CN1247790C - 生产抗坏血酸中间体的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及非发酵生产ASA中间体、KDG、DKG和KLG的方法，以及辅因子再生的方法。本发明提供了含有编码用于本方法的酶的异源核酸的基因工程宿主细胞。

Description

生产抗坏血酸中间体的方法
                        发明领域
本发明涉及生产抗坏血酸中间体的工程途径，特别是生物催化方法。具体地说，本发明提供了在非发酵体系中生产抗坏血酸中间体的方法。
                        发明背景
发现L-抗坏血酸(维生素C，ASA)作为维生素和抗氧化剂可用于药品和食品工业。由于其作为特殊性能化学药品具有相当大的市场并且价值非常高，因此多年来ASA的合成受到了极大的关注。Reichstein-Grussner法，一种由葡萄糖到ASA的化学途径，在1934年首次公开(Helv.Chim.Acta 17：311-328)。Lazarus等人(1989，″维生素C：通过重组DNA方法的生物转化″， 工业微生物的遗传学和分子生物学，美国华盛顿微生物学会，C.L.Hershberger编辑)公开了一种生产ASA中间体，2-酮基-L-古洛糖酸(2-KLG，KLG)的生物转化方法，该中间体可以化学转化成ASA。碳源向KLG的这种生物转化涉及许多中间体，该酶促过程与辅因子依赖性还原酶活性有关。酶促辅因子再生涉及在损害另一底物的情况下使用酶再生辅因子如NAD+→NADH或者NADP+→NADPH，该另一底物然后被氧化。
一直需要生产ASA中间体的经济上可行的方法。特别是，当这些方法涉及使用需要辅因子的酶促活性时，尤其希望具有提供辅因子再生的方法。本发明满足了该需要。
                        发明简述
本发明涉及在生物催化环境中由碳源非发酵生产ASA中间体，例如KDG、DKG和KLG，最后将它们转化成所需最终产物，例如异抗坏血酸盐和抗坏血酸，所述环境本文称之为生物反应器。该生物催化环境可以包括活的或者不能活的宿主细胞，它们含有至少一种能将碳源加工成所需中间体的酶促活性。在一个实施方案中，在转化成所需最终产物之前，所需中间体由生物反应器经电渗析纯化。参见图2，它图示了这些中间体和产物的生产。
本发明还涉及非发酵生产ASA中间体的方法，其中所需辅因子经再生。本发明部分地基于以下发现：在一非发酵或体外由碳源生产KLG的方法中可以再生催化量的辅因子。在本发明的一个实施方案中，所需辅因子由生物反应器经纳米过滤纯化并重新使用。
当KDG为所需ASA中间体时，向该生物反应器提供一碳源，该碳源通过至少一个氧化步骤生物催化地转化成KDG。在该实施方案中，宿主细胞可以在编码特异地氧化KDG的氧化酶促活性的基因中含有突变，这样KDG不进一步转化成其它中间体或产物。
当DKG为所需ASA中间体时，向该生物反应器提供一碳源，该碳源通过至少一个氧化步骤生物催化地转化成DKG。根据所用的宿主细胞，宿主细胞可以在编码氧化或还原酶促活性的基因中含有突变，这样DKG不进一步转化成其它中间体。
当KLG为所需ASA中间体时，向该生物反应器提供一碳源，该碳源通过至少一个氧化步骤和至少一个还原步骤生物催化地转化成KLG。根据所用的宿主细胞，宿主细胞可以在编码氧化或还原酶促活性的基因中含有突变，这样KLG不进一步转化成其它中间体。当氧化步骤和还原步骤需要辅因子时，该方法可提供一种辅因子再生的方式。
在一个实施方案中，宿主细胞为重组体并含有至少一种异源酶促活性。在一个实施方案中，酶促活性与宿主细胞膜结合；在另一实施方案中，酶促活性在溶解状态中；在另一实施方案中，酶促活性是在该细胞内可溶的；在另一实施方案中，酶促活性被固定化。可以间歇或连续地实施该方法。宿主细胞优选为肠杆菌科的成员，在一个实施方案中，该成员为一泛菌属菌种，尤其是柠檬泛菌。例如，柠檬泛菌可从ATCC以ATCC登记号39140获得。
宿主细胞可以经冻干、透化或其它处理降低其生活力或经突变消除细胞生长或新陈代谢的葡萄糖的利用，只要该酶促活性可用于将碳源转化成所需中间体。这些中间体还可以加工成最终产物异抗坏血酸或ASA。
因此，一方面，本发明提供了一种由碳源生产DKG或KDG的方法，包括：通过至少一种氧化酶促活性酶促氧化该碳源获得DKG或KDG。在另一实施方案中，该方法包括通过第一个氧化酶促活性氧化该碳源获得第一个氧化产物，通过第二个氧化酶促活性氧化所述第一个氧化产物获得KDG。在一个实施方案中，第一个氧化酶促活性为GDH活性，第二个氧化酶促活性为GADH活性。宿主细胞在编码KDGDH活性的天然存在的核酸中还可以含有一突变，这样该KDG不被进一步氧化。该KDG还可以被转化成异抗坏血酸盐。或者，该方法还可以包括通过第三个氧化酶促活性氧化KDG获得DKG。
为了生产KLG，如果碳源为KDG或者如果将碳源转化成KDG，那么该方法包括通过至少一种氧化酶促活性将该KDG酶促氧化成氧化产物；并通过至少一种还原酶促活性将所述氧化产物酶促还原成2-KLG的步骤。或者，如果DKG为碳源或者如果碳源被转化成DKG时，通过还原酶促活性将DKG转化成KLG。
本发明提供了一种由碳源非发酵生产2-KLG的方法，其中所述方法包括任意顺序的以下步骤：通过至少一种氧化酶促活性将该碳源酶促氧化成一氧化产物；和通过至少一种还原酶促活性将所述氧化产物酶促还原成2-KLG。在一个实施方案中，所述氧化酶促活性需要氧化形式的酶促辅因子，所述还原酶促活性需要还原形式的所述酶促辅因子，所述氧化形式的所述辅因子和所述还原形式的所述辅因子在至少一个氧化步骤和至少一个还原步骤之间再循环。在一个实施方案中，氧化形式的酶促辅因子为NADP+，还原形式的所述酶促辅因子为NADPH。在另一实施方案中，氧化形式的所述酶促辅因子为NAD+，还原形式为NADH。在本发明方法中有用的其它辅因子包括ATP、ADP、FAD和FMN。
在本文公开的一个描述性实施方案中，该方法包括任意顺序的以下步骤，在该方法中这些步骤可以同时进行和/或连续进行：通过第一个氧化酶促活性将碳源酶促氧化成第一个氧化产物；通过第二个氧化酶促活性将第一个氧化产物酶促氧化成第二个氧化产物；通过第三个氧化酶促活性将第二个氧化产物酶促氧化成第三个氧化产物；和通过一还原酶促活性将第三个氧化产物酶促还原成2-KLG。在一个实施方案中，所述第一个、第二个和第三个氧化酶促活性中至少一个需要一氧化形式的酶促辅因子，并且所述还原酶促活性需要还原形式的所述酶促辅因子，并且其中所述氧化形式的所述辅因子和所述还原形式的所述辅因子在至少一个氧化步骤和该还原步骤之间再循环。
