CN116622691A - 一种适用于低pH条件的葡萄糖异构酶及应用 - Google Patents
一种适用于低pH条件的葡萄糖异构酶及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及酶催化技术领域，尤其是一种适用于低pH条件的葡萄糖异构酶及应用，该葡萄糖异构酶氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。使用时，取D‑葡萄糖母液，加入PB、纯水，加入葡萄糖异构酶的粗酶液，于pH 5.8下，55℃‑85℃反应。本发明的葡萄糖异构酶能够在低pH条件下催化D‑葡萄糖生成D‑果糖；而且，与野生型葡萄糖异构酶相比，可应用于高温、高浓度转化D‑葡萄糖生成D‑果糖，表现出更强的热稳定性。
Description
技术领域
本发明涉及酶催化技术领域，具体领域为一种适用于低pH条件的葡萄糖异构酶。
背景技术
葡萄糖异构酶，也称为D-木糖异构酶，是一种具有极大工业应用价值的酶，在许多微生物中木糖代谢的第一步催化D-木糖异构化为木酮糖。木糖和木酮糖之间的相互转化为在腐烂的植物物质上生长的腐生细菌提供了营养需求，也有助于半纤维素生物转化为乙醇。其在二价金属离子(如Mg2+、Co2+或Mn2+)存在下，催化D-葡萄糖或D-木糖可逆异构化为D-果糖或D-木酮糖。葡萄糖异构酶参与糖代谢，并广泛用于果葡糖浆(HFCS)和生物乙醇的工业生产。这种异构化反应在工业过程中很重要，例如食品工业中果葡糖浆的生产。
在现有的果葡糖浆生产工艺中，来自中温微生物的不耐热葡萄糖异构酶被用于固定化酶反应器中，在50℃和58℃的操作温度下生产40％至42％的果葡糖浆，停留时间小于1小时。如果高于此温度，由于还原糖和蛋白质之间的非酶促反应(例如美拉德反应)，会形成不需要的褐变产物。然而，这种温度限制不利于高葡萄糖转化率。事实上，葡萄糖的异构化会达到一种反应平衡，该平衡在较高温度下向果糖转移。在这个过程中，需要额外昂贵的色谱步骤来获得所需的55％的果糖浆浓度。果葡糖浆-55是食品和软饮料用途所需的更理想的果葡糖浆品种。在果葡糖浆生产过程中，D-葡萄糖到D-果糖的最终转化率与温度高度依赖，往往温度越高更有利于D-果糖的产率。为了避免下游复杂的浓缩步骤，通过促进异构化反应平衡偏向D-果糖形成，直接获得果葡糖浆-55需要更高温度。理论上，由于异构化反应平衡，需要在高温(约95℃)和较低pH(约4.5–5.5)下进行异构化，才能在糖浆中达到所需的果糖水平。如果能够实现这一点，则不需要额外的浓缩步骤。
简言之，与目前使用的酶相比，工业上有价值的葡萄糖异构酶必须具有较低的pH值、较高的温度、对Ca2+抑制的抗性以及对葡萄糖有较高的亲和力。因此，目前有大量的研究工作致力于鉴定对葡萄糖具有更高亲和力的热稳定和酸稳定的葡萄糖异构酶。此外，重组DNA技术和蛋白质工程的进步为开发经济可行的商业工艺开辟了新的可能性。出于这个原因，研究人员试图分离出能够在高温下产生高活性和稳定性葡萄糖异构酶的微生物。
近年来，已经进行了一些实质性的尝试，以提高葡萄糖异构酶的活性或热稳定性，以增加可达到的D-果糖含量。已经从大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、梭菌、链霉菌、密苏里放线菌和嗜热热菌中报道了编码这些酶的基因序列。另外，研究人员也尝试通过蛋白突变体的形式达到这一目标，例如源自溶糖热厌氧杆菌菌株B6A的葡萄糖异构酶突变体W139F在80℃、pH 6.5条件下半衰期增加，对D-葡萄糖的催化效率比天然葡萄糖异构酶提高10倍。另有报告称溶钙土芽孢杆菌TK4的3个葡萄糖异构酶突变体H99Q、V184 T和D102N具有更高的热稳定性和pH稳定性。
