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GEBIET DER
ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung betrifft die technologische Stoffwechselumgestaltung
und insbesondere biokatalytische Verfahren zur Herstellung von Ascorbinsäure-Zwischenprodukten.
Insbesondere sieht die Erfindung Verfahren zur Herstellung von Ascorbinsäure-Zwischenprodukten
in nicht-fermentativen Systemen vor.
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HINTERGRUND
DER ERFINDUNG
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L-Ascorbinsäure (Vitamin
C, ASA) findet Anwendung in der pharmazeutischen und Nahrungsmittelindustrie
als ein Vitamin und Antioxidanz. Die Synthese von ASA hat beträchtliche
Beachtung über
viele Jahre erhalten, und zwar aufgrund ihres relativ großen Marktvolumens
und hohen Wertes als eine Spezialchemikalie. Das Reichstein-Grussner-Verfahren,
ein chemischer Weg von Glukose zu ASA, wurde zuerst in 1934 beschrieben
(Helv. Chim. Acta 17: 311-328). Lazarus et al. (1989, "Vitamin C: Bioconversion
via a Recombinant DNA Approach",
Genetics and Molecular Biology of Industrial Microorganisms, American
Society for Microbiology, Washington D. C., herausgegeben von C.
L. Hershberger) beschrieben ein Bioumwandlungsverfahren zur Herstellung
eines Zwischenprodukts von ASA, 2-Keto-L-gulonsäure (2-KLG, KLG), welche chemisch
zu ASA umgewandelt werden kann. Diese Bioumwandlung einer Kohlenstoffquelle
zu KLG involviert eine Vielzahl von Zwischenprodukten, wobei das
enzymatische Verfahren mit einer Cofaktor-abhängigen Reduktaseaktivität assoziiert
ist. Eine enzymatische Cofaktor-Regenierung involviert die Verwendung
von Enzymen, um Cofaktoren wie NAD+ zu NADH
oder NADP+ zu NADPH auf Kosten eines anderen
Substrates, welches dann oxidiert wird, zu regenerieren.
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Es
bleibt ein Bedarf nach wirtschaftlich gängigen Verfahren zur Herstellung
von ASA-Zwischenprodukten. Insbesondere, wenn solche Verfahren die
Verwendung von enzymatischen Aktivitäten involvieren, welche einen
Cofaktor erfordern, wäre
es besonders wünschenswert,
Verfahren zu haben, welche eine Cofaktor-Regenerierung bereitstellen.
Die vorliegende Erfindung geht dieses Bedürfnis an.
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ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung betrifft die nicht-fermentative Herstellung
von ASA-Zwischenprodukt,
KLG, und schließlich
ihre Umwandlung zu gewünschten
Endprodukten, zum Beispiel Erythorbat und Ascorbinsäure, aus
einer Kohlenstoffquelle in einer biokatalytischen Umgebung, wobei
die Umgebung, auf die hierin Bezug genommen wird, ein Bioreaktor
ist. Die biokatalytische Umgebung kann lebensfähige oder nicht lebensfähige Wirtszellen
umfassen, welche mindestens eine enzymatische Aktivität enthalten,
die zur Prozessierung der Kohlenstoffquelle zu dem gewünschten
Zwischenprodukt in der Lage ist. In einer Ausführungsform wird das gewünschte Zwischenprodukt
aus dem Bioreaktor über
Elektrodialyse vor der Umwandlung zu dem gewünschten Endprodukt gereinigt.
Siehe die 2 für eine schematische Repräsentation
der Herstellung dieser Zwischenprodukte und Produkte.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls ein nicht-fermentatives
Verfahren zur Herstellung von ASA-Zwischenprodukten, wobei der benötigte Cofaktor
regeneriert wird. Die vorliegende Erfindung basiert teilweise auf
der Feststellung, dass katalytische Mengen von Cofaktor in einem
nicht-fermentativen oder in einem in vitro-Verfahren zur Herstellung
von KLG aus einer Kohlenstoffquelle regeneriert werden können. In
einer Ausführungsform
der vorliegenden Erfin dung wird der erforderliche Cofaktor aus dem
Bioreaktor vermittels Nano-Filtration
gereinigt und wieder verwendet.
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Wenn
KLG das gewünschte
ASA-Zwischenprodukt ist, wird der Bioreaktor mit einer Kohlenstoffquelle versorgt,
welche biokatalytisch durch mindestens einen oxidativen Schritt
und mindestens einen reduzierenden Schritt zu KLG umgewandelt wird.
In Abhängigkeit
von der verwendeten Wirtszelle kann die Wirtszelle (eine) Mutation(en)
in (einem) Gen(en) umfassen, welches/welche eine oxidierende oder
reduzierende enzymatische Aktivität kodiert/kodieren, sodass
KLG nicht weiter zu anderen Zwischenprodukten umgewandelt wird. Der
oxidative Schritt und reduzierende Schritt erfordern Cofaktor, und
das Verfahren sieht ein Mittel zur Cofaktorregenerierung vor.
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In
einer Ausführungsform
sind die Wirtszellen rekombinant und umfassen mindestens eine heterologe enzymatische
Aktivität.
In einer Ausführungsform
ist die enzymatische Aktivität
an Wirtszellenmembranen gebunden; in einer anderen Ausführungsform
liegt die enzymatische Aktivität
in Lösung
vor; in einer anderen Ausführungsform
ist die enzymatische Aktivität
innerhalb der Zelle löslich;
und in einer anderen Ausführungsform
wird die enzymatische Aktivität
immobilisiert. Das Verfahren kann als ein Ansatzverfahren oder ein
kontinuierliches Verfahren durchgeführt werden. Die Wirtszellen
sind vorzugsweise Vertreter der Familie Enterobacteriacea, und in
einer Ausführungsform
ist der Vertreter eine Pantoea-Spezies und insbesondere Pantoea citrea.
Pantoea citrea kann zum Beispiel von der ATCC mit der ATCC-Zugangsnummer
39140 erhalten werden.
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Die
Wirtszellen können
lyophilisiert, permeabilisiert oder in anderer Weise behandelt werden,
um die Lebensfähigkeit
zu senken, oder mutiert werden, um die Glukosenutzung für das Zellwachstum
oder den Stoffwechsel zu eliminieren, solange die enzymatische Aktivität verfügbar ist,
um die Kohlenstoffquelle zu dem gewünschten Zwischenprodukt umzuwandeln.
Die Zwischenprodukte können
weiter zu den Endprodukten von Erythorbat oder ASA prozessiert werden.
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Bei
der Herstellung von KLG, wenn die Kohlenstoffquelle KDG ist, oder
wenn eine Kohlenstoffquelle zu KDG umgewandelt wird, umfasst das
Verfahren die Schritte des enzymatischen Oxidierens des KDG durch mindestens
eine oxidative enzymatische Aktivität zu einem Oxidationsprodukt;
und das enzymatische Reduzieren des Oxidationsprodukts durch mindestens
eine reduzierende enzymatische Aktivität zu 2-KLG. Wenn alternativ
DKG die Kohlenstoffquelle ist, oder wenn eine Kohlenstoffquelle
zu DKG umgewandelt, wird DKG zu KLG durch eine reduzierende enzymatische
Aktivität
umgewandelt.
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Die
vorliegende Erfindung sieht ein Verfahren zur nicht-fermentativen
Herstellung von 2-KLG aus einer Kohlenstoffquelle vor, wobei das
Verfahren die folgenden Schritte in einer beliebigen Reihenfolge
umfasst, das enzymatische Oxidieren der Kohlenstoffquelle durch
mindestens eine oxidative enzymatische Aktivität zu einem Oxidationsprodukt;
und das enzymatische Reduzieren des Oxidationsprodukts durch mindestens
eine reduzierende enzymatische Aktivität zu 2-KLG. Die oxidative enzymatische
Aktivität
erfordert eine oxidierte Form eines enzymatischen Cofaktors, und
die reduzierende enzymatische Aktivität erfordert eine reduzierte
Form von dem enzymatischen Cofaktor, und die oxidierte Form des
Cofaktors und die reduzierte Form des Cofaktors werden zwischen
mindestens einem Oxidationsschritt und mindestens einem Reduktionsschritt
recycelt. In einer Ausführungsform
ist die oxidierte Form des enzymatischen Cofaktors NADP+,
und die reduzierte Form des enzymatischen Cofaktors ist NADPH. In
einer anderen Ausführungsform
ist die oxidierte Form von dem enzymatischen Cofaktor NAD+ und die reduzierte Form ist NADH. Andere
Cofaktoren, die bei dem Verfahren der vorliegenden Erfindung brauchbar
sind, schließen
ATP, ADP, FAD und FMN ein.
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In
einer hierin beschriebenen veranschaulichenden Ausführungsform
umfasst das Verfahren die folgenden Schritte in einer beliebigen
Reihenfolge, und die Schritte können
gleichzeitig und/oder kontinuierlich während des Verfahrens auftreten:
enzymatisches Oxidieren der Kohlenstoffquelle durch eine erste oxi dative enzymatische
Aktivität
zu einem ersten Oxidationsprodukt; enzymatisches Oxidieren des ersten
Oxidationsprodukts durch eine zweite oxidative enzymatische Aktivität zu einem
zweiten Oxidationsprodukt; enzymatisches Oxidieren des zweiten Oxidationsprodukts
durch eine dritte oxidative enzymatische Aktivität zu einem dritten Oxidationsprodukt;
und enzymatisches Reduzieren des dritten Oxidationsprodukts durch
eine reduzierende enzymatische Aktivität zu 2-KLG. In einer Ausführungsform
erfordert mindestens eine der ersten, zweiten und dritten oxidativen
enzymatischen Aktivitäten
eine oxidierte Form eines enzymatischen Cofaktors, und die Reduzierung
enzymatischer Aktivität
erfordert eine reduzierte Form des enzymatischen Cofaktors, und
wobei die oxidierte Form des Cofaktors und die reduzierte Form des
Cofaktors zwischen mindestens einem oxidierenden Schritt und dem
reduzierenden Schritt recycelt werden.
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In
einer Ausführungsform
läuft das
Verfahren in einer Umgebung ab, die organische Lösungsmittel umfasst, und in
einer weiteren läuft
das Verfahren in einer Umgebung ab, welche lange Polymere umfasst.
In noch einer weiteren Ausführungsform
läuft das
Verfahren in einer Umgebung ab, die ein Salz umfasst, und innerhalb
eines Bereichs von Salzkonzentrationen.
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Die
vorliegende Erfindung sieht ebenfalls Vektoren und rekombinante
Wirtszellen gemäß den Ansprüchen vor,
umfassend enzymatische Aktivitäten,
welche bei den Verfahren zur Herstellung der ASA-Zwischenprodukte
verwendet werden. In einer Ausführungsform
umfasst die Wirtszelle heterologe Nukleinsäure, die GDH kodiert, erhältlich aus
Spezies, die T. acidophilum, Cryptococcus uniguttalatus und Bacillus-Spezies
einschließen,
und/oder DKG-Reduktase, die aus Corynebacterium oder Erwinia erhältlich ist.
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KURZE BESCHREIBUNG
DER ZEICHNUNG
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Die 1 ist
eine schematische Darstellung eines in vitro-Verfahrens, wobei NADP+ und NADPH zwischen Oxidations- und Reduktionsschritten
recycelt werden.
