JP3953601B2 - ガンマーデカラクトン及びガンマードデカラクトンを含有する液体組成物の製造方法 - Google Patents
ガンマーデカラクトン及びガンマードデカラクトンを含有する液体組成物の製造方法 Download PDFInfo
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、食品や医薬品に使用されている酵母菌体を基質として用い、この酵母菌体に含まれる不飽和脂肪酸を、不飽和脂肪酸のヒドロキシル化能を有する第１の微生物によってヒドロキシル化し、更にベータ酸化能を持つ第２の微生物によって処理することにより、アルコール飲料、食品、香料などに用いることができるガンマーデカラクトン及び／又はガンマードデカラクトンを含有する液体組成物を製造する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
環状エステルであるラクトン類のうち、ガンマーデカラクトン、ガンマードデカラクトンなどはピーチに似た甘い香を持っており、従来より香料の調製成分として用いられている。また、これらは食品、香粧品の調合用素材としても有用である。ガンマーデカラクトンとガンマードデカラクトンの構造式を化１に示す。
【０００３】
【化１】
（上記構造式において、ｎ＝５がガンマーデカラクトン、ｎ＝７がガンマードデカラクトンである。）
【０００４】
ガンマーデカラクトン、ガンマードデカラクトンなどのガンマーラクトンは、果実などの天然物に含有されているが、一般的に含有量が極めて少ないため、天然物から分離精製し、利用することは極めて困難である。化学合成法によるガンマーラクトン類の製造法としては、特開昭５５−１３３３７１号公報に、第１級アルコールとアクリル酸エステルとを有機過酸化物と鉱酸及び／又は有機酸の存在下に反応させて合成する方法が開示されている。
【０００５】
また、特開平４−２７５２８２号公報及び特開平４−２７５２８３号公報には、第１級アルコール並びに第２級アルコールと２−アルケン酸エステル類から有機過酸化物及び含窒素化合物の存在下又は１、１−ビス−ｔ−ブチルパーオキシシクロヘキサンの存在下に加熱反応によって合成する方法などが開示されている。
【０００６】
一方、微生物を利用した発酵法によるガンマーラクトン類の生産も試みられている。特開昭５９−８２０９０号及び特開昭６１−２３８７０８号公報には、ヒマシ油（カスターオイル）を、サッカロミセス（Saccharomyces）属、ハンゼヌラ（Hansenula）属、キャンディダ（Candida）属及びピキア（Pichia）属酵母を用いて発酵処理し、ヒマシ油中の構成脂肪酸の９０％を占めるリシノール酸から、ガンマーデカラクトンを生成させ、皮膚感を良好にし、不快臭を除去し、香気を改良する方法が開示されている。
【０００７】
また、特開平３−１１７４９４号公報には、ヒドロキシ脂肪酸を基質として酵母を用いてガンマーラクトンを生成する方法が、特開平３−１９８７８７号公報には、１０−オキソステアリン酸からベータ酸化能を有する微生物によってガンマードデカラクトンを生産する方法が開示されているが、これらの基質の製造方法については言及されていない。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
ガンマーデカラクトンは香料として食品に添加したり、芳香成分として高濃度含有する食品、飲料、アルコール飲料などを製造する用途があるが、食品としての安全性を考慮すると、複雑な化学合成工程は含まないことが望ましい。また、用いる微生物も古くから食品に用いられ、有害な副産物の産生のないことが判明し、安全性の確立した微生物であることが望ましい。更に、ガンマーラクトンを生産する原材料として、特定の高価な物質等を添加することなく、従来より食品製造に用いられてきた天然物のみで行える方法の開発が強く望まれていた。
【０００９】
また、グルコースなどの利用されやすい糖類の添加により特定の酵素の合成が低下することが古くから知られており、この現象はカタボライト抑制と呼ばれている。ラクトン類の生物変換に必要なベータ酸化系の酵素も、用いた培地中にグルコースなどが高濃度含有されていると糖によるカタボライト抑制を受け、結果としてラクトン類の生成量の著しい減少が見られる。しかし、グルコースなどを糖源として用いると酵母類の生育が速くなることや、自然界にグルコースなどの糖を含有する天然培地が存在することから、グルコースなどの糖を用いてもラクトン類の生成を行える系の開発が望まれていた。
【００１０】
本発明は、このような事情に鑑みてなされたものであり、従来から食品製造に用いられてきた天然の食品用原材料を用いて、ガンマーデカラクトン及び／又はガンマードデカラクトンを高濃度に含有する液体組成物を製造できる方法を提供することを目的とする。また、グルコースを高濃度に含有する培地を用いた場合でも、カタボライト抑制による生成量の著しい減少がなく、ガンマーデカラクトン及び／又はガンマードデカラクトンを高濃度生産できる方法を提供することを目的とする。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明によれば、不飽和脂肪酸を含有する酵母菌体を基質として用い、当該基質として用いる酵母菌体を加熱によって溶解させ、当該基質に含有される不飽和脂肪酸を、不飽和脂肪酸のヒドロキシル化能を有する第１微生物によってヒドロキシル化し、更にベータ酸化能を有する第２微生物によって処理することを特徴とするガンマーデカラクトン及び／又はガンマードデカラクトンを含有する液体組成物の製造方法、が提供される。
【００１３】
更に、本発明によれば、上記の製造方法により得られたガンマーデカラクトン及び／又はガンマードデカラクトンを含有する液体組成物に、エタノールを含有する溶液を添加し、蒸留することを特徴とするガンマーデカラクトン及び／又はガンマードデカラクトンを含有する液体組成物の製造方法、が提供される。
【００１４】
【発明の実施の形態】
本発明者らは、従来より食品の製造などに用いられてきた酵母菌体を不飽和脂肪酸の供給源として用い、この酵母菌体を溶菌することにより培地中に放出された不飽和脂肪酸を、不飽和脂肪酸のヒドロキシル化能を有する第１の微生物によってヒドロキシル化し、更に、ベータ酸化能を有する第２の微生物で処理することによってガンマーラクトン類を高濃度生成することに成功した。更に、グルコースによるベータ酸化の抑制が解除された菌株を効率良く造成する方法を開発し、得られた菌株を用いることにより、グルコースなどの糖類を高濃度含有する培地中でもガンマーラクトン類を高濃度生産することに成功した。
【００１５】
本発明において基質として用いる酵母菌体は、不飽和脂肪酸を含有するものであればどのような株でもよいが、特に従来より広く食品業界で用いられてきたサッカロミセス（Saccharomyces）属に属する酵母が有利である。かかる酵母としては、例えば、市販のパン酵母や清酒醸造用酵母（日本醸造協会より市販）、あるいはSaccharomyces cerevisiae Ｓ２８８Ｃ（米国酵母遺伝保存センター分譲菌）などの公知自由分譲株を挙げることができるが、サッカロミセス属以外の酵母菌株、例えばトルラスポラ（Torulaspora）属酵母、サッカロミコデス（Saccharomycodes）属酵母、キャンディダ（Candida）属酵母などを用いても差し支えない。
【００１６】
また、容易に溶菌できる温度感受性自己消化酵母を用いてもよい。温度感受性自己消化酵母としては、サッカロミセス・セレビシエ２３３、２５４、３０８、３１５、Ｘ３１１９−１２、Ｘ３１２４−４Ｂ（以上米国酵母遺伝保存センター分譲菌）などの公知自由分譲株を用いることができるが、一般にこれらの実験室用酵母由来の変異株は、野生酵母に比べて増殖速度が遅い上に３０℃程度でも弱い自己消化を示すものが多く、培養が容易とは言い難い。
【００１７】
そこで、温度感受性自己消化酵母として、従来より知られている方法（J.Bacteriol.,124,1604(1975)）により作製した変異株を適宜用いるようにしてもよい。発明者らは、本法を用いて、以下に記述するようにアルコール生産酵母サッカロミセス・セレビシエＮ１３０（ＦＥＲＭ Ｐ−１６３６５）株より温度感受性自己消化酵母サッカロミセス・セレビシエＯＩＩ−３３（ＦＥＲＭ Ｐ−１６３６４）株を造成した。
【００１８】
