CN1297655C

CN1297655C - 木糖葡萄球菌i2菌株和以该菌株制成的复合发酵剂及该发酵剂在肉食品中的应用

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Publication number: CN1297655C
Application number: CNB031262260A
Authority: CN
Inventors: 王玉芬; 李红伟; 赵建生; 张春晖; 王永林; 马相杰; 王爱枝; 李彦军; 孟少华; 冯月荣
Original assignee: Henan Shuanghui Investment and Development Co Ltd
Current assignee: Henan Shuanghui Investment and Development Co Ltd
Priority date: 2003-06-26
Filing date: 2003-06-26
Publication date: 2007-01-31
Anticipated expiration: 2023-06-26
Also published as: CN1566323A

Abstract

本发明涉及一种木糖葡萄球菌I2菌株，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.0919。将戊糖片球菌I9和木糖葡萄球菌I2分别在改良MRS培养基中培养至对数生长晚期后，再按照1∶1的体积比混合即可制得复合发酵剂，该发酵剂可用在肉食品如发酵香肠的生产过程中。本发明的复合发酵剂发酵风味浓郁，不产生异味，产生生物胺的量很小，发色效果良好，提高了产品的风味品质。用在发酵香肠中时发酵力适中，发酵进程平缓，酸味柔和，产品成熟后发酵香气浓郁，发色好，产品切片性良好。

Description

木糖葡萄球菌I2菌株和以该菌株制成的复合发酵剂该发酵剂在肉食品中的应用

技术领域

本发明涉及一种木糖葡萄球菌和用其制成的发酵剂及该发酵剂在肉食品中的应用。

技术背景

发酵香肠最初是由古罗马人发明的一种发酵肉制品，目前已经形成多种类型和多种风格。发酵香肠在加工过程中经过微生物发酵作用，将糖转化为各种酸和醇，使香肠的pH值降低；将脂肪和蛋白降解成醛和酮，使香肠具有良好的发酵风味；并经干燥脱水使Aw下降。因此，发酵香肠具有独特的风味品质，并具有较长的货架期。发酵肉制品的发酵方式主要有非接种发酵法和接种发酵法两种。其中非接种发酵易受杂菌感染，发酵启动慢，发酵周期长；而接种发酵法就是通过接种优良的肉制品发酵菌种进行工业化生产。接种发酵缩短了发酵周期，提高了产品质量的稳定性，有利于工艺控制。虽然发酵香肠品种繁多，工艺各不相同，但接种发酵已经成为目前生产使用的主要方法，因此，筛选优良肉制品发酵微生物是接种发酵的基础，而乳酸菌、微球菌和非致病性葡萄球菌是接种发酵最常使用的菌种。

目前，发达国家肉制品深加工比例高达30％以上，其中发酵肉制品占据重要地位。当今的欧美国家，通过对微生物发酵肉制品的特性进行了较为深入的研究，已经完成了从传统的自然发酵向微生物定向接种发酵的工业化生产的转变，发酵肉制品的生产已具备相当成熟的生产工艺。目前，国外发酵肉制品主要研究内容之一是加强了优良微生物发酵菌种的选育工作。通过对传统发酵肉制品中发酵微生物的纯种分离培养技术和微生物育种技术，筛选和构建具有优良性状的微生物发酵剂菌种。

1940年，美国人L.B.Jenson在专利中第一次描述了乳酸菌在发酵香肠中的应用，从而开始了使用纯培养的微生物发酵剂生产发酵香肠的第一步；1961年Deibel等发现片球菌可用作制作半干香肠发酵剂的菌种；1974年Everson等申请了植物乳杆菌的专利，与此同时，其他菌株如微球菌、链球菌以及乳酸菌与其他混合菌种发酵剂的研究与应用也有所发展。目前应用于肉制品上的发酵剂主要包括细菌、酵母和霉菌等。

我国地域广阔，生态条件复杂，生产实践表明，在我国传统肉制品主产区广泛存在着优良的自然菌株，但由于分离筛选较为困难和对优良菌种在生产中重要性的认识程度不够，使我国发酵肉制品乳酸菌资源研究与利用至今仍很薄弱。为此，我们系统地对我国的发酵肉制品微生物资源进行考查，希望从中优选出适合生产要求的菌株。

发明内容

本发明的目的是提供一种木糖葡萄球菌I2菌株。

本发明的目的还在于提供一种以木糖葡萄球菌I2和戊糖片球菌I9制成的复合发酵剂及该发酵剂在肉食品中的应用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：木糖葡萄球菌I2(Staphylococcus xylosus)菌株，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.0919。

一种复合发酵剂，它是将戊糖片球菌I9和木糖葡萄球菌I2分别在改良MRS培养基中培养至对数生长晚期后，再按照1∶1的体积比混合制得的发酵剂，其中戊糖片球菌I9在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.0918，木糖葡萄球菌I2在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.0919；

