CN1331750A - 使用酵母的抗坏血酸生产 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了使用能够由2－酮－L－古洛糖酸(KLG)产生抗坏血酸(ASA)的酵母的抗坏血酸生产。本发明还提供了生产ASA的方法,以及能够由碳源产生ASA的重组酵母。

Description

使用酵母的抗坏血酸生产
发明领域
本发明涉及分子生物学领域和用于抗坏血酸及抗坏血酸立体异构体生产的酵母的用途。
发明背景
L-抗坏血酸(维生素C，ASA)可以在制药和食品工业中作为维生素和抗氧化剂使用。由于作为特殊的化学药品具有较大的市场和价值，所以ASA的合成多年来一直受到密切关注。Reichstein-Grussner法是一种由葡萄糖生产ASA的化学途径，首次公开于1934年(Helv.Chim.Acta 17：311-328)。Lazarus等人(1989，“维生素C：经由重组DNA方法的生物转化”，工业微生物的遗传学和分子生物学(Genetics and MolecularBiologv of Industrial Microorganisms)，美国微生物学学会，华盛顿特区，C.L.Hershberger编)公开了生产ASA中间体2-酮-L-古洛糖酸(2-KLG，KLG)的生物转化方法，2-KLG可以化学转化成ASA。Saito等人(1997，应用和环境微生物学(Applied and EnvironmentalMicrobiology)63：454-460)报导了由D-山梨醇生产2-KLG的表达系统的构建。
已经有报导，酵母中存在ASA(Heick等人，1972，加拿大微生物学杂志(Can.J.Microbiol.)18：597-600)。已经公开了，L-半乳糖底物在假丝酵母中转化成ASA(1986年6月17日授权的美国专利号4,595,659和1990年4月10日授权的4,916,068)。Costamagna等人(1986，加拿大微生物学杂志32：756-758)公开了通过某些酵母利用ASA的研究结果。这份报告公开了能够以ASA以及异抗坏血酸生长的隐球酵母属(Cryptococcus)和假丝酵母属(Candida)的物种。
不管ASA及其生物催化中间体生产中的科学优势，仍然需要生产抗坏血酸的方法以供应全球需要。利用可更新的碳源生产抗坏血酸的方法的发现将是非常有意义的。
          发明概述
本发明涉及在酵母中生产抗坏血酸或抗坏血酸立体异构体。本发明部分根据这样的意外发现：能够以抗坏血酸或异抗坏血酸作为唯一碳源生长的多个酵母成员能够利用KLG作为唯一碳源产生抗坏血酸。相应的，本发明提供了由酵母生产抗坏血酸或抗坏血酸立体异构体的方法。
         附图简述
图1图解了布兰克假丝酵母(Candida blankii)、休哈塔假丝酵母(Candida shahatae)、和迪门纳隐球酵母(Cryptococcus dimmnae)在酵母氮基中以2KLG作为唯一碳源的生长。
图2图解了布兰克假丝酵母、休哈塔假丝酵母、迪门纳隐球酵母、和浅黄隐球酵母(Cryptococcus luteolus)在酵母氮基中在艾杜糖酸钠盐上的生长。
图3图解了使用抗坏血酸氧化酶实验测定来自全细胞反应混和物的布兰克假丝酵母和迪门纳隐球酵母的上清液中的ASA含量。
          发明详述定义：
如此处所用，术语“抗坏血酸”是生物化学命名法IUPAC-IUB委员会认可的维生素C的名称。其它名称包括L-抗坏血酸、L-木糖型抗坏血酸、和L-苏糖-己-2-烯酸γ内酯。纯的维生素是C6H8O6，分子量176.13。抗坏血酸可能有四种立体异构体：L-抗坏血酸、显示维生素C活性的D-阿拉伯糖型抗坏血酸(赤藻糖酸，异抗坏血酸)、L-阿拉伯糖型抗坏血酸、和D-木糖型抗坏血酸。抗坏血酸中间体或“途径中间体”是那些能够经由酶或化学方法转化成ASA的生化产物，包括(但不限于)葡萄糖酸、2-酮-D-葡萄糖酸、2，5-二酮-D-葡萄糖酸、2-酮-L-古洛糖酸、艾杜糖酸、葡萄糖酸、山梨醇、山梨糖、山梨酮(sorbosone)、和山梨糖双丙酮。
术语“能够利用KLG产生抗坏血酸或抗坏血酸立体异构体”，当指酵母时，指能够通过任何方法，包括生物催化转化和化学转化，由KLG产生抗坏血酸的酵母。
本领域清楚了解的，当存在于溶液中时，或者不以其所制备的溶液而以固相存在时，糖类的酸性衍生物可以根据其周围介质以多种离子化状态存在。指称这类分子的术语，诸如以艾杜糖酸为例，意欲包括所指有机分子的所有离子化状态。由此，例如，“艾杜糖酸”、其环化形式“艾杜糖酸内酯”、和“艾杜糖酸酯/盐”均指相同的有机部分，且不欲指定特定的离子化状态或化学形式。
