CN111826327A - 一株耐受高浓度茶渣的短小芽孢杆菌bp-09及其应用 - Google Patents

一株耐受高浓度茶渣的短小芽孢杆菌bp-09及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及微生物诱变育种技术领域，具体涉及一株耐受高浓度茶渣的短小芽孢杆菌BP‑09及其应用。所述的短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)BP‑09于2020年6月16日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏编号为GDMCC No：61062。本发明以开发地源性的绿茶茶渣制备功能性的菌茶生物饲料为目的，采用ARTP诱变及驯化筛选的方法进行功能性微生物的选育，得到了一株耐受高浓度茶渣并且生物量好、代谢产物活性好的短小芽孢杆菌BP‑09。该菌株能够用于茶渣发酵，能改变茶渣中的营养成分，可应用于茶渣饲料的开发，对于茶渣资源的高值化利用具有重要意义。

Description

一株耐受高浓度茶渣的短小芽孢杆菌BP-09及其应用
技术领域
本发明涉及微生物诱变育种技术领域，具体涉及一株耐受高浓度茶渣的短小芽孢杆菌BP-09及其应用。
背景技术
我国是产茶大国，2018年干毛茶叶产量超过260万吨，其中绿茶类占比超过65％，是全球绿茶的主要生产国，总产量超过全球绿茶总产量的75％。绿茶作为传统饮料，其可食部分仅占茶叶的一小部分，目前伴随着茶叶产业链的延伸，更多的干茶叶进入茶叶深加工企业，通过高温水提制备速溶茶粉及茶浓缩液，而目前的茶叶深加工后的干物质总量也仅为茶叶干重的3％左右，有效成分含量也仅提取不到40％。茶叶加工后产生茶叶原料量近三倍的湿茶渣，其中含有超过60％的茶营养成分，包含有大量的蛋白、脂肪、纤维以及茶多酚等。研究表明，绿茶渣中含有17-19％的粗蛋白，16-18％的粗纤维，1-2％的茶多酚，0.1-0.3％的咖啡碱，不仅如此，其蛋白氨基酸组成丰富，氨基酸比值系数分达到57.51-68.01，较常规饲用玉米及麸皮要好，与鱼粉接近，兼具营养与功能，具有非常高的利用与开发价值。目前，茶渣利用仍以低值化的燃料、肥料、饲料或吸附材料为主，也包括一些茶渣蛋白的提取研究，但其不论是规模化还是工业化应用都非常有限，如何实现茶渣的资源化越来越受到关注，急需拓展高效、价值化的综合方案。
随着开发技术的不断推进，有研究者利用微生物发酵的方式对茶渣饲料进行运用，有研究表明，茶渣经过不同的微生物发酵后其营养成分会有所增加。如刘姝等(2001年)以茶渣为原料，利用木霉、曲霉以及有益微生物发酵进行发酵，发现粗蛋白质和可溶性物质的含量显著增加，并且其营养含量已经完全满足仔猪配合日粮的需求。目前已报道用于茶渣发酵的微生物有黑曲霉、青霉属、酵母属、根霉属、灰绿曲霉、细菌类等。将茶渣开发成饲料的研究刚刚起步，尚存在一些问题，如何利用微生物发酵的方法来处理茶渣，使得茶渣中氨基酸含量提高，纤维素含量减少，更适于家禽的饲喂，这是目前研究需要攻克的一个方面。因此，需要根据茶渣的营养特性，筛选更多能够利用茶渣作为碳氮源生长的菌株，开发茶渣固态发酵工艺。
常压室温等离子体(Atmospheric Room Temperature Plasma,ARTP)被称为除气体、液体、固体以外物质的第四态，通过改变激发方式和发生器结构可以产生不同热力学状态的等离子体。等离子体具有臭氧浓度及紫外辐射强度均极低，安全性高、环境友好、诱变快速等特点，常压室温等离子体诱变操作简单，条件温和，菌株突变率高、突变点位和跨度广泛。ARTP工作气源种类、流量、放电功率、处理时间等条件均可控，通过改变仪器操作条件，可以大大提高菌种突变的强度和突变库容量，结合压力筛选和高通量筛选技术，ARTP已经成为高效进化育种的新方法。