ES2267308T3 - Produccion de acido ascorbico usando levadura. - Google Patents
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Abstract
Un método para la producción de ácido ascórbico o de un estereoisómero de ácido ascórbico en una levadura, que comprende las etapas de: a) obtener una levadura capaz de utilizar ácido 2-ceto-L-gulónico (KLG) como única fuente de carbono para producir ácido ascórbico o un estereoisómero de ácido ascórbico; y b) cultivar la levadura en presencia de una fuente de carbono en condiciones adecuadas para la producción de ácido ascórbico o de un estereoisómero de ácido ascórbico, en el que la levadura es natural o es una levadura según la reivindicación 20.
Description
Producción de ácido ascórbico usando
levadura.
La presente invención se refiere al campo de la
biología molecular y al uso de levaduras para la producción de
ácido ascórbico y de estereoisómeros de ácido ascórbico.
El ácido L-ascórbico (vitamina
C, AAS) tiene uso en las industrias farmacéutica y alimentaria como
vitamina y antioxidante. La síntesis de AAS ha recibido una
atención considerable durante muchos años debido a su volumen de
mercado relativamente grande y a su elevado valor como producto
químico especializado. El método
Reichstein-Grussner, una ruta química desde glucosa
a AAS, se describió por primera vez en 1934 (Helv. Chim. Acta 17:
311-328). Lazarus et al. (1989, "Vitamin
C: Bioconversion via a Recombinant DNA Approach", Genetics and
Molecular Biology of Industrial Microorqanisms, American
Society for Microbiology, Washington D.C., editado por C.L.
Hershberger) describió un método de bioconversión para la
producción de un intermedio de AAS, ácido
2-ceto-L-gulónico
(2-KLG, KLG), que se puede convertir químicamente
en AAS. Saito et al. (1997, Applied and Environmental
Microbiology, 63: 454-460) informa de la
construcción de un sistema de expresión para la producción de
2-KLG a partir de D-sorbitol.
Chemical Abstracts, vol. 84, nº 5, 2 de feb. de 1976, sumario nº:
29189, documento WO 87/00863 y documento US 5.032.514 tratan la
producción de AAS en bacterias.
Se ha informado de la presencia de AAS en
levaduras (Heick et al., Can. J. Microbiol., 1972, 18,
597-600) y se ha descrito la conversión de
sustratos de ácido L-galactónico a AAS en la
levadura Candida (patentes de Estados Unidos 4.595.659, expedida el
17/6/86, y 4.916.068, expedida el 10/4/90). Haller et al.,
(1990) Dechema Biotechnology Conferences, DE, Weinheim, vol. 4, 1
de enero de 1990, páginas 233-236, y Morimitsu
et al. (1978) Archives of Biochemistry and Biophysics, vol.
191, nº 2, páginas 479-489, también tratan la
producción de AAS en levaduras. Costamagna et al. (Can. J.
Microbiol., 1986, 32, 756-758) describe los
resultados de un estudio sobre la utilización de AAS por algunas
levaduras. Este informe describe que las especies de
Cryptococcus y Candida fueron capaces de crecer con
AAS, así como con ácido isoascórbico.
A pesar de los avances científicos hechos en la
producción de AAS y de sus intermedios biocatalíticos, permanece la
necesidad de métodos para la producción de ácido ascórbico para
satisfacer la demanda mundial. El descubrimiento de un método que
utiliza una fuente de carbono renovable para producir ácido
ascórbico sería particularmente ventajoso.
La presente invención se refiere a la producción
de ácido ascórbico o de estereoisómeros de ácido ascórbico en
levaduras. La presente invención se basa en parte en el
descubrimiento inesperado de que múltiples miembros de las
levaduras que son capaces de crecer con ácido ascórbico o con ácido
isoascórbico como única fuente de carbono son capaces de utilizar
KLG como única fuente de carbono para producir ácido ascórbico. Por
lo tanto, la presente invención proporciona métodos para la
producción de ácido ascórbico o de un estereoisómero de ácido
ascórbico a partir de levaduras.
La Figura 1 ilustra el crecimiento de Candida
blankii, Candida shehatae y Cryptococcus dimennae
con 2KLG como única fuente de carbono en base de nitrógeno para
levaduras.
La Figura 2 ilustra el crecimiento de Candida
blankii, Candida shehatae, Cryptococcus dimennae y
Cryptococcus luteolus con sal sódica de idonato en base de
nitrógeno para levaduras.
La Figura 3 ilustra la determinación del
contenido de AAS en el sobrenadante de Candida blankii y
Cryptococcus dimennae a partir de una mezcla de reacción con
células completas mediante el uso del ensayo de ascorbato
oxida-
sa.
sa.
Como se usa aquí, la expresión "ácido
ascórbico" es el nombre reconocido por la Comisión de
Nomenclatura Bioquímica de la IUPAC-IUB para la
vitamina C. Otros nombres son ácido L-ascórbico,
ácido L-xiloascórbico y
\gamma-lactona del ácido
L-treo-hex-2-enoico.
La vitamina pura es C_{6}H_{8}O_{6} y tiene un peso molecular
de 176,13. Son posibles cuatro estereoisómeros de ácido ascórbico:
ácido L-ascórbico, ácido
D-araboascórbico (ácido eritórbico), que muestra
actividad de vitamina C, ácido L-araboascórbico y
ácido D-xiloascórbico. Los intermedios de ácido
ascórbico o "intermedios de ruta" son aquellos productos
bioquímicos capaces de convertirse en AAS por medios enzimáticos o
químicos e incluyen, pero no se limitan a, ácido glucónico, ácido
2-ceto-D-glucónico,
ácido
2,5-diceto-D-glucónico,
ácido
2-ceto-L-gulónico,
ácido idónico, ácido glucónico, sorbitol, sorbosa, sorbosona, y
sorbosa diaceto-
na.
na.
La frase "capaz de utilizar KLG para producir
ácido ascórbico o un estereoisómero de ácido ascórbico", cuando
se refiere a una levadura, significa una levadura que es capaz de
producir ácido ascórbico a partir de KLG por cualquier medio, que
incluye la conversión biocatalítica.
Se entiende en la técnica que los derivados
ácidos de los sacáridos pueden existir en una diversidad de estados
de ionización que dependen del medio circundante, si están en
disolución, o, si están en forma sólida, fuera de la disolución a
partir de la que se preparan. El uso de una expresión tal como, por
ejemplo, ácido idónico para designar tales moléculas pretende
incluir todos los estados de ionización de la molécula orgánica a la
que se refiere. Así, por ejemplo, "ácido idónico", su forma
cíclica "idonolactona", e "idonato" se refieren al mismo
resto orgánico, y no pretenden especificar estados de ionización o
formas químicas particulares.
