CN103045661B - 利用克雷伯氏肺炎杆菌两段发酵生产2-酮基-d-葡萄糖酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用克雷伯氏肺炎杆菌两段发酵生产2-酮基-D-葡萄糖酸的方法，包括：第一阶段主要进行克雷伯氏肺炎杆菌的菌体生长，第二阶段主要进行2-酮基-D-葡萄糖酸合成。本发明生产2-酮基-D-葡萄糖酸的方法，具有较高底物转化效率，又具有较快的生产强度并获得较高2-酮基-D-葡萄糖酸产物终浓度。
Description
技术领域
本发明涉及一种生产2-酮基-D-葡萄糖酸的方法，特别是涉及一种利用克雷伯氏肺炎杆菌两段发酵生产2-酮基-D-葡萄糖酸的方法。
背景技术
2-酮基-D-葡萄糖酸是一种大规模生产的有机酸，其可以用作水泥增塑剂、洗涤剂，其钙盐可以用作食品添加剂用于增强钙，2-酮基-D-葡萄糖酸还可以作为前体用于合成杀虫剂、阿拉伯糖核糖等。目前发酵生产的2-酮基-D-葡萄糖酸主要直接用于合成D-异抗坏血酸，D-异抗坏血酸与L-抗坏血酸（维生素C）抗氧化作用相似，广泛用于食品添加剂替代L-抗坏血酸【Mei Chia,Thi Bich Van Nguyen,Won Jae Choi,DO-stat fed-batch production of2-keto-D-gluconic acid from cassava using immobilized Pseudomonas aeruginosa.ApplMicrobiol Biotechnol(2008)78:759–765】。
利用荧光假单胞菌发酵法生产2-酮基-D-葡萄糖酸主要采用流加批次发酵进行【孙文敬，赵峰梅，杨庆文，郭金权，秦丽，刘敬泽，补料分批培养生产2-酮基-D-葡萄糖酸的研究，食品科学，2004,25（11），115-117】。也有采用固定化细胞进行发酵的【Mei Chia,Thi BichVan Nguyen,Won Jae Choi,DO-stat fed-batch production of2-keto-D-gluconic acid fromcassava using immobilized Pseudomonas aeruginosa.Appl Microbiol Biotechnol(2008)78:759–765】。利用氧化葡萄糖酸杆菌生产2-酮基-D-葡萄糖酸有利用静息细胞催化的方法进行生产的【陈鸿胜，李克非，舒行宙，刘浏，林金萍，魏东芝，基于Gluconobacter oxydans膜结合脱氢酶的静息细胞催化合成2-酮基-D-葡萄糖酸，食品工业科技，2012,33（19），177-180】。
在克雷伯氏肺炎杆菌生产2-酮基-D-葡萄糖酸的方法中有利用连续培养进行发酵的【Hommes R,Postma P,Tempest D,Neijssel O(1989)The influence of the culture pHvalue on the direct glucose oxidative pathway in Klebsiella pneumoniae NCTC418.Archives of Microbiology151(3):261-267】。本发明人利用2,3-丁二醇合成途径缺失的克雷伯氏肺炎杆菌为生产菌株，利用葡萄糖为底物生产2-酮基-D-葡萄糖酸，具有较高的底物转化率（专利申请号201210476925.4）。但为了提高生产强度和产物终浓度，需要开发更为高效的生产2-酮基-D-葡萄糖酸的方法。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种利用克雷伯氏肺炎杆菌两段发酵生产2-酮基-D-葡萄糖酸的方法。该方法具有较高底物转化率，并能获得较高产物终浓度。
为解决上述技术问题，本发明的利用克雷伯氏肺炎杆菌两段发酵生产2-酮基-D-葡萄糖酸的方法，包括：第一阶段主要进行克雷伯氏肺炎杆菌的菌体生长，第二阶段主要进行2-酮基-D-葡萄糖酸合成。
