KR100750363B1

KR100750363B1 - 아스코르브산 중간체들의 생산 방법

Info

Publication number: KR100750363B1
Application number: KR1020017007144A
Authority: KR
Inventors: 매튜 지. 보스톤; 바바라 에이. 스완슨
Original assignee: 제넨코 인터내셔날 인코포레이티드
Priority date: 1998-12-22
Filing date: 1999-12-22
Publication date: 2007-08-17
Also published as: DE69931394D1; BR9916848A; EP1141368A1; US20020177197A1; US20040180413A1; US20020177198A1; KR20010093149A; DK1141368T3; EP1141368B1; WO2000037667A1; CN1331749A; CN1247790C; ATE326542T1; JP2003517278A; AU2485500A; CZ20012285A3; PL351711A1; DE69931394T2; US20050227337A1; MXPA01006337A

Abstract

본 발명은 ASA 중간체들, 예를 들어 KDG, DKG 및 KLG의 비-발효적인 생산에 관한 것이며, 궁극적으로 탄소원으로부터 생촉매 환경에서 원하는 최종 생산물 예를 들어, 에리소르베이트 및 아스코르브산으로의 전환에 관한 것이며, 여기에서 환경은 생체반응기를 말한다.

Description

아스코르브산 중간체들의 생산 방법{METHOD FOR PRODUCING ASCORBIC ACID INTERMEDIATES}

본 발명은 경로 공학, 특히 이스코르빅산 중간체들의 생산의 생촉매적 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 비-발효적 시스템에서 아스코르브산 중간체들의 생산 방법을 제공한다.

L-아스코르브산(비타민C, ASA)는 약제학와 식품공학에서 비타민과 항산화제로 사용된다. ASA의 합성은 오랜 기간동안 상대적으로 큰 시장 규모와 높은 가치로 인하여 특수 화합물로서 상당한 관심을 받아왔다. 글루코스으로부터 ASA로의 합성하는 레이스타인-그루스너(Reichstein-Grussner) 방법은, 1934에 처음으로 발견되었다(Helv. Chim. Acta 17:311-328). 라자루스등은 생화화적전환 방법을 이용한 ASA의 중간체, ASA로 화학적으로 전환될 수 있는 2-케토-L-글루콘 산(2-KLG, KLG)의 생산 방법을 개시하였다(1989, "Vitamin C:Bioconversio via a Recombinant DNA Approach", Genetics and Molecular Biology of Industrial Microorganisms, American Society for Microbiology, Wasington D.C. Edited by C.L. Hershberger). 이러한 탄소원으로부터 KLG로의 생화학적 전환은 다양한 중간체들, 조효소 의존성 환원효소 활성이 관여된 효소 활성등들이 관련된다. 조효소의 재생산은 NAD+에서 NADH로, NADP에서, NAPDH로의 전환과 같이 다른 기질의 재생산하는 효소의 산화를 이용하여 효소의 이용을 포함한다.

ASA중간체들의 경제적으로 타당성 있는 생산 방법이 여전히 요구된다. 특히, 이러한 방법들이 조효소를 필요로 하는 효소 활성을 이용하는 경우, 조효소 재생산 방법을 포함하는 것이 특히 바람직하다. 본 발명은 이러한 요구에 관한 것이다.

본 발명은 ASA 중간체들, 예를 들어 KDG, DKG 및 KLG의 비-발효적인 생산에 관한 것이며, 궁극적으로 탄소원으로부터 생촉매 환경에서 원하는 최종 생산물 예를 들어, 에리소르베이트 및 아스코르브산로의 전환에 관한 것이며, 상기 환경은 생체반응기를 말한다. 생촉매 환경은 탄소원으로부터 원하는 중간체로의 과정의 활성을 가지는 적어도 하나의 효소를 함유하는 생육성 또는 비-생육성 숙주 세포들로 구성될 수 있다. 한 구체예에서, 원하는 중간체는 원하는 최종 생사물로의 전환에 앞서 전기 투석을 통하여 생체반응기로부터 정제된다. 도2는 이러한 중간체들 및 생산물들의 제조를 도식적으로 보여준다.

본 발명은 역시 조효소의 재생산이 필요한 ASA중간체들의 비-발효적 생산방법에 관한 것이다. 본 발명은, 탄소원으로부터 KLG의 비발효적 또는 시험관내 생산 방법에 있어서, 촉매량의 조효소들이 재생산될 수 있다는 발견에 일부 기초한다. 본 발명의 한 구체예에서, 필요한 조효소는 생체반응기로부터 나노필터로 정제하여 재사용할 수 있다.

KDG가 원하는 ASA의 중간체인 경우, 생체 반응기는 적어도 하나의 산환 단계를 거쳐 KDG로 생화학적으로 전환될 수 있는 탄소원이 공급된다. 이러한 구체예에서, 숙주는 KDG를 특이적으로 산화시키는 산화적 효소 활성을 인코딩하는 유전자의 돌연변이(들)를 포함함으로써, KDG가 다른 중간체들 또는 생산물로 전환되지 않도록 할 수 있다.

DKG가 원하는 ASA의 중간체인 경우, 생체 반응기는 적어도 하나의 산화 단계를 거쳐 DKG로 생화학적으로 전환될 수 있는 탄소원이 공급된다. 숙주에 따라서, 숙주는 산화적 또는 환원적 효소 활성을 인코딩하는 유전자의 돌연변이(들)를 포함하여, DKG가 다른 중간체들 또는 생산물로 전환되지 않도록 할 수 있다.

KLG가 원하는 ASA의 중간체인 경우, 생체 반응기는 적어도 하나의 산화 방법 및 적어도 하나의 환원 단계를 거쳐 KLG로 생화학적으로 전환될 수 있는 탄소원이 공급된다. 숙주에 따라서, 숙주는 산화효소 활성 또는 환원효소 활성을 인코딩하는 유전자(들)의 돌연변이(들)를 포함하여, KLG가 다른 중간체들 또는 생산물로 전환되지 않도록 할 수 있다. 산화 단계 및 환원 단계가 조효소를 필요로 하는 경우에는 조효소의 재생산 수단을 공급한다.

한 구체예에서, 숙주 세포는 재조합 숙주 세포이고, 적어도 하나의 이종(heterologous) 효소 활성을 포함한다. 한 구체예에서, 효소활성은 숙주세포 멤브레인에 결합되어 있다; 또 다른 구체예에서, 효소활성은 용액중에 있다; 또 다른 구체예에서, 효소활성은 세포내 가용성이다. 또 다른 구체예에서, 효소활성은 고정화되어 있다. 생산 방법은 회분배양 또는 연속배양으로 수행될 수 있다. 숙주 세포들은 바람직하게는 엔테로박테리아(Enterbacteriacla)과의 멤버들이며, 한 구체에에서, 판토이(Pantoea)종이고 특히, 판토이 시트리(Pantoea citrea)이다. 예를 들어, 판토이 시트리는 ATCC로부터 ATCC 기탁번호 39140으로 입수가능하다.

숙주세포들은 탄소원으로부터 원하는 중간체들로 전환시킬 수 있는 효소적 활성을 유지하는 한 동결건조되거나, 투과성 있게 되거나, 또는 생존능력이 감소되도록 처리되거나, 또는 세포 생장 또는 대사를 위한 글루코스 이용이 없어지도록 변형될 수 있다. 중간체들은 에리소르베이트 또는 ASA의 최종 생산물로 더 진행될 수 있다.

따라서, 한 측면에서, 본 발명은 하나 이상의 산화적 효소 활성에 의하여 탄소원을 효소적으로 산화함으로써 DKG 또는 KDG를 생산하는 단계를 포함하는, 탄소원으로부터 DKG 또는 KDG의 효소적 생산 방법을 제공한다. 또 다른 구체예에서, 일차 산화 효소 활성에 의하여 탄소원을 산화시켜서 일차 산화 산물을 생성하고, 상기 일차 산화 산물을 이차 산화 효소 활성에 의하여 산화시켜서 KDG를 생성하는 단계를 포함하는 방법이다. 한 구체예에서 일차 산화 효소 활성은 GDH 활성이고, 이차 산화 효소 활성은 GADH 활성이다. 숙주 세포는 더 나아가 천연적으로 존재하는 KDGDH 활성을 인코딩하는 핵산에 돌연변이를 포함하여 KDG가 더 이상 산화되지 않도록 할 수 있다. KDG는 에리소르베이트로 더 전환시킬 수 있다. 선택적으로, 삼차 산화 효소 활성에 의하여 KDG를 산화시켜서 DKG를 생성하는 방법을 포함할 수 있다.

KLG의 생산을 위하여, 탄소원이 KDG이라면, 또는 KDG로 전환될 수 있는 탄소원이라면, 본 발명의 방법은 적어도 하나의 산화 효소 활성에 의하여 효소적으로 산화 생성물로 산화시키는 단계; 및 적어도 하나의 환원 효소 활성에 의하여 상기 산화 생성물을 2-KLG로 효소적으로 환원시키는 단계를 포함한다. 선택적으로 DKG가 탄소원이거나, 또는 탄소원이 DKG로 전환될 수 있다면, DKG는 환원 효소 활성에 의하여 KLG로 전환된다.

본 발명은 탄소원으로부터 비-발효적 2-KLG의 제조 방법을 제공하며, 상기 방법은 적어도 하나의 산화 효소 활성에 의한 탄소원의 산화 생성물로의 효소적 산화 단계; 및 적어도 하나의 환원 효소 활성에 의한 2-KLG로의 상기 산화 생성물의 환원 단계를 임의의 순서로 포함한다. 한 구체예에서 상기 산화 효소 활성은 산화된 형태의 조효소를 요구하고, 상기 환원 효소 활성은 환원된 형태의 조효소를 요구하며, 상기 산화된 형태의 조효소 및 상기 환원된 형태의 조효소는 적어도 하나의 산화 단계 및 적어도 하나의 환원 단계 사이에서 재순환된다. 한 구체예에서, 산화된 형태의 상기 조효소는 NAD+이고, 환윈된 형태는 NADH이다. 본 발명의 방법에 적합한 다른 조효소들은 ATP, ADP, FAD 및 FMN을 포함한다.

