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GEBIET DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Molekularbiologie
und die Verwendung von Hefe zur Herstellung von Ascorbinsäure und
Ascorbinsäure-Stereoisomeren.
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HINTERGRUND DER ERFINDUNG
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L-Ascorbinsäure (Vitamin
C, ASA) findet in der pharmazeutischen und Nahrungsmittelindustrie
als ein Vitamin und Antioxidationsmittel Verwendung. Die Synthese
von ASA hat über
viele Jahre hinweg eine beträchtliche
Beachtung gefunden, und zwar aufgrund ihres relativ großen Marktvolumens
und hohen Wertes als eine Spezialchemikalie. Das Reichstein-Grussner-Verfahren,
ein chemischer Weg aus Glukose zu ASA, wurde erstmals 1934 beschrieben
(Helv. Chim. Acta 17: 311–328).
Lazarus et al. (1989, "Vitamin
C: Bioconversion via a Recombinant DNA Approach", Genetics and Molecular Biology of
Industrial Microoranisms, American Society for Microbiology, Washington
D. C. Herausgegeben von C. L. Hershberger) beschrieben ein Bioumwandlungsverfahren
zur Herstellung eines Intermediats von ASA, 2-Keto-L-gulonsäure (2-KLG,
KLG), welches chemisch zu ASA umgewandelt werden kann. Saito et
al. (1997, Applied and Environmental Microbiology, 63: 454–460) berichteten
bezüglich
der Konstruktion eines Expressionssystems zur Herstellung von 2-KLG
aus D-Sorbitol. Chemical Abstracts, Band 84, Nr. 5, 2. Februar 1976,
Abstract Nr.: 29189, WO 87100863 und
US 5
032 514 diskutieren die Herstellung von ASA in Bakterien.
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Über die
Anwesenheit von ASA in Hefen wurde berichtet (Heick et al. Can.
J. Microbiol., 1972, 18, 597–600),
und die Umwandlung von L-Galactonsubstraten zu ASA in Candida-Hefe wurde beschrieben (US-Patente
4 595 659, erteilt am 17.06.86, und 4 916 068, erteilt am 10.04.90).
Haller et al. (1990) Dechema Biotechnology Congresses, DE, Weinheim,
Band 4, 1. Januar 1990, Seiten 233–236 und Morimitsu et al. (1978)
Archives of Biochemistry and Biophysics, Band 191, Nr. 2, Seiten
479–489,
diskutieren ebenfalls die Herstellung von ASA in Hefe. Costamagna
et al. (Can. J. Microbiol., 1986, 32, 756–758) beschreiben die Ergebnisse
einer Untersuchung bezüglich
der ASA-Nutzung von einigen Hefen. Dieser Bericht beschreibt, dass Spezies
von Cryptococcus und Candida in der Lage waren, auf ASA sowie auf
Iso-Ascorbinsäure
zu wachsen.
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Trotz
der wissenschaftlichen Fortschritte, die bezüglich der Herstellung von ASA
und seinen biokatalytischen Intermediaten gemacht worden sind, besteht
der Bedarf nach Verfahren zur Herstellung von Ascorbinsäure, um
die Weltnachfrage zu befriedigen. Das Auffinden eines Verfahrens,
welches eine erneuerbare Kohlenstoffquelle zur Herstellung von Ascorbinsäure nutzt,
wäre besonders
vorteilhaft.
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ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung betrifft die Herstellung von Ascorbinsäure oder
Ascorbinsäure-Stereoisomeren in
Hefe. Die vorliegende Erfindung basiert teilweise auf der unerwarteten
Erkenntnis, dass mehrere Vertreter von Hefe, welche in der Lage
sind auf Ascorbinsäure
oder Iso-Ascorbinsäure
als einer alleinigen Kohlenstoffquelle zu wachsen, fähig sind,
KLG als eine alleinige Kohlenstoffquelle zur Erzeugung von Ascorbinsäure zu nutzen.
Demzufolge liefert die vorliegende Erfindung Verfahren zur Herstellung
von Ascorbinsäure oder
einem Ascorbinsäure-Stereoisomer
aus Hefe.
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Kurze Beschreibung der
Zeichnungen
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Die 1 veranschaulicht
das Wachstum von Candida blankii, Candida shahatae und Cryptococcus dimmnae
auf 2 KLG als einer alleinigen Kohlenstoffquelle in einer Hefe-Stickstoff-Basis.
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Die 2 veranschaulicht
das Wachstum von Candida blankii, Candida shahatae, Cryptococcus dimmnae
und Cryptococcus luteolus auf Idonatnatriumsalz in einer Hefe-Stickstoff-Basis.
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Die 3 veranschaulicht
die Bestimmung des ASA-Gehalts im Überstand von Candida blankii
und Cryptococcus dimmnae aus einer Ganzzell-Reaktionsmischung unter
Anwendung des Ascorbatoxidaseassays.
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Genaue Beschreibung
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Definitionen:
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Wie
hierin verwendet, ist der Ausdruck "Ascorbinsäure" der Name, welcher von der IUPAC-IUB-Kommission zur
biochemischen Nomenklatur für
Vitamin C anerkannt wurde. Andere Namen sind L-Ascorbinsäure, L-Xyloascorbinsäure und
L-Threo-hex-2-en-säure-γ-lacton.
Das reine Vitamin ist C6H8O6 und besitzt ein Molekulargewicht von 176,13.
Vier Stereoisomere von Ascorbinsäure
sind möglich:
L-Ascorbinsäure,
D-Araboascorbinsäure
(Erythorbinsäure),
welche Vitamin-C-Aktivität
zeigt, L-Araboascorbinsäure
und D-Xyloascorbinsäure.
Ascorbinsäureintermediate
oder "Stoffwechselintermediate" sind jene Biochemikalien,
die in der Lage sind, zu ASA mittels enzymatischer oder chemischer
Mittel umgewandelt zu werden und schließen Gluconsäure, 2-Keto-D-gluconsäure, 2,5-Diketo-D-gluconsäure, 2-Keto-L- gulonsäure, Idonsäure, Gluconsäure, Sorbitol, Sorbose,
Sorboson und Sorbosediaceton ein, sind jedoch nicht darauf beschränkt.