所述改良MRS培养基的配制过程如下：

首先按下述每升单元组成配制培养液：

蛋白胨 10g 酵母粉 5g 牛肉膏 10g

MgSO₄·7H₂O 0.58g MnSO₄·4H₂O 0.25g K₂HPO₄2g

柠檬酸二铵 2g 乙酸钠 5g 葡萄糖 20g

Tween80 1mL 盐酸半胱氨酸 0.5g 番茄汁 10～20％v/v

然后将按上述比例配好的培养液调pH至6.2-6.4，115℃湿热灭菌30min。

将戊糖片球菌I9和木糖葡萄球菌I2在改良MRS培养基中培养时，改良MRS培养基为28～32℃静止状态。

在发酵肉食品生产过程中接种上述发酵剂。

在发酵香肠生产过程中灌肠前接种重量比为0.5～1％的发酵剂，在温度20℃、相对湿度95％发酵至pH5.0；在温度15℃、相对湿度90％继续发酵至pH4.6。

采用上述技术方案后，本发酵剂在发酵适应性方面具有优良特性：

(1)耐盐性

氯化钠在发酵香肠中的添加量通常为2.5～3.0％，而在某些类型发酵香肠，如意大利Salami中的添加量会更高一些，故筛选菌株必须有良好的食盐耐受性，要求能够在至少3.0％的食盐浓度下能正常生长。经试验本发酵剂能耐受5.0％的食盐溶液。

(2)耐NaNO₂或NaNO₃

发酵香肠(干发酵香肠除外)一般添加亚硝酸盐，添加浓度可达到150mg/Kg；而干发酵香肠通常加入硝酸盐，添加量200～600mg/Kg，甚至更高一些。但在加工过程中，起发色和抑菌作用的主要是亚硝酸钠，一般要求菌种至少在50mg/Kg的亚硝酸盐浓度下能良好的生长。经试验本发酵剂在80～100mg/Kg浓度条件下的亚硝酸盐溶液中仍能生长。

同时，本发酵剂发酵风味浓郁，不产生异味，产生生物胺的量很小，发色效果良好，提高了产品的风味品质。本发酵剂能在27～43℃范围内生长，最适温度为32℃，在57～60℃范围内灭活。本发明的发酵剂用在发酵香肠中时发酵力适中，发酵进程平缓，酸味柔和，产品成熟后发酵香气浓郁，发色好，产品切片性良好。

附图说明

图1为戊糖片球菌I9在MRS—琼脂培养基(+5％ CaCO₃)上产酸情况观察图；

图2为戊糖片球菌I9菌体形态特征观察图；

图3为木糖葡萄球菌I2在MRS—琼脂培养基(+5％ CaCO₃)上产酸情况观察图；

图4为木糖葡萄球菌I2菌体形态特征观察图；

图5为戊糖片球菌I9和木糖葡萄球菌I2菌株的分离流程图；

图6为不同菌株发酵香肠中组胺生成量的对比图；

图7为不同菌株发酵香肠中腐胺和尸胺生成量的对比图。

本发明提供的木糖葡萄球菌I2菌株，已于2003年4月8日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No.0919。

具体实施方式

将戊糖片球菌I9和木糖葡萄球菌I2分别在改良MRS培养基中培养至对数生长晚期后，再按照1∶1的体积比混合即可制得本发明的复合发酵剂，其中戊糖片球菌I9在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.0918，木糖葡萄球菌I2在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.0919。

所述改良MRS培养基可按如下比例配制：

首先按下述配方配制培养液：(单位/L)

蛋白胨 10g 酵母粉 5g 牛肉膏 10g

MgSO₄·7H₂O 0.58g MnSO₄·4H₂O 0.25g K₂HPO₄ 2g

柠檬酸二铵 2g 乙酸钠 5g 葡萄糖 20g

Tween80 1mL 盐酸半胱氨酸 0.5g 番茄汁 10％(v/v)

然后将按上述比例配好的培养液调pH至6.4，115℃湿热灭菌30min。戊糖片球菌I9和木糖葡萄球菌I2在改良MRS培养基中培养时，改良MRS培养基为30℃静止状态。

在配制上述改良MRS培养基时，番茄汁也可按15％(v/v)的比例配制，并将按此比例配制的培养液调PH至6.3，115℃湿热灭菌30min。戊糖片球菌I9和木糖葡萄球菌I2在改良MRS培养基中培养时，改良MRS培养基为28℃静止状态。

在配制上述改良MRS培养基时，番茄汁还可按20％(v/v)的比例配制，并将按此比例配制的培养液调PH至6.2，115℃湿热灭菌30min。戊糖片球菌I9和木糖葡萄球菌I2在改良MRS培养基中培养时，改良MRS培养基为32℃静止状态。

1、本发明中发酵香肠细菌菌种筛选标准

1.1安全性

作为发酵香肠细菌菌种，必须对人体无害，具体内容包括：①必须是革兰氏阳性菌，无致病性，不得产生细菌毒素(尤其在葡萄球菌的筛选中)；②不产生生物胺。某些细菌有降解蛋白质和氨基酸的能力，降解过程中的某些代谢产物对人体有一定的危害。其中，有些细菌具有氨基酸脱羧能力，能够代谢氨基酸生成生物胺，生物胺(尤其是组胺)在发酵食品中含量过高时，人食用后可能会引起过敏性反应；③不产生氨基甲酸乙酯(EC)。EC是自然发酵食品中一种常见的致癌物质，它主要是由某些LAB代谢精氨酸产生的，通过优良菌株的筛选能够克服这一问题。

