
catcaacaaa	gccatcgtgt	ttgaagatga	aaacacctcc	gtggagctga	acttgacagc	26460
cgaagtcacc	agtgacaatg	atgcggatgg	ccaagtcacg	gtcaaatttg	ttattgattc	26520
ctgtctggca	aaggagagtg	agctttcgac	atccgccaaa	ggccaaatcg	tcataaccct	26580
tggcgaggca	tcaccgtcat	cgcagctttt	gccgccacct	gaggaagagt	acccccagat	26640
gaacaatgtc	aacatcgatt	tcttctatcg	ggaacttgac	ctccttgggt	atgactacag	26700
caaagacttc	cgtcgtttgc	agaccatgag	aagggccgac	tccaaagcta	gcggcacctt	26760
ggctttcctt	ccacttaagg	atgaattgcg	caatgagccc	ctcttgctcc	acccagcgcc	26820
cctggacatc	gcgttccaga	ctgtcattgg	agcgtattcc	tctccaggag	atcgtcgcct	26880
acgctcattg	tacgtgccta	ctcacgttga	cagagtgact	ctgattccat	cgctctgtat	26940
atcggcgggt	aattctggtg	aaaccgagct	tgcgtttgac	acaatcaaca	cacacgacaa	27000
gggtgatttc	ctgagcggcg	acatcacggt	gtacgattcg	accaagacaa	cgcttttcca	27060
agttgataac	attgtcttta	agcctttctc	tcccccgact	gcttcgaccg	accaccgaat	27120
cttcgcaaag	tgggtctggg	gacccctcac	gcccgaaaaa	ctgctggagg	accctgcgac	27180
gttgatcata	gctcgggaca	aggaggacat	tctgaccatc	gagcgaatcg	tttacttcta	27240
catcaaatcc	ttcctagccc	agataacccc	cgacgaccgt	caaaatgccg	acctccattc	27300
ccagaagtac	attgaatggt	gtgaccaggt	tcaggccgat	gctcgggctg	gccaccatca	27360
gtggtaccag	gagtcttggg	aggaggacac	ttctgttcac	attgagcaaa	tgtgtgaaag	27420
gtacacccaa	agctgttccg	tgttttttca	ttcttttata	ttaacctttt	acttgaagca	27480
actcgtccca	cccacatgtg	cgcctgatcc	aaagggtagg	caaagaatta	atttcaattg	27540
ttcgcgggaa	cggggatcct	ttggatatca	tgaaccgcga	tgggttgttc	accgagtact	27600
ataccaacaa	gctcgccttt	ggctcagcaa	tacacgtcgt	tcaggatctg	gttagccaaa	27660
ttgctcatcg	ctaccaatcc	attgatatcc	ttgagatcgg	taagtcgaat	ctgaaatgta	27720
agtaactagg	cagtttgcta	atctgtcgtt	cgctttttag	gcttgggtac	aggcatcgcc	27780
acgaagcgcg	ttcttgcatc	acctcaactt	ggtttcaaca	gttacacttg	cactgacatc	27840
tcggcggatg	ttattggcaa	ggcccgtgaa	caactttccg	aattcgacgg	tctcatgcag	27900
tttgaggcac	tagacatcaa	cagaagccca	gcagagcaag	gattcaagcc	tcactcctac	27960
gatctgatta	ttgcatccga	tgtcctccat	gccagctcca	acttcgagga	aaaattggct	28020
cacataaggt	ccttgctcaa	gccgggtggt	cacttggtta	ctttcggggt	cacccatcgc	28080

gagcctgctc	gcctcgcctt	catctctggg	cttttcgctg	atcgatggac	tggagaagac	28140
gaaactcgtg	ctttgagtgc	ctcggggtcc	gttgaccaat	gggagcatac	cctcaagaga	28200
gttgggttct	ctggcgtcga	tagtcggaca	cttgatcgag	aggatgattt	gatcccgtct	28260
gtcttcagta	cacatgctgt	ggatgccacc	gttgagcgtt	tgtatgatcc	actttctgct	28320
ccattgaagg	actcataccc	gccattagtg	gttatcggtg	gcgaatcgac	aaaaaccgaa	28380
cgcattttga	acgacatgaa	agctgcccta	ccgcatagac	acatccactc	cgtcaagcgg	28440
ctggaaagtg	ttctcgacga	cccggccttg	cagcctaagt	cgacttttgt	catcctctcg	28500
gaacttgatg	atgaagtgtt	ttgcaacctt	gaagaggaca	agtttgaggc	agtcaagtct	28560
cttctcttct	acgccggacg	catgatgtgg	ctgacagaga	atgcctggat	tgatcatccc	28620
caccaggcca	gcaccatcgg	aatgttgagg	acaatcaagc	tcgagaaccc	tgacttggga	28680
acgcacgtct	tcgatgtcga	tactgtggag	aacctagaca	ccaaattctt	cgttgagcaa	28740
cttttgcgct	tcgaggagag	cgatgatcag	cttttggaat	caataacatg	gactcatgag	28800
cccgaagtgt	actggtgcaa	gggtcgtgcc	tgggtccctc	gtttgaagca	ggatattgct	28860
aggaacgacc	gtatgaactc	gtctcgtcgt	ccaattttcg	gtaactttaa	ttcgtccaag	28920
acggccattg	cactgaaaga	ggcgagggga	gcatcctcat	cgatgtacta	tcttgagtca	28980
accgagacgt	gtgattcgtt	agaagacgct	cgtcatgctg	gaaaagcaac	tgttcgtgtt	29040
cgctacgctc	ttccccaggc	aattcgcgtg	ggccatctcg	gatacttcca	tgtcgtgcag	29100
ggcagtattc	tggagaatac	atgtgaggtg	cctgtagtcg	ccctggctga	gaagaatgga	29160
tctatactgc	atgtaccgag	aaactacatg	catagtctgc	ccgataacat	ggcggaaggc	29220
gaggatagtt	ccttcttgtt	gtccacagct	gcagccctcc	ttgccgaaac	aattctctct	29280
agcgctcagt	cctttggctc	tgatgcatca	attctgatta	tggagccccc	aatcttctgc	29340
gtcaaagcaa	ttctggagtc	ggccaaaacc	tacggtgttc	aggttcattt	ggcaacaact	29400
ctgtccgacg	tcaaaactat	tccggctcct	tggatccgat	tacatgccaa	ggaaaccgac	29460
gctcggctga	aacacagcct	gccgacaaac	atgatggcat	tctttgactt	gtctaccgac	29520
cggactgctg	ccgggataac	caaccgtttg	gccaagttgc	taccacccag	ttgcttcatg	29580
tacagtggtg	actatcttat	ccgaagtaca	gcttccacat	acaaagttag	tcatgttgag	29640
gatattccaa	tcctcgagca	ctctgtggca	atggcaaaaa	ataccgtctc	tgcgtcgact	29700
gtcgacgaca	ctgagaaagt	tattacagcc	acacaaattc	tcttgcctgg	tcagctctct	29760
gtcaaccaca	atgaccaacg	cttcaatctg	gccaccgtca	tcgactggaa	ggaaaatgag	29820
gtgtccgcta	ggatttgccc	catcgactct	ggtaacttat	tttccaacaa	gaagacgtat	29880
ttgcttgttg	gtcttaccgg	ggaccttggt	cgctctctct	gtcgctggat	gatcttgcat	29940

ggcgcccgcc	atgttgtgct	cactagccgg	aaccctcgac	ttgatcccaa	atggatcgcc	30000
aacatggagg	cacttggtgg	tgacatcacc	gttctgtcaa	tgtaagttga	ttgatatcac	30060
atcacacctt	gctaccacat	cctcgtttac	ttatccaatt	actttcttta	gggatgttgc	30120
caatgaggat	tcagtcgatg	ctggccttgg	caagcttgtc	gatatgaagt	tgccacctgt	30180
tgccggcatc	gcgttcgggc	ctttggtgct	gcaggatgtc	atgctgaaga	acatggacca	30240
ccagatgatg	gacatggtgt	tgaagcccaa	ggtacaagga	gcacgcattc	ttcatgaacg	30300
gttctccgaa	cagacgggca	gcaaggcgct	cgacttcttc	atcatgtttt	cgtccattgt	30360
tgcagttatt	ggcaatcctg	gccagtccaa	ctatggcgct	gcgaatgcct	acctacaggc	30420
tctggcccag	caacggtgcg	ccagaggatt	ggcggtattt	tctacccctg	aattatcatg	30480
catcgacgtc	aagttactaa	cgcacaacca	cagggatcaa	ccatcgatat	tggtgccgtt	30540
tacggtgtag	ggtttgtcac	gagggccgag	atggaggagg	actttgatgc	tatccgtttc	30600
atgtttgact	cagttgaaga	gcatgagctg	cacacgcttt	tcgccgaagc	ggtcgtgtct	30660
gaccagcgtg	cccggcagca	accacagcgc	aagacggtca	ttgacatggc	ggaccttgag	30720
cttaccacgg	gtatcccaga	tcttgaccct	gcgcttcaag	atcgaattat	ttacttcaac	30780
gaccctcgtt	tcggaaactt	caaaattccc	ggtcaacgcg	gagacggtgg	cgacaatgga	30840
tcagggtcta	aaggctccat	tgccgaccag	ctcaaacaag	caacaacttt	agaccaagtt	30900
cggcaaatcg	tgattggtaa	gttatctctc	atgcgtttcc	tgatatcgag	ttcaaactaa	30960
caaagttgca	gatggtctat	ctgagaaact	ccgtgttacc	ctccaagttt	cggacgggga	31020
gagcgtggac	ccaaccattc	ctctcattga	tcaaggtgtc	gactccttgg	gtgcagtgac	31080
tgtcggctca	tggttctcaa	agcaactcta	ccttgacctc	ccactcttga	gggtacttgg	31140
cggtgcttct	gtcgctgatc	ttgccgacga	cgcggccacc	cgactcccag	ctacatccat	31200
tccgctgctg	ttgcaaattg	gtgattccac	gggaacctcg	gacagcgggg	cttctccgac	31260
accaacagac	agccatgatg	aagcaagctc	tgctaccagc	acagatgcgt	cgtcagccga	31320
agaggatgaa	gagcaagagg	acgataatga	gcagggaggc	cgtaagattc	ttcgtcgcga	31380
gaggttgtcc	cttggccagg	agtattcctg	gaggcagcaa	caaatggtaa	aagatcatac	31440
catcttcaac	aacactattg	gcatgttcat	gaagggtacc	attgacctcg	accggttgag	31500
gcgggctctg	aaagcctcat	tgcgccgtca	cgagatcttc	cgtacgtgct	ttgttactgg	31560
cgatgactat	agcagcgatt	taaatggtcc	cgtccaagtg	gttctcaaga	acccggagaa	31620
cagagtgcac	tttgttcagg	tgaacaacgc	tgcggaggca	gaggaagagt	accggaaact	31680
cgagaagaca	aactatagca	tctccacagg	tgacactctc	agactcgttg	atttctactg	31740

gggcacagat	gaccacctgt	tggtaatcgg	ctaccacaga	ttagttggtg	atggctcaac	31800
aacagaaaac	ctgttcaatg	agatcgggca	gatttacagc	ggggtgaaaa	tgcagcgacc	31860
atcgacccaa	ttctctgatc	tagccgtcca	acagcgggaa	aacctggaaa	atgggcgaat	31920
gggggacgat	atcgcgttct	ggaagtccat	gcatagcaaa	gtctcgtcat	ctgcgccaac	31980
cgtgcttccc	atcatgaatc	tgatcaatga	ccctgctgcc	aattcagagc	agcagcaaat	32040
acagccattc	acgtggcagc	agtatgaagc	aattgctcgt	ttagatccca	tggtcgcctt	32100
ccgaatcaaa	gagcggagcc	gcaagcacaa	ggcaaccccc	atgcagttct	acctggccgc	32160
ctaccacgtt	ttgttggcgc	gtcttaccgg	cagcaaagac	ataaccatcg	gcctcgccga	32220
aaccaaccga	tccaccatgg	aagaaatttc	ggcgatgggc	tttttcgcta	acgtgcttcc	32280
cctgcgcttt	gatgagttcg	tcggcagcaa	gacattcggc	gagcaccttg	tagccaccaa	32340
ggacagtgtg	cgtgaggcca	tgcaacacgc	gcgggtgccg	tatggcgtca	tcctcgactg	32400
tctaggcctg	aatctcccta	cctcaggcga	ggaacccaag	actcagacac	acgccccctt	32460
gttccaggct	gtctttgatt	acaagcaggg	tcaagcggag	agtggctcaa	ttggcaatgc	32520
caaaatgacg	agtgttctcg	cttcccgtga	gcgcactcct	tatgacatcg	ttctcgagat	32580
gtgggatgac	cctaccaagg	acccactcat	tcatgtcaaa	cttcagagct	cgctgtatgg	32640
ccctgagcac	gctcaggcct	ttgtagacca	cttttcttca	atcctcacta	tgttctcgat	32700
gaacccggct	ctgaagttgg	cctagatcgt	tcagcgccgt	gaattcagat	gtgtggtttg	32760
agtgttgttc	atgataaaga	tggattagaa	attggcaata	gagcagatgg	caaatctatc	32820
ctgaattcgg	cgtcaattga	cacacgcata	ttcatctaca	aatagcgaat	tcgtcttgta	32880
tctttgtcaa	aattacttct	accttcgttg	ctcttcttta	ttgcagcaat	cgtaacatca	32940
agttagatag	cgcggttcag	agtaccgtaa	cggtgataaa	tatacctcgg	tagcgcgttt	33000
cgaaagactc	tgtgaggaag	gtgaaacctc	caaggcttgg	aattgatttc	aatccatcct	33060
gtatataaat	tcgacgccat	tgcaaatagt	tccatagtta	ctggtttagt	gccttgttgt	33120
ggtgatcgag	tggttttaga	tgtctgtcat	gcctgttcag	aacgagcctt	ccatgatcta	33180
tccaaaatat	gttcacgaaa	tatttatgag	atggtcgcga	ccactataac	taaatcaccc	33240
ttggaaggtg	agcattcaaa	ccgtgtaaga	ttagaactat	tcaaatttgt	tcagtaaaaa	33300
tgtggtatgg	actaggcatg	agagccagag	ccttgctata	taccctgttg	tctcacctag	33360
acaaatgaac	ctgacatctt	gaccttttga	tatagctgtt	ggaagcgctt	gaccgtctcc	33420
tggacatcac	tcggtctgtt	gggaaaatta	tgctttccct	gaaactcgag	tacatctgca	33480
ttctgaggca	ggtaatgtgt	ttcaaccatc	tgtctcgacc	cttggagagc	aaaatcttga	33540
cgaccgtgaa	gatgcagtgt	cggcacgttg	attattagct	tgtcgtcgtc	gtcttgcgcc	33600

tc^gctctca	tgtaatctct	ggcttcatcg	ctatagaaac	agcaaatcaa	aacagcaatg	33660
ctcattttcg	gaaaccatgg	cagttttccc	atttgctgtt	gatggagcag	caaagtggcg	33720
accaatgcgc	cctcagagaa	ggccactatg	ccgacaatgg	gtgcctgtgg	gttagttata	33780
gaccaatctt	ggacggtctt	ttgcacaggc	ccgatcacag	ccgctactct	atcgcccacc	33840
gtgggggttg	tcgtgtttgt	aacggcgtca	tgatgctttt	ggaaccaggt	gtagtatgga	33900
cccatgcctt	ggaagacagg	aagcacgccg	ggtccggggc	tggagctaaa	cggcgcggtc	33960
gcatatacga	attcaaactc	gtttttcaac	gccacgcgca	gtttagagat	ctggacgcgg	34020
aatatggctg	ctgagcaccc	ggcaccgtgg	atgcataaga	gagcttttct	cggtttgcct	34080
ggcgagaaat	ctgtaatcct	cgctggactc	attttctctt	gtggtgtgag	ctgtgacttc	34140
gtctgttctg	gggaatttgt	tagtcattac	tgacaaggaa	ataacaacga	cgtagtattg	34200

atc34203 <210>3 <211>17 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<221>	neurčená vlastnost
<223>	Popis umělé sekvence: Smíšený primer který obsahuje DNA sekvenci odvozenou z aminokyselinové sekvence PKS z Aspergillus flavus.

<220>

<221>	modifikovaná báze
<222>	(6)..(6)
<223>	i

<220>

<221>	modifikovaná báze
<222>	(9) .. (9)
<223>	i

»· « · · · · · · · • · · · · · * ···« ·· · ··«·· · · · ·« · ···· « · · ·· ··· · · ·« · · ··· <400> 3 gayacngcnt gyasttc

<210>	4
<211>	17
<212>	DNA
<213>	Umělá sekvence

<220>

<221>	modifikovaná báze
<222>	(3) . . (3)
<223>	i

<220>

<221>	modifikovaná báze
<222>	(6) . . (6)
<223>	i

<220>

<221>	modifikovaná báze
<222>	(8) . . (8)
<223>	i

<220>

<221>

modifikovaná báze

<222>	(15) . . (15)
<223>	i
<400> 4 tcnccnknrc wgtgncc
<210>	5
<211>	19
<212>	DNA
<213>	Penicillium citrinum

<400> 5
gcatgttcaa tttgctctc	19

<210>	6
<211>	19
<212>	DNA
<213>	Penicillium citrinum

<400> 6 ctggatcaga cttttctgc

<210>	7
<211>	18
<212>	DNA
<213>	Penicillium citrinum

<400> 7
gtcgcagtag catgggcc	18

<210>	8
<211>	20
<212>	DNA
<213>	Penicillium citrinum

	• 4 4 44 · • * · · < * · « » 4 · r « · • « 4 4 4 * - 4 4 * « · · 44 «44 »· 4
<400>	8
gtcagagtga tgctcttctc	20
<210>	9
<211>	20
<212>	DNA
<213>	Penicillium citrinum
<400>	9
gttgagagga ttgtgagggc	20
<210>	10
<211>	19
<212>	DNA
<213>	Penicillium citrinum
<400>	10
ttgcttgtgt tggattgtc	19
<210>	11
<211>	20
<212>	DNA
<213>	Penicillium citrinum
<400>	11
catggtactc tcgcccgttc	20
<210>	12
<211>	19
<212>	DNA
<213>	Penicillium citrinum
<400>	12
ctccccagta cgtaagctc	19

<210>	13
<211>	21
<212>	DNA
<213>	Penicillium citrinum
<400>	13
ccataatgag tgtgactgtt c	21

<210>	14
<211>	19
<212>	DNA
<213>	Penicillium citrinum
<400>	14
gaacatctgc atccccgtc	19

<210>	15
<211>	20
<212>	DNA
<213>	Penicillium citrinum
<400>	15
ggaaggcaaa gaaagtgtac	20

<210>	16
<211>	21
<212>	DNA
<213>	Penicillium citrinum
<400>	16
agattcattg ctgttggcat c	21

<210> 17 <211> 722 • · <212> DNA <213> Penicillium citrinum <400> 17 ggccacgcgt aactctgcga atcaagccaa gtggtgtcaa ccaagatccc ccgggcgcac cctctttctt tgctggagac gatcctctac gtgaattgga accgtgtatc gttcatcctt tg cgactagtac ttctgtttaa ctatccaaac cacaccatca taaggagaga gaacgcaccc caacatccaa ggtctatgaa tgctgtgtac tagtattcct atacttcttc agctgccgtg gggggggggg tcccaatcct gagccaattg aaactttggg tttgacgtcg tttgcatact gctggagagg gctgtatcca gtcggtatga acatactctg gactggcatg catctggccg gggggggggg atcgcccaaa tggtagtggg agctgctcaa atacatttta tgctgcagga ccgaaacgat acgcaggcct tgacgcatga ccacgggggt ggccgagtat tccaacagct gcttgttcgc aacaggatca aagcggttgt agagccccgg cagccccgat ggatctacgc tgacccacag acggatccaa ctatgagact agctgtcagt gacgatcgac tagaacgggc tcagagattc gcagttatgg cggtttccag gatgtacaga ggcactcacc ggttttgatg caaaggctgc ggccttcaag atcgtgacgc gtggcctcca acagcctgta gagagtacca

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

720

722 <210> 18 <211> 760 <212> DNA <213> Penicillium citrinum

<400> 18
ggccacgcgt	cgactagtac	gggggggggg	gggggggggg	gactatcaac	ggttttatca	60
ccagggcgac	tgatatatca	gtcaatgaaa	caacgttgga	atgaacaata	cccccgccgt	120
aaccgcaacc	gcaaccgcaa	ccgcaaccgc	aaccgcaatg	gcaggctcgg	cttgctctaa	180
cacatccacg	cccattgcca	tagttggaat	gggatgtcga	tttgctggag	atgcaacgag	240
tccacagaag	ctttgggaaa	tggttgaaag	aggaggcagt	gcctggtcta	aggtcccctc	300
ctcgcgattc	aatgtgagag	gagtatacca	cccgaatggc	gaaagggtcg	ggtccaccca	360
cgtaaagggt	ggacacttca	tcgacgagga	tcctgcttta	tttgacgccg	cgttcttcaa	420
catgaccaca	gaggtcgcca	gctgcatgga	tccgcagtat	cggcttatgc	ttgaggtggt	480

ctacgaatcg	ctggagagtg	ccggtatcac	catcgatggt	atggcaggct	ctaatacgtc	540
ggtgtttggg	ggtgtcatgt	accacgacta	tcaggattcg	ctcaatcgtg	accccgagac	600
agttccgcgt	tatttcataa	ctggcaactc	aggaacaatg	ctttcgaacc	ggatatcaca	660
cttctacgac	ttacgtggtc	ccagcgtgac	ggttgacacg	gcctgttcga	cgacattgac	720
cgcactgcac	ttggcgtgcc	agagcttacg	tactggggag			760

<210>	19
<211>	773
<212>	DNA
<213>	Penicillium citrinum

<400> 19 ggccacgcgt agtgctctcg cagcgctctc tcacgcaatg tcaagccctt ccagtccgaa taggcaggac caagcccctg cgacgagttt ctctcatctc caaagttgtt cttggccgac tgtctattcc cgactagtac gccacaaaat attcttcgct ctcggccagg gtggcggtcg ctgcaagtct ttcgatacgt cgcttcattg cggaaaatca cctggattcg ttgaaccagt gctactattg aatggattgg gggggggggg cccagaagca ctttcttctt ttcttctgac cagtgcttct ataatcccaa atggtccgag ttgattccgg aagatatgtg acgggttcaa tacaaaccca ccaagttgtt accttgtcac ggtttttttt ttagtgctgt ttccactggt cgtcgaatcg tagtctcatc aaaatggtgg ctggatcgaa ctattgcacc catgtacaag ggaaatctgc agcccccaag cggtaaaagc acgaacagtc ttttcaaggt tattcgatta gtgcataggt taccaatggg gcctaccgtt gagttgacga gcttggttct atcctcccat tttttggcgg caggatgcac tacacaaagc gaggagtggc acactcatta tgactggaag taaaccgtcg cctatctgtc tatcgacccc tgcgggggcg ccatgagggc cgaaaaacga cgtccatggc atgactttca atcttgtcaa cattggctac aaaccgcacc tgg

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

720

773

<210>	20
<211>	527
<212>	DNA
<213>	Penicillium citrinum
<400>	20

ggccacgcgt cgactagtac gggggggggg gtacctagga actgttcagt tgtccctccc 60

aaccccttgg	gccgaacaac	cttcctccaa	tctacgacgg	cagattatac	ctaggcgcct	120
aaccgattag	gttgctcatt	cgattttgga	gagactacct	agctataggt	accactccaa	180
gctgtagcac	agacctttca	gcatggtcgc	ttcgttgcta	ccctctcgct	ttcgcggtag	240
ggaatcaatg	aatcagcagc	accctctacg	ctcgggaaat	cgggcattga	cctccacact	300
ccaatttcta	tccaaaacgg	cgtgtctaca	cccgatccat	accgtttgca	ccatagctat	360
tctagctagt	accacatacg	ttggactact	caaagacagc	ttcttccatg	gccccgcaaa	420
cgttgataaa	gcagaatggg	gctctttggt	cgaaggaagt	cgaagcttga	tcaccggccc	480
acagaatggc	tggaagtggc	agagcttcga	cggggatgca	gatgttc		527

<210>	21
<211>	522
<212>	DNA
<213>	Penicillium citrinum

<400> 21

ggccacgcgt	cgactagtac	gggggggggg	gggggggggg	ggatccatca	atctgacttc	60
aggctagcgg	accttaacga	aacaacgaga	gcgagatcat	tcatacacca	aaacacaggt	120
actatagaag	cgccgcgcag	tagagattca	caccgcccct	tgaagcaaaa	gtcggaagga	180
attgcgcgat	gtcagaacct	ctacccccta	aagaagggga	accaaggcca	cagaaggaag	240
aaagtcaaaa	tgacacgctc	gaagcgactg	agtccaagtc	ccagcacatc	acaggcctca	300
agctcgggct	ggtggttgct	tcagttactt	tcgtagcatt	tttgatgctc	cttgatatgt	360
ccattatcgt	cacggcaatc	ccacatatca	caagcgagtt	ccactctctg	aacgatgtag	420
ggtggtacgg	cagtgcttat	cttctggcta	actgtgctct	ccagcccctg	gccggtaaat	480
tgtatacact	cttgggcttg	aagtacactt	tctttgcctt	cc		522

<210> 22 <211> 541 <212> DNA <213> Penicillium citrinum <400> 22 ggccacgcgt cgactagtac gggggggggg ggctcacctc acattatttg atcttaatcc • ·

aataattatg	tccctgccgc	atgcaacgat	tccgacgaac	ctacgccgtc	gcgcgtttcg	120
acgctcatgt	gaccggtgtc	atgcacaaaa	gctcaaatgt	accggtagca	atgccaattt	180
agtccgtgct	cagtgtcaac	gttgtcagca	agccggatta	aggtgtgtgt	acagcgaaag	240
gctacccaag	cgcaatttac	ataaagaagc	cgcagctgga	actacaagag	ccacagaaac	300
ctcacaaccg	atgaccgcga	catcttctac	ggtcttctca	tcattggcag	agactcctcc	360
accttactgc	tcaccaccta	cgcatattgg	cacctcggca	ctcaaggaaa	cattatcaga	420
accatcagcg	gcaaccctgc	aattctatga	tacatcaatc	aactttgatg	atcccgagtc	480
gtttcccggc	ggctggcctc	agccaaatac	atttcgcgac	gatgccaaca	gcaatgaatc	540
t						541

<210>	23
<211>	20
<212>	DNA
<213>	Penicillium	citrinum
<400> 23 atcataccat cttcaacaac
<210>	24
<211>	20
<212>	DNA
<213>	Penicillium	citrinum
<400> 24 gctagaatag gttacaagcc
<210>	25
<211>	20
<212>	DNA
<213>	Penicillium	citrinum
<400>	25

acattgccag gcacccagac

<210>	26
<211>	20
<212>	DNA
<213>	Penicillium citrinum
<400>	26

caacgcccaa gctgccaatc

<210>	27
<211>	20
<212>	DNA
<213>	Penicillium citrinum

<400> 27 gtcttttcct actatctacc

<210>	28
<211>	20
<212>	DNA
<213>	Penicillium citrinum

<400> 28 ctttcccagc tgctactatc

<210>	29
<211>	1524
<212>	DNA
<213>	Penicillium citrinum

<400> aactggaaga attcgcggcc gcaggaattt tttttttttt tttttttcaa cgaaggtaga agtaattttg acaaagatac aagacgaatt cgctatttgt agatgaatat gcgtgtgtca

120 attgaagccg aattcaggat agatttgcca tctgctctat tgccaatttc taatccatct

180 ttatcatgaa caacactcaa accacacatc tgaattcacg gcgctgaacg atctaggcca

240 acttcagagc cgggttcatc gagaacatag tgaggattga r cctgagcgtg ctcagggcca tacagcgagc tctgaagttt tggtagggtc atcccacatc tcgagaacga tgtcataagg gaacactcgt cattttggca ttgccaattg agccactctc caaagacagc ctggaacaag ggggcgtgtg tctgagtctt ggagattcag gcctagacag tcgaggatga cgccatacgg cctcacgcac actgtccttg gtggctacaa ggtgctcgcc actcatcaaa gcgcagggga agcacgttag cgaaaaagcc tggtggatcg gttggtttcg gcgaggccga tggttatgtc ccaacaaaac gtggtaggcg gccaggtaga actgcatggg tccgctcttt gattcggaag gcgaccatgg gatctaaacg gccacgtgaa tggctgtatt tgctgctgct ctgaattggc tcatgatggg aagcacggtt ggcgcagatg acgagacttt acgcgatatc gtcccccatt cgcccatttt ccaggttttc cagagaattg ggtcgatggt cgctgcattt tcaccccgct tgaacaggtt ttctgttgtt gagccatcac caactaatct ggtggtcatc tgtgccccag tagaaatcaa cgagtctgag tatagtttgt cttctcgagt ttccggtact cttcctctgc gaacaaagtg cactctgttc tccgggttct tgagaaccac cgctgctata gtcatcgcca gtaacaaagc acgtacggaa aggctttcag agcccgcctc aaccggtcga ggtcaatggt tagtgttgtt gaagatggta tgat <210>30 <211>784 <212> DNA <213> Penicillium citrinum <400>30 aactggaaga attcgcggcc gcaggaattt tttttttttt ctcagggcca ctgtaatggt atttcaggta tctctattta attaaatagt caggctcagc ccaggctcga ttcagattgg

	• · · • · · · • · ·	• · · · • · · • · · · ·	• • · · • ·
agaaaagtgg	tctacaaagg	300
gacatgaatg	agtgggtcct	360
agtgcgctca	cgggaagcga	420
cgcttgaccc	tgcttgtaat	480
gggttcctcg	cctgaggtag	540
cacccgcgcg	tgttgcatgg	600
gaatgtcttg	ctgccgacga	660
catcgccgaa	atttcttcca	720
tttgctgccg	gtaagacgcg	780
ggttgccttg	tgcttgcggc	840
agcaattgct	tcatactgct	900
agcagggtca	ttgatcagat	960
gctatgcatg	gacttccaga	1020
ccgctgttgg	acggctagat.	1080
gtaaatctgc	ccgatctcat	1140
gtggtagccg	attaccaaca	1200
agtgtcacct	gtggagatgc	1260
ctccgcagcg	ttgttcacct	1320
ttggacggga	ccatttaaat	1380
gatctcgtga	cggcgcaatg	1440
acccttcatg	aacatgccaa	1500
		1524
tttttttttc	tttgttgctt	60
ctgctatcca	gaagtcaggc	120
attcaggctt	cagaccatgg	180

• ·

ccgctatgct ccttcgtact atacctccgt cgagctatac ccgcttggcc agacaaaagg240 cttcactgaa cccttcaact taactgcatt tcgccacaac taactcgacg aggccggcga300 tggtgttacc attcatgagc tcaaagatcg acacatcaac atggatttca gatgtgatcc360 agtttcgaag ttcaatggcg acgagtgagt ctacgccgac acctgccagg tttttggacg420 aggacatgtc gtcttctgcc agaccaaaca ttcgcatcag cttttccgtc attgctttga480 ggacgataga aatggcctcg tcgtgagagg tgaccctgct tagttgggcc cgcacgccat540 ctggtccttt tttatgcgaa gagacaaagg attggtctgc atgaaggact tggcggtatt600 taagtcccac aaaccgctgt tcctgtatcc agtttgcctc ggtccagtga gcacccgggg660 atgtgttgat tcctgtaacc acagctgcgg gaggtgatgg aaattgaggg gaagaacaca720 ggattgcctt ctccaacaca tccatgacgt ccttttcatg cataggcttg taacctattc780 tagc784 <210>31 <211>764 <212> DNA <213> Penicillium citrinum <400> 31 aactggaaga attcgcggcc gcaggaattt tttttttttt tttttttttc gaataaaatg 60 cgttttattt tactaaccta ctcgactaat acagcaccta gtttctctgg gacggaaacc 120 attggaataa gcctggggac ggatgcatat ttgttttagt ttgcgtgtta tatcttagca 180 ccggtcatga gggagcggga tgtcctcgtt gcgccggcgt accatgagct ttgtggttgg 240 atgcatacga acgctaaaag cgtgacggta gtatttgtca tcgtctcctg gtacaggctt 300 cacatcatac tgaatcagta tatgagcgag gagaatcttg atttccttcg aggcgaagaa 360 ccgcccggga caagcgcgtg ggttccagcc gaagccgatg tgatcaccgt tggtattctc 420 caattgagcg gtgaaggcct tgtctggatc ctcgcgcatg cgcataaatc ggtagggatc 480 ataattttcg gggttttccc acacatcagg gttgttcatg cggtctgcag ccacagcggc 540 caactcgccc ttgggaatga agaggccatt ggatagagtg atgtctctga gagcggtact 600 gcgcatagtg gcgcactcga ccggcttgat tcgctgcgtc tctttcatgc agctgtcgag 660 gagcttcagc ttgaacagag aggcaggcgt ccagccccct tctccgatta cagtgcggat 720 ctcttggcgg agaggctgaa taaggtctgg gtgcctggca atgt 764

<210>	32
<211>	765
<212>	DNA
<213>	Penicillium citrinum
<400>	32

aactggaaga	attcgcggcc	gcaggaattt	tttttttttt	ttttttctgg	aaaaggacca	60
tctctttata	tattcttctt	ccctactact	tgcatcgtaa	atttcaacaa	catataaaca	120
tgagataccc	tttctggccg	ttcactctac	cacctgcctg	tctcattgca	ttgtgctttt	180
gaaaattatg	acaataacaa	ccaatgagaa	aaaatatgat	cctcctgcaa	tgaatccact	240
ggagggggta	cggagcttgg	aatgctccta	agattccgac	ctaatcagcg	tcgagcccga	300
tcagtagctg	cagcactcgg	cctcagtgca	ttgttaggaa	cagggactgt	cctggttccg	360
cctgacgggg	agacacttcg	agaaggggct	gaagatgccg	gggcagaacg	gttgtgcgcc	420
atgtgcgcct	tgaccaggtg	accggcggct	agggcagcac	atagcgagag	ctccccagcc	480
aaaacagcgc	ttccgatgat	gcgcgcaagt	tgacgtgcat	tctcaccggg	agtggtcggg	540
tgtgatccgc	ggacaccaag	catgtcaagc	attgcgccct	ggggctccag	aatcgtacca	600
ccgcccaacg	ttccaacctc	aatagacggc	atggagacag	agatttgaag	cgatccgcga	660
agattgttca	tgagagtgat	gcagttagcg	ctctccacaa	cttgcgccgg	atcctgacct	720
gtggcaatga	aaatggctgc	cgcaagattg	gcagcttggg	cgttg		765

<210>	33
<211>	802
<212>	DNA
<213>	Penicillium citrinum

<400> 33
aactggaaga	attcgcggcc	gcaggaattt	tttttttttt	tttttataga	atctttgaaa	60
tcgacattaa	ttaagtatgt	ggagattctt	tgtggaggca	cggtaatgtg	tctatctagc	120
aacgcggtca	agcatcagtc	tcaggcacag	cccgggtgtc	gtttttggtt	gcaatcttcc	180
gccatcccat	tccaaaggca	aacacaaacg	tgcacgccgt	agctcccact	gctaagtaaa	240
aagtatgatc	aacggcgaga	ctgtaagctt	ttacaacccc	tggaaggtta	ttcttgctga	300
ccacatctct	gaagccagtc	gcccctgctg	ccgtcacggc	ctgcgtgtcg	acagtgggcg	360