여기에 개시된 한 도식적인 구체예에서, 방법은 다음의 단계를 임의의 순서로 포함하고 단계는 동시에 일어날 수도 있으며 및/또는 공정 중 연속적으로 일어날 수 있다: 일차 산화 효소 활성에 의하여 탄소원을 일차 산화 생성물로 효소적 산화시키는 단계; 이차 산화 효소 활성에 의하여 상기 일차 산화 생성물을 이차 산화 생성물로 효소적 산화시키는 단계; 삼차 산화 효소 활성에 의하여 상기 이차 산화 생성물을 삼차 산화 생성물로 효소적 산화시키는 단계; 및 환원 효소 활성에 의하여 상기 삼차 산화 생성물을 2-KLG로 효소적 환원시키는 단계. 한 구체예에서, 상기의 일차, 이차 및 삼차 산화 효소 활성중 적어도 하나는 상기 산화된 형태의 효소적 조-효소를 필요로 하고 상기 환원 효소 활성은 상기 환원된 형태의 효소적 조-효소를 필요로 하며, 상기 산화된 형태의 조-효소 및 상기 환원된 형태의 조-효소는 적어도 하나의 산화 단계 및 환원 단계사이에서 재순환된다.
상기 글루코스 탈수소효소 활성은 박테리아, 효모 또는 진균류로부터 얻을 수 있다.

한 구체예에서 공정은 유기 용매를 포함하는 환경에서 진행되며, 또 다른 경우, 공정은 긴 폴리머를 포함하는 환경에서 진행된다. 또 다른 구체예에서, 공정은 염 및 염 농도의 범위를 포함하는 환경에서 진행된다.

본 발명은 ASA 중간체를 제조하는 방법에 사용되는 효소적 활성을 포함하는 벡터 및 재조합 숙주 세포를 역시 제공한다. 한 구체예에서, 숙주 세포는 T. 아시도필럼(T. acidophillum), 크립토코커스 유니거타라투스(Cryptococcus uniguttalatus) 및 바실러스종(Bacillus)으로부터 얻을 수 있는 GDH를 인코딩하는 이종 핵산 및/또는 코리니박테리움(Corynebacterium) 또는 어위니아(Erwinia)로부터 얻을 수 있는 DKG 환원효소르 인코딩하는 이종 핵산을 포함한다.

바람직한 구체예의 상세한 설명

정의

여기에 사용된 약자는 다음과 같다. 글루코스(G); D-글루코네이트(GA); 2-케토-D-글루코네이트(2KDG); 2,5-디케토-D-글루코네이트(2,5DKG 또는 DKG), 2-케토-엘-굴론산(2KLG 또는 KLG), L-이돈산(IA), 아스코르브산(ASA), 글루코스 탈수소효소(GDH), 글루콘산 탈수소효소(GADH), 2,5-디케토-D-글루코네이트 환원효소(DKGR), 및 2-케토-D-글루코네이트 환원효소(KDGDH)이다.

여기에 사용된, "비-발효적" 또는 "시험관내"는 세포의 효소적 활성을 이용한 생촉매적 방법을 말한다. 세포는 비-생육 또는 생육일 수 있으며, 현저한 성장을 보이지 않는 세포일 수도 있다. 세포는 생성되는 글루코스 및/또는 임의의 중간체의 소비를 없애기 위하여 유전적으로 변경될 수 있다. 본 발명의 시험관내 방법은 생촉매 방법에 관련된 효소적 활성을 함유하는 세포 멤브레인의 이용, 생촉매 방법에 관련된 효소적 활성을 포함하는 동결건조된 세포, 또는 투과성 세포의 이용, 및 탄소원을, 한정되지 않게 GA, KDG, DKG 및 KLG를 포함하는 임의의 ASA 중간체로 생촉매적 전환시키는 필요적 효소적 활성을 제공하는 숙주세포 또는 숙주세포 멤브레인 또는 임의의 형태의 단편의 이용을 포괄한다. 상기 세포는 원하는 효소적 활성을 인코딩하는 이종 핵산을 포함하는 재조합 세포 또는 원하는 효소적 활성을 포함하는 천연적으로 존재하는 세포일 수 있다. 여기에 사용된 "생체반응기"는 비-발효적 또는 시험관내 방법이 진행되는 환경을 말한다.

많은 효소들은 예를 들어 NAD+ 또는 NADP+ 와 같은 조효소의 존재하에서만 활성이 있다. 여기에 사용된 조효소는 효소 반응에 이차적인 기질을 말하며, 효소반응에 필수적이다. 여기에 사용된 "조효소"는 한정되지 않게 NAD+/NADH; NADP+/NADPH; ATP; ADP; FAD/FADH₂ 및 FMN/FMNH₂를 포함한다. 시험관내 시스템내에서 "조효소의 재생산" 또는 "조효소의 재순환"은, 요구되는 조효소의 생촉매를 통한 연속적인 산화 및 환원 현상을 말하는 것으로, 요구되는 조효소는 효소 촉매가 일어나기에 적절한 형태로 존재하게 된다. 본 발명에서, 조효소의 재생산은 환원효소가 사용가능한 환원된 형태의 조효소, 및 산화효소가 사용가능한 산화된 형태의 조효소가 존재하는 환경을 제공한다. 본 발명은 탄소원으로부터 예를 들어 KLG같은 ASA 중간체로의 생촉매적인 경로에서 임의의 효소적인 산화 단계 및 임의의 효소적인 환원 단계사이의 조효소의 재생산을 포함한다. 필요한 조효소는 숙주 세포의 환경에 촉매적인 양으로 존재하거나 또는 산화되거나 환원된 형태의 화학양론적 양으로 생체반응기 공정의 시작단계에서 외부적으로 제공될 수 있다.

여기에 사용된 탄소원은 엔테로박테리아(Enterobacteriacea) 균주에 의해 일반적으로 이용되는 적절한 탄소원을 포함하는데, 그 예로는 D- 또는 L- 형태의 글루코스, 굴로스, 소르보스, 프럭토스, 이도스, 갈락토스, 및 만노스와 같은 6탄당, 수크로스와 같은 6탄당의 조합, 2-케토-L-굴론산, 이돈산, 글루콘산, 6-인산글루코네이트, 2-케토-D-굴론산, 5-케토-D-글루콘산, 2-케토글루코네이트포스페이트, 2,5-디케토-L-굴론산, 2,3-L-디케토굴론산, 디히드로아스코르브산, 에리스로아스코르브산 및 D-만논산을 포함하는 6탄당산, 또는 KDG, DKG 및 KLG와 같은 ASA의 중간체로 전환될 수 있는 이러한 것들의 효소적 유도체를 포함하는 탄소원을 포괄하는데, 여기에 한정되는 것은 아니다.

여기에 사용된 "엔테로박테리아(Enterobacteriaceae)" 과는 그람 음성 및 통성 혐기성의 일반적인 특성을 가지는 박테리아 균주를 말한다. 바람직한 엔테로박테리아 균주는 D-글루코스 용액으로부터 2,5-디케토-D-글루콘산을 제조할 수 있는 것이다. 엔테로박테리아세아 과에 속하는 D-글루코스용액으로부터 2,5-디케토-D-글루콘산을 제조할 수 있는 속은 예를 들어 어위나(Erwinia), 엔테로박테리아 (Enterobacteriaceae), 글루코노박터(Gluconobacter) 및 판토이(Pantoea)이다. 탄소원으로부터 ASA로의 미생물 탄수화물 경로의 중간체는 한정된지 않게 GA, 2KDG, 2,5DKG, 5DKG, 2KLG, 및 IA를 포함한다. 본 발명에서, 바람직한 엔테로박테리아 발효 균주는 판토이 종이고 특히, 판토이 시트리(Pantoea citrea)이다. 네가지 아스코르브산의 입체이성질체가 가능하다: L-아스코르브산, 비타민 씨 활성을 보이는 D-아라보아스코르브산(에리소르빅산), L-아라보아스코르브산 및 D-자일로아스코르브산이다. 여기에 사용된 ASA의 중간체는 한정되지 않게 예를 들어 KDG, DKG 및 KLG를 포함하는 ASA로의 경로의 임의의 생성물을 포괄한다.

여기에 사용된 "재조합"은 생물체에 천연적으로 존재하지 않는 핵산을 포함하는 숙주 및/또는 내생 핵산의 추가의 카피가 재조합적으로 도입된 숙주 세포를 말한다. 여기에 사용된 "이종(heterologous)"은 숙주 세포에 존재하지 않는 핵산 또는 아미노산 서열을 말한다. 여기에 사용된 "내생(endogeneous)"는 숙주세포에 천연적으로 존재하는 핵산을 말한다.

여기에 사용된 "핵산"은 뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 서열 및 이들의 단편 또는 일부, 및 게노믹 또는 합성의 더블- 또는 싱글 스트랜드이며, 센스 또는 안티센스 스트랜드 배향의 DNA 또는 RNA를 말한다. 여기에 사용된 "아미노산"은 펩티드 또는 단백질 서열들 또는 이들의 일부를 말한다.

여기에 사용된 "돌연변이"는 그 핵산의 생산물이 불활성되거나, 또는 제거되도록 하는 핵산의 임의의 변경을 말한다. 돌연변이의 예는 한정되지 않게 산화효소 활성 또는 환원효소 활성과 같은 효소적 활성을 인코딩하는 유전자의 일부 또는 전체에서의 결실, 점 돌연변이, 및 프레임 쉬프트 돌연변이를 포함한다. 여기에 개시된 KLG 생산의 한구체예에서 조효소는 재생산되며, 멤브레인에 결합하는 GDH 활성을 인코딩하는 핵산이 돌연변이되어 내생 GDH 활성이 불활성화되었다. 또 다른 구체예에서, 2-케토-D-글루코네이트 탈수소효소 활성이 불활성화되어 KDG 중간체 생산에 최적화되었다.

여기에 사용된 "산화 효소" 는 기질의 산화 상태를 기질보다 더 높은 산화 상태의 결과물로의 전환을 촉매하는 효소 또는 효소 시스템을 말한다. "환원 효소"는 기질의 산화 상태를 기질보다 더 낮은 산화 상태의 결과물로의 전환을 촉매하는 효소 또는 효소 시스템을 말한다. D-글루코스에서 KLG로의 생촉매 관련 산화효소는 특히 D-글루코스 탈수소효소, D-글루코네이트 탈수소효소 및 2-케토-D-글루코네이트 탈수소효소를 포함한다. ASA의 중간체에서 KLG로의 생촉매 경로의 생촉매와 관련된 환원효소는 특히 2,5-디케토-D-글루코네이트(DKGR), 2-케토- 환원효소(2-KR), 및 5-케토 환원효소(5-KR)을 포함한다. 이러한 효소들은 숙주세포에 의하여 천연적으로 생산되거나 재조합 수단을 통하여 도입될 수 있다. 여기에 개시된 한 구체예에서 천연적으로 멤브레인에 결합된 NADP+ 비-의존성 GDH 활성이 제거되고, 세포질 NADP+ 의존성 GDH 활성이 재조합적으로 도입된 판토이 시트리 숙주 세포에서 과정이 진행된다. 다른 구체예에서는 환원효소 활성을 인코딩하는 이종 핵산이 숙주 세포에 도입된다. 바람직한 구체예에서, 환원효소 활성은 박테리아, 효모, 또는 진균류 소스로부터 얻을 수 있는 환원효소이다. 더욱 바람직한 구체예에서, 환원효소 활성은 코리니폼(Coryneform) 종 또는 어위니아(Erwinia) 종으로부터 얻을 수 있는 환원효소이다. 여기에 사용된 "경로 효소"는 탄소원에서 예를 들어 KDG, DKG 및 KLG와 같은 ASA중간체로의 전환에 관련된 임의의 효소를 말한다.

