CN1440455A - 在通过气体流获得的还原条件下培养微生物的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种培养微生物的方法，该方法可以降低培养基的氧化还原电位，其特征在于所说的培养在通过含有氢和/或氮的、与空气相比具有还原性的气体所获得的还原条件下进行。本发明还涉及用于修饰微生物培养过程中代谢流的方法。本发明特别适用于食品领域并且特别是生产含醇饮料。

Description

在通过气体流获得的还原条件下培养微生物的方法

技术领域

本发明涉及微生物在借助于气体流(gaseous stream)获得的还原条件下的培养。

更具体说，本发明涉及通过在还原条件下使用酵母发酵来改变和/或控制生产食物制品。如含醇饮料、乳制品等等。

本发明还涉及生产生物质，具体说是酵素或发酵剂、食用酵母、益生菌酵素和酵母提取物。

本发明还涉及生产特别有用于药物或兽医工业的活性物质。

更精确说，本发明涉及一种方法，此方法可以降低微生物培养过程中、特别是使用酵母发酵用于制备上述产品的过程中的氧化-还原电位，可以修饰和/或控制代谢流(metabolic flows)并因此可以修饰和/或控制所说产品的组成和/或性能。

背景技术

氧化还原是细胞合成代谢和分解代谢反应中的基本步骤，对这些反应来说，交换的方向是由氧化还原电位(Eh)来决定的。其是一个发酵的状态参数并且其变化可改变微生物的物理化学环境，此环境影响微生物的代谢活性和生理学。

酵母被广泛用于制造发酵饮料。

在酵母中，发酵的氧化还原平衡正常情况下由乙醇的产量来平衡。此外，酵母利用一些可发酵糖来合成生物质和次级产品，其中的主要一种是甘油，其是葡萄酒中乙醇和水之后的第三种组分。其产量取决于生物合成可利用的辅酶减少的量。由此在糖的发酵过程中，乙醇和甘油的形成是保持氧化还原平衡的关键。

其它产物也被足够大量地合成来改进最终产品的感官特性。它们基本上是有机酸。发酵过程中诸如琥珀酸或乙酸的有机酸的形成也对氧化还原平衡产生影响。琥珀酸是通过氧化途径经由柠檬酸和α-酮戊二酸盐或者通过还原途径经由草酰乙酸形成的，以致发酵条件是基本的。乙酸也由乙醛通过醛脱氢酶来形成。

酵母还表征为可产生与发酵香味有关的挥发性化合物，即高级醇类、醛类和酯类。这些产品得自于碳水化合物、脂质和氮的代谢，并且正因为如此，它们的产量也取决于对氧化还原电位的变化过程中代谢流分布的可能的修饰。

从糖的代谢中，酵母菌株还合成贮藏低聚糖，如糖原和海藻糖，经常是对环境压力的响应。当培养基中的碳被耗尽时而且当菌株不再具有氮或硫源，这两种低聚糖会积累，或者在加热或渗透压力的过程中，这两种低聚糖也会积累。

贮藏糖在提高酵母的稳定性和干燥性中起重要作用，正因为如此，其浓度在活性干酵母的生产中构成一个关键的参数。事实上，为耐受干燥循环的高温，糖原级分被用来给细胞提供维持能量，而海藻糖被用作膜稳定化因子。在干燥过程中，酵母可以积累大量的海藻糖(10-15％干重)，此外，干酵母的品质被认为与细胞海藻糖含量有直接关系。脱水存活与海藻糖的合成相关，并且在重新水合过程中，海藻糖被降解。实际上，海藻糖连接在膜的磷酸基团上并且通过代替水，使它们在脱水过程中稳定。除作为贮藏和保护因子外，这些糖还在碳限制条件下以低生长率进行细胞周期中作用。

