ES2295180T3 - Procedimiento de cultivo de microorganismos en condiciones reductoras obtenidas mediante un flujo gaseoso. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento de cultivo de microorganismos: - para la producción de fermentos, especialmente levados de panificación, levaduras de alimentos y extractos de levaduras, en el que los microorganismos se sitúan en el grupo constituido por especies de los géneros Saccharomyces, Candida y Kluyveromyces; y - para la producción de bebidas no gaseosas con un grado de alcohol reducido, y, de bebidas alcohólicas gaseosas, en el que los microorganismos se sitúan en el grupo constituido por especies del género Saccharomyces, caracterizado porque dicho cultivo se realiza bajo un gas reductor que comprende hidrógeno, con el fin de reducir el potencial de oxidorreducción del medio de cultivo, con respecto al valor que tendría bajo aire, siendo todas las demás cosas iguales.
Description
Procedimiento de cultivo de microorganismos en
condiciones reductoras obtenidas mediante un flujo gaseoso.
La presente invención se refiere al cultivo de
microorganismos en condiciones reductoras obtenidas por medio de un
flujo gaseoso.
Se refiere más particularmente a la producción
modificada y/o controlada de productos alimenticios mediante
fermentación utilizando levaduras en condiciones reductoras tales
como bebidas alcohólicas, productos lácteos, etc., fermentos o
levados, levaduras de alimentos, fermentos probióticos, extractos de
levaduras.
Se refiere más precisamente a un procedimiento
que permite reducir el potencial de oxidorreducción durante el
cultivo de microorganismos, especialmente durante las fermentaciones
que utilizan levaduras para la preparación de los productos citados
anteriormente.
Las oxidorreducciones son etapas esenciales en
las reacciones del anabolismo y del catabolismo celular, para las
cuales el sentido de los intercambios está determinado por el
potencial de oxidorreducción (Eh). Este es un parámetro de estado
de las fermentaciones y su variación modifica el entorno
fisicoquímico de los microorganismos en cuyas actividades
metabólicas y fisiología influye.
Las levaduras se utilizan muy ampliamente para
la fabricación de bebidas fermentadas.
En la levadura, el equilibrio redox de la
fermentación está normalmente equilibrado por la producción de
etanol. Además, la levadura utiliza una parte de los azúcares
fermentables para sintetizar biomasa y productos secundarios de los
cuales el principal es el glicerol, tercer constituyente del vino
después del etanol y el agua. La producción de éste último
dependerá de la cantidad de coenzimas reducidas disponibles para las
biosíntesis. Durante la fermentación de los azúcares, la formación
del etanol y del glicerol es por tanto esencial para mantener el
balance redox.
Se sintetizan igualmente otros productos en
cantidades suficientemente importantes para modificar las
características sensoriales del producto final. Se trata
esencialmente de ácidos orgánicos. La formación de los ácidos
orgánicos tales como el succinato o el acetato durante la
fermentación tiene igualmente una influencia sobre el balance
redox. El succinato se forma por vía oxidativa mediante el citrato y
el \alpha-cetoglutarato o por vía reductora
mediante el oxaloacetato, aunque las condiciones de fermentación
siguen siendo esenciales. El acetato se forma igualmente a partir
del acetaldehído mediante una aldehído deshidrogenasa.
La levadura se caracteriza también por la
producción de compuestos volátiles que intervienen en los aromas de
fermentación, concretamente, los alcoholes superiores, los aldehídos
y los ésteres. Estos productos proceden de los metabolismos
glucídicos, lipídicos y nitrogenados, y por ello su producción
depende igualmente de una modificación posible de la repartición de
los flujos durante una variación del potencial redox.
A partir del metabolismo de los azúcares, la
cepa de levadura sintetiza también oligosacáridos de reserva tales
como el glucógeno y la trehalosa, a menudo en respuesta a un estrés
del entorno. Estos dos oligosacáridos pueden acumularse cuando se
agota el carbono en el medio pero también cuando la cepa ya no
dispone de fuente nitrogenada o azufrada o incluso durante un
estrés térmico u osmótico.
Los azúcares de reserva desempeñan un papel
importante para mejorar la estabilidad y el secado de las levaduras,
por ello sus concentraciones constituyen un parámetro crítico en la
producción de "polvos de levaduras activas" (Active Dry Yeast
en inglés). De hecho, para enfrentarse a las temperaturas elevadas
del ciclo de secado, se utilizan fracciones de glucógeno para
proporcionar la energía de mantenimiento a la célula mientras que
la trehalosa se utiliza como factor estabilizante de las membranas.
