JPH11127886A

JPH11127886A - ガンマーデカラクトン及びガンマードデカラクトンを含有する液体組成物の製造方法

Info

Publication number: JPH11127886A
Application number: JP9295387A
Authority: JP
Inventors: Hiromi Ozaki; 裕美尾崎; Keiichi Nakagawa; 圭一中川
Original assignee: Nikka Whisky Distilling Co Ltd
Current assignee: Nikka Whisky Distilling Co Ltd
Priority date: 1997-10-28
Filing date: 1997-10-28
Publication date: 1999-05-18
Anticipated expiration: 2017-10-28
Also published as: JP3953601B2

Abstract

(57)【要約】【課題】アルコール飲料、食品、香料などの香気成分
として有用なガンマーデカラクトン及び／又はガンマー
ドデカラクトンを高濃度含有した液体組成物の製造方法
を提供する。【解決手段】不飽和脂肪酸を含有する酵母菌体を基質
として用い、当該基質に含有される不飽和脂肪酸を、乳
酸菌などの不飽和脂肪酸のヒドロキシル化能を有する第
１微生物によりヒドロキシル化した後、酵母などのベー
タ酸化能を有する第２微生物を作用させて、ガンマーデ
カラクトン及び／又はガンマードデカラクトンを含有す
る液体組成物を製造する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、食品や医薬品に使
用されている酵母菌体を基質として用い、この酵母菌体
に含まれる不飽和脂肪酸を、不飽和脂肪酸のヒドロキシ
ル化能を有する第１の微生物によってヒドロキシル化
し、更にベータ酸化能を持つ第２の微生物によって処理
することにより、アルコール飲料、食品、香料などに用
いることができるガンマーデカラクトン及び／又はガン
マードデカラクトンを含有する液体組成物を製造する方
法に関する。

【０００２】

【従来の技術】環状エステルであるラクトン類のうち、
ガンマーデカラクトン、ガンマードデカラクトンなどは
ピーチに似た甘い香を持っており、従来より香料の調製
成分として用いられている。また、これらは食品、香粧
品の調合用素材としても有用である。ガンマーデカラク
トンとガンマードデカラクトンの構造式を化１に示す。

【０００３】

【化１】（上記構造式において、ｎ＝５がガンマーデカラクト
ン、ｎ＝７がガンマードデカラクトンである。）

【０００４】ガンマーデカラクトン、ガンマードデカラ
クトンなどのガンマーラクトンは、果実などの天然物に
含有されているが、一般的に含有量が極めて少ないた
め、天然物から分離精製し、利用することは極めて困難
である。化学合成法によるガンマーラクトン類の製造法
としては、特開昭５５−１３３３７１号公報に、第１級
アルコールとアクリル酸エステルとを有機過酸化物と鉱
酸及び／又は有機酸の存在下に反応させて合成する方法
が開示されている。

【０００５】また、特開平４−２７５２８２号公報及び
特開平４−２７５２８３号公報には、第１級アルコール
並びに第２級アルコールと２−アルケン酸エステル類か
ら有機過酸化物及び含窒素化合物の存在下又は１、１−
ビス−ｔ−ブチルパーオキシシクロヘキサンの存在下に
加熱反応によって合成する方法などが開示されている。

【０００６】一方、微生物を利用した発酵法によるガン
マーラクトン類の生産も試みられている。特開昭５９−
８２０９０号及び特開昭６１−２３８７０８号公報に
は、ヒマシ油（カスターオイル）を、サッカロミセス
（Saccharomyces）属、ハンゼヌラ（Hansenula）属、キ
ャンディダ（Candida）属及びピキア（Pichia）属酵母
を用いて発酵処理し、ヒマシ油中の構成脂肪酸の９０％
を占めるリシノール酸から、ガンマーデカラクトンを生
成させ、皮膚感を良好にし、不快臭を除去し、香気を改
良する方法が開示されている。

【０００７】また、特開平３−１１７４９４号公報に
は、ヒドロキシ脂肪酸を基質として酵母を用いてガンマ
ーラクトンを生成する方法が、特開平３−１９８７８７
号公報には、１０−オキソステアリン酸からベータ酸化
能を有する微生物によってガンマードデカラクトンを生
産する方法が開示されているが、これらの基質の製造方
法については言及されていない。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】ガンマーデカラクトン
は香料として食品に添加したり、芳香成分として高濃度
含有する食品、飲料、アルコール飲料などを製造する用
途があるが、食品としての安全性を考慮すると、複雑な
化学合成工程は含まないことが望ましい。また、用いる
微生物も古くから食品に用いられ、有害な副産物の産生
のないことが判明し、安全性の確立した微生物であるこ
とが望ましい。更に、ガンマーラクトンを生産する原材
料として、特定の高価な物質等を添加することなく、従
来より食品製造に用いられてきた天然物のみで行える方
法の開発が強く望まれていた。