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Die 2 ist
eine schematische Darstellung eines Stoffwechselwegs zu ASA-Zwischenprodukten.
Mit A markierte Schritte sind enzymatisch; mit B markierte Schritte
sind entweder enzymatische oder chemische Umwandlungen. Bei dieser
Repräsentation
ist das Enzym, welches Glukose (Glc) zu GA umwandelt, eine GDH-Aktivität; das oxidative
Enzym, welches GA zu KDG umwandelt, ist eine GADH-Aktivität; das oxidative Enzym,
welches KDG zu DKG umwandelt, ist eine KDGDH-Aktivität, und das
reduzierende Enzym, welches DKG zu KLG umwandelt ist eine DKGR-Aktivität.
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Die 3 veranschaulicht
die Aktivität
von Reduktase in Gegenwart von 0 bis 40 % Methanol bei einem pH-Wert
von 7 und 30°C.
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Die 4 veranschaulicht
die Reduktase-Aktivität
in Gegenwart von 0 bis 50 % Ethanol bei einem pH-Wert von 7,22°C.
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Die 5 veranschaulicht
die Reduktase-Aktivität
bei einem pH-Wert von 7 in Gegenwart von NaCl, KCl, CaCl2, K2SO4 oder
Kaliumphosphat (KPi). Anfängliche
Raten wurden über
eine Minute gemessen.
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Die 6 veranschaulicht
die Aktivität
von Reduktase, die nach der Inkubation bei einem pH-Wert von 7 und
45°C in
Gegenwart und Abwesenheit von bis zu 500 mM 2-KLG verbleibt.
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Die 7 zeigt
die spektrophotometrische Messung von NADPH in einer in vitro-Cofaktor-Recycling-Reaktion.
Der Absorptionswert wurde bei 340 nm gemessen. Die anfängliche
Absorptionswertablesung betrug 0,7, und zwar bevor die Enzyme hinzugesetzt
wurden. Zusätzliche
Aliquote an GDH wurden bei etwa 12 und 23 Minuten hinzugegeben.
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Die 8 zeigt
die spektrophotometrische Messung von NADPH in einer in vitro-Cofaktor-Recyclingreaktion.
Der Absorptionswert wurde bei 340 nm gemessen. Genügend NaCl
wurde bei etwa 5 Minuten hinzugesetzt, um die Endkonzentration auf
0,5 M zu bringen.
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Die 9 zeigt
den Km- und relativen Vmax-Wert von Reduktase für 2,5-DKG in Gegenwart steigender
Mengen an 2-KLG.
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GENAUE BESCHREIBUNG
DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
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Definitionen
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Die
folgenden Abkürzungen
gelten, wie sie hierin verwendet werden, für Glukose (G); D-Gluconat (GA);
2-Keto-D-gluconat (2KDG); 2,5-Diketo-D-gluconat (2,5DKG oder DKG),
2-Keto-L-gulonsäure
(2KLG oder KLG), L-Idonsäure
(IA), Ascorbinsäure
(ASA), Glukosedehydrogenase (GDH), Gluconsäuredehydrogenase (GADH), 2,5-Diketo-D-gluconatreduktase
(DKGR), und 2-Keto-D-gluconatreduktase
(KDGDH).
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Wie
hierin verwendet, bezieht sich der Ausdruck "nicht-fermentativ" oder "in vitro" auf ein biokatalytisches Verfahren,
welches die enzymatische Aktivität
einer Zelle ausnutzt. Die Zellen können nicht lebensfähig oder
lebensfähig
sein und nicht signifikant wachsen. Die Zellen können genetisch verändert werden,
um ihren Verbrauch an Glukose und/oder jedweden erzeugten Zwischenprodukten
zu eliminieren. Das in vitro-Verfahren der vorliegenden Erfindung
beinhaltet die Verwendung von Zellmembranen, weiche mit dem biokatalytischen
Verfahren assoziierte enzymatische Aktivität beinhalten, die Verwendung
von permeabilisierten Zellen oder lyophylisierten Zellen, welche
die mit dem biokatalytischen Verfahren assoziierte enzymatische
Aktivität umfassen,
und die Verwendung einer Wirtszelle oder von Wirtszellmembranen
oder -fragmenten in einer beliebigen Form, welche die notwendige
enzymatische Aktivität
für die
biokatalytische Umwandlung einer Kohlenstoffquelle zu einem beliebigen
der ASA-Zwischenprodukte bereitstellt, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf,
GA, KDG, DKG und KLG. Die Zelle kann eine rekombinante Zelle, welche
heterologe Nukleinsäure,
die eine gewünschte
enzymatische Aktivität
kodiert, umfasst, oder eine natürlich
vorkommende Zelle, welche die gewünschte enzymatische Aktivität umfasst,
sein. Der Ausdruck "Bioreaktor", wie er hierin verwendet
wird, bezieht sich auf die Umgebung, innerhalb der das nicht-fermentative
oder in-vitro-Verfahren abläuft.
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Viele
Enzyme sind nur aktiv in Gegenwart eines Cofaktors, wie zum Beispiel
NAD+ oder NADP+.
Der Ausdruck Cofaktor, wie er hierin verwendet wird, bezieht sich
auf ein Substrat, welches seiner Natur nach für die enzymatische Reaktion
sekundär
ist, jedoch für
die enzymatische Reaktion absolut notwendig ist. Wie hierin verwendet,
schließt
der Ausdruck "Cofaktor" NAD+/NADH;
NADP+/NADPH; ATP; ADP, FAD/FADH2 und FMN/FMNH2 ein, ist jedoch nicht darauf beschränkt. Der
Ausdruck "Regeneration
vom Cofaktor" oder "Recycling vom Cofaktor" innerhalb des in
vitro-Systems bezieht sich auf das Phänomen der kontinuierlichen
Oxidation und Reduktion des erforderlichen Cofaktors durch Biokatalyse,
und zwar dergestalt, dass der erforderliche Cofaktor in der angemessenen
Form vorliegt, damit die Katalyse stattfinden kann. In der vorliegenden
Erfindung sieht die Regeneration vom Cofaktor eine Umgebung vor,
in der eine reduzierte Form eines Cofaktors für ein reduzierendes Enzym verfügbar ist,
und eine oxidative Form des Cofaktors für ein oxidierendes Enzym verfügbar ist.
Die vorliegende Erfindung beinhaltet die Regeneration von Cofaktor
zwischen irgendeinem enzymatischen Oxidationsschritt und irgendeinem
enzymatischen Reduktionsschritt bei dem biokatalytischen Stoffwechselweg
von einer Kohlenstoffquelle zu dem ASA-Zwischenprodukt, zum Beispiel
KLG. Der erforderliche Cofaktor kann in katalytischen Mengen vorliegen,
die durch die Wirtszellenumgebung bereitgestellt werden, oder kann
exogen zu Beginn des Bioreaktorverfahrens in stöchiometrischen Mengen in entweder
oxidierter oder reduzierter Form vorgesehen werden.
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Wie
hierin verwendet, beinhaltet der Ausdruck Kohlenstoffquelle geeignete
Kohlenstoffquellen, die normalerweise durch Enterobacteriaceae-Stämme verwendet
werden, wie 6-Kohlenstoff-Zucker, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf,
Glukose, Gulose, Sorbose, Fructose, Idose, Galactose und Mannose,
alle entweder in der D- oder L-Form, oder eine Kombination von 6-Kohlenstoff-Zuckern, wie Saccharose,
oder 6-Kohlenstoff-Zuckersäuren,
einschließlich,
jedoch nicht beschränkt
auf, 2-Keto-L-gulonsäure,
Idonsäure,
Gluconsäure,
6-Phosphogluconat,
2-Keto-D-gluconsäure,
5-Keto-D-gluconsäure,
2-Ketogluconatphosphat, 2,5-Diketo-L-gulonsäure, 2,3-L-Diketogulonsäure, Dehydroascorbinsäure, Erythroascorbinsäure und
D-Mannonsäure,
oder die enzymatischen Derivate von diesen, solange die Kohlenstoffquelle
in der Lage ist, zu einem ASA-Zwischenprodukt wie zum Beispiel KDG,
DKG und KLG umgewandelt zu werden.
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Wie
hierin verwendet, bezieht sich die Familie "Enterobacteriaceae" auf bakterielle Stämme mit den allgemeinen Charakteristika,
dass sie gramnegativ sind und fakultativ anaerob sind. Bevorzugte
Enterobacteriaceae-Stämme
sind jene, welche in der Lage sind, 2,5-Diketo-D-gluconsäure aus
D-Glukoselösungen
zu produzieren. Eingeschlossen in der Familie der Enterobacteriaceae,
welche in der Lage sind, 2,5-Diketo-D-gluconsäure aus D-Glukoselösungen herzustellen,
sind zum Beispiel die Gattungen Erwinia, Enterobacter, Gluconobacter
und Pantoea. Zwischenprodukte bei dem mikrobiellen Kohlenhydrat-Stoffwechselweg
aus einer Kohlenstoffquelle zu ASA schließen GA, 2KDG, 2,5DKG, 5DKG,
2KLG und IA ein, sind jedoch nicht darauf beschränkt. In der vorliegenden Erfindung
ist ein bevorzugter Enterobacteriaceae-Fermentationsstamm eine Pantoea-Spezies
und insbesondere Pantoea citrea. Vier Sterioisomere von Ascorbinsäure sind
möglich:
L-Ascorbinsäure,
D-Araboascorbinsäure
(Erythorbinsäure),
welche Vitamin-C-Aktivität
zeigt, L-Araboascorbinsäure
und D-Xyloascorbinsäure.
Wie hierin verwendet, beinhaltet der Ausdruck ASA-Zwischenprodukt
jedwedes Produkt in dem Stoffwechselweg zu ASA, einschließlich KDG,
DKG und KLG, jedoch nicht darauf beschränkt.
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Wie
hierin verwendet, bezieht sich der Ausdruck "rekombinant" auf eine Wirtszelle, welche Nukleinsäure enthält, die
nicht natürlicherweise
in dem Organismus vorkommt, und/oder auf Wirtszellen, welche zusätzliche
Kopien an rekombinant eingeführter
endogener Nukleinsäure
aufweisen. Der Ausdruck "heterolog", wie hierin verwendet,
bezieht sich auf Nukleinsäure-
oder Aminosäuresequenzen,
welche in der Wirtszelle natürlicherweise
nicht auftreten. Wie hierin verwendet, bezieht sich der Ausdruck "endogen" auf eine Nukleinsäure, welche
in der Wirtszelle natürlich
auftritt.
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Wie
hierin verwendet, bezieht sich "Nukleinsäure" auf eine Nukleotid-
oder Polynukleotidsequenz und Fragmente oder Teilen davon, und auf
DNA oder RNA von genomischem oder synthetischem Ursprung, welche
doppelsträngig
oder einzelsträngig
sein können,
je nachdem, ob sie den Sinn- oder Antisinnstrang repräsentieren.
Wie hierin verwendet, bezieht sich "Aminosäure" auf Peptid- oder Proteinsequenzen oder Abschnitte
davon.