ARTP诱变一般以致死率作为筛选诱变条件等的指标，致死率不宜过高或过低，有研究表明，致死率越接近90％，诱变效果越好，此时的诱变条件越佳。专利CN201510677367.1公开了一株高产中温α-淀粉酶的枯草芽孢杆菌及其液体发酵方法，是通过对原始菌株进行ARTP诱变提高中温α-淀粉酶酶活，诱变条件为：使载片处于气流端口2mm处，设置气流量10SLM，调节功率至100W，选择诱变照射时间分别为20s、25s、30s；并对诱变株进行培养基优化和发酵活力条件优化，建立了适宜于工业化生产的液体发酵产中温α-淀粉酶的方法。
目前未见采用ARTP诱变短小芽孢杆菌的相关报道，因此筛选高性能短小芽孢杆菌突变株并用于茶渣发酵，对于茶渣资源的高值化利用具有重要意义。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明要解决的技术问题是采用ARTP诱变短小芽孢杆菌，筛选高性能短小芽孢杆菌突变株并用于茶渣发酵及茶渣资源的高值化利用。
为解决上述技术问题，本发明提供以下技术方案：
一方面，本发明提供一株耐受高浓度茶渣的短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)BP-09，于2020年6月16日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏编号为GDMCCNo：61062。
另一方面，本发明提供了上述短小芽孢杆菌BP-09在茶渣发酵中的应用。
具体地，所述的短小芽孢杆菌BP-09能提高发酵茶渣的蛋白、酸溶蛋白、氨基酸(赖氨酸、苏氨酸、蛋氨酸)含量，提高茶渣的酸度，降低发酵茶渣的粗纤维含量。
具体地，所述的应用是将上述的短小芽孢杆菌BP-09与发酵基质按重量比为4-6：94-96混匀，得到混合发酵基质；向混合发酵基质中添加纤维素酶、半纤维素酶、木聚糖酶和果胶酶，调整混合发酵基质的含水量为35-45％，于20-30℃条件下发酵7-10d。
优选地，所述的混合发酵基质中菌落总数为0.5×106-1.5×106cfu/g。
更优选地，所述的混合发酵基质中菌落总数为1×106cfu/g。
优选地，所述的短小芽孢杆菌BP-09与发酵基质的重量比为5：95。
优选地，所述的发酵基质包括茶渣、脱脂米糠和豆粕粉，三者质量比为7：2：1。
优选地，所述的混合发酵基质中纤维素酶终浓度为300μ/g，半纤维素酶终浓度为300μ/g，木聚糖酶终浓度为200μ/g，果胶酶终浓度为200μ/g。
优选地，所述的混合发酵基质的含水量为40-45％，发酵温度为25-30℃，发酵时间为8-9d。
另一方面，本发明还提供了上述短小芽孢杆菌BP-09在制备茶渣饲料中的应用。
优选地，所述的茶渣为绿茶茶渣。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明以开发地源性的绿茶茶渣制备功能性的菌茶生物饲料为目的，采用ARTP诱变及驯化筛选的方法进行功能性微生物的选育，得到了一株耐受高浓度茶渣并且生物量好、代谢产物活性好的短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)BP-09。该菌株能够用于茶渣发酵，能提高发酵茶渣的蛋白、酸溶蛋白、酸度和氨基酸含量，降低发酵茶渣的粗纤维含量，改变了茶渣中的营养成分，可应用于茶渣饲料的开发，对于茶渣资源的高值化利用具有重要意义。
附图说明
图1为ARTP处理时间对短小芽孢杆菌存活率的影响。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