考虑到目前的技术，氧化还原电位的变化似乎能够改变产品的分布和可能改变代谢中间体。

迄今，为改变发酵培养基的氧化-还原电位，所用的方法包括加热处理(如，巴氏杀菌)或添加氧化还原加成分子(如，抗坏血酸、亚硫酸盐等)。

然而，这些方法可以改变所得产品的性能但由于所设置的标准而不能系统地用于农业食品(酿酒，例如)、药物或兽医领域。

发明内容

由此，本发明的目的是弥补上述缺陷和提供一种微生物培养方法，该方法可以通过改变培养基的氧化还原电位来改变细胞中的代谢流。

本发明的目的还是提供一种使用酵母的发酵方法，用于农业食品用途、特别是酿酒，或者用于药物和兽医用途，包括对最终产品无毒性和无害的方式。

本发明的另一个目的是提供一种方法，该方法可以增加或简单化通过发酵的制造方法。

本发明的目的还是提供一种方法，该方法可以改进尤其是酵素或发酵剂的贮藏期。

本发明的一个目的还是提供发酵产品，如具有低乙醇百分比含量(葡萄酒，啤酒类等)和/或感官特性得到改进的饮料。

本发明的另一个目的是还提供具有改进特性的酵素、食用酵母或酵母提取物，特别是从保藏、营养和/或感官性方面考虑。

为此，本发明的主题是一种微生物培养方法，该方法可以降低培养基的氧化-还原电位，其特征在于所说的培养在通过与空气相比具有还原性的气体所获得的还原条件下进行，该还原性气体含有氢和/或氮。

本发明的主题还是一种微生物培养方法，该方法可以改进所说培养过程中的代谢流，其特征在于所说的微生物培养在通过与空气相比具有还原性的气体所获得的还原条件下进行，该还原性气体含有氢和/或氮。

本发明的主题还是用于生产低乙醇百分比含量的不充气饮料(non-aerated beverages)、充气含醇饮料、或酵素的微生物的培养方法，其中不充气饮料特别是葡萄酒基饮料(wine-based beverages)和蒸馏酒精饮料(distilled beverages)，充气含醇饮料特别是半发泡葡萄酒类(semi-sparkling wines)、发泡葡萄酒类、香槟酒类、啤酒类和苹果酒类，酵素特别是面包酵母、食用酵母和酵母提取物。

本发明的主题还是通过上述方法获得的产品。

本发明的主题还是通过如上所述的气体流获得的还原条件用于降低微生物培养用培养基的氧化还原电位的用途，其中所说的微生物培养用于制备欲用于农业食品工业、药物和辅助药物(parapharmaceutical)工业或兽医工业的发酵产品。

本发明的主题还是上述还原条件用于修饰微生物培养过程中的代谢流的用途。

本发明的主题还是上述还原条件用于制备上面所提及的产品的用途。

下面将对本发明的方法作更详细的描述。

本发明人非常意想不到地发现，借助于相比空气具有还原性的气体流，可以改变培养微生物用的培养基的氧化还原电位，所说的还原性气体流例如是含有氢和/或氮的气体流(与空气不同)，并且发现如此获得的还原条件可以修饰培养过程中的代谢流。

由此他们发现可以使代谢流朝着生产特定化合物的方向取向和/或以受控方式修饰所得产品的特性。

更具体说，本发明人发现在酿酒应用中可以修饰酵母发酵过程中后发酵的代谢流或动力学。

他们还发现，可以增加在培养用于生产生物质的微生物的过程中所产生的贮藏糖的量。

他们还发现，可以增加微生物在所定义的还原条件下的生存力并延长所得酵素的贮藏期。

本发明中，“还原条件”指借助于与培养基接触的气体流获得的条件，所说的气体流与空气相比具有还原性，相对于不存在所说气体流时(也就是说是在空气中，其它情况都相同)存在的值，可以减少所说培养基的氧化-还原电位。

因此，本发明包括在实际还原性培养基(氧化还原电位被降低至低于0)中的培养，也包括其中气体流可以减少初始具有氧化性的培养基的氧化还原电位的情形，即使借助于所说的气体流所达到的最终电位本身保持正值(在此情形中，在最终的分析中仍为氧化性培养基)。

使人想起的是，氧化还原电位值特别取决于培养基的组成及其pH，用来评价本发明所获得的氧化还原电位的减少的参照具有在类似pH下的相同培养基组成。

本发明的方法中，如上定义的还原条件是借助于气体获得的，所说的气体不同于空气并且，在用于培养微生物的培养基中可以获得比在常规培养条件下所获得的低的氧化还原电位，从这个意义上讲，所说的气体比空气更具有还原性，如表述“还原条件”所定义的。它由单独的或者混合物形式的氢或氮组成，这些气体的一种和/或另一种可以是与一种或多种本文中称为“从培养的观点可接受的补充气体”的其它气体的混合物形式。

