CN112430560B

CN112430560B - 一种2-酮基-l-古龙酸生产菌株及其构建方法

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Publication number: CN112430560B
Application number: CN201910788355.4A
Authority: CN
Inventors: 杨晟; 汪庆卓; 段春兰; 刘映淼; 刁刘洋; 蒋宇; 陶荣盛
Original assignee: Center for Excellence in Molecular Plant Sciences of CAS
Current assignee: Center for Excellence in Molecular Plant Sciences of CAS
Priority date: 2019-08-26
Filing date: 2019-08-26
Publication date: 2024-01-05
Anticipated expiration: 2039-08-26
Also published as: CN112430560A; WO2021036788A1

Abstract

本发明提供了一种构建2‑酮基‑L‑古龙酸生产菌株的方法，包括任意顺序的如下步骤中的一个以上：1)中断塔特姆氏菌染色体中膜结合葡萄糖脱氢酶编码基因；2)中断葡萄糖激酶编码基因；3)中断葡萄糖酸激酶编码基因；4)中断2‑酮醛糖还原酶编码基因和/或其同工酶编码基因；5)重组表达NAD(P)+型葡萄糖脱氢酶；6)重组表达NAD(P)H型2,5‑二酮基‑D‑葡萄糖酸还原酶；7)过表达2,5‑二酮基‑D‑葡萄糖酸内运蛋白ARU92990和ARU92994；8)中断细胞染色体中PTS组分编码基因，得到基因工程菌。本发明构建的2‑酮基‑L‑古龙酸生产菌可以通过一步发酵法或全细胞催化以葡萄糖为原料生产2‑酮基‑L‑古龙酸，具有工业化开发前景。

Description

一种2-酮基-L-古龙酸生产菌株及其构建方法

技术领域

本发明属于代谢工程技术领域，具体地说，涉及一种构建2-酮基-L-古龙酸生产菌株的方法。

背景技术

抗坏血酸又称维生素C(Vc)，广泛用于医药、食品、饮料、化妆品、饲料等行业。目前，我国抗坏血酸年产能约25万吨，年产量约12万吨，约占全球产量的90％。抗坏血酸能够在部分藻类、植物和部分动物中以葡萄糖为起始原料合成，但将植物抗坏血酸合成途径导入微生物所产抗坏血酸浓度极低。目前最经济的生产方法是山梨醇两步发酵法，以葡萄糖化学加氢生成山梨醇为底物，第一步发酵为山梨糖，再经双菌发酵为2-酮基-L-古龙酸(2-keto-L-gulonic acid，2-KLG)，最后经酯化反应生成抗坏血酸，图1示出了该工艺的部分路线。

众所周知，许多化学合成工序比如化学加氢、酸或醇的酯化反应都会造成环境污染，随着人们环保意识的增强和全国环保要求的提高，如何降低环保压力是所有原料药生产商必须克服的困难。

生物学方法制备2-酮基-L-古龙酸属于环境友好型的绿色制备工艺，可以克服化学合成法环境污染大的问题，因而是有吸引力和有前途的方法。如能实现葡萄糖一锅化生物催化产2-KLG，将会节约葡萄糖到山梨醇化学加氢、及两步发酵过程中多次灭菌的成本，有望实现节能和降低成本。但由于目前缺乏能够高效催化葡萄糖生成山梨醇的酶，由葡萄糖难以经山梨醇途径发酵高产2-KLG。

已报道了欧文氏菌、拉恩氏菌、沙雷氏菌、塔特姆氏菌及泛菌等多个菌属微生物中，葡萄糖可经过细胞膜上葡萄糖脱氢酶(glucose dehydrogenase，GDH)，葡萄糖酸脱氢酶(D-gluconate dehydrogenase，GADH)、2-酮基-D-葡萄糖酸脱氢酶(2-keto-D-gluconatedehydrogenase，2-KDGH)逐步氧化为葡萄糖酸(gluconic acid，GA)，2-酮基-D-葡萄糖酸(2-keto-D-gluconic acid，2-KDG)、2,5-二酮基-D-葡萄糖酸(2,5-diketo-D-gluconate，2,5-DKG)，该途径被称为2,5-DKG途径。棒杆菌来源的2,5-DKG还原酶(2,5-diketo-D-gluconate reductase，DKGR，EC 1.1.1.274)可以NADPH为辅因子，将2,5-DKG还原为2-KLG，从而将2,5-DKG途径延伸为葡萄糖(Glucose)→2,5-DKG→2-KLG(GDK)人工途径(参见图2)，实现葡萄糖直接合成2-KLG。1982年，日本盐野义制药将一株可积累2,5-DKG的欧文氏菌与棒杆菌组成GDK途径进行串联发酵，由葡萄糖产2-KLG的转化率为86％，比山梨醇二步法低。美国Anderson和瑞士Hardy实验室相继将棒杆菌DKGR导入欧文氏菌构成GDK工程菌，但葡萄糖到2-KLG转化率均不足49.4％，由于转化率低，没有实际工业应用价值，故有必要进行创新研究，开发转化率达到工业应用水平的一步发酵菌株。

发明内容

研究显示，利用GDK代谢途径、以葡萄糖为原料经由一步发酵法生产2-酮基-L-古龙酸是有工业化应用潜力的。本发明选择肠杆菌科细菌或至少含EC 1.1.99.4或EC1.1.1.274酶编码基因之一的微生物比如柠檬塔特姆氏菌作为底盘细胞，替换已有报道GDK途径中的PQQ依赖型膜结合葡萄糖脱氢酶为NAD(P)+依赖型，构建成为还原力平衡的GDK途径(rGDK途径)，葡萄糖到2-酮基-L-古龙酸理论转化率提升至100％。同时叠加竞争途径和副产物途径关键酶包括葡萄糖激酶、葡萄糖酸激酶、2-酮醛糖还原酶和PTS系统组分磷酸组氨酸搬运蛋白的敲除和增强2,5-二酮基-D-葡萄糖酸内运蛋白(或称内向转运蛋白，importer)表达，从而可以将葡萄糖到2-酮基-L-古龙酸实际转化率显著提升，有望为工业生产2-酮基-L-古龙酸的异源合成提供基础。具体而言，本发明包括如下技术方案。

一种构建2-酮基-L-古龙酸生产菌株的方法，所使用的原始宿主细胞中包含葡萄糖酸脱氢酶(简写为GADH)、2-酮基-D-葡萄糖酸脱氢酶(简写为2-KGDH)、2,5-二酮基-D-葡萄糖酸内运蛋白(简写为ARU92990和ARU92994)，该方法包括任意顺序的如下步骤中的一个以上、优选两个以上、三个以上、四个以上、五个以上、六个以上、七个或者八个：

1)中断细胞染色体中膜结合葡萄糖脱氢酶编码基因、比如PQQ依赖型膜结合葡萄糖脱氢酶(简写为mGDH)编码基因mgdh的部分序列或者全部序列；

2)中断细胞染色体中葡萄糖激酶(简写为Glk)编码基因；

3)中断细胞染色体中葡萄糖酸激酶(简写为Gntk)编码基因；

4)中断细胞染色体中2-酮醛糖还原酶(简写为2KR)编码基因和/或其同工酶(简写为2KR)编码基因；

5)在细胞中重组表达NAD(P)+依赖型葡萄糖脱氢酶(为了区别PQQ依赖型膜结合葡萄糖脱氢酶，本文中可以将NAD(P)+依赖型葡萄糖脱氢酶简写为bsGDH或者GDH)，优选以质粒形式表达GDH；

6)在细胞中重组表达NAD(P)H型2,5-二酮基-D-葡萄糖酸还原酶(简写为DKGR)，优选以质粒形式表达DKGR，从而使菌株具有以葡萄糖为原料从头合成发酵生产2-KLG的能力。其具有通过生物合成将葡萄糖依次转化为葡萄糖酸、2-酮基-D-葡萄糖酸、2,5-二酮基-D-葡萄糖酸、2-酮基-L-古龙酸的代谢途径即rGDK途径；

7)在细胞中过表达2,5-二酮基-D-葡萄糖酸(2,5-DKG)内运蛋白ARU92990和ARU92994，优选以质粒形式表达ARU92990和ARU92994。通过过表达宿主内源2,5-二酮基-D-葡萄糖酸内运蛋白(简称2,5-DKG内运蛋白)ARU92990、ARU92994，提高了宿主细胞内运2,5-DKG能力，增强菌株以葡萄糖为原料从头合成发酵生产2-酮基-L-古龙酸的能力；

8)中断细胞染色体中至少一种PTS组分编码基因，所述PTS组分编码基因选自ptsH基因、ptsG基因、ptsI基因、以及它们两种以上的组合。PTS组分编码基因比如ptsH基因的中断破坏了宿主细胞代谢途径中的PTS系统组分磷酸组氨酸搬运蛋白，实现减少原料葡萄糖通过PTS系统进入宿主代谢途径、增加原料进入GDK途径，从而大幅度提高细胞的2-KLG产率。

其中ptsG编码EII CB^Glc组分，是葡萄糖特异性组分；ptsH编码Hpr，ptsI编码EI组分，属于非葡萄糖特异性，还可与其他碳源PTS系统共享。参见Luo,Y.,T.Zhang and H.Wu.“The transport and mediation mechanisms of the common sugars in Escherichiacoli.”Biotechnol Adv.2014,32(5):905-919.。

上述内运蛋白ARU92990和ARU92994都是柠檬塔特姆氏菌来源的蛋白，它们的序列已经在NCBI数据库中公开，参见：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/ARU92990；https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/ARU92994。