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Wie
hierin verwendet, bezieht sich der Ausdruck "Mutation" auf jede beliebige Veränderung
in einer Nukleinsäure,
sodass das Produkt der Nukleinsäure
inaktiviert oder eliminiert ist. Beispiele für Mutationen schließen Punktmutationen,
Leserahmen-Verschiebungsmutationen und Deletionen eines Teils oder
der Gesamtheit eines Gens, welches eine enzymatische Aktivität kodiert,
wie eine oxidative Enzymaktivität
oder eine reduzierende Aktivität,
ein, sind jedoch nicht darauf beschränkt. In einer hierin beschriebenen
Ausführungsform
zur Herstellung von KLG, wobei Cofaktor regeneriert wird, wird Nukleinsäure, die
membrangebundene GDH-Aktivität
kodiert, mutiert, wodurch die endogene GDH-Aktivität inaktiviert wird. In einer
weiteren Ausführungsform
wird die 2-Keto-D-gluconat-dehydrogenase-Aktivität inaktiviert,
wodurch eine optimierte Herstellung des Zwischenprodukts KDG ermöglicht wird.
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Der
Ausdruck "oxidatives
Enzym", wie er hierin
verwendet wird, bezieht sich auf ein Enzym oder Enzymsystem, welches
die Umwandlung eines Substrats eines gegebenen Oxidationszustands
zu einem Produkt eines höheren
Oxidationszustandes als dem des Substrats katalysieren kann. Der
Ausdruck "reduzierendes
Enzym" bezieht sich
auf ein Enzym oder Enzymsystem, welches die Umwandlung eines Substrats
eines bestimmten Oxidationszustands zu einem Produkt eines niedrigeren
Oxidationszustands als dem des Substrats katalysieren kann. Oxidative
Enzyme, welche mit der Biokatalyse von D-Glukose zu KLG in Verbindung stehen,
schließen
unter anderen D-Glukose-Dehydrogenase, D-Gluconatdehydrogenase und
2-Keto-D-gluconatdehydrogenase ein. Reduzierende Enzyme, welche
mit der Biokatalyse von Stoffwechselzwischenprodukten von ASA zu
KLG in Verbindung stehen, schließen unter anderen 2,5-Diketo-D-gluconatreduktase
(DKGR), 2-Keto-Reduktase (2-KR) und 5-Keto-Reduktase (5-KR) ein.
Solche Enzyme schließen
jene ein, die natürlich durch
den Wirtsstamm hergestellt werden, oder jene, die über rekombinante
Mittel bzw. Methoden eingeführt werden.
In einer Ausführungsform,
welche hierin beschrieben ist, läuft
das Verfahren in einer Pantoea citrea-Wirtszelle ab, bei der die
natürlich
auftretende, membrangebundene, nicht-NADP+-abhängige GDH-Aktivität eliminiert
ist und eine cytosolische NADP+-abhängige GDH
rekombinant eingeführt
wurde. In einer anderen Ausführungsform
wird eine heterologe Nukleinsäure,
die eine Reduktaseaktivität
kodiert, in die Wirtszelle eingeführt. In einer bevorzugten Ausführungsform
ist die Reduktaseaktivität
aus einer Coryneform-Spezies oder
einer Erwinia-Spezies erhältlich.
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Ausdruck "Stoffwechselenzym" auf jedwedes Enzym, welches in die
biokatalytische Umwandlung einer Kohlenstoffquelle zu einem ASA-Zwischenprodukt,
zum Beispiel KDG, DKG und KLG involviert ist.
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Die
Ausdrücke "isoliert" oder "gereinigt", wie hierin verwendet,
beziehen sich auf eine Nukleinsäure oder
ein Protein oder Peptid oder Cofaktor, welches/welcher aus mindestens
einer Komponente entfernt ist, mit welcher es/er in natürlicher
Weise assoziiert ist. In der vorliegenden Erfindung kann eine isolierte
Nukleinsäure
einen Vektor einschließen,
der die Nukleinsäure
umfasst.
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Es
wird im Fachbereich allgemein verstanden, dass die sauren Derivate
von Sacchariden in einer Vielzahl von Ionisierungszuständen in
Abhängigkeit
von ihren Umgebungsmedien existieren können, und zwar, wenn sie in
Lösung
sind, oder außerhalb
einer Lösung,
aus der sie hergestellt werden, wenn sie in fester Form sind. Die
Verwendung eines Ausdrucks wie zum Beispiel Idonsäure, um
solche Moleküle
zu bezeichnen, soll alle Ionisationszustände des erwähnten organischen Moleküls einschließen. Somit
beziehen sich "Idonsäure", ihre zyklisierte
Form "Idonolacton" und "Idonat" auf den gleichen
organischen Rest und sie sollen keine besonderen Ionisationszustände oder
chemischen Formen spezifizieren.
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GENAUE BESCHREIBUNG
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Die
vorliegende Erfindung betrifft die biokatalytische Herstellung des
ASA-Zwischenprodukts
KLG aus einer Kohlenstoffquelle in einer in vitro- oder nicht-fermentativen Umgebung.
Das Verfahren erfordert die Gegenwart von enzymatischem Cofaktor.
Der enzymatische Cofaktor wird regeneriert. Aufgrund der Kosten
vom Cofaktor ist es in starkem Maße vorteilhaft, ein in vitro-Verfahren
anzuwenden, welches die Regeneration von katalytischen Mengen an
Cofaktor, welche durch die Umgebung der Wirtszelle bereitgestellt
werden oder exogen bereitgestellt werden, ermöglicht.
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Nicht-fermentative
Herstellung von ASA-Zwischenprodukten
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Die
vorliegende Erfindung sieht ein Mittel zur Herstellung von ASA-Zwischenprodukten
vor. Solche Zwischenprodukte können
weiter zu ASA, ASA-Stereoisomeren oder anderen Produkten, wie Erythorbat
prozessiert werden.
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Wenn
KLG das gewünschte
ASA-Zwischenprodukt ist, wird der Bioreaktor mit lebensfähigen oder nicht-lebensfähigen Pantoea
citrea-Wirtszellen und einer Kohlenstoffquelle wie Glukose, welche
biokatalytisch durch drei oxidative Schritte, wie in der 2 gezeigt,
und einen reduzierenden Schritt zu KLG umgewandelt wird, beladen.
In dieser Ausführungsform
kann die Reduktaseaktivität
durch Nukleinsäure,
welche innerhalb der Pantoea citrea-Wirtszelle enthalten ist, kodiert
werden, oder exogen zugegeben werden. In dieser Ausführungsform
erfordert die erste oxidative enzymatische Aktivität eine oxidierte
Form des Cofaktors, und die reduzierende enzymatische Aktivität erfordert
eine reduzierte Form des Cofaktors. In einer hierin beschriebenen bevorzugten
Ausführungsform
wird die Pantoea citrea-Zelle modifiziert, um die natürlich vorkommende GDH-Aktivität zu eliminieren,
und eine heterologe GDH, die aus T. acidophilum, Cryptococcus uniguttalatus oder
Bacillus-Spezies erhältlich
ist und eine Spezifität
für NADPH+ besitzt, wird in die Pantoea-Zelle eingeführt, um
ein Cofaktor-Recyclingsystem bereitzustellen, welches einen Cofaktor
erfordert und regeneriert. Diese Ausführungsform stellt ein Mittel
zur Cofaktor-Regenerierung bereit, wodurch die Kosten für ein kontinuierliches
Hinzusetzen von exogenem Cofaktor zum Bioreaktor für die Herstellung
von KLG in Pantoea-Zellen eliminiert werden. In dieser Ausführungsform
umfasst die Wirtszelle weiterhin 2,5-DKG-Reduktaseaktivität kodierende Nukleinsäure, oder
die 2,5-DKG-Reduktase
wird exogen dem Bioreaktor zugegeben.
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In
einer anderen Ausführungsform
zur Herstellung von KLG wird der Bioreaktor mit Pantoea citrea-Zellen,
welche membrangebundene GDH kodierende Nukleinsäure umfassen, geeigneten Enzymen
und Cofaktor beladen, und Glukonsäure wird hinzugesetzt, welche
zu DKG umgewandelt wird. Die Reaktionsmischung wird dann anaerob
gemacht, und Glukose wird hinzugegeben. Die GDH wandelt die Glukose
zu GA um, und die Reduktase wandelt DKG zu KLG um, während Cofaktor
recycelt wird. Wenn diese Reaktionen vollständig abgeschlossen sind, wird
Sauerstoff hinzugesetzt, um GA zu DKG umzuwandeln, und die Zyklen
werden fortgesetzt.
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Biokatalytische
in vitro-Umgebung
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Ein
biokatalytisches Verfahren zur Umwandlung einer Kohlenstoffquelle
zu einem ASA-Zwischenprodukt beginnt mit einer geeigneten Kohlenstoffquelle,
die durch Enterobacteriaceae-Stämme
verwendet wird, wie einen 6-Kohlenstoff-Zucker, einschließlich zum Beispiel Glukose
oder eine 6-Kohlenstoff-Zuckersäure,
wie zum Beispiel KDG. Andere Metabolitquellen schließen Galactose,
Lactose, Fructose oder die enzymatischen Derivate davon ein, sind
jedoch nicht darauf beschränkt.
Zusätzlich
zu einer geeigneten Kohlenstoffquelle müssen Medien geeignete Mineralien,
Salze, Cofaktoren, Puffer und andere Komponenten enthalten, welche jenen
im Fachbereich Erfahrenen zur Aufrechterhaltung von Kulturen und
zur Förderung
des enzymatischen Stoffwechselweges, der zur Herstellung von gewünschten
Endprodukten notwendig ist, bekannt sind. Bevorzugte Salze für den Bioreaktor
sind Na+, K+, NH4 +, SO4 – und
Acetat. Die Zellen werden zuerst wachsen gelassen, und für das nicht-fermentative
Verfahren wird die für
das Wachstum verwendete Kohlenstoffquelle eliminiert, wird der pH-Wert
zwischen etwa pH 4 und etwa pH 9 gehalten und liegt Sauerstoff vor.
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Bei
dem biokatalytischen in vitro-Verfahren machen die Kohlenstoffquelle
und Metabolite davon enzymatische Oxidationsschritte oder enzymatische
Oxidations- und enzymatische Reduktionsschritte durch, welche außerhalb
der intrazellulären
Wirtszellenumgebung stattfinden können, und welche die enzymatische
Aktivität,
welche mit der Wirtszelle assoziiert ist, ausnutzen, und sie laufen
durch einen Stoffwechselweg, um das gewünschte ASA-Zwischenprodukt
zu bilden. Die enzymatischen Schritte können der Reihe nach oder gleichzeitig
innerhalb des Bioreaktors ablaufen, und einige weisen einen Cofaktor-Bedarf
auf, um das gewünschte ASA-Zwischenprodukt
zu erzeugen. Die vorliegende Erfindung beinhaltet ein in vitro-Verfahren,
bei dem die Wirtszellen mit einer organischen Substanz behandelt
werden, wie in Beispiel V beschrieben, sodass die Zellen nicht-lebensfähig sind,
wobei immer noch Enzyme zur Oxidation und Reduktion der gewünschten
Kohlenstoffquelle und/oder von Metaboliten davon in der Biokatalyse
von Kohlenstoffquelle zu ASA-Zwischenprodukt verfügbar verbleiben.
