JP2003517278A

JP2003517278A - アスコルビン酸中間体の製造法

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Publication number: JP2003517278A
Application number: JP2000589720A
Authority: JP
Inventors: ボストン，マシュー・ジー; スワンソン，バーバラ・エイ
Original assignee: ジェネンコアインターナショナルインコーポレーテッド
Priority date: 1998-12-22
Filing date: 1999-12-22
Publication date: 2003-05-27
Also published as: CA2776920A1; CZ20012285A3; BR9916848A; CZ298605B6; CA2371534C; WO2000037667A1; DE69931394D1; AU2485500A; KR20010093149A; US20020177197A1; US20020177198A1; US6599722B2; EP1141368A1; EP1141368B1; CN1331749A; US20040180413A1; MXPA01006337A; CA2371534A1; DK1141368T3; KR100750363B1

Abstract

(57)【要約】本発明は、ASA中間体であるKDG、DKG、およびKLGを製造するための非発酵的方法、ならびに補因子を再生するための方法に関する。本発明は、本発明の方法において有用な酵素をコード化する異種核酸を含んだ遺伝子組換え細胞を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】発明の分野本発明は経路エンジニアリング(pathway engineering)に関し、特にアスコル
ビン酸中間体を製造するための生体触媒法に関する。本発明は特に、アスコルビ
ン酸中間体を非発酵系にて製造するための方法を提供する。

【０００２】発明の背景 L-アスコルビン酸(ビタミンC, ASA)は、製薬工業や食品産業においてビタミン
や酸化防止剤として使用されている。市場規模が比較的大きいことと、特殊化学
品としての価値が高いことから、ASAの合成は、長年にわたって高い関心を呼ん
でいる。Reichstein-Grussner法(グルコースからASAまでの化学的経路)が1934年
に先ず開示された(Helv. Chim. Acta 17:311-328)。Lazarusら(1989, "Vitamin
C: Bioconversion via a Recombinant DNA Approach", Genetics and Molecular Biology of Industrial Microorganisms , American Society for Microbiology
, ワシントンD.C., C.L.Hershberger編集)は、ASAの中間体である2-ケト-L-グロ
ン酸(2-KLG, KLG)(ASAに化学的に転化させることができる)を製造するための生
物学的変換法を開示した。炭素供給源からKLGへのこうした生物学的変換には種
々の中間体が関与し、その酵素作用プロセスは、補因子依存性のレダクターゼ活
性物質と関係している。酵素作用によって補因子を再生させるには、酸化される
別の基質を犠牲にして補因子(たとえば、NADHに対するNAD+、またはNADPHに対す
るNADP+)を再生させる酵素を使用する必要がある。

【０００３】現時点においても、ASA中間体を製造するための経済的に実現可能な方法が依
然として求められている。特に、このような方法が補因子を必要とする酵素活性
物質を使用する場合、補因子の再生をもたらす方法を得ることがとりわけ望まし
い。本発明はこうしたニーズに応えている。

【０００４】発明の概要本発明は、生体触媒環境における、炭素供給源からのASA中間体(例えばKDG、D
KG、およびKLG)の非発酵的製造、および所望の最終生成物(例えば、エリソルビ
ン酸塩（ｅｒｙｔｈｏｒｂａｔｅ）やアスコルビン酸)への転化に関する。この
とき前記生体触媒環境を本明細書ではバイオリアクターと呼ぶ。本発明の生体触
媒環境は、炭素供給源を所望の中間体に処理できる少なくとも1種の酵素活性物
質を含有する生存性または非生存性の宿主細胞を含んでもよい。1つの実施態様
においては、バイオリアクターからの所望の中間体を電気透析により精製してか
ら所望の最終生成物にする。図2は、これら中間体と生成物の産生についての概
略図である。

【０００５】本発明はさらに、必要な補因子が再生されるという状況にてASA中間体を製造
するための非発酵プロセスに関する。本発明はその一部が、炭素供給源からKLG
を製造するために触媒量の補因子を非発酵(すなわちインビトロ)法にて再生でき
る、という発見に基づいている。本発明の1つの実施態様においては、必要とさ
れる補因子をバイオリアクターからナノ濾過を介して精製して再使用する。

【０００６】 KDGが所望のASA中間体である場合は、バイオリアクターに炭素供給源を供給し
、この炭素供給源を、生体触媒作用により少なくとも１回の酸化工程を介してKD
Gに転化させる。この実施態様においては、KDGが他の中間体または生成物にさら
に転化されないようにKDG酸化することに対して特異的な酸化酵素活性物質をコ
ード化する遺伝子の突然変異体を宿主細胞が含んでよい。

【０００７】 DKGが所望のASA中間体である場合は、バイオリアクターに炭素供給源を供給し
、この炭素供給源を、生体触媒作用により少なくとも１回の酸化工程を介してDK
Gに転化させる。使用する宿主細胞によって異なるが、宿主細胞は、DKGが他の中
間体にさらに転化されないように酸化酵素活性物質もしくは還元酵素活性物質を
コード化する遺伝子の突然変異体を含んでよい。

【０００８】 KLGが所望のASA中間体である場合は、バイオリアクターに炭素供給源を供給し
、この炭素供給源を、生体触媒作用により少なくとも１回の酸化工程と少なくと
も１回の還元工程を介してKLGに転化させる。使用する宿主細胞によって異なる
が、宿主細胞は、KLGが他の中間体にさらに転化されないように酸化酵素活性物
質もしくは還元酵素活性物質をコード化する遺伝子の突然変異体を含んでよい。
酸化工程と還元工程が補因子を必要とするときに、本発明の方法は、補因子を再
生するための手段となる。

【０００９】 1つの実施態様においては、宿主細胞が組換え型であって、少なくとも1種の異
種酵素活性物質を含む。ある実施態様においては、酵素活性物質を宿主細胞膜に
結合させ; 他の実施態様においては、酵素活性物質が溶液の形態をとっており;
さらに他の実施態様においては、酵素活性物質が細胞の内部に溶解可能であり;
そしてさらに他の態様においては、酵素活性物質を固定化させる。本発明の方法
は、バッチ操作としても連続操作としても実施することができる。宿主細胞はエ
ンテロバクテリアセア科(the family Enterobacteriacea)のメンバーであるのが
好ましく、またある実施態様においては、該メンバーはパントエア種(a Pantoea
species)であり、特にパントエア・シトレア(Pantoea citrea)である。パント
エア・シトレア(Pantoea citrea)は、たとえばATCC受入れ番号39140を有するも
のをATCCから入手することができる。

【００１０】炭素供給源を所望の中間体に転化させるための酵素活性物質が得られるのであ
れば、宿主細胞を凍結乾燥することができ、透過処理することができ(permeabil
ized)、生存能力を低下させるよう処理することができ、あるいは細胞の増殖や
代謝のためにグルコースを利用しなくなるように突然変異体させることもできる
。これらの中間体をさらに処理して、エリソルビン酸塩やASAの最終生成物にす
ることができる。

【００１１】従って1つの態様においては、本発明は、炭素供給源を少なくとも1種の酸化酵
素活性物質よって酵素作用的に酸化してDKGまたはKDGを生成させる工程を含む、
炭素供給源からDKGまたはKDGを製造するための方法を提供する。他の実施態様に
おいては、本発明の方法は、炭素供給源を第1の酸化酵素活性物質によって酸化
して第1の酸化生成物を生成させる工程; および前記第1の酸化生成物を第2の酸
化酵素活性物質によって酸化してKDGを生成させる工程; を含む。1つの実施態様
においては、第1の酸化酵素活性物質はGDH活性物質であり、第2の酸化酵素活性
物質はGADH活性物質である。宿主細胞は、KDGがさらに酸化されないように、KDG
H活性物質をコード化する天然存在の核酸の突然変異体をさらに含んでよい。KDG
はさらに、エリソルビン酸塩に転化させることができる。これとは別に、本発明
の方法は、KDGを第3の酸化酵素活性物質によって酸化してDKGを生成させる工程
をさらに含んでもよい。

【００１２】 KLGの生成させようとするとき、炭素供給源がKDGであるか、あるいは炭素供給
源がKDGに転化されている場合、本発明の方法は、KDGを少なくとも1種の酸化酵
素活性物質によって酵素作用的に酸化して酸化生成物を得る工程; および前記酸
化生成物を少なくとも1種の還元酵素活性物質によって酵素作用的に還元して2-K
LGを得る工程; を含む。これとは別に、DKGが炭素供給源であるか、あるいは炭
素供給源がDKGに転化されている場合は、還元酵素活性物質によってDKGをKLGに
転化させる。

【００１３】本発明は、炭素供給源から2-KLGを非発酵的に製造するための方法を提供し、
このとき前記製造法は、炭素供給源を少なくとも1種の酸化酵素活性物質によっ
て酵素作用的に酸化して酸化生成物を得る工程; および前記酸化生成物を少なく
とも1種の還元酵素活性物質によって酵素作用的に還元して2-KLGを得る工程; を
あらゆる順序にて含む。1つの実施態様においては、前記酸化酵素活性物質が酸
化形態の酵素補因子を必要とし、前記還元酵素活性物質が還元形態の前記酵素補
因子を必要とし、前記酸化形態の前記補因子と前記還元形態の前記補因子が少な
くとも１回の酸化工程と少なくとも１回の還元工程との間で再利用される。1つ
の実施態様においては、酸化形態の酵素補因子がNADP+であって、還元形態の前
記酵素補因子がNADPHである。他の実施態様においては、酸化形態の酵素補因子
がNAD+であって、還元形態の前記酵素補因子がNADHである。本発明の方法に対し
て有用な他の補因子としては、ATP、ADP、FAD、およびFMNがある。

【００１４】本明細書に開示の1つの実施態様においては、本発明の方法は、炭素供給源を
第1の酸化酵素活性物質によって酵素作用的に酸化して第1の酸化生成物を得る工
程; 前記第1の酸化生成物を第2の酸化酵素活性物質によって酵素作用的に酸化し
て第2の酸化生成物を得る工程; 前記第2の酸化生成物を第3の酸化酵素活性物質
によって酵素作用的に酸化して第3の酸化生成物を得る工程; および前記第3の酸
化生成物を還元酵素活性物質によって酵素作用的に還元して2-KLGを得る工程;
をあらゆる順序にて含み、またこれらの工程は、プロセス中において同時的およ
び/または連続的に行ってよい。1つの実施態様においては、前記第1、第2、およ
び第3の酸化酵素活性物質の少なくとも1種が酸化形態の酵素補因子を必要とし、
前記還元酵素活性物質が還元形態の前記酵素補因子を必要とし、このとき前記酸
化形態の前記補因子と前記還元形態の前記補因子が少なくとも１回の酸化工程と
還元工程との間で再利用される。