Como se usa aquí, el término "recombinante"
se refiere a una levadura que contiene ácido nucleico que no se da
de forma natural en el organismo y/o a una levadura que tiene copias
adicionales de ácido nucleico endógeno introducidas de forma
recombinante. El término "heterólogo", como se usa aquí, se
refiere a secuencias de ácido nucleico o de aminoácidos que no se
dan de forma natural en la levadura. Como se usa aquí, el término
"endógeno" se refiere a un ácido nucleico que se da de forma
natural en la levadura. Un hospedador recombinante puede tener
también mutaciones y/o deleciones en el ácido nucleico natural, de
forma que no se produce la proteína codificada por el ácido
nucleico.
Como se usa aquí, "ácido nucleico" se
refiere a una secuencia de nucleótidos o polinucleótidos, y a sus
fragmentos o porciones, y a ADN o ARN de origen genómico o
sintético que puede ser bicatenario o monocatenario, y que
representa la cadena codificante o la complementaria. Como se usa
aquí, "aminoácido" se refiere a secuencias peptídicas o
proteicas, o a sus porciones.
La frase "enzima oxidativa", como se usa
aquí, se refiere a una enzima o sistema enzimático que puede
catalizar la conversión de un sustrato con un estado de oxidación
dado a un producto con un estado de oxidación superior que el
sustrato. La frase "enzima reductora" se refiere a una enzima o
sistema enzimático que puede catalizar la conversión de un sustrato
con un estado de oxidación dado a un producto con un estado de
oxidación inferior que el sustrato. Las enzimas oxidativas
asociadas a la biocatálisis de un carbohidrato de 6 carbonos hacia
intermedios de la ruta de AAS incluyen, entre otras,
D-glucosa deshidrogenasa,
D-gluconato deshidrogenasa y
2-ceto-D-gluconato
deshidrogenasa, así como actividad de L-sorbitol
deshidrogenasa, L-sorbosa deshidrogenasa y
actividad de L-sorbosona deshidrogenasa. Las enzimas
reductoras asociadas con la biocatálisis de intermedios de la ruta
de AAS hacia productos finales deseados incluyen, entre otras,
2,5-diceto-D-gluconato
reductasa (DKGR), 2-ceto reductasa
(2-KR) y 5-ceto reductasa
(5-KR). Tales enzimas incluyen aquellas producidas
de forma natural por la levadura hospedadora o aquellas
introducidas por medios recombinantes.
Como se usa aquí, la expresión "ácido de
carbohidrato de 6 carbonos" excluye específicamente los sustratos
de ácido L-galactónico e incluye, pero no se limita
a, ácido
2-ceto-L-gulónico,
ácido idónico, ácido glucónico, 6-fosfogluconato,
ácido
2-ceto-D-glucónico,
ácido
5-ceto-D-glucónico,
2-cetogluconatofosfato, ácido
2,5-diceto-L-gulónico,
ácido 2,3-L-dicetogulónico, ácido
deshidroascórbico, ácido eritroascórbico y ácido
D-manónico.
Como se usa aquí, la expresión "carbohidrato
de 6 carbonos" incluye, pero no se limita a, glucosa, gulosa,
sorbosa, fructosa, idosa, galactosa y manosa, todos en forma D o
L.
Los términos "aislado" o "purificado",
como se usan aquí, se refieren a un ácido nucleico o proteína o
péptido que se extrae de al menos un componente con el que está
asociado de forma natural. En la presente invención, un ácido
nucleico aislado puede incluir un vector que comprende el ácido
nucleico. Purificado, como se usa aquí para describir una fuente de
carbono derivada de un proceso fermentativo, se refiere a extraer
esa fuente de carbono de al menos un componente con el que está
asociada de forma natural en el medio de fermentación.
La presente invención se refiere a la producción
de AAS o de estereoisómeros de AAS, p.ej. ácido eritórbico, en
levaduras que son capaces de utilizar KLG como única fuente de
carbono para producir AAS. La presente invención excluye
específicamente un método para producir AAS en levaduras que
producen AAS por medio de la ruta de la
L-galactonolactona oxidasa. Las levaduras se
describen en N.J.W. Kreger-van Rij, en "The
Yeasts", vol. 1 de Biology of Yeasts, cap. 2, Eds. A.H. Rose
& J.S. Harrison, 1987, Academic Press, Londres. Las levaduras
que pertenecen a los géneros de levaduras imperfectas se
caracterizan en general por no formar ascosporas y basidiosporas.
AAS es sensible al oxígeno, y por lo tanto, se prefiere que la
levadura sea capaz de crecer de forma anaerobia para reducir la
oxidación del AAS producido. La presente invención también abarca
métodos para producir AAS mediante el uso de levaduras que se
cultivan en condiciones aerobias, con tal de que haya presentes en
el medio de AAS agentes reductores tales como ditiotreitol,
glutatión, quelantes de metales tales como EDTA, estabilizantes
tales como ácido metafosfórico, aminoácidos, glicoles,
carbohidratos, ácido oxálico, ácido tricloroacético,
8-hidroxiquinolina (D. W. Bradley, G. Emery y J.E.
Maynard, Clin. Chim. Acta 4, 47-52 (1973).
Las levaduras que se pueden usar en la presente
invención incluyen, pero no se limitan a, las descritas aquí, y se
ejemplifican mediante las denominaciones de depósito del listado:
Candida blankii CBS1898, ATCC 18735; C. curvata
CBS570; C. humicola; C. incommunis ATCC 22971; C.
salmanticensis ATCC 16042; C. sp. ATCC 28528, ATCC
20473; Cryptococcus albidus CBS4192; Cr. dimennae
CBS5770; Cr. heveanensis CBS140; Cr. kuetzingii
UCD68-196; Cr. Luteolus CBS953; Cr.
skinneri UCD60-82 CBS5029; Cr. terreus
CBS1895, CBS6293 CCY17-8-5; Cr.
uiguttulatus CBS1730; Cr. laurentii CCY
17-3-2,
CCY17-3-6, ATCC 32044; Cr.
