DE60130394T2 - Gene, die im Zusammenhang mit der Biosynthese von ML-236B stehen - Google Patents

Gene, die im Zusammenhang mit der Biosynthese von ML-236B stehen Download PDF

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    • C12P7/62—Carboxylic acid esters

Description

  • GEBIET DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft einen Gencluster und insbesondere Gene von einem Gencluster.
  • Insbesondere betrifft die Erfindung Polynucleotide, wie zum Beispiel DNA, welche die Biosynthese von einem HMG-CoA-Reduktase Inhibitor, ML-236B, in einem ML-236B produzierenden Mikroorganismus beschleunigen, wenn sie in den ML-236B produzierenden Mikroorganismus eingeführt werden. Die Erfindung betrifft weiterhin Vektoren, in welche die Polynucleotide eingebaut werden, Wirtszellen, welche durch diese Vektoren transformiert werden, Proteine, welche durch diese Vektoren exprimiert werden, ein Verfahren zum Herstellen von ML-236B unter Verwendung der Polynucleotide und/oder der Proteine, wobei das Verfahren die Zurückgewinnung von ML-236B aus der Kultur von den Wirtszellen umfasst und die Erfindung betrifft ferner andere dazugehörige Aspekte.
  • ALLGEMEINER STAND DER TECHNIK
  • Pravastatin ist ein HMG-CoA-Reduktase Inhibitor. Pravastatin Natrium ist in der Behandlung von Hyperlipämie oder Hyperlipoproteinämie eingesetzt worden und weist den nützlichen pharmakologischen Effekt auf, das Serumcholesterin zu verringern. Pravastatin kann unter Verwendung von Streptomyces carbophilus durch mikrobielle Umwandlung von ML-236B, das durch Penicillium citrinum hergestellt wurde, erhalten werden [beschrieben in Endo, A., et al., J. Antibiot., 29 1346 (1976); Matsuoka, T., et al., Eur. J. Biochem., 184, 707 (1989) und in der Japanischen Patentanmeldung Publikations-Nr. 57-2240 ].
  • Es ist gezeigt worden, dass sowohl ML-236B, ein Vorläufer von Pravastatin, als auch Lovastatin, ein HMG-CoA-Inhibitor, dieselbe partielle Struktur miteinander teilen. Sie werden biologisch über Polyketide synthetisiert [beschrieben in Moore, R. N., et al., J. Am. Chem. Soc., 107, 3694 (1985); Shiao, M. und Don, H. S., Proc. Natl. Sci. Counc. Repub. China B, 11, 223 (1987)].
  • Die Polyketide sind Verbindungen, die aus β-Ketocarbonketten erhalten werden, welche aus der fortschreitenden Kondensation von niedermolekulargewichtigen Carbonsäuren, wie zum Beispiel Essigsäure, Propionsäure, Buttersäure oder dergleichen, entstehen. Es können unterschiedliche Strukturen erhalten werden, abhängig von dem Syntheseweg der Kondensation oder der Reduktion von jeder einzelnen der β-Ketocarbonyl-Gruppen [beschrieben bei Hopwood, D. A. und Sherman, D. H., Annu. Rev. Genet., 24, 37–66(1990); Hutchinson, C. R. und Fujii, I., Annu. Rev. Microbiol., 49, 201–238 (1995)].
  • Die Polyketid-Synthetasen (hierin nachfolgend als PKSs bezeichnet), die zu der Synthese von Polyketiden beitragen, sind Enzyme, von denen bekannt ist, dass sie in Fadenpilzen und Bakterien vorkommen. Die Enzyme in den Fadenpilzen sind unter Verwendung molekularbiologischer Techniken untersucht worden [wie beschrieben in Feng, G. H. und Leonard, T. J., J. Bacteriol., 177, 6246 (1995); Takano, Y., et al., Mol. Gen. Genet. 249, 162 (1995)]. In Aspergillus terreus, welches ein Mikroorganismus ist, der Lovastatin produziert, ist ein PKS-Gen, das mit der Biosynthese von Lovastatin in Zusammenhang steht, analysiert worden [beschrieben in der Internationalen Japanischen Patentauslegeschrift (KOHYO) Nr. 9-504436 und siehe ebenfalls die entsprechende Schrift WO 9512661 , in welcher eine DNA beansprucht wird, die eine Triol-Polyketid-Synthase codiert.
  • Die Gene, die im Zusammenhang mit der Biosynthese von sekundären Metaboliten aus Fadenpilzen stehen, bilden oftmals ein Cluster an dem Genom. Es ist von den Stoffwechselwegen der Biosynthese von den Polyketiden bekannt, dass dort Gencluster vorhanden sind, welche an diesen Wegen teilnehmen. In der Biosynthese von Aflatoxin, welches ein Polyketid ist, das durch Aspergillus flavus und Aspergillus parasiticus hergestellt wird, ist für Gene, die Enzymproteine codieren, welche an der Biosynthese teilnehmen (wie zum Beispiel PKS), bekannt, dass sie eine Clusterstruktur bilden. Die genomische Analyse und ein Vergleich von den Genen, welche an der Biosynthese von Aflatoxin in jedem von diesen Mikroorganismen teilnehmen, ist durchgeführt worden [siehe Yu, J., et al., Appl. Environ. Microbiol., 61, 2365 (1995)]. Es ist berichtet worden, dass die Gene, welche an der Biosynthese von Sterigmatocystin teilnehmen, das durch Aspergillus nidulans hergestellt wird, eine Clusterstruktur in etwa 60 kb von einem kontinuierlichen Bereich auf seinem Genom bilden [beschrieben in Brown, D. W. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 1418 (1996)].
  • Die Modulation von der Polyketid-Synthaseaktivität durch sich anlagernde Proteine während der Lovastatin-Synthese ist untersucht worden [siehe Kennedy, J, et al., Science, Vol. 284, 1368 (1999)].
  • Bis zum jetzigen Zeitpunkt sind jedoch keine ausreichenden molekularbiologischen Analysen von der Biosynthese von ML-236B und der Faktoren, welche diese regulieren, durchgeführt worden. Die vorliegende Erfindung begibt sich auf den Weg, um sich mit diesem Problem zu befassen.
  • KURZDARSTELLUNG DER ERFINDUNG
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Polynucleotid bereitgestellt, welches für die Verwendung zur Beschleunigung der Biosynthese von ML-236B geeignet ist, wobei das Polynucleotid ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus:
    • (a) einem Polynucleotid, das ein Protein codiert, welches die Aminosäuresequenz von SEQ-ID Nr.: 42 aufweist;
    • (b) einem Polynucleotid, welches die Nucleotidsequenz von SEQ-ID Nr.: 41 aufweist, die geeignet ist für die Verwendung in der Beschleunigung der Biosynthese von ML-236B;
    • (c) einem Polynucleotid, welches aus der Nucleotidsequenz von SEQ-ID Nr.: 41 besteht;
    • (d) einem Polynucleotid, welches mit einem Polynucleotid gemäß (a) bis (c) unter stringenten Bedingungen hybridisiert, und das dadurch gekennzeichnet ist, dass es die Biosynthese von ML-236B in einem Mikroorganismus beschleunigt, der ML-236B produziert, wenn es in den ML-236B-produzierenden Mikroorganismus eingeführt wird; und
    • (e) einer mRNA, welche mit einem Polynucleotid von (d) unter stringenten Bedingungen hybridisieren kann.
  • Das Polynucleotid ist typischerweise ein Polynucleotid, das ein Protein codiert, welches die Aminosäuresequenz von SEQ-ID Nr.: 42 einschließt oder daraus besteht.
  • TABELLARISCHE DARSTELLUNG DER AUFLISTUNG DER SEQUENZEN
  • Eine Sequenzauflistung bildet einen Anteil von dieser Patentspezifikation. Die nachfolgende tabellarische Darstellung wird als ein Hilfsmittel für das Verständnis der aufgelisteten Sequenzen angegeben.
    SEQ-ID Nr. Identität
    1 pML48-Insert
    2 komplementär zu SEQ-ID Nr. 1
    3 PCR-Primer für Beispiel 4
    4 PCR-Primer für Beispiel 4
    5 Oligonucleotid-DNA (1) für 5'-RACE, Beispiel 8
    6 Oligonucleotid-DNA (1) für 5'-RACE, Beispiel 8
    7 Oligonucleotid-DNA (1) für 5'-RACE, Beispiel 8
    8 Oligonucleotid-DNA (1) für 5'-RACE, Beispiel 8
    9 Oligonucleotid-DNA (1) für 5'-RACE, Beispiel 8
    10 Oligonucleotid-DNA (1) für 5'-RACE, Beispiel 8
    11 Oligonucleotid-DNA (2) für 5'-RACE, Beispiel 8
    12 Oligonucleotid-DNA (2) für 5'-RACE, Beispiel 8
    13 Oligonucleotid-DNA (2) für 5'-RACE, Beispiel 8
    14 Oligonucleotid-DNA (2) für 5'-RACE, Beispiel 8
    15 Oligonucleotid-DNA (2) für 5'-RACE, Beispiel 8
    16 Oligonucleotid-DNA (2) für 5'-RACE, Beispiel 8
    17 cDNA-Fragment von 5'-Ende, Beispiel 8
    18 cDNA-Fragment von 5'-Ende, Beispiel 8
    19 cDNA-Fragment von 5'-Ende, Beispiel 8
    20 cDNA-Fragment von 5'-Ende, Beispiel 8
    21 cDNA-Fragment von 5'-Ende, Beispiel 8
    22 cDNA-Fragment von 5'-Ende, Beispiel 8
    23 Oligonucleotid-DNA (3) für 3'-RACE, Beispiel 8
    24 Oligonucleotid-DNA (3) für 3'-RACE, Beispiel 8
    25 Oligonucleotid-DNA (3) für 3'-RACE, Beispiel 8
    26 Oligonucleotid-DNA (3) für 3'-RACE, Beispiel 8
    27 Oligonucleotid-DNA (3) für 3'-RACE, Beispiel 8
    28 Oligonucleotid-DNA (3) für 3'-RACE, Beispiel 8
    29 cDNA-Fragment von 3'-Ende, Beispiel 8
    30 cDNA-Fragment von 3'-Ende, Beispiel 8
    31 cDNA-Fragment von 3'-Ende, Beispiel 8
    32 cDNA-Fragment von 3'-Ende, Beispiel 8
    33 cDNA-Fragment von 3'-Ende, Beispiel 8
    34 cDNA-Fragment von 3'-Ende, Beispiel 8
    35 RT-PCR-Primer, Beispiel 9
    36 RT-PCR-Primer, Beispiel 9
    37 mlcE; cDNA-Nucleotidsequenz und abgeleitete Aminosäuresequenz
    38 abgeleitetes mlcE-Polypeptid
    39 RT-PCR-Primer, Beispiel 12
    40 RT-PCR-Primer, Beispiel 12
    41 mlcR; cDNA-Nucleotidsequenz und abgeleitete Aminosäuresequenz
    42 abgeleitetes mlcR-Polypeptid
    43 mlcA; cDNA-Nucleotidsequenz und abgeleitete Aminosäuresequenz
    44 abgeleitetes mlcA-Polypeptid
    45 mlcB; cDNA-Nucleotidsequenz und abgeleitete Aminosäuresequenz
    46 abgeleitetes mlcB-Polypeptid
    47 mlcC; cDNA-Nucleotidsequenz und abgeleitete Aminosäuresequenz
    48 abgeleitetes mlcC-Polypeptid
    49 mlcD; cDNA-Nucleotidsequenz und abgeleitete Aminosäuresequenz
    50 abgeleitetes mlcD-Polypeptid
    51 RT-PCR-Primer, Beispiel 17
    52 RT-PCR-Primer, Beispiel 17
    53 RT-PCR-Primer, Beispiel 17
    54 RT-PCR-Primer, Beispiel 17
    55 RT-PCR-Primer, Beispiel 17
    56 RT-PCR-Primer, Beispiel 17
    57 RT-PCR-Primer, Beispiel 17
    58 RT-PCR-Primer, Beispiel 17
    59 RT-PCR-Primer, Beispiel 17
    60 RT-PCR-Primer, Beispiel 17
    61 RT-PCR-Primer, Beispiel 17
    62 RT-PCR-Primer, Beispiel 17
  • Die Polynucleotide, welche die Aminosäuresequenzen von SEQ-ID Nr.: 38, 42, 44, 46, 48, oder 50 codieren, können cDNA, genomische DNA oder mRNA sein. Die genomische DNA, welche jede von diesen sechs Sequenzen codiert, werden als die strukturellen Gene mlcE, mlcR, mlcA, mlcB, mlcC, beziehungsweise mlcD bezeichnet. Ohne an diese Zuordnungen gebunden zu sein, nehmen wir an, dass die Strukturgene Proteine mit den folgenden Funktionen codieren:
    mlcA Polyketid-Synthase
    mlcB Polyketid-Synthase
    mlcC P450-Monoxygenase
    mlcD HMG-CoA-Reduktase
    mlcE Efflux-Pumpe
    mlcR Transkriptionsfaktor
  • Wir haben herausgefunden, dass die Einfügung von mlcE oder cDNA, welche mlcE entspricht, die Biosynthese von ML-236B beschleunigen kann und die Einfügung von mlcR oder cDNA, welche mlcR entspricht, ebenfalls die Biosynthese von ML-236B beschleunigen kann. Darüber hinaus stimuliert mlcR die transkriptionelle Expression von mlcA bis zu D. mlcA, B, C und D sind an der Produktion von ML-236B beteiligt, unabhängig voneinander oder in Kombination, wie es durch Genzerstörungs-Experimente gezeigt werden konnte.
  • Varianten von mlcA, B und/oder C, die durch natürliche oder künstliche Veränderung erhältlich sind, werden nützlich sein, um Derivate von ML-236B herzustellen, einschließlich der Statine, wie zum Beispiel Pravastatin oder Lovastatin. In dieser Hinsicht könnte es möglich sein, Pravastatin direkt mittels Verwendung derartiger Varianten mit nur dem einen Fermentationsschritt herzustellen und ohne die Notwendigkeit der mikrobiellen Umwandlung von ML-236B zu Pravastatin, wie es gegenwärtig mit Streptomyces carbophilus durchgeführt wird.
  • Ein DNA-Polynucleotid, welches eine Sequenz beinhaltet, die SEQ-ID Nr.: 37 umfasst, oder eine Mutante oder Variante davon umfasst, die in der Lage ist, die Biosynthese von ML-236B zu beschleunigen, ist aus transformierten Escherichia coli pSAKexpE SANK 72499 (FERM BP-7005) erhältlich.
  • Ein bevorzugtes Nucleotid beinhaltet eine Sequenz, die ein Polynucleotid umfasst, welches aus (a) bis (e) oben ausgewählt ist, und vorzugsweise SEQ-ID Nr.: 41 umfasst, die in der Lage ist, die Biosynthese von ML-236B zu beschleunigen. Solch ein DNA-Polynucleotid ist aus transformierten Escherichia coli pSAKexpR SANK 72599 (FERM BP-7006) erhältlich.
  • Die Polynucleotide von dieser Erfindung, wie in (a) bis (e) oben beschrieben, können in operativer Kombination mit einem oder mehreren Polynucleotiden eingesetzt werden, wobei diese Kombinationen geeignet sind für die Verwendung in der Verstärkung der Herstellung von ML-236B in einem Mikroorganismus, der ML-236B herstellt.
  • Beispiele für derartige Kombinationen schließen ein Polynucleotid ein, das aus (a) bis (e) oben ausgewählt ist, vorzugsweise das Polynucleotid mit der SEQ-ID Nr.: 41, in Kombination mit einer oder mehreren Sequenzen ausgewählt aus SEQ-ID Nr.: 37, 41 selbst, 43, 45, 47 oder 49.
  • In einem Aspekt ist das Polynucleotid vorzugsweise ein Polynucleotid, welches ein Protein codiert, das die Aminosäuresequenz von den SEQ-ID Nr.: 38, 42, 44, 46, 48, oder 50 beinhaltet oder daraus besteht und in der Lage ist, die Biosynthese von ML-236B in Verbindung mit einem Polynucleotid, das aus (a) bis (e) oben ausgewählt wurde, vorzugsweise SEQ-ID Nr.: 41, zu beschleunigen.
  • Die vorliegende Erfindung erstreckt sich auf Polynucleotide, welche in der Lage sind, unter stringenten Bedingungen mit einem Polynucleotid von dieser Erfindung zu hybridisieren. Solche Polynucleotide erstrecken sich auf Polynucleotide, welche geeignet sind für die Beschleunigung der Biosynthese von ML-236B in einem ML-236B-produzierenden Mikroorganismus, wenn sie in den Mikroorganismus, der ML-236B produziert, eingeführt werden.
  • Typischerweise ist das Polynucleotid eine DNA, eine cDNA oder genomische DNA, oder RNA und kann sense oder antisense vorliegen. Das Polynucleotid ist typischerweise ein gereinigtes Polynucleotid, wie zum Beispiel ein Polynucleotid, das frei von anderen zellulären Komponenten ist.
  • Die Polynucleotid-Varianten codieren die Aminosäuresequenzen von den angegebenen SEQ-ID Nr.: 38, 42, 44, 46, 48 oder 50, in welchen ein oder mehrere Nucleotid(e) ausgetauscht worden sind. Die Austausche können natürlich auftreten und können innerhalb der Redundanz oder der Degeneration von den Triplets des genetischen Codes hergestellt werden. Derartig degeneriert veränderten Polynucleotide codieren folglich dieselbe Aminosäuresequenz. Innerhalb dieser Polynucleotid-Varianten schließen wir genomische DNA ein, die Exons und Introns aufweisen, anstelle von lediglich der cDNA-Sequenz.
  • Die Polynucleotid-Varianten codieren die Aminosäuresequenzen von den angegebenen SEQ-ID Nr.: 38, 42, 44, 46, 48 oder 50, welche eine modifizierte Aminosäuresequenz codieren, die mindestens eine Deletion, Addition, Substitution oder Veränderung aufweist. Die Polynucleotid-Varianten von den angegebenen Sequenzen codieren Aminosäuresequenzen, welche kürzer, länger oder von derselben Länge sind, als diejenigen, die durch die angegebenen Sequenzen codiert sind. Vorzugsweise behalten die Varianten der Polypeptide eine Befähigung zur Beschleunigung der Synthese von ML-236B bei und weisen vorzugsweise eine Aktivität auf, welche im Wesentlichen ähnlich oder besser als die der Ursprungs-Sequenz ist, welche zu der variierten Sequenz führte.
  • Die Polynucleotid-Varianten behalten einen Grad der Identität mit der Ursprungs-Sequenz bei. Geeigneterweise beträgt der Grad der Identität mindestens 60%, mindestens 80%, mindestens 90% oder mindestens 95% oder 100%. Der Grad der Identität von einer Variante wird vorzugsweise durch Computersoftware festgestellt, wie zum Beispiel dem BLAST-Programm, welches einen Algorithmus zur Durchführung von Homologie-Überprüfungen verwendet.
  • In einem Aspekt ist das bevorzugte Polynucleotid dieser Erfindung DNA, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:
    • (a) einer DNA, welche eine oder mehrere der Nucleotidsequenzen umfasst, die in Nucleotid Nr. 1 bis 1380 von SEQ-ID Nr.: 41 von der Auflistung der Sequenzen dargestellt sind, und die dadurch gekennzeichnet ist, dass sie die Biosynthese von ML-236B in einem ML-236B-produzierenden Mikroorganismus beschleunigt, wenn sie in diesen ML-236B-produzierenden Mikroorganismus eingeführt worden ist.
    • (b) einer DNA, welche mit der DNA, die in (a) beschrieben wurde, unter stringenten Bedingungen hybridisiert, und die dadurch gekennzeichnet ist, dass sie die Biosynthese von ML-236B in einem Mikroorganismus beschleunigt, der ML-236B produziert, wenn sie in den ML-236B-produzierenden Mikroorganismus eingeführt wird.
  • Die Polynucleotide von dieser Erfindung beschleunigen die Biosynthese von ML-236B in einem Mikroorganismus, welcher ML-236B produziert. Beispiele von ML-236B-produzierenden Mikroorganismen beinhalten Penicillium-Spezies wie Penicillium citrinum, Penicillium brevicompactum [beschrieben in Brown, A. G., et al., J. Chem. Soc. Perkin-1., 1165 (1976)], Penicillium cyclopium [beschrieben in Doss, S. L., et al., J. Natl. Prod., 49, 357 (1986)] oder dergleichen. Andere Beispiele schließen ein: Eupenicillium sp.M6603 [beschrieben in Endo, A., et al., J. Antibiot. – Tokyo, 39, 1609 (1986)], Paecilomyces viridis FERM P-6236 [beschrieben in Japanische Patentanmeldung Publikations-Nr. 58-98092 ], Paecilomyces sp. M2016 [beschrieben in Endo, A., et al., J. Antibiot. – Tokyo, 39, 1609 (1986)], Trichoderma longibrachiatum M6735 [beschrieben in Endo, A., et al., J. Antibiot. – Tokyo, 39, 1609 (1986)], Hypomyces chrysospermus IFO 7798 [beschrieben in Endo, A., et al., J. Antibiot. – Tokyo, 39, 1609 (1986)], Gliocladium sp. YJ-9515 [beschrieben in WO 9806867 ], Trichoderma viride IFO 5836 [beschrieben in Japanische Patentschrift Nr. 62-19159 ], Eupenicillium reticulisporum IFO 9022 [beschrieben in Japanische Patentschrift Nr. 62-19159 ] oder jegliche andere geeignete Organismen.
  • Unter diesen ML-236B-produzierenden Mikroorganismen ist Penicillium citrinum bevorzugt und der Penicillium citrinum-Stamm SANK 13380 ist insbesondere bevorzugt. Der Penicillium citrinum-Stamm SANK 13380 wurde in dem Research Institute of Life Science and Technology of the Agency of Industrial Science and Technology am 22. Dezember 1992 unter der Depotnummer FERM BP-4129 in Übereinstimmung mit dem Budapester Vertrag über die Hinterlegung von Mikroorganismen hinterlegt. Beispiele für ML-236B-produzierende Mikroorganismen beinhalten ebenfalls diejenigen, die aus natürlichen Vorkommen isoliert wurden und solche, die natürlich oder künstlich mutiert wurden.
  • Die Erfindung stellt ferner Vektoren bereit, die ein Polynucleotid von dieser Erfindung umfassen, wie zum Beispiel den Vektor, der aus Escherichia coli pSAKexpR SANK 72599 (FERM BP-7006) erhältlich ist. Wie hierin beschrieben, kann ein Vektor gemäß der Erfindung weiterhin ein Polynucleotid umfassen, welches die Nucleotidsequenz von SEQ-ID Nr.: 37 aufweist, oder ein Vektor gemäß der Erfindung kann ferner ein oder mehrere Polynucleotid(e) umfassen, welche aus den SEQ-ID Nummern 43, 45, 47 oder 49 ausgewählt wurden. Die Erfindung schließt Vektoren ein, die nicht die Polynucleotid-Sequenzen von den SEQ-ID Nummern 37, 43, 45, 47 oder 49 umfassen, oder die nicht die Polynucleotid-Sequenzen mit den SEQ-ID Nummern 43, 45, 47 oder 49 umfassen. Derartige Vektoren von dieser Erfindung schließen Expressionsvektoren ein.
  • Es werden ebenfalls Wirtszellen, welche durch einen Vektor von dieser Erfindung transformiert sind, bereitgestellt, einschließlich ML-236B-produzierender Mikroorganismen. Die Wirtszellen von dieser Erfindung beinhalten Penicillium citrinum und Escherichia coli, wie zum Beispiel Escherichia coli pSAKexpR SANK 72599 (FERM BP-7006).
  • Darüber hinaus erstreckt sich die Erfindung auf Polypeptide, welche durch ein Polynucleotid von dieser Erfindung codiert werden. Beispiele für Polypeptide von dieser Erfindung schließen die SEQ-ID Nr.: 42 ein, oder eine Variante daraus, welche mindestens 80% Identität zu SEQ-ID Nr.: 42 aufweist und welche in der Lage ist, die ML-236B-Produktion in einem ML-236B-produzierenden Organismus zu beschleunigen. Andere Polypeptide sind diejenigen, welche durch die anderen Polynucleotid-Sequenzen von dieser Erfindung codiert werden, und Varianten davon, welche einen Grad der Identität beibehalten.