在一个实施方案中，该方法在含有有机溶剂的环境中进行，在另一实施方案中，该方法在含有长聚合物的环境中进行。在又一实施方案中，该方法在含有盐的环境中并在盐浓度的变动范围内进行。
本发明还提供了含有用于生产ASA中间体的方法中的酶促活性的载体和重组宿主细胞。在一个实施方案中，该宿主细胞包括编码GDH和/或DKG还原酶的异源核酸，该GDH可从包括嗜酸热细菌、甲隐球菌和杆菌属菌种的种获得，该DKG还原酶可从棒状杆菌属或欧文氏菌属获得。
                        附图简述
图1图示了一种体外方法，其中NADP+和NADPH在氧化和还原步骤之间再循环。
图2图示了一种得到ASA中间体的途径。标记为a的步骤为酶促；标记为b的步骤或者为酶促或者为化学转化。在该图示中，将葡萄糖(Glc)转化成GA的酶为GDH活性；将GA转化成KDG的氧化酶为GADH活性；将KDG转化成DKG的氧化酶为KDGDH活性，将DKG转化成KLG的还原酶为DKGR活性。
图3描述了在有0-40％甲醇时在pH 7和30℃下的还原酶的活性。
图4描述了在有0-50％乙醇时在pH 7、22℃下的还原酶活性。
图5描述了在pH 7下在有NaCI、KCl CaCl2、K2SO4或磷酸钾(KPi)时的还原酶活性。在1分钟内测定初始速度。
图6描述了在pH 7和45℃下在有和没有高达500mM 2-KLG的情况下温育之后剩余的还原酶的活性。
图7显示了NADPH在一体外辅因子再循环反应中的分光光度测定。在340nm处测定吸光度。在加入酶之前的初始吸光度读数为0.7。在约12和23分钟时加入另外的GDH的等分试样。
图8显示了NADPH在一体外辅因子再循环反应中的分光光度测定。在340nm处测定吸光度。在约5分钟时加入足量NaCl，使最终浓度达到0.5M。
图9显示了在有增加量的2-KLG的情况下2,5-DKG的还原酶Km和相对Vmax。
                  优选实施方案的详细描述
定义
本文使用的以下缩写应用于葡萄糖(G)；D-葡糖酸(GA)；2-酮基-D-葡糖酸(2KDG)；2，5-二酮基-D-葡糖酸(2,5DKG或DKG)，2-酮基-L-古洛糖酸(2KLG或KLG)，L-艾杜糖酸(IA)，抗坏血酸(ASA)，葡萄糖脱氢酶(GDH)，葡糖酸脱氢酶(GADH)，2,5-二酮基-D-葡糖酸还原酶(DKGR)和2-酮基-D-葡糖酸还原酶(KDGDH)。
正如本文所用的，术语″非发酵″或″体外″是指利用细胞的酶促活性的生物催化方法。这些细胞可以是不能生活的或是活的，并且生长不显著。这些细胞可以经遗传改变，消除其对葡萄糖和/或产生的任意中间体的消耗。本发明的体外方法包括使用含有与该生物催化过程有关的酶促活性的细胞膜、使用含有与该生物催化过程有关的酶促活性的透化细胞或冻干细胞和使用为碳源向任意ASA中间体的该生物催化转化提供必需酶促活性的宿主细胞或宿主细胞膜或任意形式的片段，该ASA中间体包括(但不限于)GA、KDG、DKG和KLG。该细胞可以为含有编码所需酶促活性的异源核酸的重组细胞或者含有所需酶促活性的天然存在的细胞。本文所用的术语″生物反应器″是指非发酵或体外方法进行的环境。
许多酶仅在有辅因子的情况下才有活性，例如NAD+或NADP+。本文所用的术语辅因子是指性质上对酶促反应是次要的，但是对酶促反应又是很重要的底物。本文所用的术语″辅因子″包括，但不限于，NAD+/NADH；NADP+/NADPH；ATP；ADP，FAD/FADH2和FMN/FMNH2。短语在体外体系内的″辅因子的再生″或″辅因子的再循环″是指所需辅因子通过生物催化连续氧化和还原的现象，使得所需辅因子以发生酶催化的适宜形式存在。在本发明中，辅因子的再生提供了一环境，其中还原形式的辅因子可为还原酶所利用，氧化形式的辅因子可为氧化酶所利用。本发明包含辅因子在碳源向ASA中间体如KLG的生物催化途径中在任意酶促氧化步骤和任意酶促还原步骤之间再生。所需辅因子可以宿主细胞环境提供的催化量存在，或者可以在生物反应器处理开始时以化学计算量以氧化或还原形式外源提供。
本文所用的术语碳源包括肠杆菌科菌株常用的适宜碳源，例如6碳糖，包括(但不限于)葡萄糖、古洛糖、山梨糖、果糖、艾杜糖、半乳糖和甘露糖，它们既可以为D形式也可以为L形式；或者6碳糖的组合，如蔗糖；或者6碳糖酸，包括(但不限于)2-酮-L-古洛糖酸、艾杜糖酸、葡萄糖酸、6-磷酸葡糖酸、2-酮基-D-葡糖酸、5-酮基-D-葡糖酸、2-酮基葡糖酸磷酸、2，5-二酮基-L-古洛糖酸、2，3-L-二酮基古洛糖酸、脱氢抗坏血酸、异抗坏血酸和D-甘露糖酸或者这类酸的酶促衍生物，只要该碳源能够被转化成例如KDG、DKG和KLG的ASA中间体。
本文所用的″肠杆菌科″是指一般特性为革兰氏阴性并且为兼性厌氧的细菌菌株。优选的肠杆菌科菌株为能够由D-葡萄糖溶液生产2，5-二酮基-D葡糖酸的那些。能够由D-葡萄糖溶液生产2，5-二酮基-D-葡糖酸的肠杆菌科例如包括欧文氏菌属、肠杆菌属、葡糖杆菌属和泛菌属。在微生物碳水化合物途径中由碳源到ASA的中间体包括，但不限于，GA、2KDG、2,5DKG、5DKG、2KLG和IA。在本发明中，一种优选的肠杆菌科发酵菌株为泛菌属菌种，特别是柠檬泛菌。抗坏血酸的四个立体异构体是可能存在的：L-抗坏血酸、D-阿拉伯糖型抗坏血酸(异抗坏血酸)，它具有维生素C活性、L-阿拉伯糖型抗坏血酸和D-木糖型抗坏血酸。本文所用的术语ASA中间体包括在产生ASA的途径中的任意产物，包括(但不限于)KDG、DKG和KLG。
本文所用的术语″重组体″是指含有在生物体中天然不存在的核酸的宿主细胞和/或具有经重组引入的外源核酸的附加拷贝的宿主细胞。本文所用的术语″异源″是指宿主细胞中天然不存在的核酸或氨基酸序列。本文所用的术语″内源″是指天然存在于宿主中的核酸。
本文所用的″核酸″是指核苷酸或多核苷酸序列及其片段或部分，也指基因组或合成源的DNA或RNA，可以为双链或单链，不论其代表有意义链或反义链。本文所用的″氨基酸″是指肽或蛋白质序列或其部分。