【０００９】また、グルコースなどの利用されやすい糖
類の添加により特定の酵素の合成が低下することが古く
から知られており、この現象はカタボライト抑制と呼ば
れている。ラクトン類の生物変換に必要なベータ酸化系
の酵素も、用いた培地中にグルコースなどが高濃度含有
されていると糖によるカタボライト抑制を受け、結果と
してラクトン類の生成量の著しい減少が見られる。しか
し、グルコースなどを糖源として用いると酵母類の生育
が速くなることや、自然界にグルコースなどの糖を含有
する天然培地が存在することから、グルコースなどの糖
を用いてもラクトン類の生成を行える系の開発が望まれ
ていた。

【００１０】本発明は、このような事情に鑑みてなされ
たものであり、従来から食品製造に用いられてきた天然
の食品用原材料を用いて、ガンマーデカラクトン及び／
又はガンマードデカラクトンを高濃度に含有する液体組
成物を製造できる方法を提供することを目的とする。ま
た、グルコースを高濃度に含有する培地を用いた場合で
も、カタボライト抑制による生成量の著しい減少がな
く、ガンマーデカラクトン及び／又はガンマードデカラ
クトンを高濃度生産できる方法を提供することを目的と
する。

【００１１】

【課題を解決するための手段】本発明によれば、不飽和
脂肪酸を含有する酵母菌体を基質として用い、当該基質
に含有される不飽和脂肪酸を、不飽和脂肪酸のヒドロキ
シル化能を有する第１微生物によってヒドロキシル化
し、更にベータ酸化能を有する第２微生物によって処理
することを特徴とするガンマーデカラクトン及び／又は
ガンマードデカラクトンを含有する液体組成物の製造方
法、が提供される。

【００１２】また、本発明によれば、リシノール酸と２
−デオキシグルコースを含有する培地を用いることを特
徴とするグルコースによるベータ酸化抑制が解除された
菌株の選択法、が提供される。

【００１３】更に、本発明によれば、上記の製造方法に
より得られたガンマーデカラクトン及び／又はガンマー
ドデカラクトンを含有する液体組成物に、エタノールを
含有する溶液を添加し、蒸留することを特徴とするガン
マーデカラクトン及び／又はガンマードデカラクトンを
含有する液体組成物の製造方法、が提供される。

【００１４】

【発明の実施の形態】本発明者らは、従来より食品の製
造などに用いられてきた酵母菌体を不飽和脂肪酸の供給
源として用い、この酵母菌体を溶菌することにより培地
中に放出された不飽和脂肪酸を、不飽和脂肪酸のヒドロ
キシル化能を有する第１の微生物によってヒドロキシル
化し、更に、ベータ酸化能を有する第２の微生物で処理
することによってガンマーラクトン類を高濃度生成する
ことに成功した。更に、グルコースによるベータ酸化の
抑制が解除された菌株を効率良く造成する方法を開発
し、得られた菌株を用いることにより、グルコースなど
の糖類を高濃度含有する培地中でもガンマーラクトン類
を高濃度生産することに成功した。

【００１５】本発明において基質として用いる酵母菌体
は、不飽和脂肪酸を含有するものであればどのような株
でもよいが、特に従来より広く食品業界で用いられてき
たサッカロミセス（Saccharomyces）属に属する酵母が
有利である。かかる酵母としては、例えば、市販のパン
酵母や清酒醸造用酵母（日本醸造協会より市販）、ある
いはSaccharomyces cerevisiae Ｓ２８８Ｃ（米国酵母
遺伝保存センター分譲菌）などの公知自由分譲株を挙げ
ることができるが、サッカロミセス属以外の酵母菌株、
例えばトルラスポラ（Torulaspora）属酵母、サッカロ
ミコデス（Saccharomycodes）属酵母、キャンディダ（C
andida）属酵母などを用いても差し支えない。

【００１６】また、容易に溶菌できる温度感受性自己消
化酵母を用いてもよい。温度感受性自己消化酵母として
は、サッカロミセス・セレビシエ２３３、２５４、３０
８、３１５、Ｘ３１１９−１２、Ｘ３１２４−４Ｂ（以
上米国酵母遺伝保存センター分譲菌）などの公知自由分
譲株を用いることができるが、一般にこれらの実験室用
酵母由来の変異株は、野生酵母に比べて増殖速度が遅い
上に３０℃程度でも弱い自己消化を示すものが多く、培
養が容易とは言い難い。

【００１７】そこで、温度感受性自己消化酵母として、
従来より知られている方法（J.Bacteriol.,124,1604(19
75)）により作製した変異株を適宜用いるようにしても
よい。発明者らは、本法を用いて、以下に記述するよう
にアルコール生産酵母サッカロミセス・セレビシエＮ１
３０（ＦＥＲＭＰ−１６３６５）株より温度感受性自
己消化酵母サッカロミセス・セレビシエＯＩＩ−３３
（ＦＥＲＭＰ−１６３６４）株を造成した。