【００１５】１つの実施態様においては、本発明の方法は有機溶媒を含んだ環境において行
われ、他の実施態様においては、本発明の方法は長鎖ポリマーを含んだ環境にお
いて行われる。さらに他の実施態様においては、本発明の方法はある濃度範囲の
塩を含んだ環境において行われる。

【００１６】本発明はさらに、ASA中間体を製造するための方法において使用される酵素活
性物質を含んだ組換え宿主細胞とベクターとを提供する。1つの実施態様におい
ては、T.アシドフィラム種(T. acidophilum)、クリプトコッカス・ユニグッタラ
タス種(Cryptococcus uniguttalatus)、およびバシラス種(Bacillus species)を
含めた種から得られるGDH、および/またはコリネバクテリウム(Corynebacterium
)とアーウィニア(Erwinia)から得られるDKGレダクターゼをコード化する異種核
酸を宿主細胞が含む。

【００１７】好ましい実施態様の詳細な説明定義本明細書において使用している略語は以下の通りである: グルコース(G)、D-
グルコネート(GA)、2-ケト-D-グルコネート(2KDG)、2,5-ジケト-D-グルコネート
(2,5DKGまたはDKG)、2-ケト-L-グロン酸(2KLGまたはKLG)、L-イドン酸(IA)、ア
スコルビン酸(ASA)、グルコースデヒドロゲナーゼ(GDH)、グルコン酸デヒドロゲ
ナーゼ(GADH)、2,5-ジケト-D-グルコネートレダクターゼ(DKGR)、および2-ケト-
D-グルコネートレダクターゼ(KDGDH)。

【００１８】本明細書にて使用している“非発酵的(non-fermentative)”あるいは“インビ
トロ”とは、細胞の酵素活性物質を利用する生体触媒プロセスを表わしている。
細胞は、生存能力があってもなくてもよく、またそれほど増殖しなくてもよい。
グルコースおよび/または生成される全ての中間体を消費しないように、細胞を
遺伝学的に変えることができる。本発明のインビトロプロセスは、生体触媒プロ
セスに関連した酵素活性物質を含む細胞膜を使用すること; 生体触媒プロセスに
関連した酵素活性物質を含む透過処理細胞(permeabilized cells)もしくは凍結
乾燥細胞を使用すること; ならびに炭素供給源を、GA、KDG、DKG、およびKLG(こ
れらに限定されない)を含めたASA中間体のいずれかに生体触媒作用的に転化させ
るのに必要な酵素活性物質を供給する宿主細胞またはあらゆる形態の宿主細胞膜
もしくは宿主細胞フラグメントを使用すること; を含む。細胞は、所望の酵素活
性物質をコード化する異種核酸を含んだ組換え細胞であっても、あるいは所望の
酵素活性物質を含んだ天然存在の細胞であってもよい。本明細書で使用している
“バイオリアクター”とは、非発酵的もしくはインビトロプロセスが行われる環
境を表わしている。

【００１９】酵素の多くは、補因子(たとえば、NAD+やNADP+)の存在下でのみ活性を示す。
本明細書で使用している補因子とは、酵素反応に対する作用が本質的に二次的で
はあるが、酵素反応に不可欠であるような基質を表わしている。本明細書で使用
している“補因子”としては、NAD+/NADH、NADP+/NADPH、ATP、ADP、FAD/FADH₂
、およびFMN/FMNH₂などがあるが、これらに限定されない。インビトロ系内にお
ける“補因子の再生”または“補因子の再利用”とは、生体触媒作用全体にわた
って必要な補因子が連続的に酸化・還元されるという現象を表わしており、こう
した連続的な酸化・還元により、必要とされる補因子が、酵素触媒作用が起こる
のに適した形態にて存在する。本発明においては、補因子を再生することにより
、還元酵素に対して還元形態の補因子が利用でき、また酸化酵素に対して酸化形
態の補因子が利用できる、という環境が得られる。本発明は、炭素供給源からAS
A中間体(たとえばKLG)への生体触媒経路における、いずれかの酵素酸化工程とい
ずれかの酵素還元工程との間の補因子の再生を含む。必要とされる補因子は、宿
主細胞環境によって供給される触媒量にて存在していてもよいし、あるいはバイ
オリアクタープロセスの初期において、酸化形態または還元形態の化学量論量に
て外来的に供給してもよい。

【００２０】本明細書で使用している炭素供給源は、D形とL形の両方のグルコース、グロー
ス、ソルボース、フルクトース、イドース、ガラクトース、およびマンノース(
これらに限定されない)を含めた6炭素含有糖(6 carbon sugar)または6炭素含有
糖の組合わせ物(たとえばスクロース); 2-ケト-L-グロン酸、イドン酸、グルコ
ン酸、6-ホスホグルコネート、2-ケト-D-グルコン酸、5-ケト-D-グルコン酸、2-
ケトグルコネートホスフェート、2,5-ジケト-L-グルコン酸、2,3-L-ジケトグロ
ン酸、デヒドロアスコルビン酸、エリトロアスコルビン酸、およびD-マンノン酸
(これらに限定されない)を含めた6炭素含有糖酸(6 carbon sugar acid); ならび
に該炭素供給源がASA中間体(たとえばKDG、DKG、およびKLG)に転化可能であれば
上記物質の酵素誘導体; 等の、エンテロバクテリアセアエ(Enterobacteriaceae)
菌株によって通常使用される適切な炭素供給源を含む。

【００２１】本明細書で使用している“エンテロバクテリアセアエ(Enterobacteriaceae)”
科とは、グラム陰性であって通性嫌気性であるという一般的な特徴をもつ菌株を
表わしている。好ましいエンテロバクテリアセアエ(Enterobacteriaceae)菌株は
、D-グルコース溶液から2,5-ジケト-D-グルコン酸を生成できる菌株である。D-
グルコース溶液から2,5-ジケト-D-グルコン酸を生成できるエンテロバクテリア
セアエ(Enterobacteriaceae)科に含まれるものとしては、たとえばアーウィニア
(Erwinia)属、エンテロバクター(Enterobacter)属、グルコノバクター(Gluconob
acter)属、およびパントエア(Pantoea)属などがある。炭素供給源からASAへの微
生物による炭水化物経路における中間体としては、GA、2-KDG、2,5-DKG、5-DKG
、2-KLG、およびIAなどがあるが、これらに限定されない。本発明においては、
好ましいエンテロバクテリアセアエ(Enterobacteriaceae)発酵菌株はパントエア
(Pantoea)種、特にパントエア・シトレア(Pantoea citrea)である。アスコルビ
ン酸には4種の立体異性体が可能である。すなわち、L-アスコルビン酸、D-アラ
ボアスコルビン酸(エリソルビン酸)(ビタミンC活性を示す)、L-アラボアスコル
ビン酸、およびD-キシロアスコルビン酸である。本明細書で使用しているASA中
間体は、KDG、DHG、およびKLG(これらに限定されない)を含めて、ASAへの経路に
おける全ての生成物を含む。

【００２２】本明細書で使用している“組換え型”とは、有機体中に天然には存在しない核
酸を含有する宿主細胞、および/または組換え導入された内生核酸の追加コピー
を有する宿主細胞を表わしている。本明細書で使用している“異種の”とは、宿
主細胞中に天然には存在しない核酸配列体またはアミノ酸配列体を表わしている
。本明細書で使用している“内生の”とは、宿主中に天然に存在している核酸を
表わしている。

【００２３】本明細書で使用している“核酸”とは、ヌクレオチド配列体もしくはポリヌク
レオチド配列体、前記配列体のフラグメントもしくは一部分、および二本鎖であ
っても一本鎖であってもよい(センス鎖を示していようと、アンチセンス鎖を示
していようと)ゲノム起点もしくは合成起点のDNAまたはRNAを表わしている。本
明細書で使用している“アミノ酸”とは、ペプチド配列体、蛋白質配列体、また
は前記配列体の一部分を表わしている。

【００２４】本明細書で使用している“突然変異”とは、核酸の生成物が不活性化されるか
又は除去されるような、核酸のあらゆる変化を表わしている。突然変異の例とし
ては、点変異、フレームシフト変異、および酵素活性物質(たとえば、酸化酵素
活性物質や還元酵素活性物質)をコード化する遺伝子の一部または全部の欠失な
どがあるが、これらに限定されない。KLGを生成(これにより補因子が再生される
)すべく開示されている1つの実施態様においては、膜結合されたGDH活性物質を
コード化する核酸に突然変異を起こさせ、これによって内生GDH活性物質を不活
性化させる。他の実施態様においては、2-ケト-D-グルコネートデヒドロゲナー
ゼ活性物質を不活性化させ、これによって中間体KDGの生成を最適化することが
できる。

【００２５】本明細書で使用している“酸化酵素”とは、ある酸化状態の基質をより高い酸
化状態の生成物へと変換する上で、その変換を触媒できる酵素または酵素系を表
わしている。本明細書で使用している“還元酵素”とは、ある酸化状態の基質を
より低い酸化状態の生成物へと変換する上で、その変換を触媒できる酵素または
酵素系を表わしている。D-グルコースのKLGへの生体触媒作用に関連した酸化酵
素としては、D-グルコースデヒドロゲナーゼ、D-グルコネートデヒドロゲナーゼ
、および2-ケト-D-グルコネートデヒドロゲナーゼなどがある。ASAの経路中間体
のKLGへの生体触媒作用に関連した還元酵素としては、2,5-ジケト-D-グルコネー
トレダクターゼ(DKGR)、2-ケトレダクターゼ(2-KR)、および5-ケトレダクターゼ
(5-KR)などがある。このような酵素は、宿主菌株によって天然に生成される酵素
、および組換え手段によって導入される酵素を含む。1つの実施態様においては
、本発明の方法は、天然に存在していて膜結合しているNADP+非依存性のGDH活性
物質を除去し、そしてNADP+依存性のサイトソルGDH活性物質を組換え導入したパ
ントエア・シトレア(Pantoea citrea)宿主細胞中で行われる。他の実施態様にお
いては、レダクターゼ活性物質をコード化する異種核酸を宿主細胞中に導入する
。好ましい実施態様においては、レダクターゼ活性物質は、コリネホルム(Coryn
eform)種またはアーウィニア(Erwinia)種から得ることができる。本明細書で使
用している“経路酵素(pathway enzyme)”とは、炭素供給源のASA中間体(たとえ
ばKDG、DKG、およびKLG)への生体触媒変換に関与する全ての酵素を表わしている
。

