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ERKLÄRUNG
BETREFFEND ÖFFENTLICH
GEFÖRDERTER
FORSCHUNG ODER ENTWICKLUNG
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Diese
Erfindung wurde, zumindest in Teilen, durch das vom Wirtschaftsministerium,
NIST-ATP Kooperationsvereinbarungs-Nummer 70NANB8H4033, und dem
Energieministerium Nummer DE-FC36-95GO10099 gefördert. Der Regierung können daher
bestimmte Rechte an der Erfindung zustehen.
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HINTERGRUND DER ERFINDUNG
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BEZUG AUF VERWANDTE ANMELDUNGEN
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Diese
Anmeldung nimmt die Priorität
der vorläufigen
US-Anmeldung mit der Seriennummer 60/220,850, angemeldet am 26.
Juli 2000, in Anspruch.
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1. Gebiet der Erfindung
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Diese
Erfindung betrifft Verfahren und Zusammensetzungen zur Verbesserung
der Dicarbonsäure-Bildung
in Hefe, indem der native Promotor eines Zielgens durch einen heterologen
Promotor eines Hefegens, welcher ein gewünschtes Maß an Aktivität aufweist,
ersetzt wird.
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2. Beschreibung des verwandten
Standes der Technik
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Aliphatische
Dicarbonsäuren
sind vielseitige chemische Zwischenprodukte als Rohmaterialien zur Herstellung
von Parfüms,
Polymeren, Klebstoffen und makroliden Antibiotika. Während zahlreiche
chemische Wege zur Synthese von langkettigen α,ω-Dicarbonsäuren zugänglich sind, ist die Synthese
nicht einfach und die meisten Verfahren führen zu Mischungen, welche
kürzere
Kettenlängen
beinhalten. Im Ergebnis sind umfangreiche Aufreinigungsschritte
erforderlich. Während
bekannt ist, dass langkettige Dicarbonsäuren auch durch die mikrobielle
Umsetzung von Alkanen, Fettsäuren
oder deren Ester hergestellt werden können, ist die chemische Synthese
aufgrund von Beschränkungen
hinsichtlich der derzeitigen, biologischen Ansätze der kommerziell funktionsfähigste Weg
geblieben.
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Zahlreiche
Hefestämme
sind bekannt, welche α,ω-Dicarbonsäuren als
Nebenprodukt ausschleusen, wenn sie auf Alkanen oder Fettsäuren als
Kohlenstoffquelle kultiviert werden. Insbesondere Hefe, welche zur Gattung
Candida gehören,
wie C. albicans, C. cloacae, C. guillermondii, C. intermedia, C.
lipolytica, C. maltosa, C. parapsilosis und C. zeylenoides, sind
dafür bekannt,
dass sie solche Dicarbonsäuren
bilden (Agr. Biol. Chem., 35: 2.033–2.042 (1971)). Auch sind verschiedene
Stämme
von C. tropicalis dafür
bekannt, dass sie Dicarbonsäuren,
welche hinsichtlich ihrer Kettenlänge von C11 bis
C18 reichen, bilden (Okino et al., BM Lawrence,
BD Mookherjee und BJ Willis (Herausgeber) in „Flavors and Fragrances: A
World Perspective",
Proceedings of the 10th International Conference of Essential Oils,
Flavors and Fragrances, Elsevier Science Publishers BV Amsterdam
(1988), und sie sind die Grundlage zahlreicher Patente, wie bei
Bühler
und Schindler in Aliphatic Hydrocarbons in Biotechnology, H. J.
Rehm und G. Reed (Herausgeber), Vol. 169, Verlag Chemie, Weinheim
(1984) begutachtet.
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Studien
der biochemischen Prozesse, mittels derer Hefen Alkane und Fettsäuren metabolisieren,
haben drei Arten von Oxidationsreaktionen gezeigt: α- Oxidation von Alkanen
zu Alkoholen, ω-Oxidation
von Fettsäuren
zu α,ω-Dicarbonsäuren und
die degenerative β-Oxidation
von Fettsäuren
zu CO2 und Wasser. Die ersten beiden Typen
von Oxidationen werden durch mikrosomale Enzyme katalysiert, während der
letzte Typ in den Peroxisomen stattfindet. In C. tropicalis wird
der erste Schritt im ω-Oxidationsweg
durch einen Membrangebundenen Enzymkomplex (ω-Hydroxylase-Komplex), welcher
eine Cytochrom-P450-Monooxygenase und eine NADPH-Cytochrom-Reduktase
beinhaltet, katalysiert. Dieser Hydroxylase-Komplex ist für die primäre Oxidation
der terminalen Methyl-Gruppe in Alkanen und Fettsäuren verantwortlich,
wie zum Beispiel in Gilewicz et al., Can. J. Microbiol., 25: 201
(1979) gezeigt. Die Gene, welche die Cytochrome-P450- und NADPH-Reduktase-Komponenten
des Komplexes kodieren, wurden zuvor als P450ALK beziehungsweise P450RED
identifiziert und wurden auch kloniert und sequenziert, wie zum
Beispiel in Sanglard et al., Gene, 76: 121–136 (1989) beschrieben. P450ALK
wurde auch P450ALK1 benannt. Seit neuerem werden ALK-Gene mit dem
Symbol CYP und RED-Gene mit dem Symbol CPR gekennzeichnet. Siehe
zum Beispiel Nelson, Pharmacogenetics 6 (1): 1–42 (1996). Siehe auch Ohkuma
et al., DNA and Cell Biology, 14: 163–173 (1995), Seghezzi et al.,
DNA and Cell Biology, 11: 767–780
(1992) und Kargel et al., Yeast, 12: 333–348 (1996). Darüber hinaus
werden CPR-Gene jetzt auch als NCP-Gene bezeichnet. Siehe zum Beispiel
De Racker et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 45: 1.660
(2001). Beispielsweise wird P450ALK gemäß der Nomenklatur von Nelson,
siehe oben, auch als CYP52 bezeichnet. Fettsäuren werden letztendlich aus
Alkanen nach zwei zusätzlichen
Oxidationsschritten, katalysiert durch die Alkohol-Oxidase, wie
zum Beispiel in Kemp et al., Appl. Microbiol. And Biotechnol., 28:
370–374
(1988), hierin als Referenz eingeführt, und die Aldehyd-Dehydrogenase,
gebildet. Die Fettsäuren
können
durch den gleichen oder durch einen ähnlichen Weg zu den entsprechenden
Dicarbonsäuren
weiter oxidiert werden. Die ω-Oxidation
von Fettsäuren
schreitet über
die ω-Hydroxyfettsäure und
ihr Aldehyd-Derivat zur entsprechenden Dicarbonsäure fort, ohne dass eine CoA-Aktivierung erforderlich
ist. Jedoch können
sowohl die Fettsäuren
als auch die Dicarbonsäuren
nach einer Aktivierung zum entsprechenden Acyl-CoA-Ester, durch
den β-Oxidationsweg
in den Peroxisomen degradiert werden, was zu einer Kettenverkürzung führt. In
Saugetier-Systemen werden sowohl die Fettsäure- als auch die Dicarbonsäure-Produkte
der ω-Oxidation
in gleicher Geschwindigkeit zu ihren entsprechenden CoA-Estern aktiviert
und sind Substrat sowohl für
die mitochondrielle als auch für
die peroxisomale β-Oxidation
(J. Biochem., 102: 225–234
(1987)). In Hefe findet die β-Oxidation
ausschließlich
in den Peroxisomen statt (Agr. Biol. Chem., 49: 1.821–1.828 (1985)).
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Cytochrom-P450-Monooxygenasen
(P450er) sind terminale Monooxidasen eines Multikomponenten-Enzymsystems
beinhaltend P450 und CPR (NCP). In einigen Fällen sind ein zweiter Elektronen-Träger, Cytochrom
b5 (CYTb5) und seine assoziierte Reduktase, wie unten und in Morgan
et al., Drug Metab. Disp., 12: 358–364 (1984) beschrieben, involviert.
Die P450er umfassen eine Superfamilie von Proteinen, welche in der
Natur weit verbreitet sind und welche aus einer Vielzahl von Organismen
isoliert worden sind, wie zum Beispiel bei Nelson, siehe oben, beschrieben.
Diese Organismen beinhalten viele Säugetiere, Fische, Wirbellose, Pflanzen,
Weichtiere, Krustentiere, niedere Eukaryoten und Bakterien (Nelson,
siehe oben). Nachdem sie zuerst in Mikrosomen in der Leber von Nagetieren
als Kohlenstoffmonoxid-Bindepigment, wie zum Beispiel in Garfinkel,
Arch. Biochem. Biophys., 77: 493–509 (1958) entdeckt wurden,
wurden P450er nach ihrer Absorption bei 450 nm in einem reduzierten-CO-gekoppelten
Differenzspektrum benannt, wie zum Beispiel in Omura et al., J.
Biol. Chem., 239: 2370–2378
(1964) beschrieben.
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Monooxygenierungsreaktionen,
welche durch Cytochrom P450 in einem eukaryotischen, Membran-gebundenen
System katalysiert werden, erfordern den Transfer von Elektronen
vom NADPH zum P450 über
eine NADPH-Cytochrom-P450-Reduktase
(CPR), wie zum Beispiel in Taniguchi et al., Arch. Biochem. Biophys.,
232: 585 (1984) beschrieben. CPR ist ein Flavoprotein von etwa 78.000 Da,
beinhaltend 1 Mol Flavinadenindinudeotid (FAD) und 1 Mol Flavinmononukleotid
(FMN) pro Mol Enzym, wie zum Beispiel in Potter et al., J. Biol.
Chem. 258: 6906 (1983) beschrieben. Der FAD-Rest von CPR ist die
Stelle des Elektroneneintritts in das Enzym, wohingegen FMN die
Stelle ist, an der das Elektron auf P450 übertragen wird, wie zum Beispiel in
Vermilion et al., J. Biol. Chem. 253: 8.812 (1978) beschrieben.
Die Gesamtreaktion sieht wie folgt aus: H+ + RH + NADPH + O2 → ROH + NADP+ + H2O
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Die
Bindung eines Substrates an die katalytische Stelle von P450 führt offensichtlich
zu einer Konformationsänderung,
was einen Elektronentransfer von CPR auf P450 initiiert. Im Anschluss
an den Transfer des ersten Elektrons bindet O2 an
den Fe2 +-P450-Substrat-Komplex,
um einen Fe3 +-P450-Substrat-Komplex
zu bilden. Dieser Komplex wird dann durch ein zweites Elektron vom
CPR oder, in einigen Fällen,
von NADPH über einen
zweiten Elektronenträger,
Cytochrom b5 (CYTb5) und seine assoziierte NADH-Cytochrom-b5-Reduktase,
wie zum Beispiel in Guengerich et al., Arch. Biochem. Biophys.,
205: 365 (1980) und Morgen, siehe oben, beschrieben, reduziert.
Die meisten der vorstehend genannten Studien weisen darauf hin,
das CYTb5 nur hinsichtlich der Übertragung
des zweiten Elektrons an dem Weg involviert ist. Ein Atom dieses
reaktiven Sauerstoffes wird in das Substrat eingebracht, während das
andere zu Wasser reduziert wird. Das oxygenierte Substrat dissoziiert
dann, wobei die oxidierte Form des Cytochroms P450, wie zum Beispiel
in Klassen, Amdur und Doull, Casarett and Doull's Toxicology, Macmillan, New York (1986)
beschrieben, regeneriert wird. Hinsichtlich des CYTb5 wurden, neben
seiner Rolle als Elektronenträger,
zahlreiche andere Modelle für
die Rolle dieses Proteins bei der P450-Expression vorgeschlagen.