まず、ニッカウヰスキー株式会社保存菌株であるアルコール生産酵母サッカロミセス・セレビシエＮ１３０株（以下、「Ｎ１３０」と略す。）を親株として用い、ＹＰＤ培地（酵母エキス１％、ペプトン２％、グルコース２％）で定常期まで培養した後、滅菌水で数回洗浄した。一般的には、紫外線の照射や薬剤処理などの公知の変異誘導法によって変異率を高めてもよいが、これらの変異誘導法によって自己消化能以外の性質に変化が起こることを避けるため、ここではそのままＹＰＤプレート一枚あたりの細胞数が約１０００個になるように植菌し、２５℃で３日間培養した。生育してきたコロニーを数枚のＹＰＤプレートにレプリカし、３７℃以上では生育できない株を選択した。更に顕微鏡を用いて３７℃で自己消化を起こしている株を選択し、その中から３０℃での生育が最も良い一株を分離した。
【００１９】
このようにして分離した温度感受性自己消化酵母をサッカロミセス・セレビシエＯＩＩ−３３（Saccharomyces cerevisiae OII-33）と命名し、これを工業技術院生命工学工業技術研究所に生命研菌寄第１６３６４号（ＦＥＲＭ Ｐ−１６３６４）として寄託した。
【００２０】
このサッカロミセス・セレビシエＯＩＩ−３３株（以下「ＯＩＩ−３３」と略す。）と親株であるＮ１３０株との菌学的性質を、ザ・イースト・ア・タキソノミック・スタディー（The Yeast a taxonomic study, 3rd edition, eds. by Kreger-van Rij, Elsevier Science Publishers, Amsterdam）の記載に基づいて検討し、その結果として表１に炭素源の資化性と発酵性を、表２に窒素源の資化性とその他の特徴を示した。
【００２１】
【表１】
【００２２】
【表２】
【００２３】
変異誘導法によって処理することなく作製した変異株であるＯＩＩ−３３の菌学的性質は、表１及び表２に示すように、３７℃で生育せず、溶菌すること以外は、親株であるＮ１３０と全く同一であった。
【００２４】
上記に例示した酵母類は、一般に酵母の培養に用いられる培地、例えば麦汁やＹＰＤ培地のような天然培地やウィッカーハム改変培地のような合成培地に接種し、約１０℃から約４０℃、好ましくは２０℃から３０℃にて前培養を行なう。この時、菌体脂肪酸の不飽和度を上げるために振盪、撹拌もしくは無菌空気を通気することによって好気的条件下に培養させることが好ましい。培養に要する時間は、用いる酵母の菌株や培地、培養条件などによって異なるが、酵母が培養液１ｍｌあたり１０8個程度になるまで培養することが好ましく、一般に１２時間から７２時間必要である。
【００２５】
酵母菌体を充分に前培養した後、培養液をそのまま次の溶解工程に進めてもよいが、従来一般に行なわれている方法で集菌した後溶菌させてもよい。菌体を溶菌させる溶解工程は、培養液のまま、あるいは、集めた菌体を適当な培地あるいは水に懸濁した状態で行なってもよいが、パン酵母の製造工程で行なうように脱水した脱水酵母の状態で行なってもよい。
【００２６】
一般的なサッカロミセス属野生酵母では、少なくとも４０℃で２４時間以上の加熱溶解処理が必要であるが、オートクレーブを用いて１２１℃１５分処理でもよい。比較的低温で溶解する温度感受性自己消化酵母では、３０℃で２４時間程度の処理でもよいが、好ましくは、４０℃で２４時間、更に好ましくは５０℃で２４時間の処理が望まれる。一般に低温での溶解は、加熱に必要な光熱費を低減する上で有利であり、逆に５０℃以上での溶解は、雑菌の混入を防止するという点で有利である。
【００２７】
脱水酵母を溶菌した場合には、酵母菌体を再び一般に酵母類が生育できるような培地に懸濁する。培地としては、市販されているペプトン、酵母エキス、カザミノ酸などとグルコース、マルトースなどの糖類との混合物や、発酵飲料の原料、あるいは発酵飲料の原料とこれらとの混合物、又は廃糖蜜と尿素の混合物などからなる培地を例示することができる。また、ウィッカーハム改変培地のような合成培地を用いてもよい。
【００２８】
溶解酵母菌体を懸濁した培地に不飽和脂肪酸をヒドロキシル化する能力を持った第１微生物を接種する。この能力を持った第１微生物としては、シュードモナス（Pseudomonas）属（J.Biol.Chem.,249, 2833(1974)）、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属（J.Biol.Chem.,241, 5441(1966)）、ノカルディア（Nocardia）属（Appl.Envirom., 2116(1992)）などが知られており、ガンマーラクトン類の生成にはどの菌株を用いることも可能であるが、従来より食品製造に用いられ、安全性の確立している乳酸菌類を用いることが望ましい。
【００２９】
乳酸菌とは、炭水化物を分解し、主に乳酸を生産する細菌類の総称であり、ラクトバチルス（Lactobacillus）属、ストレプトコッカス（Streptococcus）属、ロイコノストック（Leuconostoc）属などを例示することができる。例えば、Lactobacillus casei ＪＣＭ１１６３、Lactobacillus plantarum ＩＡＭ１０４１、Pediococcus pentosaceus ＩＡＭ１２１５、Leuconostoc mesenteroides ＩＡＭ１２３３などを挙げることができる。これらの菌株は、東京大学分子生物学研究所、埼玉の理化学研究所などの公知自由分譲株として入手することができる。
【００３０】
乳酸菌は、一般に乳酸菌の培養に用いる培地、例えばＭＲＳ培地やＶ８培地などで培養液１ｍｌあたり１０6〜１０10個になるまで前培養する。前培養液はそのままあるいは、遠心処理、膜処理などによって濃縮した後、加える乳酸菌が本培養液１ｍｌあたり１０4〜１０8個になるように植菌する。このまま、約１０℃から約４０℃、好ましくは２０℃から３０℃にて１２時間から４８時間振盪、撹拌などによって好気的にあるいは静置培養する。この間に、溶解酵母由来の不飽和脂肪酸が相当するヒドロキシ脂肪酸に変化する。
【００３１】
ヒドロキシル化した脂肪酸を含む培地にベータ酸化能を有する第２微生物を植菌する。ほとんどすべての真核細胞生物がベータ酸化能を持っていることが知られているが、ここで用いる第２微生物としては、例えば、サッカロミセス（Saccharomyces）属、ピキア（Pichia）属、ハンゼヌラ（Hansenula）属、キャンディダ（Candida）属、クリベロミセス（Kluyveromyces）属などを挙げることができる。
【００３２】
かかる菌株としては、サッカロミセス属の市販パン酵母や、清酒醸造用酵母（日本醸造協会より市販）、あるいはSaccharomyces cerevisiae Ｓ２８８Ｃ（米国酵母遺伝保存センター分譲菌）などの公知自由分譲株を例示することができる。また、ピキア・ファリノーサ（Pichia farinosa）、キャンディダ・ユーチリス（Candida utilis）、ハンゼヌラ・アノマラ（Hansenula anomala）、クリベロミセス・ラクチス（Kluyveromyces lactis）などに属する公知自由分譲株を用いることも可能である。しかし、特に古来より発酵食品の生産に安全に用いられてきたサッカロミセス属酵母が有利である。
【００３３】
これらのベータ酸化能を有する第２微生物を、培養液１ｍｌあたり１０4〜１０8個になるように植菌し、約１０℃から約４０℃、好ましくは２０℃から３０℃にて培養を行なう。培養方法は一般微生物の培養方法に準じて行なわれるが、好気的培養法が有利である。これは、一般にベータ酸化が好気的反応であることに由来するが、静置培養法でも、培養開始時に溶解していた溶存酸素によってガンマーラクトン類の生成が行なわれる。好気的培養は、振盪、撹拌、通気撹拌などによって行なうことができる。
【００３４】
培養時間は、培地組成や、培養温度などに応じて適宜設定されるが、酵母が培養液１ｍｌあたり１０8個程度になるまで培養することが好ましく、一般に２４時間から９６時間必要である。また、このベータ酸化工程を先に示したヒドロキシル化工程と同時に行なうこともできる。すなわち、ヒドロキシル化能を持った第１微生物とベー夕酸化能を持った第２微生物を同時に植菌し、適宜設定された条件で培養することによってもガンマーラクトン類の生成を行なうことが可能である。
【００３５】
また、グルコースを糖源として用いてもガンマーラクトン類の高濃度の生産ができるようにするためには、グルコースによるベータ酸化系の酵素群に対する抑制が解除された菌株を造成する必要があると考えられる。このような変異株を造成するために、発明者らは、グルコースの致死性アナログである２−デオキシグルコースを、ガンマーラクトンの前駆体の一つであるリシノール酸を含有する培地に加えた選択培地を作製した。