1.2发酵适应性

(1)耐盐性

氯化钠在发酵香肠中的添加量通常为2.5～3.0％^[1]，而在某些类型发酵香肠，如意大利Salami，中的添加量会更高一些，故筛选菌株必须有良好的食盐耐受性，要求能够在至少3.0％^[1]的食盐浓度下能正常生长。

(2)耐NaNO₂或NaNO₃

发酵香肠(干发酵香肠除外)一般添加亚硝酸盐，添加浓度可达到150mg/Kg；而干发酵香肠通常加入硝酸盐，添加量200～600mg/Kg，甚至更高一些。但在加工过程中，起发色和抑菌作用的主要是亚硝酸钠，一般要求菌种至少在50mg/Kg的亚硝酸盐浓度下能良好的生长。

(3)产酸特性

发酵香肠在常温下之所以有一个较长的货架期，是因为它自身固有的“二低一高”，低pH值、低水分及高的含盐量。这就要求LAB能快速发酵葡萄糖或蔗糖产酸，这是决定发酵成功与否及发酵食品安全性的一个重要工艺条件。这项标准主要针对LAB中的杆菌和部分球菌。对于产酸速度比较缓慢的菌种，要求在3d内能使发酵香肠的pH值降至5.1±0.1；而对于产酸速度快的菌株，能在40h左右把发酵香肠的pH值降至5.0以下。

1.3发酵特性

优良发酵香肠横切面组织结构致密细腻，色泽呈可人的玫瑰红色，中间脂肪乳白色或淡黄色，这些表观现象均与微生物的发酵特性有关。

(1)有NO₂ ^-和NO₃ ^-还原能力

肉制品的发色机理是硝酸盐在还原细菌的作用下，还原成亚硝酸盐，随后与肉中乳酸发生反应形成亚硝酸，后者分解产生氧化氮(NO)，NO与肌红蛋白或血红蛋白结合生成亚硝基肌(血)红蛋白，使肉具有鲜艳的玫瑰红色。由此发色机理来看，所选菌株必须具有良好的硝酸盐还原能力。但从现代发酵香肠加工工艺来讲，非干燥发酵香肠(最终a_w在0.94～0.96之间)和半干发酵香肠(最终a_w在0.90～0.95之间)的发酵成熟期短，主要添加亚硝酸盐及发色助剂抗坏血酸钠，对添加菌种硝酸盐还原能力的要求不太严格；而干发酵香肠，兼顾发色和风味两方面因素，主要添加硝酸盐，这就要求所选菌株具有良好的硝酸盐还原能力。

(2)接触酶试验阳性

亚硝基肌红蛋白或亚硝基血红蛋白的生成是香肠发色的主要原因，但发酵成熟过程中微生物可能形成的H₂O₂会导致香肠颜色变灰发暗。H₂O₂酶阳性菌株能产生H₂O₂还原酶，把生成的H₂O₂分解成H₂O和O₂。因此，如果使用单菌种发酵，此菌必须为接触酶阳性菌株；若为复配菌种发酵，那么其中必须有接触酶阳性菌株存在。

(3)发酵过程中不得有大量气体产生，不得有粘液生成

在发酵过程中，如乳酸菌异型发酵菌株，产生大量CO₂，会影响到香肠的结构致密性；而且某些菌类的代谢产物中有粘液状物质，同样也会损坏香肠的内部组织状态。在菌株的筛选中，这些标准必须考虑。

(4)所选菌种在其生长代谢过程中能使香肠产生良好的发酵风味

发酵香肠的风味组成非常复杂，它包括挥发性成分和非挥发性成分。从目前的研究来看，发酵香肠的风味形成涉及到脂肪、蛋白质的降解和氨基酸的异化等。微球菌和葡萄球菌是风味物质形成的主要菌系，但有些LAB如片球菌属细菌也有类似特性。微球菌或葡萄球菌分泌脂肪酶，切裂大分子脂肪为短链或支链的脂肪酸；分泌蛋白酶，降解蛋白质成各种肽和氨基酸，氨基酸又进一步被其对应的酶类异化为各种醛或酮类风味物质。此外，在微生物代谢过程中还可能会产生具有不良气味的代谢产物，如H₂S。鉴于以上分析，筛选的微球菌或葡萄球菌的应具有以下特征：①能降解脂肪；②能分解蛋白质；③能异化氨基酸；④不产生影响风味的不良物质。

1.4具有抗冷冻干燥特性

肉制品发酵剂生产一般采用真空冷冻干燥法，因此要求优选菌株必须有较强地抗冷冻干燥能力。主要表现在：①在最佳培养条件下具有较大生物量(菌密度＞10⁹cfu/ml)；②冻干后具有较高的存活率。虽然影响存活率的因素很多(保护剂、冻干工艺等)，但不同菌株间抗冷冻干燥的能力还是存在很大的差异；③冻干菌种的活力能够保持较长时间。一般要求冻干菌粉在存放一年后活菌数不低于10⁹cfu/g。