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Während zahlreiche
chemische Wege zur Synthese von langkettigen α,ω-Dicarbonsäuren, wie 9-Oktadecendioische
Säure,
zugänglich
sind, sind solche Verfahren komplex und führen üblicherweise zu Mischungen
beinhaltend kürzere Kettenlängen. Als
Ergebnis sind aufwendige Aufreinigungsschritte erforderlich. Als
eine Alternative zu chemischen Synthesen können α,ω-Dicarbonsäuren, wie 9-Oktadecendioische
Säure, auch
mittels Fermentationsverfahren hergestellt werden, wie etwa durch
die mikrobielle Umsetzung der entsprechenden Kohlenwasserstoffe,
wie Alkane oder Alkene, Fettsäuren
oder deren Ester. Ein Verfahren zur Herstellung von im Wesentlichen
reinen α,ω-Dicarbonsäuren in
im Wesentlichen quantitativer Ausbeute ist in
US-Patent Nummer 5,254,466 beschrieben.
Dieses Verfahren umfasst das Kultivieren eines C. tropicalis-Stammes,
bei dem sowohl die Kopien des chromosomalen PDX5-Gens als auch jedes
der PDX4A- und PDX4B-Gene zerstört
sind, in einem Kulturmedium beinhaltend eine Stickstoffquelle, ein
organisches Substrat und ein Co-Substrat.
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Die
Zerstörung
des PDX4- und des PDX5-Gens blockiert in einem C. tropicalis-Wirtsstamm
effektiv den β-Oxidationsweg
bei seiner ersten Reaktion (welche durch die Acyl-CoA-Oxidase katalysiert
wird). Die PDX4A- und PDX5-Gene kodieren verschiedene Untereinheiten
der lange Ketten-Acyl-CoA-Oxidase, welche als peroxisomale Polypeptide
(PXP) PXP-4 beziehungsweise PXP-5 bezeichnet werden. Die Zerstörung eines oder
mehrerer dieser Gene führt
zu einer teilweisen oder vollständigen
Inaktivierung des β-Oxidationswegs, was
durch das Umleiten des Substrates in den α-Oxidationsweg erhöhte Ausbeuten
an Dicarbonsäuren
ermöglicht
und was auch die Widerverwertung der Dicarbonsäuren durch den β-Oxidationsweg
verhindert.
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Ein
anderes Verfahren zur Herstellung von im Wesentlichen reinen α,ω-Dicarbonsäuren in
ausgiebiger Ausbeute ist im
US-Patent
6,331,420 und in
WO
00/20566 A2 beschrieben. Dieses Verfahren umfasst das Vermehren
der CYP- und der
CPR(NCP)-Enzyme durch Amplifizierung der CYP- und der CPR-Genkopiezahl in einem
C. tropicalis-Stamm und das Kultivieren des genetisch modifizierten
Stammes in einem Medium beinhaltend ein organisches Substrat.
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Gene,
welche in die Biokonversion verschiedener Rohmaterialien, zum Beispiel
HOSFFA (hoch Ölsäure-haltiges
Sonnenblumenöl,
da sind Fettsäuremi schungen
beinhaltend Ölsäure, welche
kommerziell von der Cognis Corp. als EdenorTM und
EmersolTM erhältlich sind), besitzen natürliche Promotoren,
welche ihre transkriptionelle Regulation kontrollieren. Diese Promotoren
sind jedoch manchmal unzureichend, um ein Niveau der Transkription
zu erzielen, welche benötigt
wird, um Genprodukte, wie beispielsweise CPR oder CYTb5, die in
einem gegebenen Prozess involviert sind, herzustellen.
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Daher
besteht ein Bedürfnis
für ein
verbessertes Verfahren zu Erhöhung
der Produktion von Dicarbonsäuren
in Hefe.
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ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von
Dicarbonsäuren,
wie in Anspruch 1 definiert.
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BESCHREIBUNG DER FIGUREN
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1A–1B zeigen
die Nukleotid-Sequenz des CYP52A2A-Gens von C. tropicalis 20336.
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2A–2B zeigen
die Nukleotid-Sequenz des CPRA-Gens von C. tropicalis 20336.
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3A–3B zeigen
die Nukleotid-Sequenz des CPRB-Gens von C. tropicalis 20336.
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4A–4C zeigen
die Nuldeotid-Sequenz des CYTb5-Gens von C. tropicalis 20336 zusammen mit
Aminosäure-Sequenzen,
welche bestimmten, eingezeichneten Nukleinsäure-Sequenzen entsprechen.
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5A–5D zeigen
die Nukleotid-Sequenz des CYP52A2A/CPRB-Fusionsgens zusammen mit Aminosäure-Sequenzen,
welche bestimmten, eingezeichneten Nukleinsäure-Sequenzen entsprechen.
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6A ist
eine schematische Darstellung des λ-ZAP ExpressTM-Vektors
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6B ist
eine Abbildung des pBK-CMV-Phagmid-Vektors
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7 ist
eine schematische Darstellung des Plasmids pCR2.1TM,
der von Invitrogen erhältlich
ist. Nukleinsäure-Sequenzen
für ausgewählte Restriktionsstellen
und andere Merkmale sind dargestellt (SEQ. ID. Nr. 33 und komplementärer Strang
SEQ. ID. Nr. 34).
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8 stellt
die Nukleotid-Sequenz des URA3A-Gens zusammen mit Aminosäure-Sequenzen
dar, welche bestimmten, eingezeichneten Nukleinsäure-Sequenzen entsprechen.
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9 ist
eine schematische Darstellung des Plasmids pNEB 193.
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10 ist
eine schematische Darstellung des pURAin-Integrationsvektors.
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11 stellt
die Nuldeotid-Sequenz des CYP52A2A-Genpromotors/CYP52A5A-ORF-Fusionsgens dar.
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DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
DER ERFINDUNG
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Die
Erhöhung
der Produktion von Dicarbonsäure
in Übereinstimmung
mit der vorliegenden Erfindung basiert auf dem Isolieren eines Promotor
eines Hefegens, welches ein gewünschtes
Expressionsniveau aufweist, und dem operativen Verbinden des Promotors
mit einem Zielgen, welches in die Produktion von Dicarbonsäuren involviert
ist. Demzufolge erhöht
die Promotor-Subtitution unter Verwendung eines hochinduzierbaren,
heterologen Promotors, der operativ mit dem offenen Leserahmen (ORF
= Open Reading Frame) eines Zielgens, welches in die Produktion
von Dicarbonsäuren
in Hefe involviert ist, die Ausbeute an Dicarbonsäure aufgrund
einer erhöhten
Transkription. Darüber
hinaus können
Promotoren von Genen, die zu verschiedenen, definierten Zeitpunkten
während
der Biokonversion als Antwort auf bestimmte Stimuli (zum Beispiel
Hitze, Substrat, Zelltot) induziert werden, für die Promotor-Substitution
des Zielgens verwendet werden, was zu einer erhöhten Produktion von Dicarbonsäuren zu
definierten Zeitpunkten während
des Bioprozess führt.
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Das
CYP52A2A-Gen von C. tropicalis 20336 (SEQ. ID. Nr. 1) (siehe
1), wie in dem vorstehend genannten
US-Patent 6,331,420 und
in
WO 00/20566 A2 beschrieben,
ist ein Gen aus einer Familie von Genen, die in die Metabolisierung
von Ölsäure unter
Bildung von oleischer Dicarbonsäure
involviert sind. Das Niveau der transkriptionellen Induktion dieses
Gens in einer Ölsäure-Fermentation
ist vielfach (>25)
höher als das
anderer Mitglieder derselben Genfamilie. CPR-Gene von C. tropicalis
20336 (hierin auch als NCP-Gene bezeichnet), zum Beispiel CPRA (SEQ.
ID Nr. 2) und CPRB (SEQ. ID. Nr. 3) (Cytochrom-P450-Reduktase,
2 beziehungsweise
3),
sind andere Gene, die in das Verfahren zur Herstellung von Dicarbonsäuren involviert
sind. Das Niveau der transkriptionellen Induktion solcher CPR-Gene
in einer entsprechenden Fermentation ist jedoch nur dreimal höher als
der Hintergrund, was einen Geschwindigkeits-limitierenden Faktor
bei der Produktion von Dicarbonsäuren
definiert.
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Jedes
Gen, welches in die Fettsäure-Biokonversion
involviert ist und welches mit einer Geschwindigkeit transkribiert
wird, die geringer als CYP52A2A ist, kann durch die Substitution
seines nativen Promotors durch den CYP52A2A-Promotor hochreguliert werden. In einer
bevorzugten Ausführungsform
wird der Promotor des CPR-Gens durch den Promotor des CYP52A2A-Gens
oder anderer CYP-Gene substituiert, wodurch die transkriptionelle
Induktion des CPR-Gens erhöht
wird. Zum Beispiel ist der CYP-Promotor vom CYP52A2A-Gen von C.
tropicalis 20336 abgeleitet. Der vollständige Promotor des CYP-Gens
oder ein Teil davon, der alle essentiellen, funktionellen Stellen
der Promotorregion beinhaltet, wird operativ mit dem offenen Leserahmen
des CPR-Gens, wie dem CPRB-Gen aus C. tropicalis 20336, verbunden.
Dieses wiederum führt zu
einer erhöhten
Transkription und Produktion des CPR-Proteins und zu einer entsprechend
erhöhten
Konversion einer Fettsäure,
zum Beispiel Ölsäure, zu
ihrer entsprechenden Dicarbonsäure.
Der Begriff „operativ verbunden" bezieht sich auf
das Verbinden von Nukleinsäuresequenzen,
so dass die Funktion des einen durch den anderen beeinflusst wird.
Ein Promotor ist operativ mit dem offenen Lese rahmen verbunden,
wenn er in der Lage ist, die Expression des offenen Leserahmens
zu beeinflussen (das heißt,
der offene Leserahmen ist unter der transkriptionellen Kontrolle
des Promotors). Ungeachtet der Gegenwart anderer Sequenzen zwischen
dem Promotor und dem offenen Leserrahmen, ist zu verstehen, dass
der Promotor noch immer als operativ mit dem offenen Leserahmen
verbunden aufzufassen sein kann. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform
ist der Promotor des CYTb5-Gens durch den Promotor des CYP52A2A-Gens
oder eines anderen CYP-Gens in im Wesentlichen gleicher Weise, wie
hierin beschrieben, ersetzt, was zu einer erhöhten Produktion des CYTb5-Proteins
und einer Erhöhung
der Konversation von Fettsäuren
zu ihren entsprechenden Dicarbonsäuren führt.
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In
einer Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung wird der gewünschte Promotorbereich durch herkömmliche,
dem Fachmann bekannt Techniken isoliert. Das CYP-Gen wird an einer
geeigneten Stelle stromabwärts
des Promotor-Terminus
unter Verwendung eines geeigneten Restriktionsenzymes geschnitten, um
die Spaltung zu bewirken. Der strukturelle Bereich des CYP-Gens
wird dann entfernt, um im Wesentlichen eine DNA-Sequenz zu hinterlassen,
welche den Promotorbereich beinhaltet. Für die Spaltung stromaufwärts wird
eine Stelle gewählt,
die ausreichend weit stromaufwärts
liegt, damit in dem erhaltenen Bereich all die notwendigen, funktionellen
Stellen für
den Promotorbereich enthalten sind und dann unter Verwendung eines
geeigneten Restriktionsenzyms gespalten. Es sollte verstanden werden,
dass in all den hierin beschriebenen Ausführungsformen der Promotor in
einem Nukleinsäurefragment
enthalten sein kann, welches größer als
der eigentliche Promotorbereich ist und dass das gesamte Fragment,
einschließlich
einer zusätzlichen
Nuldeinsäuresequenz,
für die
Fusion mit einem Zielgen verwendet werden kann.
