DE69931807T2

DE69931807T2 - Herstellung von ascorbinsäure unter verwendung von hefe

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Publication number: DE69931807T2
Application number: DE69931807T
Authority: DE
Inventors: Manoj Fremont KUMAR
Original assignee: Genencor International Inc
Current assignee: Danisco US Inc
Priority date: 1998-12-04
Filing date: 1999-12-03
Publication date: 2007-01-04
Anticipated expiration: 2019-12-04
Also published as: CA2353558A1; CZ20011944A3; PL348509A1; US20020090689A1; US6824996B2; AU3109300A; EP1135517B1; KR20010093113A; PT1135517E; JP2002531136A; CN1331750A; CN1249220C; ES2267308T3; DE69931807D1; US20020090688A1; US20020076771A1; CA2353558C; WO2000034502A1; ATE329050T1; BR9916460A

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Molekularbiologie und die Verwendung von Hefe zur Herstellung von Ascorbinsäure und Ascorbinsäure-Stereoisomeren.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
L-Ascorbinsäure (Vitamin C, ASA) findet in der pharmazeutischen und Nahrungsmittelindustrie als ein Vitamin und Antioxidationsmittel Verwendung. Die Synthese von ASA hat über viele Jahre hinweg eine beträchtliche Beachtung gefunden, und zwar aufgrund ihres relativ großen Marktvolumens und hohen Wertes als eine Spezialchemikalie. Das Reichstein-Grussner-Verfahren, ein chemischer Weg aus Glukose zu ASA, wurde erstmals 1934 beschrieben (Helv. Chim. Acta 17: 311–328). Lazarus et al. (1989, "Vitamin C: Bioconversion via a Recombinant DNA Approach", Genetics and Molecular Biology of Industrial Microoranisms, American Society for Microbiology, Washington D. C. Herausgegeben von C. L. Hershberger) beschrieben ein Bioumwandlungsverfahren zur Herstellung eines Intermediats von ASA, 2-Keto-L-gulonsäure (2-KLG, KLG), welches chemisch zu ASA umgewandelt werden kann. Saito et al. (1997, Applied and Environmental Microbiology, 63: 454–460) berichteten bezüglich der Konstruktion eines Expressionssystems zur Herstellung von 2-KLG aus D-Sorbitol. Chemical Abstracts, Band 84, Nr. 5, 2. Februar 1976, Abstract Nr.: 29189, WO 87100863 und US 5 032 514 diskutieren die Herstellung von ASA in Bakterien.
Über die Anwesenheit von ASA in Hefen wurde berichtet (Heick et al. Can. J. Microbiol., 1972, 18, 597–600), und die Umwandlung von L-Galactonsubstraten zu ASA in Candida-Hefe wurde beschrieben (US-Patente 4 595 659, erteilt am 17.06.86, und 4 916 068, erteilt am 10.04.90). Haller et al. (1990) Dechema Biotechnology Congresses, DE, Weinheim, Band 4, 1. Januar 1990, Seiten 233–236 und Morimitsu et al. (1978) Archives of Biochemistry and Biophysics, Band 191, Nr. 2, Seiten 479–489, diskutieren ebenfalls die Herstellung von ASA in Hefe. Costamagna et al. (Can. J. Microbiol., 1986, 32, 756–758) beschreiben die Ergebnisse einer Untersuchung bezüglich der ASA-Nutzung von einigen Hefen. Dieser Bericht beschreibt, dass Spezies von Cryptococcus und Candida in der Lage waren, auf ASA sowie auf Iso-Ascorbinsäure zu wachsen.
Trotz der wissenschaftlichen Fortschritte, die bezüglich der Herstellung von ASA und seinen biokatalytischen Intermediaten gemacht worden sind, besteht der Bedarf nach Verfahren zur Herstellung von Ascorbinsäure, um die Weltnachfrage zu befriedigen. Das Auffinden eines Verfahrens, welches eine erneuerbare Kohlenstoffquelle zur Herstellung von Ascorbinsäure nutzt, wäre besonders vorteilhaft.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft die Herstellung von Ascorbinsäure oder Ascorbinsäure-Stereoisomeren in Hefe. Die vorliegende Erfindung basiert teilweise auf der unerwarteten Erkenntnis, dass mehrere Vertreter von Hefe, welche in der Lage sind auf Ascorbinsäure oder Iso-Ascorbinsäure als einer alleinigen Kohlenstoffquelle zu wachsen, fähig sind, KLG als eine alleinige Kohlenstoffquelle zur Erzeugung von Ascorbinsäure zu nutzen. Demzufolge liefert die vorliegende Erfindung Verfahren zur Herstellung von Ascorbinsäure oder einem Ascorbinsäure-Stereoisomer aus Hefe.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Die 1 veranschaulicht das Wachstum von Candida blankii, Candida shahatae und Cryptococcus dimmnae auf 2 KLG als einer alleinigen Kohlenstoffquelle in einer Hefe-Stickstoff-Basis.
Die 2 veranschaulicht das Wachstum von Candida blankii, Candida shahatae, Cryptococcus dimmnae und Cryptococcus luteolus auf Idonatnatriumsalz in einer Hefe-Stickstoff-Basis.
Die 3 veranschaulicht die Bestimmung des ASA-Gehalts im Überstand von Candida blankii und Cryptococcus dimmnae aus einer Ganzzell-Reaktionsmischung unter Anwendung des Ascorbatoxidaseassays.
Genaue Beschreibung
Definitionen:
Wie hierin verwendet, ist der Ausdruck "Ascorbinsäure" der Name, welcher von der IUPAC-IUB-Kommission zur biochemischen Nomenklatur für Vitamin C anerkannt wurde. Andere Namen sind L-Ascorbinsäure, L-Xyloascorbinsäure und L-Threo-hex-2-en-säure-γ-lacton. Das reine Vitamin ist C₆H₈O₆ und besitzt ein Molekulargewicht von 176,13. Vier Stereoisomere von Ascorbinsäure sind möglich: L-Ascorbinsäure, D-Araboascorbinsäure (Erythorbinsäure), welche Vitamin-C-Aktivität zeigt, L-Araboascorbinsäure und D-Xyloascorbinsäure. Ascorbinsäureintermediate oder "Stoffwechselintermediate" sind jene Biochemikalien, die in der Lage sind, zu ASA mittels enzymatischer oder chemischer Mittel umgewandelt zu werden und schließen Gluconsäure, 2-Keto-D-gluconsäure, 2,5-Diketo-D-gluconsäure, 2-Keto-L- gulonsäure, Idonsäure, Gluconsäure, Sorbitol, Sorbose, Sorboson und Sorbosediaceton ein, sind jedoch nicht darauf beschränkt.
Die Phrase "fähig zur Nutzung von KLG, um Ascorbinsäure oder ein Ascorbinsäure-Stereoisomer herstellen", wenn auf eine Hefe Bezug genommen wird, bedeutet eine Hefe, welche in der Lage ist, Ascorbinsäure aus KLG durch ein beliebiges Mittel, einschließlich der biokatalytischen Umwandlung, herzustellen.
Es ist im Fachbereich allgemein anerkannt, dass die sauren Derivate von Sacchariden in einer Vielzahl von Ionisationszuständen existieren können, und zwar in Abhängigkeit von ihren umgebenden Medien, wenn sie in Lösung sind, oder außerhalb einer Lösung, aus welcher sie hergestellt wurden, wenn sie in fester Form sind. Die Verwendung eines Ausdruckes, wie zum Beispiel Idonsäure, um solche Moleküle zu bezeichnen, soll alle Ionisationszustände des betreffenden organischen Moleküls einschließen. Somit beziehen sich zum Beispiel "Idonsäure", ihre cyclisierte Form "Idonolacton" und "Idonat" auf den gleichen organischen Rest und sollen nicht besondere Ionisierungszustände oder chemische Formen spezifizieren.