如此处所用，术语“重组(体)(的)”指包含生物体中非天然存在的核酸的酵母，和/或包含重组导入的内源核酸之额外拷贝的酵母。如此处所用，术语“异源”指在酵母中非天然存在的核酸或氨基酸序列。如此处所用，术语“内源”指在酵母中天然存在的核酸。重组宿主还可以在天然存在的核酸中具有突变和/或删除，使得不产生核酸编码的蛋白质。
如此处所用，“核酸”指核苷酸或多核苷酸序列、及其片段或一部分，和基因组或合成来源的DNA或RNA，可以是双链或代表有义链或反义链的单链。如此处所用，“氨基酸”指肽或蛋白质序列或其一部分。
如此处所用，术语“氧化性酶”指能够催化给定氧化状态的底物转化成比底物更高氧化状态的产物之酶或酶系统。术语“还原性酶”指能够催化给定氧化状态的底物转化成比底物更低氧化状态的产物的酶或酶系统。与六碳糖转化成ASA途径中间体的生物催化有关的氧化性酶，包括D-葡萄糖脱氢酶、D-葡萄糖酸脱氢酶、和2-酮-D-葡萄糖酸脱氢酶，以及L-山梨醇脱氢酶活性、L-山梨糖脱氢酶、和L-山梨醛脱氢酶活性。与ASA途径中间体转化成期望的终产物的生物催化有关的还原性酶，包括2，5-二酮-D-葡萄糖酸还原酶(DKGR)、2-酮还原酶(2-KR)、和5-酮还原酶(5-KR)。这类酶包括宿主酵母天然产生的那些酶和经由重组方法导入的那些酶。
如此处所用，术语“六碳糖酸”特别包括L-半乳糖酸底物，且包括(但不限于)2-酮-L-古洛糖酸、艾杜糖酸、葡萄糖酸、6-磷酸葡萄糖酸、2-酮-D-葡萄糖酸、5-酮-D-葡萄糖酸、2-酮葡萄糖磷酸酯、2，5-二酮-L-古洛糖酸、2，3-二酮-L-古洛糖酸、脱氢抗坏血酸、赤藓糖型抗坏血酸、和D-甘露糖酸。
如此处所用，术语“六碳糖”包括(但不限于)葡萄糖、古洛糖、山梨糖、果糖、艾杜糖、半乳糖、和甘露糖，均可以是D型或L型。
如此处所用，术语“分离(的)”或“纯化(的)”指与其天然相关的至少一种成分分开的核酸或蛋白质或肽。在本发明中，分离核酸可以包括一种包含核酸的载体。如此处所用，用于描述由发酵过程衍生的碳源的“纯化的”，指将该碳源与发酵培养物中与其天然相关的至少一种成分分开。发明详述：
在酵母中生产ASA
本发明涉及在能够利用KLG作为唯一碳源产生ASA的酵母中生产ASA或抗坏血酸立体异构体(如异抗坏血酸)。本发明特别排除在经由L-半乳糖酸内酯氧化酶途径产生ASA的酵母中生产ASA的方法。酵母描述于N.J.W.Kreger-van Rij，“酵母”，第1卷酵母生物学，第2章，A.H.Rose和J.S.Harrison编，1987，Academic Press，伦敦。属于半知酵母类群的酵母的一般特征为不形成子囊孢子和担孢子。ASA对氧敏感，因此，优选能够厌氧生长的酵母，以降低产生的ASA的氧化。本发明还涵盖使用在好氧条件下培养的酵母生产ASA的方法，只要ASA环境中存在还原剂，如二硫苏糖醇、谷胱甘肽，金属螯合剂(如EDTA)，稳定剂(如偏磷酸、氨基酸、乙二醇、糖、草酸、三氯乙酸、8-羟基喹啉(D.W.Bradley，G.Emery，和J.E.Maynard，1973，临床化学学报(Clin.Chim.Acta)4：47-52)。
可以用于本发明的酵母包括(但不限于)此处所列的那些酵母，并由下列保藏号例示：布兰克假丝酵母CBS1898，ATCC18735；弯假丝酵母(C.curvata)CBS570；土生假丝酵母(C.humicola)；C.incommunisATCC22971；萨地假丝酵母(C.salmanticensis)ATCC16042；假丝酵母属的种(C.sp.)ATCC28528，ATCC20473；浅白隐球酵母(Cryptococcus albidus)CBS4192；迪门纳隐球酵母CBS5770；Cr.heveanensis CBS140；枸杞隐球酵母(Cr.kuetzingii)UCD68-196；浅黄隐球酵母CBS953：斯金纳隐球酵母(Cr.skinneri)UCD60-82，CBS5029；地生隐球酵母(Cr.terreus)CBS1895，CBS6293，CCY17-8-5；指甲隐球酵母(Cr.uiguttulatus)CBS1730；罗伦隐球酵母(Cr.laurentii)CCY17-3-2，CCY17-3-6，ATCC32044；新型隐球酵母(Cr.neoformans)ATCC32045；Cr.podzolicus