DE69432676T2

DE69432676T2 - Oxidoreduktase aus fadenförmigen pilzen dafür kodierende dns und transformierte zellen

Info

Publication number: DE69432676T2
Application number: DE69432676T
Authority: DE
Inventors: Johannes Maarten Van Den Brink; Robertus Franciscus Maria Van Gorcom
Original assignee: Nederlandse Organisatie voor Toegepast Natuurwetenschappelijk Onderzoek TNO
Current assignee: Nederlandse Organisatie voor Toegepast Natuurwetenschappelijk Onderzoek TNO
Priority date: 1993-06-11
Filing date: 1994-06-10
Publication date: 2004-03-18
Anticipated expiration: 2014-06-11
Also published as: JPH08511163A; EP0793724B1; US5801024A; EP0793724A2; FI955658A0; ATE240399T1; DE69432676D1; DK0793724T3; WO1994029453A3; WO1994029453A2; AU6938094A; FI955658A; NL9301025A; CA2164206A1

Description

Die Erfindung betrifft ein neues Gen, ein rekombinantes DNA-Molekül, das zumindest einen Teil dieses Gens umfasst, ein davon abgeleitetes RNA-Molekül und ein neues Polypeptid (oder Protein) sowie eine Wirtszelle, die mindestens mit einem solchen rekombinanten DNA-Molekül transformiert ist, insbesondere ein transformierter filamentöser Pilz. Die Erfindung betrifft ferner Verfahren zur Verwendung des neuen Proteins oder der neuen Wirtszelle bei enzymatischen Umwandlungen unter Verwendung von Monooxygenasen, insbesondere von Enzymen aus der Cytochrom-P450-Superfamilie.
Die Erfindung betrifft insbesondere die Isolierung, Charakterisierung und Verwendung eines Gens, das für eine NADPH-Cytochrom-P450-Oxidoreduktase aus filamentösen Pilzen kodiert. Ferner offenbart diese Anmeldung die Verwendung dieses Gens für die Erhöhung der Cytochrom-P450-vermittelten enzymatischen Aktivitäten.
In der Natur sind Monooxygenase-Reaktionen für eine große Anzahl von Umwandlungen sowohl endogener als auch exogener Verbindungen verantwortlich. Die Monooxygenasen können in viele verschiedene Enzymklassen unterteilt werden. Eine dieser Klassen ist die Familie der Cytochrom-P450-Monooxygenasen. Bei diesen handelt es sich um Enzyme, die sowohl in Prokaryoten als auch in Eukaryoten vorkommen.
Die Raumstruktur dieser Proteine ist während der Evolution in hohem Maße konserviert worden. Der charakteristischste Teil eines jeden Cytochrom-P450 ist das Vorhandensein einer Hämgruppe, die mittels einer Schwefel-Eisen-Bindung kovalent an das Protein gebunden ist. Der Schwefel stammt stets von einem Cystein-Molekül. Das Eisenatom liegt in der Mitte eines Porphyrinrings, mit dem das Atom vier Bindungen hat. Der sechste Ligand des Eisenatoms ist an der Katalyse der Reaktion beteiligt. während des Prozesses wird ein Sauerstoff an diesen gebunden. Dementsprechend ist die Weise, auf die die Hämgruppe an das Protein gebunden ist, charakteristisch für diese Klasse von Proteinen und sorgt für ein spezifisches Absorptionsmaximum bei ungefähr P450 nm (CO-reduzierte Form).
Cytochrom-P450-Proteine sind nur in einem Enzymkomplex zusammen mit einem oder zwei anderen Proteinen funktionsfähig, die für den Transfer von Elektronen von NAD(P)H zum aktiven Zentrum des Cytochrom-P450 sorgen.
Die Klasse der Cytochrom-P450-Enzym-Systeme kann grob in zwei Unterklassen unterteilt werden, nämlich die eukaryotischen mikrosomalen P450 und die Klasse der "prokaryotisch-ähnlichen" P450. Die allgemeinen Eigenschaften der eukaryotischen mikrosomalen P450 sind die, dass sie an Membranen von Eukaryoten gebunden sind, dass sie Zwei-Komponenten-Enzym-Systeme sind (Reaktions-spezifisches Cytochrom-P450 und allgemeine NADPH-Cytochrom-P450-Oxidoreduktase), und dass die Reaktion NADPH-abhängig ist. Die allgemeine Eigenschaft der anderen Unterklasse besteht darin, dass die Enzymkomplexe aus drei Komponenten bestehen. Diese Unterklasse kann weiter in zwei Gruppen unterteilt werden, nämlich die bakteriellen P450 (löslich, meist NADH-abhängig, Komplex besteht aus einem Reaktions-spezifischen Cytochrom-P450 und einem allgemeinen Fe-S-Protein und NADH-Reduktase) und die eukaryotischen P450, die in Organellen wie beispielsweise Mitochondrien vorkommen (Membran-gebunden, meist NADPH-abhängig, Komplex besteht aus Reaktions-spezifischem Cytochrom-P450 und einem allgemeinen Fe-S-Protein und NAD(P)H-Reduktase).
Die Cytochrom-P450-Proteine der ersten Unterklasse bilden demgemäß an der Membran Komplexe mit dem Protein NADPH-Cytochrom-P450-Oxidoreduktase. Dieses Protein wird – ähnlich wie die P450-Cytochrome – in den mikrosomalen (endoplasmatisches Retikulum) Membranen von niederen Eukaryoten, Pflanzen und Tieren gefunden.
Über die Struktur dieses Proteins ist weniger bekannt als über die der P450-Cytochrome, aber auch in diesem Fall muss ein hoher Grad von struktureller Konservierung während der Evolution aufgetreten sein, da ein funktioneller Austausch von NADPH-Cytochrom-P450-Oxidoreduktase zwischen Hefen und Säugetier-Systemen gezeigt wurde.
In mikrosomalen Enzym-Systemen verschiedener Eukaryoten ist in verschiedenen Fällen gezeigt worden, dass insbesondere nach Induktion eines spezifischen Cytochrom-P450 die Oxidoreduktase in einem geringeren Anteil vorliegen kann. Daher würde die Menge an Reduktase bestimmend für die Umwandlungsrate der durch Cytochrom-P450 zu modifizierenden Verbindungen sein. Eine Erhöhung der Menge an NADPH-Cytochrom-P450-Oxidoreduktase in der Zelle könnte somit zur Erhöhung der biokatalytischen Aktivität (bezogen auf Reaktionen, die durch die P450 katalysiert werden) führen.
Bislang ist wenig über Cytochrom-P450-Enzym-Systeme in filamentösen Pilzen bekannt. Lediglich einige wenige Cytochrom-P450-Enzyme sind charakterisiert worden, und es ist relativ wenig über den Weg des Elektronen-Transfers von NADPH zum Cytochrom-P450 bekannt. Es ist gezeigt worden, dass auch bei Pilzen der Transfer von Elektronen höchstwahrscheinlich über eine NADPA-Cytochrom-P450-Oxidoreduktase stattfindet. In diesem Zusammenhang wurden immunologische und biochemische Experimente verwertet (Scala, Matthews, Costa & Van Etten (1988) Experimental Mycology 12, 377–385). Die Autoren zeigen in diesem Artikel, dass NADPH-Cytochrom-P450-Oxidoreduktasen aus anderen filamentösen Pilzen die endogene NADPH-Cytochrom-P450-Oxidoreduktase in Rekonstitutionsexperimenten mit Pisatin-Demethylase aus Nectria haematococca (CYP 57) unter Verwendung eines in vitro-Pisatin-Demethylase-Assays komplementieren können.
Diese Autoren zeigen ferner eine immunologische Verwandtschaft zwischen den von Ihnen untersuchten NADPH-Cytochrom-P450-Oxidoreduktasen aus filamentösen Ascomyceten, eine Verwandtschaft, die bei anderen NADPH-Cytochrom-P450-Oxidoreduktasen, wie beispielsweise denen der Hefe Saccharomyces cerevisiae, nicht vorkommt.
Bislang sind eine begrenzte Anzahl von Genen, die für die Cytochrom-P450-Enzyme aus filamentösen Pilzen kodieren, kloniert worden. Ferner sind einige biochemische Erkenntnisse bzw. Kenntnisse hinsichtlich der Biotransformation über einige wenige Cytochrom-P450-Enzyme verfügbar. Die Gene, die bislang kloniert worden sind, kodieren für Lanosterol 14α-Demethylase aus Penicillium italicum (CYP51), Benzoesäure-para-Hydroxylase aus Aspergillus niger (CYP53), eine Cycloheximid-induzierbares Cytochrom-P450 aus Neurospora crassa (CYP54), ein Nitrat/Nitritinduzierbares Cytochrom-P450 aus Fusarium oxysporum (CYP55) und Pisatin-Demethylase aus Nectria haematococca (CYP57). Insbesondere im Hinblick auf das erste (CYP51) und das letzte (CYP57) Enzym-System ist eine akzeptable Menge an biochemischen Erkenntnissen verfügbar. Das CYP51-Enzym ist der Ansatzpunkt für äußerst viele Fungizide und wird aus diesem Grunde seit Jahren unter dem Gesichtspunkt der Verwendung untersucht. Zusätzlich sind biochemische Erkenntnisse bezüglich der Hydroxylierung von Biphenyl-ähnlichen Verbindungen durch Aspergillus-Arten publiziert worden.
Die heterologe Expression von fungalem Cytochrom-P450 in einem nicht-verwandten fungalem Wirt ist für CYP57 beschrieben worden. Es ist herausgefunden worden, dass der einfache Transfer des für Pisatin-Demethylat kodierenden Gens aus N. haematococca auf Aspergillus nidulans zu einem neuen Wirt führt, der die Fähigkeit erlangt hat, Pisatin zu demethylieren. Dies zeigt, dass alle anderen Komponenten, die zur Bildung eines funktionstüchtigen Enzym-Komplexes in Aspergillus nidulans benötigt werden, bereits vorhanden waren, und dass sie darüber hinaus in der Lage sind, in vivo einen aktiven Enzym-Komplex mit heterologem Cytochrom-P450 zu bilden.
Die Erhöhung der Produktion eines spezifischen Cytochrom-P450-Enzyms (z. B. durch das Einbringen zusätzlicher Genkopien, die für dieses Enzym kodieren) gewährleistet definitiv nicht immer eine Zunahme der Gesamtaktivität dieser spezifischen enzymatischen Reaktion. Tatsächlich ist die Einbringung von mehreren P450-Enzymen zur Erhöhung der enzymatischen Aktivität nur zu einem gewissen Grad geeignet. Dies wird aus einer Publikation (Van Gorcom et al. (1990) Mol. Gen. Genet. 223, 192– 197) deutlich, in der die Klonierung und Charakterisierung des Gens beschrieben wird, das für die Cytochrom-P450-Enzym Benzoesäure-para-Hydroxylase aus Aspergillus niger beschrieben wird. Diese Publikation beschreibt ferner einen Versuch, die Benzoesäure-para-Hydroxylase-Aktivität von Aspergillus niger zu verbessern. Dies wurde durch Erhöhung der Produktion des in Rede stehenden Cytochrom-P450 versucht. Die Erhöhung der Produktion der Benzoesäure-para-Hydroxylase hatte jedoch keine positive Auswirkung auf die Benzoesäure-para-Hydroxylase-Aktivität. Offenbar wirkte eine andere Komponente des Enzymkomplexes limitierend. Es ist möglich, dass das P450-Enzym nicht mit ausreichend vielen Elektronen versorgt wird, die notwendig sind, es zu ermöglichen, die Umwandlungen auszuführen. Bis jetzt ist wenig über die Art und Weise bekannt, wie diese Cytochrom-P450-Enzyme mit ihren Elektronen versorgt werden. Der Donor in den hier beschriebenen mikrosomalen Systemen ist NADPH. Es ist jedoch bislang noch nicht im Detail gezeigt worden, wie sich der Transport vollzieht. Es ist biochemisch gezeigt worden, dass dies wie bei anderen eukaryotischen mikrosomalen Systemen voraussichtlich durch ein Enzym bewerkstelligt wird die NADPH-Cytochrom-P450-Oxidoreduktase. Es wird angenommen, dass diese Oxidoreduktase der limitierenden Faktor sein könnte.
Obwohl eine Anzahl von P450-Enzymen für bestimmte filamentöse Pilze beschrieben worden ist, waren die entsprechenden Oxidoreduktasen aus diesen spezifischen Pilzen bis zum Zeitpunkt der vorliegenden Erfindung nicht verfügbar.
Erfindungsgemäß kann die enzymatische Aktivität von P450-Enzym-Systemen in filamentösen Pilzen durch ein neues Gen, das für eine neue Oxidoreduktase kodiert, durch eine neue Oxidore duktase und/oder durch die neuen, nachfolgend im Detail beschriebenen Mikroorganismen verbessert werden.
Wenn in der vorliegenden Beschreibung "Polypeptid" oder "Protein" erwähnt wird, beziehen sich diese Begriffe unter anderem auf ein Polypeptid, welches zumindest teilweise durch eine erfindungsgemäße DNA-Sequenz kodiert wird. Beispiele umfassen Fragmente und/oder Derivate der neuen Oxidoreduktase, die die gewünschte Aktivität aufweisen.
Das einzige, was möglicherweise bis zum Zeitpunkt der Erfindung verwendet werden konnte, um die Cytochrom-P450-Reaktionen in Pilzen zu verbessern, sind Cytochrom-P450-Oxidoreduktasen aus anderen, nicht-verwandten Organismen, wie beispielsweise Hefen, Pflanzen, Insekten und Säugetieren. Dies sind die Organismen, dessen entsprechende Gene verfügbar sind. In dem Bestreben, homologe Systeme zu verwenden, die bestmöglich an den Wirt angepasst sind, wird die Verwendung einer Cytochrom-P450-Oxidoreduktase, die aus Pilzen stammt, naturgemäß bevorzugt.
Auf Basis der bekannten Cytochrom-P450-Reduktasen aus anderen Organismen sollte es unter Verwendung von Standardmethoden möglich sein, die Oxidoreduktase aus filamentösen Pilzen aufzufinden, zu isolieren und zu klonieren.
Überraschenderweise versagten in diesem Fall die üblichen Methoden, wie beispielsweise Nukleinsäure-Hydridisierungen und Standard-PCR (Polymerase-Kettenreaktion). Wie in den Beispielen der vorliegenden Erfindung beschrieben werden wird, hat es sich als unmöglich herausgestellt, ein für die Oxidoreduktase von filamentösen Pilzen kodierendes Gen mit Sonden (einzelsträngigen DNA-Stücken, die komplementär zu konservierten Sequenzen in anderen Oxidoreduktasen sind), die in herkömmlicher Weise hergestellt worden waren, aufzufinden.
Zusätzlich ist herausgefunden worden, dass das Enzym, welches normalerweise für die PCR verwendet wird (Taq-DNA-Poly merase), ebenfalls für die Auffindung des Gens ungeeignet ist, welches für eine Oxidoreduktase aus einem filamentösen Pilz kodiert, wobei die von uns ausgewählten Primer verwendet wurden, welche auf konservierten Domänen in anderen NADPH-Cytochrom-P450-Oxidoreduktasen basieren.
Lediglich durch die Wahl einer in hohem Maße degenerierten Sonde in Kombination mit einer unkonventionellen Polymerase ist das erfindungsgemäße Gen erfolgreich erhalten worden.
Demgemäß betrifft die vorliegende Erfindung ein rekombinantes DNA-Molekül, das