Die vorliegende Erfindung beinhaltet ebenfalls ein in vitro-Verfahren,
bei dem die Wirtszellen lyophilisiert werden, mittels eines beliebigen
Mittels permeabilisiert werden, sprühgetrocknet werden, zerbrochen
oder in anderer Weise behandelt werden, sodass die Enzyme für die Umwandlung
der Kohlenstoffquelle zum ASA-Zwischenprodukt verfügbar sind.
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Die
enzymatischen oxidativen oder reduzierenden Aktivitäten können an
eine Wirtszellenmembran gebunden werden, immobilisiert werden, wie
an ein Harz, zum Beispiel AminoLink-Kopplungsgel (von Pierce Chemical
Co), an ein Polymer, oder sie können
löslich
in der Bioreaktorumgebung sein. In einer bevorzugten Ausführungsform
ist mindestens ein oxidatives Enzym membrangebunden. Die Umgebung
kann in einem organischen oder wässrigen
System oder einer Kombination von beiden voranschreiten, oder sie
kann in einem Gefäß oder mehreren
voranschreiten. In einer Ausführungsform
läuft das
Verfahren in zwei Gefäßen ab,
wobei eines Sauerstoff verwendet und eines anaerob ist. Zum Beispiel
können
die membrangebundenen Enzyme, welche Sauerstoff erfordern (GDH,
GADH, KDGDH) von jenen Enzymen isoliert werden, welche keinen Sauerstoff
erfordern (Cofaktor-abhängige
GDH, Cofaktor-abhängige
DKGR), wodurch die Verwendung eines Gefäßes mit kleinerem Volumen,
das Sauerstoff erfordert, ermöglicht
wird, wodurch Kosten gesenkt werden. Der Bioreaktor kann in einem
satzartigen oder in einem kontinuierlichen Verfahren durchgeführt werden.
In einem Ansatz-System wird unabhängig von dem, was hinzugesetzt
wird, die gesamte Brühe
zur gleichen Zeit abgeerntet. In einem kontinuierlichen System wird
die Brühe
regelmäßig für eine stromabwärts liegende
Prozessierung entfernt, während
frisches Substrat hinzugesetzt wird. Die erzeugten Zwischenprodukte
können
aus der Fermentationsbrühe
mittels einer Vielzahl von Verfahren rückgewonnen werden, einschließlich Ionenaustauschharzen,
Absorptions- oder Ionenverzögerungs-Harzen,
Aktivkohle, Konzentration/Kristallisation, Hindurchleiten durch
eine Membran etc.
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Das
Bioreaktorverfahren kann ebenfalls mehr als einen Zelltyp involvieren,
zum Beispiel kann eine Zelle die oxidativen Aktivitäten umfassen,
und eine zweite Zelle kann die reduzierenden Aktivitäten umfassen. In
einer anderen Ausführungsform
wird die Wirtszelle permeabilisiert oder lyophilisiert (Izumi et
al., J. Ferment. Technol. 61 (1983) 135-142), solange die notwendigen
enzymati schen Aktivitäten
verfügbar
bleiben, um die Kohlenstoffquelle oder Derivate davon umzuwandeln.
Der Bioreaktor kann mit einigen enzymatischen Aktivitäten, die
exogen bereitgestellt werden, laufen, und in einer Umgebung, in
der Lösungsmittel
oder lange Polymere bereitgestellt werden, welche die enzymatischen
Aktivitäten
stabilisieren oder erhöhen.
In einer hierin beschriebenen Ausführungsform wird Methanol oder
Ethanol verwendet, um Reduktaseaktivität zu erhöhen. In einer anderen Ausführungsform
wird Gafquat verwendet, um die Reduktase zu stabilisieren (siehe
Gibson et al., US-Patent 5 240 843).
-
In
einem hierin beschriebenen illustrativen Bioreaktor ist die Wirtszelle
eine permeabilisierte Pantoea citrea-Zelle, wobei D-Glukose als
eine Kohlenstoffquelle bereitgestellt wird, welche eine Reihe von
oxidativen Schritten durch enzymatische Umwandlungen erfährt. Die
oxidierenden Enzyme schließen
GDH, GADH und DGDH und einen reduzierenden Schritt ein, welcher
2-DKGR involviert (siehe US-Patent 3 790 444), um KLG zu erhalten.
Das durch ein Verfahren der vorliegenden Erfindung hergestellte
KLG kann weiter zu Ascorbinsäure
umgewandelt werden, und das KDG zu Erythorbat, und zwar mit Hilfe
von Mitteln, die jenen im Fachbereich Erfahrenen bekannt sind, siehe
zum Beispiel Reichstein und Grussner, Helv. Chim. Acta., 17, 311-328 (1934).
-
Cofaktor-Regenerierung
-
Einer
der Vorteile des Verfahrens der vorliegenden Erfindung liegt in
der Regenerierung von Cofaktor, der für Stoffwechsel-Enzyme erforderlich
ist. Beispiele für
Cofaktor, welcher in dem vorliegenden Verfahren verwendet werden
kann, schließen
NAD+/NADH; NADP+/NADPH;
ATP; ADP, FAD/FADH2 und FMN/FMNH2 ein, sind jedoch nicht darauf beschränkt.
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In
einer Ausführungsform
der Erfindung wird eine Kohlenstoffquelle zu KLG in einem Verfahren
umgewandelt, welches die Cofaktor-Regenerierung involviert, wie
in der 1 gezeigt. Bei diesem enzymatischen Cofaktor-Regenerierungsverfahren
wird ein Äquivalent
an D-Glukose zu einem Äquivalent
D- Gluconat oxidiert, und
ein Äquivalent
NADP+ wird zu einem Äquivalent NADPH durch die katalytische
Wirkung von GDH reduziert. Das eine Äquivalent D-Gluconat, welches durch die GDH hergestellt
wird, wird dann zu einem Äquivalent 2-KDG
oxidiert, und dann zu einem Äquivalent
2,5-DKG durch die Wirkung von den membrangebundenen Dehydrogenasen
GADH bzw. KDGDH. Das eine erzeugte Äquivalent 2,5-DKG wird dann
zu einem Äquivalent 2-KLG
reduziert, und das NADPH wird zu einem Äquivalent NADP+ zurück oxidiert
durch die Wirkung der 2,5-DKG-Reduktase, wodurch in wirksamer Weise
der äquivalente
Cofaktor, der für
ein zweites Äquivalent
an D-Glukose-Oxidation verfügbar
sein soll, recycelt wird. Andere Verfahren der Cofaktor-Regeneration
können chemische,
fotochemische und elektrochemische Mittel einschließen, wobei
das Äquivalent
oxidiertes NADP+ direkt zu einem Äquivalent
NADPH entweder durch chemische, fotochemische oder elektrochemische
Mittel reduziert wird. Die Menge an Cofaktor, die exogen dem Bioreaktor
hinzugefügt
wird, liegt zwischen etwa 1 μM bis
etwa 5 mM, und in einer bevorzugten Ausführungsform zwischen etwa 5 μM bis etwa
1 mM. Wie hierin in den Beispielen veranschaulicht, beeinflusst
NaCl den Km-Wert für
NADPH, wohingegen KLG, eine einspeiste Spezies, den Km-Wert nicht
beeinflusst. Deshalb gilt, wenn NaCl in dem Bioreaktor vorliegt,
wäre mehr NADPH
erforderlich, um eine optimale Rate aufrechtzuerhalten. Ferner,
wie in den Beispielen beschrieben, hatten die meisten getesteten
Salze eine Wirkung auf die thermische Stabilität der Reduktase. Wie es durch den
Fachmann anerkannt wird, können
in Abhängigkeit
von den Konditionen des Bioreaktors, wie der Temperatur, die Salzanteile
eingestellt werden, um eine Ausgewogenheit zwischen thermischer
Stabilität
und annehmbaren Geschwindigkeiten bereitzustellen. Ein exogen einem
in vitro-System zugesetzter Cofaktor kann allein oder in Kombination
mit anderen Substanzen, die mit einer biokatalytischen Umwandlung
einer Kohlenstoffquelle zu einem ASA-Zwischenprodukt assoziiert sind, hinzugesetzt
werden. Das vorliegende Verfahren beinhaltet die Verwendung von
an einem Träger
immobilisierten Cofaktor, einem chemisch veränderten Cofaktor, wie bei der
Anheftung an ein langes Polymer, und die Verwendung von Cofaktor
in einer isolierten oder gereinigten Form.
-
Der
erforderliche Cofaktor kann ebenfalls aus der biokatalytischen Umgebung über eine
Nano-Filtration gereinigt und wieder verwendet werden. Verfahren
zur Verwendung von Nano-Filtrationsmembranen zur Cofaktorretention
werden zum Beispiel in Seelbach et al. beschrieben (1997, Enzyme
and Microbial Technology, Band 20, Seiten 389-392).
-
Rekombinante
Verfahren
-
Wirtszellen
-
Jede
beliebigen oxidativen oder reduzierenden Enzyme, die notwendig sind,
um einen Kohlenhydrat-Stoffwechsel einer Wirtszelle zu ASA-Zwischenprodukten,
wie zum Beispiel KDG, DKG oder KLG, zu steuern, können über rekombinante
DNA-Techniken eingeführt
werden, welche jenen im Fachbereich bekannt sind, wenn solche Enzyme
in der Wirtszelle nicht natürlich
auftreten. Alternativ können
Enzyme, welche einen gewünschten
Stoffwechsel behindern würden,
durch rekombinante DNA-Verfahren mutiert werden. Die vorliegende
Erfindung beinhaltet die rekombinante Einführung oder Mutation eines beliebigen
Enzyms oder eines Zwischenprodukts, die notwendig ist, um einen
gewünschten
Stoffwechselweg zu erreichen.
-
In
einer Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung wird eine Kohlenstoffquelle wie Glukose
zu KLG durch mehrere Oxidationsschritte und einen Reduktionsschritt
umgewandelt. In dieser Ausführungsform
erfordern der erste Oxidationsschritt und der reduzierende Schritt
Cofaktor. Die Wirtszelle ist Pantoea citrea, die natürlich auftretende
Nukleinsäure,
kodierend Glukosedehydrogenase (GDH), wird mutiert, sodass die Dehydrogenaseaktivität eliminiert
wird und eine heterologe GDH in die Zelle eingeführt wird. Die vorliegende Erfindung
beinhaltet eine Wirtszelle mit zusätzlicher Mutation von Enzymen
in dem Kohlenstofffluss-Stoffwechselweg, was die Produktion beeinflusst.
Für allgemeine
Techniken siehe zum Beispiel die in Maniatis et al., 1989, Molecular
Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N. Y.
und Ausubel et al., 1989, Current Protocols in Molecular Biology,
Greene Publishing "Associates
and Wiley Interscience, N. Y. beschriebenen Techniken.
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In
einer Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung wird DKG-Reduktase (DKGR) kodierende
Nukleinsäure
rekombinant in den Pantoea-Fermentationsstamm eingeführt. Es
sind viele Spezies gefunden worden, welche DKGR enthalten, insbesondere
Vertreter der Coryneform-Gruppe, einschließlich der Gattungen Corynebacterium,
Brevibacterium und Arthrobacter. In einer Ausführungsform der vorliegenden
Erfindung wird 2,5-DKGR, die vom Corynebacterium sp.-Stamm SHS752001
erhältlich
ist (Grindley et al., 1988, Applied and Environmental Microbiology
54: 1770-1775), in Pantoea citrea rekombinant eingeführt. In
einer anderen Ausführungsform
wird 2,5-DKG-Reduktase, die von Erwinia herbicola erhältlich ist,
beschrieben in dem US-Patent Nr. 5 008 193 von Anderson et al.,
rekombinant in Pantoea citrea eingeführt.