CCY17-20-1；皮状丝孢酵母(Trichosporoncutaneum)UCD54-169，CCY30-5-4；白吉利丝孢酵母(T.beigelii)NRRLY-1490；出芽丝孢酵母(T.pullulans)ATCC10677；出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)DBVA9，A10，A62，A77，A84；碎囊汉逊酵母(Hansenula capsulata)DBV3164，ATCC24204；斯达油脂酵母(Lipomyces starkeyi)UCD51-55，CBS1809；产油油脂酵母(L.lipofer)NRRL Y]1351；Phaffia rhodoayma ATCC24201；胶红酵母(Rhodotorula mucilaginosa)NRC211003；葡萄汁酵母(Saccharomycesuvarum)ATCC9373，ATCC9080；肋状复膜孢酵母(Saccharomycopsisfibuligera)ATCC2082；西方许旺酵母(Schwanniomyces occidentalis)NRC2782，NRC2783；和耶耳球拟酵母(Torulopsis ernobii)ATCC20000。在优选的实施方案中，酵母是半知酵母类群的成员。用于生产ASA方法的半知酵母优选的科是隐球酵母科。隐球酵母科优选的属是假丝酵母属和隐球酵母属。
如实施例所示，当以KLG作为唯一碳源生长时，布兰克假丝酵母和迪门纳隐球酵母能够产生比背景水平高的ASA，休哈塔假丝酵母虽然能够以KLG作为唯一碳源生长，但是不能产生ASA。例示性实施例公开了休哈塔假丝酵母ATCC编号34887、布兰克假丝酵母ATCC编号18735、迪门纳隐球酵母ATCC编号22024、和浅黄隐球酵母ATCC编号32044的用途。本发明涵盖已知酵母物种的突变体、衍生物、或后代，特别是属于隐球酵母科的属的已知物种的突变体，如属于假丝酵母属和隐球酵母属的那些，只要突变体、衍生物、或后代能够利用KLG作为唯一碳源产生ASA。本发明涵盖用于在酵母中生产ASA或ASA立体异构体的方法，其中酵母是天然存在的，即未经基因工程改造，以及其中酵母是重组的，且包含编码与酵母中碳源-KLG转化有关的氧化性和/或还原性酶的异源核酸。在本发明中，碳源(诸如六碳糖酸)可以是加入到酵母培养物中的单独发酵过程的产物，诸如通过Lazarus等人(1991，细菌学杂志(J.Bact.)173：6651-6661)公开的方法或通过Saito等人(1997，应用和环境微生物学63：454-460)公开的方法制备的KLG。衍生自单独发酵过程的碳源，可以在用于生产ASA或ASA立体异构体或者之间进行纯化，或者由发酵过程直接使用。碳源还可以衍生自化学方法。
在本发明的另一个实施方案中，酵母经基因工程改造包含与在酵母中碳源-KLG转化有关的异源氧化性酶或异源还原性酶之一，或二者兼有，由此提供能够将碳源(诸如葡萄糖或其它六碳糖)经由中间体KLG转化成抗坏血酸的单一生物体。重组酵母宿主可以包含多种异源氧化性酶和/或多种异源还原性酶，从而由六碳糖或六碳糖酸产生抗坏血酸。
在一个优选的实施方案中，碳源是葡萄糖，且重组酵母包含编码至少下列一项的异源核酸：(a)葡萄糖脱氢酶(GDH)；(b)葡萄糖酸脱氢酶(GADH)；(c)2-酮-D-葡萄糖酸脱氢酶(2-KDGDH)；和(d)2，5-二-酮-D-葡萄糖酸还原酶(2，5-DGKR)，假定如果酵母没有包含所有(a)-(d)的异源核酸，则酵母包含相应的内源核酸，使得酵母包含(a)-(d)每一项的核酸，并能够将葡萄糖经由中间体KLG转化成ASA。熟练技术人员清楚了解的，涉及碳底物向ASA转化的氧化和还原反应可能需要向酵母培养物中加入辅助因子。例如，1991年7月16日授权的美国专利号5,032,514中描述的2，5-DGKR需要NADPH。酶反应中必需的辅助因子的其它范例包括(但不限于)ATP、NAD+、NADP+、NADH、NADPH和辅酶A。酵母还可以在干扰碳流期望途径的内源氧化性和/或还原性酶中具有删除或突变。
在本发明的另一个实施方案中，碳源是山梨醇，且重组酵母包含编码至少下列一项的异源核酸：(a)D-山梨醇脱氢酶(SLDH)；(b)L-山梨糖脱氢酶；和(c)L-山梨酮(sorbosome)脱氢酶，假定如果酵母没有包含所有(a)-(c)的异源核酸，则酵母包含相应的内源核酸，使得酵母包含(a)-(c)每一项的核酸，并能够将山梨醇经由中间体2KLG转化成ASA。编码氧化性或还原性酶的核酸的来源包括：酶                          引文葡萄糖脱氢酶                Smith等人，1989，生化杂志(Biochem.