经过上述基因工程改造，最终得到能够生产2-酮基-L-古龙酸、或者2-酮基-L-古龙酸生产能力增强的基因工程菌。

优选上述构建2-酮基-L-古龙酸生产菌株的方法包括步骤1)-7)中的一个以上步骤；或者至少包括步骤1)-7)中的一个以上步骤和步骤8)。

这样，经基因组改造后的工程菌便具有rGDK途径，如图2所示。该rGDK途径是还原力平衡的葡萄糖(G)→葡萄糖酸(GA)→2-酮基-D-葡萄糖酸(2-KDG)→2,5-二酮基-D-葡萄糖酸(2,5-DKG)→2-酮基-L-古龙酸(2-KLG)的代谢途径。

在一种实施方式中，所述PQQ依赖型膜结合葡萄糖脱氢酶是EC 1.1.5.2；所述葡萄糖激酶是EC 2.7.1.2；所述葡萄糖酸激酶是EC 2.7.1.12；所述2-酮醛糖还原酶是EC1.1.1.215；所述NAD(P)+依赖型葡萄糖脱氢酶是EC 1.1.1.118或EC 1.1.1.119，优选是芽胞杆菌比如枯草芽胞杆菌来源的EC 1.1.1.118；所述葡萄糖酸脱氢酶GADH是EC 1.1.99.3；所述2-酮基-D-葡萄糖酸脱氢酶2-KGDH是EC 1.1.99.4；所述2,5-二酮基-D-葡萄糖酸还原酶DKGR是EC 1.1.1.274，优选是棒杆菌来源的2,5-DKG还原酶EC 1.1.1.274；并且/或者所述2,5-二酮基-D-葡萄糖酸内运蛋白是塔特姆氏菌比如柠檬塔特姆氏菌来源的ARU92990和ARU92994(即ARU92990和ARU92994)。

上述步骤中，通过将GDK途径中PQQ依赖型mGDH替换为NAD(P)+型GDH，能防止葡萄糖到葡萄糖酸这一步的还原力浪费，可构建成为还原力平衡的葡萄糖→2,5-DKG→2-KLG人工途径，以便实现胞内辅因子NADP+/NADPH的循环，平衡还原力。

上述2-酮醛糖还原酶(2KR)基因和/或2KR同工酶基因的中断可有利于实现在菌株中进行2-KDG、2,5-DKG或2-KLG积累。

上述步骤中PQQ依赖型膜结合葡萄糖脱氢酶mGDH编码基因mgdh的中断比如敲除/缺失、葡萄糖激酶基因Glk和葡萄糖酸激酶基因GntK的中断比如敲除/缺失、2-酮醛糖还原酶(2KR)和/或2KR同工酶基因的中断比如敲除/缺失、ptsH基因的中断比如敲除/缺失、ptsG基因的中断比如敲除/缺失、ptsI基因的中断比如敲除/缺失可以通过基因编辑技术实施。

优选地，上述基因编辑技术可以是CRISPR-Cas9系统。

本发明所使用的原始宿主细胞可以属于肠杆菌科，选自塔特姆氏菌属(Tatumella)、欧文氏菌属、肠杆菌属、葡糖杆菌属、泛菌属(Pantoea)、拉恩氏菌属、沙雷氏菌属。该原始宿主细胞具有葡萄糖脱氢酶和/或葡萄糖酸脱氢酶和/或2-酮基-D-葡萄糖酸脱氢酶，参见图3，其葡萄糖分解代谢途径中可以具有PTS系统(PTS System)。本发明所使用的宿主细胞还可以属于醋酸菌科、罗丹诺杆菌科(Rhodanobacteraceae)、丛毛单胞菌科和棒杆菌科、以及可以用任意天然或经过改造不发酵葡萄糖的微生物，优选该宿主细胞具有膜结合的葡萄糖酸脱氢酶或2-酮基-D-葡萄糖酸脱氢酶两种脱氢酶之一，优选的同时含有上述两种膜结合脱氢酶。

在现有报道中，葡萄糖-2,5-DKG转化效率最高的菌株是柠檬塔特姆氏菌(Tatumella citrea)。因此，优选上述宿主细胞可以选自塔特姆氏菌属，优选是柠檬塔特姆氏菌(Tatumella citrea)，更优选柠檬塔特姆氏菌DSM13699(Tatumella citreaDSM13699)。

关于柠檬塔特姆氏菌(Tatumella citrea DSM13699)，可参见下述文献的描述：Sonoyama,T.,et al.,“FACULTATIVELY ANAEROBIC-BACTERIA SHOWING HIGHPRODUCTIVITIES OF 2,5-DIKETO-D-GLUCONATE FROM D-GLUCOSE.”Agricultural and Biological Chemistry.1988,52(3):667-674.

Kageyama,B.,et al.,“Pantoea punctata sp.nov.,Pantoea citrea sp.nov.,and Pantoea terrea sp.nov.isolated from fruit and soil samples”.Int J Syst Bacteriol.1992,42(2):203-210.以及

Brady,C.L.,et al.,“Transfer of Pantoea citrea,Pantoea punctata andPantoea terrea to the genus Tatumella emend.as Tatumella citrea comb.nov.,Tatumella punctata comb.nov and Tatumella terrea comb.nov and description ofTatumella morbirosei sp nov.”Int J Syst Evol Microbiol.2010,60:484-494.

上述2,5-二酮基-D-葡萄糖酸内运蛋白可以选自ARU92990和ARU92994。

优选地，上述菌株中ARU92990或者ARU92994编码基因由Plac启动子控制表达。

在一种实施方式中，Plac启动子和ARU92990编码基因或者ARU92994编码基因位于低拷贝质粒上，优选作为复制子的低拷贝质粒是pSC101系列质粒，更优选是pMW118质粒。

优选地，上述菌株中2,5-二酮基-D-葡萄糖酸还原酶DKGR(比如EC 1.1.1.274)编码基因由Ptrc启动子控制表达。

上述菌株中NAD(P)+依赖型葡萄糖脱氢酶GDH(比如EC 1.1.1.118或EC1.1.1.119)编码基因和2,5-二酮基-D-葡萄糖酸还原酶DKGR(比如EC 1.1.1.274)编码基因同时由Ptrc启动子控制表达。

在一种实施方式中，Ptrc启动子和NAD(P)+依赖型葡萄糖脱氢酶GDH(比如EC1.1.1.118或EC 1.1.1.119)编码基因以及2,5-二酮基-D-葡萄糖酸还原酶DKGR(比如EC1.1.1.274)编码基因位于高拷贝质粒上，优选作为复制子的高拷贝质粒是pBR322系列质粒，更优选是pTrc99k质粒。

本发明的第二个方面提供了一种2-酮基-L-古龙酸生产菌株，其通过上述方法构建而成。

作为一个实施例，所述2-酮基-L-古龙酸生产菌株，其原始菌株为柠檬塔特姆氏菌DSM13699，基因型为DSM13699(ΔmgdhΔglkΔgntkΔtkrA1ΔtkrB1ΔtkrB2)/pTKDG/pMWAB，在本文中命名为DCL006(pTKDG+pMWAB)；或者DSM13699(ΔmgdhΔglkΔgntkΔtkrA1ΔtkrB1ΔtkrB2ΔptsH)/pTKDG/pMWAB，在本文中命名为DW002(pTKDG+pMWAB)；或者DSM13699(ΔmgdhΔglkΔgntkΔtkrA1ΔtkrB1ΔtkrB2ΔptsG)/pTKDG/pMWAB，在本文中命名为DW001(pTKDG+pMWAB)；或者DSM13699(ΔmgdhΔglkΔgntkΔtkrA1ΔtkrB1ΔtkrB2ΔptsI)/pTKDG/pMWAB，在本文中命名为DW003(pTKDG+pMWAB)，其中mgdh是PQQ依赖型膜结合葡萄糖脱氢酶EC 1.1.5.2编码基因；glk是葡萄糖激酶EC 2.7.1.2编码基因；gntk是葡萄糖酸激酶EC 2.7.1.12编码基因；tkrA1是柠檬塔特姆氏菌来源的一种2-酮醛糖还原酶同工酶的编码基因；tkrB1是柠檬塔特姆氏菌来源的一种2-酮醛糖还原酶同工酶的编码基因；tkrB2是柠檬塔特姆氏菌来源的另一种2-酮醛糖还原酶同工酶的编码基因；ptsH是柠檬塔特姆氏菌来源的磷酸组氨酸搬运蛋白编码基因；pTKDG是包含Ptrc启动子、NAD(P)+依赖型葡萄糖脱氢酶EC 1.1.1.118编码基因和2,5-二酮基-D-葡萄糖酸还原酶EC 1.1.1.274编码基因的pBR322系列质粒；pMWAB是包含Plac启动子、ARU92990编码基因和ARU92994编码基因的pSC101系列质粒。

本发明的第三个方面提供了上述2-酮基-L-古龙酸生产菌株在制备2-酮基-L-古龙酸中的应用。

具体而言，通过2-酮基-L-古龙酸生产菌在以葡萄糖、或者果糖与葡萄糖混合物为主要碳源的培养基中发酵来生产2-酮基-L-古龙酸，即“一步发酵法”实现2-酮基-L-古龙酸的体内从头合成。

对于中断细胞染色体中ptsH基因所得的2-酮基-L-古龙酸生产菌株，优选使用以果糖与葡萄糖混合物为主要碳源的培养基来发酵，克服因基因ptsH中断造成菌体对于葡萄糖利用度降低的影响。

在一种优选的实施方式中，上述应用是以葡萄糖为底物，以2-酮基-L-古龙酸生产菌菌体进行生物催化来生产2-酮基-L-古龙酸，即通过菌体酶系“一锅法”催化实现2-酮基-L-古龙酸的体外生物合成。

