KR20010093113A - 효모를 이용한 아스코르빅산의 제조 - Google Patents

효모를 이용한 아스코르빅산의 제조 Download PDF

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Abstract

본발명은 2-키토-엘-굴로닉산(2-keto-L-gulonic acid)KLG로부터 ASA를 제조할 수 있는 균주에서 아스코르빅산(ASA) 제조을 제공한다. 본발명은 ASA의 제조뿐만아니라 탄소원으로부터 ASA를 제조할 수 있는 재조합 효모의 제조방법을 제공한다.

Description

효모를 이용한 아스코르빅산의 제조{PRODUCTION OF ASCORBIC ACID USING YEAST}
엘-아스코르빅산(비타민C, ASA)는 약제학와 식품공학에서 비타민과 항산화제로 사용된다. ASA의 합성은 오랜 기간동안 상대적으로 큰 시장 규모와 높은 가치로 인하여 특수 화합물로서 상당한 관심을 받아왔다. 레이스타인-그루스너(Reichstein-Grussner) 방법은, 포도당으로부터 ASA로의 합성과정, 1934에 처음으로 발견되었다(Helv. Chim. Acta 17:311-328). 라자루스 등은 생화화적변환 방법을 이용한 ASA의 중간체, ASA로 화학적으로 변환될 수 있는 2-키토-엘-글루코닉산(2-KLG, KLG)의 제조 방법을 공개하였다(1989, "Vitamin C:Bioconversio via a Recombinant DNA Approach", Genetics and Molecular Biology of Industrial Microorganisms, American Society for Microbiology, Wasington D.C. Edited by C.L. Hershberger). 사이토 등은 디-소르비탈로부터 2-KLG 제조 발현 시스템을 보고하였다(1997, Applied and Environmental Microbilogy, 63:454-460).
효모에 ASA 존재가 보고되었으며(Heick et al. Can. J. Mirobiol., 1972, 18, 597-600), 캔디다 효모에서 엘-갈락토닉 기질로부터 ASA로의 전환이 공개되었다(미국 특허공보 4,595,659, 6/17/86과 4,916,068, 4/10/90). 코스타마그나등은 어떤 효모들을 이용한 ASA의 이용에 관한 연구를 공개하였다(Can. J. Microbiol., 1972, 18, 597-600). 이 보고서는 크립토코커스(Cryptococcus)와 캔디다(Candida)가 ASA 뿐만 아니라 이소-아스코르빅산에 의존하여 성장할 수 있음을 밝혔다.
ASA와 그 생촉매 중간체 제조 과학의 발전에고 불구하고 세계 수요를 공급할 아스코르빅산의 제조 방법의 필요성이 남아 있다. 재생가능한 탄소원을 이용한 아스코르빅산의 제조 방법은 특별한 장점이 있다.
본발명은 효모에서 아스코르빅산 또는 아스코르빅산 입체이성질체의 제조에 관한 것이다. 본발명은 부분적으로 유일한 탄소원으로 아스코르빅산 또는 이소-아스코르빅산에만 의존하여 성장할 수 있는 여러 종류의 효모가 KLG를 유일한 탄소원으로서 이용하여 아스코르빅산을 제조할 수 있다는 예상치 못한 발견에 기초하고 있다. 따라서, 본발명은 효모로부터 아스코르빅산 또는 아스코르빅산 입체이성질체의 제조 방법들을 제공한다.
본발명은 분자생물학과 관련이 있으며, 효모를 이용한 아스코르빅산과 아스코르빅산 입체이성질체의 제조에 관한 것이다.
도1은 캔디다 블랜키(Candida blankii), 캔디다 쉐하티(Candida shehatae) 및 크립토코커스 딤니(Cryptococcus dimmnae)의 유일한 탄소원으로 2KLG인 효모 질소 베이스에서의 성장을 보여준다.
도2는 캔디다 블랜키(Candida blankii), 캔디다 쉐하티(Candida shehatae),크립토코커스 딤니(Cryptococcus dimmnae), 및 크립토코커스 루테오루스(Cryptococcus luteolus)의 이도네이트 소듐 솔트인 효모 질소 베이스에 의존한 성장을 보여준다.
도3은 아스코르빅 산화효소 에세이를 이용하여 결정한 캔디다 블랜키(Candida blankii) 및 크립토코커스 딤니(Cryptococcus dimmnae)의 전체 세포 반응 혼합 상층액의 ASA 함량을 보여준다.
여기에 사용된 "아스코르빅산"은 비타민씨의 생화학적 명명에 대한 IUPAC-IUB 위원회에서 공인된 이름이다. 다른 이름들은 엘-아스코르빅산, 엘-자일로아스코르빅산 및 엘-쓰레오-헥스2-에노익산 감마 락톤이다. 순수한 비타민씨는 C6H8O6이며 분자량은 176.13이다. 네가지 아스코르빅산 입체이성질체가 가능하다: 엘-아스코르빅산, 비타민씨의 활성을 보이는 디-아라보아스코르빅산(에리소르빅산), 엘-아라보아스코르빅산 및 디-자일로아스코르빅산. 아스코르빅산 중간체들 또는 "대사과정 중간체들"는 효소적 또는 화학적 수단을 통하여 ASA로 전환될 수 있는 생화학물질이며, 한정된지 않은 예로서 글루코닉산, 2-키토-디-글루코닉산, 2,5-디케토-디-글루코닉산, 2-키토-엘-굴로닉산, 이도닉산(idonate), 글루코닉산, 소르비톨, 소르보스, 소르보손(sorbosone), 및 소르보스 디아세톤을 포함한다.
"KLG를 이용하여 아스코르빅산 또는 아스코르빅산 입체이성질체를 제조할 수 있는" 효모는 KLG로부터 생화학적 전환과 화학적 변환을 포함하는 임의의 수단을통하여 아스코르빅산을 제조할 수 있음을 말한다.
당업계에서 당들의 산 유도체들이 수용액 상태에서는 배지의 환경에 따라서, 고체 상태에서는 그것이 준비된 수용액에 따른 다양한 이온화 상태로 존재하는 것은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어 이도닉산과 같은 용어의 사용은 언급된 모든 유기 화합물의 모든 이온화 상태들을 포함한다. 따라서, 예를 들어 "이도닉산"은 환형의 "이도노락톤" 및 "이도네이트"는 동일한 유기 부분을 지칭하며, 특정의 이온화 상태 또는 화합물 형태를 구체화하기 위한 것이 아니다.