• « • ·

catacttgct	caggccagtt	ctcaaaccgg	acccaaagac	aaggttagca	aagtccagga	420
agagcgatcc	tccaaacgtc	tgtccaaaca	cggcgagaga	aattccgagg	gcaccttgtt	480
cgggcgaaag	cgtgctttgg	atggcgatga	taggcgtttg	catgccacaa	ccacgaccga	540
agcccgcgat	aaattggtac	atgacccatt	tcacagttga	tgtatggggc	tggaaggtgg	600
ataccagacc	tgcgcctatg	gcgacgagaa	cagcgctgcc	tagggcccaa	ggcaaatagt	660
atcctgtctt	tccaattgcg	aagccagaaa	ccatagccat	aatgacttgt	ccaagaattc	720
caggcaacat	gtacacacca	ctcagtgtgg	gagaaacatc	cttcacagcc	tggaagtaga	780
tcggtagata	gtaggaaaag	ac				802

<210>	34
<211>	562
<212>	DNA
<213>	Penicillium citrinum
<400>	34

aactggaaga	attcgcggcc	gcaggaattt	tttttttttt	ttttttttac	taagcaatat	60
tgtgtttctt	cgctaatgcg	aatatttcct	tatagcaacg	tcgcaacaca	tttatcgtct	120
tccctgaggc	ctttgttgac	ttgggctctt	cgtctccggc	ttcgtcactc	caaagcacag	180
ataggagacg	agaggccggc	gttatggttt	tattttcagc	gccaaggatt	tgccacgatg	240
tgcttggcat	atctgatagg	actagacgaa	tagatgccgc	agccccgtgc	tcctgtgcta	300
tccccaaagc	agtctcaatc	ccactcaata	gtcgaaggct	tacacgcaat	gtcgtgcatg	360
cagaagataa	ggcgtgcatg	aatgggtcga	gatgtgaaat	gagctcgccg	atatgaagat	420
tagagtgaaa	cgagggaagt	gcttcggctc	ttccattgtc	atttctagtg	gttgagccag	480
accagtacca	atccattcgt	gtgctttgct	tttgtccaca	aggttgggct	ttcatcacct	540
cggatagtag	cagctgggaa	ag				562

<210>	35
<211>	26
<212>	DNA
<213>	Penicillium citrinum
<400>	35

		• · 5 ·» • · · · · · • · « · ·
		• · · » · 4 · · » · · ·
gttaacatgt cagaacctct accccc	26
<210>	36
<211>	27
<212>	DNA
<213>	Penicillium citrinum

<400> 36 aatatttcaa gcatcagtct caggcac	27
<210>	37
<211>	1662
<212>	DNA
<213>	Penicillium citrinum
<220>
<221>	CDS
<222>	(1)..(1662)

<400> 37

atg Met 1

tca Ser

gaa Glu

cct Pro

cta Leu 5

ccc Pro

cct Pro

aaa Lys

gaa Glu

ggg Gly 10

gaa Glu

cca Pro

agg Arg

cca Pro

cag Gin 15

aag Lys

48

gaa

agt

caa

aat

gac

acg

ctc

gaa

gcg

act

gag

tcc

aag

tcc

cag

96

Glu

Ser

Gin

Asn

Asp

Thr

Leu

Glu

Ala

Thr

Glu

Ser

Lys

Ser

Gin

20

25

30

cac

atc

aca

ggc

ctc

aag

ctc

ggg

ctg

gtg

gtt

gct

tca

gtt

act

ttc

144

His

Ile

Thr

Gly

Leu

Lys

Leu

Gly

Leu

Val

Ala

Ser

Val

Thr

Phe

35

40

45

gta

gca

ttt

ttg

atg

ctc

ctt

gat

atg

tcc

att

atc

gtc

acg

gca

atc

192

Val

Ala

Phe

Leu

Met

Leu

Asp

Met

Ser

Ile

Val

Thr

Ala

Ile

50

55

60

cca

cat

atc

aca

agc

gag

ttc

cac

tet

ctg

aac

gat

gta

ggg

tgg

tac

240

Pro

His

Ile

Thr

Ser

Glu

Phe

His

Ser

Leu

Asn

Asp

Val

Gly

Trp

Tyr

65

70

75

80

ggc

agt

gct

tat

ctt

ctg

gct

aac

tgt

gct

ctc

cag

ccc

ctg

gcc

ggt

288

Gly

Ser

Ala

Tyr

Leu

Ala

Asn

Cys

Ala

Leu

Gin

Pro

Leu

Ala

Gly

85

90

95

aaa

ttg

tat

aca

ctc

ttg

ggc

ttg

aag

tac

act

ttc

ttt

gcc

ttc

ctc

336

* · · 4

Lys

Leu

Tyr Thr Leu 100

Leu

Gly

Leu

Lys 105

Tyr

Thr

Phe

Ala 110

Phe

Leu

tgt

att

ttt

gaa

cta

ggc

tcg

gtg

cta

tgc

ggt

gcc

gca

aga

tet

tcc

384

Cys

Ile

Phe

Glu

Leu

Gly

Ser

Val

Leu

Cys

Gly

Ala

Arg

Ser

115

120

125

acc

atg

ttg

att

gtt

ggg

cgg

gcc

gtt

get

gga

atg

gga

ggc

tea

ggt

432

Thr

Met

Leu

Ile

Val

Gly

Arg

Ala

Val

Ala

Gly

Met

Gly

Ser

Gly

130

135

140

ctt

gtc

aac

gga

gcc

ctc

aca

atc

ctc

tea

aca

get

cct

aag

cac

480

Leu

Val

Asn

Gly

Ala

Leu

Thr

Ile

Leu

Ser

Thr

Ala

Pro

Lys

His

145

150

155

160

aag

caa

cca

gtt

ttg

att

gga

gtg

atg

ggt

ctt

agt

cag

att

gcc

528

Lys

Gin

Pro

Val

Leu

Ile

Gly

Val

Met

Gly

Leu

Ser

Gin

Ile

Ala

165

170

175

att

gtc

tgt

gga

cca

ctg

ctc

gga

ggt

get

ttc

act

caa

cac

gcc

act

576

Ile

Val

Cys

Gly

Pro

Leu

Gly

Ala

Phe

Thr

Gin

His

Ala

Thr

180

185

190

tgg

ega

tgg

tgc

ttt

tat

atc

aat

ctc

ccc

atc

ggc

get

gtc

get

gca

624

Trp

Arg

Trp

Cys

Phe

Tyr

Ile

Asn

Leu

Pro

Ile

Gly

Ala

Val

Ala

195

200

205

ttc

ctc

ctt

ctc

gtc

atc

acc

ata

ccc

gac

ega

att

tea

tcc

acg

gac

672

Phe

Leu

Val

Ile

Thr

Ile

Pro

Asp

Arg

Ile

Ser

Thr

Asp

210

215

220

agc

gaa

ctc

tcg

acc

gac

aaa

cca

atg

gcc

aac

ata

aaa

tcc

aca

ctt

720

Ser

Glu

Leu

Ser

Thr

Asp

Lys

Pro

Met

Ala

Asn

Ile

Lys

Ser

Thr

Leu

225

230

235

240

cgc

aaa

ctg

gac

ctt

gta

ggc

ttt

gtg

gtc

ttt

gca

gcc

ttc

gca

acc

768

Arg

Lys

Leu

Asp

Leu

Val

Gly

Phe

Val

Phe

Ala

Phe

Ala

Thr

245

250

255

atg

att

tcc

ctc

gca

cta

gaa

tgg

gga

ggg

tcg

acc

tac

acc

tgg

ega

816

Met

Ile

Ser

Leu

Ala

Leu

Glu

Trp

Gly

Ser

Thr

Tyr

Thr

Trp

Arg

260

265

270

agt

tcc

gtc

atc

ggc

ctg

ttc

tgt

ggc

gga

ggg

ttt

get

ctg

att

864

Ser

Val

Ile

Gly

Leu

Phe

Cys

Gly

Phe

Ala

Leu

Ile

275

280

285

gcg

ttc

gtg

cta

tgg

gag

cgt

cat

gtt

ggc

gat

get

gtt

gcc

atg

att

912

Ala

Phe

Val

Leu

Trp

Glu

Arg

His

Val

Gly

Asp

Ala

Val

Ala

Met

Ile

290

295

300

cct

ggc

tea

gtg

get

ggt

aaa

ega

caa

gtg

tgg

tgc

tet

tgt

tta

ttt

960

Pro

Gly

Ser

Val

Ala

Gly

Lys

Arg

Gin

Val

Trp

Cys

Ser

Cys

Leu

Phe

305

310

315

320

atg

ggc

ttt

ttc

tet

ggc

tcc

ttg

ctt

gtc

ttt

tcc

tac

tat

cta

ccg

1008

Met

Gly

Phe

Ser

Gly

Ser

Leu

Val

Phe

Ser

Tyr

Leu

Pro

325

330

335

atc

tac

ttc

cag

get

gtg

aag

gat

gtt

tet

ccc

aca

ctg

agt

ggt

gtg

1056

Ile

Tyr

Phe

Gin

Ala

Val

Lys

Asp

Val

Ser

Pro

Thr

Leu

Ser

Gly

Val

340

345

350

tac Tyr

atg ttg cct

gga Gly

att Ile

ctt Leu

gga Gly 360

caa Gin

gtc Val

att Ile

atg gct

atg Met

gtt Val

tet Ser

1104

Met

Leu 355

Pro

Met

Ala 365

ggc

ttc

gca

att

gga

aag

aca

gga

tac

tat

ttg

cct

tgg

gcc

cta

ggc

1152

Gly

Phe

Ala

Ile

Gly

Lys

Thr

Gly

Tyr

Leu

Pro

Trp

Ala

Leu

Gly

370

375

380

agc

gct

gtt

ctc

gtc

gcc

ata

ggc

gca

ggt

ctg

gta

tcc

acc

ttc

cag

1200

Ser

Ala

Val

Leu

Val

Ala

Ile

Gly

Ala

Gly

Leu

Val

Ser

Thr

Phe

Gin

385

390

395

400

CCC

cat

aca

tca

act

gtg

aaa

tgg

gtc

atg

tac

caa

ttt

atc

gcg

ggc

1248

Pro

His

Thr

Ser

Thr

Val

Lys

Trp

Val

Met

Tyr

Gin

Phe

Ile

Ala

Gly

405

410

415

ttc

ggt

cgt

ggt

tgt

ggc

atg

caa

acg

cct

atc

gcc

atc

caa

agc

1296

Phe

Gly

Arg

Gly

Cys

Gly

Met

Gin

Thr

Pro

Ile

Ala

Ile

Gin

Ser

420

425

430

acg

ctt

tcg

CCC

gaa

caa

ggt

gcc

ctc

gga

att

tet

ctc

gcc

gtg

ttt

1344

Thr

Leu

Ser

Pro

Glu

Gin

Gly

Ala

Leu

Gly

Ile

Ser

Leu

Ala

Val

Phe

435

440

445

gga

cag

acg

ttt

gga

tcg

ctc

ttc

ctg

gac

ttt

gct

aac

ctt

gtc

1392

Gly

Gin

Thr

Phe

Gly

Ser

Leu

Phe

Leu

Asp

Phe

Ala

Asn

Leu

Val

450

455

460

ttt

ggg

tcc

ggt

ttg

aga

act

ggc

ctg

agc

aag

tat

gcg

CCC

act

gtc

1440

Phe

Gly

Ser

Gly

Leu

Arg

Thr

Gly

Leu

Ser

Lys

Tyr

Ala

Pro

Thr

Val

465

470

475

480

gac

acg

cag

gcc

gtg

acg

gca

ggg

gcg

act

ggc

ttc

aga

gat

gtg

1488

Asp

Thr

Gin

Ala

Val

Thr

Ala

Gly

Ala

Thr

Gly

Phe

Arg

Asp

Val

485

490

495

gtc

agc

aag

aat

aac

ctt

cca

ggg

gtt

gta

aaa

gct

tac

agt

ctc

gcc

1536

Val

Ser

Lys

Asn

Leu

Pro

Gly

Val

Lys

Ala

Tyr

Ser

Leu

Ala

500

505

510

gtt

gat

cat

act

ttt

tac

tta

gca

gtg

gga

gct

acg

gcg

tgc

acg

ttt

1584

Val

Asp

His

Thr

Phe

Tyr

Leu

Ala

Val

Gly

Ala

Thr

Ala

Cys

Thr

Phe

515

520

525

gtg

ttt

gcc

ttt

gga

atg

gga

tgg

cgg

aag

att

gca

acc

aaa

aac

gac

1632

Val

Phe

Ala

Phe

Gly

Met

Gly

Trp

Arg

Lys

Ile

Ala

Thr

Lys

Asn

Asp

530

535

540

acc

cgg

gct

gtg

cct

gag

act

gat

gct

tga

1662

Thr

Arg

Ala

Val

Pro

Glu

Thr

Asp

Ala

545

550

<210> 38

<211>	553
<212>	PRT

<213> Penicillium citrinum <400> 38

Met 1

Ser

Glu

Pro

Leu 5

Pro

Lys

Glu

Gly Glu 10

Pro

Arg

Pro

Gin 15

Lys

Glu

Ser

Gin

Asn

Asp

Thr

Leu

Glu

Ala

Thr

Glu

Ser

Lys

Ser

Gin

20

25

30

His

Ile

Thr

Gly

Leu

Lys

Leu

Gly

Leu

Val

Ala

Ser

Val

Thr

Phe

35

40

45

Val

Ala

Phe

Leu

Met

Leu

Asp

Met

Ser

Ile

Val

Thr

Ala

Ile

50

55

60

Pro

His

Ile

Thr

Ser

Glu

Phe

His

Ser

Leu

Asn

Asp

Val

Gly

Trp

Tyr

65

70

75

80

Gly

Ser

Ala

Tyr

Leu

Ala

Asn

Cys

Ala

Leu

Gin

Pro

Leu

Ala

Gly

85

90

95

Lys

Leu

Tyr

Thr

Leu

Gly

Leu

Lys

Tyr

Thr

Phe

Ala

Phe

Leu

100

105

110

Cys

Ile

Phe

Glu

Leu

Gly

Ser

Val

Leu

Cys

Gly

Ala

Arg

Ser

115

120

125

Thr

Met

Leu

Ile

Val

Gly

Arg

Ala

Val

Ala

Gly

Met

Gly

Ser

Gly

130

135

140

Leu

Val

Asn

Gly

Ala

Leu

Thr

Ile

Leu

Ser

Thr

Ala

Pro

Lys

His

145

150

155

160

Lys

Gin

Pro

Val

Leu

Ile

Gly

Val

Met

Gly

Leu

Ser

Gin

Ile

Ala

165

170

175

Ile

Val

Cys

Gly

Pro

Leu

Gly

Ala

Phe

Thr

Gin

His

Ala

Thr

180

185

190

Trp

Arg

Trp

Cys

Phe

Tyr

Ile

Asn

Leu

Pro

Ile

Gly

Ala

Val

Ala

195

200

205

Phe

Leu

Val

Ile

Thr

Ile

Pro

Asp

Arg

Ile

Ser

Thr

Asp

210

215

220

Ser 225

Glu Leu

Ser

Thr

Asp 230

Lys

Pro Met Ala

Asn 235

Ile

Lys

Ser

Thr

Leu 240

Arg

Lys

Leu

Asp

Leu

Val

Gly

Phe

Val

Phe

Ala

Phe

Ala

Thr

245

250

255

Met

Ile

Ser

Leu

Ala

Leu

Glu

Trp

Gly

Ser

Thr

Tyr

Thr

Trp

Arg

260

265

270

Ser

Val

Ile

Gly

Leu

Phe

Cys

Gly

Phe

Ala

Leu

Ile

275

280

285

Ala

Phe

Val

Leu

Trp

Glu

Arg

His

Val

Gly

Asp

Ala

Val

Ala

Met

Ile

290

295

300

Pro

Gly

Ser

Val

Ala

Gly

Lys

Arg

Gin

Val

Trp

Cys

Ser

Cys

Leu

Phe

305

310

315

320

Met

Gly

Phe

Ser

Gly

Ser

Leu

Val

Phe

Ser

Tyr

Leu

Pro

325

330

335

Ile

Tyr

Phe

Gin

Ala

Val

Lys

Asp

Val

Ser

Pro

Thr

Leu

Ser

Gly

Val

340

345

350

Tyr

Met

Leu

Pro

Gly

Ile

Leu

Gly

Gin

Val

Ile

Met

Ala

Met

Val

Ser

355

360

365

Gly

Phe

Ala

Ile

Gly

Lys

Thr

Gly

Tyr

Leu

Pro

Trp

Ala

Leu

Gly

370

375

380

Ser

Ala

Val

Leu

Val

Ala

Ile

Gly

Ala

Gly

Leu

Val

Ser

Thr

Phe

Gin

385

390

395

400

Pro

His

Thr

Ser

Thr

Val

Lys

Trp

Val

Met

Tyr

Gin

Phe

Ile

Ala

Gly

405

410

415

Phe

Gly

Arg

Gly

Cys

Gly

Met

Gin

Thr

Pro

Ile

Ala

Ile

Gin

Ser

420

425

430

Thr

Leu

Ser

Pro

Glu

Gin

Gly

Ala

Leu

Gly

Ile

Ser

Leu

Ala

Val

Phe

435

440

445

Gly

Gin

Thr

Phe

Gly

Ser

Leu

Phe

Leu

Asp

Phe

Ala

Asn

Leu

Val

450

455

460

Phe 4 65

Gly Ser Gly

Leu Arg 470

Thr Gly

Leu Ser

Lys 475

Tyr

Ala

Pro

Thr

Val 480

Asp

Thr

Gin

Ala

Val

Thr

Ala

Gly

Ala

Thr

Gly

Phe

Arg

Asp

Val

485

490

495

Val

Ser

Lys

Asn

Leu

Pro

Gly

Val

Lys

Ala

Tyr

Ser

Leu

Ala

500

505

510

Val

Asp

His

Thr

Phe

Tyr

Leu

Ala

Val

Gly

Ala

Thr

Ala

Cys

Thr

Phe

515

520

525

Val

Phe

Ala

Phe

Gly

Met

Gly

Trp

Arg

Lys

Ile

Ala

Thr

Lys

Asn

Asp

530

535

540

Thr

Arg

Ala

Val

Pro

Glu

Thr

Asp

Ala

545

550

<210> 39 <211> 31 <212> DNA <213> Penicillium citrinum <400> 39

ggatccatgt ccctgccgca tgcaacgatt c	31
<210>	40
<211>	30
<212>	DNA
<213>	Penicillium citrinum
<400> 40 ggatccctaa gcaatattgt gtttcttcgc	30
<210>	41
<211>	1380
<212>	DNA
<213>	Penicillium citrinum

<220>

<221> CDS <222> (1)..(1380) <400> 41

atg Met 1

tcc Ser

ctg Leu

ccg Pro

cat His 5

gca Ala

acg Thr

att Ile

ccg Pro

acg Thr 10

aac Asn

cta Leu

ege Arg

cgt Arg

ege Arg 15

gcg Ala

48

ttt

ega

ege

tea

tgt

gac

cgg

tgt

cat

gca

caa

aag

ctc

aaa

tgt

acc

96

Phe

Arg

Ser

Cys

Asp

Arg

Cys

His

Ala

Gin

Lys

Leu

Lys

Cys

Thr

20

25

30

ggt

age

aat

gcc

aat

tta

gtc

cgt

get

cag

tgt

caa

cgt

tgt

caa

144

Gly

Ser

Asn

Ala

Asn

Leu

Val

Arg

Ala

Gin

Cys

Gin

Arg

Cys

Gin

35

40

45

gcc

gga

tta

agg

tgt

gtg

tac

age

gaa

agg

cta

ccc

aag

ege

aat

tta

192

Ala

Gly

Leu

Arg

Cys

Val

Tyr

Ser

Glu

Arg

Leu

Pro

Lys

Arg

Asn

Leu

50

55

60

cat

aaa

gaa

gcc

gca

get

gga

act

aca

aga

gcc

aca

gaa

acc

tea

caa

240

His

Lys

Glu

Ala

Gly

Thr

Arg

Ala

Thr

Glu

Thr

Ser

Gin

65

70

75

80

ccg

atg

acc

gcg

aca

tet

acg

gtc

ttc

tea

ttg

gca

gag

act

288

Pro

Met

Thr

Ala

Thr

Ser

Thr

Val

Phe

Ser

Leu

Ala

Glu

Thr

85

90

95

cct

cca

cct

tac

tgc

tea

cca

cct

acg

cat

att

ggc

acc

tcg

gca

ctc

336

Pro

Tyr

Cys

Ser

Pro

Thr

His

Ile

Gly

Thr

Ser

Ala

Leu

100

105

110

aag

gaa

aca

tta

tea

gaa

cca

tea

gcg

gca

acc

ctg

caa

ttc

tat

gat

384

Lys

Glu

Thr

Leu

Ser

Glu

Pro

Ser

Ala

Thr

Leu

Gin

Phe

Tyr

Asp

115

120

125

aca

tea

atc

aac

ttt

gat

ccc

gag

tcg

ttt

ccc

ggc

tgg

cct

432

Thr

Ser

Ile

Asn

Phe

Asp

Pro

Glu

Ser

Phe

Pro

Gly

Trp

Pro

130

135

140

cag

cca

aat

aca

ttt

ege

gac

gat

gcc

aac

age

aat

gaa

tet

tcg

ggg

480

Gin

Pro

Asn

Thr

Phe

Arg

Asp

Ala

Asn

Ser

Asn

Glu

Ser

Gly

145

150

155

160

ata

cca

gat

cta

ggc

tac

gac

ttt

gaa

ggc

cct

ttg

gat

gca

acg

gcg

528

Ile

Pro

Asp

Leu

Gly

Tyr

Asp

Phe

Glu

Gly

Pro

Leu

Asp

Ala

Thr

Ala

165

170

175

cct

gtc

tcg

cca

tcg

ctg

ttt

gac

ctc

gaa

gta

gag

ggg

aac

tcg

tea

576

Pro

Val

Ser

Pro

Ser

Leu

Phe

Asp

Leu

Glu

Val

Glu

Gly

Asn

Ser

180

185

190

tcc

gga

caa

tcc

aac

aca

age

aac

acg

caa

ega

gac

ctt

ttc

gaa

agt

624

Ser

Gly

Gin

Ser

Asn

Thr

Ser

Asn

Thr

Gin

Arg

Asp

Leu

Phe

Glu

Ser

195

200

205

ctg Leu

tcg Ser 210

gat Asp

gtg Val

tca Ser

cag Gin

gac Asp 215

cta Leu

gag Glu

gta Val

ata Ile

ctc Leu 220

cac His

ggg Gly

gtg Val

act Thr

672

gtg

gaa

tgg

ccc

aag

caa

aaa

att

tta

age

tac

ccg

ata

ggg

gac

ttt

720

Val

Glu

Trp

Pro

Lys

Gin

Lys

Ile

Leu

Ser

Tyr

Pro

Ile

Gly

Asp

Phe

225

230

235

240

ttg

aat

gcc

ttt

ggt

aga

ttg

cta

cat

ctt

caa

gaa

cgt

gtg

atc

768

Leu

Asn

Ala

Phe

Gly

Arg

Leu

His

Leu

Gin

Glu

Arg

Val

Ile

245

250

255

acg

age

aat

age

atg

tta

gat

ggg

tgt

ctg

caa

acc

aag

aac

816

Thr

Ser

Asn

Ser

Met

Leu

Asp

Gly

Cys

Leu

Gin

Thr

Lys

Asn

260

265

270

ttg

ttc

atg

gcg

gtg

cat

tgc

tac

atg

ttg

tet

gtc

aaa

atc

atg

aca

864

Leu

Phe

Met

Ala

Val

His

Cys

Tyr

Met

Leu

Ser

Val

Lys

Ile

Met

Thr

275

280

285

tca

ctt

tcc

cag

ctg

cta

tcc

gag

gtg

atg

aaa

gcc

caa

cct

tgt

912

Ser

Leu

Ser

Gin

Leu

Ser

Glu

Val

Met

Lys

Ala

Gin

Pro

Cys

290

295

300

gga

caa

aag

caa

age

aca

ega

atg

gat

tgg

tac

tgg

tet

ggc

tca

acc

960

Gly

Gin

Lys

Gin

Ser

Thr

Arg

Met

Asp

Trp

Tyr

Trp

Ser

Gly

Ser

Thr

305

310

315

320

act

aga

aat

gac

aat

gga

aga

gcc

gaa

gca

ctt

ccc

tcg

ttt

cac

tet

1008

Thr

Arg

Asn

Asp

Asn

Gly

Arg

Ala

Glu

Ala

Leu

Pro

Ser

Phe

His

Ser

325

330

335

aat

ctt

cat

atc

ggc

gag

ctc

att

tca

cat

ctc

gac

cca

ttc

atg

cac

1056

Asn

Leu

His

Ile

Gly

Glu

Leu

Ile

Ser

His

Leu

Asp

Pro

Phe

Met

His

340

345

350

gcc

tta

tet

gca

tgc

acg

aca

ttg

cgt

gta

age

ctt

ega

cta

ttg

1104

Ala

Leu

Ser

Ala

Cys

Thr

Leu

Arg

Val

Ser

Leu

Arg

Leu

355

360

365

agt

gag

att

gag

act

gct

ttg

ggg

ata

gca

cag

gag

cac

ggg

gct

gcg

1152

Ser

Glu

Ile

Glu

Thr

Ala

Leu

Gly

Ile

Ala

Gin

Glu

His

Gly

Ala

370

375

380

gca

tet

att

cgt

cta

gtc

cta

tca

gat

atg

cca

age

aca

tcg

tgg

caa

1200

Ala

Ser

Ile

Arg

Leu

Val

Leu

Ser

Asp

Met

Pro

Ser

Thr

Ser

Trp

Gin

385

390

395

400

atc

ctt

ggc

gct

gaa

aat

aaa

acc

ata

acg

ccg

gcc

tet

cgt

ctc

cta

1248

Ile

Leu

Gly

Ala

Glu

Asn

Lys

Thr

Ile

Thr

Pro

Ala

Ser

Arg

Leu

405

410

415

tet

gtg

ctt

tgg

agt

gac

gaa

gcc

gga

gac

gaa

gag

ccc

aag

tca

aca

1296

Ser

Val

Leu

Trp

Ser

Asp

Glu

Ala

Gly

Asp

Glu

Pro

Lys

Ser

Thr

420

425

430

aag

gcc

tca

ggg

aag

acg

ata

aat

gtg

ttg

ega

cgt

tgc

tat

aag

gaa

1344

Lys

Ala

Ser

Gly

Lys

Thr

Ile

Asn

Val

Leu

Arg

Cys

Tyr

Lys

Glu

435

440

445

ata	ttc	gca	tta	gcg	aag	aaa	cac	aat	att	gct tag	1380
Ile	Phe	Ala	Leu	Ala	Lys	Lys	His	Asn	Ile	Ala
	450					455

<210>	42
<211>	459
<212>	PRT
<213>	Penicillium citrinum
<400>	42

Met 1

Ser Leu

Pro

His 5

Ala

Thr

Ile

Pro

Thr 10

Asn

Leu

Arg Arg

Arg 15

Ala

Phe

Arg

Ser

Cys

Asp

Arg

Cys

His

Ala

Gin

Lys

Leu

Lys

Cys

Thr

20

25

30

Gly

Ser

Asn

Ala

Asn

Leu

Val

Arg

Ala

Gin

Cys

Gin

Arg

Cys

Gin

35

40

45

Ala

Gly

Leu

Arg

Cys

Val

Tyr

Ser

Glu

Arg

Leu

Pro

Lys

Arg

Asn

Leu

50

55

60

His

Lys

Glu

Ala

Gly

Thr

Arg

Ala

Thr

Glu

Thr

Ser

Gin

65

70

75

80

Pro

Met

Thr

Ala

Thr

Ser

Thr

Val

Phe

Ser

Leu

Ala

Glu

Thr

85

90

95

Pro

Tyr

Cys

Ser

Pro

Thr

His

Ile

Gly

Thr

Ser

Ala

Leu

100

105

110

Lys

Glu

Thr

Leu

Ser

Glu

Pro

Ser

Ala

Thr

Leu

Gin

Phe

Tyr

Asp

115

120

125

Thr

Ser

Ile

Asn

Phe

Asp

Pro

Glu

Ser

Phe

Pro

Gly

Trp

Pro

130

135

140

Gin

Pro

Asn

Thr

Phe

Arg

Asp

Ala

Asn

Ser

Asn

Glu

Ser

Gly

145

150

155

160

Ile

Pro

Asp

Leu

Gly

Tyr

Asp

Phe

Glu

Gly

Pro

Leu

Asp

Ala

Thr

Ala

165

170

175

Pro

Val

Ser

Pro 180

Ser Leu

Phe

Asp Leu Glu 185

Val

Glu

Gly

Asn 190

Ser

Gly

Gin

Ser

Asn

Thr

Ser

Asn

Thr

Gin

Arg

Asp

Leu

Phe

Glu

Ser

195

200

205

Leu

Ser

Asp

Val

Ser

Gin

Asp

Leu

Glu

Val

Ile

Leu

His

Gly

Val

Thr

210

215

220

Val

Glu

Trp

Pro

Lys

Gin

Lys

Ile

Leu

Ser

Tyr

Pro

Ile

Gly

Asp

Phe

225

230

235

240

Leu

Asn

Ala

Phe

Gly

Arg

Leu

His

Leu

Gin

Glu

Arg

Val

Ile

245

250

255

Thr

Ser

Asn

Ser

Met

Leu

Asp

Gly

Cys

Leu

Gin

Thr

Lys

Asn

260

265

270

Leu

Phe

Met

Ala

Val

His

Cys

Tyr

Met

Leu

Ser

Val

Lys

Ile

Met

Thr

275

280

285

Ser

Leu

Ser

Gin

Leu

Ser

Glu

Val

Met

Lys

Ala

Gin

Pro

Cys

290

295

300

Gly

Gin

Lys

Gin

Ser

Thr

Arg

Met

Asp

Trp

Tyr

Trp

Ser

Gly

Ser

Thr

305

310

315

320

Thr

Arg

Asn

Asp

Asn

Gly

Arg

Ala

Glu

Ala

Leu

Pro

Ser

Phe

His

Ser

325

330

335

Asn

Leu

His

Ile

Gly

Glu

Leu

Ile

Ser

His

Leu

Asp

Pro

Phe

Met

His

340

345

350

Ala

Leu

Ser

Ala

Cys

Thr

Leu

Arg

Val

Ser

Leu

Arg

Leu

355

360

365

Ser

Glu

Ile

Glu

Thr

Ala

Leu

Gly

Ile

Ala

Gin

Glu

His

Gly

Ala

370

375

380

Ala

Ser

Ile

Arg

Leu

Val

Leu

Ser

Asp

Met

Pro

Ser

Thr

Ser

Trp

Gin

385

390

395

400

Ile

Leu

Gly

Ala

Glu

Asn

Lys

Thr

Ile

Thr

Pro

Ala

Ser

Arg

Leu

405

410

415

Sep

Val

Leu

Trp Ser Asp Glu Ala Gly Asp Glu Glu Pro Lys

Ser Thr

420

425

430

Lys

Ala

Ser

Gly

Lys

Thr

Ile

Asn

Val

Leu

Arg

Cys

Tyr

Lys

Glu

435

440

445

Ile

Phe

Ala

Leu

Ala

Lys

His

Asn

Ile

Ala

450

455

<210> 43 <211> 9099 <212> DNA <213> Penicillium citrinum <220>

<221> CDS <222> (1)..(9099)

