JP2003093084A - 芳香性液状組成物の製造方法並びに飲料及びアルコール飲料 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 ２，６−ノナジエナールを高濃度で含有し、
フレッシュでグリーンな香りを有する飲料、アルコール
飲料等のできる芳香性液状組成物を提供する。また、高
価な物質を添加したり、新規の設備を導入したりするこ
となく、２，６−ノナジエナールを高濃度含有し、かつ
安全性の高い液状組成物を工業的に量産することができ
る芳香性液状組成物の製造方法を提供する。 【解決手段】 リノレン酸を基質とするリポキシゲナー
ゼによる反応で、２，６−ノナジエナールを生合成する
ことにより、芳香性液状組成物を製造する。また、この
方法を用いて、２，６−ノナジエナールを、５０ｐｐｂ
以上含有する飲料又はアルコール飲料とする。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、芳香成分として
２，６−ノナジエナールを含有する芳香性液状組成物の
製造方法、並びに芳香成分である２，６−ノナジエナー
ルを比較的高い特定の濃度で含有する飲料、アルコール
飲料等に関する。

【０００２】

【従来の技術】２，６−ノナジエナールは、下記化学式
（１）に示される化合物であり、キューリ、スイカ、メ
ロン、鮎の特徴香として知られている。

【０００３】

【化１】

【０００４】また、果実等に含まれる２，６−ノナジエ
ナールの生合成のメカニズムについて、解明が試みられ
ており、現在、植物中の中性脂肪やリン脂質が酵素によ
って分解されて生成するリノレン酸が、リポキシゲナー
ゼによってヒドロキシペルオキシドに変換した後、ヒド
ロキシパーオキサイド開裂酵素によって各種のノナジエ
ナール類が合成されるものと推定されている（畑中ら、
油化学協会誌、１９８４、７０３号、３３ページ）。

【０００５】しかし、従来、２，６−ノナジエナール
は、いわゆる青くさい匂いを生じさせ、これを高濃度で
含有させた飲料、アルコール飲料等は、飲食者に受け入
れられないものとの認識が一般であった。

【０００６】また、仮に、２，６−ノナジエナールを比
較的高濃度で含有する液状組成物を製造しようとして
も、そのような液状組成物を工業的に大量に得られる製
造方法が未だ開発されていないのが現状である。

【０００７】もっとも、４，７−ノナジエナール、４，
８−ノナジエナール、２，７−オクタジエナール、２，
１１−ドデカジエナール等の他のノナジエナール類につ
いては、化学的な合成方法が開示されており（特開昭５
６−３４６５２号公報、特開昭５６−１２５３３１号公
報、特開昭６１−１９４０４４号公報）、これらの方法
を応用することも考えられる。

【０００８】しかし、これらのノナジエナール類の合成
方法は、高価な試薬を使用する上、製造工程が複雑で大
量生産には不向きな方法であった。しかも、大量の有機
溶媒を用いる必要があるため、先ず安全性の確保が重要
である食品、飲料、アルコール飲料、歯磨き粉等へ適用
することは、事実上極めて困難であった。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、上述の課題
に鑑みてなされたものであり、２，６−ノナジエナール
を比較的高濃度で含有することにより、フレッシュな香
りを有し、飲食者に清涼感を与えることができる飲料又
はアルコール飲料を提供することを目的とする。

【００１０】また、本発明は、フレッシュな香りを有
し、飲食者に清涼感を与えることができる液状組成物
を、安全かつ大量に得られる芳香性液状組成物の製造方
法を提供することを他の目的とする。

【００１１】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上述の課
題を解決すべく鋭意検討したところ、アルコール飲料、
飲料等の液状組成物に、比較的高い特定の濃度で、２，
６−ノナジエナールを含有させたところ、従来の認識と
異なりフレッシュで清涼感溢れる香りを付与することが
できることを見出した。また、本発明者は、このような
液状組成物を製造する方法についても、さらに研究を重
ね、酵素反応を利用した製造方法について検討したとこ
ろ、従来から食品の製造等で用いられ、安全性が確立し
ている植物、微生物等の中に、リノレン酸、リポキシゲ
ナーゼ等の反応成分を多量に供給し得るものを知見する
に至り、これを用いた酵素反応を利用することにより上
述の問題を解決し得ることを見出し、本発明を完成する
に至った。

【００１２】即ち、本発明によれば、リノレン酸を基質
とするリポキシゲナーゼによる反応で、２，６−ノナジ
エナールを生合成することを特徴とする芳香性液状組成
物の製造方法が提供される。

【００１３】ここで、「リポキシゲナーゼ」とは、ペン
タジエン構造を有する不飽和脂肪酸に酸素をヒドロペル
オキシ基として導入する酸化還元酵素の総称である。

【００１４】本発明においては、リノレン酸の供給源と
して、酵母を用いることが好ましく、この際には、酵母
が、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属酵母、ピキア
（Ｐｉｃｈｉａ）属酵母、又はクリベロミセス（Ｋｌｕ
ｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属酵母のいずれか１種であるこ
とが好ましい。また、リノレン酸は、酵母を加熱して、
又は酵母をリパーゼ処理して、リノレン酸を酵母から遊
離させることにより得ることができる。