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Ausdruck "rekombinant" auf eine Hefe, welche Nukleinsäure enthält, die nicht natürlich in dem Organismus vorkommt und/oder auf Hefe, die zusätzliche Kopien rekombinant eingeführter endogener Nukleinsäure aufweist. Der Ausdruck "heterolog", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf Nukleinsäure oder Aminosäuresequenzen, die nicht natürlicherweise in der Hefe auftreten. Wie hierin verwendet, bezieht sich der Ausdruck "endogen" auf eine Nukleinsäure, die natürlicherweise in der Hefe auftritt. Ein rekombinanter Wirt kann ebenfalls Mutationen und/oder Deletionen in natürlich vorkommender Nukleinsäure von solcher Art besitzen, dass das durch die Nukleinsäure kodierte Protein nicht hergestellt wird.
Wie hierin verwendet, bezeichnet "Nukleinsäure" eine Nukleotid- oder Polynukleotidsequenz, und Fragmente oder Bereiche davon, und DNA oder RNA von genomischen oder synthetischem Ursprung, welche doppelsträngig oder einzelsträngig sein können, ob sie nun den Sinn- oder Anti-Sinn-Strang repräsentieren. Wie hierin verwendet, bezeichnet "Aminosäure" Peptid- oder Proteinsequenzen oder Bereiche davon.
Der Ausdruck "oxidatives Enzym", wie er hierin verwendet wird, bezeichnet ein Enzym oder Enzymsystem, welches die Umwandlung eines Substrats eines vorgegebenen Oxidationszustandes zu einem Produkt eines höheren Oxidationszustandes als dem des Substrates katalysieren kann. Der Ausdruck "reduzierendes Enzym" bezeichnet ein Enzym oder Enzymsystem, welches die Umwandlung eines Substrats eines vorgegebenen Oxidationszustands zu einem Produkt mit einem niedrigeren Oxidationszustand als dem des Substrates katalysieren kann. Oxidative Enzyme, welche mit der Biokatalyse eines Zuckers mit 6 Kohlenstoffen zu Stoffwechselintermediaten von ASA assoziiert sind, schließen unter anderen D-Glukosedehydrogenase, D-Gluconatdehydrogenase und 2-Keto-D-gluconatdehydrogenase sowie L-Sorbitoldehydrogenase-Aktivität, L-Sorbosedehydrogenase und L-Sorbosondehydrogenase-Aktivität ein. Reduktive Enzyme, die mit der Biokatalyse von Stoffwechselintermediaten von ASA zu gewünschten Endprodukten assoziiert sind, schließen unter anderem 2,5-Diketo-D-gluconatreduktase (DKGR), 2-Ketoreduktase (2-KR) und 5-Ketoreduktase (5-KR) ein. Solche Enzyme schließen jene ein, welche natürlich durch die Wirtshefe hergestellt werden, oder jene, welche über rekombinante Mittel eingeführt werden, ein.
Wie hierin verwendet schließt der Ausdruck "Zuckersäure mit 6 Kohlenstoffen" spezifisch L-Galactonsäuresubstrate aus und schließt 2-Keto-L-gulonsäure, Idonsäure, Gluconsäure, 6-Phosphogluconat, 2-Keto-D-gluconsäure, 5-Keto-D-gluconsäure, 2-Ketogluconatphosphat, 2,5-Diketo-L-gulonsäure, 2,3-L-Diktogulonsäure, Dehydroascorbinsäure, Erythroascorbinsäure und D-Mannonsäure ein, ist jedoch nicht darauf beschränkt.
Wie hierin verwendet, schließt der Ausdruck "Zucker mit 6 Kohlenstoffen" Glukose, Gulose, Sorbose, Fructose, Idose, Galactose und Mannose, alle in entweder der D- oder L-Form, ein, ist jedoch nicht darauf beschränkt.
Die Ausdrücke "isoliert" oder "gereinigt", wie hierin verwendet, beziehen sich auf eine Nukleinsäure oder ein Protein oder Peptid, welche/welches von mindestens einer Komponente entfernt wird, mit welcher sie/es natürlicherweise assoziiert ist. In der vorliegenden Erfindung kann eine isolierte Nukleinsäure einen die Nukleinsäure umfassenden Vektor einschließen. Gereinigt, wie hierin verwendet, um eine Kohlenstoffquelle zu beschreiben, die von einem fermantativen Prozess abgeleitet ist, bezieht sich auf die Entfernung dieser Kohlenstoffquelle von mindestens einer Komponente, mit welcher sie natürlicherweise in der Fermentationskultur assoziiert ist.
Genaue Beschreibung:
Herstellung von ASA in Hefe
Die vorliegende Erfindung betrifft die Herstellung von ASA oder ASA-Stereoisomeren, zum Beispiel Erythorbinsäure, in Hefe, welche in der Lage ist, KLG als eine einzige Kohlenstoffquelle zur Herstellung von ASA zu nutzen. Die vorliegende Erfindung schließt speziell ein Verfahren zur Herstellung von ASA in Hefe aus, welches ASA über den L-Galactonolactonoxidase-Stoffwechselweg herstellt. Hefen sind in N. J. W. Kreger-van Rij, in "The Yeasts", Band 1 von Biology of Yeasts, Kapitel 2, Hrsg. A. H. Rose & J. S. Harrison, 1987, Academic Press, London, beschrieben. Hefen, die zu den Gattungen der imperfekten Hefen gehören, werden allgemein dadurch charakterisiert, dass sie keine Ascosporen und Basidiosporen bilden. ASA ist sauerstoffempfindlich, deshalb ist es bevorzugt, dass die Hefe in der Lage ist, anaerob zu wachsen, um die Oxidation der hergestellten ASA zu verringern. Die vorliegende Erfindung umfasst ebenfalls Verfahren der Herstellung von ASA unter Verwendung von Hefen, welche unter aeroben Bedingungen kultiviert werden, solange reduzierende Mittel wie Dithioetrythretol, Glutathion, Metallchelatoren wie EDTA, Stabilisatoren wie Metaphosphorsäure, Aminosäuren, Glykole, Zucker, Oxalsäure, Trichloressigsäure, 8-Hydroxychinolin in der ASA-Umgebung vorliegen (D. W. Bradley, G. Emery und J. E. Maynard, Clin. Chim. Acta 4, 47–52 (1973).