(a) eine Nukleinsäuresequenz wie in 1 gezeigt, die für eine Cytochrom-P450-Oxidoreduktase oder einen enzymatisch aktiven Teil davon kodiert;
(b) eine Nukleinsäuresequenz, die komplementär zu der Nukleinsäuresequenz von (a) ist;
(c) eine Nukleinsäuresequenz, die unter stringenten Bedingungen von 56°C und 6 × SSC mit der Nukleinsäuresequenz von (b) hybridisiert und für eine Cytochrom-P450-Oxidoreduktase oder einen enzymatisch aktiven Teil davon kodiert; oder
(d) eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die komplementär zu der Nukleinsäuresequenz von (c) ist.

Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein mRNA-Molekül, das für eine Cytochrom-P450-Oxidoreduktase kodiert, wobei die mRNA eine Nukleinsäuresequenz hat, die der Cytochrom-P450-Oxidoreduktase-kodierenden Nukleinsäuresequenz wie in 1 gezeigt entspricht.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein Polypeptid, das Cytochrom-P450-Oxidoreduktase-Aktivität hat, wobei das Poly peptid durch ein rekombinantes DNA-Molekül gemäß Anspruch 1 kodiert wird.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner eine transformierte Wirtszelle, die eine Zelle eines filamentösen Pilzes ist, die zumindest mit einem DNA-Molekül gemäß Anspruch 1 transformiert ist.
Zusätzlich betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Durchführung enzymatischer Umwandlungen unter Verwendung von P450-Cytochrom-Proteinen, bei dem ein transformierter filamentöser Pilz gemäß einem der Ansprüche 4 bis 8 verwendet wird.
Ferner betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Durchführung enzymatischer Umwandlungen, bei dem ein Polypeptid gemäß Anspruch 3 verwendet wird.
Das neue Gen umfasst eine wie in 1 gezeigte Sequenz. Die davon abgeleitete Aminosäuresequenz ist in 2 dargestellt.
Für verschiedene Arten von Verwendungen ist es interessant, die biokatalytische Aktivität einer fungalen Zelle zu erhöhen. Das naturgemäß vorhandene enzymatische Aktivitäts-Niveau ist oftmals für weitere industrielle Verwendungen dieser Enzym-Systeme nicht hoch genug, beispielsweise für die Detoxifikation von Chemikalien und Toxinen in Abfall, Boden, Wasser und Luft (umwelttechnische Verwendungen), die Modifikation und Detoxifikation von (Rohmaterialien für die Produktion von) Lebensmitteln und Viehfuttermitteln sowie die Verwendung von Pilzen oder daraus isolierten Enzymkomplexen zur Durchführung einer oder mehrerer enzymatischer Umwandlungen zum Zwecke der Synthese eines chemischen oder pharmazeutischen Intermediats oder Endproduktes. Es ist ferner denkbar, dass ein bestimmtes Produkt gänzlich durch Fermentation eines Pilzes produziert werden kann. Wenn dies ein oder mehrere Cytochrom-P450-Enzyme einschließt, kann die Produktion durch einen Stamm mit einer erhöhten NADPH-Cytochrom-P450-Oxidoreduktase-Aktivität verbessert werden.
Cytochrom-P450-Enzym-Aktivitäten stellen oftmals die Geschwindigkeits-limitierenden Schritte in einem Reaktionsweg dar.
Die Erhöhung dieser Art von Enzym-Aktivitäten wird daher eine positive Wirkung auf den Umwandlungsgrad und die Umwandlungsrate von Verbindungen haben, die durch einen solchen Reaktionsweg synthetisiert oder abgebaut werden. Beispiele für Umwandlungen, die (teilweise) von Cytochrom-P450 katalysiert werden, sind die para-Hydroxylierung von Benzoesäure und anderen aromatischen Substanzen, verschiedene Hydroxylierungen von Biphenyl-ähnlichen Verbindungen, die spezifische Hydroxylierung, die Epoxidation und Demethylierung von aromatischen und nicht-aromatischen Verbindungen mit Multiringstruktur (wie beispielsweise PAKs und Steroid-ähnlichen Molekülen), die terminale Hydroxylierung von (kurz- und langkettigen) Alkanen und Fettsäuren, die Demethylierung von Phytoalexinen, etc., etc. Derzeit wird angenommen, dass zahlreiche Cytochrom-P450-Enzyme noch nicht entdeckt sind. Im Falle dieser bislang unbekannten Enzym-Aktivitäten kann jedoch die hier beschriebene Erfindung ebenfalls zur Erhöhung der in Rede stehenden Aktivitäten beitragen.
Die Ergebnisse der hier offenbarten Erfindung sind nicht ausschließlich auf die Organismen beschränkt, mit denen die Erfindung ausgeführt wurde, d. h. Aspergillus. Zwei wichtige Gründe können dafür angeführt werden. Zum einen ist die Konservierung zwischen homologen Genen von filamentösen Pilzen meisten der Gestalt, dass die aus Aspergillus isolierten Gene als Werkzeug dienen können, um (auf einfache Weise) die entsprechenden Gene aus anderen filamentösen Pilzen zu erhalten. Im Hinblick auf die Konservierung in der Familie der Cytochrom-P450-Oxidoreduktasen wird erwartet, dass dies definitiv auch auf dieses Gen zutrifft. Zum zweiten kann das cprA Gen (das Gen, das für die erfindungsgemäßen Oxidoreduktasen aus Aspergillus niger kodiert) auch direkt in anderen filamentösen Pilzen als Lieferant zusätz licher NADPH-Cytochrom-P450-Oxidoreduktase-Aktivität verwendet werden. In den letzten Jahren ist herausgefunden worden, dass die Isolierung von Genen aus Pilzen durch heterologe Hybridisierung mit dem korrespondierenden Gen aus Hefen als Sonden oftmals relativ unerfolgreich verläuft. In diesen Fällen erwies sich die Verwendung eines korrespondierenden Gens aus einem filamentösen Pilz oftmals als erfolgreich. Selbst die Isolierung von Genen durch PCR-Experimente unter Verwendung von Oligonukleotiden, die ausgehend von (möglicherweise) konservierten Regionen in Hefegenen konstruiert wurden, als Primer erwies sich nicht immer als nützliche Strategie.
Es ist ferner herausgefunden worden, dass die Gene von filamentösen Pilzen hervorragend zur Ausführung entsprechender Aufgaben in anderen Pilzen verwendet werden können. Die Promotoren sind normalerweise funktionstüchtig und auch Introns werden – anders als bei Hefe – korrekt von anderen Pilzen gespleißt. Es ist bereits einige Male gezeigt worden, daß in Pilzen der Austausch von Proteinen, die Teil eines komplexeren Systems sind, was beispielsweise auch für Cytochrom-P450-Enzym-Systeme zutrifft, eine wirkliche Möglichkeit darstellt. Es ist herausgefunden worden, dass sowohl eine Untereinheit der Tubuline als auch eine Kern-kodierte Untereinheit eines mitochondrialen ATPase-Komplexes zwischen verschiedenen Arten von filamentösen Pilzen in vivo austauschbar sind. In vitro ist die Austauschbarkeit von NADPH-Cytochrom-P450-Oxidoreduktase zwischen verschiedenen filamentösen Pilzen bereits gezeigt worden.
Im Hinblick auf die Aktivität der NADPH-Cytochrom-P450-Oxidoreduktase ist es denkbar, dass Modifikationen des Proteins (in gerichteter oder angerichteter Weise bereitgestellt) zu einer NADPH-Cytochrom-P450-Oxidoreduktase mit allgemein besseren Eigenschaften oder mit besseren Eigenschaften für eine spezifische Verwendung führen kann. Diese Art von Anpassungen an das Protein (via Anpassungen im Gen) ist durch die vorliegende Er findung möglich geworden und fällt aus diesem Grunde in den Schutzbereich.
Bezüglich anderer Organismen ist ferner bekannt, dass die Fusion eines spezifischen Cytochrom-P450 mit der NADPH-Cytochrom-P450-Oxidoreduktase durch Fusion der entsprechenden Gene zu enzymatisch aktiven Molekülen führen kann. In mehreren Fällen könnte dies sogar eine positive Wirkung auf die gesamte enzymatische Aktivität des entsprechenden Cytochrom-P450 haben. Eine solche Fusion wird ebenfalls dahingehend verstanden, dass sie in den Bereich der vorliegenden Erfindung fällt.
Es ist in hohem Maße zweifelhaft, ob es möglich ist, die NADPH-Cytochrom-P450-Oxidoreduktase-Aktivität in der Zelle zu eliminieren. Das Enzym ist an mehreren Aktivitäten beteiligt, die für die Zelle lebensnotwendig sind, so dass eine Mutation (gerichtet oder zufällig bereitgestellt) im Genom, die zu einer Eliminierung des NADPH-Cytochrom-P450-Oxidoreduktase-Aktivität führt voraussichtlich lethal ist. Es ist jedoch relativ plausibel, dass eine Änderung des Expressionssignals des Gens, das für die NADPH-Cytochrom-P450-Oxidoreduktase kodiert (cprA), ebenfalls zu der erwünschten Wirkung führen kann (eine Änderung – meist eine Zunahme – in der NADPH-Cytochrom-P450-Oxidoreduktase-Aktivität). Die derzeit verfügbaren Daten verweisen darauf, dass der Promotor des cprA-Gens aus Aspergillus niger nicht besonders stark ist. Auf Basis der Erkenntnisse, die durch diese Erfindung verfügbar sind, ist die Strategie, die zu einer Zunahme in der NADPH-Cytochrom-P450-Oxidoreduktase-Aktivität durch Modifikation des Promotors und/oder des 5-untranslatierten Teils des cprA-Gens führen wird, einfach zu bestimmen. Es kann durch Modifikation (gerichtet oder zufällig) seiner eigenen Sequenzen, die an der Initiation der mRNA- und Proteinsynthese des cprA-Gens beteiligt sind, erreicht werden. Es kann ferner durch Ersetzen des Promotors und/oder eines Teils der Region des crpA-Gens, die für den 5'-untranslatierten Teil der mRNA kodiert, durch andere, vorzugsweise effizientere Sequenzen (synthetisch oder von einem anderen Gen stammend) erreicht werden.