【００１５】また、本発明においては、リポキシゲナー
ゼの供給源は、植物体であることが好ましく、緑麦芽で
あることがより好ましい。また、緑麦芽としては、大麦
由来のものが好ましい。

【００１６】本発明によれば、以上のような製造方法を
用いることにより、２，６−ノナジエナールを、全成分
中５０ｐｐｂ以上含有する飲料、アルコール飲料等の芳
香性液状組成物を製造することができ、フレッシュで、
清涼感を与える香りがする飲料、アルコール飲料等を提
供することができる。

【００１７】

【発明の実施の形態】以下、本発明の実施の形態を、具
体的に説明する。本発明の製造方法は、リノレン酸を基
質とするリポキシゲナーゼによる反応で、２，６−ノナ
ジエナールを生合成するものであり、これにより、フレ
ッシュで、清涼感を与える芳香性の液状組成物を、安全
かつ大量に得られることができ、特に芳香性を付与する
飲料、アルコール飲料等の工業的生産に好ましく適用す
ることができる。

【００１８】本発明において基質として用いるリノレン
酸は、有害な副産物の産生のないことが判明し、安全性
の確立した微生物である点で、酵母をリノレン酸供給源
とすることが好ましい。

【００１９】リノレン酸供給源として用いる酵母として
は、従来より食品の製造に用いられてきたサッカロミセ
ス属酵母、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属酵母、クリベロミ
セス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属酵母、又はキャ
ンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属酵母等を挙げることがで
き、中でも、リノレン酸の含量が大きい上、オフフレー
バーの生成がない点で、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属酵
母、クリベロミセス属酵母、又はキャンディダ（Ｃａｎ
ｄｉｄａ）属酵母が好ましく、さらに同属内にヒトに有
害な菌株が知られていない点でピキア（Ｐｉｃｈｉａ）
属酵母、又はクリベロミセス属酵母がより好ましい。

【００２０】サッカロミセス属酵母としては、例えば、
市販のパン酵母や清酒醸造用酵母（日本醸造協会より市
販）等の公知自由分譲株から得られるものを挙げること
ができる。

【００２１】また、ピキア属酵母としては、例えば、Ｐ
ｉｃｈｉａ ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ等を挙
げることができ、クリベロミセス属酵母としては、例え
ば、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｒｘｉａｎｕｓ
等を挙げることができ、キャンディダ属酵母としては、
例えば、Ｃａｎｄｉｄａ ｏｌｅｏｐｈｉｌａ等を挙げ
ることができる。

【００２２】さらに、これらに属する菌株としては、例
えば、埼玉の理化学研究所から入手できるＰｉｃｈｉａ
ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ ＪＣＭ１４４
２、大阪の醗酵研究所から入手できるＫｌｕｙｖｅｒｏ
ｍｙｃｅｓ ｍａｒｘｉａｎｕｓ ＩＦＯ６４８、埼玉
の理化学研究所から入手できるＣａｎｄｉｄａ ｏｌｅ
ｏｐｈｉｌａ ＪＣＭ１７９２等の公知自由分譲株を挙
げることができる。

【００２３】リノレン酸供給源として用いる酵母は、一
般に酵母の培養に用いられる培地、例えば、粉砕した麦
芽を温水で抽出して作製した麦汁やＹＰＤ培地（酵母エ
キス１％、ペプトン２％、ぶどう糖２％）等の天然培
地、又はウィッカーハム改変培地等の合成培地に接種
し、培養することができる。

【００２４】培養温度は、用いる酵母及びその他の培養
条件に応じて適切な温度を設定すればよいが、通常、５
℃〜４０℃で培養することが好ましく、１０℃〜２５℃
で培養することがより好ましく、１４℃〜２２℃で培養
することがさらに好ましく、１７℃〜２０℃で培養する
ことが特に好ましい。

【００２５】４０℃以下、好ましくは２５℃以下で培養
すると、菌体中の脂肪酸の不飽和度が上がり、菌体脂肪
酸中のリノレン酸の割合を増加させることができる。一
方、５℃以上、好ましくは１０℃以上で培養すると、酵
母菌の増殖が活発になり、比較的短時間で培養すること
ができる。

【００２６】また、菌体脂肪酸の不飽和度を上げるため
には、振盪、攪拌又は無菌空気を通気することによって
好気的条件下で培養することが好まし。また、無菌空気
を通気する際の通気量は、０．２ｖｖｍ以上が好まし
く、０．７ｖｖｍ以上がより好ましい。

【００２７】培養に要する時間は、用いる酵母、培地、
培養温度等の培養条件に応じて適切な時間とすればよい
が、酵母が培養液１ｍｌあたり１０⁹個程度になるまで
培養することが好ましく、効率的に酵母に含まれるリノ
レン酸含量を増加させる点で、通常、２４時間〜１２０
時間の範囲で培養すればよく、４０〜１００時間で培養
することが好ましい。

【００２８】なお、酵母に含まれるリノレン酸含量が増
加すると、生成する２，６−ノナジエナールも増加する
ので、リノレン酸含量の多い酵母を選択し、さらにリノ
レン酸含量が増加する培養条件を選択することが好まし
いことはいうまでもない。