我国地域广阔，生态条件复杂，生产实践表明，在我国传统肉制品主产区广泛存在着优良的自然菌株，但由于分离筛选较为困难和对优良菌种在生产中重要性的认识程度不够，使我国发酵肉制品乳酸菌资源研究与利用至今仍很薄弱。为此，我们系统地对我国的发酵肉制品微生物资源进行考查，希望从中优选出适合生产要求的菌株。本研究通过对来自我国不同生态条件下的发酵肉制品中的乳酸菌进行筛选，得到一株适合单菌株发酵的乳酸菌。

2、戊糖片球菌I9和木糖葡萄球菌I2菌株的分离过程为：

本菌株分离培养基采用MRS-琼脂、改良MRS-琼脂、MSA-琼脂等固体培养基；活化采用MRS液体培养基。培养基配方如下(1L)：

(1)MRS培养基：酵母浸出物4g，牛肉膏8g，细菌蛋白胨10g，葡萄糖20g，柠檬酸钠2g，醋酸钠5g/L，KH₂PO₄ 2g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，MnSO₄·4H₂O 0.05g，Tween80 1mL，用400mL蒸馏水溶解。另外，用500mL蒸馏水溶解20g琼脂，在沸水浴中完全溶解后，加入上述溶液，定容至1000mL，用1M的NaOH或1M HCl调整pH至5.0。121℃灭菌15min。

(2)改良MRS培养基配方：蛋白胨10g；酵母粉5g；MgSO₄·7H₂O0.58g；MnSO₄·4H₂O0.25g；牛肉膏10g；K₂HPO₄2g；柠檬酸二铵2g；乙酸钠5g；葡萄糖20g；Tween801mL；番茄汁10％(v/v)；盐酸半胱氨酸0.5g/L；调pH至6.2-6.4，115℃湿热灭菌30min。

(3)MSA培养基：牛肉膏1g，细菌蛋白胨10g，D-甘露醇10g，NaCI 75g，酚红0.025g，用400mL蒸馏水溶解(酚红除外)，用1M HCl或NaOH调pH至7.4±0.2；加1％的酚红溶液2.5ml，混匀；另外，用500mL蒸馏水溶解20g琼脂，在沸水浴中完全溶解后，加入上述溶液，定容至1000mL。121℃灭菌15min。

采用平板划线法对自然发酵肉制品(火腿和腊肠)中的乳酸细菌进行分离。取25g样品与225ml生理盐水于无菌均质袋中，用拍击式均质器Bagmixer均质120sec(腊肠)或210sec(火腿)。吸取0.1ml的酒样在分离培养基上划线，30℃条件下培养2d后观测菌落形成情况，经多次划线分离，直到获得纯菌落。分离流程如图3所示。

菌密度的测定采用平板计数法，计数结果并换算成菌落形成单位(cfu/mL)。每个培养试验均重复三次，结果取平均值。乳酸测定采用气相色谱法。pH值及总酸的测定按GB方法进行。生活力测定采用最大菌密度法。具有硝酸盐或亚硝酸盐还原能力按《工业微生物学实验技术》(杜连祥编著)进行。H₂O₂酶活性测定按《微生物学实验》(范秀蓉编著)进行操作。食盐耐受性的测定：把测试菌接种于pH4.5的MRS液体培养基，观察其生长状况；食盐耐受性的测定同乳酸耐受性的测定。是否有气体产生采用半固体软琼脂柱法；是否有黏液产生可直接从挑起菌落的状态进行观察。

采用PCR方法对分离株I9的16SrRNA基因进行扩增。PCR采用原核生物通用引物27f(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和1541R(5’-AAGGAGGTGATCCAGCC-3’)。PCR反应条件：反应混合物总体积为50ìl，内含2.5mM Mg²⁺，20mM Tris-HCl(pH9.0)，0.1％ Triton-100(v/v)，100ìM的dNTP，2.5UTaqDNA聚合酶，300ng的模板DNA，40pmol的引物，用25ìl矿物油覆盖并加盖。PCR反应进行前，DNA模板94℃变性5min，随后进行30个循环，每个循环包括94℃变性1min，52℃复性2min，72℃延伸3min，最后一个循环在72℃延伸2-3h。PCR反应在Thermolyne Amplitron I(Barnstead Thermolyne Corporation)中进行。

16SrRNA测序：

PCR产物电泳纯化后，联结在质粒pSK-T中，携带有16SrRNA的重组质粒转化E.coli DH5α中，然后在含氨卞青霉素Ap/IPTG/X-gal的平板上筛选白斑，用碱解法提取质粒，经酶切后用聚乙二醇纯化产物。16SrRNA的测序由中国科学院微生物研究所完成，用BLAST软件将测定序列与GenBank中的16SrRNA序列进行同源性分析比较。

主要实验仪器与设备：

手提式高压灭菌锅，101C型电热鼓风干燥箱，JA3003电子天平，DMB5-5数码显微镜，Ph/ORH酸度离子计，厌氧操作培养箱，YJ超净工作台，微量移液器(上海求精)，BS-2F振荡培养箱，pHB5型酸度计，超低温冰箱，Lyostar真空冷冻干燥机，GM-21低温高速离心机，BS-2F恒温培养箱，自动发酵室。