Eine gänzlich andere Verwendung des Gens ist die Verwendung dieses Gens, oder Teilen desselben, wie beispielsweise des Promotors, als Reporter für den Nachweis von induzierenden Agenzien, wie beispielsweise Toxinen, Xenobiotika und Ähnlichem. Aufgrund des allgemeinen Charakters dieses Enzyms ist es durchaus denkbar, dass auf diese Weise eine Diagnostik mit weitem Spektrum entwickelt werden kann. In diesem Zusammenhang könnte man es beispielsweise in Betracht ziehen, das Expressionssignal des Gens an ein einfach nachweisbares Reportergen zu fusionieren (das beispielsweise für β-Galactosidase, β-Glucuronidase oder Luciferase kodiert), oder es wären auf immunologischen Methoden basierende Nachweisverfahren denkbar.
Obwohl die in vitro-Verwendung von Cytochrom-P450-Enzym-Systemen bislang noch nicht in großem Ausmaß angewendet wird, stellt diese Erfindung die Möglichkeit bereit, eine der Komponenten eines solchen in vitro-Enzymsystems (die NADPH-Cytochrom-P450-Oxidoreduktase) in großem Ausmaß herzustellen. Die Erfindung schlägt ferner die Herstellung von fungalen Stämmen vor, die sowohl das entsprechende Cytochrom-P450 als auch die NADPH-Cytochrom-P450-Oxidoreduktase in erhöhten Mengen produzieren, sodass der Enzymkomplex aus diesen in einfacherer Weise und größeren Mengen isoliert werden kann.
Experimente:
Hier wird die Klonierung und Charakterisierung eines Gens beschrieben, das für eine NADPH-Cytochrom-P450-Oxidoreduktase eines filamentösen Pilzes kodiert.
Dies betrifft insbesondere das crpA-Gen von Aspergillus niger ATCC 1015. Zunächst wurde ein Versuch unternommen, das für die NADPH-Cytochrom-P450-Oxidoreduktase aus Aspergillus niger kodierende Gen durch heterologe Hybridisierung zu isolieren. Die entsprechenden Gene der Hefen Saccharomyces cerevisiae und Candida tropicalis wurden als Sonden verwendet. Diese Experimente führten zu keinen positiven Ergebnissen (siehe Beispiel I).
Anschließend wurde ein Versuch unternommen, das Gen durch PCR zu isolieren. Auf Basis eines Vergleichs von bekannten Proteinsequenzen von NADPH-Cytochrom-P450-Oxidoreduktasen aus anderen Organismen wurden Primer konstruiert, die für Aminosäuresequenzen aus den am stärksten konservierten Regionen kodieren. Diese Primer wurden wie in Beispiel II beschrieben in PCR-Experimenten verwendet. Diese PCR ergab zahlreiche Banden, jedoch nicht in den erwarteten Höhen. Nach einer Gelelektrophorese der PCR-Mischung wurde die Region der erwarteten Größe aus dem Gel ausgeschnitten und die (nicht-sichtbare) DNA wurde daraus isoliert. Anschließend wurde mit dieser DNA und mit denselben Primern eine erneute PCR-Reaktion durchgeführt. Diese PCR ergab ein Produkt der erwarteten Größe. Dieses PCR-Produkt wurde isoliert und in pUC19 kloniert. Die DNR-Sequenzanalyse des isolierten Klons ergab jedoch eine DNA-Sequenz die keinerlei Ähnlichkeit mit einer bekannten NADPH-Cytochrom-P450-Oxidoreduktase-Sequenz aufwies.
Als sich dieser Versuch ebenfalls als negativ herausstellte, wurde versucht, das Gen mit Hilfe einer Sonde zu isolieren, die auf einem alternativen Weg (Beispiel III) synthetisiert wurde. Eine PCR-Reaktion wurde unter Verwendung von genomischer DNA aus Aspergillus niger als Matrize und degenerierten Primern, die von konservierten Regionen der NADPH-Cytochrom-P450-Oxidoreduktase abgeleitet worden waren, durchgeführt. In diesem Experiment wurde statt des herkömmlichen Enzyms (Taq-DNA-Polymerase) nunmehr eine andere thermoresistente DNA-Polymerase verwendet, nämlich die sogenannte Tth DNA-Polymerase. Dieses Enzym stammt aus dem Bakterium Thermus thermophylus und wird üblicherweise zur Verwendung in PCR-Experimenten mit RNA als Matrize empfohlen. Durch dieses Enzym wurden ebenfalls mehrere verschiedene Banden gefunden, unter anderem eine Bande der erwarteten Größe. Diese Bande wurde isoliert und in pUC19 kloniert. Die Sequenzanalyse eines einzelnen Klons, pCPR1, ergab eine klar erkennbare Ähnlichkeit (auf der Proteinebene) mit der NADPH-Cytochrom-P450-Oxidoreduktasesequenz, die zu dieser Zeit bekannt war. Dieser Klon wurde als Sonde zum Zwecke der Iso lierung des NADPH-Cytochrom-P450-Oxidoreduktase-Gens von Aspergillus niger aus einer Genbibliothek verwendet.
Das Aspergillus niger crpA-Gen wurde auf einem 7 kb EcoRI-SalI-Fragment (pCPR7) und einem 3,7 kb BglII-KpnI-Fragment (Beispiel IV) isoliert. Die DNA-Sequenz des vollständigen 3,7 kb BglII-KpnI-Fragmentes wurde bestimmt. Sie ist in I dargestellt. In dieser DNA-Sequenz wurde ein offener Leserahmen gefunden, der für 692 Aminosäuren kodiert. Dieser offene Leserahmen wird einmal durch eine DNA-Sequenz unterbrochen, die für ein Intron kodiert (siehe Beispiel V). Der Start der mRNA wurde ebenfalls bestimmt (Beispiel VI).
Ein Vergleich der abgeleiteten Aminosäuresequenz mit der bekannten Aminosäuresequenz von NADPH-Cytochrom-P450-Oxidoreduktasen aus anderen Organismen verwies darauf, dass die Identität mit der auf Basis der Aminosäuresequenzen am meisten verwandten NADPH-Cytochrom-P450-Oxidoreduktase (die der Hefe Saccharomyces cerevisiae) lediglich 40% beträgt. In verschiedenen "konservierten" Regionen der NADPH-Cytochrom-P450-Oxidoreduktase von Aspergillus niger beträgt die Identität ebenfalls nicht 100%.
Die Expression des crpA-Gens von Aspergillus niger wurde auch auf mRNA-Ebene untersucht. Es wurde herausgefunden, das die Expression des Gens nicht sehr hoch ist, was Möglichkeiten für die Verbesserung der Expression durch Verbessern des crpA-Promotors oder durch Ersetzen des crpA-Promotors durch einen anderen, stärkeren Promotor eröffnet.
Es wurde die Wirkung der Einbringung mehrerer Kopien des cprA-Gens von Aspergillus niger auf das Ausmaß der NADPH-Cytochrom-P450-Oxidoreduktase-Aktivität sowie auch die Wirkung desselben auf die Cytochrom-P450-Aktivität untersucht.
Beispiel XI beschreibt, dass die Einbringung mehrerer Kopien des cprA-Gens in Aspergillus niger zu einer stark erhöhten NADPH-Cytochrom-P450-Oxidoreduktase-Aktivität führen kann.
Die Auswirkung dessen auf die Benzoesäure-para-Hydroxylase-Aktivität dieses Stammes (Wildtyp) wird ebenfalls in diesem Beispiel gezeigt.
Beispiel XII beschreibt, dass das Einbringen mehrerer Kopien des cprA-Gens in eine Aspergillus niger-Transformante, die bereits mehrere Kopien des Benzoesäure-para-Hydroxylase-Gens (bphA) enthält (und daher eine erhöhte Produktion der Benzoesäure-para-Hydroxylase aufweist) zu einer sehr wesentlichen Erhöhung der BPH-Aktivität führen kann. Diese Experimente zeigen deutlich, dass das NADPH-Cytochrom-P450-Oxidoreduktase-Gen, das in dieser Patentanmeldung beschrieben wird, eine sehr positive Wirkung auf die Cytochrom-P450-Aktivitäten haben kann, wenn es in einen Pilz eingebracht wird.
BEISPIEL I
Klonierung des cprA-Gens von Aspergillus niger durch heterologe Hybridisierung
Sofern die Techniken nicht im Detail beschrieben werden, wurden sie wie beschrieben ausgeführt (Sambrook, Fritsch & Maniatis (1989) Molecular cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, U.S.A.).
Es wurde durch heterologe Hybridisierungsexperimente versucht, das Gen zu isolieren, welches für die NADPH-Cytochrom-P450-Reduktase von Aspergillus niger ATCC 1015 kodiert. Zu diesem Zweck wurde chromosomale DNA (5 μg) von Aspergillus niger und von Saccharomyces cerevisiae mit HindIII und mit EcoRI verdaut. Diese DNA wurde durch Elektrophorese auf einem 0,8%ige TBE-Agarosegel getrennt und auf eine Hybond-N-Membran (Amersham) transferiert. Auf diese Weise wurden zahlreiche identische Blots durchgeführt. Nach Fixierung der DNA auf der Membran durch Backen für 2 Stunden bei 80°C und 2 bis 4 stündiger Prähybridisierung wurde der Blot mit ³²P-markierten (Amersham multiprime DNA labeling kit, gemäß den Anweisungen des Herstellers) Cytochrom-P450-Reduktase-spezifischen Sonden, die jeweils aus Can dida tropicalis und Saccharomyces cerevisiae stammten, hybridisiert. Als Sonde für das CPR-Gen von Candida tropicalis wurden ein 820 bp EcoRI-Fragment, das einen Teil des cprA enthielt, sowie ein 3,7 kb SpeI-Fragment, das das gesamte CPR-Gen umfasste, aus dem Plasmid pTS1 (Sutter et al., 1990, J. Biol. Chem. 265 (27), 16428–16436) isoliert. Ein 700 bp BamHI-Fragment, das einen internen Teil des CPR enthielt, sowie ein 3,3 kb PvuII-Fragment, das das gesamte CPR-Gen umfasste, wurden als Saccharomyces cerevisiae-CPR-spezifische Sonde aus dem Plasmid pTS20 (Sutter & Loper, 1989, Bioch. Biophys. Res. Comm. 160(3), 1257–1266) isoliert. Die Fragmente wurden durch Elektrophorese auf einem 0,8%igen TBE-Agarosegel getrennt und mittels eines Geneclean kit (Bio101) gemäß den Anweisungen des Hersteller gereinigt. Die Blots wurden hybridisiert und bei 56°C wie beschrieben gewaschen (Sambrook, Fritsch & Maniatis (1989) Molecular cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, U.S.A.). Der letzte Waschschritt wurde bei 56°C mit 6 × SSC, 0,1% SDS durchgeführt. Bei der S. cerevisiae-Sonde konnten klare, spezifisch hydribisierende Banden in den Bahnen mit chromosomaler DNA aus S. cerevisiae beobachtet werden. Experimente mit den C. tropicalis-Sonden wurden ausschließlich mit chromosomaler DNA von Aspergillus niger durchgeführt. Überraschenderweise wurde herausgefunden, dass in den Bahnen mit chromosomaler DNA aus Aspergillus niger mit keiner Sonde hybridisierende Banden gefunden wurden, möglicherweise aufgrund zu geringer Homologie zwischen dem Cytochrom-P450-Reduktase-Gen von Aspergillus niger auf der einen Seite und den Cytochrom-P450-Reduktase-Genen von S. cerevisiae und C. tropicalis auf der andere Seite.