【００２９】本発明において酵母をリノレン酸供給源と
して用いる場合には、通常、酵母を充分に培養した後、
リノレン酸を酵母から遊離させる。

【００３０】酵母からリノレン酸を遊離させる好ましい
一の方法としては、培養した酵母を加熱処理して、菌体
細胞膜からリノレン酸を遊離させる方法を挙げることが
できる。

【００３１】この際、加熱処理温度としては、遊離リノ
レン酸の量を増大させる点で、５０〜６０℃の温度が好
ましく、５０〜５５℃の温度がより好ましい。

【００３２】また、加熱処理時間としては、同様の点で
２時間以上が好ましく、４時間〜２４時間がより好まし
く、５〜１０時間が特に好ましい。なお、２４時間以上
の長時間にわたって加熱してもよいが、あまりに長い時
間の加熱は加熱臭のような異臭が発生するため好ましく
ない。

【００３３】酵母からリノレン酸を遊離させる好ましい
他の方法としては、培養した酵母を低温で長時間保管し
て、酵母を溶菌させることにより、菌体細胞膜からリノ
レン酸を遊離させる方法を挙げることができる。

【００３４】この際、保管温度、保管期間としては、酵
母を栄養源として他の雑菌が増殖することがあるので、
０〜１０℃で１週間〜数ヶ月間保管することが好まし
い。

【００３５】また、保管形態について特に制限はなく、
培養終了後、そのままで保管してもよく、遠心、ろ過等
により集菌した後に保管してもよい。また、集菌した菌
体は、そのまま、又は適当な培地、緩衝液、若しくは水
に懸濁してから保管してもよい。

【００３６】酵母からリノレン酸を遊離させる好ましい
更に他の方法としては、酵母細胞膜に作用し、リノレン
酸の溶出を促す酵素を添加する方法を挙げることができ
る。

【００３７】リノレン酸の溶出を促す酵素としては、タ
ンパクに作用するプロテアーゼ、脂質に作用するリパー
ゼ、炭水化物に作用するグルカナーゼ、セルラーゼ等を
挙げることができる。

【００３８】また、当該酵素は純度の高い試薬級のもの
でもよいが、食品産業用に販売されている酵素製剤でも
よい。具体的には、リパーゼ製剤としては、例えば、リ
パーゼＦ（天野エンザイム社製）、リパーゼＡＹ（天野
エンザイム社製）、リリパーゼ（長瀬産業社製）等を挙
げることができ、プロテアーゼ製剤としては、例えば、
ニューラーゼＦ（天野エンザイム社製）を挙げることが
でき、グルカナーゼ又はセルラーゼ製剤としては、例え
ば、Ｆｉｎｉｚｙｍ（ノボノルディスク社製）、セルロ
シンＡＬ（阪急共栄物産社製）を挙げることができ、プ
ロテアーゼとグルカナーゼの混合製剤としては、例え
ば、ＸＰ４１５（長瀬産業社製）等を挙げることができ
る。また、これらの酵素製剤の中でも、溶菌作用の大き
く多量の遊離リノレン酸が得られる点で、リパーゼ製剤
であるリパーゼＦ、又はリパーゼＡＹが好ましい。ま
た、これらの酵素製剤は、一種単独で又は二種以上組み
合わせて用いることができる。

【００３９】本発明においては、これらの酵素製剤を、
５０〜１０００ｐｐｍの濃度で酵母懸濁液に添加して用
いることが好ましい。また、酵素反応は、これら酵素に
とって至適の条件で反応温度や時間を適宜設定すること
が好ましい。また、本発明においては、リノレン酸の溶
出を促す酵素を添加する方法を単独で行ってもよいが、
酵母を低温で長時間保管して、酵母を溶菌させる方法と
組合わせて行うことも好ましい。

【００４０】上述した各種方法により、酵母からリノレ
ン酸を遊離させる際には、培養液をそのまま用いて行っ
てもよいが、遠心、ろ過等により集菌した後に行うこと
が好ましい。また、集菌した酵母は、そのまま、又は適
当な培地、緩衝液、若しくは水に懸濁してから加熱又は
溶菌させてもよく、或いは脱水して脱水酵母の状態で加
熱又は溶菌させてもよい。さらに、脱水酵母の状態で加
熱又は溶菌させる場合は、そのまま、又は適当な培地、
緩衝液、若しくは水に懸濁してから加熱又は溶菌すれば
よい。なお、脱水酵母をそのまま加熱又は溶菌した場合
には、加熱又は溶菌後に適当な培地、緩衝液、若しくは
水に懸濁してリノレン酸を遊離させるとよい。

【００４１】懸濁に用いる培地としては、麦汁の他、
ペプトン、酵母エキス、若しくはカザミノ酸等と、グ
ルコース、マルトース等の糖類との混合物、発酵飲料
の原料、発酵飲料の原料と、麦汁、又はペプトン、酵
母エキス、若しくはカザミノ酸等と、グルコース、マル
トース等の糖類との混合物、或いは廃糖蜜と尿素との
混合物等の天然培地、更にはウィッカーハム改変培地
等の合成培地を挙げることができる。また、懸濁に用い
る緩衝液としては、一般に菌体の懸濁に使われるもので
あればよく、例えばＰＢＳ（０．１Ｍリン酸ナトリウ
ム、０．１５Ｍ食塩）、ＴＢＳ（０．１Ｍトリス塩酸、
０．１５Ｍ食塩）等を挙げることができる。