여기에 사용된 "분리된" 또는 "정제된"은 본래 결합되어 있던 적어도 하나의 요소로부터 제거된 핵산 또는 단백질 또는 펩티드 또는 조효소를 말한다. 본 발명에서, 분리된 핵산은 그 핵산을 포함하는 벡터를 포함한다.

당업계에서, 당의 산 유도체들은, 용액상태라면 그 주변 매질에 따라서 다양한 이온화 상태로 존재할 수 있으며, 용액 밖에서는 고체 형태로 존재할 수 있다는 것이 알려져 있다. 예를 들어 이돈산과 같은 용어의 사용은 언급된 모든 유기 화합물의 모든 이온화 상태들을 포함한다. 따라서, 예를 들어 "이돈산"은 환형의 "이도노락톤" 및 "이도네이트"는 동일한 유기 부분을 지칭하며, 특정의 이온화 상태 또는 화합물 형태를 구체화하기 위한 것이 아니다.

본 발명은 탄소원으로부터 시험관내 또는 비-발효적인 환경에서 탄소원으로부터의, 예를 들어 KDG, DKG 및 KLG와 같은 ASA 중간체들의 생촉매적인 제조에 관한 것이다. 생산되는 중간체에 따라서, 방법은 조효소의 존재를 필요로 할 수 있다. 여기에 개시된 바람직한 구체예에서, 조효소는 재생산된다. 조효소의 비용으로 인하여, 숙주 세포 또는 외부에서 공급된 촉매적 양의 조효소의 재생산이 가능한 인 비트로 방법을 채용하는 것은 매우 도움이 된다.

ASA 중간체의 비-발효적 생산.
본 발명은 ASA 중간체의 제조 수단을 제공한다. 이러한 중간체들은 ASA, ASA 입체이성질체 또는 에리소르베이트와 같은 다른 생성물로 더 진행될 수 있다. 바람직한 한 구체예에서, KDG는 바람직하게 생산되는 ASA 중간체이며, 생체반응기에는 실시예 2에서 기술된 바와 같이 2-케토-D-글루코네이트를 인코딩하는 유전자에 돌연변이를 가진 판토이 시트리(Pantoea citrea) 생존 또는 비생존 숙주 세포를 공급한다. 이러한 구체예에서, 탄소원은 생촉매적으로 2단계의 산화 단계를 거쳐 KDG로 전환된다(도2 참조). 이러한 구체예에서 조효소의 재생산이 불필요하다.

DKG가 바람직한 ASA의 중간체일때, 생체반응기는 생육 또는 비생육 판토이 시트리 숙주 세포와 3단계의 산화 방법을 거쳐 DKG로 전환될 수 있는 탄소원을 공급한다(도2 참조). 이러한 구체예에서 조효소의 재생산은 필요없다.

KLG가 원하는 ASA의 중간체일때, 생체반응기에는 생육 또는 비-생육 판토이 시트리 숙주 세포 및, 도2와 같이 3단계의 산화 단계와 하나의 환원 단계를 거쳐 KLG로 생촉매적으로 전환될 수 있는 글루코스같은 탄소원이 공급된다. 이러한 구체예에서, 환원효소 활성은 판토이 시트리 숙주 세포 내에 포함된, 또는 외부에서 공급된 핵산에 의하여 인코딩될 수 있다. 이러한 구체예에서, 일차 산화적 효소 활성은 산화된 형태의 조효소를 필요로 하며 환원효소 활성은 환원된 형태의 조효소를 필요로 한다. 여기에 개시된 바람직한 구체예에서, 판토이 시트리 세포는 천연적으로 존재하는 GDH 활성은 제거하고, 티. 아시도필럼, 크립토코커스 유니거타루스 또는 바실러스 종으로부터 얻을 수 있으며 NADPH+ 특이성을 가지는 이종 GDH를 판토이 세포에 도입하여 하나의 조효소를 필요로 하고 재생산을 할 수 있는 조효소 재순환 시스템을 제공한다. 이 구체예에서, 조효소 재생산 수단을 제공하며, 판토이 세포에서 KLG를 제조하기 위해서 계속적으로 외부의 조효소를 첨가하여야 하는 비용을 없앨 수 있다. 이 구체예에서 숙주 세포는 2,5-DKG 환원효소 활성을 인코딩하는 핵산을 더 포함할 수 있으며, 또는 2,5-DKG 환원효소를 외부에서 생체반응기에 첨가할 수 있다.

KLG를 만드는 다른 구체예에서, 생체반응기는 멤브레인에 결합된 GDH를 인코딩하는 핵산, 알맞은 효소들 및 조효소를 포함하는 판토이 시트리 세포로 충진하고, DKG로 전환될 수 있는 글루콘산을 첨가한다. 그후 반응 혼합액은 혐기적으로 하고, 글루코스를 첨가한다. 조효소가 재순환하는 동안, GDH는 글루코스를 GA로 전환시키고, 환원효소는 DKG를 KLG로 전환시킨다. 이러한 반응을 마치면, GA를 DKG로 전환시키기 위하여 산소가 첨가되고, 반응 싸이클은 계속된다.

시험관내 생촉매적 환경

탄소원으로부터 ASA 중간체로의 생촉매적 전환 방법은 예를 들어, 글루코스를 포함하는 6탄당, 또는 예를 들어 KDG와 같은 6탄당산과 같이 엔테로박테리아세아 균주에 의하여 사용될 수 있는 알맞은 탄소원으로부터 시작한다. 다른 대사원은 한정되지 않게 갈락토스, 락토스, 프럭토스, 또는 이러한 것들의 효소적 유도체들을 포함한다. 알맞은 탄소원에 더하여, 배지는 반드시 알맞은 미네랄, 염, 조효소, 버퍼 및 당업자에게 알려진 배양을 유지하고 원하는 최종산물을 제조하는데 필요한 효소 경로를 활성화시키는 다른 요소들을 포함하여야 한다. 생체반응기에 바람직한 염은 Na+, K+, NH₄+, SO₄-- 및 아세테이트이다. 세포는 일차로 배양하고, 성장을 위하여 이용된 탄소원은 비-발효적인 방법을 위하여 제거하며, pH는 약 pH4 내지 pH9로 유지하고 산소는 존재한다.

시험관내 생촉매적 방법에서, 탄소원 및 이들의 대사물의 효소적 산화 단계 또는 효소적 산화 및 환원 단계가 숙주 세포 세포질내의 환경밖에서 일어날 수 있으며, 그리고 숙주 세포와 관련된 효소적 활성을 이용하여 ASA 중간체를 생산하는 경로를 통하여 진행시킬 수 있다. 효소적 단계는 생체반응기 내에서 순차적으로 또는 동시에 진행될 수 있으며, 일부는 원하는 ASA 중간체를 생산하기 위하여 조효소를 요구한다. 본 발명은 실시예 5 에서 기술된 바와 같이, 숙주 세포를 유기물로 처리하는 시험관내 과정을 포함함으로써, 세포는 비-생육이지만 효소는 여전히 탄소원의 ASA 중간체로의 생촉매에 의한 원하는 탄소원 및/또는 그 대사물의 산화 및 환원에 이용할 수 있게 된다. 본 발명은 역시 숙주 세포를 동결건조하거나, 임의의 수단으로 투과성을 부여하거나, 분무 건조하거나, 조각화한 또는 효소를 탄소원으로부터 ASA중간체로의 전환에 이용할 수 있도록 처리한 것을 포괄한다.

산화 또는 환원 효소 활성은 숙주 세포 멤브레인에 결합될 수 있으며, 예를 들어 아미노링크 커플링 젤(Pierce chamical Co.)과 같은 수지, 폴리머에 고정화시킬 수 있으며, 또는 생체반응기 환경에서 용액상일 수 있다. 바람직한 구체예에서, 적어도 하나의 산화 효소는 멤브레인에 부착된 형태이다. 유기적 또는 용액상 시스템 또는 이들 조합의 환경에서, 하나 또는 그 이상의 용기에서 진행할 수 있다. 한 구체예에서, 상기 공정은 두 개의 용기에서 진행되며, 하나는 산소를 이용하고 다른 하나는 혐기적이다. 예를 들어, 산소를 요구하는 멤브레인에 부착된 효소(GDH, GADH, KDGDH)는 산소를 요구하지 않는 효소들(조효소 의존적인 GDH, 조효소 의존적인 DKGR)과 분리되어 산소를 요구하는 용기는 보다 작은 부피로 이용하여 비용을 낮출 수 있다. 생체반응기는 회분 또는 연속 방법으로 진행될 수 있다. 회분 시스템에서, 무엇이 첨가되었는가와 상관없이 모든 배지액이 동일한 시간에 회수된다. 연속 시스템에서는 새로운 기질이 첨가되는 동시에 다음 단계를 위하여 배지가 정기적으로 제거된다. 생산된 중간체들은 발효 배지로부터 이온교환수지, 흡착 또는 이온 지체 수지, 활성탄, 농축-결정화, 막통과 등을 포함하는 다양한 방법으로 회수될 수 있다.

생체반응기 방법은 하나 이상의 세포 타잎을 포함할 수 있으며, 예를 들어 하나의 세포는 산화 활성을 포함하고, 두번쩨 세포는 환원 활성을 포함할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 숙주 세포는 탄소원 또는 이들의 유도체를 전환시킬 수 있는 필요적 효소 활성이 남아 있는 한 투과성이 부여되거나 동결건조될 수 있다(Izumi et al., J. Ferment. Techonol. 61.(1983)135-142). 생체반응기는 외부적으로 공급되는 효소 활성으로 진행될 수 있으며, 효소활성을 안정시키거나 증가시키기 위하여 공급된 용매 또는 긴 폴리머가 존재하는 환경에서 진행될 수 있다. 여기에 개시된 한 구체예에서, 메탄올 또는 에탄올은 환원효소 활성을 증가시키기 위하여 사용되었다. 또다른 구체예에서 가프쿼트(Gafquat)가 환원효소를 안정시키기 위하여 사용되었다(깁슨 등의 미국특허 5,240,843 참조).