Hefen, welche in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, schließen jene ein, die hierin aufgelistet sind, sind jedoch nicht darauf beschränkt, und sie werden beispielhaft durch der Auflistung folgende Hinterlegungsbezeichnung angegeben: Candida blankii CBS1898, ATCC 18735; C. curvata CBS570; C. humicola; C. incommunis ATCC22971; C. salmanticensis ATCC 16042; C. sp. ATCC 28528, ATCC 20473; Cryptococcus albidus CBS4192; Cr. dimennae CBS5770; Cr. heveanensis CBS140; Cr. kuetzingii UCD68-196; Cr. luteolus CBS953; Cr. skinneri UCD60-82 CBS5029; Cr. terreus CBS1895, CBS6293 CCY17-8-5; Cr. uiguttulatus CBS1730; Cr. laurenti CCY 17-3-2, CCY17-3-6, ATCC32044; Cr. neoformans ATCC32045; Cr. podzolicus CCYI7-20-1; Trichosporon cutaneum UCD54-169 CCY30-5-4; T. beigelii NRRLY-1490; T. pullulans ATCC10677; Aureobasidium pullulans DBV A9, A10, A62, A77 A84; Hansenula capsulata DBV 3164, ATCC24204; Lipomyces starkeyi UCD 51-55, 15 CBS1809; L. lipofer NRRL Y-1351, Phaffia rhodozyma ATCC24201, Rhodotorula mucilaginosa NRC 211003; Saccharomyces uvarum ATCC9373, ATCC 9080; Saccharomycopsis fibuligera ATCC2082; Schwanniomyces occidentalis NRC2782, NRC2783; and Torulopsis ernobii ATCC20000. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Hefe ein Vertreter der imperfekten Hefegruppe. Eine bevorzugte Familie von imperfekter Hefe zur Verwendung bei Verfahren zur Herstellung von ASA ist die Cryptococcaceae-Familie. Bevorzugte Gattungen von Cryptococcaceae werden aus der Gruppe gewählt, die aus Candida und Cryptococcus besteht.
Wie in den Beispielen gezeigt, waren Candida blankii und Cryptococcus dimennae in der Lage, ASA über Hintergrundspiegeln herzustellen, wenn sie auf KLG als einer alleinigen Kohlenstoffquelle wachsen gelassen wurden, wohingegen Candida shehatae, obgleich sie in der Lage ist, auf KLG als einer alleinigen Kohlenstoffquelle zu wachsen, unfähig zur Herstellung von ASA war. Die illustrierenden Beispiele beschreiben die Verwendung von Candida shehatae der ATCC-Zugangsnummer 34887, Candida blankii der ATCC-Zugangsnummer 18735, Cryptococcus dimennae ATCC-Zugangsnummer 22024 und Cryptococcus luteolus ATCC- Zugangsnummer 32044. Die vorliegende Erfindung umfasst Mutanten, Derivate und Nachfahren von bekannten Spezies von Hefe, und insbesondere Mutanten und Derivate von bekannten Spezies, die zu den Gattungen Cryptococcaceae gehören, zum Beispiel jene, die zu Candida und Cryptococcus gehören, solange die Mutante, das Derivat oder der Nachkomme in der Lage ist, KLG als eine alleinige Kohlenstoffquelle zur Herstellung von ASA zu nutzen.
Die vorliegende Erfindung umfasst Verfahren zur Herstellung von ASA oder ASA-Stereoisomeren in Hefe, wobei die Hefe natürlich auftretend ist, das heißt nicht gentechnologisch verändert ist, sowie jene, bei der die Hefe rekombinant ist und heterologe Nukleinsäure umfasst, welche oxidative und/oder reduzierende Enzyme kodiert, welche mit der Umwandlung einer Kohlenstoffquelle zu KLG in der Hefe assoziiert sind. In der vorliegenden Erfindung kann die Kohlenstoffquelle, wie eine Zuckersäure mit 6 Kohlenstoffen, ein Produkt eines separaten fermentativen Prozesses sein, welches in eine Hefekultur eingeführt wird, wie KLG, welches durch das von Lazarus et al. beschriebene Verfahren (J. Bact. 1991, 173, 6651–61) oder durch das in Saito et al. beschriebene Verfahren (1997, Applied and Environmental Microbiology, 63: 454–460) hergestellt wurde. Die Kohlenstoffquelle, welche aus einem separaten fermentativen Prozess stammt, kann vor der Verwendung bei einem Verfahren zur Herstellung von ASA oder ASA-Stereoisomeren gereinigt werden oder direkt aus dem Fermentationsprozess verwendet werden. Die Kohlenstoffquelle kann ebenfalls von chemischen Mitteln abgeleitet sein.
In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Hefe gentechnologisch so geändert, dass sie entweder ein heterologes oxidatives Enzym oder ein heterologes reduzierendes Enzym, oder beide, umfasst, dass/die mit der Umwandlung einer Kohlenstoffquelle zu KLG in der Hefe assoziiert ist/sind, wodurch ein einzelner Organismus bereitgestellt wird, welcher in der Lage ist, eine Kohlenstoffquelle, wie Glukose oder einen anderen Zucker mit 6 Kohlenstoffen zu Ascorbinsäure über KLG als ein Intermediat umzuwandeln. Der rekombinante Hefewirt kann mehrere heterologe oxidative Enzyme und/oder mehrere heterologe reduzierende Enzyme umfassen, um Ascorbinsäure aus einem Zucker mit 6 Kohlenstoffen oder einer Zuckersäure mit 6 Kohlenstoffen herzustellen.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Kohlenstoffquelle Glukose, und die rekombinante Hefe umfasst heterologe Nukleinsäure, welche mindestens eine aus (a) einer Glukosedehydrogenase (GDH); (b) einer Gluconsäuredehydrogenase (GADH); (c) einer 2-Keto-D-gluconsäuredehydrogenase (2-KDGDH); und (d) einer 2,5-Diketo-D-gluconsäurereduktase (2,5-DKGR) kodiert, mit der Maßgabe, dass, wenn die Hefe heterologe Nukleinsäure für weniger als alle von (a) bis (d) umfasst, dann die Hefe endogene Nukleinsäure umfasst, und zwar dergestalt, dass die Hefe Nukleinsäure für jedes von (a) bis (d) umfasst und in der Lage ist, Glukose zu ASA über das Intermediat KLG umzuwandeln. Wie es leicht durch den erfahrenen Fachmann verstanden wird, können Oxidations- und Reduktionsreaktionen, welche in der Umwandlung eines Kohlenstoffsubstrats zu ASA involviert sind, Cofaktoren erfordern, welche den Hefekulturen hinzuzusetzen sind. Zum Beispiel besitzt 2,5-DKGR, welche in dem US-Patent Nr. 5 032 514, erteilt am 16. Juli 1991, beschrieben ist, ein Anfordernis nach NADPH. Andere Beispiele für Cofaktoren, welche in enzymatischen Reaktionen notwendig sind, schließen ATP, NAD⁺, NADP⁺, NADH, NADPH und Coenzym A ein, sind jedoch nicht darauf beschränkt. Die Hefe kann ebenfalls Deletionen oder Mutationen von endogenen oxidativen und/oder reduzierenden Enzymen aufweisen, welche den gewünschten Weg des Kohlenstoffflusses stören.
In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Kohlenstoffquelle Sorbitol, und die rekombinante Hefe umfasst heterologe Nukleinsäure, die mindestens eine von (a) D-Sorbitoldehydrogenase (SLDH); (b) L-Sorbosedehydrogenase; und (c) L-Sorbosondehydrogenase kodiert, mit der Maßgabe, dass, wenn die Hefe heterologe Nukleinsäure für weniger als alle von (a) bis (c) umfasst, dann die Hefe endogene Nukleinsäure von solcher Art umfasst, dass die Hefe Nukleinsäure für jedes von (a) bis (c) umfasst und in der Lage ist, Sorbitol zu ASA über das Intermediat 2 KLG umzuwandeln.