美国专利WO2004/044129认为需要发掘在高温度和低pH下保持高水平活性的葡萄糖异构酶。然而，该文件中公开的肽仅在pH 5以上具有最佳活性并且在90℃以上不稳定。更重要的是，为了保持高水平的活性，这些酶需要钴(Co2+)作为辅因子。而Co2+并不适用于生产供人类食用的果葡糖浆。它不仅与许多可能的健康问题相关,而且废弃介质的处理也可能导致环境污染。最适用的离子为在食品相关应用常用的包括Mn2+和Mg2+等。然而，这些离子通常仅在与来自非嗜热生物或仅微嗜热生物的酶结合时才有效。
因此，适用于食品工业的最佳葡萄糖糖异构酶应该符合以下条件：它在酸性条件下(即pH值约为6或更低)仍可高效地发挥作用，以避免褐变反应；它可以耐受较高的底物与产物抑制(例如大于200g/L葡萄糖)，以便提高单位体积的生产效率；它应在高反应温度(即80℃或更高)下保持稳定，以促进果糖高转化率；它具有较高的催化活性，可在较短时间内达到反应平衡点，减少能耗及人力消耗；它可不使用有害的金属离子，例如Co2+；它可以在常用微生物如大肠杆菌或芽孢杆菌中高效大量地进行重组制备，以便于生产和降低成本。
因此，开发一种新的葡萄糖异构酶或突变体，提高低pH耐受性、高温耐受性及高温反应条件下的催化效率，具有很大的实用价值。
发明内容
本发明的目的在于提供一种适用于低pH条件的葡萄糖异构酶及应用。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种适用于低pH条件的葡萄糖异构酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
本发明的适用于低pH条件的葡萄糖异构酶可用于催化D-葡萄糖生成D-果糖，其使用方法为：取D-葡萄糖母液，加入PB、纯水，加入葡萄糖异构酶的粗酶液，于pH 5.8下，55℃-85℃反应。
其中，所述粗酶液的制备方法包括以下步骤：
(1)通过引物拼接的方法，将SEQ ID NO：1所示蛋白的对应编码多核苷酸序列进行组装，并克隆到原核表达载体，以实现在大肠杆菌中的高表达；
(2)采用摇瓶发酵或者分批补料发酵
①摇瓶发酵
挑取含有表达载体的大肠杆菌单菌落接种于10mL高压灭菌后的培养基A中，30℃，250rpm过夜培养；
次日取1L三角瓶，按1：100的接种比实施例接入到100mL高压灭菌后的培养基B中，于30℃中培养至菌体OD 5-6，立刻将三角瓶置于25℃摇床中，250rpm培养1小时。加IPTG至终浓度0.1mM，并于25℃，250rpm继续培养16小时；
培养结束后，将培养液于4℃，12000g下离心20分钟收集湿菌体；然后将菌体沉淀用蒸馏水清洗两次，收集菌体，-70℃保存；同时取少量菌体进行SDS-PAGE检测；
②分批补料发酵
分批补料发酵在计算机控制的生物反应器中进行，将含有表达载体的大肠杆菌单菌落制备200ml种子摇瓶，当种子摇瓶的培养物为OD2.0时接入所述生物反应器；在整个发酵过程中，温度保持37℃，发酵过程中溶解氧浓度由搅拌速率和通气供应级联自动控制在30％，而培养基的pH值由50％v/v正磷酸和30％v/v氨水维持在7.0；发酵过程中，当出现大幅的溶氧回升时，开始补料，补料溶液含有9％w/v蛋白胨、9％w/v酵母提取物、14％w/v甘油；当OD600为50.0时，控制温度为25℃，并用0.1mM IPTG诱导表达16小时，离心收菌体-25℃保存，使用时按每公斤湿菌体加入2公斤纯水使用。
其中，所述培养基A为：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，磷酸氢二钠3.55g/L，磷酸二氢钾3.4g/L，氯化铵2.68g/L，硫酸钠0.71g/L，七水硫酸镁0.493g/L，六水氯化铁0.027g/L，甘油5g/L，葡萄糖0.8g/L，添加卡那霉素至50mg/L。
其中，所述培养基B为：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，磷酸氢二钠3.55g/L，磷酸二氢钾3.4g/L，氯化铵2.68g/L，硫酸钠0.71g/L，七水硫酸镁0.493g/L，六水氯化铁0.027g/L，甘油5g/L，葡萄糖0.3g/L，添加卡那霉素至50mg/L。
