CZ20011944A3

CZ20011944A3 - Výroba kyseliny askorbové za použití kvasinek

Info

Publication number: CZ20011944A3
Application number: CZ20011944A
Authority: CZ
Inventors: Manoj Kuma
Original assignee: Genencor International, Inc.
Priority date: 1998-12-04
Filing date: 1999-12-03
Publication date: 2001-09-12
Also published as: CN1249220C; DE69931807D1; JP2002531136A; US6808918B2; US6824996B2; CA2353558A1; CN1331750A; EP1135517B1; ATE329050T1; WO2000034502A1; PL348509A1; EP1135517A1; AU3109300A; DK1135517T3; US6358715B1; BR9916460A; US20020076771A1; PT1135517E; US20020090689A1; CZ296125B6

Description

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká oblasti molekulární biologie a použití kvasinek k výrobě askorbové kyseliny a stereoisomerů kyseliny askorbové.

Dosavadní stav techniky

Kyselina L-askorbová (vitamin C, ASA) nalézá použití ve farmaceutickém a potravinářském průmyslu jako vitamin a antioxidant. Syntéza ASA získala značný zájem po mnoho let díky jejímu relativné velkému objemu na trhu a vysoké ceně jako speciální chemikálie. Chemická cesta z glukosy na ASA, Reichsteinova-Grussnerova methoda, byla poprvé publikována v roce 1934 (Helv. Chim. Acta 17: 311-328). Lazarus a spol. (1989, Vitamin C: Bioconversion via a Recombinant DNA Approach, Genetics and Molecular Biology of Industrial Microorganisms, Američan Society for Microbiology, Washington D.C., vydal C.L. Hershberger) publikovali metodu biokonverse pro výrobu intermediátu ASA, kyselinu 2-keto-L-gulonovou (2KLG, KLG), která může být chemicky konvertována na ASA. Saíto a spol. (1997, Applied and Enviromental Microbiology, 63: 454-460) uvádějí vytvoření expesivního systému pro produkci 2-KLG z D-sorbitolu.

O přítomnosti ASA v kvasinkách bylo referováno (Heick a spol., Can. J. Microbiol., 1972, 18, 597-600) a byla publikována konverse L-galaktonových substrátů na ASA v kvasinkách Candida (United States patenty: 4 595 659 vydaný 17. 6. 1986 a 4 916 068, vydaný 10. 4. 1990). Costamagna a spol.( Can. J. Microbiol., 1986, 32, 756-758) popisují výsledky studie o využití ASA některými kvasinkami. Tato zpráva uvádí, že druhy Cryptococcus a Candida byly schopny růst na ASA stejně jako iso-askorbové kyselině.

Navzdory vědeckým pokrokům, které byly učiněny v produkci ASA a jejích biokatalytických intermediátů, existuje stále potřeba metod pro výrobu kyseliny askorbové, aby se zabezpečila světová poptávka. Zejména by bylo výhodné objevit metodu, která pro produkci askorbové kyseliny využívá obnovitelný zdroj uhlíku.

• · · ·

Podstata vynálezu

Předkládaný vynález se týká výroby kyseliny askorbové nebo stereoisomerů kyseliny askorbové v kvasinkách. Předkládaný vynález je zčásti založen na neočekávaném objevu, že četné druhy kvasinek, které jsou schopny růst na askorbové kyselině nebo iso-askorbové kyselině jako jediném zdroji uhlíku, jsou schopny využívat KLG jako jediný uhlíkový zdroj pro produkci askorbové kyseliny. Ve shodě s tím předkládaný vynález poskytuje způsoby produkce askorbové kyseliny nebo stereoisomerů askorbové kyseliny z kvasinek.

Podrobný popis

Definice:

Zde používaný termín askorbové kyselina je názvem uznaným IUPAC-IUB komisí pro biochemickou nomenklaturu pro vitamin C. Jiné názvy jsou L-askorbová kyselina, L-xyloaskorbová kyselina a γ-lakton kyseliny L-threo-hex-2-enové. Čistý vitamin je C₆H₈O₆ a má molekulovou hmotnost 176,13. Jsou možné čtyři stereoisomery askorbové kyseliny: kyselina L-askorbová, kyselina D-araboaskorbová (erythorbová kyselina), která vykazuje C vitaminovou aktivitu, L-araboaskorbová kyselina a D-xyloaskorbová kyselina. Intermediáty askorbové kyseliny nebo pathway intermediáty jsou takové biochemikálie, které jsou schopné konverse na ASA pomocí enzymatických nebo chemických prostředků a zahrnují kyselinu glukonovou, kyselinu 2-keto-D-glukonovou, kyselinu 2,5-diketo-D-glukonovou, kyselinu 2-keto-Lgulonovou, kyselinu idonovou, kyselinu glukonovou, sorbitol, sorbosu, sorboson a diacetonsorbosu, ale nejsou omezeny jen na ně.

Fráze schopná využití KLG pro produkci askorbové kyseliny nebo stereoisomerů askorbové kyseliny, pokud se vztahuje na kvasinku, znamená kvasinky schopné produkovat askorbovou kyselinu z KLG jakýmikoliv způsoby včetně biokatalytické konverse a chemické konverse.

V praxi je dobře známo, že kyselé deriváty sacharidů mohou existovat v různých ionizačních stavech v závislosti na mediu, které je obklopuje, zda jsou v roztoku nebo mimo roztok, z něhož jsou preparovány, pokud jsou v tuhé formě. Použitím termínu, jako na příklad idonová kyselina, pro označení takových molekul se má na mysli, že zahrnuje všechny ionizační stavy organické molekuly, o níž se referuje. Tak na příklad idonová kyselina, její cyklizovaná forma ^fí Ϊdonolakton a • · ····· ·· · ·»· · » · t · · _ ·· *·· ·· ··· ·· ·«<

w •jdonát, se týká stejného organického podílu a není zamýšleno, aby specifikovaly jednotlivé ionizační stavy nebo chemické formy.

Zde používaný termín rekombinantní se vztahuje na kvasinku, která obsahuje nukleovou kyselinu, která se v organismu nevyskytuje přirozeně a/nebo na kvasinku, která má další kopie endogenní nukleové kyseliny zavedené rekombinantně. Termín heterologický, jak se zde používá, se vztahuje na sekvence nukleové kyseliny nebo aminokyselin, které se v kvasince nevyskytují přirozeně. Jak je zde používán termín endogenní, týká se nukleové kyseliny přirozeně se vyskytující v kvasince. Rekombinantní hostitel může mít také mutace a/nebo výpadky co do přirozeně se vyskytující nukleové kyseliny, takže není produkován protein, který nukleová kyselina kóduje.