neoformans ATCC 32045; Cr. podzolicus
CCY17-20-1; Trichosporon
cutaneum UCD54-169
CCY30-5-4; T. beigelii
NRRLY-1490; T. pullulans ATCC 10677;
Aureobasidium pullulans DBV A9, A10, A62, A77 A84;
Hansenula capsulata DBV 3164, ATCC 24204; Lipomyces
starkeyi UCD 51-55, CBS1809; L. lipofer
NRRL Y-1351, Phaffia rhodozyma ATCC 24201,
Rhodotorula mucilaginosa NRC 211003; Saccharomyces
uvarum ATCC 9373, ATCC 9080; Saccharomycopsis fibuligera
ATCC 2082; Schwanniomyces occidentalis NRC2782, NRC2783; y
Torulopsis ernobii ATCC 20000. En una realización preferida,
la levadura es un miembro del grupo de levaduras imperfectas. Una
familia preferida de las levaduras imperfectas para uso en los
métodos para producir AAS es la familia Cryptococcaceae. Los
géneros preferidos de Cryptococcaceae se seleccionan del grupo que
consiste en Candida y Cryptococcus.
Como se demuestra en los ejemplos, Candida
blankii y Cryptococcus dimennae fueron capaces de
producir AAS por encima de las concentraciones de fondo cuando se
cultivaron con KLG como única fuente de carbono, mientras
Candida shehatae, aunque fue capaz de crecer con KLG como
única fuente de carbono, fue incapaz de producir AAS. Los ejemplos
ilustrativos describen el uso de Candida shehatae, número de
acceso ATCC 34887, Candida blankii, número de acceso ATCC
18735, Cryptococcus dimennae, número de acceso ATCC 22024 y
Cryptococcus luteolus, número de acceso ATCC 32044. La
presente invención abarca mutantes, derivados y descendientes de
especies conocidas de levaduras, y en particular, mutantes y
derivados de especies conocidas que pertenecen al género
Cryptococcaceae, p.ej. las que pertenecen a Candida y Cryptococcus,
con tal de que el mutante, derivado o descendiente sea capaz de
utilizar KLG como única fuente de carbono para producir AAS.
La presente invención abarca métodos para
producir AAS o estereoisómeros de AAS en levadura, en los que la
levadura es natural, es decir, no está modificada mediante
ingeniería genética, y también en los que la levadura es
recombinante y comprende ácido nucleico heterólogo que codifica
enzimas oxidativas y/o reductoras que están asociadas con la
conversión de una fuente de carbono a KLG en la levadura. En la
presente invención, la fuente de carbono, tal como un ácido de
carbohidrato de 6 carbonos, puede ser un producto de un proceso
fermentativo distinto que se añade al cultivo de levadura, tal como
KLG producido mediante el método descrito por Lazarus et al.
(J. Bact. 1991, 173, 6651-61) o mediante el método
descrito en Saito et al. (1997, Applied and Environmental
Microbiology, 63: 454-460). La fuente de carbono
derivada de un proceso fermentativo distinto se puede purificar
antes del uso en un método para producir AAS o estereoisómeros de
AAS, o se puede usar directamente del proceso de fermentación. La
fuente de carbono puede derivar también de medios químicos.
En otra realización de la presente invención, la
levadura se modifica mediante ingeniería genética para que
comprenda una o ambas de una enzima oxidativa heteróloga o una
enzima reductora heteróloga, asociadas con la conversión de una
fuente de carbono a KLG en la levadura, por lo que se proporciona un
organismo único que es capaz de convertir una fuente de carbono,
tal como glucosa u otro carbohidrato de 6 carbonos, en ácido
ascórbico por medio de KLG como intermedio. El hospedador de
levadura recombinante puede comprender múltiples enzimas oxidativas
heterólogas y/o múltiples enzimas reductoras heterólogas para
producir ácido ascórbico a partir de un carbohidrato de 6 carbonos
o de un ácido de carbohidrato de 6 carbonos.
En una realización preferida, la fuente de
carbono es glucosa y la levadura recombinante comprende un ácido
nucleico heterólogo que codifica al menos uno de (a) una glucosa
deshidrogenasa (GDH); (b) una ácido glucónico deshidrogenasa
(GADH); (c) una ácido
2-ceto-D-glucónico
deshidrogenasa (2-KDGDH); y (d) una ácido
2,5-diceto-D-glucónico
reductasa (2,5-DGKR), con tal de que si la levadura
comprende un ácido nucleico heterólogo para menos de (a) - (d),
entonces la levadura comprende un ácido nucleico endógeno, de forma
que la levadura comprende ácido nucleico para (a) - (d), y es capaz
de convertir glucosa en AAS por el intermedio KLG. Como entenderá
fácilmente el técnico experto, las reacciones de oxidación y
reducción implicadas en la conversión de un sustrato de carbono a
AAS pueden necesitar que se añadan cofactores a los cultivos de
levadura. Por ejemplo, 2,5-DGKR descrito en la
patente de Estados Unidos número 5032514, expedida el 16 de julio de
1991, necesita NADPH. Otros ejemplos de cofactores necesarios en
reacciones enzimáticas incluyen, pero no se limitan a, ATP, NAD+,
NADP+, NADH, NADPH y coenzima A. La levadura también puede tener
deleciones o mutaciones de enzimas oxidativas y/o reductoras
endógenas que interfieren con la ruta deseada de flujo de
carbono.
En otra realización de la presente invención, la
fuente de carbono es sorbitol y la levadura recombinante comprende
un ácido nucleico heterólogo que codifica al menos uno de (a)
D-sorbitol deshidrogenasa (SLDH); (b)
L-sorbosa deshidrogenasa; y (c)
L-sorbosona deshidrogenasa, con tal de que si la
levadura comprende ácido nucleico heterólogo para menos de (a) -
(c), entonces la levadura comprende ácido nucleico endógeno de forma
que la levadura comprende ácido nucleico para (a) - (c), y es capaz
de convertir sorbitol a AAS por medio del intermedio 2KLG.