【００４２】次に、得られたリノレン酸にリポキシゲナ
ーゼを反応させる条件について説明する。

【００４３】本発明においては、酵母からリノレン酸を
遊離させた場合、リノレン酸が遊離する懸濁液を、いっ
たん遠心、ろ過等により、酵母残渣を除いた清澄液を作
製し、得られた清澄液をリポキシゲナーゼ処理してもよ
いが、懸濁液をそのままリポキシゲナー処理してもよ
い。

【００４４】本発明で用いられるリポキシゲナーゼは、
リノレン酸に作用して２，６−ノナジエナールを生合成
できるものであり、基質特異性及び反応特異性を考慮し
て選択する必要がある。具体的には、リノレン酸の９位
にヒドロペルオキシ基を導入するリポキシゲナーゼが最
も効率よく２，６−ノナジエナールを生合成できるもの
と考えられるが、必ずしも明らかではない。

【００４５】リポキシゲナーゼは、殆どすべての生物に
存在し、供給源とすることが可能であるが、リノレン酸
に作用して２，６−ノナジエナールを生合成するリポキ
シゲナーゼが比較的豊富に含まれている点で、植物体を
供給源として用いることが好ましい。

【００４６】また、リポキシゲナーゼ供給源としては、
例えば、大豆種子、キューリ葉、メロン果実、緑麦芽等
を挙げることができ、大豆種子由来の既に市販されてい
るリポキシゲナーゼ製剤を用いてもよいが、リノレン酸
に作用して２，６−ノナジエナールを生合成するリポキ
シゲナーゼが、極めて豊富で、しかも原料となる植物体
を安価に得ることができる点で緑麦芽が好ましい。

【００４７】ここで、緑麦芽とは、通常ビールやウイス
キーの製造に用いられる麦芽の乾燥前のものをいい、発
芽により糖化酵素等の各種酵素とともに、リポキシゲナ
ーゼの活性も著しく上昇することから、好適なリポキシ
ゲナーゼ酵素供給源とすることができるものである。

【００４８】緑麦芽としては、大麦、小麦、ライ麦等を
発芽させたものを挙げることができるが、中でも、オフ
フレーバーが少なく、製造・入手が容易である点で大麦
を発芽させたものが好ましい。

【００４９】また、大麦緑麦芽としては、例えば、ほし
まさり、新田二条１号、北育１９号、北育１号、カワサ
イゴク、カワホナミ、カワミズキ、ニシノホシ、ニシノ
チカラ、関東二条３号、栃系１４５、羽系Ｈ−８３、羽
系Ｈ−７９、羽系Ｊ−７、アサヒ５号、南系Ｒ１３０
３、西海皮１０号、西海皮３８号、ミサトゴールデン、
タカホゴールデン、ミカモゴールデン、又はナス二条等
の品種を挙げることができる。中でも、得られるリポキ
シゲナーゼによる酵素反応で、用いる大麦緑麦芽の重量
に対して、より多くの２，６−ノナジエナールを生合成
できる点で、ミカモゴールデン種が好ましい。なお、ミ
カモゴールデン種が、２，６−ノナジエナールを多量に
生合成することができる理由は必ずしも明らかではない
が、リノレン酸に作用して２，６−ノナジエナールを生
合成できるリポキシゲナーゼの含有量自体が多いか、或
いは当該リポキシゲナーゼの活性が高いためと推測され
る。

【００５０】本発明においては、緑麦芽の作製方法につ
いて特に制限はなく、例えば、大麦、小麦、ライ麦等を
通常の方法により充分に吸水させた後、適当な温度と湿
度の環境下で放置して発芽させることにより得ることが
できる。

【００５１】次に、本発明においては、リポキシゲナー
ゼ供給源として用いる植物体を、そのまま又は−８０℃
程度の低温で冷凍した後、常法によりできるだけ細かく
粉砕した後、適当な培地、緩衝液、又は水に懸濁させて
リポキシゲナーゼ粗酵素液を得ることができる。なお、
適当な培地、緩衝液、水に懸濁した後、公知の方法によ
り粉砕してもよいことはいうまでもない。

【００５２】得られたリポキシゲナーゼ粗酵素液は、そ
のまま酵素反応に用いることもできるが、遠心処理、又
は網、ろ紙、若しくは膜等によりろ過して清澄液として
から用いることが好ましい。また、各ろ過手段は、清澄
化が可能なろ過性能を有するものであればよい。また、
本発明においては、濃縮膜を用いたり、硫安沈殿法、ス
トレプトマイシン沈殿法、カラム樹脂法等の方法によ
り、酵素タンパク質を濃縮、精製してから用いてもよ
い。