Quellen für Nukleinsäure, die oxidative oder reduzierende Enzyme kodiert, schließen die folgenden ein:

ENZYM	REFERENZ
Glukosedehydrogenase	Smith et al. 1989, Biochem. J. 261: 973; Neijssel et al. 1989, Antonie Van Leauvenhoek 56 (1): 51–61
Gluconsäuredehydrogenase	Matsushita et al. 1979, J. Biochem. 85: 1173; Kulbe et al. 1987, Ann. N. Y. Acad Sci 506: 552
2-Keto-D-gluconsäuredehydrogenase	Stroshane 1977 Biotechnol. BioEng 19 (4) 459
2-Ketogluconatreduktase	J. Gen. Microbiol. 1991, 137: 1479
2,5-Diketo-D-gluconsäurereduktase	US-Patent Nrn. 5 795 761; 5 376 544; 5 583 025; 4 757 012; 4 758 514; 5 008 193; 5 004 690; 5 032 514
L-Sorbosedehydrogenase; L-Sorbosondehydrogenase und L-Sorbitoldehydrogenase	Saito et al. Applied and Environmental Microbiology, 1997, 63: 454

Konstruktion rekombinanter Hefe
Rekombinante Hefe, welche die Nukleinsäure(n) enthält, welche notwendig ist (sind), um ASA aus einer Kohlenstoffquelle herzustellen, kann unter Verwendung von Techniken, die im Fachbereich allgemein bekannt sind, konstruiert werden. Molekularbiologische Techniken sind in Sambrook et al., Molecular Biology Cloning: A Laboratory Manual, Zweite Ausgabe (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989) beschrieben. Gene, welche oxidative Enzyme und reduzierende Enzyme kodieren, die mit der ASA-Produktion assoziiert sind, können aus nativen Wirten, wie unten beschrieben, isoliert werden, oder durch chemische Mittel hergestellt werden. Wenn zum Beispiel die Sequenz des Gens bekannt ist, können geeignete genomische Bibliotheken durch Restriktionsendonukleaseverdau kreiert werden und mittels Sonden, welche zu der gewünschten Gensequenz komplementär sind, gescreent werden. Sobald die Sequenz isoliert ist, kann die DNA unter Verwendung von standardmäßigen primer-gerichteten Amplifikationsverfahren, wie der Polymerasekettenreaktion (PCR) ( US 4 683 202 ) amplifiziert werden, um Mengen an Nukleinsäure zu erhalten, welche für die Transformation unter Verwendung von geeigneten Vektoren geeignet sind. Eine Bandbreite von Vektoren und Transformations- und Expressionskassetten, welche für das Klonieren, Transformieren und Exprimieren in Hefe von Nukleinsäure, die oxidative und reduzierende Enzyme kodiert, welche mit der ASA-Produktion assoziiert sind, geeignet sind, sind den im Fachbereich Erfahrenen bekannt. Protokolle zum Erhalt und zur Verwendung von solchen Vektoren sind jenen im Fachbereich bekannt (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual – Bände 1, 2, 3 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, (1989)).
Typischerweise enthält der Vektor oder die Kassette Sequenzen, welche die Transkription und Translation der Nukleinsäure steuern, einen selektierbaren Marker und Sequenzen, welche die autonome Replikation oder chromosomale Integration erlauben. Geeignete Vektoren umfassen eine Region 5' des Gens, welche Transkriptionsinitiations-Steuerelemente aufnimmt, und eine Region 3' des DNA-Fragments, welches die transkriptionale Termination reguliert. Diese Regulationsregionen können von Genen abgeleitet sein, die zu der Hefe homolog oder heterolog sind, solange die gewählte Regulationsregion in der Lage ist, in der Hefe ihre Funktion zu erfüllen.
Initiations-Steuerungsregionen oder Promotoren, welche brauchbar sind, um die Expression der oxidativen oder reduktiven Enzyme in Hefe zu steuern, sind jenen im Fachbereich Erfahrenen bekannt. Im Grunde ist jeder Promotor, der in der Lage ist, diese Gene zu steuern, für die vorliegende Erfindung geeignet, einschließlich CYC1, HIS3, GAL1, GAL10, ADH1, PGK, PHO5, GADPH, ADC1, TRP1, URA3, LEU2, ENO, TPI, jedoch nicht darauf beschränkt. Nukleinsäure, welche die oxidativen oder reduzierenden Enzyme kodiert, ist operabel durch Initiationscodone an ausgewählten Expressions-Regulationsregionen für eine wirksame Expression der oxidativen oder reduzierenden Enzyme gekoppelt.
Sobald geeignete Kassetten konstruiert sind, werden sie verwendet, um Hefe zu transformieren, und die Hefe wird bezüglich der Fähigkeit gescreent, ASA aus einer geeigneten Kohlenstoffquelle herzustellen. In einer Ausführungsform zum Beispiel wird die Hefe mit Nukleinsäure, die entweder eine oder beide aus einer Dehydrogenaseaktivität und einer Reduktaseaktivität kodiert, transformiert, und die transformierte Hefe wird bezüglich ihrer Fähigkeit gescreent, ASA aus einem Zucker mit 6 Kohlenstoffen, wie Glukose, oder einer Zuckersäure mit 6 Kohlenstoffen, wie KLG, herzustellen.
Nachweis von ASA
Verfahren zum Nachweis von ASA und ASA-Stereoisomeren schließen die Anwendung der Redoxtitration mit 2,6-Dichlorindophenol (Burton et al. 1979, J. Assoc. Pub. Analysts 17: 105); die Hochleistungs-Flüssigchromatographie (HPLC) unter Verwendung des Anionenaustausches (J. Chrom. 1980, 196: 163); und Elektro-Redox-Vorgehensweisen (Pachia, 1976, Anal. Chem. 48: 364) ein. Enzymatische Vorgehensweisen, welche die Verwendung von Ascorbinsäureoxidase involvieren, können ebenfalls zur Anwendung kommen.
In der vorliegenden Erfindung wurde der Nachweis von ASA mittels HPLC, colorimetrischem Ascorbatoxidaseassay, wie hierin verwendet, und der GC-Massen-Spektrometrie bewerkstelligt. Dem Fachmann sind Kontrollen bewusst, die bei der Nutzung dieser Nachweismethoden zur Anwendung zu kommen haben. Da ein chemisches Gleichgewicht zwischen KLG und ASA vorliegt (d. h., KLG enthält Hintergrundanteile an ASA), wurde für die Anwendung der HPLC-UV-Detektion von Ascorbinsäure das Elutionsprofil des Substrates KLG aufgezeichnet und als eine Kontrolle verwendet. Für den Ascorbatoxidaseassay wurde eine Kontrolle von Leerläufen ohne Probe und Enzym laufen gelassen. Zur GCMS-Analyse wurden derivatisierendes Mittel und das Substrat KLG als eine Kontrolle analysiert.
Es ist ebenfalls wünschenswert, ein Screeningverfahren zum Nachweis von Hefe zu besitzen, welche in der Lage ist, ASA aus einer Kohlenstoffquelle herzustellen. Ein Verfahren zum Screenen nach Hefe, die in der Lage ist, ASA herzustellen, umfasst die Schritte des Erhaltens von Hefe, die in der Lage ist, auf Ascorbinsäure oder Ascorbinsäure-Stereoisomer zu wachsen, des Kultivierens der Hefe in Gegenwart von KLG unter Bedingungen, die zur Herstellung von Ascorbinsäure oder einem Ascorbinsäure-Stereoisomer geeignet sind; und des Testens der Hefekultur bezüglich der Produktion von Ascorbinsäure oder einem Ascorbinsäure-Stereoisomer.