-
Quellen
für Nukleinsäuren, die
oxidative oder reduzierende Enzyme kodieren, schließen die
Folgenden ein:
| ENZYM | REFERENZANGABE |
| Glukosedehydrogenase | Smith
et al. 1989, Biochem. J. 261: 973; Neijssel et al. 1989, Antonie
Van Leauvenhoek 56 (1): 51-61 |
| Gluconsäuredehydrogenase | Matsushita
et al. 1979, J. Biochem. 85: 1173; Kulbe et al. 1987, Ann. N. Y.
Acad Sci 506: 552 |
| 2-Keto-D-gluconsäuredehydrogenase | Stroshane
1977 Biotechnol. BioEng 19 (4) 459 |
| 2-Keto-Giuconatreduktase | J.
Gen. Microbiol. 1991, 137: 1479 |
| 2,5-Diketo-D-gluconsäurereduktase | United
States Patent Nrn.: 5 795 761; 5 376 544; 5 583 025; 4 757 012;
4 758 514; 5 008 193; 5 004 690; 5 032 514 |
-
Vektorsequenzen
-
Expressionsvektoren,
die beim Exprimieren der Stoffwechselenzyme, zum Beispiel eine Dehydrogenase
oder eine Reduktase, des vorliegenden erfindungsgemäßen Verfahrens
in Wirtsmikroorganismen verwendet werden, umfassen mindestens einen
mit dem Enzym assoziierten Promotor, wobei der Promotor in der Wirtszelle
funktionell ist. In einer Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung ist der Promotor der Promotor vom Wild-Typ
für das
gewählte
Enzym, und in einer anderen Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung ist der Promotor für das Enzym heterolog, jedoch
in der Wirtszelle immer noch funktionell. In einer Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung wird das Enzym kodierende Nukleinsäure stabil
in das Mikroorganismusgenom integriert.
-
In
einer bevorzugten Ausführungsform
enthält
der Expressionsvektor eine Kassette mit mehreren Klonierstellen,
welche vorzugsweise mindestens eine Restriktionsendonuklease-Stelle
umfasst, die für
den Vektor einzigartig ist, um die Einfachheit der Nukleinsäurehandhabung
zu begünstigen.
In einer bevorzugten Ausführungsform
umfasst der Vektor ebenfalls einen oder mehrere selektierbare Marker.
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Ausdruck, selektierbarer
Marker, auf ein Gen, welches zur Expression in dem Wirtsmikroorganismus
in der Lage ist, welches die Leichtigkeit der Selektion von jenen
den Vektor enthaltenden Wirten erlaubt. Beispiele für solche
selektierbare Marker schließen
Antibiotika, wie Erythromycin, Actinomycin, Chloramphenicol und
Tetracyclin ein, sind jedoch nicht darauf beschränkt.
-
Ein
bevorzugtes Plasmid für
die rekombinante Einführung
von nicht natürlich
auftretenden Enzymen oder Zwischenprodukten in einen Stamm von Enterobacferiaceae
ist RSF1010, ein mobilisierbares, jedoch nicht selbst übertragbares
Plasmid, welches die Fähigkeit
hat, sich in einem breiten Bereich von bakteriellen Wirten, einschließlich Gram(–)- und
Gram(+)-Bakterien, zu replizieren (Frey et al., 1989, The Molecular
biology of IncQ plasmids. In: Thomas (Hrsg.), Promiscuous Plasmids
of Gram Negative Bacteria. Academic Press, London, S. 79-94). Frey
et al. (1992, Gene 113: 101-106) berichten über drei Regionen, bei denen
man herausfand, dass sie die Mobilisierungseigenschaften von RSF1010
beeinflussen.
-
Transformation
-
Allgemeine
Transformationsprozeduren werden in Current Protocols In Molecular
Biology (Band 1, herausgegeben von Ausubel et al., John Wiley & Sons, Inc. 1987,
Kapitel 9) gelehrt und schließen
Kalziumphosphat-Verfahren, die Transformation unter Verwendung von
DEAE-Dextran und die Elektroporation ein. Eine Vielzahl von Transformationsprozeduren
ist jenen im Fachbereich Erfahrenen zur Einführung von Nukleinsäure, die
ein Stoffwechselenzym kodiert, in eine bestimmte Wirtszelle bekannt.
Das vorliegende Verfahren beinhaltet Stoffwechselenzyme, die von
rekombinanten Wirtszellen produziert werden und daraus gereinigt
werden und exogen in die in vitro-Umgebung hinzugegeben werden,
sowie Verfahren, bei denen das Stoffwechselenzym, das entweder heterolog
oder endogen gegenüber
der Wirtszelle ist, durch eine aktiv wachsende Wirtszelle exprimiert
wird oder in der Membran einer nicht-lebensfähigen Wirtszelle vorliegt.
Eine Vielzahl von Wirtszellen kann für die rekombinante Produktion
der Stoffwechselenzyme, die exogen hinzugesetzt werden sollen, verwendet
werden, einschließlich
bakterielle, pilzliche, Säuger-,
Insekten- und Pflanzenzellen. Pflanzentransformations-Verfahren
werden in Rodriquez (WO 95/14099, veröffentlicht am 26. Mai 1995)
gelehrt.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
des Verfahrens ist die Wirtszelle eine Enterobacteriaceae. Eingeschlossen
in der Gruppe der Enterobacteriaceae sind Erwinia-, Enterobacter-,
Gluconobacter- und Pantoea-Spezies. In der vorliegenden Erfindung
ist ein bevorzugter Enterobacteriaceae-Fermentationsstamm eine Pantoea-Spezies
und insbesondere Pantoea citrea. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
ist die Wirtszelle Pantoea citrea, welche Stoffwechselenzyme umfasst,
die zur Umwandlung einer Kohlenstoffquelle zu KLG in der Lage sind.
Die vorliegende Erfindung beinhaltet Stoffwechselwege von einer
Kohlenstoffquelle zu KLG durch ein beliebiges Zwischenprodukt im
mikrobiellen Kohlenhydrat-Stoffwechsel, der in der Lage ist, eine
Kohlenstoffquelle zur Herstellung von KLG zu verwenden, wobei durch
Zwischenprodukte gegangen wird, welche GA, 2KDG, 2,5DKG, 5DKG und
IA einschließen,
jedoch nicht darauf beschränkt
sind. In einer Ausführungsform
wird Nukleinsäure,
welche das Stoffwechselenzym kodiert, über einen Plasmidvektor eingeführt und in
einer anderen Ausführungsform
wird Nukleinsäure,
die ein Stoffwechselenzym kodiert, in stabiler Weise in das Wirtszellgenom
integriert.
-
Identifikation
von Transformanten
-
Ob
eine Wirtszelle transformiert worden ist, kann durch die Anwesenheit/-Abwesenheit einer
Markergen-Expression nachgewiesen werden, welche darauf hin deuten
kann, ob die Nukleinsäure
von Interesse vorliegt. Gleichwohl sollte seine Expression bestätigt werden.
Wenn zum Beispiel die Nukleinsäure,
welche ein Stoffwechselenzym kodiert, innerhalb einer Markergensequenz
insertiert wird, können
rekombinante Zellen, welche den Insert enthalten, durch die Abwesenheit
der Markergenfunktion identifiziert werden. Alternativ kann ein
Markergen im Tandem mit Nukleinsäure,
welche das Stoffwechselenzym kodiert, unter der Kontrolle eines einzigen
Promotors angeordnet werden. Die Expression des Markergens als Antwort
auf eine Induktion oder Selektion gibt für gewöhnlich die Expression des Enzyms
ebenfalls an.
-
Alternativ
können
Wirtszellen, welche die Kodiersequenz für ein Stoffwechselenzym enthalten
und das Enzym exprimieren, durch eine Vielzahl von Prozeduren, die
jenen im Fachbereich Erfahrenen bekannt sind, identifiziert werden.
Diese Prozeduren schließen
DNA-DNA- oder DNA-RNA-Hybridisierung und Protein-Bioassay- oder
Immunoassay-Techniken ein, welche membran-basierende, lösungs-basierende
oder chip-basierende Technologien für den Nachweis und/oder die
Quantifizierung der Nukleinsäure
oder des Proteins einschließen,
sind jedoch nicht darauf beschränkt.
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Darüber hinaus
kann die Anwesenheit der Enzym-Polynukleotidsequenz in einem Wirtsmikroorganismus
durch DNA-DNA- oder DNA-RNA-Hybridisierung oder Amplifizierung unter
Verwendung von Sonden, Bereichen oder Fragmenten der Enzym-Polynukleotidsequenzen
detektiert werden.
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Assaybedingungen
-
Verfahren
zum Nachweis von ASA-Zwischenprodukten, ASA und ASA-Stereoisomeren
schließen
die Anwendung der Redox-Titration mit 2,6-Dichlorindophenol (Burton
et al. 1979, J. Assoc. Pub. Analysts 17: 105) oder anderen geeigneten
Reagenzien; die Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie
(HPLC) unter Verwendung des Anionenaustausches (J. Chrom. 1980,
196: 163); und Elektro-Redox-Prozeduren (Pachia, 1976, Anal. Chem.
48: 364) ein. Dem erfahrenen Fachmann sind Kontrollen bekannt, die
bei der Nutzung dieser Nachweismethoden anzuwenden sind.
-
Gewinnung
von Zwischenprodukten
-
Sobald
ASA-Zwischenprodukte produziert worden sind, können sie unter Anwendung jedweder
Mittel gewonnen und/oder gereinigt werden, welche jenen im Fachbereich
Erfahrenen bekannt sind, einschließlich der Lyophilisierung,
Kristallisation, Sprühtrocknung
und Elektrodialyse etc. Elektrodialyse Verfahren zur Reinigung von
ASA und ASA-Zwischenprodukten wie KLG sind zum Beispiel in dem US
Patent, Nr. 5 747 306, erteilt am 5. Mai 1998, und dem US Patent,
Nr. 4 767 870, erteilt am 30. August 1998, beschrieben. Alternativ
können die
Zwischenprodukte ebenfalls direkt aus dem Bioreaktor formuliert
und granuliert werden oder zu einer flüssigen Formulierung gebracht
werden.
-
Die
Art und Weise und das Verfahren der Durchführung der vorliegenden Erfindung
können
vollständiger
durch jene im Fachbereich Erfahrenen durch den Bezug auf die folgenden
Beispiele verstanden werden, wobei die Beispiele in keiner Weise
den Umfang der vorliegenden Erfindung oder der darauf gerichteten
Ansprüche
beschränken
sollen.
-
BEISPIELE
-
Beispiel I
-
Dieses
Beispiel beschreibt das Verfahren zur Herstellung einer Pantoea
citrea-Wirtszelle
mit einer Mutation in der natürlich
vorkommenden GDH.