Durante el secado, las levaduras pueden acumular grandes cantidades
de trehalosa (del 10-15% del peso seco) y además, la
calidad de las levaduras secadas estaría en relación directa con el
contenido en trehalosa celular. La supervivencia a la deshidratación
está correlacionada con la síntesis de trehalosa y durante la
rehidratación, se degrada la trehalosa. De hecho, la trehalosa se
fija sobre los grupos fosfato de las membranas y al remplazar el
agua estabiliza a éstos últimos durante la deshidratación. Además
de actuar como factores de almacenamiento y protectores, estos
azúcares pueden desempeñar igualmente un papel en la progresión del
ciclo celular con una baja tasa de crecimiento con una limitación en
carbono.
Teniendo en cuenta los conocimientos actuales,
variaciones del potencial redox parecen poder modificar la
repartición de los productos y eventualmente de los componentes
metabólicos intermedios.
Hasta ahora, para modificar el potencial de
oxidorreducción de un medio de fermentación, se procede o bien por
tratamiento térmico (tal como la pasteurización) o bien por adición
de moléculas de adición oxidorreductoras (tales como el ácido
ascórbico, sulfitos...).
No obstante, estos métodos pueden modificar las
características de los productos obtenidos y no pueden ponerse en
práctica sistemáticamente en los dominios agroalimentario (enología,
por ejemplo), farmacéutico o veterinario debido a las normas
impuestas.
Pueden mencionarse igualmente los trabajos de
Vonktaveesuk y cols aparecido en el Journal of Fermentation and
Bioengineering en 1994, vol 77, páginas 508-512, que
se refieren a bacterias lácticas, y que parece sugerir que la
reducción del potencial redox mediante hidrógeno presenta un efecto
negativo sobre el objetivo que se habían fijado los autores,
especialmente una ralentización de la fermentación.
La invención tiene así por objeto remediar los
inconvenientes citados anteriormente y proporcionar un procedimiento
de cultivo de microorganismos que permite modificar los flujos
metabólicos en las células haciendo variar el potencial redox del
medio.
La invención tiene también por objetivo
proporcionar un procedimiento de fermentación que utiliza levaduras
en la perspectiva de una aplicación agroalimentaria en particular en
enología, o de una aplicación farmacéutica o veterinaria, que hace
intervenir medios no tóxicos y no perjudiciales para los productos
finales.
Otro objetivo de la invención es proporcionar un
procedimiento de este tipo que permite acelerar o simplificar los
procedimientos de fabricación mediante fermentación.
El objetivo de la invención también es
proporcionar un procedimiento que permite mejorar las duraciones de
conservación en particular de los fermentos o levados.
Un objetivo de la presente invención es
igualmente proporcionar productos fermentados tales como bebidas que
presentan un bajo grado de alcohol (vinos, cervezas, etc.) y/o
propiedades organolépticas modificadas.
Otro objetivo de la presente invención es además
proporcionar fermentos, levaduras de alimentos o extractos de
levaduras que presentan propiedades mejoradas especialmente desde el
punto de vista de la conservación, nutricional y/u
organoléptico.
Para ello, la invención tiene por objeto un
procedimiento de cultivo de microorganismos según la reivindicación
siguiente.
El procedimiento según la invención se
describirá a continuación en más detalle.
Los inventores han demostrado de manera
totalmente sorprendente que puede hacerse variar el potencial redox
de un medio de cultivo de microorganismos por medio de un flujo
gaseoso reductor en comparación con el aire tal como flujo gaseoso
(diferente del aire) que contiene hidrógeno, y que las condiciones
reductoras así obtenidas permiten modificar los flujos metabólicos
durante el cultivo.
De este modo han demostrado que pueden
orientarse los flujos metabólicos hacia la producción de compuestos
específicos y/o modificar, de manera controlada, las propiedades de
los productos obtenidos.
De manera más específica, los inventores han
demostrado que pueden modificarse los flujos metabólicos o la
cinética de la formación de espuma durante la fermentación de
levaduras, en el marco de aplicaciones enológicas.
También han demostrado que puede aumentarse la
cantidad de azúcares de reserva producida durante el cultivo de
microorganismos para la producción de biomasa.
Han demostrado igualmente que puede aumentarse
la viabilidad de los microorganismos en condiciones reductoras
tales como se definen y prolongar la duración de conservación de los
fermentos obtenidos.
Según la invención, por "condiciones
reductoras", se hace referencia a las condiciones obtenidas con
ayuda de un flujo gaseoso que es reductor en comparación con el
aire, que comprende hidrógeno, puesto en contacto con un medio de
cultivo, que permite reducir el potencial de oxidorreducción de
dicho medio de cultivo con respecto al valor que tendría en
ausencia de dicho flujo gaseoso, es decir al aire, siendo todas las
demás cosas iguales.
La invención cubre por tanto los cultivos en
medios reductores propiamente dichos (se ha reducido el potencial
redox por debajo de 0) pero igualmente el caso en el que el flujo
gaseoso permite reducir el potencial de oxidorreducción de un medio
inicialmente oxidante, incluso si el potencial final alcanzado con
ayuda de dicho flujo gaseoso sigue siendo positivo en sí mismo (por
tanto sigue tratándose al final de un medio oxidante).