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Als
nächstes
wird ein Promotor/Zielgen-Offener-Leserahmen-Nukleotid-Fusionskonstrukt
hergestellt. Der Promotor wird operativ mit einem heterologen Zielgen,
das heißt
mit dem offenen Leserahmen eines vom CYP52A2A-Gen verschiedenen
Gens verbunden, um ein Nukleotid-Fusionskonstrukt für eine Integra tion
in einer Wirtszelle zu bilden. Verfahren zum Fusionieren eines Promotors
mit Zielgenen derart, dass sie operativ verbunden sind und das gewünschte DNA-Konstrukt liefern,
sind aus dem Stand der Technik wohl bekannt. Restriktionsenzyme,
Ligationsenzyme und Polymerasen sind herkömmliche Werkzeuge, welche üblicherweise
durch den Fachmann zur Herstellung solcher Fusionskonstrukte verwendet
werden. In einer bevorzugten Ausführungsform werden Primer für die Polymerasekettenreaktion
(PCR = Polymerase Chain Reaction) hergestellt, um den Promotor des
CYP52A2A-Gens unter Verwendung der PCR zu amplifizieren. Die korrekte
Sequenz wird mittels herkömmlicher,
dem Fachmann bekannter Techniken verifiziert. Der offene Leserahmen (ORF)
und der nicht-translatierte 3'-Bereich
(UTR = untranslated Region) des Zielgens, zum Beispiel CPR oder CYTb5,
werden ebenfalls mittels PCR amplifiziert und durch Sequenzierung
verifiziert. Diese beiden Sequenzen werden dann mittels PCR unter
Verwendung der beiden PCR-Produkte und den Original-Primern der
ursprünglichen
PCRs, die im Bereich der Fusionsverbindung nicht homolog sind, miteinander
fusioniert. Das Produkt beinhaltet den CYP52A2A-Promotor, das ORF
des Zielgens und das 3'-UTR und wird durch
Sequenzanalyse verifiziert.
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Die
Promotor/Zielgen-ORF-Fusionskonstrukte werden dann verwendet, um
einen DNA-Integrationsvektor für
eine Transformation in irgendeine geeignete Wirtszelle herzustellen.
Geeignete Hefe-Wirtszellen zur erfindungsgemäßen Verwendung beinhalten zum
Beispiel, sind aber nicht beschränkt
auf, Yarrowia, Bebaromyces, Saccharomyces, Schizosaccharomyces und
Pichia und mehr bevorzugt solche der Gattung Candida. Bevorzugte
Arten von Candida sind tropicalis, maltosa, apicola, paratropicalis,
albicans, cloacae, guillermondii, intermedia, lipolytica, parapsilosis
und zeylenoides.
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Insbesondere
bevorzugte Wirte beinhalten C. tropicalis-Stämme, die genetisch modifiziert
wurden, so dass eines oder mehrere der chromosomalen POX4A-, PDX4B- und beide
POX5-Gene, wie zum Beispiel beschrieben in
US-Patenten 5,254,466 und
5,620,878 , jedes durch Referenz
eingeführt,
zerstört
wurden. Eine solche Zerstörung
blockiert den β-Oxidationsweg.
Beispiele für
C. tropicalis-Stämme mit
blockierter β-Oxidation
beinhalten H41, H41B, H51, H45, H43, H53, H534, H534B, 11435 und
H5343 (ATCC 20962), wie im vorstehend genannten
US-Patent 5,254,466 beschrieben.
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Die
hierin beschriebenen DNA-Konstrukte können in geeigneten Expressionsvektoren
kloniert und exprimiert werden. Beispiele beinhalten, sind jedoch
nicht beschränkt
auf, Vektoren wie Plasmide, Phagemide, Phagen oder Cosmide, episomale
Hefe-Plasmide, artifizielle Hefechromosomen und Hefe-Replikationsplasmide.
Wirtszellen können
auch durch das Einführen
eines die gewünschte
Gensequenz beinhaltenden, linearen DNA-Vektors in die Zelle transformiert
werden. Eine solche lineare DNA kann vorteilhaft sein, wenn es erforderlich
ist, das Einführen
von nicht-nativer (fremder) DNA in die Zelle zu vermeiden. Zum Beispiel
kann DNA, bestehend aus einem gewünschten Zielgen/aus gewünschten
Zielgenen, flankiert von DNA-Sequenzen, die hinsichtlich der Zelle
nativ sind, durch Methoden wie, die jedoch nicht beschränkt sind
auf, Elektroporation, Lithiumacetat-Transformation und Spheroplasten,
in die Zelle eingeführt
werden. Flankierende DNA-Sequenzen können selektierbare Marker und/oder
andere Werkzeuge der Gentechnologie beinhalten. Hefe-Zellen können mit
jedem der hierin beschriebenen Expressionsvektoren transformiert
werden. Die Bezeichnung „Expressionsvektor" wird hierin breit
verwendet und soll jedes Medium umfassen, welches Nukleinsäuren beinhaltet
und welches verwendet werden kann, um eine Zielzelle zu transformieren.
Ein Expressionsvektor umfasst alle Beispiele für hierin aufgeführte Vektoren,
zum Beispiel Integrationsvektoren.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
wird das DNA-Konstrukt zur Transformation einer Hefezelle, zum Beispiel
von Candida sp., verwendet, um eine erhöhte Expression eines Proteins,
zum Beispiel eines CPR-Proteins, zu erzielen, wobei das DNA-Konstrukt
eine induzierbare CYP-Promotor-DNA zur Promotortranskription in
Hefe umfasst, welche operativ mit einer für das CPR-Protein kodierenden
DNA verbunden ist, um dessen Expression in der Hefezelle zu er möglichen,
wobei die CYP-Promotor-DNA hinsichtlich der DNA, welche für das Protein
kodiert, fremd oder heterolog ist. Einmal hergestellt, wird eine
die CYP52A2A-Promotor/Zielgen-ORF-Chimäre beinhaltende Hefe-Wirtszelle
gebildet.
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In
einer anderen bevorzugten Ausführungsform
wird das DNA-Fusionskonstrukt
zur Transformation einer Hefezelle, zum Beispiel Candida sp., verwendet,
um eine erhöhte
Expression eines CYTb5-Proteins zu erzielen, wobei das DNA-Konstrukt
eine induzierbare CYP-Promotor-DNA zur Promotortranskription in
Hefe umfasst, welche operativ mit einer für das CYTb5-Protein kodierenden
DNA verbunden ist, um dessen Expression in der Hefezelle zu ermöglichen,
wobei die CYP-Promotor-DNA hinsichtlich der DNA, welche für das CYTS-Protein
kodiert, fremd oder heterolog ist. Beispielsweise wird der vollständige CYP52A2A-Promotor oder
ein Teil davon, welcher vom CYP52A2A-Gen aus C. tropicalis 20336
erhalten wurde und welcher alle notwendigen, funktionellen Stellen
für die
Promotorregion beinhaltet, mit dem offenen Leserahmen eines CYTb5-Gens,
wie dem CYTb5-Gen aus C. tropicalis 20336, verbunden (4 zeigt die Nukleinsäuresequenz (SEQ. ID. Nr. 4)
und die Aminosäuresequenz
(SEQ. ID. Nr. 5), welche bestimmten, eingezeichneten Nukleinsäure-Sequenzen
entsprechen).
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Die
Stärke
des Promotors kann unter Verwendung von dem Fachmann wohl bekannten
Techniken bestimmt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform
kann die Promotorstärke
unter Verwendung der quantitativen kompetitiven reversen Transkriptionspolymerase-Kettenreaktion
(QC-RT-PCR = quantitative competitive reverse transcription polymerase
chain reaction) bestimmt werden, um die CPR- und die CYTb5-Genexpression
in Hefe, zum Beispiel in aus Fermentatoren isolierten Candida-Zellen,
zu bestimmen. Enzymatische Assays und Antikörper, die für CPR- und CYTb5-Proteine spezifisch
sind, können,
wenn angebracht, verwendet werden, um zu verifizieren, dass sich
eine erhöhte
Promotorstärke
in einer erhöhten
Synthese des entsprechenden Proteins widerspiegelt. Die Produktion
von Disäuren
wird somit durch selektive Integration, Amplifizierung und Überexpression
von CPR- und CYTb5-Genen in einem Hefe-Produktionswirt, zum Beispiel
C. tropicalis, C. maltosa, Pichia usw., verbessert.
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Die
mit einem der vorstehend genannten Vektoren transformierten Hefe-Zellen können in
Medien kultiviert werden, welche ein organisches Substrat beinhalten,
um eine verbesserte Produktion von Dicarbonsäure(n) zu ermöglichen.
Das Kultivieren, das heißt
das Fermentieren, von Hefe kann durch Verfahren, welche im Stand
der Technik sehr wohl bekannt sind, wie beispielsweise im zuvor
genannten
US-Patent 5,254,466 beschrieben,
bewerkstelligt werden.
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Ein
hierin geeignetes organisches Substrat kann jede organische Verbindung
sein, das zu einer Mono- oder Polycarbonsäure biooxidierbar ist. Eine
solche Verbindung kann jede gesättigte
oder ungesättigte
aliphatische Verbindung oder jede carboxylische oder heterocyclische
aromatische Verbindung sein, die mindestens eine terminale Methyl-Gruppe,
eine terminale Carboxyl-Gruppe und/oder eine terminale funktionelle
Gruppe, die durch Biooxidation zu einer Carboxyl-Gruppe biooxidierbar
ist, besitzt. Eine terminale funktionelle Gruppe, welche ein Derivat
einer Carboxyl-Gruppe ist, kann in einem Substratmolekül vorhanden
sein und kann durch eine von einer Biooxidation verschiedenen Reaktion
zu einer Carboxyl-Gruppe umgesetzt werden. Wenn beispielsweise die
terminale Gruppe ein Ester ist, dessen Hydrolyse weder der Wildtyp
von C. tropicalis noch dessen hierein beschriebene, gentische Modifikationen
ermöglichen,
dann kann während
des Fermentationsschrittes eine Lipase zugesetzt werden, um freie
Fettsäuren
freizusetzen. Geeignete organische Substrate beinhalten, sind aber
nicht beschränkt
auf, gesättigte
Fettsäuren,
ungesättigte
Fettsäuren,
Alkane, Alkene, Alkine und Kombinationen davon.
-
Alkane
sind ein Typ gesättigter
organischer Substrate, welche hierin besonders geeignet sind. Die
Alkane können
linear oder zyklisch, verzweigt oder geradkettig, substituiert oder
unsubstitiert sein. Insbesondere bevorzugte Alkane sind solche,
welche etwa 4 bis etwa 25 Kohlenstoffatome besitzen, wobei Beispie le
hierfür Butan,
Hexen, Octan, Nonan, Dodecan, Tridecan, Tetradecan, Hexadecan, Octadecan
und dergleichen beinhalten, jedoch nicht auf diese beschränkt sind.
-
Beispiele
ungesättigter
organischer Substrate, welche hierin verwendet werden können, beinhalten, sind
jedoch nicht beschränkt
auf, interne Olefine wie etwa 2-Penten, 2-Hexen, 3-Hexen, 9-Octadecen
und dergleichen; ungesättigte
Carbonsäuren
wie etwa 2-Hexensäure
und deren Ester, Ölsäure und
deren Ester, einschließlich
Triglycerinester, welche einen vergleichsweise hohen Ölsäure-Gehalt
aufweisen, Erucasäure
und deren Ester, einschließlich
Triglycerinester, welche einen vergleichsweise hohen Erucasäure-Gehalt
aufweisen, Ricinolsäure
und deren Ester, einschließlich
Triglycerinester, welche einen vergleichsweise hohen Ricinolsäure-Gehalt
aufweisen, Linolsäure
und deren Ester, einschließlich
Triglycerinester, welche einen vergleichsweise hohen Linolsäure-Gehalt
aufweisen; ungesättigte
Alkohole wie etwa 3-Hexen-1-ol, 9-Octadecen-1-ol und dergleichen;
ungesättige
Aldehyde wie etwa 3-Hexen-1-al, 9-Octadecen-1-al und dergleichen. Zusätzlich zu
den Vorstehenden kann ein organisches Substrat, welches hierin verwendet
werden kann, alicyclische Verbindungen einschließen, welche mindestens eine
interne Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindung und mindestens eine
terminale Methyl-Gruppe, eine terminale Carboxyl-Gruppe und/oder
eine terminale funktionelle Gruppe, welche durch Biooxidation zu
einer Carboxyl-Gruppe biooxidierbar ist, aufweisen. Beispiele für solche
Verbindungen beinhalten, sind jedoch nicht beschränkt auf,
3,6-Dimethyl-1,4-Cyclohexdien, 3-Methylcyclohexen,
3-Methyl-1,4-Cyclohexadien und dergleichen.