Las fuentes de ácidos nucleicos que codifican
enzimas oxidativas o reductoras incluyen las siguientes:
| Enzima | Cita |
| glucosa deshidrogenasa | Smith et al. 1989, Biochem. J. 261:973; |
| Neijssel et al. 1989, Antonie Van | |
| Leauvenhoek 56(1):51-61 | |
| ácido glucónico deshidrogenasa | Matsushita et al. 1979, J. Biochem. |
| 85:1173; Kulbe et al. 1987, Ann. N.Y. | |
| Acad Sci 506:552 | |
| ácido 2-ceto-D-glucónico deshidrogenasa | Stroshane, 1977, Biotechnol. BioEng |
| 19(4) 459 | |
| 2-ceto gluconato reductasa | J. Gen. Microbiol. 1991, 137:1479 |
| ácido 2,5-diceto-D-glucónico reductasa Nºs: | Patente de Estados Unidos |
| 5.583.025; | 5.795.761; 5.376.544; |
| 5.008.193; | 4.757.012; 4.758.514; 5.004.690; |
| 5.032.514 | |
| L-sorbosa deshidrogenasa; | Saito et al. Applied and Environmental |
| L-sorbosona deshidrogenasa; | Microbiology, 1997, 63: 454 |
| y L-sorbitol deshidrogenasa |
\vskip1.000000\baselineskip
La levadura recombinante que contiene el/los
ácidos(s) nucleico(s) necesario(s) para
producir AAS a partir de una fuente de carbono se puede construir
mediante el uso de métodos conocidos en la técnica. Se describen
métodos de biología molecular en Sambrook et al., Molecular
Biology Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición (1989), Cold
Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989). Los
genes que codifican enzimas oxidativas y enzimas reductoras
asociadas con la producción de AAS se pueden aislar a partir de
hospedadores nativos como se describe más adelante o se pueden
producir por medios químicos. Por ejemplo, si se conoce la
secuencia del gen, se pueden crear bibliotecas genómicas adecuadas
mediante digestión con endonucleasa de restricción y se pueden
cribar con sondas complementarias para la secuencia génica deseada.
Una vez que se aísla la secuencia se puede amplificar el ADN
mediante el uso de métodos estándar de amplificación dirigida por
cebadores, tales como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
(documento de EE.UU. 4.683.202) para obtener cantidades de ácido
nucleico adecuadas para la transformación mediante el uso de
vectores apropiados. Los expertos en la técnica conocen una
diversidad de vectores y casetes de transformación y expresión
adecuados para la clonación, transformación y expresión en
levaduras de ácido nucleico que codifica enzimas oxidativas y
reductoras asociadas con la producción de AAS. Los expertos en la
técnica conocen protocolos para obtener y usar tales vectores
(Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual,
volúmenes 1, 2, 3 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring
Harbor, NY, (1989)).
Típicamente, el vector o casete contiene
secuencias que dirigen la transcripción y traducción del ácido
nucleico, un marcador seleccionable, y secuencias que permiten la
replicación autónoma o la integración cromosómica. Los vectores
adecuados comprenden una región en 5' del gen que alberga controles
de la iniciación de la transcripción, y una región en 3' del
fragmento de ADN que controla la terminación de la transcripción.
Estas regiones de control se pueden derivar de genes homólogos o
heterólogos para la levadura, con tal de que la región de control
seleccionada sea capaz de funcionar en la levadura.
Los expertos en la técnica conocen las regiones
de control de la iniciación o promotores, que son útiles para
manejar la expresión de las enzimas oxidativas o reductoras en la
levadura. Virtualmente cualquier promotor capaz de controlar estos
genes es adecuado para la presente invención, lo que incluye, pero
no se limita a, CYC1, HIS3, GAL1, GAL10, ADH1, PGK, PH05, GAPDH,
ADC1, TRP1, URA3, LEU2, ENO, TPI. El ácido nucleico que codifica
las enzimas oxidativas o reductoras está unido de forma operable por
medio de códones de iniciación a regiones de control de la
expresión seleccionadas para una expresión eficaz de las enzimas
oxidativas o reductoras.
Una vez que se construyen casetes adecuados, se
usan para transformar levaduras, y las levaduras se criban en
función de la capacidad de producir AAS a partir de una fuente de
carbono apropiada. Por ejemplo, en una realización, la levadura se
transforma con ácido nucleico que codifica una o ambas actividades
de deshidrogenasa y de reductasa, y las levaduras transformadas se
criban en función de su capacidad para producir AAS a partir de un
carbohidrato de seis carbonos, tal como glucosa, o de un ácido de
carbohidrato de seis carbonos, tal como KLG.
Los métodos para la detección de AAS y de
estereoisómeros de AAS incluyen el uso de titulación redox con
2,6-dicloroindofenol (Burton et al., 1979,
J. Assoc. Pub. Analysts 17:105); cromatografía líquida de elevado
rendimiento (HPLC) que usa intercambio de aniones (J. Chrom. 1980,
196:163); y procedimientos electro-redox (Pachia,
1976, Anal. Chem. 48:364). También se pueden emplear procedimientos
enzimáticos que implican el uso de ácido ascórbico oxidasa.
En la presente invención, la detección de AAS se
llevó a cabo mediante HPLC, ensayo colorimétrico de ascorbato
oxidasa como se usa aquí y espectrofotometría
CG-masas. El experto será consciente de los
controles a aplicar al utilizar estos métodos de detección. Debido
a que existe un equilibrio químico entre KLG y AAS (es decir, KLG
contiene concentraciones de fondo de AAS), para el uso de detección
UV en HPLC de ácido ascórbico, se registró y se usó como control el
perfil de elución del sustrato KLG. Para el ensayo de ascorbato
oxidasa, se utiliza un control de blanco sin muestra y enzima. Para
el análisis de CGMS, se analizaron como control el agente de
derivatización y el sustrato KLG.
También es deseable tener un método de cribado
para la detección de levaduras que son capaces de producir AAS a
partir de una fuente de carbono. Un método para cribar levaduras
capaces de producir AAS comprende las etapas de obtener levaduras
capaces de crecer con ácido ascórbico o estereoisómero de ácido
ascórbico, cultivar dicha levadura en presencia de KLG en
condiciones adecuadas para la producción de ácido ascórbico o de un
estereoisómero de ácido ascórbico; y analizar en dicho cultivo de
levadura la producción de ácido ascórbico o de un estereoisómero de
ácido ascórbico.
