CN1829800B

CN1829800B - 具有增加的2-酮基-d-葡萄糖酸累积的代谢工程细菌株

Info

Publication number: CN1829800B
Application number: CN2004800219827A
Authority: CN
Inventors: T·C·道奇; F·瓦耳; M·H·拉希德
Original assignee: Genencor International Inc
Current assignee: Danisco US Inc
Priority date: 2003-07-30
Filing date: 2004-07-27
Publication date: 2010-06-09
Anticipated expiration: 2024-07-27
Also published as: JP2007500507A; CA2533936C; EP1649030B1; US20050106693A1; MXPA06000949A; WO2005012486A2; CA2533936A1; CN1829800A; EP1649030A4; DK1649030T3; WO2005012486A3; CN101693908A; US20070184540A1; EP1649030A2

Abstract

本发明涉及通过失活内源性膜结合2-酮基-D-葡萄糖酸脱氢酶(2-KDGDH)改变细菌宿主细胞以积累2-酮基-D-葡萄糖酸(2-KDG)的方法，2-酮基-D-葡萄糖酸脱氢酶在失活之前催化2-KDG转变为2，5-二酮基葡萄糖酸(2，5-DKG)。

Description

具有增加的2-酮基-D-葡萄糖酸累积的代谢工程细菌株

1.发明背景

本发明涉及通过失活内源性膜结合2-酮基-D-葡萄糖酸脱氢酶(2-keto-D-gluconate dehydrogenase(2-KDGDH))而改变细菌宿主细胞以积累2-酮基-D-葡萄糖酸(2-keto-D-gluconic acid(2-KDG))的方法，2-酮基-D-葡萄糖酸脱氢酶在失活之前催化2-KDG转化为2，5-二酮基葡萄糖酸(2，5-diketogluconate(2，5-DKG))。本发明具体地涉及增强2-DKG在泛菌属(Pantoea)菌株中生物合成地积累2-KDG和如此产生的2-KDG的用途。

商业上所需的许多产品，如L-抗坏血酸(L-ascorbic acid)的中间产物，已经在遗传工程宿主细胞中生物催化地产生。尽管在许多情形下，生物转化(bioconversion)的期望终产物可以是L-抗坏血酸(ASA，维生素C)，但是ASA中间产物存在独立的用途，并且这些ASA中间产物可以是生物转化的期望产物。

用于生物催化地将普通代谢物如葡萄糖转变为ASA中间产物的一个方法显示于图1。通过氧化步骤，葡萄糖被转变为2-KDG和2，5-DKG(USP 3,790,444)。也参照产生ASA中间产物2-酮基-L-葡萄糖酸(2-KLG)的生物转化方法，其公开于Lazarus等人(1989，″Vitamin C：Bioconversion via a Recombinant DNA Approach″，GENETICS ANDMOLECULAR BIOLOGY OF INDUSTRIAL MICROORGANISMS，American Society for Microbiology，Washington D.C.由C.L.Hershberger编辑)。碳源向2-KLG的这种生物转化(bioconversion)涉及各种中间产物，并且，酶促过程和辅助因子(cofactor)依赖的2，5-DKG还原酶活性(2，5-DKG reductase(DKGR))相关。此外，已经应用重组DNA技术，在草生欧文氏菌(Erwinia herbicola)中以单一的发酵步骤(singlefermentative step)，将葡萄糖生物转化为2-KLG(Anderson，S.等人，(1985)Science 230：144-149)。

在此申请中，发明人关注于，增加ASA中间产物2-酮基-D-葡萄糖酸(2-KDG)在细菌宿主中的积累。优选地，能够通过内源性膜结合2-酮基-D-葡萄糖酸脱氢酶(2-keto-D-gluconate dehydrogenase(2-KDGDH))的酶活性、将2-KDG转化为2，5-DKG的细菌宿主细胞以失活2-KDGDH酶的方式被改变。

然后，可以将本发明包括的改变的细菌宿主中累积的2-KDG，用于各种工业和商业用途。例如，可以将2-KDG用于溶解磷酸盐或作为除草剂化合物(herbicidal compounds)合成中的中间产物，如USP3,981,860中描述的那些。此外，可以将2-KDG进一步转化为所需的终产物，如异抗坏血酸(erythorbic acid)。异抗坏血酸是ASA的立体异构体，也被称为D-异抗坏血酸(D-araboascorbic acid)。根据Reichstein和Grussner(1934)Helv.Chim.Acta 17：311-328的方法，可以化学地合成此化合物。异抗坏血酸是公知的食品添加剂、防腐剂和抗氧化剂，并且被用于工业用途和特种化学品应用中。

2.发明概述

本发明涉及，通过在碳源如葡萄糖或其它普通微生物代谢物的存在下，培养改变的宿主细胞，在细菌宿主细胞中积累2-KDG的方法。更具体地，通过失活编码膜结合2-酮基-D-葡萄糖酸脱氢酶(2-keto-D-gluconate dehydrogenase(2-KDGDH))的内源性基因，2-KDG不转变为中间产物2，5-DKG，2-KDG在改变的宿主细胞中累积。随后，可以从改变的宿主细胞分离出2-KDG，并将其用于各种商业用途或将其进一步用于产生其它所需化合物如异抗坏血酸。

在一个方面，本发明涉及在细菌宿主细胞中累积2-酮基-D-葡萄糖酸(2-keto-D-gluconic acid(2-KDG))的方法，包括：a)获取改变的细菌细胞，这是通过失活细菌宿主细胞中2-酮基-D-葡萄糖酸脱氢酶(2-keto-D-gluconate dehydrogenase(2-KDGDH))活性所需的一个或多个内源性基因实施的，其中细菌宿主细胞能够在碳源如葡萄糖的存在下产生2，5-DKG；b)在合适的培养条件下培养改变的细菌细胞，以产生2-KDG，和c)使2-KDG累积。在一种实施方案中，方法进一步包括回收2-KDG的步骤。在第二种实施方案中，方法进一步包括将2-KDG转变为第二产物，具体地是异抗坏血酸的步骤。在第三种实施方案中，细菌宿主细胞选自欧文氏菌属(Erwinia)、肠杆菌属(Enterobacter)、棒状杆菌属(Corynebacteria)、醋杆菌属(Acetobacter)、假单胞菌属(Pseudomonas)、克雷伯菌属(Klebsiella)、葡萄糖杆菌属(Gluconobacter)、泛菌属(Pantoea)、杆菌属(Bacillus)和埃希氏菌属(Escherichia)细胞。在特别优选的实施方案中，细菌宿主细胞是泛菌属细胞，更具体地是P.citrea。在第四种实施方案中，一个基因被失活。在第五种实施方案中，两个基因被失活。在第六种实施方案中，内源性2-KDGDH由三个亚基组成。在第七种实施方案中，亚基包括在SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6中列出的氨基酸序列，和与其具有至少95％、96％、97％、98％和99％序列同一性的氨基酸序列。在第八种实施方案中，SEQID NO.4所代表的亚基被失活，其被称为亚基B。在第九种实施方案中，通过删除多个或多个基因，失活一个或多个基因。

在第二方面，本发明涉及，根据本发明方法获得的改变的细菌细胞。在一种实施方案中，改变的细菌细胞是泛菌属细胞。

在又一方面，本发明涉及在细菌宿主细胞中累积2-酮基-D-葡萄糖酸(2-keto-D-gluconic acid(2-KDG))的方法，包括：a)通过失活在细菌宿主细胞中编码内源性2-酮基-D-葡萄糖酸脱氢酶(2-keto-D-gluconatedehydrogenase(2-KDGDH))的操纵子，获得改变的细菌细胞，其中细菌宿主细胞能够在葡萄糖存在下产生2，5-DKG；和操纵子包括脱氢酶基因和细胞色素c基因；b)在合适的培养条件下培养改变的细菌细胞，以产生2-KDG，和c)允许2-KDG累积。在一种实施方案中，该方法进一步包括回收2-KDG的步骤。在第二种实施方案中，该方法进一步包括将2-KDG转变为第二产物，具体地是异抗坏血酸的步骤。

在另一方面，本发明涉及遗传上改变的泛菌属细胞，其包括遗传工程的(genetically engineered)失活的操纵子，其中所述操纵子在失活之前编码内源性2-酮基-D-葡萄糖酸脱氢酶(2-keto-D-gluconatedehydrogenase(2-KDGDH))。在一种实施方案中，泛菌属细胞是Pantoescitrea细胞。在第二种实施方案中，内源性2-KDGDH酶由三个基因编码，其中一个基因编码SEQ ID NO.2的氨基酸序列或与其有至少90％同一性的氨基酸序列。在第三种实施方案中，失活是通过完全或部分删除编码2-KDGDH的一个或多个基因实施的。在第四种实施方案中，改变的泛菌属细胞进一步包括失活的葡萄糖酸转运体蛋白、无功能的葡萄糖激酶基因、无功能的葡萄糖酸激酶基因、过表达的葡萄糖脱氢酶基因、过表达的葡萄糖酸脱氢酶基因或其组合。