Zde používaný termín nukleová kyselina se vztahuje na nukleotidovou nebo polynukleotidovou sekvenci a její fragmenty nebo části a na DNA nebo RNA genomického nebo syntetického původu, které mohou být dvouvláknové nebo jednovláknové, jestli představují antikódující nebo kódující řetězec. Termín aminokyselina, jak se zde používá, se vztahuje na peptidové nebo proteinové sekvence nebo jejich části.

Jak se zde používá fráze oxidativní enzym, vztahuje se na enzym nebo enzymový sytém, který může katalyzovat konversi substrátu s daným oxidačním stavem na produkt s vyšším oxidačním stavem než má substrát. Fráze reduktivní enzym se vztahuje na enzym nebo enzymový sytém, který může katalyzovat konversi substrátu s daným oxidačním stavem na produkt s nižším oxidačním stavem než má substrát. Oxidativní enzymy spojené s biokatalýzou šestiuhlíkového cukru na pathway intermediáty ASA zahrnují mezi jinými dehydrogenázu D-glukosy, dehydrogenásu D-glukonátu a dehydrogenásu 2-keto-D-glukonátu, právě tak jako aktivitu dehydrogenázy L-sorbitolu, aktivitu dehydrogenázy L-sorbosy a dehdrogenázy L-sorbosonu. Reduktivní enzymy spojené s biokatalýzou postupných intermediátů ASA na požadované konečné produkty zahrnují mezi jinými reduktázu

2,5-diketo-D-glukonátu (DKGR), 2-ketoreduktázu (2-KR) a 5-ketoreduktázu (5-KR). Takové enzymy zahrnují ty, které jsou přirozeně produkovány hostitelskou kvasinkou nebo ty, které jsou zavedeny pomocí rekombinantních způsobů.

Zde používaný termín kyselina šestiuhlíkového cukru specificky vylučuje Lgalaktonové substráty a zahrnuje, ale neomezuje se na kyselinu 2-keto-L-gulonovou, kyselinu idonovou, kyselinu glukonovou, 6-fosfoglukonát, kyselinu 2-keto-D4 glukonovou, 5-keto-D-glukonovou, 2-ketoglukonátfosfát, kyselinu 2,5-diketo-Lgulonovou, 2,3-diketo-L-gulonovou, kyselinu dehydroaskorbovou, kyselinu erythroaskorbovou a kyselinu D-mannonovou.

Jak se zde používá termín šestiuhlíkový cukr zahrnuje, ale neomezuje se na glukosu, gulosu, sorbosu, fruktosu, idosu, galaktosu a mannosu, všechny buď v Dnebo L-formě.

Termín isolovaný nebo vyčištěný jak je zde používán, vztahuje se na nukleovou kyselinu nebo protein anebo peptid, který je vyjmut nejméně z jedné komponenty, ke které je přirozeně přidružen. V předkládaném vynálezu může isolovaná nukleová kyselina zahrnovat vektor obsahující nukleovou kyselinu. Vyčištěný jak je zde používán, aby se popsal uhlíkový zdroj pocházející z fermentačního procesu, se vztahuje na vynětí tohoto uhlíkového zdroje nejméně z jedné komponenty, která je přirozeně přičleněna ve fermentační kultuře.

Podrobný popis vynálezu:

Produkce AS A v kvasinkách

Předkládaný vynález se týká produkce ASA nebo stereoisomerů ASA, např. kyseliny erythorbové, v kvasinkách, které jsou schopny využívat k produkci ASA KLG jako jediný uhlíkový zdroj. Předkládaný vynález specificky vylučuje metodu produkce ASA v kvasinkách, která produkuje ASA cestou prostřednictvím L-galaktolaktonoxidázy. Kvasinky jsou popsány v N. J. W. Kreger-van Rij: The Yeasts Vol. 1 of Biology of Yeasts, kapitola 2, vydavatelé A. H. Rose & J. S. Harrison, 1987, Academie Press London. Kvasinky náležející rodům imperfektních kvasinek jsou charakterisovány obvykle jako netvořící ascospory a basidiospory. ASA je citlivá na kyslík, a proto se dává přednost tomu, že kvasinky jsou schopny anaerobního růstu, aby se snižovala oxidace produkované ASA. Předkládaný vynález také obsahuje způsoby produkce ASA za použití kvasinek, které jsou kultivovány za aerobních podmínek pokud jsou v prostředí ASA přítomna redukční činidla jako dithioetrythritol, glutathion, chelátory kovů jako EDTA, stabilizátory jako kyselina metafosforečná, aminokyseliny, glykoly, cukry, kyselina šťavelová, kyselina trichloroctová, 8hydroxychinolin [D. W. Bradley, G. Emery a J. E. Manyard: Clin. Chim. Acta 4, 47-52 (1973)].

Kvasinky, které mohou být použity v předkládaném vynálezu zahrnují, ale neomezují se na ty, které jsou zde uvedeny a jsou doloženy příklady označení • ♦ ♦ · tu» • ·· · · · * ··· • · · · · · · · ·· φ 0Φ·0 Φ · 0 ··

0·· ·· · | ·« <« «Φ» 0« 0«· «···· depozitu podle následujícího seznamu: Candida blankii CBS1898; ATCC 18735; C. curvata CBS570; C. humicola; C. incommunis ATCC22971; C. salmanticensis ATCC 16042; C. sp. ATCC 28528, ATCC 20473; Cryptococcus albidus CBS4192; Cr. dimennae CBS5770; Cr, heveanensis CBS140; Cr. kuetzingii UCD68-196; Cr. luteolus CBS 953; Cr. skinneri UCD60-82 CBS5029; Cr. terreus CBS1895; CBS6293, CCA17-8-5; Cr. uiguttulatus CBS1730; Cr. laurentii CCY17-3-2, CCY17-36, ATCC32044; Cr. neoformans ATCC32045; Cr. podzolicus CCY17-20-1; Trichosporon cutaneum UCD54-169 CCY30-5-4; T. beigelii NRRLY-1490; T. pullulans ATCC10677; Aureobasidium pullulans DBV A9, A10, A62, A77, A84; Hansenula capsulata DBV 3164, ATCC24204; Lipomyces starkeyi UCD 51-55, CBS 1809; L. lipofer NRRL Y-1351, Phaffia rhodozyma ATCC24201, Rhodotorula mucilaginosa NRC 211003; Saccharomyces uvarum ATCC9373, ATCC 9080; Saccharomycopsis fibuligera ATCC2082; Schwanniomyces occidentalis NRC2782, NRC2783 a Torulopsis ernobii ATCC20000. Při preferovaném provedení jsou jz kvasinky členy skupiny imperfektních kvasinek. Preferovaným rodem imperfetních kvasinek pro použití při způsobech produkce ASA je čeleď Cryptococcaceae. Preferované rody Cryptococcaceae jsou voleny ze skupiny, kterou tvoří Candida a Cryptococcus.