여기에 기술된 한 예시적인 생체반응기에서, 숙주세포는 D-글루코스가 효소적 전환방법을 통하여 일련의 산화 단계를 거치는 탄소원으로 공급된 투과성 판토이 시트리이다. 산화효소는 GDH, GADH 및 DGDH를 포함하고, 환원 단계는 KLG를 생성하는 2DKGR을 포함한다. 본 발명의 방법에 의하여 제조되는 KLG는 당업자에게 알려진 방법에 의하여 아스코르브산으로, KDG는 에리소르베이트로 당업자에게 알려진 방법으로 더 전환될 수 있다. 실시예 참조(Reichstein and Grussner, Helv. Chim. Acta., 17, 311-328(1934)).

조효소 재생산

본 발명 방법의 잇점중의 하나는 경로 효소들이 필요로하는 조효소의 재생산에 있다. 현방법에 사용되는 조효소의 예로서 제한되지 않게 NAD+/NADH; NADP+/NADPH; ATP; ADP; FAD/FADH₂ 및 FMN/FMANH₂를 포함한다.

본 발명의 한 구체에에서, 탄소원은 도1에서 보여지는 바와 같은 조효소 재생산 공정이 포함된 방법으로 KLG로 전환된다. 이러한 조효소 재생산 방법에서, GDH의 촉매 작용에 의하여 D-글루코스는 이와 동량의 D-글루코네이트로 산화되고, 이와 동량의 NADP+가 이와 동량의 NADPH로 환원된다. GDH에 의하여 생성된 D-글루코네이트는 이와 동량의 2-KDG로 산화되고, 멤브레인에 결합된 탈수소효소 GADH 및 KDGDH의 각각의 작용에 의하여 이와 동량의 2,5-DKG로 전환된다. 동량의 2,5-DKG는 2,5-DKG 환원효소에 의하여 이와 동량의 2-KLG로 환원되고, NADPH는 다시 이와 동량의 NADP+로 산화되며, 효율적으로 재생산되는 동량의 조효소는 두번째의 동량의 D-글루코스의 산화에 이용가능하다. 조효소의 재생산의 다른 방법은 화학적, 광화학정 및 전기화학적인 수단을 포함하며, 동량의 산화된 NADP+는 직접적으로 동량의 NADPH로 화학적, 광화학적, 또는 전기화학적인 수단으로 환원된다. 생체반응기에 외부적으로 첨가되는 조효소의 양은 대략 1uM 내지 5uM이며, 바람직한 구체예에서, 5uM 내지 1mM이다. 실시예에서 보여지는 바와같이, NaCl은 NADPH에 대한 Km에 영향을 주는 반면, KLG, 전하된 종은 Km에 영향을 주지 않는다. 따라서, NaCl이 생체반응기내에 존재하면, 보다 많은 NADPH가 적정 반응 속도를 유지하기 위하여 필요할 것이다. 더나아가, 실시예에서 보여진 바와 같이, 시험된 대부분의 염은 환원효소의 열적 안정성에 영향을 준다. 당업자에게 이해되듯이, 온도와 같은 생체반응기의 조건에 따라서 알맞은 반응속도와 열적 평형의 균형을 유지하도록 염 수준이 조절될 수 있다. 인 비트로 시스템에서 외부적으로 첨가되는 조효소는 혼로 또는 다른 탄소원의 ASA중간체로의 생촉매적인 전환에 관련된 기질과 함께 첨가될 수 있다. 본방법은 담체에 고정화된 조효소, 긴 폴리머에 부착된 것과 같이 화학적으로 변형되어 분리된 조효소, 분리되거나 정제된 형태의 조효소의 사용을 포괄한다.

필요한 조효소는 나노필터를 통하여 생촉매적인 환경으로부터 정제되어 재사용될 수 있다. 조효소 유지를 위한 나노 멤브레인을 사용은 예를 들어, 실바흐(Seelbach( 등에 의하여 기술되어 있다(1997, Enzyme and Microbial Technology, vol 20, pages 389-392).

재조합 방법.

숙주세포

임의의 산화 또는 환원 효소로 숙주 세포 탄수화물 경로를 예를 들어, KDG, DKG 또는 KLG와 같은 ASA중간체로의 전환에 필요한 효소들은 숙주 세포에 천연적으로 존재하지 않는 한 당업자에게 알려진 재조합 DNA 기술에 의하여 도입될 수 있다. 선택적으로, 원하는 경로를 방해하는 효소는 재조합 DNA 방법으로 돌연변이될 수 있다. 본 발명은 원하는 경로를 얻는데 필요한 중간체 또는 임의의 효소의 재조합적인 도입 또는 돌연변이를 포괄한다.

본 발명의 한 구체예에서, 글루코스과 같은 탄소원은 KLG로 다수의 산화 단계 및 하나의 환원 단계를 거쳐 KLG로 전환된다. 이러한 구체예에서 일차 산화 단계 및 환원 단계는 조효소를 필요로 한다. 숙주 세포는 판토이 시트리이고, 천연적으로 글루코스 탈수소효소를 인코딩하는 핵산은 탈수소효소 활성이 제거되도록 돌연변이되고, 이종 GDH가 세포에 도입되었다. 본 발명은 제조에 영향을 주는 탄소 흐름 경로 효소에 추가의 돌연변이를 포괄한다. 일반적인 기술은, 예를 들어 Maniatis et al., 1989, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. 및 Ausubel et al., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing "Associates and Wiley Interscience, N.Y.등을 참조할 수 있다.

본 발명의 한 구체예에서, DKG 환원효소를 인코딩하는 핵산을 판토이 발효 균주에 재조합적으로 도입한다. 많은 종들이 DKGR을 함유하는 것으로 발견되었으며, 특히 코리니박테리아(Corynebacterium)속, 브레비박테리아(Brevibacterium)속 및 아스로박터(Arthrobacter)속을 포함하는 코리니폼(Coryneform) 군이 그러하다. 본 발명의 한 구체예에서, 코리니박테리아 종 균주 SHS752001(Grindley et al., 1988, Applied and Environental Microbilogy 54:1770-1775)로부터 얻을 수 있는 2,5-DKGR이 재조합적인 방법으로 판토이 시트리에 도입되었다. 다른 구체예에서, 앤더슨등의 미국특허번호 5,008,193에 기술된 어위니아 허비콜라(Erwinia herbicola)로부터 얻을 수 있는 2,5 DKG 환원효소가 판토이 시트리에 재조합적으로 도입되었다.

산화 환원효소를 인코딩하는 핵산의 공급원은 다음을 포함한다.

글루코스 탈수소효소: 스미스 등(Smith et al. 1989,, Biochem. J.

261:973; Neijssel et al. 1989, Antonie Van Leauvenhoek 56(1):51-61)

글루콘산 탈수소효소:마쓰시다 등(Matsushita et al. 1979, J.

Biochem. 95:1173; Kulbe et al. 1987, Ann. N.Y.Acad.Sci 506:552)

2-케토-D-글루콘산 탈수소효소:스트로쉐인(Stroshane

1977 Biotechnol. BioEng 19(4) 459)

2-케토 글루코네이트 환원효소:J. Gen. Microbiol. 1991, 137:1479

2,5-디케토-D-글루콘산 환원효소: 미국 특허공보 번호들 5795761;

5376544; 5583025; 4757012; 4758514; 5008193; 5004690; 5032514

벡터 서열.

숙주 미생물들에서 본방법에서 예를 들어, 탈수소효소 또는 환원효소와 같은 경로 효소를 발현시키는데 사용되는 발현 벡터들은 숙주 세포에서 작동가능한 프로모터로서 효소와 연결된 적어도 하나의 프로모터를 가진다. 본 발명의 한 구체예에서, 프로모터는 선택된 효소에 대한 야생형 프로모터이고 본 발명의 또다른 구체예에서, 프로모터는 효소에 이종이나, 여전히 숙주 세포에서 작동가능한 것이다. 본 발명의 한 구체예에서, 효소를 인코딩하는 핵산은 미생물 게놈에 안정적으로 삽입된다.

바람직한 구체예에서, 발현 벡터는 여러개의 클로닝 위치 카세트를 가지며, 바람직하게는 적어도 하나의 벡터에서 유일한 하나의 제한 효소 위치를 포함하여, 핵산 조절을 쉽게할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 벡터는 하나 또는 그이상의 선택 마커들을 포함한다. 여기에 사용된 선택 마커는 숙주 미생물에서 발현되어 벡터를 포함하는 숙주들의 선택을 쉽게할 수 있는 유전자를 말한다. 이러한 선택 마커의 예로서 한정되지 않게, 에리스로마이신, 액티노마이신, 크로람페니콜 및 테트라싸이클린과 같은 항생물질을 포함한다.

바람직한 천연적으로 존재하지 않는 효소 또는 중간체를 재조합적으로 엔테로박테리아세아 균주에 도입되는데 사용되는 플라스미드는 이동가능하나 스스로 전파능력이 없고 그람- 및 그람+ 박테리아를 포함하는 넓은 박테리아 숙주에서 복제능력을 가지는 플라스미드 RSF1010이다(Frey et al.,1989, The Molecular Biology of IncQ plasmids. In: Thomas(Ed.), Promiscuous Plasmids of Gram Negative Bacteria. Academic Press, London, pp. 79-94). 프레이 등은 RSF1010의 이동 특성에 영향을 주는 세부분을 보고하였다(1992, Gene 113:101-106).

형질전환.

일반적인 형질전환 방법은 Current Protocols In Molecular Biology(vol. 1, edited by Ausubel et al., John Wiley & Sons, Inc. 1987, Chapter 9)에서 알수 있으며, 칼슘 인산법, DEAE-덱스트란을 이용한 방법 및 전기충격법을 포함한다. 당업자에 알려진 주어진 숙주 세포에 경로 효소를 인코딩하는 핵산을 도입하는 다양한 형질전환 방법이 알려져 있다. 본방법은 재조합 숙주세포로부터 생산된 경로효소 및 재조합 숙주세포로부터 정제된 경로 효소 및 외부적으로 시험관내 환경에 첨가된 것뿐만 아니라 숙주에 이종이거나 내성인 경로 효소의 방법이 활발히 성장하는 숙주 세포에 의하여 발현되거나 또는 사멸 숙주세포의 멤브레인에 존재하는 경로효소를 포괄한다. 외부적으로 첨가되는 경로 효소를 재조합적으로 생산하기 위하여 다양한 숙주 세포들을 사용할 수 있으며, 박테리아, 균류, 포유동물세포, 곤충 세포 및 식물 세포를 포함한다. 식물 형질 전환 방법은 로드리게즈에 의하여 기술된다(1995년 5월 26일 공개된 WO 95/14099).