여기에 사용된 "재조합" 효모는 천연적으로 존재하지 않는 핵산을 포함하는 효모 및/또는 추가의 내성(endogeneous) 핵산이 재조합적인 방법으로 도입된 효모를 말한다. "이성(heterologus)" 용어는 효모에 천연적으로 존재하지 않는 핵산 염기 또는 아미노산 서열을 말한다. 여기에 사용된 "내성" 용어는 효모에 천연적으로 존재하는 핵산을 말한다. 재조합 숙주는 핵산에 의하여 인코딩되는 단백질이 제조되지 않도록 천연적으로 존재하는 핵산에 변이 및/또는 결손을 가질 수 있다.
여기에 사용된 "핵산"은 뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 서열 및 이들의 단편 및 조각, 및 더블 스트랜드 또는 싱글 스트랜드로서 센스 또는 안티센스 스트랜드인 지노믹 또는 합성의 DNA 또는 RNA를 말한다. 여기에 사용된 "아미노산"은 펩티드 또는 단백질 서열들 및 이들의 일부분들을 말한다.
여기에 사용된 "산화 효소" 는 기질의 산화 상태를 기질보다 더 높은 산화 상태의 결과물로의 전환을 촉매하는 효소 또는 효소 시스템을 말한다. "환원 효소"는 기질의 산화 상태를 기질보다 더 낮은 산화 상태의 결과물로의 전환을 촉매하는효소 또는 효소 시스템을 말한다. 산화 효소들은 6탄당으로부터 ASA의 합성경로 중간체들로의 생촉매와 관련되어 있으며, 그 중에서도 디-포도당 탈수소효소, 디-글루코네이트 탈수소효소 및 2-키토-디-글루코네이트 탈수소효소뿐만 아니라 엘-소르비탈 탈수소효소 활성, 엘-소르보스 탈수소효소 활성 및 엘-소르보손 탈수소효소 활성을 포함한다. 환원 효소들은 ASA의 합성경로 중간체들로부터 바람직한 최종 제조물들로의 생촉매와 관련이 있으며, 그중에서도 2,5-디키토-디-글루코네이트 환원효소(DKGR), 2-키토 환원효소(2-KR) 및 5-키토 환원효소(5-KR)을 포함한다. 이러한 효소들은 숙주 효모로부터 천연적으로 제조되거나 재조합 수단으로 도입된 것들을 포함한다.
여기에 사용된 "6탄당산" 이란 특히 엘-갈라토닉 기질들을 제외하고, 한정되지 않게 2-키토-엘-글루코닉산, 이도닉산, 글루코닉산, 6-인산글루코네이트, 2-키토-디-글루코닉산, 5-키토-디글루코닉산, 2-키토글루코네이트인산, 2,5-디키토-엘-굴로닉산, 2,3-엘-디키토굴로닉산, 디히드로아스코르빅산, 에리스로아스코르빅산 및 디-만노익산을 포함한다.
여기에 사용된 "6탄당"이란 용어는 제한되지 않은 예로서, 포도당(glucose), 굴로스(gulose), 소르보스(sorbose), 프락토스(fructose), 이도스(idose), 갈락토스(galactose) 및 만노스(mannose)의 디 또는 엘 형태를 포함한다.
여기에 사용된 "분리된" 또는 "정제된" 핵산 또는 펩티드는 적어도 하나의 천연적으로 결합된 구성요소가 제거된 것을 말한다. 본발명에서 분리된 핵산은 핵산을 포함하느 벡터를 포함한다. 여기에 사용된 발효 과정으로부터 유래한 정제된탄소원이란 발효 배지에서 천연적으로 탄소원과 결합된 적어도 하나의 구성요소가 제거된 것을 말한다.
효모에서 ASA의 제조
본발명은 KLG를 유일한 탄소원으로 이용하여 ASA를 제조할 수 있는 효모에서 ASA 또는 ASA 입체이성질체, 예를 들어 에리소르빅산의 제조에 관한 것이다. 본발병은 특히 효모에서 엘-갈락토노락톤 산화효소 경로를 거쳐 ASA를 제조하는 방법을 제외한다. 효모들은 N.J.W.Kreger-van Rij, "the Yeasts", Vol.1 of Biology Yeasts, Ch.2, Eds.A.H.Rose & J.S.Harrison, 1987, Academic Press, London에 기술되어 있다. 불완전 효모속에 속하는 효모들은 아스코포자 및 바시도포자를 형성하지 않는 일반적인 특징을 가진다. ASA는 산소에 민감하며, 따라서 효모들을 제조된 ASA의 산화를 감소시키기 위하여 혐기적 조건에서 배양하는 것이 바람직하다. 본발명은 디티오에트리쓰레톨(dithioetrythretol), 글루타치온와 같은 환원제, EDTA에 같은 금속 킬레이터, 메타포스포릭산, 아미노산들, 글리콜(glycol), 당들, 옥살릭산, 트리클로로아세틱산, 8-히드록시퀴놀린과 같은 안정제들이 ASA환경(D.W.Bardley, G. Emery, and J.E. Marynard, Clin. Chim. Acta4, 47-52(1973))에 존재하는 호기적 상태에서 배양될 수 있는 효모를 이용하여 ASA를 제조하는 방법을 포괄한다.