由此，补充气体可以选自惰性气体，特别是氩、氦，也可以选自氧、二氧化碳和一氧化二氮及这些气体的一种或多种的按任何比例的混合物；补充气体可以由单独一种气体或多种气体的混合物组成。

“从培养的观点可接受的补充气体”的含义是它不会不利地影响培养并因此允许微生物令人满意地或改进地发育。

此外，还可以选自满足所针对的使用领域(例如，酿酒，食物制品，药物或兽医制品等)的标准和许可的气体。其实际上扩展至目前已知的标准，假定它们不断地变化、定期批准新化合物的到达和用途(例如参见目前在法国对臭氧用途的授权的免除)。

补充气体优选选自二氧化碳和氧及其混合物。

当使用混合物时，气体流中优选含有至少0.5％体积的氢和/或氮，更优选3-50％体积的氢和/或氮。

为容易使用和安全性，含氢量优选为小于5％。

正如在阅读前述内容的基础上理解的，气体流的组成可以根据所用的菌株和所设想的用途以及根据可能有的成本限制来改变。例如，可以提及的是，对培养欲用于酿酒用途或用于生产生物质的微生物或培养乳酸菌而言，优选使用氢/氮混合物。

一般来说，还可以提及的是，根据所用微生物(酵母)的性质使用氢/氧混合物，例如用于生产生物质。

还可以提及使用单独的氮流来促进生物质生产过程中贮藏糖(特别是糖原，海藻糖)的积累。

本发明的方法根据所针对微生物常规使用的培养程序来完成。

这尤其可以是使用尤其是酵母进行发酵或者根据所选的用途使用其它用于微生物生长的程序。

此外，提供使培养基与前述气体流接触的方式。

可以在进行微生物的生长之前和/或同时，通过任何已知的方式施加本发明的气体。

本发明的方法可以连续式进行或分批式进行，从工业的观点出发后一种方式经常是优选的。

正如本申请后面所详细介绍的，本发明的方法可以修饰微生物中的代谢流。“修饰代谢流”应理解为在微生物的培养过程中控制生产的方向，即是说获得特定的化合物，这可能要以正常情况下获得的其它产品为代价，而且还修饰这些代谢流的特性，特别是从考虑生产率、适宜的压力增加等观点出发。

换句话说，本方法可以定向和控制微生物培养过程中所说的代谢流，以便最终获得与在常规条件下进行相同培养所能获得的不同的组合物，可能同时会生产出常规生产过程(即没有与本发明所定义的还原气体接触)中通常不能获得的特定的新化合物。

本发明的方法还可以在反应特性的水平来修饰代谢流。典型地，可以提及使用酵母在密闭容器(例如，瓶子)中发酵的情况，其中在上述的还原条件下可以改进其中的后发酵过程的动力学。

代谢流的修饰还可以相当于所产生的细胞中的贮藏糖的积累、特别是海藻糖和糖原的积累。

下面将描述本发明的更具体的应用，但这些描述不应当认为是对本发明的限制而仅是以举例说明的方式给出的。

本发明的一个实施方案中，将本方法施用于酿酒所用类型的微生物，用于制备不充气的含醇饮料(不经过后发酵)，例如葡萄酒基饮料或蒸馏酒精饮料。

此发酵通常包括使用酵母属(Saccharomyces)的酵母，其主要在罐(敞口容器)中进行，典型地是分批式进行。

当使用本发明所定义的还原条件时，例如，相比于在常规条件下(即是说，没有降低培养基的氧化还原电位)生产的相同类型的饮料，生产出具有较高甘油含量的饮料。

甘油产量的增加是以损害乙醇产生为代价的。由此，可以直接获得不充气的低酒度饮料，而不用通过迄今为止生产这种饮料所用的萃取工艺来脱醇。

因此，本发明的方法特别适用于生产具有低乙醇百分比含量的饮料，例如低酒度葡萄酒基饮料。在此情形中，优选保留至少5％体积的乙醇含量，为的是保留消费者所欣赏的葡萄酒芳香和风味，因为留滞了乙醇中产生这些感官特性的挥发性化合物。