【００２６】本明細書で使用している“単離された”または“精製された”とは、天然に結
び付いている少なくとも１種の成分を取り除いた核酸、蛋白質、ペプチド、また
は補因子を表わしている。本発明においては、単離された核酸が、該核酸を構成
するベクターを含んでよい。

【００２７】当業者にとっては言うまでもないことであるが、糖類の酸誘導体は、溶液状態
であろうと、あるいはそれらが調製された溶液から析出して固体状態になってい
ようと、周囲の媒体に応じて種々のイオン化状態で存在することができる。この
ような分子を表わすために、たとえばイドン酸(idonic acid)等の用語を使用す
るときは、言及している有機分子の全てのイオン化状態を含むものとする。従っ
て、たとえば“イドン酸”、その結晶化形である“イドノラクトン(idonolacton
e)”、および“イドネート(idonate)”は同じ有機部分を表わしており、特定の
イオン化状態もしくは化学的形態を明示しているわけではない。

【００２８】詳細な記述本発明は、インビトロ環境もしくは非発酵環境において炭素供給源からASA中
間体(たとえばKDG、DKG、およびKLG)を生体触媒作用により生成させることに関
する。生成させようとする中間体によっては、本発明の方法において酵素補因子
を存在させなければならない。好ましい実施態様においては、酵素補因子が再生
される。補因子のコストが高いので、宿主細胞環境によって供給されるか又は外
来的に供給される触媒量の補因子を再生することが可能なインビトロプロセスを
使用するのが極めて有利である。

【００２９】 ASA中間体の非発酵的生成本発明は、ASA中間体を生成させるための手段を提供する。こうした中間体を
さらに処理して、ASA、ASA立体異性体、または他の生成物(たとえばエリソルビ
ン酸塩)にすることができる。1つの好ましい実施態様においては、生成される所
望のASA中間体はKDGであり、2-ケト-D-グルコネートデヒドロゲナーゼをコード
化する遺伝子の突然変異体を有する生存性もしくは非生存性のパントエア・シト
レア(Pantoea citrea)宿主細胞をバイオリアクターに供給する(実施例IIに記載)
。本実施態様においては、炭素供給源が、2回の酸化工程を介して(図2を参照)KD
Gに生体触媒作用的に転化される。本実施態様では、補因子を再生させる必要は
ない。

【００３０】 DKGが所望のASA中間体である場合は、3回の酸化工程を介して(図2を参照)DKG
に生体触媒作用的に転化される炭素供給源と生存性もしくは非生存性のパントエ
ア・シトレア(Pantoea citrea)宿主細胞とをバイオリアクターに供給する。本実
施態様では、補因子を再生させる必要はない。

【００３１】 KLGが所望のASA中間体である場合は、3回の酸化工程(図2を参照)と1回の還元
工程を介してKLGに生体触媒作用的に転化される炭素供給源(たとえばグルコース
)と生存性もしくは非生存性のパントエア・シトレア(Pantoea citrea)宿主細胞
とをバイオリアクターに供給する。本実施態様では、パントエア・シトレア(Pan
toea citrea)宿主細胞内に含まれている核酸によって、または外来的に供給され
る核酸によって、レダクターゼ活性物質をコード化することができる。本実施態
様では、第1の酸化酵素活性物質が酸化形態の補因子を必要とし、還元酵素活性
物質が還元形態の補因子を必要とする。好ましい実施態様においては、天然存在
のGDH活性物質を除去するようにパントエア・シトレア(Pantoea citrea)細胞に
変性を施し、そしてある補因子を必要とし、該補因子を再生する補因子リサイク
ル系をもたらすために、T.アシドフィラム種(T. acidophilum)、クリプトコッカ
ス・ユニグッタラタス種(Cryptococcus uniguttalatus)、またはバシラス種(Bac
illus species)から得ることができて、NADPH+に対する特異性を有する異種GDH
をパントエア(Pantoea)細胞中に導入する。本実施態様により補因子を再生する
ための手段が得られ、この結果、パントエア(Pantoea)細胞中にてKLGを生成させ
るために外来性の補因子をバイオリアクターに連続的に加える際のコストが不要
となる。本実施態様では、宿主細胞が2,5-DKGレダクターゼ活性物質をコード化
する核酸をさらに含むか、あるいは2,5-DKGレダクターゼをバイオリアクターに
外来的に加える。

【００３２】 KLGを製造するための他の態様においては、膜結合したGDHをコード化する核酸
を含んだパントエア・シトレア(Pantoea citrea)細胞、適切な酵素、および補因
子をバイオリアクターに仕込み、DKGに転化されるグルコン酸を加える。次いで
反応混合物を嫌気性にし、グルコースを加える。GDHがグルコースをGAに転化し
、レダクターゼがDKGをKLGに転化し、このとき補因子が再利用される。これらの
反応が完了したら、酸素を加えてGAをDKGに転化させ、サイクルを続ける。

【００３３】インビトロの生体触媒環境炭素供給源をASA中間体に転化させる生体触媒プロセスは、エンテロバクテリ
アセアエ(Enterobacteriaceae)菌株によって使用される適切な炭素供給源(たと
えばグルコース等の6炭素含有糖、あるいはたとえばKDG等の6炭素含有糖酸)から
始める。他の代謝産物源としては、ガラクトース、ラクトース、フルクトース、
またはこれらの酵素誘導体などがあるが、これらに限定されない。培地は、適切
な炭素供給源のほかに、適切な無機物、塩、補因子、緩衝剤、および培養物を維
持して所望する最終生成物の生成に必要な酵素経路を促進するための、当業者に
公知の他の成分を含有しなければならない。バイオリアクターのための好ましい
塩はNa⁺、K⁺、NH₄ ⁺、SO₄ ^2-、および酢酸塩である。先ず最初に細胞を増殖させ、
非発酵プロセスを起こさせるために、増殖に使用された炭素供給源を除去し、pH
を約pH4と約pH9との間に保持し、そして酸素を存在させる。

【００３４】インビトロの生体触媒プロセスにおいては、炭素供給源とその代謝産物の転化
が、酵素酸化工程を介して、又は酵素酸化工程と酵素還元工程とを介して進行し
(このときこれらの工程は宿主細胞内環境の外側で行われ、宿主細胞に関連した
酵素活性物質を利用する)、そして所望のASA中間体を生成させるための経路を介
して進行する。酵素工程は、バイオリアクター内で逐次的にも同時的にも行うこ
とができ、所望のASA中間体を生成させるために補因子を必要とする場合もある
。本発明は、宿主細胞が非生存性ではあるが、炭素供給源のASA中間体への生体
触媒作用において、所望の炭素供給源および/またはその代謝産物の酸化と還元
に対して酵素が利用できる状態のままであるように、宿主細胞を有機物質で処理
するというインビトロプロセス(実施例Vに記載)を含む。本発明はさらに、炭素
供給源のASA中間体への転化に対して酵素が利用できるように、宿主細胞を凍結
乾燥し、何らかの手段によって透過処理し、噴霧乾燥し、破砕処理し、あるいは
この他の処理を施す、というインビトロプロセスも含む。

【００３５】酸化酵素活性物質または還元酵素活性物質は、宿主細胞膜に結合させ、たとえ
ば樹脂〔ピアースケミカル社(Pierce Chemical Co.)から市販のアミノリンク(Am
inoLink)カップリング剤〕やバイオリアクター環境に溶解性のポリマーに固定化
することができる。好ましい実施態様においては、少なくとも１種の酸化酵素を
膜結合させる。この環境でのプロセスは、有機系、水系、あるいは両方の組合わ
せのいずれでも行うことがで、また1つ以上の容器にて行うことができる。1つの
実施態様においては、プロセスが2つの容器にて行われ、このとき1つは酸素を利
用し、1つは嫌気性である。たとえば、酸素を必要とする膜結合酵素(GDH、GADH
、KDGDH)を酸素を必要としない酵素(補因子依存性のGDH、補因子依存性のDKGR)
から単離することができ、従って酸素を必要とする容器としてより小さな体積の
格納容器の使用が可能となり、これによりコストの低減がはかれる。バイオリア
クターのプロセスは、バッチプロセスでも連続プロセスでも行うことができる。
バッチシステムでは、何を加えるかに関係なく、全てのブロスを同時に取り入れ
る。連続システムでは、下流のプロセシングのためにブロスを定期的に取り除く
とともに新たな基質を加える。生成される中間体は、イオン交換樹脂、吸着もし
くはイオン遅滞樹脂、活性炭、濃縮-結晶化、膜への通過などを含めめた種々の
方法によって発酵ブロスから回収することができる。

【００３６】バイオリアクタープロセスは、2種以上の細胞タイプを含んでもよい(たとえば
、第1の細胞が酸化活性物質を含み、第2の細胞が還元活性物質を含んでよい)。
他の実施態様においては、必要な酵素活性物質が、炭素供給源またはその誘導体
を転化させるのに利用しうる状態のままで存在するならば、宿主細胞を透過処理
または凍結乾燥処理する(Izumi et al., J. Ferment. Technol. 61(1983), 135-
142)。バイオリアクタープロセスは、数種の酵素活性物質を外来的に供給して、
そして酵素活性を安定化もしくは増大させる溶媒または長鎖ポリマーが供給され
ている環境にて行うことができる。本明細書に開示の実施態様においては、レダ
クターゼ活性を高めるためにメタノールまたはエタノールが使用されている。他
の実施態様においては、レダクターゼを安定化させるためにガフクアット(Gafqu
at)が使用されている(Gibsonらによる米国特許第5,240,843号を参照)。

【００３７】本明細書に記載の1つのバイオリアクターにおいては、宿主細胞は透過処理し
たパントエア・シトレア(Pantoea citrea)細胞であり、酵素作用での転化による
一連の酸化工程を受ける炭素供給源としてD-グルコースが供給される。酸化酵素
としては、GDH、GADH、およびDGDHがあり、還元工程はKLGを生成するための2DKG
Rを含む(米国特許第3,790,444号を参照)。当業者に公知の手段によって、本発明
の方法で得られるKLGをアスコルビン酸に、そしてKDGをエリソルビン酸塩にさら
に転化させることができる(たとえば、Reichstein and Grussner, Helv. Chim.
Acta., 17, 311-328 (1934)を参照)。