【００３６】
この培地で、酵母菌体が生育するためにはリシノール酸を炭素源として利用しなければならないが、野生株では２−デオキシグルコースによるカタボライト抑制により、リシノール酸より先に致死性の２−デオキシグルコースを利用することになり死滅に至る。一方、カタボライト抑制の解除された変異株では、２−デオキシグルコースが存在してもリシノール酸を利用することができ、ベータ酸化により生じるエネルギーを用いて生育することができる。
【００３７】
本選択培地としては、イースト・ニトロゲン・ベース（ＤＩＦＣＯ社製）０．６７％を含有する培地あるいはＹＰ培地（酵母エキス１％、ペプトン２％）に２％の寒天を添加した培地を基本培地として、０．０１〜０．５％、好適には０．０５％のリシノール酸と５０ｐｐｍ以上、好適には１５０ｐｐｍの２−デオキシグルコースを含むものが推奨される。
【００３８】
本選択培地に使用されるリシノール酸と２−デオキシグルコース以外の成分は、実質的に炭素源を含まない培地であれば特に限定されない。培養条件も酵母菌体が生育できる条件であれば特に限定されないが、通常３０℃で一週間程度必要である。発明者らは本選択培地を用いてベータ酸化に対するカタボライト抑制の解除された変異株サッカロミセス・セレビシエＯＡ−１（ＦＥＲＭ Ｐ−１６３６６）を得た。
【００３９】
ここでカタボライト抑制解除株を得るための親株として用いられる酵母は、市販のパン酵母や清酒醸造用酵母（日本醸造協会より市販）、あるいはSaccharomyces cerevisiae Ｓ２８８Ｃ（米国酵母遺伝保存センター分譲菌）などの公知自由分譲株をあげることができる。これらの酵母を、酵母が増殖できる培地で適宜培養する。培養条件も特に限定されない。
【００４０】
培養後、遠心分離、膜処理などによって集菌した後、滅菌水で数回洗浄することが望ましい。そのまま、あるいは、公知の変異誘導法、例えば紫外線の照射、エチルメタンスルフォネートなどの薬剤処理（微生物遺伝学実験法、石川辰夫編、１９８２、ｐ１９３、共立出版参照）を加えた後、上述の選択培地に塗布し、生育してきた菌株を耐性株とする。更に、耐性株のラクトン生産能を調ベ、グルコースによる生産能の低下の少ない株をベータ酸化に対するカタボライト抑制の解除された変異株とする。もちろん、グルコースの存在しない条件下では、これらの変異株は、野生株を用いた場合と同様にガンマーラクトン類の生成を行なうことができる。
【００４１】
なお、親株としてＮ１３０株を用いて上記方法により分離した変異株サッカロミセス・セレビシエＯＡ−１株（以下「ＯＡ−１」と略す。）と親株であるＮ１３０株との菌学的性質を、ザ・イースト・ア・タキソノミック・スタディー（The Yeast a taxonomic study, 3rd edition, eds. by Kreger-van Rij, Elsevier Science Publishers, Amsterdam）の記載に基づいて検討し、その結果として表３に炭素源の資化性と発酵性を、表４に窒素源の資化性とその他の特徴を示した。
【００４２】
【表３】
【００４３】
【表４】
【００４４】
変異誘導法によって処理することなく作製した変異株であるＯＡ−１の菌学的性質は、グルコースによるベータ酸化の抑制が解除されていること以外は、表３及び表４に示すように親株であるＮ１３０と全く同一であった。
【００４５】
本製法において菌株の接種や培養液の回収などの工程は、従来一般に行なわれている方法に従って行なうことができる。また、微生物の培養液より物質を単離するために一般に用いられている方法を用いて生成した液体組成物よりラクトン類を単離することもできる。培養液及び菌体にガンマーラクトン類が蓄積しているので、遠心処理などによって菌体と培養液を分離した後、あるいは、菌体が培養液中に懸濁した状態のまま、ガンマーラクトン類を抽出精製することもできる。ガンマーラクトン類は有機溶媒に溶解し、比較的高い沸点を持つので、有機溶媒での抽出や蒸留、カラムクロマトグラフィーなどの手段によって精製した後、有機溶媒を留去し、高純度、高品質のガンマーラクトンを提供することができる。
【００４６】
ガンマーラクトン類を含有する液体組成物にエタノールを含有する液体を添加し、あるいは、添加した後、蒸留してもよい。エタノールを含有する液体としては、例えば、アルコール飲料を製造するために醸造した発酵液、エタノールを含有する水溶液などが挙げられる。発酵液は、ウイスキー、ビール、ワイン、焼酎、清酒などを製造する途中の醸造液でもよい。
【００４７】
本発明において、酵母菌体を基質に用いてガンマーラクトン類が生成する詳細なメカニズムは必ずしも明らかではないが、酵母菌体の細胞壁中に多く含まれる不飽和脂肪酸、特にパルミトオレイン酸とオレイン酸が、菌体が溶解することによって乳酸菌などの他の微生物との接触が可能になり、ヒドロキシル化されることから始まるものと考えられる。ヒドロキシル化されたパルミトオレイン酸とオレイン酸は、更にベータ酸化されてそれぞれデカラクトンとドデカラクトンに変換される。したがって、基質となる酵母菌体中のパルミトオレイン酸とオレイン酸の量によって生成してくるデカラクトンとドデカラクトンの量が左右される。
【００４８】
【実施例】
以下に実施例を示し、具体的に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。なお、下記の実施例中、ガンマーラクトン類の分析は、得られた液体組成物をヘキサンで抽出した後、ガスクロマトグラフィーを用いて行なった。
【００４９】
（実施例１）
焼酎酵母サッカロミセス・セレビシエＨ株（鹿児島県酒造協同組合）を糖蜜培地（全糖２．４％、尿素０．１４％、リン酸０．００８７％）で流加培養し、集菌した後洗浄した。集めた菌体は脱水し、その１ｇを４０ｍｌのＹＰ培地に懸濁し、１２１℃で１５分間オートクレーブ処理を行なった。室温まで冷却後、第１微生物としてニッカウヰスキー株式会社保有の乳酸菌ラクトバチルス・カゼイＮ５０５４株（Lactobacillus casei N5054）（ＦＥＲＭ Ｐ−１６３６７）を培地１ｍｌあたり１０7個になるように植菌し、そのまま２４時間静置培養した。更に、第２微生物として同社保有のアルコール生産酵母Ｎ１３０を１ｍｌあたり１０7個になるように植菌し、そのまま２４時間振盪培養した。この培養液には、ガンマーデカラクトンが５００ｐｐｂ、ガンマードデカラクトンが１．３ｐｐｍ含まれていた。
【００５０】
（実施例２）
ＹＰＤ培地を用いて、２８℃で２４時間培養した温度感受性自己消化酵母ＯＩＩ−３３と親株のアルコール生産酵母Ｎ１３０をそれぞれ遠心によって集菌した後、滅菌水で繰り返し洗浄した。集めた菌体は素焼き板上で脱水し、脱水酵母を作製した。この脱水酵母１．２ｇを３０、４０、５０、６０℃で２４時間加熱した後、４０ｍｌのＹＰ培地に懸濁した。更に、実施例１と同様にして乳酸菌ラクトバチルス・カゼイＮ５０５４株（第１微生物）を植菌して培養した後、アルコール生産酵母Ｎ１３０（第２微生物）を接種し、好気的に培養した。この液体組成物のガンマーラクトン濃度を測定し、結果を表５に示した。
【００５１】
【表５】
【００５２】
表５に示すとおり、基質として温度感受性自己消化酵母ＯＩＩ−３３を用いた場合は、３０℃処理でもガンマーデカラクトン、ドデカラクトンが生成していたが、基質として親株Ｎ１３０を用いた場合では４０℃以上に加熱しないとガンマーラクトンは生成しなかった。
【００５３】
（参考例１）
最初に基質として加える酵母菌体の代わりにオレイン酸５０ｐｐｍ、１００ｐｐｍ、５００ｐｐｍを添加し、実施例２と同一条件でラクトンの生成を見た。この場合、ガンマーデカラクトンはまったく生成されないが、ガンマードデカラクトンがそれぞれ１３ｐｐｍ、３０ｐｐｍ、５０ｐｐｍ生成した。
【００５４】
（参考例２）
最初に基質として加える酵母菌体の代わりにパルミトオレイン酸５０ｐｐｍを添加し、実施例２と同一条件でラクトンの生成を見た。この場合、ガンマーデカラクトンが２８ｐｐｍ生成し、ガンマードデカラクトンは生成していなかった。
【００５５】
（比較例１）
最初に基質として加える酵母菌体を添加せずに実施例２と同一条件で処理し、液体組成物を作製した。この液体組成物のラクトンの生成を見たところ、ガンマーデカラクトン、ガンマードデカラクトンがそれぞれ１２ｐｐｂ、２４ｐｐｂ生成されているに過ぎず、基質としての酵母菌体の添加がガンマーラクトンの大量生産に必要であることがわかった。