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Die
Phrase "fähig zur
Nutzung von KLG, um Ascorbinsäure
oder ein Ascorbinsäure-Stereoisomer herstellen", wenn auf eine Hefe
Bezug genommen wird, bedeutet eine Hefe, welche in der Lage ist,
Ascorbinsäure aus
KLG durch ein beliebiges Mittel, einschließlich der biokatalytischen
Umwandlung, herzustellen.
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Es
ist im Fachbereich allgemein anerkannt, dass die sauren Derivate
von Sacchariden in einer Vielzahl von Ionisationszuständen existieren
können,
und zwar in Abhängigkeit
von ihren umgebenden Medien, wenn sie in Lösung sind, oder außerhalb
einer Lösung,
aus welcher sie hergestellt wurden, wenn sie in fester Form sind.
Die Verwendung eines Ausdruckes, wie zum Beispiel Idonsäure, um
solche Moleküle
zu bezeichnen, soll alle Ionisationszustände des betreffenden organischen
Moleküls
einschließen.
Somit beziehen sich zum Beispiel "Idonsäure", ihre cyclisierte Form "Idonolacton" und "Idonat" auf den gleichen
organischen Rest und sollen nicht besondere Ionisierungszustände oder
chemische Formen spezifizieren.
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Wie
hierin verwendet, bezieht sich der Ausdruck "rekombinant" auf eine Hefe, welche Nukleinsäure enthält, die
nicht natürlich
in dem Organismus vorkommt und/oder auf Hefe, die zusätzliche
Kopien rekombinant eingeführter
endogener Nukleinsäure
aufweist. Der Ausdruck "heterolog", wie er hierin verwendet
wird, bezieht sich auf Nukleinsäure
oder Aminosäuresequenzen,
die nicht natürlicherweise
in der Hefe auftreten. Wie hierin verwendet, bezieht sich der Ausdruck "endogen" auf eine Nukleinsäure, die
natürlicherweise
in der Hefe auftritt. Ein rekombinanter Wirt kann ebenfalls Mutationen
und/oder Deletionen in natürlich
vorkommender Nukleinsäure
von solcher Art besitzen, dass das durch die Nukleinsäure kodierte
Protein nicht hergestellt wird.
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Wie
hierin verwendet, bezeichnet "Nukleinsäure" eine Nukleotid-
oder Polynukleotidsequenz, und Fragmente oder Bereiche davon, und
DNA oder RNA von genomischen oder synthetischem Ursprung, welche doppelsträngig oder
einzelsträngig
sein können,
ob sie nun den Sinn- oder
Anti-Sinn-Strang repräsentieren. Wie
hierin verwendet, bezeichnet "Aminosäure" Peptid- oder Proteinsequenzen
oder Bereiche davon.
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Der
Ausdruck "oxidatives
Enzym", wie er hierin
verwendet wird, bezeichnet ein Enzym oder Enzymsystem, welches die
Umwandlung eines Substrats eines vorgegebenen Oxidationszustandes
zu einem Produkt eines höheren
Oxidationszustandes als dem des Substrates katalysieren kann. Der
Ausdruck "reduzierendes
Enzym" bezeichnet
ein Enzym oder Enzymsystem, welches die Umwandlung eines Substrats
eines vorgegebenen Oxidationszustands zu einem Produkt mit einem
niedrigeren Oxidationszustand als dem des Substrates katalysieren
kann. Oxidative Enzyme, welche mit der Biokatalyse eines Zuckers
mit 6 Kohlenstoffen zu Stoffwechselintermediaten von ASA assoziiert
sind, schließen
unter anderen D-Glukosedehydrogenase, D-Gluconatdehydrogenase und
2-Keto-D-gluconatdehydrogenase sowie L-Sorbitoldehydrogenase-Aktivität, L-Sorbosedehydrogenase
und L-Sorbosondehydrogenase-Aktivität ein. Reduktive Enzyme, die
mit der Biokatalyse von Stoffwechselintermediaten von ASA zu gewünschten
Endprodukten assoziiert sind, schließen unter anderem 2,5-Diketo-D-gluconatreduktase
(DKGR), 2-Ketoreduktase (2-KR) und 5-Ketoreduktase (5-KR) ein. Solche
Enzyme schließen
jene ein, welche natürlich
durch die Wirtshefe hergestellt werden, oder jene, welche über rekombinante
Mittel eingeführt
werden, ein.
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Wie
hierin verwendet schließt
der Ausdruck "Zuckersäure mit
6 Kohlenstoffen" spezifisch
L-Galactonsäuresubstrate
aus und schließt
2-Keto-L-gulonsäure,
Idonsäure,
Gluconsäure,
6-Phosphogluconat,
2-Keto-D-gluconsäure,
5-Keto-D-gluconsäure,
2-Ketogluconatphosphat, 2,5-Diketo-L-gulonsäure, 2,3-L-Diktogulonsäure, Dehydroascorbinsäure, Erythroascorbinsäure und
D-Mannonsäure
ein, ist jedoch nicht darauf beschränkt.
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Wie
hierin verwendet, schließt
der Ausdruck "Zucker
mit 6 Kohlenstoffen" Glukose,
Gulose, Sorbose, Fructose, Idose, Galactose und Mannose, alle in
entweder der D- oder L-Form, ein, ist jedoch nicht darauf beschränkt.
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Die
Ausdrücke "isoliert" oder "gereinigt", wie hierin verwendet,
beziehen sich auf eine Nukleinsäure oder
ein Protein oder Peptid, welche/welches von mindestens einer Komponente
entfernt wird, mit welcher sie/es natürlicherweise assoziiert ist.
In der vorliegenden Erfindung kann eine isolierte Nukleinsäure einen
die Nukleinsäure
umfassenden Vektor einschließen.
Gereinigt, wie hierin verwendet, um eine Kohlenstoffquelle zu beschreiben,
die von einem fermantativen Prozess abgeleitet ist, bezieht sich
auf die Entfernung dieser Kohlenstoffquelle von mindestens einer
Komponente, mit welcher sie natürlicherweise
in der Fermentationskultur assoziiert ist.