<400> 43

48

atg Met 1

gat Asp

caa Gin

gcc Ala

aac Asn 5

tat Tyr

cca Pro

aac Asn

gag Glu

cca Pro 10

att Ile

gtg Val

gta Val

gtg Val

gga Gly 15

age Ser

ggt

tgt

cgg

ttt

cca

ggt

gtc

aac

aca

cca

tea

aaa

ctt

tgg

gag

96

Gly

Cys

Arg

Phe

Pro

Gly

Val

Asn

Thr

Pro

Ser

Lys

Leu

Trp

Glu

20

25

30

ctg

ctc

aaa

gag

ccc

cgg

gat

gta

cag

acc

aag

atc

cct

aag

gag

aga

144

Leu

Lys

Glu

Pro

Arg

Asp

Val

Gin

Thr

Lys

Ile

Pro

Lys

Glu

Arg

35

40

45

ttt

gac

gtc

gat

aca

ttt

tac

age

ccc

gat

ggc

act

cac

ccc

ggg

ege

192

Phe

Asp

Val

Asp

Thr

Phe

Tyr

Ser

Pro

Asp

Gly

Thr

His

Pro

Gly

Arg

50

55

60

acg

aac

gca

ccc

ttt

gca

tac

ttg

ctg

cag

gag

gat

cta

ege

ggt

ttt

240

Thr

Asn

Ala

Pro

Phe

Ala

Tyr

Leu

Gin

Glu

Asp

Leu

Arg

Gly

Phe

65

70

75

80

gat

gcc

tet

ttc

aac

atc

caa

get

gga

gag

gcc

gaa

acg

att

gac

288

Asp

Ala

Ser

Phe

Asn

Ile

Gin

Ala

Gly

Glu

Ala

Glu

Thr

Ile

Asp

85

90

95

cca

cag

caa

agg

ctg

gag

acg

gtc

tat

gaa

get

gta

tcc

aac

336

Pro

Gin

Arg

Leu

Glu

Thr

Val

Tyr

Glu

Ala

Val

Ser

Asn

100

105

110

gca

ggc

cta

cgg

atc

caa

ggc

ctt

caa

gga

tcc

tet

act

get

gtg

tac

384

Ala

Gly

Leu

Arg

Ile

Gin

Gly

Leu

Gin

Gly

Ser

Thr

Ala

Val

Tyr

115

120

125

gtc ggt

atg Met

atg acg

cat His

gac Asp 135

tat Tyr

gag act

atc Ile

gtg Val 140

acg Thr

cgt Arg

gaa Glu

ttg Leu

432

Val

Gly 130

Met

Thr

Glu

Thr

gat

agt

att

cct

aca

tac

tet

gcc

acg

ggg

gta

get

gtc

agt

gtg

gcc

480

Asp

Ser

Ile

Pro

Thr

Tyr

Ser

Ala

Thr

Gly

Val

Ala

Val

Ser

Val

Ala

145

150

155

160

tcc

aac

cgt

gta

tca

tac

ttc

gac

tgg

cat

ggg

ccg

agt

atg

acg

528

Ser

Asn

Arg

Val

Ser

Tyr

Phe

Asp

Trp

His

Gly

Pro

Ser

Met

Thr

165

170

175

atc

gac

aca

gcc

tgt

agt

tca

tcc

tta

get

gcc

gtg

cat

ctg

gcc

gtc

576

Ile

Asp

Thr

Ala

Cys

Ser

Leu

Ala

Val

His

Leu

Ala

Val

180

185

190

caa

cag

ctt

aga

acg

ggc

gag

agt

acc

atg

gcg

gtt

gca

gcc

ggt

gcg

624

Gin

Leu

Arg

Thr

Gly

Glu

Ser

Thr

Met

Ala

Val

Ala

Gly

Ala

195

200

205

aat

ctg

ata

ttg

ggc

ccc

atg

acc

ttt

gta

atg

gag

agc

aaa

ttg

aac

672

Asn

Leu

Ile

Leu

Gly

Pro

Met

Thr

Phe

Val

Met

Glu

Ser

Lys

Leu

Asn

210

215

220

atg

ctg

tcc

ccc

aat

ggt

aga

tet

ega

atg

tgg

gat

get

gcc

gat

720

Met

Leu

Ser

Pro

Asn

Gly

Arg

Ser

Arg

Met

Trp

Asp

Ala

Asp

225

230

235

240

gga

tat

gcc

aga

gga

gaa

ggt

gtt

tgc

tet

att

gtc

ctg

aaa

acg

ctg

768

Gly

Tyr

Ala

Arg

Gly

Glu

Gly

Val

Cys

Ser

Ile

Val

Leu

Lys

Thr

Leu

245

250

255

agc

cag

gca

ctg

cgc

gac

ggg

gac

agt

atc

gag

tgt

gtt

atc

ega

gag

816

Ser

Gin

Ala

Leu

Arg

Asp

Gly

Asp

Ser

Ile

Glu

Cys

Val

Ile

Arg

Glu

260

265

270

acc

ggt

atc

aac

caa

gat

ggc

ega

acg

aca

ggt

atc

aca

atg

cca

aac

864

Thr

Gly

Ile

Asn

Gin

Asp

Gly

Arg

Thr

Gly

Ile

Thr

Met

Pro

Asn

275

280

285

cat

agc

gca

caa

gaa

gcc

ctc

att

cgg

gcc

aca

tat

gcc

aag

get

ggt

912

His

Ser

Ala

Gin

Glu

Ala

Leu

Ile

Arg

Ala

Thr

Tyr

Ala

Lys

Ala

Gly

290

295

300

ctt

gat

att

acc

aac

ccc

cag

gaa

cgc

tgc

cag

ttc

ttt

gaa

gcc

cat

960

Leu

Asp

Ile

Thr

Asn

Pro

Gin

Glu

Arg

Cys

Gin

Phe

Glu

Ala

His

305

310

315

320

gga

act

ggt

aca

cca

gcc

ggt

gac

cca

cag

gaa

get

gag

get

att

gca

1008

Gly

Thr

Gly

Thr

Pro

Ala

Gly

Asp

Pro

Gin

Glu

Ala

Glu

Ala

Ile

Ala

325

330

335

aca

gcc

ttc

gga

cac

aag

gat

gga

aca

atc

gac

agc

gac

ggc

gag

1056

Thr

Ala

Phe

Gly

His

Lys

Asp

Gly

Thr

Ile

Asp

Ser

Asp

Gly

Glu

340

345

350

aaa

gat

gag

ctt

ttt

gtc

ggc

agc

atc

aag

aca

gtt

ctc

ggt

cac

acg

1104

Lys

Asp

Glu

Leu

Phe

Val

Gly

Ser

Ile

Lys

Thr

Val

Leu

Gly

His

Thr

355

360

365

gaa Glu

ggc Gly 370

act Thr

get Ala

ggt Gly

att Ile

gcg Ala 375

ggc tta

atg Met

aag Lys

gca tcg

ttt Phe

get Ala

gta Val

1152

Gly

Leu

Ala 380

Ser

ega

aat

ggc

gtg

atc

ccg

cca

aac

ctg

ttt

gag

aag

atc

agt

ccc

1200

Arg

Asn

Gly

Val

Ile

Pro

Asn

Leu

Phe

Glu

Lys

Ile

Ser

Pro

385

390

395

400

cgt

gtc

get

ccg

ttc

tat

acg

cac

ttg

aaa

att

gca

acg

gag

gcc

aca

1248

Arg

Val

Ala

Pro

Phe

Tyr

Thr

His

Leu

Lys

Ile

Ala

Thr

Glu

Ala

Thr

405

410

415

gaa

tgg

ccg

att

gtt

gcg

ccc

ggg

cag

cct

ege

aga

gtc

age

gtt

aat

1296

Glu

Trp

Pro

Ile

Val

Ala

Pro

Gly

Gin

Pro

Arg

Val

Ser

Val

Asn

420

425

430

tea

ttt

gga

ttt

ggt

aca

aat

gcc

cat

get

att

atc

gaa

gag

tat

1344

Ser

Phe

Gly

Phe

Gly

Thr

Asn

Ala

His

Ala

Ile

Glu

Tyr

435

440

445

atg

get

cct

cca

cac

aag

ccg

aca

gca

gtg

gta

aca

gag

gtg

acc

tea

1392

Met

Ala

Pro

His

Lys

Pro

Thr

Ala

Val

Thr

Glu

Val

Thr

Ser

450

455

460

gat

gca

gat

gca

tgc

age

ttg

ccc

ctt

gtg

ctt

tea

tcg

aag

tcg

cag

1440

Asp

Ala

Asp

Ala

Cys

Ser

Leu

Pro

Leu

Val

Leu

Ser

Lys

Ser

Gin

465

470

475

480

ege

tec

atg

aag

gca

acg

cta

gaa

aat

atg

ctc

caa

ttt

ctg

gaa

acg

1488

Arg

Ser

Met

Lys

Ala

Thr

Leu

Glu

Asn

Met

Leu

Gin

Phe

Leu

Glu

Thr

485

490

495

cat

gat

gac

gtg

gac

atg

cat

gat

atc

gca

tat

acc

tta

ctt

gag

aaa

1536

His

Asp

Val

Asp

Met

His

Asp

Ile

Ala

Tyr

Thr

Leu

Glu

Lys

500

505

510

cgg

tet

atc

ttg

ccc

ttc

cgt

gcg

att

gca

cac

aac

aag

gaa

1584

Arg

Ser

Ile

Leu

Pro

Phe

Arg

Ala

Ile

Ala

His

Asn

Lys

Glu

515

520

525

gta

gcc

ege

gcg

gca

ctg

gag

get

gcc

atc

gcg

gac

ggt

gag

gtc

1632

Val

Ala

Arg

Ala

Leu

Glu

Ala

Ile

Ala

Asp

Gly

Glu

Val

530

535

540

acc

gac

ttc

ege

acc

gac

gcg

aat

gac

aac

cct

ege

gta

cta

ggt

gtc

1680

Thr

Asp

Phe

Arg

Thr

Asp

Ala

Asn

Asp

Asn

Pro

Arg

Val

Leu

Gly

Val

545

550

555

560

ttt

act

ggc

caa

ggt

gca

cag

tgg

ccg

ggc

atg

ctg

aag

ctc

atg

1728

Phe

Thr

Gly

Gin

Gly

Ala

Gin

Trp

Pro

Gly

Met

Leu

Lys

Leu

Met

565

570

575

gtg

ggt

atg

cca

ttt

gtg

aga

ggc

att

ctc

gaa

gag

ctg

gat

aat

tea

1776

Val

Gly

Met

Pro

Phe

Val

Arg

Gly

Ile

Leu

Glu

Leu

Asp

Asn

Ser

580

585

590

ctg

caa

aca

ctg

cct

gaa

aag

tat

cgg

cct

acg

tgg

aca

ctg

tat

gac

1824

Leu

Gin

Thr

Leu

Pro

Glu

Lys

Tyr

Arg

Pro

Thr

Trp

Thr

Leu

Tyr

Asp

595

600

605

cag Gin

ctc atg

ctt Leu

gaa Glu

ggg gat

gcc tea

aac Asn

gtc aga

ctc Leu

gcc Ala

age Ser

ttc Phe

1872

Leu 610

Met

Gly

Asp 615

Ala

Ser

Val

Arg 620

tcc

cag

cct

cta

tgc

gcc

gta

caa

atc

gtt

ctg

gtc

ega

ctt

ctc

1920

Ser

Gin

Pro

Leu

Cys

Ala

Val

Gin

Ile

Val

Leu

Val

Arg

Leu

625

630

635

640

gct

gca

gct

ggt

atc

gag

ttc

agt

gca

att

gtc

ggc

cac

agt

tea

ggt

1968

Ala

Gly

Ile

Glu

Phe

Ser

Ala

Ile

Val

Gly

His

Ser

Gly

645

650

655

gag

att

gcc

tgt

gcc

ttt

gcg

gca

gga

ttc

atc

agt

gcc

act

caa

gct

2016

Glu

Ile

Ala

Cys

Ala

Phe

Ala

Gly

Phe

Ile

Ser

Ala

Thr

Gin

Ala

660

665

670

atc

cgt

att

gcg

cat

ctg

cgt

gga

gtt

gtg

tcc

gcg

gag

cat

gcc

tet

2064

Ile

Arg

Ile

Ala

His

Leu

Arg

Gly

Val

Ser

Ala

Glu

His

Ala

Ser

675

680

685

tet

cca

age

ggc

cag

aca

ggc

gct

atg

cta

gcg

gca

ggt

atg

tcg

tac

2112

Ser

Pro

Ser

Gly

Gin

Thr

Gly

Ala

Met

Leu

Ala

Gly

Met

Ser

Tyr

690

695

700

gat

gac

gca

aag

gaa

cta

tgc

gag

ctc

gaa

gcc

ttt

gag

ggt

cgg

gtc

2160

Asp

Ala

Lys

Glu

Leu

Cys

Glu

Leu

Glu

Ala

Phe

Glu

Gly

Arg

Val

705

710

715

720

tgc

gtc

gcc

gct

age

aat

tea

ccg

gat

agt

gtg

acc

ttc

tcc

ggc

gac

2208

Cys

Val

Ala

Ser

Asn

Ser

Pro

Asp

Ser

Val

Thr

Phe

Ser

Gly

Asp

725

730

735

atg

gat

gct

atc

cag

cac

gtt

gaa

ggt

gtc

ttg

gag

gat

gaa

tcc

act

2256

Met

Asp

Ala

Ile

Gin

His

Val

Glu

Gly

Val

Leu

Glu

Asp

Glu

Ser

Thr

740

745

750

ttt

gcc

aga

atc

ttg

aga

gtt

gac

aag

gcc

tac

cat

tcg

cat

cac

atg

2304

Phe

Ala

Arg

Ile

Leu

Arg

Val

Asp

Lys

Ala

Tyr

His

Ser

His

Met

755

760

765

cac

cca

tgc

gca

gct

cca

tat

gtc

aag

gca

ttg

ctg

gag

tgc

gac

tgt

2352

His

Pro

Cys

Ala

Pro

Tyr

Val

Lys

Ala

Leu

Glu

Cys

Asp

Cys

770

775

780

gct

gtt

gcc

gat

ggc

caa

ggt

aac

gat

agt

gtt

gct

tgg

ttc

tet

gcc

2400

Ala

Val

Ala

Asp

Gly

Gin

Gly

Asn

Asp

Ser

Val

Ala

Trp

Phe

Ser

Ala

785

790

795

800

gtc

cac

gag

acc

age

aag

caa

atg

act

gta

cag

gat

gtg

atg

ccc

gct

2448

Val

His

Glu

Thr

Ser

Lys

Gin

Met

Thr

Val

Gin

Asp

Val

Met

Pro

Ala

805

810

815

tat

tgg

aaa

gac

aat

ctc

gtc

tet

ccg

gtc

ttg

ttc

tcg

cag

gct

gtg

2496

Tyr

Trp

Lys

Asp

Asn

Leu

Val

Ser

Pro

Val

Leu

Phe

Ser

Gin

Ala

Val

820

825

830

cag

aaa

gca

gtc

atc

act

cat

cgt

cta

atc

gac

gtc

gcc

atc

gaa

att

2544

Gin

Lys

Ala

Val

Ile

Thr

His

Arg

Leu

Ile

Asp

Val

Ala

Ile

Glu

Ile

835

840

845

ggc

gcc

cac

cct

gct

ctc

aag

ggt

ccg

tgt

cta

gcc

acc

atc

aag

gat

2592

Gly Ala 850

His

Pro Ala

Leu Lys 855

Gly Pro Cys

Leu Ala 860

Thr

Ile

Lys Asp

gct

ctt

gcc

ggt

gtg

gag

ctg

ccg

tat

acc

ggg

tgc

ttg

gca

ega

aac

2640

Ala

Leu

Ala

Gly

Val

Glu

Leu

Pro

Tyr

Thr

Gly

Cys

Leu

Ala

Arg

Asn

865

870

875

880

gtt

gac

gat

gtg

gac

gct

ttt

gct

gga

ggt

ctg

gga

tac

att

tgg

gag

2688

Val

Asp

Val

Asp

Ala

Phe

Ala

Gly

Leu

Gly

Tyr

Ile

Trp

Glu

885

890

895

cgt

ttc

gga

gtt

cgg

agt

atc

gac

gcc

gag

ggc

ttc

gta

caa

gtc

2736

Arg

Phe

Gly

Val

Arg

Ser

Ile

Asp

Ala

Glu

Gly

Phe

Val

Gin

Val

900

905

910

cgg

ccc

gat

cgt

gcc

gtt

caa

aac

ctg

tea

aag

tea

ttg

ccc

aca

tac

2784

Arg

Pro

Asp

Arg

Ala

Val

Gin

Asn

Leu

Ser

Lys

Ser

Leu

Pro

Thr

Tyr

915

920

925

tet

tgg

gat

cat

act

cgt

caa

tac

tgg

gca

gaa

tet

ege

tcc

acc

ege

2832

Ser

Trp

Asp

His

Thr

Arg

Gin

Tyr

Trp

Ala

Glu

Ser

Arg

Ser

Thr

Arg

930

935

940

cag

cat

ctt

cgt

gga

ggt

gcg

ccc

cat

ctt

ctg

ctt

gga

aag

ctt

tet

2880

Gin

His

Leu

Arg

Gly

Ala

Pro

His

Leu

Gly

Lys

Leu

Ser

945

950

955

960

tet

tac

age

aca

gca

tcg

acc

ttc

cag

tgg

aca

aac

ttc

atc

agg

ccc

2928

Ser

Tyr

Ser

Thr

Ala

Ser

Thr

Phe

Gin

Trp

Thr

Asn

Phe

Ile

Arg

Pro

965

970

975

cgg

gat

ctg

gaa

tgg

ctc

gac

ggt

cat

gcg

cta

caa

ggc

cag

act

gtg

2976

Arg

Asp

Leu

Glu

Trp

Leu

Asp

Gly

His

Ala

Leu

Gin

Gly

Gin

Thr

Val

980

985

990

ttc

ccc

gct

ggg

tac

ata

att

atg

[ gcc

: atg

[ gaa

i gct

gcc atg aag

3024

Phe

Pro

Ala

Gly

Tyr

Ile

Met

. Ala

i Met

. Glu Ala

Ala Met Lys

995

1000

1005

gtg Val

gct Ala 1010

ggt Gly

gag Glu

cgt Arg

gcc Ala

gcc Ala 1015

caa Gin

gtt Val

cag Gin

ctc Leu

ctg Leu 1020

gaa Glu

atc Ile

ttg Leu

3069

gac

atg

age

atc

aac

aaa

gcc

atc

gtg

ttt

gaa

gat

gaa

aac

acc

3114

Asp

Met

Ser

Ile

Asn

Lys

Ala

Ile

Val

Phe

Glu

Asp

Glu

Asn

Thr

1025

1030

1035

tcc

gtg

gag

ctg

aac

ttg

aca

gcc

gaa

gtc

acc

agt

gac

aat

gat

3159

Ser

Val

Glu

Leu

Asn

Leu

Thr

Ala

Glu

Val

Thr

Ser

Asp

Asn

Asp

1040

1045

1050

gcg

gat

ggc

caa

gtc

acg

gtc

aaa

ttt

gtt

att

gat

tcc

tgt

ctg

3204

Ala

Asp

Gly

Gin

Val

Thr

Val

Lys

Phe

Val

Ile

Asp

Ser

Cys

Leu

1055

1060

1065

gca

aag

gag

agt

gag

ctt

tcg

aca

tcc

gcc

aaa

ggc

caa

atc

gtc

3249

Ala

Lys

Glu

Ser

Glu

Leu

Ser

Thr

Ser

Ala

Lys

Gly

Gin

Ile

Val

1070

1075

1080

ata

acc

ctt

ggc

gag

gca

tea

ccg

tea

tcg

cag

ctt

ttg

ccg

cca

3294

Ile

Thr

Leu

Gly

Glu

Ala

Ser

Pro

Ser

Gin

Leu

Pro

1085

1090

1095

cct

gag

gaa

gag

tac

ccc

cag

atg

aac

aat

gtc

aac

atc

gat

ttc

3339

Pro

Glu 1100

Glu

Tyr

Pro

Gin 1105

Met

Asn

Val

Asn 1110

Ile

Asp

Phe

ttc

tat

cgg

gaa

ctt

gac

ctc

ctt

ggg

tat

gac

tac

age

aaa

gac

3384

Phe

Tyr 1115

Arg

Glu

Leu

Asp

Leu 1120

Leu

Gly

Tyr

Asp

Tyr 1125

Ser

Lys

Asp

ttc

cgt

ttg

cag

acc

atg

aga

agg

gcc

gac

tcc

aaa

get

age

3429

Phe

Arg 1130

Arg

Leu

Gin

Thr

Met 1135

Arg

Ala

Asp

Ser 1140

Lys

Ala

Ser

ggc

acc

ttg

get

ttc

ctt

cca

ctt

aag

gat

gaa

ttg

ege

aat

gag

3474

Gly

Thr 1145

Leu

Ala

Phe

Leu

Pro 1150

Leu

Lys

Asp

Glu

Leu 1155

Arg

Asn

Glu

ccc

ctc

ttg

ctc

cac

cca

gcg

ccc

ctg

gac

atc

gcg

ttc

cag

act

3519

Pro

Leu 1160

Leu

His

Pro

Ala 1165

Pro

Leu

Asp

Ile

Ala 1170

Phe

Gin

Thr

gtc

att

gga

gcg

tat

tcc

tet

cca

gga

gat

cgt

ege

cta

ege

tea

3564

Val

Ile 1175

Gly

Ala

Tyr

Ser

Ser 1180

Pro

Gly

Asp

Arg

Arg 1185

Leu

Arg

Ser

ttg

tac

gtg

cct

act

cac

gtt

gac

aga

gtg

act

ctg

att

cca

tcg

3609

Leu

Tyr 1190

Val

Pro

Thr

His

Val 1195

Asp

Arg

Val

Thr

Leu 1200

Ile

Pro

Ser

ctc

tgt

ata

tcg

gcg

ggt

aat

tet

ggt

gaa

acc

gag

ctt

gcg

ttt

3654

Leu

Cys 1205

Ile

Ser

Ala

Gly

Asn 1210

Ser

Gly

Glu

Thr

Glu 1215

Leu

Ala

Phe

gac

aca

atc

aac

aca

cac

gac

aag

ggt

gat

ttc

ctg

age

ggc

gac

3699

Asp

Thr 1220

Ile

Asn

Thr

His

Asp 1225

Lys

Gly

Asp

Phe

Leu 1230

Ser

Gly

Asp

atc

acg

gtg

tac

gat

tcg

acc

aag

aca

acg

ctt

ttc

caa

gtt

gat

3744

Ile

Thr 1235

Val

Tyr

Asp

Ser

Thr 1240

Lys

Thr

Leu

Phe 1245

Gin

Val

Asp

aac

att

gtc

ttt

aag

cct

ttc

tet

ccc

ccg

act

get

tcg

acc

gac

3789

Asn

Ile 1250

Val

Phe

Lys

Pro

Phe 1255

Ser

Pro

Thr

Ala 1260

Ser

Thr

Asp

cac

ega

atc

ttc

gca

aag

tgg

gtc

tgg

gga

ccc

ctc

acg

ccc

gaa

3834

His

Arg 1265

Ile

Phe

Ala

Lys

Trp 1270

Val

Trp

Gly

Pro

Leu 1275

Thr

Pro

Glu

aaa

ctg

gag

gac

cct

gcg

acg

ttg

atc

ata

get

cgg

gac

aag

3879

Lys

Leu 1280

Leu

Glu

Asp

Pro

Ala 1285

Thr

Leu

Ile

Ala 1290

Arg

Asp

Lys

gag

gac

att

ctg

acc

atc

gag

ega

atc

gtt

tac

ttc

tac

atc

aaa

3924

Glu

Asp 1295

Ile

Leu

Thr

Ile

Glu 1300

Arg

Ile

Val

Tyr

Phe 1305

Tyr

Ile

Lys

tcc

ttc

cta

gcc

cag

ata

acc

ccc

gac

cgt

caa

aat

gcc

gac

3969

Ser

Phe 1310

Leu

Ala

Gin

Ile

Thr 1315

Pro

Asp

Arg

Gin 1320

Asn

Ala

Asp

ctc Leu

cat His 1325

tcc Ser

cag Gin

aag Lys

tac Tyr

att Ile 1330

gaa tgg

tgt Cys

gac Asp

cag Gin 1335

gtt Val

cag Gin

gcc Ala

4014

Glu

Trp

gat

gct

cgg

gct

ggc

cac

cat

cag

tgg

tac

cag

gag

tet

tgg

gag

4059

Asp

Ala 1340

Arg

Ala

Gly

His

His 1345

Gin

Trp

Tyr

Gin

Glu 1350

Ser

Trp

Glu

gag

gac

act

tet

gtt

cac

att

gag

caa

atg

tgt

gaa

age

aac

tcg

4104

Glu

Asp 1355

Thr

Ser

Val

His

Ile 1360

Glu

Gin

Met

Cys

Glu 1365

Ser

Asn

Ser

tcc

cac

cca

cat

gtg

cgc

ctg

atc

caa

agg

gta

ggc

aaa

gaa

tta

4149

Ser

His 1370

Pro

His

Val

Arg

Leu 1375

Ile

Gin

Arg

Val

Gly 1380

Lys

Glu

Leu

att

tca

att

gtt

cgc

ggg

aac

ggg

gat

cct

ttg

gat

atc

atg

aac

4194

Ile

Ser 1385

Ile

Val

Arg

Gly

Asn 1390

Gly

Asp

Pro

Leu

Asp 1395

Ile

Met

Asn

cgc

gat

ggg

ttg

ttc

acc

gag

tac

tat

acc

aac

aag

ctc

gcc

ttt

4239

Arg

Asp 1400

Gly

Leu

Phe

Thr

Glu 1405

Tyr

Thr

Asn

Lys 1410

Leu

Ala

Phe

ggc

tca

gca

ata

cac

gtc

gtt

cag

gat

ctg

gtt

age

caa

att

gct

4284

Gly

Ser 1415

Ala

Ile

His

Val

Val 1420

Gin

Asp

Leu

Val

Ser 1425

Gin

Ile

Ala

cat

cgc

tac

caa

tcc

att

gat

atc

ctt

gag

atc

ggc

ttg

ggt

aca

4329

His

Arg 1430

Tyr

Gin

Ser

Ile

Asp 1435

Ile

Leu

Glu

Ile

Gly 1440

Leu

Gly

Thr

ggc

atc

gcc

acg

aag

cgc

gtt

ctt

gca

tca

cct

caa

ctt

ggt

ttc

4374

Gly

Ile 1445

Ala

Thr

Lys

Arg

Val 1450

Leu

Ala

Ser

Pro

Gin 1455

Leu

Gly

Phe

aac

agt

tac

act

tgc

act

gac

atc

tcg

gcg

gat

gtt

att

ggc

aag

4419

Asn

Ser 1460

Tyr

Thr

Cys

Thr

Asp 1465

Ile

Ser

Ala

Asp

Val 1470

Ile

Gly

Lys

gcc

cgt

gaa

caa

ctt

tcc

gaa

ttc

gac

ggt

ctc

atg

cag

ttt

gag

4464

Ala

Arg 1475

Glu

Gin

Leu

Ser

Glu 1480

Phe

Asp

Gly

Leu

Met 1485

Gin

Phe

Glu

gca

cta

gac

atc

aac

aga

age

cca

gca

gag

caa

gga

ttc

aag

cct

4509

Ala

Leu 1490

Asp

Ile

Asn

Arg

Ser 1495

Pro

Ala

Glu

Gin

Gly 1500

Phe

Lys

Pro

cac

tcc

tac

gat

ctg

att

gca

tcc

gat

gtc

ctc

cat

gcc

age

4554

His

Ser 1505

Tyr

Asp

Leu

Ile

Ile 1510

Ala

Ser

Asp

Val

Leu 1515

His

Ala

Ser

tcc

aac

ttc

gag

gaa

aaa

ttg

gct

cac

ata

agg

tcc

ttg

ctc

aag

4599

Ser

Asn 1520

Phe

Glu

Lys

Leu 1525

Ala

His

Ile

Arg

Ser 1530

Leu

Lys

ccg

ggt

cac

ttg

gtt

act

ttc

ggg

gtc

acc

cat

cgc

gag

cct

4644

Pro

Gly 1535

Gly

His

Leu

Val

Thr 1540

Phe

Gly

Val

Thr

His 1545

Arg

Glu

Pro

gct Ala

cgc Arg 1550

ctc gcc

ttc Phe

atc Ile

tet Ser 1555

ggg Gly

ctt Leu

ttc Phe

gct Ala

gat Asp 1560

ega Arg

tgg Trp

act Thr

4689

Leu

Ala

gga

gaa

gac

gaa

act

cgt

gct

ttg

agt

gcc

tcg

ggg

tcc

gtt

gac

4734

Gly

Glu

Asp

Glu

Thr

Arg

Ala

Leu

Ser

Ala

Ser

Gly

Ser

Val

Asp

1565

1570

1575

caa

tgg

gag

cat

acc

ctc

aag

aga

gtt

ggg

ttc

tet

ggc

gtc

gat

4779

Gin

Trp

Glu

His

Thr

Leu

Lys

Arg

Val

Gly

Phe

Ser

Gly

Val

Asp

1580

1585

1590

agt

cgg

aca

ctt

gat

ega

gag

gat

ttg

atc

ccg

tet

gtc

ttc

4824

Ser

Arg

Thr

Leu

Asp

Arg

Glu

Asp

Leu

Ile

Pro

Ser

Val

Phe

1595

1600

1605

agt

aca

cat

gct

gtg

gat

gcc

acc

gtt

gag

cgt

ttg

tat

gat

cca

4869

Ser

Thr

His

Ala

Val

Asp

Ala

Thr

Val

Glu

Arg

Leu

Tyr

Asp

Pro

1610

1615

1620

ctt

tet

gct

cca

ttg

aag

gac

tea

tac

ccg

cca

tta

gtg

gtt

atc

4914

Leu

Ser

Ala

Pro

Leu

Lys

Asp

Ser

Tyr

Pro

Leu

Val

Ile

1625

1630

1635

ggt

ggc

gaa

tcg

aca

aaa

acc

gaa

cgc

att

ttg

aac

gac

atg

aaa

4959

Gly

Glu

Ser

Thr

Lys

Thr

Glu

Arg

Ile

Leu

Asn

Asp

Met

Lys

1640

1645

1650

gct

gcc

cta

ccg

cat

aga

cac

atc

cac

tcc

gtc

aag

cgg

ctg

gaa

5004

Ala

Leu

Pro

His

Arg

His

Ile

His

Ser

Val

Lys

Arg

Leu

Glu

1655

1660

1665

agt

gtt

ctc

gac

ccg

gcc

ttg

cag

cct

aag

tcg

act

ttt

gtc

5049

Ser

Val

Leu

Asp

Pro

Ala

Leu

Gin

Pro

Lys

Ser

Thr

Phe

Val

1670

1675

1680

atc

ctc

tcg

gaa

ctt

gat

gaa

gtg

ttt

tgc

aac

ctt

gaa

gag

5094

Ile

Leu

Ser

Glu

Leu

Asp

Glu

Val

Phe

Cys

Asn

Leu

Glu

1685

1690

1695

gac

aag

ttt

gag

gca

gtc

aag

tet

ctt

ctc

ttc

tac

gcc

gga

cgc

5139

Asp

Lys

Phe

Glu

Ala

Val

Lys

Ser

Leu

Phe

Tyr

Ala

Gly

Arg

1700

1705

1710

atg

tgg

ctg

aca

gag

aat

gcc

tgg

att

gat

cat

ccc

cac

cag

5184

Met

Trp

Leu

Thr

Glu

Asn

Ala

Trp

Ile

Asp

His

Pro

His

Gin

1715

1720

1725

gcc

age

acc

atc

gga

atg

ttg

agg

aca

atc

aag

ctc

gag

aac

cct

5229

Ala

Ser

Thr

Ile

Gly

Met

Leu

Arg

Thr

Ile

Lys

Leu

Glu

Asn

Pro

1730

1735

1740

gac

ttg

gga

acg

cac

gtc

ttc

gat

gtc

gat

act

gtg

gag

aac

cta

5274

Asp

Leu

Gly

Thr

His

Val

Phe

Asp

Val

Asp

Thr

Val

Glu

Asn

Leu

1745

1750

1755

gac

acc

aaa

ttc

gtt

gag

caa

ctt

ttg

cgc

ttc

gag

age

5319

Asp

Thr

Lys

Phe

Val

Glu

Gin

Leu

Arg

Phe

Glu

Ser

1760

1765

1770

gat

cag

ctt

ttg

gaa

tea

ata

aca

tgg

act

cat

gag

ccc

gaa

5364

Asp

Asp 1775

Gin

Leu

Glu Ser 1780

Ile

Thr

Trp

Thr

His 1785

Glu

Pro

Glu

gtg

tac

tgg

tgc

aag

ggt

cgt

gcc

tgg

gtc

cct

cgt

ttg

aag

cag

5409

Val

Tyr 1790

Trp

Cys

Lys

Gly

Arg 1795

Ala

Trp

Val

Pro

Arg 1800

Leu

Lys

Gin

gat

att

get

agg

aac

gac

cgt

atg

aac

tcg

tet

cgt

cca

att

5454

Asp

Ile 1805

Ala

Arg

Asn

Asp

Arg 1810

Met

Asn

Ser

Arg 1815

Arg

Pro

Ile

ttc

ggt

aac

ttt

aat

tcg

tcc

aag

acg

gcc

att

gca

ctg

aaa

gag

5499

Phe

Gly 1820

Asn

Phe

Asn

Ser

Ser 1825

Lys

Thr

Ala

Ile

Ala 1830

Leu

Lys

Glu

gcg

agg

gga

gca

tcc

tea

tcg

atg

tac

tat

ctt

gag

tea

acc

gag

5544

Ala

Arg 1835

Gly

Ala

Ser

Ser 1840

Met

Tyr

Leu

Glu 1845

Ser

Thr

Glu

acg

tgt

gat

tcg

tta

gaa

gac

get

cgt

cat

get

gga

aaa

gca

act

5589

Thr

Cys 1850

Asp

Ser

Leu

Glu

Asp 1855

Ala

Arg

His

Ala

Gly 1860

Lys

Ala

Thr

gtt

cgt

gtt

ege

tac

get

ctt

ccc

cag

gca

att

ege

gtg

ggc

cat

5634

Val

Arg 1865

Val

Arg

Tyr

Ala

Leu 1870

Pro

Gin

Ala

Ile

Arg 1875

Val

Gly

His

ctc

gga

tac

ttc

cat

gtc

gtg

cag

ggc

agt

att

ctg

gag

aat

aca

5679

Leu

Gly 1880

Tyr

Phe

His

Val

Val 1885

Gin

Gly

Ser

Ile

Leu 1890

Glu

Asn

Thr

tgt

gag

gtg

cct

gta

gtc

gcc

ctg

get

gag

aag

aat

gga

tet

ata

5724

Cys

Glu 1895

Val

Pro

Val

Ala 1900

Leu

Ala

Glu

Lys

Asn 1905

Gly

Ser

Ile

ctg

cat

gta

ccg

aga

aac

tac

atg

cat

agt

ctg

ccc

gat

aac

atg

5769

Leu

His 1910

Val

Pro

Arg

Asn

Tyr 1915

Met

His

Ser

Leu

Pro 1920

Asp

Asn

Met

gcg

gaa

ggc

gag

gat

agt

tcc

ttc

ttg

tcc

aca

get

gca

gcc

5814

Ala

Glu 1925

Gly

Glu

Asp

Ser

Ser 1930

Phe

Leu

Ser

Thr 1935

Ala

ctc

ctt

gcc

gaa

aca

att

ctc

tet

age

get

cag

tcc

ttt

ggc

tet

5859

Leu

Leu 1940

Ala

Glu

Thr

Ile

Leu 1945

Ser

Ala

Gin

Ser 1950

Phe

Gly

Ser

gat

gca

tea

att

ctg

att

atg

gag

ccc

cca

atc

ttc

tgc

gtc

aaa

5904

Asp

Ala 1955

Ser

Ile

Leu

Ile

Met 1960

Glu

Pro

Ile

Phe 1965

Cys

Val

Lys

gca

att

ctg

gag

tcg

gcc

aaa

acc

tac

ggt

gtt

cag

gtt

cat

ttg

5949

Ala

Ile 1970

Leu

Glu

Ser

Ala

Lys 1975

Thr

Tyr

Gly

Val

Gin 1980

Val

His

Leu

gca

aca

act

ctg

tcc

gac

gtc

aaa

act

att

ccg

get

cct

tgg

atc

5994

Ala

Thr 1985

Thr

Leu

Ser

Asp

Val 1990

Lys

Thr

Ile

Pro

Ala 1995

Pro

Trp

Ile

ega

tta

cat

gcc

aag

gaa

acc

gac

get

cgg

ctg

aaa

cac

age

ctg

6039

Arg

Leu

His

Ala

Lys

Glu

Thr

Asp

Ala

Arg

Leu

Lys

His

Ser

Leu

• 9 9 » *

2000 2005 2010

ccg Pro

aca Thr 2015

aac Asn

atg atg

gca ttc

ttt Phe

gac ttg Asp Leu

tet Ser

acc Thr 2025

gac Asp

cgg Arg

act Thr

6084

Met

Ala

Phe 2020

gct

gcc

ggg

ata

acc

aac

cgt

ttg

gcc

aag

ttg

cta

cca

ccc

agt

6129

Ala

Gly

Ile

Thr

Asn

Arg

Leu

Ala

Lys

Leu

Pro

Ser

2030

2035

2040

tgc

ttc

atg

tac

agt

ggt

gac

tat

ctt

atc

ega

agt

aca

gct

tcc

6174

Cys

Phe

Met

Tyr

Ser

Gly

Asp

Tyr

Leu

Ile

Arg

Ser

Thr

Ala

Ser

2045

2050

2055

aca

tac

aaa

gtt

agt

cat

gtt

gag

gat

att

cca

atc

ctc

gag

cac

6219

Thr

Tyr

Lys

Val

Ser

His

Val

Glu

Asp

Ile

Pro

Ile

Leu

Glu

His

2060

2065

2070

tet

gtg

gca

atg

gca

aaa

aat

acc

gtc

tet

gcg

tcg

act

gtc

gac

6264

Ser

Val

Ala

Met

Ala

Lys

Asn

Thr

Val

Ser

Ala

Ser

Thr

Val

Asp

2075

2080

2085

gac

act

gag

aaa

gtt

att

aca

gcc

aca

caa

att

ctc

ttg

cct

ggt

6309

Asp

Thr

Glu

Lys

Val

Ile

Thr

Ala

Thr

Gin

Ile

Leu

Pro

Gly

2090

2095

2100

cag

ctc

tet

gtc

aac

cac

aat

gac

caa

ege

ttc

aat

ctg

gcc

acc

6354

Gin

Leu

Ser

Val

Asn

His

Asn

Asp

Gin

Arg

Phe

Asn

Leu

Ala

Thr

2105

2110

2115

gtc

atc

gac

tgg

aag

gaa

aat

gag

gtg

tcc

gct

agg

att

tgc

ccc

6399

Val

Ile

Asp

Trp

Lys

Glu

Asn

Glu

Val

Ser

Ala

Arg

Ile

Cys

Pro

2120

2125

2130

atc

gac

tet

ggt

aac

tta

ttt

tcc

aac

aag

a cg

tat

ttg

ctt

6444

Ile

Asp

Ser

Gly

Asn

Leu

Phe

Ser

Asn

Lys

Thr

Tyr

Leu

2135

2140

2145

gtt

ggt

ctt

acc

ggg

gac

ctt

ggt

ege

tet

ctc

tgt

ege

tgg

atg

6489

Val

Gly

Leu

Thr

Gly

Asp

Leu

Gly

Arg

Ser

Leu

Cys

Arg

Trp

Met

2150

2155

2160

atc

ttg

cat

ggc

gcc

ege

cat

gtt

gtg

ctc

act

age

cgg

aac

cct

6534

Ile

Leu

His

Gly

Ala

Arg

His

Val

Leu

Thr

Ser

Arg

Asn

Pro

2165

2170

2175

ega

ctt

gat

CCC

aaa

tgg

atc

gcc

aac

atg

gag

gca

ctt

ggt

6579

Arg

Leu

Asp

Pro

Lys

Trp

Ile

Ala

Asn

Met

Glu

Ala

Leu

Gly

2180

2185

2190

gac

atc

acc

gtt

ctg

tea

atg

gat

gtt

gcc

aat

gag

gat

tea

gtc

6624

Asp

Ile

Thr

Val

Leu

Ser

Met

Asp

Val

Ala

Asn

Glu

Asp

Ser

Val

2195

2200

2205

gat

gct

ggc

ctt

ggc

aag

ctt

gtc

gat

atg

aag

ttg

cca

cct

gtt

6669

Asp

Ala

Gly

Leu

Gly

Lys

Leu

Val

Asp

Met

Lys

Leu

Pro

Val

2210

2215

2220

gcc

ggc

atc

gcg

ttc

ggg

cct

ttg

gtg

ctg

cag

gat

gtc

atg

ctg

6714

Ala

Gly

Ile

Ala

Phe

Gly

Pro

Leu

Val

Leu

Gin

Asp

Val

Met

Leu

2225

2230

2235

• · · · · · * • · · · · · ♦ • · · 0 · · · · • · ······ • · · « · · · • · ··· ·· · ·