방법의 바람직한 구체예에서, 숙주세포는 엔테로박테리아이다. 엔테로박테리아 군에는 어위니아, 엔테로박터, 글루코노박터 및 판토이 종이 포함된다. 본 발명에서 바람직한 엔테로박테리아 발효 균주는 판토이 종이며, 특히 판토이 시트리이다. 또다른 바람직한 구체예에서, 숙주세포는 탄소원을 KLG로 전환시킬 수 있는 경로효소를 포함하는 판토이 시트리이다. 본 발명은 탄소원으로부터 임의의 중간체를 거치는 KLG로의 경로, 탄소원으로부터 제한되지 않게 GA, 2KDG, 2,5DKG, 5DKG 및 IA를 포함하는 중간체를 거치는 미생물의 탄소원 경로를 포괄한다. 한 구체예에서, 경로 효소를 인코딩하는 핵산은 플라스미드 벡터를 통하여 도입되고 또다른 구체예에서, 경로효소를 인코딩하는 핵산은 안정적으로 숙주 세포 게놈에 삽입된다.

형질전환체의 확인

숙주 세포가 형질전환 여부는 관심있는 핵산이 존재하는지 여부를 암시하는 마커 유전자의 발현의 존재/부존재에 의하여 검출될 수 있다. 예를 들어, 경로효소를 인코딩하는 핵산이 마커 유전자 서열안에 삽입되었다면, 삽입체를 함유하는 재조합세포는 마커 유전자 기능의 부존재로 확인될 수 있다. 선택적으로, 마커 유전자는 단일 프로모터의 조절하의 경로 효소와 일렬로 위치될 수 있다. 마커 유전자 의 유도 또는 선택에 반응한 발현은 일반적으로 효소의 발현을 나타낸다.

선택적으로, 경로 효소를 코딩하는 서열을 포함하고 효소를 발현하는 숙주 세포는 당업자에게 알려진 다양한 절차에 의하여 확인될 수 있다. 이러한 절차는 한정되지 않게, 핵산 또는 단백질의 검출 및/또는 정량을 위한 멤브레인에 기초한, 수용액에 기초한, 또는 칩에 기초한 기술을 포함하는 DNA-DNA, 또는 DNA-RNA 하이브리드, 및 단백질의 생분석 또는 면역분석 기술을 포함한다.

추가적으로, 숙주미생물에 효소 폴리뉴클레오타이드 서열의 존재는 DNA-DNA, 또는 DNA-RNA 하이브리드 또는 프로브, 효소 폴리뉴클레오타이드 서열의 일부 또는 단편을 이용한 증폭방법에 의하여 검출될 수 있다.

분석 조건.

ASA 중간체, ASA 또는 ASA 입체이성질체를 검출하기 위한 방법은 2,6 디클로로인도페놀 또는 다른 적절한 반응제와의 산화환원 적정을 이용하는 방법(Burton et al. 1979, J. Assoc. Pub. Analysts 17:105); 이온교환을 이용하는 고성능 액체 크로마토그라피(HPLC)(J. Chrom. 1980, 196:163); 및 전기적 산화환원 절차(Pachia, 1976, Anal. Chem. 48:364). 당업자는 이러한 검출방법을 이용하는 데 적용되는 대조군에 대하여 잘 알고 있다.

중간체들의 회수.

일단 생산된, ASA 중간체들은 당업자에게 알려진 동결건조, 결정화, 분사건조 및 전기적투석 등을 포함하는 임의의 수단으로 회수 및/또는 정제될 수 있다. KLG와 같은 ASA 및 ASA 중간체를 정제하는 전기적 투석방법은 예를 들어, 1998년 5 월 5일 발행된 미국특허번호 5747306 및 1998년 8월 30일 발행된 미국특허번호 4767870에 가술되어 있다. 선택적으로, 중간체들은 생체반응기로부터 직접적으로 정식화되거나 알갱이화 되거나 액체 시약에 위치할 수 있다.

본 발명을 수행하는 방식 및 방법은 본 발명의 범위를 제한하지 않고 청구범위를 안내하는 것이 아닌 다음의 실시예들을 참고하여 당업자에게 충분히 이해될 수 있다. 여기에 사용된 모든 참고문헌 및 특허 공개는 참고문헌으로 여기에 삽입되어 있다.

도1은 NADP+ 및 NADPH가 산화 및 환원 단계사이에서 재순환하는 시험관내 방법을 도식적으로 보여준다.

도2는 ASA 중간체들로의 경로를 도식적으로 나타낸다. A로 표시된 단계는 효소적이다; B로 표시된 단계는 효소적 또는 화학적인 전환일 수 있다; 이 도에서, 글루코스(Glc)를 GA로 전환시키는 효소는 GDH 활성이다; GA를 KDG로 전환시키는 효소는 GADH 활성이다; KDG를 DKG로 전환시키는 효소는 KDGDH 활성이고, DKG를 KLG로 환원시키는 효소는 DKGR 활성이다.

도3은 pH 7 및 30°C에서 0-40%의 메탄올의 존재하의 환원효소 활성을 보여준다.

도4는 pH 7 및 22°C에서 0-50%의 에탄올의 존재하의 환원효소 활성을 보여준다.

도5는 pH 7에서 NaCl, KCl, CaCl₂, K₂SO₄, 또는 포타슘 포스페이트(KPi)의 존재하에 환원효소 활성을 보여준다. 초기 속도들은 1분에 걸쳐서 측정되었다.

도6는 pH 7 및 45°C에서 2-KLG의 0 내지 500mM의 존재하의 환원효소의 활성을 보여준다.

도7은 시험관내 조효소 재순환 반응에서의 NADPH의 스펙트로포토메터의 측정을 보여준다. 흡광도는 340nm에서 측정되었다. 효소가 첨가되기 전 초기 판독값은 0.7이다. 추가의 GDH 분액이 대략 12 및 23분에서 첨가되었다.

도8은 시험관내 조효소 재순환 반응에서의 NADPH의 스펙트로포토메터의 측정을 보여준다. 흡광도는 340nm에서 측정되었다. 충분한 NaCl이 대략 5분에서 최종 농도 0.5M이 되도록 첨가되었다.

도9는 환원효소의 증가하는 2-KLG의 존재하에 2,5-DKG에 대한 Km 및 Vmax을 보여준다.

실시예1

본 실시예는 천연적으로 존재하는 GDH에 돌연변이를 가지는 판토이 시트리 숙주 세포를 제조하는 방법을 기술한다.

판토이 시트리로부터 글루코스 탈수소효소 유전자(GDH)의 클로닝: 글루코스 탈수소효소 유전자는 PCR에 의하여 클로닝하였다. PCR에서 두개의 프라이머를 사용하였다: 5'AGGGAGTGCTTACTACCTTATCTGCGGTATA3' 및 5'CGCTAGCTGTGCAATCCATTGATTTTGCACA3'. PCR후 약 2kb의 DNA 생성물이 pGEM-T 벡터(프로메가)에 클론되었고, 정확한 DNA 삽입체를 가지는 대장균이 확인되었고, 이 클론은 pRL로 명명되었다. DNA 삽입체는 DNA 시퀸싱으로 분석되었으며, 그 서열은 판토이 시트리 균주의 공개된 GDH DNA 서열과 60 내지 70%의 상동성을 가지는 것으로 밝혀졌다.

클로람페니콜 저항성 유전자의 삽입에 의한 GDH 유전자의 결실.

판토이 시트리의 GDH 유전자 결실 돌연변이를 생성하기 위하여, 선택 마커, 클로람페니콜 저항성 유전자(CAT)를 도입하여 유전자가 제거된 재조합 카피가 일차로 생성되었다. 시험관내 생성된 카피를 판토이 시트리에 도입하여 야생형 카피와 동종 재조합(homologous recombination)이 일어나도록 하였다. pRL DNA 유전자는 다양한 제한효소로 처리하여 분석하였다. GDH를 인코딩하는 DNA안에 700bp 떨어진 두개의 SmaI 위치가 발견되었다. pRL은 SmaI으로 처리하여 700 bp 단편을 제거하고 SmaI으로 처리된 클로람페니콜 저항성 유전자를 포함하는 1.05kb DNA으로 대체하여 pRLcm4로 지정된 재조합 플라스미드를 생성하였다. pRLcm4를 제조하는 데 사용된 방법은 당업계에서 사용되는 표준 기술이 이용하였다. pRLcm4로부터 GDH-CAT를 인코딩하는 서열이 pGP704에 옮겼다. GDH-CAT 카세트를 인코딩하는 DNA를 pRLcm4로부터 제한효소 AatII 및 SpeI의 조합으로 처리하여 제거하였다. 제한효소로 절단된 DNA의 결합성 말단(cohesive end)은 디옥시뉴클레오타이드 트리인산 혼합의 존재하에서 T4 DNA 중합효소로 처리하여 제거하였다. 그리고 GDH-CAT 카세트는 EcoRV로 절단된 pGP704와 접합되었다. GDH-CAT 카세트를 포함하는 pGP704 재조합 플라스미드가 확인되었으며, p704RLcm으로 지정되었다.

GDH가 제거된 유전자의 판토이 시트리 염색체로의 도입.

플라스미드 p704RLcm은 야생형 판토이 시트리에 전기충격법으로 도입하였다. 형질전환된 세포는 12.5ug/ml의 클로람페니콜을 함유하는 한천배지에 도포하고, 저항성을 가지는 콜로니를 관찰하였다. 단순히 플라스미드 p704RLcm이 포함하는 세포로부터 진정한 결손 돌연변이(클로람페니콜 저항성 표현형을 보이는)를 분리하기 위하여 클로람페니콜 저항성 콜로니들이 p704RLcm의 추가 항균 저항성 마커인 암피실린에 대하여 스크리닝하였다. 암피실린에 감수성인 균주가 확인되었다. 정확한 표현형(클로람페니콜 저항성 및 암피실린 감수성)인 수개의 클론들이 생화학적인 분석로 확인되었고, 모두 GDH 네가티브 표현형을 나타내었다. DNA 블라팅 분석 역시 야생성 GDH 유전자가 제거된 카피로 대체되었음을 확인하였다.