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Genaue Beschreibung:
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Herstellung von ASA in
Hefe
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Die
vorliegende Erfindung betrifft die Herstellung von ASA oder ASA-Stereoisomeren,
zum Beispiel Erythorbinsäure,
in Hefe, welche in der Lage ist, KLG als eine einzige Kohlenstoffquelle
zur Herstellung von ASA zu nutzen. Die vorliegende Erfindung schließt speziell
ein Verfahren zur Herstellung von ASA in Hefe aus, welches ASA über den
L-Galactonolactonoxidase-Stoffwechselweg herstellt. Hefen sind in
N. J. W. Kreger-van Rij, in "The
Yeasts", Band 1
von Biology of Yeasts, Kapitel 2, Hrsg. A. H. Rose & J. S. Harrison,
1987, Academic Press, London, beschrieben. Hefen, die zu den Gattungen
der imperfekten Hefen gehören,
werden allgemein dadurch charakterisiert, dass sie keine Ascosporen
und Basidiosporen bilden. ASA ist sauerstoffempfindlich, deshalb
ist es bevorzugt, dass die Hefe in der Lage ist, anaerob zu wachsen,
um die Oxidation der hergestellten ASA zu verringern. Die vorliegende
Erfindung umfasst ebenfalls Verfahren der Herstellung von ASA unter Verwendung
von Hefen, welche unter aeroben Bedingungen kultiviert werden, solange
reduzierende Mittel wie Dithioetrythretol, Glutathion, Metallchelatoren
wie EDTA, Stabilisatoren wie Metaphosphorsäure, Aminosäuren, Glykole, Zucker, Oxalsäure, Trichloressigsäure, 8-Hydroxychinolin
in der ASA-Umgebung vorliegen (D. W. Bradley, G. Emery und J. E.
Maynard, Clin. Chim. Acta 4, 47–52
(1973).
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Hefen,
welche in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, schließen jene
ein, die hierin aufgelistet sind, sind jedoch nicht darauf beschränkt, und
sie werden beispielhaft durch der Auflistung folgende Hinterlegungsbezeichnung
angegeben: Candida blankii CBS1898, ATCC 18735; C. curvata CBS570;
C. humicola; C. incommunis ATCC22971; C. salmanticensis ATCC 16042;
C. sp. ATCC 28528, ATCC 20473; Cryptococcus albidus CBS4192; Cr.
dimennae CBS5770; Cr. heveanensis CBS140; Cr. kuetzingii UCD68-196;
Cr. luteolus CBS953; Cr. skinneri UCD60-82 CBS5029; Cr. terreus
CBS1895, CBS6293 CCY17-8-5; Cr. uiguttulatus CBS1730; Cr. laurenti
CCY 17-3-2, CCY17-3-6, ATCC32044; Cr. neoformans ATCC32045; Cr.
podzolicus CCYI7-20-1; Trichosporon cutaneum UCD54-169 CCY30-5-4;
T. beigelii NRRLY-1490; T. pullulans ATCC10677; Aureobasidium pullulans
DBV A9, A10, A62, A77 A84; Hansenula capsulata DBV 3164, ATCC24204;
Lipomyces starkeyi UCD 51-55, 15 CBS1809; L. lipofer NRRL Y-1351,
Phaffia rhodozyma ATCC24201, Rhodotorula mucilaginosa NRC 211003;
Saccharomyces uvarum ATCC9373, ATCC 9080; Saccharomycopsis fibuligera
ATCC2082; Schwanniomyces occidentalis NRC2782, NRC2783; and Torulopsis ernobii
ATCC20000. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Hefe ein
Vertreter der imperfekten Hefegruppe. Eine bevorzugte Familie von
imperfekter Hefe zur Verwendung bei Verfahren zur Herstellung von
ASA ist die Cryptococcaceae-Familie. Bevorzugte Gattungen von Cryptococcaceae
werden aus der Gruppe gewählt,
die aus Candida und Cryptococcus besteht.
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Wie
in den Beispielen gezeigt, waren Candida blankii und Cryptococcus
dimennae in der Lage, ASA über
Hintergrundspiegeln herzustellen, wenn sie auf KLG als einer alleinigen
Kohlenstoffquelle wachsen gelassen wurden, wohingegen Candida shehatae,
obgleich sie in der Lage ist, auf KLG als einer alleinigen Kohlenstoffquelle
zu wachsen, unfähig
zur Herstellung von ASA war. Die illustrierenden Beispiele beschreiben
die Verwendung von Candida shehatae der ATCC-Zugangsnummer 34887,
Candida blankii der ATCC-Zugangsnummer 18735, Cryptococcus dimennae
ATCC-Zugangsnummer 22024 und Cryptococcus luteolus ATCC- Zugangsnummer 32044.
Die vorliegende Erfindung umfasst Mutanten, Derivate und Nachfahren
von bekannten Spezies von Hefe, und insbesondere Mutanten und Derivate
von bekannten Spezies, die zu den Gattungen Cryptococcaceae gehören, zum
Beispiel jene, die zu Candida und Cryptococcus gehören, solange
die Mutante, das Derivat oder der Nachkomme in der Lage ist, KLG
als eine alleinige Kohlenstoffquelle zur Herstellung von ASA zu
nutzen.
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Die
vorliegende Erfindung umfasst Verfahren zur Herstellung von ASA
oder ASA-Stereoisomeren
in Hefe, wobei die Hefe natürlich
auftretend ist, das heißt
nicht gentechnologisch verändert
ist, sowie jene, bei der die Hefe rekombinant ist und heterologe
Nukleinsäure
umfasst, welche oxidative und/oder reduzierende Enzyme kodiert,
welche mit der Umwandlung einer Kohlenstoffquelle zu KLG in der
Hefe assoziiert sind. In der vorliegenden Erfindung kann die Kohlenstoffquelle,
wie eine Zuckersäure
mit 6 Kohlenstoffen, ein Produkt eines separaten fermentativen Prozesses
sein, welches in eine Hefekultur eingeführt wird, wie KLG, welches durch
das von Lazarus et al. beschriebene Verfahren (J. Bact. 1991, 173,
6651–61)
oder durch das in Saito et al. beschriebene Verfahren (1997, Applied
and Environmental Microbiology, 63: 454–460) hergestellt wurde. Die
Kohlenstoffquelle, welche aus einem separaten fermentativen Prozess
stammt, kann vor der Verwendung bei einem Verfahren zur Herstellung
von ASA oder ASA-Stereoisomeren gereinigt werden oder direkt aus
dem Fermentationsprozess verwendet werden. Die Kohlenstoffquelle
kann ebenfalls von chemischen Mitteln abgeleitet sein.