Fermentation und Reinigung
Medien und Kohlenstoffsubstrate:
Natürlich vorkommende Hefe und rekombinante Hefe, die zur Nutzung von KLG zur Herstellung von ASA in der Lage sind, werden einer Fermentation im großen Maßstab in der Gegenwart einer geeigneten Kohlenstoffquelle unterzogen, die ASA wird rückgewonnen. Geeignete Kohlenstoffquellen umfassen Zucker mit sechs Kohlenstoffen oder Zuckersäuren mit sechs Kohlenstoffen. Die Kohlenstoffquelle, die beim Züchten der hierin beschriebenen Hefe genutzt wird, wird nur durch die Anfordernisse des Wirtsorganismus beschränkt. Zum Beispiel kann natürlich vorkommende Hefe in Gegenwart einer Zuckersäure mit sechs Kohlenstoffen, zum Beispiel KLG, wachsen gelassen werden, wohingegen rekombinante Hefe, welche gentechnologisch verändert wurde, damit sie Nukleinsäure, die entweder eines oder beides aus Dehydrogenase und Reduktase kodiert, enthält, in Gegenwart eines Zuckers mit sechs Kohlenstoffen, wie zum Beispiel Glukose, wachsen gelassen werden kann. Zusätzlich zu einer geeigneten Kohlenstoffquelle, müssen Fermentationsmedien geeignete Minerale, Salze, Cofaktoren, Puffer und andere Komponenten enthalten, die jenen im Fachbereich Erfahrenen bekannt sind, die geeignet für das Wachstum der Kulturen und die Herstellung von ASA geeignet sind. Verfahren bezüglich Medien und Kulturbedingungen, die für das Wachsenlassen von Hefe geeignet sind, sind in Costamagna et al., 1986, Can. J. Microbiology, 32: 756–758 beschrieben.
Die Hefe kann unter aeroben oder anaeroben Bedingungen wachsen gelassen werden. ASA ist sauerstoffempfindlich, deshalb wird das anaerobe Wachsenlassen der ASA herstellenden Hefe die Oxidation der produzierten ASA verringern. Wenn die Hefe unter aeroben Bedingungen wachsen gelassen wird, ist es in alternativer Weise bevorzugt, das reduzierende Mittel, zum Beispiel Dithiothreitol, Glutathion, Metallchelatoren, wie EDTA, Stabilisatoren wie Metaphosphorsäure, Aminosäuren, Glykole, Zucker, Oxalsäure, Trichloressigsäure, 8-Hydroxychinolin, in der ASA-Umgebung vorliegen. Die vorliegende Erfindung umfasst die satzweise oder kontinuierliche Fermentation, und das Verfahren der Herstellung von ASA kann in einem oder zwei Fermentatoren ablaufen. Wenn zum Beispiel die Hefe gentechnologisch verändert ist, um einen Stoffwechselweg von einem Zucker mit sechs Kohlenstoffen, wie zum Beispiel Glukose, zu einer Zuckersäure mit sechs Kohlenstoffen, wie KLG, zu umfassen, könnte die ASA-Herstellung in einem Fermentor unter Verwendung der rekombinanten Hefe als ein Wirt ablaufen. Wenn die Hefe natürlich auftretend ist, und ASA in der Hefe aus einer Zuckersäure mit sechs Kohlenstoffen, zum Beispiel KLG, hergestellt wird, kann die Produktion in zwei Fermentatoren ablaufen, einem zur Herstellung von KLG, wie in dem US-Patent 5 032 514 oder von Saito et al. oben beschrieben, und einem zur Herstellung von ASA aus KLG in Hefe.
Eine klassische Satzfermentation ist ein geschlossenes System, wobei die Zusammensetzung der Medien am Beginn der Fermentation eingestellt wird, und keinen künstlichen Veränderungen während der Fermentation unterworfen wird. Somit wird zu Beginn der Fermentation das Medium mit dem gewünschten Organismus oder den Organismen inokuliert, und die Fermentation wird laufen gelassen, wobei dem System nichts hinzugefügt wird. Typischerweise ist jedoch eine Satzfermentation ein "Ansatz" in Bezug auf die Zugabe der Kohlenstoffquelle, und es werden häufig Versuche unternommen, Faktoren wie den pH-Wert und der Sauerstoffkonzentration, zu regulieren. Die Metabolit- und Biomassenzusammensetzungen des Satzsystems verändern sich konstant bis zu dem Zeitpunkt, bei dem die Fermentation gestoppt wird. Innerhalb Satzkulturen verändern sich Zellen über eine statische Lag-Phase zu einer log-Phase mit hohem Wachstum und schließlich zu einer stationären Phase, bei der die Wachstumsrate verringert oder gestoppt ist. Ohne Behandlung werden Zellen in der stationären Phase schließlich sterben. Zellen in der log-Phase sind im Allgemeinen für die Hauptproduktion von Endprodukt oder Zwischenprodukt verantwortlich.
Eine Variation bezüglich des Standardsatzsystems ist das Einspeise-Satz-Fermentationssystem, welches in der vorliegenden Erfindung ebenfalls geeignet ist. Bei dieser Variation eines typischen Satzsystems wird das Substrat in Inkrementen entsprechend dem Voranschreiten der Fermentation hinzugesetzt. Einspeise-Batch-Systeme sind brauchbar, wenn die Katabolitrepression gewählt wird, um den Metabolismus der Zellen zu inhibieren, und wenn es erwünscht ist, limitierte Mengen an Substrat in den Medien vorliegen zu haben. Messungen der aktuellen Substratkonzentration in Einspeise-Satz-Systemen ist schwierig, und sie wird deshalb auf der Basis der Änderungen von messbaren Faktoren wie dem pH, gelöstem Sauerstoff und dem Partialdruck von Abfallgasen wie CO₂ abgeschätzt. Satz- und Einspeise-Satz-Fermentationen sind im Fachbereich gängig und allgemein bekannt und Beispiele können in Brock, oben, gefunden werden.
Es wird ebenfalls in Betracht gezogen, dass das Verfahren für kontinuierliche Fermentationsverfahren anpassbar wäre. Die kontinuierliche Fermentation ist ein offenes System, bei welchem ein definiertes Fermentationsmedium kontinuierlich einem Bioreaktor hinzugesetzt wird, und eine gleiche Menge konditioniertes Medium gleichzeitig zur Prozessierung entfernt wird. Die kontinuierliche Fermentation hält im Allgemeinen die Kulturen bei einer konstant hohen Dichte, wobei Zellen vornehmlich in der log-Wachstumsphase sind.
Die kontinuierliche Fermentation ermöglicht die Modulation eines Faktors oder einer beliebigen Anzahl von Faktoren, welche das Wachstum oder die Endproduktkonzentration beeinflussen. Zum Beispiel wird eine Methode einen beschränkenden Nährstoff, wie die Kohlenstoffquelle oder den Stickstoffanteil, auf einer festgelegten Rate halten und bei allen anderen Parametern eine Abänderung ermöglichen. In anderen Systemen kann eine Vielzahl von Faktoren, welche das Wachstum beeinflussen, kontinuierlich abgeändert werden, während die Zellkonzentration, gemessen durch die Trübheit des Mediums, konstant gehalten wird. Kontinuierliche Systeme versuchen, Steady-State-Wachstumsbedingungen aufrecht zu erhalten, und somit muss der Zellverlust, welcher darauf zurückzuführen ist, dass Medium abgezogen wird, gegen die Zellwachstumsrate in der Fermentation ausgeglichen werden. Verfahren des Modulierens von Nährstoffen und Wachstumsfaktoren für kontinuierliche Fermentationsprozesse sowie Techniken zur Maximierung der Rate der Produktbildung sind im Fachbereich der industriellen Mikrobiologie allgemein bekannt und eine Vielzahl von Verfahren wurde von Brock, oben, im Detail beschrieben.