在又一方面，本发明涉及分离的多核苷酸，其编码有2-KDGDH活性的酶。在一种实施方案中，分离的多核苷酸编码由三个亚基组成的酶，三个亚基称为亚基A、亚基B和亚基C，其中亚基A具有SEQ ID NO.2列出的氨基酸序列或与其有至少96％同一性的序列；亚基B具有SEQ IDNO.4列出的氨基酸序列，亚基C具有SEQ ID NO.6列出的氨基酸序列或与其有至少94％同一性的序列。在第二种实施方案中，本发明涉及分离的多核苷酸，其编码SEQ ID NO.2的氨基酸或与其有至少96％同一性的氨基酸。在第三种实施方案中，本发明涉及分离的多核苷酸，其编码SEQ ID NO.4的氨基酸序列。在第四种实施方案中，本发明涉及分离的多核苷酸，其编码SEQ ID NO.6的氨基酸或与其有至少94％同一性的氨基酸。在一种优选的实施方案中，分离的多核苷酸具有SEQ IDNO.1的核酸序列。在另一种优选的实施方案中，多核苷酸具有SEQ ID NO.3的核酸序列。在进一步优选的实施方案中，分离的多核苷酸具有SEQ IDNO.5的核酸序列。

在又一方面，本发明涉及，在严紧的杂交条件下，用SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.5的至少20个连续的序列作为探针，以发现同源序列的方法，其中同源序列编码有2-KDGDH活性的蛋白。在一种实施方案中，同源序列将编码和SEQ ID NO.2的序列有至少96％的氨基酸序列同一性的蛋白。在另一种实施方案中，同源序列将编码和SEQ IDNO.6的序列有至少94％的氨基酸序列同一性的蛋白。在进一步的实施方案中，SEQ ID NO.3的同源序列将编码脱氢酶蛋白。在另一种实施方案中，SEQ ID NO.5的同源序列将编码细胞色素C蛋白。

3.附图简述

图1描述了生成抗坏血酸(ascorbic acid(ASA))的氧化途径(oxidative pathway)。E1代表葡萄糖脱氢酶(glucose dehydrogenase(GDH))；E2代表葡萄糖酸脱氢酶(gluconic acid dehydrogenase(GADH))；E3代表2-酮基-D-葡萄糖酸脱氢酶(2-keto-D-gluconic dehydrogenase(2-KDGDH或2-KGDH))；和E4代表2，5-二酮基-D-葡萄糖酸还原酶(2，5-diketo-D-gluconic acid reductase(2，5DKGR))。

图2提供了一些代谢路径的框架示意图，所述路径涉及细菌宿主细胞如Pantoea citrea中的葡萄糖同化作用。该图显示了糖酵解途径、戊糖途径和三羧酸循环(tricarboxylic(TCA))途径之间的最共同联系。下列缩写被用于图中并贯穿应用在本公开中：葡萄糖脱氢酶(glucosedehydrogenase)＝(GDH)；葡萄糖酸脱氢酶(gluconic acid hydrogenase)＝(GADH)；2-酮基-D-葡萄糖酸(2-keto-D-gluconate)＝(2-KDG)；2-酮基-D-葡萄糖酸脱氢酶(2-keto-D-gluconic acid hydrogenase)＝(2-KDGDH或2-KGDH)；2，5-二酮基葡萄糖酸(2，5-diketogluconate)＝(2，5-DKG)；2，5-二酮基-D-葡萄糖酸还原酶(2，5-diketo-D-gluconic acid reductase)＝(2，5DKGR)；2-酮基-L-葡萄糖酸(2-keto-L-gluconic acid)＝(2-KLG)；2-酮基还原酶(2-ketoreductase)＝(2KR)；5-酮基还原酶(5-ketoreductase)＝(5KR)；5-酮基-D-葡萄糖酸(5-keto-D-gluconate)＝(5-KDG)；艾杜糖酸脱氢酶(idonate dehydrogenase)＝(IADH)；葡萄糖激酶(glucokinase)＝(GlkA)和葡萄糖酸激酶(gluconokinase)＝(GntK)。根据本发明，由2-KDGDH失活影响的酶促步骤标示为“X”。标有“T”的方框代表推定的转运体(tansporters)。

图3A描述了核酸序列(SEQ ID NO.1)，其编码Pantoea citrea2-KDGDH酶的亚基A的氨基酸序列。

图3B描述了由SEQ ID NO.1编码的亚基A的氨基酸序列(SEQ IDNO.2)。

图4描述了核酸序列(SEQ ID NO.3)，其编码Pantoea citrea2-KDGDH酶的亚基B的氨基酸序列。

图5描述了由SEQ ID NO.3编码的亚基B的氨基酸序列(SEQ ID NO.4)。

图6描述了核酸序列(SEQ ID NO.5)，其编码Pantoea citrea2-KDGDH酶亚基C的氨基酸序列。

图7描述了由SEQ ID NO.5编码的亚基C的氨基酸序列(SEQ ID NO.6)。

图8是框架图，说明了用于失活Pantoea citrea中2-KDGDH操纵子的方法。A代表染色体2-KDGDH操纵子，它由三个可读框(open readingframes(orfs))组成。Orf 2418代表亚基A，orf2419代表亚基B，orf2420代表亚基C。箭头表示引物的方向，其中1代表引物KDGF2，2代表引物KDGF 1，3代表引物KDGR1，4代表引物KDGR2。B代表应用引物2和3得到的PCR产物，含有限制性酶切位点Hpa I和Sca I。来自B的PCR产物和loxP-cat序列盒(C)应用，并被转化入非-复制的R6K载体中，载体具有卡那霉素抗性基因(D)。将载体转化入泛菌属宿主，使载体的同源区和宿主染色体中2-KDGDH操纵子编码区的同源区之间发生同源重组。也参考实施例1。

图9说明了由本发明包含的改变的细菌株(WKDG4)和未改变的(等基因野生型)菌株(139-2a/Ps-)形成2-KDG和2，5-DKG，如实施例2中进一步论述，其中代表WKDG4中的2-KDG累积；代表139-2a/Ps-中的2-KDG累积；代表WKDG4中的2，5-DKG累积

代表139-2a/Ps-中的2，5-DKG累积。

4.优选实施方案详述

如无其它指明，本发明实践将应用传统的分子生物学技术(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学和生物化学技术，这在本领域技术人员的已知范围内。这些技术在文献中得到详细说明，如MOLECULARCLONING：A LABORATORY MANUAL，第二版(Sambrook等人，1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press；CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY(F.M.Ausubel等人编辑，1987和每年更新)；OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS(M.J.Gait编辑，1984)；PCR：THEPOLYMERASE CHAIN REACTION，(Mullis等人编辑，1994)；MANUAL OF INDUSTRIAL MICROBIOLOGY ANDBIOTECHNOLOGY，第二版(A.L.Demain等人编辑，1999)；MANUALOF METHODS FOR GENERAL BACTERIOLOGY(Phillipp Gerhardt，R.G.E.Murray，Ralph N.Costilow，Eugene W.Nester，Willis A.Wood，NoelR.Krieg和G.Briggs Philips编辑)，第210-213页American Society forMicrobiology，Washington，DC，和BIOTECHNOLOGY：A TEXTBOOKOF INDUSTRIAL MICROBIOLOGY，(Thomas D.Brock)第二版(1989)Sinauer Associates，Inc.，Sunderland，Mass。

A.定义

如无其它指明，此处应用的所有技术术语和科学术语具有本发明所属领域的普通技术人员普遍理解的相同意义。Singleton等人，DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY，第二版，John Wiley和Sons，New York(1994)和Hale和Marham，THEHARPER DICTIONARY OF BIOLOGY，Harper Perennial，New York(1991)为技术人员提供了本发明中应用的许多术语的普通词典。

如此处所应用，“2-酮基-D-葡萄糖酸脱氢酶(2-keto-D-gluconatedehydrogenase(2-KDGDH))”和“具有2-KDGDH活性的酶”(an enzymehaving 2-KDGDH activity)是指一种膜结合蛋白，它能够催化细菌细胞中的2-KDG在氧化途径中转变为2，5-DKG，氧化途径起始于葡萄糖或葡萄糖酸。术语2-KDGDH具有功能上的限定并且是指任何酶，所述酶是膜结合的、并催化2-KDG转变为2，5-DKG。

“脱氢酶蛋白(dehydrogenase protein)”或“具有脱氢酶活性的蛋白”(a protein having dehydrogenase activity)是指催化氧化还原反应的酶，所述反应涉及从一个底物去除氢并将其转移至另一分子，通常转移至辅酶，如尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adeninedinucleotide(NAD))、尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotine adeninedinucleotidephosphate(NADP))和黄素腺嘌呤二核苷酸(flavin adenine dinucleotide(FAD))。

“细胞色素c蛋白”(cytochrome C protein)是指一种电子转运蛋白，它具有一个或几个血红素基团，其通过一个或多个，通常是两个硫醚键结合到该蛋白上，硫醚键含有半胱氨酸残基的巯基。第五个血红素铁配体通常由组氨酸氨基酸残基提供。(Pettigrew等人(1987)CYTOCHROMES c.BIOLOGICAL ASPECTS，Springer Verlag，Berlin；Moore等人(1990)CYTOCHROMES C：EVOLUTIONARY，STRUCTURAL AND PHYSIOCHEMICAL ASPECTS.SpringerVerlag，Berlin；和Ambler(1991)Biochim.Biophys.Acta.1058：42-47)。