相比目前工业中应用的山梨醇途径，本发明构建的2-酮基-L-古龙酸生产菌可以经由rGDK代谢途径通过“一步发酵法”或称“一锅法”以葡萄糖为原料生产2-酮基-L-古龙酸，简化了现有的化学合成+两步发酵的多步骤生产工艺，降低了生产成本。相比已报道的从头合成2-酮基-L-古龙酸途径的工程菌株，本发明构建的菌株在发酵和全细胞催化条件下都明显提高了葡萄糖转化为2-酮基-L-古龙酸的转化率，通过非发酵法(全细胞催化法)可实现葡萄糖到2-KLG转化率接近100％，具有工业化开发和应用前景。

附图说明

图1显示了现有技术的经由山梨醇途径以葡萄糖为原料生产2-酮基-L-古龙酸的工艺路线。该路线包括化学加氢工序和微生物两步发酵工序，图中，SLDH：sorbitoldehydrogenase山梨醇脱氢酶；SDH：sorbose dehydrogenase，山梨糖脱氢酶；SNDH：sorbosone dehydrogenase，山梨酮脱氢酶。

图2显示了本发明所采用的经由GDK代谢途径以葡萄糖为原料一步发酵法生产2-酮基-L-古龙酸的生物合成工艺路线。图中，GDH：glucose dehydrogenase，葡萄糖脱氢酶；GADH：D-gluconate dehydrogenase，葡萄糖酸脱氢酶；2-KDGH：2-keto-D-gluconatedehydrogenase，2-KDG脱氢酶；DKGR：2,5-diketo-D-gluconate reductase，2,5-DKG还原酶。

图3显示了本发明构建的塔特姆氏菌工程菌的葡萄糖代谢途径示意图。

图4显示了的柠檬塔特姆氏菌Tatumella citrea DSM13699在mgdh敲除前后的基因型鉴定PCR琼脂糖电泳照片。图中，M：Marker；1：空白对照；2：DSM 13699野生型；3：DSM13699mgdh基因中氯霉素抗性基因的插入验证；4：DCL001 mgdh基因中氯霉素抗性基因的消除验证

图5显示了质粒pTKDG的图谱结构。其中Ptrc：Ptrc启动子序列；DKGR：DKGR编码基因序列；bsGDH：bsGDH编码基因序列；kan：卡那霉素抗性基因序列；pBR322 origin：pBR322复制子复制起始位点。

图6显示了菌株DCL001(pTKDG)在摇瓶分批发酵过程中葡萄糖的消耗(图A)，以及产物GA、2-KDG、2,5-DKG和2-KLG的产量(图B)。(A)菌株生长和耗糖曲线；(B)产物生成曲线，其中□表示培养基中葡萄糖浓度。○表示菌液OD600。■表示培养基中2-KLG浓度。三个平行实验取平均值。

图7显示了菌株DCL008(pTKDG)在摇瓶分批发酵过程中葡萄糖的消耗(图A)，以及产物GA、2-KDG、2,5-DKG和2-KLG的产量(图B)。(A)菌株生长和耗糖曲线；(B)产物生成曲线，其中□表示培养基中葡萄糖浓度。○表示菌液OD600。■表示培养基中2-KLG浓度。三个平行实验取平均值。

图8显示了柠檬塔特姆氏菌Tatumella citrea DSM13699中2KR预测和酶活检测结果。其中图A-D显示的是四个预测得到2KR氨基酸序列与E.herbicola中2KR序列的对比；图E是预测的2KR酶活检测结果。

图9显示了菌株DCL006(pTKDG)在摇瓶分批发酵过程中葡萄糖的消耗(图A)，以及产物GA、2-KDG、2,5-DKG和2-KLG的产量(图B)。(A)菌株生长和耗糖曲线；(B)产物生成曲线，其中□表示培养基中葡萄糖浓度。○表示菌液OD600。■表示培养基中2-KLG浓度。三个平行实验取平均值。

图10显示了质粒pMWAB的图谱结构。其中，Plac：Plac启动子序列；ARU92990：ARU92990编码基因序列；ARU92994：ARU92994编码基因序列；beta-lactamase：氨苄青霉素抗性基因序列；pSC101 origin：pSC101复制子复制起始位点。

图11显示了菌株DCL006(pTKDG+pMWAB)在摇瓶分批发酵过程中葡萄糖的消耗(图A)，以及产物GA、2-KDG、2,5-DKG和2-KLG的产量(图B)。(A)菌株生长和耗糖曲线；(B)产物生成曲线，其中□表示培养基中葡萄糖浓度。○表示菌液OD600。■表示培养基中2-KLG浓度。三个平行实验取平均值。

图12显示了DSM13699和DCL006中检测的各PTS组分基因(ptsH、ptsG、ptsI、crr)敲除后菌株生长表型。三个平行实验取平均值。

图13显示了菌株DW001(pTKDG+pMWAB)在摇瓶分批发酵过程中葡萄糖的消耗(图A)，以及产物GA、2-KDG、2,5-DKG和2-KLG的产量(图B)。(A)菌株生长和耗糖曲线；(B)产物生成曲线，其中□表示培养基中葡萄糖浓度。○表示菌液OD600。■表示培养基中2-KLG浓度。三个平行实验取平均值。

图14显示了菌株DW003(pTKDG+pMWAB)在摇瓶分批发酵过程中糖的消耗(图A)，以及产物GA、2-KDG、2,5-DKG和2-KLG的产量(图B)。(A)菌株生长和耗糖曲线；(B)产物生成曲线，其中□表示培养基中葡萄糖浓度，Δ表示培养基中果糖浓度。○表示菌液OD600。■表示培养基中2-KLG浓度。三个平行实验取平均值。

图15显示了菌株DW002(pTKDG+pMWAB)在摇瓶分批发酵过程中糖的消耗(图A)，以及产物GA、2-KDG、2,5-DKG和2-KLG的产量(图B)。(A)菌株生长和耗糖曲线；(B)产物生成曲线，其中□表示培养基中葡萄糖浓度，Δ表示培养基中果糖浓度。○表示菌液OD600。■表示培养基中2-KLG浓度。三个平行实验取平均值。

图16显示了菌株DW002(pTKDG+pMWAB)在7.5L发酵罐连续发酵过程中葡萄糖的消耗以及产物GA、2-KDG、2,5-DKG和2-KLG的产量。其中□表示培养基中葡萄糖浓度，■表示培养基中2-KLG浓度。

图17显示了菌株DCL006(pTKDG+pMWAB)在3L发酵罐全细胞催化过程中葡萄糖的消耗以及产物GA、2-KDG、2,5-DKG和2-KLG的产量。其中□表示培养基中葡萄糖浓度，■表示培养基中2-KLG浓度。

图18显示了菌株DW002(pTKDG+pMWAB)在3L发酵罐全细胞催化过程中葡萄糖的消耗以及产物GA、2-KDG、2,5-DKG和2-KLG的产量。其中□表示培养基中葡萄糖浓度，■表示培养基中2-KLG浓度。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。

本文中涉及到多种物质的添加量、含量及浓度，其中所述的百分含量，除特别说明外，皆指质量百分含量。

为了增强塔特姆氏菌生物合成抗坏血酸中间体2-酮基-L-古龙酸的能力，本发明通过对塔特姆氏菌的葡萄糖代谢途径中的酶系进行改变，改变了塔特姆氏菌的葡萄糖代谢途径。优选方案包括在2,5-DKG途径中用NAD(P)+型葡萄糖脱氢酶(GDH)替换PQQ依赖型mGDH，重组表达棒杆菌来源NAD(P)H型2,5-DKG还原酶DKGR，使宿主细胞具有以葡萄糖为原料，从头合成发酵生产2-KLG的能力；再中断宿主细胞中葡萄糖激酶(Glk)、葡萄糖酸激酶(GntK)、2-酮醛糖还原酶(2KR)和/或2KR同工酶；增强表达2,5-DKG内运蛋白ARU92990和ARU92994。中断ptsH基因，以便破坏葡萄糖代谢途径中的葡萄糖特异性PTS系统组分磷酸组氨酸搬运蛋白；或中断ptsG，以便破坏葡萄糖代谢途径中的PTS系统EII CB^Glc组分；或中断ptsI，以便破坏糖代谢途径中的PTS系统EI组分。该葡萄糖代谢途径的改变达到了提高由葡萄糖合成2-酮基-L-古龙酸转化率的目的。

术语“中断(disruption)”，是某一个基因的功能丧失或者大幅度下调，包括该基因的敲除或缺失，一般可以通过敲除、插入失活、移码突变、引入终止密码子提前翻译终止等常规的基因操作手段实现。

在本文中，有时为了描述简便，会将酶比如葡萄糖脱氢酶GDH蛋白质名称与其编码基因(DNA)名称混用，本领域技术人员应能理解它们在不同描述场合表示不同的物质。例如，对于葡萄糖脱氢酶(基因)，用于描述葡萄糖脱氢酶功能或类别时，指的是GDH蛋白质；在作为一种基因描述时，指的是编码该酶GDH的基因gdh，以此类推，这是本领域技术人员容易理解的。

本发明通过遗传工程改造，构建具有还原力平衡的GDK途径、中间体内运增强和副产物途径催化酶缺失的组合，获得大幅提高葡萄糖到2-酮基-L-古龙酸转化率的工程菌株，在发酵和全细胞催化条件下达到明显更高的葡萄糖至2-酮基-L-古龙酸转化率。本发明构建的塔特姆氏菌工程菌的葡萄糖代谢途径如图3所示。