  • Geeigneterweise beträgt der Grad der Identität von den Polypeptid-Varianten zu SEQ-ID Nr.: 42 mindestens 80%, mindestens 90% oder mindestens 95% oder 100%. Der Grad der Identität von einer Variante wird vorzugsweise durch Computersoftware festgestellt, wie zum Beispiel dem BLAST-Programm, welches einen Algorithmus zur Durchführung von Homologie-Überprüfungen verwendet.
  • Die Polypeptide von dieser Erfindung schließen kürzere oder längere Sequenzen von SEQ-ID Nr.: 42 oder Varianten daraus ein. Die kürzeren Polypeptide umfassen partielle Aminosäuresequenzen von SEQ-ID Nr.: 42 oder Varianten daraus und behalten vorzugsweise die Befähigung bei, die Biosynthese von ML-236B zu beschleunigen. Die längeren Polypeptide umfassen ganze oder partielle Aminosäuresequenzen von SEQ-ID Nr.: 42 oder Varianten daraus und behalten vorzugsweise die Befähigung bei, die Biosynthese von ML-236B zu beschleunigen. Die längeren Polypeptide schließen Fusionsproteine wie zum Beispiel Fc-fusionierte Proteine ein.
  • Ein Antikörper für die Polypeptide von dieser Erfindung wie ein polyklonaler Antiköper oder ein monoklonaler Antikörper ist nützlich zur Regulation der ML-236B-Produktion und zur Herstellung von ML-236B-Derivaten, wie zum Beispiel Statine, einschließlich Pravastatin und Lovastatin. Darüber hinaus kann der Antikörper vorzugsweise für die Analyse von der ML-236B Biosynthese und der regulatorischen Mechanismen davon verwendet werden. Eine derartige Analyse ist nützlich für die Modulierung der Produktion von ML-236B und der Herstellung von ML-236B-Derivaten.
  • Die Wirtszellen von dieser Erfindung, die einen Vektor von dieser Erfindung aufweisen, können in einem Verfahren zur Produktion von ML-236B verwendet werden, welches das Kultivieren von einer derartigen Wirtszelle und danach das Zurückgewinnen von ML-236B aus der Kultur umfasst. In einem Verfahren umfasst der Vektor mlcR und sonst keine weiteren Gene wie zum Beispiel mlcA (SEQ-ID Nr.: 43), mlcB (SEQ-ID Nr.: 45), mlcC (SEQ-ID Nr.: 47) oder mlcD (SEQ-ID Nr.: 49). In einem derartigen Verfahren zur Herstellung von ML-236B kann die Wirtszelle mit einem Vektor, welcher die Nucleotidsequenz von SEQ-ID Nr.: 41 (mlcR) umfasst, transformiert sein. Ein Vektor, welcher mlcR (SEQ-ID Nr.: 41) umfasst, kann eventuell nicht die Polynucleotid-Sequenz von SEQ-ID Nr.: 37 umfassen und/oder der Vektor kann möglicherweise nicht mindestens ein Polynucleotid umfassen, das die Aminosäuresequenzen von den SEQ-ID Nummern 44, 46, 48 und/oder 50 codiert. Die Verfahren für die Produktion von ML-236B können in der Abwesenheit von einer oder mehr als einer cDNA, welche den SEQ-ID Nummern 37, 43, 45, 47 und/oder 49 entspricht, stattfinden. Folglich kann die Produktion mittels einem Verfahren von dieser Erfindung in der Abwesenheit von rekombinanten mlcA, mlcB, mlcC und/oder mlcD (Polypeptiden) stattfinden, welche der SEQ.ID Nr.: 44, SEQ-ID Nr.: 46, SEQ-ID Nr.: 48 oder SEQ-ID Nr.: 50 entsprechen.
  • Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung von Pravastatin, welches ein Verfahren zur Produktion von ML-236B gemäß der Erfindung umfasst und die Umwandlung von ML-236B in Pravastatin.
  • BESCHREIBUNG VON SPEZIFISCHEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
  • Die vorliegende Erfindung wird nachfolgend hierin detaillierter beschrieben.
  • Die Erfinder von der vorliegenen Erfindung haben genomische DNA kloniert, welche Gene umfasst, die an der Biosynthese von ML-236B in Penicillium citrinum teilnehmen. Die genomische DNA wird nachfolgend hierin als mit der ML-236B-Biosynthese zusammenhängende genomische DNA bezeichnet und wurde aus einer genomischen DNA-Bibliothek von einem ML-236B-produzierenden Mikroorganismus kloniert. Die genomische DNA wurde analysiert, um strukturelle Gene auf dieser genomischen DNA zu finden, danach wurden die cDNAs, welche den Strukturgenen entsprachen, durch Reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (nachfolgend hierin als „RT-PCR" bezeichnet) unter Verwendung der Gesamt-RNA, welche mRNA aus Penicillium citrinum als eine Matrize enthält, erhalten. Es hatte sich herausgestellt, dass die Biosynthese von ML-236B in einem ML-236B-produzierenden Mikroorganismus beschleunigt wurde, wenn der ML-236B-produzierende Mikroorganismus durch einen neu kombinierten DNA-Vektor, der die cDNAs enthält, transformiert wurde.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere cDNAs (nachfolgend hierin als ML-236B-Biosynthese beschleunigende cDNA bezeichnet), welche die Biosynthese von ML-236B in einem ML-236B-produzierenden Mikroorganismus beschleunigt, wenn sie in den ML-236B-produzierenden Mikroorganismus eingeführt wird.
  • Ein die ML-236B-Biosynthese beschleunigendes Polynucleotid von der vorliegenden Erfindung, wie die die ML236B-Biosynthese beschleunigende cDNA, beinhaltet als Beispiel:
    • (I) DNA, die mittels Synthese unter Verwendung, als eine Matrize, eines transkribierten Produktes (Boten-RNA, nachfolgend hierin als mRNA bezeichnet) von einem Strukturgen erhalten wird, welches an der Biosynthese von ML-236B teilnimmt und in der genomischen DNA von einem ML-236B-produzierenden Mikroorganismus vorhanden ist.
    • (II) doppelsträngige DNA, welche sich gebildet hat als ein Ergebnis von der Assoziation von einer DNA (I) und dem zweiten Strang der DNA, der unter Verwendung von DNA (I) als erstem Strang synthetisiert wurde;
    • (III) doppelsträngige DNA, welche sich durch Replikation oder Amplifikation der doppelsträngigen DNA (II) gebildet hat, zum Beispiel durch ein Verfahren des Klonierens oder dergleichen;
    • (IV) DNA, welche mit einer der oben erwähnten DNA's oder mit mRNA unter stringenten Bedingungen hybridisieren kann.
  • Die DNA (IV) kann aus den Nucleotidnummern 1 bis 1380 von SEQ-ID Nr.: 41 bestehen, wobei ein oder mehr Nucleotide optional substituiert, entfernt und/oder hinzugefügt sind und die die Biosynthese von ML-236B in einem ML-236B-produzierenden Mikroorganismus beschleunigen können, wenn sie in den ML-236B-produzierenden Mikroorganismus eingeführt werden.
  • Wenn zwei einzelsträngige Nucleinsäuren hybridisieren, bilden sie ein doppelsträngiges Molekül in einem Bereich, in welchem sie komplementär oder hoch komplementär zueinander sind und „stringente Bedingungen" beziehen sich geeigneterweise auf den Fall, in welchem die Hybridisierungslösung 6 × SSC [1 × SSC weist eine Zusammensetzung aus 150 mM NaCl, 15 mM Natriumcitrat auf] ist und die Temperatur für die Hybridisierung 55°C beträgt.
  • Die ML-236B-Biosynthese beschleunigende cDNA kann, zum Beispiel, durch Isolierung von einem Klon erhalten werden, der die cDNA aus einer cDNA-Bibliothek von einem ML-236B-produzierenden Mikroorganismus enthält. Als eine Alternative kann RT-PCR dazu verwendet werden, ein Primerpaar, das auf der Basis von der Nucleotidsequenz von einer mit der ML-236B-Biosynthese in Zusammenhang stehenden genomischen DNA entwickelt wurde, zusammen mit mRNA oder Gesamt-RNA von einem ML-236B-produzierenden Mikroorganismus einzusetzen.
  • Ein ML-236B-produzierender Mikroorganismus ist ein Mikroorganismus, welcher schon an sich eine Befähigung zur Produktion von ML-236B aufweist. Wie vorher schon angegeben, beinhalten Beispiele von ML-236B-produzierenden Mikroorganismen Penicillium-Spezies, wie zum Beispiel Penicillium citrinum, Penicillium brevicompactum, Penicillium cyclopium oder dergleichen und andere Beispiele schließen ein: Eupenicillium sp. M6603, Paecilomyces viridis FERM P-6236, Paecilomyces sp. M2016, Trichoderma longibrachiatum M6735, Hypomyces chrysospermus IFO 7798, Gliocladium sp. YJ-9515, Trichoderma viride IFO 5836, Eupenicillium reticulisporum IFO 9022 und jeglichen anderen entsprechenden Organismen.
  • Unter diesen ML-236B-produzierenden Mikroorganismen ist Penicillium citrinum bevorzugt und der Penicillium citrinum-Stamm SANK 13380 ist insbesondere bevorzugt. Der Penicillium citrinum-Stamm SANK 13380 wurde in dem Research Institute of Life Science and Technology of the Agency of Industrial Science and Technology am 22. Dezember 1992 unter der Depotnummer FERM BP-4129 in Übereinstimmung mit dem Budapester Vertrag über die Hinterlegung von Mikroorganismen hinterlegt. Beispiele für ML-236B-produzierende Mikroorganismen beinhalten ebenfalls diejenigen, die sowohl aus natürlichen Vorkommen isoliert wurden als auch solche, die natürlich oder künstlich mutiert wurden.
  • Die mit der ML-236B-Biosynthese in Zusammenhang stehende genomische DNA kann durch Überprüfen einer genomischen DNA-Bibliothek von einem ML-236B-produzierenden Mikroorganismus mit einer geeigneten Sonde erhalten werden. Geeigneterweise ist die Sonde auf der Basis von einer DNA-Sequenz entwickelt worden, für die prognostiziert wurde, dass sie eine Rolle in der ML-236B-Biosynthese aufweist, die entsprechend aus einem Fadenpilz abstammt.
  • Die Auswahl an Verfahren zum Herstellen von einer genomischen DNA-Bibliothek sind nicht eingeschränkt, und jegliches geeignete Verfahren kann verwendet werden, vorzugsweise stellt es ein allgemeines Verfahren zum Aufbauen von einer genomischen DNA-Bibliothek aus einem eukaryotischen Organismus dar. Beispiele davon schließen die Methode von Maniatis et al. ein Maniatis, T., et al., Molecular cloning, a laboratory manual, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989)]. Andere geeignete Verfahren sind auf dem Fachgebiet bekannt.
  • In Kurzdarstellung, die genomische DNA aus einem ML-236B-produzierenden Mikroorganismus kann durch Zurückgewinnen der Zellen von einer Kultur der M ML-236B-produzierenden Mikroorganismen, dem physikalischen Aufbrechen der Zellen, dem Extrahieren der DNA, welche in den Kernen davon vorhandenen ist, und der Reinigung der DNA erhalten werden.
  • Das Kultivieren von einem ML-236B-produzierenden Mikroorganismus kann unter Bedingungen durchgeführt werden, die für die jeweiligen ML-236B-produzierenden Mikroorganismen geeignet sind. Zum Beispiel kann die Kultivierung von Penicillium citrinum, einem bevorzugten ML-236B-produzierenden Mikroorganismus, durch Inokulieren der Zellen in MBG3-8 Medium [Zusammensetzung: 7% (w/v; Gewicht pro Volumen) Glycerin, 3% (w/v) Glucose, 1% (w/v) Sojabohnenpulver, 1% (w/v) Peptone (hergestellt durch Kyokuto Seiyaku Kogyo Corporation), 1% (w/v) Extrakt aus Mais-Keimlingen (hergestellt durch Honen Corporation), 0,5% (w/v) Natriumnitrat, 0,1% (w/v) Magnesiumsulfat Hepta hydrat (pH 6,5)] und Inkubation bei 22 bis 28°C unter Schütteln für 3 bis 7 Tage durchgeführt werden. Eine Schrägkultur zum Lagern von dem Bakterium kann durch Gießen von geschmolzenem PGA-Agarmedium [Zusammensetzung: 200 g/L Kartoffelextrakt, 15% (w/v) Glycerin, 2% (w/v) Agar] in ein Teströhrchen und dem Ermöglichen, dass der Agar sich in einem Winkel verfestigt, hergestellt werden. Penicillium citrinum kann danach unter Verwendung einer Platinnadel auf die Schrägkultur inokuliert werden, gefolgt von einer Inkubation bei 22 bis 28°C für 7 bis 15 Tage. Die Mikroorganismen oder die Bakterien, welche auf diese Art und Weise herangezogen wurden, können fortlaufend auf der Schrägkultur durch Lagern der Schrägkultur bei 0 bis 4°C gehalten werden.
  • Die Zellen von einem ML-236B-produzierenden Mikroorganismus, der in einem flüssigen Medium kultiviert wurde, können durch Zentrifugation gewonnen werden und diejenigen, die auf einem festen Medium kultiviert wurden, können durch Abschaben von dem festen Medium mit einem Zellschaber oder dergleichen gewonnen werden.
  • Das physikalische Aufbrechen von den Zellen kann mittels Zermahlen der Zellen unter Verwendung von einem Pistill und einem Mörser durchgeführt werden, nachdem sie mit flüssigem Stickstoff oder dergleichen eingefroren wurden. Die DNA in den Kernen von den aufgebrochenen Zellen kann unter Verwendung eines Netzmittels wie Natrium-Dodecylsulfat (nachfolgend hierin als SDS bezeichnet) oder von einem anderen geeigneten Netzmittel extrahiert werden. Die extrahierte genomische DNA wird geeigneterweise mit Phenol-Chloroform behandelt, um die Proteine zu entfernen, und als ein Präzipitat mittels der Durchführung einer Ethanolfällung gewonnen.
  • Die resultierende genomische DNA wird durch Verdau mit einem geeigneten Restriktionsenzym fragmentiert. Es gibt keine Einschränkung bei den Restriktionsenzymen, die für den Restriktionsverdau verwendet werden können, wobei die allgemein erhältlichen Restriktionsenzyme bevorzugt werden. Beispiele daraus beinhalten Sau3AI. Andere geeignete Enzyme sind auf dem Fachgebiet bekannt. Die verdaute DNA wird dann einer Gelelektrophorese unterworfen und die genomische DNA, welche eine geeignete Größe aufweist, aus dem Gel gewonnen. Die Größe von dem DNA-Fragment ist nicht sonderlich eingeschränkt, aber sie beträgt vorzugsweise 20 kb oder mehr.
  • Gleichermaßen gibt es keine Einschränkung bei der Auswahl von dem DNA-Vektor, welcher in der Konstruktion von der genomischen DNA-Bibliothek verwendet wird, solange der Vektor eine DNA-Sequenz aufweist, die für die Replikation in der Wirtszelle notwendig ist, welche durch den Vektor transformiert werden soll. Beispiele von geeigneten Vektoren schließen einen Plasmid-Vektor, einen Phagen-Vektor, einen Cosmid-Vektor und einen BAC-Vektor oder dergleichen ein, wobei ein Cosmid-Vektor bevorzugt wird. Der DNA-Vektor ist vorzugsweise ein Expressionsvektor. Mehr bevorzugt umfasst der DNA-Vektor eine DNA- oder Nucleotidsequenz, welche der Wirtszelle, die durch den Vektor transformiert ist, einen selektiven Phänotyp verleiht.
  • Der DNA-Vektor ist geeigneterweise ein Vektor, der sowohl bei der Klonierung als auch bei der Expression verwendet werden kann. Vorzugsweise ist der Vektor ein sogenannter Shuttle-Vektor, welcher für die Transformation von mehr als einem Wirt für die Mikroorganismen verwendet werden kann. Der Shuttle-Vektor weist geeigneterweise eine DNA-Sequenz auf, welche die Replikation in einer Wirtszelle ermöglicht, und vorzugsweise eine Sequenz oder Sequenzen, welche die Replikation in einer Anzahl von unterschiedlichen Wirtszellen aus unterschiedlichen Gruppen von Mikroorganismen wie zum Beispiel Bakterien und Pilzen ermöglichen. Darüber hinaus umfasst der Shuttle-Vektor vorzugsweise eine DNA-Sequenz, welche einen auswählbaren Phänotyp für eine Reihe von unterschiedlichen Wirtszellen bereitstellen kann, wie zum Beispiel Zellen aus unterschiedlichen Gruppen von Mikroorganismen.
  • Die Auswahl von der Kombination der Gruppen von Mikroorganismen und Wirtszellen, welche durch den Shuttle-Vektor transformiert werden, ist nicht sonderlich eingeschränkt, vorausgesetzt dass eine der Gruppen von den Mikroorganismen für die Klonierung verwendet werden kann und die andere die Fähigkeit zur Produktion von ML-236B aufweist. Eine derartige Kombination kann, zum Beispiel, eine Kombination aus einem Bakterium und einem Fadenpilz oder eine Kombination aus einer Hefe und einem Fadenpilz sein, wobei die Kombination aus einem Bakterium und einem Fadenpilz bevorzugt wird. Die Wahl des Bakteriums ist nicht sonderlich eingeschränkt, solange es allgemein in der Biotechnologie verwendet werden kann, wie zum Beispiel Escherichia coli, Bacillus subtilis oder dergleichen. Hierbei ist Escherichia coli bevorzugt und Escherichia coli XL1-Blue MR ist besonders bevorzugt. Auf ähnliche Weise ist die Wahl der Hefeart nicht eingeschränkt, solange sie allgemein in der Biotechnologie verwendet werden kann, wie zum Beispiel Saccharomyces cerevisiae oder dergleichen. Beispiele für Fadenpilze schließen ML-236B-produzierende Mikroorganismen ein, die oben beschrieben wurden. Andere geeignete Beispiele für Mikroorganismen sind auf dem Fachgebiet bekannt.
  • In der vorliegenden Erfindung kann die Gruppe der Mikroorganismen ausgewählt werden aus Bakterien, Fadenpilzen und Hefen.
  • Beispiele für den oben erwähnten Shuttle-Vektor beinhalten einen Cosmid-Vektor, welcher ein geeignetes Markergen zum Auswählen von einem Phänotyp und eine cos-Stelle aufweist. Andere geeignete Vektoren sind auf dem Fachgebiet bekannt. Der bevorzugte Vektor ist pSAKcos1, welcher konstruiert wurde durch Einsetzen von einer cos-Stelle aus dem Cosmid-Vektor pWE15 (hergestellt durch STRATAGENE) in das Plasmid pSAK333, das die Sequenz von dem Gen für die Hygromycin-B Phosphotransferase aus Escherichia coli umfasst [beschrieben in der Japanischen Patentanmeldung Publikations-Nr. 3-262486 ]. Ein Verfahren zur Konstruktion von pSAKcos1 ist in 1 dargestellt. Die vorliegende Erfindung ist nicht auf diesen Vektor beschränkt.
  • Eine genomische DNA-Bibliothek kann durch Einführen von einem Shuttle-Vektor in eine Wirtszelle hergestellt werden, wobei der Vektor ein genomisches DNA-Fragment von einem ML-236B-produzierenden Mikroorganismus enthält. Die Wirtszelle, die verwendet werden kann, ist vorzugsweise Escherichia coli, insbesondere Escherichia coli XL1-Blue MR. Wenn die Wirtszelle Escherichia coli ist, kann die Einführung mittels der in vitro Verpackung durchgeführt werden. In der vorliegenden Erfindung deckt die Transformation ebenfalls die Einführung von Fremd-DNA durch in vitro-Verpackung ab und eine transformierte Zelle umfasst ebenfalls eine Zelle, in welche Fremd-DNA durch in vitro-Verpackung eingeführt wurde.
  • Eine genomische Bibliothek kann zum Identifizieren von einem gewünschten Klon unter Verwendung von einem Antikörper oder einer Nucleinsäure-Sonde überprüft werden, wobei die Nucleinsäure-Sonde bevorzugt wird. Vorzugsweise wird die Nucleinsäure-Sonde auf der Basis von der Nucleotidsequenz von einem Gen oder einer DNA hergestellt, welche mit der Polyketid-Biosynthese in Zusammenhang steht, vorzugsweise ist es eine Sequenz, die von einem Fadenpilz erhalten wurde. Die Wahl von einem bestimmten Gen ist nicht eingeschränkt, solange es mit der Biosynthese von Polyketiden verbunden und die Nucleotidsequenz davon bekannt ist. Beispiele für derartige Gene schließen das Aflatoxin PKS-Gen aus Aspergillus flavus und Aspergillus parasiticus und das Sterigmatocystin PKS-Gen aus Aspergillus nidulans oder dergleichen ein.
  • Geeignete Nucleinsäure-Sonden können, zum Beispiel, durch Synthetisieren von einer Oligonucleotid-Sonde erhalten werden, welche Teile von einer bekannten genomischen DNA-Sequenz wie oben beschrieben umfasst, oder durch Herstellung von Oligonucleotid-Primern und Amplifizieren von der Ziel-DNA unter Verwendung der Polymerase-Kettenreaktion [nachfolgend hierin bezeichnet als „PCR"; beschrieben in Saiki, R. K., et al., Science, 239, 487 (1988)] und genomischer DNA als eine Matrize, oder durch RT-PCR unter Verwendung von mRNA als eine Matrize. Andere geeignete Verfahren für das Erhalten von derartigen Sonden sind auf dem Fachgebiet gut bekannt.
  • Eine Nucleinsäure-Sonde kann von einem ML-236B-produzierenden Mikroorganismus unter Verwendung von, zum Beispiel, PCR oder RT-PCR erhalten werden. Die Entwicklung von Primern, die für die PCR oder RT-PCR (nachfolgend hierin als „Primer für PCR" bezeichnet) verwendet werden, wird vorzugsweise basierend auf der Nucleotidsequenz von einem Gen ausgeführt, das mit der Polyketid-Biosynthese in Zusammenhang steht, für welches die Nucleotidsequenz bekannt ist. Vorzugsweise ist das Gen das Aflatoxin PKS-Gen aus Aspergillus flavus und Aspergillus parasiticus oder das Sterigmatocystin PKS-Gen aus Aspergillus nidulans.
  • Die Primer für die PCR werden geeigneterweise so ausgebildet, dass sie Nucleotidsequenzen umfassen, welche Aminosäuresequenzen codieren, die innerhalb der PKS-Gene äußerst konserviert sind. Die Verfahren zur Identifizierung von Nucleotidsequenzen, die einer bestimmten Aminosäuresequenz entsprechen, beinhalten die Ableitung auf der Basis von dem Codongebrauch von der Wirtszelle und die Verfahren zur Herstellung von gemischten Oligonucleotid-Sequenzen unter der Verwendung multipler Codons (nachfolgend hierin als „degenerierte Oligonucleotide" bezeichnet). In dem letzteren Fall kann die Multiplizität von den Oligonucleotiden mittels Einführung von Hypoxanthin in ihre Nucleotidsequenzen vermindert werden.
  • Ein Primer für die PCR kann eine Nucleotidsequenz umfassen, die konstruiert ist, sich an einer Matrizenkette anzulagern, wobei der Primer mit einer zusätzlichen 5'-Sequenz verbunden worden ist. Die Auswahl von einer derartigen zusätzlichen 5'-Nucleotidsequenz ist nicht sonderlich eingeschränkt, solange der Primer für die PCR oder die RT-PCR verwendet werden kann. Eine derartige zusätzliche 5'-Sequenz kann, zum Beispiel, eine Nucleotidsequenz sein, welche für das Klonierungsverfahren von einem PCR-Produkt zweckdienlich ist. Eine derartige Nucleotidsequenz kann, zum Beispiel, eine Schnittstelle für ein Restriktionsenzym oder eine Nucleotidsequenz sein, welche eine Schnittstelle für ein Restriktionsenzym enthält.
  • Darüber hinaus ist es in der Entwicklung von dem Primer für die PCR bevorzugt, dass die Summe von der Anzahl von den Guanin-(G) und der Anzahl von den Cytosin-(C)Basen 40 bis 60% von der Gesamtzahl der Basen ausmacht. Darüber hinaus existiert vorzugsweise wenig oder kein Selbstannealing für einen vorgegebenen Primer und in dem Fall von einem Primerpaar wenig oder kein Annealing zwischen den Primern.