【００１８】まず、ニッカウヰスキー株式会社保存菌株
であるアルコール生産酵母サッカロミセス・セレビシエ
Ｎ１３０株（以下、「Ｎ１３０」と略す。）を親株とし
て用い、ＹＰＤ培地（酵母エキス１％、ペプトン２％、
グルコース２％）で定常期まで培養した後、滅菌水で数
回洗浄した。一般的には、紫外線の照射や薬剤処理など
の公知の変異誘導法によって変異率を高めてもよいが、
これらの変異誘導法によって自己消化能以外の性質に変
化が起こることを避けるため、ここではそのままＹＰＤ
プレート一枚あたりの細胞数が約１０００個になるよう
に植菌し、２５℃で３日間培養した。生育してきたコロ
ニーを数枚のＹＰＤプレートにレプリカし、３７℃以上
では生育できない株を選択した。更に顕微鏡を用いて３
７℃で自己消化を起こしている株を選択し、その中から
３０℃での生育が最も良い一株を分離した。

【００１９】このようにして分離した温度感受性自己消
化酵母をサッカロミセス・セレビシエＯＩＩ−３３（Sa
ccharomyces cerevisiae OII-33）と命名し、これを工
業技術院生命工学工業技術研究所に生命研菌寄第１６３
６４号（ＦＥＲＭＰ−１６３６４）として寄託した。

【００２０】このサッカロミセス・セレビシエＯＩＩ−
３３株（以下「ＯＩＩ−３３」と略す。）と親株である
Ｎ１３０株との菌学的性質を、ザ・イースト・ア・タキ
ソノミック・スタディー（The Yeast a taxonomic stud
y, 3rd edition, eds. by Kreger-van Rij, Elsevier S
cience Publishers, Amsterdam）の記載に基づいて検討
し、その結果として表１に炭素源の資化性と発酵性を、
表２に窒素源の資化性とその他の特徴を示した。

【００２１】

【表１】

【００２２】

【表２】

【００２３】変異誘導法によって処理することなく作製
した変異株であるＯＩＩ−３３の菌学的性質は、表１及
び表２に示すように、３７℃で生育せず、溶菌すること
以外は、親株であるＮ１３０と全く同一であった。

【００２４】上記に例示した酵母類は、一般に酵母の培
養に用いられる培地、例えば麦汁やＹＰＤ培地のような
天然培地やウィッカーハム改変培地のような合成培地に
接種し、約１０℃から約４０℃、好ましくは２０℃から
３０℃にて前培養を行なう。この時、菌体脂肪酸の不飽
和度を上げるために振盪、撹拌もしくは無菌空気を通気
することによって好気的条件下に培養させることが好ま
しい。培養に要する時間は、用いる酵母の菌株や培地、
培養条件などによって異なるが、酵母が培養液１ｍｌあ
たり１０⁸個程度になるまで培養することが好ましく、
一般に１２時間から７２時間必要である。

【００２５】酵母菌体を充分に前培養した後、培養液を
そのまま次の溶解工程に進めてもよいが、従来一般に行
なわれている方法で集菌した後溶菌させてもよい。菌体
を溶菌させる溶解工程は、培養液のまま、あるいは、集
めた菌体を適当な培地あるいは水に懸濁した状態で行な
ってもよいが、パン酵母の製造工程で行なうように脱水
した脱水酵母の状態で行なってもよい。

【００２６】一般的なサッカロミセス属野生酵母では、
少なくとも４０℃で２４時間以上の加熱溶解処理が必要
であるが、オートクレーブを用いて１２１℃１５分処理
でもよい。比較的低温で溶解する温度感受性自己消化酵
母では、３０℃で２４時間程度の処理でもよいが、好ま
しくは、４０℃で２４時間、更に好ましくは５０℃で２
４時間の処理が望まれる。一般に低温での溶解は、加熱
に必要な光熱費を低減する上で有利であり、逆に５０℃
以上での溶解は、雑菌の混入を防止するという点で有利
である。

【００２７】脱水酵母を溶菌した場合には、酵母菌体を
再び一般に酵母類が生育できるような培地に懸濁する。
培地としては、市販されているペプトン、酵母エキス、
カザミノ酸などとグルコース、マルトースなどの糖類と
の混合物や、発酵飲料の原料、あるいは発酵飲料の原料
とこれらとの混合物、又は廃糖蜜と尿素の混合物などか
らなる培地を例示することができる。また、ウィッカー
ハム改変培地のような合成培地を用いてもよい。

【００２８】溶解酵母菌体を懸濁した培地に不飽和脂肪
酸をヒドロキシル化する能力を持った第１微生物を接種
する。この能力を持った第１微生物としては、シュード
モナス（Pseudomonas）属（J.Biol.Chem.,249, 2833(19
74)）、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属（J.
Biol.Chem.,241, 5441(1966)）、ノカルディア（Nocard
ia）属（Appl.Envirom., 2116(1992)）などが知られて
おり、ガンマーラクトン類の生成にはどの菌株を用いる
ことも可能であるが、従来より食品製造に用いられ、安
全性の確立している乳酸菌類を用いることが望ましい。