BEISPIEL II
Klonierung des cprA-Gens von Aspergillus niger durch PCR mit DNA-Polymerase
Im Hinblick auf die negativen Ergebnisse in den heterologen Hydridisierungs-Experimenten wurde entschieden zu versuchen, ein cpr-spezifisches Fragment durch PCR-Methoden zu synthetisieren. Es wurden degenerierte Primer konstruiert, die auf konservierten Sequenzen in bekannten NADPH-Cytochrom-P450-Oxidoreduktase-Genen der Ratte (Porter & Kasper (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 973–977); Candida tropicalis (Sutter et al. (1990) J. Biol. Chem. 265, 16428-16436) und Saccharomyces cerevisiae (Sutter & Loper (1989) Bioch. Biophys. Res. Comm. 160, 1257–1266) basierten (Tabelle I). An den Enden wurden zusätzliche Sequenzen bereitgestellt, die für spezifische Restriktions-Schnittstellen (5'-PCR-Primer wurden mit einer EcoRI-Restriktions-Schnittstelle bereitgestellt; 3'-Primer wurden mit einer BamHI-Restriktions-Schnittstelle bereitgestellt) kodierten, um die Klonierung von PCR-Produkten zu ermöglichen und die Spezifität dieser Vorgehensweise zu erhöhen.
Tabelle I
Tabelle I, Sequenzen der Primer, die für die Isolierung einer cpr-spezifischen Sonde verwendet wurden. N steht für G/A/T/C.
Für die PCR-Reaktionen wurde Taq-DNA-Polymerase (Perkin Elmer) verwendet. Als Matrize wurde chromosomale DNA von Aspergillus niger verwendet. Zur Kontrolle wurden PCR-Reaktionen unter Verwendung von 10 ng des Plasmids pTS20 (auf dem das gesamte Cytochrom-P450-Reduktase-Gen von Saccharomyces cerevisiae lokalisert ist) und chromosomaler DNA von Saccharomyces cerevisiae als Matrize durchgeführt.
Matrize und Primer wurden für 10 Minuten bei 94°C denaturiert, gefolgt von 25 Zyklen (1 Minuten 94°C, 1 Minute 43°C, 2 Minuten 72°C). Nach 25 Zyklen erfolgte für 5 Minuten eine Inkubation bei 72°C.
Bei Verwendung von Taq-DNA-Polymerase mit dem Plasmid pTS20 als Matrize wurden Fragmente der erwarteten Größe gefunden, sofern die Primerkombinationen MBL997-MBL999, MBL997-MBL1000 und MBL997-MBL1001 verwendet wurden. Die Verwendung des Primers MBL998 führte in keinem der Fälle zur Synthese eines Produktes der erwarteten Größe.
Die Verwendung von chromosomaler DNA von S. cerevisiae als Matrize führte zu einem klar darstellbaren Produkt der erwarteten Größe, wenn die Primerkombination MBL997-MBL1001 verwendet wurde. Die Verwendung der Kombination von MBL997 mit dem Primer MBL999, 4608 mal degeneriert, führte zu einem schwach darstellbaren Produkt der erwarteten Größe. In jedem dieser Fälle wurde eine große Menge aspezifisches Produkt von geringeren Größen gefunden. Mit den Primern MBL998 und MBL1000 konnte unter Verwendung von chromosomaler DNA von S. cerevisiae als Matrize kein korrektes PCR-Produkt gezeigt werden.
Wenn chromosomale DNA von Aspergillus niger als Matrize und Taq-DNA-Polymerase verwendet wurde, wurde kein Produkt der erwarteten Größe mit irgendeiner der verwendeten Primerkombinationen gefunden. Was bei allen möglichen Kombinationen gezeigt werden konnte, war eine große Menge von aspezifischen, zu kleinem Produkt.
Das gesamte Material eines einzelnen Experimentes mit den Primerkombinationen MBL997-999, MBL997-1000 und MBL997-1001 wurde durch Elektrophorese auf einem 0,8%igen TBE-Agarosegel getrennt. Ein Gelstück wurde auf der Höhe einer Markerbande von 1,2 kb (die erwartete Größe) ausgeschnitten. An dieser Stelle war im Gel keine DNA sichtbar. DNA aus diesem Gelfragment wurde mit Hilfe der "freeze-squeeze"-Methode isoliert. Das so erhaltene Material wurde als Matrize für eine neue PCR-Reaktion verwendet. Überraschenderweise wurde nach dieser Reaktion bei Verwendung der Primerkombinationen MBL998/999 und MBL998/1001 ein Produkt der erwarteten Größe gefunden. Jedoch wurden mit allen verwendeten Primerkombinationen (MBL997-MBL999, 1000, 1001 und MBL998-MBL999, 1000, 1001) hauptsächlich kleinere, aspezifische Produkte gefunden. Das gefundene Produkt der erwarteten Größe wurde durch Gelelektrophorese auf einem 0,8%igen Agarosegel mit niedrigem Schmelzpunkt (Low Melting Point) getrennt, und die DNA wurde anschließend durch β-Agarase (New England Biolabs, gemäß den Anweisungen des Hersteller) isoliert. Die erhaltene DNA wurde mit EcoRI und BamHI verdaut und in die EcoRI- und BamHI-Schnittstellen von pUC19 kloniert. Nach Transformation in Escherichia coli wurde Miniscreen-DNA aus 12 Ampicillin-resistenten Kolonien isoliert. Nach Verdau der erhaltenen Miniscreen-DNA mit EcoHI und BamHI wurde herausgefunden, dass lediglich ein Konstrukt ein Insert der korrekten Größe enthielt. Von diesem wurde eine große Plasmid-Isolierung durchgeführt, bei der ein Qiagen Tip500 gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet wurde. Die DNA-Sequenz dieses Konstrukts wurde mittels Didesoxysequenzanalyse (Pharmacia T7 sequencing kit, gemäß den Anweisungen des Herstellers) analysiert, wobei die M13 Universal und Reverse Primer verwendet wurden. In der DNA-Sequenz (wie bestimmt) wurde keine Homologie mit bekannten Cytochrom-P450-Reduktase-Genen anderer Organismen gefunden.
BEISPIEL III
Klonierung des cprA-Gens von Aspergillus niger durch PCR mit Tth DNA-Polymerase
Als Alternative wurde entschieden, PCR-Experimente durchzuführen, bei denen anstelle von 1 U Taq-DNA-Polymerase 0,1 U Tth-DNA-Polymerase (Spaero Q) verwendet wurden, ein Enzym, das insbesondere für RT-PCR (Reverse Transkriptase PCR)-Experimente geeignet ist. Unter Verwendung des Plasmids pTS20 als Matrize führte dies bei Verwendung der Primerkombinationen MBL997-999, MBL997-1000 und MBL997-1001 zu Produkten der erwarteten Größe. Als chromosomale DNA von Aspergillus niger als Matrize verwendet wurde, führte dies bei Verwendung der Primerkombination MBL997-1001 zu einer großen Menge von Produkten. Es wurde herausgefunden, dass der Großteil dieser Produkte kleiner als die erwartete Größe ist. Überraschenderweise wurde bei Verwendung dieser degenerierten Primer in Kombination mit Tth-DNA-Polymerase zusätzlich zu diesen aspezifischen Produkten ein Produkt der erwarteten Größe gefunden. Die PCR-Produkte wurden mittels Gelelektrophorese auf einem 1%igen TBE-Agarosegel mit niedrigem Schmelzpunkt (Low Melting Point) getrennt, und anschließend wurde das Produkt, von dem man vermutete, daß es korrekt ist, mittels β-Agarase isoliert.
Nach Verdau der erhaltenen DNA mit EcoRI und BamHI wurde das Fragment in die EcoRI- und BamHI-Restriktions-Schnittstellen des Plasmids pUC19 kloniert. Nach Transformation in E. coli wurde Miniscreen-DNA aus 12 Ampicillin-resistenten Kolonien isoliert. Nach Verdau der Miniscreen-DNA mit EcoRI und BamHI wurde herausgefunden, dass 4 der 12 Präparationen ein Plasmid mit einem Insert der korrekten Größe enthielten.
Ausgehend von diesen vier Präparationen wurde von einem Konstrukt (pCPR1) eine große DNA-Isolierung mittels einer Qiagen Tip500 durchgeführt. Von dieser DNA wurde die Sequenz eines Teils des Inserts durch die M13 Universal and Reverse Primer bestimmt. Es wurde herausgefunden, dass diese Sequenz Regionen enthielt, die auf der Aminosäure-Ebene deutlich homolog zu anderen Cytochrom-P450-Reduktase-Genen sind.
BEISPIEL IV
Screening einer Aspergillus niger-λ-Genbibliothek mit der cpr-spezifischen Sonde