【００５３】リポキシゲナーゼ粗酵素液又はその清澄液
であるリポキシゲナーゼ酵素液の添加量は、用いるリポ
キシゲナーゼ供給源の種類及び反応させる溶液のリノレ
ン酸含有量を考慮して、反応効率の高い量とすればよ
く、例えば、大麦の緑麦芽をリポキシゲナーゼ供給源と
した場合には、酵素反応させる溶液（リノレン酸換算
量）１００重量部に対し、緑麦芽０．１〜１０重量部分
に相当するリポキシゲナーゼ粗酵素液又はリポキシゲナ
ーゼ酵素液を添加することが好ましい。

【００５４】次に、リポキシゲナーゼによる反応は、当
該リポキシゲナーゼの至適温度を考慮して２０〜４０℃
で行うことが好ましく、２５〜３５℃で行うことがより
好ましい。

【００５５】また、反応時間は、リポキシゲナーゼとリ
ノレン酸とのモル比やその他の反応条件にもよるが、通
常３０分以上とすることが好ましく、効率的に生合成さ
せるためには３０分〜６時間で行うことがより好まし
い。

【００５６】本発明においては、リポキシゲナーゼによ
る反応終了後、２，６−ノナジエナールを高濃度で含有
する反応液を、そのまま、又は精製した後、アルコール
飲料、飲料、ヨーグルト等の食品、香水、シャンプー、
化粧品等の用途に応じて、希釈液等により所定の濃度に
調整する事が好ましい。

【００５７】例えば、ウイスキー、ビール、ワイン、焼
酎、清酒等のアルコール飲料、及び清涼飲料水等の飲料
の場合には、従来の当業者の認識とは異なり、全成分
中、５０ｐｐｂ以上の濃度で、より好ましくは７０ｐｐ
ｂ以上の濃度で、２，６−ノナジエナールを含有させる
ことにより、清涼感あふれるグリーンな香りを充分に付
与することができる。中でも、ウイスキーやブランデー
では、このような芳香効果が大きく、また、特に７０ｐ
ｐｂ以上の濃度で２，６−ノナジエナールを含有させる
と、より顕著な芳香効果を得ることができる。一方、本
発明においては、液状組成物に含有させる２，６−ノナ
ジエナールの含有量の上限については特に制限はない
が、５００，０００ｐｐｂ以内の濃度で、２，６−ノナ
ジエナールを含有させることが好ましく、より多くの飲
食者等に好適な印象を与える点からすると、ウイスキー
やブランデーでは、１０００ｐｐｂ以内、その他のアル
コール飲料又は清涼飲料等では５００ｐｐｂ以内で２，
６−ノナジエナールを含有させることがより好ましい。

【００５８】本発明においては、液状組成物をアルコー
ル飲料とする際には、当該アルコール飲料を製造するた
めに醸造した発酵液、又はエタノールを含有する水溶液
等に添加した後、蒸留することにより、得られる蒸留酒
に５０ｐｐｂ以上の濃度で２，６−ノナジエナールを含
有させ、所望の香りを付与することもできる。また、こ
の際、発酵液としては、例えば、ウイスキー、ビール、
ワイン、焼酎、清酒等を製造する途中の醸造液を挙げる
ことができる。

【００５９】一方、液状組成物を各種製品に添加する香
料として用いる場合には、分離・抽出等で、より高濃度
で２，６−ノナジエナールを含有させることが好まし
い。

【００６０】なお、本発明で得られる芳香性液状組成物
は、２，６−ノナジエナールを高濃度で含有するため、
この液状組成物から容易に２，６−ノナジエナールを単
離することができ、高純度、高品質の２，６−ノナジエ
ナールを安価で大量に提供することもできる。

【００６１】この際、液状組成物から２，６−ノナジエ
ナールを単離する方法としては、従来一般に用いられて
いる単離方法でよく、例えば、遠心処理等によって反応
液を清澄化した後、又は混濁した状態のまま、２，６−
ノナジエナールを有機溶媒によって抽出し、さらに蒸
留、カラムクロマトグラフィー等の手段によって精製し
た後、有機溶媒を留去する方法を挙げることができる。

【００６２】

【実施例】以下に実施例を記して、本発明をより具体的
に説明するが、本発明はこれらの実施例によってなんら
限定されるものではない。なお、下記の実施例中、２，
６−ノナジエナールの分析は、試料からＯＡＳＩＳカラ
ム（Ｗａｔｅｒｓ社製）を用いて固層抽出した後、ＮＥ
ＵＴＲＡＢＯＮＤ−１（ＧＬサイエンス社製）カラムを
用いたガスクロマトグラフィーにより行った。

【００６３】［リノレン酸供給源の選択］比重１．０４
０の麦汁２０ｍｌに、表１に示す各酵母を接種し、２８
℃で２４時間振盪培養した。培養後、遠心により集めた
各酵母を、−８０℃で凍結乾燥した後、５０％水酸化ナ
トリウム−メタノール溶液を加えて沸騰水中で１時間煮
沸して脂肪酸を遊離させた。煮沸後、塩酸を加えて酸性
にし、１４％三フッ素ホウ素−メタノール溶液を加えて
遊離した脂肪酸をメチル化した。さらに、反応液をヘキ
サンで抽出した後、ガスクロマトグラフィーにより遊離
した脂肪酸のメチルエステルを定量し、菌体に含まれる
各脂肪酸の含量を算出した。得られた結果を表１にまと
めて示す。