실시예2

실시예2는 천연적으로 존재하는 2-케토-D-글루코네이트 탈수소효소(E3)에 돌연변이를 가지는 숙주세포의 제조방법을 기술한다.

글루코노박터 메라노지너스(Gluconobacter melanogenus)로부터 2-케토-D-글루코네이드 탈수소효소(EC 1.1.99.4)가 맥킨타이어 등의 방법 및 그 참고문헌에 따라서 정제되었다(McIntire, W., Singer, T.P., Ameyama, M., Adachim O., Matsushita, K., and Shinagawa, E. Biochem. J.(1985) 231, 651-654). 정제된 단백질은 트립신 및 키모트립신 또는 다른 단백질 분해효소로 처리하여 HPLC 또는 다른 기술로 분리되는 펩티드 단편으로 제조하였다. 개별 펩타이드들은 수집하여 시퀀싱하였다. 서열로부터 숙주세포 또는 유사 생물체의 게놈의 상응하는 서열과 결합할 수 있는 DNA 프로브를 합성하였다. 표준 PCR 기술을 이용하여, 원하는 유전자의 큰 단편이 증폭되고, 정제되고 시퀀싱하였다. 이러한 단편들은 유전자에 하이브리드하는데 사용되었으며, 전체 유전자를 클로닝하고 시퀀싱하였다. 일단 서열이 알려진 경우에, 유전자는 실시예 1의 클루코네이트 탈수소효소와 같은 방법으로 제거하였다.

2-케토-D-글루코네이트 탈수소효소를 감소시키거나 제거하는 다른 방법은 저해제(시트레이트 및 숙시네이트와 같은 유기 산들은 2-케토-D-글루코네이트 탈수소효소를 저해하는 것으로 보고되었다; Shinagawa, E. and Ameyama, M. Methods in Enzymology(1982)89, 194-198), 및 pH의 변화 또는 온도를 포함한다.

효소의 활성 또는 활성의 손실은 시나가와 및 아메야마(Shinegawa, Ameyama)에 의하여 기술된 분석법을 이용하여 분석될 수 있다.

실시예3

실시예 3은 조효소가 재생산되는 생체 반응기에서 KLG를 제조하는 방법을 보여준다.

투과성 세포의 제조

천연적으로 멤브레인 결합된 GDH에 돌연변이를 가지는 400ml의 판토이 시트리 세포들을 10g/l 글루코네이트에서 80 OD(600nm)까지 배양되었으며, 16ml의 10% 톨루엔 및 90%의 아세톤을 용액과 22°C에서 3분간 혼합하였다. 투과성의 세포는 10분간 9000rpm에서 원심분리하였으며, 형성된 세포 펠릿은 400ml의 50mM 트리스, pH 7로서 세척하였다. 잔여 유기용매의 제거를 위하여 세척을 두 번 반복하였다.

반응기의 충진

상기와 같이 얻어진 50mM 트리스, pH7의 400ml의 투과성 세포는 교반기, 온도 조절장치, 산소 전달 튜브, 염기 전달 튜브, 시료 출입구, 및 산소 및 pH 프로브가 장착된 1리터 유리 용기에 놓았다. 200ul의 MAZU 안티폼(BASF)이 과도한 거품을 제어하기 위하여 첨가하였으며, 압축 공기를 용기에 공급하고, 28°C로 온도를 조절하며, 교반기는 1200rpm으로 산소 프루브가 60%이상 포화될 때까지 교반하였다. 16 그람의 결정성 글루코스 및 4그람의 결정성 소듐 글루코네이트가 최종 농도 10g/L 글루코네이트 및 40g/L 글루코스가 되도록 첨가하였다. 혼합액은 모든 글루코네이트가 DKG로 전환될 때까지 반응이 이뤄지도록 하였다. 글루코스 농도는 20g/L 이상으로 유지하였다. 세포의 투과성 때문에 최소한 양의 글루코스가 비-생산적인 세포 대사로 유입된다. pH는 7로 50% NaOH를 계속 조절하여 첨가하여 유지하였다.

용액상 효소들 및 조효소의 첨가

글루코네이트가 DKG로 전환되고, 각각 2000 유니트의 조효소 의존성 GDK 및 DKG 환원효소(DKGR, 1 유니트는 일분당 340nm에서 측정하여 1 OD 흡광도의 변화를 가져오는 양에 해당한다)가 400uM NADP+와 함께 첨가하였다. 반응기를 교반하고, 공기를 공급하고 28°C에서 상기와 같이 유지하였다. 주기적인 글루코스의 첨가를 반응동안 계속 공급하여 조효소 의존성 효소 모두의 지속적인 기질 공급을 유지하였다.

결과

생체반응기 실험은 비-정제된 환원효소 A:F22Y/A272G(미국특허번호 5795761)가 대장균의 원추출액의 형태로 수행되었다. 티. 아시도필럼(T.acidophilum) GDH 및 NADP+가 정제된 형태로 시그마로부터 구입되었다. GA로부터 DKG로의 반응 속도는 10g/L/hr보다 크다. 초기 2KLG 형성 반응속도는 10g/L/hr보다 크다. 첫 6시간동안의 통합된 반응 속도는 5g/L/hr를 넘는다. 조효소는 첫 6시간동안 안정한 것으로 보이며, 환원된 형태로 우세하게 존재한다. 전체 턴오버 속도는 537(215mM 2KLG/ 0.4mM NADP+)이다. 첫6시간동안, 중간체 GA 및 DKG는 4g/L를 초과하지 않았다. 반응은 초기 세포 충전으로부터 6.5시간에서 정지하였으며, 마감 단계는 저속 교반, 22°C에서 밤 세워 지속하였다. KLG의 최종 농도(titer)는 대략 42g/L이다.

생체반응기 배양 과정 동안 분액을 분리하였다. 이러한 분액은 우선 세포를 침강시키기 위하여 마이크로퓨즈에서 회전하였다. 남아있는 환원효소활성을 분석하기 위하여, 25uM의 샘플 상층액이 910ul의 버퍼(50mM 비스-트리스, pH7), 20ul의 DKG(70mg/ml), 및 250ul의 NADPH로 조성된 수용액에 첨가하였다. 환원효소 활성은 340nm에서 1분간 흡광도의 감소를 관찰하여 측정하였다. GDH 활성은 25ul의 샘플을 520ul의 버퍼, 150ul의 NaCl(1M), 200ul의 유레아(8M), 50ul의 글루코스(1M) 및 60ul의 NADP+(5mM)로 조성된 수용액에 첨가하였으며, 1분간 340nm에서 흡광도의 증가를 관찰하여 측정하였다. 환원효소 및 GDH는 모두 생체반응기 실험동안 완전한 활성을 보였다.

실시예 4

이 실시예는 시험관내 생체반응기에서 KDG의 생산을 도식적으로 보여준다.

멤브레인 결합된 D-글루코스 탈수소효소 및 D-글루콘산 탈수소효소 활성을 포함하나, 2-케토-D-글루코네이트 탈수소효소 활성을 포함하지 않는 세포들을 배양하여 회수하였다. 이러한 세포의 한 예로서 2-케토-D-글루코네이트 탈수소효소에 돌연변이를 가지는 판토이 시트리이고, 실시예 3과 같이 배양하고 처리하였다. 세포는 실시예 3에서 기술된 바와 같이 투과성이 부여되었다. 글루코스(결정형 또는 수용성)를 나누어서 또는 연속적으로 첨가하였다. pH는 NaOH수용액의 조절된 첨가로 유지하였다. 글루코스는 D-글루코네이트로 전환되고 그후 KDG로 되었다. 생성물 형성은 알맞은 HPLC 시스템상에서 분액을 분석하여 관찰하였다. 생성물은 원심분리로 세포를 제거하고 농축하거나 또는 잔여 액체를 제거하여 회수하였다.

실시예 5

이 실시예는 유기용매의 첨가가 환원효소 활성을 증가시키는 것을 보여준다.

DKG 1-2mg, 250uM NADPH, F22Y/A272G 환원효소 A 및 50mM 비스-트리스 버퍼, pH7, 이 최종부피 1ml이 되도록 큐벳에 첨가하였다. 환원효소활성은 340nm에서 흡광도의 감소로 관찰하여 측정하였다. 전형적으로 첨가된 환원효소 양은 실온 또는 30°C에서 흡광도 0.1-0.2 OD/min의 변화를 가져온다. 동일한 조건에서, 메탄올 또는 에탄올 분액이 수용액에 첨가하고 환원효소 활성을 측정하였다. 다양한 양의 메탄올의 존재하의 환원효소 활성을 도3에서 도시하였고, 에탄올의 존재하의 22°C에서의 활성은 도4에 도시하였다.

상기 도면에서 보여진 바와 같이, 환원효소 활성은 일정한 양의 메탄올 또는 에탄올의 존재하에서 증가한다. 적절한 농도는 대략 10 내지 25%의 유기 용매이다.

10% 메탄올(분석 조건 50mM 트리스, pH7, 12.5mM D-글루코스, 250uM NADP+인 1ml)에서 인큐베이션하였을 때, 티.아시도필럼(T.acidophilum)으로부터 얻어진 GDH는 활성은 작은 감소를 보인다. 활성은 340nm에서 흡광도의 증가로 관찰되었다. 투과성 세포를 15% 메탄올 및 글루콘산과 배양하였다. D-글루콘산 탈수소효소 및 2-케토-D-글루콘산 탈수소효소의 활성은 생성물 형성(HPLC 분석)을 관찰한 바와 같이 메탄올의 첨가로 인한 상당한 영향을 받지 않는다.

메탄올 또는 에탄올의 완전한 생체반응기 반응에의 첨가는 환원효소활성을 증가시킬 것이다. GDH 활성 또는 다른 요소들의 손실은 추가의 GDH 또는 세포를 첨가하여 극복될 수 있을 것이다.

실시예 6

실시예 6은 가프쿼트(Gafquat) 및 PEG8000의 존재하의 환원효소 활성을 보여준다.

환원효소는 1ml(50mM 비스-트리스 버퍼, pH 7)의 250uM NADPH, 1-2mg/ml DKG, 및 0, 0.7% 및 2.8% 가프쿼트 또는 0.5% PEG8000과 함께 30°C로 배양되었다. 환원효소활성은 실시예 6과 같이 측정되었다. 표1에서 보여지는 바와 같이, 가프쿼트의 첨가는 환원효소활성을 가프쿼트가 없는 경우에 비하여 80%의 활성의 증가시켰다. PEG8000은 환원효소활성을 대략 15% 증가시켰다.