-
Klonieren von Glukosedehydrogenase-Gen
(GDH) aus Panteoa citrea:
-
Das
Glukosedehydrogenase-Gen wurde durch die Polymerase-Kettenreaktion
(PCR) kloniert. Zwei Primer wurden in der PCR verwendet: 5'AGGGAGTGCTTACTACCTTATCTGCGGTATA3' und 5'CGCTAGCTGTGCAATCCATTGATTTTGCACA3'. Nach der PCR wurde
ein DNA-Produkt mit etwa 2 kb in den Vektor, pGEM-T (Promega), kloniert,
und das rekombinante E. coli mit dem korrekten DNA-Insert wurde identifiziert,
und der Klon wurde als pRL bezeichnet. Das DNA-Insert wurde mittels
DNA-Sequenzierung
analysiert, und seine Sequenz stellte sich zu 60-70 % identisch
mit den veröffentlichten
DNA-Sequenzen einer GDH eines Stamms von Pantoea citrea heraus.
-
Erzeugung eines deletierten
GDH-Gens durch die Insertion eines Chloramphenicol-Resistenzgens:
-
Um
die Deletionsmutante des GDH-Gens in Pantoea citrea zu erzeugen,
wurde eine rekombinante Kopie des zu deletierenden Gens durch die
Einführung
eines selektierbaren Markers, Chloramphenicol-Resistenzgen (CAT),
zuerst erzeugt. Die in vitro-erzeugte Kopie wurde in die Pantoea
citrea eingeführt,
und man ließ sie
mit der Kopie vom Wild-Typ durch homologe Rekombination rekombinieren.
Die pRL-DNA wurde dann durch Verdau mit verschiedenen Restriktionsenzymen
analysiert. Zwei SmaI-Spaltungsstellen, die etwa 700 bp innerhalb
der GDH-kodierenden DNA voneinander entfernt lokalisiert waren,
wurden gefunden. Das pRL wurde mit SmaI verdaut, um das 700-bp-Fragment
zu entfernen, welches dann mit einer SmaI-verdauten 1,05-kb-DNA,
die das Chlo ramphenicol-Resistenzgen enthielt, ersetzt wurde, um
das rekombinante Plasmid zu erzeugen, welches als pRLcm4 bezeichnet
wurde. Das Verfahren, welches zur Erzeugung von pRLcm4 verwendet
wurde, waren Standardtechniken, welche durch jene im Fachbereich
Erfahrenen angewandt werden. Die GDH-CAT-kodierende Sequenz vom pRLcm4 wurde
ferner zu einem Plasmid, pGP704, transferiert. Die DNA, welche die
GDH-CAT-Kassette kodierte, wurde aus pRLcm4 durch den kombinierten
Verdau der Restriktionsenzyme AatII und SpeI entfernt. Die kohäsiven Enden
der verdauten DNA wurden durch die Behandlung mit T4-DNA-Polymerase
in Gegenwart von Desoxinukleotidtriphosphatmischungen entfernt.
Die GDH-CAT-Kassette wurde dann mit dem EcoRV-verdauten pGP704 ligiert. Das rekombinante
Plasmid von pGP704, welches die GDH-CAT-Kassette enthielt, wurde
identifiziert und als p704RLcm bezeichnet.
-
Einführung des deletierten GDH-Gens
in das Chromosom von Pantoea citrea:
-
Das
Plasmid p704RLcm wurde in Pantoea citrea vom Wild-Typ durch Elektroporation
eingeführt.
Die transformierten Zellen wurden zuerst auf Agarplatten, die 12,5 μg/ml Chloramphenicol
enthielten, ausplattiert, und resistente Kolonien wurden festgestellt.
Um die wahre Deletionsmutante (welche den Chloramphenicol-resistenten
Phaenotyp zeigen sollte) von Zellen, welche nur einfach das Plasmid
p704RLcm aufgenommen haben, zu unterscheiden, wurden die Chloramphenicol-resistenten
Kolonien gegenüber
Ampicillin, einem weiteren durch p704RLcm getragenen antibiotischen
Resistenzmarker, gescreent. Ampicillinsensitive Kolonien wurden
identifiziert. Mehrere Klone, welche den richtigen Phaenotyp (Chloramphenicol-resistent
und Ampicillin-sensitiv) besaßen,
wurden durch biochemische Assays charakterisiert, und alle zeigten
den GDH-negativen Phaenotyp.
Die DNA-Blot-Analyse bestätigte
ebenfalls, dass das GDH-Gen vom Wild-Typ durch die deletierte Kopie
ersetzt worden war.
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Beispiel II
-
Das
Beispiel II beschreibt das Verfahren zur Herstellung einer Wirtszelle
mit einer Mutation in der natürlich
vorkommenden 2-Keto-D-gluconat-Dehydrogenase (E3).
-
2-Keto-D-gluconat-Dehydrogenase
(EC1.1.99.4) aus Gluconobacter melanogenus wird gemäß der Prozedur
von McIntire et al, (McIntire, W., Singer, T. P., Ameyama, M., Adachi,
O., Matsushita, K., und Shinagawa, E. Biochem. J. (1985) 231, 651-654)
und den Referenzen darin gereinigt. Das gereinigte Protein wird mit
Trypsin und Chymotrypsin oder anderen Proteasen verdaut, um Peptidfragmente
herzustellen, welche mittels HPLC oder anderen Techniken separiert
werden. Einzelne Peptide werden gesammelt und sequenziert. Aus der
Sequenz werden DNA-Sonden synthetisiert, welche sich an die entsprechende
Sequenz in dem Wirtsorganismus oder an das Genom eines verwandten
Organismus anlagern. Unter Anwendung von Standard-PCR-Techniken
werden größere Fragmente
des gewünschten
Gens amplifiziert, gereinigt und sequenziert. Diese Fragmente werden
verwendet, um das Gen zu hybridisieren und ein Klonieren und Sequenzieren des
gesamten Gens möglich
zu machen. Sobald die Sequenz bekannt ist, wird das Gen deletiert,
wie es für D-Gluconat-Dehydrogenase (GDH)
in Beispiel 1 beschrieben ist.
-
Andere
Verfahren, um 2-Keto-D-gluconat-dehydrogenase zu reduzieren oder
zu eliminieren, schließen
Inhibitoren (von organischen Säuren,
wie Citrat und Succinat, wird berichtet, dass sie 2-Keto-D-gluconat-dehydrogenase
inhibieren; Shinagawa, E. und Ameyama, M. Methods in Enzymology
(1982) 89, 194-198) und Änderungen
des pH-Werts oder der Temperatur ein.
-
Das
Enzym kann bezüglich
der Aktivität
oder des Verlusts an Aktivität
unter Anwendung der bei Shinagawa und Ameyama beschriebenen Assays
getestet werden.
-
Beispiel III
-
Das
Beispiel III veranschaulicht ein Verfahren zur Herstellung von KLG
in einem Bioreaktor, wo Cofaktor regeneriert wird.
-
Materialien
und Methoden
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Zellpermeabilisierung
-
400
ml an P. citrea-Zellen mit einer Mutation in der natürlich vorkommenden
Membran-gebundenen GDH wurden auf 80 OD (600 nm) in 10 g/L Gluconat
wachsen gelassen und mit 16 ml einer Mischung aus 10 % Toluol und
90 Aceton 3 Minuten lang bei 22°C
gemischt. Die permeabilisierten Zellen wurden dann 10 Minuten lang
bei 9000 Umdrehungen pro Minute zentrifugiert, und das resultierende
Zellpellet wurde mit 400 ml 50 mM Tris, pH 7, gewaschen. Die Waschungen
wurden noch zweimal wiederholt um die Entfernung von restlichem
organischem Lösungsmittel
sicherzustellen.
-
Beladen des
Reaktors
-
Die
400 ml permeabilisierten Zellen in 50 mM Tris, pH 7, von oben wurden
in ein ein Liter großes
Glasgefäß, das mit
einem Rührer,
einer Temperaturregulierung, einem Sauerstoffzuführrohr, einem Basenzuführrohr,
einem Probenstutzen und Sauerstoff- und pH-Sonden ausgestattet war,
gegeben. 200 μl
MAZU-Antischaum
(BASF) wurden der Lösung
hinzugesetzt, um das überschüssige Schäumen zu
regulieren, Druckluft wurde dem Gefäß hinzugegeben, die Temperatur
wurde auf 28°C
gebracht, und der Rührer
wurde angestellt, damit er bei 1200 Umdrehungen pro Minute lief,
bis die Sauerstoffsondenablesung über 60 % Sättigung angab. 16 Gramm kristalline
Glukose und 4 Gramm kristallines Na-Gluconat wurden dann auf eine Endkonzentration von
10 g/L Gluconat und 40 g/L Glukose hinzugesetzt. Die Mischung ließ man so
lange reagieren, bis das gesamte Gluconat sich zu DKG umgesetzt
hatte. Der Glukoseanteil wurde über
20 g/L gehalten. Aufgrund der Zellpermeabilisation traten minimale
Mengen an Glukose in den nicht-produktiven Zellmetabolismus ein.
Der pH-Wert wurde durch die durchgängige regulierte Zugabe von
50-%iger NaOH bei 7 gehalten.
-
Zugabe der
löslichen
Enzyme und des Cofaktors
-
Sobald
das Gluconat zu DKG umgewandelt worden war, wurden jeweils 2000
Einheiten Cofaktor-abhängige
GDH- und DKG-Reduktase (für
DKGR ist eine Einheit entsprechend zu einer OD-Absorptionsänderung
pro Minute, wenn bei 340 nm gemessen wird) zusammen mit 400 μM NADP+ hinzugesetzt. Der Reaktor wurde gerührt, Luft
wurde eingeführt,
und es wurde wie oben bei 28°C
gehalten. Periodische Zugaben an Glukose erfolgten im Verlauf des
Vorgangs, um eine konstante Substratzuführung für beide Cofaktor-abhängigen Enzyme
sicherzustellen.
-
Ergebnisse
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Ein
Bioreaktor-Experiment wurde mit nicht-gereinigter Reduktase A:F22Y/-A272G (US-Patent
Nr. 5 795 761) in Form eines rohen Extrakts von E. coli durchgeführt. T.
acidophilum GDH und NADP+ wurden in gereinigter
Form von Sigma gekauft. Die GA-zu-DKG-Raten waren größer als
10 g/L/h. Die anfänglichen
2 KLG-Bildungsraten waren größer als
10 g/L/h. Die integrierte Rate über
die ersten 6 Stunden lag über
5 g/L/h. Der Cofaktor erschien stabil über die ersten 6 Stunden, und
vornehmlich in der reduzierten Form. Die gesamte Umwandlungszahl
betrug 537 (215 mM 2 KLG/0,4 mM NADP+).
Während
der ersten 6 Stunden überstiegen die
Zwischenprodukte GA und DKG niemals 4 g/L. Der Lauf wurde 6,5 Stunden
nach der anfänglichen
Zellbeladung gestoppt, und eine Erholungsphase mit niedriger Bewegung
bei 22°C
wurde über
Nacht laufen gelassen. Der Endtiter an KLG betrug etwa 42 g/L.
-
Aliquote
wurden während
des Verlaufs der Bioreaktorinkubation entfernt. Diese Aliquote wurden
zuerst in einer Mikrofuge zu Pellets der Zellen zentrifugiert. Um
auf restliche Reduktaseaktivität
zu testen, wurden 25 Mikroliter Probenüber stand zu einer Lösung hinzugesetzt,
die aus 910 μl
Puffer (50 mM bis-Tris, pH 7), 20 μl DKG (70 mg/ml) und 250 μM NADPH bestand.