  • Die Anzahl der Nucleotide, welche den Primer für die PCR ausmachen, ist nicht sonderlich eingeschränkt, solange er für die PCR verwendet werden kann. Der untere Grenzwert von der Anzahl liegt im Allgemeinen bei 10 bis 14 Nucleotiden, wobei der obere Grenzwert bei 40 bis 60 Nucleotiden liegt. Vorzugsweise weisen die Primer eine Länge von 14 bis 40 Oligonucleotiden auf.
  • Der Primer für die PCR ist vorzugsweise DNA. Die Nucleoside in dem Primer können Deoxyadenosin, Deoxycytidin, Deoxythymidin und Deoxyguanosin und zusätzlich Deoxyinosin sein. Die 5'-Position von dem Nucleosid an dem 5'-Ende von dem Primer für die PCR ist geeigneterweise eine Hydroxylgruppe oder eine Hydroxygruppe, an welche eine Phosphorsäure über eine Esterbindung angebunden ist.
  • Die Synthese von einem Primer für die PCR kann mittels Verfahren durchgeführt werden, welche im Allgemeinen für die Synthese von Nucleinsäuren verwendet werden, zum Beispiel dem Phosphoamidit-Verfahren. Ein automatisierter DNA-Synthesizer kann vorzugsweise in einem derartigen Verfahren verwendet werden.
  • Die genomische DNA und die mRNA aus einem ML-236B-produzierenden Mikroorganismus kann als eine Matrize für die PCR oder beziehungsweise die RT-PCR verwendet werden. Die Gesamt-RNA kann ebenfalls als eine Matrize für die RT-PCR anstelle von der mRNA verwendet werden.
  • Das PCR-Produkt oder das RT-PCR-Produkt können durch Einfügung in einen zweckmäßigen DNA-Vektor kloniert werden. Die Auswahl von dem DNA-Vektor, der für den Klonierungsschritt verwendet wird, ist im Allgemeinen nicht eingeschränkt. Kits für die mühelose Klonierung von PCR- und RT-PCR-Produkten sind handelsüblich erhältlich. Beispielhalber, das Original TA-Clonings-Kit (hergestellt durch Invitrogen: unter Verwendung von pCR2.1 als DNA-Vektor) ist für eine derartige Klonierung geeignet.
  • Um ein kloniertes PCR-Produkt zu erhalten, werden transformierte Wirtszellen, welche Plasmide enthalten, die das gewünschte PCR-Produkt umfassen, kultiviert und dann die Plasmide aus den Zellen extrahiert und gereinigt. Das eingefügte DNA-Fragment wird danach aus dem resultierenden Plasmid gewonnen.
  • Das Kultivieren von den transformierten Wirtszellen wird geeigneterweise unter Bedingungen durchgeführt, welche für die Wirtszellen zweckmäßig sind. Eine bevorzugte Wirtszelle, Escherichia coli, kann in LB-Medium [1% (w/v) Trypton, 0,5% (w/v) Hefeextrakt, 0,5% (w/v) Natriumchlorid] bei 30 bis 37°C für 18 Stunden bis zwei Tage unter Schütteln kultiviert werden.
  • Die Präparation von Plasmiden aus einer Kultur von den transformierten Wirtszellen kann mittels des Zurückgewinnens der Wirtszellen und der Isolierung der Plasmide, frei von anderen Zellkomponenten wie genomischer DNA oder Wirtsproteinen, durchgeführt werden. Die Präparation von Plasmid-DNA aus einer Kultur von Escherichia coli kann gemäß zu der alkalischen Methode von Maniatis [beschrieben in Maniatis, T., et al., Molecular cloning, a laboratory manual, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laborstory, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989)] durchgeführt werden. Kits für das Gewinnen von einem Plasmid, die eine höhere Reinheit aufweisen, sind handelsüblich erhältlich. Das Plasmid Mini Kit [hergestellt durch QIAGEN AG] wird bevorzugt. Des Weiteren ist ein Kit für die Massenproduktion von einem Plasmid handelsüblich erhältlich. Das Plasmid Maxi Kit [hergestellt durch QIAGEN AG] wird bevorzugt.
  • Die Konzentration von der resultierenden Plasmid-DNA kann durch Messen der Absorption bei einer Wellenlänge von 260 nm nach einer zweckentsprechenden Verdünnung der DNA-Probe und dem Berechnen auf der Basis, dass eine Lösung mit einer Absorption bei OD260 von 1 50 μg/ml DNA enthält (beschrieben in Maniatis, T., et al., supra), bestimmt werden.
  • Die Reinheit der DNA kann aus dem Verhältnis der Absorption bei einer Wellenlänge von 280 und 260 nm kalkuliert werden (beschrieben in Maniatis, T., et al., supra).
  • Die Verfahren zur Markierung von Nucleinsäure-Sonden können im Allgemeinen als Radiomarkierung und Nicht-Radiomarkierung klassifiziert werden. Die Auswahl von Radionucleotiden zur Radiomarkierung ist im Allgemeinen nicht eingeschränkt und sie können, zum Beispiel, 32P 35S, 14C oder dergleichen sein. Die Verwendung von 32P für die Markierung ist bevorzugt. Die Auswahl von einem Agens zur Nicht-Radiomarkierung ist ebenfalls im Allgemeinen nicht eingeschränkt, solange sie allgemein für die Markierung von Nucleinsäuren verwendet werden können, und sie können, zum Beispiel, Digoxigenin, Biotin oder dergleichen sein, wobei Digoxigenin bevorzugt wird.
  • Die Verfahren zur Markierung von einer Nucleinsäure-Sonde sind im Allgemeinen ebenfalls nicht eingeschränkt. Bevorzugt sind allgemein verwendete Verfahren, wie zum Beispiel Verfahren, welche die Markierung in das Produkt durch PCR und RT-PCR unter Verwendung von markierten Nuleotidsubstraten, Nick-Translation, Verwendung von Zufalls-Primern, Endmarkierung und Verfahren zum Synthetisieren von Oligonucleotid-DNA, unter Anwendung von markierten Nucleotid-Substraten, einführen. Ein geeignetes Verfahren kann aus diesen Verfahren, abhängig von der Art der Nucleinsäure-Sonde ausgewählt werden.
  • Das Vorhandensein von einer Nucleotidsequenz, welche identisch ist zu der Nucleotidsequenz von einer bestimmten Nucleinsäure-Sonde in dem Genom von einem ML-236B-produzierenden Mikroorganismus kann durch Southern-Blot-Hybridisierung mit der genomischen DNA von dem ML-236B-produzierenden Mikroorganismus bestätigt werden.
  • Die Southern-Blot-Hybridisierung kann gemäß der Methode von Maniatis durchgeführt worden [beschrieben in Maniatis, T., et al., supra].
  • Eine markierte Nucleinsäure-Sonde, hergestellt wie oben beschrieben, kann verwendet werden, um eine genomische DNA-Bibliothek zu überprüfen. Die Auswahl der Überprüfungsmethode ist nicht sonderlich eingeschränkt, solange wie sie im Allgemeinen für die Genklonierung zweckmäßig ist, aber es ist vorzugsweise die Kolonie-Hybridisierungs-Methode [beschrieben in Maniatis, T., et al., supra].
  • Das Kultivieren von den Kolonien, welche für die Kolonie-Hybridisierung verwendet werden, wird geeigneterweise unter Bedingungen durchgeführt, die für die Wirtszellen zweckmäßig sind. Das Kultivieren von Escherichia coli, einem bevorzugten Wirt, kann in LB-Agarmedium [1% (w/v) Trypton, 0,5% (w/v) Hefeextrakt, 0,5% (w/v) Natriumchlorid, 1,5% (w/v) Agarose] bei 30 bis 37°C für 18 Stunden bis zwei Tage durchgeführt werden.
  • Die Herstellung von einem rekombinanten DNA-Vektor aus dem positiven Klon, welcher durch die Kolonie-Hybridisierung erhalten wurde, wird im Allgemeinen durch Extrahieren von dem Plasmid aus der Kultur von dem positiven Klon und dessen Reinigung durchgeführt.
  • Ein transformierter Escherichia coli-Stamm, Escherichia coli pML48 SANK 71199, welcher einen positiven Klon repräsentiert, der gemäß der vorliegenden Erfindung erhalten wurde, wurde in dem Research Institute of Life Science and Technology of the Agency of Industrial Science and Technology am 07. Juli 1999 in Übereinstimmung mit dem Budapester Vertrag über die Hinterlegung von Mikroorganismen hinterlegt und ihm die Zugangsnummer FERM BP-6780 verliehen.
  • Ein typischer DNA-Vektor, welcher von Escherichia coli pML48 SANK 71199 mitgeführt wurde, wurde als pML48 bezeichnet.
  • Die Bestätigung, dass der rekombinante DNA-Vektor, welcher in dem positiven Klon vorhanden ist, mit der ML-236B-Biosynthese verbundene genomische DNA enthält, kann in geeigneter Weise durch die Bestimmung der Nucleotidsequenz von dem Insert des rekombinanten DNA-Vektors, Southern-Blot-Hybridisierung oder der Expression von dem Insert, um dessen Funktion zu bestimmen, erhalten werden.
  • Die Nucleotidsequenz von der DNA kann gemäß der chemischen Modifikationstechnik nach Maxam und Gilbert [beschrieben in Maxam, A. M. M. und Gilbert, W., Methods in Enzymology, 65, 499 (1980)] oder durch das Dideoxy-Kettenterminierungs-Verfahren [beschrieben in Messing, J. und Vieira, J., Gene, 19, 269 (1982)] bestimmt werden. Andere geeignete Verfahren sind auf dem Fachgebiet gut bekannt. Die Plasmid-DNA, welche für die Bestimmung von der Nucleotidsequenz verwendet wurde, ist, wie oben beschrieben, vorzugsweise eine hochreine Probe.
  • Die Nucleotidsequenz von dem pML48-Insert ist in SEQ-ID Nr.: 1 von der Auflistung der Sequenzen dargestellt. Die Nucleotidsequenz, die in SEQ-ID Nr.: 2 von der Auflistung der Sequenzen dargestellt ist, ist vollständig komplementär zu der Nucleotidsequenz, welche in SEQ-ID Nr.: 1 dargestellt ist. Im Allgemeinen kann eine Nucleotidsequenz von einer genomischen DNA einen genetischen Polymorphismus, das heißt allogene Unterschiede, innerhalb einer Spezies aufweisen. Darüber hinaus ist es bekannt, dass in dem Prozess von der DNA-Klonierung und -Sequenzierung Nucleotid-Substitutionen, oder andere Veränderungen, mit einer bestimmten Frequenz vorkommen können. Dementsprechend schließt die mit der ML-236B-Biosynthese in Zusammenhang stehende genomische DNA von der vorliegenden Erfindung ebenfalls genomische oder andere DNAs ein, die unter stringenten Bedingungen mit der DNA von Nucleotid Nr. 1 bis 34203 von der SEQ-ID Nr.: 1 oder 2 von der Auflistung der Sequenzen hybridisiert werden können. Diese DNAs beinhalten die DNA von Nucleotid Nr. 1 bis 34203 von der SEQ-ID Nr.: 1 oder 2 von der Sequenzauflistung, wobei ein oder mehrere Nucleotide substituiert, entfernt und/oder hinzugefügt sind. Zusätzlich können diese hybridisierenden genomischen oder anderen DNAs eine DNA einschließen, die von anderen ML-236B-produzierenden Mikroorganismen als dem Penicillium citrinum SANK 13380 abstammt, wobei dies vorzugsweise solche sind, die im Stande sind, eine Verbesserung der Produktion von ML-236B zu erzielen, wenn sie in einen ML-236B-produzierenden Mikroorganismus eingeführt werden.
  • Die mit der ML-236B-Biosynthese in Zusammenhang stehende genomische DNA wird geeigneterweise gemäß den nachfolgenden Verfahren 1) bis 3) analysiert.
  • 1) Analyse mit Gen-Analyse-Software
  • Die Gene innerhalb der genomischen DNA können unter Verwendung von einem Programm zum Auffinden von Genen (nachfolgend hierin als „GRAIL" bezeichnet) und einem Programm für das Suchen nach homologen Sequenzen (BLASTN und BLASTX) lokalisiert werden.
  • GRAIL ist ein Programm, welches nach Strukturgenen in der genomischen DNA durch das Aufteilen der genomischen Sequenz nach sieben Parametern zur Evaluation von dem Vorkommen von einer Gensequenz und der Integration der Ergebnisse unter Verwendung des Verfahrens eines neuronalen Netzes sucht [beschrieben in Uberbacher, E. C. & Mural, R. J., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 88, 11261 (1991)]. Beispielsweise kann das ApoCom GRAIL Toolkit [hergestellt durch Apocom Corporation] verwendet werden.
  • BLAST ist ein Programm, welches einen Algorithmus zur Durchführung von Homologie-Suchen bei Nucleotidsequenzen und Aminosäuresequenzen verwendet [beschrieben in Altschul, S. F., Madden, T. L., et al., Nucl. Acids Res., 25, 3389 (1997)].
  • Die Position und die Richtung von einem Strukturgen in einer Probe der genomischen DNA-Sequenz kann durch das Aufteilen der DNA-Sequenz in zweckmäßige Längen und der Durchführung einer Homologie-Suche in einer genetischen Datenbank unter Verwendung von BLASTN vorausgesagt werden. Die Position und die Richtung von einem Strukturgen in einer DNA-Sequenz, die untersucht werden soll, kann ebenfalls durch Translatieren der aufgeteilten genomischen DNA-Sequenzen in den sechs Translationsrahmen (drei auf dem Sense-Strang und die anderen drei auf dem Antisense-Strang) und der Durchführung einer Homologie-Suche von den erhaltenen Aminosäuresequenzen in einer Peptid-Datenbank unter Verwendung von BLASTX vorausgesagt werden.
  • Die codierenden Bereiche für Strukturgene in der genomischen DNA sind bisweilen durch Introns in eukariotischen Organismen unterteilt. Für die Analyse von Strukturgenen, die derartige Lücken aufweisen, ist das BLAST-Programm für Sequenzen, die Lücken enthalten, effektiver, wobei das Gapped-BLAST-Programm (installiert in BLAST 2: WISCONSIN GCG Software-Version 10.0) bevorzugt wird.
  • 2) Analyse gemäß des Northern-Blot Hybridisierungsverfahrens
  • Die Expression von einem Strukturgen, welches durch die in Abschnitt 1) beschriebenen Verfahren prognostiziert wurde, kann unter Verwendung des Northern-Blot Hybridisierungsverfahrens untersucht werden.
  • Geeigneterweise wird die Gesamt-RNA von einem ML-236B-produzierenden Mikroorganismus aus der Kultur von dem Mikroorganismus erhalten. Eine Kultur von dem bevorzugten ML-236B-produzierenden Mikroorganismus, Penicillium citrinum, kann erhalten werden durch das Inokulieren des Mikroorganismus von einer Schrägkultur in MGB3-8 Medium, gefolgt von einer Inkubation unter Schütteln, wobei bei 22 bis 28°C für ein bis vier Tage inkubiert wird.
  • Die Auswahl von dem Verfahren zur Extraktion der RNA aus einem ML-236B-produzierenden Mikroorganismus ist nicht eingeschränkt und bevorzugt sind die Guanidinthiocyanate-Hot-Phenol-Methode, die Guanidinthiocyanat-Guanidinhydrochlorid-Methode oder dergleichen. Beispiele für ein handelsüblich erhältliches Kit zur Herstellung von Gesamt-RNA mit höherer Reinheit schließen das RNeasy Plant Mini Kit (hergestellt durch Qiagen AG) ein. Darüber hinaus kann die mRNA durch Auftragen der Gesamt-RNA auf eine Oligo-(dT) Säule und Zurückgewinnen der auf der Säule adsorbierten Fraktion erhalten werden.
  • Die Übertragung der RNA auf eine Membran, die Präparation von einer Sonde und die Hybridisierung und der Nachweis von einem Signal können auf eine ähnliche Art und Weise zu der oben erwähnten Southern-Blot Hybridisierungsmethode durchgeführt werden.
  • 3) Analyse von dem 5'-Ende und dem 3'-Ende des Transkripts.
  • Die Analyse von dem 5'-Ende und dem 3'-Ende von jedem Transkript kann gemäß der „RACE"-(schnelle Amplifikation von cDNA-Enden)Methode durchgeführt werden. RACE ist ein Verfahren zum Erhalten von einer cDNA, welche eine bekannte Nucleotidregion und eine unbekannte Region an dem 5'-Ende oder dem 3'-Ende von einem Gen umfasst, unter Verwendung von RT-PCR mit mRNA als einer Matrize [beschrieben in Frohman, M. A., Methods Enzymol. 218, 340 (1998)].
  • 5'-RACE kann gemäß dem nachfolgenden Verfahren durchgeführt werden. Der erste Strang von einer cDNA wird in Übereinstimmung mit einer Reverse Transkriptase-Reaktion unter Verwendung von mRNA als einer Matrize synthetisiert. Als ein Primer werden die Antisense-Oligonucleotide (1) verwendet, welche nach einem bekannten Teil von einer Nucleotidsequenz konstruiert wurden. Eine homopolymere Nucleotidkette (bestehend aus einer Art von Basen) wird zu dem 3'-Ende von dem ersten Strang der cDNA unter Verwendung der terminalen Deoxynucleotidyl-Transferase hinzugefügt. Danach wird eine doppelsträngige cDNA an ihrer 5'-Endregion mittels PCR unter Verwendung des ersten Stranges von der cDNA als eine Matrize amplifiziert. Für die Amplifikation werden 2 Primer verwendet, ein DNA-Oligonucleotid aus dem Sense-Strang, welches eine Sequenz enthält, die komplementär zu der homopolymeren Sequenz ist, und ein Oligonucleotid (2) an dem Antisense-Strang und an der 3'-Endstelle von der Oligonucleotid-DNA (1) [beschrieben in Frohman, M. A., Methods in Enzymol., 218, 340 (1993]. Ein Kit für das 5'-RACE ist handelsüblich erhältlich, geeignet ist das 5'-RACE System für die schnelle Amplifikation von cDNA-Enden, Version 2.0 (hergestellt durch GIBCO Corporation).
  • Das 3'-RACE ist ein Verfahren, welches die PolyA-Region verwendet, die an dem 3'-Ende von der mRNA existiert. Spezifischer, der erste Strang von der cDNA wird durch eine Reverse Transkriptase-Reaktion unter Verwendung von mRNA als eine Matrize und einem Oligo(dT)-Adapter als einem Primer synthetisiert. Danach wird eine doppelsträngige cDNA an ihrer 3'-Endregion mittels PCR unter Verwendung des ersten Stranges von der cDNA als eine Matrize amplifiziert. Als Primer werden ein DNA-Oligonucleotid (3) an dem Sense-Strang, welches nach einem bekannten Teil von der Nucleotidsequenz von dem Sense-Strang konstruiert wurde, und der Oligo(dT)-Adapter an dem Antisense-Strang verwendet. Ein Kit für das 3'-RACE ist handelsüblich erhältlich, geeignet ist das Ready-To-Go T-Primed First-Strand Kit (Pharmacia Corporation).
  • Die Ergebnisse von Analyse 1) und 2) oben werden bevorzugt in der Durchführung von RACE und in der Entwicklung von den Primern, die auf einem bekannten Teil von der interessierenden Nucleotidsequenz basieren, verwendet.
  • Unter Verwendung der Verfahren von den Analysen, die in 1) bis 3) oben beschrieben wurden, kann die Richtung von einem Strukturgen auf einer genomischen DNA-Sequenz, die Position von der Stelle der Transkriptionsaktivierung in dem Strukturgen, die Position von dem Translations-Startcodon und das Translations-Terminations-Codon sowie seine Position darauf hergeleitet werden. Basierend auf der obigen Information kann jedes Strukturgen und die cDNA davon, und zwar die die ML-236B-Biosynthese beschleunigenden cDNAs, erhalten werden.
  • Es wird angenommen, dass sechs Strukturgene auf der eingeführten Sequenz in einem rekombinanten pML48 DNA-Vektor, der gemäß der vorliegenden Erfindung erhalten wurde, vorhanden sind. Sie werden mit mlcA, mlcB, mlcC, mlcD, mlcE, beziehungsweise mlcR bezeichnet. Von mlcA, mlcB, mlcE und mlcR unter ihnen wird angenommen, dass sie einen codierenden Bereich auf der Nucleotidsequenz aufweisen, die in SEQ-ID Nr.: 2 von der Auflistung der Sequenzen dargestellt ist. Von mlcC und mlcD wird angenommen, dass sie einen codierenden Bereich auf der Nucleotidsequenz aufweisen, welche in SEQ-ID Nr.: 1 von der Auflistung der Sequenzen dargestellt ist.
  • Beispiele für ein Verfahren für das Erhalten der spezifischen, die ML-236B-Biosynthese beschleunigenden cDNAs, welche den oben erwähnten Strukturgenen entsprechen, schließen ein: Klonieren mit RT-PCR unter Verwendung von Primern, die für die Sequenz von jedem der Strukturgene und der flankierenden DNA davon entwickelt wurden und die Klonierung aus einer cDNA-Bibliothek unter Verwendung zweckentsprechender DNA-Sonden, die für bekannte Nucleotidsequenzen entwickelt wurden. Andere: geeignete Verfahren sind auf dem Fachgebiet gut bekannt. Um die gemäß dieser Verfahren erhaltene cDNA funktionell zu exprimieren, wird es bevorzugt, eine cDNA mit vollständiger Länge zu erhalten.
  • Ein Verfahren zum Erhalten der die ML-236-Biosynthese beschleunigenden cDNA unter Verwendung von RT-PCR ist nachfolgend erklärt.
  • Ein Primerpaar für die RT-PCR und zum Erhalten der die ML-236B-Biosynthese beschleunigenden cDNA muss derart entwickelt werden, dass jeder Primer sich selektiv an einen Matrizenstrang anlagert, um zu ermöglichen, dass die cDNA erhalten wird. Es ist jedoch nicht notwendig, dass die Primer für die RT-PCR vollständig komplementär zu einem Bereich von jeder Matrizenkette sind, vorausgesetzt dass sie der oben beschriebenen Bedingung gerecht werden. Geeignete Primer für die RT-PCR, die sich an den Antisense-Strang anlagern können (nachfolgend hierin als „Sense-Primer" bezeichnet), sind Sense-Primer, die vollständig komplementär zu einem Bereich von dem Antisense-Strang sind (nachfolgend hierin als „unsubstituierte Sense-Primer" bezeichnet) oder es sind Sense-Primer, welche nicht vollständig komplementär zu einem Bereich von dem Antisense-Strang sind (nachfolgend hierin als „teilweise substituierte Sense-Primer" bezeichnet). Die anderen geeigneten Primer für die RT-PCR, die sich an den Sense-Strang anlagern können (nachfolgend hierin als „Antisense-Primer" bezeichnet), sind Antisense-Primer, die vollständig komplementär zu einem Bereich von dem Sense-Strang sind (nachfolgend hierin als „unsubstituierte Antisense-Primer" bezeichnet) oder es sind Antisense-Primer, welche nicht vollständig komplementär zu einem Bereich von dem Sense-Strang sind (nachfolgend hierin als „teilweise substituierte Antisense-Primer" bezeichnet).
  • Ein Sense-Primer wird geeigneterweise derart entwickelt, dass das RT-PCR-Produkt, das durch seine Verwendung erhalten wird, das ATG-Codon an der ursprünglichen Position der Translationsinitiation enthält. Geeigneterweise enthält das RT-PCR-Produkt ebenfalls nur das richtige Translations-Terminations-Codon in dem Leserahmen, der die ursprüngliche ATG-Startstelle aufweist, und keine zusätzlichen (falschen) Translations-Stoppstellen. Die Position von dem Translationsinitiations-Codon von denjenigen Strukturgenen, welche in der vorliegenden Erfindung prognostiziert wurden, ist in der Tabelle 5 für Gene dargestellt, die in der SEQ-ID Nr.: 1 und der SEQ-ID Nr.: 2 von der Sequenzauflistung lokalisiert sind.
  • Das 5'-Ende von dem unsubstituierten Sense-Primer ist geeigneterweise das Nucleotid ,A' von ATG, dem Translations-Initiations-Codon oder eine Base, welche an der 5'-Seite davon existiert.