【００２９】乳酸菌とは、炭水化物を分解し、主に乳酸
を生産する細菌類の総称であり、ラクトバチルス（Lact
obacillus）属、ストレプトコッカス（Streptococcus）
属、ロイコノストック（Leuconostoc）属などを例示す
ることができる。例えば、Lactobacillus casei ＪＣＭ
１１６３、Lactobacillus plantarum ＩＡＭ１０４１、
Pediococcus pentosaceus ＩＡＭ１２１５、Leuconosto
c mesenteroides ＩＡＭ１２３３などを挙げることがで
きる。これらの菌株は、東京大学分子生物学研究所、埼
玉の理化学研究所などの公知自由分譲株として入手する
ことができる。

【００３０】乳酸菌は、一般に乳酸菌の培養に用いる培
地、例えばＭＲＳ培地やＶ８培地などで培養液１ｍｌあ
たり１０⁶〜１０¹⁰個になるまで前培養する。前培養液
はそのままあるいは、遠心処理、膜処理などによって濃
縮した後、加える乳酸菌が本培養液１ｍｌあたり１０⁴
〜１０⁸個になるように植菌する。このまま、約１０℃
から約４０℃、好ましくは２０℃から３０℃にて１２時
間から４８時間振盪、撹拌などによって好気的にあるい
は静置培養する。この間に、溶解酵母由来の不飽和脂肪
酸が相当するヒドロキシ脂肪酸に変化する。

【００３１】ヒドロキシル化した脂肪酸を含む培地にベ
ータ酸化能を有する第２微生物を植菌する。ほとんどす
べての真核細胞生物がベータ酸化能を持っていることが
知られているが、ここで用いる第２微生物としては、例
えば、サッカロミセス（Saccharomyces）属、ピキア（P
ichia）属、ハンゼヌラ（Hansenula）属、キャンディダ
（Candida）属、クリベロミセス（Kluyveromyces）属な
どを挙げることができる。

【００３２】かかる菌株としては、サッカロミセス属の
市販パン酵母や、清酒醸造用酵母（日本醸造協会より市
販）、あるいはSaccharomyces cerevisiae Ｓ２８８Ｃ
（米国酵母遺伝保存センター分譲菌）などの公知自由分
譲株を例示することができる。また、ピキア・ファリノ
ーサ（Pichia farinosa）、キャンディダ・ユーチリス
（Candida utilis）、ハンゼヌラ・アノマラ（Hansenul
a anomala）、クリベロミセス・ラクチス（Kluyveromyc
es lactis）などに属する公知自由分譲株を用いること
も可能である。しかし、特に古来より発酵食品の生産に
安全に用いられてきたサッカロミセス属酵母が有利であ
る。

【００３３】これらのベータ酸化能を有する第２微生物
を、培養液１ｍｌあたり１０⁴〜１０⁸個になるように植
菌し、約１０℃から約４０℃、好ましくは２０℃から３
０℃にて培養を行なう。培養方法は一般微生物の培養方
法に準じて行なわれるが、好気的培養法が有利である。
これは、一般にベータ酸化が好気的反応であることに由
来するが、静置培養法でも、培養開始時に溶解していた
溶存酸素によってガンマーラクトン類の生成が行なわれ
る。好気的培養は、振盪、撹拌、通気撹拌などによって
行なうことができる。

【００３４】培養時間は、培地組成や、培養温度などに
応じて適宜設定されるが、酵母が培養液１ｍｌあたり１
０⁸個程度になるまで培養することが好ましく、一般に
２４時間から９６時間必要である。また、このベータ酸
化工程を先に示したヒドロキシル化工程と同時に行なう
こともできる。すなわち、ヒドロキシル化能を持った第
１微生物とベー夕酸化能を持った第２微生物を同時に植
菌し、適宜設定された条件で培養することによってもガ
ンマーラクトン類の生成を行なうことが可能である。

【００３５】また、グルコースを糖源として用いてもガ
ンマーラクトン類の高濃度の生産ができるようにするた
めには、グルコースによるベータ酸化系の酵素群に対す
る抑制が解除された菌株を造成する必要があると考えら
れる。このような変異株を造成するために、発明者ら
は、グルコースの致死性アナログである２−デオキシグ
ルコースを、ガンマーラクトンの前駆体の一つであるリ
シノール酸を含有する培地に加えた選択培地を作製し
た。

【００３６】この培地で、酵母菌体が生育するためには
リシノール酸を炭素源として利用しなければならない
が、野生株では２−デオキシグルコースによるカタボラ
イト抑制により、リシノール酸より先に致死性の２−デ
オキシグルコースを利用することになり死滅に至る。一
方、カタボライト抑制の解除された変異株では、２−デ
オキシグルコースが存在してもリシノール酸を利用する
ことができ、ベータ酸化により生じるエネルギーを用い
て生育することができる。

【００３７】本選択培地としては、イースト・ニトロゲ
ン・ベース（ＤＩＦＣＯ社製）０．６７％を含有する培
地あるいはＹＰ培地（酵母エキス１％、ペプトン２％）
に２％の寒天を添加した培地を基本培地として、０．０
１〜０．５％、好適には０．０５％のリシノール酸と５
０ｐｐｍ以上、好適には１５０ｐｐｍの２−デオキシグ
ルコースを含むものが推奨される。