新鲜绿茶茶渣含水量较高(含水量70.5％)，而且粗纤维的含量也较高(粗纤维含量达到24.1％，以干重计)，其中尤以纤维类含量最为丰富，其通常是纤维素与半纤维素、果胶和木质素结合在一起，很难直接被微生物利用。为加速茶渣的生物利用，本发明选用一定量的纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶和木聚糖酶，尽可能的打开植物细胞壁，再通过配伍合适的辅料，改善和提高整个固体发酵的微生物营养结构(提高碳氮比、速效氮、无机盐和维生素等)，为微生物高强度的繁殖创造基础，结合菌酶同步发酵的方式对绿茶茶渣进行高效发酵，从而提高茶渣的生物可利用性。
1、菌种
(1)原始菌
芽孢杆菌类：短小芽孢杆菌BP(Bacillus pumilus,BP)。
(2)检菌
G+菌株为藤黄微球菌ATCC 4698(Micrococcus luteus ATCC 4698)，G-菌株为大肠杆菌ATCC25922(Escherichia coli ATCC25922)，孔径6.0±0.2mm。
2、试剂
绿茶提取后的茶渣由福建仙洋洋生物科技有限公司提供；
脱脂米糠、麸皮、豆粕粉等由广东容大生物股份有限公司提供；
纤维素酶(200000μ/g)、木聚糖酶(200000μ/g)、果胶酶(30000μ/g)、半纤维素酶(100000μ/g)均购自于枣庄市杰诺生物酶有限公司；
酵母提取粉、蛋白胨等购自于生工生物工程(上海)股份有限公司；
常压室温等离子体诱变仪(ARTP)购自于无锡源清天木生物科技有限公司；
发酵呼吸袋购自于温州创佳包装材料有限公司；
其它试剂、耗材均购自于生工生物工程(上海)股份有限公司。
3、培养基
细菌培养基(％)：牛肉膏0.5，蛋白胨1.0，氯化钠0.5，NaOH调pH至7.0，若制固体培养基，加入2.0％琼脂粉，121℃灭菌21min。该培养基主要用于芽孢类细菌的培养。
LB培养基(％)：胰蛋白胨1.0，酵母提取物0.5，NaCl 1.0，NaOH调pH至7.0，若制固体培养基，加入2.0％琼脂粉，121℃灭菌21min。该培养基主要用于检菌的培养。
平板计数培养基(％)：TSA培养基+1.0％葡萄糖，主要用于混合培养菌株及固体发酵后的菌落平板计数。其中TSA培养基购自于青岛高科技工业园海博生物技术有限公司。
驯化培养基(％)：以热水浸提后的绿茶茶渣作为主要碳源，筛选能够在一定浓度茶渣中繁殖代谢的菌株，具体配方包括(％)：茶渣5.0，硫酸铵0.5，磷酸二氢钾0.15，无水乙酸钠0.1，硫酸镁0.02，硫酸锰0.005，硫酸亚铁0.005，碳酸钙0.3，NaoH调pH至6.5-7.0，121℃灭菌20min。固体平板需添加2.0％的琼脂粉。
茶渣固体发酵培养基(％)：硫酸胺0.1，硫酸镁0.02，磷酸二氢钾0.15，轻质碳酸钙0.5，甘蔗糖蜜0.6，混合后与茶渣和辅料一起搅拌均匀，每个发酵袋装量10kg。
4、检测方法
总酸含量的测定：参照国标GB/T 12456—2008《食品中总酸的测定》中的酸碱滴定法测定。
粗蛋白含量：参照GB/T 6432-2018《饲料中粗蛋白的测定》凯氏定氮法。
酸溶蛋白含量：参照GB/T 22492-2008《大豆肽粉》中酸溶蛋白质含量的测定。
粗纤维含量：参照GB/T 6434-2006《饲料中粗纤维的含量测定》过滤法。
氨基酸含量：参照GB/T 18246-2000《饲料中氨基酸的测定》。
5、平板菌落计数
称取1.0g固体发酵样品(或1mL发酵液样品)加入到9.0mL的磷酸盐缓冲液中，然后加入2滴吐温80，这样就得到了浓度为10-1的稀释溶液。150rpm震荡摇匀5-10min，然后用磷酸盐缓冲溶液对震荡液进行梯度稀释，分别得到10-3，10-5和10-7的稀释梯度，将不同梯度的稀释液分别涂布2个平板计数培养皿，30℃培养72小时，计算总菌落数。
6、抑菌活性分析
采用改良的琼脂扩散法检测代谢产物的抑菌活性。
参考文献：郝湘妹,王宇航,王媛,等.几种检测乳酸菌抑制真菌性能的方法比较[J].食品研究与开发,2020(9).