  • Ein teilweise substituierter Sense-Primer lagert sich selektiv an einen spezifischen Abschnitt in SEQ-ID Nr.: 1 oder SEQ-ID Nr.: 2 von der Auflistung der Sequenzen an, wobei die Nucleotidsequenz von SEQ-ID Nr.: 2 von der Auflistung der Sequenzen vollständig komplementär zu der SEQ-ID Nr.: 1 von der Auflistung der Sequenzen ist.
  • Wenn ein teilweise substituierter Sense-Primer eine Nucleotidsequenz enthält, die an der 3'-Seite von dem Translations-Initiations-Codon ATG vorhanden ist, enthält es geeigneterweise keine Nucleotidsequenzen in diesem Abschnitt, welche Terminations-Codons (TAA, TAG oder TGA) in demselben Leserahmen wie das ATG darstellen.
  • Ein teilweise substituierter Sense-Primer kann das Nucleotid „A", die Nucleotidsequenz „AT" oder „ATG" enthalten (nachfolgend hierin als „Nucleotid oder Nucleotidsequenz m'" bezeichnet), welche dem Nucleotid „A", der Nucleotidsequenz „AT" oder dem „ATG" von dem Translationsinitiations-Codon entsprechen (nachfolgend hierin als Nucleotid oder Nucleotidsequenz m" bezeichnet). Wo das Nucleotid m' „A" ist, was mit dem „A" von der Sequenz m übereinstimmt, von uns wird bevorzugt, dass das m' „A" an dem 3'-Ende von dem teilweise substituierten Sense-Primer liegt. In ähnlicher Weise wird, wo m' „AT" ist, von uns bevorzugt, dass diese m' „AT"-Sequenz am 3'-Ende von dem teilweise substituierten Sense-Primer lokalisiert ist. Wenn das Nucleotid oder die Nucleotidsequenz m „ATG" ist, das mit dem m' „ATG" übereinstimmt, bevorzugen wir, dass diejenigen Trinucleotide, welche 3' zu dem ATG in dem Primer liegen, nicht Stoppcodons entsprechen. Mit anderen Worten, für Trinucleotide, deren 5'-End-Nucleotid das (3 × n + 1)-te Nucleotid (wobei n eine ganze Zahl von eins oder mehr repräsentiert) ist, gezählt von dem A von dem m' „ATGA" in der Richtung von dem 3'-Ende, ist die Nucleotidsequenz von dem Trinucleotid vorzugsweise weder TAA, TAG, noch TGA. Die oben beschriebenen Primer können verwendet werden, um eine cDNA zu erhalten, die ein Methionin-Codon an der Position aufweist, welche mit dem Translationsinitiations-Codon von der mRNA übereinstimmt, die als eine RT-PCR-Matrize verwendet wird.
  • Wo das 3'-Ende von einem teilweise substituierten Sense-Primer der Nucleotid-Position (3 × n + 1) entspricht, ist vorzugsweise das Trinucleotid, welches an dieser Position beginnt, nicht TAA, TAG oder TGA in dem RT-PCR-Produkt, das unter Verwendung von dem teilweise substituierten Sense-Primer als einer von den Primern und der RNA oder der mRNA von dem ML-236B-produzierenden Mikroorganismus als Matrize erhalten wurde, oder in den PCR-Produkten, welche unter der Verwendung der genomischen DNA oder der cDNA als Matrize erhalten wurden. Die Nucleotid-Position wird ausgehend von dem „A" des Translationsinitiations-Codons „ATG" in der Richtung von dem 3'-Ende gezählt und „n" repräsentiert hierbei eine ganze Zahl von eins oder mehr.
  • Wo das 3'-Ende von einem teilweise substituierten Sense-Primer der Nucleotid-Position (3 × n + 2) entspricht, ist das Triplett, für das die Position 3 × n + 2 das zentrale Nucleotid darstellt, vorzugsweise keine der Sequenzen TAA, TAG oder TGA für ein PCR- oder RT-PCR-Produkt, das wie oben erhalten wurde.
  • Wo das 3'-Ende von einem teilweise substituierten Sense-Primer der Nucleotid-Position (3 × n + 3) entspricht, ist das Triplett, für das die Position (3 × n + 3) das 3'-Nucleotid darstellt, vorzugsweise keine der Sequenzen TAA, TAG oder TGA.
  • Die Voraussetzungen für den Sense-Primer sind wie oben diskutiert.
  • Ein Antisense-Primer wird derart entwickelt, dass, wenn er paarweise zusammen mit dem Sense-Primer verwendet wird, eine cDNA, die jedes von den Strukturgenen (mlcA, mlcB, mlcC, mlcD, mlcE und mlcR) codiert, unter Verwendung von RT-PCR in einer Richtung amplifiziert werden kann, die entsprechend dem N-Terminus bis zu dem C-Terminus von den übereinstimmenden Peptiden ist.
  • Die Auswahl von einem unsubstituierten Antisense-Primer ist nicht eingeschränkt, solange es ein Antisense-Primer ist, der eine Nucleotidsequenz aufweist, welche komplementär zu einer Nucleotidsequenz ist, die in dem Bereich von der Translations-Terminationsstelle von der cDNA lokalisiert ist. Es wird jedoch ein Primer bevorzugt, welcher eine Base am 5'-Ende aufweist, die komplementär zu der Base an dem 3'-Ende von dem Translations-Terminations-Codon ist, oder die eine Base an der Seite des 5'-Endes von der Primerbase aufweist. Ein Primer, welcher drei Basen enthält, die komplementär zu einem Translations-Terminations-Codon sind, wird mehr bevorzugt. Die Tabellen 8 bis 10 stellen das Translations-Terminations-Codon von jedem einzelnen Strukturgen, die Sequenz, die komplementär zu dem Translations-Terminations-Codon ist, einen Aminosäure-Rest an dem C-terminalen Ende von dem Peptid, das durch jedes Strukturgen codiert wird, die Nucleotidsequenz, welche den Aminosäure-Rest codiert und die Position davon in der SEQ-ID Nr.: 1 oder der SEQ-ID Nr.: 2 dar.
  • Die teilweise substituierten Antisense-Primer lagern sich selektiv an einen spezifischen Abschnitt in der Nucleotidsequenz von SEQ-ID Nr.: 1 oder der SEQ-ID Nr.: 2 von der Auflistung der Sequenzen an.
  • Das oben erwähnte stellt die Voraussetzungen für einen Antisense-Primer dar.
  • Es ist möglich geeignete Nucleotidsequenzen an das 5'-Ende von dem teilweise substituierten Sense-Primer und den teilweise substituierten Antisense-Primer anzuhängen, solange sie den oben erwähnten Voraussetzungen gerecht werden. Die Auswahl von einer derartigen Nucleotidsequenz ist nicht sonderlich eingeschränkt, solange der Primer für die PCR verwendet werden kann. Beispiele für zweckmäßige Sequenzen schließen Nucleotidsequenzen ein, die zum Klonieren von PCR-Produkten zweckdienlich sind, wie zum Beispiel Schnittstellen von Restriktionsenzymen und Nucleotidsequenzen, welche geeignete Schnittstellen für Restriktionsenzyme enthalten.
  • Zusätzlich sind der Sense-Primer und der Antisense-Primer geeigneterweise gemäß der oben erwähnten Beschreibung und in Übereinstimmung mit der allgemeinen Konstruktion von einem Primer für die PCR entwickelt.
  • Wie oben beschrieben, können die mRNA oder die Gesamt-RNA aus einem ML-236B-produzierenden Mikroorganismus als eine Matrize für die RT-PCR verwendet werden. Eine die ML-236B-Biosynthese beschleunigende cDNA, welche mit dem Strukturgen mlcE übereinstimmt, wurde durch das Entwickeln und Synthetisieren eines Primerpaares erhalten, welches geeignet ist, den gesamten codierenden Abschnitt von dem Strukturgen mlcE in der pML48-Insert-Sequenz zu amplifizieren und anschließend die RT-PCR durchzuführen, unter Verwendung der Gesamt-RNA aus SANK 13380 als Matrize [die Primer werden durch die Nucleotidsequenzen SEQ-ID Nr.: 35, beziehungsweise 36 von der Auflistung der Sequenzen repräsentiert].
  • Eine die ML-236B-Biosynthese beschleunigende cDNA, welche mit dem Strukturgen mlcR übereinstimmt, wurde auf eine ähnlich Weise unter Verwendung der Primer erhalten, die durch die Nucleotidsequenzen SEQ-ID Nr.: 39, beziehungsweise 40 von der Auflistung der Sequenzen repräsentiert werden.
  • Wie oben beschrieben, kann das RT-PCR-Produkt durch Einfügung in einen zweckmäßigen DNA-Vektor kloniert werden. Die Auswahl von dem DNA-Vektor, der für eine derartige Klonierung eingesetzt wird, ist nicht eingeschränkt und ist geeigneterweise ein DNA-Vektor, der im Allgemeinen für die Klonierung von DNA-Fragmenten verwendet wird. Kits für die bequeme Durchführung der Klonierung von einem RT-PCR-Produkt sind handelsüblich erhältlich und es wird das Original TA Cloning Kit [hergestellt durch Invitrogen: unter Verwendung von pCR2.1 als DNA-Vektor] bevorzugt.
  • Die Bestätigung von einer funktionellen Expression von den die ML-236B-Biosynthese beschleunigenden cDNAs, die unter Verwendung der oben erwähnten Verfahren in einem ML-236B-produzierenden Mikroorganismus erhalten wurden, kann durch Klonierung der cDNA in einen DNA-Vektor erreicht werden, welcher für die funktionelle Expression in einem ML-236B-produzierenden Mikroorganismus zweckmäßig ist. Danach werden geeignete Zellen mit dem rekombinanten DNA-Vektor transformiert und die Fähigkeit zur ML-236B-Biosynthese von den transformierten Zellen und den nicht-transformierten Wirtszellen miteinander verglichen. Falls die cDNA, welche die ML-236B-Biosynthese beschleunigt, in den transformierten Zellen funktionell exprimiert ist, dann ist die Fähigkeit zur ML-236B-Biosynthese von der transformierten Zelle verglichen mit der von einer Wirtszelle erhöht.
  • Die Auswahl von einem DNA-Vektor, der für die Expression in einem ML-236B-produzierenden Mikroorganismus geeignet ist [nachfolgend hierin als ein funktioneller Expressionsvektor bezeichnet] ist nicht sonderlich eingeschränkt, solange er für die Transformation von ML-236B-produzierenden Mikroorganismen verwendet werden kann und funktionell das Polypeptid exprimieren kann, das durch die cDNA, welche die ML-236B-Biosynthese beschleunigt, in diesem Organismus codiert wird. Vorzugsweise ist der Vektor in der Wirtszelle stabil und weist eine Nucleotidsequenz auf, welche die Replikation in der Wirtszelle gestattet.
  • Der Vektor für die funktionelle Expression kann eine oder mehr als eine der die ML-236B-Biosynthese beschleunigenden cDNAs enthalten, zum Beispiel cDNAs, welche mit den Strukturgenen mlcR oder mlcR und mlcE übereinstimmen.
  • Ein Vektor für eine funktionelle Expression kann eine oder mehrere Arten von DNA enthalten, außer der cDNA, welche mit den Strukturgenen mlcR oder mlcR und mlcE übereinstimmt, die die Biosynthese von ML-236B beschleunigen, wenn sie in einen ML-236B-produzierenden Mikroorganismus eingeführt werden. Beispiele für eine derartige DNA beinhalten: cDNAs, welche mit den Strukturgenen mlcA, mlcB, mlcC, oder mlcD übereinstimmen, mit der ML-236B-Biosynthese in Zusammenhang stehende genomische DNA, DNA, welche die Expressions-Regulationsfaktoren der die ML-236B-Biosynthese beschleunigenden cDNA der vorliegenden Erfindung codiert, oder dergleichen.
  • Ein Vektor für die funktionelle Expression umfasst vorzugsweise eine Nucleotidsequenz, welche einen selektiven Phänotyp für das Plasmid in einer Wirtszelle bereitstellt und ist vorzugsweise ein Shuttle-Vektor.
  • Darüber hinaus kann der selektive Phänotyp ein Arzneistoff-resistenter Phänotyp oder dergleichen sein, ist vorzugsweise gegenüber Antibiotika resistent und insbesondere resistent gegenüber Ampicillin oder resistent gegenüber Hygromycin B.
  • In dem Falle, dass der Expressionsvektor ein Shuttle-Vektor ist, umfasst der Vektor geeigneterweise eine Nucleotidsequenz, welche es dem Vektor ermöglicht, sich in einer Wirtszelle aus einer der Gruppen der Mikroorganismen zu replizieren, und eine Nucleotidsequenz, die für die Expression von dem Polypeptid, welches durch das Vektor-Insert codiert wird, in einem anderen Wirtszell-Typ notwendig ist. Es wird bevorzugt, dass der Vektor einen unterschiedlichen selektiven Phänotyp für jede Wirtszelle aus den Gruppen der transformierten Mikroorganismen ermöglicht. Die Voraussetzungen für Kombinationen der Gruppen von Mikroorganismen sind ähnlich zu der Voraussetzung für den Shuttle-Vektor, welcher für die Klonierung und Expression von mit der ML-236B-Biosynthese in Zusammenhang stehender genomischer DNA verwendet wird, beschrieben in der vorliegenden Spezifikation.
  • In der vorliegenden Erfindung ist eine geeigneter Shuttle-Vektor der DNA-Vektor pSAK700, der durch Kombinieren von dem 3-Phosphoglyceratkinase-(nachfolgend hierin als „pgk" bezeichnet)Promotor, der aus Aspergillus nidulans abstammt, und in dem DNA-Vektor pSAK333 vorkommt (beschrieben in der Japanischen Patentanmeldung Publikations-Nr. 3-262486 ), einem Adapter für das Einführen von einem Fremdgen und einem pgk-Terminator in der DNA, in dieser Reihenfolge konstruiert wird (siehe 4).
  • Ein Polypeptid kann in einem ML-236B-produzierenden Mikroorganismus durch Einführen der cDNA, welche mit dem Strukturgen mlcE übereinstimmt, das oben beschrieben ist, in einen Expressionsvektor wie oben beschrieben exprimiert werden. Ein rekombinanter cDNA-Expressionsvektor pSAKexpE ist durch Einführung von cDNA, welche mit dem Strukturgen mlcE übereinstimmt, in eine Adapterstelle von pSAK700 erhalten worden. Die eingebaute Sequenz in pSAKexpE, nämlich die Nucleotidsequenz von der cDNA, welche mit dem Strukturgen mlcE übereinstimmt, ist in der SEQ-ID Nr.: 37 von der Auflistung der Sequenzen dargestellt. In ähnlicher Weise ist ein rekombinanter cDNA-Expressionsvektor pSAKexpR durch Einführung von cDNA, welche mit dem Strukturgen mlcR übereinstimmt, in eine Adapterstelle von pSAK700 erhalten worden. Die eingebaute Sequenz in pSAKexpR, nämlich die Nucleotidsequenz von der cDNA, welche mit dem Strukturgen mlcR übereinstimmt, ist in der SEQ-ID Nr.: 41 von der Auflistung der Sequenzen dargestellt.
  • Escherichia coli pSAKexpE SANK 72499, das heißt, der Escherichia coli-Stamm transformiert durch pSAKexpE, wurde in dem Research Institute of Life Science and Technology of the Agency of Industrial Science and Technology am 25. Januar 2000 unter der Depotnummer FERM BP-7005 in Übereinstimmung mit dem Budapester Vertrag über die Hinterlegung von Mikroorganismen hinterlegt. Escherichia coli pSAKexpR SANK 72599, das heißt, der Escherichia coli-Stamm transformiert durch pSAKexpR, wurde in dem Research Institute of Life Science and Technology of the Agency of Industrial Science and Technology am 25. Januar 2000 unter der Depotnummer FERM BP-7006 in Übereinstimmung mit dem Budapester Vertrag über die Hinterlegung von Mikroorganismen hinterlegt.
  • Geeignete Verfahren zur Transformation können zweckentsprechend, abhängig von der Wirtszelle, ausgewählt werden, um die Expression von der die ML-236B-Biosynthese beschleunigenden cDNA, der mit der ML-236B-Biosynthese in Zusammenhang stehenden genomischen DNA oder Fragmenten daraus zu erhalten. Die Transformation von Penicillium citrinum, einem bevorzugten ML-236B-produzierenden Mikroorganismus, kann durch das Präparieren von Protoplasten aus den Sporen von Penicillium citrinum durchgeführt werden, wobei anschließend der Vektor mit der rekombinanten DNA in den Protoplasten eingeführt wird [beschrieben in Nara, F., et al., Curr. Genet. 23, 28 (1993)].
  • Geeigneterweise werden Sporen aus einer Schrägkultur von Penicillium citrinum auf eine Platte mit PGA-Agarmedium inokuliert und bei 22 bis 28°C für 10 bis 14 Tage inkubiert. Die Sporen werden anschließend von der Platte geerntet und 1 × 107–1 × 109 Sporen in 50 bis 100 ml von YPL-20 Kulturmedium inokuliert [Zusammensetzung: 0,1% (w/v) Hefeextrakt (hergestellt durch Difco Corporation), 0,5% (w/v) Polypepton (hergestellt durch Nihon Seiyaku Corporation), 20% (w/v) Laktose, pH 5,0] und danach bei 22 bis 28°C für 18 Stunden bis zu zwei Tage inkubiert. Die auskeimenden Sporen werden aus der Kultur gewonnen und mit Enzymen behandelt, welche die Zellwände abbauen, um die Protoplasten zu ergeben. Die Auswahl von dem die Zellwand abbauenden Enzym ist nicht sonderlich eingeschränkt, solange es die Zellwand von Penicillium citrinum abbauen kann und keine nachteilige Wirkung auf den Mikroorganismus aufweist. Beispiele daraus beinhalten: Zymolase, Chitinase oder dergleichen.
  • Das Mischen von einem Vektor mit rekombinanter DNA, der eine die ML-236B-Biosynthese beschleunigende cDNA umfasst, und dem ML-236B-produzierenden Mikroorganismus, oder den Protoplasten davon, unter zweckmäßigen Bedingungen ermöglicht die Einführung von dem Vektor mit der rekombinanten DNA in den Protoplasten, um einen Transformanten bereitzustellen.
  • Die Kultivierung von Transformanten von ML-236B-produzierenden Mikroorganismen wird geeigneterweise unter Bedingungen durchgeführt, welche für jede von den Wirtszellen geeignet ist. Die Kultivierung von einem Transformanten von Penicillium citrinum, einem bevorzugten ML-236B-produzierenden Mikroorganismus, kann durch Kultivierung des vorher transformierten Protoplasten unter Bedingungen durchgeführt werden, die es gestatten, eine Zellwand zu regenerieren und der anschließenden Kultivierung. Dazu kann der transformierte Protoplast aus Penicillium citrinum in ein VGS-Mittelschichtagar-Medium [Zusammensetzung: Minimalmedium nach Vogel, 2% (w/v) Glucose, 1 M Glucitol, 2% (w/v) Agar] eingebracht werden, das VGS-Mittelschichtagar-Medium wird danach zwischen einem VGS-Unterschichtagar-Medium [Zusammensetzung: Minimalmedium nach Vogel, 2% (w/v) Glucose, 1 M Glucitol, 2,7% (w/v) Agar] und einem VGS-Oberschichtagar-Medium [Zusammensetzung: Minimalmedium nach Vogel, 2% (w/v) Glucose, 1 M Glucitol, 1,5% (w/v) Agar], das 800 μg/ml Hygromycin B enthält, eingeschoben und anschließend bei 22 bis 28°C für 7 bis 15 Tage inkubiert. Der resultierende Stamm wird durch Inkubation bei 22 bis 28°C auf PGA-Medium subkultiviert. Der Stamm wird mit einer Platinnadel auf eine Schrägkultur, die aus PGA-Medium hergestellt wurde, inokuliert, bei 22 bis 28°C für 10 bis 14 Tage inkubiert und anschließend bei 0 bis 4°C gehalten.
  • Wie oben beschrieben kann ML-236B wirksam produziert werden durch Inokulieren von einem Penicillium citrinum Transformanten, welcher aus einer Schrägkultur wie oben erhalten wurde, und er eine regenerierte Zellwand aufweist, in ein MBG3-8 Medium, gefolgt durch eine Inkubation unter Schütteln bei 22 bis 28°C für 7 bis 12 Tage. Penicillium citrinum kann ebenfalls als ein Wirt in flüssigem Medium kultiviert werden, um ML-236B zu produzieren.
  • Die Reinigung von ML-236B aus der Kultur von einem Transformanten von einem ML-236B-produzierenden Mikroorganismus kann durchgeführt werden durch die Kombination unterschiedlicher Verfahren, die im Allgemeinen für die Reinigung von natürlichen Produkten verwendet werden. Die Auswahl von derartigen Verfahren ist nicht sonderlich eingeschränkt und sie kann, zum Beispiel, Zentrifugation, Abtrennung der Feststoffe und Flüssigkeiten durch Filtration, Behandlung mit Alkali oder Säure, Extraktion mit organischen Lösemitteln, Auflösung, chromatographischen Verfahren wie Adsorptionschromatographie, Verteilungschromatographie oder dergleichen und Kristallisation oder dergleichen sein. ML-236B kann entweder in Hydroxysäure- oder Lacton-Form vorliegen, wobei diese wechselseitig ineinander umgewandelt werden können. Die Hydroxysäure ist zu einem Salz davon umwandelbar, das stabiler ist. Unter Ausnutzung derartiger physikalischen Eigenschaften können die ML-236B Hydroxysäure-Form (nachfolgend hierin als freie Hydroxysäure bezeichnet), die Salze der ML-236B Hydroxysäure (nachfolgend hierin als ein Salz der Hydroxysäure bezeichnet) oder die ML-236B Lacton-Form (nachfolgend hierin als Lacton bezeichnet) erhalten werden.
  • Die Kultur wird einer alkalischen Hydrolyse bei erhöhter Temperatur oder Raumtemperatur zur Ringöffnung und zur Umwandlung zu einem Salz der Hydroxysäure unterworfen und dann wird die Reaktionslösung angesäuert und anschließend filtriert. Das Filtrat wird mit einem organischen Lösemittel extrahiert, das sich von Wasser abtrennt, um das vorgesehene Produkt als eine freie Hydroxysäure bereitzustellen. Die Auswahl von dem organischen Lösemittel ist nicht sonderlich eingeschränkt. Beispiele daraus beinhalten: aliphatische Kohlenwasserstoffe wie Hexan, Heptan oder dergleichen, aromatische Kohlenwasserstoffe wie Benzol, Toluol oder dergleichen, halogenierte Kohlenwasserstoffe wie Methylenchlorid, Chloroform oder dergleichen, Ether wie Diethylether oder dergleichen, Ester wie Ethylformiat, Ethylacetat oder dergleichen, oder eine Mischung, bestehend aus zwei oder mehr Lösemitteln.
  • Die vorgesehene Verbindung kann als ein Hydroxysäure-Salz durch Auflösen der freien Hydroxysäure in einer wässrigen Lösung von einem Alkalimetall-Salz, wie zum Beispiel Natriumhydroxid, erhalten werden.
  • Darüber hinaus kann die vorgesehene Verbindung als ein Lacton durch Ringschluss mittels Erhitzen der freien Hydroxysäure in einem organischen Lösemittel zum Wasserentzug oder durch andere geeignete Verfahren erhalten werden.
  • Es ist möglich, die so erhaltene freie Hydroxysäure, das Salz der Hydroxysäure oder das Lacton unter Verwendung der Säulenchromatographie oder dergleichen zu reinigen und zu isolieren. Das Material für die in der Chromatographie verwendete Säule ist nicht sonderlich eingeschränkt. Beispiele davon beinhalten: Sephadex LH-20 (hergestellt durch Pharmacia Corporation), Diaion HP-20 (hergestellt durch Mitsubishi Kagaku Corporation), Kieselgel, Umkehrphasen-Materialien oder dergleichen, wobei Materialen von der C18-Serie bevorzugt werden.