【００３８】本選択培地に使用されるリシノール酸と２
−デオキシグルコース以外の成分は、実質的に炭素源を
含まない培地であれば特に限定されない。培養条件も酵
母菌体が生育できる条件であれば特に限定されないが、
通常３０℃で一週間程度必要である。発明者らは本選択
培地を用いてベータ酸化に対するカタボライト抑制の解
除された変異株サッカロミセス・セレビシエＯＡ−１
（ＦＥＲＭＰ−１６３６６）を得た。

【００３９】ここでカタボライト抑制解除株を得るため
の親株として用いられる酵母は、市販のパン酵母や清酒
醸造用酵母（日本醸造協会より市販）、あるいはSaccha
romyces cerevisiae Ｓ２８８Ｃ（米国酵母遺伝保存セ
ンター分譲菌）などの公知自由分譲株をあげることがで
きる。これらの酵母を、酵母が増殖できる培地で適宜培
養する。培養条件も特に限定されない。

【００４０】培養後、遠心分離、膜処理などによって集
菌した後、滅菌水で数回洗浄することが望ましい。その
まま、あるいは、公知の変異誘導法、例えば紫外線の照
射、エチルメタンスルフォネートなどの薬剤処理（微生
物遺伝学実験法、石川辰夫編、１９８２、ｐ１９３、共
立出版参照）を加えた後、上述の選択培地に塗布し、生
育してきた菌株を耐性株とする。更に、耐性株のラクト
ン生産能を調ベ、グルコースによる生産能の低下の少な
い株をベータ酸化に対するカタボライト抑制の解除され
た変異株とする。もちろん、グルコースの存在しない条
件下では、これらの変異株は、野生株を用いた場合と同
様にガンマーラクトン類の生成を行なうことができる。

【００４１】なお、親株としてＮ１３０株を用いて上記
方法により分離した変異株サッカロミセス・セレビシエ
ＯＡ−１株（以下「ＯＡ−１」と略す。）と親株である
Ｎ１３０株との菌学的性質を、ザ・イースト・ア・タキ
ソノミック・スタディー（The Yeast a taxonomic stud
y, 3rd edition, eds. by Kreger-van Rij, ElsevierSc
ience Publishers, Amsterdam）の記載に基づいて検討
し、その結果として表３に炭素源の資化性と発酵性を、
表４に窒素源の資化性とその他の特徴を示した。

【００４２】

【表３】

【００４３】

【表４】

【００４４】変異誘導法によって処理することなく作製
した変異株であるＯＡ−１の菌学的性質は、グルコース
によるベータ酸化の抑制が解除されていること以外は、
表３及び表４に示すように親株であるＮ１３０と全く同
一であった。

【００４５】本製法において菌株の接種や培養液の回収
などの工程は、従来一般に行なわれている方法に従って
行なうことができる。また、微生物の培養液より物質を
単離するために一般に用いられている方法を用いて生成
した液体組成物よりラクトン類を単離することもでき
る。培養液及び菌体にガンマーラクトン類が蓄積してい
るので、遠心処理などによって菌体と培養液を分離した
後、あるいは、菌体が培養液中に懸濁した状態のまま、
ガンマーラクトン類を抽出精製することもできる。ガン
マーラクトン類は有機溶媒に溶解し、比較的高い沸点を
持つので、有機溶媒での抽出や蒸留、カラムクロマトグ
ラフィーなどの手段によって精製した後、有機溶媒を留
去し、高純度、高品質のガンマーラクトンを提供するこ
とができる。

【００４６】ガンマーラクトン類を含有する液体組成物
にエタノールを含有する液体を添加し、あるいは、添加
した後、蒸留してもよい。エタノールを含有する液体と
しては、例えば、アルコール飲料を製造するために醸造
した発酵液、エタノールを含有する水溶液などが挙げら
れる。発酵液は、ウイスキー、ビール、ワイン、焼酎、
清酒などを製造する途中の醸造液でもよい。

【００４７】本発明において、酵母菌体を基質に用いて
ガンマーラクトン類が生成する詳細なメカニズムは必ず
しも明らかではないが、酵母菌体の細胞壁中に多く含ま
れる不飽和脂肪酸、特にパルミトオレイン酸とオレイン
酸が、菌体が溶解することによって乳酸菌などの他の微
生物との接触が可能になり、ヒドロキシル化されること
から始まるものと考えられる。ヒドロキシル化されたパ
ルミトオレイン酸とオレイン酸は、更にベータ酸化され
てそれぞれデカラクトンとドデカラクトンに変換され
る。したがって、基質となる酵母菌体中のパルミトオレ
イン酸とオレイン酸の量によって生成してくるデカラク
トンとドデカラクトンの量が左右される。

【００４８】

【実施例】以下に実施例を示し、具体的に説明するが、
本発明はこれらによって限定されるものではない。な
お、下記の実施例中、ガンマーラクトン類の分析は、得
られた液体組成物をヘキサンで抽出した後、ガスクロマ
トグラフィーを用いて行なった。