aag Lys

aac Asn 2240

atg Met

gac Asp

cac His

cag Gin

atg Met 2245

atg Met

gac Asp

atg Met

gtg Val

ttg Leu 2250

aag Lys

ccc Pro

aag Lys

6759

gta

caa

gga

gca

ege

att

ctt

cat

gaa

cgg

ttc

tcc

gaa

cag

acg

6804

Val

Gin

Gly

Ala

Arg

Ile

Leu

His

Glu

Arg

Phe

Ser

Glu

Gin

Thr

2255

2260

2265

ggc

agc

aag

gcg

ctc

gac

ttc

atc

atg

ttt

tcg

tcc

att

gtt

6849

Gly

Ser

Lys

Ala

Leu

Asp

Phe

Ile

Met

Phe

Ser

Ile

Val

2270

2275

2280

gca

gtt

att

ggc

aat

cct

ggc

cag

tcc

aac

tat

ggc

get

gcg

aat

6894

Ala

Val

Ile

Gly

Asn

Pro

Gly

Gin

Ser

Asn

Tyr

Gly

Ala

Asn

2285

2290

2295

gcc

tac

cta

cag

get

ctg

gcc

cag

caa

cgg

tgc

gcc

aga

gga

ttg

6939

Ala

Tyr

Leu

Gin

Ala

Leu

Ala

Gin

Arg

Cys

Ala

Arg

Gly

Leu

2300

2305

2310

gcg

gga

tca

acc

atc

gat

att

ggt

gcc

gtt

tac

ggt

gta

ggg

ttt

6984

Ala

Gly

Ser

Thr

Ile

Asp

Ile

Gly

Ala

Val

Tyr

Gly

Val

Gly

Phe

2315

2320

2325

gtc

acg

agg

gcc

gag

atg

gag

gac

ttt

gat

get

atc

cgt

ttc

7029

Val

Thr

Arg

Ala

Glu

Met

Glu

Asp

Phe

Asp

Ala

Ile

Arg

Phe

2330

2335

2340

atg

ttt

gac

tca

gtt

gaa

gag

cat

gag

ctg

cac

acg

ctt

ttc

gcc

7074

Met

Phe

Asp

Ser

Val

Glu

His

Glu

Leu

His

Thr

Leu

Phe

Ala

2345

2350

2355

gaa

gcg

gtc

gtg

tet

gac

cag

cgt

gcc

cgg

cag

caa

cca

cag

ege

7119

Glu

Ala

Val

Ser

Asp

Gin

Arg

Ala

Arg

Gin

Pro

Gin

Arg

2360

2365

2370

aag

acg

gtc

att

gac

atg

gcg

gac

ctt

gag

ctt

acc

acg

ggt

atc

7164

Lys

Thr

Val

Ile

Asp

Met

Ala

Asp

Leu

Glu

Leu

Thr

Gly

Ile

2375

2380

2385

cca

gat

ctt

gac

cct

gcg

ctt

caa

gat

ega

att

tac

ttc

aac

7209

Pro

Asp

Leu

Asp

Pro

Ala

Leu

Gin

Asp

Arg

Ile

Tyr

Phe

Asn

2390

2395

2400

gac

cct

cgt

ttc

gga

aac

ttc

aaa

att

ccc

ggt

caa

ege

gga

gac

7254

Asp

Pro

Arg

Phe

Gly

Asn

Phe

Lys

Ile

Pro

Gly

Gin

Arg

Gly

Asp

2405

2410

2415

ggt

ggc

gac

aat

gga

tca

ggg

tet

aaa

ggc

tcc

att

gcc

gac

cag

7299

Gly

Asp

Asn

Gly

Ser

Gly

Ser

Lys

Gly

Ser

Ile

Ala

Asp

Gin

2420

2425

2430

ctc

aaa

caa

gca

aca

act

tta

gac

caa

gtt

cgg

caa

atc

gtg

att

7344

Leu

Lys

Gin

Ala

Thr

Leu

Asp

Gin

Val

Arg

Gin

Ile

Val

Ile

2435

2440

2445

gat

ggt

cta

tet

gag

aaa

ctc

cgt

gtt

acc

ctc

caa

gtt

tcg

gac

7389

Asp

Gly

Leu

Ser

Glu

Lys

Leu

Arg

Val

Thr

Leu

Gin

Val

Ser

Asp

2450

2455

2460

• ·

ggg gag

agc Ser

gtg Val

gac Asp

cca Pro

acc Thr 2470

att Ile

cct Pro

ctc Leu

att Ile

gat Asp 2475

caa Gin

ggt Gly

gtc Val

7434

Gly

Glu 2465

gac

tcc

ttg

ggt

gca

gtg

act

gtc

ggc

tea

tgg

ttc

tea

aag

caa

7479

Asp

Ser

Leu

Gly

Ala

Val

Thr

Val

Gly

Ser

Trp

Phe

Ser

Lys

Gin

2480

2485

2490

ctc

tac

ctt

gac

ctc

cca

ctc

ttg

agg

gta

ctt

ggc

ggt

gct

tet

7524

Leu

Tyr

Leu

Asp

Leu

Pro

Leu

Arg

Val

Leu

Gly

Ala

Ser

2495

2500

2505

gtc

gct

gat

ctt

gcc

gac

gcg

gcc

acc

ega

ctc

cca

gct

aca

7569

Val

Ala

Asp

Leu

Ala

Asp

Ala

Thr

Arg

Leu

Pro

Ala

Thr

2510

2515

2520

tcc

att

ccg

ctg

ttg

caa

att

ggt

gat

tcc

acg

gga

acc

tcg

7614

Ser

Ile

Pro

Leu

Gin

Ile

Gly

Asp

Ser

Thr

Gly

Thr

Ser

2525

2530

2535

gac

agc

ggg

gct

tet

ccg

aca

cca

aca

gac

agc

cat

gat

gaa

gca

7659

Asp

Ser

Gly

Ala

Ser

Pro

Thr

Pro

Thr

Asp

Ser

His

Asp

Glu

Ala

2540

2545

2550

agc

tet

gct

acc

agc

aca

gat

gcg

tcg

tea

gcc

gaa

gag

gat

gaa

7704

Ser

Ala

Thr

Ser

Thr

Asp

Ala

Ser

Ala

Glu

Asp

Glu

2555

2560

2565

gag

caa

gag

gac

gat

aat

gag

cag

gga

ggc

cgt

aag

att

ctt

cgt

7749

Glu

Gin

Glu

Asp

Asn

Glu

Gin

Gly

Arg

Lys

Ile

Leu

Arg

2570

2575

2580

cgc

gag

agg

ttg

tcc

ctt

ggc

cag

gag

tat

tcc

tgg

agg

cag

caa

7794

Arg

Glu

Arg

Leu

Ser

Leu

Gly

Gin

Glu

Tyr

Ser

Trp

Arg

Gin

2585

2590

2595

caa

atg

gta

aaa

gat

cat

acc

atc

ttc

aac

act

att

ggc

atg

7839

Gin

Met

Val

Lys

Asp

His

Thr

Ile

Phe

Asn

Thr

Ile

Gly

Met

2600

2605

2610

ttc

atg

aag

ggt

acc

att

gac

ctc

gac

cgg

ttg

agg

cgg

gct

ctg

7884

Phe

Met

Lys

Gly

Thr

Ile

Asp

Leu

Asp

Arg

Leu

Arg

Ala

Leu

2615

2620

2625

aaa

gcc

tea

ttg

cgc

cgt

cac

gag

atc

ttc

cgt

acg

tgc

ttt

gtt

7929

Lys

Ala

Ser

Leu

Arg

His

Glu

Ile

Phe

Arg

Thr

Cys

Phe

Val

2630

2635

2640

act

ggc

gat

gac

tat

agc

gat

tta

aat

ggt

ccc

gtc

caa

gtg

7974

Thr

Gly

Asp

Tyr

Ser

Asp

Leu

Asn

Gly

Pro

Val

Gin

Val

2645

2650

2655

gtt

ctc

aag

aac

ccg

gag

aac

aga

gtg

cac

ttt

gtt

cag

gtg

aac

8019

Val

Leu

Lys

Asn

Pro

Glu

Asn

Arg

Val

His

Phe

Val

Gin

Val

Asn

2660

2665

2670

aac

gct

gcg

gag

gca

gag

gaa

gag

tac

cgg

aaa

ctc

gag

aag

aca

8064

Asn

Ala

Glu

Ala

Glu

Tyr

Arg

Lys

Leu

Glu

Lys

Thr

2675

2680

2685

aac

tat

agc

atc

tcc

aca

ggt

gac

act

ctc

aga

ctc

gtt

gat

ttc

8109

Asn

Tyr 2690

Ser

Ile

Ser Thr

Gly 2695

Asp

Thr

Leu

Arg Leu 2700

Val

Asp

Phe

tac

tgg

ggc

aca

gat

gac

cac

ctg

ttg

gta

atc

ggc

tac

cac

aga

8154

Tyr

Trp

Gly

Thr

Asp

His

Leu

Val

Ile

Gly

Tyr

His

Arg

2705

2710

2715

tta

gtt

ggt

gat

ggc

tea

aca

gaa

aac

ctg

ttc

aat

gag

atc

8199

Leu

Val

Gly

Asp

Gly

Ser

Thr

Glu

Asn

Leu

Phe

Asn

Glu

Ile

2720

2725

2730

ggg

cag

att

tac

age

ggg

gtg

aaa

atg

cag

ega

cca

tcg

acc

caa

8244

Gly

Gin

Ile

Tyr

Ser

Gly

Val

Lys

Met

Gin

Arg

Pro

Ser

Thr

Gin

2735

2740

2745

ttc

tet

gat

cta

gcc

gtc

caa

cag

cgg

gaa

aac

ctg

gaa

aat

ggg

8289

Phe

Ser

Asp

Leu

Ala

Val

Gin

Arg

Glu

Asn

Leu

Glu

Asn

Gly

2750

2755

2760

ega

atg

ggg

gac

gat

atc

gcg

ttc

tgg

aag

tcc

atg

cat

age

aaa

8334

Arg

Met

Gly

Asp

Ile

Ala

Phe

Trp

Lys

Ser

Met

His

Ser

Lys

2765

2770

2775

gtc

tcg

tea

tet

gcg

cca

acc

gtg

ctt

CCC

atc

atg

aat

ctg

atc

8379

Val

Ser

Ala

Pro

Thr

Val

Leu

Pro

Ile

Met

Asn

Leu

Ile

2780

2785

2790

aat

gac

cct

get

gcc

aat

tea

gag

cag

caa

ata

cag

cca

ttc

8424

Asn

Asp

Pro

Ala

Asn

Ser

Glu

Gin

Ile

Gin

Pro

Phe

2795

2800

2805

acg

tgg

cag

tat

gaa

gca

att

get

cgt

tta

gat

CCC

atg

gtc

8469

Thr

Trp

Gin

Tyr

Glu

Ala

Ile

Ala

Arg

Leu

Asp

Pro

Met

Val

2810

2815

2820

gcc

ttc

ega

atc

aaa

gag

cgg

age

ege

aag

cac

aag

gca

acc

CCC

8514

Ala

Phe

Arg

Ile

Lys

Glu

Arg

Ser

Arg

Lys

His

Lys

Ala

Thr

Pro

2825

2830

2835

atg

cag

ttc

tac

ctg

gcc

tac

cac

gtt

ttg

gcg

cgt

ctt

8559

Met

Gin

Phe

Tyr

Leu

Ala

Tyr

His

Val

Leu

Ala

Arg

Leu

2840

2845

2850

acc

ggc

age

aaa

gac

ata

acc

atc

ggc

ctc

gcc

gaa

acc

aac

ega

8604

Thr

Gly

Ser

Lys

Asp

Ile

Thr

Ile

Gly

Leu

Ala

Glu

Thr

Asn

Arg

2855

2860

2865

tcc

acc

atg

gaa

att

tcg

gcg

atg

ggc

ttt

ttc

get

aac

gtg

8649

Ser

Thr

Met

Glu

Ile

Ser

Ala

Met

Gly

Phe

Ala

Asn

Val

2870

2875

2880

ctt

CCC

ctg

ege

ttt

gat

gag

ttc

gtc

ggc

age

aag

aca

ttc

ggc

8694

Leu

Pro

Leu

Arg

Phe

Asp

Glu

Phe

Val

Gly

Ser

Lys

Thr

Phe

Gly

2885

2890

2895

gag

cac

ctt

gta

gcc

acc

aag

gac

agt

gtg

cgt

gag

gcc

atg

caa

8739

Glu

His

Leu

Val

Ala

Thr

Lys

Asp

Ser

Val

Arg

Glu

Ala

Met

Gin

2900

2905

2910

cac

gcg

cgg

gtg

ccg

tat

ggc

gtc

atc

ctc

gac

tgt

cta

ggc

ctg

8784

His

Ala

Arg

Val

Pro

Tyr

Gly

Val

Ile

Leu

Asp

Cys

Leu

Gly

Leu

2915 2920 2925

aat Asn

ctc Leu 2930

cct Pro

acc Thr

tca Ser

ggc Gly

gag Glu 2935

gaa Glu

ccc Pro

aag Lys

act Thr

cag Gin 2940

aca Thr

cac His

gcc Ala

8829

ccc

ttg

ttc

cag

gct

gtc

ttt

gat

tac

aag

cag

ggt

caa

gcg

gag

8874

Pro

Leu

Phe

Gin

Ala

Val

Phe

Asp

Tyr

Lys

Gin

Gly

Gin

Ala

Glu

2945

2950

2955

agt

ggc

tca

att

ggc

aat

gcc

aaa

atg

acg

agt

gtt

ctc

gct

tcc

8919

Ser

Gly

Ser

Ile

Gly

Asn

Ala

Lys

Met

Thr

Ser

Val

Leu

Ala

Ser

2960

2965

2970

cgt

gag

cgc

act

cct

tat

gac

atc

gtt

ctc

gag

atg

tgg

gat

gac

8964

Arg

Glu

Arg

Thr

Pro

Tyr

Asp

Ile

Val

Leu

Glu

Met

Trp

Asp

2975

2980

2985

cct

acc

aag

gac

cca

ctc

att

cat

gtc

aaa

ctt

cag

agc

tcg

ctg

9009

Pro

Thr

Lys

Asp

Pro

Leu

Ile

His

Val

Lys

Leu

Gin

Ser

Leu

2990

2995

3000

tat

ggc

cct

gag

cac

gct

cag

gcc

ttt

gta

gac

cac

ttt

tet

tca

9054

Tyr

Gly

Pro

Glu

His

Ala

Gin

Ala

Phe

Val

Asp

His

Phe

Ser

3005

3010

3015

atc

ctc

act

atg

ttc

tcg

atg

aac

ccg

gct

ctg

aag

ttg

gcc

tag

9099

Ile

Leu

Thr

Met

Phe

Ser

Met

Asn

Pro

Ala

Leu

Lys

Leu

Ala

3020 3025 3030

<210>	44
<211>	3032
<212>	PRT
<213>	Penicillium citrinum

<400> 44

Met Asp 1

Gin

Ala Asn 5

Tyr

Pro Asn Glu

Pro 10

Ile Val Val Val

Gly 15

Ser

Gly

Cys

Arg

Phe

Pro

Gly

Val

Asn

Thr

Pro

Ser

Lys

Leu

Trp

Glu

20

25

30

Leu

Lys

Glu

Pro

Arg

Asp

Val

Gin

Thr

Lys

Ile

Pro

Lys

Glu

Arg

35

40

45

Phe

Asp

Val

Asp

Thr

Phe

Tyr

Ser

Pro

Asp

Gly

Thr

His

Pro

Gly

Arg

50

55

60

Thr

Asn

Ala

Pro

Phe

Ala

Tyr

Leu

Gin

Glu

Asp

Leu

Arg

Gly

Phe

65

70

75

80

Asp Ala

Ser

Phe

Phe Asn 85

Ile

Gin Ala

Gly Glu 90

Ala

Glu

Thr

Ile 95

Asp

Pro

Gin

Arg

Leu

Glu

Thr

Val

Tyr

Glu

Ala

Val

Ser

Asn

100

105

110

Ala

Gly

Leu

Arg

Ile

Gin

Gly

Leu

Gin

Gly

Ser

Thr

Ala

Val

Tyr

115

120

125

Val

Gly

Met

Thr

His

Asp

Tyr

Glu

Thr

Ile

Val

Thr

Arg

Glu

Leu

130

135

140

Asp

Ser

Ile

Pro

Thr

Tyr

Ser

Ala

Thr

Gly

Val

Ala

Val

Ser

Val

Ala

145

150

155

160

Ser

Asn

Arg

Val

Ser

Tyr

Phe

Asp

Trp

His

Gly

Pro

Ser

Met

Thr

165

170

175

Ile

Asp

Thr

Ala

Cys

Ser

Leu

Ala

Val

His

Leu

Ala

Val

180

185

190

Gin

Leu

Arg

Thr

Gly

Glu

Ser

Thr

Met

Ala

Val

Ala

Gly

Ala

195

200

205

Asn

Leu

Ile

Leu

Gly

Pro

Met

Thr

Phe

Val

Met

Glu

Ser

Lys

Leu

Asn

210

215

220

Met

Leu

Ser

Pro

Asn

Gly

Arg

Ser

Arg

Met

Trp

Asp

Ala

Asp

225

230

235

240

Gly

Tyr

Ala

Arg

Gly

Glu

Gly

Val

Cys

Ser

Ile

Val

Leu

Lys

Thr

Leu

245

250

255

Ser

Gin

Ala

Leu

Arg

Asp

Gly

Asp

Ser

Ile

Glu

Cys

Val

Ile

Arg

Glu

260

265

270

Thr

Gly

Ile

Asn

Gin

Asp

Gly

Arg

Thr

Gly

Ile

Thr

Met

Pro

Asn

275

280

285

His

Ser

Ala

Gin

Glu

Ala

Leu

Ile

Arg

Ala

Thr

Tyr

Ala

Lys

Ala

Gly

290

295

300

Leu

Asp

Ile

Thr

Asn

Pro

Gin

Glu

Arg

Cys

Gin

Phe

Glu

Ala

His

305

310

315

320

• ·

Gly Thr

Pro 325

Ala

Gly

Asp

Pro

Gin 330

Glu Ala

Ile Ala 335

Thr

Ala

Phe

Gly

His

Lys

Asp

Gly

Thr

Ile

Asp

Ser

Asp

Gly

Glu

340

345

350

Lys

Asp

Glu

Leu

Phe

Val

Gly

Ser

Ile

Lys

Thr

Val

Leu

Gly

His

Thr

355

360

365

Glu Gly

Thr Ala Gly

Ile Ala Gly Leu 375

Met

Lys

Ala 380

Ser

Phe Ala

Val

370

Arg

Asn

Gly

Val

Ile

Pro

Asn

Leu

Phe

Glu

Lys

Ile

Ser

Pro

385

390

395

400

Arg

Val

Ala

Pro

Phe

Tyr

Thr

His

Leu

Lys

Ile

Ala

Thr

Glu

Ala

Thr

405

410

415

Glu

Trp

Pro

Ile

Val

Ala

Pro

Gly

Gin

Pro

Arg

Val

Ser

Val

Asn

420

425

430

Ser

Phe

Gly

Phe

Gly

Thr

Asn

Ala

His

Ala

Ile

Glu

Tyr

435

440

445

Met

Ala

Pro

His

Lys

Pro

Thr

Ala

Val

Thr

Glu

Val

Thr

Ser

450

455

460

Asp

Ala

Asp

Ala

Cys

Ser

Leu

Pro

Leu

Val

Leu

Ser

Lys

Ser

Gin

465

470

475

480

Arg

Ser

Met

Lys

Ala

Thr

Leu

Glu

Asn

Met

Leu

Gin

Phe

Leu

Glu

Thr

485

490

495

His

Asp

Val

Asp

Met

His

Asp

Ile

Ala

Tyr

Thr

Leu

Glu

Lys

500

505

510

Arg

Ser

Ile

Leu

Pro

Phe

Arg

Ala

Ile

Ala

His

Asn

Lys

Glu

515

520

525

Val

Ala

Arg

Ala

Leu

Glu

Ala

Ile

Ala

Asp

Gly

Glu

Val

530

535

540

Thr

Asp

Phe

Arg

Thr

Asp

Ala

Asn

Asp

Asn

Pro

Arg

Val

Leu

Gly

Val

545

550

555

560

Phe

Thr

Gly Gin

Gly 565

Ala

Gin Trp

Pro Gly 570

Met

Leu

Lys

Leu 575

Met

Val

Gly

Met

Pro

Phe

Val

Arg

Gly

Ile

Leu

Glu

Leu

Asp

Asn

Ser

580

585

590

Leu

Gin

Thr

Leu

Pro

Glu

Lys

Tyr

Arg

Pro

Thr

Trp

Thr

Leu

Tyr

Asp

595

600

605

Gin

Leu

Met

Leu

Glu

Gly

Asp

Ala

Ser

Asn

Val

Arg

Leu

Ala

Ser

Phe

610

615

620

Ser

Gin

Pro

Leu

Cys

Ala

Val

Gin

Ile

Val

Leu

Val

Arg

Leu

625

630

635

640

Ala

Gly

Ile

Glu

Phe

Ser

Ala

Ile

Val

Gly

His

Ser

Gly

645

650

655

Glu

Ile

Ala

Cys

Ala

Phe

Ala

Gly

Phe

Ile

Ser

Ala

Thr

Gin

Ala

660

665

670

Ile

Arg

Ile

Ala

His

Leu

Arg

Gly

Val

Ser

Ala

Glu

His

Ala

Ser

675

680

685

Ser

Pro

Ser

Gly

Gin

Thr

Gly

Ala

Met

Leu

Ala

Gly

Met

Ser

Tyr

690

695

700

Asp

Ala

Lys

Glu

Leu

Cys

Glu

Leu

Glu

Ala

Phe

Glu

Gly

Arg

Val

705

710

715

720

Cys

Val

Ala

Ser

Asn

Ser

Pro

Asp

Ser

Val

Thr

Phe

Ser

Gly

Asp

725

730

735

Met

Asp

Ala

Ile

Gin

His

Val

Glu

Gly

Val

Leu

Glu

Asp

Glu

Ser

Thr

740

745

750

Phe

Ala

Arg

Ile

Leu

Arg

Val

Asp

Lys

Ala

Tyr

His

Ser

His

Met

755

760

765

His

Pro

Cys

Ala

Pro

Tyr

Val

Lys

Ala

Leu

Glu

Cys

Asp

Cys

770

775

780

Ala

Val

Ala

Asp

Gly

Gin

Gly

Asn

Asp

Ser

Val

Ala

Trp

Phe

Ser

Ala

785

790

795

800

Val

His

Glu

Thr

Ser

Lys

Gin

Met

Thr

Val

Gin

Asp

Val

Met

Pro

Ala

Ί9

805

810

815

Tyr Trp

Lys Asp Asn 820

Leu Val

Ser

Pro Val 825

Leu Phe

Ser

Gin 830

Ala

Val

Gin

Lys

Ala

Val

Ile

Thr

His

Arg

Leu

Ile

Asp

Val

Ala

Ile

Glu

Ile

835

840

845

Gly

Ala

His

Pro

Ala

Leu

Lys

Gly

Pro

Cys

Leu

Ala

Thr

Ile

Lys

Asp

850

855

860

Ala

Leu

Ala

Gly

Val

Glu

Leu

Pro

Tyr

Thr

Gly

Cys

Leu

Ala

Arg

Asn

865

870

875

880

Val

Asp

Val

Asp

Ala

Phe

Ala

Gly

Leu

Gly

Tyr

Ile

Trp

Glu

885

890

895

Arg

Phe

Gly

Val

Arg

Ser

Ile

Asp

Ala

Glu

Gly

Phe

Val

Gin

Val

900

905

910

Arg

Pro

Asp

Arg

Ala

Val

Gin

Asn

Leu

Ser

Lys

Ser

Leu

Pro

Thr

Tyr

915

920

925

Ser

Trp

Asp

His

Thr

Arg

Gin

Tyr

Trp

Ala

Glu

Ser

Arg

Ser

Thr

Arg

930

935

940

Gin

His

Leu

Arg

Gly

Ala

Pro

His

Leu

Gly

Lys

Leu

Ser

945

950

955

960

Ser

Tyr

Ser

Thr

Ala

Ser

Thr

Phe

Gin

Trp

Thr

Asn

Phe

Ile

Arg

Pro

965

970

975

Arg

Asp

Leu

Glu

Trp

Leu

Asp

Gly

His

Ala

Leu

Gin

Gly

Gin

Thr

Val

980

985

990

Phe Pro Ala Ala Gly Tyr Ile

995

Ile Met Ala Met Glu Ala Ala Met Lys

1000 1005

Val Ala 1010

Gly

Glu

Arg

Ala

Ala 1015

Gin Val

Gin

Leu

Leu 1020

Glu

Ile

Leu

Asp

Met

Ser

Ile

Asn

Lys

Ala

Ile

Val

Phe

Glu

Asp

Glu

Asn

Thr

1025

1030

1035

Ser

Val

Glu

Leu

Asn

Leu

Thr

Ala

Glu

Val

Thr

Ser

Asp

Asn

Asp

1040

1045

1050

Ala Asp

Gly

Gin

Val

Thr

Val 1060

Lys

Phe

Val

Ile Asp 1065

Ser

Cys

Leu

1055

Ala

Lys

Glu

Ser

Glu

Leu

Ser

Thr

Ser

Ala

Lys

Gly

Gin

Ile

Val

1070

1075

1080

Ile

Thr

Leu

Gly

Glu

Ala

Ser

Pro

Ser

Gin

Leu

Pro

1085

1090

1095

Pro

Glu

Tyr

Pro

Gin

Met

Asn

Val

Asn

Ile

Asp

Phe

1100

1105

1110

Phe

Tyr

Arg

Glu

Leu

Asp

Leu

Gly

Tyr

Asp

Tyr

Ser

Lys

Asp

1115

1120

1125

Phe

Arg

Leu

Gin

Thr

Met

Arg

Ala

Asp

Ser

Lys

Ala

Ser

1130

1135

1140

Gly

Thr

Leu

Ala

Phe

Leu

Pro

Leu

Lys

Asp

Glu

Leu

Arg

Asn

Glu

1145

1150

1155

Pro

Leu

His

Pro

Ala

Pro

Leu

Asp

Ile

Ala

Phe

Gin

Thr

1160

1165

1170

Val

Ile

Gly

Ala

Tyr

Ser

Pro

Gly

Asp

Arg

Leu

Arg

Ser

1175

1180

1185

Leu

Tyr

Val

Pro

Thr

His

Val

Asp

Arg

Val

Thr

Leu

Ile

Pro

Ser

1190

1195

1200

Leu

Cys

Ile

Ser

Ala

Gly

Asn

Ser

Gly

Glu

Thr

Glu

Leu

Ala

Phe

1205

1210

1215

Asp

Thr

Ile

Asn

Thr

His

Asp

Lys

Gly

Asp

Phe

Leu

Ser

Gly

Asp

1220

1225

1230

Ile

Thr

Val

Tyr

Asp

Ser

Thr

Lys

Thr

Leu

Phe

Gin

Val

Asp

1235

1240

1245

Asn

Ile

Val

Phe

Lys

Pro

Phe

Ser

Pro

Thr

Ala

Ser

Thr

Asp

1250

1255

1260

His

Arg

Ile

Phe

Ala

Lys

Trp

Val

Trp

Gly

Pro

Leu

Thr

Pro

Glu

1265

1270

1275

Lys

Leu 1280

Leu

Glu Asp

Pro

Ala 1285

Thr

Leu

Ile

Ala 1290

Arg

Asp

Lys

Glu

Asp

Ile

Leu

Thr

Ile

Glu

Arg

Ile

Val

Tyr

Phe

Tyr

Ile

Lys

1295

1300

1305

Ser

Phe

Leu

Ala

Gin

Ile

Thr

Pro

Asp

Arg

Gin

Asn

Ala

Asp

1310

1315

1320

Leu

His

Ser

Gin

Lys

Tyr

Ile

Glu

Trp

Cys

Asp

Gin

Val

Gin

Ala

1325

1330

1335

Asp

Ala

Arg

Ala

Gly

His

Gin

Trp

Tyr

Gin

Glu

Ser

Trp

Glu

1340

1345

1350

Glu

Asp

Thr

Ser

Val

His

Ile

Glu

Gin

Met

Cys

Glu

Ser

Asn

Ser

1355

1360

1365

Ser

His

Pro

His

Val

Arg

Leu

Ile

Gin

Arg

Val

Gly

Lys

Glu

Leu

1370

1375

1380

Ile

Ser

Ile

Val

Arg

Gly

Asn

Gly

Asp

Pro

Leu

Asp

Ile

Met

Asn

1385

1390

1395

Arg

Asp

Gly

Leu

Phe

Thr

Glu

Tyr

Thr

Asn

Lys

Leu

Ala

Phe

1400

1405

1410

Gly

Ser

Ala

Ile

His

Val

Gin

Asp

Leu

Val

Ser

Gin

Ile

Ala

1415

1420

1425

His

Arg

Tyr

Gin

Ser

Ile

Asp

Ile

Leu

Glu

Ile

Gly

Leu

Gly

Thr

1430

1435

1440

Gly

Ile

Ala

Thr

Lys

Arg

Val

Leu

Ala

Ser

Pro

Gin

Leu

Gly

Phe

1445

1450

1455

Asn

Ser

Tyr

Thr

Cys

Thr

Asp

Ile

Ser

Ala

Asp

Val

Ile

Gly

Lys

1460

1465

1470

Ala

Arg

Glu

Gin

Leu

Ser

Glu

Phe

Asp

Gly

Leu

Met

Gin

Phe

Glu

1475

1480

1485

Ala

Leu

Asp

Ile

Asn

Arg

Ser

Pro

Ala

Glu

Gin

Gly

Phe

Lys

Pro

1490

1495

1500

His

Ser 1505

Tyr

Asp Leu

Ile

Ile 1510

Ala

Ser

Asp

Val

Leu 1515

His

Ala

Ser

Asn

Phe

Glu

Lys

Leu

Ala

His

Ile

Arg

Ser

Leu

Lys

1520

1525

1530

Pro

Gly

His

Leu

Val

Thr

Phe

Gly

Val

Thr

His

Arg

Glu

Pro

1535

1540

1545

Ala

Arg

Leu

Ala

Phe

Ile

Ser

Gly

Leu

Phe

Ala

Asp

Arg

Trp

Thr

1550

1555

1560

Gly

Glu

Asp

Glu

Thr

Arg

Ala

Leu

Ser

Ala

Ser

Gly

Ser

Val

Asp

1565

1570

1575

Gin

Trp

Glu

His

Thr

Leu

Lys

Arg

Val

Gly

Phe

Ser

Gly

Val

Asp

1580

1585

1590

Ser

Arg

Thr

Leu

Asp

Arg

Glu

Asp

Leu

Ile

Pro

Ser

Val

Phe

1595

1600

1605

Ser

Thr

His

Ala

Val

Asp

Ala

Thr

Val

Glu

Arg

Leu

Tyr

Asp

Pro

1610

1615

1620

Leu

Ser

Ala

Pro

Leu

Lys

Asp

Ser

Tyr

Pro

Leu

Val

Ile

1625

1630

1635

Gly

Glu

Ser

Thr

Lys

Thr

Glu

Arg

Ile

Leu

Asn

Asp

Met

Lys

1640

1645

1650

Ala

Leu

Pro

His

Arg

His

Ile

His

Ser

Val

Lys

Arg

Leu

Glu

1655

1660

1665

Ser

Val

Leu

Asp

Pro

Ala

Leu

Gin

Pro

Lys

Ser

Thr

Phe

Val

1670

1675

1680

Ile

Leu

Ser

Glu

Leu

Asp

Glu

Val

Phe

Cys

Asn

Leu

Glu

1685

1690

1695

Asp

Lys

Phe

Glu

Ala

Val

Lys

Ser

Leu

Phe

Tyr

Ala

Gly

Arg

1700

1705

1710

Met

Trp

Leu

Thr

Glu

Asn

Ala

Trp

Ile

Asp

His

Pro

His

Gin

1715

1720

1725

Ala

Ser

Thr

Ile

Gly

Met

Leu

Arg

Thr

Ile

Lys

Leu

Glu

Asn

Pro

1730

1735

1740

Asp Leu

Gly Thr

His Val

Phe 1750

Asp

Val

Asp Thr

Val 1755

Glu

Asn

Leu

1745

Asp

Thr

Lys

Phe

Val

Glu

Gin

Leu

Arg

Phe

Glu

Ser

1760

1765

1770

Asp

Gin

Leu

Glu

Ser

Ile

Thr

Trp

Thr

His

Glu

Pro

Glu

1775

1780

1785

Val

Tyr

Trp

Cys

Lys

Gly

Arg

Ala

Trp

Val

Pro

Arg

Leu

Lys

Gin

1790

1795

1800

Asp

Ile

Ala

Arg

Asn

Asp

Arg

Met

Asn

Ser

Arg

Pro

Ile

1805

1810

1815

Phe

Gly

Asn

Phe

Asn

Ser

Lys

Thr

Ala

Ile

Ala

Leu

Lys

Glu

1820

1825

1830

Ala

Arg

Gly

Ala

Ser

Met

Tyr

Leu

Glu

Ser

Thr

Glu

1835

1840

1845

Thr

Cys

Asp

Ser

Leu

Glu

Asp

Ala

Arg

His

Ala

Gly

Lys

Ala

Thr

1850

1855

1860

Val

Arg

Val

Arg

Tyr

Ala

Leu

Pro

Gin

Ala

Ile

Arg

Val

Gly

His

1865

1870

1875

Leu

Gly

Tyr

Phe

His

Val

Gin

Gly

Ser

Ile

Leu

Glu

Asn

Thr

1880

1885

1890

Cys

Glu

Val

Pro

Val

Ala

Leu

Ala

Glu

Lys

Asn

Gly

Ser

Ile

1895

1900

1905

Leu

His

Val

Pro

Arg

Asn

Tyr

Met

His

Ser

Leu

Pro

Asp

Asn

