DE3686041T2

DE3686041T2 - Herstellung eines vitamin-c-vorlaeufers mittels genetisch modifizierter organismen.

Info

Publication number: DE3686041T2
Application number: DE8686905045T
Authority: DE
Inventors: June Grindley; Kimber Hardy; A Payton; De Pol Hendrick Van
Original assignee: Biogen Inc
Current assignee: Danisco US Inc
Priority date: 1985-08-02
Filing date: 1986-08-01
Publication date: 1993-01-28
Anticipated expiration: 2006-08-02
Also published as: JPH0817706B2; JP2577876B2; AU594080B2; JPH0838185A; ATE78297T1; DK169487A; EP0231354B1; JP2526021B2; WO1987000863A1; JPH0838189A; DK169487D0; JP2577877B2; DE3686041D1; EP0231354A1; JPS63500493A; DK175120B1; JPH06319564A; EP0231354A4; AU6221086A

Description

Gebiet der Erfindung

Diese Erfindung betrifft DNA-Sequenzen, rekombinante DNA- Moleküle, Organismen, die solche Sequenzen und Moleküle enthalten, die Expression von bestimmten Enzymen durch solche Organismen und die Produktion eines Vitamin-C-Vorläufers durch Fermentation unter Verwendung solcher Organismen und Enzyme. Insbesondere betrifft diese Erfindung ein Expressionsvehikel und genetisch veränderte, durch dieses Vehikel transformierte Organismen, die Enzyme exprimieren, welche zur Umwandlung von Glucose oder einer anderen Kohlenstoffquelle durch Fermentation zu 2-Keto-L-Gluconsäure (2-KLG), einem chemischen Vorläufer von Vitamin C (Ascorbinsäure), verwendet werden.
Es gibt mehrere Verfahren zur Herstellung von Vitamin C. Ein Verfahren umfaßt mehrere chemische Syntheseschritte und einen Fermentationsschritt. Mit wenigen Worten beschrieben umfassen die Schritte Hydrierung von Glucose zu Sorbit, Fermentation von Sorbit zu Sorbose unter Verwendung von Acetobacter suboxydans, Acetonisierung von Sorbose, Oxidation von Diacetonsorbose zu 2-KLG, Veresterung von 2-KLG und Umwandlung des Esters zu Ascorbinsäure. Dieses Verfahren ist komplex und erfordert eine relativ hohe Kapitalinvestition für die technische Anlage.

Technischer Hintergrund

Ein anderes Verfahren umfaßt zwei Fermentationsschritte. Das Verfahren beginnt mit der Fermentation von Glucose zu 2,5- Diketo-D-gluconat (2,5-DKG) durch Erwinia sp.; darauf folgt Fermentation von 2,5-DKG zu 2-KLG durch Corynebacterium sp.; Veresterung von 2-KLG; und Umwandlung des Esters zu Ascorbinsäure. Eine Untersuchung hat gezeigt, daß D-Gluconat und 2- Keto-D-gluconat (2-KDG) durch Erwinia sp. nacheinander aus Glucose gebildet werden, bevor 2,5-DKG im ersten Fermentationsschritt hergestellt wird. Vgl. T. Sonoyama et al., "Production of 2-keto-L-gulonic acid from D-glucose by Two-Stage Fermentation", App. and Envir. Microbiol., 43, 1064-69 (1982). Dieses zweistufige Fermentationsverfahren ist, obwohl es etwas niedrigere Kapitalkosten aufweist als das Acetobacter-Verfahren, in der Durchführung immer noch komplex und teuer.
Auf noch ein anderes Verfahren zur Umwandlung von Glucose zu 2-KLG wird in der Europäischen Patentanmeldung 132 308 verwiesen. Diese Anmeldung betrifft die Umwandlung von Glucose zu 2-KLG in einem einstufigen Fermentationsverfahren. Zuerst betrifft sie Corynebacterium sp. ATCC 31090 als Quelle einer DNA-Sequenz, die eine bestimmte 2,5-DKG-Reduktase codiert (ein Enzym, das angeblich die Fermentation von 2,5-DKG zu 2-KLG katalysiert). Es wird berichtet, daß diese DNA-Sequenz mit ihrer eigenen oder einer synthetischen Ribosomenbindungsstelle sodann "stromabwärts" eines E. coli-trp- oder -tac-Promotors oder des pACYC184-CAT-Promotors in einen Expressionsvektor eingefügt wird. Es wird außerdem berichtet, daß der Vektor ein Gen, das Tetracyclin-Resistenz oder einen anderen selektierbaren Marker codiert, und einen von den Plasmiden ColE1, 15A oder RSF 1010 abgeleiteten Replikationsursprung enthält. Sodann wird berichtet, daß eine Wirtszelle, Erwinia herbicola (ATCC 21998), mit dem Vektor transformiert wird. Es wird berichtet, daß diese transformierte Zelle bei der Fermentation aus Glucose 2-KLG in einem Schritt herstellt. Die Umwandlung von Glucose zu 2-KLG in diesem Verfahren ist jedoch nicht ganz zufriedenstellend, da die Ausbeute von 2-KLG sehr niedrig und die Fermentationszeit zum Erhalt dieser niedrigen Ausbeute zu lange ist.
Demgemäß ist ein einziger Organismus, der dazu in der Lage ist, eine Kohlenstoffquelle, wie z.B. Glucose, mit annehmbaren Geschwindigkeiten und in einem einzigen Fermentationsschritt zu 2-KLG umzuwandeln, immer noch ein Ziel, das bisher nicht erreicht worden ist.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung löst das Problem, einen einzigen Organismus zu finden, der in der Lage ist, Glucose oder eine andere Kohlenstoffquelle rasch und mit hoher Ausbeute in 2-KLG umzuwandeln. In einer Ausführungsform stellt diese Erfindung ein Expressionsvehikel bereit, das in der Lage ist, einen Wirt so zu transformieren, daß er alle zur Umwandlung von Glucose oder einer anderen Kohlenstoffquelle zu 2-KLG erforderlichen Fermentationsschritte in einer einzigen Fermentation mit annehmbaren Umwandlungsgeschwindigkeiten ohne Schritte zur Gewinnung eines Zwischenproduktes oder zur Reinigung eines Zwischenproduktes durchführt. Das bei Durchführung der vorliegenden Erfindung resultierende 2-KLG kann sodann wie in den vorstehend beschriebenen üblichen Verfahren verestert und zu Ascorbinsäure (Vitamin C) umgewandelt werden.
Im Gegensatz zum erfindungsgemäßen Verfahren erfordern die bekannten kommerziellen Fermentationsverfahren zur Umwandlung von Glucose zu 2-KLG zwei verschiedene Organismen, z.B. Stämme von Erwinia und Corynebacterium, um Glucose zu 2-KLG umzuwandeln.
Ein Vorteil der vorliegenden Erfindung besteht darin, daß ein einziger Stamm eines genetisch modifizierten Organismus signifikante Ausbeuten von 2-KLG direkt aus Glucose in einer einzigen Fermentation erreicht. Die Fähigkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens, einen einzigen Fermentationsschritt einzusetzen, ergibt ein Verfahren, das relativ einfacher ist als das bekannte kommerzielle Verfahren, so daß zur Herstellung von Vitamin C aus Glucose weniger technische Ausstattung und weniger Energie nötig ist.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung einer neuartigen 2,5-DKG-Reduktase und eines neuartigen transformierten Organismus, die denjenigen in der Europäischen Patentanmeldung 132 308 beschriebenen überlegen sind, demgemäß sind die erfindungsgemäßen Verfahren und Produkte gegenüber den Verfahren und Produkten der Europäischen Patentanmeldung 132 308 unerwarteterweise verbessert und patentierbar.
Noch weitere Aufgaben und Aspekte der Erfindung werden aus der Beschreibung deutlich.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Figur 1 beschreibt einen Teil der Aminosäuresequenz vom N-Terminus der erfindungsgemäßen 2,5-DKG-Reduktase.
Figur 2 beschreibt einen Teil der Aminosäuresequenz eines Bromcyan-Fragments mit einem Molekulargewicht von 14 000 D der erfindungsgemäßen 2, 5-DKG-Reduktase.
Die Figuren 3 a bis e stellen die Sequenzen von mehreren Nucleotidsonden dar, die zur Lokalisierung mittels Hybridisierung von Teilen des Corynebacterium-Genoms, die das erfindungsgemäße 2,5-DKG-Reduktase-Gen enthalten, verwendet werden; und
Figur 4 zeigt die DNA-Sequenz des erfindungsgemäßen 2,5- DKG-Reduktase-Gens und die entsprechende Aminosäuresequenz der erfindungsgemäßen 2,5-DKG-Reduktase.
Figur 5 zeigt die Konstruktion von Plasmid pPLred332 aus den Plasmiden 210* und pcBR13. In Figur 5 haben die Symbole die folgende Bedeutung: PL, PL-Promotor; S-D, Shine-Dalgarno- Sequenz; ori, Replikationsursprung; Lac, lac-Promotor; amp-r, Ampicillin-Resistenz-Gen.