Se recuerda que los valores del potencial redox
dependen especialmente de la composición del medio de cultivo y de
su pH, la referencia utilizada para apreciar la reducción del
potencial redox obtenida según la invención, que presenta la misma
composición de medio a pH similar.
Según el procedimiento de la invención, las
condiciones reductoras tal como se definieron anteriormente se
obtienen por medio de un gas reductor que comprende hidrógeno.
Está compuesto por hidrógeno solo o en una
mezcla, con además, según el caso, uno o varios otros gases
denominados aquí "gas(es) complementario(s)
aceptable(s) desde el punto de vista del cultivo".
El gas complementario puede seleccionarse por
tanto de entre los gases inertes, especialmente el argón, el helio,
pero también de entre el oxígeno, el dióxido de carbono y el
protóxido de nitrógeno y las mezclas en todas las proporciones de
uno o varios de estos gases; el gas complementario puede estar
constituido por un único gas o por una mezcla de gases.
Se considera "aceptable desde el punto de
vista del cultivo" en el sentido de que no interfiere de manera
negativa con el mismo y permite por tanto un desarrollo
satisfactorio, incluso mejorado de los microorganismos.
Se selecciona además de entre los gases que
responden a las normas y autorizaciones del dominio de aplicación
considerado (por ejemplo, enología, productos alimenticios,
productos farmacéuticos o veterinarios, etc.). Se trata por
supuesto de las normas del momento conocidas sabiendo que
evolucionan permanentemente autorizando regularmente la llegada y
el uso de nuevos compuestos (véase por ejemplo las derogaciones
actualmente acordadas en Francia para el uso de ozono).
El gas complementario se selecciona
preferiblemente de entre el dióxido de carbono y el oxígeno así como
sus mezclas.
Cuando se trata de una mezcla, el flujo gaseoso
contiene preferiblemente al menos el 0,5% en volumen de hidrógeno,
más preferiblemente entre el 3 y el 50% en volumen de hidrógeno.
Por motivos de facilidad de puesta en práctica y
de seguridad, el contenido en hidrógeno se selecciona
preferiblemente inferior al 5%.
Tal como se habrá entendido tras la lectura de
lo anterior, la composición del flujo gaseoso puede variar según
las cepas puestas en práctica y las aplicaciones previstas así como
las limitaciones de coste eventualmente impuestas.
Según la invención, el procedimiento se realiza
según los procesos de cultivo utilizados clásicamente para los
microorganismos considerados.
Puede tratarse particularmente de fermentación,
utilizando especialmente las levaduras, o incluso otros procesos de
crecimiento de microorganismos según las aplicaciones elegidas.
Además se prevén medios para poner el medio de
cultivo en contacto con el flujo gaseoso citado anteriormente.
El gas según la invención puede aplicarse antes
y/o durante la realización del crecimiento de los microorganismos,
mediante cualquier medio conocido.
El procedimiento según la invención puede
ponerse en práctica de manera continua o discontinua, prefiriéndose
a menudo este último método desde un punto de vista industrial.
Tal como se demuestra en más detalle a
continuación en la presente solicitud, el procedimiento según la
invención permite modificar los flujos metabólicos de los
microorganismos. Por "modificación de los flujos metabólicos",
se entiende la orientación controlada de la producción durante un
cultivo de microorganismos, es decir, la obtención de productos
específicos eventualmente a costa de otros productos normalmente
obtenidos, pero igualmente la modificación de las características
de estos flujos, especialmente desde el punto de vista de la
velocidad de producción, del aumento de presión según el caso,
etc...
En otras palabras, el procedimiento permite
orientar y controlar dichos flujos metabólicos durante el cultivo
de los microorganismos de manera que se obtiene al final una
composición diferente de la que se obtendría realizando el mismo
cultivo en las condiciones clásicas, eventualmente acompañado por la
producción de sustancias específicas novedosas que no se obtienen
habitualmente durante la producción clásica, es decir, sin contacto
con el gas reductor tal como se define según la invención.
El procedimiento de la invención permite
igualmente modificar los flujos metabólicos a nivel de las
características de la reacción. De manera típica, puede citarse el
caso de fermentaciones que utilizan levaduras en recipiente cerrado
(por ejemplo, botella) cuya cinética de formación de espuma puede
mejorarse en condiciones reductoras tal como se describieron
anteriormente.
La modificación de los flujos metabólicos puede
corresponder igualmente a una acumulación de los azúcares de
reserva, en particular trehalosa y glucógeno, en las células
producidas.
La presente invención podrá además adoptar una o
varias de las características descritas en relación con las
reivindicaciones 2 a 9 a continuación.
A continuación se describen aplicaciones más
específicas de la invención que sin embargo no deben considerarse
limitativas y sólo se facilitan a título ilustrativo.