                        J.)261：973；Neijssel等人，1989，Antonie
                        Van Leavrnhoek 56(1)：51-61。葡萄糖酸脱氢酶              Matsushita等人，1979，生化杂志(J.
                        Biochem.)85：1173；Kulbe等人，1987，
                        纽约科学院年鉴(Ann.N.Y.Acad.
                        Sci.)506：552。2-酮-D-葡萄糖酸脱氢酶       Stroshane，1977，生物技术和生物工程
                        (Biotechnol.Bioeng.)19(4)：459。2-酮葡萄糖酸还原酶          普通微生物学杂志(J.Gen.Microbiol.)
                        1991，137：1479。2，5-二酮-D-葡萄糖酸还原酶  美国专利号：5,795,761；5,376,544；
                        5,583,025；4,757,012；4,758,514；
                        5,008,193；5,004,690；5,032,514。L-山梨糖脱氢酶；L-山梨酮Saito等人，1997，应用和环境微生物学脱氢酶；和L-山梨醇脱氢酶63：454。重组酵母的构建
可以使用本领域众所周知的技术构建包含由碳源产生ASA必需的核酸的重组酵母。分子生物学技术公开于Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)，第二版，1989，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约州。可以如下文所述由天然宿主分离或者通过化学方法产生编码与ASA产生有关的氧化性酶和还原性酶的基因。例如，如果基因序列是已知的，则可以通过限制性核酸内切酶消化构建合适的基因组文库，并用与期望基因序列互补的探针进行筛选。一旦分离得到序列，可以使用引导扩增方法(诸如聚合酶链式反应，PCR)的标准引物扩增DNA(US4,683,202)，从而获得大量适合于使用适当载体进行转化的核酸。适合于在酵母中克隆、转化、和表达编码与ASA产生有关的氧化性和还原性酶的核酸的多种载体和转化和表达盒，对本领域技术人员是众所周知的。用于获得并使用这类载体的方案，在本领域是众所周知的(Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)，第1、2、3版，冷泉港实验室，冷泉港，纽约州，1989)。
载体或盒通常包含引导核酸转录和翻译的序列、选择标记、和使其能够自主复制或染色体整合的序列。合适的载体包含控制转录起始的基因5’区和控制转录终止的DNA片段3’区。这些控制区可以衍生自酵母的同源或异源基因，只要这些选定的区能够在酵母中行使功能。
能够在酵母中驱动氧化性或还原性酶表达的起始控制区或启动子，对本领域技术人员是已知的。事实上，能够驱动这些基因的任何启动子均适合于本发明，包括(但不限于)CYC1、HIS3、GAL1、GAL10、ADH1、PGK、PHO5、GAPDH、ADC1、TRP1、URA3、LEU2、ENO、TP1。
将编码氧化性或还原性酶的核酸通过起始密码子与选定的表达控制区可操作连接，从而有效表达氧化性或还原性酶。
一旦构建了合适的盒，用它们转化酵母，并对酵母筛选由适当碳源产生ASA的能力。例如，在一个实施方案中，用编码脱氢酶活性或还原酶活性之一(或二者兼有)的核酸转化酵母，并对经转化酵母筛选由六碳糖(诸如葡萄糖)或六碳糖酸(诸如KLG)产生ASA的能力。ASA的检测
检测ASA及ASA立体异构体的方法包括利用2，6-二氯靛酚的氧化还原滴定(Burton等人，1979，分析家协会杂志(J.Assoc.Pub.Analysts)17：105)；阴离子交换高效液相层析(HPLC)(1980，层析杂志(J.Chrom.)196：163)；和电氧化还原方法(Pachia，1976，分析化学(Anal.Chem.)48：364)。还可以采用涉及抗坏血酸氧化酶的酶法。