Der beste Weg zur Ausführung der Erfindung

Die nachfolgende ausführliche Beschreibung wird zum besseren Verständnis der vorliegenden Erfindung bereitgestellt. In dieser Beschreibung werden einige der nachstehenden Begriffe verwendet:

Nucleotid

- Eine monomere DNA- oder RNA-Einheit, die aus einem Zuckerteil (Pentose), einem Phosphat und einer stickstoffhaltigen heterocyclischen Base besteht. Die Base ist über das glykosidische Kohlenstoffatom (1'-Kohlenstoffatom der Pentose) an den Zuckerteil gebunden, diese Kombination von Base und Zucker wird ein Nucleosid genannt. Die Base kennzeichnet das Nucleotid. Die vier DNA-Basen sind Adenin ("A"), Guanin ("G"), Cytosin ("C") und Thymin ("T"). Die vier RNA-Basen sind A, G, C und Uracil ("U"). Bei der DNA bedeutet "P" eines der Purine (A oder G), "Q" eines der Pyrimidine (C oder T) und "N" eine der vier Basen (A, G, C oder T). Bei der RNA haben "P", "Q" und "N" jeweils dieselbe Bedeutung mit der Ausnahme, daß "U" anstelle von "T" steht.

DNA-Sequenz

- Eine lineare Reihe von Desoxynucleotiden, die untereinander durch Phosphodiesterbindungen zwischen den 3'- und 5'-Kohlenstoffatomen der angrenzenden Pentosen verbunden sind.

Codon

- Eine aus drei Nucleotiden bestehende DNA-Sequenz (ein Triplett), die über ihre mRNA eine Aminosäure, ein Translations-Startsignal oder ein Translations-Terminationssignal codiert. Beispielsweise codieren die Nucleotidtripletts TTA, TTG, CTT, CTC, CTA und CTG die Aminosäure Leucin ("Leu"); TAG, TAA und TGA sind Translations-Stoppsignale; und ATG ist ein Translations-Startsignal, das auch für Methionin codiert.

Leserahmen

- Die Anordnung von Codons während der Translation von mRNA in Aminosäuresequenzen. Während der Translation muß der richtige Leserahmen beibehalten werden. Die DNA- Sequenz GCTGGTTGTAAG kann beispielsweise in drei Leserahmen oder Phasen exprimiert werden, von denen jede(r) eine unterschiedliche Aminosäuresequenz erzeugt:

Polypeptid

- Eine lineare Anordnung von Aminosäuren, die untereinander durch Peptidbindungen zwischen den α-Amino- und Carboxyl-Gruppen der benachbarten Aminosäuren verbunden sind. Fachleute werden wissen, daß die Verwendung des Begriffes "Polypeptid" in dieser Beschreibung den Begriff "Protein" umfaßt.

Genom

- Die gesamte DNA einer Zelle oder eines Virus. Es umfaßt u.a. die die Polypeptide der Zelle codierende DNA sowie Operator, Promotor und Ribosomen-Bindungs- und Wechselwirkungs-Sequenzen, umfassend Sequenzen, wie z.B. die Shine-Dalgarno-Sequenzen, für jede der codierenden Sequenzen.

Gen

- Eine DNA-Sequenz, die durch ihre Matrize oder messenger-RNA ("mRNA") eine Aminosäuresequenz codiert, die für ein spezifisches Polypeptid charakteristisch ist.

Expression

- Verfahren, das von einem Gen durchlaufen wird, um ein Polypeptid zu produzieren. Es umfaßt die Transcription der DNA-Sequenz in eine mRNA-Sequenz und die Translation der mRNA-Sequenz in ein Polypeptid.

Plasmid

- Eine nicht-chromosomale doppelsträngige DNA-Sequenz, die ein intaktes "Replicon" umfaßt, so daß das Plasmid in einer Wirtszelle repliziert wird. Wenn das Plasmid in einen einzelligen Organismus eingebracht wird, können die Kennzeichen dieses Organismus als Folge der Plasmid-DNA verändert oder transformiert werden. Beispielsweise transformiert ein Plasmid, das ein Gen für Tetracyclin-Resistenz (Tet ) trägt, eine vorher gegen Tetracyclin empfindliche Zelle zu einer Zelle, die dagegen resistent ist. Eine durch ein Plasmid transformierte Zelle wird eine "Transformante" genannt.

Phage oder Bakteriophage

- Ein bakterielles Virus. Viele Phagen bestehen aus DNA-Sequenzen, die in Proteinhüllen oder -Mäntel ("Kapsid") eingekapselt sind.

Clonierunasvehikel

- Ein Plasmid, eine Phagen-DNA oder andere DNA-Sequenz, die in der Lage ist, sich in einer Wirtszelle zu replizieren. Ein Clonierungsvehikel wird durch eine oder eine kleine Zahl von Endonuclease-Erkennungsstellen charakterisiert, an denen solche DNA-Sequenzen in bestimmbarer Art und Weise gespalten werden können, ohne daß dabei eine wesentliche biologische Funktion der DNA, z.B. Replikation, Herstellung von Hüllproteinen, oder Promotor oder Bindungsstellen verlorengehen. Ein Clonierungsvehikel enthält üblicherweise einen Marker, der für die Verwendung zur Identifizierung von transformierten Zellen geeignet ist, z.B. Tetracyclin-Resistenz oder Ampicillin-Resistenz. Ein Clonierungsvehikel wird häufig Vektor genannt.

Clonierung

- Verfahren zum Erhalt einer Population von Organismen oder DNA-Sequenzen, die von einem solchen Organismus oder einer solchen Sequenz durch asexuelle Vermehrung abgeleitet wird.

Rekombinantes DNA-Molekül oder Hybrid-DNA

- Ein Molekül, das DNA-Segmente aus verschiedenen Genomen enthält, die außerhalb lebender Zellen Ende-zu-Ende miteinander verbunden wurden, und das in lebenden Zellen erhalten werden kann.