【００５６】
（比較例２）
温度感受性自己消化酵母ＯＩＩ−３３の脱水酵母１．２ｇを５０℃で２４時間加熱して溶解した後、ＹＰ培地４０ｍｌに懸濁した。そのまま、乳酸菌（第１微生物）を加えずに実施例２と同様に酵母（第２微生物）を好気的に培養して作製した液体組成物にはガンマーデカラクトン、ガンマードデカラクトンがそれぞれ９０ｐｐｂ、８７ｐｐｂ生成されているに過ぎなかった。
【００５７】
（実施例３）
実施例２と同様にして、温度感受性自己消化酵母サッカロミセス・セレビシエ３５１、サッカロミセス・セレビシエＸ３１１９−１２Ａ、サッカロミコデス・ルドイギー（Saccharomycodes ludwigii）ＩＦＯ １７２１、及びトルラスポラ・デルブルツキー（Torulaspora delbrueckii）ＩＦＯ ０９５５の脱水酵母を製造し、その１．２ｇを５０℃で２４時間加熱し、溶解した。また、サッカロミセス・セレビシエ３５１とサッカロミセス・セレビシエＸ３１１９−１２Ａの２株については４０℃で２４時間加熱による溶菌処理も行った。
【００５８】
溶菌処理後、実施例２と同様に最初に乳酸菌ラクトバチルス・カゼイＮ５０５４株（第１微生物）、次いで酵母Ｎ１３０（第２微生物）による培養を行ない、液体組成物を作製した。これらの液体組成物中に含まれるガンマーラクトンを測定し、結果を表６及び表７に示した。
【００５９】
【表６】
【００６０】
【表７】
【００６１】
表６に示すとおり、上記のような公知自由分譲株である温度感受性自己溶解変異株を基質として用いても、４０℃２４時間程度の加熱でガンマーラクトン類を製造することができた。また、表７に示すとおり、サッカロミコデス・ルドイギー、トルラスポラ・デルブルツキーなどの酵母菌体を基質として用いてもガンマーラクトン類を製造することができた。更に、用いた菌株によってガンマーデカラクトンとガンマードデカラクトンの生成量の比が異なっており、このことを利用して、これら２種のラクトンの作り分けも可能であった。
【００６２】
（実施例４）
ＹＰＤ培地を用いて２８℃で２４時間培養した温度感受性自己消化酵母ＯＩＩ−３３菌体を集菌し、滅菌水で洗浄した。脱水酵母１．２ｇに相当する量の湿菌体を４０ｍｌのＹＰ培地に懸濁し、懸濁した状態のまま５０℃あるいは６０℃で２４時間加熱溶解させた。更に、実施例２と同様に乳酸菌ラクトバチルス・カゼイＮ５０５４株（第１微生物）の培養、酵母Ｎ１３０（第２微生物）の好気的培養を行ない、液体組成物を作製した。
【００６３】
この液体組成物中に含まれているラクトンを測定したところ、５０℃処理菌体を用いた場合にはデカラクトンが４．６ｐｐｍ、ドデカラクトンが６．１ｐｐｍ、また６０℃処理菌体を用いた場合にはデカラクトンが１．３ｐｐｍ、ドデカラクトンが２．０ｐｐｍ含まれていることが判明し、基質として用いる菌体は脱水していなくても問題がないことが示された。
【００６４】
（実施例５）
ＹＰＤ培地を用いて２８℃で２４時間培養した温度感受性自己消化酵母ＯＩＩ−３３及び日本醸造協会９号酵母菌体（以下「９号酵母」と略記する。）を集菌し、脱水酵母を作製した。それらの１．２ｇを５０℃２４時間加熱により溶解し、ＹＰ培地に懸濁した。更に、実施例２と同様に乳酸菌ラクトバチルス・カゼイＮ５０５４株（第１微生物）の培養を行なった後、アルコール生産酵母Ｎ１３０あるいは９号酵母（第２微生物）を植菌し、２４時間好気的に培養した。得られた培養液のラクトン含量を表８に示した。
【００６５】
【表８】
【００６６】
表８に示すとおり、上記実施例の条件下では、第２微生物として用いる酵母を特に限定しなくてもガンマーラクトン類を生成できた。
【００６７】
（実施例６）
糖蜜培地（全糖２．４％、尿素０．１４％、リン酸０．００８７％）を用いて、２８℃で２４時間培養した温度感受性自己消化酵母ＯＩＩ−３３を用いて脱水酵母を作製した。この脱水酵母１．２ｇを５０℃で２４時間加熱して溶解した後、ＹＰ培地４０ｍｌに懸濁した。これに、ラクトバチルス・カゼイＮ５０５４、ラクトバチルス・カゼイＪＣＭ１１６３、あるいはラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）ＩＡＭ１０４１（第１微生物）をそれぞれ実施例１と同様に植菌し、培養した。更に、アルコール生産酵母Ｎ１３０（第２微生物）を好気的に培養して、得られた液体組成物中に含まれるガンマーラクトンを表９に示した。
【００６８】
【表９】
【００６９】
表９に示すとおり、乳酸菌株（第１微生物）を変更しても、生成液体組成物中には大量のガンマーデカラクトン及びガンマードデカラクトンが含有されていた。
【００７０】
（実施例７）
グルコースによるベータ酸化抑制解除株を以下の方法にて取得した。すなわち、アルコール生産酵母Ｎ１３０をＹＰＤ培地で２４時間培養し、遠心分離（３０００ｒｐｍ、５分）によって集菌した。菌体を滅菌水で２回洗浄した後、０．０５％リシノール酸と１５０ｐｐｍ２−デオキシグルコース、及び２％寒天を含むＹＰ（２％ペプトン、１％酵母エキス）寒天平板培地１２枚に１０8個づつ塗布したところ、３０℃、一週間の培養にて１０個のコロニーが出現した。これらのコロニーを同じ選択培地で３回繰り返し培養したところ、６個のコロニーが耐性株として取得できた。
【００７１】
得られた耐性株６株（Ａ〜Ｆ株）を、１００ｐｐｍリシノール酸を含むＹＰ培地４０ｍｌと、１００ｐｐｍリシノール酸及び１０％グルコースを含むＹＰ培地４０ｍｌに植菌し、３０℃で２４時間培養した後の生成ラクトン量を測定して、結果を表１０に示した。
【００７２】
【表１０】
【００７３】
表１０に示すとおり、Ａ株は他の５株（Ｂ〜Ｆ株）に比して、１０％グルコースによるラクトン生成阻害を受けにくいことがわかったので、この変異株をサッカロミセス・セレビシエＯＡ−１（ＦＥＲＭ Ｐ−１６３６６）とした。
【００７４】
（実施例８）
糖蜜培地（全糖２．４％、尿素０．１４％、リン酸０．００８７％）を用いて、２８℃で２４時間培養した温度感受性自己消化酵母ＯＩＩ−３３より、実施例２と同様に脱水酵母を作製した。その１．２ｇを５０℃で２４時間加熱して溶解した後、Ｂｒｉｘ １４．０の麦汁４０ｍｌに懸濁した。実施例２と同様に乳酸菌ラクトバチルス・カゼイＮ５０５４（第１微生物）を接種して培養した後、アルコール生産酵母Ｎ１３０、あるいはグルコースによるベータ酸化抑制解除株ＯＡ−１（第２微生物）を植菌し、３０℃で２４時間好気的に培養した。この液体組成物を分析した結果を表１１に示す。なお、コントロールとして麦汁の代わりにＹＰ培地を用いた場合の値も合わせて示す。
【００７５】
【表１１】
【００７６】
表１１に示すとおり、培地に麦汁を用いた場合には、麦汁中に大量に含まれている麦芽糖やグルコースのために、ＹＰ培地を用いた場合に比して、生成するガンマーラクトン類の量は著しく減少する。しかし、グルコースによるベータ酸化抑制解除株ＯＡ−１を用いた場合には、この減少の程度を緩和することができた。
【００７７】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明によれば、従来から食品の製造に用いられてきた原材料を用いて、高価な物質を添加したり、新規の設備を導入したりすることなく、ガンマーデカラクトン及び／又はガンマードデカラクトンを高濃度含有する液体組成物が製造できる。また、本発明では、食品用の原材料を用いてガンマーデカラクトンが製造できるため、直接発酵食品の品質の向上をもたらすばかりでなく、食品に添加できる安全性の高い香料の製造法を提供することができる。
【００７８】
更に、本発明によれば、リシノール酸と２−デオキシグルコースを含有する培地を用いることにより、グルコースによるベータ酸化抑制が解除された菌株を造成でき、この菌株を使用することにより、グルコースを高濃度に含有する培地を用いた場合でも、カタボライト抑制による生成量の著しい減少がなく、ガンマーデカラクトン及び／又はガンマードデカラクトンを高濃度生産できる。
【発明の属する技術分野】
本発明は、食品や医薬品に使用されている酵母菌体を基質として用い、この酵母菌体に含まれる不飽和脂肪酸を、不飽和脂肪酸のヒドロキシル化能を有する第１の微生物によってヒドロキシル化し、更にベータ酸化能を持つ第２の微生物によって処理することにより、アルコール飲料、食品、香料などに用いることができるガンマーデカラクトン及び／又はガンマードデカラクトンを含有する液体組成物を製造する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