其中，分批补料发酵所用的培养基为：酵母抽提物24g/L，蛋白胨12g/L，葡萄糖0.4％，2.31g/L磷酸二氢酶和12.54g/L磷酸氢二钾，pH 7.0。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明的葡萄糖异构酶能够于低pH条件下催化D-葡萄糖生成D-果糖。而且，与野生型葡萄糖异构酶相比，可应用于高温、高浓度下转化D-葡萄糖生成D-果糖，表现出更强的热稳定性，可取得较好的社会效益和经济价值。
附图说明
图1为20g/L果糖高效液相色谱结果。8.4分钟为产物果糖峰。
图2为20g/L葡萄糖高效液相色谱结果。10分钟为葡萄糖峰。
图3为对比例1反应4小时的检测结果。
图4为对比例1反应19小时的检测结果。
图5为实施例5反应4小时的检测结果。
图6为实施例5反应19小时的检测结果。
图7为实施例6反应19小时的检测结果。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
在本实施例中所用到的仪器、试剂，除非有特殊说明，均为市售产品。
以下实施例中涉及到的液相检测条件如下：
流动相：乙腈：水＝70：30
检测器：示差检测器
流速：1mL/min
柱温：40℃
示差检测器池温度：40℃
使用250mm*4.6μm氨基柱。
实施例1野生型葡萄糖异构酶基因序列的获得
通过全基因合成的方法，对基因的二级结构以及密码子偏好性进行调整，以实现在大肠杆菌中的高表达。利用Primer Premier(http://primer3.ut.ee/)和OPTIMIZER(http://genomes.urv.es/OPTIMIZER/)进行设计，并保证退火温度(Tm)差异控制在3℃以内，引物长度控制在60base以内，引物序列如表2所示，并将获得的引物加双蒸水溶解后，加到如下的反应体系中，使得各引物的终浓度为30nM，首尾引物的终浓度为0.6μM。
表1
| 2mM dNTP mix(2mM eachdNTP) | 5μl |
| 10×Pfubuffer | 5μl |
| Pfu DNA polymerase(10U/μl) | 0.5μl |
| ddH2O | 使得反应体系总体积至50μl |
将配制好的PCR反应体系置于博日XP cycler基因扩增仪中，按下列程序进行扩增：98℃30s，55℃45s，72℃120s，35x。将PCR得到的DNA片段进行切胶纯化，利用同源重组的方法克隆进pET30a的NdeI/XhoI位点。挑取单克隆进行测序。测序成功的DNA序列为SEQ IDNO：4，命名为MTGIwt，其对应的氨基酸序列为SEQ ID NO：3。
表2
实施例2葡萄糖异构酶突变体基因序列的获得
本发明的适用于低pH条件的葡萄糖异构酶，其源于SEQ ID NO：3的野生型葡萄糖异构酶。葡萄糖异构酶突变体和编码这种突变体的多核苷酸可以使用本领域技术人员通常使用的方法制备。突变体可以通过使编码该酶的体外重组、多核苷酸诱变、DNA改组、易错PCR和定向进化方法等获得。
通过全基因合成的方法，对基因的二级结构以及密码子偏好性进行调整，以实现在大肠杆菌中的高表达。利用Primer Premier(http://primer3.ut.ee/)和OPTIMIZER(http://genomes.urv.es/OPTIMIZER/)进行设计，并保证退火温度(Tm)差异控制在3℃以内，引物长度控制在60base以内，引物序列如表4所示，并将获得的引物加双蒸水溶解后，加到如下的反应体系中，使得各引物的终浓度为30nM，首尾引物的终浓度为0.6μM。
表3
| 2mM dNTP mix(2mM eachdNTP) | 5μl |
| 10×Pfubuffer | 5μl |
| Pfu DNA polymerase(10U/μl) | 0.5μl |
| ddH2O | 使得反应体系总体积至50μl |