Met

1910

1915

1920

Ala

Glu

Gly

Glu

Asp

Ser

Phe

Leu

Ser

Thr

Ala

1925

1930

1935

Leu

Ala

Glu

Thr

Ile

Leu

Ser

Ala

Gin

Ser

Phe

Gly

Ser

1940

1945

1950

Asp

Ala

Ser

Ile

Leu

Ile

Met

Glu

Pro

Ile

Phe

Cys

Val

Lys

1955

1960

1965

Ala

Ile 1970

Leu

Glu

Ser Ala

Lys 1975

Thr

Tyr

Gly

Val

Gin 1980

Val

His

Leu

Ala

Thr

Leu

Ser

Asp

Val

Lys

Thr

Ile

Pro

Ala

Pro

Trp

Ile

1985

1990

1995

Arg

Leu

His

Ala

Lys

Glu

Thr

Asp

Ala

Arg

Leu

Lys

His

Ser

Leu

2000

2005

2010

Pro

Thr

Asn

Met

Ala

Phe

Asp

Leu

Ser

Thr

Asp

Arg

Thr

2015

2020

2025

Ala

Gly

Ile

Thr

Asn

Arg

Leu

Ala

Lys

Leu

Pro

Ser

2030

2035

2040

Cys

Phe

Met

Tyr

Ser

Gly

Asp

Tyr

Leu

Ile

Arg

Ser

Thr

Ala

Ser

2045

2050

2055

Thr

Tyr

Lys

Val

Ser

His

Val

Glu

Asp

Ile

Pro

Ile

Leu

Glu

His

2060

2065

2070

Ser

Val

Ala

Met

Ala

Lys

Asn

Thr

Val

Ser

Ala

Ser

Thr

Val

Asp

2075

2080

2085

Asp

Thr

Glu

Lys

Val

Ile

Thr

Ala

Thr

Gin

Ile

Leu

Pro

Gly

2090

2095

2100

Gin

Leu

Ser

Val

Asn

His

Asn

Asp

Gin

Arg

Phe

Asn

Leu

Ala

Thr

2105

2110

2115

Val

Ile

Asp

Trp

Lys

Glu

Asn

Glu

Val

Ser

Ala

Arg

Ile

Cys

Pro

2120

2125

2130

Ile

Asp

Ser

Gly

Asn

Leu

Phe

Ser

Asn

Lys

Thr

Tyr

Leu

2135

2140

2145

Val

Gly

Leu

Thr

Gly

Asp

Leu

Gly

Arg

Ser

Leu

Cys

Arg

Trp

Met

2150

2155

2160

Ile

Leu

His

Gly

Ala

Arg

His

Val

Leu

Thr

Ser

Arg

Asn

Pro

2165

2170

2175

Arg

Leu

Asp

Pro

Lys

Trp

Ile

Ala

Asn

Met

Glu

Ala

Leu

Gly

2180

2185

2190

Asp

Ile 2195

Thr Val

Leu

Ser

Met 2200

Asp

Val Ala Asn

Glu 2205

Asp

Ser

Val

Asp

Ala

Gly

Leu

Gly

Lys

Leu

Val

Asp

Met

Lys

Leu

Pro

Val

2210

2215

2220

Ala

Gly

Ile

Ala

Phe

Gly

Pro

Leu

Val

Leu

Gin

Asp

Val

Met

Leu

2225

2230

2235

Lys

Asn

Met

Asp

His

Gin

Met

Asp

Met

Val

Leu

Lys

Pro

Lys

2240

2245

2250

Val

Gin

Gly

Ala

Arg

Ile

Leu

His

Glu

Arg

Phe

Ser

Glu

Gin

Thr

2255

2260

2265

Gly

Ser

Lys

Ala

Leu

Asp

Phe

Ile

Met

Phe

Ser

Ile

Val

2270

2275

2280

Ala

Val

Ile

Gly

Asn

Pro

Gly

Gin

Ser

Asn

Tyr

Gly

Ala

Asn

2285

2290

2295

Ala

Tyr

Leu

Gin

Ala

Leu

Ala

Gin

Arg

Cys

Ala

Arg

Gly

Leu

2300

2305

2310

Ala

Gly

Ser

Thr

Ile

Asp

Ile

Gly

Ala

Val

Tyr

Gly

Val

Gly

Phe

2315

2320

2325

Val

Thr

Arg

Ala

Glu

Met

Glu

Asp

Phe

Asp

Ala

Ile

Arg

Phe

2330

2335

2340

Met

Phe

Asp

Ser

Val

Glu

His

Glu

Leu

His

Thr

Leu

Phe

Ala

2345

2350

2355

Glu

Ala

Val

Ser

Asp

Gin

Arg

Ala

Arg

Gin

Pro

Gin

Arg

2360

2365

2370

Lys

Thr

Val

Ile

Asp

Met

Ala

Asp

Leu

Glu

Leu

Thr

Gly

Ile

2375

2380

2385

Pro

Asp

Leu

Asp

Pro

Ala

Leu

Gin

Asp

Arg

Ile

Tyr

Phe

Asn

2390

2395

2400

Asp

Pro

Arg

Phe

Gly

Asn

Phe

Lys

Ile

Pro

Gly

Gin

Arg

Gly

Asp

2405

2410

2415

• ·

Gly

Gly 2420

Asp

Asn

Gly Ser

Gly 2425

Ser Lys

Gly

Ser

Ile 2430

Ala

Asp

Gin

Leu

Lys

Gin

Ala

Thr

Leu

Asp

Gin

Val

Arg

Gin

Ile

Val

Ile

2435

2440

2445

Asp

Gly

Leu

Ser

Glu

Lys

Leu

Arg

Val

Thr

Leu

Gin

Val

Ser

Asp

2450

2455

2460

Gly

Glu

Ser

Val

Asp

Pro

Thr

Ile

Pro

Leu

Ile

Asp

Gin

Gly

Val

2465

2470

2475

Asp

Ser

Leu

Gly

Ala

Val

Thr

Val

Gly

Ser

Trp

Phe

Ser

Lys

Gin

2480

2485

2490

Leu

Tyr

Leu

Asp

Leu

Pro

Leu

Arg

Val

Leu

Gly

Ala

Ser

2495

2500

2505

Val

Ala

Asp

Leu

Ala

Asp

Ala

Thr

Arg

Leu

Pro

Ala

Thr

2510

2515

2520

Ser

Ile

Pro

Leu

Gin

Ile

Gly

Asp

Ser

Thr

Gly

Thr

Ser

2525

2530

2535

Asp

Ser

Gly

Ala

Ser

Pro

Thr

Pro

Thr

Asp

Ser

His

Asp

Glu

Ala

2540

2545

2550

Ser

Ala

Thr

Ser

Thr

Asp

Ala

Ser

Ala

Glu

Asp

Glu

2555

2560

2565

Glu

Gin

Glu

Asp

Asn

Glu

Gin

Gly

Arg

Lys

Ile

Leu

Arg

2570

2575

2580

Arg

Glu

Arg

Leu

Ser

Leu

Gly

Gin

Glu

Tyr

Ser

Trp

Arg

Gin

2585

2590

2595

Gin

Met

Val

Lys

Asp

His

Thr

Ile

Phe

Asn

Thr

Ile

Gly

Met

2600

2605

2610

Phe

Met

Lys

Gly

Thr

Ile

Asp

Leu

Asp

Arg

Leu

Arg

Ala

Leu

2615

2620

2625

Lys

Ala

Ser

Leu

Arg

His

Glu

Ile

Phe

Arg

Thr

Cys

Phe

Val

2630

2635

2640

Thr

Gly

Asp

Tyr

Ser

Asp

Leu

Asn

Gly

Pro

Val

Gin

Val

2645

2650

2655

Val

Leu 2660

Lys

Asn

Pro

Glu Asn 2665

Arg

Val

His

Phe

Val 2670

Gin

Val

Asn

Ala

Glu

Ala

Glu

Tyr

Arg

Lys

Leu

Glu

Lys

Thr

2675

2680

2685

Asn

Tyr

Ser

Ile

Ser

Thr

Gly

Asp

Thr

Leu

Arg

Leu

Val

Asp

Phe

2690

2695

2700

Tyr

Trp

Gly

Thr

Asp

His

Leu

Val

Ile

Gly

Tyr

His

Arg

2705

2710

2715

Leu

Val

Gly

Asp

Gly

Ser

Thr

Glu

Asn

Leu

Phe

Asn

Glu

Ile

2720

2725

2730

Gly

Gin

Ile

Tyr

Ser

Gly

Val

Lys

Met

Gin

Arg

Pro

Ser

Thr

Gin

2735

2740

2745

Phe

Ser

Asp

Leu

Ala

Val

Gin

Arg

Glu

Asn

Leu

Glu

Asn

Gly

2750

2755

2760

Arg

Met

Gly

Asp

Ile

Ala

Phe

Trp

Lys

Ser

Met

His

Ser

Lys

2765

2770

2775

Val

Ser

Ala

Pro

Thr

Val

Leu

Pro

Ile

Met

Asn

Leu

Ile

2780

2785

2790

Asn

Asp

Pro

Ala

Asn

Ser

Glu

Gin

Ile

Gin

Pro

Phe

2795

2800

2805

Thr

Trp

Gin

Tyr

Glu

Ala

Ile

Ala

Arg

Leu

Asp

Pro

Met

Val

2810

2815

2820

Ala

Phe

Arg

Ile

Lys

Glu

Arg

Ser

Arg

Lys

His

Lys

Ala

Thr

Pro

2825

2830

2835

Met

Gin

Phe

Tyr

Leu

Ala

Tyr

His

Val

Leu

Ala

Arg

Leu

2840

2845

2850

Thr

Gly

Ser

Lys

Asp

Ile

Thr

Ile

Gly

Leu

Ala

Glu

Thr

Asn

Arg

2855

2860

2865

Ser

Thr

Met

Glu

Ile

Ser

Ala

Met

Gly

Phe

Ala

Asn

Val

2870

2875

2880

Leu

Pro 2885

Leu Arg

Phe

Asp

Glu 2890

Phe Val

Gly

Ser

Lys 2895

Thr

Phe

Gly

Glu

His

Leu

Val

Ala

Thr

Lys

Asp

Ser

Val

Arg

Glu

Ala

Met

Gin

2900

2905

2910

His

Ala

Arg

Val

Pro

Tyr

Gly

Val

Ile

Leu

Asp

Cys

Leu

Gly

Leu

2915

2920

2925

Asn

Leu

Pro

Thr

Ser

Gly

Glu

Pro

Lys

Thr

Gin

Thr

His

Ala

2930

2935

2940

Pro

Leu

Phe

Gin

Ala

Val

Phe

Asp

Tyr

Lys

Gin

Gly

Gin

Ala

Glu

2945

2950

2955

Ser

Gly

Ser

Ile

Gly

Asn

Ala

Lys

Met

Thr

Ser

Val

Leu

Ala

Ser

2960

2965

2970

Arg

Glu

Arg

Thr

Pro

Tyr

Asp

Ile

Val

Leu

Glu

Met

Trp

Asp

2975

2980

2985

Pro

Thr

Lys

Asp

Pro

Leu

Ile

His

Val

Lys

Leu

Gin

Ser

Leu

2990

2995

3000

Tyr

Gly

Pro

Glu

His

Ala

Gin

Ala

Phe

Val

Asp

His

Phe

Ser

3005

3010

3015

Ile

Leu

Thr

Met

Phe

Ser

Met

Asn

Pro

Ala

Leu

Lys

Leu

Ala

3020

3025

3030

<210> 45 <211> 7692 <212> DNA <213> Penicillium citrinum <220>

<221> CDS <222> (1)..(7692) <400> 45

atg aac aat

acc Thr

ccc Pro 5

gcc Ala

gta Val

acc gca

acc Thr 10

gca Ala

acc Thr

gca Ala

acc Thr

gca Ala 15

acc Thr

48

Met Asn 1

Asn

Thr

Ala

gca

acc

gca

atg

gca

ggc

tcg

gct

tgc

tet

aac

aca

tcc

acg

ccc

att

96

Ala

Thr

Ala

Met

Ala

Gly

Ser

Ala

Cys

Ser

Asn

Thr

Ser

Thr

Pro

Ile

20

25

30

gcc

ata

gtt

gga

atg

gga

tgt

ega

ttt

gct

gga

gat

gca

acg

agt

cca

144

Ala

Ile

Val

Gly

Met

Gly

Cys

Arg

Phe

Ala

Gly

Asp

Ala

Thr

Ser

Pro

35

40

45

cag

aag

ctt

tgg

gaa

atg

gtt

gaa

aga

gga

ggc

agt

gcc

tgg

tet

aag

192

Gin

Lys

Leu

Trp

Glu

Met

Val

Glu

Arg

Gly

Ser

Ala

Trp

Ser

Lys

50

55

60

gtc

ccc

tcc

tcg

ega

ttc

aat

gtg

aga

gga

gta

tac

cac

ccg

aat

ggc

240

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Asn

Val

Arg

Gly

Val

Tyr

His

Pro

Asn

Gly

65

70

75

80

gaa

agg

gtc

ggg

tcc

acc

cac

gta

aag

ggt

gga

cac

ttc

atc

gac

gag

288

Glu

Arg

Val

Gly

Ser

Thr

His

Val

Lys

Gly

His

Phe

Ile

Asp

Glu

85

90

95

gat

cct

gct

tta

ttt

gac

gcc

gcg

ttc

aac

atg

acc

aca

gag

gtc

336

Asp

Pro

Ala

Leu

Phe

Asp

Ala

Phe

Asn

Met

Thr

Glu

Val

100

105

110

gcc

age

tgc

atg

gat

ccg

cag

tat

cgg

ctt

atg

ctt

gag

gtg

gtc

tac

384

Ala

Ser

Cys

Met

Asp

Pro

Gin

Tyr

Arg

Leu

Met

Leu

Glu

Val

Tyr

115

120

125

gaa

tcg

ctg

gag

agt

gcc

ggt

atc

acc

atc

gat

ggt

atg

gca

ggc

tet

432

Glu

Ser

Leu

Glu

Ser

Ala

Gly

Ile

Thr

Ile

Asp

Gly

Met

Ala

Gly

Ser

130

135

140

aat

acg

tcg

gtg

ttt

ggg

ggt

gtc

atg

tac

cac

gac

tat

cag

gat

tcg

480

Asn

Thr

Ser

Val

Phe

Gly

Val

Met

Tyr

His

Asp

Tyr

Gin

Asp

Ser

145

150

155

160

ctc

aat

cgt

gac

ccc

gag

aca

gtt

ccg

cgt

tat

ttc

ata

act

ggc

aac

528

Leu

Asn

Arg

Asp

Pro

Glu

Thr

Val

Pro

Arg

Tyr

Phe

Ile

Thr

Gly

Asn

165

170

175

tca

gga

aca

atg

ctt

tcg

aac

cgg

ata

tca

cac

ttc

tac

gac

tta

cgt

576

Ser

Gly

Thr

Met

Leu

Ser

Asn

Arg

Ile

Ser

His

Phe

Tyr

Asp

Leu

Arg

180

185

190

ggt

ccc

age

gtg

acg

gtt

gac

acg

gcc

tgt

tcg

acg

aca

ttg

acc

gca

624

Gly

Pro

Ser

Val

Thr

Val

Asp

Thr

Ala

Cys

Ser

Thr

Leu

Thr

Ala

195

200

205

ctg

cac

ttg

gcg

tgc

cag

age

tta

cgt

act

ggg

gag

tca

gat

aca

gcc

672

Leu

His

Leu

Ala

Cys

Gin

Ser

Leu

Arg

Thr

Gly

Glu

Ser

Asp

Thr

Ala

210

215

220

atc

gtt

atc

ggt

gca

aat

ctt

ctg

ctc

aat

ccc

gat

gtt

ttt

gtt

acg

720

Ile

Val

Ile

Gly

Ala

Asn

Leu

Asn

Pro

Asp

Val

Phe

Val

Thr

225

230

235

240

atg

tca

aac

ctg

gga

ttt

ttg

tcc

ccg

gat

ggt

atc

tcg

tac

tet

ttt

768

Met Ser

Asn

Leu Gly 245

Phe

Leu

Ser

Pro Asp 250

Gly

Ile

Ser

Tyr

Ser 255

Phe

gat

cct

ega

gcg

aat

gga

tat

ggt

ege

ggg

gaa

gga

att

gcc

gct

ctg

816

Asp

Pro

Arg

Ala

Asn

Gly

Tyr

Gly

Arg

Gly

Glu

Gly

Ile

Ala

Leu

260

265

270

gta

ata

aag

gcc

ctc

cct

aac

gcg

ttg

ega

gac

caa

gac

cct

atc

ega

864

Val

Ile

Lys

Ala

Leu

Pro

Asn

Ala

Leu

Arg

Asp

Gin

Asp

Pro

Ile

Arg

275

280

285

gcc

gtc

att

ega

gag

aca

gcg

ctg

aac

cag

gat

ggc

aaa

aca

ccc

gca

912

Ala

Val

Ile

Arg

Glu

Thr

Ala

Leu

Asn

Gin

Asp

Gly

Lys

Thr

Pro

Ala

290

295

300

att

act

gcg

ccg

agt

gat

gtg

gcg

cag

aaa

agt

ctg

atc

cag

gag

tgt

960

Ile

Thr

Ala

Pro

Ser

Asp

Val

Ala

Gin

Lys

Ser

Leu

Ile

Gin

Glu

Cys

305

310

315

320

tac

gat

aag

gct

ggg

cta

gat

atg

tcg

ttg

acc

tcg

tac

gtg

gag

gcc

1008

Tyr

Asp

Lys

Ala

Gly

Leu

Asp

Met

Ser

Leu

Thr

Ser

Tyr

Val

Glu

Ala

325

330

335

cac

gga

act

gga

aca

cca

act

ggt

gac

ccc

ctt

gaa

atc

tea

gca

att

1056

His

cly

Thr

Gly

Thr

Pro

Thr

Gly

Asp

Pro

Leu

Glu

Ile

Ser

Ala

Ile

340

345

350

tea

gca

gct

ttt

aaa

gga

cat

cct

ctg

cac

ctt

ggc

tet

gtg

aaa

gca

1104

Ser

Ala

Phe

Lys

Gly

His

Pro

Leu

His

Leu

Gly

Ser

Val

Lys

Ala

355

360

365

aat

att

ggc

cat

aca

gaa

gcc

agt

ggc

ctg

gcc

agt

ata

atc

aag

1152

Asn

Ile

Gly

His

Thr

Glu

Ala

Ser

Gly

Leu

Ala

Ser

Ile

Lys

370

375

380

gtg

gcc

ttg

gcc

ttg

gag

aag

ggc

ttg

att

ccc

cct

aat

gcg

cgg

ttc

1200

Val

Ala

Leu

Ala

Leu

Glu

Lys

Gly

Leu

Ile

Pro

Asn

Ala

Arg

Phe

385

390

395

400

ctg

caa

aag

aac

age

aag

ctg

atg

ctt

gac

caa

aag

aac

atc

aag

atc

1248

Leu

Gin

Lys

Asn

Ser

Lys

Leu

Met

Leu

Asp

Gin

Lys

Asn

Ile

Lys

Ile

405

410

415

ccc

atg

tet

gct

caa

gac

tgg

cct

gtg

aaa

gat

ggg

act

cgt

ege

gca

1296

Pro

Met

Ser

Ala

Gin

Asp

Trp

Pro

Val

Lys

Asp

Gly

Thr

Arg

Ala

420

425

430

tet

gtc

aat

aac

ttc

ggc

ttt

ggt

tcg

aat

gct

cac

gtc

att

ttg

1344

Ser

Val

Asn

Phe

Gly

Phe

Gly

Ser

Asn

Ala

His

Val

Ile

Leu

435

440

445

gaa

tea

tat

gat

ege

gca

tea

ttg

gcc

ctg

cca

gag

gat

caa

gtg

cat

1392

Glu

Ser

Tyr

Asp

Arg

Ala

Ser

Leu

Ala

Leu

Pro

Glu

Asp

Gin

Val

His

450

455

460

gtc

aat

ggt

aac

tet

gag

cat

ggt

agg

gtt

gag

gat

ggt

tcc

aaa

cag

1440

Val

Asn

Gly

Asn

Ser

Glu

His

Gly

Arg

Val

Glu

Asp

Gly

Ser

Lys

Gin

465

470

475

480

age

ege

ata

tac

gtt

gtg

cgt

gcc

aag

gac

gag

caa

gct

tgt

cgg

ega

1488

Ser

Arg

Ile

Tyr

Val

Arg

Ala

Lys

Asp

Glu

Gin

Ala

Cys

Arg

• v

485 490 495

acg Thr

ata Ile

gca Ala

age Ser 500

ctg Leu

ega Arg

gac tac Asp Tyr

att Ile 505

aaa Lys

tcc Ser

gtc Val

gct Ala

gac Asp 510

att Ile

gac Asp

1536

ggg

gaa

ccc

ttc

ctc

gcc

age

ctc

gcc

tat

aca

cta

ggc

tet

ege

cgt

1584

Gly

Glu

Pro

Phe

Leu

Ala

Ser

Leu

Ala

Tyr

Thr

Leu

Gly

Ser

Arg

515

520

525

tcc

att

ctg

cca

tgg

acg

tea

gtg

tat

gta

gca

gac

age

ctt

ggc

1632

Ser

Ile

Leu

Pro

Trp

Thr

Ser

Val

Tyr

Val

Ala

Asp

Ser

Leu

Gly

530

535

540

ctt

gtt

tet

gcc

ctc

age

gat

gag

tcc

aat

caa

cca

aaa

ega

gcg

aat

1680

Leu

Val

Ser

Ala

Leu

Ser

Asp

Glu

Ser

Asn

Gin

Pro

Lys

Arg

Ala

Asn

545

550

555

560

gag

aaa

gta

cgg

ctc

gga

ttt

gta

ttc

acc

ggt

cag

ggg

gcg

cag

tgg

1728

Glu

Lys

Val

Arg

Leu

Gly

Phe

Val

Phe

Thr

Gly

Gin

Gly

Ala

Gin

Trp

565

570

575

cat

gca

atg

ggc

aga

gag

ctg

gtc

aat

aca

ttc

cca

gta

ttc

aaa

cag

1776

His

Ala

Met

Gly

Arg

Glu

Leu

Val

Asn

Thr

Phe

Pro

Val

Phe

Lys

Gin

580

585

590

gcg

att

ctt

gaa

tgt

gat

ggc

tac

atc

aag

caa

ctg

ggc

gcg

agt

tgg

1824

Ala

Ile

Leu

Glu

Cys

Asp

Gly

Tyr

Ile

Lys

Gin

Leu

Gly

Ala

Ser

Trp

595

600

605

aat

ttt

atg

gag

ctc

cac

cgt

gat

gag

ctg

acg

act

cgg

gta

aat

1872

Asn

Phe

Met

Glu

Leu

His

Arg

Asp

Glu

Leu

Thr

Arg

Val

Asn

610

615

620

gat

gcc

gaa

tac

agt

cta

cca

ctg

tea

acc

gct

atc

caa

att

gca

ctt

1920

Asp

Ala

Glu

Tyr

Ser

Leu

Pro

Leu

Ser

Thr

Ala

Ile

Gin

Ile

Ala

Leu

625

630

635

640

gtg

cgt

ctc

ctt

tgg

tea

tgg

gga

att

cgg

cca

acg

ggg

ata

acc

agt

1968

Val

Arg

Leu

Trp

Ser

Trp

Gly

Ile

Arg

Pro

Thr

Gly

Ile

Thr

Ser

645

650

655

cac

tea

agt

gga

gag

gct

gcc

tac

gca

gct

ggg

gct

tta

tcc

2016

His

Ser

Gly

Glu

Ala

Tyr

Ala

Gly

Ala

Leu

Ser

660

665

670

gcg

cgg

tcg

gcc

att

ggg

atc

act

tat

ata

ege

ggt

gta

ttg

acc

act

2064

Ala

Arg

Ser

Ala

Ile

Gly

Ile

Thr

Tyr

Ile

Arg

Gly

Val

Leu

Thr

675

680

685

aag

ccc

aag

ccc

gca

ttg

gca

gcc

aaa

gga

atg

gcg

gtg

ggt

2112

Lys

Pro

Lys

Pro

Ala

Leu

Ala

Lys

Gly

Met

Ala

Val

Gly

690

695

700

ctt

ggt

ege

agt

gag

acc

aat

gtt

tac

att

tcg

cgt

ctc

aac

cag

gag

2160

Leu

Gly

Arg

Ser

Glu

Thr

Asn

Val

Tyr

Ile

Ser

Arg

Leu

Asn

Gin

Glu

705

710

715

720

gac

ggc

tgt

gtg

gtt

gga

tgt

atc

aac

agt

caa

tgt

agt

gtg

acg

2208

Asp

Gly

Cys

Val

Gly

Cys

Ile

Asn

Ser

Gin

Cys

Ser

Val

Thr

725 730 735 • ·

gtg Val

tcg Ser

gga Gly

gat Asp 740

ttg Leu

ggt Gly

gca Ala

atc gag aaa

ctt Leu

gaa Glu

aag ttg

tta Leu

cac His

2256

Ile Glu 745

Lys

Leu 750

gcc

gat

ggc

atc

ttt

acc

agg

aaa

ctg

aaa

gtc

act

gaa

gcc

ttc

cat

2304

Ala

Asp

Gly

Ile

Phe

Thr

Arg

Lys

Leu

Lys

Val

Thr

Glu

Ala

Phe

His

755

760

765

tea

age

cac

atg

ega

cca

atg

gca

gat

gcc

ttt

ggg

gcg

tea

ctg

aga

2352

Ser

His

Met

Arg

Pro

Met

Ala

Asp

Ala

Phe

Gly

Ala

Ser

Leu

Arg

770

775

780

gat

ctg

ttc

aac

tcg

gat

aac

gac

aat

ccc

aat

get

gac

acc

2400

Asp

Leu

Phe

Asn

Ser

Asp

Asn

Asp

Asn

Pro

Asn

Ala

Asp

Thr

785

790

795

800

tea

aag

ggt

gta

tta

tat

tea

cct

aag

act

ggt

agt

ege

atg

acc

2448

Ser

Lys

Gly

Val

Leu

Tyr

Ser

Pro

Lys

Thr

Gly

Ser

Arg

Met

Thr

805

810

815

gat

ctt

aaa

ttg

cta

ttg

gat

ccc

aca

cac

tgg

atg

gat

agt

atg

cta

2496

Asp

Leu

Lys

Leu

Asp

Pro

Thr

His

Trp

Met

Asp

Ser

Met

Leu

820

825

830

cag

ccg

gta

gag

ttc

gag

tcc

tea

ctc

ege

gag

atg

tgc

ttt

gat

ccc

2544

Gin

Pro

Val

Glu

Phe

Glu

Ser

Leu

Arg

Glu

Met

Cys

Phe

Asp

Pro

835

840

845

aac

acc

aaa

gag

aaa

gcc

gtc

gat

gtg

att

gaa

ata

ggg

cct

cac

2592

Asn

Thr

Lys

Glu

Lys

Ala

Val

Asp

Val

Ile

Glu

Ile

Gly

Pro

His

850

855

860

gga

gcg

ctt

ggt

cca

atc

aac

caa

gtc

atg

cag

gat

ctg

ggt

ctg

2640

Gly

Ala

Leu

Gly

Pro

Ile

Asn

Gin

Val

Met

Gin

Asp

Leu

Gly

Leu

865

870

875

880

aaa

gga

aca

gat

ata

aac

tat

ctc

agt

tgc

ctt

tet

ege

ggc

aga

age

2688

Lys

Gly

Thr

Asp

Ile

Asn

Tyr

Leu

Ser

Cys

Leu

Ser

Arg

Gly

Arg

Ser

885

890

895

tcg

ttg

gag

aca

atg

tat

cgt

get

acg

gag

ttg

ata

age

aag

ggt

2736

Ser

Leu

Glu

Thr

Met

Tyr

Arg

Ala

Thr

Glu

Leu

Ile

Ser

Lys

Gly

900

905

910

tat

ggg

ctc

aaa

atg

gac

get

ata

aac

ttt

cct

cat

gga

aga

aaa

gag

2784

Tyr

Gly

Leu

Lys

Met

Asp

Ala

Ile

Asn

Phe

Pro

His

Gly

Arg

Lys

Glu

915

920

925

ccc

aga

gtg

aag

gta

ctg

age

gat

ttg

ccg

gcg

tac

ccg

tgg

aat

cac

2832

Pro

Arg

Val

Lys

Val

Leu

Ser

Asp

Leu

Pro

Ala

Tyr

Pro

Trp

Asn

His

930

935

940

caa

acc

cgt

tat

tgg

aga

gag

cct

ege

ggc

agt

cgt

gag

tcc

aaa

cag

2880

Gin

Thr

Arg

Tyr

Trp

Arg

Glu

Pro

Arg

Gly

Ser

Arg

Glu

Ser

Lys

Gin

945

950

955

960

aga

acc

cat

ccg

cct

cac

act

ttg

ata

ggc

tea

cgg

gaa

tet

ctc

tet

2928

Arg

Thr

His

Pro

His

Thr

Leu

Ile

Gly

Ser

Arg

Glu

Ser

Leu

Ser

965

970

975

• ·

cct

cat

ttc

gcg

cct

aaa

tgg

aaa

cat

gtt

ctc cgt

ctg tea gat att

2976

Pro

His

Phe

Ala

Pro

Lys

Trp

Lys

His

Val

Leu Arg

Leu Ser Asp Ile

980

985

990

cca

tgg

ata

ega

gat

cac

gtc

gtt

ggt

tcg

agc atc

atc ttt ccg gga

3024

Pro

Trp

Ile

Arg

Asp

His

Val

Gly

Ser

Ser Ile

Ile Phe Pro Gly

995

1000

1005

gct Ala

ggc Gly 1010

ttc Phe

atc Ile

agc Ser

atg Met

gcc Ala 1015

atc Ile

gag Glu

ggg Gly

ttt Phe

tea Ser 1020

caa Gin

gtc Val

tgc Cys

3069

cca

gtt

gcg

ggg

gct

agc

atc

aac

tac

aac

ttg

cgt

gac

gtt

3114

Pro

Pro 1025

Val

Ala

Gly

Ala

Ser 1030

Ile

Asn

Tyr

Asn

Leu 1035

Arg

Asp

Val

gaa

ctc

gcg

cag

gct

ctc

ata

CCC

gct

gat

gca

gaa

gca

gag

3159

Glu

Leu 1040

Ala

Gin

Ala

Leu

Ile 1045

Ile

Pro

Ala

Asp

Ala 1050

Glu

Ala

Glu

gtt

gac

ctg

ege

cta

acg

atc

cgt

tea

tgt

gag

gaa

agg

tcc

ctc

3204

Val

Asp 1055

Leu

Arg

Leu

Thr

Ile 1060

Arg

Ser

Cys

Glu

Glu 1065

Arg

Ser

Leu

ggc

aca

aag

aac

tgg

cat

caa

ttt

tet

gtg

cac

tea

att

tcg

ggc

3249

Gly

Thr 1070

Lys

Asn

Trp

His

Gin 1075

Phe

Ser

Val

His

Ser 1080

Ile

Ser

Gly

gaa

aat

acc

tgg

aca

gaa

cac

tgc

acc

gga

tta

ata

cgt

tcg

3294

Glu

Asn 1085

Asn

Thr

Trp

Thr

Glu 1090

His

Cys

Thr

Gly

Leu 1095

Ile

Arg

Ser

gag

agc

gaa

aga

agc

cac

ctt

gac

tgt

tea

act

gtg

gaa

gcc

tea

3339

Glu

Ser 1100

Glu

Arg

Ser

His

Leu 1105

Asp

Cys

Ser

Thr

Val 1110

Glu

Ala

Ser

ege

agg

ttg

aat

cta

ggc

tea

gat

aac

cgg

agc

att

gat

CCC

aac

3384

Arg

Arg 1115

Leu

Asn

Leu

Gly

Ser 1120

Asp

Asn

Arg

Ser

Ile 1125

Asp

Pro

Asn

gat

ctc

tgg

gag

tcc

tta

cac

gcg

aat

ggg

ata

tgc

cac

gga

CCC

3429

Asp

Leu 1130

Trp

Glu

Ser

Leu

His 1135

Ala

Asn

Gly

Ile

Cys 1140

His

Gly

Pro

att

ttt

cag

aac

att

cag

ega

att

caa

aac

aat

gga

cag

ggc

tcg

3474

Ile

Phe 1145

Gin

Asn

Ile

Gin

Arg 1150

Ile

Gin

Asn

Gly 1155

Gin

Gly

Ser

ttt

tgc

aga

ttt

tcc

att

gct

gac

act

gcc

tcg

gct

atg

cct

cac

3519

Phe

Cys 1160

Arg

Phe

Ser

Ile

Ala 1165

Asp

Thr

Ala

Ser

Ala 1170

Met

Pro

His

tcg

tac

gag

aat

ega

cac

atc

gtc

cat

cct

act

ctg

gac

tcg

3564

Ser

Tyr 1175

Glu

Asn

Arg

His

Ile 1180

Val

His

Pro

Thr

Thr 1185

Leu

Asp

Ser

gtg

atc

cag

gcg

gca

tac

acg

gtg

tta

CCC

tac

gcg

gga

aca

cgt

3609

Val

Ile 1190

Gin

Ala

Tyr

Thr 1195

Val

Leu

Pro

Tyr

Ala 1200

Gly

Thr

Arg

atg

aaa

acg

gcc

atg

gta

cca

agg

cta

aga

aat

gtc

aaa

ata

3654

• · • · · · •· •· •· •· • · • · •· •· •· •· • »