【００３８】補因子の再生本発明の方法の利点の1つは、経路酵素により必要とされる補因子が再生され
るという点にある。本発明の方法において使用できる補因子の例としては、NAD+
/NADH、NADP+/NADPH、ATP、ADP、FAD/FADH²、およびFMN/FMNH²などがあるが、こ
れらに限定されない。

【００３９】本発明の1つの実施態様においては、補因子の再生を含むプロセスにおいて炭
素供給源をKLGに転化させる(図1を参照)。この酵素補因子再生プロセスでは、1
当量のD-グルコースを1当量のD-グルコネートに酸化し、1当量のNADP+をGDHの触
媒作用によって1当量のNADPHに還元する。GDHによって生成された1当量のD-グル
コネートを1当量の2-KDGに酸化し、次いで膜結合したGADHとKDGDHの作用によっ
て1当量の2,5-DKGに酸化する。生成した1当量の2,5-DKGを1当量の2-KLGに還元し
、2,5-DKGレダクターゼの作用によってNADPHを1当量のNADP+に再び酸化する。別
の当量のD-グルコース酸化に対しても、同量の補因子を効果的に再利用すること
が可能である。他の補因子再生法としては、化学的手段、光化学的手段、および
電気化学的手段があり、このとき化学的手段、光化学的手段、および電気化学的
手段のいずれかによって1当量の酸化NADP+を1当量のNADPHに直接還元する。バイ
オリアクターに外来的に加える補因子の量は約1μM〜約5mMであり、好ましい実
施態様においては約5μM〜約1mMである。実施例に記載してあるように、NaClはN
ADPHに関してKmに影響を及ぼすが、KLG(帯電した化学種)はKmに影響を及ぼさな
い。従ってバイオリアクター中にNaClが存在する場合、最適速度を維持するため
にはより多くのNADPHが必要となるであろう。さらに、実施例に開示されている
ように、試験したほとんどの塩がレダクターゼの熱安定性に対して影響を及ぼし
た。当業者には周知のことであるが、バイオリアクターの条件(たとえば温度)に
応じて、熱安定性と許容しうる速度との間のバランスが得られるよう塩の量を調
節することができる。インビトロ系に外来的に加える補因子は、単独で加えても
よいし、あるいは炭素供給源のASA中間体への生体触媒転化に関連した他の物質
と組合わせて加えてもよい。本発明の方法は、キャリヤーに固定化された補因子
を使用すること、化学的に変性(たとえば長鎖ポリマーへの結合)された補因子を
使用すること、および補因子を単離形態もしくは精製形態にて使用することを含
む。

【００４０】必要とされる補因子は、ナノ濾過によって生体触媒環境から精製して再使用す
ることができる。補因子の保持のためにナノ濾過膜を使用する方法が、たとえば
Seelbachら(1997, Enzyme and Microbial Technology, vol20, p.389-392)によ
って説明されている。

【００４１】組換え法宿主細胞宿主細胞の炭水化物経路をASA中間体(たとえばKDG、DKG、またはKLG)に方向付
けるのに必要な酸化酵素または還元酵素は、宿主細胞中に天然に存在しない場合
は、当業者に公知の組換えDNA法によって導入することができる。これとは別に
、所望の経路を妨げる酵素を、組換えDNA法によって突然変異させることもでき
る。本発明は、組換え導入、および所望の経路を達成するのに必要なあらゆる酵
素もしくは中間体の突然変異を含む。

【００４２】本発明の1つの実施態様においては、複数の酸化工程と1回の還元工程とを介し
て炭素供給源(たとえばグルコース)をKLGに転化させる。本実施態様では、第1の
酸化工程と還元工程は補因子を必要とする。宿主細胞はパントエア・シトレア(P
antoea citrea)であり、グルコースデヒドロゲナーゼを(GDH)をコード化する天
然存在の核酸を、デヒドロゲナーゼ活性が取り除かれ、異種GDHが宿主細胞中に
導入されるように突然変異させる。本発明は、炭素フロー経路において生成に影
響を及ぼす酵素のさらなる突然変異を含んだ宿主細胞も含む。一般的な技術・手
法に関しては、たとえばManiatisらによる“1989, Molecular Cloning A Labora
tory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y.”およびAusubelらによる
“1989, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associ
ates and Wiley Interscience, N.Y.”に記載の技術・手法を参照のこと。

【００４３】本発明の1つの態様においては、DKGレダクターゼ(DKGR)をコード化する核酸を
パントエア(Pantoea)発酵菌株中に組換えにより導入する。多くの種がDKGRを、
特に、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属、ブレビバクテリウム(Brevibac
terium)属、およびアースロバクター(Arthrobacter)属を含めて、コリネホルム(
Coryneform)群のメンバーを含むことが見出されている。本発明の1つの実施態様
においては、コリネバクテリウム(Corynebacterium)種の菌株であるSHS752001か
ら得られる2,5-DKGR(Grindley et al., 1988, Applied and Environmental Micr obiology 54: 1770-1775)をパントエア・シトレア(Pantoea citrea)中に組換え
により導入する。他の実施態様においては、アーウィニア・ヘルビコラ(Erwinia
herbicola)により得られる2,5-DKGレダクターゼ(Andersonらによる米国特許第5
,008,193号に開示)をパントエア・シトレア(Pantoea citrea)中に組換えにより
導入する。

【００４４】酸化酵素または還元酵素をコード化する核酸に対する供給源としては以下のよ
うなものがある。

【００４５】

【表１】

【００４６】ベクター配列本発明の方法の経路酵素(たとえば、デヒドロゲナーゼやレダクターゼ)を宿主
微生物中に発現させる際に使用される発現ベクターは、酵素と結び付いた少なく
とも1種のプロモーターを含み、該プロモーターは宿主細胞中にて機能する。本
発明の1つの実施態様においては、プロモーターは選定された酵素に対する野生
型プロモーターであり、本発明の他の実施態様においては、プロモーターは酵素
に対して異種であるが、それでもなお宿主細胞中で機能する。本発明の1つの実
施態様おいては、酵素をコード化する核酸が微生物ゲノム中に安定に組み込まれ
る。

【００４７】好ましい実施態様においては、発現ベクターがマルチプルクローニング部位カ
セット(a multiple cloning site cassette)を含み、このとき前記カセットは、
核酸の操作を容易にするために、該ベクターに特異的な少なくとも1つの制限エ
ンドヌクレアーゼ部位を含むのが好ましい。好ましい実施態様においては、ベク
ターは1つ以上の選択可能なマーカーをさらに含む。本明細書で使用している選
択可能なマーカーとは、宿主微生物中での発現が可能な遺伝子を表わしており、
こうしたマーカーにより、ベクターを含有する宿主の選択が容易になる。このよ
うな選択可能なマーカーの例としては、エリスロマイシン、アクチノマイシン、
クロラムフェニコール、およびテトラサイクリン等の抗生物質があるが、これら
に限定されない。

【００４８】エンテロバクテリアセアエ(Enterobacteriaceae)菌株中に天然に存在しない酵
素または中間体を組換え導入するための好ましいプラスミドは、Gram-バクテリ
アとGram+バクテリアを含めた広範囲のバクテリア宿主中で複製できる能力を有
する、可動性ではあるが自己伝達性ではないプラスミドであるRSF1010である(Fr
ey et al., 1989, The Molecular Biology of IncQ plasmid. In: Thomas (Ed.)
, Promiscuous Plasmid of Gram Negative Bacteria. Academic Press, London,
pp.79-94)。3つの領域に関するFreyらの報文(1992, Gene 113:101-106)によれ
ば、RSF1010の可動特性に影響を及ぼすことが見出されている。

【００４９】形質転換一般的な形質転換法が“Current Protocols in Molecular Biology”(vol.1,
Ausubelら編集, John Wiley & Sons, Inc. 1987, Chapter 9)に記載されており
、リン酸カルシウム法、DEAE-デキストランを使用する形質転換法、および電気
穿孔法などがある。経路酵素をコード化する拡散を所定の宿主細胞中に導入する
ための種々の形質転換法が当業者には公知である。本発明の方法は、組換え宿主
細胞によって生成される経路酵素、組換え宿主細胞から精製される経路酵素、お
よびインビトロ環境中に外来的に加えられる経路酵素を含み、このとき経路酵素
は、宿主細胞に対して異種であろうと外来性であろうと、活発に増殖する宿主細
胞によって発現されるか、あるいは非生存性の宿主細胞の膜中に存在する。外来
的に加える経路酵素を組換えにより生成させるために、バクテリア細胞、真菌細
胞、哺乳類細胞、昆虫細胞、および植物細胞を含めた種々の宿主細胞を使用する
ことができる。植物の形質転換法がRodriquez(WO95/14099, 1995年5月26日付け
公開)によって説明されている本発明の好ましい実施態様においては、宿主細胞はエンテロバクテリアセアエ
(Enterobacteriaceae)である。エンテロバクテリアセアエ(Enterobacteriaceae)
の群に含まれるものとしては、アーウィニア(Erwinia)種、エンテロバクター(En
terobacter)種、グルコノバクター(Gluconobacter)種、およびパントエア(Panto
ea)種などがある。本発明においては、好ましいエンテロバクテリアセアエ(Ente
robacteriaceae)発酵菌株はパントエア(Pantoea)種であり、具体的にはパントエ
ア・シトレア(Pantoea citrea)である。他の好ましい実施態様においては、宿主
細胞は、炭素供給源をKLGに転化することができる経路酵素を含んだパントエア
・シトレア(Pantoea citrea)である。本発明は、炭素供給源を使用してKLGを生
成できる微生物炭水化物経路における、中間体(GA、2-KDG、2,5-DKG、5DKG、お
よびIA等の中間体を含む、但しこれらに限定されない)を介しての炭素供給源か
らKLGへの経路を含む。1つの実施態様においては、経路酵素をコード化する核酸
をプラスミドベクターによって導入し、他の実施態様においては、経路酵素をコ
ード化する核酸を宿主細胞ゲノム中に安定に組み込む。