-
Beispiele
aromatischer Verbindungen, welche hierin verwendet werden können, beinhalten,
sind jedoch nicht beschränkt
auf, Arene, wie etwa o-, m-, p-Xylol;
o-, m-, p-Methylbenzoesäure;
Dimethylpyridin, Sterole und dergleichen. Das organische Substrat
kann auch andere funktionelle Gruppen beinhalten, die zu Carboxyl-Gruppen
biooxidierbar sind, wie etwa eine Aldehyd- oder eine Alkohol-Gruppe.
Das organische Substrat kann auch andere funktionelle Gruppe bein halten,
die nicht zu Carboxyl-Gruppen bioxidierbar sind und welche die Biooxidation
nicht beeinträchtigen,
wie etwa Halogene, Ether und dergleichen.
-
Beispiel
gesättigter
Fettsäuren,
welche Hefe-Zellen, die die vorstehend genannten, erfindungsgemäßen Fusionskonstrukte
beinhalten, angeboten werden können,
beinhalten Capronsäuren,
Enanthsäuren,
Caprylsäuren,
Pelargonsäuren,
Caprinsäuren,
Undecensäuren,
Laurinsäuren,
Myristinsäuren,
Pentadecansäuren,
Palmitinsäuren,
Margarinsäuren,
Stearinsäuren,
Arachidinsäuren,
Behensäuren
und Kombinationen davon. Beispiele ungesättigter Fettsäuren, welche
genetisch modifizierten Hefe-Zellen angeboten werden können, beinhalten
Palmitoleinsäuren, Ölsäuren, Erucasäuren, Linolsäuren, Linolensäuren und
Kombinationen davon. Alkane und Fraktionen von Alkanen können eingesetzt
werden, welche Kettenlängen
von C12 bis C24 in jeder Kombination beinhalten. Ein Beispiel einer
bevorzugten Fettsäuremischung
ist HOSFFA (hoch Ölsäure-haltiges
Sonnenblumenöl,
das ist eine Fettsäuremischung
beinhaltend etwa 80% Ölsäure, kommerziell
erhältlich
von Cognis Corp. als EdenorTM).
-
Die
folgenden Beispiele dienen dazu, die Erfindung zu veranschaulichen,
nicht jedoch zu beschränken.
-
BEISPIEL 1
-
Konstruktion eines CYP52A2A/CPRB-Fusionsgens
-
PCR-Primer
wurden für
den Promotorbereich in den CYP52A2A-Konstrukten bestimmt. Ein Nukleotid-Segment
von etwa 496 bp beinhaltend den CYP52A2A-Promotor (–496 bp
vom Startkodon des CYP52A2A-Gens, siehe Positionen 9–504 in
5A)
wurde unter Verwendung der unten angegebenen CYP2A#1- und CYP2A
fus-Primer amplifiziert. Die ORF (Open Reading Frame) von CPR B
und seinem 3'UTR wurden
unter Verwendung von CPR fus und CPRB#2 amplifiziert. Diese beiden
PCR-Produkte wurden mittels PCR unter Verwendung des CYP2A#1- und
des CPRB#2-Primers fusioniert, um ein Konstrukt beinhaltend etwa
500 bp des 3'UTR
zu erzeugen. In allen PCR-Reaktionen wurde Platinum Pfx (Stratagene,
LaJolla, Ca) verwendet. Die Nukleotid-Sequenzen der vorstehend genannten Primer
sind in der nachfolgenden Tabelle 1 gezeigt: TABELLE
1
-
Die
Sequenz des resultierenden Konstruktes wurde vor der Verwendung
verifiziert (siehe 5, welche die Nukleinsäure-Sequenz
(SEQ. ID. Nr. 10) und die Aminosäure-Sequenz,
welche bestimmten, eingezeichneten Nuldeinsäure-Sequenzen entspricht, veranschaulicht.
-
Das
erzeugte Fragment beinhaltete drei Rasensubstitutionen in den Promotor-
und ORF-Bereichen der entsprechenden Gene, welche verschieden von
den elterlichen Sequenzen waren, jedoch lagen keine Veränderungen
in der Aminosäure-Zusammensetzung
vor. Es lag eine „T" durch „A"-Substitution an
Position 483 im CYP52A2A-Promotorbereich, eine „T" durch „C"-Substitution an Position 573 und eine „C" durch „T"-Substitution an
Position 2.013 des CPRB ORF vor. Zusätzlich gibt es einige Beweise
dafür,
dass in C. tropicalis das Kodon CTG nicht als Leucin in Übereinstimmung
mit dem „universellen
genetischen Code",
sondern als Serin translatiert wird. Siehe zum Beispiel Ueda et
al., Biochemie (1994) 76, 1.217–1.222).
Jedoch wurde diese Behauptung noch nicht schlüssig bewiesen. Da demnach das
CTG-Kodon an Position 652–654
der 5A entwe der als ein Leucin oder als Serin translatiert
wird, wird die fünfzigste
Aminosäure,
welche in 5A gezeigt ist, mit „X" bezeichnet, wobei „X" Leucin oder Serin
sein kann. Dieses Konstrukt wurde in einen Intergationsvektor, pURAin
RED B als ein PacI-sensitives Fragment eingeführt, um den neuen Vektor pURAin
CPR B/2A-NCP zu erzeugen, und dann in C. tropicalis überführt.
-
Die
vorstehend beschriebenen Prozeduren zum Klonieren der CYP52A2A- und CPRB-Gene, zur
Herstellung des Integrationsvektors pURAin REDE und zur Transformation
von Zellen mit dem Vektor sind im vorstehend genannten
US-Patent
6,331,420 und in
WO
00/20566 A2 beschrieben und sind auch nachfolgend enthalten.
-
BEISPIEL 2
-
Protokoll für die quantitative kompetitive
reverse Transkriptions-Polymerase-Kettenreaktion
(QC-RT-PCR)
-
QC-RT-PCR
ist eine Technik, die verwendet wird, um die Menge einer spezifischen
RNA in einer RNA-Probe zu quantifizieren. Diese Technik wendet die
Synthese eines spezifischen DNA-Moleküls, welche komplementär zu einem
RNA-Molekül
in der ursprünglichen
Probe ist, durch reverse Transkription und seine nachfolgende Amplifizierung
durch Polymerasekettenreaktion an. Durch die Zugabe verschiedener
Mengen eines Kompetitor-RNA-Moleküls zu der Probe kann man die
Konzentration des im Interesse stehenden RNA-Moleküls (beispielsweise
der mRNA-Transkripte des CPR- oder CYTb5-Gens) bestimmen. Die Mengen an
spezifischen mRNA-Iranskripten werden zeitabhängig als Antwort auf die Zugabe
von Fettsäure-
oder Alkansubstraten zum Wachstumsmedium von fermentativ gezüchteten
C. tropicalis-Kulturen bestimmt, um die Gene, welche in die Oxidation
dieser Substrate involviert sind, zu identifizieren und zu charakterisieren.
-
A. Primer-Design
-
Die
erste Voraussetzung für
eine QC-RT-PCR ist das Design der Primer-Paare, welche für die reverse Transkription
und die nachfolgenden PCR-Reaktionen
verwendet werden sollen. Diese Primer müssen einzigartig und spezifisch
für das
im Interesse stehende Gen sein. Primer, welche zur Messung der Expression
der CYTb5-Gene von C. tropicalis 20336 unter Verwendung des QC-RT-PCR-Protokolls verwendet
wurden, sind in der Tabelle 2 aufgeführt.
-
Tabelle
2. Primer, welche zur Messung der C. tropicalis CYTb5-Genexpression in
den QC-RT-PCR-Reaktionen verwendet wurden
- V
= Vorwärts
R = Rückwärts
-
B. Design und Synthese des DNA-Kompetitor-Templates
-
Die
Kompetitor-RNA wird in vitro von einem DNA-Kompetitor-Templat synthetisiert,
welches den T7-Polymerase-Promotor aufweist und vorzugsweise eine
kleine Deletion von beispielsweise etwa 10 bis 25 Nukleotiden im
Vergleich zur nativen Ziel-RNA-Sequenz in sich trägt. Das
DNA-Templat für
die in vitro-Synthese
der Kompetitor-RNA wird unter Verwendung von PCR-Primern, die zwischen
42 und 46 Nukleotide lang sind, synthetisiert. In diesem Beispiel
sind die Primer-Paare für
die Synthese der CYTb5-Kompetitor-DNA in der Tabelle 3 gezeigt.
-
Tabelle
3. Vorwärts-
und Rückwärts-Primer,
welche zur Synthese des RNA-Kompetitor-Templates
für die
QC-RT-PCR-Messung der Expression des CYTb5-Gens verwendet wurden
-
Der
Vorwärts-Primer
wird mit dem entsprechenden Rückwärts-Primer
verwendet, um das DNA-Kompetitor-Templat zu synthetisieren. Die
Primer-Paare werden in einer Standart-Taq Gold Polymerase-PCR-Reaktion
(Perkin-Elmer/Applied
Biosystems, Foster City, CA) gemäß den vom
Hersteller empfohlenen Instruktionen kombiniert. Die PCR-Reaktionsmischung
enthält
eine finale Konzentration von 250 nM für jeden Primer und 10 ng chromosomaler
C. tropicalis-DNA als Templat. Die Reaktionsmischung wird für 25 bis
35 Zyklen unter Verwendung der höchsten
Annealing-Temperaturen, welche während
der PCR-Reaktionen
möglich
sind, in einem Thermozykler platziert, um ein homogenes PCR-Produkt
sicherzustellen (in diesem Fall 62°C). Die PCR-Produkte werden
entweder über
ein Gel oder über
einen Filter aufgereinigt, um nicht-eingebaute Nukleotide und Primer
zu entfernen. Das DNA-Kompetitor-Templat wird dann unter Verwendung
der (A260/A280)-Methode quantifiziert.
-
C. Synthese der Kompetitor-RNH
-
DNA-Kompetitor-Templat
wird in vitro unter Verwendung des Megascript T7 von Ambion Biosciences (Ambion
Inc., Austin, Texas) transkribiert, um die Kompetitor-RNA herzustellen.
250 Nanogramm (ng) des DNA-Kompetitor-Templates und die Reagenzien für die in
vitro-Transkiption wurden vermischt und die Reaktionsmischung wurde
für 4 Stunden
bei 37°C
inkubiert. Die resultierenden RNA-Präparationen wurden dann durch
Gel-Elektrophorese dahingehend untersucht, unter welchen Bedingungen
die höchste
Ausbeute und Qualität
an Kompetitor-RNA erhalten wird. Dieser Schritt kann eine Optimierung
entsprechend den Beschreibungen des Herstellers erfordern. Das DNA-Templat
wurde dann unter Verwendung der DNase I-Restriktionsendonuklease
entfernt. Die Kompetitor-RNA wurde dann durch die (A260/A230)-Methode quantifiziert. Serielle Verdünnungen
(1 ng/ml bis 1 Femtogramm (fg)/ml) der RNA wurden zur Verwendung
in den QC-RT-PCR-Reaktionen hergestellt und die ursprünglichen
Stammlösungen
wurden bei –70°C gelagert.
-
D. QC-RT-PCR-Reaktionen
-
QC-RT-PCR-Reaktionen
wurden unter Verwendung des rTth-Polymerase-Kits (Perkin-Elmer/Applied Biosystems,
Foster City, CA) entsprechend den vom Hersteller empfohlenen Bedingungen
durchgeführt.