如此处所应用，术语“碳源”(carbon source)包括微生物通常应用的合适的碳底物，如6碳糖，包括但不限于葡萄糖(G)、古洛糖、乳糖、山梨糖、果糖、艾杜糖、半乳糖和甘露糖，均为D型或L型，或6碳糖的组合，如葡萄糖和果糖，和/或6碳糖酸，包括但不限于2-酮基-L-葡萄糖酸、艾杜糖酸(idonic acid(IA))、葡萄糖酸(gluconic acid(GA))、6-磷酸葡萄糖酸、2-酮基-D-葡萄糖酸(2-keto-D-gulonic acid(2KDG))、5-酮基-D-葡萄糖酸、2-酮基葡萄糖酸磷酸、2，5-二酮基-L-葡萄糖酸、2，3-L-二酮基葡萄糖酸、脱氢抗坏血酸、异抗坏血酸(erythorbic acid(EA))和D-甘露糖酸。

当指操纵子、基因或蛋白时，术语“无功能的”(non-functional)、“失活的”(inactivated)和“失活”(inactivation)意味着操纵子、基因或蛋白的已知正常功能或活性被消除、破坏或高度降低。导致操纵子、基因或蛋白无功能的失活包括这样的方法如删除、突变、取代、中断(interruption)或插入核酸序列。

如此处所应用，操纵子或基因的“删除”(deletion)是指删除一个或多个基因的完整编码序列、删除一个或多个基因的部分编码序列、删除调控区、删除翻译信号或删除编码序列包括一个或多个基因的侧翼序列。

如此处所应用，术语“基因”(gene)意味着参与产生多肽的DNA片段并包括编码区之前和之后的区以及各个编码片段(外显子)之间的间隔序列(内含子)。

术语“多核苷酸”(polynucleotide)和“核酸”(nucleic acid)，在此可交换应用，是指聚合形式的任意长度的核苷酸，或是核糖核苷酸或是脱氧核糖核苷酸。这些术语包括单链、双链或三链DNA、基因组DNA、cDNA、RNA、DNA-RNA杂交体、或包括嘌呤和嘧啶碱基或其它天然的、化学的、生物化学修饰的、非天然的或衍生的核苷酸碱基的聚合物。下列是多核苷酸的非限制性例子：基因或基因片段、外显子、内含子、mRNA、tRNA、rRNA、核酶、cDNA、重组的多核苷酸、分支的多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离的DNA、任何序列的分离的RNA、核酸探针和引物。多核苷酸可以包括修饰的核苷酸如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物、uracyl、其它糖和连接基团如氟代核糖(fluororibose)和硫代物(thioate)、和核苷酸分支。核苷酸序列可以被非核苷酸成分中断。

如此处所应用，术语“操纵子”(operon)意味着两个或多个基因，从一个共同的启动子作为一个转录单位被转录。在一些优选的实施方案中，包括操纵子的基因是连续的基因(contiguous genes)。

如此处所应用，术语“启动子”(promoter)是指核酸序列，其功能是指导下游基因或多个基因转录。

“处于转录调控下”(under transcriptional control)或“被转录调控的”(transcriptionally controlled)是本领域中熟知的术语，提示多核苷酸序列的转录取决于其被可操纵地连接于有助于转录起始或促进转录的元件，所述多核苷酸序列通常是DNA序列。

“可操纵地连接”(operably linked)是指并列(juxtaposition)，其中元件处于使它们起作用的排列中。“处于翻译调控下”(under translationalcontrol)是本领域中熟知的术语，提示形成信使RNA后发生的调控过程。

术语“过表达”(over expressed)意味着在宿主细胞中的相同基因产物的拷贝数目增加。

如此处所应用，当描述蛋白和编码它们的基因时，用于基因的词语不大写并且是斜体的，即，glkA。用于蛋白的词语通常不斜体并且第一个字母是大写的，即，GlkA。

术语“蛋白”(protein)和“多肽”(polypeptide)在此处可互换应用。

如此处所应用，“抗坏血酸(ASA)中间产物(ascorbic acid(ASA)intermediate)”意味着葡萄糖酸(gluconate(GA))；2-酮基-D-葡萄糖酸(2-keto-D-gulonic acid(2KDG))、2，5-二酮基-D-葡萄糖酸(2，5-diketo-D-gulonate(2，5-DKG))；2-酮基-L-葡萄糖酸(2-keto-L-gulonicacid(2-KLG))；和L-艾杜糖酸(L-idonic acid(IA))。这些化合物中的一些的化学式显示于图1。

如此处所应用，宿主细胞的“氧化途径”(oxidative pathway)意味着宿主细胞包括至少一种氧化碳源的酶，碳源如D-葡萄糖和/或其代谢物。宿主细胞中的氧化途径可以包括一种、两种、三种或多种酶。氧化途径的一个例子是由葡萄糖脱氢酶活性从葡萄糖形成葡萄糖酸。氧化途径的另一个例子是由葡萄糖脱氢酶和葡萄糖酸脱氢酶活性从葡萄糖形成2-KDG。氧化途径的另一个例子是经葡萄糖脱氢酶、葡萄糖酸脱氢酶和2-KDGDH活性从葡萄糖形成2，5-DKG。

如此处所应用，宿主细胞的“分解代谢途径”(catabolic pathway)意味着，宿主细胞包括至少一种酶，其产生至少一种代谢中间产物。经常地，代谢中间产物的形成和ATP、NADPH、或NADH的形成相偶联，例如，由氧化磷酸化碳源如D-葡萄糖和/或其代谢物形成。宿主细胞中的细胞内分解代谢途径意味着，宿主细胞在宿主细胞胞浆中包括至少一种酶的活性。在一些实施方案中，分解代谢途径包括两种、三种或多种酶的活性。分解代谢途径包括但不限于糖酵解、戊糖途径和TCA循环途径。

如此处所应用，术语“细菌”(bacteria)是指微小生物体的任何集合，所述生物体是原核的，即，缺少膜包绕的细胞核和细胞器。所有细菌由液态膜包绕，液态膜调节物质流入和流出细胞。刚性的细胞壁完全包绕细菌并位于膜外。有许多不同种类的细菌，其中的一些包括但不限于杆菌(Bacillus)、链霉菌(Streptomyces)、假单胞菌(Pseudomonas)、和肠杆菌科(Enterobacteriaceae)家族的菌株。

如此处所应用，家族“肠杆菌科”是指细菌株，其具有革兰氏阴性和兼性厌氧的一般特征。对于产生ASA中间产物，优选的肠杆菌科菌株是那些能够从D-葡萄糖或碳源产生2，5-二酮基-D-葡萄糖酸的菌株，所述碳源能够被该菌株转变为D-葡萄糖。(Kageyama等人，International J.Sys.Bacteriol.42：203(1992))。包含在肠杆菌科家族中的是欧文氏菌属、肠杆菌属、葡萄糖杆菌属、克雷伯菌属、埃希菌属和泛菌属。在本发明中，用于生成2-KDG的优选的肠杆菌科发酵菌株是泛菌属菌种。

泛菌属包括成团泛菌(P.agglomerans)、分散泛菌(P.dispersa)、P.punctata、P.citrea、P.terrea、P.ananas和P.stewartii，特别是Pantoeacitrea。Pantoea citrea可以从ATCC(Manassas，VA)，例如ATCC编号39140获得。Pantoea citrea有时被称为Erwinia citreus或Acetobactercerinus。因此，意图在于，泛菌属包括重新分类的种，包括但不限于Pantoea citrea或Acetobacter cerinus。

如此处所应用，家族“杆菌”(Bacillus)是指棒状的细菌株，具有革兰氏阳性的一般特征并能够在氧存在下产生抗性内生孢子(resistantendospores)。杆菌的例子包括枯草芽胞杆菌(B.subtilis)、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、缓慢芽孢杆菌(B.lentus)、环状芽胞杆菌(B.circulans)、B.lautus、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)、嗜碱芽孢杆菌(B.alkalophilus)、凝结芽胞杆菌(B.coagulans)、苏云金芽胞杆菌(B.thuringiensis)和B.brevis。

根据本发明的“改变的细菌宿主”(altered bacterial host)或“改变的细菌细胞”(altered bacterial cell)是指细菌细胞，其能够通过内源性2-KDGDH酶的作用将2-KDG酶促转变为2，5-DKG，其中使内源性2-KDGDH酶无功能。在一种实施方案中，与在基本上相同的培养条件下生长的相应的未改变的细菌宿主细胞中累积的(或短暂累积的(transiently accumulated)2-KDG水平相比，改变的细菌细胞将具有更高水平的累积的2-KDG。

根据本发明的“未改变的细菌细胞”(unaltered bacterial cell)或“未改变的细菌宿主”(unaltered bacterial host)是细菌细胞，其中内源性2-KDGDH未被失活，并且2-KDGDH酶保持导致2-KDG氧化为2，5-DKG的功能。

“更高水平的累积的2-KDG”(Higher level of accumulated 2-KDG)是指在基本上相同的条件下培养时，与相应的未改变的细菌宿主细胞中的2-KDG量相比，改变的细菌细胞中的2-KDG量。例如，更高水平的累积的2-KDG可以是比相应的未改变的细菌宿主中产生的2-KDG的量增加至少1％、2％、5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％或更多。累积水平的增加可以用多种方式表达，包括以重量百分数(产物gm/底物gm)或gm/L每时间单位。更高水平的累积的2-KDG由一个或多个基因的失活产生，所述基因是产生功能性2-KDGDH所需的基因。

如此处所应用，“染色体整合”(chromosomal intergration)是一种方法，通过该方法，导入的多核苷酸被并入宿主细胞染色体。方法优选地经同源重组发生。