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In
einer anderen Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung ist die Hefe gentechnologisch so geändert, dass
sie entweder ein heterologes oxidatives Enzym oder ein heterologes
reduzierendes Enzym, oder beide, umfasst, dass/die mit der Umwandlung
einer Kohlenstoffquelle zu KLG in der Hefe assoziiert ist/sind, wodurch
ein einzelner Organismus bereitgestellt wird, welcher in der Lage
ist, eine Kohlenstoffquelle, wie Glukose oder einen anderen Zucker
mit 6 Kohlenstoffen zu Ascorbinsäure über KLG
als ein Intermediat umzuwandeln. Der rekombinante Hefewirt kann
mehrere heterologe oxidative Enzyme und/oder mehrere heterologe
reduzierende Enzyme umfassen, um Ascorbinsäure aus einem Zucker mit 6
Kohlenstoffen oder einer Zuckersäure
mit 6 Kohlenstoffen herzustellen.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
ist die Kohlenstoffquelle Glukose, und die rekombinante Hefe umfasst
heterologe Nukleinsäure,
welche mindestens eine aus (a) einer Glukosedehydrogenase (GDH);
(b) einer Gluconsäuredehydrogenase
(GADH); (c) einer 2-Keto-D-gluconsäuredehydrogenase
(2-KDGDH); und (d) einer 2,5-Diketo-D-gluconsäurereduktase (2,5-DKGR) kodiert,
mit der Maßgabe,
dass, wenn die Hefe heterologe Nukleinsäure für weniger als alle von (a)
bis (d) umfasst, dann die Hefe endogene Nukleinsäure umfasst, und zwar dergestalt,
dass die Hefe Nukleinsäure
für jedes
von (a) bis (d) umfasst und in der Lage ist, Glukose zu ASA über das
Intermediat KLG umzuwandeln. Wie es leicht durch den erfahrenen
Fachmann verstanden wird, können
Oxidations- und Reduktionsreaktionen, welche in der Umwandlung eines
Kohlenstoffsubstrats zu ASA involviert sind, Cofaktoren erfordern,
welche den Hefekulturen hinzuzusetzen sind. Zum Beispiel besitzt
2,5-DKGR, welche in dem US-Patent Nr. 5 032 514, erteilt am 16.
Juli 1991, beschrieben ist, ein Anfordernis nach NADPH. Andere Beispiele
für Cofaktoren,
welche in enzymatischen Reaktionen notwendig sind, schließen ATP,
NAD+, NADP+, NADH,
NADPH und Coenzym A ein, sind jedoch nicht darauf beschränkt. Die
Hefe kann ebenfalls Deletionen oder Mutationen von endogenen oxidativen
und/oder reduzierenden Enzymen aufweisen, welche den gewünschten
Weg des Kohlenstoffflusses stören.
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In
einer anderen Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung ist die Kohlenstoffquelle Sorbitol, und die
rekombinante Hefe umfasst heterologe Nukleinsäure, die mindestens eine von
(a) D-Sorbitoldehydrogenase (SLDH); (b) L-Sorbosedehydrogenase;
und (c) L-Sorbosondehydrogenase kodiert, mit der Maßgabe, dass, wenn
die Hefe heterologe Nukleinsäure
für weniger
als alle von (a) bis (c) umfasst, dann die Hefe endogene Nukleinsäure von
solcher Art umfasst, dass die Hefe Nukleinsäure für jedes von (a) bis (c) umfasst
und in der Lage ist, Sorbitol zu ASA über das Intermediat 2 KLG umzuwandeln.
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Quellen
für Nukleinsäure, die
oxidative oder reduzierende Enzyme kodiert, schließen die
folgenden ein:
ENZYM | REFERENZ |
Glukosedehydrogenase | Smith
et al. 1989, Biochem. J. 261: 973; Neijssel et al. 1989, Antonie
Van Leauvenhoek 56 (1): 51–61 |
Gluconsäuredehydrogenase | Matsushita
et al. 1979, J. Biochem. 85: 1173; Kulbe et al. 1987, Ann. N. Y.
Acad Sci 506: 552 |
2-Keto-D-gluconsäuredehydrogenase | Stroshane
1977 Biotechnol. BioEng 19 (4) 459 |
2-Ketogluconatreduktase | J.
Gen. Microbiol. 1991, 137: 1479 |
2,5-Diketo-D-gluconsäurereduktase | US-Patent
Nrn. 5 795 761; 5 376 544; 5 583 025; 4 757 012; 4 758 514; 5 008
193; 5 004 690; 5 032 514 |
L-Sorbosedehydrogenase;
L-Sorbosondehydrogenase
und L-Sorbitoldehydrogenase | Saito
et al. Applied and Environmental Microbiology, 1997, 63: 454 |
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Konstruktion
rekombinanter Hefe
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Rekombinante
Hefe, welche die Nukleinsäure(n)
enthält,
welche notwendig ist (sind), um ASA aus einer Kohlenstoffquelle
herzustellen, kann unter Verwendung von Techniken, die im Fachbereich
allgemein bekannt sind, konstruiert werden. Molekularbiologische
Techniken sind in Sambrook et al., Molecular Biology Cloning: A
Laboratory Manual, Zweite Ausgabe (1989) Cold Spring Harbor Laboratory
Press, Cold Spring Harbor, NY (1989) beschrieben. Gene, welche oxidative
Enzyme und reduzierende Enzyme kodieren, die mit der ASA-Produktion assoziiert
sind, können
aus nativen Wirten, wie unten beschrieben, isoliert werden, oder
durch chemische Mittel hergestellt werden. Wenn zum Beispiel die
Sequenz des Gens bekannt ist, können
geeignete genomische Bibliotheken durch Restriktionsendonukleaseverdau
kreiert werden und mittels Sonden, welche zu der gewünschten
Gensequenz komplementär
sind, gescreent werden. Sobald die Sequenz isoliert ist, kann die
DNA unter Verwendung von standardmäßigen primer-gerichteten Amplifikationsverfahren,
wie der Polymerasekettenreaktion (PCR) (
US 4 683 202 ) amplifiziert werden,
um Mengen an Nukleinsäure
zu erhalten, welche für
die Transformation unter Verwendung von geeigneten Vektoren geeignet
sind. Eine Bandbreite von Vektoren und Transformations- und Expressionskassetten,
welche für
das Klonieren, Transformieren und Exprimieren in Hefe von Nukleinsäure, die
oxidative und reduzierende Enzyme kodiert, welche mit der ASA-Produktion assoziiert
sind, geeignet sind, sind den im Fachbereich Erfahrenen bekannt.