Las levaduras naturales o las levaduras
recombinantes capaces de utilizar KLG para producir AAS se someten
a fermentación a gran escala en presencia de una fuente de carbono
adecuada, y se recupera AAS. Las fuentes de carbono adecuadas
incluyen carbohidratos de seis carbonos o ácidos de carbohidratos de
seis carbonos. La fuente de carbono utilizada para cultivar las
levaduras descritas aquí estará limitada solamente por las
necesidades del organismo hospedador. Por ejemplo, las levaduras
naturales se pueden cultivar en presencia de un ácido de
carbohidrato de seis carbonos, p.ej. KLG, mientras la levadura
recombinante que se ha modificado mediante ingeniería genética para
que contenga ácido nucleico que codifica una o ambas de
deshidrogenasa y reductasa se puede cultivar en presencia de un
carbohidrato de seis carbonos, p.ej. glucosa. Además de una fuente
de carbono apropiada, los medios de fermentación deben contener
minerales, sales, cofactores, tampones y otros componentes
adecuados, conocidos para los expertos en la técnica, adecuados para
el crecimiento de los cultivos y la producción de AAS. Los métodos
para los medios y las condiciones de cultivo adecuados para cultivar
levaduras se describen en Costamagna et al., 1986, Can. J.
Microbiology, 32:756-758.
La levadura se puede cultivar en condiciones
aerobias o anaerobias. AAS es sensible al oxígeno, y, por lo tanto,
el cultivar la levadura que produce AAS de forma anaerobia reducirá
la oxidación del AAS producido. De forma alternativa, si las
levaduras se cultivan en condiciones aerobias se prefiere que haya
presentes en el medio de AAS agentes reductores, p.ej.
ditiotreitol, glutatión, agentes quelantes de metales tales como
EDTA, estabilizantes tales como ácido metafosfórico, aminoácidos,
glicoles, carbohidratos, ácido oxálico, ácido tricloroacético,
8-hidroxiquinolina. La presente invención abarca la
fermentación discontinua o continua, y el proceso para producir AAS
puede desarrollarse en uno o dos fermentadores. Por ejemplo, si la
levadura está modificada mediante ingeniería genética para incluir
una ruta a partir de un carbohidrato de seis carbonos, tal como
glucosa, por ejemplo, hasta un ácido de carbohidrato de seis
carbonos, tal como KLG, la producción de AAS podría desarrollarse
en un fermentador usando las levaduras recombinantes como
hospedador. Si la levadura es natural y AAS se produce en la
levadura a partir de un ácido de carbohidrato de seis carbonos,
p.ej. KLG, la producción de AAS puede desarrollarse en dos
fermentadores, uno para producir KLG como se describió en la
patente de EE.UU. 5032514 o como describió Saito et al.,
anteriormente mencionado, y otro para producir AAS a partir de KLG
en levaduras.
Una fermentación discontinua clásica es un
sistema cerrado en el que se ajusta la composición del medio al
comienzo de la fermentación y no se somete a alteraciones
artificiales durante la fermentación. Así, al comienzo de la
fermentación se inocula el medio con el organismo u organismos
deseados y se permite que la fermentación ocurra sin añadir nada al
sistema. Típicamente, sin embargo, una fermentación discontinua es
"discontinua" con respecto a la adición de la fuente de
carbono, y a menudo se intenta controlar factores tales como el pH
y la concentración de oxígeno. Las composiciones de metabolito y de
biomasa del sistema discontinuo cambian constantemente hasta el
momento en el que se detiene la fermentación. Dentro de los cultivos
discontinuos las células pasan por una fase retardada estática,
después por una fase logarítmica de elevado crecimiento y
finalmente por una fase estacionaria en la que la velocidad de
crecimiento disminuye o se detiene. Si se dejan sin tratar, las
células en la fase estacionaria finalmente morirán. Las células de
la fase logarítmica son responsables generalmente del volumen de
producción de producto final o intermedio.
El sistema de fermentación semicontinuo es una
variación del sistema discontinuo estándar, que también es adecuado
en la presente invención. En esta variación de un sistema
discontinuo típico, el sustrato se añade en incrementos a medida
que progresa la fermentación. Los sistemas semicontinuos son útiles
cuando la inhibición por catabolitos es apta para inhibir el
metabolismo de las células, y cuando es deseable tener cantidades
limitadas de sustrato en los medios. La medida de la concentración
de sustrato real en los sistemas semicontinuos es difícil, y por lo
tanto se estima en base a cambios de factores medibles, tales como
el pH, el oxígeno disuelto y la presión parcial de gases de
desecho, tales como CO_{2}. Las fermentaciones discontinuas y
semicontinuas son habituales y se conocen en la técnica, y se pueden
encontrar ejemplos en Brock, anteriormente mencionado.
También se contempla que el método sería
adaptable a métodos de fermentación continua. La fermentación
continua es un sistema abierto en el que se añade continuamente un
medio de fermentación definido a un biorreactor y se extrae una
cantidad igual de medio condicionado simultáneamente para
procesarlo. La fermentación continua mantiene generalmente los
cultivos en una densidad elevada constante, en la que las células
están principalmente en la fase logarítmica del crecimiento.
La fermentación continua permite la modulación
de un factor o de cualquier número de factores que afecten al
crecimiento celular o a la concentración de producto final. Por
ejemplo, un método mantendrá un nutriente limitante, tal como la
concentración de la fuente de carbono o de nitrógeno, en una
proporción fija y permitirá que otros parámetros cambien. En otros
sistemas se pueden alterar continuamente varios factores que afectan
al crecimiento mientras se mantiene constante la concentración
celular, medida por medio de la turbidez. Los sistemas continuos
procuran mantener las condiciones de crecimiento en estado
estacionario, y así la pérdida de células debida a la retirada del
medio se puede equilibrar con la velocidad de crecimiento celular en
la fermentación. Los métodos para modular los nutrientes y los
factores de crecimiento para los procesos de fermentación
continuos, así como los métodos para maximizar la velocidad de la
formación de producto, se conocen en la técnica de la microbiología
industrial, y se detallan una diversidad de métodos en Brock,
anteriormente mencionado.
Los métodos de la presente invención se pueden
poner en práctica mediante el uso de procesos discontinuos,
semicontinuos o continuos. Tras la fermentación, el AAS producido se
puede recuperar del caldo de fermentación mediante una diversidad
de métodos, que incluyen resinas de intercambio iónico, resinas de
absorción o de retraso de iones, carbón activo,
concentración-cristalización, etc.
Se describirán adicionalmente diversos aspectos
de la presente invención con respecto a los siguientes ejemplos
específicos, que no pretenden limitar el alcance de la presente
invención.
La siguiente descripción de materiales y métodos
se aplica a los ejemplos I-III.
Se cultivaron levaduras en base de nitrógeno
para levaduras de Difco (YNB) de 6,7 g/L con un crecimiento inicial
en un 2% de glucosa, seguido de transferencia a un 0,5% (p/v) de
fuente de carbono única de L-AAS, y después
2-KLG o L-idonato 20,8 mM. Las
levaduras se cultivaron en 50 ml de medio YNB a 22ºC y pH 5,5
durante un ciclo de 48 horas a una velocidad de agitación de 250
rpm en un matraz con agitación.