【００５０】形質転換細胞の識別宿主細胞が形質転換されたかどうかは、問題としている核酸が存在しているこ
とを示すことのあるマーカー遺伝子発現の有無によって調べることができる。し
かしながら、その発現を確認しなければならない。たとえば、経路酵素をコード
化する核酸がマーカー遺伝子配列内に挿入されれば、挿入物を含んだ組換え細胞
を、マーカー遺伝子の非存在によって識別することができる。これとは別にマー
カー遺伝子を、単一プロモーターの制御下で、経路酵素をコード化する核酸との
連携関係にて配置することもできる。誘導または選択に応答したマーカー遺伝子
の発現は通常、同様に酵素も発現していることを示している。

【００５１】これとは別に、経路酵素に対するコード配列を含んでいて酵素を発現する宿主
細胞は、当業者に公知の種々の方法によって識別することができる。これらの方
法としては、DNA-DNAもしくはDNA-RNAハイブリット形成法、および核酸や蛋白質
の検出および/または定量のための、膜ベース技術、溶液ベース技術、またはチ
ップベース技術を含んだ蛋白質バイオアッセイ法もしくはイムノアッセイ法など
があるが、これらに限定されない。

【００５２】さらに、宿主微生物中における酵素ポリヌクレオチド配列体の存在は、DNA-DN
AもしくはDNA-RNAハイブリット形成法、あるいは酵素ポリヌクレオチド配列体の
プローブ、一部分、もしくはフラグメントを使用する増幅法によって検出するこ
とができる。

【００５３】アッセイ条件 ASA中間体、ASA、およびASA立体異性体を検出するための方法としては、2,6-
ジクロロインドフェノール(Burton et al., 1979, J. Assoc. Pub. Analyst 17:
105)または他の適切な試剤による酸化還元滴定を使用する方法; アニオン交換樹
脂を使用する高速液体クロマトグラフィー(HPLC)法; およびエレクトロレドック
ス(electro-redox)法(Pachia, 1976, Anal. Chem. 48:364); などがある。当業
者は、これらの検出法を使用する際に適用すべき対照標準について周知している
。

【００５４】中間体の回収 ASA中間体が生成されると、これらのASA中間体は、凍結乾燥、結晶化、噴霧乾
燥、および電気透析などを含めた、当業者に公知のいかなる手段によっても回収
および/または精製することができる。ASAおよびASA中間体(たとえばKLG)を精製
するための電気透析法は、たとえば1998年5月5日付け取得の米国特許第5,747,30
6号、および1998年8月30日付け取得の米国特許第4,767,870号に記載されている
。これとは別に、中間体をバイオリアクターから直接取り出し、顆粒状にするこ
とも、あるいは液状配合物にすることもできる。

【００５５】本発明を実施する仕方と方法は、下記の実施例を参照すれば当業者にとって理
解がより深まるであろう。下記の実施例によって、本発明範囲および特許請求の
範囲が限定されることはない。本明細書において引用した文献と特許を全て参照
により本明細書に含める。

【００５６】実施例実施例I 本実施例は、天然に存在するGDHの突然変異体を有するパントエア・シトレア(
Pantoea citrea)宿主細胞を製造するための方法について説明する。

【００５７】パントエア・シトレア(Pantoea citrea)からのグルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子(GDH)のクローニング : グルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子をポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって複
製した。PCRにおいては2種のプライマー(5'AGGGAGTGCTTACTACCTTATCTGCGGTATA3'
と5'CGCTAGCTGTGCAATCCATTGATTTTGCACA3')を使用した。PCRの後、約2kbのDNA生
成物をベクター〔pGEM-T(Promega)〕中で複製し、正しいDNA挿入物との組換えE.
コリ(E.coli)を識別し、このクローンをpRLと表示した。DNA挿入物をDNA塩基配
列決定法によって分析し、その配列が、パントエア・シトレア(Pantoea citrea)
菌株のGDHの公開DNA配列と60〜70%同一であることがわかった。

【００５８】クロラムフェニコール耐性遺伝子の挿入による欠失GDH遺伝子の生成: GDH遺伝子の欠失突然変異体をパントエア・シトレア(Pantoea citrea)中に生
成させるために、先ず最初に選択可能なマーカー〔クロラムフェニコール耐性遺
伝子(CAT)〕を導入することによって、欠失させようとする遺伝子の組換えコピ
ーを生成させた。インビトロで生成させたコピーをパントエア・シトレア(Panto
ea citrea)中に導入し、相同的組換えにより野生型コピーと再結合させた。種々
の制限酵素を使用した消化によってpRL DNAを分析した。GDHをコード化するDNA
内にて約700bp離れて位置する2つのSmal開裂部位が見出された。pRLをSmalで消
化して700bpフラグメントを除去し、次いでクロラムフェニコール耐性遺伝子を
含有するSmal消化させた1.05kb DNAで置き換えて、組換えプラスミド(pRLcm4と
表示)を生成させた。pRLcm4を生成させるのに使用した方法は当業者によって使
用されている標準的な方法である。pRLcm4からのGDH-CATコード配列をさらにプ
ラスミド(pGP704)に変えた。GDH-CATカセットをコード化するDNAを、制限酵素Aa
tllとSpelとの複合消化によってpRLcm4から除去した。消化されたDNAの付着末端
を、デオキシヌクレオチド三リン酸混合物の存在下でのT4 DNAポリメラーゼの処
理によって除去した。次いでGDH-CATカセットをEcoRV消化のpGP704と連結した。
GDH-CATカセットを含有するpGP704の組換えプラスミドを識別し、これをp704RLc
mと表示した。

【００５９】パントエア・シトレア(Pantoea citrea)の染色体中への欠失GDH遺伝子の導入: 電気穿孔法によって、プラスミドp704RLcmを野生型のパントエア・シトレア(P
antoea citrea)中に導入した。先ず最初に、12.5ug/mlのクロラムフェニコール
を含有する寒天プレート中で形質転換細胞を培養し、耐性コロニーを観察した。
真性の欠失突然変異体(クロラムフェニコール耐性の表現型を示すはずである)を
単にプラスミドp704RLcmを収容するだけの細胞と区別するために、クロラムフェ
ニコール耐性コロニーをアンピシリン(p704RLcmによる他の抗生物質耐性マーカ
ーキャリヤー)に対してスクリーニングした。アンシピリン感受性のクローンを
識別した。正しい表現型を有する幾つかのクローン(クロラムフェニコール耐性
で且つアンシピリン感受性)を生化学的アッセイによって特性決定したところ、
全てがGDH陰性表現型を示した。DNAブロット分析により、野生型のGDH遺伝子が
欠失コピーで置き換えられたことが確認された。

【００６０】実施例II 実施例IIでは、天然に存在する2-ケト-D-グルコネートデヒドロゲナーゼ(E3)
の突然変異体を有する宿主細胞を製造するための方法について説明する。

【００６１】グルコノバクター・メラノゲナス(Gluconobacter melanogenus)からの2-ケト-
D-グルコネートデヒドロゲナーゼ(EC1.1.99.4)を、Mclntireらの方法(Mclntire,
W., Singer, T.P., Ameyama, M., Adachi, O., Matsushita, K., and Shinagaw
a, E. Biochem. J. (1985) 231, 651-654)に従って精製した。精製した蛋白質を
トリプシンとキモトリプシンもしくは他のプロテアーゼとで消化してペプチドフ
ラグメントを生成させ、これらをHPLCまたは他の手段によって分離した。個々の
ペプチドを採取し、配列決定を行った。この配列体から、宿主有機体または関連
有機体ゲノム中の対応する配列体にアニールするDNAプローブを合成した。標準
的なPCR法を使用して、所望遺伝子のより大きなフラグメントを拡大し、精製し
、そして配列決定した。これらのフラグメントを使用して遺伝子にハイブリッド
形成し、遺伝子全体のクローニングと配列決定を可能にした。いったん配列がわ
かったら、実施例IのD-グルコネートデヒドロゲナーゼ(GDH)に関して記載のよう
に遺伝子に欠失を起こさせた。

【００６２】 2-ケト-D-グルコネートデヒドロゲナーゼを減少もしくは除去するために他の
方法では、阻害剤(クエン酸塩やコハク酸塩等の有機酸が2-ケト-D-グルコネート
デヒドロゲナーゼを阻害すると報告されている; Shinagawa, E. and Ameyama, M
. Methods in Enzymology (1982) 89, 194-198)を使用し、またpHや温度を変え
ている。

【００６３】酵素は、ShinagawaとAmeyamaの文献に記載のアッセイを使用して、活性または
活性の低下に関して分析評価することができる。実施例III 実施例IIIでは、補因子が再生されるという状況にてバイオリアクター中でKLG
を製造するための方法を説明する。

【００６４】物質と方法細胞の透過処理(permeabilization) 天然に存在する膜結合GDHの突然変異体を有するパントエア・シトレア(Pantoe
a citrea)細胞400mlを、グルコネート1リットル当たり10gにて80OD(600nm)に増
殖させ、10%トルエンと90%アセトンとの混合物16mlと22℃で3分混合した。透過
処理した細胞を9000rpmで10分遠心分離にかけ、得られた細胞ペレットを400mlの
50mMtris(pH7)で洗浄した。洗浄を2回以上繰り返して、残留有機溶媒を確実に除
去した。

【００６５】反応器への仕込み撹拌機、温度制御器、酸素供給管、塩基供給管、サンプル入口、酸素プローブ
、およびpHプローブを備えた1リットル容量のガラス容器に、50mMtris(pH7)中40
0mlの透過処理細胞を入れた。200ulのMAZU消泡剤(BASF)を溶液に加えて過剰の発
泡を抑え、加圧空気を容器に供給し、温度を28℃にし、そして撹拌機のスイッチ
を入れて、酸素プローブの指示値が60%飽和を超えるまで1200rpmで回転撹拌した
。16gの結晶質グルコースと4gの結晶質グルコン酸ナトリウムを加えて、10g/1リ
ットルグルコネート、および40g/1リットルグルコースの最終濃度にした。本混
合物を、全てのグルコネートがDKGに転化されるまで反応させた。グルコースの
レベルを20g/リットル以上に保持した。細胞の透過処理により、非生産的な細胞
代謝に入り込んだグルコースの量は最少量であった。全体を通して制御可能な仕
方で50%NaOHを加えることによってpHを7に維持した。

【００６６】可溶性の酵素と補因子の添加グルコネートをDKGに転化させた後、それぞれ2000ユニットの補因子依存性のG
DHとDKGレダクターゼ(DKGRの場合、1ユニットは、340nmで測定したときの1分当
たり1ODの吸光度変化に等しい)を400uMのNADP+と共に加えた。反応器を撹拌し、
空気を供給し、そして前述のように28℃に保持した。実験全体を通してグルコー
スを定期的に加えて、補因子依存性酵素の両方に関して一定の基質供給が確実に
得られるようにした。