然而，本发明也可用于生产具有比上述界限值低的乙醇百分比含量的饮料，在此情形中可以生产出具有新感官特性的低酒度饮料。

本发明的方法还适用于生产具有改进的感官特性的具有相同百分比含乙醇量的饮料，例如在蒸馏酒精饮料的领域中。

本发明方法的优点是允许基本上完全回收且不降解不挥发性化合物以及不会形成与处理方法特别是常规脱醇方法有关的差的味道。

由此，本发明的方法可以控制发酵生产的饮料的特性，特别是从感官特性及其百分比含乙醇量的观点。特别是在减少其百分比含乙醇量的同时可以保持或增强饮料的通常的感官特性。在其它情形中，可以生产出具有常规方法所不能获得的新感官特性或质地(texture)的饮料。例如，可以提及的是生产被称作“粘稠(ropy)”葡萄酒的具有高甘油含量的葡萄酒。

由此，本发明的方法可应用于使用酵母或与酵母相同种的其它微生物的、其中希望减少乙醇产生和/或增加甘油产生的、任何类型的发酵。

本发明的另一个实施方案中，将本方法应用于在密闭容器(例如，瓶或桶)中进行的酵母发酵，用于生产具有后发酵的饮料。

它们包括，例如，主要由酵母属的酵母进行的用于生产发泡(sparkling)葡萄酒类、啤酒类或苹果酒类的发酵。

在此情形中，在本发明的所定义的还原条件下，可以通过加速瓶子中压力的增加而改进后发酵的动力学。

由此，可以通过一种更容易且更快速的方法来制备香槟酒、发泡葡萄酒类、半发泡葡萄酒类、啤酒类或苹果酒类型的饮料。

本发明的其它实施方案中，将本方法应用于微生物以制备食品领域以及药物或兽医领域所用的酵素、食用酵母或酵母提取物。

举例来说，可以提及培养酵母属和假丝酵母属(Candida)物种的菌株用于生产制作面包用酵素或发酵剂，培养酵母属、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)和假丝酵母属物种的菌株用于生产食用酵母、特别是药用或兽医用酵母以及酵母提取物；培养乳球菌属(Lactococcus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、乳杆菌属(Lactobacillus)和嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)的细菌用于生产乳制品工业中所用乳酸菌。

当使用本发明定义的还原条件时，例如可以产生更多的贮藏糖，特别是海藻糖和糖原。

在通过将所说的酵母脱水的方法来获得活性干酵母的生产中，贮藏糖的含量是一个重要的因素，甚至是一个关键的参数。

处于本发明还原条件下，同时可以观察到微生物的良好生存力。

因此，所述的方法可以改进这种脱水酵母的生产。

由此本发明的方法可应用于饮食领域，其中干食用酵母可用作天然食物成分，富含蛋白质、B类维生素和矿物质。

本发明的方法还可应用于药物和辅助药物，其中可以将被富集的干酵母掺入到营养补剂中，特别是通过对它们所含的微量元素的高生物利用，并且其中可以将酵母提取物用于药学的发酵以及可用于微生物学，特别是用于制备生长培养基。

本发明的方法还可应用于食品领域，其中自溶酵母是特别适合增味的成分，特别是适合制备风味小吃或美味饼干，并且其中酵母提取物是肉汤、蔬菜汤等中的传统成分，而且还是富含生长因子、肽和氨基酸的成分，而生长因子、肽和氨基酸对微生物的培养方法是有用的。