Die Reaktion der reversen Transkription wurde in einem Volumen von
10 μl mit
einer finalen Konzentration von 200 mM für jedes dNTP, 1,25 Einheiten
rTth-Polymerase, 1,0 mM MnCl2, 1 X des 10
X-Puffers, der vom Hersteller des Enzyms mitgeliefert wurde, 100
ng an Gesamt-RNA, welche aus einer fermentativ gewachsenen C. tropicalis-Kultur
isoliert wurde, und 1.25 mM des geeigneten reversen Primers durchgeführt. Um
die CYTb5-Expression in C. tropicalis zu quantifizieren, ist 3740-179C
(siehe Tabelle 2) ein geeigneter, reverser Primer. Es wurden einige
Reaktionsmischungen für
jede charakterisierte RNA-Probe hergestellt. Um die CYTb5-Expression
zu quantifizieren, wurde eine Serie von 8 bis 12 der zuvor beschriebenen
QC-RT- PCR-Reaktionsmischungen
in verschiedenen Reaktions-Röhrchen
aliquotiert. 1 ml einer seriellen Verdünnung, beinhaltend 100 pg bis 100
fg CYTb5-Kompetitor-RNA
pro ml, wurde jedem Röhrchen
zugesetzt, um die finalen Reaktionsmischungen auf ein finales Volumen
von 10 μl
zu bringen. Die QC-RT-PCR-Reaktionsmischungen
wurden vermischt und bei 70°C
für 15
Minuten entsprechend den vom Hersteller empfohlenen Zeiten inkubiert,
damit die reverse Transkription erfolgt. Nachdem die 15-minütige Inkubation
abgeschlossen war, wurde die Temperatur der Probe auf 4°C reduziert,
um die Reaktion zu stoppen, und 40 μl der PCR-Reaktionsmischung
wurden der Reaktion zugesetzt, um das Gesamtvolumen auf 50 μl zu bringen.
Die PCR-Reaktionsmischung bestand aus einer wässrigen Lösung beinhaltend 0,3125 mM
des Vorwärts-Primers
3740-179A (siehe
Tabelle 2), 3,125 mM MgCl2 und 1 X des mit
dem Enzym von Perkin-Elmer mitgelieferten Chelatisierungs-Puffers.
Die Reaktionsmischungen wurden in einen Perkin-Elmer GeneAmp-PCR-System-2400-Thermozykler
(Perkin-Elmer/Applied Biosystems,
Foster City, CA) platziert und der folgende PCR-Zykius wurde durchgeführt: 94°C für 1 Minute, gefolgt
von 94°C
für 10
Sekunden, gefolgt von 58°C
für 40
Sekunden für
17 bis 22 Zyklen. Die PCR-Reaktion wurde mit einer finalen Inkubation
bei 58°C
für 2 Minuten,
gefolgt von 4°C,
vervollständigt.
In einigen Reaktionen, bei denen keine nachweisbaren PCR-Produkte hergestellt
wurden, wurden die Proben für
zusätzliche
Zyklen in den Thermozykler zurückgebracht
und dieser Prozess wurde wiederholt, bis ausreichend PCR-Produkte
hergestellt wurden, um diese mittels HPLC zu quantifizieren. Die
Zahl der Zyklen, die notwendig waren, um genügend PCR-Produkt zu bilden,
ist eine Funktion der Menge an Ziel-mRNA in den 100 ng der zellulären Gesamt-RNA.
In Kulturen, in denen das CYTb5-Gen stark exprimiert ist, liegt
ausreichend CYTb5-mRNA vor und es sind weniger (<17) PCR-Zyklen notwendig, um quantifizierbare
Mengen an PCR-Produkt zu bilden. Je geringer die Konzentrationen
der vorhandenen Ziel-mRNA, je mehr PCR-Zyklen sind erforderlich,
um detektierbare Mengen an Produkt zu bilden.
-
E. HPLC-Quantifizierung
-
Nach
Beendigung der QC-RT-PCR-Reaktionen wurden die Proben analysiert
und mittels HPLC und Agarose-Gel-Elektrophorese quantifiziert. Fünf bis fünfzehn Mikroliter
der QC-RT-PCR-Reaktionsmischung wurden in eine Waters-Bio-Compatible-625-HPLC,
welche mit einem abstimmbaren Waters-484-Detektor (Waters Corp., Milford, MA)
ausgerüstet
war, injiziert. Der Detektor wurde so eingestellt, dass er eine
Wellenlänge
von 254 nm misst. Die HPLC beinhaltete eine Sarasep-Marken-DNASepTM-Säule
(Sarasep, Inc., San Jose, CA), welche innerhalb des Ofen platziert
war, und die Temperatur wurde auf 52°C eingestellt. Die Säule wurde
entsprechend der Empfehlung des Herstellers mit 30 cm eines erhitzten
PEEK-Schlauches, welcher zwischen dem Injektor und der Säule installiert
war, installiert. Das System wurde mit einer vor dem Injektor positionierten
Sarasep-Marken-Schutzsäule
konfiguriert. Zusätzlich
befand sich eine 0,22 mm-Filterplatte unmittelbar vor der Säule innerhalb
des Ofens. Zwei Puffer wurden verwendet, um einen Elutionsgradienten
zum Herauslösen
und Quantifizieren der PCR-Produkte aus den QC-RT-PCR-Reaktionen
zu erzeugen. Puffer A besteht aus 0,1 M Triethylammoniumacetat (TEAA)
und 5% Acetonitril (Volumen auf Volumen). Puffer B besteht aus 0,1
M TEAA und 25% Acetonitril (Volumen auf Volumen). Die QC-RT-PCR-Proben
wurden in die HPLC injiziert und der lineare Gradient aus 75% Puffer
A/25% Puffer B bis 45% Puffer A/55% B wird über 6 Minuten bei einer Fließgeschwindigkeit
von 0,85 ml pro Minute gelaufen. Die kleinere QC-RT-PCR-Kompetitor-RNA
wurde vor dem größeren QC-RT-PCR-Produkt der
CYTb5-mRNA(U) aus der HPLC-Säule
eluiert. Die Menge an QC-RT-PCR-Produkten wurde mittels eines angeschlossenen
Waters-Corporation-745-Data-Moduls
aufgezeichnet und quantifiziert. Die logarithmischen Verhältnisse
der Menge an CYTb5-mRNA-QC-RT-PCR-Produkt (U) zur Menge an Kompetitor-QC-RT-PCR-Produkt
(C), gemessen als Peak-Flächen, wurden
aufgezeichnet und die Menge an Kompetitor-RNA, welche benötigt wurde,
um die Menge an CYTb5-mRNA-Produkt auszugleichen, wurde bestimmt.
-
BEISPIEL III
-
Aufreinigung genomischer DNA aus C. tropicalis
ATCC 20336
-
A. Herstellung einer genomischen Bibliothek
-
50
ml YEPD-Brühe
(siehe Anhang) wurden mit einer einzelnen C. tropicalis 20336-Kolonie
aus einer YEPD-Agar-Platte inokuliert und es über Nacht bei 30°C gezüchtet. 100
ml frische YEPD-Brühe
wurden mit 5 ml der Übernachtkultur
inokuliert und bei 30°C
für 4 bis
5 Stunden unter Schütteln
inkubiert. Die Zellen wurden durch Zentrifugation geerntet, zweimal
mit sterilem, destilliertem Wasser gewaschen, in 4 ml Spheroplasten-Puffer
(1 M Sorbitol, 50 mM EDTA, 14 mM Mercaptoethanol) resuspendiert
und für
30 Minuten bei 37°C unter
schonendem Schütteln
inkubiert. 0,5 ml Zymolase (2 mg/ml) (ICN Pharmaceuticals, Inc.,
Irvine, CA) wurden zugesetzt und es wurde bei 37°C für 30 bis 60 Minuten unter schonendem
Schütteln
inkubiert. Die Bildung von Spheroplasten wurde mittels SDS-Lyse
verfolgt. Die Spheroplasten wurden durch kurze Zentrifugation (4.000
UpM, 3 Minuten) geerntet und einmal mit dem Spheroplasten-Puffer
ohne Mercaptoethanol gewaschen. Die geernteten Spheroplasten wurden
dann in 4 ml Lysis-Puffer (0,2 M Tris/pH 8.0, 50 mM EDTA, 1% SDS), beinhaltend
100 mg/ml RNase (Qiagen Inc., Chatsworth, CA) resuspendiert und
bei 37°C
für 30
bis 60 Minuten inkubiert.
-
Die
Proteine wurden denaturiert und zweimal mit einem gleichen Volumen
an Chloroform/Isoamyl-Alkohol (24:1) durch schonendes Mischen der
zwei Phasen durch Drehung der Hand extrahiert. Die zwei Phasen wurden
durch Zentrifugation bei 10.000 UpM für 10 Minuten getrennt und die
wässrige
Phase beinhaltend die DNA mit hohem Molekulargewicht wurde gewonnen.
NaCl wurde der wässrigen
Phase bis zu einer finalen Konzentration von 0,2 M zugesetzt und
die DNA wurde durch den Zusatz von 2 Volumen Ethanol präzipitiert. Die präzipitierte
DNA wurde mit einem sauberen Glasstab aufgespult, in TE-Puffer (10
mM Tris/pH 8,0, 1 mM EDTA) resuspendiert und es wurde ihr ermöglicht,
sich über
Nacht bei 4°C
aufzulösen.
Der gelösten
DNA wurde RNase, welche frei von jeglicher DNase-Aktivität war (Qiagen
Inc., Chatsworth, CA) bis zu einer finalen Konzentration von 50
mg/ml zugesetzt und es wurde bei 37°C für 30 Minuten inkubiert. Dann
wurde Protease (Qiagen Inc., Chatsworth, CA) bis zu einer finalen
Konzentration von 100 mg/ml zugesetzt und es wurde für 30 Minuten
bei 55 bis 60°C
irrkubiert. Die Lösung
wurde einmal mit einem gleichem Volumen an Phenol/Chloroform/Isoamylal-Alkohol
(25:24:1) und einmal mit gleichem Volumen an Chloroform/Isoamyl-Alkohol
(24:1) extrahiert. 0,1 Volumen an 3 M Natriumacetat und 2 Volumen
an eiskaltem Alkohol (200 Proof) wurden der wässrigen Phase zugesetzt und
die DNA mit hohem Molekulargewicht wurde mit einem Glasstab aufgespult und
in 1 bis 2 ml TB-Puffer gelöst.
-
B. Präparation
genomischer DNA für
die PCR-Amplifizierung von CYTbS-Genen
-
Fünf 5 ml
YEPD-Medium wurde mit einer einzelnen Kolonie inokuliert und bei
30°C über Nacht
gezüchtet.
Die Kultur wurde für
5 Minuten bei 1.200 × g
zentrifugiert. Der Überstand
wurde durch Aufsaugen entfernt und 0,5 ml einer Sorbitol-Lösung (0,9
M Sorbitol, 0,1 M Tris-HCl/pH 8,0, 0,1 M EDTA) wurde dem Pellet zugesetzt.
Das Pellet wurde durch Vortexen resuspendiert und 1 ml 2-Mercaptoethanol und
50 ml einer Zymolase-Lösung
(10 mg/ml) wurden der Mischung zugesetzt. Das Röhrchen wurde für 1 Stunde
bei 37°C
auf einem Rotationsschüttler
(200 UpM) inkubiert. Das Röhrchen
wurde dann für
5 Minuten bei 1.200 × g
zentrifugiert und der Überstand
wurde durch Aufsaugen entfernt. Das Protoplasten-Pellet wurde in
0,5 ml 1 ×-TE
(10 mM Tris-Cl/pH 8,0, 1 mM EDTA) resuspendiert und in ein 1,5 ml-Mikrozentrifugenröhrchen transferiert.
Die Protoplasten wurden durch den Zusatz von 50 ml 10% SDS, gefolgt
von einer Inkubation bei 65°C
für 20
Minuten lysiert. Anschließend
wurden 200 ml 5 M Kaliumacetat zugesetzt und nach dem Mischen wurde
das Röhrchen
für mindestens
30 Minuten auf Eis inkubiert. Zelluläre Debris wurde durch Zentrifugation
bei 13.000 × g
für 5 Minuten
entfernt. Der Überstand
wurde sorgfältig
entfernt und in ein neues Mikrofugenröhrchen transferiert. Die DNA
wurde durch die Zugabe von 1 ml 100% (200 Proof) Ethanol, gefolgt
von einer Zentrifugation für
5 Minuten bei 13.000 × g
präzipitiert.