在本发明中，通过HPLC、此处所用的比色法抗坏血酸氧化酶实验、和GC-质量分光光度法进行ASA检测。熟练技术人员熟知用于这些检测方法的对照。由于KLG和ASA之间存在化学平衡(即KLG包含背景水平的ASA)，为了使用HPLC UV检测抗坏血酸，记录底物KLG的洗脱特性并作为对照。对于抗坏血酸氧化酶实验，进行不含样品和酶的空白对照。对于GCMS分析，分析衍生剂和底物KLG作为对照。
还期望有检测能够由碳源产生ASA的酵母的筛选方法。筛选能够产生ASA的酵母的方法包括下列步骤：获得能够以抗坏血酸或抗坏血酸立体异构体生长的酵母，在适合产生抗坏血酸或抗坏血酸立体异构体的条件下在存在KLG时培养所述酵母，并对所述酵母培养物测试抗坏血酸或抗坏血酸立体异构体的产生。发酵和纯化
培养基和碳底物
将天然存在的酵母或能够利用KLG产生ASA的重组酵母在存在合适碳源时进行大规模发酵，并回收ASA。合适的碳源包括六碳糖或六碳糖酸。此处公开的酵母生长利用的碳源将只受宿主有机体的需要限制。例如，天然存在的酵母可以在存在六碳糖酸(如KLG)时生长，而经基因工程改造包含编码脱氢酶和还原酶之一(或二者兼之)的核酸的重组酵母可以在存在六碳糖(如葡萄糖)时生长。除了适当碳源，发酵培养基必须包含合适的矿物质、盐、辅助因子、缓冲液、和其它成分，这些物质对本领域技术人员是已知的，且适合培养物的生长和ASA的产生。Costamagna等人(1986，加拿大微生物学杂志(Can.J.Microbiology)32：756-758)描述了适用于培养酵母的培养基和培养条件。
可以在好氧或厌氧条件下培养酵母。ASA对氧敏感，因此，厌氧培养产生ASA的酵母将降低产生的ASA的氧化。或者，如果在好氧条件下培养酵母，ASA环境中优选存在还原剂，如二硫苏糖醇、谷胱甘肽，金属螯合剂(如EDTA)，稳定剂(如偏磷酸、氨基酸、乙二醇、糖、草酸、三氯乙酸、8-羟基喹啉。本发明涵盖分批发酵或连续发酵，而生产ASA的方法可在一个或两个发酵罐中进行。例如，如果酵母经基因工程改造包含由六碳糖(诸如葡萄糖)转化成六碳糖酸(诸如KLG)的途径，则ASA生产将以重组酵母作为宿主在一个发酵罐中进行。如果酵母天然存在，且在酵母中由六碳糖酸(如KLG)产生ASA，则ASA生产可能在两个发酵罐中进行，一个如美国专利5,032,514或Saito等人(见上文)所述产生KLG，另一个在酵母中由KLG产生ASA。
典型的分批发酵是密闭系统，其中培养基的组成于发酵开始时设定，且在发酵过程中不再人为改变。由此，在发酵开始时给培养基接种期望的有机体并进行发酵，此后不再向系统中加入任何物质。然而，分批发酵通常指添加碳源是“分批”的，常常尝试控制诸如pH和氧浓度等因素。分批系统的代谢物和生物量组成不断变化，直至发酵停止。在分批培养物中，细胞由静止的延滞期过渡到快速生长的对数期，最终达到生长速率降低或停滞的稳定期。如果不经处理，稳定期的细胞最终将死亡。对数期的细胞通常负责终产物或中间体的大量产生。
标准的分批系统的变化是补料-分批发酵系统，该系统也适合本发明。在典型的分批系统的这种变化中，随发酵过程添加底物。当代谢物抑制倾向于抑制细胞代谢时，当期望限制培养基中底物的量时，可以使用补料-分批系统。在补料-分批系统中测量实际底物浓度是困难的，因此根据诸如pH、溶解氧、和废气(诸如CO2)分压等可测因素进行估计。分批和补料-分批发酵是常用的，在本领域是众所周知的，且可以在Brock(见上文)中找到范例。
本发明还涵盖适用于连续发酵法的方法。连续发酵是开放系统，其中向生物反应器中连续添加精细发酵培养基，同时除去等量的条件培养基进行处理。连续发酵通常将培养物维持在持续高密度，其中细胞主要处于对数生长期。
连续发酵能够允许调整影响细胞生长或终产物浓度的一种因素或任何数目的因素。例如，一种方法将有限的营养物(诸如碳源或氮水平)维持在固定速率，而允许调整所有其它参数。在其它系统中，当细胞浓度(通过培养基混浊度测量)保持恒定时，能够连续改变影响生长的大量因素。连续系统力争维持稳定状态的生长条件，由此必须在发酵中将由于培养基消耗造成的细胞损失与细胞生长速率平衡。用于调整连续培养过程的营养和生长速率的方法，以及用于使产物形成速率最大化的技术，在工业微生物学领域是众所周知的，且Brock(见上文)详述了多种方法。本发明的方法可以使用分批、补料-分批、或连续过程进行。发酵后，可以通过多种方法由发酵液回收产生的ASA，包括离子交换树脂、吸收或离子迟滞树脂、活性炭、浓缩-结晶等等。