将配制好的PCR反应体系置于博日XP cycler基因扩增仪中，按下列程序进行扩增：98℃30s，55℃45s，72℃120s，35x。将PCR得到的DNA片段进行切胶纯化，利用同源重组的方法克隆进pET30a的NdeI/XhoI位点。挑取单克隆进行测序。测序成功的DNA序列为SEQ IDNO：2，命名为MTGI1，其对应的氨基酸序列为SEQ ID NO：1。与MTGIwt的序列相比，具有三处突变A276S，Q326R，A327S。
表4
实施例3摇瓶表达测试
挑取含有表达载体的大肠杆菌单菌落接种于10ml高压灭菌后的培养基中：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，磷酸氢二钠3.55g/L，磷酸二氢钾3.4g/L，氯化铵2.68g/L，硫酸钠0.71g/L，七水硫酸镁0.493g/L，六水氯化铁0.027g/L，甘油5g/L，葡萄糖0.8g/L，添加卡那霉素至50mg/L。30℃，250rpm过夜培养。
次日取1L三角瓶，按1：100的接种比例接入到100ml高压灭菌后的培养基中：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，磷酸氢二钠3.55g/L，磷酸二氢钾3.4g/L，氯化铵2.68g/L，硫酸钠0.71g/L，七水硫酸镁0.493g/L，六水氯化铁0.027g/L，甘油5g/L，葡萄糖0.3g/L，添加卡那霉素至50mg/L。于30℃中培养至菌体OD 5-6，立刻将三角瓶置于25℃摇床中，250rpm培养1小时。加IPTG至终浓度0.1mM，并于25℃，250rpm继续培养16小时。
培养结束后，将培养液于4℃，12000g下离心20分钟收集湿菌体。然后将菌体沉淀用蒸馏水清洗两次，收集菌体，-70℃保存。同时取少量菌体进行SDS-PAGE检测。
实施例4分批补料发酵
分批补料发酵在计算机控制的生物反应器(上海国强)中进行，反应器容量为15L，工作体积为8L，所用到的培养基为酵母抽提物24g/L，蛋白胨12g/L，葡萄糖0.4％，2.31g/L磷酸二氢酶和12.54g/L磷酸氢二钾，pH 7.0。
将含有表达载体的大肠杆菌单菌落制备200ml种子摇瓶，当种子摇瓶的培养物为OD2.0时接入所述生物反应器。在整个发酵过程中，温度保持在37℃，发酵过程中溶解氧浓度由搅拌速率(rpm)和通气供应级联自动控制在30％，而培养基的pH值由50％(v/v)正磷酸和30％(v/v)氨水维持在7.0。发酵过程中，当出现大幅的溶氧回升时，开始补料。补料溶液含有9％w/v蛋白胨、9％w/v酵母提取物、14％w/v甘油。当OD600约为50.0(湿重约为100g/L)时，控制温度为25℃，并用0.1mM IPTG诱导表达16小时，离心收菌体-25℃保存，使用时按每公斤湿菌体加入2公斤纯水使用。
对比例1低pH反应对照实例
10ml反应管中配制2ml体系，50mM PB缓冲液pH5.8，10mM MgSO4，0.5mM MnCl2，400g/L D-葡萄糖，50μl/ml的MTGIwt粗酶液。55℃水浴反应4小时、19小时分别取样。点板并稀释3倍后高效液相检测，如图3-4所示，结果显示19小时果糖浓度为26.57g/L，低pH时MTGIwt活性被严重抑制。
实施例5低pH反应实例
10ml反应管中配制2ml体系，50mM PB缓冲液pH5.8，10mM MgSO4，0.5mM MnCl2，400g/L D-葡萄糖，50μl/ml的MTGI1粗酶液。55℃水浴反应4小时、19小时分别取样。点板并稀释3倍后高效液相检测，如图5-6所示，结果显示19小时果糖浓度为203.6g/L，低pH底物时MTGI1仍具有较高活性。
实施例6低pH高浓度高温反应实例