Genomische DNA des Aspergillus niger-Stamms ATCC 1015 wurde teilweise mit Sau3AI verdaut und durch Gelelektrophorese getrennt. DNA einer Größe zwischen 13 und 17 kb wurde aus dem Gel isoliert, und die DNA wurde isoliert. Die isolierte DNA wurde in Vektor λEMBL3 kloniert, der mit BamHI geschnitten worden war. Diese genomische Bibliothek wurde mit der cpr-spezifischen Sonde durchsucht, die aus dem Plasmid pCPR1 (das 1,2 kb-EcoRI-BamHI-Fragment, vgl. 4) isoliert worden war. Das isolierte EcoRI-BamHI-Restriktionsfragment wurde mit dem cpr-spezifischen PCR-Fragment radioaktiv mit ³²P-dCTP unter Verwendung des Multiprime DNA labeling kit (Amersham) gemäß den Anweisungen des Herstellers markiert. Die Markierungsreaktionen wurden für 3 Stunden bei Raumtemperatur durchgeführt. Die Sonde wurde durch Spin-Säulenfiltration mit einer 1 ml-Sephadex G50-Mediumsäulen gereinigt. Etwa 40.000 pfu wurden durchsucht (etwa 20-mal das Genom). Bei der ersten Untersuchung wurden 13 positive Plaques isoliert. Diese wurden nochmals durchsucht. Nach der zweiten Untersuchung verblieben drei positive Plaques (λ5-3, λ11-1 und λ19-1). Durch Southern-Analyse wurde gezeigt, dass alle Klone Fragmente enthielten, die mit der cpr-spezifischen Sonde hybridisierten. Die Restriktionsmuster dieser Klone waren deutlich verwandt, jedoch nicht identisch. Eine Restriktionskarte des Klons λ19-1 wurde angefertigt (vgl. 3). Ein 7 kb EcoRI--SalI-Fragment und ein 3,7 kb BglII-KpnI-Fragment des Klons λ19-1 die die kodierende Region des cprA-Gens enthalten, wurden isoliert und in den Vektor pBluescript-SK II⁺ (Stratagene) kloniert, der jeweils mit EcoRI und SalI bzw. BamHI und KpnI geschnitten worden war. Dies ergab die Vektoren pCPR7 und pCPR2 (vgl. 3 und 4).
BEISPIEL V
Sequenzanalyse des cprA-Gens von Aspergillus niger
Die Sequenz beider Stränge des Aspergillus niger-BglII-KpnI-Fragments, das in das Plasmid pPCPR2 kloniert worden war, wurde mittels der "Didesoxy-Ketten-Abbruchmethode" (Sanger et al. 1977) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74, 5463–5467) unter Verwendung des ³⁵S-dATP T7 DNA sequencing kit (Pharmacia) gemäß den Anweisungen des Herstellers bestimmt. Die Sequenz-Analyse von Subklonen wurde unter Verwendung der M13 Universal und Reverse Primer durchgeführt. Teile der Sequenz wurden unter Verwendung synthetischer Oligonukleotide bestimmt, wobei pCPR2 ds-DNA als Matrize verwendet wurde (vgl. 4). Die Sequenzinformationen wurden mittels der GCG-Software (Devereux et al., (1984) Nucleic Acids Res 12, 387–395) analysiert.
In der DNA-Sequenz wurde eine Region gefunden, die möglicherweise für ein Intron kodiert (2, Position 2367 ... 2437). Das tatsächliche Fehlen dieses Introns in der mRNA des cprA-Gens wurde in RT-PCR-Versuchen gezeigt. In diesen Versuchen wurde der erwartete Größenunterschied des PCR-Produkts gefunden, wenn Primer, die um das Intron lokalisiert sind, mit chromosomaler DNA oder isolierter Gesamt-RNA als Matrize verwendet wurden (GeneAmp RNA-PCR Kit, Perkin Elmer).
Es wurde herausgefunden, dass die abgeleitete Aminosäuresequenz des cprA-Gens von Aspergillus niger eine 39–46%ige Identität zu den Aminosäuresequenzen der CPRs der Hefen Saccharomyces cerevisiae, Candida tropicalis und Schizosaccharomyces pombe und zu den Genen von Nagetieren zeigt, sowie eine ungefähr 35%ige Identität zu den bislang publizierten CPR-Aminosäuresequenzen aus Pflanzen.
BEISPIEL VI
Bestimmung des Transkriptionsstarts
Zur Bestimmung des Transkriptionsstarts des Cytochrom-P450-Reduktase-Gens von Aspergillus niger wurde ein Primer-Extensionsversuch durchgeführt. Dazu wurden zwei Primer (PE50 und PE100) konstruiert. Diese Primer basierten auf Sequenzen, die jeweils 50 bp bzw. 100 bp 3' vom ATG lokalisiert sind und in Richtung des ATG abgelesen werden.
RNA wurde aus der Aspergillus niger-Transformante T16 (Van Gorcum et al., (1990) Mol Gen Genet 223, 192–197) isoliert.
Das Myzel wurde kultiviert und in flüssigen Stickstoff pulverisiert. Der feine Puder wurde in 1 ml RNAzol (Cinna/Biotecx) resuspendiert, und anschließend wurde die Isolierung gemäß den Anweisungen des Herstellers fortgeführt.
Von beiden Primern wurden 100 ng mit einer Kinase behandelt, wobei 5 μl ³²P-_γATP verwendet wurden. Die Reaktionen wurden für 30 Minuten bei 37°C wie beschrieben durchgeführt (Sambrook, Fritsch & Maniatis (1989) Molecular cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, U.S.A.). Nach der Inkubation wurden die Primer durch Filtrieren über eine Sephadex G50 Spin-Säule gereinigt. Zu den Primern wurde NH₄-Acetat bis zu einer Endkonzentration von 2 M sowie 2,5 Volumen eiskaltes Ethanol gegeben. Die Primer wurden bei –20°C für 60 Minuten präzipitiert. Die Primer wurden durch Zentrifugation bei 4°C, 14.000 rpm für 30 Minuten sedimentiert. Anschließend wurden die Pellets mit 70% Ethanol gewaschen und 20 μl TE resuspendiert.
Die Primer wurden mit M-MLV Reverser Transkriptase für 1 Stunde bei 37°C verlängert. Der Reaktionsmix (25 μl) enthielt 10 μg RNA, 50 mM NaCl, 34 mM Tris-HCl/pH 8,3, 6 mM MgCl₂, 5 mM DTT, 200 U M-MLV Reverse Transkriptase (Gibco), 0,5 mM dGTP, 0,5 mM dATP, 0,5 mM dCTP, 0,5 mM dTTP und 5 μl (25 ng) der mit Kinase behandelten Primer.
Die Reaktionen wurden durch Zugabe von 2 μl 0,5 M EDTA abgestoppt, gefolgt von einer Alkoholpräzipitation (60 Minuten –20°C). Nach Zentrifugation (30 Minuten, 14.000 rpm, 4°C) wurde das Pellet in 5 μl destilliertem Wasser resuspendiert. 3,4 μl Stopmix (Pharmacia T7 polymerase sequencing kit) wurden zu dem Gemisch gegeben. Bevor die Proben auf das Gel aufgebracht wurden, wurden sie durch Inkubation bei 95°C für 5 Minuten denaturiert, und anschließend direkt auf Eis gestellt. Die Hälfte der Probe wurde auf ein 8%iges keilförmiges denaturierendes Polyacrylamidgel aufgebracht.
Zur Kontrolle wurden die Sequenzreaktionen mit beiden Primern (Pharmacia T7 polymerase sequencing kit) mit dem Plasmid pCPR2 als Matrize durchgeführt und gleichzeitig mit dem Primerextensionsgemisch auf das Gel aufgebracht. Nach 2stündiger Elektrophorese (1100 V) wurde das Gel getrocknet und einem Röntgenstrahlungs-sensitivem Film ausgesetzt.
Es war auffällig, dass die Ergebnisse mit dem Primer PE50 wesentlich stärker als die mit dem Primer PE100 waren. Insbesondere in den Bahnen mit Primer PE50 waren zahlreiche Banden sichtbar. Die Kombination beider Ergebnisse führte zu der Benennung von drei möglichen Transkriptionsstartpunkten, nämlich 86 bp (ctcActc), 55 bp (cagActcg) und 37 bp (aagTcgg) vor dem ATG. Die letzte Bande wurde bei Verwendung des Primers PE100 nicht gefunden.
BEISPIEL VII
Transformation von Aspergillus niger-Stämmen
Die Aspergillus niger-Stämme N204 (ATCC 1015, csp, met, Boschloo et al., Appl. Microbiol Biotechnol (1990) 34, 225–228; enthält eine Kopie des bphA-Gens) und T18 (Aspergillus niger N271 ausgestattet mit etwa 12 Kopien des bphA-Gens; Van Gorcom et al. (1990) Mol Gen Genet 223, 192–197) wurden in 250 ml Komplettmedium (Minimalmedium supplementiert mit 0,1% Cas-Aminosäuren, 0,5% Hefeextrakt, 0,1 mg/ml Methionin, 1 μg/ml Pyridoxin) in 2 l-Erlenmeyer-Kolben kultiviert. Die Kulturen wurden mit 1 × 10⁶ Sporen pro ml inokuliert und anschließend für 18 Stunden in einem Luft-gerührten Inkubator bei 35°C und 300 rpm inkubiert. Nach der Inkubation wurde das Myzel durch Filtration mit einem Miracloth-Filter (Calbiochem) geerntet. Dieses Myzel wurde anschließend in Protoplasten umgewandelt und die davon isolierten Protoplasten wurden wie durch Yelton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 1470–1474, transformiert.
Proben von 100 μl Protoplasten wurden mit insgesamt 1 μg zirkulärer pAN7-1-DNA, 9 μg zirkulärer pCPR2-DNA und 2 μl einer 1 M ATA (Aureen-Tricarboxylsäure)-Lösung transformiert. Die Kontrollgefäße enthielten keine DNA oder lediglich 1 μg pAN7-1 (Punt et al., Gene 56 (1987) 117–124). Die transformierten Protoplasten wurden anschließend auf Minimalmedium-Agarplatten ausplattiert, die mit 1,2 M Sorbitol, 1 μg/ml Pyridoxin, 0,1 mg/ml Methionin und 100 μg/ml Hygromycin supplementiert waren. Diese Platten wurden 10 Tage bei 35°C inkubiert. Nach 4 Tagen wurden die ersten sporulierenden Transformanten sichtbar. Die Transformanten wurden zweimal mit einem Pinsel auf Minimalmedium-Agarplatten mit 100 μg/ml Hygromycin, 0,1 mg/ml Methionin und 1 μg/ml Pyridoxin aufgebracht, um reine Kulturen zu bilden.
Durch Transformation wurden 10 bis 40 Hygromycin-resistente Transformanten gebildet. Auf Transformationsplatten von Protoplasten, die ohne DNA behandelt worden waren, konnten nach 14 Tagen Inkubation bei 35°C keine Hygromycin-resistenten Transformanten gefunden werden.
BEISPIEL VIII
Screening der Transformanten
T18 Multiple Copy-cprA-Transformanten
Die Transformanten aus Beispiel VII wurden hinsichtlich ihres Hygromycin-Resistenzgrads durch Ausplattieren von Sporen auf Minimalmedium-Agarplatten, die mit 500 μg/ml Hygromycin, 0,1 mg/ml Methionin und 1 μg/ml Pyridoxin supplementiert waren, getestet.