Jak je ukázáno v příkladech provedení, Candida blankii a Cryptococcus dimennae jsou schopny produkovat ASA nad úrovně pozadí, když jsou pěstovány na KLG jako jediném uhlíkovém zdroji, zatímco Candida shehatae, když mohla být pěstována na KLG jako jediném uhlíkovém zdroji, byla neschopná produk^wT ASA. Ilustrativní příklady uvádějí použití Candida shehatae ATCC přístupové Číslo 34887, Candida blankii ATCC přístupové číslo 18735, Cryptococcus dimennae ATCC přístupové číslo 22024 a Cryptococcus dimennae ATCC přístupové číslo 32044. Předkládaný vynález zahrnuje mutanty, deriváty a progeny známých kvasinkových species a zejména mutanty a deriváty známých species náležejících rodu Cryptococcaceae, např. ty, co náleží ke Candida a Cryptococcus, pokud mutant, derivát nebo progen je schopen využívat KLG jako jediný uhlíkový zdroj k produkci ASA.

Předkládaný vynález zahrnuje způsoby produkce ASA nebo stereoisomerů

ASA kvasinkami, kde kvasinky jsou přirozeně se vyskytující, tj. nikoliv geneticky konstruovány, právě tak jako kde je kvasinka rekombinantní a obsahuje heterologickou nukleovou kyselinu kódující oxidativní a/nebo reduktivní enzymy, ···· · «« ···· fl • ·♦ · · · · · • · 9 9 9 9 9 ·· které jsou v kvasinkách spojeny s konversí uhlíkového zdroje na KLG. V předkládaném vynálezu může být uhlíkový zdroj jako je šestiuhlíková cukerná kyselina produktem separátního fermentačního procesu, který je zaveden do kvasinkové kultury, jako KLG získaná metodou, kterou publikoval Lazarus a spol. (J. Bact. 1991, 173, 6651-61) nebo metodou, kterou publikoval Saito a spol. (1997, Applied and Enviromental Microbiology 63: 454-460). Uhlíkový zdroj pocházející ze separátního fermentačního procesu může být před použitím ve způsobu produkce ASA nebo stereoisomerů ASA vyčištěn nebo použit přímo z fermentačního procesu. Uhlíkový zdroj může být získán také chemickými prostředky.

Při jiném provedení předkládaného vynálezu jsou kvasinky konstruovány geneticky, aby obsahovaly buď heterologický oxidativní enzym nebo heterologický reduktivní enzym anebo oba, asociované ke konversi uhlíkového zdroje na KLG v kvasinkách, poskytujíce tím samostatný organismus, který je schopen konvertovat uhlíkový zdroj jako je glukosa nebo jiný šestiuhlíkový cukr na askorbovou kyselinu via KLG jako intermediátu. Aby rekombinantní hostitelská kvasinka produkovala askorbovou kyselinu ze šestiuhlíkového cukru nebo ze šestiuhlíkové cukerné kyseliny může obsahovat rozmanité heterologické oxidativní enzymy a/nebo rozmanité heterologické reduktivní enzymy.

Při jednom preferovaném provedení je uhlíkovým zdrojem glukosa a rekombinantní kvasinka obsahuje heterologickou nukleovou kyselinu kódující nejméně jednu z (a) dehydrogenázy glukosy (GDH); (b) dehydrogenázy glukonové kyseliny (GADH); (c) dehydrogenázy 2-keto-D-glukonové kyseliny (2-KDGDH) a (d) reduktázy 2,5-diketo-D-glukonové kyseliny (2,5-DGKR) za předpokladu, že obsahujeli kvasinka heterologickou nukleovou kyselinu pro méně než všechny z (a) - (d), pak obsahuje kvasinka endogenní nukleovou kyselinu tak, že kvasinka obsahuje nukleovou kyselinu pro každé z (a) - (d) a je schopná konvertovat glukosu na ASA via intermediátní KLG. Jak je snadno pochopitelné zkušeným odborníkům, oxidační a redukční reakce zúčastněné na konversi uhlíkového substrátu na ASA, mohou vyžadovat, aby do kvasinkových kultur byly přidány kofaktory. Na příklad 2,5-DGKR popisovaná v U. S. patentu číslo 5032514 vydaného 16. července 1991 má nutnou potřebu NADPH. Jiné příklady kofaktorů nezbytných v enzymatických reakcích zahrnují, ale nejsou omezeny na ATP, Nad+, NADP+, NADH, NADPH a koenzym A. Kvasinky mohou také mít výpadky nebo mutace endogenních oxidativních a/nebo reduktivních enzymů, které interferují s požadovanou cestou oběhu uhlíku.

·· ·♦

Při jiném provedení předkládaného vynálezu je uhlíkovým zdrojem sorbitol a rekombinantní kvasinka obsahuje heterologickou nukleovou kyselinu kódující nejméně jednu z (a) dehydrogenázy D-sorbitolu (SLDH); (b) dehydrogenázy Lsorbosy a (c) dehydrogenázy L-sorbosomu za předpokladu, že obsahuje-li kvasinka heterologickou nukleovou kyselinu pro méně než všechny z (a) - (c), pak obsahuje kvasinka endogenní nukleovou kyselinu tak, že kvasinka obsahuje nukleovou kyselinu pro každé z (a) - (c) a je schopná konvertovat sorbitol na ASA via intermediátní 2KLG.

Zdroje pro nukleovou kyselinu kódující oxidativní nebo reduktivní enzymy představují následující:

ENZYM dehydrogenáza glukosy dehydrogenáza kyseliny glukonové dehydrogenáza kyseliny 2-keto-D-glukonové reduktáza 2-ketoglukonátu reduktáza 2,5-diketo-D-glukonové kyseliny dehydrogenáza L-sorbosy; dehydrogenáza L-sorbosonu a dehydrogenáza L-sorbitolu

CITACE

Smith a spol. Biochem. J., 261:973 Neijssel a spol. 1989,

Antonie Van Leauvenhoek 56(1) 51-61

Matsushita a spol., 1979 J. Biochem. 85:1173; Kulbe a spol. 1987, Ann. N.Y. Acad. Sci. 506:552

Stroshane 1997 Biotechnol.