本文所用的术语″突变″是指核酸中的任意改变，致使该核酸的产物失活或消除。突变的例子包括(但不限于)点突变、移码突变和编码酶促活性如氧化酶活性或还原活性的基因部分或全部缺失。在本文公开的生产KLG由此再生辅因子的一个实施方案中，编码膜结合GDH活性的核酸发生突变，由此使外源GDH失去活性。在另一实施方案中，使2-酮基-D-葡糖酸脱氢酶失去活性，由此最佳化产生中间体KDG。
本文所用的短语″氧化酶″是指可以催化给定氧化态的底物转化成具有比底物高的氧化态的产物的酶或酶体系。短语″还原酶″是指可以催化给定氧化态的底物转化成具有比底物低的氧化态的产物的酶或酶体系。与D-葡萄糖向KLG的生物催化有关的氧化酶尤其包括D-葡萄糖脱氢酶、D-葡糖酸脱氢酶和2-酮基-D-葡糖酸脱氢酶。与ASA中间体向KLG的生物催化途径有关的还原酶尤其包括2，5-二酮基-D-葡糖酸还原酶(DKGR)、2-酮基还原酶(2-KR)和5-酮基还原酶(5-KR)。这些酶包括由宿主菌株天然产生的那些或者通过重组方式引入的那些。在本文公开的一个实施方案中，该过程在柠檬泛菌宿主细胞中进行，在该宿主细胞中天然存在的膜结合、非-NADP+依赖性GDH活性被消除和胞质NADP+依赖性GDH经重组引入。在另一实施方案中，将编码还原酶活性的异源核酸引入宿主细胞中。在一优选实施方案中，还原酶活性可由棒杆菌种或欧文氏菌属菌种获得。本文所用的术语″途径酶″是指在将碳源向ASA中间体如KDG、DKG和KLG生物催化转化过程中所涉及的任意酶。
本文所用的术语″分离的″或″纯化的″是指从天然结合的至少一种组分中除去的核酸或蛋白质或肽或辅因子。在本发明中，分离的核酸可以包括含有该核酸的载体。
很显然，在本领域中，糖类的酸性衍生物，如果在溶解状态中，或者如果为固体形式，则在从中制备它们的非溶解状态中，根据其周围介质，可以各种电离态存在。使用术语，例如艾杜糖酸，称呼这些分子，意欲包括该有机分子的所有电离态。因此，例如″艾杜糖酸″，其环化形式″艾杜糖内酯″和″艾杜糖酸盐″是指相同有机部分，并不打算特指特定的电离态或化学形式。
                           详述
本发明涉及在体外或非发酵环境中由碳源生物催化生产ASA中间体，例如KDG、DKG和KLG。根据所生产的中间体，该方法可能要求存在酶促辅因子。在本文公开的一优选实施方案中，该酶促辅因子经再生。由于辅因子的成本，使用一种允许再生催化量的由宿主细胞环境提供或经外源提供的辅因子的体外方法是非常有利的。
非发酵生产ASA中间体
本发明提供了一种生产ASA中间体的方法。这些中间体可以进一步加工成ASA、ASA立体异构体或其它产物如异抗坏血酸。在一优选实施方案中，KDG为产生的所需ASA中间体，为生物反应器提供有活的或不能生活的柠檬泛菌宿主细胞，如本文实施例II中所述，这些宿主细胞在编码2-酮基-D-葡糖酸脱氢酶活性中有一突变。在该实施方案中，通过两个氧化步骤将该碳源生物催化转化成KDG，参见图2。在该实施方案中，不需要再生辅因子。
当DKG为所需ASA中间体时，为生物反应器提供活的或不能生活的柠檬泛菌宿主细胞和一碳源，该碳源通过三个氧化步骤经生物催化被转化成DKG，参见图2。在该实施方案中，不需要再生辅因子。
当KLG为所需ASA中间体时，为生物反应器提供活的或不能生活的柠檬泛菌宿主细胞和一碳源如葡萄糖，该碳源通过图2所示的三个氧化步骤和一个还原步骤经生物催化被转化成KLG。在该实施方案中，还原酶活性可以由柠檬泛菌宿主细胞内所含的核酸编码，或者经外源提供。在该实施方案中，第一个氧化酶促活性需要氧化形式的辅因子，还原酶促活性需要还原形式的辅因子。在本文公开的一优选实施方案中，柠檬泛菌细胞经修饰，消除了天然存在的GDH活性，并将可从嗜酸热细菌、甲隐球菌和杆菌属菌种获得的且对NADPH+具有特异性的异源GDH引入泛菌细胞中，从而提供需要并再生一辅因子的辅因子再循环体系。该实施方案提供了一种辅因子再生的方法，因此消除了向在泛菌细胞中生产KLG的生物反应器中连续添加外源辅因子的成本。在该实施方案中，宿主细胞还含有编码2,5-DKG还原酶活性的核酸，或者将该2,5-DKG还原酶外源地添加到该生物反应器中。
在制备KLG的另一实施方案中，生物反应器装有柠檬泛菌细胞，该细胞含有编码膜结合GDH的核酸、适宜酶和辅因子，并加入待转化成DKG的葡糖酸。然后使该反应混合物厌氧，并加入葡萄糖。该GDH将葡萄糖转化成GA，该还原酶将DKG转化成KLG，同时将辅因子再循环。当这些反应完成时，加入氧，将GA转化成DKG，并继续该循环。
体外生物催化环境
一种将碳源转化为ASA中间体的生物催化方法是从被肠杆菌科菌株利用的适宜碳源开始的，该碳源例如为6碳糖，包括例如葡萄糖，或者为6碳糖酸，例如KDG。其它代谢产物源包括，但不限于半乳糖、乳糖、果糖或它们的酶促衍生物。除了适宜碳源之外，培养基必需含有适宜矿物质、盐、辅因子、缓冲剂和本领域技术人员已知的用于维持培养物并促进生产所需最终产物必需的酶促途径的其它组分。优选用于生物反应器中的盐有Na+、K+、NH4 +、SO4 --和乙酸根。首先使细胞生长，在非发酵过程中将生长所用的碳源除去，将pH保持在约pH 4和约pH 9之间，并且有氧。
在该体外生物催化过程中，该碳源及其代谢产物通过酶促氧化步骤或酶促氧化和酶促还原步骤，它们可以在宿主细胞胞内环境之外进行并利用与宿主细胞有关的酶促活性，通过一途径生产所需ASA中间体。这些酶促步骤可以在生物反应器内相继或同时进行，为了生产所需ASA中间体，一些步骤需要辅因子。本发明包含一种体外方法，其中用有机物处理宿主细胞，如实施例V所述，使得细胞不能生活，而在将碳源生物催化成ASA中间体时酶仍可用于氧化和还原所需碳源和/或其代谢产物。本发明还包含一种体外方法，其中宿主细胞经冻干、通过任意方式透化、喷雾干燥、破碎或其它处理，以便酶可用于将碳源转化成ASA中间体。
氧化或还原酶促活性可以与宿主细胞膜结合，固定到例如树脂上，例如AminoLink偶联凝胶(来自Pierce Chemical Co)，固定到聚合物上，或者溶于生物反应器环境中。在一优选实施方案中，至少一个氧化酶与膜结合。该环境可以在一有机或含水体系或两者的组合中进行，并且可以在一个容器或多个容器中进行。在一个实施方案中，该过程在两个容器中进行，一个利用氧，一个没有氧。例如，需要氧的膜结合酶(GDH，GADH，KDGDH)可以与不需要氧的那些酶(辅因子依赖性GDH、辅因子依赖性DKGR)分离，这样可以使用较小体积的需氧容器，因此降低了成本。生物反应器可以间歇或连续进行。在间歇系统中，无论加入什么，将所有肉汤同时收获。在连续系统中，为了下游加工，有规律地除去肉汤，同时加入新的底物。产生的中间体可以通过各种方法从发酵肉汤中回收，这些方法包括离子交换树脂、吸收或离子阻滞型树脂、活性炭、浓缩结晶、通过膜等。