본발명에 사용된 효모들은 여기에 열거된 한정되지 않은 예를 포함하며 다음의 기탁 균주 지정으로 예시되었다 : 캔디다 블랜키(Candida blankii) CBS 1898, ATCC 18735; 캔디다 커르바타(C.curvata) CBS570; 캔디다 휴미콜라(C. humicola);캔디다 인코뮤니스(C. incommunis) ATCC22971; 캔디다 살만티센시스(C. salamnticensis) ATCC16042; C. sp. ATCC 28528, ATCC 20473; 크립토코커스 알비두스(Cryptococcus albidus) CBS4192; 크립토코커스 디메니(Cryptococcus dimennae) CBS 5770; 크립토코커스 헤비넨시스(Cryptococcus heveanensis) CBS 140; 크립토코커스 쿠트진지 (Cr. kuetzingii) UCD68-196; 크립토코커스 루테오로루스 (Cr. luteolus) CBS953; 크립토코커스 스키네리 (Cr. skinneri) UCD60-82 CBS5029; 크립토코커스 테리우스 (Cr. terreus) CBS1895, CBS6293 CCY17-8-5; 크립토코커스 위거투라투스 (Cr. uiguttulatus) CBS1730; 크립토코커스 로렌티 (Cr. laurentii) CCY 17-3-2, CCY17-3-6, ATCC32044; 크립토코커스 네오포르만스 (Cr. neoformans) ATCC32045; 크립토코커스 포드조리쿠스 (Cr. podzolicus) CCY17-20-1;트리코스포론 큐타니움 (Trichosporon cutaneum) UCD54-169 CCY30-5-4; 트리코스포론 베이길리 (T. beigelii) NRRLY-1490; 트리코스포론 풀루란스 (T. pullulans) ATCC10677; 오레오바시디움 풀루란스 (Aureobasidium pullulans) DBV A9, A10, A62, A77 A84; 한세눌라 캡수라타 (Hansenula capsulata) DBV 3164, ATCC24204; 림포마이세스 스타키 (Lipomyces starkeyi) UCD 51-55, CBS1809; 림포마이세스 리포퍼 (L. lipofer) NRRL Y-1351, 파피아 로도지마 (Phaffia rhodozyma) ATCC24201, 로도토루라 무시라기노사 (Rhodotorula mucilaginosa) NRC 211003; 싸카로마이세스 우바룸 (Saccharomyces uvarum) ATCC9373, ATCC 9080;싸카로마이코시스 피브리게라 (Saccharomycopsis fibuligera) ATCC2082; 슈와니노마이세스 옥시덴탈리스 (Schwanniomyces occidentails)NRC2782, NRC2783; 및 토루로시스 에르노비 (Torulopsis ernobii) ATCC20000. 바람직한 구체에에서 효모는 불완전 효모군에 속하는 멤버이다. ASA 제조 방법에 바람직한 불완전 효모과는 크립토코카시(Cryptococcaceae)이다. 크립토코카시(Cryptococcaceae)의 바람직한 속은 캔디다와 크립토코커스로 구성되는 그룹에서 선택되는 것이다.
실시예에서 보여지는 바와 같이, 캔디다 블랜키 및 크립토코커스 디메니는 KLG를 유일한 탄소원으로 하여 백그라운드 수준이상의 ASA를 제조하나, KLG를 유일한 탄소원으로 성장할 수 있는 캔디다 쉐하티(Candida shehatae)는 그렇지 못하다. 도시적인 실시예는 캔디다 쉐하티(Candida shehatae) ATCC 기탁번호 34887, 캔디다 블랜키(Candida blankii) ATCC 기탁번호 18735, 크립토코커스 디메니(Cryprococcus dimennae) ATCC 기탁번호 22024 및 크립토코커스 루테오루스(Cryprococcus luteolus) ATCC 기탁번호 32044의 이용을 공개하고 있다. 본발명은 알려진 종들의 돌연변이주들, 유도주들 및 자손들, 특히 크립토코카시속에 속하는 알려진, 예를 들어 캔디다 및 크립토코커스에 속하는 KLG를 유일한 탄소원으로 이용하여 ASA를 제조할 수 있는 돌연변이주, 유도주 또는 자손들을 포괄한다.
본발명은 천연적으로 존재하는 효모, 즉 유전적으로 조작되지 않은 효모뿐만 아니라 효모에서 탄소원을 KLG로 변환시킬 수 있는 산화 및/또는 환원 효소들을 인코딩할 수 있는 이성(heterologus) 핵산을 포함하는 재조합 효모에서 ASA 또는 ASA 입체이성질체를 제조할 수 있는 방법을 포괄한다. 본발명에서 6탄당산과 같은 탄소원은 효모 배지에 공급될 수 있는 라자루스 등에 의하여 공개된 방법(J.Bact. 1991, 173, 6651-61) 또는 싸이토 등에 의하여 공개된 방법(1997, Applied andEnvironmental Microbiology, 63: 454-460)에 의하여 만드어진 KLG와 같이 분리된 발효공정의 제조물일 수 있다. 분리된 공정으로부터 얻어진 탄소원은 ASA 또는 ASA 입테이성질체의 제조전에 정제되거나 발효공정으로부터 직접적으로 이용될 수 있다. 탄소원은 역시 화학적 수단으로부터도 얻을 수 있다.
본발명의 또다른 구체예에서, 효모는 탄소원의 KLG로의 전환에 관여하는 이성의 산화 효소 또는 이성의 환원 효소가 하나 또는 모두 도입되도록 유전적으로 조작되어, 포도당 또는 다른 6탄당의 탄소원으로부터 KLG를 중간체로 하여 아스코르빅산을 만들 수 있는 하나의 오르가니즘을 제공할 수 있다. 재조합 효모 숙주는 6탄당 또는 다른 6탄당산으로부터 아스코르빅산을 제조하기 위하여 다수의 이성 산화 효소들 및/또는 다수의 이성 환원 효소들을 포함할 수 있다.
본발명의 바람직한 구체예에서, 상기 탄소원이 포도당이고, (a)포도당 탈수소효소(GDH); (b) 글루코닉산 탈수소효소(GADH); (c) 2-키토-디-글루코닉산 탈수소효소(2-KDGDH); (d) 2,5-디키토-디-글루코닉 탈수소효소(2,5-DGKR)중 적어도 하나를 인코딩하는 이성 핵산을 포함하며, 효모가 (a) - (d) 의 일부만의 이성 핵산을 갖는 경우에는 효모는 내성(endogenous) 핵산을 가져서 상기 효모가 (a) - (d) 각각에대한 핵산을 포함하고 포도당으로부터 중간체KLG를 거쳐 ASA로 전환시킬 수 있는 효모이다. 당업자에게 이미 잘 알려진 바와 같이, 탄소 기질로부터 ASA로의 전환과정에는 산화 환원 반응들이 포함되며, 효모 배지에 조효소들을 첨가할 필요가 있을 수 있다. 예를 들어, 1991년 7월 16일 발행된 미국 특허공보 5032514의 2,5-DGKR은 NADPH를 필요로 한다. 효소반응에 필요한 조효소의 한정된지 않은 다른 예들은 ATP, NAD+, NADP+, NADH, NADPH 및 코엔자임 A이다. 효모들은 또한 원하는 탄소흐름을 방해하는 내성 산화 및/또는 환원 효소들의 결손 또는 돌연변이를 가질 수 있다.