应理解，在本发明的2-酮基-L-古龙酸生产菌构建的具体操作中，步骤1)、步骤2)、步骤3)、步骤4)、步骤5)、步骤6)、步骤7)和步骤8)的排序并非完全根据阿拉伯数字由前到后地固定不变，它们可以交叉、颠倒地操作，只要每个步骤能实现各自的功能、完成宿主细胞基因型的定向改变即可。例如，在一种可选的具体实施方式中，构建2-KLG生产菌株的方法可以包括如下步骤：

1)敲除肠杆菌比如柠檬塔特姆氏菌染色体中PQQ依赖型膜结合葡萄糖脱氢酶mGDH编码基因mgdh；以质粒形式表达枯草芽胞杆菌来源NAD(P)+型葡萄糖脱氢酶GDH，获得工程菌株a’；

2)以步骤1)中获得的工程菌株a’为宿主细胞，重组表达棒杆菌来源NAD(P)H型2,5-DKG还原酶DKGR，获得工程菌A’，其具有通过生物合成将葡萄糖依次转化为葡萄糖酸、2-酮基-D-葡萄糖酸、2,5-二酮基-D-葡萄糖酸、2-酮基-L-古龙酸的代谢途径；

3)敲除工程菌A’基因组中的葡萄糖激酶基因、葡萄糖酸激酶基因，得到工程菌B’；

4)敲除工程菌B’基因组中的2-酮醛糖还原酶基因和/或其同工酶基因，得到工程菌C’；

5)将2,5-二酮基-D-葡萄糖酸内运蛋白ARU92990和ARU92994编码基因导入工程菌C’，使工程菌C’过表达2,5-二酮基-D-葡萄糖酸内运蛋白ARU92990和ARU92994，得到工程菌D’；

6)以步骤5)中获得的工程菌D’为宿主细胞，失活或敲低其染色体中ptsH、ptsG或者ptsI基因中的至少一种例如ptsH基因，得到工程菌E’。

当本发明构建的2-酮基-L-古龙酸生产菌作为生物催化剂用于生产2-酮基-L-古龙酸时，本发明的菌体形式包括存活菌体和死亡菌体，包括冻融的菌体、固定化的菌体。当采用微生物发酵来生产2-酮基-L-古龙酸时，仅需要发酵就可以作为“微型生物工厂”将培养液中作为碳源的葡萄糖通过代谢转化为2-酮基-L-古龙酸。

实施例

材料和方法

实施例中的全基因合成、引物合成及测序皆由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。

实施例中的分子生物学实验包括质粒构建、酶切、连接、感受态细胞制备、转化、培养基配制等等，主要参照《分子克隆实验指南》(第三版)，J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔(美)编著，黄培堂等译，科学出版社，北京，2002)进行。必要时可以通过简单试验确定具体实验条件。

PCR扩增实验根据质粒或DNA模板供应商提供的反应条件或试剂盒说明书进行。必要时可以通过简单试验予以调整。

HPLC测定条件：

葡萄糖酸、GA、2-KDG、2,5-DKG和2-KLG的含量测定使用Agilent technologies1200高校液相色谱仪，色谱柱为HPX-87H(Bio-Rad,300×7.8mm)，流动相为5mM H₂SO₄，流速0.6ml/min，紫外检测器(210nm)和示差检测器，温度30℃。

实施例1柠檬塔特姆氏菌中PQQ依赖型膜结合葡萄糖脱氢酶基因mgdh敲除

使用PCR-Targeting方法，缺失柠檬塔特姆氏菌Tatumella citrea DSM13699(购自德国微生物菌种保藏中心DSMZ(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen)，下文中有时简称为T.citrea DSM13699或者DSM13699)中PQQ依赖型膜结合葡萄糖脱氢酶mGDH编码基因mgdh，获得菌株DCL001，其基因型为DSM13699(Δmgdh)。

主要步骤包括：在mgdh基因中通过同源重组插入FRT位点和氯霉素抗性基因，并替换mgdh基因部分序列，使用引物进行PCR验证，插入失活成功的菌株，再转入pCP20质粒，消除氯霉素抗性基因，使用引物进行PCR验证，成功消除氯霉素抗性片段。

具体操作包括：根据文献(Neijssel,O.M.,et al.,Physiological significanceand bioenergetic aspects of glucose dehydrogenase.Antonie Van Leeuwenhoek,1989.56(1):p.51-61.和Smith,L.D.,et al.,Purification and characterization ofglucose dehydrogenase from the thermoacidophilic archaebacterium Thermoplasmaacidophilum.Biochem J,1989.261(3):p.973-7.)已报道的mgdh序列，设计简并引物GDH-F/GDH-R进行DSM 13699mgdh基因扩增。以DSM 13699基因组为模板扩增到0.5kb片段，跑胶回收片段后，将该片段通过TA克隆连入TAKARA公司pMD18T载体，得到pMD18T-GDH质粒。以pKD-Muarm-CM质粒为模板，使用引物Cm-FRT-F/Cm-FRT-R扩增得到FRT-Cm-FRT片段，跑胶回收片段后使用EcoRV和HpaI双酶切，并清洁回收酶切片段；使用EcoRV酶切pMD18T-GDH质粒，并清洁回收酶切后的质粒骨架片段；上述两片段使用T4 DNA连接酶连接，转化DH5α，获得质粒pMD-GDH-Cm。使用SalI和SacI双酶切得到两端为mgdh同源臂，中间夹带Cm抗性基因的片段GDH-Cm。

PCR体系和条件如表1.1、表1.2、表1.3所示，所使用PCR酶和试剂为TOYOBO公司产品；酶切反应所使用限制性核酸内切酶及相关试剂为Fermentas公司产品，酶切反应体系如表1.4所示，条件为37℃水浴反应1小时；连接反应所使用T4 DNA连接酶和相关试剂为TAKARA公司产品，连接反应体系如表1.5所示，条件为16℃反应过夜；胶回收和清洁回收所用试剂盒为Axygen DNA凝胶回收试剂盒，实验方法同试剂盒说明书。

表1.1 KOD-NEO-plus PCR体系(50μL)

试剂	体积(μL)
		KOD-NEO-plus buffer(10x)	5
Primer-F(20nm)	1.5
		Primer-R(20nm)	1.5
Template	2
		H₂O	31
Mg²⁺(25nm)	3
		dNTP	5
KOD-NEO-plus	1

表1.2 PCR反应条件

表1.3基因mgdh敲除步骤所用引物序列

引物名称	序列5’-3’
		GDH-F	TCWACCCGTGARCCDTCAGG
GDH-R	GGACGGAARGTCAGYTCAG
		Cm-FRT-F	AGAGCTCGTTAACGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC
Cm-FRT-R	CGCTAGCG ATAT CCATGGGAATTAGCCATGGTC
		gdh-test-up	ACCAGCTGACCAGTCACACGGTTC
gdh-test-dn	TAACTACTCAACCCGCGAGCCGTC

表1.4酶切反应体系

表1.5连接反应体系

试剂	体积(μL)
		10× T4 DNA Ligase Buffer	1
DNA片段	5
		质粒骨架片段	3
T4 DNA Ligase	1

制备DSM 13699的电转感受态方法同《分子克隆实验指南》中大肠杆菌电转化感受态制备方法，电转入pKD46质粒。使用10mM阿拉伯糖诱导条件下制备电转感受态，转化片段GDH-Cm，涂布氨苄青霉素+氯霉素双抗LB平板在30℃进行筛选。长出的转化子在37℃条件下培养，丢除质粒pKD46，得到菌株CIBTS1404。

为消除CIBTS1404中的氯霉素抗性片段，将pCP20质粒电转至CIBTS1404，涂布氨苄青霉素+氯霉素双抗LB平板，30℃培养长出菌落后，挑单克隆至LB液体培养基37℃培养过夜，菌液稀释十倍涂布无抗LB平板，37℃培养，克隆长出后，挑单克隆分别划氯霉素、氨苄青霉素和无抗LB平板，验证氯霉素抗性片段的消除以及pCP20的丢除。使用引物gdh-test-up/gdh-test-dn进行PCR验证，成功消除氯霉素抗性片段的转化子可扩增得到575bp片段。正确的转化子命名为DCL001。

该菌株的基因型PCR鉴定结果如图4所示。结果表明，在柠檬塔特姆氏菌DSM13699中成功缺失了柠檬塔特姆氏菌DSM13699 mgdh基因，获得菌株DCL001。

实施例2柠檬塔特姆氏菌中重组表达bsGDH和DKGR

构建质粒pTKDG，以Ptrc启动子表达枯草芽胞杆菌来源的NAD(P)+依赖型GDH和棒杆菌来源NAD(P)H依赖型2,5-DKG还原酶DKGR。电转化pTKDG进入DCL001获得菌株DCL001(pTKDG)，其基因型为DSM13699(Δmgdh)/pTKDG。

主要步骤包括：通过PCR扩增和基因合成的方法，获得枯草芽胞杆菌来源的NAD(P)+依赖型bsGDH的基因序列和棒杆菌来源NAD(P)H依赖型2,5-DKG还原酶DKGR。使用酶切连接方法，分别将DKGR和bsGDH基因序列构建至pTrc99k质粒(购自BioVector质粒载体菌种细胞基因保藏中心)上，以pTrc99k质粒上Ptrc启动子表达DKGR和bsGDH。

具体操作包括：带有两个点突变F22Y/A272G的DKGR突变体编码基因dkr由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，使用DKGR-N-up/DKGR-N-dn分别为上下引物扩增得到DKGR基因片段864bp，胶回收目的片段。以Bacillus subtilis(strain 168)为模板，使用bsGDH-N-up/bsGDH-N-dn分别为上下引物扩增得到bsGDH基因片段819bp，胶回收目的片段。使用NcoI和EcoRI双酶切DKGR基因片段，清洁回收；使用EcoRI和HindIII双酶切bsGDH基因片段，清洁回收；使用NcoI和HindIII双酶切质粒pTrc99k，胶回收质粒骨架片段。上述三片段使用T4DNA连接酶连接，转化DH5α，得到使用Ptrc表达DKGR和bsGDH的质粒pTKDG。