生物反应器过程还可以涉及不只一类细胞，例如一种细胞可以含有氧化活性，第二种细胞可以含有还原活性。在另一实施方案中，宿主细胞经透化或冻干(Izumi等人， 发酵技术杂志，61(1983)135-142)，只要必需的酶促活性保持可用于转化碳源或其衍生物。生物反应器可以在外源提供了一些酶促活性的情况下并在提供溶剂或长聚合物以使酶促活性稳定或增加的环境中进行。在本文公开的一个实施方案中，使用甲醇或乙醇增加还原酶活性。在另一实施方案中，使用Gafquat稳定该还原酶(参见Gibson等人的US5,240,843)。
在本文所述的一个描述性生物反应器中，宿主细胞为一提供D-葡萄糖为碳源的透化柠檬泛菌细胞，该碳源通过酶促转化经受一系列氧化步骤。为了获得KLG，氧化酶包括GDH、GADH和DGDH，还原步骤涉及2DKGR(参见US3,790,444)。通过本发明方法产生的该KLG可以进一步转化成抗坏血酸，并通过本领域技术人员已知的方式将KDG转化成异抗坏血酸，参见例如Reichstein和Grussner，Helv.Chim.Acta.，17，311-328(1934)。
辅因子再生
本发明方法的优点之一在于再生途径酶所需的辅因子。可用于本方法中的辅因子的例子包括(但不限于)NAD+/NADH；NADP+/NADPH；ATP；ADP，FAD/FADH2和FMN/FMNH2。
在本发明的一个实施方案中，在涉及辅因子再生的方法中将碳源转化成KLG，如图1所示。在该酶促辅因子再生过程中，将1当量的D-葡萄糖氧化成1当量的D-葡糖酸，并通过GDH的催化作用将1当量的NADP+还原为1当量的NADPH。然后将由GDH产生的1当量的D-葡糖酸氧化成1当量的2-KDG，然后分别通过膜结合脱氢酶GADH和KDGDH的作用转化成1当量的2,5-DKG。然后将产生的1当量的2,5-DKG还原为1当量的2-KLG，通过2,5-DKG还原酶的作用将该NADPH再氧化成1当量的NADP+，这样有效地再循环当量辅因子，从而可用于第二个当量的D-葡萄糖氧化。辅因子再生的其它方法可以包括化学、光化学和电化学方式，其中通过化学、光化学或电化学方法将该当量氧化的NADP+直接还原为1当量的NADPH。经外源向生物反应器加入的辅因子的量为约1μM-约5mM，在一优选实施方案中为约5μM-约1mM。正如本文实施例中所述的，NaCl影响NADPH的Km，而KLG，带电形式，并不影响该Km。因此如果在生物反应器中有NaCl，那么将需要更多的NADPH来维持最佳速度。而且，正如实施例中所公开的，试验的大多数盐对还原酶的热稳定性都有影响。本领域技术人员显然可以根据生物反应器的条件如温度来调整盐含量，从而在热稳定性和可接受的速度之间获得一平衡。经外源加入到体外系统中的辅因子可以单独加入，或者可以与碳源向ASA中间体的生物催化转化有关的其它底物一起加入。本方法包括使用固定在一载体上的辅因子、经化学改变如连接在长聚合物上的辅因子、以及使用分离或纯化形式的辅因子。
所需辅因子还可以从生物催化环境中经纳米过滤纯化并再使用。用于保留辅因子的纳米过滤膜的使用方法描述在例如Seelbach等人(1997，《酶和微生物技术》，第20卷，第389-392页)。
重组方法
宿主细胞
指导宿主细胞碳水化合物途径生成ASA中间体所需的任意氧化或还原酶，例如KDG、DKG或KLG，如果在宿主细胞中天然不存在，那么可以通过本领域技术人员已知的重组DNA技术引入。或者，可以通过重组DNA方法使阻碍所需途径的酶发生突变。本发明包括实现所需途径所需的任意酶或中间体的重组引入或突变。
在本发明的一个实施方案中，通过多个氧化步骤和一个还原步骤将碳源如葡萄糖转化成KLG。在该实施方案中，第一个氧化步骤和还原步骤需要辅因子。宿主细胞为柠檬泛菌，将编码葡萄糖脱氢酶(GDH)的天然存在的核酸突变，从而消除该脱氢酶活性，并将一外源GDH引入该细胞中。本发明包含在影响生产的碳流动途径中酶具有其它突变的宿主细胞。就常规技术而言，例如参见Maniatis等人在1989年于《分子克隆》实验室手册，纽约冷泉港实验室和Ausubel等人在1989年于《分子生物学的当前技术》，Greene Publishing″Associates and Wiley Interscience，N.Y中所述的技术。
在本发明的一个实施方案中，编码DKG还原酶(DKGR)的核酸经重组引入泛菌属发酵菌株中。已发现许多菌种含有DKGR，特别是棒杆菌类的成员，包括棒形杆菌属、短颈细菌属和分节孢子杆菌属。在本发明的一个实施方案中，将可从棒形杆菌某种菌株SHS752001(Grindley等人，1988，《应用和环境微生物学》54：1770-1775)获得的2，5-DKGR经重组引入柠檬泛菌中。在另一实施方案中，将通过授予Anderson等人的US5,008,193中公开的草生欧文氏菌获得的2,5-DKG还原酶经重组引入柠檬泛菌中。
编码氧化或还原酶的核酸源包括如下：
酶                          出处
葡萄糖脱氢酶               Smith等人1989，《生物化学杂志》
                           261：973；Neijssel等人1989，
                           Antonie Van Leauv enhoek
                           56(1)：51-61
葡糖酸脱氢酶               Matsushita等人1979，《生物化学
                           杂志》85：1173；Kulbe等人1987，
                           Ann.N.Y.Acad Sci 506：552
2-酮基-D-葡糖酸脱氢酶      Stroshane 1977 Biotechnol.