Die Verfahren der vorliegenden Erfindung können entweder unter Anwendung von Satz-, Einspeise-Satz- oder kontinuierlichen Verfahren ausgeführt werden. Nach der Fermentation kann die hergestellte ASA aus der Fermentationsbrühe mit einer Vielzahl von Verfahren rückgewonnen werden, einschließlich Ionenaustauschharzen Absorptions- oder Ionenverzögerungsharzen, Aktivkohle, Konzentrationskristallisation etc.
Verschiedene Aspekte der vorliegenden Erfindung werden weiter in Bezug auf die folgenden spezifischen Beispiele beschrieben, welche den Umfang der vorliegenden Erfindung nicht beschränken sollen.
Beispiele
Die folgende Beschreibung von Materialien und Methoden betrifft die Beispiele I–III.
Materialien und Methoden
Kulturbedingungen:
Hefe wurde wachsen gelassen und kultiviert auf Difco-Hefe-Stickstoff-Basis (YNB), 6,7 g/l, mit einem anfänglichen Wachstum auf 2% Glukose, gefolgt von einem Transfer zu 0,5% (w/v) alleiniger Kohlenstoffquelle von L-ASA und dann 2-KLG oder L-Idonat 20,8 mM. Die Hefe wurde in 50 ml YNB-Medium bei 22°C, pH 5,5 während eines 48-Stunden-Zyklus mit einer Rührgeschwindigkeit von 250 U/min. in einem Schüttelkolben kultiviert.
HPLC: Die HPLC-Elution von Ascorbat und anderen Ketozuckersäuren wurde unter Verwendung einer analytischen Dionex IonPac AS10-Säule mit einer Guard-Säule durchgeführt. Es wurde eine isokratische Elution unter Verwendung eines 40 mM Acetat pH 4,86-Eluenten durchgeführt, um eine gute Retentionszeitenseparation zwischen dem Substrat KLG und dem Produkt Ascorbat (> 5 min.) zu erhalten. Ascorbat wurde unter Verwendung eines UV-Detektors zwischen einer Wellenlänge von 245 bis 270 nm nachgewiesen (> 100 ppb), wohingegen KLG unter Verwendung eines Brechungsindexdetektors nachgewiesen wurde. Das HPLC-System, welches für die Untersuchung verwendet wurde, ist ein HP-Alliance-Gerät, die mit dem Millenium-Softwarepack, welches für die Peak-Flächen-Integrations-Berechnung verwendet wurde, ausgestattet war. Eine Eichkurve zur Ascorbatquantifizierung wurde zwischen (100 ppb–100 ppm) erzeugt.
GC-MS: Die Ascorbatidentifizierung unter Verwendung von GC-MS wurde unter Verwendung einer veröffentlichten Prozedur durchgeführt (J. C. Deutsch und J. Fred Kolhouse, Anal. Chem. 1993, 65, 321–326). Die GC-Arbeiten wurden auf einer HP-Gerätschaft 5890 unter Verwendung einer 15 Meter mal 0,25 mm großen Supelco SPB-1-Quarzglas-Kapillarsäule durchgeführt. Die Ascorbatderivatisierung wurde unter Verwendung von N-Methyl-N-(tert-butyldimethylsilyl)trifluoracetamid und Acetonitril entsprechend dem Verfahren, welches in der oben stehenden Referenz angegeben ist, durchgeführt. Eine Standard-Ascorbat-Retentionszeit, die unter unsere experimentellen Bedingungen erhalten wurde, lag bei 8,75 Minuten. Charakteristische Massenfragmentierungsmuster von m/z von 575, 531, 443, 343, wurden in den Spektren nachgewiesen, die sowohl für Standardproben als auch für unbekannte Proben erhalten wurden.
Ascorbatoxidaseassay: Der Ascorbatoxidaseassay wurde unter Verwendung des L-Ascorbinsäure-Bestimmungskits (Kat. Nr. 408677), beschafft von Boehringer Mannheim, und dem mit dem Kit bereitgestellten Protokoll nachfolgend durchgeführt. Der Kit enthielt Ascorbatoxidaseenzym und eine Detektion/Quantifizierung (578 nm) unter Verwendung eines gekoppelten Farbstoffsystems aus MTT und PMS (Beutler, H.-O. und Beinstingl, G., 1984 in methods of enzymatic analysis (Bergmeyer, H. U. Ed.) 3. Ausgabe, Band 7., S. 376–385, Verlag Chemie, Weinheim, Deerfield, Beach/Florida, Basel.
Kontrollen und Leerwerte: Eine 0,5%-ige 2-KLG-Lösung enthält ~2 ppm Ascorbat bei einem pH von 6,1. Es wurde eine Kontrollreaktion nur mit Puffer, enthaltend KLG, neben jedem Experiment als eine Kontrollreaktion zusammen mit einer Hefe enthaltenden Reaktionsmischung während des Zeitverlaufs des Umwandlungsexperimentes in ganzen Zellen von KLG zu ASA laufen gelassen. In einer anderen Kontrolle wurden Hefezellen durch Wärme getötet und dann mit KLG inkubiert, um sicherzustellen, dass keine KLG-zu-ASA-Transformation unter diesen Bedingungen nachgewiesen wird. Bei einem mittels HPLC-Analyse nachgewiesenen Ascorbatpeak erfolgte eine weitere Bestätigung durch die Reaktion der Probe mit Ascorbatoxidase, und somit trat ein Verschwinden des Peaks in dem Chromatogramm aufgrund des Ascorbatabbaus durch die Ascorbatoxidase auf.
Beispiel I
Dieses Beispiel veranschaulicht, dass die Hefe Candida blankii in der Lage ist, KLG oder Idonat als eine alleinige Kohlenstoffquelle zum Wachstum zu nutzen. Dieses Beispiel zeigt ebenfalls die Herstellung von Ascorbinsäure durch Candida blankii, wenn sie in Gegenwart von KLG als alleinige Kohlenstoffquelle wachsen gelassen wird.
Candida blankii mit der ATCC-Zugangsnummer 18735 wurde wie in den Material- und Methoden-Abschnitten beschrieben, kultiviert. Die KLG-zu-ASA-Reaktion in ganzen Zellen wurde durchgeführt, wie es unten beschrieben ist. Etwa 3 Gramm nasse Zellen wurden aus einer 500 ml großen 48-stündigen Wachstumskultur mittels Zentrifugation bei 4°C und 9000 U/min. gesammelt. Zellen wurden mit kaltem 200 mM Phosphatpuffer bei einem pH von 6,1, enthaltend 0,5 mM EDTA, gewaschen. Zellen wurden dann in dem gleichen Puffer, enthaltend 0,5% KLG (10 ml), erneut suspendiert. Drei ml dieser Reaktionsmischung wurden abgezogen und in einem Mikrowellenofen zwei Minuten lang gekocht. Beide Reaktionsmischungen wurden dann auf 30°C in einen Rotationsinkubator zur Ganzzell-ASA-Produktion gestellt. 1,5 ml der Probe zum Zeitpunkt Null wurden abgezogen, zur Entfernung des Zellpellets zentrifugiert und bei –20°C gelagert. Der Überstand wurde durch einen 0,2 μm-Filter filtriert und einer HPLC-Analyse, gefolgt von Ascorbatoxidase- und GCMS-Analyse, wie oben beschrieben, unterzogen. Das gleiche Probenabzieh- und Aufarbeitungsverfahren wurde für die Zeitpunkte 2, 4 und 20 Stunden für die Lebendzellreaktion und für die 20 Stunden-Probe für die durch Wärme getötete Reaktionsmischung (Tabelle 1) verwendet. Durch Wärme getötete Proben besaßen keine Hintergrundspiegel an ASA und erzeugten keine ASA.