【００４９】（実施例１）焼酎酵母サッカロミセス・セ
レビシエＨ株（鹿児島県酒造協同組合）を糖蜜培地（全
糖２．４％、尿素０．１４％、リン酸０．００８７％）
で流加培養し、集菌した後洗浄した。集めた菌体は脱水
し、その１ｇを４０ｍｌのＹＰ培地に懸濁し、１２１℃
で１５分間オートクレーブ処理を行なった。室温まで冷
却後、第１微生物としてニッカウヰスキー株式会社保有
の乳酸菌ラクトバチルス・カゼイＮ５０５４株（Lactob
acillus casei N5054）（ＦＥＲＭＰ−１６３６７）
を培地１ｍｌあたり１０⁷個になるように植菌し、その
まま２４時間静置培養した。更に、第２微生物として同
社保有のアルコール生産酵母Ｎ１３０を１ｍｌあたり１
０⁷個になるように植菌し、そのまま２４時間振盪培養
した。この培養液には、ガンマーデカラクトンが５００
ｐｐｂ、ガンマードデカラクトンが１．３ｐｐｍ含まれ
ていた。

【００５０】（実施例２）ＹＰＤ培地を用いて、２８℃
で２４時間培養した温度感受性自己消化酵母ＯＩＩ−３
３と親株のアルコール生産酵母Ｎ１３０をそれぞれ遠心
によって集菌した後、滅菌水で繰り返し洗浄した。集め
た菌体は素焼き板上で脱水し、脱水酵母を作製した。こ
の脱水酵母１．２ｇを３０、４０、５０、６０℃で２４
時間加熱した後、４０ｍｌのＹＰ培地に懸濁した。更
に、実施例１と同様にして乳酸菌ラクトバチルス・カゼ
イＮ５０５４株（第１微生物）を植菌して培養した後、
アルコール生産酵母Ｎ１３０（第２微生物）を接種し、
好気的に培養した。この液体組成物のガンマーラクトン
濃度を測定し、結果を表５に示した。

【００５１】

【表５】

【００５２】表５に示すとおり、基質として温度感受性
自己消化酵母ＯＩＩ−３３を用いた場合は、３０℃処理
でもガンマーデカラクトン、ドデカラクトンが生成して
いたが、基質として親株Ｎ１３０を用いた場合では４０
℃以上に加熱しないとガンマーラクトンは生成しなかっ
た。

【００５３】（参考例１）最初に基質として加える酵母
菌体の代わりにオレイン酸５０ｐｐｍ、１００ｐｐｍ、
５００ｐｐｍを添加し、実施例２と同一条件でラクトン
の生成を見た。この場合、ガンマーデカラクトンはまっ
たく生成されないが、ガンマードデカラクトンがそれぞ
れ１３ｐｐｍ、３０ｐｐｍ、５０ｐｐｍ生成した。

【００５４】（参考例２）最初に基質として加える酵母
菌体の代わりにパルミトオレイン酸５０ｐｐｍを添加
し、実施例２と同一条件でラクトンの生成を見た。この
場合、ガンマーデカラクトンが２８ｐｐｍ生成し、ガン
マードデカラクトンは生成していなかった。

【００５５】（比較例１）最初に基質として加える酵母
菌体を添加せずに実施例２と同一条件で処理し、液体組
成物を作製した。この液体組成物のラクトンの生成を見
たところ、ガンマーデカラクトン、ガンマードデカラク
トンがそれぞれ１２ｐｐｂ、２４ｐｐｂ生成されている
に過ぎず、基質としての酵母菌体の添加がガンマーラク
トンの大量生産に必要であることがわかった。

【００５６】（比較例２）温度感受性自己消化酵母ＯＩ
Ｉ−３３の脱水酵母１．２ｇを５０℃で２４時間加熱し
て溶解した後、ＹＰ培地４０ｍｌに懸濁した。そのま
ま、乳酸菌（第１微生物）を加えずに実施例２と同様に
酵母（第２微生物）を好気的に培養して作製した液体組
成物にはガンマーデカラクトン、ガンマードデカラクト
ンがそれぞれ９０ｐｐｂ、８７ｐｐｂ生成されているに
過ぎなかった。

【００５７】（実施例３）実施例２と同様にして、温度
感受性自己消化酵母サッカロミセス・セレビシエ３５
１、サッカロミセス・セレビシエＸ３１１９−１２Ａ、
サッカロミコデス・ルドイギー（Saccharomycodes ludw
igii）ＩＦＯ１７２１、及びトルラスポラ・デルブル
ツキー（Torulaspora delbrueckii）ＩＦＯ０９５５の
脱水酵母を製造し、その１．２ｇを５０℃で２４時間加
熱し、溶解した。また、サッカロミセス・セレビシエ３
５１とサッカロミセス・セレビシエＸ３１１９−１２Ａ
の２株については４０℃で２４時間加熱による溶菌処理
も行った。