\newpage
Según un modo de realización de la invención, el
procedimiento se aplica a microorganismos del tipo utilizado en
enología, para la preparación de bebidas alcohólicas no gaseosas
(sin formación de espuma) tales como bebidas a base de vinos o
bebidas destiladas.
Se trata generalmente de fermentaciones
utilizando levaduras del género Saccharomyces, principalmente
realizadas en cuba (recipiente abierto) normalmente de manera
discontinua.
Al situarse en condiciones reductoras tal como
se definen según la invención, se producen por ejemplo bebidas con
un contenido en glicerol más elevado en comparación a los mismos
tipos de bebidas producidas en condiciones clásicas, es decir sin
reducción del potencial redox del medio.
El aumento de la producción de glicerol se
realiza a costa de la producción de etanol. De este modo pueden
obtenerse directamente bebidas poco alcohólicas no gaseosas evitando
la desalcoholización mediante un proceso de extracción, empleado
hasta ahora para producir tales bebidas.
Por tanto, el procedimiento según la invención
se aplica especialmente a la producción de bebidas con un grado de
alcohol reducido, por ejemplo bebidas a base de vinos poco
alcohólicos. En ese caso, se prefiere conservar un contenido en
etanol de al menos el 5% en volumen para restituir los aromas y
sabores del vino, apreciados por los consumidores, debido a la
retención de los compuestos volátiles que originan estas propiedades
organolépticas, en el etanol.
No obstante, la invención puede aplicarse a la
producción de bebidas con un grado de alcohol inferior al umbral
citado anteriormente, en cuyo caso pueden producirse bebidas poco
alcohólicas con propiedades organolépticas novedosas.
El procedimiento según la invención se aplica
igualmente a la producción de bebidas que, con un grado de alcohol
equivalente, tienen propiedades organolépticas mejoradas, por
ejemplo en el dominio de las bebidas destiladas.
El procedimiento de la invención presenta la
ventaja de permitir una recuperación sensiblemente total y la no
degradación de los compuestos no volátiles así como la ausencia de
formación de malos sabores relacionados con el procedimiento de
tratamiento, especialmente para la desalcoholización clásica.
El procedimiento según la invención permite de
este modo controlar las características de las bebidas producidas
mediante fermentación, en particular desde el punto de vista de las
propiedades organolépticas y de su grado de alcohol. Permite
especialmente conservar o reforzar las propiedades organolépticas
habituales de una bebida al tiempo que se reduce su grado de
alcohol. En otros casos, permite producir bebidas que presentan
características organolépticas novedosas o texturas no accesibles
mediante los procedimientos clásicos. Puede citarse por ejemplo la
obtención de vinos con un contenido en glicerol elevado calificados
como vinos "grasos".
El procedimiento según la invención puede
aplicarse de ese modo a cualquier tipo de fermentación que utiliza
levaduras u otros microorganismos de la misma especie que las
levaduras en el que se busca la disminución de la producción de
etanol y/o el aumento de la producción de glicerol.
Según una variante de puesta en práctica, el
procedimiento se aplica a fermentaciones de levaduras realizadas en
recipiente cerrado (por ejemplo botella o tonel) para la producción
de bebidas con formación de espuma.
Se trata por ejemplo de fermentación de
levaduras principalmente del género Saccharomyces, utilizada
para la producción de vinos espumosos, cervezas o sidras.
En ese caso, en condiciones reductoras tal como
se definen según la invención, puede mejorarse la cinética de la
formación de espuma acelerando el aumento de presión en la
botella.
De este modo pueden preparase bebidas de tipo
champán, vinos espumosos, vinos de aguja de uva, cervezas o sidras,
mediante un procedimiento más fácil y más rápido.
Según otros modos de realización de la
invención, el procedimiento se aplica a microorganismos para la
preparación de fermentos, levaduras de alimentos o incluso
extractos de levaduras, utilizados en el dominio alimenticio pero
igualmente en el dominio médico o veterinario.
A título de ejemplo, puede citarse el cultivo de
especies de los géneros Saccharomyces y Candida para
la producción de fermentos o levados de panificación; el cultivo de
especies de los géneros Saccharomyces, Kluyveromyces
y Candida para la producción de levaduras de alimentos
especialmente de uso farmacéutico o veterinario, y de extractos de
levaduras; el cultivo de bacterias de los géneros
Lactococcus, Leuconostoc, Lactobacillus y
Streptococcus thermophilus para la producción de
bacterias lácticas utilizadas en la industria láctea.
Al situarse en condiciones reductoras tal como
se definen según la invención, se producen por ejemplo más azúcares
de reserva, especialmente trehalosa y glucógeno.
El contenido en azúcares de reserva es un factor
importante e incluso un parámetro crítico en la producción de
"polvos de levaduras activas" (Active Dry Yeast) que se
obtienen mediante un procedimiento de deshidratación de dichas
levaduras.
Se observa en paralelo una buena viabilidad de
los microorganismos en las condiciones reductoras de la
invención.