폴리머	최종 수용액에 첨가된 %	첨가제 없는 활성 %
가프쿼트	0.7-2.8	180
PEG8000	0.5	115

실시예7

실시예7은 염의 존재하 환원효소활성을 보여준다.

환원효소 A F22Y/A272G 활성은 다양한 양의 서로 다른 염의 존재하에서 측정하였다. 분석은 (최종 부피 1ml) 250uM NADPH, DKG(1-1.5mg/ml), 50mM 비스-트리스 버퍼, pH 7.0 및 다양한 양의 포타슘 포스페이트, NaCl, KCl, K₂SO₄, 또는 CaCl0₂를 포함하는 수용액에 환원효소의 첨가로 구성된다. 결과는 도5에 보여진다.

도5에서 보여지는 바와 같이, 100mM까지의 NaCl 또는 KCl과 배양되었을 때, 환원효소 활성은 동일하거나 또는 약간 증가한다. 그리고 활성은 염 농도가 250mM까지 증가되면 떨어진다. 환원효소 활성은 CaCl₂ 또는 포타슘 포스페이트이 20mM 또는 그 이상인 농도에서 떨어진다.

200mM NaCl의 존재하의 NADPH에 대한 환원효소의 결합 상수(Km)는 표준 생화학 기술을 이용하여 결정하였다(Fersht, A. "Enzyme Structure and Mechanism"(1997) W.H.Freeman and Company). 반응은 1.5mg/ml DKG를 함유하는 pH 7 비스-트리스 버퍼에서 30°C에서 다양한 양의 NADPH로 수행하였다. 200mM NaCl의 존재하의 NADPH에 대한 Km은 NaCl이 없는 경우 결정된 Km의 10 - 40 배로 증가하였다. 염에서 최대 속도(Vmax)는 염이 없는 경우의 Vmax값과 유사하거나 약간 증가하였다. 염의 환원효소 활성에의 영향을 줄이는 방법은 NADPH의 농도를 이러한 조건에서 Km 또는 그 이상까지 증가시키는 것이다. 선택적으로, KLG를 포함한 하전된 종들은 제거할 수 있다.

실시예8

실시예8은 염/생성물의 존재하에서 환원효소 A F22Y/A272G의 안정성을 보여준다.

환원효소 열적 안정성은 염의 존재하에 크게 증가되었다. 환원효소는 다음의 방식 중 하나로 시험하였다. 첫 번째 경우, 환원효소는 버퍼(50mM 비스-트리스, pH7)에 다양한 양의 2-KLG(0-500mM)의 존재 및 부존재 하에 첨가한다. 이러한 수용액은 1.5ml 에펜도르프 튜브에 분주(40ul)한다. 환원효소는 표준 환원효소 분석 방법을 사용하여 잔여 활성이 분석된다. 결과는 도6에 보여진다.

도6에서 보여지는 바와 같이, 환원효소는 이러한 조건에서 500mM 2-KLG의 존재하에서 상당한 활성을 잃지 않는다. 그러나, 버퍼만으로 인큐베이션된 환원효소는 10분동안 그 활성의 절반을 손실하였다. 중간체 2-KLG 농도는 부분적인 안정화를 준다.

환원효소는 10분간 버퍼(50Mm 비스-트리스, pH 7, 또는 25mM MOPS, pH7), 0.5M NaCl, 0.5M KCl, 0.5M NH₄Cl, 0.5M K₂SO₄ 및 0.1M NaCl의 존재하에서 pH 7, 45°C에서 인큐베이션하였다. 아래의 표2에서 보는 바와 같이, 이러한 조성물등의 존재하에서 활성의 손실은 거의 없는 반면, 버퍼만의 환원효소는 거의 활성의 반을 손실하였다. 이러한 조성물들이 환원효소를 안정화하는 것은 명백하다. 이러한 조성물들의 낮고 높은 수준 역시 환원효소를 안정화한다.

환원요소 샘플 12분 인큐베이션후 잔여활성% 10분 인큐베이션후 잔여활성%
버퍼 25-40 0.5 M NaCl 100 0.5 M KCl 100 0.5 M NH₄Cl 100 0.5 M K₂SO₄ 100 0.1 M Nal 80-85 100 mM NADPH 80-90 200 mM K₂PO₄ 65-78 100 mM K₂SO₄ 90-100

2KLG 및 NaCl간의 안정화를 비교하였다. 인큐베이션 온도는 45.5°C이고 25mM MOPS, pH 7 조건이다. 20mM 2-KLG 또는 20mM NaCl을 사용하였다. 분석 시간은 0, 5, 및 10분이다. 결과는 표3에서 보여진다. 보는 바와 같이 동일한 양의 NaCl이 환원효소를 2-KLG보다 더 안정화시킨다.

조건	%활성, 0분	%활성, 5분	%활성, 10분
20 mM NaCl	100	72	59
20 mM 2-KLG	100	51	29

46.6-46.9°C에서, 0-400mM NaKLG의 존재하의 환원효소의 반감기가 결정되었다. 이러한 온도는 동일한 온도에서 모든 반감기를 결정하기 위해 선택하였다. 버퍼는 25mM MOPS, pH 7.0이다. 분액을 제거하고 잔여 활성을 분석하였다. 열적 안정성 반감기 측정은 다음과 같이 수행하였다; 버퍼, 환원효소 및 2KLG를 포함하는 450ul의 샘플을 에펜도르프 튜브에 놓고 수욕에서 가열하였다. 시간에 따른 8 또는 9 분액을 10 내지 30분의 시간에 걸쳐서 제거하였다. 각각의 분액은 얼음 위에 놓고 이중으로 실험 종말점에서 분석하였다. 활성은 시간과 잔여 활성간의 함수로 표시하였다. Kf를 결정하였으며, b는 지수적 감소를 계산하는 컴퓨터 그래픽 프로그램을 이용하여 라인을 최적화하였다. 그리고 이 값은 반감기를 계산하는데 사용하였다(Fersht, A. "Enzyme Structure and Mechanism"(1977) W.H.Freeman and Co.). 결과는 아래의 표4에서 보여진다.

NaKLG 농도.	0 mM	100 mM	200 mM	300mM	400mM
반감기(분)	3.5 +/- 0.5	5.5 +/- 1	7.5 +/- 1.5	10 +/- 3	18.5 +/- 3

표4의 결과에서 보듯이 NaKLG는 명백하게 환원효소를 안정화시키고, 이러한 안정화는 농도에 의존적이다.

이러한 데이터는 염의 증가가 환원효소를 안정화시킨다는 것을 보여준다. 생체반응기에의 사용에 알맞은 염은 암모늄 설페이트, 소듐 아세테이트, 암모늄 아세테이트, 암모늄 클로라이드, 소듐 설페이트, 포타슘 포스페이트, 소듐 포스페이트, 소듐 클로라이드, KCL, NH₄Cl, K₂SO₄ 및 NaI를 포함한다. 당업자는 염의 적정 농도는 온도에 의존적이라는 것을 알 것이다. 따라서, 생체반응기에서 온도 또는 염 농도 또는 모두 원하는 환원효소의 안정화를 위하여 조절될 수 있다. 생체반응기가 전형적으로 작동되는 보다 낮은 온도에서는, 표4에서 보는 바와 같이 동일한 양의 환원효소를 안정화시키는데 보다 적은 양의 염을 사용할 것이다.

실시예9

실시예9는 NADPH/NADP+ 비율 및 반응 평형을 측정하는 방법을 도식화한다.

환원된 조효소(NADPH)는 340nm에서 강력한 흡광도를 가지는 반면, 산화된 조효소(NADP+)는 이러한 파장에서 흡수하지 않는다. 따라서, 두 조효소들이 함께 섞이면, 존재하는 NADPH의 양은 340nm에서의 흡광도에 의하여 결정될 수 있다. 만약 NADP+의 초기 첨가량을 안다면, 두 조효소들의 비율은 쉽게 결정될 수 있다. 이러한 방법은 조효소 재순환 반응과 같은 반응물에 다양한 조성물의 첨가가 반응 평형에 어떻게 영향을 미치는지 측정하는데 사용될 수 있다.

1ml의 반응물을 실온에서 큐벳에 준비하였다. 반응물은 버퍼(50mM 비스-트리스, pH7), 5mg 글루코스, 5mg 2,5-DKG, 100uM NADPH, 100uM NADP+, 환원효소 및 글루코스 탈수소효소(GDH)로 조성된다. 효소는 반응을 개시하기 마지막에 첨가하였으며, 조효소의 수준은 340nm에서 관찰되었다. 반응이 평형에 도달한 후에, 추가의 GDH 분액을 첨가하였다(도7). 매우 빨리, 평형은 추가 NADPH가 존재하는 쪽으로 쉬프트되었다. 추가 GDH의 첨가는 동일한 반응을 보였다.

또 다른 1ml 반응이 상기와 같이 준비하였다. 평형에 도달한 후에, 29mg의 NaCl을 0.5M NaCl의 최종농도로 첨가하였다. 도8에서 보이는 바와 같이, 평형은 극적으로 NADPH의 존재하는 쪽으로 쉬프트되었다.

실시예10

실시예10은 조효소 재순환 반응을 보여준다.

조효소 재순환 반응은 환원효소, GDH, 글루코스, 2,5-DKG 및 NADP+를 반응용기에 첨가하여 수행하였다. 추가적으로, 정제된 2-KLG를 일부 반응에 첨가하여 생산물의 존재하의 반응을 분석하였다. 이러한 반응을 유지하여 글루콘산 및 2-KLG를 생성하였다. 조효소는 두 효소의 반응에 의하여 NADP+ 및 NADPH간에서 순환된다. 분액을 주기적으로 제거하고 기질들 및 생산물들의 존재를 확인하기 위하여 HPLC에 의하여 분석하였다. 반응은 적어도 20시간동안 실온에서 유지하였다.

반응은 작게는 3ml로 수행하였다. 반응에서, 환원효소, GDH, 10mg/ml 글루코스 및 10mg/ml 동결건조된 2,5-DKG를 50mM 비스-트리스 버퍼에 추가하였다. 2-KLG를 75mg/ml의 농도로 일부 반응에 첨가하엿다. 반응은 실온에서 NADP+(400uM)의 첨가로 개시하였다. 반응액의 pH는 NaOH의 적은 양의 첨가로 pH 6-7.5로 유지하였다. 글루코스 및 2, 5-DKG 분액을 주기적으로 첨가하였다. 오후 마지막부터 반응물을 4°C에 밤 세워 놓아두었다. 다음날 아침 실온으로 가열하고, pH를 조정하고 반응을 계속하였다. 적은 양의 분액을 제거하여 HPLC에 주입하였다. 표준과 비교하여, 글루네이트 및 2-KLG의 양을 계산할 수 있다. 전형적인 반응에서 적어도 60%의 글루코스가 글루코네이트로 전환되었고, 적어도 60%의 2,5-DKG가 2-KLG로 전환되었다.