本发明的方法可应用于使用活发酵剂的任何工业，例如酿酒，啤酒类酿造，苹果酒类制作，面包制作，还可用于药物、辅助药物、兽药，特别是伴有益生菌剂快速生长的那些。

本发明由此涉及通过上述方法获得的任何产品。

附图说明

以下将通过给出的实施例参考附图对本发明作举例说明，这些实施例没有任何限制作用，所说的附图中：

图1显示了当在基本培养基上连续发酵时不同氧化还原电位(Eh)下获得的乙醇和甘油的产量，参考实施例1；

图2a-2d和3a-3d是分别显示在酒精发酵过程中不存在气体及在三种不同鼓泡条件下(产生四种不同氧化还原电位)所观察到的乙醇和甘油产率的曲线，参考实施例2；

图4，5和6各自是显示当在具有后发酵的瓶子中发酵时乙醇产量、瓶中压力和醇百分比含量(后发酵的决定性参数)作为时间函数的变化的曲线，参考实施例3；

图7，8和9各自是汇报当在具有后发酵的瓶子中发酵时整个时间内的氧化还原电位(Eh)、监测的残余糖量和监测的甘油产量(后发酵的辅助性参数)的曲线，参考实施例3；

图10和11显示了对分别在基本培养基上和在葡萄汁培养基上的贮藏糖(糖原和海藻糖)作为氧化还原电位(Eh)函数的定量分析，参考

实施例4；

图12和13是显示分别在生理盐水和葡萄酒中贮藏的过程中细胞的生存力的曲线，参考实施例5。

实施例

I-本发明还原条件对发酵培养基氧化还原电位值的影响

在此研究中，使用三种类型的气体，即单独的氮、4％氢的氮/氢混合物和单独的氢。

观察这些不同气体的鼓泡对无机培养基的氧化还原电位(Eh)值的影响，其中所说的无机培养基具有以下适合酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)生长的组成：

无机培养基的组成：

对1升蒸馏水的量

             (NH₄)₂SO₄            5g

                KH₂PO₄             3g

            MgSO₄.7H₂O             0.5g

                  EDTA                15mg

            ZnSO₄.7H₂O             4.5mg

            CoCl₂.6H₂O             0.3mg

            CaCl₂.2H₂O             4.5mg

            FeSO₄.7H₂O             3mg

           NaMoO₄.2H₂O             0.4mg

                 H₃BO₃             1mg

                   KCl                0.1mg

          消泡用硅氧烷                0.025ml

              麦角甾醇                10mg

                吐温80                420mg

              乙醇1mM                 46mg

                葡萄糖                23g

                生物素                0.05mg

                泛酸钙                1mg

                  烟酸                1mg

                  肌醇                25mg

            盐酸硫胺素                1mg

         对-氨基苯甲酸                0.2mg

            盐酸吡哆醇                1mg

               pH＝4.1

还观察这些气体对相当于酿酒用途的葡萄汁培养基的效果。

第一阶段，观察无菌培养基(即是说，没有接种的培养基)上的Eh值，并且第二阶段，观察接种的培养基上的Eh值。

让气体或气体混合物通过发酵培养基鼓泡，直至观察到Eh值。这些实验在25℃下和保持恒定的所示培养基的pH下进行。

下表1汇报了在基本培养基上获得的氧化还原电位(Eh)值。

表1

	氮	氮/氢	氢
				无菌培养基	+250mV(pH＝4.13 )	-200mV(pH＝4.14)	-300mV(pH＝5)
接种的培养基(*)	+100至+70mV(pH＝5)	-100mV(pH＝5)	-300mV(pH＝5)

(*)酿酒酵母CBS 8066菌株

作为其的一部分，表2显示了在葡萄汁培养基上获得的氧化还原电位(Eh)值。

表2

	氮	氮/氢	氢
				无菌葡萄汁	+300mV(pH＝3.01)	-100mV(pH＝3.04)	-200mV(pH＝3.02)
接种的葡萄汁(**)	+100至+300mV(pH＝3)	-100mV(pH＝3)	-200mV(pH＝3)

(**)酿酒酵母RC 212菌株

通过比较，无菌葡萄汁培养基在常规条件下(不存在本发明的气体流)的电位是400mV。

II-本发明还原条件对发酵代谢流的影响

实施例1：基本培养基上的研究

使用在无机培养基上发育的酿酒酵母CBS 8066菌株，所说的无机培养基中限制葡萄糖并且补充有对应于第I段所示组成中的维生素和不饱和脂肪酸。将此酵母在30℃恒温和pH保持在5的厌氧条件下连续培养。稀释率D(进料速率与液体体积之比)范围为0.05h^-1至0.3h^-1。

使用不同气体应用三种Eh值，即100mV，-100mV和-300mV。

通过定量分析代谢流的分布来研究发酵过程中代谢流的修饰：

所观察的结果汇报在图1中，其显示了上述三种Eh条件下以D＝0.1h^-1时乙醇和甘油的量(以g/l计)。在还原培养基中，碳流朝着以减少乙醇为代价生产甘油的方向偏离。

在监测代谢物-底物化学计量的过程中所得的结果示于表3中。

根据此表所示的结果，观察到在还原条件(氢气和氢/氮混合物)下，甘油的合成比氧化条件(氮条件下)下增加，此是以乙醇的大大减少为代价的。在这些条件下，当从在氮条件下的发酵向在氢条件下的发酵转变时，甘油/乙醇比加倍。