实施例1菌株的ARTP诱变
1、菌株活化
取短小芽孢杆菌的甘油菌接种于细菌培养基的斜面培养基，30℃培养24h，培养结束后，从中取一环菌株划线至新鲜的斜面培养基中，30℃培养16h，进一步强化菌株活力，复壮菌株，达到菌株活化的目的。
2、菌株ARTP诱变参数的确定
活化培养好的斜面中加入无菌生理盐水，洗脱，制备菌悬液，控制菌悬液OD600nm值在0.5-0.7之间。取10μL的菌悬液，均匀涂布在金属载片的表面，干燥后用灭菌镊子将装有样品载片的平板转移至ARTP操作仓。采用高纯氦气作为等离子体的工作气体处理菌物载片，设置电源功率60W，照射距离3mm，等离子体的温度26℃，气流量10L/min，设置不同的处理组，各组的处理时间分别为0(对照)、30、60、90、120、150、180s，每组设置三次重复。将处理后的载片转移到装有1mL灭菌生理盐水的EP管中，振荡器洗脱60s，把附着在载片上的微生物洗脱到无菌生理盐水中，形成菌悬液。将菌悬液适当稀释后涂布至相应的平板，置于30℃培养箱内培养48h后进行计数，计算致死率，致死率计算方法如下所示：
致死率％＝(未经诱变处理菌落数-经诱变处理菌落数)/未经诱变菌落数×100％
通过统计各处理组的致死率，选择致死率约80％的照射处理时间进行正式实验，即保证一定的突变丰富度，又提供一定的存活率。
结果：短小芽孢杆菌的菌悬液经ARTP诱变，以未经ARTP处理的(处理时间0s)的菌株为对照，绘制短小芽孢杆菌的致死率曲线(图1)。由图1可知，原核生物短小芽孢杆菌对ARTP具有较好的耐受性，ARTP处理60s，致死率仅为24.6％；处理90s，致死率上升至50.6％；处理120s，致死率为80.1％；而处理时间达到150s时，细胞存活率还有3.6％；处理180s，细胞存活率基本为0。
所以，在保证诱变效果的同时又有一定的细胞存活率进行后续筛选，选择致死率约为80％的条件进行ARTP处理，所以短小芽孢杆菌的处理时间确定为120s。
实施例2突变株的驯化筛选
取ARTP处理后的菌悬液直接接种至驯化培养基中，装液量为250mL三角瓶装液50mL，30℃，220rpm，培养72h，考察菌株在以茶渣为主要碳源的培养基中的生长与繁殖能力。并通过逐级的提高驯化培养基中的茶渣含量，结合平板分离，获得菌株生长力强，可以耐受和利用高浓度茶渣的优良菌株，保存，备用。具体如下：
(1)低浓度茶渣对突变株的驯化
将ARTP处理后的菌悬液直接转接至驯化培养基进行培养，以未处理的菌株为对照，观察发酵液的颜色及气味变化，并对发酵液菌落进行计数。
结果显示：短小芽孢杆菌突变菌株在含有以5.0％茶渣为唯一碳源的培养基中能够进行繁殖，并且能够进行一定的代谢活动，而原始菌株在以5.0％茶渣为唯一碳源的培养基中不能繁殖。从代谢产物活性来说，短小芽孢杆菌突变菌株也体现了一定的对G+(藤黄微球菌)的抑菌活性。
(2)高茶渣浓度耐受性突变株的复筛
同时，继续将驯化培养获得的菌液分别涂布至含有10％、15％、20％茶渣浸提液的驯化培养基平板，挑取能够在高浓度茶渣中生长的菌落进行摇瓶培养。
结果显示：短小芽孢杆菌突变菌株有能够在20％茶渣浸提液中生长的菌落，而其液体发酵的菌浓与低浓度茶渣驯化培养结果基本一致，说明高浓度的茶渣营养环境对突变株的生长基本没有抑制，反而突变株合成活性成分的能力还受到明显的刺激，不管是抑菌活性还是产酸能力都有一定程度的提高(表1)。短小芽孢杆菌只对G+菌株有抑菌活性，最高的为12±0.1mm。
表1突变株对高浓度茶渣的耐受性筛选(部分)
Figure BDA0002620170870000061
Figure BDA0002620170870000071
选择生物量最好、代谢产物活性好的菌株BP-09进行摇瓶复筛，采用琼脂扩散法检测抑菌活性。
结果显示：短小芽孢杆菌BP-09只对G+菌株有明显抑菌效果，能够形成清晰明确的抑菌圈，这与上述耐受筛选的结果基本一致。
实施例3短小芽孢杆菌BP-09的鉴定
1、形态特征
将短小芽孢杆菌BP-09菌株制备成菌悬液并稀释后涂布于TSA培养基上，于30℃培养48h后观察菌落和菌体形态。
结果显示：在TSA培养基上培养48h后，菌落呈圆形、扁平、不透明、淡黄色，表面有褶皱，边缘不整齐，在显微镜下观察细胞呈杆状，两端钝圆。
2、生理生化特征
参照细菌鉴定手册对短小芽孢杆菌BP-09的VP反应、碳源利用、吲哚试验等生理生化特性进行测定。
结果显示：该菌株为革兰氏阳性菌，不能还原硝酸盐，柠檬酸盐试验为阳性反应，吲哚反应、甲基红反应和伏普试验均呈阳性反应，接触酶、氧化酶阳性，利用葡萄糖、木糖、甘露醇产酸，水解淀粉、纤维素。
3、16S rDNA测序
短小芽孢杆菌BP-09的16S rDNA测序结果在GeneBank中进行BLAST比对分析，结果发现该菌株的16S rDNA序列如下(SEQ ID NO：1)：