如此处所应用，“改变”(modifying)宿主细胞产生的蛋白水平或酶活性是指，控制培养期间产生的蛋白水平或酶活性，以致于水平如所需地增加或降低。

如此处所应用，当指核酸或多核苷酸时，术语“修饰的”(modified)意味着，相比于野生型核酸，该核酸已经以某些方式被改变，如经突变；删除部分或全部核酸；或经操纵地连接于转录调控区实施。如此处所应用，当指代核酸时，术语“突变”(mutation)是指核酸中的任何改变，以致于该核酸的产物被部分或全部失活。突变的例子包括但不限于点突变、移码突变和编码2-KDGDH的部分或全部基因的删除。

如此处所应用，“所需产物”(desired product)是指所需化合物，碳底物被生物转化为该化合物。代表性的所需产物是葡萄糖酸、2-KDG；和5-酮基-葡萄糖酸。

如此处所应用，当用于指代细胞、核酸或蛋白时，术语“重组子”(combinant)是指，已经通过导入异源核酸或改变天然核酸修饰了细胞、核酸或蛋白，或者该细胞来源于如此修饰的细胞。因此，例如，重组细胞表达天然(非重组)形式细胞中未发现的基因，或表达天然基因，所述天然基因否则表达不足或根本不表达。在一些实施方案中，本发明的改变的细菌宿主细胞是重组细胞。

如此处所应用，术语“内源的”(endogenous)是指宿主中天然发生的核酸或核酸所编码的蛋白。

如此处所应用，术语“异源的”(heterogenous)是指宿主中不天然发生的核酸或蛋白序列。

如此处所应用，术语“分离的”(isolated)或“纯化的”(purified)是指酶、核酸、蛋白、肽或辅助因子，其从天然联系的至少一种成分中被去除。

如此处所应用，术语“载体”(vector)是指多核苷酸构建体，其被设计为将核酸导入一种或多种细胞类型。载体包括克隆载体、表达载体、穿梭载体、质粒、序列盒和类似物质。

与另一序列有一定百分数(例如，80％、85％、90％、95％、96％、97％或99％)的“序列同一性”(sequence identity)的多核苷酸或多肽意味着，在比较两个序列时，当联配时，这些百分数的碱基或氨基酸是相同的。可以用本领域中已知的软件程序来确定这种联配和同源性百分数或序列同一性，例如描述于CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY(F.M.Ausubel等人编辑，1987)增刊30，7.7.18部分中的那些程序。优选的联配程序是ALIGN Plus(Scientific andEducational Software，Pennsylvania)，优选地应用缺省参数，如下：错配＝2；开放空位(open gap)＝0；延伸空位(extend gap)＝2。可以应用的另一序列软件程序是TFastA Data Searching Program，可以从SequenceAnalysis Software Package版本6.0(Genetic Computer Group，Universityof Wisconsin，Madison，WI)得到。

本领域充分理解的是，糖类的酸性衍生物，可以以各种电离状态存在，这取决于它们的周围环境(media)，不论是在溶液中，或是如果以固体形式，在其被制备的溶液之外。应用术语如，例如，葡萄糖酸指定这种分子，意图于包括所指的有机分子的所有电离状态。因此，例如，“葡萄糖酸”(gluconic acid)和“葡萄糖酸”(gluconate)是指相同的有机部分，并且不意图于指定具体的电离状态或化学形式。

如此处所应用，术语“培养”(culturing)是指在反应器中促发酵地将碳底物生物转化为所需产物。生物转化意味着，用碳底物接触微生物，以转化碳底物为所需产物。

如此处所应用，术语“包括”(comprising)及其同源词以其包含的意义被应用；即，等价于术语“包括”(including)和其相应的同源词。

如果上下文没有清楚地指明，“一个”(A)、“一个”(an)、和“那个“(the)包括复数形式。

如此处所应用，术语“转运体”(transporter)是指催化分子穿过细胞内膜(internal cell membrane)转运的蛋白。葡萄糖转运体催化葡萄糖转运进入细胞质，葡萄糖酸转运体催化葡萄糖酸的转运并且也催化其它糖酸分子或糖-酮酸穿过细胞膜转运。

“细胞质”(cytoplasma)或“细胞质的”(cytoplasmic)是指，在细胞内膜(inner cell membrane)之内。细胞外或细胞内膜外是指细胞质膜相反侧的细胞区域，包括但不限于周质(periplasma)。内部的或内膜(internal orinner membrance)(和有时称为周质膜)是指将细胞质和周质分隔的屏障。细胞内(intracellular)是指靠近细胞溶质的膜侧的细胞部分。细胞内包括细胞溶质。

如此处所应用，词语“葡萄糖激酶”(glucokinase)(E.C.-2.7.1.2)意味着磷酸化D-葡萄糖或L-葡萄糖6位碳的酶，例如GlkA。

如此处所应用，词语“葡萄糖酸激酶”(gluconokinase)(E.C.-2.7.1.12)意味着磷酸化D-葡萄糖酸或L-葡萄糖酸6位碳的酶，例如GntK。

B.优选实施方案

多核苷酸和蛋白：

本申请涉及编码2-KDGDH酶的分离的多核苷酸。已经发现许多细菌菌种含有2-KDGDH酶。国际生物化学和分子生物学联盟命名委员会(Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry andMolecular Biology)(NC-IUBMB)对2-KDGDH指定编号为EC 1.1.99.4。更具体地，2-KDGDH属于中等链脱氢酶/还原酶(MDR)(medium-chaindehydrogenase/reductase)种类的酶。这是大的酶超家族，有大约一千(1000)个成员。2-KDGDH已经被归类在MDR支类中，其显示多羟基化合物脱氢酶(PDH)活性。(Nordling等人，(2002)Eur.J.Biochem.269：4267-4276)。

2-KDGDH酶优选地是膜结合酶，分离自泛菌属、醋杆菌属、欧文氏菌属或葡萄糖杆菌属菌种，特别是来自Pantoea citrea或Pantoeaagglomerans。已经显示，这些菌种从2-KDG和葡萄糖酸的转化产生2-5-DKG。

在一种实施方案中，2-KDGDH酶是多聚复合体，由包括三个基因的操纵子编码。优选地，三个基因是相邻的并且是作为一个转录单位被组织起来的。操纵子的第一个基因编码称为亚基A的蛋白。操纵子的第二个基因编码称为亚基B的蛋白，其中亚基B是脱氢酶蛋白。在一种优选的实施方案中，亚基B脱氢酶是黄素蛋白。黄素蛋白是含有核黄素的衍生物作为辅基的酶。操纵子的第三个基因编码称为亚基C的蛋白，其中亚基C是细胞色素c蛋白。

在一种实施方案中，分离的多核苷酸编码具有SEQ ID NO.2氨基酸序列的亚基A蛋白，或和SEQ ID NO.2具有至少93％、95％、96％、97％、98％和99％序列同一性的氨基酸。在另一种实施方案中，分离的多核苷酸编码具有SEQ ID NO.4的氨基酸序列的亚基B脱氢酶蛋白，或和SEQ ID NO.4具有至少93％、95％、96％、97％、98％和99％序列同一性的氨基酸。在又一种实施方案中，分离的多核苷酸编码亚基C细胞色素C蛋白，其具有SEQ ID NO.6的氨基酸序列，或和SEQ ID NO.2具有至少93％、95％、96％、97％、98％和99％序列同一性的氨基酸。本领域的技术人员清楚地意识到，遗传密码的简并性以及一个氨基酸可以由多于一个密码子来编码。这些变化作为本发明的一部分包含于此。

在进一步的实施方案中，编码2-KDGDH复合体亚基A的分离的多核苷酸包括SQE ID NO.1的核酸序列；编码被称为亚基B的脱氢酶蛋白的分离的多核苷酸包括SEQ ID NO.3的核酸序列，编码被称为亚基C的细胞色素C蛋白的分离的多核苷酸包括SEQ ID NO.5的核酸序列。

本发明也提供了方法，用SEQ ID Nos.1、3或5中列出的多核苷酸序列作为探针，在其它微生物体中检测2-KDGDH。在一种实施方案中，来自SEQ ID Nos.1、3或5中任一一个的至少10、15、20、25、30、40、50或更多的连续序列可以被用作探针，以检测编码2-KDGDH酶复合体中亚基A、亚基B或亚基C的多核苷酸。在另一种实施方案中，来自SEQID Nos.1、3或5中任一一个的至少20个连续序列可以被用作探针。进一步地，来自SEQ ID No.3的至少10、15、20、25、30、40、50或更多的连续序列可以被用作探针。此外，用于本发明的寡核苷酸探针可以包括编码多肽的核酸序列，所述多肽具有SEQ ID Nos.2、4或6中至少5、10、15、20、25、30或更多的连续氨基酸残基。