Das DNA-Pellet wurde mit 1 ml 70% Ethanol gewaschen, gefolgt von einer
Zentrifugation für
5 Minuten bei 13.000 × g.
Nach teilweisem Trocknen der DNA unter Vakuum wurde sie in 200 ml
1 × TE
resuspendiert. Die DNA-Konzentration wurde durch das Verhältnis der
Absorption bei 260 nm/280 nm (A260/280)
gemessen.
-
BEISPIEL IV
-
Konstruktion
einer genomischen Candida tropicalis 20336-Bibliothek Eine genomische
Bibliothek wurde unter Verwendung des λ-ZAP-ExpressTM-Vektors
(Stratagene, La Jolla, CA) (6A) konstruiert.
Genomische DNA wurde teilweise mit Sau3Al verdaut und Fragmente
im Bereich von 6 bis 12 kb wurden aus einem Agarose-Gel nach Elektrophorese
der verdauten DNA aufgereinigt. Diese DNA-Fragmente wurden dann
mit den BamHI-verdauten Armen des λ-ZAP-ExpressTM-Vektor
gemäß dem Protokoll
des Herstellers verbunden. Es wurden drei Ligationen angesetzt,
um etwa 9,8 × 105 unabhängige
Klone zu erhalten. Die Bibliothek wurde gepoolt und gemäß den Instruktionen
des Herstellers amplifiziert, um einen Vorrat mit hohem Titer (> 10 Plaque-bildende
Einheiten/ml) für
die Langzeitlagerung zu erhalten. Der Titer der verpackten Phagen-Bibliothek wurde
nach einer Infektion von E. coli XL1Blue-MRF'-Zellen bestimmt. E. coli XL1Blue-MRF'-Zellen wurden über Nacht
entweder in LB-Medium
oder in NZCYM (siehe Anhang), beinhaltend 10 mM MgSO4 und
0,2% Maltose, bei 37°C
beziehungsweise bei 30°C
unter Schütteln
gezüchtet.
Die Zellen wurden dann Zentrifugiert und in 0,5 bis 1 Volumen 10
mM MgSO4 resuspendiert. 200 ml dieser E.
coli-Kultur wurden mit verschiedenen Verdünnun gen der verpackten Phagen-Bibliothek
vermischt und für
15 Minuten bei 37°C
inkubiert. Zu dieser Mischung wurden 2,5 ml LB-Top-Agarose oder
NZCYM-Top-Agarose
(bei 60°C
gehalten) (siehe Anhang) zugegeben und auf LB-Agar oder NZCYM-Agar,
welcher sich in 82 mm-Petrischalen befand, platziert. Den Phagen
wurde es ermöglicht,
sich über
Nacht bei 37°C
fortzupflanzen, um diskrete Plaques zu erhalten und der Phagen-Titer
wurde bestimmt.
-
BEISPIEL 5
-
Screening der genomischen Bibliothek
-
Der λ-ZAP-ExpressTM-Vektor ist ein Phagemid-Vektor, der sich
entweder als Phagen- oder als Plasmid-DNA (nach Umwandlung des Phagen
in das Plasmid) fortpflanzen kann. Daher kann die genomische Bibliothek,
welche in diesem Vektor konstruiert wurde, entweder durch Plaque-Hybridisierung
(Screenen der lambda-Form der Bibliothek) oder durch Kolonie-Hybridisierung
(Screenen der Plasmid-Form der Bibliothek nach der Umwandlung des
Phagen in das Plasmid) gescreent werden. Der Mechanismus der Exzision
des Plasmids pBK-CMV (6B) aus dem Phagen λ-ZAP-ExpressTM (Stratagene, La Jolla, CA) erfordert die
Unterstützung
durch einen Helfer-Phagen, wie etwa ExAssistTM (Stratagene)
und eines E. coli-Stammes, wie etwa XLOR (Stratagene). Das Plasmid
pBK-CMV kann sich autonom in E. coli replizieren.
-
A. Screening genomischer Bibliotheken
(Plaque-Form)
-
1) Das Plattieren der λ-Bibliothek
-
E.
coli XL1Blue-MRF'-Zellen
wurden über
Nacht in LB-Medium (25 ml) beinhaltend 10 mM MgSO4 und 0,2%
Maltose bei 37°C
und 250 UpM gezüchtet.
Die Zellen wurden dann zentrifugiert (2.200 × g für 10 Minuten) und in 0,5 Volumen
10 mM MgSO4 resuspendiert. 500 ml dieser
E. coli-Kultur wurden mit einer Phagen-Suspension beinhaltend 25.000
amplifizierte lambda-Phagenpartikel
vermischt und für
15 Minuten bei 37°C
inkubiert. Zu dieser Mi schung wurden 6,5 ml NZCYM-Top-Agarose (bei
60°C gehalten)
zugegeben und auf 80–100
ml NZCYM-Agar (siehe Anhang), welcher sich in einer 150 mm-Petrischale befand,
plattiert. Es wurde den Phagen ermöglicht, sich über Nacht
bei 37°C
fortzupflanzen, um diskrete Plaques zu erhalten. Nach dem Wachstum über Nacht
wurden die Schalen für
1–2 Stunden
im Kühlschrank
gelagert, bevor das Herunternehmen der Plaques durchgeführt wurde.
-
2) Das Herunternehmen der Plaques und
DNA-Hybridisierung
-
Magna-LiftTM-Nylonmembranen (Micron Separartions, Inc.,
Westborough, MA) wurden unter vollständigem Kontakt mit den Plaques
auf die Agar-Oberfläche gelegt
und es wurde für
5 Minuten bei Raumtemperatur der Transfer der Plaques auf die Nylonmembranen
ermöglicht.
Nach dem Transfer der Plaques wurde die Membran auf zwei Lagen Whatman
3MTM-Filterpapier (Whatman, Hillsboro, OR),
welches mit einer 0,5 N NaOH, 1,0 M NaC1-Lösung gesättigt war, platziert und für 10 Minuten
bei Raumtemperatur dort belassen, um die DNA zu denaturieren. Ein Überschuss
an Denaturierungslösung
wurde durch das kurze Blotten auf trockenes Whatman 3M-PapierTM entfernt. Die Membranen wurden dann auf
zwei Lagen Whatman 3MTM-Papier, welches mit
0,5 M Tris-HCl (pH 8.0), 1,5 M NaCl gesättigt war, transferiert und
dort für
5 Minuten zur Neutralisation belassen. Die Membranen wurden dann
kurz in 200–500
ml 2 X SSC gewaschen, durch Luft getrocknet und für 30–40 Minuten
bei 80°C
gebacken. Die Membranen wurden dann mit markierter DNA untersucht.
-
Die
Membranen wurden mit 200–500
ml einer Lösung
aus 5 X SSC, 0,5% SDS, 1 mM EDTA (pH 8,0) für 1–2 Stunden bei 42°C unter Schütteln (60
UpM) vorgewaschen, um bakterielle Debris auf den Membranen loszuwerden.
Die Membranen wurden für
1–2 Stunden
bei 42°C
mit ECL-GoldTM-Puffer, beinhaltend 0,5 M NaCl
und 5% Blockierungsreagenz (Amersham) (in einem Volumen-Äquivalent von 0,125–0,25 ml/cm2 Membran) vorhybridisiert. DNA-Fragmente,
welche als Sonde verwendet wurden, wurden aus einem Agarose-Gel unter
Ver wendung eines QIAEX IITM-Gelextraktionskits
(Qiagen Inc., Chatsworth, CA) gemäß dem Protokoll des Herstellers
aufgereinigt und unter Verwendung eines Amersham ECLTM-direct-Nukleinsäure-Markierungskits
(Amersham) markiert. Markierte DNA (5–10 ng/ml Hybridisierungslösung) wurde
zu den vorhybridisierten Membranen gegeben und es wurde ein Fortschreiten
der Hybridisierung über
Nacht ermöglicht.
Am folgenden Tag wurden die Membranen zweimal unter Schütteln (60
UpM) bei 42°C
jeweils für
20 Minuten in einem Puffer beinhaltend entweder 0,1 (hohe Stringenz)
oder 0,5 (niedrige Stringenz) X SSC, 0,4% SDS und 360 g/l Harnstoff
(in einem Volumen-Äquivalent
von 2 ml/cm2 Membran) gewaschen. Danach
folgten zwei 5-Minuten-Waschungen bei Raumtemperatur in 2 X SSC
(in einem Volumen-Äquivalent
von 2 ml/cm2 Membran). Hybridisierungssignale
wurden unter Verwendung des ECLTM-Nukleinsäure-Detektions-Reagenzes erzeugt
und unter Verwendung von Hyperfilm ECLTM (Amersham)
detektiert.
-
Agar-Stopfen,
welche Plaques enthielten, die positiven Signalen auf dem Röntgenfilm
entsprechen, wurden mittels des breiten Endes einer Pasteurpipette
aus den Masterplatten herausgenommen. Die Plaques wurden durch das
Ausrichten der Platten auf dem Röntgenfilm
selektiert. Zu diesem Zeitpunkt wurden im Allgemeinen mehrfache
Plaques entnommen. Phagen-Partikel wurden durch das Aufquellen in
1 ml SM-Puffer (Sambrook et al., siehe oben) über Nacht eluiert. Das Phagen-Eluat
wurde dann verdünnt
und mit frisch gezüchteten
E. coli XL1Blue-MRF'-Zellen
plattiert, um 100–500
Plaques pro 85 mm NZCYM-Agarplatte
zu erhalten. Die Plaques wurden, wie zuvor, auf Magna-Lift-Nylonmembranen transferiert
und unter Verwendung derselben Sonde untersucht. Isolierte Plaques
aus Einzel-Wells, welche Signalen auf dem Röntgenfilm entsprachen, wurden
durch das Entfernen von Agar-Stopfen und das Eluieren der Phagen
durch das Aufquellen über Nacht
in 0,5 ml SM-Puffer ausgewählt.
-
B. Umwandlung der λ-Klone in die Plasmid-Form
-
Die
isolierten λ-Klone
wurden zur weiteren Analyse in die Plasmid-Form umgewandelt. Die
Umwandlung von der Plaque- in die Plasmid-Form wurde durch Infektion
der Plaques in den E. coli-Stamm BM25.8 bewerkstelligt. Der E. coli-Stamm
wurde über
Nacht bei 31°C,
250 UpM in LB-Medium beinhaltend 10 mM MgSO4 und
0,2% Maltose gezüchtet,
bis der OD600 1,1–1,4 erreicht hatte. Zehn Milliliter
der Übernachtkultur
wurden entfernt und mit 100 ml 1 M MgCl2 vermischt.
Ein Zellen-Volumen von 200 ml wurde entfernt, mit 150 ml eluierter
Phagen-Suspension vermischt und für 30 Minuten bei 31°C inkubiert.
LB-Brühe
(400 ml) wurde dem Röhrchen
zugefügt
und die Inkubation wurde für
1 Stunde bei 31°C
unter Schütteln,
250 UpM, fortgeführt.
1–10 ml
der infizierten Zellsuspension wurde auf LB-Agar beinhaltend 100
mg/ml Ampicillin (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO) ausplattiert.
Well-isolierte Kolonien wurden ausgewählt und über Nacht in 5 ml LB-Brühe beinhaltend
100 mg/ml Ampicillin bei 37°C,
250 UpM, gezüchtet.
Plasmid-DNA wurde aus diesen Kolonien isoliert und analysiert. Um
den λ-ZAP-ExpressTM-Vektor in die Plasmid-Form umzuwandeln,
wurden E. coli-XL1Blue-MRF'-Stämme und
XLOR verwendet. Die Umwandlung wurde entsprechend den Protokollen
des Herstellers (Stratagene) für
Einzel-Plaques-Exzisionen
durchgeführt.