对于上述生产2-酮基-D-葡萄糖酸的方法，其步骤包括：
1）第一阶段发酵培养
配制培养基，灭菌后，在培养基中接入克雷伯氏肺炎杆菌进行好氧培养，并保持充足供氧以及在该培养过程中，利用碱控制发酵液pH处于中性或接近中性条件；其中，培养基包括：底物葡萄糖、氮源和无机盐；
氮源包括：酵母粉、酵母膏、蛋白胨、玉米浆、硫酸铵、尿素和硝酸铵；无机盐包括：钠盐、镁盐、铁盐、磷酸盐和锰盐；
本步骤中，中性培养条件适宜菌体生长，能使菌体大量增加；
2）第二阶段发酵培养
第一阶段培养结束后，继续进行菌体的发酵培养，并停止或减慢碱的加入，利用菌体生长产生的有机酸使得培养基的pH逐渐降低到酸性条件或用酸调节发酵液处于酸性条件，然后用碱控制发酵液稳定于酸性条件；
本步骤中，酸性条件下菌体生长被抑制，菌体利用葡萄糖氧化生成2-酮基-D-葡萄糖酸；
3）在发酵培养过程中，当培养基中的底物葡萄糖消耗到0～50g/L时，补加葡萄糖。
所述步骤1）中，好氧培养的温度为20～45℃，优选35～40℃；步骤1）中，待菌生长到菌体浓度为OD6001～20时，结束第一阶段培养，优选为OD6005～15。
所述步骤1）、2）中，碱包括：氢氧化钠、氢氧化钾、氨水、碳酸钙、碳酸钠和碳酸氢钠。
所述步骤1）中，发酵液pH处于中性或接近中性条件为发酵液pH处于6～8，优选为6.5～7.5。
所述步骤2）中，第二阶段发酵培养的温度为20～45℃，优选35～40℃，培养时间为5～50小时；酸性条件为发酵液pH处于4～6，优选为4.5～5.5。
所述步骤2）的用酸调节发酵液处于酸性条件中，酸包括：2-酮基-D-葡萄糖酸、乙酸、乳酸、琥珀酸、盐酸、硝酸、磷酸和硫酸。
所述步骤3）中，优选当培养基中的底物葡萄糖消耗到20～40g/L时，补加葡萄糖。
本发明所用的克雷伯氏肺炎杆菌，较优的选用2,3-丁二醇合成途径阻断的克雷伯氏肺炎杆菌。其中，2,3-丁二醇合成途径阻断的克雷伯氏肺炎杆菌的制备方法，可通过对克雷伯氏肺炎杆菌2,3-丁二醇合成途径中乙酰乳酸合成酶基因或乙酰乳酸脱羧酶基因或双乙酰氧化还原酶基因进行失活，实现克雷伯氏肺炎杆菌合成2,3-丁二醇能力的阻断。如对于乙酰乳酸合成酶基因或乙酰乳酸脱羧酶基因或双乙酰氧化还原酶基因进行失活，可通过基因突变进行失活，该基因突变包括：基因重组，优选为通过基因同源重组进行失活。
本发明所用克雷伯氏肺炎杆菌在中性pH条件下适宜菌体生长，可以获得较多的菌体量，但是中性条件下产生2-酮基-D-葡萄糖酸能力很弱。酸性条件下有利于产物2-酮基-D-葡萄糖酸合成，但是菌体生长受到抑制。本发明分两段进行发酵，先在中性条件下培养使得菌体大量繁殖，获得较多的菌体量，然后将发酵液的pH控制在酸性条件，由于第一阶段已经获得大量菌体，第二阶段在酸性条件下培养时，菌体量已经较高，可以获得较快的产物2-酮基-D-葡萄糖酸合成速率，同时在葡萄糖消耗到低水平后补加葡萄糖，可以获得较高的产物终浓度。
本发明生产2-酮基-D-葡萄糖酸的方法，具有较高底物转化效率，又具有较快的生产强度并获得较高2-酮基-D-葡萄糖酸产物终浓度。
具体实施方式
以下实施例中，所用试剂如未特别说明，均为商业化产品。
另外，对于以下实施例所获得的发酵液中组分（如葡萄糖和2-酮基-D-葡萄糖酸）的测定：采用高效液相色谱仪，利用HPX-87H色谱柱，视差检测器对发酵液组分进行检测。
以下实施例中涉及的构建的2,3-丁二醇合成途径阻断的克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC1.6366-budA-，其具体的构建方法如下：
1、利用PCR扩增克雷伯氏肺炎杆菌乙酰乳酸脱羧酶基因（budA）。
根据克雷伯氏肺炎杆菌MGH78578（Genbank:CP000647）基因组信息，设计乙酰乳酸脱羧酶PCR引物，上游引物budA-s：GAAGATCAGAACATCGCCAGA（SEQ ID NO.1所示），下游引物budA-a：CTCTGATGGACCTGCTTCGCCTTAT（SEQ ID NO.2所示）。