실시예11

실시예11은 NaCl 키네틱스를 보여준다.

250uM NADPH 및 10-20 mM DKG를 포함하는 표준 환원효소 분석에 NaCl(100 mM 또는 그 이상)이 첨가되면, 환원효소 반응속도는 감소한다. 키네틱 분석을 통하여, NaCl이 조효소 NADPH에 대한 환원효소의 Km을 증가시킨다는 것이 발견되었다. NaCl이 첨가됨에 따라서, Km도 증가한다. 만약 포화 직전(subsaturating)NADPH가 사용된다면, 환원효소는 NaCl에 의하여 저해될 것이다. 이러한 효과를 상쇄시키기 위하여, 추가의 NADPH가 반응에 Km보다 수배가 되도록 첨가된다. 저해 모드는 경쟁적(competetive)인 것이다.

NaCl의 존재하의 DKG에 대한 Km을 표준 기술을 이용하여 결정하였다. 각각의 측정에 사용된 NADPH 농도는 적어도 각각의 NaCl 농도에서의 Km의 3배가 되도록 조절하였다.

[NaCl], mM	NADPH에 대한 Km(mM)	DKG에 대한 Km(mM)
0	4-9	6-14
100	30-100	6-14
200	13-230	6-14
400	260-360	6-14

실시예12

실시예12는 2-KLG 키네틱스를 보여준다.

2-KLG의 존재하의 DKG에 대한 Km은 표준 생화학 기술을 이용하여 결정하였다. 2-KLG의 양은 pH 7 버퍼에서 0 - 150 mM로 하였다. pH 7 조건에서 DKG에 대한 Km은 10-12mM이다. 2-KLG의 농도가 증가함에 따라서, 2,5-KLG에 대한 Km은 감소하였다. 예를 들어, 150mM 2-KLG에서의 DKG에 대한 Km은 2-4mM이다. KLG 농도가 0-150mM로 증가할 때에, 반응속도가 역시 감소하고 2-4배의 감소를 경험하였다. 이러한 양태는 반경쟁적 저해와 일치한다.

100mM 2-KLG의 존재하의 NADPH에 대한 Km은 4-9mM로 결정되었다. 이것은 pH7에서, 2,5-DKG 농도가 14mM이상, 및 Km 값을 포괄하는 NADPH 농도에서 표준 생화학 기술을 이용하여 측정하였다.

따라서, 생체반응기 환경에서 증가하는 KLG양의 존재는 환원효소 활성의 감소 및 전체 반응속도의 감소가 예상된다. 이러한 현상은 두가지 방법으로 극복될 수 있으며, 예를 들어 전기적투과와 같은 KLG의 회수, 또는 선택적으로 추가의 환원효소를 생체반응기에 첨가하는 것이다.

실시예13

실시예13은 2,5-DKG의 합성을 보여준다.

판토이 시트리 세포가 알맞은 버퍼(25mM 비스-트리스 또는 25mM MOPS가 pH 6으로 사용된)에서 150mM 소듐 글루코네이트와 함께 인큐베이션하였다. 25ml의 세포, 버퍼, 및 기질은 125ml의 배플이 있는 엘렌마이어 플라스크에 첨가되어 28°C에서 대략 250rpm의 진탕으로 인큐베이션하였다. 16-24 시간의 경과후에, 플라스크는 HPLC 분석 및 활성 분석에 의하여 2,5-DKG의 형성이 관찰되었다. 세포는 원심분리하고, 상층액을 분리하였다. 성분들은 멸균 여과하고 4°C 또는 냉동 보관할 수 있다. 선택적으로, 성분들은 동결건조하여 고체상태로 할 수 있다.

Claims

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탄소원으로부터 2-KLG를 비발효적으로 제조하는 방법으로서,

a. 일차 산화적 효소 활성에 의하여 탄소원을 효소적으로 일차 산화 생성물로 산화하는 단계;

b. 이차 산화적 효소 활성에 의하여 일차 산화 생성물을 효소적으로 이차 산화 생성물로 산화하는 단계;

c. 삼차 산화적 효소 활성에 의하여 이차 산화 생성물을 효소적으로 삼차 산화 생성물로 산화하는 단계; 및

d. 환원 효소 활성에 의하여 삼차 산화 생성물을 효소적으로 2-KLG로 환원시키는 단계를 포함하며,

상기 일차 산화적 효소 활성은 산화된 형태의 조효소를 필요로 하고, 상기 환원효소 활성은 환원된 형태의 상기 조효소를 필요로 하고,

상기 산화된 형태의 상기 조효소 및 환원된 형태의 상기 조효소는 상기 산화 단계 및 환원 단계 사이에서 재순환하는 것을 특징으로 하는 방법..
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제15항에 있어서, 상기 탄소원이 글루코스이고 상기 일차 효소적 활성이 글루코스 탈수소효소 활성인 것을 특징으로 하는 방법.
제21항에 있어서, 상기 글루코스 탈수소효소 활성이 박테리아, 효모 또는 진균류로부터 얻을 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
제22항에 있어서, 상기 글루코스 탈수소효소 활성이 티. 아시도필럼(T.acidophilum), 크립토코커스 유니거타라투스(Cryptococcus uniguttalatus) 및 바실러스(Bacillus) 종을 포함하는 소스로부터 얻을 수 있는 것임을 특징으로 하는 방법.
제15항에 있어서, 상기 일차, 상기 이차 효소 및 상기 삼차 효소가 탈수소효소 활성인 것을 특징으로 하는 방법.
제15항에 있어서, 적어도 하나의 상기 일차, 상기 이차, 및 상기 삼차, 및 상기 환원 효소적 활성이 고정화된 것임을 특징으로 하는 방법.
제15항에 있어서, 적어도 하나의 상기 일차, 상기 이차, 및 삼차, 및 상기 환원 효소적 활성이 용액 중에 있는 것을 특징으로 하는 방법.
제25항에 있어서, 상기 이차 효소가 GADH 활성인 것을 특징으로 하는 방법.
제25항에 있어서, 상기 삼차 효소가 KDGDH 활성인 것을 특징으로 하는 방법.
제25항에 있어서, 상기 환원 효소가 환원효소 활성인 것을 특징으로 하는 방법.
제29항에 있어서, 상기 환원효소 활성이 박테리아, 효모, 또는 진균류 소스로부터 얻을 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
제29항에 있어서, 상기 환원효소 활성의 소스가 코리니박테리움(Corynebacterium) 및 어위니아(Erwinia)를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제31항에 있어서, 상기 환원효소 활성이 2,5 DKG 환원효소인 것을 특징으로 하는 방법.
제15항에 있어서, 상기 일차 산화 생성물이 글루코네이트이고, 상기 이차 산화 생성물이 2-KDG이고, 상기 삼차 산화 생성물이 2,5-DKG인 것을 특징으로 하는 방법.
제15항에 있어서, 상기 방법은 재조합 숙주세포를 포함하는 환경에서 진행되는 것을 특징으로 하는 방법.
제34항에 있어서, 상기 숙주세포가 생육성인 방법.
제34항에 있어서, 상기 숙주세포가 비-생육성인 방법.
제34항에 있어서, 상기 재조합 숙주세포가 엔테로박테리아세아 (Enterobacteriacea) 멤버를 포함하는방법.
제34항에 있어서, 상기 방법은 재조합 숙주세포 멤브레인을 포함하는 환경에서 진행되고, 상기 일차, 상기 이차, 및 상기 삼차 효소들 중 적어도 하나는 상기 숙주세포 멤브레인에 결합되는 것을 특징으로 하는 방법.
제37항에 있어서, 상기 재조합 숙주세포가 판토이(Pantoea) 종인 것을 특징으로 하는 방법.
제39항에 있어서, 상기 재조합 숙주세포가 판토이 시트리(Pantoea citrea)인 것을 특징으로 하는 방법.
제40항에 있어서, 상기 재조합 숙주세포가 적어도 하나의 자연 발생적인 탈수효소 활성의 돌연변이를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
제41항에 있어서, 상기 돌연변이가 멤브레인에 결합된 GDH 활성에 있는 것을 특징으로 하는 방법.
제41항에 있어서, 상기 숙주세포가 이종(heterologous) GDH 활성을 인코딩하는 핵산을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제43항에 있어서, 상기 이종 GDH 활성은, 티. 아시도필럼(T.acidophilum), 크립토코커스 유니거타라투스(Cryptococcus uniguttalatus) 및 바실러스(Bacillus) 종으로부터 얻을 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
제15항에 있어서, 상기 산화된 형태의 상기 조효소가 NADP+이고, 상기 환원된 형태의 상기 조효소가 NADPH인 방법.
제15항에 있어서, 상기 산화된 형태의 상기 조효소가 NAD+이고, 상기 환원된 형태가 NADH인 방법.
제15항에 있어서, 상기 방법은 연속식인 것을 특징으로 하는 방법.
제15항에 있어서, 상기 방법은 회분식인 것을 특징으로 하는 방법.
제15항에 있어서, 상기 방법은 유기용매를 포함하는 환경에서 진행되는 것을 특징으로 하는 방법.
제15항에 있어서, 상기 방법은 긴 폴리머를 함유하는 환경에서 진행되는 것을 특징으로 하는 방법.
제15항에 있어서, 상기 2-KLG로부터 ASA를 얻는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
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제15항에 있어서, 상기 2-KLG는 전기투석을 통하여 더 정제하는 것을 특징으로 하는 방법.
제45항 또는 제46항에 있어서, 상기 조효소는 나노필터를 통하여 정제하는 것을 특징으로 하는 방법.
제15항에 있어서, 상기 방법은 염을 포함하는 환경에서 진행되는 방법.
제60항에 있어서, 염이 암모늄 설페이트, 소듐 아세테이트, 암모늄 아세테이트, 암모늄 클로라이드, 소듐 설페이트, 포타슘 포스페이트, 소듐 포스페이트, 소듐 클로라이드, KCl, NH₄Cl,K₂SO₄ 및 NaI를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제60항에 있어서, 0 내지 500 mM의 염 농도를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.