【００６７】結果精製していないレダクターゼ A:F22Y/A272G(米国特許第5,795,761号)をE.コリ
(E. coli)からの粗製抽出物の形で使用してバイオリアクター実験を行った。T.
アシドフィラムGDHとNADP+はシグマ社から購入した精製品であった。GAからDKG
への速度は10g/リットル/hrより大きかった。初期の2-KLG形成速度は10g/リット
ル/hrより大きかった。初期6時間にわたる統合速度は5g/リットル/hrより大きか
った。補因子は初期の6時間にわたって安定のようであり、主として還元形態で
存在した。トータルの代謝回転数は537(215mM 2KLG/0.4mM NADP+)であった。初
期の6時間中、中間体GAとDKGは4g/リットルを越えることはなかった。初期の細
胞仕込みから6.5時間後に実験を停止し、22℃での低速撹拌のウインドダウンフ
ェーズ(a wind down phase)を一晩行った。KLGの最終的な滴定量は42g/リットル
であった。

【００６８】バイオリアクターのインキュベーション工程中にアリコートを取り出した。こ
れらのアリコートを先ず小型遠心分離機にかけて細胞をペレット状にした。残留
レダクターゼの活性に関して分析評価するために、910ulの緩衝液(50mM bis-tri
s, pH7)、20ulのDKG(70mg/ml)、および250uMのNADPHで構成される溶液に25マイ
クロリットルのサンプル上澄み液を加えた。レダクターゼの活性は、340nmにて1
分間にわたって吸光度の減少をモニターすることによって測定した。GDHの活性
は、520ulの緩衝液、150ulのNaCl(1M)、200ulの尿素(8M)、50ulのglc(1M)、およ
び60ulのNADP+(5mM)を含む溶液に25ulのサンプルを加えることによって、そして
340nmにて1分間にわたって吸光度の増大をモニターすることによって測定した。
レダクターゼもGDHも、バイオリアクター実験の工程全体にわたって充分な活性
を示した。

【００６９】実施例IV 本実施例では、インビトロのバイオリアクターでKDGを製造することについて
説明する。

【００７０】膜結合したD-グルコースデヒドロゲナーゼとD-グルコン酸デヒドロゲナーゼ活
性物質を含有するが、2-ケト-D-グルコネートデヒドロゲナーゼ活性物質を含有
しない細胞を増殖させ、取り入れた。このような細胞の1つの例は、2-ケト-D-グ
ルコネートデヒドロゲナーゼ酵素の突然変異体を有するパントエア・シトレア(P
antoea citrea)であり、実施例IIIに記載のように増殖させて処理した。グルコ
ース(結晶質または溶液形態)を少量ずつ又は連続的に加えた。高濃度のNaOH溶液
を慎重に加えることによってpHを保持した。グルコースをD-グルコン酸に転化し
、次いでKDGに転化した。適切なHPLCシステムに基づいてアリコートを分析する
ことによって生成物の形成状況を観察した。遠心分離により細胞を取り除き、残
留している液体を濃縮または除去することによって生成物を回収した。

【００７１】実施例V 本実施例では、有機溶媒を加えることによりレダクターゼの活性が高くなるこ
とを説明する。

【００７２】 1〜2mgのDKG、250uMのNADPH、F22Y/A272GレダクターゼA、および50mMのbis-tr
is緩衝液をキュベット(cuvette)に加えて、最終的な体積を1mlとした。340nmで
の吸光度の減少をモニターすることによってレダクターゼの活性を測定した。加
えるレダクターゼの量により、一般には、室温または30℃にて0.1〜0.2OD/分の
吸光度変化がもたらされた。同じ条件下にて、メタノールまたはエタノールのア
リコートを溶液に加え、レダクターゼの活性を測定した。種々の量のメタノール
の存在下における30℃でのレダクターゼの活性を図3に、またエタノールの存在
下における22℃でのレダクターゼの活性を図4に示す。

【００７３】図に示すように、特定量のメタノールまたはエタノールが存在すると、レダク
ターゼの活性が増大した。最適の濃度は、有機溶媒が10〜25%の範囲であった。 T.アシドフィラム(T. acidphilum)からのGDHは、10%メタノールでインキュベ
ートしたときはわずかな活性の増大を示した(アッセイ条件は、1ml中に50mMのTr
is(pH7)、12.5mMのD-グルコース、および250uMのNADP+)。活性は、340nmにおけ
る吸光度の増大によってモニターした。透過処理した細胞を15%MeOHおよびグル
コン酸と共にインキュベートした。D-グルコン酸デヒドロゲナーゼ活性物質と2-
ケト-D-グルコン酸デヒドロゲナーゼ活性物質は、メタノールを加えてもそれほ
ど影響を及ぼさなかった(HPLCによる生成物の分析によってモニター)。

【００７４】全体的なバイオリアクター反応にメタノールまたはエタノールを加えると、レ
ダクターゼの活性が増す。GDH活性物質や他の成分の減少は、さらなるGDHまたは
細胞を加えることによって克服できる。

【００７５】実施例VI 本実施例では、ガフクアット(Gafquat)とPEG8000の存在下におけるレダクター
ゼの活性について説明する。

【００７６】 1ml(50mM bis-tris緩衝液, pH7)中、250uMのNADPH、1〜2mg/mlのDKG、ならび
に0、0.07%、および2.8%のガフクアット(ISPテクノロジー社)もしくは0.5%のPEG
8000と共に30℃にてレダクターゼをインキュベートした。レダクターゼの活性は
、実施例VIに記載のように測定した。表1に示すように、ガフクアットを加える
と、ガフクアットが存在しない場合の活性と比較してレダクターゼの活性が80%
増大した。PEG8000はレダクターゼの活性を約15%高めた。

【００７７】

【表２】

【００７８】実施例VII 本実施例では、塩の存在下におけるレダクターゼの活性を説明する。レダクタ
ーゼA F22Y/A272Gの活性を種々の量の異なった塩の存在下で測定した。本アッセ
イでは、250uMのNADPH、DKG(1〜1.5mg/ml)、50mMのbis-tris緩衝液(pH7.0)、な
らびに種々の量のリン酸カリウム、NaCl、KCl、K₂SO₄、もしくはCaCl₂を含有す
る溶液(最終体積1ml)にレダクターゼを加えた。反応は全て30℃で行った。得ら
れた結果を図5に示す。

【００７９】図5に示すように、最大100mMまでのNaClまたはKClと共にインキュベートする
と、レダクターゼの活性は同程度のままか、あるいはやや増大する。次いで塩の
濃度が250mMに増大するにつれて活性が低下する。CaCl₂またはリン酸カリウムの
濃度が20mM以上であると、レダクターゼの活性は低下する。

【００８０】標準的な生化学的方法を使用して、200mMのNaClの存在下でのNADPHに対するレ
ダクターゼ結合定数(Km)を測定した(Fersht, A. "Enzyme Structure and Mechan
ism"(1977) W.H.Freeman and Company)。反応は、約1.5mg/mlのDKGと種々の量の
NADPHとを含有するbis-tris緩衝液(pH7)中にて30℃で行った。200mMのNaClの存
在下でのNADPHに対するKmは、NaClなしで測定したKmに比べて10〜40倍増大する
ことがわかった。塩の存在下での最大速度(Vmax)は、塩が存在しない場合のVmax
と比較して同等であるか、あるいはやや増大した。レダクターゼの活性に及ぼす
影響を少なくするための1つの方法は、こうした条件下にてKmと同等以上になる
までNADPHの濃度を増大させることである。これとは別に、KLGを含んだ帯電化学
種を除去してもよい。

【００８１】実施例VIII 本実施例では、塩/生成物の存在下におけるレダクターゼA F22Y/A272Gの安定
性について説明する。

【００８２】レダクターゼの熱安定性は、塩の存在下で大幅に増大した。下記の方法のうち
の1つでレダクターゼを試験した。第1のケースでは、2-KLGが全く存在しないか
、あるいは種々の量の2-KLG(0〜500mM)の存在下にてレダクターゼを緩衝液(50mM
のbis-tris, pH7)に加えた。これら溶液の少量(40ul)を1.5mlのエッペンドルフ
・チューブ(eppendorf tube)中に入れた。チューブを45℃の水浴中に置き、設定
された間隔で取り出した。標準的なレダクターゼ活性アッセイを使用して、残留
活性に関してレダクターゼを分析評価した。得られた結果を図6に示す。

【００８３】図6に示すように、50mMの2-KLGが存在する条件下では、レダクターゼはそれほ
ど活性が低下しない。しかしながら、緩衝液だけと共にインキュベートしたレダ
クターゼは、10分経過後において活性が約半分に低下する。中間体2-KLGの濃度
が増すと、ある程度の安定化がもたらされる。

【００８４】緩衝液(50mMのbis-tris, pH7, または25mMのMOPS, pH7)、0.5MのNaCl、0.5Mの
KCl、0.5MのNH₄Cl、0.5MのK₂SO₄、および0.1MのNaClの存在下にてpH7および45℃
で10分、レダクターゼをインキュベートした。下記の表2に示すように、これら
の化合物の存在下では活性はほとんど失われないが、緩衝液だけのレダクターゼ
の場合は、その活性がほぼ1/2に低下する。これらの化合物は明らかにレダクタ
ーゼを安定化する。これらの化合物は、そのレベルがより高くても低くてもレダ
クターゼを安定化させるはずである。

【００８５】

【表３】

【００８６】 2-KLGによる安定化とNaClによる安定化との比較を行った。インキュベーショ
ンは、25mMのMOPS(pH7)中にて45.4℃で行った。20mM濃度の2-KLGまたは20mM濃度
のNaClを使用した。0分、5分、および10分の時点にてアッセイを行った。得られ
た結果を下記の表3に示す。表からわかるように、同量の場合、NaClのほうが2-K
LGよりレダクターゼを安定化する。