Met

Lys 1205

Thr Ala

Met

Val

Pro 1210

Arg

Arg Leu

Arg

Asn 1215

Val

Lys

Ile

tcc

tet

age

ctg

gct

gac

ttg

gag

gct

ggt

gat

gct

ctg

gac

gca

3699

Ser

Ser 1220

Ser

Leu

Ala

Asp

Leu 1225

Glu

Ala

Gly

Asp

Ala 1230

Leu

Asp

Ala

cag

gcc

age

atc

aag

gat

ege

aac

tet

caa

tcc

ttc

tet

acc

gac

3744

Gin

Ala 1235

Ser

Ile

Lys

Asp

Arg 1240

Asn

Ser

Gin

Ser

Phe 1245

Ser

Thr

Asp

ttg

gca

gtg

ttt

gat

gac

tat

gat

age

ggt

tet

ccc

tcg

gac

3789

Leu

Ala 1250

Val

Phe

Asp

Tyr 1255

Asp

Ser

Gly

Ser

Ser 1260

Pro

Ser

Asp

gga

atc

cca

gtc

ata

gag

att

gaa

ggc

ctt

gtt

ttc

cag

tcg

gtt

3834

Gly

Ile 1265

Pro

Val

Ile

Glu

Ile 1270

Glu

Gly

Leu

Val

Phe 1275

Gin

Ser

Val

gga

age

ttc

tet

gac

caa

aag

tca

gac

tcc

aac

gac

aca

gaa

3879

Gly

Ser 1280

Ser

Phe

Ser

Asp

Gin 1285

Lys

Ser

Asp

Ser

Asn 1290

Asp

Thr

Glu

aat

gcc

tgc

age

tcc

tgg

gtt

tgg

gcc

cct

gac

atc

age

ttg

ggt

3924

Asn

Ala 1295

Cys

Ser

Trp

Val 1300

Trp

Ala

Pro

Asp

Ile 1305

Ser

Leu

Gly

gac

tcc

act

tgg

ctc

aaa

gaa

aag

ttg

age

act

gag

gct

gag

acg

3969

Asp

Ser 1310

Thr

Trp

Leu

Lys

Glu 1315

Lys

Leu

Ser

Thr

Glu 1320

Ala

Glu

Thr

aaa

gaa

acg

gaa

ctc

atg

gac

ctc

ega

aga

tgc

acg

atc

aac

4014

Lys

Glu 1325

Thr

Glu

Leu

Met

Met 1330

Asp

Leu

Arg

Cys 1335

Thr

Ile

Asn

ttt

ata

cag

gag

gct

gtc

act

gat

ttg

aca

aat

tet

gat

atc

caa

4059

Phe

Ile 1340

Gin

Glu

Ala

Val

Thr 1345

Asp

Leu

Thr

Asn

Ser 1350

Asp

Ile

Gin

cat

ctg

gat

ggc

cac

ctt

cag

aag

tat

ttc

gat

tgg

atg

aat

gtc

4104

His

Leu 1355

Asp

Gly

His

Leu

Gin 1360

Lys

Tyr

Phe

Asp

Trp 1365

Met

Asn

Val

caa

ttg

gac

ctt

gcg

aga

caa

aac

aag

ctc

age

cca

gcc

agt

tgc

4149

Gin

Leu 1370

Asp

Leu

Ala

Arg

Gin 1375

Asn

Lys

Leu

Ser

Pro 1380

Ala

Ser

Cys

gac

tgg

cta

agt

gac

gat

gct

gag

cag

aag

aaa

tgc

cta

cag

gcc

4194

Asp

Trp 1385

Leu

Ser

Asp

Ala 1390

Glu

Gin

Lys

Cys 1395

Leu

Gin

Ala

aga

gtc

gct

gga

gaa

age

gtc

aat

ggc

gag

atg

att

tet

cgt

cta

4239

Arg

Val 1400

Ala

Gly

Glu

Ser

Val 1405

Asn

Gly

Glu

Met

Ile 1410

Ser

Arg

Leu

gga

cct

cag

tta

ata

gca

atg

cta

ege

gaa

aca

gag

cca

ctt

4284

Gly

Pro 1415

Gin

Leu

Ile

Ala

Met 1420

Leu

Arg

Glu

Thr 1425

Glu

Pro

Leu

gag

ttg

atg

caa

gat

cag

ctg

cta

age

aga

tac

gtc

aac

4329

Glu

Leu

Met

Gin

Asp

Gin

Leu

Ser

Arg

Tyr

Val

Asn

• ·

1430 1435 1440

gca Ala

atc Ile 1445

aaa tgg

age ega Ser Arg

tea Ser 1450

aac Asn

gca Ala

caa Gin

gcc Ala

age Ser 1455

gag ctg

atc Ile

4374

Lys

Trp

Glu

Leu

ega

ctt

tgc

gcc

cac

aag

aac

ccg

cgt

tet

ege

att

ttg

gag

att

4419

Arg

Leu 1460

Cys

Ala

His

Lys

Asn 1465

Pro

Arg

Ser

Arg

Ile 1470

Leu

Glu

Ile

ggc

gga

ggc

acg

ggc

tgc

aca

aag

ctt

att

gtc

aat

gca

ttg

4464

Gly

Gly 1475

Gly

Thr

Gly

Cys 1480

Thr

Lys

Leu

Ile

Val 1485

Asn

Ala

Leu

gga

aac

acc

aag

ccg

atc

gat

cgt

tat

gac

ttc

acc

gat

gtg

tet

4509

Gly

Asn 1490

Thr

Lys

Pro

Ile

Asp 1495

Arg

Tyr

Asp

Phe

Thr 1500

Asp

Val

Ser

gcc

ggg

ttt

ttc

gag

tcg

gcg

cgt

gag

caa

ttt

gcg

gat

tgg

caa

4554

Ala

Gly 1505

Phe

Glu

Ser

Ala 1510

Arg

Glu

Gin

Phe

Ala 1515

Asp

Trp

Gin

gac

gtg

atg

act

ttc

aaa

ttg

gat

att

gaa

age

gat

ccc

gag

4599

Asp

Val 1520

Met

Thr

Phe

Lys

Lys 1525

Leu

Asp

Ile

Glu

Ser 1530

Asp

Pro

Glu

caa

ggg

ttt

gaa

tgt

gcc

acc

tac

gat

gtg

gtc

gtg

get

tgc

4644

Gin

Gin 1535

Gly

Phe

Glu

Cys

Ala 1540

Thr

Tyr

Asp

Val

Val 1545

Val

Ala

Cys

cag

gtc

ctg

cat

gca

act

ega

tgc

atg

aaa

ega

aca

ctg

agt

aac

4689

Gin

Val 1550

Leu

His

Ala

Thr

Arg 1555

Cys

Met

Lys

Arg

Thr 1560

Leu

Ser

Asn

gtt

ega

aaa

ttg

ctc

aag

cct

ggg

ggc

aac

ttg

att

ttg

gtt

gag

4734

Val

Arg 1565

Lys

Leu

Lys

Pro 1570

Gly

Asn

Leu

Ile 1575

Leu

Val

Glu

act

acc

agg

gat

cag

ctc

gat

ttg

ttc

ttt

acc

ttc

gga

ctg

ttg

4779

Thr

Thr 1580

Arg

Asp

Gin

Leu

Asp 1585

Leu

Phe

Thr

Phe 1590

Gly

Leu

cca

ggt

tgg

ctc

agt

gag

cct

gag

cgg

aag

tcg

acg

cca

4824

Pro

Gly 1595

Trp

Leu

Ser

Glu 1600

Glu

Pro

Glu

Arg

Lys 1605

Ser

Thr

Pro

tcg

ctc

act

acc

gat

ctt

tgg

aac

acc

atg

ttg

gac

acg

age

ggt

4869

Ser

Leu 1610

Thr

Asp

Leu

Trp 1615

Asn

Thr

Met

Leu

Asp 1620

Thr

Ser

Gly

ttc

aac

ggt

gtg

gaa

ttg

gag

gtt

cgt

gat

tgt

gaa

gac

gat

gag

4914

Phe

Asn 1625

Gly

Val

Glu

Leu

Glu 1630

Val

Arg

Asp

Cys

Glu 1635

Asp

Glu

ttt

tac

atg

atc

age

aca

atg

cta

tcg

acg

get

aga

aaa

gag

aat

4959

Phe

Tyr 1640

Met

Ile

Ser

Thr

Met 1645

Leu

Ser

Thr

Ala

Arg 1650

Lys

Glu

Asn

aca

acc

ccg

gat

aca

gtg

gca

gaa

tcg

gag

gtg

ctt

ttg

ctg

cac

5004

Thr

Thr 1655

Pro

Asp

Thr

Val

Ala 1660

Glu

Ser

Glu

Val

Leu 1665

Leu

His

• · • ·

gga Gly

gcg Ala 1670

ctc Leu

ega Arg

cct Pro

tea Ser 1675

tet Ser

tgg Trp

ctg Leu

gaa Glu

agt Ser 1680

ctc Leu

cag Gin

gca Ala

5049

gca

att

tgt

gaa

aag

acc

agt

tet

agc

cca

tcg

atc

aac

gct

ctg

5094

Ala

Ile 1685

Cys

Glu

Lys

Thr

Ser 1690

Ser

Pro

Ser

Ile 1695

Asn

Ala

Leu

ggc

gag

gta

gat

acc

act

gga

agg

aca

tgc

att

ttt

ctt

ggg

gaa

5139

Gly

Glu 1700

Val

Asp

Thr

Gly 1705

Arg

Thr

Cys

Ile

Phe 1710

Leu

Gly

Glu

atg

gag

tcc

tcg

ctc

ctt

gga

gag

gtg

gga

agc

gag

acc

ttc

aaa

5184

Met

Glu 1715

Ser

Leu

Gly 1720

Glu

Val

Gly

Ser

Glu 1725

Thr

Phe

Lys

tcc

atc

acc

gcg

atg

ctg

aat

aac

tgc

aac

gca

ctt

ctc

tgg

gtg

5229

Ser

Ile 1730

Thr

Ala

Met

Leu

Asn 1735

Asn

Cys

Asn

Ala

Leu 1740

Leu

Trp

Val

tet

aga

gga

gca

gcc

atg

agc

tcc

gag

gat

cca

tgg

aaa

gct

cta

5274

Ser

Arg 1745

Gly

Ala

Met

Ser 1750

Ser

Glu

Asp

Pro

Trp 1755

Lys

Ala

Leu

cat

att

ggt

ctg

cgt

acc

atc

cgc

aac

gaa

aat

aac

ggg

aag

5319

His

Ile 1760

Gly

Leu

Arg

Thr 1765

Ile

Arg

Asn

Glu

Asn 1770

Asn

Gly

Lys

gaa

tat

gta

tcg

ttg

gat

ctc

gat

cct

tet

ega

aac

gca

tac

acc

5364

Glu

Tyr 1775

Val

Ser

Leu

Asp

Leu 1780

Asp

Pro

Ser

Arg

Asn 1785

Ala

Tyr

Thr

cac

gag

tcc

ctg

tat

gct

atc

tgc

aat

atc

ttc

aat

ggc

cgc

ctc

5409

His

Glu 1790

Ser

Leu

Tyr

Ala

Ile 1795

Cys

Asn

Ile

Phe

Asn 1800

Gly

Arg

Leu

ggc

gac

ctt

tcc

gaa

gac

aag

gag

ttt

gaa

ttt

gca

gag

aga

aac

5454

Gly

Asp 1805

Leu

Ser

Glu

Asp

Lys 1810

Glu

Phe

Glu

Phe

Ala 1815

Glu

Arg

Asn

ggc

gtc

atc

cac

gta

ccg

ega

ctt

ttc

aat

gac

ccg

cac

tgg

aag

5499

Gly

Val 1820

Ile

His

Val

Pro

Arg 1825

Leu

Phe

Asn

Asp

Pro 1830

His

Trp

Lys

gac

caa

gaa

gcg

gtt

gag

gtc

aca

ctg

cag

ccg

ttc

gag

caa

ccc

5544

Asp

Gin 1835

Glu

Ala

Val

Glu

Val 1840

Thr

Leu

Gin

Pro

Phe 1845

Glu

Gin

Pro

ggg

cgt

ctg

cgg

atg

gag

gtt

gag

acg

cca

ggg

ctc

tta

gac

5589

Gly

Arg 1850

Arg

Leu

Arg

Met

Glu 1855

Val

Glu

Thr

Pro

Gly 1860

Leu

Asp

tcc

ctg

caa

ttt

ega

gac

gaa

gga

cgt

gaa

ggc

aag

gat

ctt

5634

Ser

Leu 1865

Gin

Phe

Arg

Asp

Asp 1870

Glu

Gly

Arg

Glu

Gly 1875

Lys

Asp

Leu

ccg

gat

tgg

gta

gaa

atc

gaa

ccc

aaa

gct

ttc

ggt

ctc

aat

5679

Pro

Asp 1880

Asp

Trp

Val

Glu

Ile 1885

Glu

Pro

Lys

Ala

Phe 1890

Gly

Leu

Asn

ttt Phe

cgg Arg 1895

gat Asp

gtc Val

atg Met

gtt Val

gcc Ala 1900

atg Met

ggt Gly

caa Gin

ttg Leu

gag Glu 1905

gcc aac

cgt Arg

5724

Ala

Asn

gtg

atg

ggc

ttc

gaa

tgc

gcc

gga

gtg

atc

aca

aag

ctc

ggt

gga

5769

Val

Met

Gly

Phe

Glu

Cys

Ala

Gly

Val

Ile

Thr

Lys

Leu

Gly

1910

1915

1920

gct

gcc

gct

age

caa

ggc

ctc

aga

tta

ggg

gac

ege

gta

tgt

5814

Ala

Ser

Gin

Gly

Leu

Arg

Leu

Gly

Asp

Arg

Val

Cys

1925

1930

1935

gca

cta

ctg

aaa

ggc

cat

tgg

gcg

acc

aga

aca

cag

acg

ccg

tac

5859

Ala

Leu

Lys

Gly

His

Trp

Ala

Thr

Arg

Thr

Gin

Thr

Pro

Tyr

1940

1945

1950

act

aat

gtc

cgt

att

ccg

gac

gaa

atg

ggc

ttc

cca

gaa

gcc

5904

Thr

Asn

Val

Arg

Ile

Pro

Asp

Glu

Met

Gly

Phe

Pro

Glu

Ala

1955

1960

1965

gct

tcg

gtc

ccc

ctg

gct

ttc

act

acc

gca

tat

att

gcg

ctt

tat

5949

Ala

Ser

Val

Pro

Leu

Ala

Phe

Thr

Ala

Tyr

Ile

Ala

Leu

Tyr

1970

1975

1980

acc

acg

gca

aag

cta

ega

ggc

gaa

aga

gtc

ttg

atc

cac

agt

5994

Thr

Ala

Lys

Leu

Arg

Gly

Glu

Arg

Val

Leu

Ile

His

Ser

1985

1990

1995

gga

gct

gga

ggc

gtc

ggt

caa

gca

gcg

atc

att

ttg

tcc

cag

ctt

6039

Gly

Ala

Gly

Val

Gly

Gin

Ala

Ile

Leu

Ser

Gin

Leu

2000

2005

2010

gcg

ggt

gcc

gag

gtc

ttc

gtc

aca

gcg

gga

act

caa

gcc

aag

cgt

6084

Ala

Gly

Ala

Glu

Val

Phe

Val

Thr

Ala

Gly

Thr

Gin

Ala

Lys

Arg

2015

2020

2025

gac

ttt

gtc

ggc

gat

aaa

ttc

ggc

atc

aat

ccg

gat

cat

atc

ttc

6129

Asp

Phe

Val

Gly

Asp

Lys

Phe

Gly

Ile

Asn

Pro

Asp

His

Ile

Phe

2030

2035

2040

tcg

age

agg

aat

gac

tta

ttc

gtc

gac

ggc

atc

aaa

gcc

tac

acg

6174

Ser

Arg

Asn

Asp

Leu

Phe

Val

Asp

Gly

Ile

Lys

Ala

Tyr

Thr

2045

2050

2055

ggc

gga

ctt

ggc

gtt

cat

gtc

gtt

cta

aac

tea

ttg

gca

ggt

caa

6219

Gly

Leu

Gly

Val

His

Val

Leu

Asn

Ser

Leu

Ala

Gly

Gin

2060

2065

2070

ctc

caa

gca

age

ttt

gac

tgc

atg

gcc

gaa

ttc

ggc

aga

ttt

6264

Leu

Gin

Ala

Ser

Phe

Asp

Cys

Met

Ala

Glu

Phe

Gly

Arg

Phe

2075

2080

2085

gtt

gag

att

gga

aaa

aag

gac

ctg

gag

caa

aac

age

aga

ctt

gac

6309

Val

Glu

Ile

Gly

Lys

Asp

Leu

Glu

Gin

Asn

Ser

Arg

Leu

Asp

2090

2095

2100

atg

ctg

cca

ttc

acc

cgg

gac

gtc

tet

ttc

aca

tea

att

gat

ctt

6354

Met

Leu

Pro

Phe

Thr

Arg

Asp

Val

Ser

Phe

Thr

Ser

Ile

Asp

Leu

2105

2110

2115

ctc

tcg

tgg

caa

aga

gcc

aaa

agt

gaa

gta

tcc

gaa

gcg

ttg

6399

• ·

Lep

Ser 2120

Trp

Gin Arg

Ala

Lys 2125

Ser Glu

Glu

Val

Ser 2130

Glu

Ala

Leu

aac

cat

gtc

aca

aaa

ctc

gag

aca

aaa

gcg

att

ggc

ttg

att

6444

Asn

His

Val

Thr

Lys

Leu

Glu

Thr

Lys

Ala

Ile

Gly

Leu

Ile

2135

2140

2145

ggt

cca

atc

cag

cac

tcc

ttg

tea

aac

atc

gag

aag

gcc

ttc

6489

Gly

Pro

Ile

Gin

His

Ser

Leu

Ser

Asn

Ile

Glu

Lys

Ala

Phe

2150

2155

2160

cgt

acg

atg

cag

agt

ggt

cag

cat

gtt

ggc

aaa

gtt

gtg

gtc

aat

6534

Arg

Thr

Met

Gin

Ser

Gly

Gin

His

Val

Gly

Lys

Val

Asn

2165

2170

2175

gta

tet

ggg

gac

gaa

ctg

gtc

cca

gtc

ggc

gat

gga

ggg

ttc

tcg

6579

Val

Ser

Gly

Asp

Glu

Leu

Val

Pro

Val

Gly

Asp

Gly

Phe

Ser

2180

2185

2190

ctg

aag

ctg

aag

cct

gac

agt

tet

tac

cta

gtt

gct

ggt

ggg

ctg

6624

Leu

Lys

Leu

Lys

Pro

Asp

Ser

Tyr

Leu

Val

Ala

Gly

Leu

2195

2200

2205

ggg

gga

att

gga

aag

cag

atc

tgt

cag

tgg

ctt

gtt

gat

cat

ggc

6669

Gly

Ile

Gly

Lys

Gin

Ile

Cys

Gin

Trp

Leu

Val

Asp

His

Gly

2210

2215

2220

gcg

aag

cac

ttg

att

atc

cta

tcg

aga

agt

gca

aag

gcc

agt

cca

6714

Ala

Lys

His

Leu

Ile

Leu

Ser

Arg

Ser

Ala

Lys

Ala

Ser

Pro

2225

2230

2235

ttc

ata

acc

age

ttg

caa

aat

caa

cag

tgc

gct

gtc

tat

cta

cac

6759

Phe

Ile

Thr

Ser

Leu

Gin

Asn

Gin

Cys

Ala

Val

Tyr

Leu

His

2240

2245

2250

gca

tgt

gac

atc

tea

gat

caa

gat

cag

gtc

acc

aag

gtg

ctc

cgg

6804

Ala

Cys

Asp

Ile

Ser

Asp

Gin

Asp

Gin

Val

Thr

Lys

Val

Leu

Arg

2255

2260

2265

ttg

tgc

gaa

gca

cat

gca

ccg

cca

att

ega

ggt

atc

ata

caa

6849

Leu

Cys

Glu

Ala

His

Ala

Pro

Ile

Arg

Gly

Ile

Gin

2270

2275

2280

ggt

gcc

atg

gtt

ctc

aag

gac

gcg

ctt

cta

tcg

ega

atg

aca

ttg

6894

Gly

Ala

Met

Val

Leu

Lys

Asp

Ala

Leu

Ser

Arg

Met

Thr

Leu

2285

2290

2295

gat

gaa

ttt

aat

gca

aca

cgc

cca

aaa

gta

cag

ggt

agt

tgg

6939

Asp

Glu

Phe

Asn

Ala

Thr

Arg

Pro

Lys

Val

Gin

Gly

Ser

Trp

2300

2305

2310

tat

ctt

cac

aag

atc

gca

cag

gat

gtt

gac

ttc

gtg

atg

ctc

6984

Tyr

Leu

His

Lys

Ile

Ala

Gin

Asp

Val

Asp

Phe

Val

Met

Leu

2315

2320

2325

tea

tcc

ctt

gtt

ggg

gtc

atg

ggt

ggg

gca

ggc

cag

gcc

aat

tac

7029

Ser

Leu

Val

Gly

Val

Met

Gly

Ala

Gly

Gin

Ala

Asn

Tyr

2330

2335

2340

gca

gct

ggt

gca

ttc

cag

gac

gca

ctt

gcg

cac

cgg

aga

7074

Ala

Gly

Ala

Phe

Gin

Asp

Ala

Leu

Ala

His

Arg

• ·

2345 2350 2355

gcc Ala

cat His 2360

ggc atg ccg

get Ala

gtc Val 2365

acc Thr

att Ile

gac ttg Asp Leu

ggc Gly 2370

atg Met

gtc Val

aag Lys

7119

Gly Met

Pro

tet

gtt

gga

tac

gtg

get

gaa

act

ggc

cgt

ggt

gtg

gcc

gac

cgg

7164

Ser

Val

Gly

Tyr

Val

Ala

Glu

Thr

Gly

Arg

Gly

Val

Ala

Asp

Arg

2375

2380

2385

ctc

get

aga

ata

ggt

tac

aag

cct

atg

cat

gaa

aag

gac

gtc

atg

7209

Leu

Ala

Arg

Ile

Gly

Tyr

Lys

Pro

Met

His

Glu

Lys

Asp

Val

Met

2390

2395

2400

gat

gtg

ttg

gag

aag

gca

atc

ctg

tgt

tet

tcc

cct

caa

ttt

cca

7254

Asp

Val

Leu

Glu

Lys

Ala

Ile

Leu

Cys

Ser

Pro

Gin

Phe

Pro

2405

2410

2415

tea

cct

CCC

gca

get

gtg

gtt

aca

gga

atc

aac

aca

tcc

ccg

ggt

7299

Ser

Pro

Ala

Val

Thr

Gly

Ile

Asn

Thr

Ser

Pro

Gly

2420

2425

2430

get

cac

tgg

acc

gag

gca

aac

tgg

ata

cag

gaa

cag

cgg

ttt

gtg

7344

Ala

His

Trp

Thr

Glu

Ala

Asn

Trp

Ile

Gin

Glu

Gin

Arg

Phe

Val

2435

2440

2445

gga

ctt

aaa

tac

ege

caa

gtc

ctt

cat

gca

gac

caa

tcc

ttt

gtc

7389

Gly

Leu

Lys

Tyr

Arg

Gin

Val

Leu

His

Ala

Asp

Gin

Ser

Phe

Val

2450

2455

2460

tet

tcg

cat

aaa

gga

cca

gat

ggc

gtg

cgg

gcc

caa

cta

age

7434

Ser

His

Lys

Gly

Pro

Asp

Gly

Val

Arg

Ala

Gin

Leu

Ser

2465

2470

2475

agg

gtc

acc

tet

cac

gac

gag

gcc

att

tet

atc

gtc

ctc

aaa

gca

7479

Arg

Val

Thr

Ser

His

Asp

Glu

Ala

Ile

Ser

Ile

Val

Leu

Lys

Ala

2480

2485

2490

atg

acg

gaa

aag

ctg

atg

ega

atg

ttt

ggt

ctg

gca

gaa

gac

7524

Met

Thr

Glu

Lys

Leu

Met

Arg

Met

Phe

Gly

Leu

Ala

Glu

Asp

2495

2500

2505

atg

tcc

tcg

tcc

aaa

aac

ctg

gca

ggt

gtc

ggc

gta

gac

tea

ctc

7569

Met

Ser

Lys

Asn

Leu

Ala

Gly

Val

Gly

Val

Asp

Ser

Leu

2510

2515

2520

gtc

gcc

att

gaa

ctt

ega

aac

tgg

atc

aca

tet

gaa

atc

cat

gtt

7614

Val

Ala

Ile

Glu

Leu

Arg

Asn

Trp

Ile

Thr

Ser

Glu

Ile

His

Val

2525

2530

2535

gat

gtg

tcg

atc

ttt

gag

ctc

atg

aat

ggt

aac

acc

atc

gcc

ggc

7659

Asp

Val

Ser

Ile

Phe

Glu

Leu

Met

Asn

Gly

Asn

Thr

Ile

Ala

Gly

2540

2545

2550

ctc

gtc

gag

tta

gtt

gtg

gcg

aaa

tgc

agt

taa

7692

Leu

Val

Glu

Leu

Val

Ala

Lys

Cys

Ser

2555

2560

<210> 46

100

<2J1> 2563 <212> PRT <213> Penicillium citrinum <400> 46

Met 1

Asn Asn Thr

Pro 5

Ala Val

Thr Ala

Thr 10

Ala Thr

Ala

Thr Ala 15

Thr

Ala

Thr

Ala

Met

Ala

Gly

Ser

Ala

Cys

Ser

Asn

Thr

Ser

Thr

Pro

Ile

20

25

30

Ala

Ile

Val

Gly

Met

Gly

Cys

Arg

Phe

Ala

Gly

Asp

Ala

Thr

Ser

Pro

35

40

45

Gin

Lys

Leu

Trp

Glu

Met

Val

Glu

Arg

Gly

Ser

Ala

Trp

Ser

Lys

50

55

60

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Asn

Val

Arg

Gly

Val

Tyr

His

Pro

Asn

Gly

65

70

75

80

Glu

Arg

Val

Gly

Ser

Thr

His

Val

Lys

Gly

His

Phe

Ile

Asp

Glu

85

90

95

Asp

Pro

Ala

Leu

Phe

Asp

Ala

Phe

Asn

Met

Thr

Glu

Val

100

105

110

Ala

Ser

Cys

Met

Asp

Pro

Gin

Tyr

Arg

Leu

Met

Leu

Glu

Val

Tyr

115

120

125

Glu

Ser

Leu

Glu

Ser

Ala

Gly

Ile

Thr

Ile

Asp

Gly

Met

Ala

Gly

Ser

130

135

140

Asn

Thr

Ser

Val

Phe

Gly

Val

Met

Tyr

His

Asp

Tyr

Gin

Asp

Ser

145

150

155

160

Leu

Asn

Arg

Asp

Pro

Glu

Thr

Val

Pro

Arg

Tyr

Phe

Ile

Thr

Gly

Asn

165

170

175

Ser

Gly

Thr

Met

Leu

Ser

Asn

Arg

Ile

Ser

His

Phe

Tyr

Asp

Leu

Arg

180

185

190

Gly

Pro

Ser

Val

Thr

Val

Asp

Thr

Ala

Cys

Ser

Thr

Leu

Thr

Ala

195

200

205

101

Leu His

Leu Ala

Cys

Gin

Ser 215

Leu Arg Thr

Gly Glu 220

Ser Asp

Thr

Ala

210

Ile

Val

Ile

Gly

Ala

Asn

Leu

Asn

Pro

Asp

Val

Phe

Val

Thr

225

230

235

240

Met

Ser

Asn

Leu Gly 245

Phe

Leu

Ser

Pro Asp Gly Ile Ser Tyr Ser

Phe

250

255

Asp

Pro

Arg

Ala

Asn

Gly

Tyr

Gly

Arg

Gly

Glu

Gly

Ile

Ala

Leu

260

265

270

Val

Ile

Lys

Ala

Leu

Pro

Asn

Ala

Leu

Arg

Asp

Gin

Asp

Pro

Ile

Arg

275

280

285

Ala

Val

Ile

Arg

Glu

Thr

Ala

Leu

Asn

Gin

Asp

Gly

Lys

Thr

Pro

Ala

290

295

300

Ile

Thr

Ala

Pro

Ser

Asp

Val

Ala

Gin

Lys

Ser

Leu

Ile

Gin

Glu

Cys

305

310

315

320

Tyr Asp

Lys Ala Gly 325

Leu

Asp Met

Ser

Leu Thr Ser 330

Tyr

Val

Glu 335

Ala

His

Gly

Thr

Gly

Thr

Pro

Thr

Gly

Asp

Pro

Leu

Glu

Ile

Ser

Ala

Ile

340

345

350

Ser

Ala

Phe

Lys

Gly

His

Pro

Leu

His

Leu

Gly

Ser

Val

Lys

Ala

355

360

365

Asn

Ile

Gly

His

Thr

Glu

Ala

Ser

Gly

Leu

Ala

Ser

Ile

Lys

370

375

380

Val

Ala

Leu

Ala

Leu

Glu

Lys

Gly

Leu

Ile

Pro

Asn

Ala

Arg

Phe

385

390

395

400

Leu

Gin

Lys

Asn

Ser

Lys

Leu

Met

Leu

Asp

Gin

Lys

Asn

Ile

Lys

Ile

405

410

415

Pro

Met

Ser

Ala

Gin

Asp

Trp

Pro

Val

Lys

Asp

Gly

Thr

Arg

Ala

420

425

430

Ser

Val

Asn

Phe

Gly

Phe

Gly

Ser

Asn

Ala

His

Val

Ile

Leu

435

440

445

102 • ·

Glu Ser Tyr Asp Arg Ala

450

Ser Leu Ala Leu Pro Glu Asp Gin Val His

455 460

Val Asn 465

Gly Asn Ser

Glu His 470

Gly Arg Val

Glu 475

Asp Gly

Ser Lys Gin 480

Ser

Arg

Ile

Tyr

Val

Arg

Ala

Lys

Asp

Glu

Gin

Ala

Cys

Arg

485

490

495

Thr

Ile

Ala

Ser

Leu

Arg

Asp

Tyr

Ile

Lys

Ser

Val

Ala

Asp

Ile

Asp

500

505

510

Gly

Glu

Pro

Phe

Leu

Ala

Ser

Leu

Ala

Tyr

Thr

Leu

Gly

Ser

Arg

515

520

525

Ser

Ile

Leu

Pro

Trp

Thr

Ser

Val

Tyr

Val

Ala

Asp

Ser

Leu

Gly

530

535

540

Leu Val 545

Ser Ala

Leu Ser Asp Glu Ser Asn Gin

Pro

Lys

Arg

Ala

Asn 560

550

555

Glu

Lys

Val

Arg

Leu

Gly

Phe

Val

Phe

Thr

Gly

Glri

Gly

Ala

Gin

Trp

565

570

575

His

Ala

Met

Gly

Arg

Glu

Leu

Val

Asn

Thr

Phe

Pro

Val

Phe

Lys

Gin

580

585

590

Ala

Ile

Leu

Glu

Cys

Asp

Gly

Tyr

Ile

Lys

Gin

Leu

Gly

Ala

Ser

Trp

595

600

605

Asn

Phe

Met

Glu

Leu

His

Arg

Asp

Glu

Leu

Thr

Arg

Val

Asn

610

615

620

Asp

Ala

Glu

Tyr

Ser

Leu

Pro

Leu

Ser

Thr

Ala

Ile

Gin

Ile

Ala

Leu

625

630

635

640

Val

Arg

Leu

Trp

Ser

Trp

Gly

Ile

Arg

Pro

Thr

Gly

Ile

Thr

Ser

645

650

655

His

Ser

Gly

Glu

Ala

Tyr

Ala

Gly

Ala

Leu

Ser

660

665

670

Ala

Arg

Ser

Ala

Ile

Gly

Ile

Thr

Tyr

Ile

Arg

Gly

Val

Leu

Thr

675

680

685

Lys

Pro

Lys

Pro

Ala

Leu

Ala

Lys

Gly

Met

Ala

Val

Gly

103

690

695

700

Leu 705

Gly

Arg Ser

Glu

Thr 710

Asn Val Tyr

Ile

Ser Arg Leu 715

Asn Gin

Glu 720

Asp

Gly

Cys

Val

Gly

Cys

Ile

Asn

Ser

Gin

Cys

Ser

Val

Thr

725

730

735

Val

Ser

Gly

Asp

Leu

Gly

Ala

Ile

Glu

Lys

Leu

Glu

Lys

Leu

His

740

745

750