上述PCR反应、酶切反应、连接反应和胶回收、清洁回收所用试剂(盒)和条件同实施例1中所列，其中PCR扩增所用引物如表2.1所示。

表2.1质粒pTKDG构建所用引物序列

成功构建质粒pTKDG，其图谱结构如图5所示。将质粒pTKDG电转化入菌株DCL001，得到菌株DCL001(pTKDG)。

实施例3菌株DCL001(pTKDG)分批发酵测试

按表3.1成分配制发酵培养基，以NaOH调节pH为6.0，分装250mL摇瓶，分装体积100mL。121℃灭菌20min。

表3.1发酵培养基配方

发酵菌株DCL001(pTKDG)划线卡那霉素抗性LB平板，30℃过夜培养。分别挑取3个单克隆至LB试管，加卡那霉素抗生素，过夜30℃培养，作为种子液。将种子液以1％v/v接种量接种发酵培养基，28℃，250rpm条件进行发酵。培养至OD₆₀₀为0.6～0.8，加入终浓度1mM的IPTG进行诱导，继续发酵至72h。结果如图6所示。

发酵实验表明，DCL001(pTKDG)2-KLG的产量低于1g/L。且只在发酵过程中有少量积累，最终又被消耗。可能的原因是DSM 13699中的葡萄糖和葡萄糖酸代谢途径的存在导致葡萄糖和葡萄糖酸被用于生长，2KR的存在使2-KLG最终也被消耗。

实施例4敲除内源葡萄糖激酶、葡萄糖酸激酶和分批发酵测试

由于宿主细胞中葡萄糖激酶Glk和葡萄糖酸激酶GntK的存在会消耗底物葡萄糖，使大多数葡萄糖进入糖酵解途径，用于生长。使用CRISPR-Cas9基因编辑方法依次敲除DCL001中Glk和GntK，减少葡萄糖和葡萄糖酸的消耗，得到菌株DCL008。电转化pTKDG进入DCL008，获得菌株DCL008(pTKDG)，其基因型为DSM13699(ΔmgdhΔglkΔgntk)/pTKDG。

主要步骤包括：参照文献(Jiang,Y.,et al.,“Multigene Editing in theEscherichia coli Genome via the CRISPR-Cas9 System.”Applied and environmental microbiology.2015,81(7):2506-2514.)中描述的CRISPR-Cas9基因编辑方法，将DCL001中Glk和GntK编码基因glk和gntk进行敲除，敲除方式为将glk和gntk基因编码序列完全缺失。获得改造菌株命名为DCL008，其基因型为DSM13699(ΔmgdhΔglkΔgntk)。

按照实施例1中所述方法，电转化质粒pTKDG进入DCL008，获得菌株DCL008(pTKDG)。

按照实施例3中所述方法，将所获得菌株DCL008(pTKDG)在发酵培养基(表3.1)中进行发酵测试。结果如图7所示。

发酵实验表明，菌株DCL008(pTKDG)2-KLG最终的产量约6.81±0.56g/L，但相较于60h时的产量(7.34±0.26g/L)有所降低，推测是2KR的作用使2-KLG被还原为艾杜糖酸。

实施例5 2-酮醛糖还原酶鉴定

2-酮醛糖还原酶(2KR)是已有报道的rGDK途径的重要副产物催化酶，根据已报道的草生欧文氏菌(Erwinia herbicola)中的两个2KR同工酶编码基因序列(tkrA和tkrB，分别编码2KR(A)和2KR(B))，在柠檬塔特姆氏菌中寻找疑似2KR编码基因。将相似度最高的几条序列扩增下来，得到一个疑似2KR(A)的基因序列(tkrA1)和三个疑似2KR(B)的基因序列(tkrB1，tkrB2，tkrB3)。将这四个基因分别克隆在pET-28a载体上并进行表达和酶活测定。

主要步骤包括：使用NCBI网站的tblastn功能(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ Blast.cgi)，在柠檬塔特姆氏菌基因组中，以草生欧文氏菌tkrA和tkrB氨基酸序列为query序列进行比对。分别获得tkrA和tkrB的相似序列。

设计引物如表5.1所示，扩增柠檬塔特姆氏菌疑似2KR编码基因tkrA1(SEQ ID NO:1)、tkrB1(SEQ ID NO:2)、tkrB2(SEQ ID NO:3)、tkrB3(SEQ ID NO:4)，并通过酶切连接构建至pET28a表达质粒，获得质粒pET28a-NT-tkrA1、pET28a-NT-tkrB1、pET28a-NT-tkrB2和pET28a-NT-tkrB3。

表5.1 PCR扩增预测的2KR编码基因所用引物序列

引物名称	序列5’-3’
		tkrA-up	ACGCATATGAAACCCCCGGTTATCG
tkrA-dn	CGCAAGCTTTTATTGTTGCTTCACCGAC
		tkrB1-up	AGCCATATGTCTTCATCCCTGGTG
tkrB1-dn	CGGAAGCTTTTATCAGGCTTTTGGTGTC
		tkrB2-up	AGCGG ATCCATGAAGCTGTTAAAACAAG
tkrB2-dn	ATTAAGCTTTTATCGGACCGGGGTAACTAAC
		tkrB3-up	ACGCATATGGCAAAGGTATCACTCGAG
tkrB3-dn	ATTAAGCTTTTAGTACAGCAGACGGGCAC

具体操作包括：以DSM 13699基因组为模板，使用tkrA-up/tkrA-dn、tkrB1-up/tkrB1-dn、tkrB2-up/tkrB2-dn、tkrB3-up/tkrB3-dn分别为上下引物，扩增得到978bp的基因片段tkrA1、945bp的基因片段tkrB1、927bp的基因片段tkrB2和1239bp的基因片段tkrB3，胶回收上述目的片段。使用NdeI和HindIII分别双酶切tkrA1、tkrB1、tkrB3基因片段和pET28a质粒，清洁回收后，使用T4 DNA连接酶连接，转化DH5α，得到质粒pET28a-NT-tkrA1、pET28a-NT-tkrB1、pET28a-NT-tkrB3。使用BamHI和HindIII双酶切tkrB2基因片段和pET28a质粒，清洁回收后，使用T4 DNA连接酶连接，转化DH5α，得到质粒pET28a-NT-tkrB2。

上述PCR反应、酶切反应、连接反应和胶回收、清洁回收所用试剂(盒)和条件同实施例1中所述。

按照实施例1中所述方法，分别电转化质粒pET28a-NT-tkrA1、pET28a-NT-tkrB1、pET28a-NT-tkrB2和pET28a-NT-tkrB3进入大肠杆菌BL21(DE3)菌株，获得重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a、BL21(DE3)/pET28a-NT-tkrA1、BL21(DE3)/pET28a-NT-tkrB1、BL21(DE3)/pET28a-NT-tkrB2和BL21(DE3)/pET28a-NT-tkrB3。

将BL21(DE3)/pET28a、BL21(DE3)/pET28a-NT-tkrA1、BL21(DE3)/pET28a-NT-tkrB1、BL21(DE3)/pET28a-NT-tkrB2和BL21(DE3)/pET28a-NT-tkrB3分别接种至LB试管，37℃过夜培养后，1％v/v转接至LB培养基，37℃培养至OD₆₀₀ 0.6～0.8后，加入终浓度为0.5mM的IPTG，28℃诱导5h。于4℃，5000rpm离心收集菌体，重悬于50mM Tris-HCl(pH7.0)缓冲液，重复洗涤两次，超声破碎后，于4℃，12000rpm离心10min，取上清液进行酶活反应测定。同时将上清液和沉淀制备蛋白样品，用于SDS-PAGE检测表达情况。

酶活测定体系：50mM Tris-HCl(pH7.0)缓冲液，100mM 2-KDG或10mM 2,5-DKG，0.2mM NADPH，以及50μl稀释到合适浓度的酶，反应体系为1ml。用分光光度计于340nm监测吸光度的变化。2KR酶活定义：25℃条件下，每分钟消耗1μmol NADPH所需要的酶量为1U。

根据酶活测定方法，我们分别以2-KDG和2,5-DKG为底物对2KR(A)、2KR(B)1、2KR(B)2和2KR(B)3这四个酶(分别对应于基因tkrA1、tkrB1、tkrB2和tkrB3)进行酶活测定，结果显示，2KR(A)以2-KDG为底物的酶活为9.30±0.40U/ml，以2,5-DKG为底物的酶活为13.90±2.32U/ml；2KR(B)1以2-KDG为底物的酶活为116.39±12.67U/ml，以2,5-DKG为底物的酶活为443.82±53.62U/ml；2KR(B)2以2-KDG为底物的酶活为10.46±0.43U/ml，以2,5-DKG为底物的酶活为7.56±0.90U/ml；2KR(B)3以2-KDG为底物的酶活为0.2U/ml，基本没有活力，以2,5-DKG为底物没有活力。因此，预测的四个疑似2KR的酶有三个确实存在2KR活性。结果如图8所示。

实施例6三个2KR同工酶敲除和分批发酵表型测试

使用CRISPR-Cas9基因编辑方法敲除菌株DCL008中验证的3个2KR编码基因tkrA1、tkrB1和tkrB2，得到菌株DCL006。电转化pTKDG进入DCL006，获得菌株DCL006(pTKDG)，其基因型为DSM13699(ΔmgdhΔglkΔgntkΔtkrA1ΔtkrB1ΔtkrB2)/pTKDG。在发酵培养基中进行摇瓶分批发酵测试。