实施例2：葡萄汁培养基上的研究

使用酿酒酵母RC 212酿酒用菌株。发酵在含约165g/l可发酵糖的葡萄汁培养基上并且温度保持在25℃下分批式进行145小时。这是一种工业用培养基，其中物理化学性能和营养物的浓度不同于无机培养基。此培养基能够再现高浓度糖时的现象并且具有由平衡的葡萄糖-果糖混合物组成的底物。本实验还可以控制分批培养中的此现象。

使用以下四种反应器测试四种氧化还原电位(Eh)条件：

-没有气体鼓泡的反应器(图2a和3a)

-具有氮鼓泡的反应器(图2b和3b)

-具有氮/氢鼓泡的反应器(图2c和3c)

-具有氢鼓泡的反应器(图[原文如此]和3d)。

监测整个时间内生物质，pH，Eh的变化，乙醇和甘油的产生以及残余糖的量。

所示的结果相当于3次重复的平均值。

它们在图2a至2d对乙醇作举例说明并且在图3a至3d中对甘油作举例说明。

由于未发酵葡萄汁中糖的浓度是不定的(150-350g/l汁，取决于葡萄品种)，所得的结果应当考虑形成的乙醇/可发酵的糖(以mol/mol计)和所形成的甘油/可发酵的糖(以mol/mol计)比，而且还考虑甘油/乙醇比来解释。

正如对恒化器中的基本培养基的研究一样，代谢物-底物化学计量分析证实，当处于还原条件下时有利于以减少乙醇为代价来产生甘油这种途径。

这些结果显示，在葡萄酒制作的应用中，可以产生具有低乙醇百分比含量的发酵饮料，同时保持(或同时增加)甘油的产生，甘油在葡萄酒的稠度和丰富度(fullness)中起作用。

下表3给出了在监测以下情形的代谢物-底物化学计量过程中获得的结果：

(1)在恒化器中以D＝0.1h^-1对基本培养基(23g/l葡萄糖)的发酵：实施例1，

(2)对葡萄汁(165g/l可发酵糖)的分批式发酵(在100小时)：实施例2。

所汇报的产率对应于图2a-2d和3a-3d中回归线的方向系数(direction coefficients)：

图2a：  y＝1.79x-105.00；产率＝94％

图2b：  y＝1.29x-23.47；产率＝93％

图2c：  y＝0.91x-45.92；产率＝96％

图2d：  y＝0.85x-72.42；产率＝88％

图3a：  y＝0.06x-3.51；产率＝98％

图3b：  y＝0.10x-6.92；产率＝95％

图3c：  y＝0.09x-4.46；产率＝93％

图3d：  y＝0.11x-8.08；产率＝94％

为了比较，此表显示了现有技术中Michnick等，1997(Yeast，vol.13，783-793)和Oura，1977(Process Biochemistry，vol.4，19-35)报道的值，第二个参照对应于5名不同作者的汇总。