Ala

Asp

Gly

Ile

Phe

Thr

Arg

Lys

Leu

Lys

Val

Thr

Glu

Ala

Phe

His

755

760

765

Ser

His

Met

Arg

Pro

Met

Ala

Asp

Ala

Phe

Gly

Ala

Ser

Leu

Arg

770

775

780

Asp 785

Leu

Phe Asn

Ser Asp 790

Asn Asn

Asn Asp

Asn 795

Pro

Asn Ala

Asp

Thr 800

Ser

Lys

Gly

Val

Leu

Tyr

Ser

Pro

Lys

Thr

Gly

Ser

Arg

Met

Thr

805

810

815

Asp

Leu

Lys

Leu

Asp

Pro

Thr

His

Trp

Met

Asp

Ser

Met

Leu

820

825

830

Gin

Pro

Val

Glu

Phe

Glu

Ser

Leu

Arg

Glu

Met

Cys

Phe

Asp

Pro

835

840

845

Asn Thr

Lys

Glu Lys

Ala

Val Asp Val 855

Ile

Glu 860

Ile

Gly

Pro

His

850

Gly

Ala

Leu

Gly

Pro

Ile

Asn

Gin

Val

Met

Gin

Asp

Leu

Gly

Leu

865

870

875

880

Lys

Gly

Thr

Asp

Ile

Asn

Tyr

Leu

Ser

Cys

Leu

Ser

Arg

Gly

Arg

Ser

885

890

895

Ser

Leu

Glu

Thr

Met

Tyr

Arg

Ala

Thr

Glu

Leu

Ile

Ser

Lys

Gly

900

905

910

Tyr

Gly

Leu

Lys

Met

Asp

Ala

Ile

Asn

Phe

Pro

His

Gly

Arg

Lys

Glu

915

920

925

Pro

Arg

Val

Lys

Val

Leu

Ser

Asp

Leu

Pro

Ala

Tyr

Pro

Trp

Asn

His

930

935

940

104

Gin

Thr

Arg

Tyr

Trp

Arg

Glu

Pro

Arg

Gly

Ser

Arg

Glu

Ser

Lys

Gin

945

950

955

960

Arg

Thr

His

Pro

His

Thr

Leu

Ile

Gly

Ser

Arg

Glu

Ser

Leu

Ser

965

970

975

Pro

His

Phe

Ala

Pro

Lys

Trp

Lys

His

Val

Leu

Arg

Leu

Ser

Asp

Ile

980

985

990

Pro Trp

Ile Arg Asp His

995

Val Val Gly Ser Ser Ile Ile

1000 1005

Phe Pro Gly

Ala

Gly 1010

Phe

Ile

Ser Met Ala 1015

Ile

Glu

Gly

Phe

Ser 1020

Gin

Val

Cys

Pro

Val

Ala

Gly

Ala

Ser

Ile

Asn

Tyr

Asn

Leu

Arg

Asp

Val

1025

1030

1035

Glu

Leu

Ala

Gin

Ala

Leu

Ile

Pro

Ala

Asp

Ala

Glu

Ala

Glu

1040

1045

1050

Val

Asp

Leu

Arg

Leu

Thr

Ile

Arg

Ser

Cys

Glu

Arg

Ser

Leu

1055

1060

1065

Gly

Thr

Lys

Asn

Trp

His

Gin

Phe

Ser

Val

His

Ser

Ile

Ser

Gly

1070

1075

1080

Glu

Asn

Thr

Trp

Thr

Glu

His

Cys

Thr

Gly

Leu

Ile

Arg

Ser

1085

1090

1095

Glu Ser 1100

Glu Arg Ser

His

Leu 1105

Asp Cys

Ser

Thr

Val 1110

Glu

Ala

Ser

Arg

Leu

Asn

Leu

Gly

Ser

Asp

Asn

Arg

Ser

Ile

Asp

Pro

Asn

1115

1120

1125

Asp

Leu

Trp

Glu

Ser

Leu

His

Ala

Asn

Gly

Ile

Cys

His

Gly

Pro

1130

1135

1140

Ile

Phe

Gin

Asn

Ile

Gin

Arg

Ile

Gin

Asn

Gly

Gin

Gly

Ser

1145

1150

1155

Phe Cys Arg Phe Ser 1160

Ile Ala Asp Thr Ala 1165

Ser Ala Met Pro His

1170

105

Ser

Tyr 1175

Glu

Asn Arg

His

Ile 1180

Val

His

Pro

Thr

Thr 1185

Leu Asp

Ser

Val

Ile

Gin

Ala

Tyr

Thr

Val

Leu

Pro

Tyr

Ala

Gly

Thr

Arg

1190

1195

1200

Met

Lys

Thr

Ala

Met

Val

Pro

Arg

Leu

Arg

Asn

Val

Lys

Ile

1205

1210

1215

Ser

Leu

Ala

Asp

Leu

Glu

Ala

Gly

Asp

Ala

Leu

Asp

Ala

1220

1225

1230

Gin Ala

Ser

Ile

Lys

Asp Arg 1240

Asn Ser Gin Ser

Phe 1245

Ser

Thr

Asp

1235

Leu

Ala

Val

Phe

Asp

Tyr

Asp

Ser

Gly

Ser

Pro

Ser

Asp

1250

1255

1260

Gly

Ile 1265

Pro

Val

Ile

Glu

Ile 1270

Glu

Gly

Leu

Val

Phe 1275

Gin

Ser

Val

Gly

Ser 1280

Ser

Phe

Ser

Asp

Gin 1285

Lys

Ser

Asp

Ser

Asn 1290

Asp

Thr

Glu

Asn

Ala 1295

Cys

Ser

Trp

Val 1300

Trp

Ala

Pro

Asp

Ile 1305

Ser

Leu

Gly

Asp

Ser 1310

Thr

Trp

Leu Lys

Glu 1315

Lys

Leu

Ser

Thr Glu 1320

Ala

Glu

Thr

Lys

Glu

Thr

Glu

Leu

Met

Asp

Leu

Arg

Cys

Thr

Ile

Asn

1325

1330

1335

Phe

Ile

Gin

Glu

Ala

Val

Thr

Asp

Leu

Thr

Asn

Ser

Asp

Ile

Gin

1340

1345

1350

His

Leu

Asp

Gly

His

Leu

Gin

Lys

Tyr

Phe

Asp

Trp

Met

Asn

Val

1355

1360

1365

Gin

Leu

Asp

Leu

Ala

Arg

Gin

Asn

Lys

Leu

Ser

Pro

Ala

Ser

Cys

1370

1375

1380

Asp Trp Leu

1385

Ser Asp Asp Ala

1390

Glu Gin

Lys

Lys Cys Leu Gin Ala

1395

106

Arg Val

Ala Gly

Glu

Ser

Val 1405

Asn Gly

Glu

Met

Ile 1410

Ser

Arg

Leu

1400

Gly

Pro

Gin

Leu

Ile

Ala

Met

Leu

Arg

Glu

Thr

Glu

Pro

Leu

1415

1420

1425

Glu

Leu

Met

Gin

Asp

Gin

Leu

Ser

Arg

Tyr

Val

Asn

1430

1435

1440

Ala

Ile

Lys

Trp

Ser

Arg

Ser

Asn

Ala

Gin

Ala

Ser

Glu

Leu

Ile

1445

1450

1455

Arg

Leu

Cys

Ala

His

Lys

Asn

Pro

Arg

Ser

Arg

Ile

Leu

Glu

Ile

1460

1465

1470

Gly Gly

Gly Thr

Gly Gly

Cys 1480

Thr Lys

Leu

Ile

Val 1485

Asn

Ala

Leu

1475

Gly

Asn

Thr

Lys

Pro

Ile

Asp

Arg

Tyr

Asp

Phe

Thr

Asp

Val

Ser

1490

1495

1500

Ala

Gly

Phe

Phé

Glu

Ser

Ala

Arg

Glu

Gin

Phe

Ala

Asp

Trp

Gin

1505

1510

1515

Asp

Val

Met

Thr

Phe

Lys

Leu

Asp

Ile

Glu

Ser

Asp

Pro

Glu

1520

1525

1530

Gin

Gly

Phe

Glu

Cys

Ala

Thr

Tyr

Asp

Val

Ala

Cys

1535

1540

1545

Gin

Val

Leu

His

Ala

Thr

Arg

Cys

Met

Lys

Arg

Thr

Leu

Ser

Asn

1550

1555

1560

Val

Arg

Lys

Leu

Lys

Pro

Gly

Asn

Leu

Ile

Leu

Val

Glu

1565

1570

1575

Thr

Arg

Asp

Gin

Leu

Asp

Leu

Phe

Thr

Phe

Gly

Leu

1580

1585

1590

Pro

Gly

Trp

Leu

Ser

Glu

Pro

Glu

Arg

Lys

Ser

Thr

Pro

1595

1600

1605

Ser

Leu

Thr

Asp

Leu

Trp

Asn

Thr

Met

Leu

Asp

Thr

Ser

Gly

1610

1615

1620

Phe

Asn

Gly

Val

Glu

Leu

Glu

Val

Arg

Asp

Cys

Glu

Asp

Glu

107

1625

1630

1635

Phe Tyr

Met

Ile

Ser

Thr

Met 1645

Leu Ser

Thr

Ala

Arg 1650

Lys

Glu

Asn

1640

Thr

Pro

Asp

Thr

Val

Ala

Glu

Ser

Glu

Val

Leu

His

1655

1660

1665

Gly

Ala

Leu

Arg

Pro

Ser

Trp

Leu

Glu

Ser

Leu

Gin

Ala

1670

1675

1680

Ala

Ile

Cys

Glu

Lys

Thr

Ser

Pro

Ser

Ile

Asn

Ala

Leu

1685

1690

1695

Gly Glu

1700

Val Asp Thr Thr Gly Arg Thr Cys

1705

Ile

Phe Leu Gly Glu 1710

Met

Glu 1715

Ser

Leu

Gly 1720

Glu Val

Gly

Ser

Glu 1725

Thr

Phe

Lys

Ser

Ile

Thr

Ala

Met

Leu

Asn

Cys

Asn

Ala

Leu

Trp

Val

1730

1735

1740

Ser

Arg

Gly

Ala

Met

Ser

Glu

Asp

Pro

Trp

Lys

Ala

Leu

1745

1750

1755

His

Ile

Gly

Leu

Arg

Thr

Ile

Arg

Asn

Glu

Asn

Gly

Lys

1760

1765

1770

Glu

Tyr

Val

Ser

Leu

Asp

Leu

Asp

Pro

Ser

Arg

Asn

Ala

Tyr

Thr

1775

1780

1785

His

Glu 1790

Ser

Leu Tyr

Ala

Ile 1795

Cys

Asn

Ile

Phe Asn 1800

Gly

Arg

Leu

Gly

Asp

Leu

Ser

Glu

Asp

Lys

Glu

Phe

Glu

Phe

Ala

Glu

Arg

Asn

1805

1810

1815

Gly

Val

Ile

His

Val

Pro

Arg

Leu

Phe

Asn

Asp

Pro

His

Trp

Lys

1820

1825

1830

Asp

Gin

Glu

Ala

Val

Glu

Val

Thr

Leu

Gin

Pro

Phe

Glu

Gin

Pro

1835

1840

1845

Gly Arg Arg

1850

Leu Arg Met

Glu Val Glu Thr

1855

Pro Gly Leu Leu Asp

1860

108

Ser Leu Gin Phe Arg Asp Asp Glu Gly Arg Glu Gly

1865 1870 1875

Lys Asp Leu

Pro Asp

Asp Trp Val

Glu Ile 1885

Glu

Pro

Lys

Ala

Phe 1890

Gly Leu Asn

1880

Phe

Arg

Asp

Val

Met

Val

Ala

Met

Gly

Gin

Leu

Glu

Ala

Asn

Arg

1895

1900

1905

Val

Met

Gly

Phe

Glu

Cys

Ala

Gly

Val

Ile

Thr

Lys

Leu

Gly

1910

1915

1920

Ala

Ser

Gin

Gly

Leu

Arg

Leu

Gly

Asp

Arg

Val

Cys

1925

1930

1935

Ala

Leu 1940

Leu

Lys

Gly His

Trp 1945

Ala

Thr Arg

Thr

Gin 1950

Thr

Pro

Tyr

Thr

Asn

Val

Arg

Ile

Pro

Asp

Glu

Met

Gly

Phe

Pro

Glu

Ala

1955

1960

1965

Ala

Ser

Val

Pro

Leu

Ala

Phe

Thr

Ala

Tyr

Ile

Ala

Leu

Tyr

1970

1975

1980

Thr

Ala

Lys

Leu

Arg

Gly

Glu

Arg

Val

Leu

Ile

His

Ser

1985

1990

1995

Gly

Ala

Gly

Val

Gly

Gin

Ala

Ile

Leu

Ser

Gin

Leu

2000

2005

2010

Ala

Gly 2015

Ala

Glu Val

Phe

Val 2020

Thr Ala

Gly

Thr

Gin 2025

Ala Lys

Arg

Asp

Phe

Val

Gly

Asp

Lys

Phe

Gly

Ile

Asn

Pro

Asp

His

Ile

Phe

2030

2035

2040

Ser

Arg

Asn

Asp

Leu

Phe

Val

Asp

Gly

Ile

Lys

Ala

Tyr

Thr

2045

2050

2055

Gly

Leu

Gly

Val

His

Val

Leu

Asn

Ser

Leu

Ala

Gly

Gin

2060

2065

2070

Leu

Gin

Ala

Ser

Phe

Asp

Cys

Met

Ala

Glu

Phe

Gly

Arg

Phe

2075

2080

2085

109

Val Glu

2090

Ile Gly Lys Lys Asp Leu Glu Gin Asn 2095 • ·

Ser Arg

2100

Leu Asp

Met

Leu 2105

Pro

Phe

Thr

Arg

Asp 2110

Val

Ser

Phe

Thr

Ser 2115

Ile

Asp

Leu

Ser

Trp

Gin

Arg

Ala

Lys

Ser

Glu

Val

Ser

Glu

Ala

Leu

2120

2125

2130

Asn

His

Val

Thr

Lys

Leu

Glu

Thr

Lys

Ala

Ile

Gly

Leu

Ile

2135

2140

2145

Gly

Pro

Ile

Gin

His

Ser

Leu

Ser

Asn

Ile

Glu

Lys

Ala

Phe

2150

2155

2160

Arg

Thr

Met

Gin

Ser

Gly

Gin

His

Val

Gly

Lys

Val

Asn

2165

2170

2175

Val Ser

Gly

Asp

Glu Leu

Val 2185

Pro Val Gly Asp Gly 2190

Gly Phe

Ser

2180

Leu

Lys

Leu

Lys

Pro

Asp

Ser

Tyr

Leu

Val

Ala

Gly

Leu

2195

2200

2205

Gly

Ile

Gly

Lys

Gin

Ile

Cys

Gin

Trp

Leu

Val

Asp

His

Gly

2210

2215

2220

Ala

Lys

His

Leu

Ile

Leu

Ser

Arg

Ser

Ala

Lys

Ala

Ser

Pro

2225

2230

2235

Phe

Ile

Thr

Ser

Leu

Gin

Asn

Gin

Cys

Ala

Val

Tyr

Leu

His

2240

2245

2250

Ala

Cys

Asp

Ile

Ser

Asp

Gin

Asp

Gin

Val

Thr

Lys

Val

Leu

Arg

2255

2260

2265

Leu

Cys

Glu

Ala

His

Ala

Pro

Ile

Arg

Gly

Ile

Gin

2270

2275

2280

Gly

Ala

Met

Val

Leu

Lys

Asp

Ala

Leu

Ser

Arg

Met

Thr

Leu

2285

2290

2295

Asp

Glu

Phe

Asn

Ala

Thr

Arg

Pro

Lys

Val

Gin

Gly

Ser

Trp

2300

2305

2310

110

Tyr

Leu 2315

His

Lys

Ile

Ala

Gin 2320

Asp

Val

Asp

Phe

Phe 2325

Val

Met

Leu

Ser

Ser 2330

Leu

Val

Gly

Val

Met 2335

Gly

Ala

Gly

Gin 2340

Ala

Asn

Tyr

Ala Ala

Ala

Gly Ala

Phe

Gin 2350

Asp Ala Leu Ala

His 2355

His Arg Arg

2345

Ala

His

Gly

Met

Pro

Ala

Val

Thr

Ile

Asp

Leu

Gly

Met

Val

Lys

2360

2365

2370

Ser

Val

Gly

Tyr

Val

Ala

Glu

Thr

Gly

Arg

Gly

Val

Ala

Asp

Arg

2375

2380

2385

Leu

Ala

Arg

Ile

Gly

Tyr

Lys

Pro

Met

His

Glu

Lys

Asp

Val

Met

2390

2395

2400

Asp Val 2405

Leu

Glu

Lys

Ala

Ile 2410

Leu

Cys

Ser

Pro 2415

Gin

Phe

Pro

Ser

Pro

Ala

Val

Thr

Gly

Ile

Asn

Thr

Ser

Pro

Gly

2420

2425

2430

Ala

His

Trp

Thr

Glu

Ala

Asn

Trp

Ile

Gin

Glu

Gin

Arg

Phe

Val

2435

2440

2445

Gly

Leu

Lys

Tyr

Arg

Gin

Val

Leu

His

Ala

Asp

Gin

Ser

Phe

Val

2450

2455

2460

Ser

His

Lys

Gly

Pro

Asp

Gly

Val

Arg

Ala

Gin

Leu

Ser

2465

2470

2475

Arg

Val

Thr

Ser

His

Asp

Glu

Ala

Ile

Ser

Ile

Val

Leu

Lys

Ala

2480

2485

2490

Met

Thr

Glu

Lys

Leu

Met

Arg

Met

Phe

Gly

Leu

Ala

Glu

Asp

2495

2500

2505

Met

Ser

Lys

Asn

Leu

Ala

Gly

Val

Gly

Val

Asp

Ser

Leu

2510

2515

2520

Val

Ala

Ile

Glu

Leu

Arg

Asn

Trp

Ile

Thr

Ser

Glu

Ile

His

Val

2525

2530

2535

Asp

Val

Ser

Ile

Phe

Glu

Leu

Met

Asn

Gly

Asn

Thr

Ile

Ala

Gly

111

2540

2545

2550

Leu Val Glu Leu Val Val Ala Lys Cys Ser 2555 2560

<210>	47
<211>	1557
<212>	DNA
<213>	Penicillium citrinum

<220>
<221>	CDS
<222>	(1)..(1557)

<400> 47

cag Gin

gtt Val 5

ctt Leu

ctg Leu

acc Thr

gtc Val

gaa Glu 10

tcg Ser

tac Tyr

caa Gin

tgg Trp

gta Val 15

tcg Ser

48

atg Met 1

ctc ggc Leu Gly

acc

cct

caa

gcc

ctt

gtg

gcg

gtc

gca

gtg

ctt

agt

ctc

atc

gcc

96

Thr

Pro

Gin

Ala

Leu

Val

Ala

Val

Ala

Val

Leu

Ser

Leu

Ile

Ala

20

25

30

tac

cgt

ttg

cgg

ggg

cgc

cag

tcc

gaa

ctg

caa

gtc

tat

aat

ccc

aaa

144

Tyr

Arg

Leu

Arg

Gly

Arg

Gin

Ser

Glu

Leu

Gin

Val

Tyr

Asn

Pro

Lys

35

40

45

aaa

tgg

gag

ttg

acg

acc

atg

agg

get

agg

cag

gac

ttc

gat

acg

192

Lys

Trp

Glu

Leu

Thr

Met

Arg

Ala

Arg

Gin

Asp

Phe

Asp

Thr

50

55

60

tat

ggt

ccg

age

tgg

atc

gaa

get

tgg

ttc

tcg

aaa

aac

gac

aag

ccc

240

Tyr

Gly

Pro

Ser

Trp

Ile

Glu

Ala

Trp

Phe

Ser

Lys

Asn

Asp

Lys

Pro

65

70

75

80

ctg

cgc

ttc

att

gtt

gat

tcc

ggc

tat

tgc

acc

atc

ctc

cca

tcg

tcc

288

Leu

Arg

Phe

Ile

Val

Asp

Ser

Gly

Tyr

Cys

Thr

Ile

Leu

Pro

Ser

85

90

95

atg

gcc

gac

gag

ttt

cgg

aaa

atc

aaa

gat

atg

tgc

atg

tac

aag

ttt

336

Met

Ala

Asp

Glu

Phe

Arg

Lys

Ile

Lys

Asp

Met

Cys

Met

Tyr

Lys

Phe

100

105

110

ttg

gcg

gat

gac

ttt

cac

tet

cat

ctc

cct

gga

ttc

gac

ggg

ttc

aag

384

Leu

Ala

Asp

Phe

His

Ser

His

Leu

Pro

Gly

Phe

Asp

Gly

Phe

Lys

115

120

125

gaa

atc

tgc

cag

gat

gca

cat

ctt

gtc

aac

aaa

gtt

ttg

aac

cag

4 32

Glu

Ile

Cys

Gin

Asp

Ala

His

Leu

Val

Asn

Lys

Val

Leu

Asn

Gin

130

135

140

112

tta Leu 145

caa Gin

acc caa Thr Gin

gcc ccc

aag Lys

tac Tyr

aca aag cca ttg

gct Ala

acc ttg gcc

480

Ala

Pro 150

Thr Lys

Pro 155

Leu

Thr Leu

Ala 160

gac

gct

act

att

gcc

aag

ttg

ttc

ggt

aaa

age

gag

tgg

caa

acc

528

Asp

Ala

Thr

Ile

Ala

Lys

Leu

Phe

Gly

Lys

Ser

Glu

Trp

Gin

Thr

165

170

175

gca

cct

gtc

tat

tcc

aat

gga

ttg

gac

ctt

gtc

aca

ega

aca

gtc

aca

576

Ala

Pro

Val

Tyr

Ser

Asn

Gly

Leu

Asp

Leu

Val

Thr

Arg

Thr

Val

Thr

180

185

190

ctc

att

atg

gtc

ggc

gac

aaa

atc

tgc

cac

aat

gag

tgg

ctg

gat

624

Leu

Ile

Met

Val

Gly

Asp

Lys

Ile

Cys

His

Asn

Glu

Trp

Leu

Asp

195

200

205

att

gca

aag

aac

cat

gcc

gtg

agt

gtg

gcg

gta

caa

gct

cgc

caa

ctt

672

Ile

Ala

Lys

Asn

His

Ala

Val

Ser

Val

Ala

Val

Gin

Ala

Arg

Gin

Leu

210

215

220

cgc

gta

tgg

ccc

atg

cta

ctg

ega

ccg

ctc

gct

cac

tgg

ttt

caa

ccg

720

Arg

Val

Trp

Pro

Met

Leu

Arg

Pro

Leu

Ala

His

Trp

Phe

Gin

Pro

225

230

235

240

caa

gga

cgc

aaa

ttg

cgt

gac

caa

gtg

cgc

gca

ega

aag

atc

att

768

Gin

Gly

Arg

Lys

Leu

Arg

Asp

Gin

Val

Arg

Ala

Arg

Lys

Ile

245

250

255

gat

cct

gag

att

cag

ega

cgt

gct

gaa

aag

gcc

gca

tgt

gta

gcg

816

Asp

Pro

Glu

Ile

Gin

Arg

Ala

Glu

Lys

Ala

Cys

Val

Ala

260

265

270

aag

ggc

gtg

cag

ccg

ccc

cag

tac

gtc

gat

acc

atg

caa

tgg

ttt

gaa

864

Lys

Gly

Val

Gin

Pro

Gin

Tyr

Val

Asp

Thr

Met

Gin

Trp

Phe

Glu

275

280

285

gac

acc

gcc

gac

ggc

cgc

tgg

tac

gat

gtg

gcg

ggt

gct

cag

ctc

gct

912

Asp

Thr

Ala

Asp

Gly

Arg

Trp

Tyr

Asp

Val

Ala

Gly

Ala

Gin

Leu

Ala

290

295

300

atg

gat

ttc

gcc

ggc

atc

tac

gcc

tcg

acg

gat

ctt

ttc

gtc

ggt

gcc

960

Met

Asp

Phe

Ala

Gly

Ile

Tyr

Ala

Ser

Thr

Asp

Leu

Phe

Val

Gly

Ala

305

310

315

320

ctt

gtg

gac

att

gcc

agg

cac

cca

gac

ctt

att

cag

cct

ctc

cgc

caa

1008

Leu

Val

Asp

Ile

Ala

Arg

His

Pro

Asp

Leu

Ile

Gin

Pro

Leu

Arg

Gin

325

330

335

gag

atc

cgc

act

gta

atc

gga

gaa

ggg

ggc

tgg

acg

cct

gcc

tet

ctg

1056

Glu

Ile

Arg

Thr

Val

Ile

Gly

Glu

Gly

Trp

Thr

Pro

Ala

Ser

Leu

340

345

350

ttc

aag

ctg

aag

ctc

gac

age

tgc

atg

aaa

gag

acg

cag

ega

atc

1104

Phe

Lys

Leu

Lys

Leu

Asp

Ser

Cys

Met

Lys

Glu

Thr

Gin

Arg

Ile

355

360

365

aag

ccg

gtc

gag

tgc

gcc

act

atg

cgc

agt

acc

gct

ctc

aga

gac

atc

1152

Lys

Pro

Val

Glu

Cys

Ala

Thr

Met

Arg

Ser

Thr

Ala

Leu

Arg

Asp

Ile

370

375

380

113

act Thr 385

cta Leu

tcc aat

ggc Gly

ctc Leu 390

ttc Phe

att Ile

ccc Pro

aag ggc

gag ttg gcc

get Ala

gtg Val 400

1200

Ser

Asn

Lys

Gly 395

Glu

Leu

Ala

get

gca

gac

ege

atg

aac

cct

gat

gtg

tgg

gaa

aac

ccc

gaa

aat

1248

Ala

Asp

Arg

Met

Asn

Pro

Asp

Val

Trp

Glu

Asn

Pro

Glu

Asn

405

410

415

tat

gat

ccc

tac

ega

ttt

atg

ege

atg

ege

gag

gat

cca

gac

aag

gcc

1296

Tyr

Asp

Pro

Tyr

Arg

Phe

Met

Arg

Met

Arg

Glu

Asp

Pro

Asp

Lys

Ala

420

425

430

ttc

acc

get

caa

ttg

gag

aat

acc

aac

ggt

gat

cac

atc

ggc

ttc

ggc

1344

Phe

Thr

Ala

Gin

Leu

Glu

Asn

Thr

Asn

Gly

Asp

His

Ile

Gly

Phe

Gly

435

440

445

tgg

aac

cca

ege

get

tgt

ccc

ggg

cgg

ttc

gcc

tcg

aag

gaa

atc

1392

Trp

Asn

Pro

Arg

Ala

Cys

Pro

Gly

Arg

Phe

Ala

Ser

Lys

Glu

Ile

450

455

460

aag

att

ctc

get

cat

ata

ctg

att

cag

tat

gat

gtg

aag

cct

gta

1440

Lys

Ile

Leu

Ala

His

Ile

Leu

Ile

Gin

Tyr

Asp

Val

Lys

Pro

Val

465

470

475

480

cca

gga

gac

gat

gac

aaa

tac

cgt

cac

get

ttt

age

gtt

cgt

atg

1488

Pro

Gly

Asp

Lys

Tyr

Arg

His

Ala

Phe

Ser

Val

Arg

Met

485

490

495

cat

cca

acc

aca

aag

ctc

atg

gta

ege

cgg

ege

aac

gag

gac

atc

ccg

1536

His

Pro

Thr

Lys

Leu

Met

Val

Arg

Asn

Glu

Asp

Ile

Pro

500

505

510

ctc

cct

cat

gac

cgg

tgc

taa

1557

Leu

Pro

His

Asp

Arg

Cys

515

<210>	48
<211>	518
<212>	PRT
<213>	Penicillium citrinum

<400> 48

Met 1

Leu

Gly

Gin

Val 5

Leu

Thr Val

Glu Ser Tyr Gin Trp Val

Ser

10

15

Thr

Pro

Gin

Ala

Leu

Val

Ala

Val

Ala

Val

Leu

Ser

Leu

Ile

Ala

20

25

30

Tyr

Arg

Leu

Arg

Gly

Arg

Gin

Ser

Glu

Leu

Gin

Val

Tyr

Asn

Pro

Lys

35

40

45

114

Lys Trp 50

Trp

Glu Leu

Thr Thr Met Arg Ala Arg Gin Asp Phe Asp

Thr

55

60

Tyr

Gly

Pro

Ser

Trp

Ile

Glu

Ala

Trp

Phe

Ser

Lys

Asn

Asp

Lys

Pro

65

70

75

80

Leu

Arg

Phe

Ile

Val

Asp

Ser

Gly

Tyr

Cys

Thr

Ile

Leu

Pro

Ser

85

90

95

Met

Ala

Asp

Glu

Phe

Arg

Lys

Ile

Lys

Asp

Met

Cys

Met

Tyr

Lys

Phe

100

105

110

Leu

Ala

Asp Asp Phe His 115

Ser His Leu Pro Gly Phe Asp Gly Phe

Lys

120

125

Glu

Ile

Cys

Gin

Asp

Ala

His

Leu

Val

Asn

Lys

Val

Leu

Asn

Gin

130

135

140

Leu

Gin

Thr

Gin

Ala

Pro

Lys

Tyr

Thr

Lys

Pro

Leu

Ala

Thr

Leu

Ala

145

150

155

160

Asp Ala

Thr

Ile

Ala

Lys

Leu

Phe

Gly

Lys

Ser

Glu

Trp

Gin

Thr

165

170

175

Ala

Pro

Val

Tyr

Ser

Asn

Gly

Leu

Asp

Leu

Val

Thr

Arg

Thr

Val

Thr

180

185

190

Leu

Ile

Met

Val

Gly

Asp

Lys

Ile

Cys

His

Asn

Glu

Trp

Leu

Asp

195

200

205

Ile

Ala

Lys

Asn

His

Ala

Val

Ser

Val

Ala

Val

Gin

Ala

Arg

Gin

Leu

210

215

220

Arg

Val

Trp

Pro

Met

Leu

Arg

Pro

Leu

Ala

His

Trp

Phe

Gin

Pro

225

230

235

240

Gin

Gly

Arg

Lys

Leu

Arg

Asp

Gin

Val

Arg

Ala

Arg

Lys

Ile

245

250

255

Asp

Pro

Glu

Ile

Gin

Arg

Ala

Glu

Lys

Ala

Cys

Val

Ala

260

265

270

Lys

Gly

Val

Gin

Pro

Gin

Tyr

Val

Asp

Thr

Met

Gin

Trp

Phe

Glu

275

280

285

Asp

Thr

Ala

Asp

Gly

Arg

Trp

Tyr

Asp

Val

Ala

Gly

Ala

Gin

Leu

Ala

115 • ·

290

295

300

Met 305

Asp Phe

Ala Gly

Ile Tyr Ala Ser Thr Asp Leu Phe Val Gly

Ala 320

310

315

Leu

Val

Asp

Ile

Ala

Arg

His

Pro

Asp

Leu

Ile

Gin

Pro

Leu

Arg

Gin

325

330

335

Glu

Ile

Arg

Thr

Val

Ile

Gly

Glu

Gly

Trp

Thr

Pro

Ala

Ser

Leu

340

345

350

Phe Lys

Leu 355

Lys

Leu

Asp

Ser Cys Met 360

Lys

Glu Thr Gin 365

Arg

Ile

Lys

Pro

Val

Glu

Cys

Ala

Thr

Met

Arg

Ser

Thr

Ala

Leu

Arg

Asp

Ile

370

375

380

Thr

Leu

Ser

Asn

Gly

Leu

Phe

Ile

Pro

Lys

Gly

Glu

Leu

Ala

Val

385

390

395

400

Ala

Asp

Arg

Met

Asn

Pro

Asp

Val

Trp

Glu

Asn

Pro

Glu

Asn

405

410

415

Tyr

Asp

Pro

Tyr

Arg

Phe

Met

Arg

Met

Arg

Glu

Asp

Pro

Asp

Lys

Ala

420

425

430

Phe

Thr

Ala

Gin

Leu

Glu

Asn

Thr

Asn

Gly

Asp

His

Ile

Gly

Phe

Gly

435

440

445

Trp

Asn

Pro

Arg

Ala

Cys

Pro

Gly

Arg

Phe

Ala

Ser

Lys

Glu

Ile

450

455

460

Lys

Ile

Leu

Ala

His

Ile

Leu

Ile

Gin

Tyr

Asp

Val

Lys

Pro

Val

465

470

475

480

Pro

Gly

Asp

Lys

Tyr

Arg

His

Ala

Phe

Ser

Val

Arg

Met

485

490

4 95

His

Pro

Thr

Lys

Leu

Met

Val

Arg

Asn

Glu

Asp

Ile

Pro

500

505

510

Leu Pro

His Asp Arg Cys

515 <210> 49

116 • · • · • · · ·

<211> 3522 <212> DNA <213> Penicillium citrinum

<220>
<221>	CDS
<222>	(1)·.(3522)