                           BioEng 19(4)459
2-酮基葡糖酸还原酶        《微生物遗传学杂志》1991，
                           137：1479
2，5-二酮基-D-葡糖酸还原   美国专利5,795761；5,376,544；
酶                         5,583,025；4,757,012；
                           4,758,514；5,008,193；
                           5,004,690；5,032,514
载体序列
用于在宿主微生物中表达本方法的这些途径酶，例如脱氢酶或还原酶的表达载体，含有至少一种与酶有关的启动子，该启动子在宿主细胞中为功能性的。在本发明的一个实施方案中，该启动子为选择酶的野生型启动子，在本发明的另一实施方案中，该启动子对该酶而言为异源性的，但在该宿主细胞中仍然为功能性的。在本发明的一个实施方案中，编码该酶的核酸被稳定地整合到微生物基因组中。
在一优选实施方案中，表达载体含有一多克隆位点盒，它优选含有至少一个对该载体独特的限制性核酸内切酶位点，从而易于核酸操作。在一优选实施方案中，载体还含有一个或多个选择性标记。本文所用的术语“选择性标记”是指能够在宿主微生物中表达的基因，从而易于对含有该载体的那些宿主进行选择。这些选择性标记的例子包括(但不限于)抗生素类，如红霉素、放线菌素、氯霉素和四环素。
用于将非天然存在的酶或中间体重组引入肠杆菌科菌株的一优选质粒为RSF1010，它是一种可移动的，但是不能自身传递的质粒，具有在广泛细菌宿主，包括革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌中复制的能力(Frey等人，1989，《IncQ质粒的分子生物学》于：Thomas(编辑)，《革兰氏阴性菌的混杂质粒》Academic Press，London，第79-94页)。Frey等人(1992，《基因》113：101-106)报道发现在三个区域可以影响RSF1010的移动性能。
转化
常规转化步骤受教于《分子生物学的当前技术》(第1卷，由Ausubel等人编辑，John Wiley和Sons公司1987，第9章)，并包括磷酸钙法，使用二乙氨基乙基葡聚糖的转化和电穿孔。用于将编码途径酶的核酸引入给定宿主细胞的各种转化程序是本领域中的技术人员已知的。本方法包括由重组宿主细胞产生并从中纯化以及外源地加入体外环境的途径酶，在该方法中对宿主细胞或者为异源或者为内源的途径酶被活跃生长的宿主细胞表达或者存在于不能生活的宿主细胞的膜中。可以使用各种宿主细胞重组地生产待外源地加入的途径酶，包括细菌、真菌、哺乳动物、昆虫和植物细胞。在Rodriquez(WO95/14099，1995年5月26日公开)中教导了植物转化方法。
在该方法的一优选实施方案中，宿主细胞为肠杆菌科。在肠杆菌科组中包括有欧文氏菌属、肠杆菌属、葡糖杆菌属和泛菌属菌种。在本发明中，一优选的肠杆菌科发酵菌株为泛菌属菌种，尤其是柠檬泛菌。在另一优选实施方案中，宿主细胞为含有能够将碳源转化成KLG的途径酶的柠檬泛菌。本发明包括在能够使用碳源生产KLG并能够通过包括但不限于GA、2KDG、2,5DKG、5DKG和IA的中间体的微生物碳水化合物途径中通过任意中间体从碳源到KLG的途径。在一个实施方案中，编码该途径酶的核酸通过质粒载体引入，而在另一实施方案中，编码途径酶的核酸被稳定地整合到宿主细胞基因组中。
转化体的鉴定
尽管宿主细胞是否已被转化可以通过存在/没有标记基因表达来检测(这可以暗示感兴趣的核酸是否存在)，但是其表达应被证实。例如，如果编码途径酶的该核酸插入标记基因序列的话，含有插入片段的重组细胞可以通过缺少标记基因功能来鉴定。或者，在单个启动子的控制下标记基因可以与编码途径酶的核酸一前一后地放置。标记基因响应诱导或选择的表达通常也表明了酶的表达。
或者，含有途径酶的编码序列并表达该酶的宿主细胞可以通过本领域技术人员已知的各种步骤鉴定。这些步骤包括，但不限于，DNA-DNA或DNA-RNA杂交和蛋白质生物测定或免疫测定技术，它们包括用于检测和/或定量核酸或蛋白质的膜基、溶液基或碎片基技术。
此外，酶多核苷酸序列在宿主微生物中的存在可以通过使用探针、该酶多核苷酸序列的部分或片段的DNA-DNA或DNA-RNA杂交或扩增来检测。
测定条件
检测ASA中间体、ASA和ASA立体异构体的方法包括使用2,6二氯靛酚(Burton等人1979，J.Assoc.Pub.Analysts 17：105)或其它适宜试剂的氧化还原滴定法、使用阴离子交换的高效液相色谱法(HPLC)(J.Chrom.1980，196：163)和电氧化还原步骤(Pachia，1976，《分析化学》48：364)。本领域技术人员应很清楚适用于这些检测方法的对照。
中间体的回收
一旦生产之后，可以通过本领域技术人员已知的任意方式将这些ASA中间体回收和/或纯化，包括冻干、结晶、喷雾干燥和电渗析等。纯化ASA和ASA中间体如KLG的电渗析法描述于例如1998年5月5日授权的US5747306和1998年8月30日授权的US4767870中。或者，这些中间体还可以直接从生物反应器中配制并造粒或制成液体制剂。
通过参照以下实施例，本领域技术人员可以更全面地理解实施本发明的方式和方法，这些实施例不打算以任意方式限制本发明或有关的权利要求书的范围。将本文参照的所有文献和专利出版物并入本文作为参考。
                          实施例
实施例I
本实施例描述了生产在天然存在的GDH中存在一突变的柠檬泛菌宿主细胞的方法。
由柠檬泛菌克隆葡萄糖脱氢酶基因(GDH)：通过聚合酶链反应(PCR)克隆葡萄糖脱氢酶基因。将两个引物用于该PCR中：5’AGGGAGTGCTTACTACCTTATCTGCGGTATA3’和5’CGCTAGCTGTGCAATCCATTGATTTTGCACA3’。PCR之后，在该载体中克隆一约2kb的DNA产物，pGEM-T(Promega)，并鉴定带有该正确DNA插入片段的重组大肠杆菌，将该克隆命名为pRL。通过DNA测序分析该DNA插入片段，并发现其序列与公开的柠檬泛菌菌株的GDH的DNA序列有60-70％相同。
通过插入氯霉素抗性基因产生一缺失的GDH基因：
为了在柠檬泛菌中产生GDH基因的缺失突变体，首先通过引入一选择性标记—氯霉素抗性基因(CAT)产生一待缺失的基因的重组拷贝。将该体外产生的拷贝引入柠檬泛菌，并通过同源重组使其与野生型拷贝重组。然后用不同限制酶消化分析该pRL DNA。发现在编码DNA的GDH中有两个间隔约700bp的Smal切割位点。该pRL用Smal消化，除去该700bp片段，然后将其用一Smal消化的含有氯霉素抗性基因的1.05kb DNA替换，产生重组质粒，将其命名为pRLcm4。用于产生pRLcm4的该方法为本领域技术人员使用的标准技术。来自pRLcm4的该GDH-CAT编码序列进一步被转移到一质粒pGP704上。通过限制酶Aatll和Spel的组合消化将编码该GDH-CAT盒的DNA从pRLcm4中除去。将经过消化的DNA的粘性末端在有脱氧核苷酸三磷酸酯混合物的情况下通过T4 DNA的处理除去。然后将该GDH-CAT盒与EcoRV消化的pGP704相连。含有GDH-CAT盒的pGP704的重组质粒经鉴定并命名为p704RLcm。