鉴定其它细菌微生物，特别是泛菌属菌种中发现的2-KDGDH酶或2-KDGDH酶亚基的方法，在本领域中是已知的，并且包括杂交研究方法。因此，例如，在高度严紧条件下和图3A、4或6中的序列杂交的核酸序列或其互补序列，也可以编码起2-KDGDH酶亚基A、亚基B或亚基C作用的蛋白。杂交包括核酸链通过碱基配对结合于互补链的过程。高度严紧条件是本领域中已知的，参见例如，Maniatis等人，MOLECULARCLONING：A LABORATORY MANUAL，第二版(1989)和SHORTPROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，编者Ausubel等人。严紧条件是序列依赖性的，并且在不同环境下将是不同的。较长的序列在较高温度下特异地杂交。核酸杂交的详细指南参见Tijssen，TECHNIQUESIN BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY-HYBRIDIZATIONWITH NUCLEIC ACID PROBES，OVERVIEW of Principles ofHybridization and the Strategy ofNucleic Acid Assay(1993)。对于指定的离子强度和pH下的特定序列，通常被选出的严紧条件是，比热熔点(thermal melting point)Tm低大约5至10度。Tm是50％的探针互补于靶序列，平衡地杂交于靶序列的温度(在限定的离子强度、pH和核酸浓度下)。严紧条件是那些条件，其中盐浓度在pH7.0至8.3下低于大约1.0M钠离子，典型地是大约0.01至1.0M钠离子浓度(或其它盐类)，并且对于短的探针(例如，对于10至50个核苷酸)，温度至少为30℃，对于长的探针(例如，多于50个核苷酸)，是至少60℃。也可以通过加入去稳定剂如甲酰胺获得严紧条件。在另一种实施方案中，应用较低严紧的杂交条件。例如，可以应用中度或低度严紧条件。

也可以用聚合酶链式反应(PCR)筛选同源序列，参见Chen等人，(1995)Biotechniques 18(4)：609-612。其它方法包括蛋白质生物分析或免疫分析技术，其包括基于膜的、基于溶液的、或基于芯片的技术，用于检测和/或定量核酸或蛋白质。

进一步地，本发明涉及分离的细胞色素c蛋白，其具有SEQ ID NO.6中列出的氨基酸序列，和分离的脱氢酶，其具有SEQ IDNO.4中列出的氨基酸序列。亚基A具有SEQ ID NO.1中列出的核酸序列，其编码SEQID NO.2中列出的氨基酸序列，相对于Pujol及Kado(2000)J.Bacteriol.182：2230-2237中公开的编码酮基-D-葡萄糖酸脱氢酶亚基前体的多核苷酸，分别具有89.6％的同一性和95.8％的同一性。亚基B具有SEQ IDNO.3中列出的核酸序列，其编码SEQ ID NO.4中列出的氨基酸序列，相对于Pujol及Kado(2000)supra中公开的编码酮基-D-葡萄糖酸脱氢酶亚基前体的多核苷酸，分别具有89.9％的同一性和99.8％的同一性。亚基C具有SEQ ID NO.5中列出的核酸序列，其编码SEQ ID NO.6中列出的氨基酸序列，相对于Pujol及Kado(2000)supra中公开的编码酮基-D-葡萄糖酸脱氢酶亚基前体的多核苷酸，具有85.5％的同一性和94.3％的同一性。Pujol及Kado中公开的推断的2-酮基葡萄糖酸脱氢酶操纵子的核苷酸序列，已经保存在GenBank中，收录编号是AF131202。

脱氢酶分析方法是公知的，可以采用Bouvet等人(1989)Int.J.Syst.Bacteriol.39：61-67中描述的方法，应用补充有2KDG的MGY中生长的细胞。也参考Shinagawa和Ameyama(1982)Meth.Enzymol.89：194-198。

用于检测葡萄糖酸、2-KDG和2，5-DKG的进一步的定性分析方法是本领域中已知的，例如，可以通过应用HPLC得到。

失活2-KDGDH酶的方法

大体而言，使染色体基因无功能的方法在本领域中是已知的，许多这些技术可以被用来失活具有2-KDGDH活性的酶。这些方法中的一些包括遗传工程技术，其它方法包括技术如筛选和诱变。

通过失活组成2-KDGDH酶复合体的三个亚基中的任一，可以使根据本发明的2-KDGDH酶无功能。这些亚基被称为亚基A、具有脱氢酶活性的亚基B、和亚基C(细胞色素c蛋白)。

在一种优选的实施方案中，使亚基B无功能，此亚基的失活导致2-KDGDH酶失活。在另一种实施方案中，使亚基C无功能，此亚基的失活导致2-KDGDH酶失活。在另一种实施方案中，使亚基A无功能，此亚基的失活导致2-KDGDH酶失活。

在进一步的实施方案中，使两个亚基无功能，例如，亚基B和亚基C，这导致2-KDGDH酶失活。在进一步的实施方案中，失活基因如删除基因的表达产物，可以是截短的蛋白，只要该蛋白在生物活性上有变化。生物活性的变化可以是改变的活性，但是优选地是生物活性的丧失。

一种优选的失活方法是删除至少一个基因，所述基因编码2-KDGDH酶的亚基之一。在一种实施方案中，欲被删除的基因编码亚基B，其为脱氢酶。在另一种实施方案中，欲被删除的基因编码亚基C，其为细胞色素C蛋白。在另一种实施方案中，欲被删除的基因编码亚基A。在进一步的实施方案中，可以删除两个基因，例如，编码亚基B和亚基C的基因。优选地，编码亚基B的基因是通过删除而失活的。在所有情况下，只要留在染色体中的序列对于待决基因的生物活性来说是过短的，删除可以是部分的。

根据本发明，删除2-KDGDH酶亚基的一种方法包括构建载体，载体包括所需亚基编码序列的同源侧翼区。侧翼区可以包括5’和3’末端的从大约1bp至大约500bp。载体的侧翼区可以大于500bp，在一些实施方案中，可以包括包含2-KDGDH操纵子的其它基因，其也导致这些基因的失活或删除。载体构建体可以被导入宿主细胞，例如，通过转化，随后，被整合入宿主细胞染色体。最终的结果是，导入的DNA引起编码2-KDGDH的一个或多个内源性基因的删除，因此导致无功能的2-KDGDH酶。

例如，如图8所示，首先通过将含有2-KDGDH亚基B(2-KDGDH-B)基因的DNA片段克隆入载体，构建失活序列盒。为了失活2-KDGDH基因，将抗生素抗性基因(即，氯霉素，Cm^R基因)克隆入2-KDGDH基因中发现的唯一的限制性酶切位点。将抗生素标记插入2-KDGDH-B基因中断了其正常编码序列。用非-复制的R6K载体如pGP704，经同源重组将失活的序列盒导入宿主细胞染色体(Miller等人(1988)J.Bacterial 170：2575-2583)。序列盒导入宿主细胞染色体是通过宿主细胞含有Cm^R选出的。一旦确证2-KDGDH-B基因的失活，从2-KDGDH-B编码区去除Cm^R，在编码区中留下中断区(interrupting spacer)(在本例子中，其包括一个拷贝的loxP位点)，使编码区失活(Palmeros等人，(2000)Gene 247：255-264)。

在另一种实施方案中，失活是通过插入实施的。插入失活包括中断染色体编码区。例如，当编码亚基B的基因是欲失活的基因，DNA构建体将包括编码亚基B的核酸序列，其中编码序列被选择标记(selective marker)中断。选择标记将位于亚基B编码序列的片段(sections)的每一侧的侧翼。DNA构建体和宿主染色体中亚基B基因基本上同一的序列对齐(align)，在双交换事件(double crossover event)中，通过插入选择标记，亚基B基因被失活。可选择标记是指能够在宿主微生物中表达的基因，其允许容易地选出那些含有载体的宿主。这种可选择标记的例子包括但不限于抗生素抗性基因如红霉素、卡那霉素、氯霉素和四环素。上面通常描述的方法可以用编码亚基A、亚基B或亚基C的序列实施。

可以在细菌生物体中用作载体的质粒是公知的，参见Maniatis等人，MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，第二版(1989)和MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，第二版(Sambrook等人，1989)和Harwood及Cutting编辑的MOLECULARBIOLOGY METHODS FOR BACILLUS(1990)中的Bron，S，第三章，Plasmids，John Wiley & Sons Ltd。

用于将编码非天然发生蛋白或酶的多核苷酸重组导入肠杆菌科菌株的质粒是RSF1010，其为可移动(mobilizable)但不自动转移(selftransmissible)的质粒，具有在宽范围的细菌宿主，包括革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌中复制的能力。(Frey等人，1989，The MolecularBiology of IncQ Plasmids.在：Thomas，(编者)，PROMISCUOUSPLASMIDS OF GRAM NEGATIVE BACTERIA中，Academic Press，London，第79-94页)。Frey等人报道了发现影响PSF1010移动特性的三个区(Frey等人(1992)Gene 113：101-106)。

在另一种实施方案中，失活是通过以质粒为载体，在单交换事件(single crossover event)中插入实施的。例如，编码2-KDGDH亚基如亚基B的染色体基因，和包括SEQ ID NO.3序列或基因编码序列一部分以及选择标记的质粒并列，所述染色体基因具有SEQ ID NO.3公开的核酸序列。选择标记可以位于基因编码序列之内，或在与该基因分离的质粒部分上。载体可以被整合入细菌染色体，通过将载体插入编码序列，使基因失活。

失活也可以通过基因突变发生。突变基因的方法是本领域公知的，包括但不限于化学诱变、定点突变、产生随机突变、和双链缺口方法(gapped-duplex approaches)。(USP 4,760,025；Moring等人，Biotech.2：646(1984)；和Kramer等人，Nucleic Acids Res.12：9441(1984))。另一公知方法包括应用经转座子的随机诱变(random mutagenesis)(Miller J.H.(1992)A SHORT COURSE IN BACTERIAL GENETICS，Cold SpringHarbor Laboratory Press，New York 372-380页)。诱变发生之后，可以用各种方法选出具有所需性质的突变体，例如，在选择性培养基中进行选择性分离。