<400> 49

tcg Ser

ttg Leu 5

cta Leu

ccc Pro

tet Ser

ege Arg

ttt Phe 10

ege Arg

ggt Gly

agg Arg

gaa Glu

tea Ser 15

atg Met

48

atg Met 1

gtc get Val Ala

aat

cag

cac

cct

cta

ege

tcg

gga

aat

cgg

gca

ttg

acc

tcc

aca

96

Asn

Gin

His

Pro

Leu

Arg

Ser

Gly

Asn

Arg

Ala

Leu

Thr

Ser

Thr

20

25

30

ctc

caa

ttt

cta

tcc

aaa

acg

gcg

tgt

cta

cac

ccg

atc

cat

acc

gtt

144

Leu

Gin

Phe

Leu

Ser

Lys

Thr

Ala

Cys

Leu

His

Pro

Ile

His

Thr

Val

35

40

45

tgc

acc

ata

get

att

cta

get

agt

acc

aca

tac

gtt

gga

cta

ctc

aaa

192

Cys

Thr

Ile

Ala

Ile

Leu

Ala

Ser

Thr

Tyr

Val

Gly

Leu

Lys

50

55

60

gac

age

ttc

cat

ggc

ccc

gca

aac

gtt

gat

aaa

gca

gaa

tgg

ggc

240

Asp

Ser

Phe

His

Gly

Pro

Ala

Asn

Val

Asp

Lys

Ala

Glu

Trp

Gly

65

70

75

80

tet

ttg

gtc

gaa

gga

agt

ega

age

ttg

atc

acc

ggc

cca

cag

aat

ggc

288

Ser

Leu

Val

Glu

Gly

Ser

Arg

Ser

Leu

Ile

Thr

Gly

Pro

Gin

Asn

Gly

85

90

95

tgg

aag

tgg

cag

age

ttc

gac

ggg

gat

gca

gat

gtt

ctc

gga

gat

ttc

336

Trp

Lys

Trp

Gin

Ser

Phe

Asp

Gly

Asp

Ala

Asp

Val

Leu

Gly

Asp

Phe

100

105

110

aac

cat

caa

gca

cta

atg

acc

ttg

gta

ttc

ccg

ggg

tea

tat

ggg

gtt

384

Asn

His

Gin

Ala

Leu

Met

Thr

Leu

Val

Phe

Pro

Gly

Ser

Tyr

Gly

Val

115

120

125

gca

tet

caa

gca

gcc

tea

cca

ttc

ctt

get

ccc

ctc

cct

gtg

aac

cta

432

Ala

Ser

Gin

Ala

Ser

Pro

Phe

Leu

Ala

Pro

Leu

Pro

Val

Asn

Leu

130

135

140

tet

gtg

att

gac

ctt

ccc

tea

acg

tcg

age

cct

tta

acc

gcc

tat

tcg

480

Ser

Val

Ile

Asp

Leu

Pro

Ser

Thr

Ser

Pro

Leu

Thr

Ala

Tyr

Ser

145

150

155

160

aaa

gat

aaa

gtt

ttc

gcc

ttc

tet

gtg

gaa

tac

age

gcg

ccg

gaa

528

Lys

Asp

Lys

Val

Phe

Ala

Phe

Ser

Val

Glu

Tyr

Ser

Ala

Pro

Glu

165

170

175

117

ctc Leu

gtg gct

gct Ala 180

gtt Val

caa Gin

gaa Glu

atc Ile

ccc aac aac agt

gcc gac Ala Asp 190

ctg Leu

aaa Lys

576

Val

Ala

Pro 185

Asn

Asn Ser

ttg

cag

gag

acg

caa

ttg

atc

gag

atg

gaa

cgc

cag

atg

tgg

atc

atg

624

Leu

Gin

Glu

Thr

Gin

Leu

Ile

Glu

Met

Glu

Arg

Gin

Met

Trp

Ile

Met

195

200

205

aag

gct

gcc

agg

gct

cac

aca

aaa

cgc

agc

ctt

gct

caa

tgg

gtg

cac

672

Lys

Ala

Arg

Ala

His

Thr

Lys

Arg

Ser

Leu

Ala

Gin

Trp

Val

His

210

215

220

gat

acc

tgg

aca

gag

tet

ctt

gat

ctt

atc

aag

agc

gct

caa

acg

ctc

720

Asp

Thr

Trp

Thr

Glu

Ser

Leu

Asp

Leu

Ile

Lys

Ser

Ala

Gin

Thr

Leu

225

230

235

240

gac

gtg

gtt

gtc

atg

gtg

cta

ggt

tat

ata

tea

atg

cac

ttg

act

ttc

768

Asp

Val

Met

Val

Leu

Gly

Tyr

Ile

Ser

Met

His

Leu

Thr

Phe

245

250

255

gtc

tea

ctc

ttc

ctc

agc

atg

aaa

ttg

gga

tcg

aag

gtt

tgg

ctg

816

Val

Ser

Leu

Phe

Leu

Ser

Met

Lys

Leu

Gly

Ser

Lys

Val

Trp

Leu

260

265

270

gct

aca

agc

gtc

ctt

ttg

tcg

tea

aca

ttt

gcc

ttt

ctc

ggt

ctc

864

Ala

Thr

Ser

Val

Leu

Ser

Thr

Phe

Ala

Phe

Leu

Gly

Leu

275

280

285

gac

gtg

gcc

ata

aga

cta

ggg

gtt

ccg

atg

agc

atg

agg

ttg

cta

tcc

912

Asp

Val

Ala

Ile

Arg

Leu

Gly

Val

Pro

Met

Ser

Met

Arg

Leu

Ser

290

295

300

gaa

ggc

ctc

ccc

ttc

ttg

gtg

atc

gtt

ggc

ttt

gag

aag

agc

atc

960

Glu

Gly

Leu

Pro

Phe

Leu

Val

Ile

Val

Gly

Phe

Glu

Lys

Ser

Ile

305

310

315

320

act

ctg

acc

agg

gct

gtt

ttg

tcc

tat

gct

gtg

cag

cac

ega

aag

ccc

1008

Thr

Leu

Thr

Arg

Ala

Val

Leu

Ser

Tyr

Ala

Val

Gin

His

Arg

Lys

Pro

325

330

335

cag

aag

ata

cag

tet

gac

cag

ggt

agc

gtg

aca

gcc

att

gct

gaa

agt

1056

Gin

Lys

Ile

Gin

Ser

Asp

Gin

Gly

Ser

Val

Thr

Ala

Ile

Ala

Glu

Ser

340

345

350

acc

atc

aat

tac

gcc

gta

ega

agc

gcc

att

cgg

gag

aag

ggt

tac

aat

1104

Thr

Ile

Asn

Tyr

Ala

Val

Arg

Ser

Ala

Ile

Arg

Glu

Lys

Gly

Tyr

Asn

355

360

365

atc

gtg

tgc

cac

tac

gtg

gtc

gag

atc

ctg

ctc

cta

gtt

atc

ggt

gct

1152

Ile

Val

Cys

His

Tyr

Val

Glu

Ile

Leu

Val

Ile

Gly

Ala

370

375

380

gtc

tta

ggc

atc

caa

ggt

ggg

cta

cag

cac

ttc

tgt

gtt

cta

gct

gca

1200

Val

Leu

Gly

Ile

Gin

Gly

Leu

Gin

His

Phe

Cys

Val

Leu

Ala

385

390

395

400

ttg

atc

ctg

ttc

ttt

gac

tgt

ctg

ttt

aca

ttc

tac

act

gcg

1248

Leu

Ile

Leu

Phe

Asp

Cys

Leu

Phe

Thr

Phe

Tyr

Thr

Ala

405

410

415

att

ctg

tet

atc

aag

ctc

gag

gta

aac

cgc

ctc

aaa

cgt

cat

atc

aac

1296

118 • ·

Ile

Leu Ser

Ile Lys 420

Leu Glu

Val

Asn Arg 425

Leu

Lys Arg His 430

Ile

Asn

atg

cgg

tac

gcg

ttg

gaa

gat

gag

ggt

ctc

agt

cag

cgg

acg

gcg

gag

1344

Met

Arg

Tyr

Ala

Leu

Glu

Asp

Glu

Gly

Leu

Ser

Gin

Arg

Thr

Ala

Glu

435

440

445

agt

gtc

gcg

acc

age

aat

gat

gcc

caa

gac

agt

gca

cgt

aca

tat

ctg

1392

Ser

Val

Ala

Thr

Ser

Asn

Asp

Ala

Gin

Asp

Ser

Ala

Arg

Thr

Tyr

Leu

450

455

460

ttt

ggc

aat

gat

atg

aaa

ggc

age

agt

gtt

ccg

aag

ttc

aaa

ttc

tgg

1440

Phe

Gly

Asn

Asp

Met

Lys

Gly

Ser

Val

Pro

Lys

Phe

Lys

Phe

Trp

465

470

475

480

atg

gtc

gtt

ggt

ttc

ctt

atc

gtc

aac

ctc

gtc

aac

atc

ggc

tcc

acc

1488

Met

Val

Gly

Phe

Leu

Ile

Val

Asn

Leu

Val

Asn

Ile

Gly

Ser

Thr

485

490

4 95

ctt

ttc

caa

gcc

tet

agt

gga

tcg

ttg

tcc

agt

ata

tea

tet

tgg

1536

Leu

Phe

Gin

Ala

Ser

Gly

Ser

Leu

Ser

Ile

Ser

Trp

500

505

510

acc

gaa

agt

ctg

age

gga

tcg

gcc

att

aaa

ccc

ccg

ctt

gag

ccc

ttc

1584

Thr

Glu

Ser

Leu

Ser

Gly

Ser

Ala

Ile

Lys

Pro

Leu

Glu

Pro

Phe

515

520

525

aag

gta

get

gga

agt

gga

cta

gat

gaa

cta

ctt

ttc

cag

gca

aga

ggg

1632

Lys

Val

Ala

Gly

Ser

Gly

Leu

Asp

Glu

Leu

Phe

Gin

Ala

Arg

Gly

530

535

540

cgc

ggt

caa

tcg

act

atg

gtc

act

gtc

ctc

gcc

ccc

atc

aag

tac

gaa

1680

Arg

Gly

Gin

Ser

Thr

Met

Val

Thr

Val

Leu

Ala

Pro

Ile

Lys

Tyr

Glu

545

550

555

560

cta

gag

tat

cct

tcc

att

cac

cgt

ggt

acc

tcg

cag

cta

cac

gag

tat

1728

Leu

Glu

Tyr

Pro

Ser

Ile

His

Arg

Gly

Thr

Ser

Gin

Leu

His

Glu

Tyr

565

570

575

gga

gtt

ggt

gga

aaa

atg

gtc

ggt

age

ctg

ctc

acc

age

ctg

gaa

gat

1776

Gly

Val

Gly

Lys

Met

Val

Gly

Ser

Leu

Thr

Ser

Leu

Glu

Asp

580

585

590

ccc

gtc

ctc

tcc

aaa

tgg

gtg

ttt

gtg

gca

ctt

gcc

cta

agt

gtc

get

1824

Pro

Val

Leu

Ser

Lys

Trp

Val

Phe

Val

Ala

Leu

Ala

Leu

Ser

Val

Ala

595

600

605

ctg

aac

age

tat

ctg

ttc

aag

gcc

aga

ctg

gga

atc

aaa

gat

cct

1872

Leu

Asn

Ser

Tyr

Leu

Phe

Lys

Ala

Arg

Leu

Gly

Ile

Lys

Asp

Pro

610

615

620

aat

ctc

ccg

agt

cac

cca

gtt

gat

cca

gtt

gag

ctt

gac

cag

gcc

gaa

1920

Asn

Leu

Pro

Ser

His

Pro

Val

Asp

Pro

Val

Glu

Leu

Asp

Gin

Ala

Glu

625

630

635

640

age

ttc

aac

get

gcc

cag

aac

cag

acc

cct

cag

att

caa

tea

agt

ctc

1968

Ser

Phe

Asn

Ala

Gin

Asn

Gin

Thr

Pro

Gin

Ile

Gin

Ser

Leu

645

650

655

caa

get

cct

cag

acc

aga

gtg

ttc

act

cct

acc

gac

agt

gac

2016

Gin

Ala

Pro

Gin

Thr

Arg

Val

Phe

Thr

Pro

Thr

Asp

Ser

Asp

119

660

665

670

agt Ser

gat Asp

gcc Ala 675

tea Ser

tta gtc Leu Val

tta Leu

att Ile 680

aaa Lys

gca tet

cta Leu

aag Lys 685

gtc Val

act Thr

aag Lys

2064

Ala

Ser

ega

gca

gaa

gga

aag

aca

gcc

act

agt

gaa

ctt

ccc

gtg

tet

cgc

aca

2112

Arg

Ala

Glu

Gly

Lys

Thr

Ala

Thr

Ser

Glu

Leu

Pro

Val

Ser

Arg

Thr

690

695

700

caa

atc

gaa

ctg

gac

aat

ttg

ctg

aag

cag

aac

aca

atc

age

gag

ttg

2160

Gin

Ile

Glu

Leu

Asp

Asn

Leu

Lys

Gin

Asn

Thr

Ile

Ser

Glu

Leu

705

710

715

720

aac

gat

gag

gat

gtc

gtt

gcc

ttg

tet

ttg

cgg

gga

aag

gtt

ccc

ggg

2208

Asn

Asp

Glu

Asp

Val

Ala

Leu

Ser

Leu

Arg

Gly

Lys

Val

Pro

Gly

725

730

735

tat

gcc

cta

gag

aag

agt

ctc

aaa

gac

tgc

act

cgt

gcc

gtc

aag

gtt

2256

Tyr

Ala

Leu

Glu

Lys

Ser

Leu

Lys

Asp

Cys

Thr

Arg

Ala

Val

Lys

Val

740

745

750

cgc

tet

atc

att

tcg

agg

aca

ccg

gct

acc

gca

gag

ctt

aca

agt

2304

Arg

Ser

Ile

Ser

Arg

Thr

Pro

Ala

Thr

Ala

Glu

Leu

Thr

Ser

755

760

765

atg

ctg

gag

cac

tcg

aag

ctg

ccg

tac

gaa

aac

tac

gcc

tgg

gaa

cgc

2352

Met

Leu

Glu

His

Ser

Lys

Leu

Pro

Tyr

Glu

Asn

Tyr

Ala

Trp

Glu

Arg

770

775

780

gtg

ctc

ggt

gca

tgt

tgc

gag

aac

gtt

att

ggc

tat

atg

cca

gtc

cct

2400

Val

Leu

Gly

Ala

Cys

Glu

Asn

Val

Ile

Gly

Tyr

Met

Pro

Val

Pro

785

790

795

800

gtt

ggc

gtc

gcc

ggt

cct

att

gtt

atc

gac

ggc

aag

agt

tat

ttc

att

2448

Val

Gly

Val

Ala

Gly

Pro

Ile

Val

Ile

Asp

Gly

Lys

Ser

Tyr

Phe

Ile

805

810

815

cct

atg

gca

acc

gag

ggc

gtc

ctc

gtc

gct

agt

gct

age

cgt

ggc

2496

Pro

Met

Ala

Thr

Glu

Gly

Val

Leu

Val

Ala

Ser

Ala

Ser

Arg

Gly

820

825

830

agt

aag

gca

atc

aac

ctc

ggt

ggc

ggt

gcc

gtg

aca

gtc

ctg

act

ggc

2544

Ser

Lys

Ala

Ile

Asn

Leu

Gly

Ala

Val

Thr

Val

Leu

Thr

Gly

835

840

845

gac

ggt

atg

aca

ega

ggc

ccg

tgt

gtg

aag

ttt

gat

gtc

ctt

gaa

ega

2592

Asp

Gly

Met

Thr

Arg

Gly

Pro

Cys

Val

Lys

Phe

Asp

Val

Leu

Glu

Arg

850

855

860

gct

ggt

gct

aag

atc

tgg

ctc

gat

tcg

gac

gtc

ggc

cag

acc

gta

2640

Ala

Gly

Ala

Lys

Ile

Trp

Leu

Asp

Ser

Asp

Val

Gly

Gin

Thr

Val

865

870

875

880

atg

aaa

gaa

gcc

ttc

aat

tea

acc

age

aga

ttt

gcg

cgc

tta

caa

agt

2688

Met

Lys

Glu

Ala

Phe

Asn

Ser

Thr

Ser

Arg

Phe

Ala

Arg

Leu

Gin

Ser

885

890

8 95

atg

cgg

aca

act

atc

gcc

ggt

act

cac

tta

tat

att

ega

ttt

aag

act

2736

Met

Arg

Thr

Ile

Ala

Gly

Thr

His

Leu

Tyr

Ile

Arg

Phe

Lys

Thr

900

905

910

120

act Thr

ggc gac

gct Ala

atg gga

atg aat Met Asn 920

atg att

tet Ser

aag ggc gtg gag

2784

Gly 915

Asp

Met

Gly

Met

Ile

Lys 925

Gly Val Glu

cat

gca

ctg

aat

gtt

atg

gcg

aca

gag

gca

ggt

ttc

age

gat

atg

aat

2832

His

Ala

Leu

Asn

Val

Met

Ala

Thr

Glu

Ala

Gly

Phe

Ser

Asp

Met

Asn

930

935

940

att

acc

cta

tca

gga

aat

tac

tgt

acg

gat

aag

aaa

cct

tca

gct

2880

Ile

Thr

Leu

Ser

Gly

Asn

Tyr

Cys

Thr

Asp

Lys

Pro

Ser

Ala

945

950

955

960

ttg

aat

tgg

atc

gat

gga

cgg

ggc

aag

ggc

att

gtg

gcc

gaa

gcc

atc

2928

Leu

Asn

Trp

Ile

Asp

Gly

Arg

Gly

Lys

Gly

Ile

Val

Ala

Glu

Ala

Ile

965

970

975

ata

ccg

gcg

aac

gtt

gtc

agg

gat

gtc

tta

aag

age

gat

gtg

gat

age

2976

Ile

Pro

Ala

Asn

Val

Arg

Asp

Val

Leu

Lys

Ser

Asp

Val

Asp

Ser

980

985

990

atg

gtt

cag

ctc

aac

ata

tcg

aaa

aat

ctg

att

ggg

[ tcc

: gct atg gct

3024

Met

Val

Gin

Leu

Asn

Ile

Ser

Lys

Asn

. Leu

Ile

Gly

Ser

Ala Met Ala

995

1000

1005

ggc tca

gtt Val

ggc Gly

ttc Phe

aac Asn 1015

gcc Ala

caa gct Gin Ala

gcc Ala

aat Asn 1020

ctt Leu

gcg Ala

gca Ala

3069

Gly

Ser 1010

gcc

att

ttc

att

gcc

aca

ggt

cag

gat

ccg

gcg

caa

gtt

gtg

gag

3114

Ala

Ile

Phe

Ile

Ala

Thr

Gly

Gin

Asp

Pro

Ala

Gin

Val

Glu

1025

1030

1035

age

gct

aac

tgc

atc

act

ctc

atg

aac

aat

ctt

ege

gga

tcg

ctt

3159

Ser

Ala

Asn

Cys

Ile

Thr

Leu

Met

Asn

Leu

Arg

Gly

Ser

Leu

1040

1045

1050

caa

atc

tet

gtc

tcc

atg

ccg

tet

att

gag

gtt

gga

acg

ttg

ggc

3204

Gin

Ile

Ser

Val

Ser

Met

Pro

Ser

Ile

Glu

Val

Gly

Thr

Leu

Gly

1055

1060

1065

ggt

acg

att

ctg

gag

ccc

cag

ggc

gca

atg

ctt

gac

atg

ctt

3249

Gly

Thr

Ile

Leu

Glu

Pro

Gin

Gly

Ala

Met

Leu

Asp

Met

Leu

1070

1075

1080

ggt

gtc

ege

gga

tca

cac

ccg

acc

act

ccc

ggt

gag

aat

gca

cgt

3294

Gly

Val

Arg

Gly

Ser

His

Pro

Thr

Pro

Gly

Glu

Asn

Ala

Arg

1085

1090

1095

caa

ctt

gcg

ege

atc

gga

age

gct

gtt

ttg

gct

ggg

gag

ctc

3339

Gin

Leu

Ala

Arg

Ile

Gly

Ser

Ala

Val

Leu

Ala

Gly

Glu

Leu

1100

1105

1110

tcg

cta

tgt

gct

gcc

cta

gcc

ggt

cac

ctg

gtc

aag

gcg

cac

3384

Ser

Leu

Cys

Ala

Leu

Ala

Gly

His

Leu

Val

Lys

Ala

His

1115

1120

1125

atg

gcg

cac

aac

cgt

tet

gcc

ccg

gca

tet

tca

gcc

cct

tet

ega

3429

Met

Ala

His

Asn

Arg

Ser

Ala

Pro

Ala

Ser

Ala

Pro

Ser

Arg

1130

1135

1140

121 • ·

agt gtc tcc ccg tea ggc gga acc agg aca gtc cct gtt cct aac 3474

Ser Val Ser Pro Ser Gly Gly Thr Arg Thr Val Pro Val Pro Asn

1145 1150 1155 aat gca ctg agg ccg agt get gca get act gat cgg get ega ege 3519

Asn Ala Leu Arg Pro Ser Ala Ala Ala Thr Asp Arg Ala Arg Arg

1160	1165	1170
tga			3522
<210>	50
<211>	1173
<212>	PRT
<213>	Penicillium	citrinum

<400>

Met

Val

Ala

Ser

Leu

Pro

Ser

Arg

Phe

Arg

Gly

Arg

Glu

Ser

Met

Asn

Gin

His

Pro

Leu

Arg

Ser

Gly

Asn

Arg

Ala

Leu

Thr

Ser

Thr

Leu

Gin Phe Leu 35

Ser

Lys

Thr

Ala 40

Cys

Leu His

Pro

Ile 45

His

Thr

Val

Cys

Thr

Ile

Ala

Ile

Leu

Ala

Ser

Thr

Tyr

Val

Gly

Leu

Lys

50

55

60

Asp

Ser

Phe

His

Gly

Pro

Ala

Asn

Val

Asp

Lys

Ala

Glu

Trp

Gly

65

70

75

80

Ser

Leu

Val

Glu

Gly

Ser

Arg

Ser

Leu

Ile

Thr

Gly

Pro

Gin

Asn

Gly

85

90

95

Trp

Lys

Trp

Gin

Ser

Phe

Asp

Gly

Asp

Ala

Asp

Val

Leu

Gly

Asp

Phe

100

105

110

Asn

His

Gin

Ala

Leu

Met

Thr

Leu

Val

Phe

Pro

Gly

Ser

Tyr

Gly

Val

115

120

125

Ala

Ser

Gin

Ala

Ser

Pro

Phe

Leu

Ala

Pro

Leu

Pro

Val

Asn

Leu

130

135

140

Ser

Val

Ile

Asp

Leu

Pro

Ser

Thr

Ser

Pro

Leu

Thr

Ala

Tyr

Ser

145

150

155

160

122

Lys Asp

Lys

Val

Phe Ala 165

Phe

Ser

Val

Glu 170

Tyr Ser

Ser

Ala

Pro 175

Glu

Leu

Val

Ala

Val

Gin

Glu

Ile

Pro

Asn

Ser

Ala

Asp

Leu

Lys

180

185

190

Leu

Gin

Glu

Thr

Gin

Leu

Ile

Glu

Met

Glu

Arg

Gin

Met

Trp

Ile

Met

195

200

205

Lys

Ala

Arg

Ala

His

Thr

Lys

Arg

Ser

Leu

Ala

Gin

Trp

Val

His

210

215

220

Asp

Thr

Trp

Thr

Glu

Ser

Leu

Asp

Leu

Ile

Lys

Ser

Ala

Gin

Thr

Leu

225

230

235

240

Asp	Val	Val	Val	Met 245	Val	Leu	Gly
Val	Ser	Leu	Phe 260	Leu	Ser	Met	Lys
Ala	Thr	Ser 275	Val	Leu	Leu	Ser	Ser 280
Asp	Val 290	Ala	Ile	Arg	Leu	Gly 295	Val
Glu 305	Gly	Leu	Pro	Phe	Leu 310	Val	Val

Tyr	Ile 250	Ser	Met	His	Leu	Thr 255	Phe
Lys 265	Leu	Gly	Ser	Lys	Val 270	Trp	Leu
Thr	Phe	Ala	Phe	Leu 285	Leu	Gly	Leu
Pro	Met	Ser	Met 300	Arg	Leu	Leu	Ser
Ile	Val	Gly 315	Phe	Glu	Lys	Ser	Ile 320

Thr	Leu	Thr	Arg	Ala 325	Val	Leu	Ser
Gin	Lys	Ile	Gin 340	Ser	Asp	Gin	Gly
Thr	Ile	Asn 355	Tyr	Ala	Val	Arg	Ser 360
Ile	Val 370	Cys	His	Tyr	Val	Val 375	Glu
Val 385	Leu	Gly	Ile	Gin	Gly 390	Gly	Leu

Tyr	Ala 330	Val	Gin	His	Arg	Lys 335	Pro
Ser 345	Val	Thr	Ala	Ile	Ala 350	Glu	Ser
Ala	Ile	Arg	Glu	Lys 365	Gly	Tyr	Asn
Ile	Leu	Leu	Leu 380	Val	Ile	Gly	Ala
Gin	His	Phe 395	Cys	Val	Leu	Ala	Ala 400

123 • ·

Leu Ile

Leu

Phe

Phe 405

Asp Cys

Leu

Leu Leu 410

Phe

Thr

Phe Tyr Thr 415

Ala

Ile

Leu

Ser

Ile

Lys

Leu

Glu

Val

Asn

Arg

Leu

Lys

Arg

His

Ile

Asn

420

425

430

Met

Arg

Tyr

Ala

Leu

Glu

Asp

Glu

Gly

Leu

Ser

Gin

Arg

Thr

Ala

Glu

435

440

445

Ser

Val

Ala

Thr

Ser

Asn

Asp

Ala

Gin

Asp

Ser

Ala

Arg

Thr

Tyr

Leu

450

455

460

Phe

Gly

Asn

Asp

Met

Lys

Gly

Ser

Val

Pro

Lys

Phe

Lys

Phe

Trp

465

470

475

480

Met

Val

Gly

Phe

Leu

Ile

Val

Asn

Leu

Val

Asn

Ile

Gly

Ser

Thr

485

490

495

Leu

Phe

Gin

Ala

Ser

Gly

Ser

Leu

Ser

Ile

Ser

Trp

500

505

510

Thr

Glu Ser Leu 515

Ser

Gly Ser

Ala 520

Ile

Lys

Pro

Leu Glu 525

Pro

Phe

Lys

Val

Ala

Gly

Ser

Gly

Leu

Asp

Glu

Leu

Phe

Gin

Ala

Arg

Gly

530

535

540

Arg

Gly

Gin

Ser

Thr

Met

Val

Thr

Val

Leu

Ala

Pro

Ile

Lys

Tyr

Glu

545

550

555

560

Leu

Glu

Tyr

Pro

Ser

Ile

His

Arg

Gly

Thr

Ser

Gin

Leu

His

Glu

Tyr

565

570

575

Gly

Val

Gly

Lys

Met

Val

Gly

Ser

Leu

Thr

Ser

Leu

Glu

Asp

580

585

590

Pro

Val

Leu

Ser

Lys

Trp

Val

Phe

Val

Ala

Leu

Ala

Leu

Ser

Val

Ala

595

600

605

Leu

Asn

Ser

Tyr

Leu

Phe

Lys

Ala

Arg

Leu

Gly

Ile

Lys

Asp

Pro

610

615

620

Asn

Leu

Pro

Ser

His

Pro

Val

Asp

Pro

Val

Glu

Leu

Asp

Gin

Ala

Glu

625

630

635

640

124

Ser Phe

Asn Ala Ala 645

Gin

Asn

Gin

Thr Pro Gin 650

Ile

Gin

Ser

Ser 655

Leu

Gin

Ala

Pro

Gin

Thr

Arg

Val

Phe

Thr

Pro

Thr

Asp

Ser

Asp

660

665

670

Ser

Asp

Ala

Ser

Leu

Val

Leu

Ile

Lys

Ala

Ser

Leu

Lys

Val

Thr

Lys

675

680

685

Arg

Ala

Glu

Gly

Lys

Thr

Ala

Thr

Ser

Glu

Leu

Pro

Val

Ser

Arg

Thr

690

695

700

Gin

Ile

Glu

Leu

Asp

Asn

Leu

Lys

Gin

Asn

Thr

Ile

Ser

Glu

Leu

705

710

715

720

Asn

Asp

Glu

Asp

Val

Ala

Leu

Ser

Leu

Arg

Gly

Lys

Val

Pro

Gly

725

730

735

Tyr

Ala

Leu

Glu

Lys

Ser

Leu

Lys

Asp

Cys

Thr

Arg

Ala

Val

Lys

Val

740

745

750

Arg

Ser

Ile

Ser

Arg

Thr

Pro

Ala

Thr

Ala

Glu

Leu

Thr

Ser

755

7 60

765

Met

Leu

Glu

His

Ser

Lys

Leu

Pro

Tyr

Glu

Asn

Tyr

Ala

Trp

Glu

Arg

770

775

780

Val

Leu

Gly

Ala

Cys

Glu

Asn

Val

Ile

Gly

Tyr

Met

Pro

Val

Pro

785

790

795

800

Val

Gly

Val

Ala

Gly

Pro

Ile

Val

Ile

Asp

Gly

Lys

Ser

Tyr

Phe

Ile

805

810

815

Pro

Met

Ala

Thr

Glu

Gly

Val

Leu

Val

Ala

Ser

Ala

Ser

Arg

Gly

820

825

830

Ser

Lys

Ala

Ile

Asn

Leu

Gly

Ala

Val

Thr

Val

Leu

Thr

Gly

835

840

845

Asp

Gly

Met

Thr

Arg

Gly

Pro

Cys

Val

Lys

Phe

Asp

Val

Leu

Glu

Arg

850

855

860

Ala

Gly

Ala

Lys

Ile

Trp

Leu

Asp

Ser

Asp

Val

Gly

Gin

Thr

Val

865

870

875

880

Met

Lys

Glu

Ala

Phe

Asn

Ser

Thr

Ser

Arg

Phe

Ala

Arg

Leu

Gin

Ser

125

»

885

890

895

Met

Arg

Thr

Ile

Ala

Gly

Thr

His

Leu

Tyr

Ile

Arg

Phe

Lys

Thr

900

905

910

Thr

Gly

Asp

Ala

Met

Gly

Met

Asn

Met

Ile

Ser

Lys

Gly

Val

Glu

915

920

925

His

Ala

Leu

Asn

Val

Met

Ala

Thr

Glu

Ala

Gly

Phe

Ser

Asp

Met

Asn

930

935

940

Ile

Thr

Leu

Ser

Gly

Asn

Tyr

Cys

Thr

Asp

Lys

Pro

Ser

Ala

945

950

955

960

Leu

Asn

Trp

Ile

Asp

Gly

Arg

Gly

Lys

Gly

Ile

Val

Ala

Glu

Ala

Ile

965

970

975

Ile

Pro

Ala

Asn

Val

Arg

Asp

Val

Leu

Lys

Ser

Asp

Val

Asp

Ser

980

985

990

Met

Val

Gin

Leu

Asn

Ile

Ser

Lys

Asn

i Leu

i Ile

Gly Ser

Ala Met Ala

995

1000

1005

Gly

Ser 1010

Val Gly

Gly

Phe Asn 1015

Ala

Gin

Ala

Ala Asn 1020

Leu

Ala

Ile

Phe

Ile

Ala

Thr

Gly

Gin

Asp

Pro

Ala

Gin

Val

Glu

1025

1030

1035

Ser

Ala

Asn

Cys

Ile

Thr

Leu

Met

Asn

Leu

Arg

Gly

Ser

Leu

1040

1045

1050

Gin

Ile

Ser

Val

Ser

Met

Pro

Ser

Ile

Glu

Val

Gly

Thr

Leu

Gly

1055

1060

1065

Gly

Thr

Ile

Leu

Glu

Pro

Gin

Gly

Ala

Met

Leu

Asp

Met

Leu

1070

1075

1080

Gly

Val

Arg

Gly

Ser

His

Pro

Thr

Pro

Gly

Glu

Asn

Ala

Arg

1085

1090

1095

Gin

Leu

Ala

Arg

Ile

Gly

Ser

Ala

Val

Leu

Ala

Gly

Glu

Leu

1100

1105

1110

Ser

Leu

Cys

Ala

Leu

Ala

Gly

His

Leu

Val

Lys

Ala

His

1115

1120

1125

126 • ·

Met Ala 1130

His Asn

Arg

Ser Ala 1135

Pro Ala

Ser

Ala 1140

Pro Ser

Arg

Ser

Val

Ser

Pro

Ser

Gly

Thr

Arg

Thr

Val

Pro

Val

Pro

Asn

1145

1150

1155

Asn

Ala

Leu

Arg

Pro

Ser

Ala

Thr

Asp

Arg

Ala

Arg

1160

1165

1170

<210>	51
<211>	20
<212>	DNA
<213>	Penicillium citrinum
<400> 51 gcaagctctg ctaccagcac
<210>	52
<211>	20
<212>	DNA
<213>	Penicillium citrinum
<400> 52 ctaggccaac ttcagagccg
<210>	53
<211>	20
<212>	DNA
<213>	Penicillium citrinum
<400>	53

agtcatgcag gatctgggtc <210> 54 <211> 20

127 <212> DNA <213> Penicillium citrinum <400>54 gcagacacat cggtgaagtc <210>55 <211> 20 <212> DNA <213> Penicillium citrinum <400>55 aaaccgcacc tgtctattcc

<210>	56
<211>	20
<212>	DNA
<213>	Penicillium citrinum
<400> 56 ctttgtggtt ggatgcatac	20

<210>	57
<211>	20
<212>	DNA
<213>	Penicillium citrinum
<400> 57 cgctctatca tttcgaggac	20

<210>	58
<211>	20
<212>	DNA
<213>	Penicillium citrinum

128

<400> 58 tcaatagacg gcatggagac

<210>	59
<211>	20
<212>	DNA
<213>	Penicillium citrinum
<400> 59 atgtcagaac ctctaccccc	20

<210>	60
<211>	20
<212>	DNA
<213>	Penicillium citrinum
<400> 60 tcaagcatca gtctcaggca	20

<210>	61
<211>	20
<212>	DNA
<213>	Penicillium citrinum
<400> 61 atgtccctgc cgcatgcaac	20

<210>	62
<211>	20
<212>	DNA
<213>	Penicillium citrinum
<400>	62

ctaagcaata ttgtgtttct

Claims

1. Polynukleotid vybraný ze skupiny obsahující:

(a) polynukleotid kódující protein mající aminokyselinovou sekvenci SEKV. ID. Č. 38 nebo varianta tohoto polynukleotidu kódující modifikovanou aminokyselinovou sekvenci obsahující alespoň jednu deleci, adici, substituci nebo alteraci, kdy zmíněná varianta polynukleotidu je vhodná pro urychlení biosyntézy ML-236B; a (b) polynukleotid kódující protein mající aminokyselinovou sekvenci SEKV. ID. Č. 42 nebo varianta tohoto polynukleotidu kódující modifikovanou aminokyselinu obsahující alespoň jednu deleci, substituci nebo alteraci a zmíněná varianta polynukleotidu je vhodná pro urychlení biosyntézy ML-236B.

2. Polynukleotid podle nároku 1 obsahující SEKV. ID. Č. 37 nebo její mutantu či variantu vhodnou pro urychlení biosyntézy ML-236B.

3. Polynukleotid podle nároku 1 nebo 2 obsahující SEKV. ID. Č. 37.

4. Polynukleotid podle kteréhokoli nároku 1 až 3 obsahující DNA, kterou lze získat z Escherichia coli transformované pSAKexpE SANK 72499; FERM BP-7005.

5. Polynukleotid podle nároku 1 obsahující SEKV. ID. Č. 41 nebo obsahující její variantu vhodnou pro urychlení biosyntézy ML-236B.

6. Polynukleotid podle nároku 1 nebo 5, obsahující SEKV. ID. Č. 41.

7. Polynukleotid podle nároku 1, 5 nebo 6 obsahující DNA, kterou lze získat z Escherichia coli transformované pSAKexpE SANK 72599; FERM BP-7006.

, ΛΛ · · · · * ·· · ”

Λ#Μ :::: ::.., : : ·:

ti I * · · · · ·· *

8. Polynukleotid podle kteréhokoli předcházejícího nároku ve funkční kombinaci s jedním nebo více polynukleotidy, kdy řečená kombinace je vhodná pro zesílení produkce ML-236B v mikroorganismu produkujícím ML-236B.

9. Polynukleotid podle nároku 8 obsahující polynukleotid sekvence SEKV. ID. C. 37 nebo její varianty mající podobnou funkci v kombinaci s jednou nebo více sekvencemi vybranými z SEKV. ID. Č. 37,41,43,45,47 nebo 49, nebo jejich variant majících podobnou funkci.

10. Polynukleotid podle nároku 8 obsahující polynukleotid SEKV. ID. Č. 41 nebo jeho variantu mající podobnou funkci v kombinaci s jednou nebo více sekvencemi vybranými ze sekvencí SEKV. ID. Č. 37,41,43,45,47 nebo 49, nebo jejich variant majících podobnou funkci.

11. Polynukleotid schopný za striktních podmínek hybridizovat s polynukleotidem podle kteréhokoli předchozího nároku.

12. Polynukleotid podle nároku 11, který, je-li vnesen do mikroorganismu produkujícího ML-236B, je vhodný pro urychlení biosyntézy ML-236B v mikroorganismu produkujícím ML-236B.

13. Polynukleotid podle nároku 11 nebo 12, který je RNA.

14. Vektor obsahující polynukleotid podle kteréhokoli předchozího nároku.

15. Vektor podle nároku 14, který lze získat z Escherichia coli pSAKexpE SANK 72499; FERM BP-7005 nebo Escherichia coli pSAKexpR SANK 72599; FERM BP-7006.

16. Vektor podle nároku 14 nebo 15, který je expresní vektor.

17. Hostitelská buňka transformovaná vektorem podle kteréhokoli nároku 14 nebo 16.

18. Hostitelská buňka podle nároku 17 charakterizovaná tím, že je mikroorganismem produkujícím ML-236B.

19. Hostitelská buňka podle nároku 18 charakterizovaná tím, zeje Penicillium citrinum.

20. Hostitelská buňka podle nároku 17 charakterizovaná tím, zeje Escherichia coli.

21. Hostitelská buňka podle nároku 20 charakterizovaná tím, že je Escherichia coli transformovaná vektorem pSAKexpE SANK 72499; FERM BP-7005.

22. Hostitelská buňka podle nároku 20 charakterizovaná tím, že je Escherichia coli. transformovaná vektorem pSAKexpR SANK 72599; FERM BP-7006.

23. Polypeptid kódovaný polynukleotidem podle kteréhokoli nároku 1 až 13.

24. Polypeptid obsahující sekvenci SEKV. ID. Č. 38 nebo její variantu, mající alespoň 80% identitu se SEKV. ID. Č. 38, který je schopen urychlovat produkci ML-236B v mikroorganismu produkujícím ML-236B.

25. Polypeptid podle nároku 24, mající sekvenci SEKV. ID. Č. 38.

26. Polypeptid obsahující sekvenci SEKV. ID. Č. 42 nebo její variantu mající alespoň 80% identitu se sekvencí SEKV. ID. Č. 42 a schopnost urychlit produkci ML-236B v mikroorganismu produkujícím ML-236B.

27. Polypeptid podle nároku 26, mající sekvenci SEKV. ID. Č. 42.

28. Způsob přípravy ML-236B, vyznačující se tím, že obsahuje kultivaci hostitelské buňky podle kteréhokoli nároku 17 až 19 a následné získání ML-236B z kultury.

29. Způsob podle nároku 28, v y z n a č u j í c í se t í m, že hostitelská buňka je transformována vektorem obsahujícím SEKV. ID. Č. 37 nebo SEKV. ID. Č. 41.

30. Způsob podle nároku 29, vyznačující se tím, že vektor neobsahuje další geny.

• · ·

31. Způsob podle kteréhokoli nároku 28 až 30, v y z n a č u j í c í se t í m, že produkce probíhá v nepřítomnosti rekombinantu mlcA, B, C nebo D odpovídajících SEKV. ID. Č. 44, 46, 48 nebo 50.

32. ML-236B produkovaný způsobem přípravy podle kteréhokoli nároku 28 až 31.

33. Způsob přípravy pravastatinu, vyznačující se tím, že zahrnuje způsoby přípravy podle kteréhokoli nároku 28 až 31 a přeměnu ML-236B na pravastatin.

34. Protilátka reagující s proteinem majícím sekvenci SEKV. ID. Č. 38 nebo SEKV. ID. Č. 42.

35. Polynukleotid kódující protein mající aminokyselinovou sekvenci vybranou ze sekvencí SEKV. ID. Č. 44,46,48 nebo 50, nebo varianta tohoto polynukleotidu kódující modifikaci uvedené aminokyselinové sekvence obsahující deleci, substituci, adici nebo alteraci, kdy je uvedená varianta vhodná pro užití ke zrychlení biosyntézy ML-236B.

36. Polynukleotid podle nároku 35 vybraný ze skupiny sestávající ze sekvencí SEKV. ID. Č. 43, 45, 47 nebo 49.

37. Polynukleotid podle nároku 35 nebo 36, kdy je řečený polynukleotid schopný urychlit biosyntézu ML-236B sám, nebo ve spojení s polynukleotidem o sekvenci SEKV. ID. Č. 37 nebo SEKV. ID. Č. 41.

38. Vektor obsahující polynukleotid podle kteréhokoli nároku 35 až 37.

39. Hostitelská buňka obsahující vektor podle nároku 38.

40. Polypeptid kódovaný polynukleotidem podle kteréhokoli nároku 35 až 37.

41. Způsob přípravy ML-236B, vyznačující se t í m, že obsahuje kultivaci hostitelské buňky podle nároku 39 a následné získání ML-236B z kultury.