【００５８】溶菌処理後、実施例２と同様に最初に乳酸
菌ラクトバチルス・カゼイＮ５０５４株（第１微生
物）、次いで酵母Ｎ１３０（第２微生物）による培養を
行ない、液体組成物を作製した。これらの液体組成物中
に含まれるガンマーラクトンを測定し、結果を表６及び
表７に示した。

【００５９】

【表６】

【００６０】

【表７】

【００６１】表６に示すとおり、上記のような公知自由
分譲株である温度感受性自己溶解変異株を基質として用
いても、４０℃２４時間程度の加熱でガンマーラクトン
類を製造することができた。また、表７に示すとおり、
サッカロミコデス・ルドイギー、トルラスポラ・デルブ
ルツキーなどの酵母菌体を基質として用いてもガンマー
ラクトン類を製造することができた。更に、用いた菌株
によってガンマーデカラクトンとガンマードデカラクト
ンの生成量の比が異なっており、このことを利用して、
これら２種のラクトンの作り分けも可能であった。

【００６２】（実施例４）ＹＰＤ培地を用いて２８℃で
２４時間培養した温度感受性自己消化酵母ＯＩＩ−３３
菌体を集菌し、滅菌水で洗浄した。脱水酵母１．２ｇに
相当する量の湿菌体を４０ｍｌのＹＰ培地に懸濁し、懸
濁した状態のまま５０℃あるいは６０℃で２４時間加熱
溶解させた。更に、実施例２と同様に乳酸菌ラクトバチ
ルス・カゼイＮ５０５４株（第１微生物）の培養、酵母
Ｎ１３０（第２微生物）の好気的培養を行ない、液体組
成物を作製した。

【００６３】この液体組成物中に含まれているラクトン
を測定したところ、５０℃処理菌体を用いた場合にはデ
カラクトンが４．６ｐｐｍ、ドデカラクトンが６．１ｐ
ｐｍ、また６０℃処理菌体を用いた場合にはデカラクト
ンが１．３ｐｐｍ、ドデカラクトンが２．０ｐｐｍ含ま
れていることが判明し、基質として用いる菌体は脱水し
ていなくても問題がないことが示された。

【００６４】（実施例５）ＹＰＤ培地を用いて２８℃で
２４時間培養した温度感受性自己消化酵母ＯＩＩ−３３
及び日本醸造協会９号酵母菌体（以下「９号酵母」と略
記する。）を集菌し、脱水酵母を作製した。それらの
１．２ｇを５０℃２４時間加熱により溶解し、ＹＰ培地
に懸濁した。更に、実施例２と同様に乳酸菌ラクトバチ
ルス・カゼイＮ５０５４株（第１微生物）の培養を行な
った後、アルコール生産酵母Ｎ１３０あるいは９号酵母
（第２微生物）を植菌し、２４時間好気的に培養した。
得られた培養液のラクトン含量を表８に示した。

【００６５】

【表８】

【００６６】表８に示すとおり、上記実施例の条件下で
は、第２微生物として用いる酵母を特に限定しなくても
ガンマーラクトン類を生成できた。

【００６７】（実施例６）糖蜜培地（全糖２．４％、尿
素０．１４％、リン酸０．００８７％）を用いて、２８
℃で２４時間培養した温度感受性自己消化酵母ＯＩＩ−
３３を用いて脱水酵母を作製した。この脱水酵母１．２
ｇを５０℃で２４時間加熱して溶解した後、ＹＰ培地４
０ｍｌに懸濁した。これに、ラクトバチルス・カゼイＮ
５０５４、ラクトバチルス・カゼイＪＣＭ１１６３、あ
るいはラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus
plantarum）ＩＡＭ１０４１（第１微生物）をそれぞれ
実施例１と同様に植菌し、培養した。更に、アルコール
生産酵母Ｎ１３０（第２微生物）を好気的に培養して、
得られた液体組成物中に含まれるガンマーラクトンを表
９に示した。

【００６８】

【表９】

【００６９】表９に示すとおり、乳酸菌株（第１微生
物）を変更しても、生成液体組成物中には大量のガンマ
ーデカラクトン及びガンマードデカラクトンが含有され
ていた。

【００７０】（実施例７）グルコースによるベータ酸化
抑制解除株を以下の方法にて取得した。すなわち、アル
コール生産酵母Ｎ１３０をＹＰＤ培地で２４時間培養
し、遠心分離（３０００ｒｐｍ、５分）によって集菌し
た。菌体を滅菌水で２回洗浄した後、０．０５％リシノ
ール酸と１５０ｐｐｍ２−デオキシグルコース、及び２
％寒天を含むＹＰ（２％ペプトン、１％酵母エキス）寒
天平板培地１２枚に１０⁸個づつ塗布したところ、３０
℃、一週間の培養にて１０個のコロニーが出現した。こ
れらのコロニーを同じ選択培地で３回繰り返し培養した
ところ、６個のコロニーが耐性株として取得できた。