-
BEISPIEL VI
-
Klonierung und Charakterisierung des C.
tropicalis 20336 Cytochrome b5-(CYTb5)-Gens
-
Das
CYTb5-Gen wurde aus der genomischen Candida tropicalis ATCC 20336-Bibliothek,
welche wie im Beispiel IV beschrieben hergestellt wurde, unter Verwendung
eines PCR-Fragmentes als Sonde isoliert. Die PCR-Fragment-Sonde
für CYTb5
wurde nach PCR-Amplifizierung genomischer Saccharomyces cerevisiae-DNA
mit Oligonukleotid-Primern erzeugt, welche entworfen wurden, um
eine Region unter Verwendung des vom National Center for Biotechnology
In formation erhältlichen
CYTb5-Gens von S. cerevisiae zu amplifizieren. Ein Vorwärts-Primer
3698-66A, 5' ATAAGAATGCGGCCGCTGAAC-GAGAACCACATCCAGGAG
3' (SEQ. ID. Nr.
16) und ein Rückwärts-Primer
3698-66B 5' CCTTAATTAAGGATAACCACATCCATACGTCGC
3' (SEQ. ID. Nr.
17) wurden basierend auf der S. cerevisiae-CYTb5-Sequence hergestellt.
Diese Primer wurden in paarweisen Kombinationen in einer PCR-Reaktion
mit Tag-Polymerase (Perkin-Elmer Cetus, Foster City, CA) entsprechend
den vom Hersteller empfohlenen Instruktionen verwendet. Ein PCR-Produkt
von etwa 1.036 bp wurde erhalten. Dieses Produkt wurde aus einem
Agarose-Gel unter Verwendung von Qiaquick (Quiagen, Chatsworth,
CA) aufgereinigt und in den pCR2.1-Vektor (7, Invitrogen,
La Jolla, CA) entsprechend den Empfehlungen des Herstellers ligiert.
Dieses PCR-Fragment wurde als Sonde für die Isolierung des C. tropicalis
20336-CYTb5-Homologs verwendet. Die genomische Bibliothek (siehe
Beispiele IV & V)
wurde unter Verwendung dieser CYTb5-Sonde gescreent und es wurde
ein Klon, welches das CYTb5-Gen in voller Länge enthielt, erhalten. Der
Klon enthielt ein Gen, welches regulatorische und Protein-kodierende
Bereiche enthielt (4). Ein offener
Leserahmen von 387 Nuldeotiden kodiert ein CYTb5-Protein von 129 Aminosäuren (4).
-
BEISPIEL VII
-
Konstruktion des CYP52A2A/CYTb5-Fusionsgens
-
In
einer Art und Weise ähnlich
wie in Beispiel I oben wird das 496 bp-Nukleotid-Segment beinhaltend den CYP52A2A-Promotor
mit dem offenen Leserahmen von CYTb5 verbunden, um ein CYP52A2A-Promotor/CYTb5-ORF-Fusionsprodukt zu
erhalten. Der CYP52A2A-Promotorbereich wird unter Verwendung von CYP2A#1-
und CYP2A/b5 fus-Primern (TGTGTCGGTCATGGTCGTGATGTG SEQ. ID. Nr.
18) amplifiziert. Das ORF von CYTb5 und sein 3'UTR werden unter Verwendung der b5/2A
fus- (CACATCACGACCATGACCGACACA SEQ. ID. Nr. 19) und b5#2-Primer
(CCCTTAATTAA GGGGGGATGGAAGTGGCCG SEQ. ID. Nr. 20) amplifiziert. Diesen
beiden PCR-Produkte werden mittels PCR unter Verwendung der CYP52A#1-
und b5#2-Primer
miteinander verbunden. Das resultierende Konstrukt wird vor der
Verwendung verifiziert und dann in einen Integrationsvektor, pURAin
RED B, als ein Pacl-sensitives Fragment eingesetzt, um einen neuen
Vektor zu erzeugen, und dann in C. tropicalis transformiert.
-
BEISPIEL VIII
-
Integration von CYP52A2A/CYTb5- und CYP52A2A/CPRB- Fusionsgenen in
das Genom von Candida tropicalis
-
Um
die ausgewählten
Gene in das Chromosom von C. tropicalis einzufügen, muss eine Ziel-DNA-Sequenz,
bei der es sich um ein intaktes Gen handeln kann oder auch nicht,
vorliegen, in welche die Gene eingefügt werden können. Weiterhin muss ein Verfahren
vorliegen, mittels dessen ein Integrations-Ereignis selektiert werden
kann. In einigen Fällen
sind die Ziel-DNA-Sequenz und der selektierbare Marker identisch
und, wenn dieses der Fall ist, dann muss auch ein Verfahren vorliegen,
mit dem die Verwertbarkeit des Zielgens als selektierbarer Marker
im Anschluss an ein Integrationsereignis wieder gewonnen werden
kann. In C. tropicalis und seinen Nachkommen ist URA3A, welches
für die
Orotidin-5'-Phosphat-Decarboxylase
kodiert, ein Gen, welches diese Kriterien erfüllt. Wenn es als ein Ziel für die Integration
verwendet wird, dann können
ura–-Varianten
in einer solchen Art und Weise transformiert werden, dass über homologe
Rekombination ein URA+-Gentyp regeneriert
wird. Abhängig
vom Design des Integrationsvektors können ein oder mehrere Gene gleichzeitig
in das Genom integriert werden. Unter Verwendung eines gespaltenen
URA3A-Gens würde
eine homologe Integration zu mindestens einer Kopie des Gens/der
Gene von Interesse führen,
welches/welche zwischen den Spaltbereichen des URA3A-Gens eingefügt ist/sind.
-
Darüber hinaus
kann aufgrund der hohen Ähnlichkeit
in der Sequenz zwischen den URA3A- und URA3B-Genen die Integration
des Konstruktes sowohl am URA3A- als auch am URA3B-Locus erfolgen.
Anschließend
kann ein Oligonukleotid, das mit einer Deletion in einem Teil des
URA-Gens entworfen wurde, welcher auf einer identischen Sequenz
sowohl innerhalb des URA3- als auch innerhalb des URA3B-Gens basiert, verwendet
werden, um C. tropicalis-Transformanten
zu erhalten, die wiederum ura
– sind, die jedoch ein
oder mehrere neu eingefügte,
ausgewählte
Gene tragen. Ura
–-Varianten von C. tropicalis
können
auch mittels anderer Methoden, wie etwa durch klassische Mutagenese
oder durch spontane Mutation isoliert werden. Unter Verwendung etablierter
Protokolle kann die Selektion von ura
–-Stämmen durch
die Verwendung von 5-Fluororotsäure (5-FOA
= 5'-Fluoroorotic
acid) erleichtert werden, wie zum Beispiel in Boeke et al., Mol.
Gen. Genet., 197: 345–346
(1984) beschrieben. Der Nutzen dieses Ansatzes zur Manipulation
von C. tropicalis ist gut dokumentiert und zum Beispiel beschrieben
in Picataggio et al., Mol. and Cell. Biol., 11: 4.333–4.339 (1991);
Rohrer et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 36: 650–654 (1992);
Picataggio et al., Bio/Technology, 10: 894–898 (1992);
US-Patent-Nummer 5,648,247 ;
US-Patent-Nummer 5,620,878 ;
US-Patent-Nummer 5,204,252 ;
US-Patent-Nummer 5,254,466 .
-
A. Konstruktion eines URA-Intergrationsvektors,
pURAin
-
Primer
wurden entworfen und synthetisiert, welche auf der 1712 bp-Sequenz
des URA3A-Gens von C. tropicalis 20336 basieren. URA3A-Primer Set
#1a (AGGCGCGCCGGAGTCCAAAAAGACCAACCTCTG (SEQ. ID. Nr. 21) und #1b
(CCTTAATTAATACGTGGATACCTTCAAGCAAGTG (SEQ. ID. Nr. 22) wurden in
einer PCR mit genomischer DNA von C. tropicalis verwendet, um URA3A-Sequenzen
zwischen den Nukleotiden 733 und 1.688 zu amplifizieren, wie in 8 gezeigt,
welche die Nuldeinsäure-Sequenz
(SEQ. ID. Nr. 23) und die Aminosäure-Sequenz
(SEQ. ID. Nr. 24), welche bestimmten, eingezeichneten Nukleinsäure-Sequenzen entsprechen,
darstellt. Die Primer wurden entworfen, um einzigartige 5'-AscI- und 3'-PacI-Restriktionsstellen in
das resultierende, amplifizierte URA3A-Fragment einzufügen. AscI-
und PacI-Stellen wurden ausgewählt, weil
diese Stellen in den CYTb5- oder CPRB-Genen nicht vorkommen. URA3A-Primer Set#2 wurde
in einer PCR mit genomischer DNA von C. tropicalis 20336 als Templat
verwendet, um URA3A-Sequenzen zwischen den Nukleotiden 9 und 758
zu amplifizieren, wie in 8 gezeigt. URA3A-Primer set
#2a, CCTTAATTAAGCTCACGAGTTTTGGGATTTT-CGAG (SEQ. ID. Nr. 25) und
#2b GGGTTTAAACCGCAGAGGTTGGTCTTTTTGGACTC (SEQ. ID. Nr. 26) wurden
entworfen, um einzigartige 5'-PacI-
und 3'-PmeI-Restriktionsstellen
in das resultierende, amplifizierte URA3A-Fragment einzufügen. Die
PmeI-Stelle kommt ebenfalls innerhalb der CYTb5- und CPRB-Gene nicht
vor. PCR-Fragmente
der URA3A-Gene wurden aufgereinigt, mit AscI-, PacI- und PmeI-Restriktionsenzymen
geschnitten und mit einem Gel-aufgereinigten, QiaexII-gereinigten AscI-PmeI-Verdau
des Plasmids pNEB 193 (9), erhalten von New England
Biolabs (Beverly, MA) verbunden. Das Verbinden wurde mit einer äquimolaren
Menge an DNA-Termini bei 16°C
für 16
Stunden unter Verwendung von T4-DNA-Ligase (New England Biolabs)
durchgeführt.
Ligationen wurden in E. coli XL1-Blue-Zellen (Stratagene, La Jolla,
CA) entsprechend den Empfehlungen des Herstellers transformiert.
Weiße
Kolonien wurden isoliert, gezüchtet,
Plasmid-DNA wurde isoliert und mit AscI-PmeI verdaut, um das Einfügen des
modifizierten URA3A in pNEB 193 zu bestätigen. Der resultierende Basen-Integrationsvektor
wurde als pURAin bezeichnet (10, SEQ.
ID. Nr. 27).
-
B. Konstruktion von pURAin RED B
-
Der
nächste
Schritt bestand darin, das CPRB-Fusionsgen in den pURAin-Integrationsvektor
zu klonieren. Gemäß einem
bevorzugten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird keine andere
als die speziell durch synthetische Restiktionsstellen-Sequenzen
bereitgestellte Fremd-DNA in die DNA, welche in das Ge nom von C.
tropicalis kloniert wird, eingefügt,
das heißt
mit Ausnahme der Restriktionsstellen-DNA werden nur native C. tropicalis-DNA-Sequenzen
in das Genom eingefügt.
pURAin wird mit PacI verdaut, mit QiaexII gereinigt und mit alkaliner
Phosphatase aus Garnelen (SAP = Shrimp Alkaline Phosphatase) (United
States Biochemical, Cleveland, OH) entsprechend den Empfehlungen
des Herstellers dephosphoryliert. Etwa 500 ng PacI-linearisierter
pURAin wurde für
1 Stunde bei 37°C
unter Verwendung von SAP in einer Konzentration von 0,2 Enzym-Einheiten
pro 1 pmol an DNA-Termini dephosphoryliert. Die Reaktion wurde durch
Hitze-Inaktivierung bei 65°C
für 20
Minuten gestoppt.