HPLC: La elución mediante HPLC de
ascorbato y otros ácidos de ceto-carbohidratos se
realizó mediante el uso de una columna analítica Dionex IonPac AS10
con una precolumna. Se empleó elución isocrática usando como
eluyente acetato 40 mM de pH 4,86 para obtener una buena separación
de los tiempos de retención entre el sustrato KLG y el producto
ascorbato (>5 min). Se detectó ascorbato (>100 ppb) mediante
el uso de un detector UV entre las longitudes de onda de
245-270 nm, mientras KLG se detectó mediante el uso
de un detector de índice de refracción. El sistema de HPLC usado
para el estudio es un aparato HP-Alliance, equipado
con un paquete informático Millenium usado para el cálculo de la
integración del área de los picos. Se generó una curva de
calibración para la cuantificación de ascorbato entre 100 ppb - 100
ppm.
CG-MS: La identificación
de ascorbato mediante el uso de CG-MS se realizó
usando un procedimiento publicado (J. C. Deutsch y J. Fred
Kolhouse, Anal. Chem., 1993, 65, 321-326). La CG se
realizó en un equipo HP 5890 con el uso de una columna capilar de
sílice fundida Supelco SPB-1 de 15 metros por 0,25
mm. La derivatización de ascorbato se realizó mediante el uso de
N-metil-N-(tert-butildimetilsilil)trifluoroacetamida
y acetonitrilo, siguiendo el método informado en la referencia
anteriormente mencionada. El tiempo de retención de ascorbato
estándar obtenido en estas condiciones experimentales fue de 8,75
minutos. El patrón de fragmentación de masas característico de m/z
575, 531, 433, 343 se detectó en los espectros obtenidos tanto para
la muestra estándar como para la desconocida.
Ensayo de ascorbato oxidasa: El ensayo de
ascorbato oxidasa se realizó usando el equipo de determinación de
ácido L-ascórbico (nº de cat. 409677) obtenido de
Boehringer Mannheim y siguiendo el protocolo proporcionado con el
equipo. El equipo contenía enzima ascorbato oxidasa y una
detección/cuantificación (578 nm) mediante el uso de un sistema de
colorante acoplado de MTT y PMS (Beutler, H.-O. y Beinstingl, G.;
1984, en methods of enzymatic analysis (Bergmeyer, H. U. Ed.) 3ª
ed., vol. 7, págs. 376-385, Vertag Chemie, Weinheim,
Deerfield, Beach/Florida, Basilea).
Controles y blancos: La disolución de
0,5% de 2-KLG contiene 2 ppm de ascorbato a pH 6,1.
Se ensayó una reacción de control solamente con tampón que contenía
KLG junto con cada experimento como reacción de control, junto con
una mezcla de reacción que contenía levadura durante el transcurso
del tiempo del experimento de conversión de KLG a AAS con células
completas. En otro control, las células de levadura se destruyeron
térmicamente y después se incubaron con KLG para asegurarse de que
no se detectaba transformación de KLG a AAS en estas condiciones.
El pico de ascorbato detectado mediante análisis de HPLC se confirmó
adicionalmente mediante reacción de la muestra con ascorbato
oxidasa, y así se comprobó la desaparición del pico en el
cromatograma debida a la degradación de ascorbato por la ascorbato
oxidasa.
Este ejemplo ilustra que la levadura Candida
blankii es capaz de utilizar KLG o idonato como única fuente de
carbono para el crecimiento. Este ejemplo también demuestra la
producción de ácido ascórbico mediante Candida blankii cuando
se cultiva en presencia de KLG como única fuente de carbono.
Se cultivó Candida blankii que tenía el
número de acceso ATCC 18735 como se describió en la sección de
materiales y métodos. La reacción de KLG a AAS con células
completas se realizó como se describe más adelante. Se recogieron
alrededor de 3 gramos de células húmedas de un cultivo de 48 horas y
500 ml mediante centrifugación a 4ºC y 9000 rpm. Las células se
lavaron con tampón fosfato frío 200 mM de pH 6,1 que contenía EDTA
0,5 mM. Las células se resuspendieron después en el mismo tampón
que contenía un 0,5% de KLG (10 ml). Se extrajeron tres ml de esta
mezcla de reacción y se hirvieron en un microondas durante dos
minutos. Ambas mezclas de reacción se colocaron después a 30ºC en
un incubador rotatorio para la producción de AAS con células
completas. Se extrajeron 1,5 ml de muestra para el tiempo cero, se
centrifugaron para eliminar el sedimento celular y se almacenaron a
-20ºC. El sobrenadante se filtró a través de un filtro de 0,2 \mum
y se sometió a análisis de HPLC seguido de análisis con ascorbato
oxidasa y CGMS como se describió anteriormente. Se usó la misma
retirada de muestra y el mismo método de trabajo para los tiempos de
2, 4 y 20 horas para la reacción con células vivas, y la muestra de
20 horas para la mezcla de reacción de células destruidas
térmicamente (Tabla 1). Las muestras de células destruidas
térmicamente no tuvieron concentraciones de fondo de AAS y no
produjeron AAS.
Después de la extracción de la muestra de las 20
horas, se disminuyó el pH de la mezcla de reacción en tres unidades
de pH hasta pH 3,15 usando tampón citrato-fosfato.
Se extrajo una muestra y se analizó a las 21 horas para marcar el
tiempo cero para este cambio de estado. La reacción se dejó
continuar durante la noche. Después de otro periodo de 24 h, se
tomó la muestra final. Se usó una reacción de control de blanco de
KLG paralela sin células a ambos valores de pH para observar la
producción de fondo de AAS a partir de KLG (véase la Tabla 1, Fig.
3).
Como se puede observar a partir de la Tabla 1 y
de la Figura 3, cuando se cultivó C. blankii en el cultivo
de células completas usando KLG como único sustrato, se confirmó la
presencia de AAS en el medio de reacción. La concentración del AAS
presente en la mezcla de reacción superó en 3 veces las
concentraciones de fondo. Disminuyendo el pH de la mezcla de
reacción a pH 3, se observó otro incremento de 3 veces en las
concentraciones de AAS. La disminución del pH tuvo el efecto de
estabilizar el AAS, así como de favorecer la termodinámica química
hacia la producción de AAS.