ttcggcggctggctccataaaggttacctcaccgacttcgggtgttgcaaactctcctggtgtgacgggcggtgtgtacaaggcccgggaacgtattcaccgcggcatgctgatccgcgattactagcgattccagcttcacgcagtcgagttgcagactgcgatccgaactgagaacagatttatgccattggctaaaccttgcggtcttgcagccctttgttcaatccattgtagcacgtgtgtagcccaggtcataaggggcatgatgatttgacgtcatccccaccttcctccggtttgtcaccggcagtcaccttagagtgcccaactgaatgctggcaactaagatcaagggttgcgctcgttgcgggacttaacccaacatctcacgacacgagctgacgacaaccatgcaccacctgtcactctgtccccgaagggaaagccctatctctagggttgtcagaggatgtcaagacctggtaaggttcttcgcgttgcttcgaattaaaccacatgctccaccgcttgtgcgggcccccgtcaattcctttgagtttcagtcttgcgaccgtactccccaggcggagtgcttaatgcgttagctgcagcactaaggggcggaaaccccctaacacttagcactcatcgtttacggcgtggactaccagggtatctaatcctgttcgctccccacgctttcgctcctcagcgtcagttacagaccagagagtcgccttcgccactggtgttcctccacatctctacgcatttcaccgctacacgtggaattccactctccagttctgcactcaagtttcccagtttccaatgaccctccccggttgagccgggggctttcacatcagacttaagaaaccgcctgcgagccgattacgcccaataattccggacaacgcttgccacctacgtattaccgcggctgctggcacgtagttagccgtggctttctggttaggtaccgtcaaggtgcgagcagttactctcgcacttgttcttccctaacaacagagctttacgatccgaaaaccttcatcactcacgcggcgttgctccgtcagactttcgtccattgcggaagattccctactgctgcctcccgtaggagtctgggccgtgtctcagtcccagtgtggccgatcaccctctcaggtcggctacgcatcgtcgccttggtgagccattaccccaccaactagctaatgcgccgcgggtccatctgtaagtgacagccgaaaccgtctttcatccttgaaccatgcggttcaaggaactatccggtattagctccggtttcccggagttatcccagtcttacaggcaggttacccacgtgttactcacccgtccgccgctaacatccgggagcaagctcccttctgtccgctcgactgca。
与已报道的Bacillus pumilusATCC7061的16S rDNA(登录号为NR043242)的相似性达99.23％，表明该菌株与短小芽孢杆菌的亲缘关系很近。结合其形态学和生理生化特征，可以初步确定BP-09为短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)。
将短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)BP-09于2020年6月16日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏编号为GDMCC No：61062。保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
实施例4茶渣的菌酶协同发酵
固体发酵茶渣试验步骤如下：
发酵基质由湿的绿茶茶渣和辅料构成，茶渣：脱脂米糠：豆粕＝7：2：1。同时为了更好的促进微生物对茶渣的转化，选用酶的协同发酵，其中，纤维素酶终浓度为300μ/g，半纤维素酶终浓度为300μ/g，木聚糖酶终浓度为200μ/g，果胶酶终浓度为200μ/g。