Por tanto, el procedimiento descrito permite
mejorar la producción de tales levaduras deshidratadas.
De este modo puede aplicarse en el dominio de la
dietética en el que las levaduras secas alimenticias se utilizan
como componentes alimenticios naturales, ricos en proteínas,
vitaminas del grupo B y minerales.
Puede aplicarse igualmente en farmacia y
parafarmacia en las que las levaduras secas enriquecidas pueden
incorporarse en complementos nutricionales, en particular por la
fuerte biodisponibilidad de los oligoelementos que contienen, y en
las que los extractos de levaduras se utilizan en la fermentación
farmacéutica pero también en microbiología especialmente para la
preparación de medios de crecimiento.
El procedimiento de la presente invención puede
aplicarse también al dominio de la alimentación en el que las
levaduras autolisadas son componentes particularmente bien adaptados
a la aromatización especialmente para la preparación de aperitivos
aromatizados o de galletas saladas o en el que los extractos de
levaduras son componentes tradicionales de caldos, sopas, etc. pero
también componentes ricos en factores de crecimiento, en péptidos y
en aminoácidos utilizados para los procedimientos de cultivo de
microorganismos.
El procedimiento según la invención puede
aplicarse a cualquier industria que utiliza levados vivos tales
como la enología, la industria cervecera, la sidrería, la
panificación pero igualmente la farmacia, la parafarmacia, la
veterinaria especialmente con la expansión de los agentes
probióticos.
La invención se refiere por tanto a todos los
productos obtenidos mediante el procedimiento descrito
anteriormente.
La invención se ilustra con ayuda de los
ejemplos facilitados a continuación, a título no limitativo, en
referencia a los dibujos en los que:
\bullet la figura 1 es un diagrama que muestra
la producción de etanol y de glicerol obtenida mediante diferentes
potenciales redox (Eh) en el caso de una fermentación continua sobre
medio mínimo, en referencia al ejemplo
1;
1;
\bullet las figuras 2a a 2d y 3a a 3d son
curvas que muestran respectivamente los rendimientos en etanol y en
glicerol observados en ausencia de gas y con tres burbujeos
diferentes (que generan cuatro potenciales redox diferentes) en el
transcurso de una fermentación alcohólica, en referencia al ejemplo
2;
\bullet las figuras 4, 5 y 6 representan las
curvas que muestran respectivamente la evolución de la producción
de etanol, de la presión en la botella y del grado de alcohol
(parámetros determinantes de una formación de espuma) en función
del tiempo, en el caso de una fermentación en botella con formación
de espuma, en referencia al ejemplo
3;
3;
\bullet las figuras 7, 8 y 9 representan
curvas que muestran respectivamente el potencial redox (Eh), el
seguimiento de la cantidad de azúcar residual y el seguimiento de la
producción de glicerol en el transcurso del tiempo (parámetros
adjuntos de una formación de espuma) en el caso de una fermentación
en botella con formación de espuma, en referencia al ejemplo 3;
\bullet las figuras 10 y 11 son diagramas que
ilustran el análisis cuantitativo de los azúcares de reserva,
glucógeno y trehalosa, en función del potencial redox (Eh)
respectivamente sobre medio mínimo y sobre medio de zumo de uva, en
referencia al ejemplo 4;
\bullet las figuras 12 y 13 son curvas que
muestran la viabilidad de las células en el transcurso de su
conservación respectivamente en agua fisiológica y en vino, en
referencia al ejemplo 5.
Para este estudio se utilizaron tres tipos de
atmósferas, concretamente nitrógeno solo, mezcla de
nitrógeno/hidró-
geno a razón del 4% de hidrógeno e hidrógeno solo.
geno a razón del 4% de hidrógeno e hidrógeno solo.
Se observa el efecto de un burbujeo de estos
gases diferentes sobre el valor del potencial redox (Eh) de un
medio mineral que tiene la composición siguiente conveniente para el
crecimiento de Saccharomyces cerevisiae:
Cantidades para 1 litro de agua destilada
- (NH_{4})_{2}SO_{4}
- 5 g
- KH_{2}PO_{4}
- 3 g
- MgSO_{4}, 7H_{2}O
- 0,5 g
- EDTA
- 15 mg
- ZnSO_{4}, 7H_{2}O
- 4,5 mg
- CoCl_{2}, 6H_{2}O
- 0,3 mg
- CaCl_{2}, 2H_{2}O
- 4,5 mg
- FeSO_{4}, 7H_{2}O
- 3 mg
- NaMoO_{4}, 2H_{2}O
- 0,4 mg
- H_{3}BO_{3}
- 1 mg
- KCl
- 0,1 mg
- Antiespumante de silicona
- 0,025 ml
- Ergosterol
- 10 mg
- Tween 80
- 420 mg
- Etanol 1 mM
- 46 mg
- Glucosa
- 23 g
- Biotina
- 0,05 mg
- Pantotenato de calcio
- 1 mg
- Ácido nicotínico
- 1 mg
- Inositol
- 25 mg
- Tiamina HCl
- 1 mg
- Ácido para-aminobenzoico
- 0,2 mg
- Piridoxina HCl
- 1 mg
pH = 4,1
\vskip1.000000\baselineskip
Se observó igualmente el efecto de estos gases
sobre el medio de zumo de uva correspondiente a una aplicación
enológica.