菌种鉴定：

个体形态特征、菌落形态特征、Gram染色、过氧化氢酶实验、对不同胁迫环境的耐受性以及其他生理生化特征的测定按凌代文主编的“乳酸细菌分类鉴定及实验方法”和Holt J G，Krieg N R and Snath P H A，et al.Bergey’s manualof determinative bacteriology(9^th edition).Batimore：Williams & Wilkins，1993两部参考文献的方法进行；菌种鉴定按Holt J G，Krieg N R and Snath P H A，et al.Bergey’s manual of determinative bacteriology(9^th edition).Batimore：Williams&Wilkins，1993进行。

结果与分析：

(1)、发酵微生物的分离结果

筛选优良肉制品发酵菌株，应根据菌种的发酵特性，结合产品特点对菌株进行筛选。优选菌株发酵特性研究的主要内容包括：①食盐耐受性(＞3％的食盐溶液)；②亚硝酸盐耐受性(在80-100mg/Kg浓度条件下仍能生长)；③能在27-43℃范围内生长，最适温度为30～32℃；④发酵副产物不产生异味；⑤无致病性；⑥产组胺量要小。

(2)、菌种分离

本实验从金华火腿、国外发酵火腿、国外肉制品发酵剂、从DSM C型和Yogurt type II型牛奶发酵剂等生境中共分离得到120余株乳酸菌，分离结果如下：

①从金华火腿中分离29株

以无菌操作取金华火腿适量，加灭菌生理盐水，均质，吸取上清液作梯度稀释，倾注平板培养。依据菌落特征，逐一挑取单菌落，以平板划线两次纯化，之后转接斜面，4℃保藏，备用。

②从国外发酵火腿中分离29株

③从国外肉制品发酵剂中分离12株

以无菌操作取发酵剂适量，加灭菌生理盐水梯度稀释，倾注平板培养。依据菌落特征，逐一挑取单菌落，以平板划线两次纯化，之后转接斜面，4℃保藏，备用。

④从DSM C型和Yogurt type II型牛奶发酵剂中分离共11株

以无菌操作取发酵剂适量，加灭菌生理盐水梯度稀释，倾注平板培养。依据菌落特征，逐一挑取单菌落，以平板划线二次纯化，之后转接斜面，4℃保藏，备用。

另外，从其他发酵肉制品样品中分离得到42株分离物。

(3)菌株鉴定：

戊糖片球菌I9的鉴定：

①形态学特征

固体培养特征在30℃条件下培养2d后，I9在MRS+5％CaCO₃固体培养基上形成明显的透明圈，表面光滑湿润(如图1所示)。

细胞形态特征I9菌株革兰氏染色阳性，经亚甲蓝单染色后与光学显微镜(1600×)下观察，细胞球状，四联或成片状排列，细胞直径约1μm(如图2所示)。

液体培养特征在无菌条件下，用接种针挑取1个菌落于澄清的MRS液体培养基中30℃静止培养，细菌在培养基中生长缓慢而均匀，达到最大浑浊度后，菌体逐渐沉淀到培养基的底部，菌体呈白色。

②生理生化特征

分离菌株I9的表型特征

鉴定项目	结果	鉴定项目	结果
鉴定项目	结果	鉴定项目	结果	过氧化氢酶石蕊牛奶从葡萄糖产酸类型从葡萄糖产酸、产气pH9.6条件下pH4.5条件下5％NaCl厌氧培养好氧培养45℃条件下10℃条件下	阴性产酸乳酸产酸但不产气-+-++-+	碳水化合物产酸：乳糖鼠李糖核糖麦芽糖蔗糖苦杏仁苷葡萄糖酸盐甘露醇蜜二糖甘露糖	++++++----

根据I9细菌表型特征和生理生化特点，按照Bergey’s细菌鉴定手册有关乳酸菌的鉴定标准，初步可以将I9归类为戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)。

③I9的16SrRNA测序分析

通过对分离菌株的16SrRNA序列(长度：1477bp)与GenBank基因库中所有已知序列进行了同源性比较，结果显示分离株I9与戊糖片球菌(P.pentosaceus)具有高度的同源性(99％)。这从分子系统学角度证实分离株I9为戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)，结果如下：