環状エステルであるラクトン類のうち、ガンマーデカラクトン、ガンマードデカラクトンなどはピーチに似た甘い香を持っており、従来より香料の調製成分として用いられている。また、これらは食品、香粧品の調合用素材としても有用である。ガンマーデカラクトンとガンマードデカラクトンの構造式を化１に示す。
【０００３】
【化１】
【０００４】
ガンマーデカラクトン、ガンマードデカラクトンなどのガンマーラクトンは、果実などの天然物に含有されているが、一般的に含有量が極めて少ないため、天然物から分離精製し、利用することは極めて困難である。化学合成法によるガンマーラクトン類の製造法としては、特開昭５５−１３３３７１号公報に、第１級アルコールとアクリル酸エステルとを有機過酸化物と鉱酸及び／又は有機酸の存在下に反応させて合成する方法が開示されている。
【０００５】
また、特開平４−２７５２８２号公報及び特開平４−２７５２８３号公報には、第１級アルコール並びに第２級アルコールと２−アルケン酸エステル類から有機過酸化物及び含窒素化合物の存在下又は１、１−ビス−ｔ−ブチルパーオキシシクロヘキサンの存在下に加熱反応によって合成する方法などが開示されている。
【０００６】
一方、微生物を利用した発酵法によるガンマーラクトン類の生産も試みられている。特開昭５９−８２０９０号及び特開昭６１−２３８７０８号公報には、ヒマシ油（カスターオイル）を、サッカロミセス（Saccharomyces）属、ハンゼヌラ（Hansenula）属、キャンディダ（Candida）属及びピキア（Pichia）属酵母を用いて発酵処理し、ヒマシ油中の構成脂肪酸の９０％を占めるリシノール酸から、ガンマーデカラクトンを生成させ、皮膚感を良好にし、不快臭を除去し、香気を改良する方法が開示されている。
【０００７】
また、特開平３−１１７４９４号公報には、ヒドロキシ脂肪酸を基質として酵母を用いてガンマーラクトンを生成する方法が、特開平３−１９８７８７号公報には、１０−オキソステアリン酸からベータ酸化能を有する微生物によってガンマードデカラクトンを生産する方法が開示されているが、これらの基質の製造方法については言及されていない。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
ガンマーデカラクトンは香料として食品に添加したり、芳香成分として高濃度含有する食品、飲料、アルコール飲料などを製造する用途があるが、食品としての安全性を考慮すると、複雑な化学合成工程は含まないことが望ましい。また、用いる微生物も古くから食品に用いられ、有害な副産物の産生のないことが判明し、安全性の確立した微生物であることが望ましい。更に、ガンマーラクトンを生産する原材料として、特定の高価な物質等を添加することなく、従来より食品製造に用いられてきた天然物のみで行える方法の開発が強く望まれていた。
【０００９】
また、グルコースなどの利用されやすい糖類の添加により特定の酵素の合成が低下することが古くから知られており、この現象はカタボライト抑制と呼ばれている。ラクトン類の生物変換に必要なベータ酸化系の酵素も、用いた培地中にグルコースなどが高濃度含有されていると糖によるカタボライト抑制を受け、結果としてラクトン類の生成量の著しい減少が見られる。しかし、グルコースなどを糖源として用いると酵母類の生育が速くなることや、自然界にグルコースなどの糖を含有する天然培地が存在することから、グルコースなどの糖を用いてもラクトン類の生成を行える系の開発が望まれていた。
【００１０】
本発明は、このような事情に鑑みてなされたものであり、従来から食品製造に用いられてきた天然の食品用原材料を用いて、ガンマーデカラクトン及び／又はガンマードデカラクトンを高濃度に含有する液体組成物を製造できる方法を提供することを目的とする。また、グルコースを高濃度に含有する培地を用いた場合でも、カタボライト抑制による生成量の著しい減少がなく、ガンマーデカラクトン及び／又はガンマードデカラクトンを高濃度生産できる方法を提供することを目的とする。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明によれば、不飽和脂肪酸を含有する酵母菌体を基質として用い、当該基質として用いる酵母菌体を加熱によって溶解させ、当該基質に含有される不飽和脂肪酸を、不飽和脂肪酸のヒドロキシル化能を有する第１微生物によってヒドロキシル化し、更にベータ酸化能を有する第２微生物によって処理することを特徴とするガンマーデカラクトン及び／又はガンマードデカラクトンを含有する液体組成物の製造方法、が提供される。
【００１３】
更に、本発明によれば、上記の製造方法により得られたガンマーデカラクトン及び／又はガンマードデカラクトンを含有する液体組成物に、エタノールを含有する溶液を添加し、蒸留することを特徴とするガンマーデカラクトン及び／又はガンマードデカラクトンを含有する液体組成物の製造方法、が提供される。
【００１４】
【発明の実施の形態】
本発明者らは、従来より食品の製造などに用いられてきた酵母菌体を不飽和脂肪酸の供給源として用い、この酵母菌体を溶菌することにより培地中に放出された不飽和脂肪酸を、不飽和脂肪酸のヒドロキシル化能を有する第１の微生物によってヒドロキシル化し、更に、ベータ酸化能を有する第２の微生物で処理することによってガンマーラクトン類を高濃度生成することに成功した。更に、グルコースによるベータ酸化の抑制が解除された菌株を効率良く造成する方法を開発し、得られた菌株を用いることにより、グルコースなどの糖類を高濃度含有する培地中でもガンマーラクトン類を高濃度生産することに成功した。
【００１５】
本発明において基質として用いる酵母菌体は、不飽和脂肪酸を含有するものであればどのような株でもよいが、特に従来より広く食品業界で用いられてきたサッカロミセス（Saccharomyces）属に属する酵母が有利である。かかる酵母としては、例えば、市販のパン酵母や清酒醸造用酵母（日本醸造協会より市販）、あるいはSaccharomyces cerevisiae Ｓ２８８Ｃ（米国酵母遺伝保存センター分譲菌）などの公知自由分譲株を挙げることができるが、サッカロミセス属以外の酵母菌株、例えばトルラスポラ（Torulaspora）属酵母、サッカロミコデス（Saccharomycodes）属酵母、キャンディダ（Candida）属酵母などを用いても差し支えない。
【００１６】
また、容易に溶菌できる温度感受性自己消化酵母を用いてもよい。温度感受性自己消化酵母としては、サッカロミセス・セレビシエ２３３、２５４、３０８、３１５、Ｘ３１１９−１２、Ｘ３１２４−４Ｂ（以上米国酵母遺伝保存センター分譲菌）などの公知自由分譲株を用いることができるが、一般にこれらの実験室用酵母由来の変異株は、野生酵母に比べて増殖速度が遅い上に３０℃程度でも弱い自己消化を示すものが多く、培養が容易とは言い難い。
【００１７】
そこで、温度感受性自己消化酵母として、従来より知られている方法（J.Bacteriol.,124,1604(1975)）により作製した変異株を適宜用いるようにしてもよい。発明者らは、本法を用いて、以下に記述するようにアルコール生産酵母サッカロミセス・セレビシエＮ１３０（ＦＥＲＭ Ｐ−１６３６５）株より温度感受性自己消化酵母サッカロミセス・セレビシエＯＩＩ−３３（ＦＥＲＭ Ｐ−１６３６４）株を造成した。
【００１８】
まず、ニッカウヰスキー株式会社保存菌株であるアルコール生産酵母サッカロミセス・セレビシエＮ１３０株（以下、「Ｎ１３０」と略す。）を親株として用い、ＹＰＤ培地（酵母エキス１％、ペプトン２％、グルコース２％）で定常期まで培養した後、滅菌水で数回洗浄した。一般的には、紫外線の照射や薬剤処理などの公知の変異誘導法によって変異率を高めてもよいが、これらの変異誘導法によって自己消化能以外の性質に変化が起こることを避けるため、ここではそのままＹＰＤプレート一枚あたりの細胞数が約１０００個になるように植菌し、２５℃で３日間培養した。生育してきたコロニーを数枚のＹＰＤプレートにレプリカし、３７℃以上では生育できない株を選択した。更に顕微鏡を用いて３７℃で自己消化を起こしている株を選択し、その中から３０℃での生育が最も良い一株を分離した。
【００１９】
このようにして分離した温度感受性自己消化酵母をサッカロミセス・セレビシエＯＩＩ−３３（Saccharomyces cerevisiae OII-33）と命名し、これを工業技術院生命工学工業技術研究所に生命研菌寄第１６３６４号（ＦＥＲＭ Ｐ−１６３６４）として寄託した。