表3

对照：没有氧化还原的修饰(a)和(b)：常规条件(没有氧化还原修饰)和分批式培养的对照

实施例3：香槟酒培养基上的研究

使用酵母属的酿酒发酵剂酵母菌株。此培养基由基本葡萄酒(basic wine)组成，其中所说的葡萄酒中补充有富含糖的高酒度蒸馏酒(liquor)。

使用以下四种装瓶(bottling)测试四种Eh条件：

-没有气体鼓泡的装瓶

-具有氮鼓泡的装瓶

-具有氮/氢鼓泡的装瓶

-具有氢鼓泡的装瓶

监测整个时间(6周)内Eh变化，乙醇和甘油的产生，酵母细胞的生存力，压力变化以及残余糖(葡萄糖+果糖)的量。

监测用于评价后发酵的决定性参数：

这实际上包括测定乙醇的产量、压力的变化并且计算所得乙醇(alcohol)的百分比含量。

根据图4、5和6所示的曲线，观察到在3周之后，在瓶子中获得了12.5％，与所测试的Eh条件无关。根据法规，此值对任何香槟酒制造来说是必需的。

监测辅助性参数：

这包括测定Eh以及甘油和残余糖的量。

参看图7，测定整个6周内的Eh，可以作出的结论是在整个时间内瓶子中的所述值得以保持。

关于残余糖的量，根据图8的曲线，取决于所测试的Eh条件，糖被酵母所消耗的方式是不相同的。被放在还原条件下的菌株消耗可发酵糖比在氧化环境下的要更快。

最后，参看图9，可以看出甘油的产量基本上没有被所施用的不同条件所改变。

此研究显示了在瓶子中发酵的过程中，由于使用不同还原条件而产生的Eh修饰而使产品的物理化学的变化。

III- 本发明还原条件对贮藏糖含量的影响

实施例4：基本培养基上的研究

将酿酒酵母CBS 8066在葡萄糖限制的无机培养基上于30℃并且同时以300rpm(转每分钟)搅拌分批式生长，所说的培养基的组成对应于I中所给出的组成。

测试两种Eh条件：

-处于氮鼓泡条件下的反应器

-处于氢鼓泡条件下的反应器

生长进行14小时，随后收集样品，以便按照Parrou和Francois，1997(Analytical Biochemistry，vol.248，186-188)中设立的方案进行海藻糖和糖原分析。

所示结果相当于2次分析的平均值。

图10中所汇报的酵母细胞内贮藏糖的积累的定量分析显示，在本发明的还原条件的存在下，菌株比在处于氧化条件下时更大量地合成了贮藏低聚糖，这是由于物理化学环境的修饰所导致的。

实施例5：葡萄汁培养基上的研究

使用酿酒酵母RC 212酿酒用菌株。发酵在含约165g/l可发酵糖的葡萄汁培养基上并且温度保持在25℃下分批式进行145小时。

使用以下四种反应器测试四种Eh条件：

-没有气体鼓泡的反应器

-具有氮鼓泡的反应器

-具有氮/氢鼓泡(本发明的条件)的反应器

-具有氢鼓泡(本发明的条件)的反应器。

128小时乙醇发酵(这时差不多所有的(约99.9％)可发酵糖被消耗)后，收集细胞以作海藻糖和糖原的分析。

测定整个时间内细胞对亚甲基蓝的生存力。然后，将收集的样品在4℃下储存，无任何特别的预防措施，除了将一部分细胞放到生理盐水中并且将另一部分放到从中收集它们的葡萄酒培养基中。监测整个时间内的生存力。

- 海藻糖和糖原的分析：

所示的结果相对于2次重复的平均值。

从图11所示的定量分析中，可以注意到，当处于本发明的还原条件下酵母比处于氧化条件下时积累了更多的贮藏糖。

据观察，在放置于氮条件下的培养基上的这种积累是最佳的，氮是非还原性气体，但与不存在气体(氮)时所具有的值相比，其导致了培养基氧化还原电位的降低。

- 监测整个时间内的生存力：

根据图12和13给出的曲线，非常有利的是注意到对从放置在氮/氢条件下的反应器所得的细胞来说，生存力是最佳的。在此情形中，相对于这种混合物的Eh值对于允许酵母细胞在整个时间内更好地贮藏来说看来是最佳的。

Claims (37)

1.培养微生物的方法，该方法可以降低培养基的氧化-还原电位，其特征在于所说的培养在通过含有氢和/或氮的、与空气相比具有还原性的气体所获得的还原条件下进行。

2.培养微生物的方法，该方法可以修饰所说培养过程中的代谢流，其特征在于所说的微生物的培养在通过含有氢和/或氮的、与空气相比具有还原性的气体所获得的还原条件下进行。

3.权利要求1和2任一项的方法，其特征在于它由使用酵母的发酵组成。

4.权利要求3的方法，其特征在于它用于通过使用酵母在敞口容器中、特别是大桶中发酵来生产具有降低的乙醇百分比含量的不充气饮料，特别是用于生产葡萄酒基饮料和蒸馏酒精饮料。

5.权利要求4的方法，其特征在于所产生的甘油的量增加并且所产生的乙醇的量减少。

6.权利要求5的方法，其特征在于在还原条件下甘油/乙醇比增加到1.5-5倍，优选2-4倍。

7.权利要求3的方法，其特征在于它用于通过使用酵母在密闭容器中、特别是瓶或桶中发酵来生产充气含醇饮料，特别是用于生产半发泡葡萄酒类、发泡葡萄酒类、香槟酒类、苹果酒类和啤酒类。