Protokolle zum Erhalt und zur Verwendung von solchen Vektoren sind
jenen im Fachbereich bekannt (Sambrook et al., Molecular Cloning:
A Laboratory Manual – Bände 1, 2,
3 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, (1989)).
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Typischerweise
enthält
der Vektor oder die Kassette Sequenzen, welche die Transkription
und Translation der Nukleinsäure
steuern, einen selektierbaren Marker und Sequenzen, welche die autonome
Replikation oder chromosomale Integration erlauben. Geeignete Vektoren
umfassen eine Region 5' des
Gens, welche Transkriptionsinitiations-Steuerelemente aufnimmt,
und eine Region 3' des
DNA-Fragments, welches die transkriptionale Termination reguliert.
Diese Regulationsregionen können
von Genen abgeleitet sein, die zu der Hefe homolog oder heterolog
sind, solange die gewählte
Regulationsregion in der Lage ist, in der Hefe ihre Funktion zu
erfüllen.
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Initiations-Steuerungsregionen
oder Promotoren, welche brauchbar sind, um die Expression der oxidativen
oder reduktiven Enzyme in Hefe zu steuern, sind jenen im Fachbereich
Erfahrenen bekannt. Im Grunde ist jeder Promotor, der in der Lage
ist, diese Gene zu steuern, für
die vorliegende Erfindung geeignet, einschließlich CYC1, HIS3, GAL1, GAL10,
ADH1, PGK, PHO5, GADPH, ADC1, TRP1, URA3, LEU2, ENO, TPI, jedoch
nicht darauf beschränkt.
Nukleinsäure,
welche die oxidativen oder reduzierenden Enzyme kodiert, ist operabel
durch Initiationscodone an ausgewählten Expressions-Regulationsregionen
für eine
wirksame Expression der oxidativen oder reduzierenden Enzyme gekoppelt.
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Sobald
geeignete Kassetten konstruiert sind, werden sie verwendet, um Hefe
zu transformieren, und die Hefe wird bezüglich der Fähigkeit gescreent, ASA aus
einer geeigneten Kohlenstoffquelle herzustellen. In einer Ausführungsform
zum Beispiel wird die Hefe mit Nukleinsäure, die entweder eine oder
beide aus einer Dehydrogenaseaktivität und einer Reduktaseaktivität kodiert,
transformiert, und die transformierte Hefe wird bezüglich ihrer
Fähigkeit
gescreent, ASA aus einem Zucker mit 6 Kohlenstoffen, wie Glukose,
oder einer Zuckersäure
mit 6 Kohlenstoffen, wie KLG, herzustellen.
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Nachweis von ASA
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Verfahren
zum Nachweis von ASA und ASA-Stereoisomeren schließen die
Anwendung der Redoxtitration mit 2,6-Dichlorindophenol (Burton et
al. 1979, J. Assoc. Pub. Analysts 17: 105); die Hochleistungs-Flüssigchromatographie
(HPLC) unter Verwendung des Anionenaustausches (J. Chrom. 1980,
196: 163); und Elektro-Redox-Vorgehensweisen (Pachia, 1976, Anal.
Chem. 48: 364) ein. Enzymatische Vorgehensweisen, welche die Verwendung
von Ascorbinsäureoxidase
involvieren, können
ebenfalls zur Anwendung kommen.
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In
der vorliegenden Erfindung wurde der Nachweis von ASA mittels HPLC,
colorimetrischem Ascorbatoxidaseassay, wie hierin verwendet, und
der GC-Massen-Spektrometrie bewerkstelligt. Dem Fachmann sind Kontrollen
bewusst, die bei der Nutzung dieser Nachweismethoden zur Anwendung
zu kommen haben. Da ein chemisches Gleichgewicht zwischen KLG und
ASA vorliegt (d. h., KLG enthält
Hintergrundanteile an ASA), wurde für die Anwendung der HPLC-UV-Detektion
von Ascorbinsäure
das Elutionsprofil des Substrates KLG aufgezeichnet und als eine
Kontrolle verwendet. Für
den Ascorbatoxidaseassay wurde eine Kontrolle von Leerläufen ohne
Probe und Enzym laufen gelassen. Zur GCMS-Analyse wurden derivatisierendes
Mittel und das Substrat KLG als eine Kontrolle analysiert.
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Es
ist ebenfalls wünschenswert,
ein Screeningverfahren zum Nachweis von Hefe zu besitzen, welche in
der Lage ist, ASA aus einer Kohlenstoffquelle herzustellen. Ein
Verfahren zum Screenen nach Hefe, die in der Lage ist, ASA herzustellen,
umfasst die Schritte des Erhaltens von Hefe, die in der Lage ist,
auf Ascorbinsäure
oder Ascorbinsäure-Stereoisomer
zu wachsen, des Kultivierens der Hefe in Gegenwart von KLG unter Bedingungen,
die zur Herstellung von Ascorbinsäure oder einem Ascorbinsäure-Stereoisomer
geeignet sind; und des Testens der Hefekultur bezüglich der
Produktion von Ascorbinsäure
oder einem Ascorbinsäure-Stereoisomer.
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Fermentation und Reinigung
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Medien und Kohlenstoffsubstrate:
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Natürlich vorkommende
Hefe und rekombinante Hefe, die zur Nutzung von KLG zur Herstellung
von ASA in der Lage sind, werden einer Fermentation im großen Maßstab in
der Gegenwart einer geeigneten Kohlenstoffquelle unterzogen, die
ASA wird rückgewonnen.