【００２０】
このサッカロミセス・セレビシエＯＩＩ−３３株（以下「ＯＩＩ−３３」と略す。）と親株であるＮ１３０株との菌学的性質を、ザ・イースト・ア・タキソノミック・スタディー（The Yeast a taxonomic study, 3rd edition, eds. by Kreger-van Rij, Elsevier Science Publishers, Amsterdam）の記載に基づいて検討し、その結果として表１に炭素源の資化性と発酵性を、表２に窒素源の資化性とその他の特徴を示した。
【００２１】
【表１】
【表２】
変異誘導法によって処理することなく作製した変異株であるＯＩＩ−３３の菌学的性質は、表１及び表２に示すように、３７℃で生育せず、溶菌すること以外は、親株であるＮ１３０と全く同一であった。
【００２４】
上記に例示した酵母類は、一般に酵母の培養に用いられる培地、例えば麦汁やＹＰＤ培地のような天然培地やウィッカーハム改変培地のような合成培地に接種し、約１０℃から約４０℃、好ましくは２０℃から３０℃にて前培養を行なう。この時、菌体脂肪酸の不飽和度を上げるために振盪、撹拌もしくは無菌空気を通気することによって好気的条件下に培養させることが好ましい。培養に要する時間は、用いる酵母の菌株や培地、培養条件などによって異なるが、酵母が培養液１ｍｌあたり１０8個程度になるまで培養することが好ましく、一般に１２時間から７２時間必要である。
【００２５】
酵母菌体を充分に前培養した後、培養液をそのまま次の溶解工程に進めてもよいが、従来一般に行なわれている方法で集菌した後溶菌させてもよい。菌体を溶菌させる溶解工程は、培養液のまま、あるいは、集めた菌体を適当な培地あるいは水に懸濁した状態で行なってもよいが、パン酵母の製造工程で行なうように脱水した脱水酵母の状態で行なってもよい。
【００２６】
一般的なサッカロミセス属野生酵母では、少なくとも４０℃で２４時間以上の加熱溶解処理が必要であるが、オートクレーブを用いて１２１℃１５分処理でもよい。比較的低温で溶解する温度感受性自己消化酵母では、３０℃で２４時間程度の処理でもよいが、好ましくは、４０℃で２４時間、更に好ましくは５０℃で２４時間の処理が望まれる。一般に低温での溶解は、加熱に必要な光熱費を低減する上で有利であり、逆に５０℃以上での溶解は、雑菌の混入を防止するという点で有利である。
【００２７】
脱水酵母を溶菌した場合には、酵母菌体を再び一般に酵母類が生育できるような培地に懸濁する。培地としては、市販されているペプトン、酵母エキス、カザミノ酸などとグルコース、マルトースなどの糖類との混合物や、発酵飲料の原料、あるいは発酵飲料の原料とこれらとの混合物、又は廃糖蜜と尿素の混合物などからなる培地を例示することができる。また、ウィッカーハム改変培地のような合成培地を用いてもよい。
【００２８】
溶解酵母菌体を懸濁した培地に不飽和脂肪酸をヒドロキシル化する能力を持った第１微生物を接種する。この能力を持った第１微生物としては、シュードモナス（Pseudomonas）属（J.Biol.Chem.,249, 2833(1974)）、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属（J.Biol.Chem.,241, 5441(1966)）、ノカルディア（Nocardia）属（Appl.Envirom., 2116(1992)）などが知られており、ガンマーラクトン類の生成にはどの菌株を用いることも可能であるが、従来より食品製造に用いられ、安全性の確立している乳酸菌類を用いることが望ましい。
【００２９】
乳酸菌とは、炭水化物を分解し、主に乳酸を生産する細菌類の総称であり、ラクトバチルス（Lactobacillus）属、ストレプトコッカス（Streptococcus）属、ロイコノストック（Leuconostoc）属などを例示することができる。例えば、Lactobacillus casei ＪＣＭ１１６３、Lactobacillus plantarum ＩＡＭ１０４１、Pediococcus pentosaceus ＩＡＭ１２１５、Leuconostoc mesenteroides ＩＡＭ１２３３などを挙げることができる。これらの菌株は、東京大学分子生物学研究所、埼玉の理化学研究所などの公知自由分譲株として入手することができる。
【００３０】
乳酸菌は、一般に乳酸菌の培養に用いる培地、例えばＭＲＳ培地やＶ８培地などで培養液１ｍｌあたり１０6〜１０10個になるまで前培養する。前培養液はそのままあるいは、遠心処理、膜処理などによって濃縮した後、加える乳酸菌が本培養液１ｍｌあたり１０4〜１０8個になるように植菌する。このまま、約１０℃から約４０℃、好ましくは２０℃から３０℃にて１２時間から４８時間振盪、撹拌などによって好気的にあるいは静置培養する。この間に、溶解酵母由来の不飽和脂肪酸が相当するヒドロキシ脂肪酸に変化する。
【００３１】
ヒドロキシル化した脂肪酸を含む培地にベータ酸化能を有する第２微生物を植菌する。ほとんどすべての真核細胞生物がベータ酸化能を持っていることが知られているが、ここで用いる第２微生物としては、例えば、サッカロミセス（Saccharomyces）属、ピキア（Pichia）属、ハンゼヌラ（Hansenula）属、キャンディダ（Candida）属、クリベロミセス（Kluyveromyces）属などを挙げることができる。
【００３２】
かかる菌株としては、サッカロミセス属の市販パン酵母や、清酒醸造用酵母（日本醸造協会より市販）、あるいはSaccharomyces cerevisiae Ｓ２８８Ｃ（米国酵母遺伝保存センター分譲菌）などの公知自由分譲株を例示することができる。また、ピキア・ファリノーサ（Pichia farinosa）、キャンディダ・ユーチリス（Candida utilis）、ハンゼヌラ・アノマラ（Hansenula anomala）、クリベロミセス・ラクチス（Kluyveromyces lactis）などに属する公知自由分譲株を用いることも可能である。しかし、特に古来より発酵食品の生産に安全に用いられてきたサッカロミセス属酵母が有利である。
【００３３】
これらのベータ酸化能を有する第２微生物を、培養液１ｍｌあたり１０4〜１０8個になるように植菌し、約１０℃から約４０℃、好ましくは２０℃から３０℃にて培養を行なう。培養方法は一般微生物の培養方法に準じて行なわれるが、好気的培養法が有利である。これは、一般にベータ酸化が好気的反応であることに由来するが、静置培養法でも、培養開始時に溶解していた溶存酸素によってガンマーラクトン類の生成が行なわれる。好気的培養は、振盪、撹拌、通気撹拌などによって行なうことができる。
【００３４】
培養時間は、培地組成や、培養温度などに応じて適宜設定されるが、酵母が培養液１ｍｌあたり１０8個程度になるまで培養することが好ましく、一般に２４時間から９６時間必要である。また、このベータ酸化工程を先に示したヒドロキシル化工程と同時に行なうこともできる。すなわち、ヒドロキシル化能を持った第１微生物とベー夕酸化能を持った第２微生物を同時に植菌し、適宜設定された条件で培養することによってもガンマーラクトン類の生成を行なうことが可能である。
【００３５】
また、グルコースを糖源として用いてもガンマーラクトン類の高濃度の生産ができるようにするためには、グルコースによるベータ酸化系の酵素群に対する抑制が解除された菌株を造成する必要があると考えられる。このような変異株を造成するために、発明者らは、グルコースの致死性アナログである２−デオキシグルコースを、ガンマーラクトンの前駆体の一つであるリシノール酸を含有する培地に加えた選択培地を作製した。
【００３６】
この培地で、酵母菌体が生育するためにはリシノール酸を炭素源として利用しなければならないが、野生株では２−デオキシグルコースによるカタボライト抑制により、リシノール酸より先に致死性の２−デオキシグルコースを利用することになり死滅に至る。一方、カタボライト抑制の解除された変異株では、２−デオキシグルコースが存在してもリシノール酸を利用することができ、ベータ酸化により生じるエネルギーを用いて生育することができる。
【００３７】
本選択培地としては、イースト・ニトロゲン・ベース（ＤＩＦＣＯ社製）０．６７％を含有する培地あるいはＹＰ培地（酵母エキス１％、ペプトン２％）に２％の寒天を添加した培地を基本培地として、０．０１〜０．５％、好適には０．０５％のリシノール酸と５０ｐｐｍ以上、好適には１５０ｐｐｍの２−デオキシグルコースを含むものが推奨される。