En un primer momento, se observó el valor del Eh
sobre el medio estéril (es decir sin sembrar) y en un segundo
momento sobre un medio sembrado.
Se hace burbujear en el medio de fermentación el
gas o la mezcla de gases hasta fijar el valor del Eh. Estos
experimentos se realizan a 25ºC y considerando que el pH del medio
permanece constante.
La tabla 1 a continuación muestra los valores
del potencial redox (Eh) obtenidos sobre medio mínimo.
\vskip1.000000\baselineskip
La tabla 2 indica los valores del potencial
redox (Eh) obtenidos sobre medio de zumo de uva.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
A título comparativo, el potencial del medio de
zumo de uva estéril es de 400 mV en condiciones clásicas (ausencia
de flujo gaseoso según la invención).
Se utilizó la cepa Saccharomyces
cerevisiae CBS 8066 que se desarrolla sobre un medio mineral con
glucosa limitante y suplementado con vitaminas y ácidos grasos
insaturados correspondiente a la composición facilitada en el
párrafo I. Se cultivan las levaduras en anaerobiosis, en continuo, a
una temperatura constante de 30ºC y un pH mantenido a 5. Se
rastrean las tasas de dilución D (razón del caudal de alimentación
con respecto al volumen del líquido) de 0,05 h^{-1} a 0,3
h^{-1}.
Se aplican tres valores de Eh gracias al uso de
diferentes gases, concretamente 100 mV, -100 mV y -300 mV.
Se estudia la modificación de los flujos
metabólicos, durante la fermentación, mediante análisis cuantitativo
de la distribución de los flujos metabólicos.
Los resultados observados se indican en la
figura 1 que presenta la cantidad (en g/l) de etanol y de glicerol
para las tres condiciones de Eh citadas anteriormente a D = 0,1
h^{-1}. En medio reducido, el flujo carbonado se desvía hacia la
producción de glicerol a costa del etanol.
Los resultados obtenidos durante el seguimiento
de la estequiometría metabolito-sustrato se
facilitan en la tabla 3.
En vista de los resultados presentados en esta
tabla, se constata que en condiciones reductoras (gas hidrógeno y
mezcla hidrógeno/nitrógeno), se aumenta la síntesis de glicerol con
respecto a las condiciones oxidantes (bajo nitrógeno) y ello a
costa de la del etanol que disminuye fuertemente. En estas
condiciones, se dobla la razón glicerol/etanol cuando se pasa de
una fermentación bajo nitrógeno a una fermentación bajo
hidrógeno.
\global\parskip0.950000\baselineskip
Se utilizó una cepa enológica de
Saccharomyces cerevisiae RC 212. Se lleva a cabo la
fermentación en discontinuo (por lotes) durante 145 horas sobre
medio de zumo de uva que contiene aproximadamente 165 g/l de
azúcares fermentables y se mantiene la temperatura a 25ºC. Se trata
de un medio industrial cuyas propiedades fisicoquímicas y las
concentraciones de elementos nutritivos son diferentes al medio
mineral. Este medio presenta la capacidad de reproducir el fenómeno
a concentración elevada de azúcares y con un sustrato compuesto por
una mezcla glucosa-fructosa equilibrada. Este
experimento permite igualmente controlar el fenómeno en cultivo
discontinuo.
Se someten a prueba cuatro condiciones de
potencial redox (Eh) utilizando:
- un reactor sin burbujeo de gas (figuras 2a y
3a)
- un reactor con burbujeo de nitrógeno (figuras
2b y 3b)
- un reactor con burbujeo de nitrógeno/hidrógeno
(figuras 2c y 3c)
- un reactor con burbujeo de hidrógeno (figuras
d2 y 3d).
En el transcurso del tiempo, se realizó un
seguimiento de la biomasa, el pH, la evolución del Eh, la producción
de etanol y de glicerol así como la cantidad de azúcares
residuales.
Los resultados presentados corresponden a una
media de 3 repeticiones.
Se ilustran en las figuras 2a a 2d para el
etanol y en las figuras 3a a 3d para el glicerol.
Al ser variables las concentraciones en azúcares
en los mostos (de 150 a 350 g/l de zumo según las cepas), conviene
interpretar los resultados obtenidos teniendo en cuenta las razones
de etanol formado/azúcares fermentables (en mol/mol) y glicerol
formado/azúcares fermentables (en mol/mol) pero también la razón de
glicerol/etanol.