CATGCAAGTCGAACGAACTTCCGTTAATTGATTATGACGTACTT

GTACTGATTGAGATTTTAACACGAAGTGAGTGGCGAACGGGTG

AGTAACACGTGGGTAACCTGCCCAGAAGTAGGGGATAACACCT

GGAAACAGATGCTAATACCGTATAACAGAGAAAACCGCATGGT

TTTCTTTTAAAAGATGGCTCTGCTATCACTTCTGGATGGACCCG

CGGCGTATTAGCTAGTTGGTGAGGTAAAGGCTCACCAAGGCAG

TGATACGTAGCCGACCTGAGAGGGTAATCGGCCACATTGGGAC

TGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAA

TCTTCCACAATGGACGCAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGA

GTGAAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAGCTCTGTTGGTTAAGAAG

AACGTGGGTAAGAGAACTGGTTACCCAGTGACGGTATTTAACC

AGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACG

TAGGTGGCAAGCGTTATCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCG

CAGGCGGTCTTTTAAGTCTAATGTGAAAGCCTTCGGCTCAACCG

AAGAAGTGCATTGGAAACTGGGAGACTTGAGTGCAGAAGAGG

ACAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGG

AAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTGTCTGGTCTGCAACTGA

CGCTGAGGCTC

GAAAGCATGGGTAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCAT

GCCGTAAACGATGATTACTAAGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTC

AGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGTAATCCGCCTGGGGAGTACG

ACCGCAAGGTTGAAACTCAAAAGAATTGACGGGGGCCCGCAC

AAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCTACGCGAAGAAC

CTTACCAGGTCTTGACATCTTCTGACAGTCTAAGAGATTAGAGG

TTCCCTTCGGGGACAGAATGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTC

AGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGC

AACCCTTATTACTAGTTGCCAGCATTAAGTTGGGCACTCTAGTG

AGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCA

AATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAAT

GGATGGTACAACGAGTCGCGAGACCGCGAGGTTAAGCTAATCT

CTTAAAACCATTCTCAGTTCGGACTGTAGGCTGCAACTCGCCTA

CACGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCG

GTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCAT

GAGAGTTTGTAACACCCAAAGCCGGTGGGGTAACCTTTTAGGA

GCTAGCCGTCTAAGGTGGGACAGATGATTAGGGTGAAGTC

木糖葡萄球菌I2的鉴定：

①形态学特征

固体培养特征在30℃条件下培养48后，形成圆形、凸起、白色菌落，菌落直径约1mm，I2在MRS+5％CaCO₃固体培养基上不形成明显的透明圈，表面光滑湿润(如图3所示)。

细胞形态特征I2菌株革兰氏染色阳性，经亚甲蓝单染色后与光学显微镜(1600×)下观察，细胞球状，细胞直径约1μm，成对或四联排列(如图4所示)。

②I2生理生化特征

分离菌株I2的表型特征

鉴定项目	结果	鉴定项目	结果
鉴定项目	结果	鉴定项目	结果	接触酶氧化酶从葡萄糖产酸类型从葡萄糖产酸、产气pH9.6条件下pH4.5条件下NO₃ ^-厌氧培养好氧培养45℃条件下10℃条件下18％NaCl	阳性阴性乳酸产酸很少，不产气++-++-++	碳水化合物产酸：纤维二糖果糖半乳糖乳糖麦芽糖甘露醇棉籽糖蔗糖木糖甘露糖蜜二糖	--+w-++w+w++++

根据I2细菌表型特征和生理生化特点，按照Bergey’s细菌鉴定手册有关乳酸菌的鉴定标准，初步可以将I2归类为木糖葡萄球菌(Staphylococcusxylosus)。

③I2的16SrRNA测序分析

通过对分离菌株的16SrRNA序列(长度：1477bp)与GenBank基因库中所有已知序列进行了同源性比较，结果显示分离株I2与木糖葡萄球菌(Staphylococcus xylosus)具有高度的同源性(99％)。这从分子系统学角度证实分离株I2为木糖葡萄球菌，结果如下：

GGCCTTCCGATACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCCAATCATTTGTCCC

ACCTTCGACGGCTAGCTCCATAAATGGTTACTCCACCGGCTTCGGGTGTT

ACAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGACCCGGGAACGTA

TTCACCGTAGCATGCTGATCTACGATTACTAGCGATTCCAGCTTCATGTAG

TCGAGTTGCAGACTACAATCCGAACTGAGAACAACTTTATGGGATTTGCA

TGACCTCGCGGTTTAGCTGCCCTTTGTATTGTCCATTGTAGCACGTGTGTA

GCCCAAATCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCC

GGTTTGTCACCGGCAGTCAACCTAGAGTGCCCAACTTAATGATGGCAACT

AAGCTTAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGAC

ACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCACTTTGTCCCCCGAAGGG

GGAAGGCTCTATCTCTAGGAGTTTTCAAAGGGATGTCAAGATTTGGTAAG

GGTCTTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGGCTTGGGCG

GGTCCCCGNCAATTCCTTTTGAGGTTTCAACTTTNNCGGGCCGTANCTCC

CCAAGGCCGGAGTGCTTAAATGCGTTTAGCTGCCACACTTAAGGGGGCG

GGAAAACCCCTTACACTTACACTTNAATCGTTA

NCGGGNGNGGACTCCCNAGGGNATCTAANTCCTTTNTTGGATCCCCACG

CTTTTCCACANTAANNGNTANTTACAGGACNANAAAGGNNCCTTCCCC

CCNGGGGGNTCCTCCANATTTTTTGNNNATTTNACCGCTCCCAATGGAA

NTCNCNTTTNNTTTTTTNCCTTAAANTTTTCNGGTTCNAANACCCTTTCC

CNGTTNACCNGNGNNTTTTNTTTNNNNTTNNNTNANCNNCCCCCCCCCC

CCCT

在发酵肉食品生产过程中可接种本发明的复合发酵剂。如在发酵香肠的生产过程中，在灌肠前接种重量比为0.5％的发酵剂，在温度20℃、相对湿度95％发酵至pH5.0；在温度15℃、相对湿度90％继续发酵至pH4.6，发酵后在温度14℃，相对湿度70％～80％下进行成熟。本发明的复合发酵剂发酵力适中，发酵进程平缓，酸味柔和，产品成熟后发酵香气浓郁，发色好，产品切片性良好。