Die Reduktaseaktivität
wurde gemessen, indem der Verlust an Extinktion bei 340 nm 1 Minute
lang überwacht
wurde. Die GDH-Aktivität
wurde gemessen, indem 25 μl einer
Probe zu einer Lösung
hinzugesetzt wurden, die 520 μl
Puffer, 150 μl
NaCl (1M), 200 μl
Harnstoff (8 M), 50 μl
Glc (1 M) und 60 μl
NADP+ (5 mM) enthielt, und es wurde die
Zunahme in der Extinktion bei 340 nm 1 Minute lang beobachtet. Sowohl
die Reduktase als auch die GDH zeigten eine volle Aktivität im Verlauf
des Bioreaktorexperiments.
-
Beispiel IV
-
Dieses
Beispiel veranschaulicht die Produktion von KDG in einem in-vitro-Bioreaktor.
-
Zellen,
welche Membran-gebundene D-Glukosedehydrogenase- und D-Gluconsäuredehydrogenase-Aktivitäten, jedoch
keine 2-Keto-D-gluconat-dehydrogenase-Aktivität enthielten, wurden wachsen
gelassen und geerntet. Ein Beispiel von einer solchen Zelle ist
Pantoea citrea, welche eine Mutation in dem 2-Keto-D-gluconatdehydrogenase-Enzym besitzt,
und es wird wie in Beispiel III wachsen gelassen und behandelt. Die
Zellen werden wie in Beispiel III beschrieben, permeabilisiert.
Glukose (kristallin oder in Lösung)
wird in Aliquoten oder kontinuierlich hinzugesetzt. Der pH-Wert
wird durch regulierte Zugabe einer konzentrierten NaOH-Lösung aufrechterhalten.
Die Glukose wird zu D-Gluconsäure und
dann KDG umgewandelt. Produktbildung wird überwacht, indem Aliquote auf
einem geeigneten HPLC-System analysiert werden. Das Produkt wird
gewonnen, indem die Zellen durch Zentrifigution entfernt werden
und die restliche Flüssigkeit
konzentriert oder entfernt wird.
-
Beispiel V
-
Dieses
Beispiel veranschaulicht, dass die Zugabe von organischen Lösungsmitteln
die Reduktaseaktivität
erhöht.
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1-2
mg DKG, 250 μM
NADPH, F22Y/A272G-Reduktase A und genügend 50 50 mM bis-Tris-Puffer,
pH 7, um das Endvolumen auf 1 ml zu bringen, wurden einer Cuvette
hinzugesetzt. Die Reduktaseaktivität wurde gemessen, indem die
Abnahme in der Extinktion bei 340 nm gemessen wurde. Die Menge an
hinzugesetzter Reduktase erzeugte typischerweise eine Änderung
in der Extinktion von 0,1 bis 0,2 OD/min bei Raumtemperatur oder
30°C. Unter
den gleichen Bedingungen wurde Aliquote an Methanol oder Ethanol
der Lösung
hinzugesetzt, und die Reduktaseaktivität wurde gemessen. Die Reduktaseaktivität in Gegenwart
von verschiedenen Mengen an Methanol bei 30°C ist in der 3 gezeigt,
und die Aktivität
in Gegenwart von Ethanol bei 22°C ist
in der 4 gezeigt.
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Wie
in den Figuren gezeigt, wird die Reduktaseaktivität in Gegenwart
von bestimmten Mengen an Methanol oder Ethanol erhöht. Optimale
Konzentrationen liegen zwischen 10 und 25 % des organischen Lösungsmittels.
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GDH
aus T. acidophilum zeigt eine kleine Abnahme in der Aktivität, wenn
sie mit 10%igem Methanol inkubiert wird (die Testbedingungen sind:
50 mM Tris, pH 7, 12,5 mM D-Glukose, 250 μM NADP+ in
1 ml. Die Aktivität
wird durch die Zunahme in der Extinktion bei 340 nm festgestellt).
Permeabilisierte Zellen wurden mit 15%igem MeOH und Gluconsäure inkubiert.
Die Aktivitäten
von D-Gluconsäuredehydrogenase
und 2-Keto-D-gluconsäure-dehydrogenase
wurden durch die Zugabe von Methanol nicht signifikant beeinflusst,
wie durch die Produktbildung überwacht
(HPLC-Analyse).
-
Die
Zugabe von Methanol oder Ethanol zu einer vollständigen Bioreaktorreaktion würde die
Reduktaseaktivität
steigern. Verluste bezüglich
der GDH-Aktivität oder
anderer Komponenten könnten
durch Zugabe von mehr GDH oder Zellen überwunden werden.
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Beispiel VI
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Das
Beispiel VI veranschaulicht die Reduktaseaktivität in Gegenwart von Gafquat
und PEG8000.
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Reduktase
wurde mit 250 μM
NADPH, 1-2 mg/ml DKG und 0, 0,7 % und 2,8 % Gafquat (ISP Technologies,
Inc.) oder 0,5 % PEG8000 in 1 ml (50 mM bis-Tris-Puffer, pH 7) bei 30 °C inkubiert.
Die Reduktaseaktivität
wurde wie in Beispiel VI gemessen. Wie in der Tabelle 1 gezeigt,
erhöht
die Zugabe von Gafquat die Reduktaseaktivität um 80 % im Vergleich zu der
Aktivität
ohne Gafquat. PEG8000 erhöht
die Reduktaseaktivität um
etwa 15 %.
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Tabelle
1. Erhöhung
der Reduktaseaktivität
in Gegenwart von Gatquat oder PEG8000.
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Beispiel VII
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Das
Beispiel VII veranschaulicht die Reduktaseaktivität in Gegenwart
an Salz.
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Die
Reduktase A F22Y/A272G-Aktivität
wurde in Gegenwart von variierenden Mengen von unterschiedlichen
Salzen gemessen. Der Test bestand aus dem Hinzusetzen von Reduktase
zu einer Lösung
(1 Milliliter Endvolumen), die 250 μM NADPH, DKG (1-1,5 mg/ml) 50
mM bis-Tris-Puffer, pH 7, und unterschiedliche Mengen an Kaliumphosphat,
NaCl, KCl, K2SO4 oder
CaCl2 enthielt. Alle Reaktionen wurden bei
30°C durchgeführt. Die
Ergebnisse sind in der 5 gezeigt.
-
Wie
in der 5 gezeigt, bleibt die Reduktaseaktivität die gleiche
oder erhöht
sich etwas, wenn mit 100 mM NaCl oder KCl inkubiert wird. Die Aktivität fällt dann,
wenn die Salzkonzentrationen auf 250 mM erhöht werden. Die Reduktaseaktivität fällt bei
CaCl2- oder Kaliumphosphatkonzentrationen
von 20 mM oder mehr.
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Die
Reduktase-Bindungskonstante (Km) für NADPH in Gegenwart von 200
mM NaCl wurde unter Anwendung von biochemischen Standardtechniken
bestimmt (Fersht, A. "Enzyme
Structure and Mechanism" (1977)
W. H. Freeman und Company). Die Reaktionen wurden in bis-Tris-Puffer
mit einem pH-Wert von 7, der etwa 1,5 mg/ml DKG enthielt, bei 30°C und unterschiedlichen
Mengen an NADPH durchgeführt.
Es wurde festgestellt, dass der Km-Wert für NADPH in Gegenwart von 200
mM NaCl sich um das 10- bis 40-Fache gegenüber dem Km-Wert, welcher ohne
NaCl bestimmt wurde, erhöhte.
Die maximale Rate (Vmax) in Salz war der Vmax ohne Salz ähnlich oder
war etwas erhöht.
Ein Weg, um die Wirkung von Salz auf die Reduktaseaktivität zu verringern,
ist es, die Konzentration an NADPH solange zu erhöhen, bis
sie bei oder oberhalb des Km-Wertes unter diesen Bedingungen liegt.
Alternativ könnten
geladene Spezies, einschließlich
KLG, entfernt werden.
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Beispiel VIII
-
Das
Beispiel VIII veranschaulicht die Stabilität von Reduktase A F22Y/A272G
in Gegenwart von Salz/Produkt.
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Die
thermische Stabilität
von Reduktase wurde in starkem Maße in Gegenwart von Salzen
erhöht.
Reduktase wurde auf einem der folgenden Wege getestet. Im ersten
Fall wurde Reduktase zu Puffer (50 mM bis-Tris, pH 7) in Gegenwart
und Abwesenheit von verschiedenen Mengen an 2-KLG (0-500 mM) hinzugesetzt. Diese
Lösungen
wurden dann in 1,5 ml große
Eppendorf-Röhrchen
in Aliquote (40 μl)
aufgeteilt. Die Röhrchen wurden
dann in ein Wasserbad bei 45°C
gestellt und zu festgelegten Intervallen entfernt. Die Reduktase
wurde dann bezüglich
der restlichen Aktivität
unter Verwendung des standardmäßigen Reduktaseaktivitäts-Tests
getestet. Die Ergebnisse sind in der 6 gezeigt.
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Wie
in der 6 gezeigt, verliert die Reduktase nicht in signifikanter
Weise Aktivität
unter diesen Bedingungen in Gegenwart von 500 mM 2-KLG. Gleichwohl
verliert Reduktase, die nur mit Puffer inkubiert wird, etwa die
Hälfte
ihrer Aktivität
in 10 Minuten. Dazwischen liegende Konzentrationen von 2-KLG führen zu
einer teilweisen Stabilisierung.
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Reduktase
wurde 10 Minuten lang in Gegenwart von Puffer (50 mM bis-Tris, pH
7, oder 25 mM MOPS, pH 7), 0,5 M NaCl, 0,5 M KCl, 0,5 M NH4Cl, 0,5
M K2SO4 und 0,1
M NaCl bei einem pH-Wert von 7 und bei 45°C inkubiert. Wie unten in der
Tabelle 2 gezeigt ist, geht nur wenig Aktivität in Gegenwart dieser Verbindungen
verloren, wohingegen Reduktase nur mit Puffer fast die Hälfte ihrer
Aktivität
verlor. Diese Verbindungen stabilisieren die Reduktase deutlich.
Niedrigere und höhere
Anteile dieser Verbindungen sollten ebenfalls die Reduktase stabilisieren.
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Tabelle
2. Reduktaseaktivität
nach 10-minütiger
Inkubation bei Raumtemperatur oder 45°C. Die Aktivität wurde unter
Standardtestbedingungen gemessen.
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Ein
Vergleich zwischen der Stabilisation durch 2-KLG und NaCl wurde
durchgeführt.
Die Temperaturinkubation wurde bei 45,4°C in 25 mM MOPS, pH 7, durchgeführt. Eine
Konzentration von 20 mM 2-KLG oder 20 mM NaCl wurde verwendet. Zeitpunkte
der Messung lagen bei 0,5 und 10 Minuten. Die Ergebnisse sind unten
in der Tabelle 3 aufgelistet. Wie gezeigt, stabilisiert die gleiche
Menge an NaCl die Reduktase mehr als 2-KLG.
- In
der Tabelle 3 sind alle %-Angaben +/– 10 %.