通过上述引物，以克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC1.6366（CGMCC1.6366菌株为中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏，具有氨苄青霉素抗性）基因组DNA为模板，经PCR扩增，获得乙酰乳酸脱羧酶基因片段，通过TA克隆方法（Original TA Cloning Kit）连接到pMD-18T simple质粒上，命名为pMD18T-budA质粒，序列测定结果如下：
budA基因相邻上游部分序列为：
GAAGATCAGAACATCGCCAGAAAGCGTTTCACCGTGCGCGAGCGCTCGAAGCGCCGCCAGGCGATGGCGATATCGGTCTTCAGCGGTGCCCCGCTGAGCGGGTGATAGCTGACGTTCGGCTGTTGAATGCAGGTCATCGACTGCGGGACCAGCGCGAAGCCGAACCCGGCATTGACCATGCTCAGCGATGACGAAATCTGCGACGACTGCCAGGCGCGCTCCATATCGATGCCGGCGCGCAGGCAGCTGTTGTACACCAGCTCATACAGCCCCGGGGCCACCTCCCGCGGGA（SEQ ID NO.3所示）。
budA基因阅读框为：
AGAGAGTCTGTGCGAAACCCTGCGGGCGTTTTCCGCGCAGCATCCCGAGAGCGTGCTCTATCAGACATCGCTCATGAGCGCCCTGCTGAGCGGGGTTTACGAAGGCAGCACCACCATCGCGGACCTGCTGAAGCACGGCGATTTCGGTCTCGGCACCTTTAATGAGCTGGACGGGGAGCTGATCGCCTTCAGCAGTCAGGTCTATCAGCTGCGGGCCGACGGCAGCGCGCGCAAAGCCCAGCCGGATCAGAAAACGCCGTTCGCGGTGATGACCTGGTTCCAGCCGCAGTACCGGAAAACCTTCGACCATCCGGTGAGCCGCCAGCAGCTGCACGAGGTGATCGACCAGCAAATCCCCTCTGACAACCTGTTCTGCGCCCTGCGCATCGACGGCCATTTCCGCCATGCCCATACCCGCACCGTGCCGCGCCAGACGCCGCCGTACCGGGCGATGACCGACGTCCTCGACGATCAGCCGGTGTTCCGCTTTAACCAGCGCGAAGGGGTGCTGGTCGGCTTCCGTACCCCACAGCATATGCAGGGGATCAACGTCGCCGGGTATCACGAGCACTTTATAACCGATGACCGCAAAGGCGGCGGTCACCTGCTGGATTACCAGCTCGACCACGGGGTATTGACCTTCGGCGAAATTCACAAGCTGATGATCGACCTGCCCGCCGACAGCGCGTTCCTGCAGGCCAATCTGCATCCCGATAATCTCGATGCCGCCATCCGTTCCGTAGAAAGTTAAGGGGGTCACATGGACAAACAGTATCCGGT（SEQ ID NO.4所示）。
budA基因相邻下游部分序列为：
ACGCCAGTGGGCGCACGGCGCCGATCTCGTCGTCAGCCAGCTGGAAGCCCAGGGGGTACGTCAGGTGTTCGGCATCCCTGGCGCCAAAATCGACAAGGTATTCGACTCACTGCTGGATTCCTCCATTCGCATTATTCCGGTACGCCACGAAGCTAACGCCGCCTTTATGGCCGCCGCCGTCGGGCGCATTACCGGTAAAGCGGGCGTGGCGCTGGTCACCTCCGGTCCGGGCTGTTCCAACCTGATCACCGGTATGGCCACCGCCAACAGCGAAGGCGACCCGGTGGTGGCCCTGGGCGGCGCGGTGAAACGCGCCGATAAGGCCAAACAGGTCCACCAGAG（SEQ ID NO.5所示）。