Geeignete Kohlenstoffquellen umfassen Zucker mit sechs Kohlenstoffen
oder Zuckersäuren
mit sechs Kohlenstoffen. Die Kohlenstoffquelle, die beim Züchten der hierin
beschriebenen Hefe genutzt wird, wird nur durch die Anfordernisse
des Wirtsorganismus beschränkt. Zum
Beispiel kann natürlich
vorkommende Hefe in Gegenwart einer Zuckersäure mit sechs Kohlenstoffen, zum
Beispiel KLG, wachsen gelassen werden, wohingegen rekombinante Hefe,
welche gentechnologisch verändert
wurde, damit sie Nukleinsäure,
die entweder eines oder beides aus Dehydrogenase und Reduktase kodiert,
enthält,
in Gegenwart eines Zuckers mit sechs Kohlenstoffen, wie zum Beispiel
Glukose, wachsen gelassen werden kann. Zusätzlich zu einer geeigneten
Kohlenstoffquelle, müssen
Fermentationsmedien geeignete Minerale, Salze, Cofaktoren, Puffer
und andere Komponenten enthalten, die jenen im Fachbereich Erfahrenen bekannt
sind, die geeignet für
das Wachstum der Kulturen und die Herstellung von ASA geeignet sind.
Verfahren bezüglich
Medien und Kulturbedingungen, die für das Wachsenlassen von Hefe
geeignet sind, sind in Costamagna et al., 1986, Can. J. Microbiology,
32: 756–758
beschrieben.
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Die
Hefe kann unter aeroben oder anaeroben Bedingungen wachsen gelassen
werden. ASA ist sauerstoffempfindlich, deshalb wird das anaerobe
Wachsenlassen der ASA herstellenden Hefe die Oxidation der produzierten
ASA verringern. Wenn die Hefe unter aeroben Bedingungen wachsen
gelassen wird, ist es in alternativer Weise bevorzugt, das reduzierende
Mittel, zum Beispiel Dithiothreitol, Glutathion, Metallchelatoren, wie
EDTA, Stabilisatoren wie Metaphosphorsäure, Aminosäuren, Glykole, Zucker, Oxalsäure, Trichloressigsäure, 8-Hydroxychinolin,
in der ASA-Umgebung vorliegen. Die vorliegende Erfindung umfasst
die satzweise oder kontinuierliche Fermentation, und das Verfahren
der Herstellung von ASA kann in einem oder zwei Fermentatoren ablaufen.
Wenn zum Beispiel die Hefe gentechnologisch verändert ist, um einen Stoffwechselweg von
einem Zucker mit sechs Kohlenstoffen, wie zum Beispiel Glukose,
zu einer Zuckersäure
mit sechs Kohlenstoffen, wie KLG, zu umfassen, könnte die ASA-Herstellung in
einem Fermentor unter Verwendung der rekombinanten Hefe als ein
Wirt ablaufen. Wenn die Hefe natürlich
auftretend ist, und ASA in der Hefe aus einer Zuckersäure mit
sechs Kohlenstoffen, zum Beispiel KLG, hergestellt wird, kann die
Produktion in zwei Fermentatoren ablaufen, einem zur Herstellung
von KLG, wie in dem US-Patent 5 032 514 oder von Saito et al. oben beschrieben,
und einem zur Herstellung von ASA aus KLG in Hefe.
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Eine
klassische Satzfermentation ist ein geschlossenes System, wobei
die Zusammensetzung der Medien am Beginn der Fermentation eingestellt
wird, und keinen künstlichen
Veränderungen
während
der Fermentation unterworfen wird. Somit wird zu Beginn der Fermentation
das Medium mit dem gewünschten
Organismus oder den Organismen inokuliert, und die Fermentation
wird laufen gelassen, wobei dem System nichts hinzugefügt wird.
Typischerweise ist jedoch eine Satzfermentation ein "Ansatz" in Bezug auf die
Zugabe der Kohlenstoffquelle, und es werden häufig Versuche unternommen,
Faktoren wie den pH-Wert und der Sauerstoffkonzentration, zu regulieren.
Die Metabolit- und Biomassenzusammensetzungen des Satzsystems verändern sich
konstant bis zu dem Zeitpunkt, bei dem die Fermentation gestoppt
wird. Innerhalb Satzkulturen verändern
sich Zellen über
eine statische Lag-Phase zu einer log-Phase mit hohem Wachstum und
schließlich
zu einer stationären
Phase, bei der die Wachstumsrate verringert oder gestoppt ist. Ohne
Behandlung werden Zellen in der stationären Phase schließlich sterben.
Zellen in der log-Phase sind im Allgemeinen für die Hauptproduktion von Endprodukt
oder Zwischenprodukt verantwortlich.
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Eine
Variation bezüglich
des Standardsatzsystems ist das Einspeise-Satz-Fermentationssystem,
welches in der vorliegenden Erfindung ebenfalls geeignet ist. Bei
dieser Variation eines typischen Satzsystems wird das Substrat in
Inkrementen entsprechend dem Voranschreiten der Fermentation hinzugesetzt.
Einspeise-Batch-Systeme sind brauchbar, wenn die Katabolitrepression
gewählt
wird, um den Metabolismus der Zellen zu inhibieren, und wenn es
erwünscht
ist, limitierte Mengen an Substrat in den Medien vorliegen zu haben. Messungen
der aktuellen Substratkonzentration in Einspeise-Satz-Systemen ist
schwierig, und sie wird deshalb auf der Basis der Änderungen
von messbaren Faktoren wie dem pH, gelöstem Sauerstoff und dem Partialdruck
von Abfallgasen wie CO2 abgeschätzt. Satz-
und Einspeise-Satz-Fermentationen
sind im Fachbereich gängig
und allgemein bekannt und Beispiele können in Brock, oben, gefunden
werden.
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Es
wird ebenfalls in Betracht gezogen, dass das Verfahren für kontinuierliche
Fermentationsverfahren anpassbar wäre. Die kontinuierliche Fermentation
ist ein offenes System, bei welchem ein definiertes Fermentationsmedium
kontinuierlich einem Bioreaktor hinzugesetzt wird, und eine gleiche
Menge konditioniertes Medium gleichzeitig zur Prozessierung entfernt
wird. Die kontinuierliche Fermentation hält im Allgemeinen die Kulturen
bei einer konstant hohen Dichte, wobei Zellen vornehmlich in der
log-Wachstumsphase sind.
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Die
kontinuierliche Fermentation ermöglicht
die Modulation eines Faktors oder einer beliebigen Anzahl von Faktoren,
welche das Wachstum oder die Endproduktkonzentration beeinflussen.