BioEng 19(4) 459

J. Gen. Microbiol. 1991,137:1479 U.S. patenty č. 5 795 761; 5 583 025; 5 376 544, 5 008 193;

757 012; 4 758 514; 5 004 690;

032 514

Saito a spol., Applied and Enviromental Microbiology, 1997, 63:454

Konstrukce rekombinantních kvasinek

Rekombinantní kvasinky obsahující nukleovou(vé) kyselinu(y) nezbytnou pro produkci ASA z uhlíkového zdroje mohou být konstruovány pomocí v oboru běžně známých technik. Techniky molekulární biologie publikoval Sambrook a spol. v Molecular Biology Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989). Geny kódující oxidativní enzymy a reduktivní enzymy, související s produkcí ASA, mohou být isolovány z nativních hostitelů, jak se popisuje níže nebo produkovány chemickými prostředky. Na příklad, jestliže je známa sekvence genu, mohou být vhodné genomové sbírky vytvořeny omezováním digesce endonukleázy a mohou být vyhledány sondami komplementárními vůči požadované genové sekvenci. Jakmile je sekvence isolována, může být DNA rozmnožena za použití standardních základně zaměřených amplifikačních metod jako řetězové reakce polymerázy (PCR) (U. S. 4 683 202), aby se získala množství nukleové kyseliny vhodná pro transformaci za použití příslušných vektorů. Těm, kteří v mají oboru zkušenosti jsou známy různé vektory i transformační a expresivní kazety vhodné pro klonování, transformaci a expresi nukleové kyseliny v kvasinkách, kódující oxidativní a reduktivní enzymy související s produkcí ASA. Odborníkům jsou známy postupy pro získání a využití takových vektorů [Sambrook a spol. Molecular Cloning: A Laboratory Manual - Volumes 1,2,3; Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989)].

Vektor nebo kazeta typicky obsahuje sekvence řídící transkripci a translaci nukleové kyseliny, volitelný značkovač a sekvence dovolující autonomní replikaci nebo chromosomální integraci. Vhodné vektory obsahují 5' oblast genu, která v sobě chová kontroly iniciace transkripce a 3' oblast fragmentu DNA, která kontroluje zakončení transkripce. Tyto kontrolní oblasti mohou pocházet z genů kvasinkám homologických nebo heterologických, pokud vybraná kontrolní oblast je schopná v kvasinkách fungovat.

Iniciační kontrolní oblasti či promotory, které jsou užitečné k puzení exprese oxidativních nebo reduktivních enzymů v kvasinkách jsou odborníkům známy. Ve skutečnosti jakýkoli promotor schopný ovlivňovat tak tyto geny je pro předkládaný vynález vhodný, včetně CYC1, HIS3, GAL1, GAL10, ADH1, PGK, PHO5, GAPDH, ADC1.TRP1, URA3, LEU2, ENO, TPI, ale není to na ně omezeno. Nukleové kyseliny kódující oxidativní nebo reduktivní enzymy jsou pro efektivní expresi oxidativních a reduktivních enzymů operabilně připojeny iniciačními kodóny na vybrané kontrolní oblasti exprese.

Jakmile jsou zkonstruovány vhodné kazety, použijí se na transformování kvasinek a kvasinky se prověřují na schopnost produkovat ASA z vhodného <··· φ «· φ··· ««

ΦΦΦ φ φ φ φφφ φ φ · φ φ · φ φφ uhlíkového zdroje. Na příklad v jednom provedení jsou kvasinky transformovány nukleovou kyselinou kódující aktivitu dehydrogenázy a aktivitu reduktázy buď jednu z nich nebo obě a transformované kvasinky jsou prověřeny na schopnost produkovat ASA ze šestiuhlíkového cukru jako glukosy nebo šestiuhlíkové cukerné kyseliny jako KLG.

Detekce ASA

Metody detekce ASA a stereoisomerů ASA zahrnují aplikaci redox-titrace s

2,6-dichlorindofenoíem (Burton a spol., 1979, J. Assoc. Pub. Analysts 17:105); vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií (HLPC) na iontoměniči (J. Chrom. 1980, 196:163); a elektro-redox procedury (Pachia, 1976, Anal. Chem. 48:364). Mohou být rovněž použity enzymatické procedury zahrnující použití oxidázy askorbové kyseliny.

V předkládaném vynálezu byla detekce ASA uskutečněna HPLC, kolorimetrickým esejem oxidázy askorbátu jak je zde uveden a GC-hmotnostní spektrofotometr!í. Zkušení odborníci budou dobře informováni o kontrolách aplikovatelných při využívání těchto detekčních metod. Protože mezi KLG a ASA existuje chemická rovnováha (tj. KLG obsahuje pozadí hladin ASA) byl při užívání UV detekce v HPLC askorbové kyseliny zaznamenáván a ke kontrole používán eluční profil KLG substrátu. Pro esej askorbátu oxidázy probíhá kontrola slepým pokusem bez vzorku a zkoumá se jen enzym. Při GCMS analýze bylo jako kontrola analysováno derivatisační činidlo a KLG substrát.

Rovněž je žádoucí mít prověřovací metodu pro kvasinky, které jsou schopny produkovat ASA z uhlíkového zdroje. Metoda screeningu kvasinek schopných produkce ASA obsahuje kroky k získání kvasinek schopných pro růst askorbové kyseliny nebo stereoisomerů askorbové kyseliny, kultivace řečených kvasinek v přítomnosti KLG za podmínek vhodných pro produkci askorbové kyseliny nebo stereoisomerů askorbové kyseliny a analyzování řečené kvasinkové kultury na produkci askorbové kyseliny nebo stereoisomerů askorbové kyseliny.

Fermentace a čistění

Media a uhlíkové substráty

Přírodně se vyskytující kvasinky nebo rekombinantní kvasinky schopné využití

KLG na produkci ASA se podrobují fermentaci ve velkém měřítku v přítomnosti vhodných uhlíkových zdrojů a získává se ASA. Vhodné uhlíkové zdroje zahrnují • · « 44 44 · ··· • · · ··· ··· • · · 4 4 4 V44 • · · 4 · · · 44 šestiuhlíkové cukry nebo šestiuhlíkové cukrerné kyseliny. Zde pro růst kvasinek uváděný zdroj uhlíku bude limitován pouze požadavky hostitelského organismu. Na příklad, přírodně se vyskytující kvasinky mohou být pěstovány v přítomnosti šestiuhlíkové cukrerné kyseliny, např. KLG, zatímco rekombinantní kvasinky, které byly geneticky upraveny, aby obsahovaly nukleovou kyselinu kódující dehydrogenázu a reduktázu buď jednu z nich nebo obě, mohou být pěstovány v přítomnosti šesti uhlíkového cukru např. glukosy. Kromě vhodného uhlíkového zdroje musí fermentační media obsahovat vhodné minerály, soli, kofaktory, pufry a jiné komponenty, o nichž v praxi zkušení vědí, že jsou vhodné pro pěstování kultur a produkci ASA. Metody pro media a podmínky kultivace vhodné pro pěstování kvasinek popsal Costamagna a spol, 1986 v Can. J. Microbiology, 32: 756-758.