Este ejemplo ilustra que Cryptococcus
dimennae es capaz de utilizar KLG o idonato como única fuente de
carbono para el crecimiento. Este ejemplo también muestra la
producción de ácido ascórbico mediante Cryptococcus dimennae
cuando se cultiva en presencia de KLG como única fuente de
carbono.
Se cultivó Cryptococcus dimennae que
tiene el número de acceso de ATCC 22024 como se describió en la
sección de materiales y métodos. La reacción de KLG a AAS con
células completas se realizó como se describió en el Ejemplo I.
Como se puede observar a partir de la Tabla 1 y
de la Figura 3, cuando se hizo crecer el cultivo de células
completas de Cryptococcus dimennae mediante el uso de KLG
como único sustrato, se confirmó la presencia de AAS en el medio de
reacción. La concentración de AAS presente en la mezcla de reacción
superó en 2 veces las concentraciones de fondo.
Este ejemplo ilustra que Candida shehatae
es capaz de usar KLG como única fuente de carbono, pero no es capaz
de producir AAS. La reacción de KLG a AAS con células completas se
realizó como se describió en el Ejemplo I. Como se puede observar a
partir de la Figura 1, Candida shehatae no es capaz de
producir AAS a partir de KLG en estas condiciones.
| ABC/área a 266 nm | Conc. de ácido ascórbico, mg/L | |||||
| Muestras | Tiempo | Tiempo | Tiempo | Tiempo | Tiempo | Tiempo |
| 0 h | 4 h | 20 h | 0 h | 4 h | 20 h | |
| Blanco de tampón 2KLG | 259831 | 280706 | 264840 | 1,9 | 2,1 | 1,9 |
| Candida blankii | 314059 | 240613 | 905162 | 2,3 | 1,8 | 6,6 |
| Candida shehatae | 204867 | 205323 | 270663 | 1,5 | 1,5 | 1,9 |
| Cryptoc. dimennae | 224203 | 223112 | 522325 | 1,6 | 1,6 | 3,8 |
Claims (40)
1. Un método para la producción de ácido
ascórbico o de un estereoisómero de ácido ascórbico en una levadura,
que comprende las etapas de:
- a)
- obtener una levadura capaz de utilizar ácido 2-ceto-L-gulónico (KLG) como única fuente de carbono para producir ácido ascórbico o un estereoisómero de ácido ascórbico; y
- b)
- cultivar la levadura en presencia de una fuente de carbono en condiciones adecuadas para la producción de ácido ascórbico o de un estereoisómero de ácido ascórbico,
en el que la levadura es natural o
es una levadura según la reivindicación
20.
2. El método de la reivindicación 1, que
comprende además la etapa de recuperar dicho ácido ascórbico.
3. El método de la reivindicación 1, en el
que dicha fuente de carbono es un ácido de carbohidrato de seis
carbonos.
4. El método de la reivindicación 3, en el
que dicho ácido de carbohidrato de seis carbonos incluye ácido
2-ceto-L-gulónico,
ácido idónico, ácido glucónico, 6-fosfogluconato,
ácido
2-ceto-D-glucónico,
ácido
5-ceto-D-glucónico,
2-cetogluconato-6-fosfato,
ácido
2,5-diceto-L-glucónico,
ácido 2,3-L-dicetogulónico, ácido
deshidroascórbico, ácido eritroascórbico y ácido
D-manónico.
5. El método de la reivindicación 1, en el
que dicha fuente de carbono es un carbohidrato de seis carbonos y
dicha levadura comprende uno o ambos de a) un ácido nucleico
heterólogo que codifica una enzima oxidativa asociada con la
producción de ácido ascórbico o de un estereoisómero de ácido
ascórbico en dicha levadura, y b) un ácido nucleico heterólogo que
codifica una enzima reductora asociada con la producción de ácido
ascórbico o de un estereoisómero de ácido ascórbico en dicha
levadura.
6. El método de la reivindicación 5, en el
que dicho carbohidrato de seis carbonos incluye glucosa, gulosa,
idosa, galactosa, manosa, sorbosa y fructosa.
7. El método de la reivindicación 5, en el
que dicha enzima oxidativa tiene actividad deshidrogenasa.
8. El método de la reivindicación 7, en el
que dicha deshidrogenasa incluye una actividad de glucosa
deshidrogenasa, una actividad de ácido glucónico deshidrogenasa,
una actividad de ácido
2-ceto-D-glucónico
deshidrogenasa, una actividad de galactosa deshidrogenasa, una
actividad de L-sorbosa deshidrogenasa, una actividad
de D-sorbitol deshidrogenasa, una actividad de
L-sorbosona deshidrogenasa, ácido
L-idónico oxidasa y ácido L-gulónico
oxidasa.
9. El método de la reivindicación 5, en el
que dicha enzima reductora tiene una actividad de reductasa.
10. El método de la reivindicación 9, en el que
dicha actividad de reductasa incluye actividad de
2,5-diceto-D-gluconato
(DKG) reductasa, 2,3-DKG reductasa,
5-ceto reductasa, 2-ceto reductasa y
2-cetogulonato reductasa.
11. El método de la reivindicación 1, en el que
dicha fuente de carbono es glucosa y la levadura comprende un ácido
nucleico heterólogo que codifica al menos uno de (a) una glucosa
deshidrogenasa (GDH); (b) una ácido glucónico deshidrogenasa
(GADH); (c) una ácido
2-ceto-D-glucónico
deshidrogenasa (2-KDGDH); y (d) una ácido
2,5-diceto-D-glucónico
reductasa (2,5 [DKGR]), con tal de que si la levadura comprende
ácido nucleico heterólogo para menos de (a) - (d), entonces la
levadura comprende ácido nucleico endógeno, de forma que la levadura
comprende ácido nucleico para (a) - (d), y es capaz de convertir
glucosa en ácido ascórbico (AAS) por el intermedio KLG.
12. El método de la reivindicación 1, en el que
la levadura es un miembro del grupo de levaduras imperfectas.
13. El método de la reivindicación 12, en el
que la levadura es un miembro de la familia Cryptococcaceae.
14. El método de la reivindicación 13, en el
que la levadura incluye Candida y Cryptococcus.
15. El método de la reivindicación 14, en el
que la levadura es Candida blankii.
16. El método de la reivindicación 14, en el
que la levadura es Cryptococcus dimennae.