8.权利要求2或3的方法，其特征在于它用于增加所说的培养过程中所产生的贮藏糖的量，特别是海藻糖和糖原的量。

9.权利要求8的方法，其特征在于它用于生产酵素，特别是面包制作用的发酵剂，食用酵母和酵母提取物。

10.前述权利要求任一项的方法，其特征在于微生物的培养是在氢气下进行的。

11.权利要求1-9任一项的方法，其特征在于微生物的培养是在氮气下进行的。

12.权利要求1-9任一项的方法，其特征在于微生物的培养是在由氢和氮的混合物组成的气体下进行的。

13.权利要求1-9任一项的方法，其特征在于微生物的培养是在与空气相比具有还原性的气体下进行的，所说的具有还原性的气体含有氢和/或氮及从所述培养的观点可接受的补充气体。

14.权利要求13的方法，其特征在于所述气体含有至少0.5％体积的氢和/或氮，优选3-50％体积的氢和/或氮。

15.权利要求13和14任一项的方法，其特征在于还原性气体的含氢量小于5％体积。

16.权利要求13-15任一项的方法，其特征在于补充气体选自惰性气体，特别是氩、氦，以及氧、二氧化碳和一氧化二氮及这些气体的按任何比例的混合物，优选选自二氧化碳和氧及其混合物。

17.权利要求13-16任一项的方法，其特征在于微生物的培养是在含有氢和二氧化碳的气体下进行的。

18.权利要求3的方法，其特征在于所述酵母是酵母属(Saccharomyces)的酵母。

19.含有氢和/或氮的与空气相比具有还原性的气体用于降低培养微生物用培养基的氧化-还原电位的用途。

20.权利要求19的用途，用于修饰微生物培养过程中的代谢流。

21.权利要求19和20任一项的用途，用在使用酵母的发酵工艺中。

22.权利要求19-21任一项的用途，用于通过使用酵母在敞口容器中、特别是大桶中发酵来生产具有降低的乙醇百分比含量的不充气饮料，特别是用于生产葡萄酒基饮料和蒸馏酒精饮料。

23.权利要求19-21任一项的用途，用于增加所产生的甘油的量和减少所产生的乙醇的量。

24.权利要求23的用途，用于获得在还原条件下增加到1.5-5倍，优选2-4倍的甘油/乙醇比。

25.权利要求19-21任一项的用途，用于通过使用酵母在密闭容器中、特别是瓶或桶中发酵来生产充气含醇饮料，特别是用于生产半发泡葡萄酒类、发泡葡萄酒类、香槟酒类、苹果酒类和啤酒类。

26.权利要求19-21任一项的用途，用于增加所说培养过程中所产生的贮藏糖的量，特别是海藻糖和糖原的量。

27.权利要求19-21和26任一项的用途，用于生产酵素，特别是面包制作用的发酵剂，食用酵母和酵母提取物。

28.权利要求19-27任一项的用途，其特征在于还原性气体由氢组成。

29.权利要求19-27任一项的用途，其特征在于还原性气体由氮组成。

30.权利要求19-27任一项的用途，其特征在于还原性气体由氢和氮的混合物组成。

31.权利要求19-27任一项的用途，其特征在于与空气相比具有还原性的气体含有氢和/或氮及从微生物培养的观点可接受的补充气体。

32.权利要求31的用途，其特征在于还原性气体含有至少0.5％体积的氢和/或氮，优选3-50％体积的氢和/或氮。

33.权利要求31和33任一项的用途，其特征在于还原性气体的含氢量小于5％体积。

34.权利要求31-33任一项的用途，其特征在于补充气体选自惰性气体，特别是氩、氦，以及氧、二氧化碳和一氧化二氮及这些气体的按任何比例的混合物，优选选自二氧化碳和氧及其混合物。

35.权利要求31-34任一项的用途，其特征在于还原性气体含有氢和二氧化碳。

36.通过权利要求1、2、3和8-18任一项的方法获得的酵素，特别是面包制作用发酵剂，食用酵母和酵母提取物。

37.通过权利要求1-8和10-18任一项的方法获得的具有降低的乙醇百分比含量的不充气饮料，特别是葡萄酒基饮料和蒸馏酒精饮料，充气含醇饮料，特别是半发泡葡萄酒类、发泡葡萄酒类、香槟酒类、啤酒类和苹果酒类。

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