Espressionskontrollsequenz

- Eine Nucleotidsequenz, die die Expression von Genen kontrolliert und reguliert, wenn sie mit solchen Genen operativ verbunden ist. Sie umfasst das lac- System, das β-Lactamase-System, das trp-System, das tac- System, das trc-System, die Haupt-Operator- und -Promotorbereiche des λ-Phagen, den Kontrollbereich des fd-Hüllproteins, die frühen und späten Promotoren von SV40, von Polyoma- Virus und Adenovirus abgeleitete Promotoren, Metallothionein-Promotoren, Promotor für 3-Phosphoglycerat-Kinase oder andere glykolytische Enzyme, die Promotoren der sauren Phosphatase, z.B. Pho5, die Promotoren der Hefe-α-Paarungsfaktoren und andere Sequenzen, von denen bekannt ist, daß sie die Expression von Genen von prokaryotischen oder eukaryotischen Zellen und deren Viren oder Kombinationen davon kontrollieren. Bei Säugerzellen kann das Gen mit einem eukaryotischen Promotor, wie z.B. dem für die frühe Region von SV40, der an das Dihydrofolat-Reduktase codierende Gen gekoppelt ist, verbunden und in Ovarzellen des Chinesischen Hamsters selektiv amplifiziert werden, wodurch eine Zellinie hergestellt wird, die viele Kopien von aktiv transcribierten eukaryotischen Genen enthält.
In einer Ausführungsform betrifft diese Erfindung rekombinante DNA-Moleküle, die von Corynebacterium sp. SHS 752001 abgeleitet wurden und durch eine DNA-Sequenz gekennzeichnet sind, die die erfindungsgemäße 2,5-DKG-Reduktase codiert. In einer anderen Ausführungsform betrifft diese Erfindung einen durch ein solches rekombinantes DNA-Molekül transformierten Wirt, vorzugsweise Erwinia citreus.
Die erfindungsgemäßen rekombinanten DNA-Moleküle sind gekennzeichnet durch eine DNA-Sequenz, die die erfindungsgemäße 2,5-DKG-Reduktase codiert, und eine Expressionskontrollsequenz, die im rekombinanten DNA-Molekül mit dieser DNA-Sequenz funktionell verbunden ist. In den erfindungsgemäßen rekombinanten DNA-Molekülen können viele verschiedene Sequenzen zur Expressionskontrolle verwendet werden. Diese umfassen das lac-System, das β-Lactamase-System, das trp-System, das tac-System, das trc-System, die Haupt-Operator- und -Promotorbereiche des λ-Phagen, den Kontrollbereich des fd- Hüllproteins, die frühen und späten Promotoren von SV40, von Polyomavirus und Adenovirus abgeleitete Promotoren, Metallothionin-Promotoren, Promotor für 3-Phosphoglycerat-Kinase und andere glykolytische Enzyme, die Promotoren der sauren Phosphatase, z.B. Pho5, die Promotoren der Hefe-α-Paarungsfaktoren, Neomycin-Phosphotransferase-Promotor und andere Sequenzen, von denen bekannt ist, daß sie die Expression von Genen von prokaryotischen oder eukaryotischen Zellen und ihren Viren oder Kombinationen davon kontrollieren. Bei Säugerzellen kann das Gen mit einem eukaryotischen Promotor, wie z.B. dem für die frühe Region von SV40, der an das Dihydrofolat-Reduktase codierende Gen gekoppelt ist, verbunden und in Ovarzellen des Chinesischen Hamsters selektiv amplifiziert werden, wodurch eine Zellinie hergestellt wird, die viele Kopien davon enthält. Die bevorzugte erfindungsgemäße Expressionskontrollsequenz wird von der lac-Sequenz von pUC8 abgeleitet.
Außerdem können die erfindungsgemäßen rekombinanten DNA- Moleküle DNA-Sequenzen aus vielen verschiedenen Plasmiden und Phagen umfassen, die ihre Replikation im gewählten Wirt ermöglichen. Vorzugsweise umfassen sie außerdem einen Selektionsmarker, z.B. eine Arzneistoff-Resistenz codierende DNA- Sequenz. Solche Plasmid- und Phagen-Sequenzen können beispielsweise aus Segmenten von chromosomalen, nichtchromosomalen und synthetischen DNA-Sequenzen abgeleitet werden, wie z.B. verschiedene bekannte Derivate von SV40 und bekannte bakterielle Plasmide, z.B. Plasmide aus E. coli, umfassend col E1, pCR1, pBR322, pMB9 und ihre Derivate, Plasmide mit größerem Wirtsbereich, z.B. RP4, Phagen-DNAs, z.B. zahlreiche Derivate des λ-Phagen, z.B. NM989, und anderer DNA-Phagen, z.B. M13 und filamentöser einzelsträngiger DNA-Phagen, und Vektoren, die aus Kombinationen von Plasmiden und Phagen-DNAs abgeleitet wurden, wie z.B. Plasmide, modifiziert zum Einsatz von Phagen-DNA oder anderer Expressionskontrollsequenzen, oder Hefeplasmide, wie z.B. das 2 u-Plasmid oder Derivate davon.
Es sollte auf jeden Fall so verstanden werden, daß nicht alle Vektoren und Expressionskontrollsequenzen in gleicher Weise funktionieren, um die erfindungsgemäßen, modifizierten DNA-Sequenzen zu exprimieren und die neue erfindungsgemäße 2,5-DKG-Reduktase herzustellen. Auch wird nicht jeder Wirt mit demselben Expressionssystem gleich gut funktionieren. Ein Fachmann kann jedoch unter diesen Vektoren, Expressionskontrollsequenzen und Wirten eine Auswahl treffen, ohne daß übermäßiges Experimentieren nötig ist und ohne daß er den Umfang dieser Erfindung verläßt. Beim Auswählen eines Vektors muß beispielsweise der Wirt berücksichtigt werden, denn der Vektor muß sich darin replizieren. Außerdem sollten die Kopienzahl des Vektors, die Fähigkeit, diese Kopienzahl zu kontrollieren, und die Expression von anderen durch den Vektor codierten Proteinen, wie z.B. Antibiotika-Markern, berücksichtigt werden.
Auch bei der Auswahl einer Expressionskontrollsequenz sollten viele verschiedene Faktoren berücksichtigt werden. Diese umfassen beispielsweise die relative Beständigkeit des Systems, dessen Kontrollierbarkeit und dessen Kompatibilität mit der die erfindungsgemäße 2,5-DKG-Reduktase codierenden DNA-Sequenz, insbesondere hinsichtlich möglicher sekundärer Strukturen.
Die DNA-Sequenz für die erfindungsgemäße 2,5-DKG-Reduktase kann verwendet werden, um diese Reduktase in vielen verschiedenen Wirten herzustellen, z.B. in Bakterien, wie in Stämmen von E. coli, z.B. E. coli C600, E. coli ED8767, E. coli DH1, E. coli LE392, E. coli HB101, E. coli X1776, E. coli X2282, E. coli MRCI, und Stämmen von Pseudomonas, Bacillus und Streptomyces, Hefen und anderen Pilzen, tierischen Wirten, wie z.B. Ovarzellen des Chinesischen Hamsters oder Mauszellen, anderen tierischen (umfassend menschlichen) Wirten, Pflanzenzellen in Kultur oder anderen Wirten. Nach der Expression ist das Enzym nützlich, um 2,5-DKG zu 2-KLG umzuwandeln.
Wirte für die DNA-Sequenz der erfindungsgemäßen 2,5-DKG- Reduktase sollten im allgemeinen ausgewählt werden unter Berücksichtigung ihrer Verträglichkeit mit dem ausgewählten Vektor, der Toxizität der erfindungsgemäßen 2,5-DKG-Reduktase für den Wirt, der Empfindlichkeit des gewünschten Proteins gegen proteolytischen Abbau durch Enzyme der Wirtszelle, von Verunreinigung der 2,5-DKG-Reduktase durch oder deren Bindung an Proteine der Wirtszelle, die während der Reinigung schwierig zu entfernen sind, von Expressionskennzeichen, der Fähigkeit des Wirtes, die 2,5-DKG-Reduktase zu produzieren und auszuscheiden, der Fähigkeit des Wirtes, die Reduktase richtig zu falten, der Bedürfnisse des Wirts bezüglich Fermentation, der Einfachheit der Reinigung der 2,5-DKG-Reduktase aus dem Wirt, der Sicherheit und der Kosten.
In einer Ausführungsform wird Erwinia citreus SHS 2003 als Wirt ausgewählt, da es 2,5-DKG aus Glucose produziert und da 2-KLG durch ein transformiertes Erwinia citreus SHS 2003 direkt aus Glucose produziert werden kann.
Am stärksten bevorzugte Wirte der vorliegenden Erfindung sind Erwinia citreus, SHS2003 (FERM-P-Nr. 5449, ATCC-Nr. 31623) und der aus Erwinia citreus SHS2003 mutierte Stamm Erwinia citreus ER1026, der nicht in der Lage ist, entweder 2,5- DKG oder 2-KLG als einzige Kohlenstoffquelle zu verwenden.
Das nachstehende Beispiel zeigt einige Ausführungsformen der Erfindung, es soll aber den Umfang der Erfindung in keiner Weise einschränken.