Um Transformanten mit erhöhtem cprA-mRNA-Gehalt zu selektivieren, wurde ein RNA-Kolonie-Hybridisierungs-Experiment gemäß einer modifizierten Version des Protokolls durchgeführt, das für Saccharomyces cerevisiae von Stepien und Butow (1992), Nucl. Acids Res. 18(2) S.380, beschrieben wurde. Minimalmedium-Agarplatten wurden mit Sporen von Transformanten inokuliert, mit einem Hybond-N-Filter bedeckt und anschließend bei 25°C inkubiert, bis das Myzel gerade sichtbar war, jedoch die Sporenbildung noch nicht eingesetzt hatte. Die Filter wurden auf einen 500 μl-Tropfen Sorbitolpuffer (1,2 M Sorbitol, 0,1 M Natriumcitrat/pH 5,8, 0,1 M EDTA, 50 mM β-Mercaptoethanol) transferiert, für 5 Minuten inkubiert und anschließend auf eine Schicht Whatman 3MM-Filterpapier transferiert. Nach Trocknen für 5 Minuten auf dem Whatman-Papier wurden die Filter in eine Petrischale mit einem Tropfen (500 μl) Sorbitolpuffer transferiert, dem 10 mg/ml Novozym 234 (NOVO Nordisk) zugegeben worden waren. Die Petrischale wurde luftdicht mit Parafilm verschlossen und das Myzel wurde für 1 Stunde durch Inkubation bei 35°C in Protoplasten umgewandelt. Nach dem Umwandeln in Protoplasten wurden die Protoplasten durch Transfer der Filter auf einen 500 μl-Tropfen Lysepuffer (2% SDS, 7,3% Formaldehyd, 50 mM Tris-HCl/pH 7,5, 10 mM EDTA) lysiert, gefolgt von einer Inkubation von 5 Minuten bei Raumtemperatur. Die RNA wurde auf den Filter geblotet, indem man den Filter mit den lysierten Protoplasten auf eine Schicht Whatmann 3MM-Filterpapier transferierte, bis der Filter trocken war (etwa 5 Minuten). Dieser Blot-Schritt wurde einmal wiederholt. Schließlich wurden die Filter für 1 Minute auf einen Tropfen von 800 μl 6 × SSC (Sambrook et al, ***), 0,1% SDS transferiert und anschließend durch Transfer des Filters auf eine Schicht Whatmann 3MM-Papier getrocknet. Die RNA wurde auf dem Hybond-N-Filter durch W-Quervernetzung fixiert. Dazu wurde der Filter für 3 Minuten in eine W-Licht-Kammer gestellt. Die Filter wurden über Nacht bei 65°C mit einer ³²P-dCTP-markierten cprA-Sonde hybridisiert. Die Filter wurden bei 65°C gewaschen, wobei 0,2 × SSC verwendet wurde, 0,1% SDS im letzten Wachschritt. Nach Auflegen eines Films über Nacht bei –70°C konnten positive Transformanten identifiziert werden.
N204-Transformanten mit mehreren Kopien von cprA
Hygromycin-resistente Transformanten von N204 wurden mit einer RNA-Kolonie-Hybridisierung untersucht, bei der eine cprA-spezifische Sonde verwendet wurde. Eine zweite Untersuchung wurde mit einem Cytochrom-P450-Reduktase-spezifischen Filter-Aktivitäts-Assay durchgeführt. Zu diesem Zweck wurden Sporen von Hygromycin-resistenten Transformanten auf Minimalmedium-Agarplatten inokuliert, die mit 0,1 mg/ml Methionin und 1 μg/ml Pyridoxin supplementiert waren. Die Platten wurden mit einem Hybond-N-Filter bedeckt und bei 25°C inkubiert, bis das Myzel gerade sichtbar war, aber sich tatsächlich bis dahin noch keine Sporen gebildet hatten. Die Filter wurden entfernt, und das Myzel wurde durch Einfrieren in flüssigem Stickstoff und anschließend Auftauen lysiert. Die Filter wurden im Dunkeln für etwa 1 Stunde in 25 ml Neotetrazolium-Lösung (5 mg Neotetrazolium, 5 mg NADPH pro 25 ml) inkubiert. An Stellen mit Cytochrom-P450-Reduktase-Aktivität bildete sich ein deutliches pinkfarbenes Präzipitat.
Auf Basis der zwei Screeningverfahren wurden die Transformanten W13 und W35 als Transformanten selektiert, von denen man annahm, daß sie mehrere Kopien von cprA aufweisen.
BEISPIEL IX
DNA-Analyse von Transformanten
Das Myzel von in Beispiel VIII selektierten Transformanten wurde in 50 ml Minimalmedium kultiviert, das mit 1 μg/ml Pyridoxin, 0,1 mg/ml Methionin und 0,1% CAS-Aminosäuren supplementiert war. Erlenmeyer-Kolben (300 ml) wurden mit 1 × 10⁸ Sporen inokuliert und in einen Luft-gerührten Inkubator (35°C, 300 rpm) eingebracht. Das Myzel wurde durch Filtration mit einem Miracloth-Filter (Calbiochem) geerntet und mit 25 ml 0,9%igem NaCl gewaschen. Das Myzel wurde sofort in flüssigem Stickstoff gefroren. Von diesem Myzel wurde chromosomale DNA gemäß des Verfahrens, das bei Kolar et al. (Gene 62 (1988) 127–134) beschrieben wurde, isoliert. Das Pellet der letzten Alkoholpräzipitation wurde in 100 μl destilliertes Wasser eingebracht.
Chromosomale DNA (10 μl) wurde mit 20 U EcoRI und 20 U KpnI für 6 Stunden bei 37°C verdaut. Nach dem Verdau wurden gleiche Mengen DNA auf einem 0,8%igen TBE-Agarosegel durch Elektrophorese (18 Stunden, 35 V) getrennt. Nach der Trennung wurde die DNA auf eine Schicht Hybond-N-Filter (Amersham) gemäß den Anweisungen des Herstellers transferiert. Nach Fixierung der DNA (2 Stunden, 80°C) wurde der Blot bei 65°C für 4 Stunden vorhybridisiert und anschließend bei 65°C mit einer ³²P-markierten, cprA-spezifischen Sonde hybridisiert. Der Blot wurde bei 65°C gewaschen, wobei der letzte Waschschritt 0,2 × SSC, 0,1% SDS umfasste. Ein Röntgenstrahlungs-sensitiver Film wurde bei –70°C für 24 Stunden aufgelegt.
Sieben selektierte Transformanten wurden auf diese Weise analysiert. In einer Transformante wurde lediglich die Wild-Typ-Bande gefunden, in vier Transformanten wurde die Integration von 1 bis 2 Kopien des cprA-Gens gefunden und in zwei Transformanten wurde die Integration von mehreren Kopien des cprA gefunden. Von Integranten mit mehreren Kopien wurde die Transformante T18 #5 selektiert.
BEISPIEL X
NADPH: Cytochrom-P450 (Cytochrom c)-Reduktase-Aktivität
Die CPR-Aktivität wurde durch Messen der Fähigkeit zellfreier Extrakte von Transformanten, Cytochrom c zu reduzieren, bestimmt. (Angepasst von Madyastha et al. (1976) Biochemistry 15, 1097–1102).
Das Myzel wurde für 18 Stunden in 50 ml Minimalmedium kultiviert, das mit 0,1% CAS Aminosäuren, 0,1 mg/ml Methionin und 0,1 μg/ml Pyridoxin supplementiert war. Das Medium wurde mit 1 × 10⁶ Sporen pro ml in 300 ml Erlenmeyer-Kolben in einem Luftgerührten Inkubator (35°C, 300 rpm) inokuliert. Das Myzel wurde durch Filtration mit einem Miracloth-Filter (Calbiochem) geerntet und mit 25 ml 0,9%igen NaCl gewaschen. Überschüssiger Puffer wurde entfernt, indem der Filter mit dem Myzel zwischen Tüchern geblotet wurde. Das Myzel wurde in flüssigen Stickstoff gefroren und in einem Mörser pulverisiert. Der feine Puder wurde in ein Eppendorf Reaktionsgefäß transferiert, das mit 1 ml eiskaltem CPR-Extraktionspuffer (50 mM Natriumphosphat-Puffer/pH 7,8, 20% Glycerol, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 5 μg/ml Leupeptin, 4 mM PMSF, 0,2% Natriumdesoxycholat) gefüllt war. Die Gefäße wurden direkt gemischt und auf Eis gestellt. Die Extrakte wurden für 15 Minuten auf Eis inkubiert (Solubilisierungs-Schritt) und für 15 Minuten bei 4°C, 1000 g zentrifugiert. Der Überstand wurde in ein neues Gefäß transferiert und auf Eis aufbewahrt. Die Cytochrom c-Reduktase-Aktivität wurde direkt gemessen.
Zu 1 ml CPR-Assay-Mix (0,3 M K-Phosphatpuffer/pH 7,7, 0,1 mM EDTA, 1 mM KCN) wurden 2 μl 20 mM Cytochrom c gegeben. Bei Raumtemperatur (20 bis 25°C) wurden 5 bis 20 μl zellfreier Extrakt zugesetzt und es wurde für 1 bis 2 Minuten inkubiert. Die Reaktionen wurden durch Zugabe von 1 μl 100 mM NADPH initiiert. Die Reduktion des Cytochrom c wurde spektrophotometrisch für 3 Minuten (550 nm) verfolgt.
Die Proteinkonzentrationen wurden mit dem Bio Rad protein assay kit gemäß den Anweisungen des Herstellers unter Verwendung von BSA als Standard bestimmt.
Tabelle II, Cytochrom C-Reduktase-Aktivitäten (e = 21 mM·cm^–1 der verschiedenen Stämme/Transformanten.
Die angegebenen Werte stammen von zwei unabhängigen Kulturen. Die Prozentwerte basieren auf dem Durchschnitt der Parallel-Experimente. 1 Unit ist die Menge an Cytochrom C (mM) die pro Minute pro mg Gesamtprotein reduziert wird.
BEISPIEL XI
BPH-Aktivität, in vitro-Assay
Zur Messungen der BPH-Aktivität in vitro wurde ein noch nicht optimierter Assay verwendet, der auf dem Benzoat-abhängigen Verbrauch von NADPH durch die NADPH-Cytochrom-P450-Oxidoreduktase basiert.
Die BPH-Aktivität wurde in vitro in den Aspergillus Niger-Stämmen T18 (1 Kopie cprA, 12 Kopien bphA), Stamm T18 # 5 (6 Kopien cprA, 12 Kopien bphA), Stamm N204 (1 Kopie cprA, 1 Kopie bphA) und Stamm W35 (1 Kopie cprA, mehrere Kopien cprA) gemessen.