采用短小芽孢杆菌BP-09菌液(初始菌落总数约1×106cfu/g)接种，接种量按短小芽孢杆菌BP-09与发酵基质的重量比为5：95计，同时，调节含水量，保证基质一触即散，且手捏成团但不滴水为最佳(含水量约为40-45％)。然后将混合好的基质装入带有单向阀的发酵袋中，常温(25-30℃)发酵7-10d，直至有酸甜的酒曲香味，表明发酵完成且充分。发酵完成后主要测定发酵样品的总活菌数、总酸、粗蛋白、酸溶蛋白、粗纤维、赖氨酸、苏氨酸及甲硫氨酸等指标，检测方法参考国标及行业标准方法执行。
菌酶协同发酵9天，检测结果见表2。
表2菌酶协同发酵茶渣
Figure BDA0002620170870000081
注：此次发酵指标的检测数据均以湿重计。
表2中的结果显示，采用短小芽孢杆菌BP-09进行茶渣发酵：
(1)从发酵前后的水分含量来看，发酵后的水份含量较发酵前略有减少，说明BP-09菌株能够在发酵基质中有效生长，并在整个发酵过程中产气或热。
(2)从菌落总数来看，发酵前接入BP-09的总菌落数为1×106cfu/g，该菌株能够首先利用易消化的碳、氮源进行基础代谢，特别是辅料豆粕，其中的氨基酸氮等最有利于菌株的生长，同时其合成代谢产物如蛋白酶和纤维素水解酶类进一步水解复杂底物，反过来促进菌株的进一步生长繁殖，体现了较好的茶渣基质生长特性。
(3)从蛋白含量来看，发酵后基质的粗蛋白略有提高，而酸溶蛋白明显增多。其中总粗蛋白的含量的增加可能与水分、产气代谢等相关，毕竟辅料的添加有利于微生物繁殖，也有助于微生物的代谢。另外，BP-09菌株也加速基质中难溶蛋白的分解，以及非蛋白氮的转化与合成为可溶的小分子蛋白或肽，酸溶蛋白增加了48.9％。
(4)从发酵后的总酸来看，总酸含量提高一倍，展现了BP-09菌株较好的有机酸发酵特性，能够代谢茶渣基质进行酸的代谢，而作为发酵饲料，一定的酸度值不仅利于发酵基质的防霉，而且作为生物饲料其也有一定的诱食作用，体现了较好的应用特性。
(5)从粗纤维的含量来看，发酵前后，粗纤维的含量差异明显，这其中和外源添加的酶制剂有关，同时也与菌株BP-09的生长代谢密切相关。BP-09菌株较好的茶渣耐受性和生长特性也充分展示了BP-09的粗纤维的降解能力，这也是其能够发酵茶渣基质的基础，菌、酶协同条件下，粗纤维含量降低了49.6％。
(6)从氨基酸的含量看，发酵前后必需氨基酸中的赖氨酸、苏氨酸和蛋氨酸都成倍的增加，分别增加了4.3倍、4.8倍和2.3倍。这三个氨基酸作为动物营养中的限制性氨基酸，直接影响动物对其他氨基酸的吸收利用，也充分体现了BP-09菌株良好的茶渣发酵代谢能力。
因此，本发明经过ARTP诱变获得的能够耐受高茶渣浓度并且生物量好、代谢产物活性好的短小芽孢杆菌BP-09，能够用于茶渣发酵，对于茶渣资源的高值化利用具有重要意义。
最后应当说明的是，以上内容仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，本领域的普通技术人员对本发明的技术方案进行的简单修改或者等同替换，均不脱离本发明技术方案的实质和范围。
序列表
<110> 清远一生自然生物研究院有限公司
福建师范大学
<120> 一株耐受高浓度茶渣的短小芽孢杆菌BP-09及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1420
<212> DNA
<213> 短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)
<400> 1
ttcggcggct ggctccataa aggttacctc accgacttcg ggtgttgcaa actctcctgg 60
tgtgacgggc ggtgtgtaca aggcccggga acgtattcac cgcggcatgc tgatccgcga 120
ttactagcga ttccagcttc acgcagtcga gttgcagact gcgatccgaa ctgagaacag 180
atttatgcca ttggctaaac cttgcggtct tgcagccctt tgttcaatcc attgtagcac 240
gtgtgtagcc caggtcataa ggggcatgat gatttgacgt catccccacc ttcctccggt 300
ttgtcaccgg cagtcacctt agagtgccca actgaatgct ggcaactaag atcaagggtt 360
gcgctcgttg cgggacttaa cccaacatct cacgacacga gctgacgaca accatgcacc 420
acctgtcact ctgtccccga agggaaagcc ctatctctag ggttgtcaga ggatgtcaag 480
acctggtaag gttcttcgcg ttgcttcgaa ttaaaccaca tgctccaccg cttgtgcggg 540