BEISPIEL

Identifizierung einer Pollypeptidsequenz der erfindungsgemäßen 2.5-DKG-Reduktase und Herstellung von Clonierungsvektoren

Corynebacterium sp. SHS752001 wurde in T. Sonoyama et al., "Production of 2-keto-L-gulonic acid from D-Glucose by two-stage fermentation", App. and Envir. Microbiol.. 43, 1064- 69 (1982), beschrieben. Der beschriebene Corynebacterium-Stamm wurde als Donor einer eine 2,5-DKG-Reduktase codierenden DNA- Sequenz ausgewählt. Um die Identifizierung des 2,5-DKG-Reduktase-Gens zu unterstützen, wurde aus diesem Corynebacterium-Stamm eine Enzymprobe unter Verwendung des nachstehenden Verfahrens isoliert und bis zu einer Reinheit von 95% gereinigt.

A. Züchtung von Corynebacterium SHS 752001

1. Eine gefriergetrocknete Kultur von Corynebacterium SD. SHS 752001 wurde unmittelbar nach Öffnen durch Zusatz von 0,4 ml 0,9% NaCl-Lösung (sterilisiert bei 120ºC, 20 Minuten) zum Inhalt eines Glasfläschchens, das die gefriergetrocknete Kultur enthielt, rehydratisiert.
2. Die Kultur wurde auf ein Reagenzglas übertragen, das 8 ml einer Lösung enthielt, die 0,5% Glucose, 0,5% Hefeextrakt (Difco), 0,5% Pepton (Difco), 0,1% KH&sub2;PO&sub4;, 0,02% MgSO&sub4; 7H&sub2;O und 2,0% Agar enthielt. Der pH-Wert der Lösung betrug 7,0, die Lösung war 15 Minuten bei 120ºC sterilisiert worden. Vierzig Stunden nach Zusatz der Kultur bei 28ºC wurde die Kultur mit 0,4 ml 0,9% NaCl-Lösung, die 20 Minuten bei 120ºC sterilisiert worden war, suspendiert.
3. 5 Proben zu 0,1 ml der Suspension aus Schritt 2 wurden auf 5 Schrägagars aufgetragen, die dieselben Bestandteile wie die Lösung von Schritt 2 enthielten. Die Kulturen wurden dieselbe Zeitspanne und unter denselben Bedingungen wie in Schritt 2 inkubiert. Die Kulturen wurden mit 5 ml 0,9% NaCl (sterilisiert bei 120ºC, 20 Minuten) suspendiert, jeweils 2,5 ml der Suspension wurden in zehn Vorkulturkolben, die jeweils 500 ml Medium enthielten, überführt.
4. Eine Lösung, die 1% Glucose, 0,5% Hefeextrakt (Difco), 0,5% Pepton (Difco), 0,1% NaNO&sub3;, 0,1% KH&sub2;PO&sub4; und 0,02% MgSO&sub4; 7H&sub2;O enthielt und einen pH-Wert von 7,0 aufwies, wurde 15 Minuten bei 120ºC sterilisiert. 60 ml der Lösung wurden zu einem 500-ml-Kolben, der die Kultur enthielt, hinzugefügt. Nach 16- bis 18-stündiger Züchtung bei 28ºC wurde der Inhalt von zehn solchen 500-ml-Kulturkolben in einen 30-Liter- Glasfermenter übertragen; und
5. 20 Liter einer Lösung bei pH 7,2, die 1,8% Glucose, 2,7% Maisquellwasser, 0,31% NaNO&sub3;, 0,06% KH&sub2;PO&sub4;, 4,4 ppm ZnSO&sub4; 7H&sub3;O, 0,72 ppm MnCl&sub2; 4H&sub2;O, 0,2 ppm Vitamin B&sub1;-HCl, 0,15 ppm Calciumpanthothenat und 0,005% Antischaummittel (Adekanol) enthielt, wurden in den 30-Liter-Glasfermenter hinzugegeben, der die Kultur enthielt. Der Fermenter wurde bei 28ºC unter Rühren mit 400 UpM und einer Luftdurchf lußrate von 0,5 VVM inkubiert. Die Fermentation wurde beendet, sobald die Glucose aus der Kultur verschwunden war (22 Stunden). Am Ende lag ein pH-Wert von 7,5 und eine OD von 19,2 vor.

B. Herstellung von Zellextrakt

Etwa 750 g Zellen wurden aus dem 30-Liter-Glasfermenter durch Zentrifugation unter Verwendung einer Sharples-Zentrifuge (10 000 g, 10 Minuten) geerntet. Die Zellen wurden in 0,1 M Tris-HCl-Puffer (pH 7, 2,5 l) suspendiert, dreimal mit demselben Puffer (jeweils 2,5 l) unter Verwendung einer Zentrifuge gewaschen und schließlich in 1,6 l Puffer resuspendiert (OD 150). Die Zellen (80 ml Zellsuspension) wurden durch Beschallung (160 Watt, 7 Minuten) aufgeschlossen. Nicht aufgeschlossene Zellen und Zelltrümmer wurden abzentrifugiert (15 000 g, 30 Minuten) und der Überstand (1 l) vereinigt.

C. Fraktionierung durch AmSO&sub4;

Das Proteinmaterial, das zwischen 40% und 70% Sättigung ausgefällt wurde, wurde abzentrifugiert und in 80 ml 0,1 M Tris-HCl-Puffer, pH 7, erneut gelöst. Die Lösung wurde gegen 0,02 M Tris-HCl-Puffer, pH 7, über Nacht dialysiert.

D. Ionenaustausch-Chromatographie

Die dialysierte Lösung (99 ml) wurde auf eine DEAE-Sepharose CL-6B-Säule (1,6 x 30 cm) aufgetragen, die vorher mit 0,02 M Tris-HCl-Puffer (pH 7) äquilibriert worden war. Die Säule wurde schrittweise mit 0,02 M Tris-HCl-Puffer, der null und 0,2 M NaCl enthielt (pH 7), gewaschen. Das Enzym wurde mit demselben Puffer, der 0,3 M NaCl enthielt (pH 7), eluiert. Die aktiven Fraktionen wurden vereinigt und das Protein durch Zusatz von AmSO&sub4; bis zu 70% Sättigung konzentriert. Der Niederschlag wurde gesammelt und wie in Schritt C dialysiert.

E. Erste Affinitätschromatographie

Die aus Schritt D erhaltene dialysierte Lösung (37 ml) wurde auf eine Amicon Matrix Red A-Säule (1,6 x 19 cm) aufgetragen, die vorher mit 0,02 M Tris-HCl-Puffer (pH 7) äquilibriert worden war. Die Säule wurde schrittweise mit 0,02 M Tris-HCl-Puffer (pH 7), der 0,3 bis 0,5 M NaCl enthielt, gewaschen. Das Enzym wurde mit demselben Puffer, der 0,7 bis 1,0 M NaCl enthielt, eluiert. Die aktiven Fraktionen (90 ml) wurden vereinigt.