主要步骤包括：

按照实施例4中所述方法，将菌株DCL008基因组中tkrA1、tkrB1和tkrB2基因进行敲除，获得改造菌株命名为DCL006，其基因型为DSM13699(ΔmgdhΔglkΔgntkΔtkrA1ΔtkrB1ΔtkrB2)。

按照实施例1中所述方法，电转化质粒pTKDG进入DCL006，获得菌株DCL006(pTKDG)。

按照实施例3中所述方法，将所获得菌株DCL006(pTKDG)在发酵培养基中进行发酵测试。

发酵测试结果为：菌株DCL006(pTKDG)在发酵72h时2-KLG的产量8.62±0.09g/L。与DCL008(pTKDG)相比，2-KLG未出现被消耗的情况，说明3个2-酮醛糖还原酶基因tkrA1、tkrB1和tkrB2有效减弱了这一趋势，实验结果如图9所示。

实施例7 2,5-DKG内运蛋白ARU92990、ARU92994过表达和分批发酵表型测试

实施例6中的实验结果表明，在DCL006菌株中，2,5-DKG到2-KLG的转化是限速步骤。根据背景研究显示，提高2,5-DKG内运蛋白(即2,5-二酮基-D-葡萄糖酸内运蛋白)ARU92990和ARU92994表达可以有效解决这一限速步骤。使用低拷贝质粒pMW118，以Plac启动子对柠檬塔特姆氏菌内源2,5-DKG内运蛋白基因ARU92990和ARU92994进行过表达，构建成为质粒pMWAB(图10)。电转化pMWAB进入DCL006(pTKDG)获得菌株DCL006(pTKDG+pMWAB)，其基因型为DSM13699(ΔmgdhΔglkΔgntkΔtkrA1ΔtkrB1ΔtkrB2)/pTKDG/pMWAB，在发酵培养基中进行摇瓶分批发酵测试。

主要步骤包括：

通过PCR扩增的方法，获得柠檬塔特姆氏菌内源2,5-DKG内运蛋白基因ARU92990和ARU92994。使用ClonExpress MultiS One Step Cloning Kit(南京诺唯赞生物科技有限公司)进行多片段组装，将ARU92990和ARU92994基因构建至pMW118质粒(NIPPON GENE)上，以Plac启动子表达ARU92990和ARU92994。

具体操作包括：以DSM 13699基因组为模板，使用ARU92990-F/ARU92990-R2为引物，扩增得到ARU92990基因片段约1.3kb，胶回收目的片段。以DSM 13699基因组为模板，使用ARU92994-F/ARU92994-R为引物，扩增得到ARU92994基因片段约1.3kb，胶回收目的片段。使用HindIII和EcoRI双酶切质粒pMW118，清洁回收。使用ClonExpress MultiS One StepCloning Kit(南京诺唯赞生物科技有限公司)将上述三片段进行组装，转化DH5α，得到质粒pMWAB。

表7.1质粒pMWAB构建所用引物序列

引物名称	序列5’-3’
		ARU92990-F	TCACACAGGAAACAGCTATGACCATGCAAAAATCACAGCCGGG
ARU92990-R2	GTATTCATAGCTGTTTCCTGTGTGATTATTTGGCATCATGAATAC
		ARU92994-F	TCACACAGGAAACAGCTATGAATACAAGCAGAAAACTGC
ARU92994-R	GTAAAACGACGGCCAGTGCCTTACTTTGCATCACCTTTCAG

按照实施例1中所述方法，电转化质粒pMWAB进入实施例6中菌株DCL006(pTKDG)，获得菌株DCL006(pTKDG+pMWAB)。

按照实施例3中所述方法，将所获得菌株DCL006(pTKDG+pMWAB)在发酵培养基中进行发酵测试。

发酵测试结果为：菌株DCL006(pTKDG+pMWAB)在72h时2-KLG的产量为11.23±0.56g/L。2-KLG的产量相较于DCL006(pTKDG)有明显上升，说明2,5-DKG内运蛋白ARU92990和ARU92994的过表达确实有效增强了2,5-DKG到2-KLG的合成。葡萄糖到2-KLG的质量转化率为44.9％，摩尔转化率为42％。实验结果如图11所示。

实施例8PTS系统组分敲除对柠檬塔特姆氏菌的葡萄糖、果糖利用表型影响

柠檬塔特姆氏菌中葡萄糖特异性PTS系统包括的酶有：磷酸烯醇式丙酮酸依赖性蛋白激酶I(基因ptsI编码)、磷酸组氨酸搬运蛋白(基因ptsH编码)以及酶II(Enzyme II，基因crr和ptsG编码)。本发明利用CRISPR-cas9系统分别对野生型DSM13699以及DCL006的葡萄糖PTS组分进行逐个敲除(以及一个ptsIcrr的组合敲除)，并在葡萄糖或果糖最小培养基中进行唯一碳源生长测试。

主要步骤包括：

按照实施例4中所述方法，在柠檬塔特姆氏菌DSM13699和DCL006中，将ptsG、ptsH、ptsI、crr或ptsIcrr共转录框进行分别敲除，分别获得各PTS组分单缺失的突变菌株。

将所得多个敲除菌株DSM13699和DCL006分别在以25g/L葡萄糖为碳源或10g/L果糖为碳源的M9N最小培养基中(M9N培养基为在《分子克隆指南》中所述M9培养基中加入0.02g/L烟酸)，进行唯一碳源生长测试。

发酵测试结果为：由于具有非PTS葡萄糖利用途径和完整的酮基葡萄糖代谢途径，在25g/L葡萄糖M9N培养基中，DSM13699的PTS各组分单缺失对DSM13699生长影响不明显。DCL006敲除了各PTS组分对葡萄糖利用有不同程度影响，特别是ptsI的敲除，完全消除了在葡萄糖唯一碳源中的生长；ptsH敲除使得菌体基本不能利用葡萄糖生长，ptsG对生长稍有影响。在果糖唯一碳源培养基中，ptsI组分敲除同样完全消除菌体的生长，但ptsH敲除对其生长影响不明显。

实验结果如表8.1和图12所示。

表8.1菌株DSM13699葡萄糖特异性PTS系统组分考察

实施例9 PtsG敲除菌分批发酵表型测试

将敲除ptsG基因后DCL006的菌株命名为DW001，其基因型为DSM13699(ΔmgdhΔglkΔgntkΔtkrA1ΔtkrB1ΔtkrB2ΔptsG)。电转化pTKDG和pMWAB质粒进入DW001菌株，获得菌株DW001(pTKDG+pMWAB)，其基因型为DSM13699(ΔmgdhΔglkΔgntkΔtkrA1ΔtkrB1ΔtkrB2ΔptsG)/pTKDG/pMWAB。在发酵培养基中进行摇瓶分批发酵测试。

主要步骤包括：

按照实施例1中所述方法，电转化质粒pTKDG和pMWAB进入DW001，获得菌株DW001(pTKDG+pMWAB)。

按照实施例3中所述方法，将所获得菌株DW001(pTKDG+pMWAB)在发酵培养基中进行发酵测试。

发酵测试结果为：在25g/L葡萄糖培养基中，ptsG敲除可以显著提升葡萄糖转化率，经过96小时发酵，DW001(pTKDG+pMWAB)的2-KLG产量达到15.4g/L，2-KLG摩尔转化率提升至58.4％。实验结果如图13所示。

实施例10PtsI敲除菌在混合碳源中分批发酵表型

将敲除ptsI基因后DCL006的菌株命名为DW003，其基因型为DSM13699(ΔmgdhΔglkΔgntkΔtkrA1ΔtkrB1ΔtkrB2ΔptsI)。电转化pTKDG和pMWAB质粒进入DW003菌株，获得菌株DW003(pTKDG+pMWAB)，其基因型为DSM13699(ΔmgdhΔglkΔgntkΔtkrA1ΔtkrB1ΔtkrB2ΔptsI)/pTKDG/pMWAB。在发酵培养基中进行摇瓶分批发酵测试。

主要步骤包括：

按照实施例1中所述方法，电转化质粒pTKDG和pMWAB进入DW003，获得菌株DW003(pTKDG+pMWAB)。

按照实施例3中所述方法，将所获得菌株DW003(pTKDG+pMWAB)在发酵培养基中进行发酵测试，其中发酵所用碳源由25g/L葡萄糖改为25g/L葡萄糖+10g/L果糖。

发酵测试结果为：ptsI的敲除同时影响菌体利用葡萄糖和果糖进行生长，在25g/L葡萄糖+10g/L果糖的混合碳源培养基中，菌体生长仍然较慢，经过144小时，DW003(pTKDG+pMWAB)的2-KLG产量达到11.8g/L，葡萄糖到2-KLG摩尔转化率55％。实验结果如图14所示。

实施例11 PtsH敲除菌在混合碳源中分批发酵表型

将敲除ptsH基因后DCL006的菌株命名为DW002，其基因型为DSM13699(ΔmgdhΔglkΔgntkΔtkrA1ΔtkrB1ΔtkrB2ΔptsH)。电转化pTKDG和pMWAB质粒进入DW002菌株，获得菌株DW002(pTKDG+pMWAB)，其基因型为DSM13699(ΔmgdhΔglkΔgntkΔtkrA1ΔtkrB1ΔtkrB2ΔptsH)/pTKDG/pMWAB。在发酵培养基中进行摇瓶分批发酵测试。