【００３８】
本選択培地に使用されるリシノール酸と２−デオキシグルコース以外の成分は、実質的に炭素源を含まない培地であれば特に限定されない。培養条件も酵母菌体が生育できる条件であれば特に限定されないが、通常３０℃で一週間程度必要である。発明者らは本選択培地を用いてベータ酸化に対するカタボライト抑制の解除された変異株サッカロミセス・セレビシエＯＡ−１（ＦＥＲＭ Ｐ−１６３６６）を得た。
【００３９】
ここでカタボライト抑制解除株を得るための親株として用いられる酵母は、市販のパン酵母や清酒醸造用酵母（日本醸造協会より市販）、あるいはSaccharomyces cerevisiae Ｓ２８８Ｃ（米国酵母遺伝保存センター分譲菌）などの公知自由分譲株をあげることができる。これらの酵母を、酵母が増殖できる培地で適宜培養する。培養条件も特に限定されない。
【００４０】
培養後、遠心分離、膜処理などによって集菌した後、滅菌水で数回洗浄することが望ましい。そのまま、あるいは、公知の変異誘導法、例えば紫外線の照射、エチルメタンスルフォネートなどの薬剤処理（微生物遺伝学実験法、石川辰夫編、１９８２、ｐ１９３、共立出版参照）を加えた後、上述の選択培地に塗布し、生育してきた菌株を耐性株とする。更に、耐性株のラクトン生産能を調ベ、グルコースによる生産能の低下の少ない株をベータ酸化に対するカタボライト抑制の解除された変異株とする。もちろん、グルコースの存在しない条件下では、これらの変異株は、野生株を用いた場合と同様にガンマーラクトン類の生成を行なうことができる。
【００４１】
なお、親株としてＮ１３０株を用いて上記方法により分離した変異株サッカロミセス・セレビシエＯＡ−１株（以下「ＯＡ−１」と略す。）と親株であるＮ１３０株との菌学的性質を、ザ・イースト・ア・タキソノミック・スタディー（The Yeast a taxonomic study, 3rd edition, eds. by Kreger-van Rij, Elsevier Science Publishers, Amsterdam）の記載に基づいて検討し、その結果として表３に炭素源の資化性と発酵性を、表４に窒素源の資化性とその他の特徴を示した。
【００４２】
【表３】
【表４】
変異誘導法によって処理することなく作製した変異株であるＯＡ−１の菌学的性質は、グルコースによるベータ酸化の抑制が解除されていること以外は、表３及び表４に示すように親株であるＮ１３０と全く同一であった。
【００４５】
本製法において菌株の接種や培養液の回収などの工程は、従来一般に行なわれている方法に従って行なうことができる。また、微生物の培養液より物質を単離するために一般に用いられている方法を用いて生成した液体組成物よりラクトン類を単離することもできる。培養液及び菌体にガンマーラクトン類が蓄積しているので、遠心処理などによって菌体と培養液を分離した後、あるいは、菌体が培養液中に懸濁した状態のまま、ガンマーラクトン類を抽出精製することもできる。ガンマーラクトン類は有機溶媒に溶解し、比較的高い沸点を持つので、有機溶媒での抽出や蒸留、カラムクロマトグラフィーなどの手段によって精製した後、有機溶媒を留去し、高純度、高品質のガンマーラクトンを提供することができる。
【００４６】
ガンマーラクトン類を含有する液体組成物にエタノールを含有する液体を添加し、あるいは、添加した後、蒸留してもよい。エタノールを含有する液体としては、例えば、アルコール飲料を製造するために醸造した発酵液、エタノールを含有する水溶液などが挙げられる。発酵液は、ウイスキー、ビール、ワイン、焼酎、清酒などを製造する途中の醸造液でもよい。
【００４７】
本発明において、酵母菌体を基質に用いてガンマーラクトン類が生成する詳細なメカニズムは必ずしも明らかではないが、酵母菌体の細胞壁中に多く含まれる不飽和脂肪酸、特にパルミトオレイン酸とオレイン酸が、菌体が溶解することによって乳酸菌などの他の微生物との接触が可能になり、ヒドロキシル化されることから始まるものと考えられる。ヒドロキシル化されたパルミトオレイン酸とオレイン酸は、更にベータ酸化されてそれぞれデカラクトンとドデカラクトンに変換される。したがって、基質となる酵母菌体中のパルミトオレイン酸とオレイン酸の量によって生成してくるデカラクトンとドデカラクトンの量が左右される。
【００４８】
【実施例】
以下に実施例を示し、具体的に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。なお、下記の実施例中、ガンマーラクトン類の分析は、得られた液体組成物をヘキサンで抽出した後、ガスクロマトグラフィーを用いて行なった。
【００４９】
（実施例１）
焼酎酵母サッカロミセス・セレビシエＨ株（鹿児島県酒造協同組合）を糖蜜培地（全糖２．４％、尿素０．１４％、リン酸０．００８７％）で流加培養し、集菌した後洗浄した。集めた菌体は脱水し、その１ｇを４０ｍｌのＹＰ培地に懸濁し、１２１℃で１５分間オートクレーブ処理を行なった。室温まで冷却後、第１微生物としてニッカウヰスキー株式会社保有の乳酸菌ラクトバチルス・カゼイＮ５０５４株（Lactobacillus casei N5054）（ＦＥＲＭ Ｐ−１６３６７）を培地１ｍｌあたり１０7個になるように植菌し、そのまま２４時間静置培養した。更に、第２微生物として同社保有のアルコール生産酵母Ｎ１３０を１ｍｌあたり１０7個になるように植菌し、そのまま２４時間振盪培養した。この培養液には、ガンマーデカラクトンが５００ｐｐｂ、ガンマードデカラクトンが１．３ｐｐｍ含まれていた。
【００５０】
（実施例２）
ＹＰＤ培地を用いて、２８℃で２４時間培養した温度感受性自己消化酵母ＯＩＩ−３３と親株のアルコール生産酵母Ｎ１３０をそれぞれ遠心によって集菌した後、滅菌水で繰り返し洗浄した。集めた菌体は素焼き板上で脱水し、脱水酵母を作製した。この脱水酵母１．２ｇを３０、４０、５０、６０℃で２４時間加熱した後、４０ｍｌのＹＰ培地に懸濁した。更に、実施例１と同様にして乳酸菌ラクトバチルス・カゼイＮ５０５４株（第１微生物）を植菌して培養した後、アルコール生産酵母Ｎ１３０（第２微生物）を接種し、好気的に培養した。この液体組成物のガンマーラクトン濃度を測定し、結果を表５に示した。
【００５１】
【表５】
表５に示すとおり、基質として温度感受性自己消化酵母ＯＩＩ−３３を用いた場合は、３０℃処理でもガンマーデカラクトン、ドデカラクトンが生成していたが、基質として親株Ｎ１３０を用いた場合では４０℃以上に加熱しないとガンマーラクトンは生成しなかった。
【００５３】
（参考例１）
最初に基質として加える酵母菌体の代わりにオレイン酸５０ｐｐｍ、１００ｐｐｍ、５００ｐｐｍを添加し、実施例２と同一条件でラクトンの生成を見た。この場合、ガンマーデカラクトンはまったく生成されないが、ガンマードデカラクトンがそれぞれ１３ｐｐｍ、３０ｐｐｍ、５０ｐｐｍ生成した。
【００５４】
（参考例２）
最初に基質として加える酵母菌体の代わりにパルミトオレイン酸５０ｐｐｍを添加し、実施例２と同一条件でラクトンの生成を見た。この場合、ガンマーデカラクトンが２８ｐｐｍ生成し、ガンマードデカラクトンは生成していなかった。
【００５５】
（比較例１）
最初に基質として加える酵母菌体を添加せずに実施例２と同一条件で処理し、液体組成物を作製した。この液体組成物のラクトンの生成を見たところ、ガンマーデカラクトン、ガンマードデカラクトンがそれぞれ１２ｐｐｂ、２４ｐｐｂ生成されているに過ぎず、基質としての酵母菌体の添加がガンマーラクトンの大量生産に必要であることがわかった。
【００５６】
（比較例２）
温度感受性自己消化酵母ＯＩＩ−３３の脱水酵母１．２ｇを５０℃で２４時間加熱して溶解した後、ＹＰ培地４０ｍｌに懸濁した。そのまま、乳酸菌（第１微生物）を加えずに実施例２と同様に酵母（第２微生物）を好気的に培養して作製した液体組成物にはガンマーデカラクトン、ガンマードデカラクトンがそれぞれ９０ｐｐｂ、８７ｐｐｂ生成されているに過ぎなかった。
【００５７】
（実施例３）
実施例２と同様にして、温度感受性自己消化酵母サッカロミセス・セレビシエ３５１、サッカロミセス・セレビシエＸ３１１９−１２Ａ、サッカロミコデス・ルドイギー（Saccharomycodes ludwigii）ＩＦＯ １７２１、及びトルラスポラ・デルブルツキー（Torulaspora delbrueckii）ＩＦＯ ０９５５の脱水酵母を製造し、その１．２ｇを５０℃で２４時間加熱し、溶解した。また、サッカロミセス・セレビシエ３５１とサッカロミセス・セレビシエＸ３１１９−１２Ａの２株については４０℃で２４時間加熱による溶菌処理も行った。