将缺失的GDH基因引入柠檬泛菌的染色体：通过电穿孔将质粒p704RLcm引入野生型柠檬泛菌。首先将该转化细胞平铺于含有12.5μg/ml氯霉素的琼脂平板中，观察抗性克隆。为了从单纯包含质粒p704RLcm的细胞中分化真缺失突变体(它应呈现氯霉素抗性表型)，针对氨苄青霉素(p704RLcm的另一抗生素抗性标记载体)地筛选氯霉素抗性菌落。鉴定氨苄青霉素敏感性克隆。通过生物化学测定鉴定具有正常表型(氯霉素抗性和氨苄青霉素敏感性)的几个克隆，所有克隆都呈现GDH阴性表型。DNA印迹分析还证实了，野生型GDH基因被缺失的拷贝替换。
实施例II
实施例II描述了生产在天然存在的2-酮基-D-葡糖酸脱氢酶(E3)中具有一突变的宿主细胞的方法。
按照Mclntire等人的方法(Mclntire，W，、Singer，T.P.，Ameyama，M.，Adachi，O.，Matsushita，K.和Shinagawa，E.《生物化学杂志》(1985)231，651-654)和其中的参考文献纯化来自生黑葡糖杆菌的2-酮基-D-葡糖酸脱氢酶(EC1.1.99.4)。该纯化的蛋白质用胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶或其它蛋白酶消化产生肽片段，将其通过HPLC或其它技术分离。将单个肽收集并测序。由这些序列合成DNA探针，它们将退火至该宿主生物体或相关生物体的基因组中的相应序列。使用标准PCR技术，将所需基因的更大片段扩增、纯化和测序。将这些片段用于与该基因杂交，使其克隆整个基因并对其测序。一旦序列已知之后，如实施例1中对D-葡糖酸脱氢酶(GDH)所述的使该基因缺失。
减少或消除2-酮基-D-葡糖酸脱氢酶的其它方法包括抑制剂(据报道有机酸如柠檬酸和琥珀酸抑制2-酮基-D-葡糖酸脱氢酶；Shinagawa，E.和Ameyama，M.《酶学方法》(1982)89，194-198)，以及pH或温度的改变。
可以使用Shinagawa和Ameyama中所述的试验测定该酶的活性或活性损失。
实施例III
实施例III描述了一种在使辅因子再生的生物反应器中生产KLG的方法。
材料和方法
细胞透化
将400ml在天然存在的膜结合GDH中具有一突变的柠檬泛菌在10g/L葡萄糖酸盐中生长至80OD(600nm)，在22℃下将其与16ml的10％甲苯和90％丙酮的混合物混合3分钟。然后在9000rpm下将该透化细胞离心10分钟，并将所得细胞沉淀用400ml的50mM tris，pH 7洗涤。将洗涤重复2次以上，确保除去残余有机溶剂。
反应器装料
将来自上面的在50mM tris，pH 7中的该400ml透化细胞放入1升配备有搅拌器、温度控制器、氧输送管、碱输送管、样品口和氧及pH探子的玻璃容器中。向该溶液中加入200μl的MAZU消泡剂(BASF)，控制过量起泡，将压缩空气输入容器中，使温度为28℃，打开搅拌器，使其以1200rpm旋转，直到氧探子读数超过60％饱和度。然后加入16g结晶葡萄糖和4g结晶葡萄糖酸钠，使最终浓度为10g/L葡萄糖酸盐和40g/L葡萄糖。使混合物发生反应，直到所有葡萄糖酸盐转化成DKG。将葡萄糖水平保持在20g/L以上。由于细胞透化，因此最少量的葡萄糖进入非生产性细胞代谢。通过自始至终控制地加入50％NaOH，将pH保持在7。
加入可溶性酶和辅因子
一旦葡萄糖酸盐转化为DKG之后，加入各自2000单位的辅因子依赖性GDH和DKG还原酶(就DKGR而言，1单位等于在340nm下测定时每分钟改变1OD吸光度)和400μM NADP+。如上所述将反应器搅拌，输入空气，并保持在28℃。在整个反应过程中定期加入葡萄糖，确保对两种辅因子依赖性酶提供恒定的底物。
结果
以来自大肠杆菌的粗提取物形式用非纯化还原酶A：F22Y/A272G(US5,795,761)进行生物反应器实验。嗜酸热细菌GDH和NADP+是以纯化形式从Sigma购买的。GA转化为DKG的速度大于10g/L/hr。形成2KLG的初始速度大于10g/L/hr。在头6个小时内的累积速度在5g/L/hr以上。在头6个小时内辅因子看上去是稳定的，并且主要为还原形式。总转换数为537(215mM 2KLG/0.4mM NADP+)。在头6个小时内，中间体GA和DKG从不超过4g/L。在细胞开始加入之后6.5小时停止运行，在22℃下将逐渐减速的低搅拌相进行一夜，KLG的最终滴度为约42g/L。
在生物反应器温育过程中除去等分试样。首先将这些等分试样在一微量离心机中旋转，使细胞沉淀。为了测定剩余还原酶活性，将25微升样品上清液加入由910μl缓冲剂(50mM bis-tris，pH7)、20μlDKG(70mg/ml)和250μM NADPH组成的溶液中。通过监测340nm下1分钟内吸光度的损失测定还原酶活性。GDH活性的测定如下：将25μl样品加入到含520μl缓冲剂、150μl NaCl(1M)、200μl脲(8M)、50μl glc(1M)和60μl NADP+(5mM)的溶液中，监控340nm下1分钟内吸光度的增加。在生物反应器实验的整个过程中还原酶和GDH都显示出全活性。
实施例IV
本实施例描述了在体外生物反应器中生产KDG。
使含有膜结合D-葡萄糖脱氢酶和D-葡萄糖酸脱氢酶活性但不含2-酮基-D-葡糖酸脱氢酶活性的细胞生长并收获。这种细胞的一个例子是柠檬泛菌，它在2-酮基-D-葡糖酸脱氢酶中有一突变，并如实施例III生长和处理。这些细胞如实施例III中所述经过透化。将葡萄糖(结晶或溶液)以等分试样或连续地加入。通过控制地加入NaOH浓溶液保持其pH。将该葡萄糖转化为D-葡糖酸，然后转化为KDG。在适宜HPLC系统上通过分析等分试样来监控产物形成。通过离心和浓缩或除去剩余液体除去细胞来回收产物。
实施例V
本实施例描述了加入有机溶剂增加还原酶活性。
将1-2mg的DKG、250μM NADPH、F22Y/A272G还原酶A和使最终体积为1ml的足量50mM bis-tris缓冲剂，pH 7，加入一比色杯中。在340nm下通过监控吸光度的增加测定还原酶活性。在室温或30℃下还原酶的加入量典型地导致吸光度改变0.1-0.2OD/min。在相同条件下，向该溶液中加入等分试样的甲醇或乙醇，并测定还原酶活性。在30℃下在有不同量甲醇的情况下的还原酶活性示于图3，并且在图4中显示了22℃下在有乙醇的情况下的活性。
如这些图所示，在有一定量甲醇或乙醇的情况下还原酶活性增加。最佳浓度范围为10-25％的有机溶剂。
来自嗜酸热细菌的GDH当用10％甲醇温育时，其活性有少许降低(测定条件为50mM Tris，pH 7、12.5mM D-葡萄糖、250μM NADP+，为1ml。通过340nm下的吸光度增加监控活性)。透化细胞用15％甲醇和葡糖酸温育。通过产物形成监控(HPLC分析)，加入甲醇对D-葡糖酸脱氢酶和2-酮基-D-葡糖酸脱氢酶的活性没有显著影响。
向一完全生物反应器反应添加甲醇或乙醇将增加还原酶活性。GDH活性或其它组分的损失可以通过加入更多GDH或细胞来克服。
实施例VI
实施例VI描述了在有Gafquat和PEG8000的情况下还原酶活性。