  • Die Auswahl von einem Verfahren für die Quantifizierung von ML-236B ist nicht sonderlich eingeschränkt, vorzugsweise soll es ein Verfahren sein, dass im Allgemeinen zur Quantifizierung von organischen Verbindungen verwendet wird. Beispiele davon beinhalten: Umkehrphasen-Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (nachfolgend hierin als „Umkehrphasen-HPLC" bezeichnet) oder dergleichen. Die Quantifizierung gemäß der Umkehrphasen-HPLC kann durch alkalische Hydrolyse einer Kultur von einem ML-236B-produzierenden Mikroorganismus, Unterwerfen der löslichen Fraktion einer Umkehrphasen-HPLC unter Verwendung einer C18-Säule, Messung der UV-Absorption und Umrechnen des Absorptionswertes zu einer Menge an ML-236B. Die Auswahl von C18-Säulen ist nicht sonderlich eingeschränkt, vorzugsweise soll es eine C18-Säule sein, die für eine allgemeine Umkehrphasen-HPLC verwendet wird. Beispiele davon beinhalten: SSC-ODS-262 (Durchmesser von 6 mm, Länge 100 mm, hergestellt durch Senshu Kagaku Corporation) oder dergleichen. Die Auswahl von einem Lösemittel für die mobile Phase ist nicht sonderlich eingeschränkt, solange es ein Lösemittel ist, welches für die Umkehrphasen-HPLC allgemein verwendbar ist. Es kann sein, zum Beispiel, 75% (v/v; Volumen pro Volumen) Methanol – 0,1% (v/v) Triethylamin – 0,1% (v/v) Essigsäure oder dergleichen. Wenn ML-236B bei Raumtemperatur zu einer SSC-ODS-262-Säule gegeben wird, wo 75% (v/v) Methanol – 0,1% (v/v) Triethylamin – 0,1% (v/v) Essigsäure als mobile Phase bei einer Geschwindigkeit von 2 ml/Minute verwendet werden, wird ML-236B nach 4,0 Minuten eluiert. ML-236B kann unter Verwendung eines UV-Detektors für die HPLC nachgewiesen werden. Die absorbierte Wellenlänge bei dem UV-Nachweis liegt bei 220 bis 280 nm, vorzugsweise 220 bis 260 nm, insbesondere 236 nm.
  • Es können pharmazeutische Zusammensetzungen, die ML-236B, das unter Verwendung der vorliegenen Erfindung erhalten wurde, zusammen mit einem pharmazeutischen Trägerstoff enthalten, hergestellt werden.
  • Es können pharmazeutische Zusammensetzungen hergestellt werden, die Pravastatin, präpariert aus ML-236B, welches unter Verwendung der vorliegenen Erfindung erhalten wurde, zusammen mit einem pharmazeutischen Trägerstoff enthalten.
  • Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können konventionell und dieselben sein wie diejenigen, die für existierende Formulierungen von ML-236B oder Pravastatin eingesetzt werden.
  • Die Erfindung wird jetzt detaillierter unter Bezugnahme auf die nachfolgenden Figuren und Beispiele veranschaulicht. Die Beispiele sind veranschaulichend für, aber nicht daran gebunden, die vorliegende Erfindung.
  • BESCHREIBUNG DER FIGUREN
  • 1 zeigt ein Diagramm, das den Aufbau des DNA-Vektors pSAKcos1 bildlich darstellt;
  • 2 stellt die Ergebnisse der Strukturgen-Analyse von der eingebauten Sequenz von pML48 dar;
  • 3 stellt die Northern-Blot-Hybridisierung von der eingebauten Sequenz von pML48 dar;
  • 4 zeigt ein Diagramm, das den Aufbau des cDNA-Expressionsvektors pSAK700 bildlich darstellt; und
  • 5 stellt die RT-PCR-Analyse für die Transkription von mlcA–E und R in einem pSAKexpR-Transformanten dar.
  • 6 stellt die RT-PCR-Analyse für die Transkription von mlcE in einem pSAKexpE-Transformanten dar.
  • BEISPIELE DER ERFINDUNG
  • Beispiel 1: Konstruktion des pSAKcos1-Vektors
  • Das Plasmid pSAK333, welches das Hygromycin B Phosphotransferase-Gen (nachfolgend hierin als "HTP" bezeichnet) enthält, das aus Escherichia coli abstammt ( Japanische Patentanmeldung Publikations-Nr. 3-262486 ), wurde mit dem Restriktionsenzym BamHI (hergestellt durch Takara Shuzo Co., Ltd., Japan) verdaut und wurde mit der T4-DNA-Polymerase (hergestellt durch Takara Shuzo Co., Ltd., Japan) behandelt, um stumpfe Enden zu formen.
  • Das DNA-Fragment, das wie oben erwähnt, erhalten wurde, wurde unter Verwendung des DNA Ligation Kit, Ver. 2 (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd., Japan) in eine runde Form selbstligiert und die kompetenten Escherichia coli-Zellen JM109 (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd., Japan) wurden danach damit transformiert. Ein Stamm, der ein Plasmid aufweist, in welchem die BamHI-Stelle entfernt wurde, wurde aus den transformierten Escherichia coli ausgewählt und als pSAK360 bezeichnet.
  • pSAK360 wurde mit dem Restriktionsenzym PvuII verdaut und anschließend mit alkalischer Phosphatase behandelt, um ein Fragment herzustellen, das an dem 5'-Ende dephosphoryliert war. Ein SalI-ScaI-Fragment (etwa 3 kb), welches eine cos-Stelle enthält, wurde aus einem Cosmid-Vektor pWE15 (hergestellt durch STRATAGENE) erhalten und mit T4-DNA-Polymerase behandelt, um ein stumpfes Ende zu formen. Es wurde anschließend an die PvuII-Stelle von pSAK360 ligiert. Die JM109-Zellen wurden mit dieser DNA transformiert. Diejenigen Bakterienstämme, die ein Plasmid aufweisen, in welches das SalI-ScaI-Fragment (etwa 3 kb) an der PvuII-Stelle eingebaut wurde, wurden aus den transformierten Escherichia coli ausgewählt und das Plasmid, das von dem Bakterienstamm in sich getragen wurde, als pSAKcos1 bezeichnet. pSAKcos1 enthält eine Schnittstelle für die Restriktionsenzyme BamHI, EcoRI und NotI, wobei jede Stelle aus pWE15 abstammt. Das pSAKcos1 weist ein Ampicillin-Resistenzgen und ein Hygromycin-Resistenzgen als Selektionsmarker auf.
  • In den nachfolgenden Beispielen, wo Escherichia coli als Wirt verwendet wurde, wurde die Selektion von den pSAKcos1-Transformanten oder den Transformanten von pSAKcos1, welche ein Fremdgen-Insert umfassen, durch Hinzufügen von 40 μg/ml Ampicillin (Ampicillin: hergestellt durch Sigma Corporation) zu dem entsprechenden Medium durchgeführt. Wo Penicillium citrinum SANK 13380 als Wirt verwendet wurde, wurde die Selektion von den pSAKcos1-Transformanten oder den Transformanten von pSAKcos1, welche ein Fremdgen-Insert umfassen, durch Hinzufügen von 200 μg/ml Hygromycin (Hygromycin B: hergestellt durch Sigma Corporation) zu dem entsprechenden Medium durchgeführt.
  • Das Verfahren zur Konstruktion von pSAKcos1 ist in 1 dargestellt.
  • Beispiel 2: Präparation von genomischer DNA aus Penicillium citrinum SANK 13380
  • 1) Kultur von Penicillium citrinum SANK 13380
  • Eine Saatkultur aus Penicillium citrinum SANK 13380 wurde von einer Schrägkultur aus PGA-Agarmedium hergestellt. Dazu wurde der Agar mit Penicillium citrinum SANK 13380 unter Verwendung einer Platinnadel inokuliert und bei 26°C für 14 Tage gehalten. Die Schrägkultur wurde bei 4°C gehalten.
  • Die Hauptkultivierung wurde in einer durchlüfteten Flüssigkultur durchgeführt. Zellen von einem 5 mm großen Quadrat von der oben erwähnten Schrägkultur wurden in 50 ml MBG3-8 Medium in einen 500 ml Erlenmeyerkolben inokuliert und unter Schütteln mit 210 min–1 bei 26°C für fünf Tage inkubiert.
  • 2) Präparation von genomischer DNA aus Penicillium citrinum SANK 13380
  • Die in Schritt 1) erhaltene Kultur wurde bei 10.000 × G bei Raumtemperatur für 10 Minuten zentrifugiert und die Zellen wurden geerntet. 3 g (Feuchtgewicht) der Zellen wurden in einem Mörser, welcher mit Trockeneis gekühlt war, zermahlen, bis sie in der Form eines Pulvers vorlagen. Die gemahlenen Zellen wurden in ein Zentrifugenröhrchen mit 20 ml 62,5 mM EDTA·2Na (hergestellt durch Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) – 5% (w/v) SDS – 50 mM Tris-Salzsäure-(hergestellt durch Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)Puffer (pH 8,0), hinzugefügt und schonend gemischt, danach wurden sie bei 0°C für eine Stunde stehen lassen. Es wurden 10 ml Phenol, gesättigt mit 10 mM Tris-Salzsäure – 0,1 mM EDTA·2Na (pH 8,0; nachfolgend hierin als „TE" bezeichnet) dazu gegeben und die Mischung vorsichtig bei 50°C für eine Stunde gerührt.
  • Nach der Zentrifugation bei Raumtemperatur mit 10.000 × G für 10 Minuten wurden 15 ml von der oberen Schicht (Wasserphase) in ein weiteres Zentrifugenröhrchen gegeben. Zu dieser Lösung wurden das 0,5-fache des Volumens an mit TE gesättigtem Phenol und das 0,5-fache des Volumens einer Chloroform-Lösung hinzugefügt. Die Mischung wurde für zwei Minuten gerührt und dann bei Raumtemperatur mit 10.000 × G für 10 Minuten zentrifugiert (nachfolgend hierin als „Phenol-Chloroform-Extraktion" bezeichnet). Zu 10 ml von der oberen Schicht (Wasserphase) wurden 10 ml 8 M Ammoniumacetat (pH 7,5) und 25 ml 2-Propanol (hergestellt durch Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) hinzugefügt, gefolgt durch Kühlen bei –80°C für 15 Minuten und einer Zentrifugation bei 4°C bei 10.000 × G für 10 Minuten.
  • Nach der Präzipitation wurden die Präzipitate in 5 ml TE aufgelöst, wonach 20 μl von 10 mg/ml Ribonuclease A (hergestellt durch Sigma Corporation) und 250 Einheiten Ribonuclease T1 (hergestellt durch GIBCO Corporation) dazu hinzugefügt wurden, gefolgt durch eine Inkubation bei 37°C für 20 Minuten. Dazu wurden 20 ml 2-Propanol hinzugefügt und schonend gemischt. Anschließend wurden Fäden von genomischer DNA mit der Spitze von einer Pasteur-Pipette aufgewickelt und in einem ml TE aufgelöst.
  • Als nächstes wurde das 0,1-fache des Volumens an 3 M Natriumacetat (pH 6,5) und das 2,5-fache des Volumens an Ethanol zu der DNA-Lösung hinzugefügt. Die Lösung wurde bei –80°C für 15 Minuten gekühlt und danach bei 4°C mit 10.000 × G für fünf Minuten zentrifugiert (nachfolgend hierin als „Ethanolfällung" bezeichnet). Das sich ergebende Präzipitat wurde in 200 μl TE aufgelöst und als eine Fraktion mit genomischer DNA angesehen.
  • Beispiel 3: Herstellung einer genomischen DNA-Bibliothek aus Penicillium citrinum SANK 13380
  • 1) Herstellung von Fragmenten genomischer DNA
  • Es wurden 0,25 Einheiten von Sau3AI (Takara Shuzo Co., Ltd., Japan) zu 100 μl von einer wässrigen Lösung mit genomischer DNA (50 μg) aus Penicillium citrinum SANK 13380, die in Beispiel 2 erhalten wurde, hinzugefügt. Nach Intervallen von 10, 30, 60, 90 und 120 Sekunden wurden 20-μl Proben aus der Mischung entnommen und 0,5 M EDTA (pH 8,0) wurden zu jeder Probe hinzugefügt, um die Reaktion des Restriktionsenzyms zu beenden. Die resultierenden, teilweise verdauten DNA-Fragmente wurden über Agarose-Gel-Elektrophorese aufgetrennt und das Agarose-Gel, das DNA-Fragmente von 30 kb oder größer enthielt, wurde gewonnen.
  • Das gewonnene Gel wurde fein zerkleinert und in eine Ultra Free C3 Centrifuged Filtration Unit (hergestellt durch Japan Millipore Corporation) gegeben. Das Gel wurde bei –80°C für 15 Minuten bis es gefroren war gekühlt und dann wurde das Gel geschmolzen, indem es bei 37°C für 10 Minuten inkubiert wurde. Um die DNA zu extrahieren, wurde es bei 5.000 × G für 5 Minuten zentrifugiert. Die DNA wurde einer Phenol-Chloroform-Extraktion und einer Ethanolfällung unterworfen. Die sich ergebenden Präzipitate wurden in einer zweckmäßigen Menge an TE aufgelöst.
  • 2) Vorbehandlung des DNA-Vektors pSAKcos1
  • pSAKcos1 wurde mit dem Restriktionsenzym BamHI (Takara Shuzo Co., Ltd., Japan) verdaut und danach einer Behandlung mit alkalischer Phosphatase (Takara Shuzo Co., Ltd., Japan) bei 65°C für 30 Minuten unterworfen. Die sich ergebende Reaktionslösung wurde einer Phenol-Chloroform-Extraktion und einer Ethanolfällung unterworfen. Das sich ergebende Präzipitat wurde in einer kleinen Menge an TE aufgelöst.
  • 3) Ligation und in vitro-Verpackung
  • Das genomische DNA-Fragment (2 μg), das in dem obigen Schritt 1) beschrieben wurde, und pSAKcos1 (1 μg), welches einer Vorbehandlung wie oben unterworfen wurde, werden gemischt und sodann bei 16°C für 16 Stunden unter Verwendung des DNA-Ligations-Kits Ver. 2 (Takara Shuzo Co., Ltd., Japan) ligiert. Die sich ergebende Reaktionslösung wurde einer Phenol-Chloroform-Extraktion und einer Ethanolfällung unterworfen. Das sich ergebende Präzipitat wurde in 5 μl TE aufgelöst. Die Lösung mit dem Ligationsprodukt wurde der in vitro-Verpackung unter Verwendung des GIGAPAK II Gold Kit (hergestellt durch STRATAGENE Corporation) unterworfen, um Escherichia coli-Transformanten bereitzustellen, die einen rekombinanten DNA-Vektor enthalten. Es wurden 3 ml LB-Medium auf eine Platte gegossen, auf der sich Kolonien aus Escherichia coli-Transformanten gebildet hatten und dann wurden die Kolonien auf der Platte unter Verwendung von einem Zellschaber gewonnen (nachfolgend hierin als „gewonnene Lösung 1" bezeichnet). Die Platte wurde mit weiteren 3 ml an LB-Medium gewaschen und die Zellen gewonnen (als „gewonnen Lösung 2" bezeichnet). Glycerol wurde zu den gewonnenen Lösungen 1 und 2 hinzugefügt, um eine Endkonzentration von 18% zu erreichen (bezeichnet als Escherichia coli-Zelllösung), welche bei –80°C als eine genomische DNA-Bibliothek von Penicillium citrinum SANK 13380 aufbewahrt wurden.
  • Beispiel 4: Amplifikation eines PKS-Genfragments durch PCR unter Verwendung von genomischer DNA aus Penicillium citrinum SANK 13380 als Matrize
  • 1) Entwurf und Synthese von Primern für die PCR.
  • Basierend auf der Aminosäuresequenz von einem PKS-Gen aus Aspergillus flavus (beschrieben in Brown, D. W., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 1418 (1996)) wurden degenerierte Primer, welche in den SEQ-ID Nr.: 3 und 4 von der Auflistung der Sequenzen dargestellt werden, konstruiert und synthetisiert. Die Synthese wurde gemäß der Phosphoamidit-Methode durchgeführt.
    • SEQ-ID Nr.: 3 von der Auflistung der Sequenzen: gayacngcntgyasttc
    • SEQ-ID Nr.: 4 von der Auflistung der Sequenzen: tcnccnknrcwgtgncc
  • In der Nucleotidsequenz von SEQ-ID Nr. 3 und 4 steht n für Inosin (Hypoxanthin), y steht für t oder c, s steht für g oder c, k steht für g oder t, r steht für g oder a und w steht für a oder t.
  • 2) Amplifikation von DNA-Abschnitten durch PCR
  • Es wurden 50 μl von einer Reaktionslösung hergestellt, welche die Primer für die PCR (jeweils 100 pmol), die in dem obigen Schritt 1) beschrieben wurden, die genomische DNA aus Penicillium citrinum SANK 13380, welche in Beispiel 2 erhalten wurde (500 ng), 0,2 mM dATP, 0,2 mM dCTP, 0,2 mM dGTP, 0,2 mM dTTP, 50 mM Kaliumchlorid, 2 mM Magnesiumchlorid und 1,25 Einheiten von Ex.-Tac DNA-Polymerase (Takara Shuzo Co., Ltd., Japan) enthält. Die Reaktionslösung wurde einem Reaktionszyklus unterworfen, der aus drei aufeinanderfolgenden Schritten wie folgt besteht: eine Minute bei 94°C, zwei Minuten bei 58°C und 3 Minuten bei 70°C. Der Zyklus wurde 30 mal wiederholt, um das DNA-Fragment zu amplifizieren. Die PCR wurde unter Verwendung des TaKaRa PCR Thermal Cycler MP TP 3000 (hergestellt durch Takara Shuzo Co., Ltd., Japan) durchgeführt.
  • Die amplifizierten DNA-Fragmente wurden einer Agarose-Gel-Elektrophorese unterworfen und danach wurde Agarose mit Stücke DNA-Fragmente mit einer Größe von etwa 1,0 bis 2,0 kb gewonnen. Die DNA wurde aus dem Gel gewonnen und einer Phenol-Chloroform-Extraktion und einer Ethanolfällung unterworfen. Das sich ergebende Präzipitat wurde in einer kleinen Menge an TE aufgelöst.
  • 3) Ligation und Transformation
  • Das DNA-Fragment, welches in Schritt 2) erhalten wurde, wurde an das Plasmid pCR2.1 unter Verwendung des TA-Klonierungs-Systems pCR2.1 (hergestellt durch Invitrogen Corporation) ligiert, wobei das Plasmid als Teil von dem Kit bereitgestellt wurde. Das Plasmid wurde in Escherichia coli JM109 transformiert, um Transformanten zu erhalten.
  • Mehrere Kolonien wurden aus den sich ergebenden Transformanten ausgewählt und gemäß zu der Methode von Maniatis et al. [beschrieben in Maniatis, T., et al., Molecular cloning, a laboratory manual, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989)] kultiviert. Dazu wurde jede einzelne von den Kolonien in ein 24-ml Teströhrchen, das 2 ml LB-Medium enthielt, inokuliert und dann bei 37°C für 18 Stunden unter Schütteln inkubiert.
  • Ein rekombinanter DNA-Vektor wurde aus der Kultur gemäß der alkalischen Methode (beschrieben in Maniatis, T., et al., supra) hergestellt. Dazu wurden 1,5 ml von der Kulturlösung bei Raumtemperatur mit 10.000 × G für zwei Minuten zentrifugiert. Die Zellen wurden dann aus dem Niederschlag gewonnen. Zu den Zellen wurden 100 μl von einer Lösung aus 50 mM Glucose, 25 mM Tris-Salzsäure, 10 mM EDTA (pH 8,0) hinzugefügt, um eine Suspension zu formen. Dazu wurden 200 μl 0,2 N Natriumhydroxid – 1% (w/v) SDS hinzugefügt. Die Suspension wurde schonend gerührt, um die Mikroorganismen zu lysieren. Danach wurden 150 μl 3 M Kaliumacetat – 11,5% (w/v) Essigsäure hinzugefügt, um jegliches Protein zu denaturieren, gefolgt durch eine Zentrifugation bei Raumtemperatur mit 10.000 × G für 10 Minuten. Der Überstand wurde gewonnen. Dann wurde der Überstand einer Phenol-Chloroform-Extraktion und einer Ethanolfällung unterworfen. Das sich ergebende Präzipitat wurde in 50 μl TE, das 40 μg/ml Ribonuclease A (hergestellt durch Sigma Corporation) enthält, aufgelöst.
  • Jeder von den rekombinanten DNA-Vektoren wurde mit den Restriktionsenzymen verdaut und einer Elektrophorese unterworfen. Die Nucleotidsequenzen von den DNA-Inserts in den rekombinanten DNA-Vektoren wurden unter Verwendung von einem DNA-Sequenzer (Modell 377: hergestellt durch Perkin Elmer Japan) für alle Inserts, welche unterschiedliche Verdauungsmuster bei der Elektrophorese aufwiesen, bestimmt.
  • Auf diese Art und Weise wurde ein Transformant identifiziert, welcher einen rekombinanten DNA-Vektor aufweist, der ein PKS-Fragment enthält, das aus Penicillium citrinum erhalten wurde.
  • Beispiel 5: Genomische Southern-Blot-Hybridisierung von Penicillium citrinum SANK 13380
  • 1) Elektrophorese und Transfer auf die Membran
  • Die genomische DNA (10 μg) aus Penicillium citrinum SANK 13380, die in Beispiel 2 erhalten wurde, wurde mit den Restriktionsenzymen EcoRI, SalI, HindIII oder SacI (alle hergestellt durch Takara Shuzo Co., Ltd., Japan) verdaut und danach einer Agarose-Gel-Elektrophorese unterworfen. Das Gel wurde unter Verwendung von Agarose L03 „TAKARA" (Takara Shuzo Co., Ltd., Japan) hergestellt. Nach der Elektrophorese wurde das Gel in 0,25 N Salzsäure (hergestellt durch Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) eingetaucht und bei Raumtemperatur für 10 Minuten unter leichtem Schütteln inkubiert. Das Gel wurde in 0,4 N Natriumhydroxid (hergestellt durch Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) überführt und schonend bei Raumtemperatur für 30 Minuten inkubiert. Unter Verwendung der alkalischen Transfer-Methode von Maniatis et al. (supra), wurde die DNA anschließend auf eine Nylonmembran HybondTM-N+ (hergestellt durch Amersham Corporation) überführt und daran fixiert. Die Membran wurde mit 2 × SSC (1 × SSC enthält 150 mM NaCl, 15 mM Natriumcitrat) gewaschen und dann an der Luft getrocknet.
  • 2) Hybridisierung und Nachweis des Signals
  • Die Membran, welche in Schritt 1) erhalten wurde, wurde mit dem PKS-Genfragment, das in Beispiel 4 erhalten wurde, als eine Sonde hybridisiert.
  • Für die Sonde wurde 1 μg von dem Insert der PKS-Genfragment-DNA, welche in Beispiel 4 erhalten wurde, mit einem DIG DNA-Labeling Kit (hergestellt durch Boehringer-Mannheim) markiert und dann direkt vor der Verwendung für 10 Minuten erhitzt und danach schnell abgekühlt.
  • Die Membran, welche in Schritt 1) beschrieben wurde, wurde in Hybridisierungs-Flüssigkeit (DIG Easy Hyb: hergestellt durch Boehringer-Mannheim) eingetaucht und anschließend einer Vorhybridisierung durch Schütteln bei 20 min–1 bei 42°C für 2 Stunden unterworfen. Dann wurde die oben erwähnte markierte Sonde zu der Hybridisierungs-Flüssigkeit hinzugefügt und die Hybridisierung unter Schütteln bei 20 min bei 42°C für 18 Stunden unter Verwendung eines Multishaker Oven HB (hergestellt durch TAITEC Corporation) hybridisiert. Die Membran, welche der Hybridisierung unterworfen war, wurde dann einem dreimaligen Waschen unter Verwendung von 2 × SSC bei Raumtemperatur für 20 Minuten und zweimaligem Waschen unter Verwendung von 0,1 × SSC bei 55°C für 30 Minuten unterzogen.
  • Die gewaschene Membran wurde mit dem DIG Luminescent Detection Kit for Nucleic Acids (hergestellt durch Boehringer-Mannheim) behandelt und zu einem Röntgenfilm (Lumifilm, Boehringer-Mannheim) exponiert. Die Exposition wurde unter Verwendung des Fuji Medical Film Processor FPM 800A (hergestellt durch Fuji Film Corporation) durchgeführt.
  • Es konnte als Ergebnis bestätigt werden, dass das PKS-Genfragment, welches in Beispiel 4 erhalten wurde, auf dem Genom von Penicillium citrinum vorhanden war.