Kvasinky mohou být pěstovány za aerobních nebo anaerobních podmínek. ASA je citlivá na kyslík, a proto anaerobně pěstované kvasinky produkující ASA budou snižovat oxidaci produkované ASA. Alternativně, pokud jsou kvasinky pěstovány za aerobních podmínek, preferuje se, aby v prostředí ASA byla přítomna redukční činidla, např. dithiothreitol, glutathion, chelátory kovů jako EDTA, stabilizátory jako kyselina metafosforečná, aminokyseliny, glykoly, cukry, kyselina šťavelová, kyselina trichloroctová, 8-hydroxychinolin. Předkládaný vynález obsahuje vsádkovou nebo kontinuální fermentaci a proces produkce ASA může probíhat v jednom nebo ve dvou fermentorech. Na příklad jsou-li kvasinky geneticky konstruovány, aby vytvářely cestu ze šestiuhlíkového cukru, jako na příklad glukosy, k šestiuhlíkové cukerné kyselině jako KLG, může produkce ASA probíhat v jednom fermentoru za použití rekombinantních kvasinek jako hostitele. Jestliže jde o přirozeně se vyskytující kvasinky a ASA je v kvasinkách produkována ze šestiuhlíkové cukerné kyseliny, např. KLG, může produkce ASA probíhat ve dvou fermentorech, v jednom pro produkci KLG jak je popsáno v U. S. patentu 5032514 nebo od Saito a spol. viz nahoře a v druhém pro produkci ASA z KLG v kvasinkách.

Klasická vsádková fermentace je uzavřený systém, kdy skladba media se vkládá na začátku fermentace a není subjektem nucených změn během fermentace. Na začátku fermentace je tedy medium naočkováno požadovaným organismem nebo organismy a fermentace se nechá probíhat bez přidání čehokoliv do systému. Vsádková fermentace je však typicky vsádkovou s ohledem na přidání uhlíkového zdroje a často se dělají pokusy při kontrole faktorů jako pH a koncentrace kyslíku. Složení metabolitů a biomasy systému ve vsádce se konstantně mění dokud není

999»

9 • 9

99 9 • ·· doba fermentace zastavena. Ve vsádkových kulturách procházejí buňky přes statickou zpožďovanou fázi do exponenciální fáze prudkého růstu a nakonec do stacionární fáze, kdy je rychlost růstu zmenšena nebo zastavena. Nejsou-li zpracovány budou buňky ve stacionární fázi ncib/nec> odumírat. Buňky v exponenciální fázi jsou obvykle zodpovědné za množství produkce konečného produktu nebo intermediátu.

Variací standardního vsádkového systému je doplňovaný vsádkový fermentační systém, který je pro předkládaný vynález rovněž vhodný. Při této variaci typického vsádkového systému je substrát přidáván v přírůstcích tak, jak fermentace postupuje. Doplňovaný vsádkový systém je užitečný, kde potlačování katabolitu je schopné inhibovat metabolismus buněk, a kde je žádoucí mít v mediu omezené množství substrátu. Měření aktuální koncentrace substrátu u doplňovaného vsádkového systému je nesnadné, a proto je odhadována na základě změn měřitelných faktorů jako pH, rozpuštěného kyslíku a parciálního tlaku odpadních plynů jako je CO₂. Vsádkové a doplňované vsádkové fermentace jsou běžné a v praxi dobře známé a příklady mohou být nalezeny v Brock-ovi, viz shora.

Předpokládá se rovněž, že metoda by byla adaptovatelná na kontinuální fermentační metody. Kontinuální fermentace je otevřeným systémem, kde je do bioreaktoru kontinuálně přidáváno definované fermentační medium a simultánně se odebírá stejné množství patřičně upraveného media. Kontinuální fermentace obvykle udržuje kultury při konstantně vysoké hustotě, kdy buňky jsou hlavně v exponenciální fázi růstu.

Kontinuální fermentace umožňuje modulovat jeden faktor nebo nějaký počet faktorů, které ovlivňují pěstování buněk nebo koncentraci konečného produktu. Jedna metoda bude na příklad udržovat na stálém stupni omezenou živinu jako je uhlíkový zdroj nebo hladina dusíku a dovolí upravovat všechny ostatní parametry. V jiných systémech může být kontinuálně měněna řada faktorů ovlivňujících růst, zatímco koncentrace buněk, měřená zakalením media se udržuje konstantní. Kontinuální systémy usilují o udržování podmínek ustáleného stavu růstu, a tudíž ztráta buněk způsobená odebráním media musí být vyvážena proti rychlosti růstu buněk při fermentaci. Metody modulace živin a faktorů růstu pro kontinuální fermentační procesy, stejně jako techniky pro maximalisaci stupně tvorby produktu jsou v oboru průmyslové mikrobiologie dobře známy a rozličné metody jsou podrobně popsány Brock-em, viz shora.

• ·

Způsoby podle předkládaného vynálezu mohou být uplatněny v praxi buď vsádkovými, doplňovanými vsádkovými nebo kontinuálními procesy. Po fermentaci může být produkovaná ASA isolována z fermentační kapaliny různými způsoby, včetně pryskyřic iontoměničů, absorpčních nebo ionty zadržujících pryskyřic, aktivního uhlí, zakoncentrování ke krystalisaci atd.

Různé aspekty předkládaného vynálezu vzhledem k následujícím specifickým příkladům, které nejsou zamýšleny tak, aby rozsah předkládaného vynálezu omezovaly, budou popsány dále.

Přehled obrázků na výkresech

Obrázek 1 ilustruje růst Candida blankii, Candida shehatae a Cryptococcus dimennae na 2KLG jako jediném uhlíkovém zdroji v dusíkové basi v kvasinkách.

Obrázek 2 ilustruje růst Candida blankii, Candida shehatae, Cryptococcus dimennae a Cryptococcus luteolus na sodné soli ídonátu v dusíkové basi v kvasinkách.

Obrázek 3 ukazuje stanovení obsahu ASA v supernatantu Candida blankii a Cryptococcus dimennae v celkové reakční směsi při použití eseje s askorbátovou oxidázou.

Příklady provedení vynálezu

Následující popis materiálů a metod se vztahuje na příklady I - III.

Materiály a metody

Podm ínky kultur:

Kvasinky byly pěstovány na Difco kultivované kvasinkové dusíkové basi (YNB)

6,7 g/l s počátečním růstem na 2 % glukosy, následovaným přenosem k 0,5 % (hm./obj.) jediného uhlíkového zdroje L-ASA a pak 2-KLG nebo L-idonátu 20,8 mM. Kvasinky byly v třepacích baňkách kultivovány v 50 ml YNB media při 22°C, pH 5,5 ve 48 hodinovém cyklu při třepání rychlostí 250 ot/min.