Das Myzel wurde für 18 Stunden in 250 ml Minimalmedium kultiviert, das mit 0,1% CAS Aminosäuren, 0,1 mg/ml Methionin und 0,1 μg/ml Pyridoxin supplementiert war. Das Medium wurde mit 1 × 10⁶ Sporen pro ml in 2 ml-Erlenmeyer-Kolben in einem Luftgerührten Inkubator inokuliert (35°C, 300 rpm). Das Myzel wurde durch Filtration mit einem Miracloth-Filter (Calbiochem) geerntet und mit 250 ml 0,9%igem NaCl gewaschen. Das Myzel wurde in 2 l-Erlenmeyer-Kolben transferiert, die mit 250 ml Induktionsmedium (Minimalmedium mit Pyridoxin und Methionin, in dem statt Glucose 0,1% Benzoat als C-Quelle vorhanden war) gefüllt waren. Das Myzel wurde durch Filtration mit einem Miracloth-Filtrationsgewebe geerntet. Nach Waschen mit 0,9%igen NaCl wurde der überschüssige Puffer entfernt, indem der Filter mit dem Myzel zwischen Tüchern geblotet wurde. Das Myzel wurde in flüssigem Stickstoff gefroren und in einem Mörser pulverisiert. Der feine Puder wurde in ein Eppendorf-Reaktionsgefäß transferiert, das mit 1 ml eiskaltem CPR-Extraktionspuffer (50 mM Natriumphosphat-Puffer/pH 7,8, 20% Glycerol, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 5 μg/ml Leupeptin, 4 mM PMSF, 0,2% Natriumdesoxycholat) gefüllt war. Die Gefäße wurden direkt gemischt und auf Eis gestellt. Der Extrakt wurde für 15 Minuten auf Eis inkubiert (Solubilisierung) und anschließend für 15 Minuten bei 4°C, 3500 rpm zentrifugiert. Der Überstand wurde in ein neues Gefäß transferiert und auf Eis aufbewahrt.
Die BPH-Aktivität wurde durch spektrophotometrische Kontrolle (340 nm) des BPH-spezifischen Verbrauchs von NADPH durch die Cytochrom-P450-Reduktase gemessen. Zell-freie Extrakte (10 ml) wurden zu 500 μl BPH-Assaypuffer (100 mM Tris/pH 7,8, 10 mM MgCl₂, 200 μM NADPH) gegeben. Der nicht-spezifische NADPH-Verbrauch wurde für 2 Minuten gemessen (δ – BA). Das Benzoat wurde zugesetzt (20 μl einer 20 mM Lösung) und der NADPH-Verbrauch wurde für 4 Minuten gemessen (δ + BA). Der BPH-spezifische NADPH-Verbrauch wurde durch die folgende Rechenmethode bestimmt:
Units (1 Unit = 1 μmol verbrauchtes NADPH pro Minute pro mg Gesamtprotein) wurden durch Multiplikation von δBA mit dem Extinktions-Koeffizienten (e = 6,22·10^–3M^–1cm^–1 berechnet.
Die Proteinkonzentrationen wurden mit dem Bio Rad protein assay kit gemäß den Anweisungen des Herstellers unter Verwendung von BSA als Standard bestimmt.
Tabelle IV, in vitro BPH-Aktivität. Ein Unit entspricht dem Benzoat-abhängigen Verbrauch von NADPH (μM) pro Minute pro mg Gesamtprotein.
BEISPIEL XII
Bph-Aktivität in vivo HPLC-Assay
Das Myzel wurde für 18 Stunden in 500 ml Minimalmedium kultiviert, das mit 0,1% CAS Aminosäuren, 0,1 mg/ml Methionin und 0,1 μg/ml Pyridoxin supplementiert war. Das Medium wurde mit 1 × 10⁶ Sporen pro ml in 2 l-Erlenmeyer-Kolben in einem Luftgerührten Inkubator (35°C, 300 rpm) inokuliert. Das Myzel wurde durch Filtration mit einem Miracloth-Filter (Calbiochem) geerntet und mit 25 ml 0,9%igem NaCl gewaschen. Das Myzel wurde in Induktionsmedium subkultiviert (Minimalmedium, supplementiert mit 0,1 mg/ml Methionin und 0,1 μg/ml Pyridoxin, wobei statt 1 Glucose 0,1% Benzoat als C-Quelle zugesetzt wurde). Proben des Mediums wurden nach 5 Stunden entnommen.
Proben von 2 μl wurden mittels HPLC-Chromatographie auf einer reversed phase C-18ßSäule (Superchem LC 18-DB) bei 30°C unter Verwendung von 10 mM Natriumcitratpuffer/pH 3, 60% Methanol als Elutionspuffer analysiert. Es wurde eine Flussrate von 1 ml/min verwendet. Sowohl Benzoat als auch 4-Hydroxy-benzoat wurden bei 245 nm detektiert. Die Referenzproben enthielten 10 μl 1 mM Benzoat und 10 μl 1 mM 4-Hydroxy-benzoat.
Tabelle IV, Konzentration von Benzoat und 4-Hydroxy-benzoat nach Inkubation der Transformanten für 5 Stunden in Induktionsmedium. Detektion mittels HPLC. Aspergillus niger kann 4-Hydroxy-benzoat als C-Quelle verwenden und somit weiter metabolisieren. Aus diesem Grunde sind die Summen der letzten zwei Spalten der Mengen von Benzoat und 4-OH-benzoat nicht identisch.
BEISPIEL XIII
Um die breite Wirkung des Cytochrom-P450-Reduktase-Gens zu verifizieren wurden Experimente durchgeführt, in denen die Wirkung der CPR-Überproduktion auf die Aktivität eines unterschiedlichen (in diesem Beispiel sogar heterologen) Cytochrom-P450-Enzyms getestet wurde.
Für diesen Zweck wurden Aspergillus niger-Stämme konstruiert, die mit mehreren Kopien des cprA-Gens von Aspergillus niger und mehreren Kopien des Gens, welches für Lanosterol 14α-Demethylase (14dm) des filamentösen Pilzes Penicillium italicum kodiert, ausgestattet waren.
Konstruktion von Plasmiden
Für das Einbringen der zwei Gene wurden zwei Plasmide konstruiert. Das Plasmid pCPR2-amdS wurde konstruiert, indem das Plasmid pCPR2 mit NotI verdaut wurde und mit einer funktionstüchtigen Kopie des amdS-Gens von Aspergillus nidulans (Hynes et l1. Mol. Cell. Biol. 3 (1983) 1430–1439) ausgestattet wurde, das auf einem NotI-Fragment einer Größe von ungefähr 5 kb lokalisiert ist (die ursprünglichen Enden des chromosomalen amdS-Fragments (EcoRI und SalI) waren durch NotI-Schnittstellen ersetzt worden). Das amdS-Gen wurde in den Transformationsexperimenten als Selektionsmarker verwendet. Das Plasmid p14dm wurde wie folgt konstruiert. Das Hefe-Expessionsplasmid YEP24 wurde mit BamHI und SalI verdaut. Zwischen diesen Schnittstellen wurde ein ungefähr 2,1 kb großes, chromosomales (teilweise) BamHI – (teilweise) SalI-Fragment ligiert, auf dem das gesamte 14dm-Gen von Penicillium italicum lokalisiert war (vgl. 5).
Transformation von Aspergillus niger pCPR2-amdS
A. niger N402 (Bos, Doktorarbeit Landwirtschaftl. Universität Wageningen, Niederlande, 1986) wurde als Ausgangsstamm verwendet. Die Transformationsexperimente wurden wie in (Kelly and Hynes EMBO J. 4 (1985) 475–479) beschrieben durchgeführt. A. niger N402 wurde mit pCPR2-amdS transformiert. Nachdem die Transformanten mit einem Pinsel auf Selektionsplatten (Minimalmediumplatten mit 15 mM CsCl mit Acetamid (10 mM), welches als einzige N-Quelle fungiert) aufgetragen worden waren, um Reinkulturen zu bilden, wurden die Transformanten weiter auf ihre Möglichkeit selektiert, Acrylamid als einzige N-Quelle zu verwenden. Stämme mit einer hohen amdS-Kopienzahl wachsen besser auf Acrylamid als Stämme mit geringer Kopienzahl (Verdoes et al., Transgenic Research 2 (1993) 84–92).
Eine ausgewählte Anzahl von Transformanten wurde durch Southernblot-Analyse weiter analysiert. Die Transformante AB2-2 (≥10 Kopien cprA) wurde schließlich für weitere Experimente ausgewählt.
p14dm
Das Plasmid p14dm wurde durch Co-Transformation mit dem Plasmid pAN7-1, auf dem das hph-Gen lokalisiert ist, welches Resistenz gegenüber Hygromycin verleiht (Punt et al. Gene 56 (1987) 117–124) in Aspergillus niger co-transformiert. Transformanten wurden auf Platten mit 100 μg/ml Hygromycin selektiert. Positive Transformanten wurden anschließend auf ihre Resistenz gegenüber höheren Konzentrationen von Hygromycin selektiert. Transformanten, die bei höheren Konzentrationen von Hygromycin ebenfalls gut wuchsen, wurden durch Southernblot-Analyse weiter analysiert. Schließlich wurde die Transformante AB-D1 (≥10 Kopien 14dm) für weitere Experimente ausgewählt.
In der Transformante AB-D1 wurde in einem zweiten Transformationsexperiment versucht, zusätzlich zu weiteren 14dm-Kopien weitere cprA-Kopien einzubringen. Die Transformante AB-D1 wurde zu diesem Zweck mit dem Plasmid pCPR2-amdS transformiert. Das weitere Selektionsverfahren war mit der Vorgehensweise identisch, die für die Isolierung der Transformante AB2-2 verwendet wurde. Schließlich wurde die Transformante ABD1.15 (≥10 Kopien 14dm, ≥10 Kopien cprA) für weitere Experimente ausgewählt.
Cytochrom-P450-Reduktase-Aktivität
Tabelle V. CPR-Aktivität in selektierten Transformanten, gemessen als NADPH-abhängige Cytochrom C-Reduktion und ausgedrückt in Units (mmol reduziertes Cytochrom C pro Minute pro mg Gesamtprotein). Geschätzte 14DM Kopienzahl: "1" Wildtyp A. Niger 14DM Gen, +: zusätzliche Kopien des P. italicum 14DM-Gens.
Lanosterol 14α-Demethylase-Aktivität
Die Lanosterol 14α-Demethylase-Aktivität in den vier verschiedenen Stämmen wurde in einem Experiment bestimmt, bei dem das radiale Wachstum der verschiedenen Stämme in Medien mit verschiedenen Konzentrationen eines Inhibitors der Lanosterol 14α-Demethylase als Maß für die enzymatische Aktivität gemessen wird. Zu diesem Zweck wurde Myzel-Pfropfen auf Platten mit ansteigenden Konzentrationen bekannter Lanosterol 14α-Demethylase-Inhibitoren (DMIs) bereitgestellt. Bei einer höheren Konzentration des DMI entwickelt sich ein zunehmend kleineres Auswachsen des Myzels. Nach ein paar Tagen wurde die Länge der ausgewachsenen Myzelfilamente bestimmt. Die EC₅₀-Werte wurde berechnet, die Konzentration des DMI, bei der die Länge der ausgewachsenen Myzelfilamente der Hälfte des Auswachsens in Abwesenheit von DMI entspricht. Die verwendeten DMIs waren Fenarimol, Etaconazol und Imazalil. Zur Kontrolle wurde die Inhibierung des Wachstums durch Benomyl ebenfalls überprüft. Dieses Produkt inhibiert das Wachstum des Myzels über einen anderen 14 dm-unabhängigen Mechanismus. Die Ergebnisse dieser Experimente sind in Tabelle VI und 6 gezeigt.
Tabelle VI. Lanosterol 14α-Demethylase-Inhibierung (DMI) EC₅₀-Werte ausgedrückt in ppm. Geschätzte 14DM Kopienzahl: "1" wild typ A. niger 14DM Gen, +: zusätzliche Kopien des P. italicum 14DM Gens.
Medien und Lösungen
50 × AspA (1 l)