在30℃下用250μM NADPH、1-2mg/ml DKG以及0、0.7％和2.8％Gafquat(ISP Technologies，Inc.)或0.5％PEG8000于1ml(50mM bis-tris缓冲液，pH 7)温育还原酶。如实施例VI测定还原酶活性。如表1所示，与没有Gafquat的活性相比，加入Gafquat使还原酶活性增加80％。PEG8000使还原酶活性增加约15％。
  聚合物   向最终溶液中添加的％   没有添加剂的活性％
  GafquatPEG8000   0.7-2.80.5   180115
表1.在有Gafquat或PEG8000的情况下还原酶活性的增加。
实施例VII
实施例VII描述了在有盐的情况下还原酶活性。
在有不同量的不同盐的情况下测定还原酶A F22Y/A272G的活性。该测定是由将还原酶添加到含250μM NADPH、DKG(1-1.5mg/ml)、50mMbis-tris缓冲液，pH7.0和不同量的磷酸钾、NaCl、KCl、K2SO4或CaCl2的溶液(最终体积为1ml)构成的。所有反应都是在30℃下进行的。这些结果示于图5中。
如图5所示，当用高达100mM NaCl或KCl温育时，还原酶活性保持相同或略有增加。当盐浓度增加到250mM时，活性降低。在CaCl2或磷酸钾的浓度为20mM或更高时，还原酶活性降低。
使用标准生物化学技术(Fersht，A.″酶的结构和机理″(1977)W.H.Freeman和Company)测定在有200mM NaCl的情况下NADPH的还原酶结合常数(Km)。在30℃下在含有约1.5mg/ml DKG和不同量NADPH的pH 7bis-tris缓冲液中进行这些反应。发现在有200mM NaCl的情况下NADPH的Km比没有NaCl时测定的Km高10-40倍。在盐中的最大速度(Vmax)与没有盐的Vmax相似或略高。减少盐对还原酶活性的影响的一个途径是增加NADPH的浓度，直到在这些条件下其为Km或之上。或者，可以将含有KLG的带电形式除去。
实施例VIII
实施例VIII描述了还原酶A F22Y/A272G在有盐/产物的情况下的稳定性。
在有盐的情况下还原酶的热稳定性大大增加。以下列一种方式测定还原酶。在第一种情况下，将还原酶加入有或没有不同量2-KLG(0-500mM)的缓冲液(50mM bis-tris，pH 7)中。然后将这些溶液等分(40μl)到1.5ml微量离心管中。然后将这些管放入一45℃水浴中并在设定间隔取出。然后使用标准还原酶活性测定法测定还原酶的剩余活性。结果示于图6中。
如图6所示，在这些条件下在有500mM 2-KLG时还原酶的任意活性没有明显损失。然而，仅用缓冲液温育的还原酶，在10分钟后其活性损失将近一半。中间体2-KLG浓度部分得到稳定。
在有缓冲液(50mM bis-tris，pH7或25mM MOPS，pH7)、0.5M NaCl、0.5M KCl、0.5M NH4Cl、0.5M K2SO4和0.1M NaCl的情况下在pH7和45℃下对还原酶进行温育。如下表2所示，在有这些化合物的情况下几乎无活性损失，而仅有缓冲液的还原酶的活性损失将近一半。显然这些化合物稳定了还原酶。更低或更高含量的这些化合物应该也能稳定还原酶。
  还原酶样品   温育12分钟后的剩余活性％   温育10分钟后的剩余活性％
  缓冲液0.5M NaCl0.5M KCl0.5M NH4Cl0.5M K2SO40.1M NaI100mM NADPH200mM K2PO4100mM K2SO4 80-85   25-4010010010010080-9065-7890-100
表2.在室温或45℃下温育10分钟后的还原酶活性。活性是使用标准试验测定的。
将2-KLG和NaCl的稳定性进行比较。在45.4℃下在25mM MOPS，pH7中进行温度温育。使用20mM 2-KLG或20mM NaCl浓度。在0、5和10分钟的时间点进行测定。结果列于下表3中。如表3所示，相同量的NaCl比2-KLG更好地稳定还原酶。
  条件  ％活性，0分钟  ％活性，5分钟   ％活性，10分钟
  20mM NaCl  100  72   59
  20mM 2-KLG  100  51   29
表3中所有％都为+/-10％。
在46.6-46.9℃下，已测定了在0-400mM NaKLG的情况下还原酶的半衰期。选择该温度是为了测定相同温度下的所有半衰期。缓冲液为25mMMOPS，pH7.0。将等分试样取出并测定剩余活性。如下进行热稳定性半衰期测定：将含有缓冲液、还原酶和2KLG(这里所用的)的450μl样品放入一微量离心管中并在水浴中加热。在从10-30分钟的时间过程中取出8或9个等分试样。将每个等分试样放在冰上并在实验结束时一式两份地测定。将时间与剩余活性作图。Kf是通过使用计算机作图程序拟合该线条求解指数衰减确定的。然后将该值用于计算半衰期(Fersht，A.″酶的结构和机理″(1977)W.H.Freeman and Co.)。结果示于下表4中。
  NaKLG浓度   0mM   100mM   200mM   300mM   400mM
  半衰期(分钟)   3.5+/-0.5   5.5+/-1   7.5+/-1.5   10+/-3   18.5+/-3
正如表4中的结果显示的，NaKLG显然稳定了还原酶，并且该稳定作用为浓度依赖性的。
该数据说明，增加量的盐可以稳定还原酶。可用于生物反应器的适宜盐包括硫酸铵、乙酸钠、乙酸铵、氯化铵、硫酸钠、磷酸钾、磷酸钠、氯化钠、KCl、NH4Cl、K2SO4和NaI。本领域技术人员应意识到，盐的最佳范围应为温度依赖性的。因此，在生物反应器中，或者可以改变温度，或者可以改变盐浓度，或者将两者加以改变，从而达到还原酶的所需稳定性。如表4所示，在典型生物反应器运行的较低温度下，为了提供相同量的还原酶的稳定作用必须使用较少的盐。
实施例IX
实施例IX描述了一种测定NADPH/NADP+的比和反应平衡的方法。
还原辅因子(NADPH)在340nm下具有强的吸光度，而氧化辅因子(NADP+)在该波长下不吸收。因此，如果两个辅因子混合在一起时，通过340nm下的吸光度可以确定存在的NADPH的量。如果最初加入的NADP+的量也是已知的话，那么就可以容易地测定这两种辅因子的比。该方法可用于测定各种组分加入到反应，如辅因子再循环反应中是如何影响反应平衡的。
在室温下在比色杯中建立一1ml反应。该反应是由缓冲液(50mMbis-tris，pH7)、5mg葡萄糖、5mg 2,5-DKG、100μM NADPH、100μM NADP+、还原酶和葡萄糖脱氢酶(GDH)组成的。将这些酶最后加入，开始反应，并在340nm下监控辅因子水平。达到平衡之后(图7)，加入另外的GDH等分试样。很快平衡偏移，有利于更多NADPH出现。加入更多的GDH得到相同反应。
如上建立另一1ml温育反应。达到平衡之后，将29mg的NaCl加入其中，使最终浓度为0.5M NaCl。如图8所示，这引人注目地使平衡向有利于NADPH出现偏移。
实施例X
实施例X描述了辅因子再循环反应。
通过将还原酶、GDH、葡萄糖、2,5-DKG和NADP+加入反应容器中进行辅因子再循环反应。此外，向一些反应中加入纯化的2-KLG，在有产物的情况下评价该反应。保持这些反应以产生葡糖酸和2-KLG。通过这两种酶的作用使辅因子在NADP+和NADPH之间再循环。定期取出等分试样并通过HPLC分析底物和产物的存在。在室温下将该反应保持至少20小时。