본발명의 또다른 구체예에서, 탄소원은 소르비톨이고, 적어도 하나의 (a) 디-소르비탈 탈수소효소(SLDH); (b) 엘-소르보스 탈수소효소; (c) 엘-소르보솜(l-sorbosome) 탈수소효소(2-KDGDH)를 인코딩하는 이성 핵산을 포함하는, (a)-(c)의 이성 핵산을 전체보다 적게 포함하는 경우에는 효모는 (a)-(c)의 핵산을 내성으로 포함하며, 소르비톨으로부터 2KLG 중간체를 통한 ASA로의 전환능력을 포함하는 재조합 효모이다.
산화 또는 환원 효소들을 인코딩하는 핵산의 소스(인용문헌)는 다음을 포함한다.
포도당 탈수소효소: 스미스 등(Smith et al. 1989,, Biochem. J.
261:973; Neijssel et al. 1989, Antonie Van Leauvenhoek 56(1):51-61)
글루코닉산 탈수소효소:마쓰시다 등(Matsushita et al. 1979, J.
Biochem. 95:1173; Kulbe et al. 1987, Ann. N.Y.Acad.Sci 506:552)
2-키토-디-글루코닉산 탈수소효소:스트로쉐인(Stroshane
1977 Biotechnol. BioEng 19(4) 459)
2-키토 글루코네이트 환원효소:J. Gen. Microbiol. 1991, 137:1479
2,5-디키토-디-글루코닉산 환원효소: 미국 특허공보 번호들 5795761;
5376544; 5583025; 4757012; 4758514; 5008193; 5004690; 5032514
엘-소르보스 탈수소효소; 엘-소르보손 탈수소효소; 및
엘-소르비톨 탈수소효소: 싸이토등.(Applied and
Environmental,1997, Microbiology 63:454)
재조합 효모의 제작
탄소원으로부터 ASA의 제조에 필요한 핵산(들)을 포함하는 재조합 효모는 당업계에 잘 알려진 방법에 의하여 제조될 수 있다. 분자생물학적 방법들은 샘브룩 등의 Molecular Biology Cloning: A Laboratory Manual, second edition(1989) Cold Spring Harbor Laboatory Press, Cold Spring Harbor, NY(1989)에 기술되어 있다. ASA의 제조에 관련된 산화 효소들 또는 환원 효소들을 인코딩하는 유전자들은 이하에 기술된 천연적 숙주로부터 또는 화학적 방법에 의하여 분리될 수 있다. 예를 들어, 유전자의 서열이 알려진 경우에는 알맞은 지노믹 라이브러리들을 제한 엔도뉴클리아제로 처리하여 얻을 수 있으며, 원하는 유전자에 상보적인 프루브들을 이용하여 스크리닝할 수 있다. 서열이 분리되면, PCR(미국특허 4683202)등의 표준 프라이머를 이용한 유전자 증폭 방법으로 알맞은 벡터들에 형질전환시키기 위하여 충분한 양으로 증폭될 수 있다. 효모에 ASA의 제조에 관련된 산화 및 환원 효소들을 인코딩하는 핵산을 형질전환 및 발현에 알맞은 다양한 벡터들 및 형질전환방법 및 발현 카세트들이 당업계에 잘 알려져 있다. 이러한 벡터들의 입수 및 사용에 대한 프로토콜 역시 당업계에 잘 알려져 있다(Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual- volume1,2,3(Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, (1989))).
전형적으로 벡터 또는 카세트등은 핵산의 전사 및 번역, 선택적 마커, 및 복제 개시점 또는 염색체에 삽입을 조절할 수 있는 서열들을 포함한다. 알맞은 벡터들은 유전자의 5' 부분에 전사를 개시를 조절하는 부분을 포함하고 DNA 단편의 3' 부분에 전사의 종료를 조절하는 서열을 포함한다. 이러한 조절 부분들은 효모에서 작용 가능한 조절부분으로 효모에 내성 또는 이성인 유전자로부터 얻을 수 있다.
효모에서 산화 또는 환원 효소들의 발현을 유도하는 유용한 개시 조절 부분 또는 프로모터들은 당업계에 잘 알려져 있다. 사실상 이러한 유전자들을 조절할 수 있는 임의의 프로모터는 본발명에 적합하며, 제한되지 않은 예로서 CYC1, HIS3, GAL1, GAL10, ADH1, PGK, PHO5, GAPDH, ADC1, TRP1, URA3, LEU2, ENO, TPI를 포함한다. 산화 또는 환원 효소들을 인코딩하는 유전자들은 개시 코돈은 선택된 발현 조절 부분에 산화 또는 환원 효소들의 효율적인 발현을 위하여 작동 가능하게 연결되었다.
알맞은 카세트들이 제작되어 효모에 형질전환에 사용되고 알맞은 탄소원으로부터 ASA를 제조할 수 있는 효모가 스크리닝되었다. 예를 들어, 한 구체예에서 하나 또는 모두의 탈수소효소 활성 및 환원 효소를 인코딩하는 핵산으로 형질 전환되고, 6탄당, 포도당 또는 KLG와 같은 6탄당산으로부터 ASA를 제조할 수 있는 효모가 스크린되었다.
ASA의 검출
ASA 또는 ASA 입체이성질체들을 검출할 수 있는 방법은 2,6-디클로로인도페놀로 산화환원 적정을 이용하는 방법(Burton et al. 1979, J.Assoc.Pub. Analysts17:105); 음이온 교환수지를 이용한 고성능 액상 크로마토그래피(HPLC) 방법(J.Chrom.1980, 196:163); 전기적 산화환원 과정(Pachia, 1976, Anl. Chem. 48:364) 방법이 있다. 아스코르빅산 산화 효소의 이용을 포함하는 효소적 방법도 이용될 수 있다.
본발명에서 ASA의 검출은 HPLC를 이용하여 수행되었다. 여기에 색채적 아스코르베이트 산화효소 에세이 방법이 사용되었고 GC-질량 스펙트로포토메트리가 사용되었다. 당업자는 이러한 검출 방법들의 이용을 위한 콘트롤들을 잘 알고 있다. KLG와 ASA의 화학적 평형에 의하여 아스코르빅산의 HPLC UV 검출에서 KLG의 기질의 용리 프로파일이 기록되고 콘트롤로 사용되었다. 아스코르베이트 산화효소 에세이에서 블랭크 콘트롤은 시료 및 효소없이 수행되었다. GCMS 분석에서 유도제 및 KLG 기질이 콘트롤로 분석되었다.