Este análisis de la estequiometría de
metabolitos-azúcares confirma, tal como durante el
estudio sobre medio mínimo en quimiostato, el hecho de que se
favorece la vía del glicerol a costa de la del etanol cuando la
levadura se encuentra en condiciones reductoras.
Estos resultados muestran que en el marco de una
aplicación en vinificación, es posible producir una bebida
fermentada con un grado bajo de alcohol, al tiempo que se mantiene
(o se aumenta) la producción de glicerol que interviene en el
cuerpo y la redondez de los vinos.
La tabla 3 a continuación facilita los
resultados obtenidos durante el seguimiento de la estequiometría
metabolito-sustrato en el caso:
(1) de una fermentación en quimiostato a D = 0,1
h^{-1} sobre medio mínimo (23 g/l de glucosa): ejemplo 1,
(2) de una fermentación discontinua sobre zumo
de uva a 100 horas (165 g/l de azúcares fermentable): ejemplo
2.
Los rendimientos indicados corresponden a los
coeficientes directores de las rectas de regresión de las figuras
2a-2d y 3a-3d:
Figura 2a: y = 1,79x -105,00; Rendimiento =
94%
Figura 2b: y = 1,29x + 23,47; Rendimiento =
93%
Figura 2c: y = 0,91 x + 45,92; Rendimiento =
96%
Figura 2d: y = 0,85x + 72,42; Rendimiento =
88%
Figura 3a: y = 0,06x -3,51; Rendimiento =98%
Figura 3b: y = 0,10x -6,92; Rendimiento =
95%
Figura 3c: y = 0,09x -4,46; Rendimiento =
93%
Figura 3d: y = 0,11 x -8,08; Rendimiento =
94%
A título comparativo, esta tabla indica los
valores indicados por Michnick y cols, 1997 (Yeast, vol. 13,
783-793) y Oura, 1977 (Process Biochemistry, vol. 4,
19-35) en la técnica anterior, correspondiendo la
segunda referencia a una síntesis de 5 autores diferentes.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Se utiliza una cepa enológica de levadura de
embotellamiento del género Saccharomyces. El medio está
constituido por un vino de base con adición de un licor enriquecido
en azúcares.
- -
- un embotellamiento si burbujeo de gas,
- -
- un embotellamiento con burbujeo de nitrógeno,
- -
- un embotellamiento con burbujeo de nitrógeno/hidrógeno,
- -
- un embotellamiento con burbujeo de hidrógeno.
En el transcurso del tiempo (6 semanas), se
realizó un seguimiento de la evolución del Eh, la producción de
etanol y de glicerol, la viabilidad de las células de levaduras, la
evolución de la presión así como la cantidad de azúcares residuales
(glucosa + fructosa).
Se trata de hecho de la medición de la
producción de etanol, de la evolución de la presión y del cálculo
del grado de alcohol alcanzado.
En vista de las curvas presentadas en las
figuras 4, 5 y 6, se constata que al cabo de 3 semanas se alcanzan
los 12,5º en las botellas independientemente de las condiciones de
Eh sometidas a prueba. Se recuerda que según la legislación, este
valor es exigible para cualquier fabricación de champán.
Se trata de la medición del Eh y de las
cantidades de glicerol y de azúcares residuales.
En referencia a la figura 7, la medición del Eh
durante 6 semanas permite concluir que el valor se mantiene en las
botellas en el transcurso del tiempo.
En lo que se refiere a la cantidad de los
azúcares residuales, en vista de las curvas de la figura 8, según
las condiciones de Eh sometidas a prueba el consumo de azúcar por la
levadura no se realiza de la misma manera. La cepa colocada en
condiciones reductoras consume los azúcares fermentables mucho más
rápidamente que en un entorno oxidante.
Finalmente, en referencia a la figura 9, se
observa que la producción de glicerol no se ve sensiblemente
modificada por las diferentes condiciones aplicadas.
Este estudio muestra el cambio de la
fisicoquímica del producto, durante la fermentación en botella,
debido a la modificación del Eh utilizando diferentes condiciones
reductoras.
Se realizó un crecimiento en lotes de
Saccharomyces cerevisisae CBS 8066 sobre un medio mineral
limitante en glucosa cuya composición corresponde a la facilitada
en el ejemplo 1, a 30ºC y con agitación a 300 rpm (rotaciones por
minuto).
Se someten a prueba dos condiciones de Eh:
- un reactor con burbujeo de nitrógeno,
- un reactor con burbujeo de hidrógeno.
Se lleva a cabo el crecimiento durante 14 horas,
tras lo cual se toma una muestra de células para realizar la
dosificación de trehalosa y glucógeno según el protocolo establecido
por Parrou y François, 1997 (Analytical Biochemistry, vol. 248,
186-188).
Los resultados presentados corresponden a una
media de 2 dosificaciones.