使反应小至3ml。在反应中，将还原酶、GDH、10mg/ml葡萄糖和10mg/ml冻干的2,5-DKG加入50mM bis-tris缓冲液中。以75mg/ml的浓度将2-KLG加入一些温育反应中。在室温下通过加入NADP+(400μM)开始反应。通过加入少量NaOH维持溶液pH在6-7.5。将等分葡萄糖和2,5-DKG定期加入。在一天结束时，将该反应放在4℃下过夜。第二天早晨将其温热至室温，调整其pH，继续反应。取出少量等分试样并将其注射到HPLC上。通过与一标准比较，可以计算出制备的葡糖酸和2-KLG的量。在一典型反应中，至少60％的葡萄糖转化成葡糖酸，并且至少60％的2,5-DKG转化成2-KLG。
实施例XI
实施例XI描述了NaCl动力学。
当将NaCl(100mM或更高)加入含有250μM NADPH和10-20mM DKG的标准还原酶测定时，还原酶速度降低。通过进行动力学分析，发现氯化钠增加辅因子NADPH的还原酶的Km。当加入更多的NaCl时，Km增加。如果使用不完全饱和量的NADPH，那么还原酶看来受到NaCl抑制。为了抵消该影响，将更多的NADPH加入反应中，这样其为该Km的几倍。该抑制模式显然为竞争性的。
使用标准技术测定有NaCl的情况下DKG的Km。将用于每次测定的NADPH的浓度加以调整，使其Km在每个NaCl浓度下为至少3倍。
  [NaCl]，mM   NADPH的Km(mM)   DKG的Km(mM)
  0   4-9   6-14
  100   30-100   6-14
  200   130-230   6-14
  400   260-360   6-14
实施例XII
实施例XII显示了2-KLG动力学。
使用标准生物化学技术测定有2-KLG时的DKG的Km。2-KLG的量在pH7缓冲液中从0变为150mM。在pH7的条件下的DKG的Km为10-12mM。当2-KLG的浓度增加时，2,5-DKG的Km降低。例如，在150mM 2-KLG下DKG的Km为2-4mM。反应速度也降低，当KLG的浓度从0增加至150mM时，反应速度降低2-4倍。这种行为与非竞争性抑制一致。
测定有100mM 2-KLG的NADPH的Km为4-9mM。这是在pH7下使用标准生物化学技术进行的，2,5-DKG的浓度大于14mM，并且NADPH浓度将Km值括入括号。
因此，在生物反应器环境中存在增加量的KLG可望降低还原酶活性，并减慢整个反应速度。克服该现象的两种途径是回收KLG，例如通过电渗析或者通过向生物反应器中加入更多的还原酶。
实施例XIII
实施例XIII描述了2,5-DKG的合成。
在适宜缓冲液中将柠檬泛菌细胞用150mM葡糖酸钠温育：使用pH6的25mM bis-tris或者25mM MOPS。将25ml细胞、缓冲液和底物加入一125ml带折流板的锥形瓶中，并在28℃和约250rpm摇动下温育。16-24小时之后，通过HPLC分析和活性测定监控该锥形瓶中形成的2,5-DKG。将这些细胞旋转下降并除去上清液。将物料无菌过滤，并且可以将它们贮藏在4℃下或冷冻。或者，可以将该物料冻干成固体。

Claims (28)

1.一种由碳源非发酵生产2-酮基-L-古洛糖酸的方法，包括任意顺序的以下步骤：
a)通过葡萄糖脱氢酶(GDH)将碳源酶促氧化成葡糖酸；
b)通过葡糖酸脱氢酶(GADH)将葡糖酸酶促氧化成2-酮基-D-葡糖酸(2-KDG)；
c)通过2-酮基-D-葡糖酸脱氢酶(KDGDH)将2-KDG酶促氧化成2，5-DKG；和
d)通过2，5-DKG还原酶(2，5-DKGR)将2，5-二酮基-D-葡糖酸(2，5-DKG)酶促还原成2-KLG，
其中
(i)所述碳源是一种6碳糖，6碳糖的组合，6碳糖酸或其能被转变成KDG，DKG或KLG的酶促衍生物，
(ii)GDH需要氧化形式的酶促辅因子，2，5-DKGR需要还原形式的所述酶促辅因子，氧化形式的辅因子和还原形式的辅因子在氧化步骤(a)和还原步骤(d)之间再循环，和
(iii)所述方法在包含肠杆菌科宿主细胞的环境中进行，所述肠杆菌科宿主细胞可以是存活的和/或非存活的。
2.权利要求1的方法，其中碳源为葡萄糖、葡糖酸、果糖、KDG、蔗糖或山梨糖。
3.权利要求1的方法，其中所述GDH得自细菌、酵母或真菌来源。
4.权利要求3的方法，其中GDH得自嗜酸热细菌、甲隐球菌或杆菌属菌种。
5.权利要求1的方法，其中GDH、GADH、KDGDH或2，5-DKGR中至少一种被固定化。
6.权利要求1的方法，其中GDH、GADH、KDGDH或2，5-DKGR中至少一种在溶解状态中。
7.权利要求1的方法，其中2，5-DKGR从细菌、酵母或真菌源获得。
8.权利要求7的方法，其中2，5-DKGR得自棒状杆菌属或欧文氏菌属。
9.权利要求1的方法，该方法在含有重组宿主细胞的环境中进行。
10.权利要求9的方法，其中宿主细胞为活的。
11.权利要求9的方法，其中宿主细胞为非存活的。
12.权利要求9的方法，其中重组宿主细胞包括肠杆菌科的成员。
13.权利要求9的方法，其中该方法在含有重组宿主细胞膜的环境中进行并且选自GDH、GADH、KDGDH和2，5-DKGR的至少一种酶与宿主细胞膜结合。
14.权利要求12的方法，其中重组宿主细胞为泛菌属菌种。
15.权利要求14的方法，其中重组宿主细胞为柠檬泛菌。
16.权利要求15的方法，其中重组宿主细胞具有灭活的膜结合的GDH。
17.权利要求16的方法，其中宿主细胞还含有编码GDH的异源核酸。
18.权利要求17的方法，其中编码GDH的异源核酸从嗜酸热细菌、甲隐球菌或杆菌属菌种获得。
19.权利要求1的方法，其中氧化形式的辅因子为NADP，还原形式的辅因子为NADPH。
20.权利要求1的方法，其中氧化形式的辅因子为NAD，还原形式的辅因子为NADH。
21.权利要求1的方法，该方法为连续方法。
22.权利要求1的方法，该方法为间歇方法。
23.权利要求1的方法，该方法在含有有机溶剂的环境中进行。
24.权利要求1的方法，该方法在含有长聚合物的环境中进行。
25.权利要求1的方法，还包括由2-KLG获得ASA的步骤。
26.一种由碳源非发酵生产2-KLG的方法，包括任意顺序的以下步骤：
a)通过葡萄糖脱氢酶(GDH)将含葡萄糖的碳源酶促氧化成葡糖酸；
b)通过葡糖酸脱氢酶(GADH)将葡糖酸酶促氧化成2-酮基-D-葡糖酸(2-KDG)；
c)通过2-酮基-D-葡糖酸脱氢酶(KDGDH)将2-KDG酶促氧化成2，5-二酮基-D-葡糖酸(2，5-DKG)；和
d)通过2，5-DKG还原酶(2，5-DKGR)将2，5-DKG酶促还原成2-KLG，
其中该方法在含有重组肠杆菌科宿主细胞的环境中进行，葡萄糖脱氢酶需要氧化形式的酶促辅因子，2，5-DKG还原酶需要还原形式的所述酶促辅因子，氧化形式的辅因子和还原形式的辅因子在葡萄糖脱氢酶和2，5-DKG还原酶之间再循环。
27.权利要求26的方法，其中所述重组肠杆菌科宿主细胞是泛菌属细胞。
28.权利要求27的方法，其中所述泛菌属细胞是柠檬泛菌细胞。
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