【００６４】

【表１】

【００６５】表１に示す通り、キャンディダ属酵母、ピ
キア属酵母、及びクリベロミセス属酵母で、リノレン酸
含有量が多かった。

【００６６】［酵母の培養条件１］比重１．０４０の麦
汁４００ｍｌを、１Ｌ容のジャーに入れ、Ｐｉｃｈｉａ
ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ ＪＣＭ１４４２株
を接種し、１２℃、１５℃、１８℃、又は２１℃の各温
度で、空気を２ｖｖｍの割合で通気し、４００ｒｐｍで
攪拌しながら培養した。培養２７時間後と４８時間後
に、一部菌体を遠心により集め、［リノレン酸供給源の
選択］について述べた方法と同様にして、酵母に含まれ
る脂肪酸含量を測定した。得られた結果を表２にまとめ
て示す。

【００６７】

【表２】

【００６８】表２に示す通り、いずれの温度でも、実用
上充分な量のリノレン酸が生合成されたが、１２℃では
酵母の増殖が比較的悪く、結果的に酵母に含まれるリノ
レン酸の総量も他の温度で培養した場合に比べ少なかっ
た。また、特に１８℃で培養した場合は、酵母の増殖が
良く、リノレン酸が最も多く生合成された。また、いず
れの温度でも培養時間が４８時間の方が、２７時間に比
べ、リノレン酸が多く生合成された。

【００６９】［酵母の培養条件２］比重１．０４０の麦
汁４００ｍｌを、１Ｌ容のジャーに入れ、Ｐｉｃｈｉａ
ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ ＪＣＭ１４４２株
を接種し、１８℃で培養した。培養中の攪拌は４００ｒ
ｐｍで行ったが、通気量は０．２５〜１ｖｖｍと変化さ
せた。４８時間培養した後、酵母を遠心により集め、
［リノレン酸供給源の選択］について述べた方法と同様
にして、酵母に含まれる脂肪酸含有量を測定した。得ら
れた結果を表３にまとめて示す。

【００７０】

【表３】

【００７１】表３に示す通り、通気量が多いほうがリノ
レン酸の含有量も多く、特に１ｖｖｍの通気量で培養し
た場合に、最もリノレン酸が多く生合成された。

【００７２】［リノレン酸遊離条件１］比重１．０４０
の麦汁４００ｍｌを、１Ｌ容のジャーに入れ、Ｐｉｃｈ
ｉａｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ ＪＣＭ１４４
２株を接種し、１８℃で４８時間培養した。培養中の攪
拌は４００ｒｐｍで行い、通気量は０．５ｖｖｍで行っ
た。培養終了後、培養液をそれぞれ５０℃、６０℃、７
０℃の恒温槽に入れ、４時間加熱し、その後、加熱した
培養液を遠心して菌体を除去した。得られた培養上清中
に、塩酸を加えて酸性にした後、エーテルで遊離リノレ
ン酸を抽出し、抽出液に１４％三フッ素ホウ素−メタノ
ール溶液を加えて遊離脂肪酸をメチル化した。さらに、
反応液をヘキサンで抽出した後、ガスクロマトグラフィ
ーにより脂肪酸のメチルエステルを定量し、菌体に含ま
れる各脂肪酸の含量を算出した。結果を表４にまとめて
示す。

【００７３】

【表４】

【００７４】表４中に示したように、培養上清中に遊離
したリノレン酸は、５０℃で加熱したときに、１１．５
μｇ／ｍｌと最も多く、７０℃で加熱したときには、
１．５μｇ／ｍｌと少なかった。

【００７５】［リノレン酸遊離条件２］比重１．０４０
の麦汁４００ｍｌを、１Ｌ容のジャーに入れ、Ｐｉｃｈ
ｉａｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ ＪＣＭ１４４
２株を接種し、１８℃で４８時間培養した。培養中の攪
拌は４００ｒｐｍで行い、通気量は０．５ｖｖｍで行っ
た。培養終了後、培養液をそれぞれ５０℃の恒温槽に入
れ、加熱時間がそれぞれ２時間、４時間、８時間、２２
時間になったところで、加熱した培養液を遠心して菌体
を除去し、得られた培養上清中に遊離したリノレン酸の
含有量を［リノレン酸遊離条件１］で述べた方法と同様
にして測定した。結果を表５にまとめて示す。

【００７６】

【表５】

【００７７】表５に示す通り、上清中に遊離したリノレ
ン酸の含有量は、５０℃で２時間以上加熱すれば、実用
上充分な量となり、５０℃で８時間程度加熱したときに
最大となった。また、さらに２２時間程度まで加熱を継
続してもほとんど変わらなかった。