  • Beispiel 6: Überprüfen der genomischen DNA-Bibliothek von Penicillium citrinum SANK 13380 unter Verwendung des PKS-Genfragmentes als Sonde
  • Die Klonierung von einem genomischen DNA-Fragment, das ein PKS-Gen enthält, wurde unter Verwendung eines Kolonie-Hybridisierungs-Verfahrens durchgeführt.
  • 1) Herstellung der Membran
  • Die Escherichia coli-Zelllösung, welche als eine genomische DNA-Bibliothek von Penicillium citrinum SANK 13380 (beschrieben in Beispiel 3) aufbewahrt wurde, wurde verdünnt und auf einer Platte aus LB-Agarmedium derart verteilt, dass 5.000 bis 10.000 Kolonien pro Platte wachsen können. Die Platte wurde für 18 Stunden bei 26°C gehalten und dann bei 4°C für eine Stunde abgekühlt. HybondTM-N+ (hergestellt durch Amersham Corporation) wurde auf die Platte platziert und mit ihr für eine Minute in Kontakt gebracht. Die Membran, an der die Kolonien anhaften, wurde sorgfältig von der Platte heruntergenommen. Die Fläche, welche mit den Kolonien in Kontakt gewesen ist, wurde nach oben gedreht und die Membran in 200 ml einer Lösung aus 1,5 M Natriumchlorid, 0,5 N Natriumhydroxid für 7 Minuten eingetaucht und danach in 200 ml einer Lösung aus 1,5 M Natriumchlorid, 0,5 M Tris-Salzsäure, 1 mM EDTA (pH 7,5) für jeweils 3 Minuten zweimal eingetaucht und dann mit 400 ml 2 × SSC gewaschen. Die gewaschene Membran wurde für 30 Minuten an der Luft getrocknet.
  • 2) Hybridisierung
  • Die DNA (1 μg) von dem Insert des PKS-Gens, welche in Beispiel 4 erhalten wurde, wurde als Sonde verwendet. Die DNA wurde unter Verwendung eines DIG DNA-Labeling-Kit (hergestellt durch Boehringer-Mannheim) markiert und dann für 10 Minuten erhitzt und unmittelbar vor der Verwendung schnell abgekühlt.
  • Die Membran, welche in Schritt 1) beschrieben wurde, wurde in Hybridisierungs-Flüssigkeit (DIG Easy Hyb: hergestellt durch Boehringer-Mannheim) eingetaucht und anschließend einem Vorhybridisierungs-Waschschritt bei 20 min–1 bei 42°C für 2 Stunden unterworfen. Dann wurde die oben erwähnte markierte Sonde zu der Hybridisierungs-Flüssigkeit hinzugefügt und die Hybridisierung bei 20 min–1 bei 42°C für 18 Stunden unter Verwendung eines Multishaker Oven HB (hergestellt durch TAITEC Corporation) hybridisiert. Die Membran, welche der Hybridisierung unterworfen war, wurde einem dreimaligen Waschen unter Verwendung von 2 × SSC bei Raumtemperatur für 20 Minuten und zweimaligem Waschen unter Verwendung von 0,1 × SSC bei 68°C für 30 Minuten unterzogen.
  • Die gewaschene Membran wurde mit dem DIG Luminescent Detection Kit for Nucleic Acids (hergestellt durch Boehringer-Mannheim) behandelt und zu einem Röntgenfilm (Lumifilm, Boehringer-Mannheim) exponiert. Die Exposition wurde unter Verwendung des Fuji Medical Film Processor FPM 800A (hergestellt durch Fuji Film Corporation) durchgeführt.
  • Die oben erwähnten Schritte 1) und 2) werden als Überprüfung bezeichnet.
  • Die Kolonien auf der Platte, von denen ein positives Signal bei der ersten Überprüfung nachgewiesen wurde, wurden abgeschabt und die gewonnen Zellen in LB-Medium suspendiert. Dann wurden die Zellen zweckentsprechend verdünnt und auf einer geeigneten Platte verteilt. Anschließend wurde eine zweite Überprüfung durchgeführt, um die positiven Klone zu reinigen.
  • Der positive Klon, welcher in dem vorliegenden Beispiel erhalten wurde, nämlich die transformierten Escherichia coli, der Escherichia coli pML48 SANK 71199-Stamm, wurde in dem Research Institute of Life Science and Technology of the Agency of Industrial Science and Technology am 07. Juli 1999 unter der Depotnummer FERM BP-6780 in Übereinstimmung mit dem Budapester Vertrag über die Hinterlegung von Mikroorganismen hinterlegt.
  • Beispiel 7: Analyse von der eingebauten Sequenz von einem rekombinanten DNA-Vektor pML48 (1)
  • Die Kultivierung von Stamm Escherichia coli pML48 SANK 71199, welcher in Beispiel 6 erhalten wurde, und die Herstellung von einem rekombinanten DNA-Vektor aus der Kultur wurden auf eine ähnliche Art und Weise wie in Beispiel 4 durchgeführt.
  • Der erhaltene DNA-Vektor wurde als pML48 bezeichnet. Das Insert von pML48, welches eine mit der ML-236B-Biosynthese in Zusammenhang stehende genomische DNA ist, wurde mit unterschiedlichen Restriktionsenzymen verdaut und die sich ergebenden Fragmente in pUC119 (hergestellt durch Takara Shuzo Co., Ltd., Japan) subkloniert. Es wurde, unter Verwendung der sich ergebenden Subklone als Sonden, eine Southern-Blot-Hybridisierung mit einem ähnlichen Verfahren, wie zu dem in Beispiel 5 beschriebenen, durchgeführt. Es wurden dazu nämlich die Produkte, welche durch den Verdau von pML48 mit unterschiedlichen Restriktionsenzymen erhalten wurden, einer Elektrophorese unterworfen und die DNAs auf eine Membran transferiert und eine Hybridisierung durchgeführt. Als Ergebnis wurde unter der Verwendung von Techniken, die Standard auf dem Fachgebiet sind, eine Karte der Restriktionsenzym-Schnittstellen von der eingebauten Sequenz von pML48 hergestellt.
  • Die Nucleotidsequenz von der eingebauten Sequenz von jedem der Subklone wurde unter Verwendung des DNA-Sequenzers Modell 377 (hergestellt durch Perkin Elmer Japan Co., Ltd.) bestimmt, gefolgt von der Ermittlung von der vollständigen Nucleotidsequenz von pML48.
  • Die eingebaute Sequenz von pML48 bestand insgesamt aus 34.203 Basen.
  • Die Nucleotidsequenz von der eingebauten Sequenz von pML48 ist in SEQ-ID Nr.: 1 und 2 von der Auflistung der Sequenzen beschrieben. Die Sequenzen, welche in SEQ-ID Nr.: 1 und 2 von der Auflistung der Sequenzen beschrieben werden, sind zueinander vollständig komplementär.
  • Das Vorhandensein von Strukturgenen auf der pML48-Insert-Sequenz wurde unter Verwendung von einem Gen-Suchprogramm GRAIL (ApoCom GRAIL Toolkit: produziert durch Apocom Corporation) und von einem Homologie-Suchprogramm BLAST (Gapped-BLAST (BLAST2): installiert in WISCONSIN GCG Software-Version 10.0) analysiert.
  • Als Ergebnis konnte die Existenz von sechs unterschiedliche Strukturgene in der eingebauten Sequenz von pML48 prognostiziert werden und diese wurden mit mlcA, mlcB, mlcC, mlcD, mlcE, beziehungsweise mlcR bezeichnet. Darüber hinaus wurde vorausberechnet, dass mlcA, mlcB, mlcE und mlcR einen codierenden Bereich auf der Nucleotidsequenz von SEQ-ID Nr.: 2 aus der Auflistung der Sequenzen aufweisen, und mlcC und mlcD einen codierenden Bereich auf der Nucleotidsequenz von SEQ-ID Nr.: 1 aus der Auflistung der Sequenzen aufweisen. Die relative Position und die Länge von jedem der vermuteten Strukturgene von der eingebauten Sequenz wurde ebenfalls vorausberechnet.
  • Die Ergebnisse von dem vorliegenen Beispiel sind in 2 dargestellt. Jeder Pfeil kennzeichnet die Lokalisation, die Richtung und die relative Größe von jedem Strukturgen auf dem pML48-Insert. Ein Pfeil, welcher nach der linken Seite zeigt, weist darauf hin, dass der codierende Bereich von einem Strukturgen (mlcA, B, E oder R) auf SEQ-ID Nr.: 2 existiert. Ein Pfeil, welcher nach der rechten Seite zeigt, weist darauf hin, dass der codierende Bereich von einem Strukturgen (mlcC oder D) auf SEQ-ID Nr.: 1 existiert.
  • Beispiel 8: Analyse von der eingebauten Sequenz von einem rekombinanten DNA-Vektor pML48 (2)
  • Die Analyse der Expression von den Strukturgenen, deren Existenz in Beispiel 7 vorausberechnet worden war, wurde durch Northern-Blot-Hybridisierung und RACE durchgeführt. Eine Analyse der 5'- und der 3'-Endbereiche wurde ausgeführt.
  • 1) Präparation von Gesamt-RNA aus Penicillium citrinum SANK 13380
  • Die Zellen von einem 5 mm großen Quadrat in der Penicillium citrinum SANK 13380 Schrägkultur (beschrieben in Beispiel 2) wurden in 10 ml MGB3-8 Medium in einem 100-ml Erlenmeyerkolben inokuliert und dann bei 26°C für 3 Tage unter Schütteln inkubiert.
  • Die Präparation der Gesamt-RNA aus der Kultur wurde mittels des RNeasy Plant Mini Kit (hergestellt durch Qiagen AG), welches die Guanidin-Isothiocyanat-Methode verwendet, durchgeführt. Dazu wurde die Kultur bei Raumtemperatur mit 5.000 × G für 10 Minuten zentrifugiert, um die Zellen zurückzugewinnen. Anschließend werden 2 g (Feuchtgewicht) von den Zellen mit flüssigem Stickstoff gefroren und dann in einem Mörser fein zerkleinert, um ein Pulver zu formen. Die fein zerkleinerten Zellen werden in 4 ml von dem Puffer für die Lyse (in dem Kit enthalten) suspendiert. Es wurden 450 μl von der Suspension jeweils in eine von den 10 QIAshredder Zentrifugen-Säulen, die in dem Kit enthalten sind, hineingegossen und dann bei Raumtemperatur bei 1.000 × G für 10 Minuten zentrifugiert. Jedes von den resultierenden Eluaten wurde zurückgewonnen und jeweils 225 μl Ethanol hinzugefügt, welches dann insgesamt auf eine RNA-Minizentrifugen-Säule, die in dem Kit enthalten war, aufgetragen wurde. Die Säule wurde mit einem Puffer zum Waschen, der in dem Kit enthalten war, gewaschen, gefolgt durch eine Elution der absorbierten Stoffe von jeder Säule mit 50 μl eines Ribonuclease-freien destillierten Wassers. Das Eluat wurde als die Gesamt-RNA Fraktion verwendet.
  • 2) Northern-Blut Hybridisierung
  • Es wurde eine RNA-Probe hergestellt durch Hinzufügen von 2,25 μl von einer wässrigen Lösung, die 20 μg der Gesamt-RNA aus Penicillium citrinum SANK 13380 enthält, zu einem μl 10 × MOPS (Zusammensetzung: 200 mM 3-Morpholinopropane-sulfonsäure, 50 mM Natriumacetat, 10 mM EDTA·2Na; pH 7,0; verwendet nach Sterilisation bei 121°C für 20 Minuten in einem Autoklaven; hergestellt durch Dojinkagaku Laboratory Co., Ltd.), 1,75 μl Formaldehyd und 5 μl Formamid, gefolgt von Mischen. Die RNA-Probe wurde für 10 Minuten bei 65°C gehalten, dann schnell in Eiswasser gekühlt und einer Agarose-Gel-Elektrophorese unterworfen. Das Gel für die Elektrophorese wurde durch Mischen von 10 ml 10 × MOPS und einem Gramm Agarose L03 „TAKARA" (hergestellt durch Takara Shuzo Co., Ltd., Japan) mit 72 ml Pyrocarbonsäurediethylester-behandeltem Wasser (hergestellt durch Sigma Corporation) hergestellt, erhitzt, um die Agarose aufzulösen und dann abgekühlt, gefolgt von dem Zusatz von 18 ml Formaldehyd. Als Probenpuffer wurde 1 × MOPS (hergestellt durch Verdünnung von 10 × MOPS mit dem 10-fachen Volumen Wasser) verwendet. Die RNA in dem Gel wurde auf HybondTM-N+ (hergestellt durch Amersham Corporation) in 10 × SSC übertragen.
  • Die DNA-Fragmente a, b, c, d und e, welche durch den Verdau der eingebauten Sequenz von pML48 mit den Restriktionsenzymen 1 und 2 erhalten wurden, dargestellt in der nachfolgenden Tabelle 1, wurden als Sonden verwendet. Die Lokalisation von jeder Sonde auf dem pML48-Insert ist in dem oberen Feld von 3 dargestellt. TABELLE 1 SONDEN FÜR DIE NORTHERN-BLOT HYBRIDISIERUNG
    Sonde Restriktions-Enzym 1 Nucleotid-Nr. der Restriktionsenzym-Stelle* Restriktions-Enzym 2 Nucleotid-Nr. der Restriktionsenzym-Stelle*
    a EcoRI 6319 bis 6324 EcoRI 15799 bis 15804
    b BamHI 16793 bis 16798 PstI 18164 bis 18169
    c KpnI 26025 bis 26030 BamHI 27413 bis 27418
    d SalI 28691 bis 28696 SalI 29551 bis 29556
    e HindIII 33050 bis 33055 SacI 34039 bis 34044
    • *Jede Nucleotid-Nr. ist auf SEQ-ID Nr.: 1 von der Auflistung der Sequenzen vorhanden.
  • Die Markierung der Sonden, die Hybridisierung und der Nachweis des Signals wurden gemäß der Southern-Blot-Hybridisierung durchgeführt, wie beschrieben in Beispiel 5.
  • Die Ergebnisse von dem Beispiel sind in dem unteren Feld von 3 dargestellt.
  • Jedes Signal zeigt das Vorhandensein von einem Transkriptionsprodukt an, welches homolog zu der Nucleotidsequenz von jeder Sonde ist.
  • Die Ergebnisse lassen vermuten, dass die Strukturgene, deren Existenz in der eingebauten Sequenz von pML48 in dem vorliegenden Beispiel prognostiziert wurde, nämlich mlcA, mlcB, mlcC, mlcD, mlcE und mlcR, in Penicillium citrinum SANK 13380 transkribiert waren.
  • Die Position von jedem Signal zeigt nicht die relative Größe von dem Transkriptionsprodukt.
  • 3) Bestimmung der Sequenz des 5'-Endes mittels 5'-RACE
  • Die cDNA, die den 5'-Endbereich von jedem Strukturgen enthält, wurde unter Verwendung des 5'-RACE-Systems für die schnelle Amplifikation von cDNA-Enden, Version 2.0 (hergestellt durch GIBCO Corporation) erhalten.
  • Zwei Arten von Antisense-Oligonucleotid-DNAs wurden hergestellt. Die Konstruktion basierte auf der Nucleotidsequenz, von der vermutet wurde, dass sie in dem codierenden Bereich und nahe bei dem 5'-Ende von jedem Strukturgen in der eingebauten Sequenz von pML48 liegt, wie durch die Ergebnisse von Beispiel 7 und der Position 2) des vorliegenden Beispiels vorausberechnet wurde.
  • Die Nucleotidsequenz von der Antisense-Oligonucleotid-DNA (1), welche, basierend auf der Nucleotidsequenz an der Seite von dem 3'-Ende von jedem Strukturgen konstruiert wurde, ist in Tabelle 2 dargestellt. Die Nucleotidsequenz von der Antisense-Oligonucleotid-DNA (2), welche, basierend auf der Nucleotidsequenz an der Seite von dem 5'-Ende von jedem Strukturgen konstruiert wurde, ist in Tabelle 3 dargestellt. TABELLE 2: OLIGONUCLEOTID-DNA (1), DIE FÜR DIE BESTIMMUNG DER SEQUENZ DES 3'-ENDES MITTELS 5'-RACE VERWENDET WURDE
    Figure 00360001
    TABELLE 3: OLIGONUCLEOTID-DNA (2), DIE FÜR DIE BESTIMMUNG DER SEQUENZ DES 5'-ENDES MITTELS 5'-RACE VERWENDET WURDE
    Figure 00360002
  • Der erste Strang der cDNA wurde gemäß einer reversen Transkriptions-Reaktion unter Verwendung der Oligonucleotid-DNA (1) als Primer und der Gesamt-RNA von Penicillium citrinum SANK 13380 als Matrize synthetisiert. Dazu wurden 24 μl von der Reaktionsmischung, welche ein μg Gesamt-RNA, 2,5 pmol Oligonucleotid-DNA (1) und einen μl von SUPER SCRIPTTM II Reverse Transkriptase (in dem Kit enthalten) enthält, bei 16°C für eine Stunde inkubiert und das Reaktionsprodukt wurde in eine GLASS-MAX-Zentrifugen-Kartusche, die in dem Kit enthalten war, hineingegeben, um den ersten Strang von der cDNA zu reinigen.
  • Eine Poly-C-Kette wurde an das 3'-Ende von der Erststrang-cDNA unter Verwendung der terminalen Deoxyribonucleotid-Transferase, die in dem Kit enthalten ist, angehängt.
  • Es wurden 50 μl von der Reaktionsmischung, welche den ersten Strang der cDNA enthält, an dessen 3'-Ende die Poly-C-Kette angehängt worden war, mit 40 pmol Oligonucleotid-DNA (2) und 40 pmol Abriged Anchor Primer (in dem Kit enthalten) gemischt, gefolgt durch eine Inkubation bei 94°C für zwei Minuten. Der Inkubationszyklus von 30 Sekunden bei 94°C, 30 Sekunden bei 55°C und zwei Minuten bei 72°C wurde dann 35 mal wiederholt, gefolgt durch eine Inkubation bei 72°C für fünf Minuten und bei 4°C für 18 Stunden. Das sich ergebende Produkt wurde einer Agarose-Gel-Elektrophorese unterworfen und die DNA wurde aus dem Gel gewonnen. Das Produkt wurde durch Phenol-Chloroform-Extraktion und Ethanolfällung gereinigt und in der ähnlichen Art und Weise zu einer Methode, welche in Beispiel 4 unter Verwendung von pCR2.1 beschrieben wurde, kloniert.
  • Der oben beschriebene Arbeitsvorgang wird als 5'-RACE bezeichnet.
  • Die Nucleotidsequenz von dem cDNA-Fragment, welches das 5'-Ende enthält, wurde bestimmt und die Position von dem Transkriptions-Initiationspunkt und dem Transkriptions-Initiations-Codon wurden vorausberechnet.
  • Tabelle 4 zeigt die SEQ-ID Nr., in welcher die Nucleotidsequenz von dem 5'-Ende des cDNA-Fragments, die jedem einzelnen Strukturgen entspricht, das durch 5'-RACE erhalten wurde, beschrieben wird. Tabelle 5 stellt die SEQ-ID Nr. dar, in welcher der Transkriptions-Initiationspunkt und der Translations-Initiationspunkt von jedem Strukturgen vorhanden ist, und die Position von dem Transkriptions-Initiationspunkt und dem Translations-Initiationspunkt. TABELLE 4: SEQ-ID NUMMERN, IN DENEN DIE NUCLEOTIDSEQUENZ DES 5'-END cDNA- FRAGMENTS NACHGEWIESEN IST
    Gen SEQ-ID Nr.: der Auflistung der Sequenzen
    mlcA SEQ-ID Nr.: 17
    mlcB SEQ-ID Nr.: 18
    mlcC SEQ-ID Nr.: 19
    mlcD SEQ-ID Nr.: 20
    mlcE SEQ-ID Nr.: 21
    mlcR SEQ-ID Nr.. 22
    TABELLE 5: POSITION DES TRANSKRIPTIONS-INITIATIONSPUNKTES UND DES TRANSLATIONS-INITIATIONSPUNKTES VON JEDEM GEN
    Gen SEQ-ID Nr.: wo der Translations-Initiations-Codon vorkommt Nucleotid-Nummer in SEQ-ID Nr.: 1 oder SEQ-ID Nr.: 2
    Transkriptions-Initiations-Punkt Translations-Initiations-Codon
    mlcA SEQ-ID Nr.: 2 22913 23045 bis 23047
    mlcB SEQ-ID Nr.: 2 11689 11748 bis 11750
    mlcC SEQ-ID Nr.: 1 11631 11796 bis 11798
    mlcD SEQ-ID Nr.: 1 24066 24321 bis 24323
    mlcE SEQ-ID Nr.: 2 3399 3545 bis 3547
    mlcR SEQ-ID Nr.: 2 365 400 bis 402
    • *Die Nucleotidsequenzen, gezeigt in SEQ-ID Nr.: 1 und 2 der Auflistung der Sequenzen, sind zueinander vollständig komplementär.
  • 4) Bestimmung der Sequenz des 3'-Endes mittels 3'-RACE
  • cDNA, die den 3'-Endbereich von jedem Strukturgen enthält, wurde unter Verwendung des Ready-To-Go: T-Primed First-Strand Kit (hergestellt durch Pharmacia Corporation) erhalten.
  • Eine Art der Sense-Oligonucleotid-DNA (3), von der vermutet wurde, dass sie in dem codierenden Bereich und nahe bei dem 3'-Ende von jedem Strukturgen in der eingebauten Sequenz von pML48 liegt, wurde hergestellt, vorausberechnet durch die Ergebnisse von Beispiel 7 und der Position 2) des vorliegenden Beispiels.
  • Die Nucleotidsequenz von der Oligonucleotid-DNA (3), die für jedes Strukturgen hergestellt wurde, ist in Tabelle 6 dargestellt. TABELLE 6: OLIGONUCLEOTID-DNA (3), VERWENDET FÜR DIE BESTIMMUNG DER SEQUENZ DES 3'-ENDES MITTELS 3'-RACE
    Figure 00380001
  • Der erste Strang der cDNA wurde gemäß einer reversen Transkriptions-Reaktion synthetisiert unter Verwendung des NotI-d(T)18 Primer (enthalten in dem Kit) und der Gesamt-RNA von Penicillium citrinum SANK 13380 (ein μg) als Matrize.
  • Es wurden 100 μl der Reaktionsmischung, die den ersten Strang der cDNA, 40 pmol Oligonucleotid-DNA (3) und NotI-d(T)18-Primer (in dem Kit enthalten) umfasst, für zwei Minuten bei 94°C gehalten.
  • Ein Inkubationszyklus von 30 Sekunden bei 94°C, 30 Sekunden bei 55°C und zwei Minuten bei 72°C wurde 35 mal wiederholt, gefolgt durch eine Inkubation bei 72°C für fünf Minuten und bei 4°C für 18 Stunden. Das sich ergebende Produkt wurde einer Agarose-Gel-Elektrophorese unterworfen und die DNA wurde aus dem Gel gewonnen. Das Produkt wurde durch Phenol-Chloroform-Extraktion und Ethanolfällung gereinigt und in der ähnlichen Art und Weise zu einer Methode, welche in Beispiel 4 unter Verwendung von pCR2.1 beschrieben wurde, kloniert.
  • Der oben beschriebene Arbeitsvorgang wird als 3'-RACE bezeichnet.
  • Die Nucleotidsequenz von der cDNA an dem 3'-Ende wurde bestimmt und die Position von dem Translations-Terminations-Codon wurde vorausberechnet.