在一些实施方案中，构建致突变载体(mutagenic vector)，所述载体含有多克隆位点序列盒，其优选地包括至少一个限制性内切酶位点，所述位点对于载体是唯一的，以协助容易地进行核酸操作。在一种优选的实施方案中，载体也包括一个或多个选择标记。

根据本发明，在改变的细菌株中，2-KDGDH酶失活将优选地是稳定的和不可恢复的失活。

宿主细胞

根据本发明的特别优选的细菌宿主细胞是肠杆菌科细胞。优选的肠杆菌科宿主是大肠杆菌、克雷伯菌属和泛菌属细胞。特别优选的泛菌属细胞P.citrea和P.aggolmerans。这些微生物的来源包括公立保藏单位如ATCC和商业来源。例如，ATCC保藏编号21998、13182和39140。进一步参照见USP 5,032,514和Truesdell等人，(1991)J.Bacteriol.173：6651-6656。杆菌属的菌种也可以作为宿主细胞。包括无功能2-KDGDH酶的改变的细菌宿主细胞可以是重组的宿主细胞。

在一种实施方案中，本发明的改变的细菌细胞包括操纵子，操纵子包括编码三个蛋白亚基的三个基因，亚基被称为亚基A、亚基B和亚基C，所述本发明的改变的菌体细胞包括失活的2-KDGDH酶，其中2-KDGDH酶在失活之前能够催化2-KDG转变为2，5-DKG。修饰如删除任何一个亚基或任一亚基的一部分，可以导致内源性2-KDGDH无功能。

在优选的实施方案中，修饰的是亚基C和/或亚基B，以获得本发明的改变的菌体细胞。优选地，亚基B是通过或是删除部分编码区或是插入失活被修饰的。

在一种实施方案中，是脱氢酶蛋白的亚基B是由多核苷酸编码的，所述多核苷酸具有SEQ ID NO.3列出的序列或具有和SEQ ID NO.3序列至少有70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％或99％同一性的核酸序列。在进一步的实施方案中，是细胞色素c蛋白的亚基C是由多核苷酸编码的，所述多核苷酸具有SEQ ID NO.5列出的序列或具有和SEQ ID NO.5序列至少有70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％或99％同一性的核酸序列。

作为2-KDGDH酶失活的结果，不论失活是否是由于例如2-KDGDH酶复合体中的一个、两个或三个亚基的失活或删除，2-KDG向2，5DKG的转变将被减少，并且2-KDG将在细胞环境中累积。根据本发明的这方面，相比于相应的未改变的细菌宿主细胞，改变的细菌细胞将具有增加的或更高水平的累积2-KDG，其中2-KDG是被短暂积累的。

附加的基因修饰

如上所述，细菌宿主细胞可以是重组的宿主细胞。对宿主细胞的修饰可以在2-KDGDH失活之前、同时或之后被认识到。可以对染色体基因进行修饰，修饰可以包括失活，如删除或中断内源性染色体基因、导致内源性染色体基因表达增加的修饰、和包含异源基因。

可以被并入本发明包含的细菌宿主细胞的附加修饰的更具体例子包括但不限于：i)对编码葡萄糖酸转运体的基因的修饰；ii)对编码葡萄糖转运体的基因的修饰(Peekhaus等人，1997，Fems Micro.Lett.147：233-238)；iii)对编码KDG转运体的基因的修饰；iv)导致基因过表达的基因修饰，例如，葡萄糖脱氢酶基因的过表达、葡萄糖酸脱氢酶基因的过表达、或参与细胞色素c的生物发生(biogenesis)的基因如ccm基因的过表达(Kranz等人，(1996)Mol.Microbiol.29：3283-396)；v)对多核苷酸的修饰，所述多核苷酸使分解代谢途径从氧化途径中解偶联，如通过失活在第六位碳上磷酸化D-葡萄糖或D-葡萄糖酸的酶，更特异地是失活己糖激酶基因、葡萄糖激酶基因或葡萄糖酸激酶基因即gntK和/或glkA实施，参照WO 02/081440；和vi)对编码酶的基因的修饰，所述酶以2-KDG作为底物，例如，2-酮基-还原酶或2-酮基激酶。

在一些优选的实施方案中，根据本发明的改变的细菌株将包括失活的gntK和/或失活的glkA基因。在另一种优选的实施方案中，根据本发明的改变的细菌株将包括失活的葡萄糖酸转运体。

在一些实施方案中，包括失活2-KDGDH的改变的细菌株可以附加地包括其它失活基因，例如，两个失活基因、三个失活基因、四个失活基因、五个失活基因、六个失活基因或更多。失活的基因可以是彼此相邻的，或可以位于细菌染色体的分别的区中。在一些情况下，失活的染色体基因可以具有必要的功能，但是在实验室条件下，该基因对于细菌株的存活能力不是必要的。优选的实验室条件包括但不限于条件如在发酵罐中生长，在摇瓶中生长，在平板培养基中生长或类似条件。

在一种实施方案中，包括失活2-KDGDH的根据本发明的改变的细菌细胞可以进一步包括失活的葡萄糖激酶基因。在另一种实施方案中，可以将宿主细胞设计为，含有编码酶的基因，已知所述酶影响葡萄糖或其它普通代谢物从已知包含它们的生物体中转变为2-KDG或2-KLG。影响普通代谢物转变为2-KDG或2-KLG的例子是D-葡萄糖脱氢酶(Adachi，O.等人，(1980)Agric.Biol.Chem.，44：301-308；Ameyama，M.等人，(1981)Agric.Biol.Chem.45：851-861；Smith等人(1989)Biochem.J.261：973；和Neijssel等人，(1989)Antonie Van Leauvenhoek 56(1)：51-61)；和D-葡萄糖酸脱氢酶(Mcintire，W.等人，(1985)Biochem.J.，231：651-654；Shinagawa，E.等人，(1976)Agric.Biol.Chem.40：475-483；Shinagawa，E.等人，(1978)Agric.Biol Chem.42：1055-1057；和Matsushita等人(1979)，J.Biochem.85：1173)；5-酮基-D-葡萄糖酸脱氢酶(Shinagawa，E.等人，(1981)Agric.Biol.Chem.，45：1079-1085和Stroshane(1977)Biotechnol.BioEng.19(4)459)；和2，5-二酮基-D-葡萄糖酸还原酶(USP Nos：5,795,761；5,376,544；5,583,025；4,757,012；4,758,514；5,008,193；5,004,690；和5,032,514)。在另一种实施方案中，可以将宿主细胞设计为，含有编码酶的基因，所述酶将2-KDG转变为其它商业上有用的产物。

根据本发明的优选的改变的细菌株将是重组的泛菌属菌株，优选地是P.citrea菌株。在一些实施方案中，重组的菌株将任选地包括或是单独地或是联合的失活的葡萄糖酸转运体基因；失活的葡萄糖激酶基因；失活的葡萄糖酸激酶基因；失活的甘油激酶基因；和失活的葡萄糖转运体系。如果葡萄糖酸不被转运穿过细胞膜，可以有更多的可利用葡萄糖酸，用于在氧化途径中转变为2-KDG。

回收、鉴定和纯化ASA中间产物

检测ASA中间产物、ASA和ASA立体异构体如异抗坏血酸(D-异抗坏血酸)、L-异抗坏血酸和D-木糖型抗坏血酸(D-xyloascorbic acid)的方法包括用2，6二氯吲哚酚(Burton等人(1979)J.Assoc.Pub.Analysts 17：105)或其它合适的试剂进行氧化还原滴定；用阴离子交换进行高效液相色谱(HPLC)；和电-氧化还原方法(eletro-redox procedures)(Pachia，(1976)Anal.Chem.48：364)。技术人员将意识到，利用这些检测方法中使用的操作(controls)。选择性地，中间产物也可以直接从发酵肉汤或生物反应器中制备并颗粒化或放入液态制剂中。通过本领域技术人员已知的方法，可以将根据本发明产生和累积的2-KDG进一步转变为异抗坏血酸，参见例如，Reichstein和Grussner，Helv.Chim.Acta.，17，311-328(1934)。

基因转移

用于细菌细胞的基因转移技术是公知的，这些技术包括转化、转导、接合和原生质体融合。基因转移是将基因或多核苷酸转移到一个细胞或多个细胞中的过程，其中细菌吸收了外源加入的DNA。CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(第一卷，Ausubel等人编辑，John Wiley & Sons，Inc.1987，第九章)中教导了普通的转化方法，包括磷酸钙法、用DEAE-Dextran转化和电穿孔。本领域技术人员已知在特定宿主细胞中导入核酸的各种转化方法。(也参见USP 5,032,514；Potter H.(1988)AnaL Biochem 174：361-373；Sambrook，J.等人，MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，ColdSpring Harbor Laboratory Press(1989)；和Ferrari等人，Genetics，BACILLUS中57-72页，Harwood等人编辑，Plenum Publishing Corp))。

可以通过标记基因表达的存在/不存在检测宿主细胞的转化，标记基因表达的存在/不存在可以提示所需核酸是否存在。然而，其表达应该被证实。例如，如果编码亚基B脱氢酶蛋白的核酸被插入标记基因序列中，可以通过标记基因功能的不存在来鉴定含有插入序列的重组细胞。选择性地，标记基因可以和编码脱氢酶的核酸串联，处于单一启动子的调控下。标记基因响应于诱导或选择的表达通常也提示蛋白或酶的表达。一旦创建了如上所述的能够进行转变的细菌微生物，可以根据用于重组蛋白的表达载体构建体的性质和根据宿主的生长特征，用各种方式行使本发明方法。