탄소원으로부터 ASA를 제조할 수 있는 효모를 스크리닝할 수 있는 방법을 가지는 것이 바람직하다. ASA를 제조할 수 있는 효모를 스크리닝하는 방법은 ASA 또는 ASA 입체이성질체에 의존하여 성장할 수 있는 효모를 얻으며, 상기 효모를 ASA 또는 ASA 입체이성질체의 제조에 알맞은 조건에서 KLG의 존재하에 배양하고; 상기 ASA 또는 ASA 입체이성질체의 제조을 위한 효모 배양액을 에세이하는 것이다.
발효 및 정제
배지 및 탄소 기질들:
KLG로부터 ASA를 제조할 수 있는 능력을 지닌 천연적으로 존재하는 효모 또는 재조합 효모가 알맞은 탄소원이 존재하는 대용량 발효에 접종되고, ASA가 회수되었다. 알맞은 탄소원은 6탄당 또는 6탄당산들을 포함한다. 여기에 공개된 효모의 배양에 사용되는 탄소원들은 숙주 오르가니즘에 의하여만 제한될 것이다. 예를 들어, 천연적을 존재하는 효모는 6탄당, 예를 들어 KLG의 존재하에 성장할 수 있는 반면, 재조합 효모는 탈수소효소 및 환원 효소의 하나 또는 전부를 인코딩할 수 있는 핵산을 포함하도록 조작된 효모는 6탄당산, 예를 들어 포도당의 존재하에 성장할 수 있다. 알맞은 탄소원에 더하여, 발효 배지는 알맞은 무기질, 염, 조효소, 버퍼 및 당업계에 알려진, 배양과 ASA의 제조에 알맞은 다른 요소들을 함유하여야 한다. 효모의 성장에 알맞은 배지와 배양 조건 방법은 코스타마그나 등에 의하여 기술되어 있다(Costamagna et al., 1986, Can. J. Microbilogy, 32:756-758).
효모는 호기적 또는 혐기적 조건에서 배양될 수 있다. ASA는 산소에 민감하며, 따라서 제조된 ASA의 산화를 감소시키기 위하여 효모를 혐기적으로 배양할 수 있다. 선택적으로, 만약 효모가 호기적 조건에서 배양된다면, 디티오에트리스레톨(dithioetrythretol), 글루타치온와 같은 환원제, EDTA 같은 금속 킬레이터, 메타포스포릭산, 아미노산들, 글리콜, 당들, 옥살릭산, 트리클로로아세틱산, 8-히드로퀴놀린과 같은 안정제들이 ASA환경에 존재하는 호기적 상태에서 배양될 수 있다. 본발명은 회분 또는 연속 발효 및 ASA의 제조이 하나 또는 두개의 발효조에서의 과정을 포괄한다. 예를 들어, 효모가 유전자 조작을 통하여 6탄당으로부터 예를 들어, 포도당에서 6탄당으로의 예를 들어, KLG로의 경로로 구성되도록 조작되어 ASA 제조이 재조합 효모를 숙주로 하여 하나의 발효조에서 진행될 수 있다. 만약 천연적으로 존재하는 효모이면, ASA는 6탄당 예를 들어 KLG로부터 제조되고, ASA의 제조은 두개의 발효조에서 진행될 수 있으며, 하나에서는 상기 싸이토등에 의하여 기술된 미국특허 5032514과 같이 KLG를 제조하고, 다른 하나에서는 효모에서 KLG로부터 ASA를 제조한다.
전통적인 회분 발효는 초기 배지의 조성이 발효기간동안 인위적인 변경없이 유지되는 폐쇄 시스템이다. 따라서, 발효 초기에 배지는 원하는 오르가니즘 또는 오르가니즘들로 접종되며, 시스템에 아무런 첨가없이 발효가 진행된다. 전형적으로, 그러나, 회분발효에서 탄소원의 첨가와 pH 및 산소농도와 같은 요소들을 조절이 함께 수행된다. 회분 시스템의 대사물과 생체조성은 발효가 끝날때까지 계속 변화한다. 회분 배양내에서 세포들은 지체기로부터, 대수생장기 및 세포의 성장이 멈추는 사멸기에 이르기까지 적응한다. 만약 아무런 조치를 취하지 않으면, 정체기의 세포들은 결국 죽게될 것이다. 대수생장기의 세포들이 일반적으로 최정 제조물 또는 중간체의 대량 제조을 담당한다.
기본 회분 발효 시스템의 변형으로서 본발명에 적합한 반회분(Fed-batch) 발효법이 있다. 전형적인 회분 발효의 변형에서는 기질이 발효가 진행됨에 따라서 증가하여 첨가된다. 반회분 시스템은 세포의 대사를 방해하는 기질의 양을 제한하고 배지에 제한된 양으로 존재하게 하여 카타볼라이트 억제에 유용하다. 반화분 시스템에서 실제 기질 농도를 측정하는 것은 어려우며, 따라서 pH, 용존산소, 배출CO2분압등의 측정가능한 요소들의 변화에 근거하여 추정된다. 회분 및 반회분 발효는 당업계에 잘 알려져 있으며, 그 예는 상기 브록(Brock)책에서 찾을 수 있다.
본방법이 연속 발효 방법에 적합할 수 있도록 고려되었다. 연속 발효는 일정한 발효 배지가 발효조에 계속적으로 공급되는 개방계이며, 동일한 양의 배지가 발효과정에서 동시에 제거된다. 일반적으로 연속배양에서는 대체로 대수 증식기의 세포를 계속적으로 고농도로 유지한다.
연속 발효는 세포의 성장 또는 최종 제조물 농도에 영향을 주는 하나의 요소 또는 그 이상의 요소를 조절가능하게 한다. 예를 들어, 탄소원 또는 질소 수준과 같은 영양농도의 제한을 유지하고 다른 인자들은 알맞게 할 수 있다. 또 다른 시스템에서 성장에 영향을 주는 수개의 요소가 배지 탁도에 의하여 측정되는 세포농도를 일정하게 유지하기 위하여 변화될 수 있다. 연속 시스템은 일정한 성장 조건을 유지하여 발효조에서 배지의 제거로 인한 세포의 유출과 세포의 성장이 균형을 이루도록 노력한다. 연속 발효에서 영양분 및 성장 요소들을 조절하는 것 뿐만 아니라 제조물 형성을 극대화할 수 있는 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 다양한 방법이 상기 브록에 의하여 기술되어 있다.