10ml反应管中配制2ml体系，50mM PB缓冲液pH5.8，10mM MgSO4，0.5mM MnCl2，600g/L D-葡萄糖，50μl/ml的MTGI1粗酶液。85℃水浴反应19小时取样。点板并稀释5倍后高效液相检测，如图7所示，结果显示19小时果糖浓度为315.65g/L，高温高浓度底物时MTGI1仍具有较高活性。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (7)
1.一种适用于低pH条件的葡萄糖异构酶，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
2.权利要求1所述适用于低pH条件的葡萄糖异构酶在催化D-葡萄糖生成D-果糖中的应用。
3.根据权利要求2所述适用于低pH条件的葡萄糖异构酶在催化D-葡萄糖生成D-果糖中的应用，其特征在于：取D-葡萄糖母液，加入PB、纯水，加入权利要求1所述葡萄糖异构酶的粗酶液，于pH 5.8下，55℃-85℃反应。
4.根据权利要求3所述适用于低pH条件的葡萄糖异构酶在催化D-葡萄糖生成D-果糖中的应用，其特征在于，所述粗酶液的制备方法包括以下步骤：
(1)通过引物拼接的方法，将SEQ ID NO：1所示蛋白的对应编码多核苷酸序列进行组装，并克隆到原核表达载体，以实现在大肠杆菌中的高表达；
(2)采用摇瓶发酵或者分批补料发酵
①摇瓶发酵
挑取含有表达载体的大肠杆菌单菌落接种于10mL高压灭菌后的培养基A中，30℃，250rpm过夜培养；
次日取1L三角瓶，按1：100的接种比实施例接入到100mL高压灭菌后的培养基B中，于30℃中培养至菌体OD 5-6，立刻将三角瓶置于25℃摇床中，250rpm培养1小时。加IPTG至终浓度0.1mM，并于25℃，250rpm继续培养16小时；
培养结束后，将培养液于4℃，12000g下离心20分钟收集湿菌体；然后将菌体沉淀用蒸馏水清洗两次，收集菌体，-70℃保存；同时取少量菌体进行SDS-PAGE检测；
②分批补料发酵
分批补料发酵在计算机控制的生物反应器中进行，将含有表达载体的大肠杆菌单菌落制备200ml种子摇瓶，当种子摇瓶的培养物为OD2.0时接入所述生物反应器；在整个发酵过程中，温度保持37℃，发酵过程中溶解氧浓度由搅拌速率和通气供应级联自动控制在30％，而培养基的pH值由50％v/v正磷酸和30％v/v氨水维持在7.0；发酵过程中，当出现大幅的溶氧回升时，开始补料，补料溶液含有9％w/v蛋白胨、9％w/v酵母提取物、14％w/v甘油；当OD600为50.0时，控制温度为25℃，并用0.1mM IPTG诱导表达16小时，离心收菌体-25℃保存。
5.根据权利要求4所述适用于低pH条件的葡萄糖异构酶在催化D-葡萄糖生成D-果糖中的应用，其特征在于：粗酶液制备方法中，所述培养基A为：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，磷酸氢二钠3.55g/L，磷酸二氢钾3.4g/L，氯化铵2.68g/L，硫酸钠0.71g/L，七水硫酸镁0.493g/L，六水氯化铁0.027g/L，甘油5g/L，葡萄糖0.8g/L，添加卡那霉素至50mg/L。
6.根据权利要求4所述适用于低pH条件的葡萄糖异构酶在催化D-葡萄糖生成D-果糖中的应用，其特征在于：粗酶液制备方法中，所述培养基B为：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，磷酸氢二钠3.55g/L，磷酸二氢钾3.4g/L，氯化铵2.68g/L，硫酸钠0.71g/L，七水硫酸镁0.493g/L，六水氯化铁0.027g/L，甘油5g/L，葡萄糖0.3g/L，添加卡那霉素至50mg/L。
7.根据权利要求4所述适用于低pH条件的葡萄糖异构酶在催化D-葡萄糖生成D-果糖中的应用，其特征在于：粗酶液制备方法中，分批补料发酵所用的培养基为：酵母抽提物24g/L，蛋白胨12g/L，葡萄糖0.4％，2.31g/L磷酸二氢酶和12.54g/L磷酸氢二钾，pH 7.0。
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