F. Zweite Affinitätschromatographie

0,02 M Tris-HCl-Puffer (pH 7, 225 ml) wurden zu den vereinigten Fraktionen aus Schritt E hinzugefügt und die resultierende Lösung auf eine Amicon Matrix Red A-Säule (1,9 x 12,3 cm) aufgetragen, die vorher mit 0,02 M Tris-HCl-Puffer (pH 7) äquilibriert worden war. Die Säule wurde mit 0,02 M Tris-HCl- Puffer (pH 7), der 0,2 M NaCl enthielt, gewaschen. Das Enzym wurde mit demselben Puffer, der 0,5 mM NADPH enthielt, eluiert. Die aktiven Fraktionen (35 ml) wurden vereinigt und durch Ultrafiltration eingeengt (Ausschluß unter einem MG. von 10 000), um NADPH zu entfernen.
Um zu zeigen, daß die erfindungsgemäße 2,5-DKG-Reduktase während des Beschallungsprozesses nicht denaturiert wurde, und um zu bestätigen, daß die erfindungsgemäße 2,5-DKG-Reduktase 2,5-DKG zu 2-KLG umwandelt, wurde ein Gemisch mit 0,1 M Tris- HCl (pH 7) hergestellt, das 7 mg NADPH, 2 mg 2,5-DKG und 50 ul des durch Beschallung hergestellten Zellextrakts bei einer Gesamt-Protein-Konzentration von 2,5 mg/ul enthielt. Das gesamte Reaktionsvolumen betrug 200 ul. Die Reaktionsprodukte wurden durch HPLC analysiert und das Vorliegen von 2-KLG bestätigt.
Antikörper gegen die erfindungsgemäße 2,5-DKG-Reduktase wurden hergestellt. Die Antikörper wurden entwickelt, indem einem Kaninchen 100 ug der erfindungsgemäßen 2,5-DKG-Reduktase in Freund-Adjuvans an mehreren Stellen intraderial injiziert wurden und 21 Tage später eine Booster-Injektion mit 50 ug Enzym in unvollständiger Freund-Lösung verabreicht wurde. Zehn Tage nach der Booster-Injektion wurde Serum abgenommen, mit einem Enzym-Immun-Test (Enzyme-Linked-Immunoabsorbent Assay, ELISA) wurde nachgewiesen, daß dieses Serum Aktivität gegen die erfindungsgemäße 2,5-DKG-Reduktase aufwies.
Das gereinigte Enzym wurde unter Verwendung eines von Applied Biosystems hergestellten Hochempfindlichkeits-Gasphasen- Sequenators vom N-Terminus her sequenziert. Die durch dieses Verfahren erhaltene partielle Sequenz ist in Figur 1 dargestellt. Ein Fragezeichen in der Figur bedeutet, daß eine bestimmte Aminosäure nicht mit absoluter Sicherheit bestimmt werden konnte.
Außerdem wurde das gereinigte Enzym durch Bromcyan-Spaltung unter Verwendung eines Standardverfahrens gespalten. Ein Teil der Aminosäuresequenz eines durch dieses Verfahren hergestellten 14 000 D-Fragments ist in Figur 2 dargestellt.
Um aus einer Clon-Bank eine diese erfindungsgemäße 2,5- DKG-Reduktase codierende DNA-Sequenz zu selektieren, wurde unter Verwendung des Phosphotriester-Verfahrens eine Reihe von Oligonucleotid-Sonden (dargestellt in den Figuren 3a bis e) hergestellt. Diese Sonden wurden aus den Aminosäuresequenzen der Figuren 1 und 2 abgeleitet.
Da der genetische Code degeneriert ist, stellte jede Sonde in Wirklichkeit eine Familie von strukturell verwandten Molekülen dar. Beispielsweise hatte die DNA-Sonde mit 14 Nucleotiden von Figur 3a (Sonde I von Figur 1l) eine Redundanz von 96 mit einer C-T-Fehlpaarung gegenüber der vorhergesagten Sequenz, die DNA-Sonde mit 14 Nucleotiden von Figur 3b (Sonde II von Figur 1) hatte eine Redundanz von 32 mit einer G-T- Fehlpaarung, die DNA-Sonden mit 17 Nucleotiden der Figuren 3c und 3d (Sonde III von Figur 1) hatten jeweils eine Redundanz von 32 und unterschieden sich voneinander nur in den ersten zwei Positionen und die DNA-Sonde mit 14 Nucleotiden von Figur 3e (Sonde IV von Figur 2) hatte eine Redundanz von 32.
Zur Konstruktion von Corynebacterium-DNA-Banken, die ein Absuchen mit den Sonden der Figuren 3 (a bis e) zur Selektion des erfindungsgemäßen 2,5-DKG-Reduktase-Gens ermöglichen, wurde Corynebacterium sp. SHS 752001 lysiert, indem eine Zellsuspension von Corynebacterium sp. SHS 752001 mit Lysozym (1 mg/l) in 10 mM Tris-HCl (ph 8), 1 mM EDTA und 20% (Gew./Vol.) Saccharose und anschließend mit Natriumdodecylsulfat (SDS) (5 mg/ml) versetzt wurde. Anschließend wurde DNA aus den lysierten Corynebacterium sp. SHS 752001-Zellen unter Verwendung der Restriktionsendonuclease Sau3a in einem Puffer, der 150 mM NaCl, 6 mM Tris-HCl (pH 7,9), 6 mM MgCl&sub2; und 100 ug/ml Rinderserumalbumin enthielt, gespalten. Die DNA-Fragmente wurden sodann in pUC8-Vektoren an einer BamHI-Stelle eingefügt, wobei das Verfahren von J. Viera und J. R. Messing, Gene, 19, 259 (1982), verwendet wurde, und die rekombinanten Plasmide sodann in Escherichia coli JM83, W3110iq und W 3110iq recA transformiert. Das Verfahren zur Transformation der rekombinanten Plasmide in E. coli JM83 ist in J. R. Messing, R. Corea, P. H. Seeburg, Nucleic Acids Res., 9, 309 (1981), dargestellt. Ähnliche Verfahren wurden für andere Wirtsstämme verwendet.
Kolonien der resultierenden Bank wurden mit den Sonden der Figuren 3 (a bis e) abgesucht, wobei das in Wallace, R. B., Johnson, M. J., Hirose, T., Miyake, T., Kawashima, E. H., und Itakura, K., Nucleic Acids Res., 9, 879-94 (1981), beschriebene Verfahren verwendet wurde. Die Sonden wurden bei 37ºC hybridisiert und außerdem bei 37ºC in einer Standardwaschlösung gewaschen, die 6 x SSC, 5 x Denhardt-Puffer, 0,1% SDS und 50 ug/ml t-RNA umfaßte. Von 17 Kolonien, die mit der Sonde von Figur 3 e positiv waren (hybridisierten), waren zwei auch mit den Sonden der Figuren 3c oder 3d oder beiden positiv. Die zwei rekombinanten Plasmide dieser Clone wurden pCBR10 und pCBR13 genannt. Die fremde DNA von jedem der zwei rekombinanten Plasmide war 3,0 kB lang.

Eigenschaften von erfindungsgemäßen Expressionsvektoren und Transformanten

Um die Eigenschaften der rekombinanten Plasmide, einschließlich Produktionsraten der erfindungsgemäßen 2 , 5-DKG-Reduktase durch die transformierten Wirte zu bestimmen, wurden die zwei rekombinanten Plasmide und pUC8, ein Vektor, der keine für die erfindungsgemäße 2,5-DKG-Reduktase codierende DNA enthielt, in Escherichia coli W3110iq recA und Erwinia punctata transformiert, wobei das in Cohen, S. N., Chang, A. C. Y., und Hsu, L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972), beschriebene Verfahren verwendet wurde. Vektor pUC8, der mit pBR322 verwandt ist, hat einen starken lac-Promotor, der etwas stromaufwärts von einer BamHI-Stelle liegt.
Mehrere Verfahren wurden geprüft, die die erfindungsgemäße 2,5-DKG-Reduktase aus den transformierten Zellen, die dieses Enzym produzierten, freisetzten, so daß die Produktionsraten gemessen werden konnten. Die Beschallung erwies sich als das beste Verfahren für E. coli und Erwinia.
Extrakte von E. punctata und E. coli, die pCBR10 und pCBR13 trugen, wurden durch Natrium-Dodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) (Laemmli, U. K., Nature, 227, 680-85 (1970)) und durch Western Blotting (Thomas, P. S., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 5201-05 (1980)) unter Verwendung des vorstehend hergestellten, gegen die erfindungsgemäße 2,5-DKG-Reduktase gerichteten Antikörpers analysiert, um die Menge der erfindungsgemäßen 2,5-DKG-Reduktase zu bestimmen, die durch die Transformanten produziert wird. Extrakte von E. coli W3110iq recA (pCBR13), behandelt mit dem lac-Inductor Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG), enthielten etwa fünfmal mehr Enzym als Extrakte von nichtinduzierten Zellen mit dem das Gen tragende Plasmid.