Nach der 20 Stunden-Probenabnahme wurde der pH-Wert der Reaktionsmischung um 3 pH-Einheiten auf einen pH-Wert von 3,15 unter Verwendung eines Citrat-Phosphat-Puffers gesenkt. Eine Probe wurde abgenommen und bei 21 Stunden zur Markierung der Null-Zeit für diese Zustandsänderung analysiert. Die Reaktion wurde über Nacht laufen gelassen. Nach weiteren 24 Stunden wurde die Endprobe abgenommen. Eine parallele KLG-Leerkontroll-Reaktion ohne Zellen wurde bei beiden pH-Werten laufen gelassen, um die Hintergrundproduktion von ASA aus KLG festzustellen (siehe Tabelle 1, 3).
Wie aus der Tabelle 1 und 3 ersichtlich ist, wurde, wenn C. blankii in der Ganzzellkultur unter Verwendung von KLG als einem alleinigen Substrat wachsen gelassen wurde, die Anwesenheit von ASA in dem Reaktionsmedium bestätigt. Die Konzentration der ASA, welche in der Reaktionsmischung vorlag, übertraf um das Dreifache die Hintergrundspiegel. Durch Senkung des pH-Wertes der Reaktionsmischung auf einen pH-Wert von 3 wurde eine weitere dreifache Zunahme in den ASA-Spiegeln festgestellt. Das Senken des pH-Wertes besaß den Effekt der Stabilisierung der ASA, sowie der Begünstigung der chemischen Thermodynamik in Richtung auf die ASA-Herstellung.
Beispiel II
Dieses Beispiel veranschaulicht, dass Cryptococcus dimennae in der Lage ist, KLG oder Idonat als eine alleinige Kohlenstoffquelle zum Wachstum zu nutzen. Dieses Beispiel zeigt ebenfalls die Herstellung von Ascorbinsäure durch Cryptococcus dimennae, wenn er in Gegenwart von KLG als einer alleinigen Kohlenstoffquelle wachsen gelassen wird.
Cryptococcus dimennae mit der ATCC-Zugangsnummer 22024 wurde kultiviert, wie es in den Material- und Methoden-Abschnitten beschrieben ist. Die KLG-zu-ASA-Reaktion in ganzen Zellen wurde durchgeführt, wie es im Beispiel I beschrieben ist.
Wie aus der Tabelle 1 und der 3 ersichtlich ist, wurde, wenn die Cryptococcus dimennae-Ganzzellkultur unter Verwendung von KLG als einem alleinigen Substrat wachsen gelassen wurde, die Anwesenheit von ASA im Reaktionsmedium bestätigt. Die Konzentration der in der Reaktionsmischung vorliegenden ASA überschritt um das Zweifache die Hintergrundspiegel.
Beispiel III
Dieses Beispiel veranschaulicht, dass Candida shehatae in der Lage ist, KLG als eine alleinige Kohlenstoffquelle zu nutzen, jedoch nicht in der Lage ist, ASA herzustellen. Die KLG-zu-ASA-Reaktion in ganzen Zellen wurde durchgeführt, wie es in Beispiel 1 beschrieben ist. Wie aus der 1 ersichtlich ist, ist Candida shehatae nicht in der Lage, ASA aus KLG unter diesen Bedingungen herzustellen.
Tabelle 1 HPLC-Ergebnisse, AU/Fläche und mg/l ASA-Konzentration in den Proben

Claims

Verfahren zur Herstellung von Ascorbinsäure oder einem Ascorbinsäure-Stereoisomer in einer Hefe, umfassend die folgenden Schritte: a) Erhalten einer Hefe, die in der Lage ist, 2-Keto-L-gulonsäure (KLG) als einzige Kohlenstoffquelle zu nutzen, um Ascorbinsäure oder ein Ascorbinsäure-Stereoisomer herzustellen; und b) Kultivieren der Hefe in Gegenwart einer Kohlenstoffquelle unter Bedingungen, die zur Herstellung von Ascorbinsäure oder einem Ascorbinsäure-Stereoisomer geeignet sind, wobei die Hefe natürlicherweise vorkommt oder eine Hefe gemäß Anspruch 20 ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1, ferner den Schritt des Rückgewinnens der Ascorbinsäure umfassend.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Kohlenstoffquelle eine Zuckersäure mit sechs Kohlenstoffen ist.
Verfahren gemäß Anspruch 3, wobei die Zuckersäure mit sechs Kohlenstoffen 2-Keto-L-gulonsäure, Idonsäure, Gluconsäure, 6-Phosphogluconat, 2-Keto-D-gluconsäure, 5-Keto-D-gluconsäure, 2-Ketogluconat-6-phosphat, 2,5-Diketo-L-gluconsäure, 2,3-L-Diketogulonsäure, Dehydroascorbinsäure, Erythroascorbinsäure und D-Mannonsäure einschließt.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Kohlenstoffquelle ein Zucker mit sechs Kohlenstoffen ist und die Hefe entweder eines oder beides von a) einer heterologen Nukleinsäure, die ein oxidatives Enzym kodiert, das mit der Produktion von Ascorbinsäure oder einem Ascorbinsäure-Stereoisomer in der Hefe assoziiert ist, und von b) einer heterologen Nukleinsäure, die ein reduzierendes Enzym kodiert, welches mit der Herstellung von Ascorbinsäure oder einem Ascorbinsäure-Stereoisomer in der Hefe assoziiert ist, umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 5, wobei der Zucker mit sechs Kohlenstoffen Glukose, Gulose, Idose, Galactose, Mannose, Sorbose und Fructose einschließt.
Verfahren gemäß Anspruch 5, wobei das oxidative Enzym eine Dehydrogenaseaktivität besitzt.
Verfahren gemäß Anspruch 7, wobei die Dehydrogenase eine Glukosedehydrogenaseaktivität, eine Gluconsäuredehydrogenaseaktivität, eine 2-Keto-D-gluconsäuredehydrogenaseaktivität, eine Galactosedehydrogenaseaktivität, eine L-Sorboseaktivität, eine D-Sorbitoldehydrogenaseaktivität, L-Sorbosondehydrogenaseaktivität, L-Idonsäureoxidase und L-Gulonsäureoxidase einschließt.
Verfahren gemäß Anspruch 5, wobei das reduzierende Enzym eine Reduktaseaktivität ist.
Verfahren gemäß Anspruch 9, wobei die Reduktaseaktivität 2,5-Diketo-D-gluconat-(DKG)reduktaseaktivität, 2,3-DKG-Reduktase, 5-Ketoreduktase, 2-Ketoreduktase und 2-Ketogulonatreduktase einschließt.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Kohlenstoffquelle Glukose ist und die Hefe heterologe Nukleinsäure umfasst, welche mindestens eines von (a) einer Glukosedehydrogenase (GDH); (b) einer Gluconsäuredehydrogenase (GADH); (c) einer 2-Keto-D-gluconsäuredehydrogenase (2-KDGDH); und (d) einer 2,5-Diketo-D-gluconsäurereduktase (2,5-DKGR) kodiert, mit der Maßgabe, dass, wenn die Hefe heterologe Nukleinsäure für weniger als alle von (a)–(d) umfasst, dann die Hefe endogene Nukleinsäure umfasst, so dass die Hefe Nukleinsäure jedes von (a)–(d) umfasst und in der Lage ist, Glukose zu Ascorbinsäure (ASA) mittels des intermediären KLG umzuwandeln.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Hefe ein Vertreter der Imperfekten Hefegruppe ist.