본발명에 따른 방법은 회분, 반회분 또는 연속 발효를 이용하여 실시될 수 있다. 발효후에, 제조된 ASA는 발효배지로부터 이온 교환 수지,흡착 또는 이온 지연 수지, 활성탄, 농축 결정화 등를 포함한 다양한 방법으로 회수될 수 있다.
본발명의 다양한 측면은 본발명의 범위를 제한하지 않는 다음의 특정 실시예들에 비추어 더 기술될 것이다.
다음의 성분 및 방법들은 실시예 1 내지 3에서 사용되었다.
배양 조건:
효모는 초기의 2% 포도당인 디프코사의 효모 질소 베이스(YNB) 6.7g/l에서 0.5%(w/v)의 엘-ASA의 유일한 탄소원으로의 공급하고 그 다음 2-KLG 또는 엘-이도네이트를 20.8mM으로 공급되는 배지에서 배양되었다. 효모는 50ml YNB 배지에서 22°C, pH 5.5에서 48시간동안 250rpm의 교반 속도로 쉐이크-플라스크에서 배양되었다.
HPLC:
아스코르베이트 또는 다른 키토당산들의 HPLC 용리는 디오넥스 이온팩(Dionex IonPac AS 10)분석 컬럼 및 가드(guard)컬럼을 이용하여 수행되었다. 40mM 아세테이트 pH 4.86을 이용한 이소크락틱(isocratic) 용리가 KLG기질과 아스코르베이트 제조물의 좋은 잔류시간 분리(>5분)을 얻기 위하여 사용되었다. 아스코르베이트는 245-270nm의 파장에서 UV 검출기를 이용하여 검출되었으나(>100ppb), 반면 KLG는 굴절 계수 검출기를 이용하여 검출되었다. 본연구를 위하여 사용된 HPLC 시스템은 정점 넓이를 산출하기 위한 밀레니움 소프트웨어가 장치된 HP-Alliance 기계가 사용되었다. 아스코르베이트 측정을 위한 교정 곡선(calibration curve)은 100ppb-100ppm사이로 조정되었다.
GC-MS:
GC-MS를 이용한 아스코르베이트 확인은 공표된 방법에 따라서 수행되었다(J.C. Deutsch and J.Fred. kolhoue, Anal. Chem., 1993, 65, 321-326). GC 수행은 HP기구5890상 15 미터ㅡ 0.25mm 슈펠코 SPB-1 퓨즈된 실리카 모세관을이용하여 수행되었다. 아스코르베이트 유도화는 N-메틸-N-(터트-뷰틸디메틸시릴)트리플로로아세타미드((N-methyl-N(tert-butyldimethylsilyl)trifluoroacetamide) 및 아세코나이트릴를 상기 문헌에 보고된 방법에 따라 이용하였다. 우리의 실험 조건하에서 표준 아스코르베이트 잔류시간은 8.75분이다.특징적인 질량 단편 패턴으로 스펙트라에서 표준시료와 미지시료에서 모두 m/z 575, 531, 443, 343이 검출되었다.
아스코르베이트 산화효소 에세이:
아스코르베이트 산화효소 에세이는 베링거 맨하임의 엘-아스코르빅산 측정 키트(cat. No. 409677)을 이용하여 키트에서 제공된 방법에 따라서 수행되었다. 키트는 아스코르베이트 산화 효소 및 검출/MTT 및 PMS 염료 시스템(Beutler, H.-O. and Beinstingl, G, 1984m in methods if enzymatic analysis(Bergmeyer,H.U.Ed.)3rd ed., col.7,pp.376-385, Verlag Chemie, Weinheim, Deerfiled, Beach/Florida, Basel)커플된 분량측정(578nm)를 포함한다.
콘트롤 및 블랭크:
0.5% 2-KLG 수용액은 pH 6.1에서 ~2ppm의 아스코르베이트를 함유한다. KLG를 함유한 버퍼만의 콘트롤 반응이 각각의 실험에서 전체 세포의 KLG의 ASA로의 전환 시간 코스실험에서 각각의 실험에서 동시에 수행되었다. 또 다른 콘트롤에서는 효모 세포들을 열처리 사멸시키고 KLG에서 배양하여, KLG의 ASA로의 전환이 이러한 조건에서 검출되지 않도록 하였다. HPLC 분석에서 아스코르베이트 정점은 아스코르베이트 산화효소 반응에 의하여 확인되었으며, 크로마토그람에서 아스코르베이트정점의 소멸은 아스코르베이트 산화효소에 의한 분해에 의한 것이다.
실시예1:
본 실시예는 효모, 캔디다 블랭키가 KLG 또는 이도네이트를 유일한 탄소원으로 이용하여 성장할 수 있음을 보여준다. 본 실시예는 KLG를 유일한 탄소원으로 성장할 때 캔디다 블랭키에의한 아스코르빅산의 제조을 보여준다.
ATCC 기탁번호 18735를 가지는 캔디다 블랭키가 상기 성분 빛 방법 부분에서 기술된 바와 같이 배양되었다. 전체-세포의 KLG의 ASA로의 반응이 다음과 같이 실시되었다. 대략 3 그람의 습식 세포가 500ml의 48시간 배양액이 4°C에서 9000rpm으로 원심분리되어 수집되었다. 세포들은 차가운 200mM, pH6.13의 0.5mM EDTA를 함유하는 인산 버퍼로 세척되었다. 0.5% KLG를 함유하는 동일한 버퍼에 다시 서스펜션되었다. 3ml의 반응 혼합액이 분리되고, 전자 랜지에서 2분간 끓여졌다. 전체 반응 혼합액이 전체-세포 ASA제조을 위하여 로타리 배양기에서 30°C로 세팅되었다. 1.5ml 샘플이 시간0에서 분리되고, 세포 펠릿을 제거하기위하여 원심분리하고 -20°C에 보관하였다. 상층액은 0.2μ필터를 통과시키고, 상기 기술된 아스코르베이트 산화 효소 및 GCMS 분석이 따르는 HPLC 분석에 이용되었다. 분리된 동일한 샘플 및 실시 방법이 2, 4 및 20 시간 포인트의 생-세포 반응에 이용되었으며, 20 시각 샘플로 열 사멸된 반응 혼합액에 사용되었다(표1). 열 사멸된 샘플들은 ASA의 백그라운드 수준이 없으며, ASA를 제조하지 않았다.