【００８７】

【表４】

【００８８】 0〜400mMのNaKLGの存在下でのレダクターゼに対する半減期を46.6〜46.9℃に
て測定した。この温度は、全ての半減期を同じ温度で測定するために選定した。
緩衝液は25mMのMOPS(pH7.0)であった。アリコートを取り出し、残留活性に関し
て分析評価した。熱安定性と半減期の測定は以下のように行った。緩衝液、レダ
クターゼ、および2-KLG(使用する場合)を含有する450μlサンプルをエッペンド
ルフ・チューブ中に入れ、水浴中で加熱した。10〜30分の時間間隔にて8個また
は9個のアリコートを取り出した。各アリコートを氷上に置き、実験の最終時点
に2つずつ分析評価した。活性を、時間vs.残留活性の関係にてプロットした。指
数関数的減衰を解くためのコンピュータ・グラフィング・プログラムを使用して
ラインを適合させることによってK_fを求めた。次いでこの値を使用して半減期を
算出した(Fersht, A. "Enzyme Structure and Mechanism"(1977) W.H.Freeman a
nd Co.)。得られた結果を下記の表4に示す。

【００８９】

【表５】

【００９０】表4に記載の結果からわかるように、NaKLGは明らかにレダクターゼを安定化し
、そしてこの安定化は濃度依存性である。このデータは、塩の量を増大させることによりレダクターゼを安定化できるこ
とを示している。バイオリアクターにおいて使用できる適切な塩としては、硫酸
アンモニウム、酢酸ナトリウム、酢酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硫酸ナ
トリウム、リン酸カリウム、リン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、KCl、NH₄Cl、
K₂SO₄、およびNaIなどがある。当業者であれば、塩の最適範囲が温度依存性であ
ることを周知している。従ってバイオリアクターにおいては、温度、塩の濃度、
またはこれら両方をモニターして、レダクターゼの所望する安定性を達成するこ
とができる。一般的なバイオリアクターが機能するより低い温度では、表4に示
すようなレダクターゼの同程度の安定化を得るためには、より少ない量の塩を使
用しなければならない。

【００９１】実施例IX 本実施例では、NADPH/NADP+比と反応の平衡を測定するための方法について説
明する。

【００９２】還元補因子(NADPH)は340nmにおいて高い吸光度を有するが、酸化補因子(NADP+
)は該波長において光を吸収しない。従って、これら2つの補因子が混合されてい
る場合、340nmでの吸光度を測定することによって存在するNADPHの量を決定する
ことができる。さらに、最初に加えたNADP+の量が既知であれば、2つの補因子の
比を容易に求めることができる。この方法を使用して、反応(たとえば補因子再
利用反応)に種々の成分を加えることが反応の平衡にどのように影響を及ぼすか
を調べることができる。

【００９３】キュベット中にて室温で1mlの反応をセットした。この反応では、緩衝液(50mM
のbis-tris, pH7)、5mgのグルコース、5mgの2,5-DKG、100uMのNADPH、100uMのNA
DP+、レダクターゼ、およびグルコースデヒドロゲナーゼ(GDH)を使用した。反応
を開始させるために最後に酵素を加え、340nmにて補因子のレベルをモニターし
た。平衡に達した後(図7)、追加アリコートのGDHを加えた。平衡は、より多くの
NADPHが存在するほうに速やかにシフトした。GDHをさらに加えると、同じ応答を
示した。

【００９４】別の1mlのインキュベーションを上記のようにセットした。平衡に達した後、2
9mgのNaClを加えて0.5M NaClの最終濃度とした。図8に示すように、NADPHが存在
するほうに急激に平衡がシフトした。

【００９５】実施例X 本実施例では、補因子再利用反応について説明する。レダクターゼ、GDH、グルコース、2,5-DKG、およびNADP+を反応容器中に加え
ることによって補因子再利用反応を行った。さらに、精製した2-KLGを幾つかの
反応に加えて、生成物の存在下での反応を調べた。これらの反応を、グルコン酸
と2-KLGを生成するように維持した。2つの酵素の作用によって、NADP+とNADPHと
の間で補因子を再利用した。定期的にアリコートを採取し、基質と生成物の存在
に関してHPLCにより分析した。反応を、室温にて少なくとも20分保持した。

【００９６】 3mlという少量にて反応を行った。反応においては、レダクターゼ、GDH、10mg
/mlのグルコース、および10mg/mlの凍結乾燥した2,5-DKGを50mMのbis-tris緩衝
液に加えた。幾つかのインキュベーションに2-KLGを75mg/mlの濃度で加えた。NA
DP+(400uM)を加えることによって、反応を室温で開始させた。少量のNaOHを加え
ることによって、溶液のpHを6〜7.5に保持した。グルコースと2,5-DKGのアリコ
ートを定期的に加えた。反応混合物を4℃にて一晩静置した。翌朝、室温に加温
し、pHを調節し、反応を継続した。少量のアリコートを採取してHPLCに注入した
。対照標準と比較することにより、グルコネートと2-KLGの量を算出した。典型
的な反応においては、グルコースの少なくとも60%がグルコネートに転化され、
また2,5-DKGの少なくとも60%が2-KLGに転化された。

【００９７】実施例XI 本実施例では、NaClの動力学について説明する。 250uMのNADPHと10〜20mMのDKGを含有する標準的なレダクターゼアッセイにNaC
l(100mM以上)を加えると、レダクターゼの反応速度が減少した。動力学の解析を
行うことによって、塩化ナトリウムが補因子NADPHに対するレダクターゼのKmを
増大させることがわかった。NaClをさらに加えるにつれてKmが増大した。亜飽和
量(subsaturating amount)のNADPHを使用した場合は、レダクターゼがNaClによ
って阻害されるようであった。この影響を打ち消すため、数倍大きいKmが得られ
るよう反応混合物にさらにNADPHを加えた。阻害の態様は拮抗的であった。

【００９８】 NaClが存在するときのDKGに対するKmを、標準的な方法を使用して求めた。各
測定に対して使用したNADPHの濃度は、各NaCl濃度におけるKmより少なくとも3倍
高くなるように調節した。

【００９９】

【表６】

【０１００】実施例XII 本実施例は2-KLGの動力学を示す。 2-KLGが存在する場合のDKGに対するKmを、標準的な生化学的方法を使用して求
めた。2-KLGの量を、pH7の緩衝液にて0〜150mMの範囲で変えた。pH7の条件下で
のDKGに対するKmは10〜12mMであった。2-KLGの濃度が増大するにつれて、2,5-DK
Gに対するKmが減少した。たとえば、150mMの2-KLGでのDKGに対するKmは2〜4mMで
あった。さらに反応速度も減少し、KLGの濃度を0mMから150mMに増大させると、
反応速度は1/2〜1/4に減少した。こうした挙動は非拮抗的阻害と矛盾しない。

【０１０１】 100mMの2-KLGの存在下でのNADPHに対するKmは4〜9mMであることが求められた
。この測定は、2,5-DKGの濃度を14mMより大きくし、そしてNADPHの濃度を考慮し
ないで、標準的な生化学的方法を使用してpH7にて行った。

【０１０２】従って、バイオリアクター環境においてKLGの量が増大すると、レダクターゼ
の活性を低下させ、全体としての反応速度を遅くすると考えられる。こうした現
象に打ち勝つための2つの方法は、KLGを回収する(たとえば電気透析によって)と
いう方法、およびバイオリアクーにさらにレダクターゼを加えるという方法であ
る。

【０１０３】実施例XIII 本実施例では、2,5-DKGの合成について説明する。パントエア・シトレア(P. citrea)細胞を、適切な緩衝液(25mMのbis-trisまた
は25mMのMOPSをpH6にて使用)中にて150mMのグルコン酸ナトリウムと共にインキ
ュベートした。バッフルを備えた125mlの三角フラスコに25mlの細胞、25mlの緩
衝液、および25mlの基質を加え、約250rpmで振盪しながら28℃でインキュベート
した。16〜24時間後、HPLC分析と活性アッセイ(activity assay)により、2,5-DK
Gの形成に関してフラスコ内容物を調べた。細胞をスピンダウンし、上澄み液を
採取した。本物質を滅菌濾過した。本物質は4℃で保存してもよいし、あるいは
凍結状態で保存してもよい。これとは別に、凍結乾燥して固体にしてもよい。

【図面の簡単な説明】

【図１】図1は、NADP+とNADPHが酸化工程と還元工程との間で再利用されているインビ
トロプロセスの概略図である。

【図２】図2は、ASA中間体への経路の概略図である。工程表示Aは酵素作用による転化
であり、工程表示Bは酵素作用による転化または化学的転化である。この図面で
は、グルコース(Glc)をGAに転化させる酵素がGDH活性物質であり; GAをKDGに転
化させる酸化酵素がGADH活性物質であり; KDGをDKGに転化させる酸化酵素がKDGD
H活性物質であり; そしてDKGをKLGに転化させる還元酵素がDKGR活性物質である
。

【図３】図3は、pH7および温度30℃における、0〜40%のメタノールの存在下でのレダク
ターゼの活性を示している。

【図４】図4は、pH7および温度22℃における、0〜50%のエタノールの存在下でのレダク
ターゼの活性を示している。

【図５】図5は、NaCl、KCl、CaCl₂、K₂SO₄、またはリン酸カリウム(KPi)の存在下にお
けるpH7でのレダクターゼの活性を示している。初期速度は1分間にわたって測定
した。

【図６】図6は、2-KLGが存在しない場合と、最大500mMまでの2-KLGが存在する場合にお
ける、pH7および温度45℃でインキュベーションした後に残留しているレダクタ
ーゼの活性を示している。

【図７】図7は、インビトロの補因子再利用反応におけるNADPHの分光光度測定結果を示
している。吸光度は340nmにて測定した。酵素を加える前の初期吸光度の測定値
は0.7であった。約12分と23分の時点で追加少量のGDHを加えた。

【図８】図8は、インビボの補因子再利用反応におけるNADPHの分光光度測定結果を示し
ている。吸光度は340nmにて測定した。約5分の時点にて充分な量のNaClを加えて
最終濃度を0.5Mにした。

【図９】図9は、2-KLGの量を増大させたときの、2,5-DKGに関するレダクターゼKmと相
対的なVmaxを示している。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｐ 17/04 Ｃ１２Ｐ 17/04 // Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:15 (Ｃ１２Ｎ 9/04 1:18 Ｃ１２Ｒ 1:15） 1:01 (Ｃ１２Ｎ 9/04 1:07 Ｃ１２Ｒ 1:18）Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (Ｃ１２Ｎ 11/16 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 11/16 Ｃ１２Ｒ 1:07） (Ｃ１２Ｐ 7/60 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｐ 7/60 Ｃ１２Ｒ 1:07） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷＦターム(参考） 4B024 AA01 AA03 AA05 BA08 BA80 CA04 DA05 EA04 4B033 NA01 NA23 NA24 NB56 ND02 4B050 CC03 DD02 GG10 LL05 4B064 AD53 AD54 AE45 CA19 CA21 CA32 CB11 CB16 CC24 DA10 DA16 4B065 AA01X AA01Y AA24Y AA25Y AB01 AC10 BA02 BA22 CA10 CA18 CA28 CA41 CA44