Verfahren gemäß Anspruch 12, wobei die Hefe ein Vertreter der Cryptococcaceae-Familie ist.
Verfahren gemäß Anspruch 13, wobei die Hefe Candida und Cryptococcus einschließt.
Verfahren gemäß Anspruch 14, wobei die Hefe Candida blankii ist.
Verfahren gemäß Anspruch 14, wobei die Hefe Cryptococcus dimennae ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Hefe Candida blankii oder Cryptococcus dimennae ist die Kohlenstoffquelle Glukose umfasst, wobei die Hefe eine heterologe Glukosedehydrogenaseaktivität und eine 2,5-DKG-Reduktaseaktivität umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Hefe Candida blankii oder Cryptococcus dimennae ist und die Kohlenstoffquelle D-Sorbitol, L-Sorbose oder L-Sorboson umfasst, wobei die Hefe mindestens eine von einer L-Sorbose-Aktivität, einer D-Sorbitoldehydrogenaseaktivität, einer L-Sorbosondehydrogenaseaktivität und einer Galactosedehydrogenase-Aktivität umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das Ascorbinsäure-Stereoisomer D-Ascorbinsäure, D-Araboascorbinsäure und L-Araboascorbinsäure einschließt.
Rekombinante Hefe, die in der Lage ist, 2-Keto-L-gulonsäure (KLG) als einzige Kohlenstoffquelle zu nutzen, um Ascorbinsäure oder ein Ascorbinsäure-Stereoisomer herzustellen, umfassend eine oder beide von (a) einer heterologen Nukleinsäure, die ein oxidatives Enzym kodiert, welches mit der Umwandlung einer Kohlenstoffquelle zu KLG in der Hefe assoziiert ist, und von (b) einer heterologen Nukleinsäure, die ein reduzierendes Enzym kodiert, welches mit der Umwandlung einer Kohlenstoffquelle zu KLG in der Hefe assoziiert ist.
Hefe gemäß Anspruch 20, wobei das oxidative Enzym eine Dehydrogenaseaktivität ist.
Hefe gemäß Anspruch 21, wobei die Dehydrogenase eine Glukosedehydrogenaseaktivität, eine Gluconsäuredehydrogenaseaktivität, eine 2-Keto-D-gluconsäuredehydrogenaseaktivität, eine Galactosedehydrogenaseaktivität, eine L-Sorboseaktivität, eine D-Sorbitoldehydrogenaseaktivität, L-Sorbosondehydrogenaseaktivität, L-Idonsäureoxidase und L-Gulonsäureoxidase einschließt.
Hefe gemäß Anspruch 20, wobei das reduzierende Enzym eine Reduktaseaktivität ist.
Hefe gemäß Anspruch 23, wobei die Reduktaseaktivität 2,5-Diketo-D-gluconsäure-(DKG)reduktaseaktivität, 2,3-DKG-Reduktase, 5-Ketoreduktase, 2-Ketoreduktase und 2-Ketogulonatreduktase einschließt.
Hefe gemäß Anspruch 20, wobei die Hefe ein Vertreter der imperfekten Hefegruppe ist.
Hefe gemäß Anspruch 25, wobei die Hefe ein Vertreter der Cryptococcaceae-Familie ist.
Hefe gemäß Anspruch 26, wobei die Hefe Candida und Cryptococcus einschließt.
Hefe gemäß Anspruch 27, wobei die Hefe Candida blankii ist.
Hefe gemäß Anspruch 27, wobei die Hefe Cryptococcus dimennae ist.
Hefe gemäß Anspruch 20, wobei die Hefe Candida blankii oder Cryptococcus dimennae ist und die Kohlenstoffquelle Glukose umfasst, wobei die Hefe eine heterologe Glukosedehydrogenaseaktivität und eine 2,5-DKG-Reduktaseaktivität umfasst.
Hefe gemäß Anspruch 20, wobei die Hefe Candida blankii oder Cryptococcus dimennae und die Kohlenstoffquelle D-Sorbitol, L-Sorbose oder L-Sorboson umfasst, wobei die Hefe mindestens eine von einer L-Sorbose-Aktivität, einer D-Sorbitoldehydrogenaseaktivität, einer L-Sorbosondehydrogenaseaktivität und einer Galactosedehydrogenase-Aktivität umfasst.
Verfahren zur Herstellung einer rekombinanten Hefe, die zur Nutzung eines Zuckers mit sechs Kohlenstoffen zur Herstellung von Ascorbinsäure (ASA) oder eines ASA-Stereoisomeren in der Lage ist, umfassend die folgenden Schritte: a) Erhalten einer Hefe, die zur Nutzung von 2-Keto-L-gulonsäure (KLG) als einzige Kohlenstoffquelle zur Herstellung von ASA oder einem ASA-Stereoisomer in der Lage ist, und b) Einführen von mindestens einem oder beiden von a) einer heterologen Nukleinsäure, die ein oxidatives Enzym kodiert, welche mit der Umwandlung einer Kohlenstoffquelle zu KLG in der Hefe assoziiert ist, und von b) einer heterologen Nukleinsäure, die ein reduzierendes Enzym kodiert, welches mit der Umwandlung einer Kohlenstoffquelle zu KLG in der Hefe assoziiert ist.
Verfahren gemäß Anspruch 32, wobei die Hefe ein Vertreter der imperfekten Hefegruppe ist.
Verfahren gemäß Anspruch 33, wobei die Hefe ein Vertreter der Cryptococcaceae-Familie ist.
Verfahren gemäß Anspruch 34, wobei die Hefe Candida und Cryptococcus einschließt.
Verfahren gemäß Anspruch 35, wobei die Hefe Candida blankii ist.
Verfahren gemäß Anspruch 35, wobei die Hefe Cryptococcus dimennae ist.
Verfahren gemäß Anspruch 32, wobei die Hefe Candida blankii oder Cryptococcus dimennae ist und die Kohlenstoffquelle Glukose umfasst, wobei die Hefe eine heterologe Glukosedehydrogenaseaktivität und eine 2,5-Diketo-gluconat(DKG)-Reduktaseaktivität umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 32, wobei die Hefe Candida blankii oder Cryptococcus dimennae ist und die Kohlenstoffquelle D-Sorbitol, L-Sorbose oder L-Sorboson umfasst, wobei die Hefe mindestens eine von einer L-Sorbose-Aktivität, einer D-Sorbitoldehydrogenaseaktivität, einer L-Sorbosondehydrogenaseaktivität und einer Galactosedehydrogenase-Aktivität umfasst.
Verfahren zum Screenen nach Hefe, die zur Herstellung von Ascorbinsäure (ASA) aus 2-Keto-L-gulonsäure (KLG) in der Lage ist, umfassend die Schritte des Erhaltens von Hefe, die in der Lage ist, auf Ascorbinsäure oder auf einem Ascorbinsäure-Stereoisomer zu wachsen, des Kultivierens der Hefe in Gegenwart von KLG als einzige Kohlenstoffquelle unter Bedingungen, die für die Herstellung von Ascorbinsäure oder dem Ascorbinsäure-Stereoisomer geeignet sind; und des Testens der Hefekultur bezüglich der Herstellung von Ascorbinsäure oder einem Ascorbinsäure-Stereoisomer, wobei die Hefe eine natürlich vorkommende Hefe oder eine Hefe gemäß Anspruch 20 ist.