HLPC:

Eluování askorbátu a jiných cukerných ketokyselin při HLPC bylo prováděno za použití Dionex lonPac AS10 analytické kolony s ochranným sloupcem. Byla použita isokratická eluce za použití 40 mM acetátového eluentu o pH 4,86, aby se dosáhlo dobrého rozdělení re teční doby mezi substrátem KLG a produktem askorbátu (>5 min). Askorbát byl detegován (>100 ppb) pomocí UV detektoru mezi vlnovými délkami 245 - 270 nm, zatímco KLG byla detegována pomocí detektoru indexu refrakce. Ke studii použitý systém HPLC je přístroj HP-Alliance opatřený softwarovým souborem Millenium pro výpočet integrace ploch peaků. Kalibrační křivka pro kvantifikaci askorbátu byla vytvořena mezi 100 ppb -100 ppm.

GC - MS:

Identifikace askorbátu pomocí GC - MS byla prováděna podle publikovaného postupu (J. C. Deutsch a J. Fred Kolhouse, Anal. Chem., 1993, 65, 321-326). GC separace byla prováděna na HP přístroji 5890 s použitím Supelco SPB-1 kapilární kolony z taveného křemene o délce 15 m a průměru 0,25 mm. Derivatisace askorbátu byla provedena N-methyl-N-(terc.butyldimethylsilyl)trifluoracetamidem a acetonitrilem podle metody uvedené v hořejším odkazu. Standardní retenční doba získaná za našich experimentálních podmínek byla 8,75 minut. Ve spektrech získaných jak u standardních tak i neznámých vzorků byly detegovány charakteristické linie hmotnostních fragmentů při m/z 575, 531,443, 343.

Esej askorbátové oxidázy

Esej akorbátové oxidázy byl prováděn pomocí soupravy pro stanovení Laskorbové kyseliny (katalog, č. 409677) poskytované firmou Boehringer Mannheim a postupováním podle návodu, kterým je souprava opatřena. Souprava obsahuje enzym askorbátové oxidázy a detekci / stanovení kvantity (578 nm) pomocí sdruženého barevného systému MTT a PMS H.O. Beutler a G. Beistingl, 1984 v Methods of Enzymatic Analysis (H.U. Bergmeyer, editor) 3.vyd., sv. 7, str. 376-365, Verlag Chemie, Weinheim, Deerfield, Beach / Florida, Basel.

Kontroly a slepé pokusy

0,5 % roztoku^KLG obsahuje ~ 2 ppm askorbátu při pH 6,1. Kontrolní reakce pouze s pufrem obsahujícím KLG byla prováděna u každého experimentu spolu s reakční směsí obsahující kvasinky jako kontrolní reakce během doby průběhu experimentu konverse veškeré buněčné KLG na ASA. Při jiné kontrole byly buňky kvasinek usmrceny teplem a potom inkubovány s KLG pro ujištění, že za těchto podmínek nebyla detegována žádná transformace KLG na ASA. Peak askorbátu detegovaný HLPC analýzou byl dále potvrzen reakcí vzorku s askorbátovou *··· 0 ·· · ♦ · · · * < · · 0 * 0 «·· * 4 » · · · · · · oxidázou a takto zmizením peaku v chromatogramu díky degradaci askorbátu askorbátovou oxidázou.

Příklad I

Tento příklad ukazuje, že kvasinka Candida blankii je schopná využívat jako jediný uhlíkový zdroj pro růst KLG nebo idonát. Tento příklad ukazuje také produkci askorbové kyseliny pomocí Candida blankii, když je pěstována v přítomnosti KLG jako jediném uhlíkovém zdroji.

Candida blankii mající ATCC přístupové číslo 18735 byla kultivována jak se popisuje v oddíle materiály a metody. Reakce veškerých buněk KLG na ASA byla provedena jak se níže popisuje. Kolem 3 gramů mokrých buněk bylo sebráno z 500 ml 48 h rostlé kultury centrifugací při 4°C a 9000 ot/min. Buňky byly promyty studeným 200 mM fosfátovým pufrem při pH 6,1 obsahujícím 0,5 mM EDTA. Potom byly buňky znovu suspendovány ve stejném pufru obsahujícím 0,5 % KLG (10 ml). Tři ml této reakční směsi byly odebrány a dvě minuty vařeny v mikrovlnce. Obě reakční směsi byly potom při 30°C vloženy do rotačního inkubátoru k celkové buněčné produkci ASA. 1,5 ml vzorku v čase nula bylo odebráno, centrifugováno aby se odstranil sbalek buněk a skladováno při -20°C. Supernatant byl filtrován přes filtr 0,2 pa podroben HPLC analýze následované askorbátovou oxidázou a GCMS analýzou jak se shora popisuje. Odebrání vzorku a způsob zpracování byly pro reakci živých buněk aplikovány v časovém úseku po 2, 4 a 20 hodinách a po 20 hodinách u vzorku reakční směsi s teplem usmrcenými buňkami (Tabulka 1). Teplem usmrcené vzorky neměly pozadí hladin ASA a ASA neprodukovaly.

Po odebrání vzorku po 20 hodinách bylo pH reakční směsi citrát-fosfátovým pufrem sníženo o tři jednotky na 3,15. Byl odebrán vorek a v 21 hodině analyzován, aby se zaznamenal čas nula pro změnu této podmínky. Reakce se nechala pokračovat přes noc. Po další 24 h periodě byl odebrán konečný vzorek. Při obou hodnotách pH byla provedena paralelní kontrolní reakce slepého pokusu KLG bez buněk, aby se zaznamenalo pozadí produkce ASA z KLG (viz tabulka 1, obr. 3).

Jak lze vidět z tabulky 1 a obrázku 3, když jsou pěstovány C. blankii v celé buněčné kultuře při použití KLG jako jediného substrátu, byla v reakčním mediu potvrzena přítomnost ASA. Koncentrace ASA přítomné v reakční směsi třikrát překračovala hladiny pozadí. Při snížení pH reakční směsi na pH 3 bylo pozorováno ···· další trojnásobné zvýšení hladin ASA. Snížení pH mělo účinek na stabilizaci ASA právě tak jako na favorisování termodynamiky pro produkci ASA.

Příklad II

Tento příklad ukazuje, že Cryptococcus dimennae je schopen využívat jako jediný uhlíkový zdroj pro růst KLG nebo idonát. Tento příklad ukazuje také produkci askorbové kyseliny pomocí Cryptococcus dimennae, když je pěstován v přítomnosti KLG jako jediném uhlíkovém zdroji.

Cryptococcus dimennae mající ATCC přístupové číslo 22024 byl kultivován jak se popisuje v oddíle materiály a metody. Reakce celkové buněčné KLG na ASA byla provedena jak je popsáno v příkladu I.

Jak lze vidět z tabulky 1 a obrázku 3, když je v celkové buněčné kultuře pěstován Cryptococcus dimennae při použití KLG jako jediného substrátu, byla v reakčním mediu potvrzena přítomnost ASA. Koncentrace ASA přítomné v reakční směsi dvakrát překračovala hladiny pozadí.