【００７８】［リノレン酸溶出補助酵素の選択］比重
１．０４０の麦汁１００ｍｌを、５００ｍｌ容の三角フ
ラスコに入れ、Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａ
ｃｉｅｎｓ ＪＣＭ１４４２株を接種し、１８℃で４８
時間培養した。培養終了液にそれぞれリリパーゼとＸＰ
４１５（長瀬産業社）、リパーゼＦとリパーゼＡＹ（天
野エンザイム社）、Ｆｉｎｉｚｙｍ（ノボノルディスク
社）、セルロシンＡＬ（阪急共栄物産社）、ニューラー
ゼＦ（天野エンザイム社）を０．１％濃度になるように
加え、５０℃で４時間反応させた。一方、国産大麦ミカ
モゴールデン種に水を充分に浸漬させた後、常法により
発芽させた緑麦芽２８ｇをコーヒーミルで粉砕して蒸留
水２８０ｍｌに懸濁し、そのまま室温で６０分間放置し
た後、Ｎｏ．２ろ紙でろ過して、リポキシゲナーゼ酵素
液を作製しておき、各リノレン酸溶出補助酵素による反
応終了後、得られたリポキシゲナーゼ酵素液を全量添加
し、その後、３０℃で１時間反応させて液状組成物を作
製した。リポキシゲナーゼによる反応終了後、生成した
遊離リノレン酸量と、２，６−ノナジエナール量を測定
した。結果を表６にまとめて示す。

【００７９】

【表６】

【００８０】表６に示す通り、リパーゼＦ、又はリパー
ゼＡＹを加えたときに２，６−ノナジエナール量が最も
増大した。

【００８１】［緑麦芽種、及びろ過条件の選択］比重
１．０４０の麦汁４００ｍｌを、１Ｌ容のジャーに入
れ、Ｐｉｃｈｉａｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ
ＪＣＭ１４４２株を接種し、１８℃で４８時間培養し
た。培養中の攪拌は４００ｒｐｍで行い、通気量は０．
５ｖｖｍで行った。培養終了後、培養液に２００ｐｐｍ
のリパーゼＡＹを添加し、５０℃で２２時間加熱した。
一方、国産大麦ミカモゴールデン種とナス二条種に水を
充分に浸漬した後、常法により各種の緑麦芽を作製し
た。次いで、各種緑麦芽２８ｇをコーヒーミルで粉砕
し、蒸留水２８０ｍｌに懸濁し、そのまま室温で６０分
間放置した後、Ｎｏ．２ろ紙、又は６０メッシュの金網
でろ過し、リポキシゲナーゼ酵素液を作製した。リパー
ゼＡＹによる反応終了後、作製した各リポキシゲナーゼ
酵素液４０ｍｌを培養液に添加し、３０℃で２時間反応
させて液状組成物を作製した。リポキシゲナーゼによる
反応終了後に、２，６−ノナジエナール量を測定した。
結果を表７にまとめて示す。

【００８２】

【表７】

【００８３】表７に示す通り、リポキシゲナーゼ供給源
として用いた大麦の種類によって、生成する２，６−ノ
ナジエナール量に違いがあり、ナス二条種よりもミカモ
ゴールデン種の緑麦芽を用いた方が２，６−ノナジエナ
ールの生成量が増加した。また、６０メッシュの金網で
粗くろ過して完全に清澄化しなかったものよりも、Ｎ
ｏ．２ろ紙でろ過して完全に清澄化した緑麦芽抽出液を
用いた方が生成量が増大した。

【００８４】［異なる植物由来リポキシゲナーゼの選
択］前述した緑麦芽由来のリポキシゲナーゼとの比較の
為、緑麦芽由来のリポキシゲナーゼに代え、試薬として
市販されている大豆由来のリポキシゲナーゼ（日本バイ
オコン社製、リポキシゲナーゼＤＯＳＯＹ）を培養液中
に１０ｐｐｍの濃度で添加したこと以外は［緑麦芽種、
及びろ過条件の選択］で述べたのと同様にして液状組成
物を作製した。得られた液状組成物には、５０ｐｐｂと
前述した緑麦芽由来のリポキシゲナーゼを用いた場合に
比べ約１／１２〜１／３の２，６−ノナジエナールが含
まれていた。

【００８５】［実施例１及び比較例１（２，６−ノナジ
エナールを含む蒸留酒の製造）］上述した各種検討に基
づき以下のようにして、蒸留酒を製造した。比重１．０
４の麦汁５０Ｌを９７℃で２時間加熱殺菌した後、室温
まで冷却し、Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃ
ｉｅｎｓ ＪＣＭ１４４２株を接種した。２ｖｖｍの空
気を通気し、４００ｒｐｍで攪拌しながら１８℃で４８
時間培養したところ、菌数が１ｍｌあたり１０⁹まで増
殖していたので、５０℃の恒温槽中で２時間加熱した
後、さらにリパーゼＡＹ１０ｇを加えて５０℃で一晩反
応させた。反応終了液には、遊離リノレン酸が８０ｐｐ
ｍ含まれていた。一方、凍結保存していた緑麦芽５００
ｇをハンマーミルで粉砕し、滅菌水２．５Ｌを加え室温
で１時間ゆっくり攪拌した。攪拌後のリポキシゲナーゼ
粗酵素液はＮｏ．２のろ紙でろ過し、得られたリポキシ
ゲナーゼ酵素液全量を、リパーゼ処理後の、遊離リノレ
ン酸溶液に添加した。そのまま３０℃で２時間反応させ
たところ、反応液中には２，６−ノナジエナールが８４
０ｐｐｂ生成していた。得られた反応液を１０倍量のウ
イスキー発酵終了醪に添加し、銅製ポットスティルを用
いて２回蒸留して常法どおりウイスキー本留液を製造し
た。得られたウイスキー本留液には、６８％のアルコー
ルと８５ｐｐｂの２，６−ノナジエナールが含まれてい
た。また、製造した２，６−ノナジエナールを８５ｐｐ
ｂ含む本留液と液状組成物を添加せずに蒸留して作られ
た本留液（比較例１）を対象として１０名の専門パネラ
ーによる官能検査を行った。結果を表８に示す。なお、
官能検査の評価は以下の基準に基づき、４点を中心に７
段階で行い、全員の平均点で示した。