在发酵香肠的生产过程中，也可按0.8％、1％或0.5％～1％之间的任意比例接种发酵剂。

以下通过不同发酵剂在发酵香肠生产过程中的使用对比对本发明的复合发酵剂使用效果进行详细说明：

在发酵食品如发酵香肠、酸奶、泡菜及葡萄酒中，大都含有生物胺。胺在生活细胞中具有重要的生理功能，但当人体吸收过量时，可能会引起头痛、呼吸紊乱、心悸、血压变化等过敏性反应。此外，生物胺还是亚硝胺的前体，后者具有致癌效应。Vandekerckhove(1977)曾报道在老化的和霉菌成熟型的发酵香肠中，生物胺的含量可达100mg/Kg，有时甚至高达1000mg/Kg，因此，近年来，发酵食品中的生物胺含量问题已引起了人们的重视。

发酵香肠中生物胺是由氨基酸脱羧而产生的。其生成量取决于原料肉组织酶和微生物酶活力以及生物胺前体物(氨基酸、寡肽)的丰度。通过采用优质的新鲜生肉、适当的发酵剂和合理的发酵工艺，可以降低产品中的生物胺产量。其中，发酵剂菌种的相关氨基酸脱羧酶活性直接影响着产品中生物胺的含量，因为生产发酵香肠所使用的乳酸菌如乳杆菌、片球菌和微球菌等的大多数菌株具有对相关氨基酸脱羧能力，因而能够在发酵过程中产生生物胺。通过筛选氨基酸脱羧酶活性低或无脱羧酶活性的突变株对于降低发酵香肠中的生物胺含量具有重要的意义。

1材料与方法

1.1菌种

供试菌种：戊糖片球菌I9(Pediococcus pentosaceus I9)、米酒乳杆菌54(Lactobacillus sake 54)、戊糖乳杆菌R1(Lactobacillus pentosus R1)、小片球菌M7(Pediococcus parvus M7)和木糖葡萄球菌I2(Staphylococcus xylosus I2)。以上试验菌株是于2001-2002年通过对湖南、浙江和四川等发酵肉制品主产区的自然发酵肉制品(火腿、香肠和腊肉)中分离得到的120余株微生物中筛选而得到的，菌种的鉴定由中国科学院微生物研究所完成。

商业发酵剂：德国CHR.HANSEN公司Bactoferm^TM F-1肉制品发酵剂(冷冻干燥菌粉)。

1.2工艺流程

发酵香肠工艺流程：切肉、斩拌、混合后接种发酵剂(10⁷个/g)，之后灌肠和发酵(温度20℃、相对湿度95％发酵至pH5.0；温度15℃、相对湿度90％继续发酵至pH4.6；)，最后进行成熟(温度4℃，相对湿度为70％-80％)。不添加香辛料。

1.3生物胺的测定

生物胺(组胺、尸胺、腐胺、酪胺、亚精胺、精胺和色胺)的测定采用反相离子对柱后衍生法。

高效液相色谱仪：日本岛津LC10A型；色谱柱：C₁₈反相柱(DISCOVERY)；离子对试剂：辛烷磺酸钠；流动相：10mmol/L辛烷磺酸钠、0.1mol/L乙酸钠溶液和乙腈；衍生液：0.1邻苯二甲醛溶液；激发波长：340nm；发射波长：440nm；流动相流速：1.0ml/min；衍生液流速：0.5ml/min。

取适量样品用0.6mol/L的高氯酸提取后上机分析。

2.结果与分析

2.1不同菌株的组胺生成量

组胺是发酵香肠中最重要的生物胺成分之一，由组氨酸脱羧而成。在生物胺中，组胺的生理毒性最强。生物胺在人体细胞内会被一些酶促代谢反应降解，但是酒精和有些药物能抑制这些酶的活性，从而降低了脱毒效率^[4]。长期以来，研究者们认为只有Pediococcus属细菌能够产生组胺，但研究表明，乳杆菌属(Lactobacillus)和葡萄酒菌属(Staphylococcus)的一些菌株也有组氨酸脱羧酶(histidine decarboxylase，HDC)活性，因此也能产生组胺。

从图6能够看出，所有的供试菌株均能在发酵过程中产生组胺，但含量随着菌株的不同而异，即存在着菌株效应。L.sake 54的组胺产生量最高，达1.98mg/Kg，而L.pentosus R1的生成量最低，为0.831.98mg/Kg，P.pentosaceusI9和P.parvus M7的组胺产量也高于对照。

2.2不同菌株的腐胺和尸胺生成量

赖氨酸脱羧基作用生成尸胺，精胺酸脱羧基作用生成腐胺。与组胺的生理作用相似，尸胺和腐胺也有升血压的作用，同时具有较强的生理毒性，二者更是水产品和肉制品腐败变质的特征产物。图7表明，供试的4株菌株都能在发酵过程中产生不等量的尸胺和腐胺，所有的菌株产生的尸胺量都比腐胺量高，而且存在着菌株效应。与对照(Bactoferm^TM F-1)相比，乳杆菌(L.sake 54和L.pentosus R1)产生的腐胺比片球菌(P.pentosaceus I9和P.parvus M7)的相对要低。