cccccgtcaa ttcctttgag tttcagtctt gcgaccgtac tccccaggcg gagtgcttaa 600
tgcgttagct gcagcactaa ggggcggaaa ccccctaaca cttagcactc atcgtttacg 660
gcgtggacta ccagggtatc taatcctgtt cgctccccac gctttcgctc ctcagcgtca 720
gttacagacc agagagtcgc cttcgccact ggtgttcctc cacatctcta cgcatttcac 780
cgctacacgt ggaattccac tctccagttc tgcactcaag tttcccagtt tccaatgacc 840
ctccccggtt gagccggggg ctttcacatc agacttaaga aaccgcctgc gagccgatta 900
cgcccaataa ttccggacaa cgcttgccac ctacgtatta ccgcggctgc tggcacgtag 960
ttagccgtgg ctttctggtt aggtaccgtc aaggtgcgag cagttactct cgcacttgtt 1020
cttccctaac aacagagctt tacgatccga aaaccttcat cactcacgcg gcgttgctcc 1080
gtcagacttt cgtccattgc ggaagattcc ctactgctgc ctcccgtagg agtctgggcc 1140
gtgtctcagt cccagtgtgg ccgatcaccc tctcaggtcg gctacgcatc gtcgccttgg 1200
tgagccatta ccccaccaac tagctaatgc gccgcgggtc catctgtaag tgacagccga 1260
aaccgtcttt catccttgaa ccatgcggtt caaggaacta tccggtatta gctccggttt 1320
cccggagtta tcccagtctt acaggcaggt tacccacgtg ttactcaccc gtccgccgct 1380
aacatccggg agcaagctcc cttctgtccg ctcgactgca 1420

Claims (10)

1.一株耐受高浓度茶渣的短小芽孢杆菌BP-09，其特征在于，所述的短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)BP-09于2020年6月16日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏编号为GDMCC No：61062。
2.权利要求1所述的短小芽孢杆菌BP-09在茶渣发酵中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的应用是将权利要求1所述的短小芽孢杆菌BP-09与发酵基质按重量比为4-6：94-96混匀，得到混合发酵基质；向混合发酵基质中添加纤维素酶、半纤维素酶、木聚糖酶和果胶酶，调整混合发酵基质的含水量为35-45％，于20-30℃条件下发酵7-10d。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的混合发酵基质中菌落总数为0.5×106-1.5×106cfu/g。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的混合发酵基质中菌落总数为1×106cfu/g。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的短小芽孢杆菌BP-09与发酵基质的重量比为5：95。
7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的发酵基质包括茶渣、脱脂米糠和豆粕粉，三者质量比为7：2：1。
8.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的混合发酵基质中纤维素酶终浓度为300μ/g，半纤维素酶终浓度为300μ/g，木聚糖酶终浓度为200μ/g，果胶酶终浓度为200μ/g。
9.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的混合发酵基质的含水量为40-45％，发酵温度为25-30℃，发酵时间为8-9d。
10.权利要求1所述的短小芽孢杆菌BP-09在制备茶渣饲料中的应用。
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