主要步骤包括：

按照实施例1中所述方法，电转化质粒pTKDG和pMWAB进入DW002，获得菌株DW002(pTKDG+pMWAB)。

按照实施例3中所述方法，将所获得菌株DW002(pTKDG+pMWAB)在发酵培养基中进行发酵测试，其中发酵所用碳源由25g/L葡萄糖改为25g/L葡萄糖+10g/L果糖。

发酵测试结果为：由于ptsH的敲除显著影响菌体利用葡萄糖进行生长，需在培养基中加入果糖为碳源供菌体生长。25g/L葡萄糖+10g/L果糖的混合碳源培养基中，ptsH敲除可以大幅度提升葡萄糖转化率，经过96小时发酵，DW002(pTKDG+pMWAB)的2-KLG产量达到18g/L，摩尔转化率提升至72％。实验结果如图15所示。

实施例12发酵罐中补料发酵生产2-KLG

使用实施例11中构建的菌株DW002(pTKDG+pMWAB)，在7.5L发酵罐中进行补料发酵生产2-KLG。

主要步骤包括：

配制种子培养基：

12g/L KH₂PO₄，4g/L K₂HPO₄，2g/L MgSO₄·7H₂O，2g/L大豆蛋白胨，0.1g/L柠檬酸钠，5g/L果糖，1g/L(NH₄)₂SO₄，0.02g/L烟酸，FeCl₃·6H₂O(5mL/L，0.4g/L母液)，微量元素(5mL/L，母液如下：0.58g/L ZnSO₄·7H₂O，0.34g/L MnSO₄·H₂O，0.48g/L Na₂MoO₄·2H₂O)。以20％NaOH调节pH为7.0，灭菌后，接种，加入kan和amp抗生素，29℃，220rpm培养过夜。

发酵方法：

按表3.1配制发酵培养基4L，其中发酵所用碳源由25g/L葡萄糖改为25g/L葡萄糖+25g/L果糖，灭菌后接入333mL过夜培养的种子液。29℃发酵，用20％NaOH控制pH为6.0。调节搅拌速率、空气流速保证溶氧大于30％。发酵至4.5h，加入终浓度1mM的IPTG诱导。当初糖耗尽时进行补料，葡萄糖母液500g/L，预先115℃，15min灭菌。

发酵测试结果如图16所示：96小时2-KLG浓度达到167g/L，葡萄糖到2-KLG摩尔转化率65.9％。

实施例13全细胞催化法高效合成2-KLG

使用实施例7中构建的菌株DCL006(pTKDG+pMWAB)和实施例11中构建的菌株DW002(pTKDG+pMWAB)，通过全细胞催化方法进行2-KLG生产。首先在果糖碳源培养基中进行细胞扩大培养，离心收菌后将菌体转移至葡萄糖碳源培养基中进行催化反应产2-KLG。

试管中全细胞催化主要步骤包括：

将表3.1发酵培养基中25g/L葡萄糖替换为10g/L果糖，将菌株以1％v/v接种量接种至5mL该培养基中，培养24h后，离心收集菌体。将收集所得全部菌体转移至1mL表3.1发酵培养基中(葡萄糖浓度提升至50g/L)，240rpm、28℃条件下进行48h全细胞催化。

反应器中全细胞催化主要步骤包括：

按表3.1配制培养基6L，其中发酵所用碳源由25g/L葡萄糖改为25g/L果糖，按实施例10方法接种，以氨水调节pH为6.0。培养至4.5h，加入终浓度1mM的IPTG诱导。待罐中果糖耗尽(溶氧上升)，停止发酵。离心，收集菌体。

按表3.1配制催化培养基1.5L，葡萄糖浓度提升至50g/L。按100g/L湿菌体量接种。在29℃下进行全细胞催化，用50％NaOH控制pH为7.0。调节搅拌速率、空气流速保证溶氧大于60％，当初糖耗尽时进行补料。葡萄糖母液500g/L，预先115℃，15min灭菌。

DW002(pTKDG+pMWAB)试管全细胞催化测试结果为：48h全细胞催化结束后，可以将培养基中50g/L葡萄糖基本完全消耗，催化产生44.46g/L的2-KLG，葡萄糖到2-KLG摩尔转化率高达97％。实验结果如表13.1所示。

表13.1菌株DW002(pTKDG+pMWAB)全细胞催化葡萄糖转化生产2-KLG

DCL006(pTKDG+pMWAB)反应器中全细胞催化结果如图17所示：催化49h后，2-KLG积累量达到178.6g/L。全部的葡萄糖可转化为2-酮基-L-古龙酸，葡萄糖到2-KLG摩尔转化率达到66.3％，2-KLG生产速率为3.644g/L/h。

DW002(pTKDG+pMWAB)反应器中全细胞催化结果如图18所示：催化16h时，2-KLG积累量达到148.85g/L，催化26h后，2-KLG积累量超过200g/L。葡萄糖到2-KLG摩尔转化率约86％，2-KLG生产速率为7.36g/L/h。

总之，本发明构建的柠檬塔特姆氏菌工程菌比如DCL006(pTKDG+pMWAB)或DW002(pTKDG+pMWAB)可以通过“一步发酵法”或“一锅法”高效率地将葡萄糖转化为2-KLG。本领域技术人员显然容易理解，与现有技术的化学合成+两步发酵法相比，本发明的生物转化法具有绿色环保的天然优势，因而具有工业化开发和应用前景。