本发明的各个方面将由下列特定实施例进一步描述，这些实施例并非意欲限制本发明的范围。
实施例
下列关于材料和方法的描述应用于实施例1-3。材料和方法
培养条件：
将酵母在6.7g/L Difco酵母氮基(YNB)中进行培养，最初以2％葡萄糖作为碳源，然后以0.5％(w/v)L-ASA作为唯一碳源，再然后以20.8mM2-KLG或L-艾杜糖酸为碳源。将酵母在装有50ml YNB培养基(pH5.5)的摇瓶中于22℃和250rpm培养48小时。HPLC：
使用配备了保护柱的Dionex IonPac ASl0分析柱，对抗坏血酸和其它酮糖酸进行HPLC。为了在底物KLG和产物抗坏血酸盐之间获得足够的滞留时间分离(＞5min)，采用40mM醋酸盐(pH4.86)洗脱液的等度洗脱。使用UV监测仪在波长245-270nm之间检测抗坏血酸(＞100ppb)，使用折射率监测仪检测KLG。用于研究的HPLC系统是HP-Alliance的机器，配备了用于峰面积积分计算的Millenium软件包。绘制用于抗坏血酸定量的校准曲线(100ppb-100ppm)。GC-MS：
根据发表的步骤(J.C.Deutsch和J.Fred Kolhouse，1993，分析化学(Anal.Chem.)65：321-326)，使用GC-MS进行抗坏血酸的鉴定。在HP设备5890上使用15m×0.25mm Supelco SPB-1融合硅毛细管层析柱进行GC工作。根据上述文献中报导的方法，使用N-甲基-N-(叔-丁基二甲基硅烷基)三氟乙酰胺和乙腈依上述方法进行抗坏血酸的衍生。在我们的实验条件下获得的标准抗坏血酸滞留时间是8.75分钟。在由标准和未知样品获得的波谱中检测m/z 575、531、443、和343的特征性质量片段化模式。
抗坏血酸氧化酶实验：
使用购自Boehringer Mannheim的L-抗坏血酸测定试剂盒(产品目录号409677)，根据随试剂盒提供的实验方案，进行抗坏血酸氧化酶实验。试剂盒包含抗坏血酸氧化酶和用于检测/定量(578nm)的MTT和PMS的偶联染料系统(H.O.Beutler和G.Beinstingl，1984，酶分析方法(H.U.Bergmeyer编)第3版，第7卷，第376-385页，Verlag Chemie，Weinheim，Deerfield，Beach/Florida，Basel)。
对照和空白：
0.5％2-KLG溶液含～2ppm抗坏血酸(pH6.1)。在全细胞KLG-ASA转化实验过程中，在进行含酵母反应混和物的每次实验时，都进行只含缓冲液的对照反应(含KLG)。在另一个对照中，加热杀死酵母细胞，然后与KLG温育，以确认在这些条件下未检测到KLG向ASA转化。
由于抗坏血酸氧化酶对抗坏血酸的降解作用导致层析峰的消失，通过样品与抗坏血酸氧化酶的反应，进一步确认了HPLC分析检测到的抗坏血酸峰。
实施例1
此实施例说明布兰克假丝酵母能够以KLG或艾杜糖酸作为生长的唯一碳源。此实施例还显示，当以KLG作为唯一碳源生长时，布兰克假丝酵母产生抗坏血酸。
将具有ATCC编号18735的布兰克假丝酵母如材料和方法部分所述进行培养。如下文所述进行了全细胞KLG-ASA反应。将500ml 48小时培养物于4℃以9000rpm离心，收集了大约3g湿细胞。将细胞用冷的含0.5mMEDTA的200mM磷酸盐缓冲液(pH6.1)进行清洗。然后将细胞重悬于10ml含0.5％KLG的相同缓冲液。取3ml此反应混和物，于微波炉中煮沸2分钟。然后将两种反应混和物都置于30℃摇床中进行全细胞ASA产生。于时间零点取1.5ml样品，离心除去细胞沉淀，并保存于-20℃。将上清液用0.2μm滤膜进行过滤，进行HPLC分析，然后如上所述进行抗坏血酸氧化酶和GC-MS分析。于活细胞反应的2、4、和20小时时间点和热杀死反应混和物的20小时时间点，进行相同取样和检查(表1)。热杀死样品不具有ASA的背景水平，且不产生ASA。