Zum Beispiel wird eine Methode einen beschränkenden Nährstoff, wie die Kohlenstoffquelle
oder den Stickstoffanteil, auf einer festgelegten Rate halten und
bei allen anderen Parametern eine Abänderung ermöglichen. In anderen Systemen kann
eine Vielzahl von Faktoren, welche das Wachstum beeinflussen, kontinuierlich
abgeändert
werden, während
die Zellkonzentration, gemessen durch die Trübheit des Mediums, konstant
gehalten wird. Kontinuierliche Systeme versuchen, Steady-State-Wachstumsbedingungen
aufrecht zu erhalten, und somit muss der Zellverlust, welcher darauf
zurückzuführen ist,
dass Medium abgezogen wird, gegen die Zellwachstumsrate in der Fermentation
ausgeglichen werden. Verfahren des Modulierens von Nährstoffen
und Wachstumsfaktoren für kontinuierliche
Fermentationsprozesse sowie Techniken zur Maximierung der Rate der
Produktbildung sind im Fachbereich der industriellen Mikrobiologie
allgemein bekannt und eine Vielzahl von Verfahren wurde von Brock,
oben, im Detail beschrieben.
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Die
Verfahren der vorliegenden Erfindung können entweder unter Anwendung
von Satz-, Einspeise-Satz- oder kontinuierlichen Verfahren ausgeführt werden.
Nach der Fermentation kann die hergestellte ASA aus der Fermentationsbrühe mit einer
Vielzahl von Verfahren rückgewonnen
werden, einschließlich
Ionenaustauschharzen Absorptions- oder Ionenverzögerungsharzen, Aktivkohle,
Konzentrationskristallisation etc.
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Verschiedene
Aspekte der vorliegenden Erfindung werden weiter in Bezug auf die
folgenden spezifischen Beispiele beschrieben, welche den Umfang
der vorliegenden Erfindung nicht beschränken sollen.
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Beispiele
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Die
folgende Beschreibung von Materialien und Methoden betrifft die
Beispiele I–III.
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Materialien und Methoden
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Kulturbedingungen:
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Hefe
wurde wachsen gelassen und kultiviert auf Difco-Hefe-Stickstoff-Basis
(YNB), 6,7 g/l, mit einem anfänglichen
Wachstum auf 2% Glukose, gefolgt von einem Transfer zu 0,5% (w/v)
alleiniger Kohlenstoffquelle von L-ASA und dann 2-KLG oder L-Idonat
20,8 mM. Die Hefe wurde in 50 ml YNB-Medium bei 22°C, pH 5,5 während eines
48-Stunden-Zyklus mit einer Rührgeschwindigkeit
von 250 U/min. in einem Schüttelkolben
kultiviert.
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HPLC:
Die HPLC-Elution von Ascorbat und anderen Ketozuckersäuren wurde
unter Verwendung einer analytischen Dionex IonPac AS10-Säule mit
einer Guard-Säule
durchgeführt.
Es wurde eine isokratische Elution unter Verwendung eines 40 mM
Acetat pH 4,86-Eluenten durchgeführt,
um eine gute Retentionszeitenseparation zwischen dem Substrat KLG
und dem Produkt Ascorbat (> 5
min.) zu erhalten. Ascorbat wurde unter Verwendung eines UV-Detektors zwischen
einer Wellenlänge
von 245 bis 270 nm nachgewiesen (> 100
ppb), wohingegen KLG unter Verwendung eines Brechungsindexdetektors
nachgewiesen wurde. Das HPLC-System, welches für die Untersuchung verwendet
wurde, ist ein HP-Alliance-Gerät,
die mit dem Millenium-Softwarepack, welches für die Peak-Flächen-Integrations-Berechnung
verwendet wurde, ausgestattet war. Eine Eichkurve zur Ascorbatquantifizierung
wurde zwischen (100 ppb–100
ppm) erzeugt.
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GC-MS:
Die Ascorbatidentifizierung unter Verwendung von GC-MS wurde unter
Verwendung einer veröffentlichten
Prozedur durchgeführt
(J. C. Deutsch und J. Fred Kolhouse, Anal. Chem. 1993, 65, 321–326). Die
GC-Arbeiten wurden auf einer HP-Gerätschaft 5890 unter Verwendung
einer 15 Meter mal 0,25 mm großen
Supelco SPB-1-Quarzglas-Kapillarsäule durchgeführt. Die
Ascorbatderivatisierung wurde unter Verwendung von N-Methyl-N-(tert-butyldimethylsilyl)trifluoracetamid
und Acetonitril entsprechend dem Verfahren, welches in der oben
stehenden Referenz angegeben ist, durchgeführt. Eine Standard-Ascorbat-Retentionszeit, die
unter unsere experimentellen Bedingungen erhalten wurde, lag bei
8,75 Minuten. Charakteristische Massenfragmentierungsmuster von
m/z von 575, 531, 443, 343, wurden in den Spektren nachgewiesen,
die sowohl für
Standardproben als auch für
unbekannte Proben erhalten wurden.
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Ascorbatoxidaseassay:
Der Ascorbatoxidaseassay wurde unter Verwendung des L-Ascorbinsäure-Bestimmungskits
(Kat. Nr. 408677), beschafft von Boehringer Mannheim, und dem mit
dem Kit bereitgestellten Protokoll nachfolgend durchgeführt. Der
Kit enthielt Ascorbatoxidaseenzym und eine Detektion/Quantifizierung
(578 nm) unter Verwendung eines gekoppelten Farbstoffsystems aus
MTT und PMS (Beutler, H.-O. und Beinstingl, G., 1984 in methods
of enzymatic analysis (Bergmeyer, H. U. Ed.) 3. Ausgabe, Band 7.,
S. 376–385,
Verlag Chemie, Weinheim, Deerfield, Beach/Florida, Basel.
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Kontrollen
und Leerwerte: Eine 0,5%-ige 2-KLG-Lösung enthält ~2 ppm Ascorbat bei einem
pH von 6,1. Es wurde eine Kontrollreaktion nur mit Puffer, enthaltend
KLG, neben jedem Experiment als eine Kontrollreaktion zusammen mit
einer Hefe enthaltenden Reaktionsmischung während des Zeitverlaufs des
Umwandlungsexperimentes in ganzen Zellen von KLG zu ASA laufen gelassen.