-
Vor
seiner Verwendung wurde das durch die Verwendung der vorstehend
beschriebenen Primer erhaltene CPRB-PacI-Fragment sequenziert und
mit CPRB verglichen, um zu bestätigen,
das durch die PCR keine DNA-Basenpaar-Austausche einführt wurden, welche zu einem
Aminosäure-Austausch
führen
würden. Nach
der Bestätigung
wurde CPRB mit dem Plasmid pURAin ligiert, der ebenfalls mit PacI
verdaut worden war. PacI-verdauter pURAin wurde dephosphoryliert
und mit dem CPR-Expand-Hi-Fi-PCR-Produkt, wie zuvor beschrieben,
ligiert. Die Ligations-Mischung wurde in E. coli XL1 Blue MRF' (Stratagene) transformiert
und es wurden mehrere resistente Kolonien ausgewählt und hinsichtlich korrekter
Konstrukte, welche die Vektor-Sequenz, das invertierte URA3A-Gen
und das amplifizierte CPRB-Gen (3)
aus 20336 beinhalten, gescreent. Ein AscI-PmeI-Verdau bestätigte ein
erfolgreiches Konstrukt. Dieser Vektor wurde mit pURAin RED B bezeichnet.
-
C. Konstruktion von Vektoren beinhaltend
die CYP52A2A/CPRB- und CYP52A2A/CYTb5-Fusionsgene
-
Der
zuvor konstruierte Integrationsvektor pURAin RED B wurde als Startvektor
ausgewählt.
Dieser Vektor wurde teilweise mit PacI verdaut und das linearisierte
Fragment wurde Gel-isoliert. Die aktive PacI wurde durch die Behandlung
mit T4-DNA-Polymerase zerstört
und der Vektor wurde re-ligiert. Die nach folgende Isolierung und
der komplette Verdau dieses neuen Plasmids brachte einen Vektor
hervor, der nur eine PacI-Stelle beinhaltete. Dieses Fragment wurde
Gel-isoliert, dephosphoryliert und mit dem CYP52A2A/CPRB-PacI-Fragment
ligiert. Alternativ wurde dieses Fragment Gel-isoliert, dephosphoryliert
und mit dem CYP52A2A/CYTb5-PacI-Fragment ligiert.
-
D. Bestätigung der Integration des
CYPS2A2A/CPRB-Fusionsgens
-
Basierend
auf dem Vektorkonstrukt beinhaltend das CYP52A2A/CPRB-Fusionsgen, welches
zur Transformation von C. tropicalis verwendet wurde, wurde ein
Schema zum Nachweise einer Integration entworfen. Genomische DNA
aus Transformanten wurde mit PacI, welches ein Enzym ist, das das
Fusionsgen schneidet und freisetzt, welches aber nicht innerhalb
der CYP52A2A- und CPRB-Gene
schneidet, verdaut. Der Verdau der genomischen DNA, bei der eine
Integration an den URA3A- oder URA3B-loci stattgefunden hat, sollte
zu einem 3,04 kb-Fragment
führen.
Southern-Hybridisierung dieses Verdaus mit Fragmenten des CPRB-Gens
wurde verwendet, um nach diesen Integrationsereignissen zu screenen.
Die Intensität
des Bandensignals aus der Southern unter Verwendung des PacI-Verdaus
wird als Maß für Zahl der
Integrationsereignisse verwendet (das heißt, je mehr Kopien des CYP52A2A/CPRB-Fusionsgens
vorhanden sind, desto stärker ist
das Hybridisierungssignal).
-
C.
tropicalis-URA-Prototrophen wurden bei 30°C, 170 UpM, in 10 ml SC-Uracil-Medium gezüchtet, um genomische
DNA herzustellen. Genomische DNA wurde durch das vorstehend beschriebene
Verfahren isoliert. Genomische DNA wurde mit PacI verdaut. Ein 0,95%iges
Agarose-Gel wurde verwendet, um einen Southern-Hybridisierungs-Blot
herzustellen. Die DNA aus dem Gel wurde auf eine MagnaCharge-Nylonfiltermembran
(MSI Technologies, Westborn, MA) nach dem Verfahren des alkalischen
Transfers von Sambrook et al., oben, übertragen. Für die Southern-Hybridisierung
wurde ein 3,3 kb-CPRB-DNA-Fragment als Hybridisierungssonde verwendet.
300 ng CPRB-DNA wurde unter Verwen dung eines ECL-Direct-Markierungs-
und Detektionssystems (Amersham) markiert und der Southern wurde
entsprechend der Beschreibung des ECL-Kits aufgearbeitet. Der Blot
wurde in einem Volumen von 30 ml Hybridisierungsflüssigkeit,
was 0,125 ml/cm2 entspricht, aufgearbeitet.
Im Anschluss an eine Vor-Hybridisierung
bei 42°C
für 1 Stunde
wurden 300 ng CPRB-Sonde zugesetzt und die Hybridisierung wurde
für 16
Stunden bei 42°C
fortgeführt.
Im Anschluss an die Hybridisierung wurden die Blots zweimal für jeweils
20 Minuten bei 42°C
in primärer
Waschlösung
beinhaltend Harnstoff gewaschen. Es wurden zwei 5-minütige Waschungen
bei Raumtemperatur durchgeführt,
gefolgt von einer Detektion nach Vorschrift. Die Blots wurden, wie
empfohlen, 16 Stunden exponiert. Die Integration wurde durch den
Nachweis eines PacI 3,04 kb-Fragments aus der genomischen DNA der
Transformanten, aber ohne C. tropicalis 20336-Kontrolle, bestätigt. Dieser
Stamm wurde als HDC25 bezeichnet.
-
BEISPIEL IX
-
Fusion des CYP52-Promotors mit den ORFs
von CPR und CYPS2
-
Basierend
auf der QC-RT-PCR-Analyse wurde bestimmt, dass der CYP52A2A-Promotor
der am stärksten
induzierte Promotor der CYPS2-Familie in ATCC 20336 ist. Die folgenden
Promotor/ORF-Kombinationen wurden hergestellt: CYP52A2A-Promotor/CPR
ORF (HDC25) und CYP52A2A-Promotor/CYP52A5A-ORF
(HDC28)
-
A. Konstruktion des CYP52A2A/CYP52A5A-Fusionsgens
-
PCR-Primer
wurden derart entworfen, dass die gleiche Promotorregion, welches
in den vorherigen, hierin beschriebenen CYP52A2A-Konstrukten verwendet
wurde, beibehalten wurde. 496 bp des CYP52A2A-Promotors wurden unter
Verwendung der CYP2A#1- (SEQ. ID. Nr. 6) und CYP2A/5A RC fus-Primer (SEQ. ID.
Nr. 28) amplifiziert. Das ORF von CYP52A5A und seine 3'UTR wurden unter
Verwendung der CYP2A/5A fus- (SEQ. ID. Nr. 29) und CYP5A#2-Primer
(SEQ. ID. Nr. 30) amplifiziert. Diesen beiden PCR-Produkte wurden
mittels PCR unter Verwendung von CYP2A#1 und CYP5A#2 miteinander
verbunden, um ein Konstrukt zu erzeugen, welches etwa 687 bp der
3'-UTR beinhaltete.
In allen PCR-Reaktionen wurde Platinum Pfx (Stratagene, La Jolla,
CA) verwendet. Die Nukleotid-Sequenzen der vorstehend genannten
Primer sind in der Tabelle 1 und der Tabelle 4 gezeigt.
-
Um
das Sequenzieren zu Minimieren, wurde ein 1.632 bp-AatII/MluI-Fragment aus dem
genomischen Bibliotheks-Plasmid pPal3 (CYP52A5A) isoliert und verwendet,
um das entsprechende Fragment des CYP52A2A-Promotor/CYP52A5A-ORF-PCR-Produktes
zu ersetzen. Die Sequenz (SEQ. ID. Nr. 31) des resultierenden Konstruktes
wurde vor der Verwendung verifiziert (siehe
11). Dieses
Konstrukt wurde in einen Integrationsvektor, pURAin, als ein PacI-sensitives
Fragment eingefügt,
um einen neuen Vektor, pURAin 2A–5A, zu erzeugen und dann in
C. tropicalis transformiert. Dieses Konstrukt wurde erfolgreich
eingesetzt, um die Stämme
HDC 28-1, –2, –3 und –4 zu erzeugen.
Die Aminosäure-Sequenz
des CYP52A5A-Proteins wird durch SEQ. ID. Nr. 32 wiedergegeben. Tabelle
4
-
B. Analyse der Transformanten
-
Im
Anschluss an die Isolation der genomischen DNA aus den Transformanten
wurde die DNA mit PacI verdaut. Die PacI-Verdaue wurden durch das
Stand art-Southern-Verfahren aufgearbeitet und mit einem 3,3 kb-CYP52A5A-Fragment
untersucht. Nur diejenigen Stämme,
welche das Intergationskonstrukt empfangen haben, lieferten die
zu erwartende 2,7 kb-Bande nach einer Southern-Hybridisierung.
-
C. Stamm-Vergleiche
-
Bei
einem Vergleich von Stamm HDC28-1 mit Stamm H5343 (Basis-Stamm) zeigte sich,
dass HDC28-1 die Eigenschaft besitzt, mehr Öl-Dicarbonsäure aus HOSFFA zu bilden als
der Vergleichsstamm. Die Tabelle gibt den Anstieg in der Öl-Dicarbonsäure-Produktion
als Funktion der Zeit im Vergleich zu H5343 an.
| Umsetzungs-Zeit
(Stunden) | Gesamt-Produkt
(g/Kg) | %
Verbesserung gegenüber
H5343 |
| | H5343 | HDC28-1 | |
| 16 | 8,8 | 16,9 | 92 |
| 25 | 15,4 | 29,2 | 89,6 |
| 41 | 25,9 | 42,8 | 65,2 |
| 48 | 24,9 | 49,2 | 97,6 |
| 64 | 24,9 | 63,7 | 155,8 |
| 73 | 38,7 | 67,5 | 74,4 |
-
Bei
einem Vergleich von Stamm HDC25 mit Stamm H5343 (Basis-Stamm) zeigte
sich, dass HDC25 die Eigenschaft besitzt, mehr Öl-Dicarbonsäure aus HOSFFA zu bilden als
der Vergleichsstamm. Die Tabelle gibt den Anstieg in der Öl-Dicarbonsäure-Produktion
als Funktion der Zeit im Vergleich zu H5343 an.
| Umsetzungs-Zeit
(Stunden) | Gesamt-Produkt
(g/Kg) | %
Verbesserung gegenüber
H5343 |
| | H5343 | HDC25 | |
| 17 | 11,4 | 12,8 | 12,3 |
| 27 | 20,9 | 22,5 | 7,7 |
| 41 | 31,3 | 33,9 | 8,3 |
| 68 | 38 | 51,8 | 36,3 |
-
Es
wird verstanden werden, dass verschiedene Veränderungen in den hierin beschriebenen
Ausführungsformen
und Beispielen durchgeführt
werden können.
Daher soll die vorstehende Beschreibung nicht als Limitierung, sondern
vielmehr als Veranschaulichung bevorzugter Ausführungsformen ausgelegt werden.
So kann zum Beispiel die Transformation von Wirtszellen unter Verwendung
biolistischer Gen-Transfertechniken bewerkstelligt werden. Auch
wenn hierin Bezug auf die Produktion von Dicarbonsäure genommen
wurde, so ist dennoch beabsichtigt, dass die vorliegende Offenbarung
ebenso auch auf Polycarbonsäuren
anwendbar ist. Diejenigen mit Fachwissen können sich andere Modifikationen
der verschiedenen Ausführungsformen
und Beispiele vorstellen, die immer noch als innerhalb des Umfangs
der hierin angefügten
Ansprüche
befindlich angesehen werden. ANHANG Medien-Zusammensetzung
- *
siehe Kaiser et al., Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor
Laboratory Press, USA (1994), hiermit als Referenz eingeführt.
SEQUENZ-PROTOKOLL