于20小时取样后，通过加入柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液将反应混和物的pH降低3个pH单位至pH3.15。于21小时取样并分析，以标定此条件变化的时间零点。将反应进行过夜。又过了24小时后，取最终样品。在两种pH值进行平行KLG空白对照(无细胞)反应，以观察由KLG产生ASA的背景(见表1和图3)。
如表l和图3所示，当布兰克假丝酵母全细胞培养物以KLG作为唯一底物生长时，在反应培养基中确认了ASA的存在。反应混和物中存在的ASA的浓度比背景水平高3倍。通过将反应混和物的pH降至pH3，观察到ASA水平又增加了3倍。降低pH对ASA具有稳定作用，以及使得化学热力学倾向于产生ASA。
实施例2
此实施例说明迪门纳隐球酵母能够以KLG或艾杜糖酸作为生长的唯一碳源。此实施例还显示，当以KLG作为唯一碳源生长时，迪门纳隐球酵母产生抗坏血酸。
将具有ATCC编号22024的迪门纳隐球酵母如材料和方法部分所述进行培养。如实施例1所述进行了全细胞KLG-ASA反应。
如表1和图3所示，当迪门纳隐球酵母全细胞培养物以KLG作为唯一底物生长时，在反应培养基中确认了ASA的存在。反应混和物中存在的ASA的浓度比背景水平高2倍。
实施例3
此实施例说明休哈塔假丝酵母能够以KLG作为唯一碳源，但是不能够产生ASA。如实施例1所述进行了全细胞KLG-ASA反应。如图1所示，休哈塔假丝酵母不能够在这些条件下由KLG产生ASA。
                                  表1
    HPLC结果(AU/面积)和样品中的ASA浓度(mg/L)
        AU/面积于266nm     mg/L抗坏血酸浓度
样品 时间0小时 时间4小时 时间20小时 时间0小时 时间4小时 时间20小时
2KLG缓冲液空白 259831 280706 264840 1.9 2.1 1.9
布兰克假丝酵母 314059 240613 905162 2.3 1.8 6.6
休哈塔假丝酵母 204867 205323 270663 1.5 1.5 1.9
迪门纳隐球酵母 224203 223112 522325 1.6 1.6 3.8

Claims (40)

1.一种在酵母中生产抗坏血酸或抗坏血酸立体异构体的方法，包括下列步骤：
a)获得能够利用KLG产生抗坏血酸或抗坏血酸立体异构体的酵母；并
b)在适合产生抗坏血酸或抗坏血酸立体异构体的条件下在存在碳源时培养酵母。
2.权利要求1的方法，还包括回收所述抗坏血酸的步骤。
3.权利要求1的方法，其中所述碳源是六碳糖酸。
4.权利要求3的方法，其中所述六碳糖酸包括2-酮-L-古洛糖酸、艾杜糖酸、葡萄糖酸、6磷酸葡糖酸、2-酮-D-葡萄糖酸、5-酮-D-葡萄糖酸、2-酮葡萄糖酸-6-磷酸、2，5-二酮-L-葡萄糖酸、2，3-L-二酮-古洛糖酸、脱氢抗坏血酸、赤藓糖型抗坏血酸、和D-甘露糖酸。
5.权利要求1的方法，其中所述碳源是六碳糖，且所述酵母包含下列二者之一或二者兼有：a)编码与在所述酵母中产生抗坏血酸或抗坏血酸立体异构体有关的氧化性酶的异源核酸，和b)编码与在所述酵母中产生抗坏血酸或抗坏血酸立体异构体有关的还原性酶的异源核酸。
6.权利要求5的方法，其中所述六碳糖包括葡萄糖、古洛糖、艾杜糖、半乳糖、甘露糖、山梨糖和果糖。
7.权利要求5的方法，其中所述氧化性酶具有脱氢酶活性。
8.权利要求7的方法，其中所述脱氢酶包括葡萄糖脱氢酶活性、葡萄糖酸脱氢酶活性、2-酮-D-葡萄糖酸脱氢酶活性、半乳糖脱氢酶活性、L-山梨糖活性、D-山梨醇脱氢酶活性、L-山梨酮脱氢酶活性、L-艾杜糖酸氧化酶、和L-古洛糖酸氧化酶。
9.权利要求5的方法，其中所述还原性酶是还原酶活性。
10.权利要求9的方法，其中所述还原酶活性包括2，5-DGK还原酶活性、2，5-DKG还原酶活性、2，3-DKG还原酶、5-酮还原酶、2-酮还原酶、和2-酮古洛糖酸还原酶。
11.权利要求1的方法，其中所述碳源是葡萄糖，且酵母包含编码至少下列一项的异源核酸：(a)葡萄糖脱氢酶(GDH)；(b)葡萄糖酸脱氢酶(GADH)；(c)2-酮-D-葡萄糖酸脱氢酶(2-KDGDH)；和(d)2，5-二酮-D-葡萄糖酸还原酶(2，5-DGKR)，假定如果酵母没有包含所有(a)-(d)的异源核酸，则酵母包含相应的内源核酸，使得酵母包含(a)-(d)每一项的核酸，并能够将葡萄糖经由中间体KLG转化成ASA。