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】炭素供給源を少なくとも1種の酸化酵素活性物質よって酵素
作用的に酸化してKDGまたはDKGを生成させる工程を含む、炭素供給源からKDGま
たはDKGを非発酵的に製造するための方法。
【請求項２】前記KDGをさらにエリソルビン酸塩に転化させる、請求項1記
載の製造法。
【請求項３】炭素供給源を第1の酸化酵素活性物質によって酸化して第1の
酸化生成物を生成させる工程; および前記第1の酸化生成物を第2の酸化酵素活性
物質によって酸化してKDGを生成させる工程; を含む、請求項1記載の製造法。
【請求項４】前記第1の酸化酵素活性物質がGDH活性物質であり、前記第2
の酸化酵素活性物質がGADH活性物質である、請求項3記載の製造法。
【請求項５】宿主細胞を含んだ環境において行われる、請求項1記載の製
造法。
【請求項６】前記宿主細胞が非生存性である、請求項5記載の製造法。
【請求項７】前記宿主細胞が生存性である、請求項5記載の製造法。
【請求項８】少なくとも1種の酸化酵素を前記宿主細胞膜に結合させる、
請求項5記載の製造法。
【請求項９】少なくとも１種の酸化酵素活性物質が溶液の形態をとってい
る、請求項1記載の製造法。
【請求項１０】前記宿主細胞が、KDGDH活性物質をコード化する天然存在
の核酸の突然変異体を含む、請求項8記載の製造法。
【請求項１１】前記宿主細胞がエンテロバクテリアセア科のメンバーであ
る、請求項5記載の製造法。
【請求項１２】前記メンバーがパントエア種である、請求項11記載の製造
法。
【請求項１３】少なくとも1種の酸化酵素活性物質が固定化される、請求
項1記載の製造法。
【請求項１４】 KDGを少なくとも1種の酸化酵素によって酵素作用的に酸化
して酸化生成物を得る工程; および前記酸化生成物を少なくとも1種の還元酵素
によって酵素作用的に還元して2-KLGを得る工程; をさらに含む、請求項3記載の
製造法。
【請求項１５】炭素供給源を少なくとも1種の酸化酵素活性物質によって
酵素作用的に酸化して酸化生成物を得る工程; および前記酸化生成物を少なくと
も1種の還元酵素活性物質によって酵素作用的に還元して2-KLGを得る工程; を任
意の順序にて含む、炭素供給源から2-KLGを非発酵的に製造するための方法。
【請求項１６】前記炭素供給源がKDGである、請求項15記載の製造法。
【請求項１７】前記酸化酵素活性物質が酸化形態の酵素補因子を必要とし
、前記還元酵素活性物質が還元形態の前記酵素補因子を必要とし、前記酸化形態
の前記補因子と前記還元形態の前記補因子が少なくとも１回の酸化工程と少なく
とも１回の還元工程との間で再利用される、請求項15記載の製造法。
【請求項１８】 a. 炭素供給源を第1の酸化酵素活性物質によって酵素作
用的に酸化して第1の酸化生成物を得る工程; b. 前記第1の酸化生成物を第2の酸化酵素活性物質によって酵素作用的に酸化
して第1の酸化生成物を得る工程; c. 前記第2の酸化生成物を第3の酸化酵素活性物質によって酵素作用的に酸化
して第3の酸化生成物を得る工程; および d. 前記第3の酸化生成物を還元酵素活性物質によって酵素作用的に還元して2
-KLGを得る工程; を任意の順序にて含む、請求項15記載の製造法。
【請求項１９】前記第1、第2、および第3の酸化酵素活性物質の少なくと
も1種が酸化形態の酵素補因子を必要とし、前記還元酵素活性物質が還元形態の
前記酵素補因子を必要とし、前記酸化形態の前記補因子と前記還元形態の前記補
因子が少なくとも１回の酸化工程と還元工程との間で再利用される、請求項18記
載の製造法。
【請求項２０】前記第1の酸化酵素活性物質が酸化形態の前記酵素補因子
を必要とする、請求項19記載の製造法。
【請求項２１】前記炭素供給源がグルコースであり、前記第1の酵素活性
物質がグルコースデヒドロゲナーゼ活性物質である、請求項18記載の製造法。
【請求項２２】前記グルコースデヒドロゲナーゼ活性物質がバクテリア供
給源、酵母供給源、または真菌類供給源から得られる、請求項21記載の製造法。
【請求項２３】前記グルコースデヒドロゲナーゼ活性物質が、T.アシドフ
ィラム種、クリプトコッカス・ユニグッタラタス種、およびバシラス種を含めた
供給源から得られる、請求項22記載の製造法。
【請求項２４】前記第1の酵素、前記第2の酵素、および前記第3の酵素の
それぞれがデヒドロゲナーゼ活性物質である、請求項19記載の製造法。
【請求項２５】前記第1の酵素活性物質、前記第2の酵素活性物質、前記第
3の酵素活性物質、および前記第4の酵素活性物質の少なくとも1種が固定化され
る、請求項19記載の製造法。
【請求項２６】前記第1の酵素活性物質、前記第2の酵素活性物質、前記第
3の酵素活性物質、および前記第4の酵素活性物質の少なくとも1種が溶液の形態
をとっている、請求項19記載の製造法。
【請求項２７】前記第2の酵素がGADH活性物質である、請求項25記載の製
造法。
【請求項２８】前記第3の酵素がKDGDH活性物質である、請求項25記載の製
造法。
【請求項２９】前記第4の酵素がレダクターゼ活性物質である、請求項25
記載の製造法。
【請求項３０】前記リダクターゼ活性物質がバクテリア供給源、酵母供給
源、または真菌類供給源から得られる、請求項29記載の製造法。
【請求項３１】前記供給源がコリネバクテリウムとアーウィニアを含む、
請求項29記載のレダクターゼ活性物質。
【請求項３２】前記レダクターゼ活性物質が2,5-DKGレダクターゼである
、請求項31記載の製造法。
【請求項３３】前記第1の酸化生成物がグルコネートであり、前記第2の酸
化生成物が2-KDGであり、そして前記第3の酸化生成物が2,5-DKGである、請求項1
8記載の製造法。
【請求項３４】組換え宿主細胞を含んだ環境において行われる、請求項18
記載の製造法。
【請求項３５】前記宿主細胞が生存性能である、請求項34記載の製造法。
【請求項３６】前記宿主細胞が非生存性である、請求項34記載の製造法。
【請求項３７】前記組換え宿主細胞がエンテロバクテリアセアのメンバー
を含む、請求項34記載の製造法。
【請求項３８】組換え宿主細胞を含んだ環境において行われ、前記第1の
酵素、前記第2の酵素、および前記第3の酵素の少なくとも1種を前記宿主細胞膜
に結合させる、請求項34記載の製造法。
【請求項３９】前記組換え宿主細胞がパントエア種である、請求項37記載
の製造法。
【請求項４０】前記組換え宿主細胞がパントエア・シトレアである、請求
項39記載の製造法。
【請求項４１】前記組換え宿主細胞が、天然に存在する少なくとも1種の
デヒドロゲナーゼ活性物質の突然変異体を有する、請求項40記載の製造法。
【請求項４２】前記突然変異体が膜に結合されたGDH活性物質中に存在す
る、請求項41記載の製造法。
【請求項４３】前記宿主細胞が異種GDH活性物質をコード化する核酸をさ
らに含む、請求項41記載の製造法。
【請求項４４】前記異種GDH活性物質がT.アシドフィラム種、クリプトコ
ッカス・ユニグッタラタス種、およびバシラス種から得られる、請求項43記載の
製造法。
【請求項４５】前記酸化形態の前記酵素補因子がNADP+であり、前記還元
形態の前記酵素補因子がNADPHである、請求項18記載の製造法。
【請求項４６】前記酸化形態の前記酵素補因子がNADであり、前記還元形
態の前記酵素補因子がNADHである、請求項18記載の製造法。
【請求項４７】連続的である、請求項1、請求項15、または請求項18に記
載の製造法。
【請求項４８】バッチ式である、請求項1、請求項15、または請求項18に
記載の製造法。
【請求項４９】有機溶媒を含んだ環境において行われる、請求項1、請求
項15、または請求項18に記載の製造法。
【請求項５０】長鎖ポリマーを含んだ環境において行われる、請求項1、
請求項15、または請求項18に記載の製造法。
【請求項５１】前記2-KLGからASAを得る工程をさらに含む、請求項14、請
求項15、または請求項18に記載の製造法。
【請求項５２】 GHD活性物質をコード化する遺伝子の突然変異体を有する
核酸、を含んだ宿主細胞。
【請求項５３】 KDGDH活性物質をコード化する遺伝子の突然変異体を有す
る核酸、を含んだ宿主細胞。
【請求項５４】パントエア種である、請求項52または請求項53に記載の宿
主細胞。
【請求項５５】異種GDH活性物質をコード化する核酸をさらに含む、請求
項52記載の宿主細胞。
【請求項５６】異種レダクターゼ活性物質をコード化する核酸をさらに含
む、請求項55記載の宿主細胞。
【請求項５７】前記のKDGまたはDKGを回収する工程を所望により含む、請
求項1記載の製造法。
【請求項５８】前記2-KLGを電気透析によってさらに精製する、請求項14
、請求項15、または請求項18に記載の製造法。
【請求項５９】前記補因子をナノ濾過によって精製する、請求項45または
請求項46に記載の製造法。
【請求項６０】塩を含んだ環境において行われる、請求項18記載の製造法
。
【請求項６１】前記塩が、硫酸アンモニウム、酢酸ナトリウム、酢酸アン
モニウム、塩化アンモニウム、硫酸ナトリウム、リン酸カリウム、リン酸ナトリ
ウム、塩化ナトリウム、KCl、NH₄Cl、K₂SO₄、およびNaIを含む、請求項60記載の
製造法。
【請求項６２】塩を0mM〜500mMの濃度にて含む、請求項60記載の製造法。