还需说明的是，本说明书中对先前公开的文献的列举和论述不应视为承认该文献是现有技术或者是公知常识。

序列表

<110> 中国科学院上海生命科学研究院

<120> 一种2-酮基-L-古龙酸生产菌株及其构建方法

<130> SHPI1812134

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 978

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 1

atgaaacccc cggttatcgt gtataaatct ttacctgctg aattgctgag ccttctgtcg 60

gaacattgtc agataaccga agttagcgac ctgagcgaga acacagtcac acaacacgcc 120

actgcctttt ctcaggccgt cgggcttctg ggctctggtg ccaaagtgga tcagcaactg 180

ctggacagaa tgccggcact gcgtgtctgc tctactctca cggccgggta cgatctgttc 240

gatcttgatg ccctgaatgc acggcacatt gctctgatgc ataccaccat attaagtgaa 300

acggttgccg ataccatttt tgcactgatc ctcgccagtg cccgtcacat tacctggctg 360

gatagttggg tcaaagctgg ccaatggcag aaaagcatca caccggaatt attcagtatc 420

gatgtgcatc ataaaacgct cggtattatc ggtatgggac ggattggcat ggcagtcgca 480

cagcgtgcac atcttggttt cagcatggat attctgtata acgcgcgtaa aaatcatccg 540

gatgcagaac agcgtttttc ggctcagtat tgctgtctcg acgaattgct ggagaaaagc 600

gactttgtct gcattatttt acctctctct gatgaaacac ggcagttgat tggagcgcgg 660

caactggcat taatgaaacc cggagcggtg ttggttaatg ccggtcgcgg tgctgtcgtt 720

gaccaacaag cactgactga tgcactgaaa aacaagcaaa tttatgccgc aggcctggat 780

gtatttgaac acgaacccat acctgccgac gcagaactcc tgacattacc caacgtcgtc 840

actttgccgc atgtcggttc agcaacccat cagacacgtt atgcaatgaa gcaagaaggg 900

gtagaaaacc tgatcgccgc actggccggg aaactggaca aaaattgcgt caatccgcag 960

tcggtgaagc aacaataa 978

<210> 2

<211> 945

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 2

atgtcttcat ccctggtgtt agccgacaaa gttccaccgg ctctggcaga aaaactggca 60

aacgactatc agttatattt ctacacgaaa tcatcgcctg aagagattca ggcgatcagt 120

gaacagactg aaatcatcgt ggccagcggc gagtcgacgg tcaatgcaga gatgatcagc 180

cggttcccta atctaaaact gattgccgtt ttcggggttg gttatgatgg tattgatgtt 240

gcgactgcca ccagcaaaaa tatccaggtc accaatactc cggatattct caccgatgat 300

gtcgccgatc tcgggtttgc actgattctc aatgcttccc gacgtatcaa tgcagctcaa 360

cgctttattg agcaaggcaa ttgggcctca ggttcttttc cgctggccag taaagttacc 420

ggtaaacgtc tgggtattgt gggttacggc cgtattggtc aggcagtggc tgaccgtgcg 480

cgtggttttt caatgcctgt tgcttgtttc agccggcatc cggtcaccga tcaggatgtt 540

aaatggtatg gcgatttaac tgagctggct cataacagtg atattctggt ggtttgtgtc 600

agtgccaacc ctcagactcg tggactgatc aacaagcagg tactcacagc gttaggtcca 660

aaaggaattc taatcaatat ttcacgcggt agtgtggttg atgaagctgc tctggttgac 720

gccattaccc gtggagaaat tggcggagcc gggctggatg tgtttgccgc agaaccgtcg 780

gttccggaag cgctgctgaa tcgtcctgaa gtagtactga ctccgcatat tgccagtggt 840

acacacgaga cacgggcgga tatggcaaaa ctggtgatcg acaatattac ggcgtttcag 900

aacggtcagc cgttgctgac tccggtgaca ccaaaagcct gataa 945

<210> 3

<211> 927

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 3

atgaagctgt taaaacaagc cgggcttcct gacagactga ctgccgagct gcacgatgcg 60

tatgacatgt gcgattacgg gacaatgagc gagtctgaac tggcggcagt ggctccgata 120

attgacgtaa tggtcaccaa tggtgaagcg gtggtcacgg cagagttaat ctctcaattt 180

cctgcgctga aactgattgt agtttttggg gttggctatg atggtgttga tgtcagtgcc 240

gcggcgtcca ggggaattgc agtgactcat actccggaag tgctgacaga tgacgtggcc 300

gatttggcga tagggctgat gatagcaact tgccgaaaga tagttgcggc tcagaaattt 360

attgagcgtg ggggatggca gcagggagga tttcagtgga cgaaaaaagt ctctggtgcc 420

cgtttaggca ttgttggtat gggcagaatt ggccaggcga ttgcccgtcg ggccacagga 480

ttttctatgg ctatcagtta ctacgaccgt cgatcgcgcg aacttgctgg ctgggatttt 540

cagtcggata tttatgaact tgcccgtcaa agcgacattc tggtggtatg tatcccggga 600

ggggaagata ctcgcgggct tattgatgct caggttcttc gggctctggg gcctgaaggg 660

gtattaatta atgtcggccg gggcagcgtg gtggatgaaa acgcactgac tgaagccata 720

cagcaggagt atattgccgg ggcgggatta gatgtgttta gtgatgagcc tgaagtgcca 780

gagtctttgc tgcagcggga cgatgtggtg gtaacgccgc atatggccag tgctacctgg 840

caaacacgcg ctgagatgtc acggctggtt atggaaaata ttcgggcatg gcagcaggga 900

ttgccgttag ttaccccggt ccgataa 927

<210> 4

<211> 1239

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 4

atggcaaagg tatcactcga gaaagataaa attaagttcc tgctggtgga aggtgtccat 60

cagacagcac tggataattt acgcgcagca ggttacacca acatcgaatt ccacaaagga 120

gcgctggata ctgaagccct gaaagagtcg attcgtgatg cgcactttat cggtatccgt 180

tcccgttccc agttaaccga agaagttttc gctgcggccg aaaaactggt cgctgtcggc 240

tgcttctgta tcggaaccaa ccaggttgat ctggatgctg ccggtaaacg tggtattccg 300

gtatttaatg caccgttctc aaacactcgt tctgtggcag aactggtgat tggtgaactg 360

ctgctgttgc tgcgtggaat tcctgaagcc aatgccaaag ctcaccgtgg tatctggaat 420

aaaaatgcca aaggttcctt cgaagcccgt ggtaaaaaac tggggatcgt gggttacggt 480

catatcggca tgcagctggg agtgttggcg gaaagcctgg gtatgcatgt gttcttctat 540

gatgtggaag acaaactgcc gttaggtaat gccactcagg tgaaaggatt gcacgacctg 600

ctggcaatga gcgatgtggt cactctgcat gttcctgaaa caccgaacac ccaaaatatg 660

attggtgctg aagaactggc cgcgatgaaa aaaggcggat tgttgatcaa tgcctcacgc 720

ggaactgtta tcgatatccc ggcgttgtgt gaagctctgg ccagcaaaca tgtcggtggg 780

gctgccatcg atgtttaccc ggtcgaacct gcgacgaaca gcgatccgtt tatctctccg 840

ctgtgtgagt ttgataacgt gatcctgacg ccacatatcg gcggttctac cgaggaagct 900

caggaaaata tcggcctgga agtctcaggt aaattaatca aatactctga caatggttct 960

accctgtcag cggttaattt cccggaagtc tctctgccag cccatgctgc cagtgccagc 1020

cgtctgttgc atatccatga aaaccgtccg ggtgtactga ccgcaattaa ccagattttt 1080

gcggagcagg gcatcaacat catgggtcag tatctgcaga ctaccccgta tatgggttat 1140

gtggttatcg atatcgatgc tccgcaggaa gttgcggata aagctctgga agcaatgaaa 1200

ggtattcagg gaacactgcg tgcccgtctg ctgtactaa 1239

Claims

1.一种构建2-酮基-L-古龙酸生产菌株的方法，所使用的原始宿主细胞为柠檬塔特姆氏菌，所述宿主细胞中包含葡萄糖酸脱氢酶和2-酮基-D-葡萄糖酸脱氢酶，该方法包括任意顺序的如下步骤：

1)敲除或缺失细胞染色体中膜结合葡萄糖脱氢酶编码基因；

2)敲除或缺失细胞染色体中葡萄糖激酶编码基因；

3)敲除或缺失细胞染色体中葡萄糖酸激酶编码基因；

5)在细胞中重组表达NAD(P)+依赖型葡萄糖脱氢酶；

6)在细胞中重组表达NAD(P)H型2,5-二酮基-D-葡萄糖酸还原酶；

7)在细胞中过表达2,5-二酮基-D-葡萄糖酸内运蛋白。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括如下步骤：

4)敲除或缺失细胞染色体中2-酮醛糖还原酶编码基因和/或其同工酶编码基因，其中所述2-酮醛糖还原酶编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:1；所述同工酶编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括如下步骤：

8)敲除或缺失细胞染色体中一种PTS组分编码基因，所述PTS组分编码基因选自磷酸组氨酸搬运蛋白编码基因ptsH、PTS系统葡萄糖特异性IICB组分编码基因ptsG、磷酸烯醇式丙酮酸依赖性蛋白激酶I编码基因ptsI。

4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述膜结合葡萄糖脱氢酶是EC1.1.5.2；所述葡萄糖激酶是EC 2.7.1.2；所述葡萄糖酸激酶是EC 2.7.1.12；所述2-酮醛糖还原酶是EC 1.1.1.215；所述NAD(P)+依赖型葡萄糖脱氢酶是EC 1.1.1.118或EC1.1.1.119；所述葡萄糖酸脱氢酶是EC 1.1.99.3；所述2-酮基-D-葡萄糖酸脱氢酶是EC1.1.99.4；所述2,5-二酮基-D-葡萄糖酸还原酶是EC 1.1.1.274；并且所述2,5-二酮基-D-葡萄糖酸内运蛋白是塔特姆氏菌来源的ARU92990和ARU92994，其中所述ARU92990和ARU92994是NCBI数据库中公开的柠檬塔特姆氏菌来源的蛋白。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述菌株中ARU92990或者ARU92994编码基因由Plac启动子控制表达。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述Plac启动子和ARU92990编码基因或者ARU92994编码基因构建至pSC101系列质粒上。

7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述Plac启动子和ARU92990编码基因或者ARU92994编码基因构建至pMW118质粒上。

8.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述菌株中2,5-二酮基-D-葡萄糖酸还原酶编码基因由Ptrc启动子控制表达。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述菌株中NAD(P)+依赖型葡萄糖脱氢酶编码基因和2,5-二酮基-D-葡萄糖酸还原酶编码基因同时由Ptrc启动子控制表达。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述Ptrc启动子和NAD(P)+依赖型葡萄糖脱氢酶编码基因以及2,5-二酮基-D-葡萄糖酸还原酶编码基因构建至pBR322系列质粒上。

11.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述Ptrc启动子和NAD(P)+依赖型葡萄糖脱氢酶编码基因以及2,5-二酮基-D-葡萄糖酸还原酶编码基因构建至pTrc99k质粒上。

12.一种2-酮基-L-古龙酸生产菌株，其通过如权利要求1-11中任一项所述的方法构建而成。

13.如权利要求12所述的2-酮基-L-古龙酸生产菌株，其原始菌株为柠檬塔特姆氏菌DSM13699，基因型为DSM13699(ΔmgdhΔglkΔgntkΔtkrA1ΔtkrB1ΔtkrB2)/pTKDG/pMWAB或者DSM13699(ΔmgdhΔglkΔgntkΔtkrA1ΔtkrB1ΔtkrB2ΔptsH)/pTKDG/pMWAB，或者DSM13699(ΔmgdhΔglkΔgntkΔtkrA1ΔtkrB1ΔtkrB2ΔptsI)/pTKDG/pMWAB，或者DSM13699(ΔmgdhΔglkΔgntkΔtkrA1ΔtkrB1ΔtkrB2ΔptsG)/pTKDG/pMWAB，其中mgdh是PQQ依赖型膜结合葡萄糖脱氢酶EC 1.1.5.2编码基因；glk是葡萄糖激酶EC 2.7.1.2编码基因；gntk是葡萄糖酸激酶EC 2.7.1.12编码基因；tkrA1是柠檬塔特姆氏菌来源的一种2-酮醛糖还原酶同工酶的编码基因；tkrB1是柠檬塔特姆氏菌来源的一种2-酮醛糖还原酶同工酶的编码基因；tkrB2是柠檬塔特姆氏菌来源的另一种2-酮醛糖还原酶同工酶的编码基因；ptsH是柠檬塔特姆氏菌来源的磷酸组氨酸搬运蛋白编码基因；ptsI是柠檬塔特姆氏菌来源的磷酸烯醇式丙酮酸依赖性蛋白激酶Ⅰ编码基因；ptsG是柠檬塔特姆氏菌来源的PTS系统葡萄糖特异性IICB组分编码基因；pTKDG是包含Ptrc启动子、NAD(P)+依赖型葡萄糖脱氢酶EC1.1.1.118或EC 1.1.1.119编码基因和2,5-二酮基-D-葡萄糖酸还原酶EC 1.1.1.274编码基因的pBR322系列质粒；pMWAB是包含Plac启动子、ARU92990编码基因和ARU92994编码基因的pSC101系列质粒。

14.如权利要求12所述的2-酮基-L-古龙酸生产菌株在制备2-酮基-L-古龙酸中的应用。

15.如权利要求14所述的应用，其特征在于，通过如权利要求12所述的2-酮基-L-古龙酸生产菌株在以果糖与葡萄糖混合物为碳源的培养基中发酵来生产2-酮基-L-古龙酸。

16.如权利要求14所述的应用，其特征在于，以葡萄糖为底物，通过如权利要求12所述的2-酮基-L-古龙酸生产菌株进行生物催化来生产2-酮基-L-古龙酸。