300 g NaNO₃

26 g KCl

76 g KH₂PO₄

18 ml KOH (10 M)
1000* Sporenelemente (100 ml)

2,2 g ZnSO₄ × 7H₂O

1,1 g H₃BO₃

0,5 g MnCl₂ × 4H₂O

0,5 g FeSO₄ × 7H₂O

0,17 g CoCl₂ × 6H₂O

0,16 g CuSO₄ × 5H₂O

0,15 g Na₂MoO₄ × 2H₂O

5,0 g EDTA
Minimalmedium (500 ml)

10 ml 50* AspA

10 ml 50% Glucose

0,5 ml 1000* Sporenelemente

1,0 ml 1 M MgSO₄
Komplettmedium

10 ml 50* AspA

10 ml 50% Glucose

0,5 ml 1000* Sporenelemente

1,0 ml 1 M MgSO₄

5,0 ml 10% Cas-Aminosüren

25 ml 10% Hefeextrakt
4: Die aufgefundenen positiven λ-Klone, λ19-l und die daraus konstruierten Subklone, pCPR2 und pCPR7.
(S = SalI, E = EcoRI, Bg = BglII, K = KpnI, N = NcoI).
5: Zeigt das Insert von pCPR2, auf dem das CPR-Gen lokalisiert ist. Die Regionen, dessen Sequenzen bestimmt worden sind, sind als Pfeile dargestellt.
(Bg = BglII), N = NcoI, X = XhoI, P = PstI, K = KpnI)

Claims

Rekombinantes DNA-Molekül, das (a) eine Nukleinsäuresequenz wie in 1 gezeigt, die für eine Cytochrom-P450-Oxidoreduktase oder einen enzymatisch aktiven Teil davon kodiert; (b) eine Nukleinsäuresequenz, die komplementär zu der Nukleinsäuresequenz von (a) ist; (c) eine Nukleinsäuresequenz, die unter stringenten Bedingungen von 56°C und 6 × SSC mit der Nukleinsäuresequenz von (b) hybridisiert und für eine Cytochrom-P450-Oxidoreduktase oder einen enzymatisch aktiven Teil davon kodiert; oder (d) eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die komplementär zu der Nukleinsäuresequenz von (c) ist.
mRNA-Molekül, das für eine Cytochrom-P450-Oxidoreduktase kodiert, wobei die mRNA eine Nukleinsäuresequenz hat, die der Cytochrom-P450-Oxidoreduktase-kodierenden Nukleinsäuresequenz wie in 1 gezeigt entspricht.
Polypeptid, das Cytochrom-P450-Oxidoreduktase-Aktivität hat, wobei das Polypeptid durch ein rekombinantes DNA-Molekül gemäß Anspruch 1 kodiert wird.
Transformierte Wirtszelle, die eine Zelle eines filamentösen Pilzes ist, die zumindest mit einem DNA-Molekül gemäß Anspruch 1 transformiert ist.
Transformierte Wirtszelle nach Anspruch 4, die eine filamentöse Ascomyceten-Zelle ist.
Transformierte Wirtszelle nach Anspruch 5, die eine Aspergillus-Zelle ist.
Transformierte Wirtszelle nach Anspruch 6, die eine Aspergillus niger-Zelle ist.
Transformierte filamentöse Pilzzelle nach Anspruch 4, die ferner mit einem DNA-Molekül transformiert ist, das für ein P450-Cytochrom-Protein kodiert.
Verfahren zur Durchführung enzymatischer Umwandlungen unter Verwendung von P450-Cytochrom-Proteinen, bei dem ein transformierter filamentöser Pilz gemäß einem der Ansprüche 4–8 verwendet wird.
Verfahren zur Durchführung enzymatischer Umwandlungen, bei dem ein Polypeptid gemäß Anspruch 3 verwendet wird.