12.权利要求1的方法，其中酵母是半知酵母类群的成员。
13.权利要求12的方法，其中酵母是隐球酵母科的成员。
14.权利要求13的方法，其中酵母包括假丝酵母属和隐球酵母属。
15.权利要求14的方法，其中酵母是布兰克假丝酵母。
16.权利要求14的方法，其中酵母是迪门纳隐球酵母。
17.权利要求1的方法，其中所述酵母是布兰克假丝酵母或迪门纳隐球酵母，且所述碳源包括葡萄糖，其中所述酵母包含异源葡萄糖脱氢酶活性和2，5-DKG还原酶活性。
18.权利要求1的方法，其中所述酵母是布兰克假丝酵母或迪门纳隐球酵母，且所述碳源包括D-山梨醇、L-山梨糖、或L-山梨酮，其中所述酵母包括L-山梨糖活性、D-山梨醇脱氢酶活性、L-山梨酮脱氢酶活性和半乳糖脱氢酶活性中的至少一种。
19.权利要求1的方法，其中所述抗坏血酸立体异构体包括D-抗坏血酸、D-阿拉伯糖型抗坏血酸、和L-阿拉伯糖型抗坏血酸。
20.一种包含下列二者之一或二者兼有、能够利用KLG产生抗坏血酸或抗坏血酸立体异构体的重组酵母：a)编码与在所述酵母中产生抗坏血酸或抗坏血酸立体异构体有关的氧化性酶的异源核酸，和b)编码与在所述酵母中产生抗坏血酸或抗坏血酸立体异构体有关的还原性酶的异源核酸。
21.权利要求20的酵母，其中所述氧化性酶是脱氢酶活性。
22.权利要求21的酵母，其中所述脱氢酶包括葡萄糖脱氢酶活性、葡萄糖酸脱氢酶活性、2-酮-D-葡萄糖酸脱氢酶活性、半乳糖脱氢酶活性、L-山梨糖脱氢酶活性、D-山梨醇脱氢酶活性、L-山梨酮脱氢酶活性、L-艾杜糖酸氧化酶、和L-古洛糖酸氧化酶。
23.权利要求20的酵母，其中所述还原性酶是还原酶活性。
24.权利要求23的酵母，其中所述还原酶活性包括2，5-DKG还原酶活性、2，5-DKG还原酶活性、2，3-DKG还原酶、5-酮还原酶、2-酮还原酶、和2-酮古洛糖酸还原酶。
25.权利要求20的酵母，其中酵母是半知酵母类群的成员。
26.权利要求25的方法，其中酵母是隐球酵母科的成员。
27.权利要求26的方法，其中酵母包括假丝酵母属和隐球酵母属。
28.权利要求27的方法，其中酵母是布兰克假丝酵母。
29.权利要求27的方法，其中酵母是迪门纳隐球酵母。
30.权利要求20的酵母，其中所述酵母是布兰克假丝酵母或迪门纳隐球酵母，且所述碳源包括葡萄糖，其中所述酵母包含异源葡萄糖脱氢酶活性和2，5-DKG还原酶活性。
31.权利要求20的酵母，其中所述酵母是布兰克假丝酵母或迪门纳隐球酵母，且所述碳源包括D-山梨醇、L-山梨糖、或L-山梨酮，其中所述酵母包含L-山梨糖活性、D-山梨醇脱氢酶活性、L-山梨酮脱氢酶活性、和半乳糖脱氢酶活性中的至少一种。
32.一种产生能够利用六碳糖产生ASA或ASA立体异构体的重组酵母的方法，包括下列步骤：
a)获得能够利用KLG产生ASA或ASA立体异构体的酵母；并
b)导入下列二者之一或二者兼有：a)编码与在所述酵母中产生抗坏血酸或抗坏血酸立体异构体有关的氧化性酶的异源核酸，和b)编码与在所述酵母中产生抗坏血酸或抗坏血酸立体异构体有关的还原性酶的异源核酸。
33.权利要求32的方法，其中所述酵母是半知酵母类群的成员。
34.权利要求33的方法，其中酵母是隐球酵母科的成员。
35.权利要求34的方法，其中酵母包括假丝酵母属和隐球酵母属。
36.权利要求35的方法，其中酵母是布兰克假丝酵母。
37.权利要求35的方法，其中酵母是迪门纳隐球酵母。
38.权利要求32的酵母，其中所述酵母是布兰克假丝酵母或迪门纳隐球酵母，且所述碳源包括葡萄糖，其中所述酵母包含异源葡萄糖脱氢酶活性和2，5-DKG还原酶活性。
39.权利要求32的酵母，其中所述酵母是布兰克假丝酵母或迪门纳隐球酵母，且所述碳源包括D-山梨醇、L-山梨糖、或L-山梨酮，其中所述酵母包含L-山梨糖活性、D-山梨醇脱氢酶活性、L-山梨酮脱氢酶活性、和半乳糖脱氢酶活性中的至少一种。
40.一种筛选能够产生ASA的酵母的方法，包括下列步骤：获得能够以抗坏血酸或抗坏血酸立体异构体生长的酵母，在适合产生抗坏血酸或抗坏血酸立体异构体的条件下在存在KLG时培养所述酵母；并对所述酵母培养物测试抗坏血酸或抗坏血酸立体异构体的产生。
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