In einer anderen Kontrolle wurden Hefezellen durch Wärme getötet und
dann mit KLG inkubiert, um sicherzustellen, dass keine KLG-zu-ASA-Transformation unter
diesen Bedingungen nachgewiesen wird. Bei einem mittels HPLC-Analyse nachgewiesenen Ascorbatpeak
erfolgte eine weitere Bestätigung
durch die Reaktion der Probe mit Ascorbatoxidase, und somit trat
ein Verschwinden des Peaks in dem Chromatogramm aufgrund des Ascorbatabbaus
durch die Ascorbatoxidase auf.
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Beispiel I
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Dieses
Beispiel veranschaulicht, dass die Hefe Candida blankii in der Lage
ist, KLG oder Idonat als eine alleinige Kohlenstoffquelle zum Wachstum
zu nutzen. Dieses Beispiel zeigt ebenfalls die Herstellung von Ascorbinsäure durch
Candida blankii, wenn sie in Gegenwart von KLG als alleinige Kohlenstoffquelle
wachsen gelassen wird.
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Candida
blankii mit der ATCC-Zugangsnummer 18735 wurde wie in den Material-
und Methoden-Abschnitten beschrieben, kultiviert. Die KLG-zu-ASA-Reaktion
in ganzen Zellen wurde durchgeführt,
wie es unten beschrieben ist. Etwa 3 Gramm nasse Zellen wurden aus
einer 500 ml großen
48-stündigen
Wachstumskultur mittels Zentrifugation bei 4°C und 9000 U/min. gesammelt.
Zellen wurden mit kaltem 200 mM Phosphatpuffer bei einem pH von
6,1, enthaltend 0,5 mM EDTA, gewaschen. Zellen wurden dann in dem
gleichen Puffer, enthaltend 0,5% KLG (10 ml), erneut suspendiert.
Drei ml dieser Reaktionsmischung wurden abgezogen und in einem Mikrowellenofen
zwei Minuten lang gekocht. Beide Reaktionsmischungen wurden dann
auf 30°C
in einen Rotationsinkubator zur Ganzzell-ASA-Produktion gestellt.
1,5 ml der Probe zum Zeitpunkt Null wurden abgezogen, zur Entfernung
des Zellpellets zentrifugiert und bei –20°C gelagert. Der Überstand
wurde durch einen 0,2 μm-Filter
filtriert und einer HPLC-Analyse, gefolgt von Ascorbatoxidase- und
GCMS-Analyse, wie oben beschrieben, unterzogen. Das gleiche Probenabzieh-
und Aufarbeitungsverfahren wurde für die Zeitpunkte 2, 4 und 20
Stunden für
die Lebendzellreaktion und für
die 20 Stunden-Probe
für die
durch Wärme
getötete
Reaktionsmischung (Tabelle 1) verwendet. Durch Wärme getötete Proben besaßen keine
Hintergrundspiegel an ASA und erzeugten keine ASA.
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Nach
der 20 Stunden-Probenabnahme wurde der pH-Wert der Reaktionsmischung
um 3 pH-Einheiten auf
einen pH-Wert von 3,15 unter Verwendung eines Citrat-Phosphat-Puffers
gesenkt. Eine Probe wurde abgenommen und bei 21 Stunden zur Markierung
der Null-Zeit für
diese Zustandsänderung
analysiert. Die Reaktion wurde über
Nacht laufen gelassen. Nach weiteren 24 Stunden wurde die Endprobe
abgenommen. Eine parallele KLG-Leerkontroll-Reaktion ohne Zellen wurde bei beiden
pH-Werten laufen gelassen, um die Hintergrundproduktion von ASA
aus KLG festzustellen (siehe Tabelle 1, 3).
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Wie
aus der Tabelle 1 und 3 ersichtlich ist, wurde, wenn
C. blankii in der Ganzzellkultur unter Verwendung von KLG als einem
alleinigen Substrat wachsen gelassen wurde, die Anwesenheit von
ASA in dem Reaktionsmedium bestätigt.
Die Konzentration der ASA, welche in der Reaktionsmischung vorlag, übertraf
um das Dreifache die Hintergrundspiegel. Durch Senkung des pH-Wertes
der Reaktionsmischung auf einen pH-Wert von 3 wurde eine weitere
dreifache Zunahme in den ASA-Spiegeln festgestellt. Das Senken des pH-Wertes besaß den Effekt
der Stabilisierung der ASA, sowie der Begünstigung der chemischen Thermodynamik
in Richtung auf die ASA-Herstellung.
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Beispiel II
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Dieses
Beispiel veranschaulicht, dass Cryptococcus dimennae in der Lage
ist, KLG oder Idonat als eine alleinige Kohlenstoffquelle zum Wachstum
zu nutzen. Dieses Beispiel zeigt ebenfalls die Herstellung von Ascorbinsäure durch
Cryptococcus dimennae, wenn er in Gegenwart von KLG als einer alleinigen
Kohlenstoffquelle wachsen gelassen wird.
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Cryptococcus
dimennae mit der ATCC-Zugangsnummer 22024 wurde kultiviert, wie
es in den Material- und Methoden-Abschnitten beschrieben ist. Die
KLG-zu-ASA-Reaktion in ganzen Zellen wurde durchgeführt, wie
es im Beispiel I beschrieben ist.
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Wie
aus der Tabelle 1 und der 3 ersichtlich
ist, wurde, wenn die Cryptococcus dimennae-Ganzzellkultur unter
Verwendung von KLG als einem alleinigen Substrat wachsen gelassen
wurde, die Anwesenheit von ASA im Reaktionsmedium bestätigt. Die
Konzentration der in der Reaktionsmischung vorliegenden ASA überschritt
um das Zweifache die Hintergrundspiegel.
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Beispiel III
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Dieses
Beispiel veranschaulicht, dass Candida shehatae in der Lage ist,
KLG als eine alleinige Kohlenstoffquelle zu nutzen, jedoch nicht
in der Lage ist, ASA herzustellen. Die KLG-zu-ASA-Reaktion in ganzen Zellen wurde
durchgeführt,
wie es in Beispiel 1 beschrieben ist. Wie aus der 1 ersichtlich
ist, ist Candida shehatae nicht in der Lage, ASA aus KLG unter diesen
Bedingungen herzustellen.
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Tabelle
1 HPLC-Ergebnisse,
AU/Fläche
und mg/l ASA-Konzentration in den Proben