细胞培养物和发酵(fermentations)

适于维持细菌细胞生长的方法是公知的，参考MANUAL OFMETHODSOF GENERAL BACTERIOLOGY，Eds.P.Gerhardt等人，American Society for Microbiology，Washington DC(1981)和T.D.Brock，BIOTECHNOLOGY：A TEXTBOOK OF INDUSTRIALMICROBIOLOGY，第二版(1989)Sinauer Associates，Sunderland，MA。

细胞预培养物一典型地，细胞培养物在25至32℃，优选地在大约28或29℃，在合适的培养基中生长。用于本发明的代表性的生长培养基是普通的商业制备的培养基，如同但不限于Luria Bertani(LB)肉汤、沙氏葡糖(Sabouraud Dextrose)(SD)肉汤或酵母培养基(Yeastmedium)(YM)肉汤。这些可以从，例如GIBCO/BRL(Gaithersburg，MD)得到。可以应用其它限定的或合成的生长培养基，并且，用于具体细菌微生物生长的合适培养基对于微生物学或发酵科学领域的技术人员将是已知的。发酵优选的合适pH范围是pH5至pH8之间。种植烧瓶(seedflasks)的优选范围是pH7至pH7.5，反应器的优选范围是pH5至pH6。发酵微生物领域技术人员将理解的是，为了最大化抗坏血酸中间产物的产量，必须优化和控制影响发酵过程的许多因素。这些因素中的许多如pH、碳源浓度和溶解的氧水平可以影响酶促过程，这取决于用于抗坏血酸中间产物生产的细胞类型。

ASA中间产物的生产可以在促发酵环境中进行，即，在体内环境，或非促发酵环境中进行，即，在体外环境；或在结合的体内/体外环境中进行。发酵或生物反应器可以以分批方法或连续方法实施。

体内生物催化环境：

生物催化起始于，在带有合适碳源的环境中，培养根据本发明的改变的细菌宿主细胞，所述碳源通常被肠杆菌科或其它细菌株利用。合适的碳源包括六碳糖，例如，葡萄糖，或六碳糖酸，或六碳糖和/或六碳糖酸的结合。其它碳源包括但不限于半乳糖、乳糖、果糖、或这样的酶促衍生物。

此外，发酵培养基必须包括合适的碳源底物，其包括但不限于单糖如葡萄糖、寡糖如乳糖或蔗糖、多糖如淀粉或纤维素和来自可更新进料(feedstock)的未纯化混合物如干酪乳清渗透物(cheese wheypermeate)、玉米浆(cornsteep liquor)、甜菜糖蜜(sugar beet molasses)和大麦芽。尽管预期了，本发明中应用的碳源可以包括宽范围的含碳底物，并且仅被生物体的选择所限，优选的碳底物包括葡萄糖、果糖和蔗糖及其混合物。通过应用葡萄糖和果糖的混合物，结合此处描述的改变的细菌株，氧化途径从分解代谢途径解偶联使得应用葡萄糖改进产量和转变为所需的ASA中间产物，而应用果糖满足宿主细胞的代谢需求。发酵培养基也必须含有合适的矿物质、盐、维生素、辅助因子和缓冲液，所述矿物质、盐、维生素、辅助因子和缓冲液适于培养物生长并促进抗坏血酸中间产物产生所需的酶促途径。

分批发酵和连续发酵：

本发明也应用分批发酵法，修改的分批发酵法、称作补料分批(Fed-batch)发酵法，或连续发酵法。经典的分批发酵是密闭体系，其中在发酵起始设置培养基组合物，并且在发酵期间培养基组合物不遭受人工改变。在发酵起始，用所需的细菌生物体或多种生物体种植培养基，使在不向体系中加入任何物质的情况下发生发酵。然而，典型地，“分批”(batch)发酵是针对加入碳源的分批，并且经常尝试调控因素(controlling factors)如pH和氧浓度。在分批体系中，体系的代谢物和生物材料组合物不断变化，直至发酵停止。在分批培养物中，细胞缓和地通过静止停滞期(static lag phase)到达高生长对数期(high growth logphase)，最终到达稳定期(stationary phase)，其中生长速度减低或停止。如果未经处理，稳定期的细胞将最终死亡。对数期的细胞通常对所需产物或中间产物的大部分产量负责。

对标准分批体系的变化是补料分批体系。补料分批发酵法也适于本发明，包括典型的分批体系，例外之处是，在发酵进行时累加加入底物。当分解代谢物抑制倾向于抑制细胞代谢时，和需要在培养基中存在限制量的底物时，补料分批发酵体系是有用的。测定补料分批发酵体系中的实际底物浓度是困难的，因而根据可测定因素如pH、溶解的氧和废气如CO₂分压的变化来估计。分批发酵法和补料分批发酵法是本领域中普遍的和公知的，例子参见T.D.Brock，BIOTECHNOLOGY：A TEXTBOOK OF INDUSTRIAL MICROBIOLOGY，第二版(1989)Sinauer Associates，Inc.Sunderland，MA。

在一种实施方案中，碳底物在进料溶液(feed solution)中的浓度是从大约55％至大约75％，这基于重量/重量比。优选地，浓度是从大约60％至大约70％，这基于重量/重量比。最优选地，应用的浓度是60％至67％葡萄糖。

连续发酵是开放体系，其中向生物反应器中连续加入限定的发酵培养基，同时移除等量的条件培养基(conditioned media)用于处理。连续发酵通常将培养物维持在不变的高密度，其中细胞基本上处于对数期生长。连续发酵允许调整一个因素或任意数目的因素，所述因素影响细胞生长或终产物浓度。例如，一个方法将维持限制性营养物(limiting nutrient)如碳源或氮水平在固定比例，并使所有其它参数是适度的。在其它体系中，尽管由培养基混浊度(media turbidity)测定的细胞浓度持续不变，可以连续改变许多影响生长的因素。连续体系努力维持稳定状态生长条件，因此，移去的培养基造成的细胞丢失必须平衡于发酵中的细胞生长速度。调整连续发酵法中营养物和生长因素的方法，以及最大化产物形成速度的技术，在工业微生物领域是已知的，Brock，supra中详述了各种方法。

所需产物从ASA途径的产量增加

除了2-KDG在根据本发明的改变的细菌宿主细胞中累积增加之外，进一步的实施方案可以导致分解代谢途径从ASA氧化途径解偶联，以增加葡萄糖酸的可利用性，用于2-KDG的产生。

如图2中所示，葡萄糖酸可以跨过细胞内膜被转运至细胞质。然后，葡萄糖酸可以被磷酸化，例如变为葡萄糖酸-6-磷酸，并且可以用于戊糖途径中的分解代谢。此外，葡萄糖酸可以在细胞质中被酶促还原为5-KDG或2-KDG。通过失活编码葡萄糖酸转运体的核酸，失活或改变葡萄糖酸转运体的水平，可以导致氧化ASA生成途径中可利用的葡萄糖酸的量增加。此外，葡萄糖酸激酶基因的失活可以导致葡萄糖酸磷酸化降低，进一步增加氧化ASA生成途径中可利用的葡萄糖酸的量和异抗坏血酸的产量。

通过参照下列实施例，本领域的技术人员可以更充分理解行使本发明的方式和方法，实施例不以任何方式意图于限制本发明的范围或其涉及的权利要求的范围。此处提及的所有参考文献和专利出版物在此并入，作为参考。

6.实施例

实施例1

失活orfs 2418-2420，其编码P.citrea中的2-酮基-D-葡萄糖酸脱氢酶 (2-KDGDH)活性：

A.克隆KDGDH操纵子：

应用菌株139-2a/Ps-克隆2-KDGDH操纵子。此菌株是菌株139-2a的衍生物，139-2a的ATCC保藏编号是39140，其中隐蔽质粒(pS)是用WO98/59054公开的方法去除的。也参考Truesdell等人，(1991)J.Bacteriol.173：6651-6656。

应用标准技术(Sambrook等人，MOLECULAR CLONING：ALABORATORY MANUAL，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)第二版)，用两个PCR引物，KDGF1和KDGR1，扩增2.8-kb的DNA片段，片段含有来自P.citrea 139-2a/Ps-菌株染色体的2-KDGDH操纵子。

KDGF15′AGTTAGCCGCTCATTTCCTG 3′(SEQ ID NO.7)

KDGR15′AGCCGCCTGGTTTTTAC 3′(SEQ ID NO.8)

以大肠杆菌TOP10细胞为宿主，将DNA片段克隆入pZeroBIunt载体，载体具有lac启动子(lacP)(Invitrogen，Carlsbad CA)。这导致了质粒pKDG2(6.32-kb)。在LA+Kan50平板上，(LB培养基，用1.5％琼脂固化，加50ppm卡那霉素)得到三个Kan^R转化株。当用合适的限制性内切酶消化时(EcoR I，Sca I+Spe I，Sal I+Spe I)，发现所有三个转化株具有插入片段，所有三个转化株的转录方向和lacP的方向相反。

B.构建敲除质粒(knockout plasmid)，敲除质粒用于从P.citrea染色体删除2-KDGDH操纵子：

通常地，用质粒经同源重组失活基因的策略在此前被描述过，参见Miller等人，(1988)J.Bacteriol.170：2575-2583。用这种普通方法失活2-KDGDH操纵子。