本实验还对发酵香肠中的酪胺、亚精胺、精胺和色胺的含量进行了测定，研究表明(见下表)，所有菌株都能产生酪胺、亚精胺和精胺，但都不产生色胺。这表明，供试菌株都没有色氨酸脱羧酶活性。

不同菌株发酵香肠中其他种类生物胺含量

菌株	生物胺含量(mg/Kg)
	生物胺含量(mg/Kg)				酪胺	亚精胺	精胺	色胺
	P.pentosaceus I9L.sake 54L.pentosus R1P.parvus M7Bactoferm^TM F-1	8.419.285.926.185.24	2.602.512.292.023.27	4.033.893.293.883.50	酪胺	亚精胺	精胺	色胺	未检出未检出未检出未检出未检出

2.3菌株复配对生物胺生成量的影响

发酵香肠生产中通常使用的发酵剂大多为两种或两种以上的菌株复配复配而成的发酵剂。发酵剂中各单个菌株间实际上可以看作是一种特殊的互生关系。一般而言，发酵剂中的乳酸菌如乳杆菌(Lactobacillus)、片球菌(Pediococcus)的作用主要是在较短的时间内将香肠的pH降至5.0以下，以抑制其他有害微生物的生长。而与之互生的葡萄球菌(Staphylococcus)、微球菌(Micrococcus)主要与香肠的风味形成有密切关系。在香肠发酵基质中，各组分菌株可以单独生活，但当它们在同一基质中生长时，又能够通过各自的代谢活动而影响对方的代谢行为。下表表明，戊糖片球菌I9和木糖葡萄球菌I2复配后，能够显著降低发酵香肠中生物胺含量。其中，组胺的含量从1.42mg/Kg降到不能检出，腐胺和酪胺的含量也有明显的降低。此外，I9和I2复配发酵剂发酵产生的生物胺总量也低于I9单菌种发酵和商业发酵剂发酵产生的生物胺总量。

菌株复配对发酵香肠中生物胺含量的影响

菌株	生物胺含量(mg/Kg)							生物胺总量(mg/Kg)
	生物胺含量(mg/Kg)								组胺	腐胺	尸胺	酪胺	亚精胺	精胺	色胺
	P.pentosaceus I9P.pentosaceus I9+S.xylosus I2Bactoferm^TM F-1	1.42未检出0.89	3.851.532.72	7.907.208.25	8.413.145.24	2.602.613.27	4.033.453.50		组胺	腐胺	尸胺	酪胺	亚精胺	精胺	色胺	未检出未检出未检出	28.2117.9323.87

注：P.pentosaceus I9和S.xylosus I2的复配比例为1∶1

3.结论与讨论

由于酶和细菌的作用，肉中蛋白质、脂肪及糖类发生分解变化而腐败变质。在肉品腐败过程中，蛋白质分解产生氨(NH₃)和胺类(R-NH₂)等碱性含氮的有毒物质如酪胺、组胺、尸胺、腐胺和色胺等，它们统称为有毒胺。有毒胺具有一定的毒性，可引起食物中毒。如酪胺能引起血管收缩，组胺能使血管扩张，尸胺、腐胺等也能引起明显的中毒反应，因此，在发酵香肠产生中要通过筛选优良的发酵剂和工艺措施来降低产品中生物胺的含量。本实验结果表明，在香肠发酵过程中，所有供试菌株与商业发酵剂都能产生组胺、腐胺、尸胺、酪胺、亚精胺和精胺，但都不产生色胺，各供试菌株生物胺的生成量存在着菌株效应。将片球菌与葡萄球菌复配制得的复合型发酵剂接种发酵，能够显著降低产品中生物胺总量尤其是组胺、腐胺和酪胺的含量。本研究结果也为筛选优良生产性能而且生物胺生产量低的自然菌株提供了参考依据。

Claims

1、木糖葡萄球菌I2菌株，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.0919。

2、一种复合发酵剂，其特征在于：它是将戊糖片球菌I9和木糖葡萄球菌I2分别在改良MRS培养基中培养至对数生长晚期后，再按照1∶1的体积比混合制得的发酵剂，其中戊糖片球菌I9在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.0918，木糖葡萄球菌I2在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.0919；

所述改良MRS培养基的配制过程如下：

首先按下述每升单元组成配制培养液：

蛋白胨10g 酵母粉5g 牛肉膏 10g

MgSO₄·7H₂O 0.58g MnSO₄·4H₂O 0.25g K₂HPO₄ 2g

柠檬酸二铵 2g 酸钠 5g 葡萄糖 20g

Tween80 1mL 盐酸半胱氨酸 0.5g 番茄汁 10～20％v/v

3、如权利要求2所述的发酵剂，其特征在于：将戊糖片球菌I9和木糖葡萄球菌I2在改良MRS培养基中培养时，改良MRS培养基为28～32℃静止状态。

4、如权利要求2或3所述的发酵剂在肉食品中的应用，其特征在于：在发酵肉食品生产过程中接种本发酵剂。

5、如权利要求4所述的发酵剂在肉食品中的应用，其特征在于：所述肉食品为发酵香肠，在灌肠前接种重量比为0.5～1％的发酵剂，在温度20℃、相对湿度95％发酵至pH5.0；在温度15℃、相对湿度90％继续发酵至pH4.6。