Příklad III

Tento příklad ukazuje, že Candida shehatae je schopna využívat KLG jako jediný uhlíkový zdroj, ale není schopna produkovat ASA. Reakce celkové buněčné KLG na ASA byla provedena jak je popsáno v příkladu I. Jak lze vidět z obrázku 1 Candida shehatae není za těchto podmínek schopna produkovat ASA z KLG.

Tabulka 1

HPLC výsledky AU/area a koncentrace ASA v mg/l ve vzorcích

	AU/area @ 266 nm	Askorbová kys.,konc. mg/l
Vzorky	Cas 0 h	Cas 4 h	Cas 20 h	Cas 0 h	Cas 4 h	Cas 20 h

2KLG pufr, slepý p.	259831	280706	264840	1,9	2,1	1,9
Candida blankii	314059	240613	905162	2,3	1,8	6,6
Candida shahatae	204867	205323	270663	1,5	1,5	1,9
Cryptoc. dimennae	224203	223112	522325	1,6	1,6	3,8

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Způsob produkce askorbové kyseliny nebo stereoisomerů askorbové kyseliny vyznačený tím, že obsahuje stupně

a) získání kvasinek schopných využívat KLG na produkci askorbové kyseliny nebo stereoisimeru askorbové kyseliny a

b) kultivace kvasinek v přítomnosti uhlíkového zdroje za podmínek vhodných pro produkci askorbové kyseliny nebo stereoisomerů askorbové kyseliny.
2. Způsob podle nároku 1 vyznačený tím, že dále obsahuje stupeň získání řečené kyseliny askorbové.
3. Způsob podle nároku 1 vyznačený tím, že řečeným uhlíkovým zdrojem je šestiuhlíková cukerná kyselina.
4. Způsob podle nároku 3 vyznačený tím, že řečená šestiuhlíková cukerná kyselina zahrnuje kyselinu 2-keto-L-gulonovou, kyselinu idonovou, kyselinu glukonovou, 6-fosfoglukonát, kyselinu 2-keto-D-glukonovou, 5keto-D-glukonovou, 2-ketoglukonát-6-fosfát, kyselinu 2,5-diketo-L-glukonovou, 2,3diketo-L-gulonovou, kyselinu dehydroaskorbovou, kyselinu erythroaskorbovou a kyselinu D-mannonovou.
5. Způsob podle nároku 1 vyznačený tím, že řečeným uhlíkovým zdrojem je šestiuhlíkový cukr a řečená kvasinka obsahuje buď jednu nebo obě a) heterologickou nukleovou kyselinu kódující oxidativní enzym spojený s produkcí askorbové kyseliny nebo stereoisomerů askorbové kyseliny v řečené kvasince a b) heterologickou nukleovou kyselinu kódující reduktivní enzym spojený s produkcí askorbové kyseliny nebo stereoisomerů askorbové kyseliny v řečené kvasince.
6. Způsob podle nároku 5 vyznačený tím, že řečený šestiuhlíkový cukr zahrnuje glukosu, gulosu, idosu, galaktosu, mannosu, sorbosu a fruktosu.

9999 9 99 999999

9 99 9999

9 9 9 9 999 9 99

9 9 9 9 9 9 9 9 99

9 9 9 9 9 9 9 99

17 «· ··· ·· ··· ····«
7. Způsob podle nároku 5 vyznačený tím, že řečený oxidativní enzym má aktivitu dehydrogenázy.
8. Způsob podle nároku 7 vyznačený tím, že řečená dehydrogenáza zahrnuje aktivitu dehydrogenázy glukosy, aktivitu dehydrogenázy kyseliny glukonové, aktivitu dehydrogenázy kyseliny 2-keto-D-glukonové, aktivitu dehydrogenázy galaktosy, aktivitu dehydrogenázy L-sorbosy, aktivitu dehydrogenázy D-sorbitolu, aktivitu dehydrogenázy L-sorbosonu, oxidázu kyseliny L-idonové a oxidázu kyseliny L-gulonové.
9. Způsob podle nároku 5 vyznačený tím, že řečený reduktivní enzym má aktivitu reduktázy.
10. Způsob podle nároku 9 vyznačený tím, že řečená aktivita reduktázy zahrnuje aktivitu reduktázy 2,5-DGK, aktivitu reduktázy 2,5-DKG, 2,3-DKG reduktázu, 5-ketoreduktázu, 2-ketoreduktázu a reduktázu 2-ketogulonátu.
11. Způsob podle nároku 1 vyznačený tím, že řečeným uhlíkovým zdrojem je glukosa a kvasinka obsahuje heterologickou nukleovou kyselinu kódující nejméně jednu z (a) dehydrogenázy glukosy (GDH); (b) dehydrogenázy glukonové kyseliny (GADH); (c) dehydrogenázy 2-keto-D-glukonové kyseliny (2-KDGDH) a (d) reduktázy 2,5-diketo-D-glukonové kyseliny (2,5-DGKR) za předpokladu, že obsahujeli kvasinka heterologickou nukleovou kyselinu pro méně než všechny z (a) - (d), pak obsahuje kvasinka endogenní nukleovou kyselinu tak, že kvasinka obsahuje nukleovou kyselinu pro každé z (a) - (d) a je schopná konvertovat glukosu na ASA via intermediátní KLG.
12. Způsob podle nároku 1 vyznačený tím, že kvasinka je členem skupiny imperfektních kvasinek.
13. Způsob podle nároku 12 vyznačený tím, že kvasinka je členem čeledi Cryptococcaceae.

4 444

4 4 · 4 · 4

4 4 4 4 ·♦ 4>4
14. Způsob podle nároku 13 v y z n a č e n ý tím, že kvasinka zahrnuje Candida a Cryptococcus.
15. Způsob podle nároku 14 vyznačený tím, že kvasinkou je

Candida blankii.
16. Způsob podle nároku 14vyznačený tím, že kvasinkou je

Cryptococcus dimennae.
17. Způsob podle nároku 1 v y z n a č e n ý tím, že řečenou kvasinkou je Candida blankii nebo Cryptococcus dimennae a řečený uhlíkový zdroj obsahuje glukosu, kde řečená kvasinka má aktivitu heterologické dehydrogenázy glukosy a aktivitu 2,5-DKG reduktázy.
18. Způsob podle nároku 1 v y z n a č e n ý tím, že řečenou kvasinkou je Candida blankii nebo Cryptococcus dimennae a řečený uhlíkový zdroj obsahuje Dsorbitol, L-sorbosu nebo L-sorboson, kde řečená kvasinka má aktivitu nejméně jedné z aktivity L-sorbosy, aktivity dehydrogenázy D-sorbitolu, aktivity dehydrogenázy Lsorbosonu a aktivity dehydrogenázy galaktosy.
19. Způsob podle nároku Ivyznačený tím, že řečený stereoisomer askorbové kyseliny zahrnuje kyselinu D-askorbovou, kyselinu Daraboaskorbovou a kyselinu L-araboaskorbovou.
20. Rekombinantni kvasinka, schopná využívat KLG pro produkci askorbové kyseliny nebo stereoisomeru askorbové kyseliny, obsahující buď jednu nebo obě a) heterologickou nukleovou kyselinu kódující oxidativní enzym spojený s produkcí askorbové kyseliny nebo stereoisomeru askorbové kyseliny v řečené kvasince a b) heterologickou nukleovou kyselinu kódující reduktivní enzym spojený s produkcí askorbové kyseliny nebo stereoisomeru askorbové kyseliny v řečené kvasince.
21. Kvasinka podle nároku 20, kde oxidativní enzym má aktivitu dehydrogenázy.