Bestätigung. daß die erfindunasgemäße 2,5-DKG-Reduktase während der Rekombination nicht verändert wurde

Die durch E. punctata und E. coli nach Transformation mit pCBR10 und pCBR13 hergestellte 2,5-DKG-Reduktase wurde untersucht, um zu sehen, ob es sich um dasselbe Enzym handelte wie dasjenige, das aus Corynebacterium SD. SHS 752001 isoliert worden war.
Das Protein, das durch Western-Blotting der Extrakte von Erwinia (pCBR13), E. coli W3110iq recA (pCBR13) und Corynebacterium markiert wurde, wies dasselbe Molekulargewicht auf wie die gereinigte erfindungsgemäße 2,5-DKG-Reduktase (d.h., etwa 29 000 D). Aufgrund des Vergleichs der für die verschiedenen Zellen erhaltenen Muster wurde angenommen, daß die erfindungsgemäße 2,5-DKG-Reduktase 1 bis 2% des gesamten Zellproteins von Erwinia (pCBR13) ausmachte.
Wir haben weitere Konstruktionen durchgeführt, wobei der λPL-Promotor verwendet wurde, ein starker Promotor, der durch das λcI-Repressor-Protein kontrolliert werden kann. Die Expression des λPL-Promotors kann in einem Stamm, der auch den temperaturempfindlichen λcI&sub8;&sub5;&sub7;-Repressor trägt, kontrolliert werden, indem die Temperatur von 30ºC auf 42ºC erhöht wird. Unter Verwendung dieses Promotor-Systems wurden gesteigerte Ausbeuten von 2-KLG aus rekombinanten Stämmen erhalten.
Figur 5 zeigt die physikalische Karte des Vektors, der dazu verwendet wurde, um die Plasmide zur Expression von 2,5- DKG-Reduktase unter der Kontrolle des λPL-Promotors zu bringen. Plasmid pPLred332 wurde hergestellt, indem das 2,5-DKG- Reduktase codierende Fragment aus Plasmid pCBR13 in Plasmid p210* eingeführt wurde. Das eingeführte Fragment wurde durch Spaltung von pCBR13 mit den Restriktionsendonucleasen EcoRI und HindIII erzeugt; die zwei Fragmente wurden mittels Elektrophorese durch Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt getrennt. Der Vektor wurde auch mit EcoRI und HindIII gespalten (vgl. Figur 5), so daß die geeigneten Fragmente ligiert werden konnten. Das resultierende Plasmid pPLred332 wurde in Stamm W3110 cIts transformiert, wodurch Stamm EC1083 entstand. Dieser Stamm trägt eine chromosomale Insertion des temperaturempfindlichen λ-Repressorgens cI&sub8;&sub5;&sub7;. Plasmid pPLred332, das das von 210* abgeleitete Vektorelement und die Insertion aus pCBR13 gemäß Fig. 5 umfaßt, ergibt eine 2,5-DKG-Reduktase, die sowohl in E. coli als auch in Erwinia citreus dasselbe Molekulargewicht aufweist wie diejenige von pCBR13.
Erwinia citreus ER1026 wurde mit pPLred332 transformiert, wodurch Stamm ER1116 entstand.
Um die Aminosäure- und DNA-Sequenz der erfindungsgemäßen 2,5-DKG-Reduktase zu bestätigen, wurde die 3-kB-Insertion von pcBR13 sequenziert, wobei die Technik von Maxam und Gilbert (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 560 (1977), und Maxam, A. M., und Gilbert, W., Meth. Enzym., 65, 499-560 (1980)) und die Sanger-Sequenzierung unter Verwendung von Plasmid M13 (Sanger, F., Nicklen, S., und Coulson, A. R., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463-67 (1977)) verwendet wurden. Die Untersuchung der Sequenz der 3,0-kB-Insertion zeigte, daß diese Sequenz fast genau die ersten sechzig Aminosäuren codierte, die für das Enzym selbst bestimmt wurden (dargestellt in Figur 1). Die 3,0-kB-Insertion enthielt außerdem eine Sequenz, die fast genau die Aminosäuresequenz von Figur 2 codierte. Das Ende des Reduktase-Gens in der 3,0-kB-Insertion wurde durch ein Stopp- Codon bezeichnet. Auf diese Weise wurde bestimmt, daß das Reduktase-Gen 831 Nucleotide lang war (ausschließlich Stopp- Codon und einschließlich Start-Codon ATG), seine Sequenz wird in Figur 4 gezeigt.
Die die Aminosäuresequenz der erfindungsgemäßen 2,5-DKG- Reduktase codierende DNA-Sequenz kann mit der DNA-Sequenz, die das Polypeptid der Europäischen Patentanmeldung 132 308 codiert, und der Aminosäuresequenz dieses Polypeptids verglichen werden. Figur 4 zeigt sowohl die DNA-Sequenz als auch die Aminosäuresequenz für die erfindungsgemäße 2,5-DKG- Reduktase. Figur 4 der Europäischen Patentanmeldung 132 308 zeigt die besagte DNA-Sequenz und Aminosäuresequenz dieses Polypeptids. Ein Vergleich der zwei Figuren zeigt deutlich, daß die erfindungsgemäße 2,5-DKG-Reduktase und ihre DNA-Sequenz sich auffallend von der Aminosäuresequenz und der DNA-Sequenz der Europäischen Patentanmeldung 132 308 unterscheiden.
Die Michaelis-Konstante (Km) eines Enzyms bestimmt die Kinetiken dieses Enzyms. Je niedriger der Wert der Konstante ist, desto höher ist die Aktivität oder Schnelligkeit des Enzyms. Die Michaelis-Konstante für 2,5-DKG, die in der Europäischen Patentanmeldung 132 308 dargestellt wird, beträgt 15,5 mM, die Michaelis-Konstante für die erfindungsgemäße 2,5- DKG-Reduktase (unter Verwendung von 100 uM NADPH als Cofaktor) in 0,1 M Tris-HCl, pH 7,0, bei 30ºC, beträgt 2,0 mM.
Die nachstehenden Verfahren erläutern die Fermentation von Glucose zu 2-KLG, einem Vitamin-C-Vorläufer, unter Verwendung eines genetisch modifizierten Organismus dieser Erfindung.