El análisis cuantitativo de la acumulación de
los azúcares de reserva en el seno de la célula de levadura
indicado en la figura 10, muestra que en presencia de condiciones
reductoras según la invención, la cepa sintetiza oligosacáridos de
reserva en cantidad más importante que en condiciones oxidantes en
respuesta a esta modificación del entorno fisicoquímico.
Se utilizó una cepa enológica de
Saccharomyces cerevisiae RC 212. Se lleva a cabo la
fermentación en discontinuo (en lotes) durante 145 horas sobre
medio de zumo de uva que contiene aproximadamente 165 g/l de
azúcares fermentables y se mantiene la temperatura a 25ºC.
Se someten a prueba cuatro condiciones de Eh
utilizando:
- un reactor sin burbujeo de gas
- un reactor con burbujeo de nitrógeno
- un reactor con burbujeo de nitrógeno/hidrógeno
(condiciones según la invención)
- un reactor con burbujeo de hidrógeno
(condiciones según la invención).
Se extrajeron células para la dosificación de
trehalosa y de glucógeno al cabo de 128 horas de fermentación
alcohólica, cuando se había consumido casi la totalidad de los
azúcares fermentables (aproximadamente el 99,9%).
Se midió en tiempo real la viabilidad de las
células con azul de metileno. A continuación se conservan las
muestras extraídas a 4ºC sin precauciones particulares salvo que se
lleva una parte de las células a agua fisiológica y la otra parte
al medio de vino del que se extrajeron. Se realizó un seguimiento
con el transcurso del tiempo de la viabilidad.
Los resultados presentados corresponden a una
media de 2 repeticiones.
A partir del análisis cuantitativo ilustrado en
la figura 11, puede constatarse que la levadura acumula más
azúcares de reserva cuando está en condiciones reductoras según la
invención que en condiciones oxidantes.
Se constata que esta acumulación es óptima en el
medio colocado bajo nitrógeno, gas no reductor pero que conduce a
una reducción del potencial redox del medio con respecto al valor
que tendría en ausencia de gas (nitrógeno).
En vista de las curvas facilitadas en las
figuras 12 y 13, resulta muy interesante observar que la viabilidad
es óptima para las células procedentes del reactor colocado bajo
nitrógeno/hidrógeno. En ese caso, el valor del Eh que corresponde a
esta mezcla aparece como el más óptimo para permitir una mejor
conservación de las células de levadura con el transcurso del
tiempo.
Claims (9)
1. Procedimiento de cultivo de
microorganismos:
- -
- para la producción de fermentos, especialmente levados de panificación, levaduras de alimentos y extractos de levaduras, en el que los microorganismos se sitúan en el grupo constituido por especies de los géneros Saccharomyces, Candida y Kluyveromyces; y
- -
- para la producción de bebidas no gaseosas con un grado de alcohol reducido, y, de bebidas alcohólicas gaseosas, en el que los microorganismos se sitúan en el grupo constituido por especies del género Saccharomyces,
caracterizado porque dicho cultivo se
realiza bajo un gas reductor que comprende hidrógeno, con el fin de
reducir el potencial de oxidorreducción del medio de cultivo, con
respecto al valor que tendría bajo aire, siendo todas las demás
cosas iguales.
2. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque está destinado a la producción de
bebidas no gaseosas con un grado de alcohol reducido mediante
fermentación utilizando levaduras en recipientes abiertos,
especialmente en cubas, y porque se aumenta la cantidad de glicerol
producida y se reduce la cantidad de etanol producida con respecto
al valor que tomarían bajo aire, siendo todas las demás cosas
iguales.
3. Procedimiento según la reivindicación 2,
caracterizado porque la razón glicerol/etanol se multiplica
por un factor de 1,5 a 5, preferiblemente de 2 a 4.
4. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque está destinado a la producción de
fermentos, especialmente levados de panificación, levaduras de
alimentos y extractos de levaduras, y porque permite aumentar la
cantidad de azúcares de reserva especialmente trehalosa y glucógeno,
producida durante dicho cultivo, con respecto al valor que tendría
bajo aire, siendo todas las demás cosas iguales.
5. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque se realiza dicho
cultivo de los microorganismos bajo hidrógeno.
6. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque se realiza
dicho cultivo bajo un gas formado por un mezcla de hidrógeno y de
nitrógeno.
7. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque se realiza dicho
cultivo bajo un gas que contiene hidrógeno y nitrógeno y un gas
complementario aceptable desde el punto de vista de dicho
cultivo.
8. Procedimiento según la reivindicación 7,
caracterizado porque el gas complementario se elige de entre
los gases inertes, especialmente argón, helio, y de entre el
oxígeno, el dióxido de carbono y el protóxido de nitrógeno y sus
mezclas en todas las proporciones, preferiblemente del dióxido de
carbono y el oxígeno así como sus mezclas.
9. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque se realiza dicho
cultivo bajo un gas que contiene hidrógeno y dióxido de
carbono.
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