  • Tabelle 7 zeigt die SEQ-ID Nr. von der Auflistung der Sequenzen, in welcher die Nucleotidsequenz von dem 3'-Ende des cDNA-Fragments, die jedem einzelnen Strukturgen entspricht, das durch 3'-RACE erhalten wurde, beschrieben wird. Tabelle 8 zeigt das Translations-Terminations-Codon und die Position des Codons, basierend auf den SEQ-ID Nummern 1 und 2 der Auflistung der Sequenzen. TABELLE 7: SEQ-ID NUMMERN, IN DENEN DIE NUCLEOTIDSEQUENZ DES 3'-END cDNA- FRAGMENTS VORHANDEN SIND
    Gen SEQ-ID Nr.: der Auflistung der Sequenzen
    mlcA SEQ-ID Nr.: 29
    mlcB SEQ-ID Nr.: 30
    mlcC SEQ-ID Nr.: 31
    mlcD SEQ-ID Nr.: 32
    mlcE SEQ-ID Nr.: 33
    mlcR SEQ-ID Nr.: 34
    TABELLE 8: TRANSLATIONS-TERMINATIONS-CODON UND POSITION VON DEM TRANSLATIONS-TERMINATIONS-CODON VON JEDEM STRUKTURGEN
    Gen Translations-Terminations-Codon SEQ-ID Nr.: wo das Translations-Terminations-Codon vorhanden ist Nucleotid-Nr. von dem Translations-Terminations-Codon in SEQ-ID Nr.: 1 oder SEQ-ID Nr.: 2
    mlcA tag SEQ-ID Nr.: 2 32723 bis 32725
    mlcB taa SEQ-ID Nr.: 2 19840 bis 19842
    mlcC taa SEQ-ID Nr.: 1 13479 bis 13481
    mlcD tga SEQ-ID Nr.: 1 27890 bis 27892
    mlcE tga SEQ-ID Nr.: 2 5730 bis 5732
    mlcR tag SEQ-ID Nr.: 2 1915 bis 1917
    • *Die Nucleotidsequenzen, gezeigt in SEQ-ID Nr. 1 und 2 der Auflistung der Sequenzen, sind zueinander vollständig komplementär.
  • Tabelle 9 zeigt den C-terminalen Aminosäure-Rest von dem Polypeptid wovon erwartet wird das es von jedem Strukturgen codiert wird, die Nucleotidsequenz von dem Trinucleotid, das den Aminosäure-Rest codiert und die Position von dem Trinucleotid. TABELLE 9: C-TERMINALER AMINOSÄURE-REST VON DEM POLYPEPTID, DAS DURCH JEDES STRUKTURGEN CODIERT WIRD
    Gen C-terminaler Aminosäure-Rest Nucleotid-sequenz des Aminosäure-codierenden Trinucleotids SEQ-ID, wo das Trinucleotid vorkommt Nucleotid-Nr. von dem Trinucleotid in SEQ-ID Nr.: 1 oder 2
    mlcA Alanin gcc SEQ-ID Nr.: 2 32720 bis 32722
    mlcB Serin agt SEQ-ID Nr.: 2 19837 bis 19839
    mlcC Cystein tgc SEQ-ID Nr.: 1 13476 bis 13478
    mlcD Arginin cgc SEQ-ID Nr.: 1 27887 bis 27889
    mlcE Alanin gct SEQ-ID Nr.: 2 5727 bis 5729
    mlcR Alanin gct SEQ-ID Nr.: 2 1912 bis 1914
    • *Die Nucleotidsequenzen, gezeigt in SEQ-ID Nr. 1 und 2 der Auflistung der Sequenzen, sind zueinander vollständig komplementär.
  • Die Tabelle 10 fasst die Sequenz, die komplementär ist zu dem in Tabelle 8 gezeigten Translations-Terminations-Codon, die SEQ-ID, wo die komplementäre Sequenz vorkommt und die Position von der komplementären Sequenz zusammen. TABELLE 10: KOMPLEMENTÄRE SEQUENZ ZU DEM TRANSLATIONS-TERMINATIONS-CODON VON JEDEM STRUKTURGEN
    Gen Komplementäre Sequenz zu dem Translations-Terminations-Codon SEQ-ID Nr.:, wo die komplementäre Sequenz vorhanden ist Nucleotid-Nr. der komplementären Sequenz in SEQ-ID Nr.: 1 oder SEQ-ID Nr.: 2
    mlcA cta SEQ-ID Nr.: 1 1479 bis 1481
    mlcB tta SEQ-ID Nr.: 1 14362 bis 14364
    mlcC tta SEQ-ID Nr.: 2 20723 bis 20725
    mlcD tca SEQ-ID Nr.: 2 6312 bis 6314
    mlcE tca SEQ-ID Nr.: 1 28472 bis 28474
    mlcR cta SEQ-ID Nr.: 1 32287 bis 32289
    • *Die Nucleotidsequenzen, gezeigt in SEQ-ID Nr. 1 und 2 der Auflistung der Sequenzen, sind zueinander vollständig komplementär.
  • Wie oben beschrieben, wurde die Position von jedem Strukturgen, die Richtung und die Position hiervon festgestellt. Basierend auf den obigen Informationen kann das Transkriptionsprodukt und das Translationsprodukt von jedem Strukturgen erhalten werden.
  • Beispiel 9: Erlangen von cDNA, die dem Strukturgen mlcE entspricht
  • 1) Herstellung der Gesamt-RNA
  • Die Gesamt-RNA von Penicillium citrinum wurde gemäß der Methode von Beispiel 8 präpariert.
  • 2) Konstruktion der Primer
  • Um eine Full-Length cDNA zu erhalten, die dem Strukturgen mlcE entspricht, das in Beispiel 8 bestimmt wurde, wurden die folgenden Primer entwickelt und synthetisiert:
    Sense-Primer 5'-gttaacatgtcagaacctctaccccc-3' (siehe SEQ-ID 35 der Auflistung der Sequenzen); und Antisense-Primer 5'-aatatttcaagcatcagtctcaggcac-3': (Siehe SEQ-ID 36 der Auflistung der Sequenzen).
  • Die Primer sind aus der Sequenz von der Upstream-Region am 5'-Ende von dem Strukturgen mlcE, beziehungsweise aus der Sequenz von der Downstream-Region an dem 3'-Ende abgeleitet. Die Synthese wurde gemäß der Phosphoamidit-Methode durchgeführt.
  • 3) RT-PCR
  • Um eine Full-Length cDNA zu erhalten, welche das Genprodukt von mlcE codiert, wurde das Takara RNA LA PCR Kit (AMV) Ver. 1.1 verwendet.
  • Spezifisch, 20 μl von einer Reaktionsmischung, die ein μg Gesamt-RNA, 2,5 pmol 9-mer Zufallsprimer (in dem Kit enthalten) und einen μl des Reverse Transkriptase-Enzyms (in dem Kit enthalten) umfasst, wurden bei 42°C für 30 Minuten inkubiert, um den ersten Strang der cDNA herzustellen. Das Reverse Transkriptase-Enzym wurde dann durch Erhitzen bei 99°C für fünf Minuten deaktiviert.
  • Es wurden 100 μl von einer zweiten Reaktionsmischung, welche die gesamte Menge von der Reaktionsmischung von dem ersten Strang der cDNA (siehe oben), 40 pmol Sense-Primer und 40 pmol Antisense-Primer umfasst, bei 94°C für zwei Minuten inkubiert. Ein Inkubationszyklus von 30 Sekunden bei 94°C, 30 Sekunden bei 60°C und zwei Minuten bei 72°C wurde 30 mal wiederholt, gefolgt durch eine Inkubation bei 72°C für fünf Minuten und bei 4°C für 18 Stunden. Das sich ergebende Produkt wurde einer Agarose-Gel-Elektrophorese unterworfen und die DNA wurde aus dem Gel gewonnen. Das Produkt wurde durch Phenol-Chloroform-Extraktion und Ethanolfällung gereinigt und verwendet, um den kompetenten Zellstamm Escherichia coli JM109 (hergestellt durch Takara Shuzo Co., Ltd., Japan) in der ähnlichen Art und Weise zu der Methode zu transformieren, welche in Beispiel 4 unter Verwendung von pCR2.1 beschrieben wurde. Ein Transformant, der ein Plasmid trägt, welches das DNA-Fragment aufweist, wurde aus den transformierten Escherichia coli ausgewählt und das Plasmid, das von dem Transformanten getragen wird, als pCRexpE bezeichnet.
  • Die Nucleotidsequenz von der eingebauten DNA des resultierenden rekombinanten DNA-Vektors pCRexpE wurde bestimmt. Die eingebaute DNA enthielt Full-Length cDNA, welche mit dem Strukturgen mlcE übereinstimmte. Die Nucleotidsequenz davon und eine Aminosäuresequenz von dem Peptid, die von der Nucleotidsequenz abgeleitet wurde, sind in SEQ-ID Nr.: 37 und/oder SEQ-ID Nr.: 38 von der Auflistung der Sequenzen dargestellt.
  • Die nächste bekannte Sequenz für mlcE (Polypeptid) war ORF10 auf dem Gencluster, der mit der Biosynthese von Lovastatin in Zusammenhang steht, mit 70% Identität.
  • Beispiel 10: Konstruktion des Expressionsvektors pSAK700
  • Der cDNA-Expressionsvektor pSAK700 wurde unter Verwendung der Vektoren pSAK333 und pSAK360, die in Beispiel 1 beschrieben sind, konstruiert.
  • pSAK333 wurde sowohl mit dem Restriktionsenzym BamHI als auch mit HindIII (hergestellt durch Takara Shuzo Co., Ltd., Japan) verdaut und dann einer Agarose-Gel-Elektrophorese unterworfen. Ein 4,1 kb Fragment wurde aus dem Gel gewonnen und die Enden von dem DNA-Fragment wurden mit T4-DNA-Polymerase (hergestellt durch Takara Shuzo Co., Ltd., Japan) stumpf gemacht.
  • Ein EcoRI-NotI-BamHI-Adapter (hergestellt durch Takara Shuzo Co., Ltd., Japan) wurde mit dem oben erwähnten DNA-Fragment unter Verwendung des DNA-Ligation Kit Ver. 2 (hergestellt durch Takara Shuzo Co., Ltd., Japan) verbunden. Der kompetente Zellstamm Escherichia coli JM109 (hergestellt durch Takara Shuzo Co., Ltd., Japan) wurde mit der ligierten DNA transformiert. Ein Transformant, der das Plasmid trägt, welches den Adapter aufweist, wurde aus den transformierten Escherichia coli ausgewählt und das Plasmid, das von dem Transformanten getragen wird, als pSAK410 bezeichnet.
  • pSAK360 wurde sowohl mit dem Restriktionsenzym PvuII als auch mit dem Restriktionsenzym SspI verdaut und der Elektrophorese unterworfen. Ein DNA-Fragment (etwa 2,9 kb), welches den Promotor und den Terminator von dem 3-Phosphoglyceratkinase-(nachfolgend hierin als „pgk" bezeichnet)Gen und von HPT, das aus Escherichia coli abstammt, enthält, wurde aus dem Gel gewonnen.
  • Das gewonnene, oben erwähnte DNA-Fragment wurde unter Verwendung des DNA-Ligation Kit Ver. 2 (hergestellt durch Takara Shuzo Co., Ltd. Japan) mit der PvuII-Stelle von pSAK410 verbunden. Der kompetente Zellstamm Escherichia coli JM109 wurde mit der ligierten DNA transformiert. Ein Transfor mant, der das Plasmid trägt, welches das DNA-Fragment aufweist, wurde aus den transformierten Escherichia coli ausgewählt und das Plasmid, das von dem Transformanten getragen wird, als pSAK700 bezeichnet.
  • Die Konstruktion von pSAK700 ist in 4 dargestellt.
  • pSAK700 weist eine Restriktionsenzym-Stelle für jedes von den Enzymen BamHI und NotI auf. PSAK700 weist ebenfalls ein Ampicillin-Resistenzgen (nachfolgend hierin als „Amp" bezeichnet) und Hygromycin-Resistenzgen HTP als Selektionsmarker auf. In den nachfolgenden Beispielen, wo Escherichia coli als Wirt verwendet worden ist, wurde die Selektion von den Zellen, welche durch pSAK700 oder durch pSAK700, die ein Fremd-DNA-Insert umfassen, transformiert waren, durch Hinzufügen von 40 μg/ml Ampicillin zu dem entsprechenden Medium durchgeführt. Wenn Penicillium citrinum SANK 13380 als Wirt verwendet worden ist, wurde die Selektion von den Zellen, welche durch pSAK700 oder durch pSAK700, die ein Fremd-DNA-Insert umfassen, transformiert waren, durch Hinzufügen von 200 μg/ml Ampicillin zu dem entsprechenden Medium durchgeführt.
  • Beispiel 11: Konstruktion des cDNA-Expressionsvektors pSAKexpE
  • Der Rekombinante DNA-Vektor pCRexpE, der in Beispiel 9 erhalten wurde, wurde bei 37°C für 2 Stunden in der Gegenwart von den Restriktionsenzymen HpaI und SspI (hergestellt durch Takara Shuzo Co., Ltd., Japan) umgesetzt und das Reaktionsprodukt einer Agarose-Gel-Elektrophorese unterworfen. Eine Bande von ungefähr 1,7 kb, welche die Full-Length cDNA von mlcE enthält, wurde aus dem Gel gewonnen.
  • Nach dem Reagieren von pSAK700 mit dem Restriktionsenzym NotI (hergestellt durch Takara Shuzo Co., Ltd., Japan) bei 37°C für eine Stunde, wurden die Enden von dem Vektor zu stumpfen Enden durch T4-DNA-Polymerase (Takara Shuzo Co., Ltd., Japan) bei 37°C für 5 Minuten umgeformt. Dann wurde der Vektor einer Phenol-Chloroform-Extraktion und einer Ethanolfällung unterworfen. Die präzipitierte DNA wurde in einer kleinen Menge an TE aufgelöst. Dazu wurde alkalische Phosphatase hinzugefügt und bei 65°C für 30 Minuten inkubiert. pSAK700, hergestellt wie oben beschrieben, wurde an das 1,7 kb DNA-Fragment ligiert, welches in Schritt 1) unter Verwendung des DNA-Ligation Kit Ver. 2 (hergestellt durch Takara Shuzo Co., Ltd., Japan) erhalten wurde. Der kompetente Zellstamm Escherichia coli JM109 wurde unter Verwendung der ligierten DNA transformiert. Es wurde so ein Escherichia coli-Transformant erhalten, der durch den cDNA-Expressionsvektor transformiert war.
  • Die transformierten Escherichia coli, bezeichnet als Escherichia coli pSAKexpE SANK 72499, welche in dem vorliegenden Beispiel erhalten wurden, wurden in dem Research Institute of Life Science and Technology of the Agency of Industrial Science and Technology am 25. Januar 2000 unter der Depotnummer FERM BP-7005 in Übereinstimmung mit dem Budapester Vertrag über die Hinterlegung von Mikroorganismen hinterlegt.
  • Beispiel 12: Erlangen von cDNA, die dem Strukturgen mlcR entspricht
  • 1) Herstellung der Gesamt-RNA
  • Die Gesamt-RNA von Penicillium citrinum wurde gemäß der Methode von Beispiel 8 präpariert.
  • 2) Konstruktion der Primer
  • Um eine Full-Length cDNA zu erhalten, die mit dem Strukturgen mlcR übereinstimmt, das in Beispiel 8 bestimmt wurde, wurden die folgenden Primer entwickelt und synthetisiert:
    Sense-Primer: 5'-ggatccatgtccctgccgcatgcaacgattc-3': (siehe SEQ-ID 39 der Auflistung der Sequenzen); und
    Antisense-Primer: 5'-ggatccctaagcaatattgtgtttcttcgc-3': (siehe SEQ-ID 40 der Auflistung der Sequenzen).
  • Die Primer wurden aus der Sequenz von der Upstream-Region am 5'-Ende von dem Strukturgen mlcR, beziehungsweise aus der Sequenz von der Downstream-Region an dem 3'-Ende konstruiert. Die Synthese wurde gemäß der Phosphoamidit-Methode durchgeführt.
  • 3) RT-PCR
  • Um eine Full-Length cDNA zu erhalten, welche das Genprodukt von mlcR kodiert, wurde ein Takara RNA LA PCR Kit (AMV) Ver. 1.1 verwendet.
  • Spezifisch, 20 μl von einer Reaktionsmischung, die ein μg Gesamt-RNA, 2,5 pmol 9-mer Zufallsprimer (in dem Kit enthalten) und einen μl des Reverse Transkriptase-Enzyms (in dem Kit enthalten) umfasst, wurden bei 42°C für 30 Minuten inkubiert, um den ersten Strang der cDNA herzustellen. Das Reverse Transkriptase-Enzym wurde dann durch Erhitzen bei 99°C für fünf Minuten deaktiviert.
  • Es wurden 100 μl von einer zweiten Reaktionsmischung, welche die gesamte Menge von der Reaktionsmischung von dem ersten Strang der cDNA (siehe oben), 40 pmol Sense-Primer und 40 pmol Antisense-Primer umfasst, bei 94°C für zwei Minuten inkubiert. Ein Inkubationszyklus von 30 Sekunden bei 94°C, 30 Sekunden bei 60°C und zwei Minuten bei 72°C wurde 30 mal wiederholt, gefolgt durch eine Inkubation bei 72°C für fünf Minuten und bei 4°C für 18 Stunden. Das sich ergebende Produkt wurde einer Agarose-Gel-Elektrophorese unterworfen und die DNA wurde aus dem Gel zurückgewonnen. Das Produkt wurde durch Phenol-Chloroform-Extraktion und Ethanolfällung gereinigt und verwendet, um den kompetenten Zellstamm Escherichia coli JM109 (hergestellt durch Takara Shuzo Co., Ltd., Japan) in der ähnlichen Art und Weise zu der Methode zu transformieren, welche in Beispiel 4 unter Verwendung von pCR.2.1 beschrieben wurde. Ein Transformant, der ein Plasmid trägt, welches das DNA-Fragment aufweist, wunde aus den transformierten Escherichia coli ausgewählt und das Plasmid, das von dem Transformanten getragen wird, als pCRexpR bezeichnet.
  • Die Nucleotidsequenz von der eingebauten DNA des resultierenden rekombinanten DNA-Vektors pCRexpR wurde bestimmt. Die eingebaute DNA enthielt Full-Length cDNA, welche mit dem Strukturgen mlcR übereinstimmte. Die Nucleotidsequenz davon und eine Aminosäuresequenz von dem Peptid, die von der Nucleotidsequenz abgeleitet wurde, sind in SEQ-ID Nr.: 41 und/oder SEQ-ID Nr.: 42 von der Auflistung der Sequenzen dargestellt.
  • Die nächste bekannte Sequenz für mlcR (Polypeptid) war lovE auf dem Gencluster, der mit der Biosynthese von Lovastatin in Zusammenhang steht, mit 34% Identität.
  • Beispiel 13: Konstruktion des cDNA-Expressionsvektors pSAKexpR
  • Der rekombinante DNA-Vektor pCRexpR, der in Beispiel 12 erhalten wurde, wurde bei 37°C für 2 Stunden in der Gegenwart von dem Restriktionsenzym BamHI (hergestellt durch Takara Shuzo Co., Ltd., Japan) umgesetzt und das Reaktionsprodukt einer Agarose-Gel-Elektrophorese unterworfen. Eine Bande bei ungefähr 1,4 kb, welche eine Full-Length cDNA von mlcR enthält, wurde aus dem Gel gewonnen.
  • Nach dem Reagieren von pSAK700 mit dem Restriktionsenzym BamHI (hergestellt durch Takara Shuzo Co., Ltd., Japan) bei 37°C für eine Stunde, wurde alkalische Phosphatase (hergestellt durch Takara Shuzo Co., Ltd., Japan) hinzugefügt und bei 65°C für 30 Minuten die Reaktion durchgeführt. pSAK700, mit BamHI wie oben beschrieben verdaut, wurde an das 1,4 kb DNA-Fragment ligiert, welches in Schritt 1) unter Verwendung des DNA-Ligation Kit Ver. 2 (hergestellt durch Takara Shuzo Co., Ltd., Japan) erhalten wurde. Der kompetente Zellstamm Escherichia coli JM109 wurde mit der ligierten DNA transformiert. Es wurde so ein Escherichia coli-Transformant erhalten, der durch den cDNA-Expressionsvektor transformiert war.
  • Die transformierten Escherichia coli, bezeichnet als Escherichia coli pSAKexpR SANK 72599, welche in dem vorliegenden Beispiel erhalten wurden, wurden in dem Research Institute of Life Science and Technology of the Agency of Industrial Science and Technology am 25. Januar 2000 unter der Depotnummer FERM BP-7006 in Übereinstimmung mit dem Budapester Vertrag über die Hinterlegung von Mikroorganismen hinterlegt.
  • Beispiel 14: Transformation von ML-236B-produzierenden Mikroorganismen
  • 1) Herstellung der Protoplasten
  • Sporen von einer Schrägkultur von dem Penicillium citrinum-Stamm SANK 13380 wurden auf ein PGA-Agarmedium inokuliert und dann bei 26°C für 14 Tage inkubiert. Die Sporen von dem Penicillium citrinum-Stamm SANK 13380 wurden dann aus der Kultur zurückgewonnen und 1 × 108 der Sporen wurden in 80 ml von YPL-20 Kulturmedium inokuliert und bei 26°C für einen Tag inkubiert. Nach der Bestätigung der Keimung von den Sporen durch Beobachtung unter einem Mikroskop, wurden die keimenden Sporen bei Raumtemperatur mit 5.000 × G für zehn Minuten zentrifugiert und als ein Präzipitat zurückgewonnen.
  • Die Sporen wurden dreimal mit sterilisiertem Wasser gewaschen und für die Bildung von Protoplasten verwendet. Dazu wurden 200 mg Zymolase 20 T (hergestellt durch Seikagaku Kogyo Corporation) und 100 mg Chitinase (hergestellt durch Sigma Corporation) in 10 ml 0,55 M Magnesiumchloridlösung aufgelöst und bei Raumtemperatur mit 5.000 × G für 10 Minuten zentrifugiert. Der resultierende Überstand wurde als eine Enzymlösung verwendet. Es wurden 20 ml von der Enzymlösung und 0,5 g (Feuchtgewicht) der keimenden Sporen in einen 100-ml Erlenmeyerkolben hineingegeben und unter schonendem Schütteln bei 30°C für 60 Minuten inkubiert. Nachdem unter Verwendung von einem Mikroskop bestätigt wurde, dass aus den keimenden Sporen Protoplasten geworden waren, wurde die Reaktionslösung durch ein 3G-2 Glasfilter (hergestellt durch HARIO Corporation) filtriert. Das Filtrat wurde bei Raumtemperatur mit 1.000 × G für 10 Minuten zentrifugiert und dann wurden die Protoplasten als Präzipitat zurückgewonnen.
  • 2) Transformation
  • Die in Schritt 1) erhaltenen Protoplasten wurden zweimal mit 30 ml 0,55 M Magnesiumchlorid und einmal mit 30 ml von einer Lösung bestehend aus 0,55 M Magnesiumchlorid, 50 mM Calciumchlorid und 10 mM 3-Morpholino-propansulfonat (pH 6,3 oder niedriger, nachfolgend hierin als MCM-Lösung bezeichnet) gewaschen. Die Protoplasten wurden dann in 100 μl von einer Lösung aus 4% (w/v) Polyethy lenglycol 8000, 10 mM 3-Morpholino-propansulfonat, 0,0025% (w/v) Heparin (hergestellt durch Sigma Corporation), 50 mM Magnesiumchlorid (pH 6,3 oder niedriger, nachfolgend hierin als „Transformations-Lösung" bezeichnet) suspendiert.
  • Es wurden 96 μl der Transformationslösung, welche etwa 5 × 10 Protoplasten enthält, und 10 μl TE, das 120 μg pSAKexpE oder pSAKexpR enthält, gemischt und auf Eis für 30 Minuten stehen lassen. Dazu wurden 1,2 ml von einer Lösung aus 20% (w/v) Polyethylenglycol, 50 mM Magnesiumchlorid und 10 mM 3-Morpholino-propansulfonat (pH 6,3) hinzugefügt. Die Flüssigkeit wurde dann schonend pipettiert und bei Raumtemperatur für 20 Minuten stehen lassen. Dazu wurden 10 ml MCM-Lösung hinzugefügt, gefolgt durch schonendes Mischen und einer Zentrifugation bei Raumtemperatur mit 1.000 × G für 10 Minuten. Die transformierten Protoplasten wurden aus dem Präzipitat zurückgewonnen.
  • 3) Regeneration der Zellwand von transformierten Protoplasten
  • Die transformierten Protoplasten, welche in Schritt 2) erhalten wurden, wurden in 5 ml flüssigem VGS Mittelschichtagar-Medium suspendiert und auf eine Platte aus 10 ml verfestigtem VGS Unterschichtsgar-Medium aufgetragen. Die Platte wurde bei 26°C für einen Tag inkubiert, wonach 10 ml flüssiges VGS Oberschichtagar-Medium, welches 5 mg Hygromycin B pro Platte enthält (Endkonzentration von Hygromycin von 200 μg/ml), darüber geschichtet wurde. Nach der Inkubation bei 26°C für 14 Tage, wurden beide Stämme (d. h. solche Stämme, die aus Protoplasten erhalten wurden, die mit pSAKexpE oder pSAKexpR transformiert waren) auf PGA-Agarmedium, das 200 μg/ml Hygromycin B enthält, subkultiviert und auf einer Schrägkultur, die aus PGA-Agarmedium hergestellt war, bei 26°C für 14 Tage subkultiviert.