Fermentation von Glucose zu 2-KLG unter Verwendung von transformiertem Erwinia

Erwinia citreus SHS 2003, hinterlegt bei "American Type Culture Collection", Maryland, USA, ATCC-Nr. 31623 und bei "Fermentation Research Institute, Yatabe, Japan, FERM-P-Nr. 5449, exprimiert normalerweise Enzyme zur Umwandlung von Glucose zu 2,5-DKG. Dieser Stamm wurde mit pCBR13 transformiert, das, wie vorstehend beschrieben, ein die erfindungsgemäße 2,5- DKG-Reduktase codierendes Gen enthält, wobei das in Cohen, S. N., Chang, A. C. Y., und Hsu, L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972), dargestellte Verfahren verwendet wurde. Der mit ER817 bezeichnete resultierende Stamm sollte daher die Gene für alle die Enzyme enthalten, die für die Umwandlung von Glucose zu 2-KLG in einer einzigen Fermentation nötig sind.
Stamm ER817 wurde auf eine Platte mit L-Nährlösung-Agar angeimpft, der Ampicillin (40 ug/ml) enthielt. Der Stamm war von einer Stammkultur abgenommen worden, die in L-Nährlösung plus 15% Glycerin bei -70ºC gehalten worden war. Nachdem die Platte 24 Stunden bei 18ºC inkubiert worden war, wurden 10 ml eines Vorkulturmediums (Glycerin, 5 g/l; Maisquellwasser, 27,5 g/l; KH&sub2;PO&sub4;, 1 g/l; pH 6,8) in einem 250 ml-Erlenmeyerkolben zum Erhalt einer Absorbanz bei 650 nm von 0,05 (A650 = 0,05) mit dem von der Platte abgenommenen Stamm ER817 beimpft.
Die resultierende Vorkultur wurde 24 Stunden bei 18ºC auf einem Kreisschüttler inkubiert. 10 ml eines Produktionsmediums (Maisquellwasser, 30 g/l; KH&sub2;PO&sub4;, 1 g/l; NaCl, 1 g/l; CaCO&sub3;, 29 g/l; Glucose, 10 g/l; pH 6,8) in einem 250-ml-Erlenmeyerkolben wurden zum Erhalt von A&sub6;&sub5;&sub0; = 0,2 mit der Vorkultur beimpft und auf dem Kreisschüttler 65 Stunden bei 28ºC inkubiert.
Anschließend wurde die Kultur zentrifugiert und der Überstand durch Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie (HPLC) auf das Vorliegen von 2-KLG untersucht. Proben zu 50 ul des Überstandes wurden unter Verwendung einer Biorad HPX-87H-Säule bei 65ºC (0,6 ml/min) in 0,18 N H&sub2;SO&sub4; analysiert. Ein Peak mit einer Retentionszeit von 8,86 Minuten zeigt das Vorliegen von 2-KLG. Die Retentionszeiten der anderen interessierenden Komponenten waren wie nachstehend: 2,5-DKG, 8,46 min; 2-Keto-D- Gluconsäure (2-KDG), 9,20 min; Gluconsäure, 10,0 min; und Fucose, 12,1 min.
Die verschiedenen Proben des Überstandes zeigten einen Peak bei 8,86 min, was auf das Vorliegen von 2-KLG in einer Konzentration von 1 g/l hinwies. Zur Bestätigung, daß die Verbindung, die einen Peak bei 8,86 min Produzierte, 2-KLG war, wurde eine Menge von bekanntem 2-KLG (als Natriumsalz) zu einer Probe des Überstands hinzugefügt. Dadurch wurde nur der Peak bei 8,86 min erhöht, wodurch die erwartete Bestätigung bereitgestellt wurde. Im Gegensatz dazu zeigte die HPLC- Analyse des Überstandes einer Probe der Kultur, die bereits 18 Stunden nach Beimpfung (anstatt nach 65 Stunden) abgenommen worden war, 2,5-DKG in einer Konzentration von 7 g/l, aber kein nachweisbares 2-KLG.
Zur weiteren Bestätigung, daß in der 65-Stunden-Kultur wirklich 2-KLG (und nicht 2-KDG) erzeugt worden ist, wurde eine Menge von bekanntem 2-KDG (als Calciumsalz) zu einer Probe des Überstandes bis zu einer Konzentration von 1 g/l hinzugefügt. Die HPLC-Analyse dieser Kultur zeigte sodann das Vorliegen eines neuen Peaks bei 9,16 min, jedoch im wesentlichen keine Veränderung des 2-KLG-Peaks bei 8,86 min.
Außerdem wurde noch ein anderes Verfahren verwendet, um die Herstellung von 2-KLG durch die Kultur zu zeigen. Durch Umwandlung des durch die Fermentation erzeugten 2-KLG zu Ascorbinsäure, einem Reduktionsmittel, kann das Reduktionsvermögen eines Fermentationsmediums, das 2-KLG enthält, gemessen werden und die Menge 2-KLG, die in der Lösung vor dessen Umwandlung zu Ascorbinsäure vorlag, berechnet werden. Um das Vorliegen von anderen Reduktionsmitteln als Ascorbinsäure in einem Fermentationsgemisch auszugleichen, wird eine erste Probe des Fermentationsgemisches entsprechend behandelt, daß 2-KLG zu Ascorbinsäure umgewandelt wird, und sodann das gesamte Reduktionsvermögen der Probe bestimmt. Eine zweite Probe wird hergestellt, bei der nach Umwandlung von 2-KLG die gesamte Ascorbinsäure aus dem Medium entfernt worden war. Die Reduktionsaktivitäten der zwei Proben werden sodann verglichen, wobei die Differenz der Aktivitäten die Menge der in den Proben vorliegenden Ascorbinsäure und daher auch des im Fermentationsmedium vorliegenden 2-KLG anzeigen sollte.
Eine Probe eines Fermentationsmediumsüberstandes wurde behandelt, um vorliegendes 2-KLG zu Vitamin C umzuwandeln. 75 ul 8 N HCl wurden zu 50 ul des Überstandes hinzugefügt und das Gemisch 30 Minuten bei 95ºC inkubiert. 120 ul 5 N NaOH wurden hinzugefügt und der pH-Wert unter Verwendung von 1 N Natriumacetat auf 3,75 eingestellt.
Ascorbinsäure und irgendwelche anderen Reduktionsmittel im Gemisch wurden das Tetrazolium-Salz MTT [3-(4,5-Dimethylthiazolyl-2)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid] in Gegenwart des Elektronenträgers PMS [5-Methylphenazium-methylsulphat) zu einem Formazan reduzieren. Eine solche Behandlung wurde durchgeführt und sie zeigte die Summe aller Reduktionsmittel (umfassend Vitamin C) im Gemisch.
Um die spezifische Bestimmung von Vitamin C zu erleichtern, wurde eine Probe des Fermentationsgemisches vor Behandlung mit MTT und PMS mit Ascorbinsäure-Oxidase und Sauerstoff versetzt, um vorliegendes Vitamin C zu zerstören. Die anschließende Behandlung mit MTT und PMS zeigte sodann die Menge der vorliegenden Reduktionsmittel, die von Vitamin C verschieden sind, und aus der Differenz wurde die Menge Vitamin C (und auch 2-KLG) bestimmt. Auf diese Weise wurden das Vorliegen von Vitamin C im Gemisch und auch das Vorliegen von 2-KLG im Überstand bestätigt.
Eine Standardkurve konnte erstellt werden, indem das Verfahren zur Umwandlung von 2-KLG zu Vitamin C mit Proben durchgeführt wurde, die bekannte Konzentrationen von 2-KLG enthielten. Die Kurve zeigte, daß der aus der 65-Stunden-Kultur von Stamm ER817 erhaltene Überstand 1 g/l 2-KLG enthielt, was mit den Ergebnissen der HPLC-Analysen übereinstimmte. 2-KLG wurde im Überstand einer genauso hergestellten und behandelten Kultur eines anderen Stammes von Erwinia citreus, der pCBR13 nicht aufweist (Stamm SHS2003), nicht nachgewiesen.
Die Umwandlung von Glucose zu 2-KLG wurde mit dem folgenden Fermentationsverfahren unter Verwendung des transformierten Stammes ER817 durchgeführt. Die Beimpfung wurde wie in Beispiel 1 durchgeführt, die Inkubation im Produktionsmedium fand jedoch 30 Stunden anstelle von 65 Stunden statt, und 100 ml Kultur wurden verwendet. Der Kulturüberstand enthielt 1 g/l 2-KLG, aber weniger als 0,1 g/l Glucose, 2-KDG, 2,5-DKG oder Gluconsäure.
Ein Weg zum Erhalt von besseren Ausbeuten von 2-KLG besteht darin, sicherzustellen, daß keine der bei der Fermentation von Glucose zu 2-KLG erzeugten Zwischenprodukte bei biologischen Reaktionen, die nicht mit der Erzeugung von 2-KLG zusammenhängen, verbraucht werden. Demgemäß wurde anschließend an eine Nitrosoguanidin-Mutagenese eine Mutante von Erwinia citreus (SHS2003) isoliert, die nicht in der Lage war, 2,5-DKG oder 2-KLG als einzige Kohlenstoffquelle zu verwerten, wobei das von Miller in "Experiments in Molecular Genetics" (Cold Spring Harbor, 1974) beschriebene Verfahren verwendet wurde, mit der Ausnahme, daß die Zellen in Gegenwart von Nitrosoguanidin bei 30ºC inkubiert wurden. Nach der Mutagenese wurden die Zellen 18 Stunden bei 30ºC in M9-Medium, das Glucose (0,2%, Gew./Vol.) oder Glycerin (0,4%, Gew./Vol.) enthielt, inkubiert, wie es von Miller in "Experiments in Molecular Genetics" (Cold Spring Harbor, 1974) beschrieben wird. Proben der Kultur wurden auf Platten mit M9-Glucose- oder M9-Glycerin-Medium verteilt und sodann auf Platten mit M9-Medium, das 2,5-DKG (0,5%, Gew./Vol.) oder 2-KLG (0,2%, Gew./Vol.) enthielt, repliziert. Mutanten, die nicht in der Lage waren, auf einem dieser Medien zu wachsen, wurden durch erneutes Ausstreichen gereinigt und aufihre Fähigkeit zur Verwendung verschiedener Substrate als einzige Kohlenstoffquelle getestet. Mehrere Mutanten wurden erhalten, die keine der Substanzen 2,5-DKG, 2-KDG oder 2-KLG als einzige Kohlenstoffquelle verwerten konnten. Eine solche Mutante wurde mit Plasmid pCBR13 transformiert, wodurch Stamm ER1037 gebildet wurde, dessen Fähigkeit zur Umwandlung von Glucose zu 2-KLG sodann getestet wurde.
Eine Kultur von Erwinia citreus ER1037 wurde in der Kultursammlung "Deutsche Sammlung von Mikroorganismen" hinterlegt. Die Kultur wurde am 22. Juli 1985 hinterlegt und folgendermaßen bezeichnet: DSM-Nr. 3404.
Eine Kultur von Stamm ER 1037 wurde 18 Stunden in L-Nährlösung gezüchtet und 90 ml dieser Kultur in 500 ml eines Mediums beimpft, das (pro Liter) folgendes enthielt: K&sub2;HPO&sub4;, 4 g; KH&sub2;PO&sub4;, 1 g; NH&sub4;Cl, 1 g; CaCl&sub2;, 0,01 g; K&sub2;SO&sub4;, 2,6 g; Casaminosäuren, 10 g; Hefeextrakt, 1,5 g; Maisquellwasser, 10 g; D- Mannit, 20 g; und Glucose, 10 g. Nach 20-stündigem Wachstum bei pH 6,0 in einem 1-Liter-Fermenter (Belüftung mit 0,7 Gefäßvolumina pro Minute&supmin;¹ (VVM); Rühren mit 800 UpM) betrug die Konzentration von 2-KLG im Wachstumsmedium 6,25 g/Liter.
Eine weitere Verbesserung der Ausbeute von 2-KLG kann erreicht werden, indem Erwinia citreus ER1026, transformiert mit Plasmid pPLred332, verwendet wird. Der resultierende Stamm ER1116 wird wie vorstehend beschrieben gezüchtet. Jedoch anstatt die Fermentation, wie im Beispiel beschrieben, nach 20 Stunden zu beenden, wird die Fermentation 12 Stunden nach der Beimpfung durch Zusatz von weiteren 10 g/l Glucose fortgesetzt.
Außerdem können zwei weitere Zugaben von 10 g/l Glucose 36 und 60 Stunden nach Beginn der Fermentation erfolgen. Am Ende betrug 2-KLG-Spiegel in der Fermentationsnährlösung 19,83 g/l und entsprach einer Umwandlung aus Glucose von 49,4%.
Für Fachleute wird klar sein, daß in dieser Erfindung verschiedene Modifikationen vorgenommen werden können, ohne deren Umfang oder Inhalt zu verlassen, und daß unsere grundlegende Konstruktion zur Bereitstellung anderer Ausführungsformen verändert werden kann, in denen die erfindungsgemäßen Verfahren und Zusammensetzungen verwendet werden. Aus diesem Grunde muß es so verstanden werden, daß der Umfang dieser Erfindung eher durch die beigefügten Patentansprüche als durch die als Beispiele dargestellten spezifischen Ausführungsformen definiert werden muß.