2、利用步骤1克隆到的基因序列，制备两侧连有同源臂中间连接抗性核的DNA片段。
本步骤中的操作，采用在大肠杆中利用Red重组酶催化，具有同源臂连接抗性核的DNA片段与pMD18T-budA质粒进行同源重组，获得pMD18T-budA质粒上失活的budA基因，利用该质粒作为模板通过PCR扩增具有长的同源臂的DNA片段，该片段两侧连有与budA基因上下游序列同源的序列，中间连接抗性核。
本步骤操作原理可参见（Wei et.al.Red recombinase assisted gene replacement inKlebsiella pneumoniae Journal of Industrial Microbiology&Biotechnology2012），具体步骤如下：
a．pMD18T-budA质粒热击转化到含有pIJ790质粒的大肠杆菌DH5α-pIJ790中，命名为DH5α-pMD18T-budA。
制备DH5α-pMD18-budA感受态细胞，在菌体培养1个小时后，添加10mmol/L的阿拉伯糖，诱导pIJ790质粒中Red重组酶的表达。
b．设计引物budA-s2和budA-a2，序列分别为：
GCCCTGCTGAGCGGGGTTTACGAAGGCAGCACCACCATCATTCCGGGGATCCGTCGACC（SEQ ID NO.6所示）和
TTGCGGTCATCGGTTATAAAGTGCTCGTGATACCCGGCGATGTAGGCTGGAGCTGCTTC（SEQ ID NO.7所示）。
引物budA-s2的“GCCCTGCTGAGCGGGGTTTACGAAGGCAGCACCACCATC”序列与budA基因序列同源，引物budA-a2的“TTGCGGTCATCGGTTATAAAGTGCTCGTGATACCCGGCGA”序列与budA基因相应序列同源。
利用引物budA-s2和budA-a2，以质粒pIJ778为模板扩增出长约1491bp的DNA片段A。该片段两段分别具有与budA序列同源的同源臂，中间包含了来源于pIJ778质粒的链霉素抗性基因aadA。
c．利用DNA片段A转化感受态DH5α-pMD18T-budA感受态细胞。利用电击转化方法，转化电压为2000V，选择链霉素抗性的菌株，链霉素用量为50mg/L。
DNA片段A两侧的同源序列与质粒pMD18T-budA上的budA同源部分发生重组，获得了pMD18T-A质粒。
d．利用引物budA-s（SEQ ID NO.1所示）和budA-a（SEQ ID NO.2所示），以pMD18T-A质粒为模板进行PCR扩增，获得3114bp的DNA片段B。
DNA片段B两端分别具有1131bp和571bp的budA基因和相邻序列，该序列作为同源臂。DNA片段B中间具有链霉素抗性基因aadA，DNA片段B用于进行CGMCC1.6366染色体上budA基因重组的线性DNA片段。
3、利用转化或结合方法将制备的DNA片段B转入到克雷伯氏肺炎杆菌中，利用同源重组与染色体上的乙酰乳酸脱羧酶基因进行重组，筛选获得乙酰乳酸脱羧酶基因失活的菌株，具体步骤如下：
a.将pDK6-red质粒转化到CGMCC1.6366中，获得CGMCC1.6366-pDK6-red菌株，线性DNA片段B电击转化CGMCC1.6366-pDK6-red感受态细胞。利用链霉素筛选抗性菌株。
b.重组菌的验证，设计验证引物Yanzheng778z：AGAATCTCGCTCTCTCCAGGGGAAG（SEQID NO.8所示），其序列对应链霉素抗性基因aadA中间的一段序列。