17. El método de la reivindicación 1, en el que
dicha levadura es Candida blankii o Cryptococcus
dimennae, y dicha fuente de carbono comprende glucosa, en el
que dicha levadura comprende una actividad de glucosa deshidrogenasa
heteróloga y una actividad de 2,5-DKG
reductasa.
18. El método de la reivindicación 1, en el que
dicha levadura es Candida blankii o Cryptococcus
dimennae, y dicha fuente de carbono comprende
D-sorbitol, L-sorbosa o
L-sorbosona, en el que dicha levadura comprende al
menos uno de una actividad de L-sorbosa
deshidrogenasa, una actividad de D-sorbitol
deshidrogenasa, una actividad de L-sorbosona
deshidrogenasa y una actividad de galactosa deshidrogenasa.
19. El método de la reivindicación 1, en el que
dicho estereoisómero de ácido ascórbico incluye ácido
D-ascórbico, ácido D-araboascórbico
y ácido L-araboascórbico.
20. Una levadura recombinante capaz de utilizar
ácido
2-ceto-D-glucónico
(KLG) como única fuente de carbono para producir ácido ascórbico o
un estereoisómero de ácido ascórbico, que comprende uno o ambos de
a) un ácido nucleico heterólogo que codifica una enzima oxidativa
asociada con la conversión de una fuente de carbono a KLG en la
levadura, y b) un ácido nucleico heterólogo que codifica una enzima
reductora asociada con la conversión de una fuente de carbono a KLG
en la levadura.
21. La levadura de la reivindicación 20, en la
que dicha enzima oxidativa tiene una actividad deshidrogenasa.
22. La levadura de la reivindicación 21, en la
que dicha deshidrogenasa incluye una actividad de glucosa
deshidrogenasa, una actividad de ácido glucónico deshidrogenasa, una
actividad de ácido
2-ceto-D-glucónico
deshidrogenasa, una actividad de galactosa deshidrogenasa, una
actividad de L-sorbosa deshidrogenasa, una
actividad de D-sorbitol deshidrogenasa, actividad de
L-sorbosona deshidrogenasa, ácido
L-idónico oxidasa y ácido
L-gulónico oxida-
sa.
sa.
23. La levadura de la reivindicación 20, en la
que dicha enzima reductora tiene una actividad reductasa.
24. La levadura de la reivindicación 23, en la
que dicha actividad reductasa incluye actividad de ácido
2,5-diceto-D-glucónico
(DKG) reductasa, 2,3-DKG reductasa,
5-ceto reductasa, 2-ceto reductasa y
2-cetogulonato reductasa.
25. La levadura de la reivindicación 20, en la
que la levadura es un miembro del grupo de levaduras
imperfectas.
26. La levadura de la reivindicación 25, en la
que la levadura es un miembro de la familia Cryptococcaceae.
27. La levadura de la reivindicación 26, en la
que la levadura incluye Candida y Cryptococcus.
28. La levadura de la reivindicación 27, en la
que la levadura es Candida blankii.
29. La levadura de la reivindicación 27, en la
que la levadura es Cryptococcus dimennae.
30. La levadura de la reivindicación 20, en la
que dicha levadura es Candida blankii o Cryptococcus
dimennae, y dicha fuente de carbono comprende glucosa, en la
que dicha levadura comprende una actividad de glucosa deshidrogenasa
heteróloga y una actividad de 2,5-DKG
reductasa.
31. La levadura de la reivindicación 20, en la
que dicha levadura es Candida blankii o Cryptococcus
dimennae, y dicha fuente de carbono comprende
D-sorbitol, L-sorbosa o
L-sorbosona, en la que dicha levadura comprende al
menos uno de una actividad de L-sorbosa
deshidrogenasa, una actividad de D-sorbitol
deshidrogenasa, una actividad de L-sorbosona
deshidrogenasa y una actividad de galactosa deshidrogenasa.
32. Un método para producir una levadura
recombinante capaz de utilizar un carbohidrato de seis carbonos
para producir ácido ascórbico (AAS) o un estereoisómero de AAS, que
comprende las etapas de:
- a)
- obtener una levadura capaz de utilizar ácido 2-ceto-L-gulónico (KLG) como única fuente de carbono para producir AAS o un estereoisómero de AAS, y
- b)
- introducir al menos uno o ambos de a) un ácido nucleico heterólogo que codifica una enzima oxidativa asociada con la conversión de una fuente de carbono a KLG en dicha levadura, y b) un ácido nucleico heterólogo que codifica una enzima reductora asociada con la conversión de una fuente de carbono a KLG en dicha levadura.
33. El método de la reivindicación 32, en el
que dicha levadura es un miembro del grupo de levaduras
imperfectas.
34. El método de la reivindicación 33, en el
que la levadura es un miembro de la familia Cryptococcaceae.
35. El método de la reivindicación 34, en el
que la levadura incluye Candida y Cryptococcus.
36. El método de la reivindicación 35, en el
que la levadura es Candida blankii.
37. El método de la reivindicación 35, en el
que la levadura es Cryptococcus dimennae.
38. El método de la reivindicación 32, en el
que dicha levadura es Candida blankii o Cryptococcus
dimennae, y dicha fuente de carbono comprende glucosa, en el
que dicha levadura comprende una actividad de glucosa deshidrogenasa
heteróloga y una actividad de 2,5-dicetogluconato
(DKG) reductasa.
39. El método de la reivindicación 32, en el
que dicha levadura es Candida blankii o Cryptococcus
dimennae, y dicha fuente de carbono comprende
D-sorbitol, L-sorbosa o
L-sorbosona, en el que dicha levadura comprende al
menos uno de una actividad de L-sorbosa
deshidrogenasa, una actividad de D-sorbitol
deshidrogenasa, una actividad de L-sorbosona
deshidrogenasa y una actividad de galactosa deshidrogenasa.
40. Un método para cribar una levadura capaz de
producir ácido ascórbico (AAS) a partir de ácido
2-ceto-L-glucónico
(KLG), que comprende las etapas de obtener una levadura capaz de
crecer con ácido ascórbico o con un estereoisómero de ácido
ascórbico, cultivar dicha levadura en presencia de KLG como única
fuente de carbono en condiciones adecuadas para la producción de
ácido ascórbico o del estereoisómero de ácido ascórbico; y analizar
en dicho cultivo de levadura la producción de ácido ascórbico o de
un estereoisómero de ácido ascórbico, en el que la levadura es una
levadura natural o una levadura según la reivindicación 20.
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