시간20 샘플의 분리후에, 반응 혼합액의 pH가 시트레이트-인산 버퍼를 이용하여 pH 3.15로 세 pH 단계 낮추어졌다. 시간21에서 분리되고 분석된 샘플은 이러한 조건변화의 시간0으로 표시되었다. 반응은 밤세워 지속되도록 하였다. 다시 24시간의 경과후에 마지막 샘플을 분리하였다. 양 pH 값에서 KLG로부터 ASA의 제조의 백그라운드를 관찰하기 위하여 세포가 없는 KLG 블랭크 콘트롤 반응이 나란히 수행되었다(표1, 도3 참조).
표1 및 도3에서 보는 바와 같이, KLG를 유일한 탄소원으로 캔디다 블랭키를 전체 세포 배양할 때, 반응 배지에 ASA의 존재가 확인되었다. 반응 혼합액의 ASA의 농도는 백그라운 수준의 3배로 존재한다. 반응 혼합액을 pH 3으로 낮추면, 다시 ASA 수준의 3배 증가가 관찰되었다. pH를 낮추는 것은 ASA를 안정화시키는 것 뿐만 아니라 열역학적으로 ASA의 제조을 촉진한다.
실시예2:
본실시예는 크립토코커스 디메니가 KLG 또는 이도네이트를 유일한 탄소원으로 성장할 수 있음을 보여준다. 본실시예는 KLG를 유일한 탄소원으로하여 성장할 때 크립토코커스 디메니에 의한 아스코르빅산 제조을 보여준다.
ATCC 기탁번호 22024를 가지는 크립코커스 디메니가 성분 및 방법에서 기술된 바와 같이 배양되었다. 전체세포의 KLG에서 ASA로의 반응은 실시예1에서와 같이 수행되었다.
표1 및 도3에서 보는 바와 같이, 전체 세포 크립토코커스 디메니를 KLG를 유일한 탄소원으로 배양할 때, 반응 혼합액에 ASA의 존재가 확인되었다. 반응 혼합액에 존재하는 ASA의 농도는 백그라운드 수준의 2배이다.
실시예3:
본실시예는 캔디다 쉐하티가 KLG를 유일한 탄소원으로 성장할 수 있으나, ASA를 제조할 수 없음을 보여준다. 전체 세포가 KLG에서 ASA로의 반응이 실시예1에서 기술된 바와 같이 실시되었다. 도1에서 보여지는 바와 같이, 캔디다 쉐하티는 이러한 조건에서 KLG로부터 ASA를 제조할 수 없다.
샘플의 흡광도/면적 및 ASA의 농도(mg/L)
266nm에서의 흡광도/면적 아스코르빅산 농도(mg/L)
샘플 시간 0 시간 4 시간 20 시간 0 시간 4 시간 20
2KLG 버퍼 블랭크 259831 280706 264840 1.9 2.1 1.9
캔디다 블랭키 314059 240613 905162 2.3 1.8 6.6
캔디다 쉐하티 204867 205323 270663 1.5 1.5 1.9
크립토코커스 디메니 224203 223112 522325 1.6 1.6 3.8

Claims (40)

  1. 아스코르빅산 또는 아스코르빅산 입체이성질체를 효모에서 제조하는 방법에 있어서,
    a)KLG로부터 아스코르빅산 또는 아스코르빅산 입체이성질체를 제조할 수 있
    는 능력을 가진 효모의 획득; 및
    b)아스코르빅산 또는 아스코르빅산 입체이성질체의 제조에 적합한 조건에서
    탄소원의 존재하에 상기 효모를 배양하는 단계
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 아스코르빅산 회수 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 탄소원이 6탄당산인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 6탄당산이 2-키토-엘-굴로닉산, 이도닉산, 글루코닉산, 6-인산글루코네이트, 2-키토-디-글루코닉산, 5-키토-디-글루코닉산, 2-키토글루코네이트-6-인산, 2,5-디키토-엘-글루코닉산, 2,3,-엘-디키토굴로닉산, 디히드로아스코르빅산, 에리스로아스코르빅산 및 디-만노익산을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 탄소원이 6탄당이고, 상기 효모가 a)아스코르빅산 또는 아스코르빅산 입체이성질체를 상기 효모에서 제조에 관련된 산화 효소를 인코딩하는 이성 핵산 및 b)아스코르빅산 또는 아스코르빅산 입체이성질체를 상기 효모에서 제조에 관련된 환원 효소를 인코딩하는 이성(heterologus) 핵산중 하나 또는 모두를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 6탄당이 포도당, 굴로스(gulose), 이도스, 갈락토스, 만노스, 소르보스 및 프락토스를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제5항에 있어서, 상기 산화 효소가 탈수소효소 활성을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 탈수소효소가 포도당 탈수소효소 활성, 글루코닉산 탈수소효소 활성, 2-키토-디-글루코닉산 탈수소효소 활성, 갈락토스 탈수소효소 활성, 엘-소르보스 활성,디-소르비톨 탈수소효소 활성, 엘-소르보손 탈수소효소 활성, 엘-이도닉산 산화효소 및 엘-굴로닉산 산화효소를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제5항에 있어서, 상기 환원 효소가 환원효소 활성인 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 환원효소 활성이 2,5-DGK 환원효소 활성, 2,5-DKG 환원효소 활성, 2,3-DKG 환원효소, 5-키토 환원효소, 2-키토 환원효소 및 2-키토굴로네이트 환원효소를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제1항에 있어서, 상기 탄소원이 포도당이고, (a)포도당 탈수소효소(GDH); (b) 글루코닉산 탈수소효소(GADH); (c) 2-키토-디-글루코닉산 탈수소효소(2-KDGDH); (d) 2,5-디키토-디-글루코닉 탈수소효소(2,5-DGKR)중 적어도 하나를 인코딩하는 이성 핵산을 포함하며, 효모가 (a) - (d) 의 일부만의 이성 핵산을 갖는 경우에는 효모는 내성(endogenous) 핵산을 가져서 상기 효모가 (a) - (d) 각각에대한 핵산을 포함하고 포도당으로부터 중간체KLG를 거쳐 ASA로 전환시킬 수 있는 효모인 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제1항에 있어서, 효모가 불완전 효모군의 멤버인 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 효모가 크립토코커시(Cryptococcaceae)과의 멤버인 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제13항에 있어서, 효모가 캔디다(Candida) 및 크립토코커스(Cryptococcus)를포함하는 방법.