Claims

1. Isolierte DNA-Sequenz, die eine 2,5-DKG-Reduktase Codiert, wobei die DNA-Sequenz aus der Gruppe ausgewählt wird, die besteht aus: (a) DNA-Sequenz der Formel:

(b) DNA-Sequenzen, die als Folge des degenerierten genetischen Codes ein durch die vorstehende DNA-Sequenz spezifiziertes Polypeptid codieren.

2. Rekombinantes DNA-Molekül, umfassend eine eine 2,5-DKG- Reduktase codierende DNA-Sequenz, wobei die DNA-Sequenz aus der Gruppe ausgewählt wird, die besteht aus: (a) DNA-Sequenz der Formel:

(b) DNA-Sequenzen, die als Folge des degenerierten genetischen Codes ein durch die vorstehende DNA-Sequenz bezeichnetes Polypeptid codieren.

3. Rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 2, wobei die DNA- Sequenz mit einer Expressionskontrollsequenz im Molekül funktionell verbunden ist.

4. Rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 3, wobei die Expressionskontrollsequenz ausgewählt wird aus der Gruppe, umfassend das lac-System; das β-Lactamase-System, das trp-System; das tac-System; das trc-System, die Hauptoperator- und -Promotorbereiche des λ-Phagen; und den Kontrollbereich des fd-Hüllproteins, die frühen und späten Promotoren von SV40, Promotoren, die von Polyomavirus und Adenovirus abgeleitet sind, Metallothionin-Promotoren, den Promotor für 3-Phosphoglycerat-Kinase oder andere glykolytische Enzyme, die Promotoren der sauren Phosphatase, die Promotoren der Hefe-α-Paarungsfaktoren; Promotoren für Säugerzellen, wie z.B. die frühen und späten Promotoren von SV40, den späten Adenovirus-Promotor, und andere Sequenzen, die die Expression von Genen von prokaryotischen oder eukaryotischen Zellen und deren Viren und Kombinationen davon kontrollieren.

5. Transformante, umfassend einen mit mindestens einem rekombinanten DNA-Molekül nach Anspruch 3 oder 4 transformierten Wirt.

6. Transformante nach Anspruch 5, wobei der Wirt 2,5-Diketo- D-gluconsäure herstellt.

7. Transformante nach Anspruch 6, wobei der Wirt zur Gattung Erwinia gehört.

8. Transformante nach Anspruch 6, wobei der Wirt Erwinia citreus ist.

9. 2,5-DKG-Reduktase, ausgewählt aus der Gruppe, die umfaßt: (a) 2,5-DKG-Reduktase, die die Aminosäuresequenz aufweist:

(b) 2,5-DKG-Reduktase, die die Aminosäuresequenz von (a) aufweist und außerdem Methionin am Aminoende umfaßt.

10. 2,5-DKG-Reduktase, die durch den Wirt nach Anspruch 5 erzeugt wird.

11. Verfahren zur Herstellung einer 2,5-DKG-Reduktase, das die Züchtung eines durch ein rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 2 oder 3 transformierten Wirtes umfaßt.

12. Verfahren nach Anspruch 11, das ferner den Schritt zur Isolierung der 2,5-DKG-Reduktase umfaßt.

13. Verfahren zur Erzeugung von 2-KLG aus Glucose, das den Schritt der Fermentation der Transformante nach Anspruch 8 in einem Medium, das Glucose enthält, umfaßt.

14. Verfahren zur Herstellung von Vitamin C, das die folgenden Schritte umfaßt:

(a) Fermentation der Transformante von Anspruch 6 in einem Medium, das Glucose enthält, zur Herstellung von 2- KLG; und

(b) Umwandlung von 2-KLG zu Vitamin C.

15. Transformante nach Anspruch 8, wobei der Wirt eine Mutante von Erwinia citreus ist, die nicht in der Lage ist, 2,5-DKG oder 2-KLG als einzige Kohlenstoffquelle zu verwerten.

16. Transformante nach Anspruch 8, wobei der Wirt Erwinia citreus SHS 2003 (ATCC 31623) ist.

17. Verfahren zur Herstellung von 2-KLG aus Glucose, das die folgenden Schritte umfaßt:

(a) Isolierung einer Mutante von Erwinia, die nicht in der Lage ist, 2,5-DKG als einzige Kohlenstoffquelle zu verwerten;

(b) Transformation der Mutante mit einem rekombinanten DNA-Molekül, das eine DNA-Sequenz nach Anspruch 1 umfaßt, die mit einem λ-PL-Promotor funktionell verbunden ist; und

(c) Fermentation der Mutante in einem Medium, das Glucose enthält.

18. Verfahren nach Anspruch 17, wobei der pH-Wert des Mediums bei etwa 6,0 gehalten wird.