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Bei
46,6-46,9°C
wurden die Halbwertszeiten für
Reduktase in Gegenwart von 0-400 mM NaKLG bestimmt. Diese Temperatur
wurde gewählt,
um alle Halbwertszeiten bei der gleichen Temperatur zu bestimmen. Der
Puffer ist 25 mM MOPS, pH 7,0. Aliquote wurden entfernt und bezüglich der
verbleibenden Aktivität
getestet. Die Halbwertszeitmessungen zur Thermostabilität wurden
wie folgt durchgeführt:
ein 450 μl
Probe enthaltender Puffer, Reduktase und 2 KLG (sofern verwendet)
wurden in ein Eppendorf-Röhrchen
gegeben und in einem Wasserbad erhitzt. 8 oder 9 Aliquote wurden
im Zeitverlauf entfernt, welche von 10 bis 30 Minuten variierten.
Jedes Aliquot wurde auf Eis gestellt und zweifach am Ende des Experiments
getestet. Die Aktivitäten wurden
mit der Zeit vs. restliche Aktivität aufgetragen. Der Kf-Wert wurde bestimmt durch Anpassung der
Linie unter Verwendung eines Computergrafikprogramms zur Lösung einer
exponentiellen Abnahme. Dieser Wert wurde dann verwendet, um die
Halbwertszeit zu berechnen (Fersht, A. "Enzyme Structure and Mechanism" (1977) W. H. Freeman
und Co.). Die Ergebnisse sind unten in der Tabelle 4 gezeigt.
-
-
Wie
die Ergebnisse in Tabelle 4 zeigen, stabilisiert NaKLG deutlich
die Reduktase, und diese Stabilisierung ist konzentrationsabhängig.
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Diese
Daten zeigen, dass erhöhte
Mengen an Salz Reduktase stabilisieren können. Geeignete Salze, welche
in dem Bioreaktor verwendet werden können, schließen Ammoniumsulfat,
Natriumacetat, Ammoniumacetat, Ammoniumchlorid, Natriumsulfat, Kaliumphosphat,
Natriumphosphat, Natriumchlorid, KCl, NH4Cl, K2SO4 und NaI ein.
Ein im Fachbereich Erfahrener würde
erkennen, dass der optimale Salzbereich temperaturabhängig wäre. Deshalb
könnte
im Bioreaktor entweder die Temperatur oder die Salzkonzentration
oder Beides modifiziert werden, um die gewünschte Stabilität der Reduktase
zu erreichen. Bei niedrigeren Temperaturen, unter welchen ein typischer
Bioreaktor laufen gelassen werden würde, müsste weniger Salz verwendet
werden, um die gleiche Menge an Stabilisierung der Reduktase, wie
es in Tabelle 4 gezeigt ist, bereitzustellen.
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Beispiel IX
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Das
Beispiel IX veranschaulicht ein Verfahren zum Messen des NADPH/-NADP+-Verhältnisses
und des Reaktionsgleichgewichts.
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Der
reduzierte Cofaktor (NADPH) besitzt eine starke Extinktion bei 340
nm, während
oxidierter Cofaktor (NADP+) bei dieser Wellenlänge nicht
absorbiert. Wenn die zwei Cofaktoren miteinander gemischt werden, kann
deshalb die Menge an vorliegendem NADPH durch Extinktion bei 340
nm bestimmt werden. Wenn die Menge an ursprünglichem zugesetztem NADP+ ebenfalls bekannt ist, kann das Verhältnis der
zwei Cofaktoren dann leicht bestimmt werden. Dieses Verfahren kann
verwendet werden, um zu messen, wie die Zugabe von verschiedenen
Komponenten zu einer Reaktion, wie einer Cofaktor-Recyclingreaktion,
das Reaktionsgleichgewicht beeinflusst.
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Eine
1 ml-Reaktion wurde in einer Küvette
bei Raumtemperatur angesetzt. Die Reaktion bestand aus Puffer (50
mM bis-Tris, pH7), 5 mg Glukose, 5 mg 2,5-DKG, 100 μM NADPH, 100 μM NADP+, Reduktase und Glukosedehydrogenase (GDH).
Die Enzyme wurden zuletzt hinzugesetzt, um die Reaktion zu initiieren,
und die Cofaktoranteile wurden bei 340 nm überwacht. Nachdem das Gleichgewicht
erreicht war (7), wurde ein zusätzliches
Aliquot an GDH hinzugesetzt. Sehr schnell verschob sich das Gleichgewicht
in Richtung auf mehr vorliegendes NADPH. Die Zugabe von mehr GDH
ergab das gleiche Verhalten.
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Eine
weitere 1 ml-Inkubation wurde wie oben angesetzt. Nachdem sie das
Gleichgewicht erreicht hatte, wurden 29 mg NACl hinzugesetzt, um
eine Endkonzentration von 0,5 M NaCl zu erhalten. Wie in der 8 gezeigt,
verschob dies dramatisch das Gleichgewicht in Richtung auf die Begünstigung
der Anwesenheit von NADPH.
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Beispiel X
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Das
Beispiel X veranschaulicht Cofaktor-Recyclingreaktionen.
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Cofaktor-Recyclingreaktionen
wurden durch Zugabe von Reduktase, GDH, Glukose, 2,5-DKG und NADP+ in ein Reaktionsgefäß durchgeführt. Zusätzlich wurde gereinigte 2-KLG
zu einigen Reaktionen hinzugesetzt, um die Reaktion in Gegenwart
von Produkt zu bestimmen. Diese Reaktionen wurden aufrechterhalten,
um Gluconsäure
und 2-KLG herzustellen. Cofaktor wurde zwischen NADP+ und
NADPH durch die Wirkung der zwei Enzyme recycelt. Aliquote wurden
periodisch entfernt und mittels HPLC zur Bestimmung der Gegenwart
von Substraten und Produkten analysiert. Die Reaktion wurde mindestens
20 Stunden bei Raumtemperatur aufrechterhalten.
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Reaktionen
mit so wenig wie 3 ml wurden durchgeführt. In einer Reaktion wurden
Reduktase, GDH, 10 mg/ml Glukose und 10 mg/ml lyophilisiertes 2,5-DKG
zu 50 mM bis-Tris-Puffer hinzugesetzt. 2-KLG wurde einigen Inkubationen
bei einer Konzentration von 75 mg/ml hinzugesetzt. Die Reaktion
wurde bei Raumtemperatur durch Zugabe von NADP+ (400 μM) initiiert.
Der Lösungs-pH
wurde zwischen einem pH-Wert von 6-7,5 durch Zugabe kleiner Mengen
an NaOH aufrechterhalten. Aliquote an Glukose und 2,5-DKG wurden
periodisch hinzugegeben. Am Ende eines Tages wurde die Reaktion
bei 4°C über Nacht
stehen gelassen. Am folgenden Morgen wurde sie auf Raumtemperatur
erwärmt,
der pH-Wert wurde eingestellt und die Reaktion wurde fortgesetzt.
Kleine Aliquote wurden entfernt und in eine HPLC injiziert. Durch
den Vergleich mit einem Standard konnten die hergestellten Mengen
an Gluconat und 2-KLG berechnet werden. In einer typischen Reaktion wurden
mindestens 60 % der Glukose zu Gluconat umgewandelt, und mindestens
60 % des 2,5-DKG wurden zu 2-KLG umgewandelt.
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Beispiel XI
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Das
Beispiel XI veranschaulicht NaCl-Kinetiken.
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Wenn
NaCl (100 mM oder mehr) zu einem standardmäßigen Reduktaseassay, enthaltend
250 μM NADPH
und 10-20 mM DKG, hinzugesetzt wurde, verringerte sich die Reduktaserate.
Durch die Durchführung von
kinetischen Analysen stellte sich heraus, dass Natriumchlorid den
Km-Wert der Reduktase für
den Cofaktor NADPH erhöhte.
Wenn mehr NaCl hinzugegeben wurde, erhöhte sich der Km-Wert. Wenn
eine untersättigende
Menge an NADPH verwendet wurde, schien es, dass die Reduktase durch
NaCl inhibiert wurde. Um diesem Effekt entgegenzuwirken, wurde mehr
NADPH der Reaktion hinzugesetzt, sodass es mehrfach über dem
Km-Wert lag. Der Modus der Inhibition erschien kompetitiv zu sein.
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Der
Km-Wert für
DKG in Gegenwart von NaCl wurde unter Anwendung von Standardtechniken
bestimmt. Die NADPH-Konzentration, welche für jede Messung verwendet wurde,
wurde so eingestellt, dass sie mindestens 3-fach über ihrem
Km-Wert bei jeder NaCl-Konzentration lag.
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Beispiel XII
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Das
Beispiel XII zeigt 2-KLG-Kinetiken.
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Der
Km-Wert für
DKG in Gegenwart von 2-KLG wurde unter Anwendung von biochemischen
Standardtechniken bestimmt. Die Menge an 2-KLG wurde von 0 bis 150
mM in einem Puffer mit einem pH-Wert von 7 variiert. Der Km-Wert
für DKG
unter pH-7-Bedingungen betrug 10-12 mM. Wenn sich die Konzentration von
2-KLG erhöhte,
sank der Km-Wert für
2,5-DKG. Zum Beispiel beträgt
der Km-Wert für
DKG bei 150 mM 2-KLG 2-4 mM. Die Reaktionsrate nimmt ebenfalls ab
und erfährt
eine 2- bis 4-fache Abnahme, wenn sich die KLG-Konzentration von 0 auf 150 mM erhöht. Dieses
Verhalten ist konsistent mit einer nicht kompetitiven Inhibition.
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Der
Km-Wert für
NADPH in Gegenwart von 100 mM 2-KLG wurde zu 4-9 mM bestimmt. Dies
wurde unter Anwendung biochemischer Standardtechniken bei einem
pH-Wert von 7, mit einer Konzentration an 2,5-DKG von mehr als 14
mM und NADPH-Konzentrationen, welche den Km-Wert einrahmten, durchgeführt.
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Deshalb
würde man
erwarten, dass die Anwesenheit von steigenden Mengen an KLG in einer
Bioreaktorumgebung die Reduktaseaktivität senken würde und die Reaktionsgesamtrate
verlangsamen würde. Zwei
Wege, um dieses Phänomen
zu überwinden,
wären die
KLG-Gewinnung, zum Beispiel durch Elektrodialyse oder alternativ
durch Zugabe von mehr Reduktase zu dem Bioreaktor.
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Beispiel XIII
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Das
Beispiel XIII veranschaulicht die Synthese von 2,5-DKG.
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P.
citrea-Zellen werden mit 150 mM Natriumgluconat in einem geeigneten
Puffer: 25 mM bis-Tris, oder 25 mM MOPS wird bei einem pH-Wert von
6 verwendet. 25 ml der Zellen, Puffer und Substrat werden in einen 125
ml großen
Erlenmeyer-Kolben mit Bafflen gegeben und bei 28°C unter Schütteln bei etwa 250 Umdrehungen
pro Minute inkubiert. Nach 16-24 Stunden wurde der Kolben bezüglich der
Bildung von 2,5-DKG mittels HPLC-Analyse und Aktivitätsassay
begutachtet. Die Zellen wurden zentrifugiert und der Überstand
wurde entfernt. Das Material wird steril filtriert und kann bei
4°C oder
eingefroren gelagert werden. Alternativ kann das Material zu einem
Feststoff lyophilisiert werden.