【００５８】
溶菌処理後、実施例２と同様に最初に乳酸菌ラクトバチルス・カゼイＮ５０５４株（第１微生物）、次いで酵母Ｎ１３０（第２微生物）による培養を行ない、液体組成物を作製した。これらの液体組成物中に含まれるガンマーラクトンを測定し、結果を表６及び表７に示した。
【００５９】
【表６】
【表７】
表６に示すとおり、上記のような公知自由分譲株である温度感受性自己溶解変異株を基質として用いても、４０℃２４時間程度の加熱でガンマーラクトン類を製造することができた。また、表７に示すとおり、サッカロミコデス・ルドイギー、トルラスポラ・デルブルツキーなどの酵母菌体を基質として用いてもガンマーラクトン類を製造することができた。更に、用いた菌株によってガンマーデカラクトンとガンマードデカラクトンの生成量の比が異なっており、このことを利用して、これら２種のラクトンの作り分けも可能であった。
【００６２】
（実施例４）
ＹＰＤ培地を用いて２８℃で２４時間培養した温度感受性自己消化酵母ＯＩＩ−３３菌体を集菌し、滅菌水で洗浄した。脱水酵母１．２ｇに相当する量の湿菌体を４０ｍｌのＹＰ培地に懸濁し、懸濁した状態のまま５０℃あるいは６０℃で２４時間加熱溶解させた。更に、実施例２と同様に乳酸菌ラクトバチルス・カゼイＮ５０５４株（第１微生物）の培養、酵母Ｎ１３０（第２微生物）の好気的培養を行ない、液体組成物を作製した。
【００６３】
この液体組成物中に含まれているラクトンを測定したところ、５０℃処理菌体を用いた場合にはデカラクトンが４．６ｐｐｍ、ドデカラクトンが６．１ｐｐｍ、また６０℃処理菌体を用いた場合にはデカラクトンが１．３ｐｐｍ、ドデカラクトンが２．０ｐｐｍ含まれていることが判明し、基質として用いる菌体は脱水していなくても問題がないことが示された。
【００６４】
（実施例５）
ＹＰＤ培地を用いて２８℃で２４時間培養した温度感受性自己消化酵母ＯＩＩ−３３及び日本醸造協会９号酵母菌体（以下「９号酵母」と略記する。）を集菌し、脱水酵母を作製した。それらの１．２ｇを５０℃２４時間加熱により溶解し、ＹＰ培地に懸濁した。更に、実施例２と同様に乳酸菌ラクトバチルス・カゼイＮ５０５４株（第１微生物）の培養を行なった後、アルコール生産酵母Ｎ１３０あるいは９号酵母（第２微生物）を植菌し、２４時間好気的に培養した。得られた培養液のラクトン含量を表８に示した。
【００６５】
【表８】
表８に示すとおり、上記実施例の条件下では、第２微生物として用いる酵母を特に限定しなくてもガンマーラクトン類を生成できた。
【００６７】
（実施例６）
糖蜜培地（全糖２．４％、尿素０．１４％、リン酸０．００８７％）を用いて、２８℃で２４時間培養した温度感受性自己消化酵母ＯＩＩ−３３を用いて脱水酵母を作製した。この脱水酵母１．２ｇを５０℃で２４時間加熱して溶解した後、ＹＰ培地４０ｍｌに懸濁した。これに、ラクトバチルス・カゼイＮ５０５４、ラクトバチルス・カゼイＪＣＭ１１６３、あるいはラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）ＩＡＭ１０４１（第１微生物）をそれぞれ実施例１と同様に植菌し、培養した。更に、アルコール生産酵母Ｎ１３０（第２微生物）を好気的に培養して、得られた液体組成物中に含まれるガンマーラクトンを表９に示した。
【００６８】
【表９】
表９に示すとおり、乳酸菌株（第１微生物）を変更しても、生成液体組成物中には大量のガンマーデカラクトン及びガンマードデカラクトンが含有されていた。
【００７０】
（実施例７）
グルコースによるベータ酸化抑制解除株を以下の方法にて取得した。すなわち、アルコール生産酵母Ｎ１３０をＹＰＤ培地で２４時間培養し、遠心分離（３０００ｒｐｍ、５分）によって集菌した。菌体を滅菌水で２回洗浄した後、０．０５％リシノール酸と１５０ｐｐｍ２−デオキシグルコース、及び２％寒天を含むＹＰ（２％ペプトン、１％酵母エキス）寒天平板培地１２枚に１０8個づつ塗布したところ、３０℃、一週間の培養にて１０個のコロニーが出現した。これらのコロニーを同じ選択培地で３回繰り返し培養したところ、６個のコロニーが耐性株として取得できた。
【００７１】
得られた耐性株６株（Ａ〜Ｆ株）を、１００ｐｐｍリシノール酸を含むＹＰ培地４０ｍｌと、１００ｐｐｍリシノール酸及び１０％グルコースを含むＹＰ培地４０ｍｌに植菌し、３０℃で２４時間培養した後の生成ラクトン量を測定して、結果を表１０に示した。
【００７２】
【表１０】
表１０に示すとおり、Ａ株は他の５株（Ｂ〜Ｆ株）に比して、１０％グルコースによるラクトン生成阻害を受けにくいことがわかったので、この変異株をサッカロミセス・セレビシエＯＡ−１（ＦＥＲＭ Ｐ−１６３６６）とした。
【００７４】
（実施例８）
糖蜜培地（全糖２．４％、尿素０．１４％、リン酸０．００８７％）を用いて、２８℃で２４時間培養した温度感受性自己消化酵母ＯＩＩ−３３より、実施例２と同様に脱水酵母を作製した。その１．２ｇを５０℃で２４時間加熱して溶解した後、Ｂｒｉｘ １４．０の麦汁４０ｍｌに懸濁した。実施例２と同様に乳酸菌ラクトバチルス・カゼイＮ５０５４（第１微生物）を接種して培養した後、アルコール生産酵母Ｎ１３０、あるいはグルコースによるベータ酸化抑制解除株ＯＡ−１（第２微生物）を植菌し、３０℃で２４時間好気的に培養した。この液体組成物を分析した結果を表１１に示す。なお、コントロールとして麦汁の代わりにＹＰ培地を用いた場合の値も合わせて示す。
【００７５】
【表１１】
表１１に示すとおり、培地に麦汁を用いた場合には、麦汁中に大量に含まれている麦芽糖やグルコースのために、ＹＰ培地を用いた場合に比して、生成するガンマーラクトン類の量は著しく減少する。しかし、グルコースによるベータ酸化抑制解除株ＯＡ−１を用いた場合には、この減少の程度を緩和することができた。
【００７７】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明によれば、従来から食品の製造に用いられてきた原材料を用いて、高価な物質を添加したり、新規の設備を導入したりすることなく、ガンマーデカラクトン及び／又はガンマードデカラクトンを高濃度含有する液体組成物が製造できる。また、本発明では、食品用の原材料を用いてガンマーデカラクトンが製造できるため、直接発酵食品の品質の向上をもたらすばかりでなく、食品に添加できる安全性の高い香料の製造法を提供することができる。
【００７８】
更に、本発明によれば、リシノール酸と２−デオキシグルコースを含有する培地を用いることにより、グルコースによるベータ酸化抑制が解除された菌株を造成でき、この菌株を使用することにより、グルコースを高濃度に含有する培地を用いた場合でも、カタボライト抑制による生成量の著しい減少がなく、ガンマーデカラクトン及び／又はガンマードデカラクトンを高濃度生産できる。
Claims (6)
- 不飽和脂肪酸を含有する酵母菌体を基質として用い、当該基質として用いる酵母菌体を加熱によって溶解させ、当該基質に含有される不飽和脂肪酸を、不飽和脂肪酸のヒドロキシル化能を有する第１微生物によってヒドロキシル化し、更にベータ酸化能を有する第２微生物によって処理することを特徴とするガンマーデカラクトン及び／又はガンマードデカラクトンを含有する液体組成物の製造方法。
- 温度感受性自己消化酵母を基質として用いる請求項１記載の製造方法。
- 温度感受性自己消化酵母がサッカロミセス・セレビシエＯＩＩ−３３（ Saccharomyces cerevisiae OII-33 ）（ＦＥＲＭ Ｐ−１６３６４）である請求項２記載の製造方法。
- 第２微生物が、グルコースによるベータ酸化抑制が解除された菌株である請求項１ないし３のいずれかに記載の製造方法。
- グルコースによるベータ酸化抑制が解除された菌株がサッカロミセス・セレビシエＯＡ−１（ Saccharomyces cerevisiae OA-1 ）（ＦＥＲＭ Ｐ−１６３６６）である請求項４記載の製造方法。
- 請求項１ないし５のいずれかに記載の製造方法により得られたガンマーデカラクトン及び／又はガンマードデカラクトンを含有する液体組成物に、エタノールを含有する溶液を添加し、蒸留することを特徴とするガンマーデカラクトン及び／又はガンマードデカラクトンを含有する液体組成物の製造方法。
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