用Hpa I+Sca I酶消化根据上面的实施例1A得到的pKDG2质粒，以从B亚基(2-KDGDH-B)的中间至C-末端去除0.993-kb的区域。然后，将侧翼是两个loxP位点的cat序列盒(1.080-kb)插入质粒(Palmeros等人，(2000)Gene 247：255-264)，生成质粒pKDGCatl(6.41-kb；cat延伸方向和KDGDH操纵子相反)。用Not I，Sac I和Xba I酶消化验证质粒。从质粒pKDGCatl去除含有ColEl起始区(Ori region)的1.5-kbAatII+SpeI片段，然后用502-bp的AatII+Spe I DNA片段连接，所述502bp DNA片段含有复制(起始)区的最小R6K起点。用质粒pGP704(Miller等人，(1988)J.Bacteriol.170：2575-2583)作为PCR底物，用引物经PCR得到R6K起始区DNA(ori DNA)。从而得到最终的敲除质粒pKDGCatR6(5.37-kb)。用Sambrook等人MOLECULAR CLONING：ALABORATORY MANUAL，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)第二版中描述的方法转化大肠杆菌PIR1菌株(Invitrogen，Carlsbad，CA)。在此最终敲除的构建体中，在KDGDH操纵子的5’和3’末端可以得到960-bp和840-bp的同源区，以允许在P.citrea中同源重组。同源区由对亚基B的图4和图5中示例的orf表示。

C.转化入P.citrea菌株以得到改变的菌株：

用HindIII消化证实最终的敲除质粒pKDGcatR6(5.37kb)之后，将质粒电穿孔(Sambrook等人，MOLECULAR CLONING：ALABORATORY MANUAL，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)第二版)进入P.citrea 139-2a/Ps-(pKD46)感受态细胞，并用公知技术在LA+Cm 10平板上(LA是LB加琼脂平板，带有10ppm Cm)选择氯霉素抗性(CmR)转化株。为了区分单交换重组事件和双交换重组事件，在LA+Kan3平板上检查CmR转化株的卡那霉素敏感度(KanS)。13个CmR转化株中的9个是KanS，提示它们经历了双交换重组事件，其导致2-KDGDH操纵子失活。用下面描述的内部引物和外部引物(internal andexternal primers)，经PCR检查四个转化株4、5、8和9号。

D.PCR证实敲除菌株

为了证实KDGDH操纵子删除，在含有功能性KDGDH操纵子的野生型中和假定的突变体(putative mutants)中(改变的菌株)，两个外部引物均将扩增相同长度的条带，假定的突变体中删除了KDGDH操纵子。(参照上面的实施例1C，其中0.993-kb替换为1.08-kb cat-loxPDNA)。

因此，用一个外部引物和一个cat基因特异引物证实假定突变体的重组连接。与未改变的菌株相比，用cat3+KDGR2引物，所有四个转化株扩增出预期的1.14-kb条带，未改变的菌株没有扩增。用KDGF2+cat4引物，转化株扩增预期的1.17-kb条带。此结果显示，四个转化株如所预期，在KDG位置经历了双交换重组事件，从而失活了操纵子。

KDGF25’GCGTCTCTGCCATTGCGTAGTTTC 3’(SEQ ID NO.9)

KDGR25’GGGTGCGGATCGGTGTGGTTT 3’(SEQ ID NO.10)

CAT35’AAAGTTGGAACCTCTTACGTGCCG 3’(SEQ ID NO.11)

CAT45’CAACAGTACTGCGATGAGTGGCAG 3’(SEQ ID NO.12)

E.去除pKD46质粒：

由于改变的菌株仍然含有质粒pKD46质粒(Datsenko和Wanner(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.97：6640-6645)，它们被如下复原(be cured of)出此质粒。使细胞生长在不含羧苄青霉素(Carb)的液体培养基中，温度是30℃，3次传代(3天)，随后铺板和分离单个菌落。当在LA+Carb200平板上检测Carb敏感度时(Datsenko和Wanner，supra和Palmeros等人.(2000)Gene 247：255-264)，所有单个菌落分离物丢失了pKD46质粒。而且，应用标准方案分离质粒DNAs时(Sambrook等人，supra)，任何单一菌落分离物中均未检测到质粒。得到复原为pKD46的改变的泛菌属细胞并将其指定为WKDG4。

实施例2

用Pantoea citrea进行发酵试验

如无其它指明，用于细菌细胞生长的所有试剂和物质来自DiffcoLaboratories(Detroit，Mich.)、Aldrich Chemicals(Milwaukee，Wis.)或Sigma Chemical Company(St.Louis，Mo.)。

种子培养(Seed Train)：在空气中解冻贮存在液氮中的培养瓶，培养瓶含有所指的菌株WKDG4，将0.75ml加入含有500ml种子培养基(seedmedium)的无菌2-L-锥形烧瓶。于29℃和250rpm温育烧瓶12小时。转移标准是OD₅₅₀大于2.5。

种子烧瓶培养基(Seed flask medium)-如下制备培养基组合物：KH₂PO₄(12.0g/L)；K₂HPO₄(4.0g/L)；MgSO₄·7H₂O(2.0g/L)；Difco Soytone(2.0g/L)；柠檬酸钠(0.1g/L)；果糖(5.0g/L)；(NH₄)₂SO₄(1.0g/L)；尼克酸(0.02g/L)；FeCl₃·6H₂O(5mL/L的0.4g/L贮存液)和痕量的盐(5mL/L的下列溶液：0.58g/L ZnSO₄·7H₂O，0.34g/L MnSO₄·H₂O，0.48g/LNa₂MoO₄·2H₂O)。用20％NaOH将培养液的pH值调节至7.1±0.1单位。然后，用0.2μ过滤单位将得到的培养液无菌过滤。将无菌培养液加入预先高压灭菌的烧瓶中。

生产发酵罐(Production Fermentor)-灭菌之前加入反应器的物质包括：KH₂PO₄3.5g/L)；MgSO₄·7H₂O(1.0g/L)；(NH₄)₂SO₄(0.92g/L)；谷氨酸一钠(15.0g/L)；ZnSO₄·7H₂O(5.79mg/L)；MnSO₄·H₂O(3.44mg/L)；Na₂MoO₄·2H₂O(4.70mg/L)；FeCl₃·6H₂O(2.20mg/L)；氯化胆碱(0.112g/L)和Mazu DF-204(0.167g/L)抗泡沫剂。

将上面构建的培养基在121℃灭菌45分钟。罐灭菌之后，向发酵罐进行下列添加：尼克酸(16.8mg/L)；Ca-泛酸盐(Ca-pantothenate)(3.36mg/L)；葡萄糖(25g/L)和果糖(25g/L)。

灭菌和加入灭菌后组分之后的终体积是6.0L。用来自如上制备的种植烧瓶的全部完整内容物接种如此制备的罐和培养基，得到6.5L的体积。

生长条件是29℃和pH6.0。如所需调整搅拌速度、反压(backpressure)和气流，以保持溶解的氧高于零。当起始分批进入培养基的糖被耗尽时，应用如此处前述的补料分批法。在分批法期间用葡萄糖和果糖作为底物，在补料分批法期间仅应用葡萄糖作为底物。

如下面的表1所观察到，对于代表性的发酵过程，和等基因野生型菌株(139-2a/Ps-)相比，在补料分批发酵下，用菌株WKDG4在30小时时间段之后得到的2-KDG产量有显著意义，所述野生型菌株仅短暂产生2-KDG，这发生在其进一步转变为2，5-DKG之前。

表1-发酵产量

菌株	2-KDG浓度(g/L)	2-KDG产率(wt％)	生产率(g/L/小时)
菌株	2-KDG浓度(g/L)	2-KDG产率(wt％)	生产率(g/L/小时)	139-2a/Ps-	0	0	0
WKDG4	300	89	11.4	139-2a/Ps-	0	0	0

另一代表性发酵过程示例于图9中，其中改变的菌株WKDG4和未改变的菌株139-2a/Ps-如上述生长。如从图中所观察到，菌株139-2a/Ps-主要产生2，5-DKG，并在180g/L达到最大。2-KDG短暂累积至仅20g/L高的水平，在反应终末，2-KDG累积至10g/L的水平。与之相对，改变的菌株(WKDG4)有非常不同的曲线图。2，5-DKG未被检测到，在反应终末，2-KDG积累至如302g/L高的水平。

Claims

1.增加细菌宿主细胞中2-酮基-D-葡萄糖酸(2-KDG)累积的方法，包括：

a)在细菌宿主细胞中失活至少一个内源性基因，以得到改变的细菌细胞，其中，在碳源存在下，所述细菌宿主细胞能够从2-KDG的酶促转变产生2，5-二酮基葡萄糖酸(2，5-DKG)，所述内源性基因是2-酮基-D-葡萄糖酸脱氢酶(2-KDGDH)活性所需的；和

b)在合适的培养条件下培养改变的细菌细胞，产生2-KDG，

其中2-KDGDH由三个亚基组成，

其中第一个亚基由SEQ ID NO：2的氨基酸序列组成，第二个亚基由SEQ ID NO：4的氨基酸序列组成，第三个亚基由SEQ ID NO：6的氨基酸序列组成。

2.分离的多核苷酸，编码具有2-酮基-D-葡萄糖酸脱氢酶(2-KDGDH)活性的酶，其中所述酶由三个亚基组成，其中，第一个亚基，亚基A由SEQ ID NO：2的氨基酸序列组成；第二个亚基，亚基B由SEQ ID NO：4的氨基酸序列组成；第三个亚基，亚基C由SEQ ID NO：6的氨基酸序列组成。