利用引物budA-s（SEQ ID NO.1所示）和Yanzheng778z，以长出的菌株总DNA为模板进行PCR扩增，产物DNA片段为1889bp，而以出发菌株CGMCC1.6366总DNA为模板进行PCR无特异性条带，表明获得的重组菌正确，命名为CGMCC1.6366-budA-。该菌株的乙酰乳酸脱羧酶基因通过同源重组而失活。
另外，利用CGMCC1.6366出发菌株和CGMCC1.6366-budA-菌株进行发酵培养，发酵结束后，利用气相色谱和液相色谱对发酵液各组分进行定量分析，结果发现CGMCC1.6366-budA-菌株中，未检测出2,3-丁二醇含量，说明CGMCC1.6366-budA-菌株的2,3-丁二醇合成途径已经阻断。
实施例1
利用克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC1.6366菌株（CGMCC1.6366菌株为中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏）发酵葡萄糖生产2-酮基-D-葡萄糖酸，其步骤如下：
1）将葡萄糖和其他组分配制成培养基
葡萄糖50g/L，玉米浆4g/L，酵母粉5g/L，蛋白胨5g/L，氯化钠7g/L自来水配置。
2）种子培养
配制好的培养基，分装到250ml锥形瓶中，装液量50ml，并加入1g碳酸钙。灭菌后接入克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC1.6366菌株，37℃摇床好氧培养，转速为200转每分钟，培养12小时。
3）第一阶段发酵培养
在5L发酵罐中装入3L配制好的培养基，灭菌后接入50ml种子培养物，37℃，通风量4L/分钟，搅拌桨转速为500转每分钟，利用氢氧化钠溶液控制发酵液pH保持7.5，培养3小时，测定菌体浓度OD600为5。
4）第二阶段发酵培养
将发酵罐中发酵液pH设定为pH4.5，继续培养3小时后，发酵液pH逐渐降低到4.5后用氢氧化钠调节发酵液，使得发酵液pH保持在pH4.5。继续培养，及时取样测定发酵液中底物葡萄糖的浓度，保持发酵液中葡萄糖浓度大于10g/L。
培养28小时后，测定发酵液中产物2-酮基-D-葡萄糖酸为153g/L。计算生产强度为5.46克每升每小时，底物转化率0.95mol/mol。
实施例2
利用CGMCC1.6366菌株（CGMCC1.6366菌株为中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏）发酵葡萄糖生产2-酮基-D-葡萄糖酸，其步骤如下：
1）将葡萄糖和其他组分配制成培养基
葡萄糖150g/L，玉米浆4g/L，酵母粉5g/L，蛋白胨5g/L，氯化钠7g/L自来水配置。
2）种子培养
配制好的培养基，分装到250ml锥形瓶中，装液量50ml，并加入1g碳酸钙。灭菌后接入克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC1.6366菌株，37℃摇床好氧培养，转速为200转每分钟，培养12小时。
3）第一阶段发酵培养
在5L发酵罐中装入3L配制好的培养基，灭菌后接入50ml种子培养物，37℃，通风量4L/分钟，搅拌桨转速为600转每分钟，利用氢氧化钾溶液控制发酵液pH保持6.5，培养6小时，测定菌体浓度OD600为15。
4）第二阶段发酵培养
将发酵罐中发酵液pH设定为pH5.5，继续培养2小时后，发酵液pH逐渐降低到5.5后用氢氧化钾调节发酵液，使得发酵液pH保持在pH5.5。继续培养，及时取样测定发酵液中底物葡萄糖的浓度，保持发酵液中葡萄糖浓度大于等于50g/L。
培养26小时后，测定发酵液中产物2-酮基-D-葡萄糖酸为141g/L。计算生产强度为5.42克每升每小时，底物转化率0.92mol/mol。
实施例3
利用上述构建的2,3-丁二醇合成途径阻断的克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC1.6366-budA-发酵葡萄糖生产2-酮基-D-葡萄糖酸，其步骤如下：