  • Die Schrägkultur wurde bei 4°C gehalten.
  • Test-Beispiel 1: Vergleich der Fähigkeit der ML-236B-Biosynthese in transformierten und ursprünglichen Stämmen
  • Die transformierten Stämme, welche in Beispiel 14 erhalten wurden, und Penicillium citrinum SANK 13380 wurden kultiviert und die Menge an ML-236B in jeder Kultur gemessen.
  • Ein 5 mm großes Inokulierquadrat mit Sporen von der Schrägkultur, in welcher die transformierten Stämme, wie in Beispiel 14 beschrieben, kultiviert wurden, wurde kultiviert und auch von der Schrägkultur, die in Beispiel 2 beschrieben wurde, welche Penicillium citrinum SANK 13380 entspricht. Die Zellen wurden in 10 ml MBG3-8 Medium in einem 100-ml Erlenmeyerkolben inokuliert, dann bei 24°C für zwei Tage unter Schütteln inkubiert, gefolgt von der Zugabe von 3,5 ml einer 50%igen (w/v) Glycerinlösung. Danach wurde das Kultivieren bei 24°C für 10 Tage unter Schütteln fortgesetzt.
  • Zu 10 ml von der Kultur wurden 50 ml 0,2 N Natriumhydroxid hinzugefügt, gefolgt durch Inkubation bei 26°C für eine Stunde unter Schütteln. Die Kultur wurde bei Raumtemperatur mit 3000 × G für zwei Minuten zentrifugiert. Ein ml von dem Überstand wurde zurückgewonnen, mit 9 ml 75% Methanol gemischt und der HPLC unterworfen.
  • SSC-ODS-262 (mit einem Durchmesser von 6 mm, einer Länge von 100 mm, hergestellt durch Senshu Kagaku Co., Ltd.) wurde als HPLC-Säule verwendet und 75% (v/v) Methanol – 0,1% (v/v) Triethylamin – 0,1% (v/v) Essigsäure wurde als die mobile Phase verwendet. Die Elution wurde bei Raumtemperatur bei einer Flussgeschwindigkeit von 2 ml/Minute durchgeführt. Unter diesen Bedingungen wurde ML-236B 4 Minuten nach Aufgabe auf die Säule eluiert. Der Nachweis wurde mit einem UV-Detektor bei einer Absorptionswellenlänge von 236 nm durchgeführt.
  • Die Fähigkeit zur ML-236B-Biosynthese war in drei Stämmen unter den acht mit pSAKexpE transformierten Stämmen erhöht. Die Fähigkeit zur ML-236B-Biosynthese von diesen Stämmen war im Durchschnitt 10% höher verglichen mit dem Originalstamm. Die Fähigkeit zur ML-236B-Biosynthese von diesen drei Stämmen blieb ebenfalls nach Subkultur, wie zum Beispiel Einsporkultur oder dergleichen, stabil erhalten. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass das Insert von pSAKexpE eine die ML-236B-Biosynthese beschleunigende cDNA ist.
  • Die Fähigkeit zur ML-236B-Biosynthese war in fünf Stämmen unter den mit pSAKexpR transformierten Stämmen erhöht. Die Fähigkeit zur ML-236B-Biosynthese von diesen Stämmen war im Durchschnitt 15% höher verglichen mit dem Originalstamm. Die Fähigkeit zur ML-236B-Biosynthese von diesen fünf Stämmen blieb ebenfalls nach Subkultur, wie zum Beispiel Einsporkultur oder dergleichen, stabil erhalten. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass das Insert von pSAKexpR eine die ML-236B-Biosynthese beschleunigende cDNA ist.
  • Demnach beschleunigt eine die ML-236B-Biosynthese beschleunigende cDNA, welche aus einem ML-236B-produzierenden Mikroorganismus gemäß der vorliegenden Erfindung erhalten wurde, die ML-236B-Biosynthese in dem ML-236B-produzierenden Mikroorganismus, wenn sie in den ML236B-produzierenden Mikroorganismus eingeführt wird.
  • Beispiel 15: Bestimmung der Sequenz von cDNAs, die den Strukturgenen mlcA–D entsprechen.
  • Es wurde die Sequenz von der cDNA, welche mit dem Strukturgen mlcA übereinstimmt, bestimmt.
  • Die Erststrang-cDNA wurde mit dem TAKARA LA PCR Kit Ver. 1.1 (Takara Shuzo Co., Ltd.) synthetisiert. Verschiedene PCRs wurden zur Amplifikation von dem vollständigen oder dem partiellen Bereich der cDNA unter Verwendung der Erststrang-cDNA als Matrize und mehreren unterschiedlichen Paaren an Oligonucleotiden als Primer durchgeführt.
  • Der Zyklus mit 30 Sekunden bei 94°C, 30 Sekunden bei 60°C und fünf Minuten bei 72°C wurde 30 mal unter Verwendung von The Big Dye Primer/Terminator Cycle Sequencing Kit und The ABI Prism 377 Sequencer (PE Applied Biosystems) wiederholt.
  • Das Produkt von jeder Reaktion wurde in das Plasmid pCR2.1 einzeln eingebaut.
  • Es wurden Escherichia coli-Transformanten von jedem rekombinanten Plasmid erhalten.
  • Die Nucleotidsequenzen von jedem Insert von den rekombinanten Plasmiden, die von diesen Transformanten erhalten wurden, wurden bestimmt.
  • Die Sequenzen von Exons und Introns wurden auf der Basis von einem Vergleich zwischen der Nucleotidsequenz von mehreren RT-PCR-Produkten, die oben erwähnt wurden, und der von dem Strukturgen mlcA bestimmt.
  • Dann wurde die Sequenz von der cDNA, welche mit dem Strukturgen mlcA übereinstimmt, bestimmt (SEQ-ID Nr.: 43). Die entsprechende Aminosäuresequenz von dem Polypeptid, das durch die cDNA codiert wird, wurde vorausberechnet (SEQ-ID Nr.: 44) und eine Funktion von dem Polypeptid wurde auf der Basis von einer Homologie-Suche unter Verwendung der Aminosäuresequenz unterstellt.
  • Die am nächsten liegende bekannte Sequenz für mlcA (Polypeptid) war LNKS (lovB) auf dem Gencluster, der mit der Biosynthese von Lovastatin in Zusammenhang steht, mit 60% Identität.
  • Auf eine ähnliche Art wurde die Sequenz von der cDNA, welche mit dem Strukturgen mlcB übereinstimmt, bestimmt (SEQ-ID Nr.: 45). Die entsprechende Aminosäuresequenz von dem Polypeptid, das durch die cDNA codiert wird, wurde vorausberechnet (SEQ-ID Nr.: 46) und eine Funktion von dem Polypeptid wurde auf der Basis von einer Homologie-Suche unter Verwendung der Aminosäuresequenz unterstellt.
  • Die am nächsten liegende bekannte Sequenz für mlcB (Polypeptid) war LDKS (lovF) auf dem Gencluster, der mit der Biosynthese von Lovastatin in Zusammenhang steht, mit 61% Identität.
  • Auf die gleiche Weise wurde die Sequenz von der cDNA bestimmt, welche mit dem Strukturgen mlcC übereinstimmt (SEQ-ID Nr.: 47). Die entsprechende Aminosäuresequenz von dem Polypeptid, das durch die cDNA codiert wird, wurde vorausberechnet (SEQ-ID Nr.: 48) und eine Funktion von dem Polypeptid wurde auf der Basis von einer Homologie-Suche unter Verwendung der Aminosäuresequenz unterstellt.
  • Die am nächsten liegende bekannte Sequenz für mlcC (Polypeptid) war lovA auf dem Gencluster, der mit der Biosynthese von Lovastatin in Zusammenhang steht, mit 72% Identität.
  • Darüber hinaus wurde die Sequenz von der cDNA bestimmt, welche mit dem Strukturgen mlcD übereinstimmt (SEQ-ID Nr.: 49). Die entsprechende Aminosäuresequenz von dem Polypeptid, das durch die cDNA codiert wird, wurde vorausberechnet (SEQ-ID Nr.: 50) und eine Funktion von dem Polypeptid wurde auf der Basis von einer Homologie-Suche unter Verwendung der Aminosäuresequenz unterstellt.
  • Die am nächsten liegende bekannte Sequenz für mlcD (Polypeptid) war ORF8 auf dem Gencluster, der mit der Biosynthese von Lovastatin in Zusammenhang steht, mit 63% Identität.
  • Die Positionen von Exons und Introns von jedem Strukturgen auf SEQ-ID Nr.: 1 oder SEQ-ID Nr.: 2 wurde wie folgt bestimmt: TABELLE 11: DIE POSITIONEN DER EXONS VON mlcA–D IN PML48-INSERTS
    SEQ-ID, wo ein Exon vorhanden ist. Exon-Nummer Nucleotid-Nummer von SEQ-ID Nr.: 1 oder SEQ-ID Nr.: 2
    mlcA 2 1 22913 bis 22945
    2 23003 bis 23846
    3 23634 bis 23846
    4 23918 bis 24143
    5 24221 bis 24562
    6 24627 bis 27420
    7 27479 bis 27699
    8 27761 bis 30041
    9 30112 bis 30454
    10 30514 bis 30916
    11 30972 bis 32910
    mlcB 2 1 11689 bis 12002
    2 12106 bis 12192
    3 12247 bis 12304
    4 12359 bis 12692
    5 12761 bis 13271
    6 13330 bis 13918
    7 13995 bis 20052
    mlcC 1 1 11631 bis 12140
    2 12207 bis 12378
    3 12442 bis 13606
    mlcD 1 1 24066 bis 24185
    2 24270 bis 27463
    3 27514 bis 28130
  • Die Position von der Transkriptions-Terminations-Stelle von jedem Strukturgen auf SEQ-ID Nr.: 1 oder SEQ-ID Nr.: 2 wurde wie folgt bestimmt: TABELLE 12: DIE POSITION VON DEN TRANSKRIPTIONS-TERMINATIONS-STELLEN DER STRUKTURGENE mlcA–E UND R IN PML48-INSERTS
    Gen SEQ-ID Nr.:, wo die Transkriptions-Terminations-Stelle vorkommt Nucleotid-Nummer der Transkriptions-Terminations-Stelle in SEQ-ID Nr.: 1 oder SEQ-ID Nr.: 2
    mlcA SEQ-ID Nr.: 2 32910
    mlcB SEQ-ID Nr.: 2 20052
    mlcC SEQ-ID Nr.: 1 13606
    mlcD SEQ-ID Nr.: 1 28130
    mlcE SEQ-ID Nr.: 2 5814
    mlcR SEQ-ID Nr.: 2 1918
  • Beispiel 16: Experimente zur Genzerstörung
  • Die Strukturgene mlcA, B oder D von P. citrinum wurden über die ortsspezifische Mutagenese unter Verwendung der homologen Rekombination zerstört.
  • Das rekombinante Plasmid für das Erlangen der Mutante des zerstörten mlcA-Strukturgens von P. citrinum wurde unter Verwendung des Plasmids pSAK333 konstruiert.
  • Ein internes, 4,1 kb großes KpnI-Fragment von dem mlcA-Genlokus auf dem pML48-Insert wurde gewonnen, gereinigt, durch ein DNA Blunting Kit (Takara Shuzo Co., Ltd.) mit stumpfen Enden versehen und in einen durch PvuII verdauten pSAK333-Vektor ligiert. Das sich ergebende Plasmid wurde als pdismlcA bezeichnet.
  • P. citrinum SANK 13380 wurde durch pdismlcA transformiert.
  • Es wurde eine Southern-Blot-Hybridisierung der genomischen DNA von dem pdismlcA-Transformanten durchgeführt, um die Zerstörung von dem Strukturgen mlcA zu bestätigen.
  • Die resultierende mlcA-zerstörte Mutante produzierte überhaupt kein ML-236B oder Vorläufer davon.
  • Das rekombinante Plasmid für das Erlangen der Mutante des zerstörten mlcB-Strukturgens von P. citrinum wurde unter Verwendung eines Plasmids, pSAK333, konstruiert.
  • Ein internes, 1,4 kb großes PstI-BamHI-Fragment von dem mlcB-Genlokus auf dem pML48-Insert wurde gewonnen, gereinigt, durch ein DNA Blunting Kit (Takara Shuzo Co., Ltd.) mit stumpfen Enden versehen und in einen durch PvuII verdauten pSAK333-Vektor ligiert. Das sich ergebende Plasmid wurde als pdismlcB bezeichnet.
  • P. citrinum SANK 13380 wurde durch pdismlcB transformiert.
  • Es wurde eine Southern-Blot-Hybridisierung der genomischen DNA von dem pdismlcB-Transformanten durchgeführt, um die Zerstörung von dem Strukturgen mlcB zu bestätigen.
  • Die resultierende mlcB-zerstörte Mutante produzierte kein ML-236B, aber ML-236A, den Vorläufer von ML-236B.
  • Das rekombinante Plasmid für das Erlangen der Mutante des zerstörten mlcD-Strukturgens von P. citrinum wurde unter Verwendung eines Plasmids, pSAK333, konstruiert.
  • Ein 1,4 kb großes KpnI-BamHI-Fragment von dem mlcD-Genlokus auf dem pML48-Insert wurde gewonnen, gereinigt, durch ein DNA Blunting Kit (Takara Shuzo Co., Ltd.) mit stumpfen Enden versehen und in einen durch PvuII verdauten pSAK333-Vektor ligiert. Das sich ergebende Plasmid wurde als pdismlcD bezeichnet.
  • P. citrinum SANK 13380 wurde durch pdismlcD transformiert.
  • Es wurde eine Southern-Blot-Hybridisierung der genomischen DNA von dem pdismlcD-Transformanten durchgeführt, um die Zerstörung von dem Strukturgen mlcD zu bestätigen.
  • Die Menge von ML-236B, welche durch die resultierende mlcD-zerstörte Mutante produziert wurde, war etwa 30% von der von dem nicht-transformierten Kontrollwirt.
  • Beispiel 17: Funktionelle Analyse von mlcR in pSAKexpR-Transformanten.
  • Zwei von den pSAKexpR-Transformanten, die in Beispiel 12 erhalten wurden, bezeichnet als TR1, beziehungsweise TR2, und nicht-transformierte Wirtszellen, Penicillium citrinum SANK 13380, wurden in MBG3-8 Medium inokuliert und einzeln, wie in Beispiel 8 beschrieben, inkubiert.
  • Die Gesamt-RNA wurde, wie in Beispiel 8 beschrieben, von jeder der Kulturen extrahiert.
  • Die RT-PCR wurde unter Verwendung der Gesamt-RNA als Matrize und einem Paar von Oligonucleotiden, welche auf der Basis der Nucleotidsequenz von den Strukturgenen mlcA, B, C, D, E oder R konstruiert wurden, als Primer durchgeführt. TABELLE 13: NUCLEOTIDSEQENZEN DER PRIMERPAARE FÜR DIE RT-PCR.
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  • Die Ergebnisse von der RT-PCR-Analyse sind in 5 für das nicht-transformierte Penicillium citrinum 13380 und für die zwei Transformanten, bezeichnet mit TR1 und TR2, dargestellt.
  • Die Strukturgene mlcA, B, C, D und R wurden an dem ersten, dem zweiten und dem dritten Tag der Kultivierung von den pSAKexpR-Transformanten exprimiert.
  • Im Gegensatz dazu wurden alle diese Strukturgene nur an dem dritten Tag der Kultivierung in den nicht-transformierten Wirtszellen exprimiert.
  • Es ergab sich kein Unterschied in der Expression von dem Strukturgen mlcE zwischen den pSAKexpR-Transformanten und den nicht-transformierten Wirtszellen.
  • Diese Ergebnisse lassen darauf schließen, dass ein Protein, welches durch die cDNA codiert wird, die mit dem Strukturgen mlcR übereinstimmt, die Transkription von einigen der anderen Strukturgene (zum Beispiel mlcA, B, C, D) induziert, die in dem mit der ML-236B-Biosynthese in Zusammenhang stehenden Gencluster lokalisiert sind.
  • Beispiel 18: Funktionelle Analyse von mlcE in pSAKexpE-Transformanten.
  • Ein pSAKexpE-Transformant, bezeichnet als TE1, welcher in Beispiel 12 erhalten wurde, und nicht-transformierte Wirtszellen, Penicillium citrinum SANK 13380, wurden in MBG3-8 Medium inokuliert und einzeln, wie in Beispiel 8 beschrieben, inkubiert.
  • Die Gesamt-RNA wurde, wie in Beispiel 8 beschrieben, von jeder der Kulturen extrahiert.
  • Die RT-PCR wurde unter Verwendung der Gesamt-RNA als Matrize und einem Paar von Oligonucleotiden, welche auf der Basis der Nucleotidsequenz von den Strukturgenen mlcA, B, C, D, E oder R konstruiert wurden, als Primer durchgeführt. Die Primer, welche für das vorliegende Beispiel verwendet wurden, waren identisch zu denjenigen in der Tabelle von dem vorigen Beispiel.
  • Die Ergebnisse von der RT-PCR-Analyse sind in 6 für das nicht-transformierte Penicillium citrinum 13380 und für einen Transformanten, bezeichnet mit TEL dargestellt.
  • Das Strukturgen mlcE wurde an dem ersten, dem zweiten und dem dritten Tag der Kultivierung in den pSAKexpE-Transformanten exprimiert.
  • Im Gegensatz dazu wurde das Strukturgen mlcE nur an dem dritten Tag der Kultivierung in den nicht-transformierten Wirtszellen exprimiert.
  • Auf der anderen Seite ergab sich kein Unterschied in der Expression von den Strukturgenen mlcA, B, C, D und R zwischen dem pSAKexpE-Transformanten und den nicht-transformierten Wirtszellen (Daten nicht dargestellt).
  • Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass ein Protein, welches durch die cDNA codiert wird, die mit einem Strukturgen mlcE übereinstimmt, die ML-236B-Biosynthese unabhängig von den Strukturgenen mlcA, B, C, D und R beschleunigt. AUFLISTUNG DER SEQUENZEN
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Claims (31)

  1. Polynucleotid, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: (a) einem Polynucleotid, das ein Protein mit einer Aminosäuresequenz SEQ ID Nr.: 42 codiert; (b) einem Polynucleotid, welches die Nucleotidsequenz SEQ ID Nr.: 41 aufweist und zur Verwendung für die Beschleunigung der Biosynthese von ML-236B geeignet ist; (c) einem Polynucleotid, das aus der Nucleotidsequenz SEQ ID Nr.: 41 besteht; (d) einem Polynucleotid, das unter stringenten Bedingungen mit einem Polynucleotid hybridisiert, welches (a) bis (c) entspricht und das durch die Beschleunigung der Biosynthese von ML-236B in einem ML-236B-produzierenden Mikroorganismus charakterisiert ist, wenn es in diesem ML-236B-produzierenden Mikroorganismus eingeführt wird, und (e) einer mRNA, die mit einem Polynucleotid von (d) unter stringenten Bedingungen hybridisieren kann.
  2. Polynucleotid nach Anspruch 1, aufweisend eine DNA, die aus transformiertem Escherichia coli pSAKexpR SANK 72599 (FERM BP-7006) erhalten werden kann.
  3. Polynucleotid nach einem der vorstehenden Ansprüche in operativer Kombination mit einem oder mehreren Polynucleotiden, wobei diese Kombination zur Verwendung für die verstärkte Erzeugung von ML-236B in einem ML-236B-produzierenden Mikroorganismus geeignet ist.
  4. Polynucleotid nach Anspruch 3, aufweisend ein Polynucleotid nach Anspruch 1 oder 2 in Verknüpfung mit einem Polynucleotid, welches ein Protein codiert, das die Aminosäuresequenz SEQ ID Nr.: 38, 42, 44, 46, 48 oder 50 einschließt oder aus dieser besteht.
  5. Polynucleotid nach Anspruch 3, aufweisend das Polynucleotid der SEQ ID Nr.: 41 in Kombination mit einer oder mehreren Sequenzen, die ausgewählt sind aus den SEQ ID Nr.: 37, 41, 43, 45, 47 oder 49.
  6. Polynucleotid nach einem der vorgenannten Ansprüche, das eine DNA ist.
  7. Polynucleotid nach einem der vorgenannten Ansprüche, das eine genomische DNA ist.
  8. Polynucleotid nach Anspruch 1 bis 6, das eine cDNA ist.
  9. Vektor, aufweisend ein Polynucleotid nach einem der vorgenannten Ansprüche.
  10. Vektor nach Anspruch 9, wobei der Vektor ferner ein Polynucleotid mit einer Nucleotidsequenz SEQ ID Nr.: 37 aufweist.
  11. Vektor nach Anspruch 9 oder 10, wobei der Vektor ferner eines oder mehrere Polynucleotide aufweist, die ausgewählt sind aus dem SEQ ID Nr.: 43, 45, 47 oder 49.
  12. Vektor nach Anspruch 9, wobei der Vektor nicht die Polynucleotidsequenz SEQ ID Nr.: 37, 43, 45, 47 oder 49 aufweist.
  13. Vektor nach Anspruch 9, wobei der Vektor nicht die Polynucleotidsequenz SEQ ID Nr.: 43, 45, 47 oder 49 aufweist.
  14. Vektor nach Anspruch 9, der aus Escherichia coli pSAKexpR SANK 72599 (FERM BP-7006) erhalten werden kann.
  15. Vektor nach einem der vorgenannten Ansprüche 9 bis 14, der ein Expressionsvektor ist.
  16. Wirtszelle, transformiert mit Hilfe eines Vektors nach einem der Ansprüche 9 bis 15.
  17. Wirtszelle nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass sie ein ML-236B-produzierender Mikroorganismus ist.
  18. Wirtszelle nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Penicillium-Spezies ist.
  19. Wirtszelle nach Anspruch 17 oder 18, dadurch gekennzeichnet, dass sie ein Penicillium citrinum ist.
  20. Wirtszelle nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass sie Escherichia coli ist.
  21. Wirtszelle nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass sie ein Escherichia coli pSAKexpR SANK 72599 (FERM BP-7006) ist.
  22. Polypeptid, codiert durch ein Polynucleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 8.
  23. Polypeptid, aufweisend die Sequenz SEQ ID Nr.: 42 oder eine Variante davon, die mindestens über 80% Identität mit SEQ ID Nr.: 42 hat und die zur Beschleunigung der ML-236B-Produktion in einem ML-236B-produzierenden Organismus in der Lage ist.
  24. Polypeptid, bestehend aus der Sequenz SEQ ID Nr.: 42.
  25. Verfahren zum Erzeugen von ML-236B, umfassend das Kultivieren einer Wirtszelle nach einem der Ansprüche 16 bis 19 und anschließend Gewinnen von ML-236B aus der Kultur.
  26. Verfahren nach Anspruch 25, wobei die Wirtszelle mit einem Vektor transformiert wird, der die Nucleotidsequenz SEQ ID Nr.: 41 aufweist.
  27. Verfahren nach Anspruch 26, wobei der Vektor nicht die Polynucleotidsequenz SEQ ID Nr.: 37 aufweist.
  28. Verfahren nach Anspruch 26 oder 27, wobei der Vektor mindestens nicht ein Polynucleotid aufweist, das die Aminosäuresequenzen SEQ ID Nr.: 44, 46, 48 und/oder 50 codiert.
  29. Verfahren nach einem der Ansprüche 25 bis 28, wobei die Erzeugung in Abwesenheit von einem oder mehr als einem rekombinanten Polypeptid erfolgt, das eine Aminosäuresequenz hat, die der SEQ ID Nr.: 38, 44, 46, 48 und/oder 50 entspricht.
  30. Verfahren nach einem der Ansprüche 25 bis 28, wobei die Erzeugung in Abwesenheit von einer oder mehr als einer cDNA erfolgt, die den SEQ ID Nr.: 37, 43, 45, 47 und/oder 49 entspricht.
  31. Verfahren zum Herstellen von Pravastatin, welches Verfahren die Ausführung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 25 bis 30 umfasst und das Umwandeln des ML-236B zu Pravastatin.
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