【００７１】得られた耐性株６株（Ａ〜Ｆ株）を、１０
０ｐｐｍリシノール酸を含むＹＰ培地４０ｍｌと、１０
０ｐｐｍリシノール酸及び１０％グルコースを含むＹＰ
培地４０ｍｌに植菌し、３０℃で２４時間培養した後の
生成ラクトン量を測定して、結果を表１０に示した。

【００７２】

【表１０】

【００７３】表１０に示すとおり、Ａ株は他の５株（Ｂ
〜Ｆ株）に比して、１０％グルコースによるラクトン生
成阻害を受けにくいことがわかったので、この変異株を
サッカロミセス・セレビシエＯＡ−１（ＦＥＲＭＰ−
１６３６６）とした。

【００７４】（実施例８）糖蜜培地（全糖２．４％、尿
素０．１４％、リン酸０．００８７％）を用いて、２８
℃で２４時間培養した温度感受性自己消化酵母ＯＩＩ−
３３より、実施例２と同様に脱水酵母を作製した。その
１．２ｇを５０℃で２４時間加熱して溶解した後、Ｂｒ
ｉｘ１４．０の麦汁４０ｍｌに懸濁した。実施例２と
同様に乳酸菌ラクトバチルス・カゼイＮ５０５４（第１
微生物）を接種して培養した後、アルコール生産酵母Ｎ
１３０、あるいはグルコースによるベータ酸化抑制解除
株ＯＡ−１（第２微生物）を植菌し、３０℃で２４時間
好気的に培養した。この液体組成物を分析した結果を表
１１に示す。なお、コントロールとして麦汁の代わりに
ＹＰ培地を用いた場合の値も合わせて示す。

【００７５】

【表１１】

【００７６】表１１に示すとおり、培地に麦汁を用いた
場合には、麦汁中に大量に含まれている麦芽糖やグルコ
ースのために、ＹＰ培地を用いた場合に比して、生成す
るガンマーラクトン類の量は著しく減少する。しかし、
グルコースによるベータ酸化抑制解除株ＯＡ−１を用い
た場合には、この減少の程度を緩和することができた。

【００７７】

【発明の効果】以上説明したように、本発明によれば、
従来から食品の製造に用いられてきた原材料を用いて、
高価な物質を添加したり、新規の設備を導入したりする
ことなく、ガンマーデカラクトン及び／又はガンマード
デカラクトンを高濃度含有する液体組成物が製造でき
る。また、本発明では、食品用の原材料を用いてガンマ
ーデカラクトンが製造できるため、直接発酵食品の品質
の向上をもたらすばかりでなく、食品に添加できる安全
性の高い香料の製造法を提供することができる。

【００７８】更に、本発明によれば、リシノール酸と２
−デオキシグルコースを含有する培地を用いることによ
り、グルコースによるベータ酸化抑制が解除された菌株
を造成でき、この菌株を使用することにより、グルコー
スを高濃度に含有する培地を用いた場合でも、カタボラ
イト抑制による生成量の著しい減少がなく、ガンマーデ
カラクトン及び／又はガンマードデカラクトンを高濃度
生産できる。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】不飽和脂肪酸を含有する酵母菌体を基質
として用い、当該基質に含有される不飽和脂肪酸を、不
飽和脂肪酸のヒドロキシル化能を有する第１微生物によ
ってヒドロキシル化し、更にベータ酸化能を有する第２
微生物によって処理することを特徴とするガンマーデカ
ラクトン及び／又はガンマードデカラクトンを含有する
液体組成物の製造方法。
【請求項２】第１微生物が乳酸菌である請求項１記載
の製造方法。
【請求項３】第２微生物がサッカロミセス（Saccharo
myces）属酵母である請求項１又は２に記載の製造方
法。
【請求項４】基質として用いる酵母菌体を加熱によっ
て溶解させる請求項１ないし３のいずれかに記載の製造
方法。
【請求項５】温度感受性自己消化酵母を基質として用
いる請求項１ないし４のいずれかに記載の製造方法。
【請求項６】温度感受性自己消化酵母がサッカロミセ
ス・セレビシエＯＩＩ−３３（Saccharomyces cerevisi
ae OII-33）（ＦＥＲＭＰ−１６３６４）である請求
項５記載の製造方法。
【請求項７】第２微生物が、グルコースによるベータ
酸化抑制が解除された菌株である請求項１ないし６のい
ずれかに記載の製造方法。
【請求項８】グルコースによるベータ酸化抑制が解除
された菌株がサッカロミセス・セレビシエＯＡ−１（Sa
ccharomyces cerevisiae OA-1）（ＦＥＲＭＰ−１６３
６６）である請求項７記載の製造方法。
【請求項９】リシノール酸と２−デオキシグルコース
を含有する培地を用いることを特徴とするグルコースに
よるベータ酸化抑制が解除された菌株の選択法。
【請求項１０】請求項１ないし８のいずれかに記載の
製造方法により得られたガンマーデカラクトン及び／又
はガンマードデカラクトンを含有する液体組成物に、エ
タノールを含有する溶液を添加し、蒸留することを特徴
とするガンマーデカラクトン及び／又はガンマードデカ
ラクトンを含有する液体組成物の製造方法。