【００８６】 １…非常に劣る。 ２…劣る。 ３…やや劣る。 ４…標準的。 ５…やや良好。 ６…良好。 ７…非常に優れている。

【００８７】

【表８】

【００８８】表８に示す通り、２，６−ノナジエナール
を高濃度で含むウイスキー本留液（実施例１）は、グリ
ーンでフレッシュな香気を持つという評価がなされ、液
状組成物を添加せずに蒸留して作られた本留液（比較例
１）と差別化されていた。

【００８９】[実施例２、３及び比較例２、３（２，６
−ノナジエナール濃度による芳香性効果）]一般に市販
されている国産ウイスキーに、４段階の異なる濃度で
２，６−ノナジエナールを含有させ、各ウイスキーにつ
いて官能検査により芳香性効果を調べた。検査は、５名
の専門パネラーにより、上述した実施例１と同様の基準
により行った。なお、用いた国産ウイスキーでは２，６
−ノナジエナールが全く検出されなかった。結果をまと
めて表９に示す。

【００９０】

【表９】

【００９１】表９に示す通り、２，６−ノナジエナール
を高濃度で含む程官能検査の評価が、高くなる傾向が見
られ、中でも、２，６−ノナジエナール濃度が０ｐｐｂ
である比較例２と、２，６−ノナジエナール濃度が２０
ｐｐｂである比較例３とでは、評価に大きな差が見られ
ないのに対し、２，６−ノナジエナール濃度が２０ｐｐ
ｂである比較例３と、２，６−ノナジエナール濃度が８
０ｐｐｂである実施例２とでは、評点の差が１．４と、
評価に大きな差が認められ、少なくとも、２，６−ノナ
ジエナール濃度が８０ｐｐｂ以上であると大きな芳香性
が得られることがわかった。

【００９２】［参考例］参考として、一般に市販されて
いる各種蒸留酒について、２，６−ノナジエナールの含
量を測定した。結果をまとめて表１０に示す。

【００９３】

【表１０】

【００９４】表１０に示す通り、麦焼酎やドライジンに
は、２，６−ノナジエナールは全く含まれておらず、一
部のウイスキーにのみ含まれていた。また、その含有量
は、もっとも多く含まれているものでも１５ｐｐｂと極
く少量であった。

【００９５】

【発明の効果】以上説明したように、本発明によれば、
２，６−ノナジエナールを高濃度で含有し、フレッシュ
でグリーンな香りを有する飲料、アルコール飲料等を提
供することができる。また、本発明によれば、高価な物
質を添加したり、新規の設備を導入したりすることな
く、２，６−ノナジエナールを高濃度含有し、かつ安全
性の高い液状組成物を工業的に量産することができ、特
に、アルコール飲料、飲料等のように安全性が特に問題
となる液状組成物の製造に好ましく適用することができ
る芳香性液状組成物の製造方法を提供することができ
る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き Ｆターム(参考） 4B015 NB01 NB02 NG02 NG14 NG17 NP01 NP02 NP08 4B064 AC24 CA21 CB13 CD07 CD30 DA10

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 リノレン酸を基質とするリポキシゲナー
   ゼによる反応で、２，６−ノナジエナールを生合成する
   ことを特徴とする芳香性液状組成物の製造方法。
2. 【請求項２】 前記リノレン酸の供給源として、酵母を
   用いることを特徴とする請求項１に記載の芳香性液状組
   成物の製造方法。
3. 【請求項３】 前記酵母が、キャンディダ（Ｃａｎｄｉ
   ｄａ）属酵母、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属酵母、又はク
   リベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属酵母の
   いずれか１種であることを特徴とする請求項２に記載の
   芳香性液状組成物の製造方法。
4. 【請求項４】 前記酵母を加熱して、前記リノレン酸を
   該酵母から遊離させることを特徴とする請求項２又は３
   に記載の芳香性液状組成物の製造方法。
5. 【請求項５】 前記酵母をリパーゼ処理して、前記リノ
   レン酸を該酵母から遊離させることを特徴とする請求項
   ２又は３に記載の芳香性液状組成物の製造方法。
6. 【請求項６】 前記リポキシゲナーゼの供給源が、緑麦
   芽であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか一項
   に記載の芳香性液状組成物の製造方法。
7. 【請求項７】 ２，６−ノナジエナールを、５０ｐｐｂ
   以上含有することを特徴とする飲料。
8. 【請求項８】 ２，６−ノナジエナールを、５０ｐｐｂ
   以上含有することを特徴とするアルコール飲料。