  15. 제14항에 있어서 효모가 캔디다 블랭키(Candida blankii)인 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제14항에 있어서, 효모가 크립토코커스 디메니(Cryptococcus dimennae)인 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제1항에 있어서, 상기 효모가 캔디다 블랭키(Candida blankii) 또는 크립토코커스 디메니(Cryptococcus dimennae)이고, 상기 탄소원이 포도당을 포함하며, 상기 효모가 이성 포도당 탈수소효소 활성 및 2,5-DKG환원효소 활성을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제1항에 있어서, 상기 효모가 캔디다 블랭키 또느 크립토코커스 디메니이고, 상기 탄소원이 디-소르비톨, 엘-소르보스 또는 엘-소르보손을 포함하고, 상기 효모가 엘-소르보스 활성, 디-소르비톨 탈수소효소 활성, 엘-소르보손 탈수소효소 활성 및 갈락토스 탈수소효소 활성중 적어도 하나를 포함하는 방법.
  19. 제1항에 있어서, 상기 아스코르빅산 입체이성질체가 디-아스코르빅산, 디-아라보아스코르빅산 및 엘-아라보아스코르빅산을 포함하는 방법.
  20. KLG를 이용하여 아스코르빅산 또는 아스코르빅산 입체이성질체를 제조할 수 있는 재조합 효모에 있어서,
    a) 상기 효모에서 아스코르빅산 또는 아스코르빅산 입체이성질체의 제조에
    관련된 산화효소를 인코딩하는 이성 핵산 및
    b) 상기 효모에서 아스코르빅산 또는 아스코르빅산 입체이성질체의 제조에
    관련된 환원효소를 인코딩하는 이성 핵산중 하나 또는 모두를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 효모.
  21. 제20항에 있어서, 상기 산화효소가 탈수소효소 활성인 것을 특징으로 하는 효모.
  22. 제21항에 있어서, 상기 탈수소효소가 포도당 탈수소효소 활성, 글루코닉산 탈수소효소 활성, 2-키토-디-글루코닉산 탈수소효소 활성, 갈락토스 탈수소효소 활성, 엘-소르보스 활성, 디-소르비톨 탈수소효소 활성, 엘-소르보손 탈수소효소 활성, 엘-이도닉산 산환효소 및 엘-굴로닉산 산화효소를 포함하는 것을 특징으로 하는 효모.
  23. 제20항에 있어서, 상기 환원효소가 환원효소 활성인 것을 특징으로 하는 효모.
  24. 제23항에 있어서, 상기 환원효소 활성이 2,5DKG환원효소 활성, 2,5-DKG환원효소 활성, 2,3-DKG 환원효소, 5-키토환원효소, 2-키토 환원효소 및 2키토굴로네이트 환원효소를 포함하는 것을 특징으로 하는 효모.
  25. 제20항에 있어서, 효모가 불완전 효모군의 멤버인 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 제25항에 있어서, 효모가 크립토코커스과의 멤버인 것을 특징으로 하는 효모.
  27. 제26항에 있어서, 효모가 캔디다 및 크립토코커스를 포함하는 것을 특징으로 하는 효모.
  28. 제27항에 있어서, 효모가 캔디다 블랭키인 것을 특징으로 하는 효모
  29. 제27항에 있어서, 효모가 크립토코커스 디메니인 것을 특징으로 하는 효모.
  30. 제20항에 있어서, 상기 효모가 캔디다 블랭키 또는 크립토코커스 디메니이고, 상기 탄소원이 포도당을 포함하며, 상기 효모가 이성 포도당 탈수소효소 활성 및 2,5-DKG환원효소 활성을 포함하는 것을 특징으로 하는 효모.
  31. 제20항에 있어서, 상기 효모가 캔디다 블랭키 또는 크립토코커스 디메니이고, 상기 탄소원이 디-소르비톨, 엘-소르보스 또는 엘-소르보손을 포함하며, 상기 효모가 엘-소르보스 활성, 디-소르비톨 탈수소효소 활성, 엘-소르보손 탈수소효소 활성 및 갈락토스 탈수소효소 활성중 적어도 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 효모.
  32. 6탄당을 이용하여 ASA 또는 ASA 입체이성질체를 제조할 수 있는 재조합 효모를 제조하는 방법에 있어서
    a)KLG를 이용하여 ASA 또는 ASA 입체이성질체를 제조할 수 있는 효모를 획득
    단계 및
    b) i)상기 효모에서 ASA 또는 ASA 입체이성질체의 제조에 관련된 산화효소를
    인코딩하는 이성 핵산 ii)상기 효모에서 ASA 또는 ASA 입체이성질체의 제조
    에 관련된 환원효소를 인코딩하는 이성 핵산중 하나 또는 모두를 도입하는
    단계
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  33. 제32항에 있어서, 상기 효모가 불완전 효모군의 멤버인 것을 특징으로하느 방법.
  34. 제33항에 있어서, 효모가 크립토코커시과의 멤버인 것을 특징으로 하는 효모.
  35. 제34항에 있어서, 효모가 캔디다 및 크립토코커스를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  36. 제35항에 있어서, 효모가 캔디다 블랭키인 것을 특징으로 하는 방법.
  37. 제35항에 있어서, 효모가 크립토코커스 디메니인 것을 특징으로 하는 방법.
  38. 제32항에 있어서, 상기 효모가 캔디다 블랭키 또는 크립토코커스 디메니이고, 상기 탄소원이 포도당을 포함하며, 상기 효모가 이성 포도당 탈수소효소 활성 및 2,5-DKG환원효소 활성을 포함하는 것을 특징으로 하는 효모.
  39. 제32항에 있어서, 상기 효모가 캔디다 블랭키 또는 크립토코커스 디메니이고, 상기 탄소원이 디-소르비톨, 엘-소르보스 또는 엘-소르보손을 포함하며, 상기 효모가 엘-소르보스 활성, 디-소르비톨 탈수소효소 활성, 엘-소르보손 탈수소효소 활성 및 갈락토스 탈수소효소 활성중 적어도 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 효모.
  40. ASA를 제조할 수 있는 효모를 스크리닝하는 방법에 있어서, 아스코르빅산 또는 아스코르빅산 입체이성질체에 의존하여 성장할 수 있는 효모를 얻는 단계, 아스코르빅산 또는 아스코르빅산 입체이성질체의 제조에 일맞은 조건에서 KLG의 존재하에 상기 효모를 배양하는 단계; 및 상기 효모 배양액의 아스코르빅산 또는 아스코르빅산 입체이성질체의 제조을 에세이하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
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