1）将葡萄糖和其他组分配制成培养基
葡萄糖100g/L，玉米浆4g/L，酵母粉5g/L，蛋白胨5g/L，氯化钠7g/L自来水配置。
2）种子培养
配制好的培养基，分装到250ml锥形瓶中，装液量50ml，并加入1g碳酸钙。灭菌后接入克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC1.6366-budA-菌株，37℃摇床好氧培养，转速为200转每分钟，培养12小时。
3）第一阶段发酵培养
在5L发酵罐中装入3L配制好的培养基，灭菌后接入50ml种子培养物，37℃，通风量4L/分钟，搅拌桨转速为600转每分钟，利用氢氧化钠溶液控制发酵液pH保持7，培养4小时，测定菌体浓度OD600为8。
4）第二阶段发酵培养
将发酵罐中发酵液pH设定为pH5，继续培养1小时后，发酵液pH逐渐降低到5后用氢氧化钠调节发酵液，使得发酵液pH保持在pH5。继续培养，及时取样测定发酵液中底物葡萄糖的浓度，保持发酵液中葡萄糖浓度大于30g/L。
培养34小时后，测定发酵液中产物2-酮基-D-葡萄糖酸为177g/L。计算生产强度为5.20克每升每小时，底物转化率0.98mol/mol。
Claims (6)
1.一种利用克雷伯氏肺炎杆菌两段发酵生产2-酮基-D-葡萄糖酸的方法，其特征在于，包括：第一阶段主要进行克雷伯氏肺炎杆菌的菌体生长，第二阶段主要进行2-酮基-D-葡萄糖酸合成；
所述方法，其步骤包括：
1）第一阶段发酵培养
配制培养基，灭菌后，在培养基中，接入克雷伯氏肺炎杆菌进行好氧培养，并保持充足供氧以及在该培养过程中，利用碱控制发酵液pH处于中性或接近中性条件；
所述步骤1）中，培养基包括：底物葡萄糖、氮源和无机盐；其中，氮源选自：酵母粉、酵母膏、蛋白胨、玉米浆、硫酸铵、尿素和硝酸铵；无机盐选自：钠盐、镁盐、铁盐、磷酸盐和锰盐；
步骤1）的好氧培养的温度为20～45℃，待菌生长到菌体浓度为OD6001～20时，结束第一阶段培养；
步骤1）的发酵液pH处于中性或接近中性条件为发酵液pH处于6.5～7.5；
2）第二阶段发酵培养
第一阶段培养结束后，继续进行菌体的发酵培养，并停止或减慢碱的加入，利用菌体生长产生的有机酸使得培养基的pH逐渐降低到酸性条件或用酸调节发酵液处于酸性条件，然后用碱控制发酵液稳定于酸性条件；
所述步骤2）中，第二阶段发酵培养的温度为20～45℃，培养时间为5～50小时；
步骤2）的用酸调节发酵液处于酸性条件中，酸选自：2-酮基-D-葡萄糖酸、乙酸、乳酸、琥珀酸、盐酸、硝酸、磷酸和硫酸；
步骤2）的酸性条件为发酵液pH处于4～6；
3）在发酵培养过程中，当培养基中的底物葡萄糖消耗到0～50g/L时，补加葡萄糖。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述好氧培养的温度为35～40℃，待菌生长到菌体浓度为OD6005～15时，结束第一阶段培养。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤1）、2）中，碱选自：氢氧化钠、氢氧化钾、氨水、碳酸钙、碳酸钠和碳酸氢钠。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述第二阶段发酵培养的温度为35～40℃；
步骤2）的酸性条件为发酵液pH处于4.5～5.5。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤3）中，当培养基中的底物葡萄糖消耗到20～40g/L时，补加葡萄糖。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述克雷伯氏肺炎杆菌为2,3-丁二醇合成途径阻断的克雷伯氏肺炎杆菌。
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