• 999 ·· ···· ·«9 • · · · · · • · 999 9 99 • · · ·· · 9 99

19 ** .............
22. Kvasinka podle nároku 21, kde řečená dehydrogenáza zahrnuje aktivitu dehydrogenázy glukosy, aktivitu dehydrogenázy kyseliny glukonové, aktivitu dehydrogenázy kyseliny 2-keto-D-glukonové, aktivitu dehydrogenázy galaktosy, aktivitu dehydrogenázy L-sorbosy, aktivitu dehydrogenázy L-sorbosonu, oxidázu kyseliny L-idonové a oxidázu kyseliny L-gulonové.
23. Kvasinka podle nároku 20, kde řečený reduktivní enzym má aktivitu reduktázy.
24. Kvasinka podle nároku 23, kde řečená aktivita reduktázy zahrnuje aktivitu reduktázy 2,5-DGK, aktivitu reduktázy 2,5-DKG, 2,3-DKG reduktázu, 5ketoreduktázu, 2-ketoreduktázu a reduktázu 2-ketogulonátu.
25. Kvasinka podle nároku 20, kde kvasinka je členem skupiny imperfektních kvasinek.
26. Kvasinka podle nároku 25, kde kvasinka je členem čeledi Cryptococcaceae.
27. Kvasinka podle nároku 26, kde kvasinka zahrnuje Candida a Cryptococcus.
28. Kvasinka podle nároku 27, kde kvasinkou je Candida blankii.
29. Kvasinka podle nároku 27, kde kvasinkou je Cryptococcus dimennae.
30. Kvasinka podle nároku 20, kde řečenou kvasinkou je Candida blankii nebo Cryptococcus dimennae a řečený uhlíkový zdroj obsahuje glukosu, kde řečená kvasinka má aktivitu heterologické dehydrogenázy glukosy a aktivitu 2,5-DKG reduktázy.
31. Kvasinka podle nároku 20, kde řečenou kvasinkou je Candida blankii nebo Cryptococcus dimennae a řečený uhlíkový zdroj obsahuje D-sorbitol, L-sorbosu nebo L-sorboson, kde řečená kvasinka má aktivitu nejméně jedné z aktivity L• to ···· < to · · >«· ·· · to ··«· ···· « ··· ·· ♦ · · ·

20 ** *** ** *’* ** ·** sorbosy, aktivity dehydrogenázy D-sorbitolu, aktivity dehydrogenázy L-sorbosonu a aktivity dehydrogenázy galaktosy.
32. Způsob produkce rekombinantní kvasinky schopné využívat šestiuhlíkový cukr na produkci ASA nebo stereoisomeru ASA vyznačený tím, že obsahuje stupně:

a) získat kvasinky schopné využívat KLG na produkci ASA nebo stereoisomeru ASA a (b) zavést nejméně buď jednu nebo obě a) heterologickou nukleovou kyselinu kódující oxidativní enzym spojený s produkcí askorbové kyseliny nebo stereoisomeru askorbové kyseliny v řečené kvasince a b) heterologickou nukleovou kyselinu kódující reduktivní enzym spojený s produkcí askorbové kyseliny nebo stereoisomeru askorbové kyseliny v řečené kvasince.
33. Způsob podle nároku 32 vyznačený tím, že kvasinka je členem skupiny imperfektních kvasinek.
34. Kvasinka podle nároku 33 vyznačená tím, že kvasinka je členem čeledi Cryptococcaceae.
35. Kvasinka podle nároku 34 vyznačená tím, že kvasinka zahrnuje Candida a Cryptococcus.
36. Kvasinka podle nároku 35 vyznačená tím, že kvasinkou je Candida blankii.
37. Kvasinka podle nároku 35 vyznačená tím, že kvasinkou je Cryptococcus dimennae.
38. Kvasinka podle nároku 32 vyznačená tím, že řečenou kvasinkou je Candida blankii nebo Cryptococcus dimennae a řečený uhlíkový zdroj obsahuje glukosu, kde řečená kvasinka má aktivitu heterologické dehydrogenázy glukosy a aktivitu 2,5-DKG reduktázy.

• 9 «·» · • 9

9 999 • 9

9 9 9 9 9 9 9 9

21 .............
39. Kvasinka podle nároku 32 vyznačená tím, že řečenou kvasinkou je Candida blankii nebo Cryptococcus dimennae a řečený uhlíkový zdroj obsahuje D-sorbitol, L-sorbosu nebo L-sorboson, kde řečená kvasinka má aktivitu nejméně jedné z aktivity L-sorbosy, aktivity dehydrogenázy D-sorbitolu, aktivity dehydrogenázy L-sorbosonu a aktivity dehydrogenázy galaktosy.
40. Způsob screeningu kvasinek schopných produkce ASA obsahující získání kvasinek schopných pěstování na askorbovou kyselinu nebo stereoisomer askorbové kyseliny, kultivací řečených kvasinek v přítomnosti KLG za podmínek vhodných pro produkci askorbové kyseliny nebo stereoisomerů askorbové kyseliny a analyzování řečené kultury kvasinek na produkci askorbové kyseliny nebo stereoisomerů askorbové kyseliny.

·· ...» ·. · • » * » · ·· : :··*..::: *· ··· ··* ···* *··* ··.

’ r V C&QD4 _ 4 Algi

Pěstování vsádkových kultur vybraných kvasinek na 2KLG jako jediném uhlíkovém zdroji (0,5 %) v YNB při 23°C a 250 ot/min v třepacích baňkách

Pěstování vybraných kvasinek na sodné soli idonátu jako jediném uhlíkovém zdroji (0,5 %) v YNB mediu (6,7 g/l) při 23°C a 250 ot/min

ČAS (HODINY)

OBR. 2 ···· ··· ·· ··· ·· ··· 'γ’ν OŽJEMZU —

Stanovení obsahů ASA v supernatantech celkové reakční směsi buněk a kontroly esejem oxidázy askorbátu